JPH08508168A - タンパク質の分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は他の酵素を有する混合物中に酵素を含んでなる水性溶液から酵素を分離し次いで目的の酵素を結晶質の形態で回収する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の分離 技術分野 本発明は、他のタンパク質を有する混合物中に酵素を含んでなる水性溶液から 酵素を分離しそして所望の酵素を結晶形で回収する方法に関する。 背景技術 酵素は、工業的目的に対し液体又は非晶質の物質として通常提供される。液体 として提供されないときは、酵素は通常非晶質として提供される；何故なら酵素 の結晶化のための公知方法は、余りに高価であり工業的規模で用いられないとし て通常見なされている。これは結晶が非常に純粋でかつ濃厚溶液からのみ成長し 得るという仮定に起因する。実際、結晶を形成する能力は、タンパク質化学者に より高純度のタンパク質溶質の証拠としてしばしば見なされている。 高純度の酵素結晶のため、酵素の結晶化のための安価かつ簡易な方法（これは 工業的規模に容易に適合し得る）の提供は産業界において明らかに必要なことで ある。 酵素の結晶化に関し十分な文献がある。今日まで知られている結晶化方法の特 徴は、比較的純粋でかつ濃厚初期溶液、低収率、極めて長い結晶化時間、有機溶 剤を含有する化学薬品の高消費および低工業的適合性である。 低伝導率およびpI付近のpHの使用は、それ自身タンパク質の結晶化に対する新 規な方法からほど遠い。それは文献中に十分記載され ている技術でありそしてしばしば高純度のタンパク質溶液からＸ線回析のための 単結晶の製造に対してしばしば用いられる。マクファーソンは彼の書物「Prepar ation and Analysis of Protein Crystals」（ワイリー、ニューヨーク、1982） において、「Salting in」としても知られているこの技術が結晶化においてどの ように用いられるか記載している。それ以来、幾人かの他の人々がこの方法を用 いたが、精製された溶液から結晶化のためにのみであった。実際、不純物そして 特に他のタンパク質は高度に好ましくないとして報告されている（例えば、Ａ． マクファーソンEur.J.Biochem. 289，1990，１−23真参照）。従って、技術そ れ自身は新規ではないが、しかし何人もそれを他のタンパク質を有する混合物中 の酵素の精製のための精製技術としてこれまで用いてはいない。そのようなもの として極めて不純な溶液に対する驚くべき良好な適合性のためこの技術は経済的 に実行可能となり、そして例えばクロマトグラフィーの如き予備精製を必要とし ない。 結晶化と沈殿を区別することは重要であり、後者は純度の低い非晶質形を生成 する。 ヨーロッパ特許193,046において、その溶液から酵素の回収方法が開示されて いる。この方法により、酵素含有溶液は、酵素の等電点付近の範囲内のpHにおい て濃縮され過飽和となり、そして結晶化が誘起される。塩又は有機溶剤の存在は 、全ての結晶化方法に必須であると考えられてきた。前記ヨーロッパ特許193,04 6において、塩又は有機溶剤の導入は、記載された方法に対し不必要であるが、 しかし記載された実験から次の内容が明らかである；すなわちこの特許公報にお いて研究された酵素は高い塩濃度の存在下、すなわち限外濾過が真空蒸発後に行 なわれるとき、最も結晶化する。更に、該方法はアミラーゼに対してのみ適合し 、長い結晶化時間を必要と し、そして該方法は好ましくない非晶質でかつミクロ結晶質の沈殿を生じる。 発明の要約 本発明の目的は、結晶質の酵素を回収する方法を提供することであり、この方 法は塩又は有機溶剤の添加を必要とせず、そして短い結晶化時間と高収率を可能 とし、そして簡易かつ安価で、しかも工業的要求に適合し得る。 かくして、本発明は他のタンパク質を有する混合物中に酵素を含んでなる水性 溶液から酵素を分離する方法を提供し、この方法は溶液から塩を浸出し、次いで 酵素のpI付近のレベルに溶液のpHを調節し、次いで引き続き酵素を結晶質の形態 で回収することを含んでなる。 発明の詳細な開示 これまで、濃厚溶液はタンパク質結晶の生成に必須であると考えられた。しか し、今や以下の内容が見出された；すなわち飽和および過飽和は、結晶化工程前 のプロセス工程中避けるべきである；何故なら、飽和そして特に過飽和は、未制 御の条件中沈殿によるタンパク質のより好ましくない非晶質の形態の形成を助成 する。 今や驚くべきことに次の内容が見出された；すなわち本発明方法を用いること により、酵素は他のタンパク質を有するそれらの、混合物から分離し（たとえそ の混合物が他の酵素を含んでいても）、次いで目的の酵素は結晶質の形態で沈殿 する。 従って、本発明は異なる結晶化性質を有する他のタンパク質を含んでなる水性 混合物から酵素を分離する方法を提供する。この方法は溶液から塩および他の低 分子量の不純物を浸出し、これにより溶 液中の低イオン強度を得、次いで目的のタンパク質のpI付近のレベルにpHを調節 することを含んでなる。この方法により酵素は結晶質の形態で沈殿する。 本発明方法は、酵素の分離／結晶化に適用できる。しかしながら、好ましい態 様において、本発明方法は脂肪分解酵素を含有するあらゆる混合物に適用される 。 本発明方法により、１％（ｗ／ｗ）程度に低い濃度の目的リパーゼを含んでな るリポーゼ含有混合物は、結晶化により酵素分離に成功裏に委ねることができる 。加えて、総タンパク質含量の50％（ｗ／ｗ）超、好ましくは５０％（ｗ／ｗ） 未満の濃度で他のタンパク質（他の酵素を含む）を含んでなるリパーゼ含有混合 物は、結晶化により酵素分離に成功裏に委ねることができる。 脂肪分解酵素は、菌類又は細菌起源のものであってよい。好ましい態様におい て、プロセスはグルコリパーゼに適用される。他の好ましい態様において、プロ セスは酸性リパーゼ、すなわち３〜７の範囲内、より好ましくは3.5〜5.5の範囲 内のpI値を有するリパーゼに適用される。 本発明のプロセスに適当な菌類起源のリパーゼの例は、属アスペルギルス（As pergillus）（例えばＡ．ニガー（niger））；カンジダ（Candida）（例えばＣ ．アンタルクチカ（antarctica））；フミコラ（Humicola）（例えばＨ．ラヌギ ノザ（lonuginosa）およびＨ．インソレンス（insolens））；およびリゾムコー ム（Rhizomucor）（例えばＲ．マイヘイ（miehei））の構成員から得ることので きるリパーゼである。 本発明方法に適した細菌由来のリパーゼの例は、属シュドモナス（Pseudomona s）（例えばPs．セパシア（cepacia））の構成員から得ることのできるリパーゼ である。 リパーゼ含有溶液は、リパーゼ生産微生物の発酵によって得ることができる。 しかしながら、大抵の場合、リパーゼ生産生物体は例えばアスペルギルス オリ ゼ（Aspergillus oryzae）中で発現されたフミコラ（Humicola）リパーゼ又はリ ゾムコール（Rhizomucor）リパーゼの如き目的リパーゼをコードする挿入された 遺伝子を有する宿主生物体であろう（ヨーロッパ公開番号238,023および305,216 参照）。 好ましい態様において、本発明方法はリパーゼの分離に適用され、リパーゼは 培養ブロスからの細胞内又は細胞外のいずれかであってよい。培養後細胞溶解は 達成され、そして培養ブロスは遠心分離により固体／液体分離に委ねられる。 本発明方法により、塩および他の低分子量の不純物が水性溶液から浸出され、 これにより低イオン強度の溶液が得られる。これらの低分子物質は、ダイアフイ ルトレーション（diafiltration）、透析、又は電気透析、又はゲル濾過により 又はクロマトグラフィー法により、又は沈殿により除去できる。ダイアフイルト レーション、透析又は電気透析は、対象のリパーゼの分子量未満のカットオフ値 を有する膜を用いるのが好ましい。 溶液のイオン強度は、伝導計を用いて好都合に監視できる。本発明に関し、低 イオン強度は10mS／cm以下、好ましくは５mS／cm以下、最も好ましくは２mS／cm 以下のコンダクタンスによって表わされる。 低分子不純物の除去に引き続き、水性溶液のpHをリパーゼのpI±３付近の範囲 内のpH値、より好ましくはリパーゼのpI±1.5付近の範囲内のpH値、更に一層好 ましくはリパーゼのpI±１付近の範囲内のpH値、最も好ましくはリパーゼのpI± 0.5付近の範囲内のpH値に調節される。 水性溶液のpHは、実質的に酸又は塩基の使用により調節できる。酸は有機酸又 は無機酸であってよい。幾つかの例は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエ ン酸、およびギ酸である。好ましい酸はギ酸、クエン酸、又は酢酸である。 本発明方法は、１％（ｗ／ｗ）の低いリパーゼ含量を有する水性リパーゼ含有 溶液に加えられる。好ましくは、本発明方法は、５％（ｗ／ｗ）超、特に５−20 ％（ｗ／ｗ）、より好ましくは10−20％（ｗ／ｗ）のリパーゼ含量および総DS（ 乾燥物質）の10％超のリパーゼ含量、好ましくは総DSの30％のリパーゼ含量を有 する水性リパーゼ含有溶液に適用される。 本発明のより特異的態様において、常法による限外濾過コンセントレートの予 備的沈殿は、例えば硫酸ナトリウム又はアンモニウムを用い、次いでフィルター ケークの再溶解および再溶解リパーゼの限外濾過およびダイアフイルトレーショ ン（diafiltratio）および／又は希釈による塩の除去によって行うことができる 。 もしも極めて高い純度の結晶質生成物、（例えば治療適用のためのリパーゼが 望まれる場合、本発明方法はくり返され、すなわち本発明方法の結晶質目的生成 物は再溶解されそして１以上の付加的結晶化プロセスに委ねられる。 次の実施例は更に本発明を説明し、そしてそれらは権利要求される本発明の範 囲を制限するものではない。 例１ この例は、ヨーロッパ特許公開第305,216号に記載される如く得られた培養ブ ロスから得られるフミコララヌギノサ（Humicola Ianuginosa）リパーゼの分離 に適用された。 培養ブロスを遠心分離およびカットオフ値20kDを有する膜を用い 限外濾過／ダイアフイルトレーションに委ね、そして３mS／cmのコンダクタンス までダイアフィルターにかけた。ダイアフイルトレートは、13％のリパーゼ（ｗ ／ｗ）および20％の総乾燥物質（ｗ／ｗ）を含有し、このことは総乾燥物質の65 ％がリパーゼであることを意味する。pHをクエン酸で4.5に調節した。 表１に、塩の添加を含む通常の結晶化方法と比較してこの例の結果を示す。表 に測定された収率の％および純度を示す。 純度をリパーゼ活性で示す。１リバーゼ単位（LU；1000LU＝１KLU）は、乳化 剤としてガムアラビック（Gum Arabic）および基質としてトリブチリンを用い、 30.0℃，pH7.0で１分当たり１μmolの滴定可能な酪酸を遊離する酵素の量である 。 この例は本発明方法の驚くべき効果：高収率、高純度および短い結晶化時間を 実証している。 例２ この例は、ヨーロッパ特許公開第305,216号に記載される如く得 られた培養ブロスから得られるフミコララヌギノサ（Humicola lanuginosa）リ パーゼの分離に適用された。 培養ブロスを遠心分離およびカットオフ値20kDを有する膜を用い限外濾過／ダ イアフイルトレーションに委ね、そして３mS／cmのコンダクタンスまでダイアフ ィルターにかけた。ダイアフイルトレートは、11％のリパーゼ（ｗ／ｗ）および 20％の総乾燥物質（ｗ／ｗ）を含有した。pHをクエン酸で4.3に調節した。 表２に、塩の添加を含む通常の結晶化方法と比較してこの例の結果を示す。表 に測定された収率の％を示す。 この例は、本発明方法の高収率を実証する。 例３ この例は、ヨーロッパ特許公開第238,023号に記載される如く得られた培養ブ ロスから得られるリゾムコールマイヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼの分離 に適用された。 培養ブロスを遠心分離およびカットオフ値20kDを有する膜を用い限外濾過／ダ イアフイルトレーションに委ね、そして2.5mS／cmのコンダクタンスまでダイア フィルターにかけた。ダイアフイルトレートは、10％のリパーゼ（ｗ／ｗ）およ び16％の総乾燥物質（ｗ／ｗ）を含有した。pHをクエン酸で5.0に調節した。 表３に、塩の添加を含む通常の結晶化方法と比較してこの例の結果を示す。表 に測定された収率の％を示す。 この例は本発明方法の高収率および短い結晶化時間を実証している。 例４ この例は、ヨーロッパ特許公開第305,216号に記載される如く得られた培養ブ ロスから得られるフミコララヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼの分離 に適用された。 ５回の実験を行った。前記培養ブロスを遠心分離およびカットオフ値20kDを有 する膜を用い限外濾過／ダイアフイルトレーションに委ね、そして１mS／cmのコ ンダクタンスまでダイアフィルターにかけた。ダイアフイルトレートは、18％の 総乾燥物質（ｗ／ｗ）を含有した。pHをクエン酸で4.3に調節した。溶液を28℃ で20時間撹拌した。結果を下記の表４に示す。 この例は、たとえ本発明方法が低濃度のリパーゼに適用されたとしても、そし てたとえ他の酵素が比較的高濃度で存在したとしても、秀ねた収率が本発明方法 によって得られることを実証している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/40 Ｃ０７Ｋ 14/40 //(Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 パール，クリスティーネ デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト，バグスバエルト ホーベガゼ 188 イーベー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．他のタンパク質を有する混合物中に酵素を含んでなる水性溶液から酵素を 分離する方法であって、該溶液から塩を浸出し、次いで酵素のpI付近のレベルに 溶液のpHを調節し、次いで引き続き酵素を結晶質の形態で回収することを含んで なる、前記方法。 ２．ダイアフイルトレーション、透析、又は電気透析より又はゲル濾過により 、又はクロマトグラフィー法により、又は沈殿により塩を浸出する、請求の範囲 第１項記載の方法。 ３．10mS／cm以下、好ましくは５mS／cm以下最も好ましくは２mS／cm以下のコ ンダクタンスが検出可能であるまで塩を浸出する、請求の範囲第１又は２項記載 の方法。 ４．水性溶液のpHを酵素のpI±３付近の範囲内のpH値、より好ましくは酵素の pI±1.5付近の範囲内のpH値、更に一層好ましくは酵素のpI±１付近の範囲内のp H値、最も好ましくは酵素のpI±0.5付近の範囲内のpH値に調節する、請求の範囲 第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。 ５．水性溶液のpHをギ酸、クエン酸又は酢酸を用いて調節する、請求の範囲第 １〜４項のいずれか１項に記載の方法。 ６．酵素がリパーゼである、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方 法。 ７．水性リパーゼ浸有溶液が５％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは10−20％（ｗ／ ｗ）のリパーゼ含量を有しそして10％超の総乾燥物質のリパーゼ含量、好ましく は30％超の総乾燥物質のリパーゼ含量に相当する純度を有する、請求の範囲第６ 項記載の方法。 ８．リパーゼが菌類起源でありそしてアスペルギルス（Aspergillus）（例え ばＡ．ニガー（niger））の菌株、カンジダ（Candida）（ 例えばＣ．アンタルクチカ（antarctica））の菌株、フミコラ（Humicola）（例 えばＨ．ラヌギノザ（lanuginosa）およびＨ．インソレンス（insolens））の菌 株およびリゾムコーム（Rhizomucor）（例えばＲ．マイヘイ（miehei））の菌株 から得ることのできる請求の範囲第６又は７項記載の方法。 ９．リパーゼが、細菌由来のものでありそしてシュードモナス（Pseudomonas ）（例えば（Ps．セパシア（cepacia））の菌株から得ることのできる、請求の 範囲第６又は７項記載の方法。