FI112949B

FI112949B - Proteiinien erottaminen

Info

Publication number: FI112949B
Application number: FI960073A
Authority: FI
Inventors: Birgitte Mahler Nilsson; Mads Aage Laustsen; Anders Rancke-Madsen
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1996-01-08
Publication date: 2004-02-13
Also published as: DE69429172T2; US5728559A; ES2168300T3; CN1126477A; AU7121494A; EP0707594A1; CN1054159C; BR9407047A; DK0707594T3; JPH08512294A; DE69429172D1; WO1995001989A1; FI960073A0; EP0707594B1; FI960073A; ATE209214T1; PT707594E; DK83093D0

Description

112949 τ

Proteiinien erottaminen - Separering av proteiner Tämä keksintö koskee menetelmää proteiinin, erityisesti ent-5 syymin erottamiseksi proteiinien vesiliuoksesta, ja halutun proteiinin talteenottoa kidemuodossa.

Entsyymejä tuotetaan tavallisesti nesteinä tai amorfisina aineina teollisiin käyttötarkoituksiin. Silloin kun niitä ei 10 tuoteta nesteinä, ne tuotetaan tavallisesti amorfisina aineina, koska tunnetut menetelmät entsyymien kiteyttämiseksi ovat tavallisesti liian kalliita käytettäväksi teollisessa mitassa. Entsyymikiteiden korkeasta puhtaudesta johtuen, edullisen ja yksinkertaisen menetelmän aikaansaaminen entis syymien kiteyttämiseksi, joka on helposti sopeutettavissa teolliseen mittaan, on selvästi teollisuuden toive.

On olemassa runsaasti kirjallisuutta, joka koskee entsyymien kiteyttämistä. On vaikeaa tehdä yleistyksiä mitä tulee spe-20 sifisten kiteyttämismenetelmien tuloksiin. Entsyymien ki-teyttämisala on hyvin kokemusperäistä ja yhdelle entsyymi-ryhmälle menestykselliseksi osoitettu menetelmä ei välttä-; ’ mättä ole menestyksellinen muille entsyymeille.

25 Tunnusomaisia piirteitä tähän mennessä tunnetuille proteii-' nien kiteyttämisprosesseille ovat hyvin puhtaat ja väke- vöidyt lähtöliuokset, alhainen saanto, hyvin pitkä kiteyttä-·.· ·' misaika, suuri kemikaalikulutus mukaan lukien orgaaniset liuottimet, ja huono teollisuuteen soveltuvuus.

. 30 Tämän keksinnön kohteena on saada aikaan prosessi kiteisten * _ proteiinien, erityisesti entsyymien talteenottamiseksi, joka prosessi ei edellytä suurten suolamäärien tai orgaanisten liuotinmäärien lisäämistä, joka antaa mahdollisuuden lyhyi-35 siin kiteyttämisaikoihin ja korkeisiin saantoihin, ja joka . ' , on yksinkertainen ja edullinen ja yhteensopiva teollisuuden vaatimusten kanssa.

112949 Tämä keksintö koskee sen mukaisesti menetelmää proteiinin erottamiseksi vesipitoisesta proteiiniseoksesta, käsittäen (a) vesipitoisen proteiiniseoksen aikaansaamisen, jonka suo-5 lapitoisuus on 1,5-molaarinen tai pienempi, johon on lisätty vesiliukoinen polymeeri (b) proteiinin talteenottamisen kiteisessä muodossa.

10 Piirrosten lyhyt kuvaus Tätä keksintöä kuvataan lisäksi viitaten oheisiin piirroksiin, joissa 15 Kuvio 1 esittää peroksidaasin kiteytyssaantoa (%) erilaisissa PEG 4000 -pitoisuuksissa ja erilaisissa CaCl^pitoisuuksissa (· 1 % C aCl2 ; *2 % CaCl2 ja □ 2,5 % CaCl2 ) .

Kuvio 2 esittää peroksidaasin kiteytyssaantoa (%) erilaisis-20 sa pH-arvoissa.

Kuvio 3 esittää peroksidaasin kiteytyssaantoa (%) erilaisis-.· ’ sa entsyymi- ja PEG 4000 -pitoisuuksissa (« 3 % peroksidaa- sia ja 1,4 % muita entsyymejä; Φ 4,8 % peroksidaasia ja 2,3 25 % muita entsyymejä ja * 6,7 7» peroksidaasia ja 3,1 % muita entsyymejä).

V ·’ Kuvio 4 esittää katalaasin kiteytyssaantoa (¾) erilaisissa C'aCl2-pitoisuuksissa ja erilaisissa PEG 4000 -pitoisuuksissa 30 (« 20 % PEG 4000; Φ 22 % PEG 4000; a 24 % PEG 4000; □ 26 % PEG 4000; V 28 % PEG 4000 ja δ 30 % PEG 4000).

Kuvio 5 esittää katalaasin kiteytyssaantoa (%) erilaisissa CaCl2-pitoisuuksissa ja erilaisissa PEG 4000 -pitoisuuksissa 35 { 20 % PEG 4000 ja Φ 25 % PEG 4000).

112949

Kuvio 6 esittää katalaasin kiteytyssaantoa erilaisissa PEG 1500 -pitoisuuksissa ja CaCl2-pitoisuudessa 0,2 %.

Kuvio 7 esittää proteaasin kiteytyssaantoa (%) erilaisissa 5 PEG 4000 -pitoisuuksissa.

Kuvio 8 esittää proteaasin kiteytyssaantoa {%) erilaisissa PEG 4000 -pitoisuuksissa ja CaCl2-pitoisuudessa 1,1 %.

10 Tämä keksintö koskee menetelmää proteiinin tai polypeptidin erottamiseksi vesipitoisesta seoksesta, joka sisältää muita proteiineja, joiden kiteytymisominaisuudet ovat erilaiset. Odottamatta on havaittu, että lisäämällä vesiliukoista polymeeriä, esim. polyetyleeniglykolia, proteiini voidaan erot-15 taa seoksestaan muiden proteiinien ja muiden epäpuhtauksien kuten hiilihydraatti-yhdisteiden kanssa, ja saostaa kiteisessä muodossa.

Proteiinien säestäminen ja kiteyttäminen polyetyleeniglyko-20 Iin (PEG) kanssa tunnetaan kirjallisuudesta liittyen PEG:n käyttöön kiteiden modifioimiseksi kidetiedettä varten, mutta . PEG-kitevttämisen käyttö proteiinien puhdistukseen on uutta.

; ·" PEG:a on käytetty yksinomaan kiteiden saamiseksi diffraktio- : ” analyysiin, johon viitataan julkaisuissa A. McPherson, Eur.

' 25 J. Biochem. 189. 1990, ss. 1-23,- R.N. Haire et ai. . Biopoly- • mers 23(12), 1984, ss. 2761-2779 ja J. C. Lee et ai.. J.

1 · Biol. Chem. 256(2), 1981, ss. 625-631.

On yleisesti hyväksytty, että osa mekanismista, jonka avulla 30 PEG toimii, on poistosuolausvaikutus yhdistettynä liuoksen dielektristen ominaisuuksien alentamiseen, - kuten suolan ja orgaanisen liuottimen indusoimissa kiteyttämisissä. Sen lisäksi PEG näyttää tietyissä olosuhteissa kykenevän erotta-,· maan proteiinin liuoksesta lisäämällä proteiinin termodynaa- 35 mistä aktiivisuutta, joka johtaa amorfiseen PEG-niukkaan faasiin, josta amorfinen proteiinisaostuma voidaan potenti- 112949 aalisesti muuntaa proteiinikiteiksi, vr't. R.N. Haire et a 1_^, Biopolymers 23(12), 1984, ss. 2761-2779.

Toinen PEG:n käyttö proteiinien kiteytyksessä on käsittänyt 5 vesipitoisen 2-faasisvsteemin muodostamisen käyttäen PEG:a ja korkeita suolapitoisuuksia, jossa proteiini väkevöityy PEG-faasiin, kidealkiot muodostuvat välifaasiin ja kidekas-vua esiintyy vesifaasissa, käyttövoiman piillessä korkeassa suolapitoisuudessa, josta viitteenä Eur. J. Biochem. 189, 10 1990, ss. 1-23.

Tämän keksinnön mukaisten tutkimusten perusteella kiteytyksille näyttää olevan erilainen ja odottamaton mekanismi, olennaisen eron ollessa se, että kiteytymistä ohjaa PEG-mo-15 lekyylien ja proteiinin välinen affiniteetti verrattain alhaisessa suolapitoisuudessa. Tuloksena on faasien erottuminen, jossa proteiini väkevöityy liukoisessa muodossa mikro-pisaroihin, joissa kidealkion muodostumista ja kidekasvua tapahtuu kuten jäljempänä on kuvailtu .- 20

Kun PEG:a lisätään proteiiniliuokseen (pitoisuuksissa, jotka eivät itsessään muodosta 2-faasisysteemiä) , proteiini, jolla ·' on sitoutumistaipumusta PEG:iin, liittyy PEG-molekyyleihin

•·, muodostaen epähomogeenisen liuoksen, joka oikeassa PEG

,_ 25 MP:ssa, PEG-pitoisuudessa, suolapitoisuudessa ja prote- ‘1 iinipitoisuudessa voi muodostua systeemiksi, joka käsittää i : vesifaasin, jossa on alhainen proteiinipitoisuus, ja raikro-’ pisarat, loissa on hyvin korkea proteiinipitoisuus. Tämä systeemi näyttää olevan aivan erilainen kuin normaali 2-faa-• 30 sisvsteemi, koska faaseja ei voi erottaa tavanomaisella pie- : ninopeuksisella sentrifugoinnilla; ultrasentrifugoinnissa , , : kuitenkin (kuten esimerkiksi esimerkissä 11 kuvaillaan) on . . mahdollista havaita kaksi faasia.

i : : ’ 35 Pisaroissa, joiden proteiinipitoisuus on korkea, ja jonkin verran epäpuhtauksista niiden ulkopuolella, kidemuodostuksen optimiolosuhteet tulevat esiin. Kiteet muotoutuvat sen jäi- 112949

C

keen ilmeisesti pisaroissa kunnes ne saavuttavat koon, jossa ne saattaisivat puhjeta ulos pisaroista muodostaen normaalin yksifaasisen vesipitoisen systeemin kiinteillä kiteillä ki-teyttämisen lopussa. Riippuen kuitenkin kyseessä olevasta 5 proteiinista, systeemi voi myös päätyä 2~faasisysteemiin, pääosan kiteistä ollessa yhä pisarat'aasissa. Esimerkkejä kidekasvusta, jota esiintyy sekä pisarafaasissa että pisaroiden pinnalta ympäröivässä liuoksessa, on myös todettu.

10 Tämä esitetty mekanismi, jonka mukaan proteiini kiteytetään 2-faasisessa pisarasysteemissä niin, että proteiini on puhtaassa ja väkevöidyssä muodossa, joka on saatu aikaan vesiliukoisen polymeerin ja proteiinin välisen affiniteetin avulla, viittaa siihen, että tekniikka voi olla hyvin teho-15 kas myös laimeille ja epäpuhtaille proteiiniliuoksille.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää proteiinin erottamiseksi proteiiniseoksesta, erityisesti entsyymin erottamiseen proteiiniseoksesta. Edullisessa suoritusmuodos-20 sa entsyymin sisältävä liuos on kasvuliemi, joka on saatu viljelemällä entsyymiä tuottavaa mikro-organismia. Keksinnön mukaista menetelmää käytetään edullisesti kasvuliemeen, jota ensin on käsitelty kiinteä aine/neste-erotustekniikoilla, "·. esim. flokkuloimalla. sentrifugoimalla, suodattamalla tai ,··, 25 mikrosuodattamalla. Voi olla myös käyttökelpoista puhdistaa ”! säestämällä tai kävttää kromatografisia menetelmiä ennen i ; kiteyttämistä.

t : :

Erityissuoritusmuodossa keksinnön mukainen menetelmä käsit-‘30 taa entsyymiä sisältävän liuoksen väkevöinnin sinänsä tun-: netuilla menetelmillä. Sellaisia menetelmiä ovat väkevöinti ultrasuodattamalla , diasuodattamalla, dialysoimalla tai haihduttamalla.

' ,· 35 Proteiinia sisältävän liuoksen väkevöinti, vaikka se ei ole välttämätön kiteyttämisen suoritukselle, on tarkoituksenmukainen käsittelyn ja saannon kannalta. Käytännön syistä ent- syyniin sisältävä liuos voidaan väkevöidä entsyymiprote- iinipitoisuuteen 0,1-25 % paino/paino, edullisimmin 1-10 % paino/paino.

Ί12949

H

5 Edullisessa suoritusmuodossa menetelmää käytetään oksidore-duktaasien, proteaasien, lipaasien, amylaasien ja sellu-laasien erotukseen. Oksidoreduktaasit, jotka määritellään ja kuvaillaan julkaisussa "Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, Inc., San Diego”, kuuluvat entsyymiryhmään, joka ka-10 talysoi elektronien siirtoa aineesta toiseen (hapetus-pelkistys) . Oksidoreduktaaseja ovat dehydrogenaasit, reduktaa-sit, oksidaasit, transhydrogenaasit, katalaasit, peroksidaa-sit ja oksygenaasit.

15 Spesifisempiä esimerkkejä ovat piparjuuriperoksidaasi, lig-ninaasit ja muut peroksidaasit, ja oksidaasit kuten lakkaa-sit. Nämä entsyymit ovat edullisesti mikrobiperäisiä.

Esimerkkejä mikro-organismisuvuista, joita voidaan käyttää 20 sopivien oksidoreduktaasien tuotantoon, ovat: Trametes. Rhi-zoctonia, Pseudomonas . Bacillus. Streptomyces, Hygrophorus. Coprinus. Polyporus, Candida. Curvularia, Cercospora, Myco-liophtora. Aspergillus ja Scytalidium. Keksintö ei kuitenkaan ole rajoittunut edellä määritellyistä ryhmistä peräisin ’ 25 oleviin entsyymeihin. Kaikkia mikro-organismeja, jotka tuot tavat halutuilla ominaisuuksilla varustettuja oksidoreduk-taaseja, voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti.

Oksidoreduktaasi on edullisesti lakkaasi (EC 1.10.3.2), ka-, 30 talaasi (EC 1.11.1.6), peroksidaasi (1.11.1.7) tai oksidaa- : ; si .

Edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaista menetelmää 1 ' käytetään peroksidaasia sisältävään liuokseen ja katalaasia 35 sisältävään liuokseen.

112949

Sopiva peroksidaasi on kasvien (esim. piparjuuriperoksidaa-si) tai mikro-organismien kuten sienten tai bakteerien tuottama peroksidaasi. Edullisessa suoritusmuodossa peroksidaasi on peräisin suvusta Coprinus. esim. C. cinereus tai C. mac-5 rorhizus tai Bacillus. esim. B. pumilus, erityisesti kansainvälisen patenttihakemuksen W0 91/05858 mukainen peroksidaasi .

Entsyymi voi sen lisäksi olla sellainen, jota voidaan tuot-10 taa menetelmällä, joka käsittää isäntäsolun viljelyn, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA-vektorilla, joka sisältää mainittua entsyymiä koodittavan DNA-sekvenssin sekä DNA-sek-venssejä, jotka koodittavat toimintoja, jotka mahdollistavat entsyymiä koodittavan DNA-sekvenssin ilmentymisen viljely-15 alustassa olosuhteissa, jotka mahdollistavat entsyymin ilmentymisen ja entsyymin talteenoton viljelmästä.

Yhdistelmätekniikalla tuotettu peroksidaasi on edullisesti Coprinus sp. -peroksidaasi, erityisesti C. macrorhizus tai 20 C. cinereus -peroksidaasi WO 92/16634:n mukaisesti.

Katalaasit tunnetaan sekä eläinlähteistä (esim. lehmän mak-* ·' sasta) että monista eri mikro-organismeista. JP-patenttiha- kemuksessa 2-76579 esitellään katalaasi Aspergillus niger -25 kannasta NFAG-2. GB-patentissä 2 216 149 tuodaan esille ka-: talaasi Penicilliumista. Keksinnön mukaisessa suoritusmuo- i dossa katalaasi saadaan Scytalidium- ja Humicola-kannoista j kuten W0 92/17571.-ssä kuvaillaan.

, 30 Keksinnön mukaisen menetelmän toisessa edullisessa suoritus- _ muodossa entsyymi on proteaasi. Sopivia proteaaseja ovat eläimistä, kasveista tai mikrobeista saatavat proteaasit. Kemiallisesti tai geneettisesti modifioidut mutantit laske-1 : taan mukaan. Se voi olla seriiniproteaasi, edullisesti alka- , ·, 35 linen mikrobiproteaasi tai trypsiinintyyppinen proteaasi.

Esimerkkejä aikalisistä proteaaseista ovat subtilisiinit, erityisesti Bacillus-peräiset, esim. subtiilein Novo, subti- 112949 8 lisin Carlsberg, subtilisin 309, subtilisin 147 ja subtili-sin 168 (kuvailtu WO 89/06279:ssä). Esimerkkejä kaupallisista Bacillus-subtilistineistä ovat Novo Nordisk A/S.-n Alc-a-laseR-, Savinasi*-, EsperaseR- ja DurazynP-tuotteet. Esimerk-5 kejä trvpsiinityyppisistä proteaaseista ovat trypsiini (esim. porsaasta tai naudasta) ja Fusarium-proteaasi, jota on kuvailtu W0 89/06270:ssä.

Keksinnön mukaisen menetelmän toisessa edullisessa suoritus-10 muodossa entsyymi on lipaasi. Sopivia lipaaseja ovat bakteereista ja sienistä saatavat lipaasit. Kemiallisesti tai geneettisesti modifioidut mutantit lasketaan mukaan. Erityisen edullinen on lipaasi, joka saadaan suvuista Pseudomonas, Candida ja Mucor. erityisesti Pseudomonas cepaciaen lipaasi, 15 jota on kuvailtu EP 0 214 761:ssä, tai lipaasi, joka saadaan kloonaamalla Humicola lanuginosan geeni ja ilmentämällä geeni Aspergillus oryzaessa kuten EP 0 258 068:ssa on kuvailtu, jota on saatavissa kauppanimellä LipolaseR Novo Nordisk A/S:Itä.

20

Keksinnön mukaisen menetelmän toisessa edullisessa suoritusmuodossa entsyymi on amylaasi. Sopivia amylaaseja ovat bakteeri- ja sieniperäisiä. Kemiallisesti tai geneettisesti modifioidut mutantit lasketaan mukaan. Amylaaseja ovat esi-25 merkiksi a-amylaasit, jotka saadaan Bacilluksista. esim.B.

licheniformiksesta. jota kuvaillaan yksityiskohtaisemmin GB-patenttijulkaisussa 1 296 839.

Keksinnön mukaisen menetelmän toisessa edullisessa suoritus-30 muodossa entsyymi on sellulaasi. Sopivia sellulaaseja ovat ,ν. bakteeri- ja sieniperäiset sellulaasit, erityisesti sie- nisellulaasit ovat edullisia. Kemiallisesti tai geneettisesti modifioidut mutantit lasketaan mukaan. Esimerkkejä sie-! , nista, joita voidaan käyttää sopivien sellulaasien tuotan- ·, 35 toon ovat: Trichoderma. Phanerochaete, Humicola, Fusarium ja

Myceliopthora.

112949 9

Keksinnön mukainen menetelmä käsittää lisäksi vesiliukoisen polymeerin lisäämisen.

Edullisia vesiliukoisia polymeerejä ovat glykolit ja amii-5 nit, esim. polyamiinit. Edullisempia ovat polyetyleeniglyko-li ia polypropyleeniglykoli. Edullisimpia ovat polyety-leeniglykolit, joiden mol.p. on 200-10000.

Vesiliukoisia polymeerejä voidaan lisätä pitoisuuksissa 1-50 10 % paino/paino, edullisesti 2-90 % paino/paino.

Keksinnön mukainen menetelmä voi käsittää lisäksi suolan lisäämisen pitoisuudessa, joka on enintään 1,5 moolia, edullisesti pitoisuudessa, joka on enintään 1,0 moolia.

15

Edullisia suoloja ovat magnesiumin, kalsiumin, natriumin, kaliumin ja ammoniumin suolat. Edullisimpia ovat suolat, joissa anioni on valittu ryhmästä kloridi, formiaatti, ase-taatti ja sulfaatti.

20

Keksinnön mukaisessa menetelmässä väkevöidyn vesiliuoksen pH, johon vesiliukoinen polymeeri on lisätty, voidaan säätää kiteyttämiselle optimaaliseksi; joissakin tapauksissa ki-teyttämisen optimi on suunnilleen entsyymin pl-tasolla.

25 Edullisessa suoritusmuodossa pH säädetään tasoon pH = pl±l.

pH: n säätämistä varten käytännöllisesti katsoen mitä tahansa ! ; * happoa tai emästä voidaan käyttää. Happo voi olla epäor gaaninen tai orgaaninen. Joitakin esimerkkejä ovat kloorive-30 tyhappo, rikkihappo, typpihappo, fosforihappo, etikkahappo, sitruunahappo ja muurahaishappo. Edullisia happoja ovat muurahaishappo, sitruunahappo ja etikkahappo. Edullinen emäs on natriumhydroksidi.

35 Keksinnön mukaisessa erityissuoritusmuodossa vesipitoiseen proteiiniseokseen lisätään suolaa pitoisuudessa, joka on 112949 10 enintään 1,5-molaarinen, edullisesti pitoisuudessa 1,0 moolia, ja liuoksen pH säädetään kiteyttämisen optimiarvoon.

Keksinnön mukainen menetelmä aiheuttaa proteiinin, erityi-5 sesti entsyymin, saostumisen kiteisessä muodossa. Kiteisen proteiinin talteenotto voidaan suorittaa tavanomaisilla menetelmillä, esim. suodattamalla ja sen jälkeen kuivaamalla, tai liuottamalla kiteet uudelleen nestemäisten proteiinituotteiden valmistusta varten.

10

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen tätä keksintöä eikä niitä ole tarkoitettu mitenkään rajoittamaan keksinnön piiriä, joita on vaadittu.

15 Esimerkki 1

Vesiliukoisen polymeerin vaikutus

Coprinus cinereuksen peroksidaasia sisältävää kasvulientä, joka oli saatu kuten EP-patenttihakemuksessa 505 311 on kuvailtu, käsiteltiin keksinnön mukaisella menetelmällä.

20

Alussa kasvuliemi saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen sentrifugoimalla. Saatiin aikaan ultrasuodos, joka sisälsi 5,5 % paino/paino kuiva-ainetta peroksidaasiproteiinia ja 2,4 % paino/paino kuiva-ainetta muita entsyymejä.

25

Polyetyleeniglykolia (PEG 4000) ja CaCl2;2^,0:a lisättiin erilaisina määrinä (vrt. kuvio 1) ja pH säädettiin arvoon pH

4,0 lisäämällä muurahaishappoa. Liuosta sekoitettiin 28° C .· ssa 24 tunnin ajan.

: 30 ; Kiteytyssaannot erilaisissa PEG- ja suolapitoisuuksissa (« 1 : % CaCi^ ; * 2 % CaCl 2 ja □ 2,5 % CaCl2) esitetään oheisessa kuviossa 1.

112949 11

Esimerkki 2 pH:n vaikutus

Coprinus cinereuksen peroksidaasia sisältävää kasvulientä, joka oli saatu kuten EP-patenttihakemuksessa 505 311 on ku-5 vailtu, käsiteltiin keksinnön mukaisella menetelmällä.

Alussa kasvuliemi saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen sentrifugoimalla. Saatiin aikaan ultrasuodos, joka sisälsi 5,5 % paino/paino kuiva-ainetta peroksidaasiproteiinia ja 10 2,4 % paino/paino kuiva-ainetta muita entsyymejä.

Tähän liuokseen lisättiin 20 % paino/paino polyetyleenigly-kolia (PEG 4000) ja 1,5 % paino/paino CaCl2;2f^0:a, ja pH säädettiin erilaisiin pH-arvoihin muurahaishapolla. Liuosta 15 sekoitettiin 28°C.-ssa 24 tunnin ajan.

Kiteytyssaannot eri pH-arvoissa esitetään oheisessa kuviossa 2 .

20 Esimerkki 3

Pitoisuuksien vaikutus

25 / Alussa kasvuliemi saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen i sentrifugoimalla. Sen jälkeen saatiin useita uitrasuodoksia, ; : jotka sisälsivät erilaisia pitoisuuksia peroksidaasiproteii nia ja muita entsyymejä.

30

Kuhunkin näistä liuoksista lisättiin 1,5 % paino/paino CaCl2;2Hp: a . Polyetyleeniglykolia (PEG 4000 ) lisättiin erilaina määrinä. pH säädettiin 4,0:ksi muurahaishapolla ja liuoksia sekoitettiin 28°C:ssa 24 tunnin ajan.

Kiteytyssaannot eri entsyymi- ja PEG-pitoisuuksissa ( 3 % peroksidaasia ja 1,4 % muita entsyymejä; #4,8 % peroksidaa- 35 112949 12 siä ja 2,3 % muita entsyymejä ja * 6,7 % peroksidaasia ja 3,1 % muita entsyymejä) esitetään oheisessa kuviossa 3.

Esimerkki 4 5 Katalaasin kiteyttäminen

Kasvulientä, joka sisälsi Scytalidium thermofilumin katalaa-sia, joka oli saatu kuten Wö 92/17571:ssä on kuvailtu, käsiteltiin tämän keksinnön mukaisella menetelmällä.

10 Alussa kasvuliemi saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen flokkuloimalla ja suodattamalla. Sen jälkeen suodos väkevoi-tiin haihduttamalla ja ultra/diasuodatuksella. Konsentraatti sisälsi 1,2 7o paino/paino kuiva-ainetta katalaasiproteiinia ja 5,5 % paino/paino kokonaiskuiva-ainetta.

15

Polyetyleeniglykolia (PEG 4000) ja CaCl2;2^,0:a lisättiin erilaisina määrinä (vrt. kuvio 4) ja pH säädettiin pH-arvoon 6,8. Liuosta sekoitettiin 28°C.-ssa 24 tunnin ajan.

20 Kiteytyssaannot erilaisissa CaCl2-pitoisuuksissa ja erilaisissa PEG 4000 -pitoisuuksissa (* 20 % PEG 4000; Φ 22 % PEG 4000; * 24 % PEG 4000; □ 26 % PEG 4000; V 28 % PEG 4000 ja ώ » 30 % PEG 4000) esitetään oheisessa kuviossa 4.

,25 Esimerkki 5 ' Katalaasin kiteyttäminen ' Kasvulientä, joka sisälsi Scytalidium thermofilumin katalaa- ' siä, joka oli saatu kuten WO 92/17571:ssä on kuvailtu, käsi teltiin tämän keksinnön mukaisella menetelmällä.

; 30

Alussa kasvuliemi saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen flokkuloimalla ja suodattamalla. Sen jälkeen suodos väkevöi-tiin haihduttamalla. Konsentraatti sisälsi 0,28 % paino/paino kuiva-ainetta katalaasiproteiinia ja 9,2 % paino/paino l 35 kokonaiskuiva-ainetta.

112949 13

Polyetyleeniglykolia (PEG 4000) ja CaCl2;2I^0:a lisättiin erilaisina määrinä (vrt. kuvio 5) ja pH säädettiin pH-arvoon 6,0-6,5. Liuosta sekoitettiin 28°C.-ssa 48 tunnin ajan.

5 Kiteytyssaannot erilaisissa CaCl2-pitoisuuksissa ja erilaisissa PEG 4000 -pitoisuuksissa ( 20 % PEG 4000 ja ♦ 25 % PEG 4000) esitetään oheisessa kuviossa 5.

Esimerkki 6 10 Katalaasin kiteyttäminen

Kasvulientä, joka sisälsi Scytalidium thermofilumin katalaa-sia, joka oli saatu kuten WO 92/17571:ssä on kuvailtu, käsiteltiin tämän keksinnön mukaisella menetelmällä.

15 Alussa kasvuliemi saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen flokkuloimalla ja suodattamalla. Sen jälkeen suodos väkevöi-tiin haihduttamalla. Konsentraatti sisälsi 0,28 % paino/pai-no kuiva-ainetta katalaasiproteiinia ja 9,2 % paino/paino kokonaiskuiva-ainetta.

20

Polyetyleeniglykolia (PEG 1500) ja CaCl2;2)^0:a lisättiin erilaisina määrinä (vrt. kuvio 6) ja pH säädettiin pH-arvoon _ 6,5-7,0. Liuosta sekoitettiin 28°C:ssa 48 tunnin ajan.

^ 25 Kiteytyssaannot erilaisissa PEG 1500 -pitoisuuksissa ja

CaCl2-pitoisuudessa 0,2 % esitetään oheisessa kuviossa 6.

Esimerkki 7

Proteaasin kiteyttäminen 30 Vil jelyalusta, joka sisälsi proteaasia (Savinasi ) Bacillus v : lentuksesta, (llS-patentti 3 723 250), käsiteltiin keksinnön ,mukaisella menetelmällä.

‘7 Alussa kasvualusta saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen ,·’ 35 f lokkuloimalla ja sentrif ugoimalla. Sen jälkeen supernatant- : ti väkevöitiin ultrasuodattamalla. Konsentraatti sisälsi 9,2 112949 14 % paino/paino kuiva-ainetta proteaasiproteiinia ja 19,6 % paino/paino kokonaiskuiva-ainetta. Johtokyky oli 1,55 mS/cm.

Polyetyleeniglykolia (PEG 4000) lisättiin erilaisina määrinä 5 (vrt. kuvio 7) ja pH säädettiin pH-arvoon 5,6. Liuosta sekoitettiin 28°C:ssa 24 tuntia.

Kiteytyssaannot erilaisissa PEG-pitoisuuksissa esitetään oheisessa kuviossa 7.

10

Esimerkki 8

Proteaasin kiteyttäminen

Viljelyalustaa, joka sisälsi proteaasia (Savinase1) Bacillus lentuksesta, (us-patentti 3 723 250), käsiteltiin keksinnön 15 mukaisella menetelmällä.

Alussa kasvualusta saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen flokkuloimalla ja sentrifugoimalla. Sen jälkeen supernatant-ti väkevöitiin ultrasuodattamalla. Konsentraatti sisälsi 9,2 20 % paino/paino kuiva-ainetta proteaasiproteiinia ja 19,6 % paino/paino kokonaiskuiva-ainetta. Johtokyky oli 1,55 mS/cm.

: .. Polyetyleeniglykolia (PEG 4000) lisättiin erilaisina määrinä : yhdessä 1,1-%,-n paino/paino kanssa CaCl2 ; 21-Jp: a ja pH säädet- \ 25 tiin pH-arvoon 5,6. Liuosta sekoitettiin 28°C:ssa 24 tuntia.

^ Kiteytyssaannot erilaisissa PEG-pitoisuuksissa esitetään oheisessa kuviossa 8.

30 Esimerkki 9

Lipaasin kiteyttäminen J Konsentraattia, joka sisälsi Pseudomonas cepaciae -lipaasia, joka oli saatu kuten EP 0 214 761:ssa on kuvailtu, käsitel tiin keksinnön mukaisella menetelmällä.

35 . Konsentraattiin, joka sisälsi 2,1 % paino/paino lipaasipro- teiinin kuiva-ainetta ja 20 % paino/paino kokonaiskuiva-ai- 112949 15 netta, lisättiin 31 % PEG 4000:a pH:ssa 7,8. Liuosta sekoitettiin 28°C:ssa 24 tunnin ajan.

Kiteytyssaanto oli sen jälkeen 47 %.

5

Esimerkki 10

Sellulaasin kiteyttäminen

Humicola insolensin sellulaasia, jota oli saatu kuten W0 91/17244:ssä on kuvailtu, tuotettiin fermentoimalla ja otet-10 tiin talteen suodattamalla, ultrasuodattamalla ja diasuodat-tamalla ionivaihdetun veden kanssa.

Väkevöidyn sellulaasiliuoksen entsyymipitoisuus oli 105 g/1, entsyymin puhtaus oli 58 % kuiva-ainepitoisuudesta ja prote-15 iinipuhtaus oli 88 %. pH oli 7,0 ja johtokyky oli 607 uS.

PEG 300:a lisättiin 39,6 g 100 g:aan sellulaasiliuosta sekoittaen. Lämpötila oli 27°C. Kahdenkymmenen tunnin kuluttua kiteet otettiin talteen sentrifugoimalla ja liuotettiin uu-20 delieen 0,5-%:iseen NaCl-liuokseen. Kidesaanto oli 83 % määritettynä entsyymiaktiivisuutena sellulaasiproteiinipuh-: taudessa 100 %.

Esimerkki 11 25 PEG/entsyymisysteemin karakterisointi

Kun PEG:a ja suolaa lisätään entsyymikonsentraattiin, run-! säästi entsyymiä sisältäviä mikropisaroita muodostuu ja ki teytyminen tapahtuu näiden pisaroiden sisällä. Kaksi faasia voidaan erottaa ultrasentrifugoinnin avulla.

30 v : Coprinus cinereuksen peroksidaasia sisältävää kasvulientä, ;··· joka oli saatu kuten EP-patenttihakemuksessa 505 311 on ku- ,··, vailtu, käsiteltiin keksinnön mukaisella menetelmällä.

35 Alussa kasvuliemi saatettiin kiinteä aine/neste-erotukseen . ' sentrifugoimalla. Saatiin aikaan ultrasuodos, joka sisälsi 5,1 7o paino/paino kuiva-ainetta peroksidaasiproteiinia. Kon- 112949 16 sentraattiin lisättiin 20 % PEG 4000 .-a ja 1,5 % paino/paino CaCl2;2Hp:a ja pH säädettiin pH-arvoon 4,0. Välittömästi sekoittamisen jälkeen liuoksessa havaittiin mikropisaroita mikroskoopin avulla. Ultrasentrifugoimalla (27000 g 15 min.) 5 voitiin erottaa kaksi faasia. Peroksidaasipitoisuus määritetään Aws-arvon avulla ja sitä verrataan A^^ssä mitattuun kokonaisproteiinipitoisuuteen. Tulokset esitetään taulukossa 1. Voidaan todeta, että peroksidaasi väkevöityy ja puhdistuu mikropisaroiden sisään.

10

Taulukko 1 A.o* A403/Ahjo KPOXU' /g

Pohjafaasi: 388 1,35 472 15 Pintafaasi: 31 0,82 33

Konsentraatti, ennen PEG:n ja suolan lisäystä:169 1,16 172

Uudelleenliuotetut kiteet 2.0 20 * )

Peroksidaasiaktiivisuuden (POKU) määrittäminen: l peroksi-; daasiyksikkö (POXU) on se entsyymimäärä, joka katalysoi 1 , umoolin vetyperoksidia muuntumisen minuutissa seuraavissa analyyttisissä olosuhteissa: 2,0 mM vetyperoksidia, 0,46 mM 25 2,2'-atsino-bis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonaattia), 0,086 M fosfaattipuskuria; pH 7,0, inkuboituna 40°C:Ssa, i : fotometrisesti mitattuna 418 nm.-ssä. 1 KPOXU = 1000 POXU: a.

Claims

17 112949

1. Menetelmä proteiinin, joka on valittu ryhmästä oksidore-duktaasi, proteaasi ja sellulaasi, erottamiseksi viljely-alustasta, tunnettu siitä, että 5 (a) aikaansaadaan vesipitoinen proteiiniseos, jonka suolapitoisuus on 1,5-molaarinen tai alempi ja johon on lisätty glykolia, ja vesipitoisen proteiiniseoksen pH säädetään optimaaliseksi kiteytymiselle, 10 (b) otetaan talteen proteiini kiteisessä muodossa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen proteiiniseos väkevöidään proteiinipi- 15 toisuuteen 0,1-25 % paino/paino, edullisemmin 0,5-15 % pai-no/paino, edullisimmin 1-10 % paino/paino.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glykoli on polyetyleeniglykoli tai polypropyleeni- 20 glykoli, edullisesti polyetyleeniglykoli.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polyetyleeniglykolin molekyylipaino on 200-10000.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että glykoli lisätään pitoisuuksissa 1-50 % paino/paino glykolia, edullisesti 2-40 % paino/paino glykolia. ·' 30 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tun- . ' nettu siitä, että suolaa lisätään vesipitoiseen proteii- V; niseokseen pitoisuudessa, joka on enintään 1,5-molaarinen, • , edullisesti pitoisuudessa, joka on enintään 1,0-molaarinen.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii- ; tä, että lisätty suola on magnesiumin, kalsiumin, natriumin, kaliumin tai ammoniumin suola. 112949

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suolan anioni on valittu ryhmästä kloridi, formi-aatti, asetaatti ja sulfaatti.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että pH säädetään pl±l:ksi.