CN1039244C - 蛋白质的分离 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从含有酶与其他蛋白质的混合物的水溶液中分离酶并以结晶形式回收所需酶的方法。

Description

蛋白质的分离
本发明涉及一种从含有一种酶及其他蛋白质的混合物的水溶液中分离这种酶并以结晶形式回收所需酶的方法。
工业用的酶通常是以液状或非结晶材料的形式提供的。如果不是以液体形式提供的，那么通常是以非结晶材料的形式提供的，因为人们通常认为已知的结晶酶的方法在工业规模生产中使用过于昂贵。这是因为人们假设晶体只能在非常纯的和高浓度的溶液中生长。实际上，蛋白质化学家们经常把形成结晶的能力看成是一种蛋白质溶液高纯度的证明。
由于酶晶体的高纯度，提供一种廉价的、简单的、在工业规模生产中易于采用的结晶酶的方法，已明显地成为一种工业上迫切需要的东西。
有大量的关于结晶酶的文献。迄今为止，已知的结晶方法的特点是需要很纯的、高浓度的起始溶液，产量低，要很长的结晶时间，对包括有机溶剂在内的化学品的大量消耗及工业适用性低。
低导电性及等电点附近PH值的使用就其本身而言对结晶蛋白质来说远非新方法。在文献中已有对该技术的很多描述，并常用于从高度提纯的蛋白质溶液中制备X线衍射所用的单晶。A.McPhcrson在他的著作《蛋白质结晶的制备及分析》(Wiley，NewYork，1982)中，描述了这种也被称为“盐析”的技术在结晶过程中如何使用。从那以后另有几人曾使用过这一方法，但也只是从提纯的溶液中结晶。实际上，经常有报道说杂质，尤其是其他的蛋白质被认为是非常不利的东西(参见Eur.J.Biochem 289，1990，第1-23页中A.MoPherson的描述)。因此，这一技术就其本身而言并非新技术，但还从未有人在以与其他蛋白质的混合物中纯化酶时使用它作为提纯技术。鉴于对非常不纯的溶液有令人惊异的适用性，使这一技术具有经济可行性，其中不需用层析等方法进行预提纯。
区别结晶与沉淀是十分重要的，后者产生纯度差的非结晶形式。
在欧洲专利193,046中公开了一种从溶液中回收酶的方法。在这种方法中，将含酶的溶液在PH值接近酶的等电点的范围内的情况下，浓缩成过饱和状态，并引发结晶。盐或有机溶剂的使用被认为是任何结晶方法所必需的。以上所说的EP193,046中声明它所描述的方法中不需使用盐及有机溶剂，但描述的实验表明，这一专利公开中所研究的酶在高浓度的盐存在时结晶最好，即在超滤后进行真空蒸发。此外，这一方法只适用于淀粉酶，需要很长的结晶时间，而且这一方法还导致形成不希望的非晶体及微晶体沉淀。
本发明的目的是提供一种回收结晶酶的方法，这一方法不需加入盐或有机溶剂，只需较短的结晶时间，有较高的产量，简单而廉价，适合工业需要。
由上所述，本发明提供一种从含有酶和其他蛋白质的混合物的水溶液中分离这种酶的方法，这一方法包括从溶液中沥滤(leach-ing ort)出盐，然后调节熔液的PH值至酶的等电点附近，然后以结晶形式回收这种酶。
迄今为止，蛋白质浓溶液被认为是产生蛋白质结晶所必需的。但现在发现，在结晶阶段前的处理阶段中，应当避免饱和及过饱和状态，因为在无控制的条件下，饱和，尤其是过饱和状态对沉淀形成不希望的非晶体形式的蛋白有利。
现令人惊奇地发现酶可从与其它蛋白质，甚至是其他酶的混合物中分离出来，所需要的酶以结晶形式沉淀。
根据以上所述，本发明提供一种从含有具有不同结晶特征的其他蛋白质的水性混合物中分离酶的方法。这一方法包括从溶液中沥滤掉盐及其他低分子量杂质，从而使溶液离子强度降低，然后调节PH值至所需蛋白的等电点附近。这一方法使酶以结晶形式沉淀。
本发明方法可应用于任何酶的分离/结晶。但在优选的具体实施方案中，本发明方法应用于脂酶。本发明方法可应用于含有脂解酶的任何混合物。
根据本发明的方法，用结晶方法可在所需脂酶的浓度低至1％(w/w)的含有脂酶的溶液中成功地进行酶分离。另外，用结晶方法可在总蛋白质含量中其他蛋白质(包括其他酶)含量占50％(w/w)以上(优选低于50％w/w)的含有脂酶的混合物中成功地进行酶分离。
脂解酶可以是真菌来源，也可是细菌来源的。在优选的具体实施方案中，这一方法应用于糖脂酶。另一具体实施方案中，这一方法应用于酸性脂酶，即等电点范围是3-7，更优选在3.5-5.5的脂酶。
适用于本发明方法的真菌来源脂酶的例子是从曲霉属(如黑曲霉)；假丝酵母属(如南极假丝酵母)；腐植霉属(如柔毛腐植霉和insolens腐植霉)；及根粘霉属(如Miehei根粘霉)获得的。
适用于本发明方法的细菌来源的脂酶是从假单胞菌属如洋葱假单胞菌)获得的。
含有脂酶的溶液通过产生脂酶的微生物发酵而获得。但多数情况下，产物脂酶的生物体是含有编码所需脂酶的插入基因的宿主生物，如在米曲霉中表达的腐植霉脂酶或根粘霉脂酶(参见EP专利公开No.238,023和305,216)。
在优选的具体实施方案中，本方法用于从培养液中分离脂酶，脂酶既可是细胞内的，也可是细胞外的。经过培养后，可进行细胞溶解并且培养液通过离心进行固/液相分离。
根据本发明方法，盐及其他低分子量杂质从水溶液中沥滤去除，从而得到低离子强度的溶液。这些低分子量物质可通过透滤、透析或电透析或凝胶过滤或层析或沉淀方法去除。透滤，透析、或电透析是优选方法，使用临界值低于要分离的脂酶的分子量的膜。
溶液的离子强度可用电导计很方便地监测。根据本发明，低离子强度表示电导率为10mS/cm或更小，优选值为5mS/cm或更小，最优值为2mS/cm或更小。
去除低分子量杂质后，调节溶液PH值至脂酶的等电点±3的范围内，优选范围为脂酶等电点±1.5，更优选的范围为脂酶等电点±1，最优范围为脂酶等电点±0.5。
实际上，水溶液的PH值可用任何酸或碱来调节。酸可是有机酸或无机酸，如盐酸、硫酸、亚硝酸，磷酸、醋酸、柠檬酸和甲酸。优选的酸是甲酸、柠檬酸或醋酸。
本发明的方法可用于脂酶含量低至1％(w/w)的合有脂酶的水溶液。应用本发明时，优选的含有脂酶的水溶液的脂酶含量为高于5％(w/w)，尤其是5-20％(w/w)，更加优选的是10-20％(w/w)，脂酶含量高于干物质总量的10％，优选高于干物质总量的30％。
在本发明的一个更具体实施方案中，对超滤浓缩液的预沉淀可用传统方式进行，如用硫酸钠或硫酸铵，然后重新溶解滤饼，对重新溶解的脂酶进行超滤，并任选地用透滤和/或稀释方法去除盐。
如果需高纯度的结晶产品，如治疗用的脂酶，可重复本发明的方法，即将通过本发明的方法得到的结晶产品重新溶解，并再进行一次或多次结晶过程。
以下实施例对本发明做了进一步描述，但并不想对所要求的本发明范围做任何限制。
                     实施例1
本例说明本发明的方法应用于从按欧洲专利公开305,216描述的方法获得的培养液中分离柔毛腐植霉脂酶。
培养液通过离心并用临界值20KD的膜进行超滤/透滤，并透滤至电导率3mS/cm。透滤液中所含脂酶的量为13％(w/w)，含干物质20％(w/w)，即干物质的65％为脂酶，用柠檬酸将PH值调至4.5。
表1对比了本例与一种传统的用盐的结晶方法的结果，此表表示产率(％)及纯度的测量结果。
纯度用脂酶活力来表达。一脂酶单位(LU；1000LU＝IKLU)是在30℃，PH7.0用阿拉伯胶敞乳化剂三丁酸甘油酯做底物时每分钟可释放1μmol可滴定丁酸的酶量。
                表    1
                       结晶时间             纯度15h(25℃) 15h(25℃)添加物                   +48h(5℃) KLU/A280·KLU/A440
  无               90％       -         3.8      8051％Na2SO4 (1   14％      85％       3.2      6803％Na2SO4 (2   12％      79％       3.2      6503％甲酸钠(3      8％      71％       3.1      660
(1 1％Na2SO4＝13mS/cm
(2 3％Na2SO4＝31mS/cm
(3 3％甲酸钠＝15mS/cm
本例说明了本发明方法的令人惊异的效果：高产，高纯度，结晶时间短。
                        实施例2
本例说明用本方法从按欧洲专利公开305,216中所述方法获得的培养液中分离柔毛腐植霉脂酶。
对培养液进行离心，并用临界值20KD的膜进行超滤/透滤，透滤至电导率为3mS/cm。透滤液中含11％(w/w)脂酶及20％的总干物质(w/w)。用柠檬酸调节PH值至4.3。
表2表明该例与传统的使用盐类的结晶方法的对比结果，表中表明了产率(％)。
       表    2
                     结晶时间添加物              21h(25℃)
    无                    80％8％(NH4)2S04 (1    40％12％(NH4)2SO4 (2   40％18％(NH4)2SO4 (3   32％9％Na2SO4 (4        43％
(1  8％(NH4)2SO4＝92mS/cm
(2 12％(NH4)2SO4＝126mS/cm
(3 18％(NH4)2SO4＝165mS/cm
(4  9％Na2SO4    ＝71mS/cm
本例说明了本发明方法的高产率。
                    实施例3
本例说明用本方法从按欧洲专利公开238,023中所述方法制得的培养液中分离Miehei根粘霉脂酶。
培养液经过离心，并用临界值20KD的膜进行超滤/透滤，透滤至电导率2.5mS/cm。透滤液中含10％脂酶(w/w)及16％的总干物(w/w)。用柠檬酸调节PH值至5.0。
表3表示与传统的加盐的结晶方法对比的本例的结果。表中用百分率表明产率。
                    表    3
                结晶时间4h(25℃)  4h(25℃)添加物            2h(25℃) 4h(25℃)  +21h(5℃) +96h(5℃)
    无                 70％    70％       70％     70％2％(NH4)2SO4 (1    -      35％       70％     70％4％(NH4)2SO4 (2    -      11％       45％     68％7％(NH4)2SO4 (3    -      3％         6％     20％10％(NH4)2SO4 (4    -      -         ＜3％      5％
(1  2％(NH4)2SO4＝ 28mS/cm
(2  4％(NH4)2SO4＝ 54mS/cm
(3  7％(NH4)2SO4＝ 83mS/cm
(4 10％(NH4)2SO4＝108mS/cm
本例说明了本发明的高产率及较短的结晶时间。
              实施例4
本例说明本发明方法应用干按欧洲专利公开305,216中的描述获得的柔毛腐植霉脂酶。
进行了5次实验。上述培养液经过离心并用临界值20KD的膜进行超滤，并透滤至电导率1mS/cm。透滤液中含18％总干物。用甲酸调节PH值至4.3。溶液在28℃搅拌20小时。结果见表4。
                表    4
  脂酶(％)  其他酶(％)  总干物质(％) 结晶收率(％)*(w/w)      (w/w)        (w/w)
    9.4        3.2          18            728.6        3.8          18            718.3        4.3          18            687.4        4.8          18            637.1        5.3          18            61
*  结晶收率
本例说明即使在脂酶浓度很低时，甚至含有浓度相当的其他酶时，应用本发明方法仍可获得非常高的收率。

Claims (12)

1.一种从混合蛋白的溶液以结晶形式获得目的酶的方法，所述方法包括：
(a)从所述溶液形成一种低离子强度溶液，其中所述低离子强度溶液的电导率为10mS/cm或更小；
(b)调节(a)步的低离子强度溶液的pH至目的酶的pI±3范围内，其中所述酶结晶；和
(c)收集结晶形式的目的酶。
2.权利要求1的方法，其中通过透滤、透析、电透析、凝胶过滤、层析或沉淀方法除去所述溶液中存在的盐形成所述低离子强度溶液。
3.权利要求1的方法，其中所述低离子强度溶液的电导率为5mS/cm或更小。
4.权利要求3的方法，其中所述低离子强度溶液的电导率为2mS/cm或更小。
5.权利要求1的方法，其中所述pH值被调节至酶的等电点±1.5的范围内。
6.权利要求5的方法，其中所述pH值被调至酶的等电点±0.5的范围内。
7.权利要求1的方法，其中所述目的酶是脂酶。
8.权利要求7的方法，其中所述溶液中所述脂酶的浓度范围为1-20％(w/w)。
9.权利要求7的方法，其中所述脂酶占所述溶液中总干物质的10％以上。
10.权利要求7的方法，其中所述脂酶是真菌脂酶或细菌脂酶。
11.权利要求10的方法，其中所述真菌脂酶是从曲霉属的菌株，假丝酵母属的菌株，腐植霉属的菌株或根粘霉属的菌株分离到的。
12.权利要求10的方法，其中细菌脂酶是从假单胞菌属的菌株分离到的。
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