KR20230161522A - 신규 베타-락토글로불린 제제의 제조 및 관련 방법, 용도 및 식료품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단리된 베타-락토글로불린 조성물 및/또는 결정화된 베타-락토글로불린을 함유하는 조성물의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규 베타-락토글로불린 조성물, 이러한 조성물의 용도 및 이러한 조성물을 포함하는 식료품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 단리된 베타-락토글로불린 조성물 및/또는 결정화된 베타-락토글로불린을 함유하는 조성물의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규 베타-락토글로불린 조성물, 이러한 조성물의 용도 및 이러한 조성물을 포함하는 식료품에 관한 것이다.
우유 단백질 분별의 개념은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 지난 수십년 동안 각각 특정 특성 및 특징을 갖는 다양한 우유 단백질 종이 풍부한 조성물을 제조하기 위한 다수의 기술로 개발되어 왔다.
유청 또는 유장으로부터 베타-락토글로불린(BLG)의 단리는 다수의 간행물의 주제이며, 통상적으로 다수의 분리 단계 및 종종 정제된 베타-락토글로불린 생성물에 이르기 위한 크로마토그래피 기법을 포함한다.
예를 들어, de Jongh외 다수(Mild Isolation Procedure Discloses New Protein Structural Properties of β-Lactoglobulin, J Dairy Sci., vol. 84(3), 2001, pages 562-571)는 카제인을 저온 산 응고시키고, 수득된 산 유장에 친화 크로마토그래피(DEAE 세파로스) 및 겔 투과 크로마토그래피의 조합을 수행함으로써 새롭게 착유된 우유로부터 BLG를 정제하는 것을 기재하였다. 수득된 BLG 조성물은 단백질 1 g 당 0.985 g의 베타-락토글로불린을 함유하는 것으로 언급되었다.
Slack외 다수(Journal of Food Processing and Preservation, vol. 10, 1986, pages 19-30)는 상이한 접근법을 탐구하고, 탈염된 산 유장 및 감미 유장을 pH 4.65로 pH 조정하고, 형성된 침전물을 원심 분리 및 디캔테이션에 의해 분리함으로써 BLG-풍부 침전물을 제조하였다. 수득된 침전물 펠렛은 비교적 불용성인 것으로 기재되었으며, 추가의 BLG에 상당량의 단백질 불순물을 함유하였다. 결정 형성이 관찰되지 않았다. pH 4.65에서 형성될 수 있는 BLG 침전물은 BLG 결정이 아니라는 것을 주목하여야 한다.
Palmer(Crystalline Globulin from Cow's Milk, J. Biol. Chem., Vol. 104, 1934, pages 359-372)는 원하지 않는 단백질의 염 침전, pH-조정, 및 기타 다른 원하지 않는 단백질을 제거하기 위한 투석의 몇 가지 시퀀스들을 사용하여 산 유장을 기재로 하는 단백질 결정을 제조하는 것은 힘들고 시간 소모적인 공정이라고 보고하였다. 마지막으로, 고도로 정제된 BLG 용액이 수득되었을 때, BLG가 결정화되었다. 공정은 12일 초과 동안 지속되고, 톨루엔의 첨가를 필요로 하였다. 따라서 Palmer에 개시된 절차는 안전한 식품 제조와 양립할 수 없으며, 분명하게 식용될 수 없는 생성물을 제공한다.
Aschaffenburg외 다수(Improved Method for the Preparation of Crystalline beta-Lactoglobulin and alpha-Lactalbumin from Cow's Milk, Bioch., vol. 65, 1957, pages 273-277)는 Palmer 공정의 공정에 대해 개선된 공정을 개시하며, 이러한 개선은 몇 주 대신 대략 며칠 동안 베타-락토글로불린 결정을 제조할 수 있게 한다. 그러나, 개선된 방법은 여전히 결정화 전에 원하지 않는 단백질의 제거를 필요로 하고, 또한 결정화를 위하여 톨루엔을 사용하며, 이것은 안전한 식품 제조와 양립할 수 없게 한다.
JP H10 218755 A에는 활성 성분으로서 BLG를 포함하는 멜라닌-생성 억제제를 함유하는 화장품 조성물의 제조가 개시되어 있다. 또한, 상기 문헌은, 예를 들어 BLG가, 염산을 우유에 첨가하여 카제인을 침전시킨 후, 여과하여 유장을 수득하는 공정에 의해 단리될 수 있다고 제안한다. 유장의 pH를 6.0으로 조정하고, 암모늄 설페이트를 반 포화 양으로 첨가하고; 침전된 단백질을 염석에 의해 제거하고, 여액을 회수한다. 여액을 암모늄 설페이트로 포화시키고, 침전된 단백질을 회수한다. 회수된 단백질을 다시 물에 용해시키고, pH 5.2에서 투석하여 결정을 분리하고, β-락토글로불린이 유장 1 L로부터 약 1.8 g의 비율로 제조된다. 그러나, JP H10 218755 A에 기재된 제안된 방법의 일반적인 공정 단계는 BLG 결정 형성을 이끌기에는 불충분하다. 따라서, 상기 문헌은 BLG의 결정화 또는 BLG 결정에 대한 가능한 개시 내용을 함유하고 있지 않다.
US 2,790,790에는 용액으로부터 단백질의 침전 방법, 및 보다 구체적으로는 침전제로서 나트륨 클로라이드를 사용하여 수용액으로부터 비교적 비공액화된 단백질의 분별 침전이 개시되어 있다. 상기 방법은 pH 3.6 내지 3.8에서 NaCl-유도 침전에 의해 BLG를 단리시키는 데 유용한 것으로 제안되어 있다. 상기 문헌의 실시예 II에서, NaCl-침전물을 일반적인 방식으로 투석하여 결정질 B-락토글로불린을 형성할 수 있다고 시사하고 있다. 그러나, US 2,790,790은 pH 3.6 내지 3.8에서 BLG 결정의 형성이 실제로 가능하다는 것을 입증하지 않으며, BLG 침전물의 투석의 "일반적인 방식"의 의미에 대한 언급을 함유하고 있지 않다. 따라서, 상기 문헌은 BLG의 결정화 또는 BLG 결정에 대한 가능한 개시 내용을 함유하고 있지 않다.
우연히, 본 발명자들은 고도로 순수한 BLG 결정이 유기 용매, 예컨대 톨루엔의 사용없이 BLG 이외에 상당한 양의 기타 다른 유장 단백질을 함유하는 조 유장 단백질 용액에서 직접 제조될 수 있다는 놀라운 발견을 하였다. 이것은 단백질이 그것을 결정화할 수 있기 전에 고도로 정제되어야 하며, 모든 단백질이 결정화될 수 있는 것은 아니라고 교시한 당업계의 통상적인 일반 지식과 상충되는 것이다.
이러한 발견은 낙농업에서 유장 단백질을 취급 및 분별하는 방식을 바꿀 수 있다는 잠재력을 가지며, 식품 성분으로서 사용하기에 안전한 고도로 정제된 BLG의 효율적이고 완만한 제조가 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 일 양태는
a) BLG 및 적어도 1종의 추가의 유장 단백질을 포함하는 유장 단백질 용액을 제공하고, 상기 유장 단백질 용액은 BLG에 대해 과포화되고, 5 내지 6 범위의 pH를 갖는 것인 단계,
b) 과포화된 유장 단백질 용액에서 BLG를 결정화시키는 단계, 및
c) 선택적으로, 잔류 유장 단백질 용액으로부터 BLG 결정을 분리하는 단계
를 포함하는, 베타-락토글로불린(BLG)을 결정화된 및/또는 단리된 형태로 포함하는 식용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명자들은 BLG 결정을 함유하는 분말 형태의 식용 유장 단백질 조성물이 선행 기술의 비교용 조성물보다 상당히 더 높은 벌크 밀도를 갖는다는 것을 발견하였다. 이것은 그것이 분말의 취급을 용이하게 하고, 먼지를 덜 일으키므로 유리하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 예를 들어 본원에 기재된 하나 이상의 방법에 의해 수득가능한, 베타-락토글로불린을 결정화된 및/또는 단리된 형태로 포함하는 식용 조성물에 관한 것이다. 식용 조성물은, 예를 들어 BLG 결정을 함유하고, 적어도 0.40 g/mL의 벌크 밀도를 갖는 분말일 수 있다. 대안적으로, 식용 조성물은 BLG 결정을 함유하는 액체 현탁액 또는 슬러리일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "BLG 결정"을 포함하는 건조 생성물, 예를 들어 분말은 BLG 결정의 현탁액의 건조로부터 수득된 생성물을 함유하고, 습윤 BLG 결정의 결정 구조는 건조 공정 동안 왜곡될 수 있고, 적어도 부분적으로 그의 x-선 회절 특징을 손실할 수 있다. 같은 방식으로, 용어 "건조 BLG 결정" 및 "건조된 BLG 결정"은 습윤 BLG 결정의 건조로부터 수득된 입자를 의미하고, 이러한 건조 입자는 결정 구조 그 자체를 가질 필요가 없다. 그러나, 본 발명자들은 건조된 BLG 결정이 2부의 물 대 1부의 건조된 BLG 결정의 중량비로 차가운(4℃) 탈염수에 재현탁될 때, BLG 결정이 재수화되고, 건조 전과 실질적으로 동일한 결정 구조(공간군-유형 및 단위 격자 치수)를 재개한다는 것을 알게 되었다.
BLG는 예를 들어 류신을 포함하는 필수 아미노산의 중요한 공급원인 것으로 널리 공지되어 있으며, 따라서 본 발명에 의해 제공되는 식용 BLG 조성물은 몇 가지 흥미로운 영양학적 용도를 갖는다.
본 발명의 추가의 양태는 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68(±5%) Å, b = 68.68(±5%) Å 및 c = 156.65(±5%) Å을 갖는 단리된 BLG 결정에 관한 것이며; 여기서 결정은 단위 격자 필수(integral) 각 α=90°, β=90°, 및 γ=90°를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태는 식품 성분으로서 본원에 정의된 식용 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 정의된 식용 조성물 및 지방 공급원 및/또는 탄수화물 공급원을 포함하는 식료품에 관한 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 일 양태는
a) BLG 및 적어도 1종의 추가의 유장 단백질을 포함하는 유장 단백질 용액을 제공하고, 상기 유장 단백질 용액은 BLG에 대해 과포화되고 5 내지 6 범위의 pH를 갖는 것인 단계,
b) 과포화된 유장 단백질 용액에서 BLG를 결정화시키는 단계, 및
c) 선택적으로, 잔류 유장 단백질 용액으로부터 BLG 결정을 분리하는 단계
를 포함하는, 베타-락토글로불린(BLG)을 결정화된 및/또는 단리된 형태로 포함하는 식용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "식용 조성물"은 식품 성분으로서 인간의 소비 및 사용에 안전하고, 문제가 되는 양의 독성 성분, 예컨대 톨루엔 또는 기타 다른 원하지 않는 유기 용매를 함유하지 않는 조성물에 관한 것이다. BLG는 소 유장 및 유청에서 가장 우세한 단백질이고, 몇 가지 유전 변이체로 존재하며, 소 젖에서 주요한 것은 A 및 B로 표지된다. BLG는 리포칼린 단백질이고, 다수의 소수성 분자를 결합할 수 있으며, 이는 그의 운반에 있어서의 역할을 시사한다. 또한, BLG는 사이드로포어를 통해 철을 결합할 수 있는 것으로 나타났으며, 병원균의 퇴치에 역할을 할 수 있다. BLG의 동족체는 인간의 모유에서 결핍되어 있다.
소 BLG는 약 18.3 내지 18.4 kDa의 분자량을 갖는 약 162개의 아미노산 잔기의 비교적 소형 단백질이다. 생리학적 조건하에, 그것은 우세하게는 이량체이지만, NMR을 사용하여 측정된 바와 같이 그의 천연 상태를 보존하면서 약 pH 3 미만에서 단량체로 해리된다. 역으로, BLG는 또한 다양한 자연 조건하에 사량체, 팔량체 및 기타 다른 다중 결합 응집 형태로 존재한다.
BLG 용액은 본래의 구조가 충분히 불안정하여 응집을 허용할 때 다양한 조건하에 겔을 형성할 수 있다. 낮은 pH 및 낮은 이온 강도에서 장시간의 가열하에, 투명한 '미세 가닥(fine-stranded)' 겔이 형성되며, 여기서 단백질 분자는 긴 뻣뻣한 섬유로 조립된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "BLG" 또는 "베타-락토글로불린"은 예를 들어 천연 및/또는 글리코실화된 형태의 포유동물 종으로부터의 BLG에 관한 것이고, 천연 발생 유전 변이체를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "결정"은 구성 성분(예컨대, 원자, 분자 또는 이온)이 고도로 정돈된 미세 구조로 배열되어 모든 방향으로 연장되는 결정 격자를 형성하는 고체 물질에 관한 것이다. BLG 결정은 주로 고도로 정돈된 미세 구조로 배열되어 모든 방향으로 연장되는 결정 격자를 형성하는 BLG를 함유하는 단백질 결정이다. BLG 결정은, 예를 들어 모놀리식 또는 다결정질일 수 있고, 예를 들어 온전한 결정, 결정의 단편 또는 이들의 조합일 수 있다. 결정의 단편은, 예를 들어 가공 처리 동안 온전한 결정에 기계적 전단을 수행할 때 형성된다. 또한, 결정의 단편은 결정의 고도로 정돈된 미세 구조를 갖지만, 온전한 결정의 편평한 표면 및/또는 편평한 엣지 또는 모서리가 결핍될 수 있다. 예를 들어, 다수의 온전한 BLG 결정의 예에 대한 도 18 및 BLG 결정의 단편의 예에 대한 도 13을 참조한다. 두 경우에서, BLG 결정 또는 결정 단편은 광학 현미경을 사용하여 윤곽이 분명한 치밀한 일관된 구조로서 시각적으로 식별될 수 있다. BLG 결정 또는 결정 단편은 종종 적어도 부분적으로 투명하다. 또한, 단백질 결정은 복굴절성인 것으로 공지되어 있고, 이러한 광학 특성을 사용하여 미공지 입자가 결정 구조를 갖는 것으로 식별될 수 있다. 반면, 비결정질 BLG 응집체는 윤곽이 불량하고 불투명하며, 불규칙한 크기의 개방형 또는 다공성 덩어리로서 보인다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "결정화하다"는 단백질 결정의 형성에 관한 것이다. 결정화는, 예를 들어 자발적으로 일어나거나, 결정화 시드(seed)의 첨가에 의해 개시될 수 있다.
식용 조성물은 BLG를 결정화된 및/또는 단리된 형태로 포함한다. BLG를 단리된 형태로 포함하는 식용 조성물은 총 고체에 대해 적어도 80%(w/w)의 BLG를 포함한다. BLG를 결정화된 형태로 포함하는 식용 조성물은 적어도 일부의 BLG 결정 및 바람직하게는 상당량의 BLG 결정을 포함한다.
BLG 결정은 종종 현미경 관찰에 의해 관찰될 수 있고, 심지어 육안으로 볼 수 있을 정도의 크기에 이를 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "과포화된" 또는 "BLG에 대해 과포화된" 액체는 주어진 물리적 및 화학적 조건에서 상기 액체 중 BLG의 포화점 초과인 용해된 BLG의 농도를 함유한다. 용어 "과포화된"은 결정화 분야에 널리 공지되어 있고(예를 들어, 문헌[Gerard Coquerela, "Crystallization of molecular systems from solution: phase diags, supersaturation and other basic concepts", Chemical Society Reviews, p. 2286-2300, Issue 7, 2014] 참조), 과포화는 다수의 상이한 측정 기법에 의해(예를 들어, 분광학 또는 입자 크기 분석에 의해) 측정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, BLG에 대해 과포화는 하기 절차에 의해 측정된다.
특정 세트의 조건에서 액체가 BLG에 대해 과포화되는지의 여부를 시험하기 위한 절차:
a) 시험될 액체의 50 ml의 샘플을 115 mm의 높이, 25 mm의 내직경 및 50 mL의 용량을 갖는 원심분리기 관(VWR 카탈로그 번호 525-0402)으로 옮긴다. 단계 a) 내지 h) 동안 액체의 원래의 물리적 및 화학적 조건에서 샘플 및 그의 후속 분획을 조심스럽게 유지시켜야 한다.
b) 샘플을 3000 g에서 3.0분 동안 최대 30초의 가속 및 최대 30초의 감속으로 즉시 원심분리한다.
c) 원심 분리 직후, 가능한 한 많은 상청액을 (펠렛이 형성될 경우 펠렛을 방해하지 않고) 제2 원심분리기 관(단계 a에서와 동일한 유형)으로 옮긴다.
d) 상청액의 0.05 mL의 서브샘플(서브샘플 A)을 취한다.
e) 최대 200 미크론의 입자 크기를 갖는 10 mg의 BLG 결정(총 고체에 대해 적어도 98% 순수 BLG)을 제2 원심분리기 관에 첨가하고, 혼합물을 교반한다.
f) 제2 원심분리기 관을 60분 동안 원래 온도에서 정치시킨다.
g) 단계 f) 직후, 제2 원심분리기 관을 500 g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상청액의 또 다른 0.05 mL의 서브샘플(서브샘플 B)을 취한다.
h) 존재할 경우, 단계 g)의 원심 분리 펠렛을 회수하고, 그것을 밀리큐 워터 (milliQ water)에 재현탁시키고, 즉시 현미경 관찰에 의해 육안으로 볼 수 있는 결정의 존재에 대해 현탁액을 조사한다.
i) 실시예 9.9에 개괄된 방법을 사용하여 서브샘플 A 및 B에서 BLG의 농도를 측정한다 - 결과는 서브샘플의 총 중량에 대한 %의 BLG w/w로서 표현된다. 서브샘플 A의 BLG의 농도는 CBLG, A로 칭해지고, 서브샘플 B의 BLG의 농도는 CBLG, B로 칭해진다.
j) cBLG, B가 cBLG, A보다 낮을 경우 및 결정이 단계 i)에서 관찰될 경우, 단계 a)의 샘플이 취해진 액체가 과포화되었다(특정 조건에서).
본 발명의 맥락에서, 용어 "액체" 및 "용액"은 액체 및 고체 또는 반고체 입자, 예컨대 단백질 결정 또는 기타 다른 단백질 입자의 조합을 함유하는 조성물을 포함한다. 따라서, "액체" 또는 "용액"은 현탁액 또는 심지어 슬러리일 수 있다. 그러나, "액체" 및 "용액"은 바람직하게는 펌프로 퍼낼 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 방법은 단계 c)의 분리를 함유하지 않고, BLG 결정 및 추가의 유장 단백질 둘 다를 포함하는 식용 조성물을 제공한다. 이러한 변법이 단계 f)의 건조를 더 포함할 경우, 그것은 BLG 결정 및 추가의 유장 단백질, 즉 WPC 또는 WPI를 함유하고, 여기서 BLG의 적어도 일부분이 BLG 결정의 형태로 존재하는 건조 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 방법은 단계 a), b) 및 f)를 직접적인 시퀀스로 함유한다.
유장 단백질 공급물이 유장 단백질 농축물(WPC), 유장 단백질 단리물(WPI), 혈청 단백질 농축물(SPC) 또는 혈청 단백질 단리물(SPI)일 경우, 상기 방법의 변법은 WPC, WPI, SPC, 또는 SPI를 액체 또는 건조 형태로 제조할 수 있게 하며, 여기서 BLG의 적어도 일부는 결정 형태이다.
용어 "유장 단백질 농축물" 및 "혈청 단백질 농도"는 총 고체에 대해 20 내지 89%(w/w)의 단백질의 총량을 함유하는 건조 또는 수성 조성물에 관한 것이다.
WPC 또는 SPC는 바람직하게는 다음을 함유한다:
총 고체에 대해 20 내지 89%(w/w)의 단백질,
총 단백질에 대해 15 내지 70%(w/w)의 BLG,
총 단백질에 대해 8 내지 50%(w/w)의 ALA, 및
단백질에 대해 0 내지 40%(w/w)의 CMP.
대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는, WPC 또는 SPC는 다음을 함유할 수 있다:
총 고체에 대해 20 내지 89%(w/w)의 단백질,
총 단백질에 대해 15 내지 90%(w/w)의 BLG,
총 단백질에 대해 4 내지 50%(w/w)의 ALA, 및
단백질에 대해 0 내지 40%(w/w)의 CMP.
바람직하게는, WPC 또는 SPC는 다음을 함유한다:
총 고체에 대해 20 내지 89%(w/w)의 단백질,
총 단백질에 대해 15 내지 80%(w/w)의 BLG,
총 단백질에 대해 4 내지 50%(w/w)의 ALA, 및
단백질에 대해 0 내지 40%(w/w)의 CMP.
보다 바람직하게는 WPC 또는 SPC는 다음을 함유한다:
총 고체에 대해 70 내지 89%(w/w)의 단백질,
총 단백질에 대해 30 내지 90%(w/w)의 BLG,
총 단백질에 대해 4 내지 35%(w/w)의 ALA, 및
단백질에 대해 0 내지 25%(w/w)의 CMP.
용어 "유장 단백질 단리물" 및 "혈청 단백질 단리물"은 총 고체에 대해 90 내지 100%(w/w)의 단백질의 총량을 함유하는 건조 또는 수성 조성물에 관한 것이다.
WPI 또는 SPI는 바람직하게는 다음을 함유한다:
총 고체에 대해 90 내지 100%(w/w)의 단백질,
총 단백질에 대해 15 내지 70%(w/w)의 BLG,
총 단백질에 대해 8 내지 50%(w/w)의 ALA, 및
총 단백질에 대해 0 내지 40%(w/w)의 CMP.
대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는, WPI 또는 SPI는 다음을 함유할 수 있다:
총 고체에 대해 90 내지 100%(w/w)의 단백질,
총 단백질에 대해 30 내지 95%(w/w)의 BLG,
총 단백질에 대해 4 내지 35%(w/w)의 ALA, 및
총 단백질에 대해 0 내지 25%(w/w)의 CMP.
보다 바람직하게는 WPI 또는 SPI는 다음을 함유할 수 있다:
총 고체에 대해 90 내지 100%(w/w)의 단백질,
총 단백질에 대해 30 내지 90%(w/w)의 BLG,
총 단백질에 대해 4 내지 35%(w/w)의 ALA, 및
총 단백질에 대해 0 내지 25%(w/w)의 CMP.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 방법은 BLG 결정, 예를 들어 단계 c)로부터 수득된 분리된 BLG 결정을 세척하는 단계 d)를 더 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 방법은 BLG 결정, 예를 들어 단계 c) 또는 d)로부터 수득된 BLG 결정을 재결정화시키는 단계 e)를 더 포함한다.
방법은, 예를 들어 단계 a), b), c), d), 및 e)를 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 방법은 단계 a), b), c), 및 e)를 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서, 방법은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물을 건조시키는 단계 f)를 더 포함한다.
방법은, 예를 들어 단계 a), b), 및 f)를 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다.
대안적으로, 방법은 단계 a), b), c) 및 f)를 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다.
대안적으로, 방법은 단계 a), b), c), d) 및 f)를 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다.
대안적으로, 방법은 단계 a), b), c), d), e) 및 f)를 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 단계 a)는 BLG 및 적어도 추가의 유장 단백질을 포함하는 유장 단백질 용액을 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "유장 단백질"은 유장 또는 유청에서 발견되는 단백질에 관한 것이다. 유장 단백질 용액의 유장 단백질은 유장 또는 유청에서 발견되는 단백질 종의 서브세트이거나, 유장 및/또는 유청에서 발견되는 단백질 종의 완전한 세트일 수 있다. 그러나, 유장 단백질 용액은 항상 BLG를 함유한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "추가의 단백질"은 BLG가 아닌 단백질을 의미한다. 유장 단백질 용액에 존재하는 추가의 단백질은 통상적으로 유청 또는 유장에서 발견되는 1종 이상의 비-BLG 단백질을 포함한다. 이러한 단백질의 비제한적인 예는 알파-락트알부민, 소 혈청 알부민, 면역글로불린, 카제이노-마크로펩티드(CMP), 오스테오폰틴, 락토페린 및 우유 지방구 피막 단백질이다.
따라서, 유장 단백질 용액은 바람직하게는 알파-락트알부민, 소 혈청 알부민, 면역글로불린, 카제이노마크로펩티드(CMP), 오스테오폰틴, 락토페린, 우유 지방구 피막 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 추가의 유장 단백질을 함유할 수 있다.
알파-락트알부민(ALA)은 거의 모든 포유동물 종의 젖에 존재하는 단백질이다. ALA는 락토스 합성효소(LS) 헤테로다이머의 조절 서브유닛을 형성하고, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(베타4Gal-T1)는 촉매 성분을 형성한다. 이러한 단백질은 함께 LS가 갈락토스 모이어티(moiety)를 글루코스로 이동시킴으로써 락토스를 생성할 수 있게 한다. 멀티머로서, 알파-락트알부민은 칼슘 및 아연 이온을 강하게 결합시키고, 살균성 또는 항종양 활성을 가질 수 있다. 베타-락토글로불린과 주요 구조적 차이점 중 하나는 ALA가 공유 결합 응집 반응을 위한 출발점으로 작용할 수 있는 임의의 자유 티올 기를 갖지 않는다는 것이다. 결과적으로, 순수 ALA는 변성 및 산성화시 겔을 형성하지 않을 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "ALA" 또는 "알파-락트알부민"은 예를 들어 천연 및/또는 글리코실화된 형태의 포유동물 종으로부터의 알파-락트알부민에 관한 것이며, 천연 발생 유전 변이체를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 최대 10%(w/w)의 카제인, 바람직하게는 단백질의 총량에 대해 최대 5%(w/w), 보다 바람직하게는 최대 1%(w/w), 훨씬 더 바람직하게는 최대 0.5%의 카제인을 포함한다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액은 임의의 검출가능한 양의 카제인을 함유하지 않는다.
용어 "유청"은 카제인 및 우유 지방 입자가 예를 들어 미세여과 또는 대형 세공 한외여과에 의해 우유로부터 제거될 때 남아 있는 액체에 관한 것이다. 유청은 또한 "이상적인 유장"으로서 칭해질 수 있다.
용어 "유청 단백질" 또는 "혈청 단백질"은 유청에 존재하는 단백질에 관한 것이다.
용어 "유장"은 우유의 카제인이 침전 및 제거된 후 남아있는 액체 상청액에 관한 것이다. 카제인 침전은, 예를 들어 우유의 산성화 및/또는 레닛 효소의 사용에 의해 수행될 수 있다.
몇 가지 유형의 유장, 예컨대 카제인의 레닛-기재 침전에 의해 생성된 유장 생성물인 "감미 유장", 및 카제인의 산-기재 침전에 의해 생성된 유장 생성물인 산 유장" 또는 "사워(sour) 유장"이 존재한다. 카제인의 산-기재 침전은, 예를 들어 식품 산의 첨가 또는 박테리아 배양에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 5%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 10%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 15%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함한다.
훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 20%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 가장 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 30%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 1%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 2%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 3%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 가장 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 4%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 35%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 40%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 예를 들어 단백질의 총량에 대해 적어도 45%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 50%(w/w)의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 5 내지 90%(w/w) 범위의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 10 내지 80%(w/w) 범위의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다. 단계 a)의 유장 단백질 용액은 예를 들어 단백질의 총량에 대해 20 내지 70%(w/w) 범위의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 30 내지 70%(w/w) 범위의 추가의 유장 단백질을 포함한다.
언급한 바와 같이, 본 발명자들은 유기 용매의 사용 없이 BLG를 결정화시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 정제 접근법은 또한 몇 가지 BLG 정제가 이미 수행된, 유장 단백질을 함유하는 제제를 정제하기 위하여 사용될 수 있으며, BLG의 순도를 훨씬 더 증가시키는 간단한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 1 내지 20%(w/w) 범위의 추가의 유장 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 2 내지 15%(w/w) 범위의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은, 예를 들어 단백질의 총량에 대해 3 내지 10%(w/w) 범위의 추가의 유장 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 5%(w/w)의 ALA를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 10%(w/w)의 ALA를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 15%(w/w)의 ALA를 포함한다. 대안적으로, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 20%(w/w)의 ALA를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 25%(w/w)의 ALA를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 30%(w/w)의 ALA를 포함한다. 단계 a)의 유장 단백질 용액은 바람직하게는 단백질의 총량에 대해 적어도 35%(w/w)의 ALA를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 40%(w/w)의 ALA를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 5 내지 95%(w/w) 범위의 ALA를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 5 내지 70%(w/w) 범위의 ALA를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 10 내지 60%(w/w) 범위의 ALA를 포함할 수 있다. 단계 a)의 유장 단백질 용액은 바람직하게는 단백질의 총량에 대해 12 내지 50%(w/w) 범위의 ALA를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 20 내지 45%(w/w) 범위의 ALA를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 적어도 0.01의 BLG와 ALA 사이의 중량비를 갖는다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 적어도 0.5의 BLG와 ALA 사이의 중량비를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 적어도 1, 예컨대 적어도 2의 BLG와 ALA 사이의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 적어도 3의 BLG와 ALA 사이의 중량비를 가질 수 있다.
유장 단백질 용액 및 유장 단백질 공급물 중 BLG 및 기타 다른 단백질의 양 및 농도는 모두 용해된 단백질을 칭하며, 침전된 또는 결정화된 단백질을 포함하지 않는다.
본 발명의 맥락에서, 성분 X와 성분 Y 사이의 "중량비"라는 용어는 계산식 mX/mY에 의해 수득된 값을 의미하며, 여기서 mX는 성분 X의 양(중량)이고, mY는 성분 Y의 양(중량)이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 0.01 내지 20 범위의 BLG와 ALA 사이의 중량비를 갖는다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 0.2 내지 10 범위의 BLG와 ALA 사이의 중량비를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 0.5 내지 4 범위의 BLG와 ALA 사이의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 1 내지 3 범위의 BLG와 ALA 사이의 중량비를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 1%(w/w)의 BLG를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 2%(w/w)의 BLG를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 5%(w/w)의 BLG를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 10%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 12%(w/w)의 BLG를 포함한다. 예를 들어, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 15%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 단계 a)의 유장 단백질 용액은, 예를 들어 단백질의 총량에 대해 적어도 20%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 적어도 30%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 최대 95%(w/w)의 BLG를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 최대 90%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은, 예를 들어 단백질의 총량에 대해 최대 85%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은, 예를 들어 단백질의 총량에 대해 최대 80%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 최대 78%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 최대 75%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 1 내지 95%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 5 내지 90%(w/w) 범위의 BLG를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 10 내지 85%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 10 내지 80%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 가장 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 20 내지 70%(w/w) 범위의 BLG를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 10 내지 95%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 12 내지 90%(w/w) 범위의 BLG를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 15 내지 85%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 15 내지 80%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 가장 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 단백질의 총량에 대해 30 내지 70%(w/w) 범위의 BLG를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 유장 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 0.4%(w/w)의 BLG를 포함한다. 바람직하게는 유장 단백질 용액은 적어도 1.0%(w/w)의 BLG를 포함한다. 보다 바람직하게는 유장 단백질 용액은 적어도 2.0%(w/w)의 BLG를 포함한다. 유장 단백질 용액이 적어도 4%(w/w)의 BLG를 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
더 높은 농도의 BLG가 훨씬 더 바람직하고, 바람직하게는 유장 단백질 용액은 적어도 6%(w/w)의 BLG를 포함한다. 보다 바람직하게는 유장 단백질 용액은 적어도 10%(w/w)의 BLG를 포함한다. 유장 단백질 용액이 적어도 15%(w/w)의 BLG를 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 유장 단백질 용액의 중량에 대해 0.4 내지 40%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 바람직하게는 유장 단백질 용액은 1 내지 35%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 보다 바람직하게는 유장 단백질 용액은 4 내지 30%(w/w) 범위의 BLG를 포함한다. 유장 단백질 용액이 10 내지 25%(w/w) 범위의 BLG를 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
임의의 적합한 유장 단백질 공급원을 사용하여 유장 단백질 용액을 제조할 수 있다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액은 유청 단백질 농축물, 유장 단백질 농축물, 유청 단백질 단리물, 유장 단백질 단리물, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 심지어 이것으로 구성된다.
유장 단백질 용액은 탈염된 유장 단백질 용액인 것이 바람직하다.
이러한 맥락에서, 용어 "탈염된"은 유장 단백질 용액의 전도율이 최대 15 mS/cm, 바람직하게는 최대 10 mS/cm, 훨씬 더 바람직하게는 최대 8 mS/cm이라는 것을 의미한다. 탈염된 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 바람직하게는 최대 7 mS/cm, 보다 바람직하게는 최대 4 mS/cm, 훨씬 더 바람직하게는 최대 1 mS/cm이다.
유장 단백질 용액이 탈염된 유청 단백질 농축물, 탈염된 유청 단백질 단리물, 탈염된 유장 단백질 농축물, 또는 탈염된 유장 단백질 단리물인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액은 탈염되고 pH 조정된 유청 단백질 농축물, 유장 단백질 농축물, 유청 단백질 단리물, 유장 단백질 단리물, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 심지어 이것으로 구성된다.
유장 단백질 용액은, 예를 들어 탈염된 유청 단백질 농축물을 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 유장 단백질 용액은 탈염된 유장 단백질 농축물을 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 유장 단백질 용액은 탈염된 유청 단백질 단리물을 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 유장 단백질 용액은 탈염된 유장 단백질 단리물을 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "유장 단백질 농축물" 및 "유청 단백질 농축물"은 총 고체에 대해 약 20 내지 89%(w/w) 범위의 단백질을 함유하는 유장 또는 유청의 제제에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "유장 단백질 단리물" 및 "단리된 유청 단백질"은 총 고체에 대해 적어도 90%(w/w)의 단백질을 함유하는 유장 또는 유청의 제제에 관한 것이다.
용어 "~으로 본질적으로 구성된다" 및 "~으로 본질적으로 구성되는"은 해당 청구항 또는 특성이 명시된 물질 또는 단계, 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포함한다는 것을 의미한다.
유장 단백질 용액의 단백질은 바람직하게는 포유동물의 젖, 바람직하게는 반추 동물, 예컨대 젖소, 양, 염소, 버팔로, 낙타, 라마, 암말 및/또는 사슴의 젖으로부터 유래된다. 소(젖소) 젖으로부터 유래된 단백질이 특히 바람직하다. 따라서, BLG 및 추가의 유장 단백질은 바람직하게는 소 BLG 및 소 유장 단백질이다.
유장 단백질 용액의 단백질은 가능한 한 그의 천연 상태에 가까운 것이 바람직하고, 바람직하게는 만약 있더라도, 오직 완만한 열처리만이 수행된 것이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 BLG는 최대 1의 락토실화도를 갖는다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 BLG는 최대 0.6의 락토실화도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 BLG는 최대 0.4의 락토실화도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 BLG는 최대 0.2의 락토실화도를 갖는다. 가장 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 BLG는 최대 0.1, 예컨대 바람직하게는 최대 0.01의 락토실화도를 갖는다.
BLG의 락토실화도는 문헌[Czerwenka et al, J. Agric. Food Chem., Vol. 54, No. 23, 2006, pages 8874-8882]에 따라 측정된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액은 최대 80 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액은 최대 40 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다. 보다 바람직하게는, 유장 단백질 용액은 최대 20 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 유장 단백질 용액은 최대 10 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다. 가장 바람직하게는, 유장 단백질 용액은 최대 5 mg/100 g(단백질)의 푸로신가, 예컨대 바람직하게는 0 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다.
유장 단백질 용액은 통상적으로 단백질 이외에 기타 다른 성분을 함유한다. 유장 단백질 용액은 유장 또는 유청에서 일반적으로 발견되는 기타 다른 성분, 예컨대 무기물, 탄수화물, 및/또는 지질을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 유장 단백질 용액은 유장 또는 유청에 고유하지 않은 성분을 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 비-천연 성분은 바람직하게는 식품 제조에 사용하기 위하여, 그리고 바람직하게는 또한 인간 소비를 위하여 안전하여야 한다.
본 발명의 방법은 BLG 이외에 기타 다른 고체를 함유하는 조 유장 단백질 용액으로부터 BLG를 분리하는데 특히 유리하다.
유장 단백질 용액은, 예를 들어 탄수화물, 예컨대 락토스, 올리고사카라이드 및/또는 락토스의 가수분해 생성물(즉, 글루코스 및 갈락토스)을 함유할 수 있다. 유장 단백질 용액은, 예를 들어 탄수화물을 0 내지 40%(w/w) 범위, 예컨대 1 내지 30%(w/w) 범위 또는 2 내지 20%(w/w) 범위로 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액은 최대 20%(w/w)의 탄수화물, 바람직하게는 최대 10%(w/w)의 탄수화물, 보다 바람직하게는 최대 5%(w/w)의 탄수화물, 훨씬 더 바람직하게는 최대 2%(w/w)의 탄수화물을 함유한다.
또한, 유장 단백질 용액은 지질을 예를 들어 트리글리세라이드 및/또는 기타 다른 지질 유형, 예컨대 인지질 형태로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 총 고체에 대해 최대 15%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 총 고체에 대해 최대 10%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다. 보다 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 총 고체에 대해 최대 6%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 총 고체에 대해 최대 1.0%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다. 가장 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 총 고체에 대해 최대 0.5%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다.
유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 통상적으로 유장 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 1%(w/w)이다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 적어도 5%(w/w)이다. 보다 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 적어도 10%(w/w)이다. 훨씬 더 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 적어도 15%(w/w)이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 1 내지 50%(w/w) 범위이다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 5 내지 40%(w/w) 범위이다. 보다 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 10 내지 30%(w/w) 범위이다. 훨씬 더 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 15 내지 25%(w/w) 범위이다.
유장 단백질 용액의 단백질의 총량은 실시예 9.2에 따라 측정된다.
유장 단백질 용액은 통상적으로 유장 단백질 공급물에 하나 이상의 조정을 수행하여 BLG에 대해 과포화된 유장 단백질 용액을 형성함으로써 제조된다.
공급물은 바람직하게는 WPC, WPI, SPC, SPI, 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "유장 단백질 공급물"은 BLG에 대해 과포화된 유장 단백질 용액으로 변환된 조성물에 관한 것이다. 유장 단백질 공급물은 통상적으로 BLG 및 적어도 1종의 추가의 유장 단백질을 포함하는 수성 액체이지만, 일반적으로 BLG에 대해 과포화되지 않는다.
유장 단백질 용액의 화학 조성에 관한 구현예는 유장 단백질 공급물에 동일하게 적용되지만, 통상적으로 유장 단백질 공급물의 적어도 하나의 파라미터는 과포화 또는 적어도 자발적인 결정화를 방지하도록 설정된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 과포화된 유장 단백질 용액은 유장 단백질 공급물에 다음의 조정 중 하나 이상을 수행함으로써 제조된다:
- pH의 조정
- 전도율의 감소
- 온도의 감소
- 단백질 농도의 증가
- 수분 활성도를 감소시키는 작용제의 첨가
- 이온 조성의 개질.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물의 pH를 5 내지 6 범위의 pH로 조정하는 것을 포함한다.
모든 pH 값은 pH 유리 전극을 사용하여 측정되고, 25℃로 정규화된다.
유장 단백질 용액은 예를 들어 4.9 내지 6.1 범위의 pH를 가질 수 있다. 유장 단백질 용액의 pH는, 예를 들어 5.0 내지 6.1 범위일 수 있다. 대안적으로, 유장 단백질 용액의 pH는 5.1 내지 6.1 범위일 수 있다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 pH는 5.1 내지 6.0 범위이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 pH는 5.0 내지 6.0 범위이다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 pH는 5.1 내지 6.0 범위이다. 보다 바람직하게는 유장 단백질 용액의 pH는 5.1 내지 5.9 범위이다. 훨씬 더 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 pH는 5.2 내지 5.9 범위일 수 있다. 가장 바람직하게는 유장 단백질 용액의 pH는 5.2 내지 5.8 범위이다.
pH는 바람직하게는 식품 허용 산 및/또는 염기를 사용하여 조정된다. 식품 허용 산, 예컨대 카르복실산이 특히 바람직하다. 이러한 산의 유용한 예는, 예를 들어 염산, 황산, 인산, 아세트산, 말레산, 타르타르산, 락트산, 시트르산, 또는 글루콘산 및/또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, pH는 락톤, 예컨대 D-글루코노-델타-락톤을 사용하여 조정되며, 락톤은 천천히 가수분해되고, 동시에 락톤을 함유하는 수성 액체의 pH를 감소시킨다. 락톤의 가수분해가 종결된 후, 표적 pH는 정확하게 계산될 수 있다.
식품 허용 염기의 유용한 예는, 예를 들어 히드록시드 공급원, 예컨대 나트륨 히드록시드, 칼륨 히드록시드, 칼슘 히드록시드, 식품 산의 염, 예컨대 트리-나트륨 시트레이트, 및/또는 이들의 조합이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, pH는 그의 H+ 형태에 대한 양이온 교환 물질의 첨가에 의해 조정된다. 비드-유형/큰 입자 유형 양이온 교환 물질은 결정화 전 또는 심지어 결정화 후에도 유장 단백질 용액으로부터 쉽게 제거된다. 그의 H+ 형태에 대한 양이온 교환 물질의 첨가에 의한 pH의 조정은, 그것이 유장 단백질 공급물의 전도율에 유의미하게 영향을 미치는 반대 음이온을 첨가하지 않고 pH를 감소시키기 때문에 본 발명에 특히 유리하다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물의 전도율의 감소를 포함한다.
본원에 언급된 전도율 값은 달리 명시되지 않는 한, 25℃로 정규화되었다.
본 발명자들은 유장 단백질 용액의 전도율의 감소가 BLG 결정의 높은 수율을 초래한다는 것을 발견하였다. 유장 단백질 용액의 최소 수득가능한 전도율은 단백질 분획 및 지질 분획(존재할 경우)의 조성에 따라 달라진다. 일부 단백질 종, 예컨대 카제이노마크로펩티드(CMP)는 기타 다른 단백질 종보다 전도율에 더 많이 기여한다. 따라서, 유장 단백질 공급물의 전도율은 단백질 및 단백질의 반대 이온이 전도율에 주된 기여자인 수준 근처로 만드는 것이 바람직하다. 전도율의 감소는 종종 액체 상에 존재하고 단백질에 단단히 결합되지 않은 소형 유리 이온의 적어도 일부의 제거를 포함한다.
유장 단백질 용액이 최대 10 mS/cm의 전도율을 갖는 것이 종종 바람직하다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액은 최대 5 mS/cm의 전도율을 갖는다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액은 최대 4 mS/cm의 전도율을 갖는다.
더 낮은 전도율이 훨씬 더 바람직하며, BLG 결정의 더 높은 수율을 초래한다. 따라서, 유장 단백질 용액은 바람직하게는 최대 3 mS/cm의 전도율을 갖는다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액은 최대 1 mS/cm의 전도율을 갖는다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액은 최대 0.5 mS/cm의 전도율을 갖는다.
유장 단백질 공급물의 전도율은 바람직하게는 투석 또는 정용여과(diafiltration)에 의해 감소된다. 한외여과에 의한 정용여과는 단백질이 보유되는 동안 염 및 소형의 하전된 분자의 세척 제거를 가능하게 하기 때문에 특히 바람직하다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 동일한 UF 유닛이 유장 단백질 공급물의 UF/정용여과 및 후속 농축에 사용된다.
본 발명자들은 전도율(mS/cm으로 표현됨)과 유장 단백질 용액 중 단백질의 총량(wt%로 표현됨, 유장 단백질 용액의 총 중량에 대한 총 단백질) 사이의 비는 유리하게는 BLG의 결정화를 촉진시키는 특정 임계값에서 또는 그러한 임계값 미만에서 유지될 수 있다는 징후를 보았다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 전도율과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량 사이의 비는 최대 0.3이다. 바람직하게는, 전도율과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량 사이의 비는 최대 0.25이다. 바람직하게는, 전도율과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량 사이의 비는 최대 0.20이다. 보다 바람직하게는, 전도율과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량 사이의 비는 최대 0.18이다. 훨씬 더 바람직하게는, 전도율과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량 사이의 비는 최대 0.12이다. 가장 바람직하게는, 전도율과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량 사이의 비는 최대 0.10이다.
예를 들어, 전도율과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량 사이의 비가 약 0.07, 또는 심지어 그 미만인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명자들은 유장 단백질 공급물은 유리하게는 최대 10 mS/cm의 UF 투과액 전도율을 갖는 유장 단백질 용액을 제공하도록 컨디셔닝될 수 있다는 것을 발견하였다. UF 투과액 전도율은 액체의 소분자 분획의 전도율의 측정값이며, 실시예 9.10에 따라 측정된다. 용어 "전도율"이 본원에서 그렇게 사용될 경우, 그것은 해당 액체의 전도율을 의미한다. 용어 "UF 투과액 전도율"이 사용될 경우, 그것은 액체의 소분자 분획의 전도율을 의미하고, 실시예 9.10에 따라 측정된다.
바람직하게는, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 7 mS/cm이다. 보다 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 5 mS/cm일 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 3 mS/cm일 수 있다.
훨씬 더 낮은 UF 투과액 전도율이 사용될 수 있고, BLG의 고 수율이 수득되어야 할 경우, 특히 바람직하다. 따라서, 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 1.0 mS/cm이다. 보다 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 0.4 mS/cm일 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 0.1 mS/cm일 수 있다. 가장 바람직하게는, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 0.04 mS/cm일 수 있다.
훨씬 더 낮은 UF 투과액 전도율에 도달할 수 있으며, 예를 들어 훨씬 더 낮은 UF 투과액 전도율의 밀리큐 워터가 정용여과 동안 희석제로서 사용된다(밀리큐 워터는 약 0.06 μS/cm의 전도율을 갖는다). 따라서, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 0.01 mS/cm일 수 있다. 대안적으로, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 0.001 mS/cm일 수 있다. 대안적으로, 유장 단백질 용액의 UF 투과액 전도율은 최대 0.0001 mS/cm일 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물의 온도의 감소를 포함한다.
예를 들어, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물의 온도를 적어도 5℃, 바람직하게는 적어도 10℃, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 15℃까지 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물의 온도를 적어도 20℃까지 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
유장 단백질 공급물의 온도는, 예를 들어 최대 30℃, 바람직하게는 최대 20℃, 훨씬 더 바람직하게는 최대 10℃까지 감소될 수 있다. 본 발명자들은 훨씬 더 낮은 온도가 더 높은 과포화도를 제공하고, 따라서 유장 단백질 공급물의 온도가 예를 들어 최대 5℃, 바람직하게는 최대 2℃, 훨씬 더 바람직하게는 최대 0℃까지 감소될 수 있다는 것을 발견하였다. 온도는 심지어 0℃ 미만일 수 있지만, 바람직하게는 유장 단백질 용액은 펌프로 퍼낼 수 있게, 예를 들어 아이스 슬러리 형태로 남아있어야 한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액은 BLG 결정화의 초기 전에 아이스 슬러리이다. 대안적으로 또는 추가로, 결정성 유장 단백질 용액은 단계 b)의 BLG 결정화 동안 아이스 슬러리로 전환되거나, 아이스 슬러리로 유지될 수 있다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물의 총 단백질 농도의 증가를 포함한다. 유장 단백질 공급물에는, 예를 들어 하나 이상의 단백질 농축화 단계, 예컨대 한외여과, 나노여과, 역삼투 및/또는 증발이 수행되고, 이로써 농축되어 유장 단백질 용액을 수득할 수 있다.
한외여과는 염 및 탄수화물의 농도에 거의 영향을 미치지 않으면서 단백질의 선택적 농축을 허용하기 때문에 특히 바람직하다. 상기 언급한 바와 같이, 한외여과는 바람직하게는 유장 단백질 공급물의 정용여과 및 농축 둘 다에 대해 사용된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 BLG의 농도는 BLG의 자발적인 결정화가 일어나는 수준 미만이다. 따라서, 유장 단백질 용액이 준안정 영역, 즉 시딩이 사용될 때 BLG 결정이 성장할 수 있지만, 결정화가 자발적으로 시작되지 않는 과포화된 영역에 존재할 때 유장 단백질 공급물의 개질을 중단시키는 것이 종종 바람직하다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 1종 이상의 수분 활성도 감소제(들)의 유장 단백질 공급물로의 첨가를 포함한다.
이러한 수분 활성도 감소제의 유용하지만 비제한적인 예는 폴리사카라이드 및/또는 폴리-에틸렌 글리콜(PEG)이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 예를 들어 이온 교환, 새로운 이온 종의 첨가, 투석 또는 정용여과에 의해 유장 단백질 공급물의 이온 조성을 개질시키는 것을 포함한다.
통상적으로, 유장 단백질 용액은 과포화를 생성시키기 위하여 상기 공정 단계 중 2개 이상을 조합함으로써 제조된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물을 적어도:
- 예를 들어, 10℃ 초과의 온도에서 한외여과, 나노여과 또는 역삼투를 사용하여 농축시키고,
- 이후에 10℃ 미만의 온도까지 냉각시키는 것
을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물을 적어도
- 6.0 초과의 pH에서 농축시키고,
- 이후에 산(예를 들어, GDL 또는 H+ 형태의 양이온 교환 물질)의 첨가에 의해 pH를 감소시키는 것
을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물을 적어도:
- 예를 들어 적어도 BLG를 보유하는 막을 사용하여 정용여과에 의해 전도율을 감소시키는 것
을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제조는 유장 단백질 공급물에 적어도:
- pH를 5 내지 6으로 조정,
- 적어도 BLG를 보유하는 막을 사용한 정용여과에 의한 전도율의 감소,
- 예를 들어, 10℃ 초과의 온도에서 한외여과, 나노여과 또는 역삼투를 사용한 단백질의 농축, 및
- 마지막으로, 10℃ 미만의 온도까지 냉각
의 조합을 수행하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 방법의 BLG 수율이 나트륨+칼륨의 합 대 칼슘과 마그네슘의 합 사이의 몰비를 제어함으로써 개선될 수 있다는 것을 발견하였다. 칼슘 및 마그네슘의 높은 상대량은 놀랍게도 BLG의 수율을 증가시키는 것으로 보이고, 따라서 본 발명의 방법의 BLG 회수의 효율을 증가시킨다.
본 발명의 방법의 일부 바람직한 구현예에서 단계 a)의 유장 단백질 용액은 Na + K와 Ca + Mg 사이의 몰비가 최대 4이다. 보다 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 Na + K와 Ca + Mg 사이의 몰비가 최대 2이다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 Na + K와 Ca + Mg 사이의 몰비가 최대 1.5, 훨씬 더 바람직하게는 최대 1.0이다. 가장 바람직하게는, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 Na + K와 Ca + Mg 사이의 몰비가 최대 0.5, 예컨대 최대 0.2이다.
Na + K와 Ca + Mg 사이의 몰비는 (mNa+mK)/(mCa+mMg)로서 계산되며, 여기서 mNa는 원소 Na의 함량(몰)이고, mK는 원소 K의 함량(몰)이고, mCa는 원소 Ca의 함량(몰)이고, mMg는 원소 Mg의 함량(몰)이다.
유장 단백질 용액은 염용에 의해 BLG에 대해 과포화되고, 따라서 BLG는 염용 방식으로 유장 단백질 용액으로부터 결정화될 수 있는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유장 단백질 용액은 특히 본 발명의 식용 BLG 제품이 단백질 변성도를 역시 가져야 할 경우, 낮은 함량의 변성된 단백질을 갖는다. 바람직하게는, 유장 단백질 용액은 최대 2%, 바람직하게는 최대 1.5%, 보다 바람직하게는 최대 1.0%, 및 가장 바람직하게는 최대 0.8%의 단백질 변성도를 갖는다.
방법의 단계 b)는 과포화된 유장 단백질 용액의 BLG의 적어도 일부를 결정화시키는 것을 포함한다.
단계 b)의 결정화는 염용 방식으로, 즉 낮은 이온 강도 및 전도율을 갖는 액체에서 수행되는 것이 특히 바람직하다. 이것은 상당한 양의 염이 용액에 첨가되어 결정화를 유발하는 염석 방식과 상반된다.
단계 b)의 BLG의 결정화는, 예를 들어 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
- 결정화가 일어나기를 기다림,
- 결정화 시드의 첨가,
- BLG의 과포화도의 훨씬 더 증가, 및/또는
- 기계적 자극.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 b)는 결정화 시드를 유장 단백질 용액에 첨가하는 것을 포함한다. 본 발명자들은 결정화 시드의 첨가가 BLG 결정화가 언제 어디서 일어나는 지를 제어하여 제조 동안 공정 장비의 갑작스러운 막힘 및 의도하지 않은 중단을 방지할 수 있게 한다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 유장 단백질 공급물을 농축하는 동안 결정화 개시를 방지하는 것이 종종 바람직하다.
원칙적으로, BLG의 결정화를 개시하는 임의의 시드 물질이 사용될 수 있다. 그러나, 수화된 BLG 결정 또는 건조된 BLG 결정을 시딩에 사용하여 유장 단백질 용액에 추가의 불순물을 첨가하는 것을 방지하는 것이 바람직하다.
결정화 시드는 건조 형태 상에 존재하거나 유장 단백질 용액에 첨가될 때 현탁액의 일부를 형성할 수 있다. 결정화 시드, 예를 들어 BLG 결정을 함유하는 현탁액의 첨가는 결정화의 더 빠른 개시를 제공하는 것으로 보이기 때문에 현재 바람직하다. 결정화 시드를 함유하는 이러한 현탁액은 5 내지 6 범위의 pH 및 최대 10 mS/cm의 전도율을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 구현예에서, 결정화 시드의 적어도 일부는 유장 단백질 용액과 접촉하는 고체 상에 위치한다.
결정화 시드는 바람직하게는 BLG 결정의 원하는 크기훨씬 더 작은 입자 크기를 갖는다. 결정화 시드의 크기는 최대 시드를 체별 또는 기타 다른 크기 분별 공정에 의해 제거함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어 분쇄에 의한 입자 크기 감소가 입자 크기 분별 전에 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 결정화 시드의 적어도 90%(w/w)는 0.1 내지 600 미크론 범위의 입자 크기(체별 분석에 의해 측정됨)를 갖는다. 예를 들어, 결정화 시드의 적어도 90%(w/w)는 1 내지 400 미크론 범위의 입자 크기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 결정화 시드의 적어도 90%(w/w)는 5 내지 200 미크론 범위의 입자 크기를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 결정화 시드의 적어도 90%(w/w)는 5 내지 100 미크론 범위의 입자 크기를 가질 수 있다.
결정화 시드의 입자 크기 및 투여량을 조정하여 BLG의 최적의 결정화를 제공할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 결정화 시드를 BLG에 대해 과포화를 수득하기 전에 바람직하게는 과포화에 도달했을 때 결정화 시드의 적어도 일부가 여전히 존재하도록 하는 방식으로 유장 단백질 공급물에 첨가한다. 이것은, 예를 들어 유장 단백질 공급물이, 예를 들어 냉각, 농축 및/또는 pH 조정 동안 과포화에 근접하고, 결정화 시드가 완전히 용해되기 전에 과포화에 도달하는데 근접할 때, 결정화 시드를 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 b)는 BLG의 과포화도를 훨씬 더, 바람직하게는 BLG의 결정화가 즉시, 즉 최대 20분, 및 바람직하게는 최대 5분 내에 개시되는 정도로 증가시키는 것을 포함한다. 이것은 또한 결정자가 자발적으로 형성되고 결정화 과정이 시작되는 핵 형성 구역으로서 칭해진다.
과포화도는, 예를 들어 다음 중 하나 이상에 의해 증가될 수 있다:
- 유장 단백질 용액의 단백질 농도를 더 증가시킴
- 유장 단백질 용액을 더 냉각시킴
- 유장 단백질 용액을 BLG 결정화에 대한 최적의 pH에 더 근접하게 함
- 전도율을 훨씬 더 감소시킴.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 b)는 BLG 결정이 형성되는 것을 기다리는 것을 포함한다. 이것은 몇 시간이 걸릴 수 있고, 통상적으로 BLG에 대해 단지 약간 과포화되고, 결정화 시드가 첨가되지 않은 유장 단백질 용액에 대한 것이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 유장 단백질 용액의 제공(단계 a) 및 BLG의 결정화(단계 b)는 2개의 별개의 단계로 수행된다.
그러나, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 단계 b)는 BLG의 과포화도를 상승시키거나, 적어도 과포화를 유지시키는 결정성 유장 단백질 용액의 추가의 조정을 포함한다. 추가의 조정은 BLG 결정의 증가된 수율을 초래한다.
이러한 추가의 조정은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
- 결정성 유장 단백질 용액의 단백질 농도를 훨씬 더 증가시킴
- 결정성 유장 단백질 용액을 훨씬 더 낮은 온도까지 냉각시킴
- 결정성 유장 단백질 용액을 BLG 결정화를 위한 최적의 pH로 훨씬 더 근접하게 만듦
- 결정성 유장 단백질 용액의 전도율을 훨씬 더 감소시킴.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 결정성 유장 단백질 용액은 단계 b) 동안 준안정 구역에서 유지되어 새로운 결정자의 자발적인 형성을 방지한다.
본 발명자들은 x-선 결정학에 의해 단리된 BLG 결정의 결정 격자 구조를 결정하였으며, 선행 기술에서는 유사한 결정을 발견하지 못하였다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 b) 동안 수득된 BLG 결정의 적어도 일부는 사방정계 공간군 P 21 21 21을 갖는다.
바람직하게는, 수득된 BLG 결정의 적어도 일부는 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68(±5%) Å, b = 68.68(±5%) Å 및 c = 156.65(±5%) Å; 및 단위 격자 필수 각 α=90°, β=90°, 및 γ=90°를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 수득된 BLG 결정의 적어도 일부는 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68(±2%) Å, b = 68.68(±2%) Å, 및 c = 156.65(±2%) Å; 및 단위 격자 필수 각 α=90°, β=90°, 및 γ=90°를 갖는다.
훨씬 더 바람직하게는, 수득된 BLG 결정의 적어도 일부는 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68(±1%) Å, b = 68.68(±1%) Å, 및 c = 156.65(±1%) Å; 및 단위 격자 필수 각 α=90°, β=90°, 및 γ=90°를 가질 수 있다.
가장 바람직하게는, 수득된 BLG 결정의 적어도 일부는 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68 Å, b = 68.68 Å, 및 c = 156.65 Å; 및 단위 격자 필수 각 α=90°, β=90°, 및 γ=90°를 갖는다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서 방법은 잔류 유장 단백질 용액으로부터 BLG 결정의 적어도 일부를 분리하는 단계 c)를 함유한다. 이것은 BLG의 정제를 원할 때 특히 바람직하다.
단계 c)는, 예를 들어 BLG 결정을 적어도 30%(w/w)의 고체 함량으로 분리하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단계 c)는 BLG 결정을 적어도 40%(w/w)의 고체 함량으로 분리하는 것을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는 단계 c)는 BLG 결정을 적어도 50%(w/w)의 고체 함량으로 분리하는 것을 포함한다.
본 발명자들은 분리된 BLG 결정에 부착된 수성 부분이 통상적으로 방지되어야 하는 불순물을 함유하기 때문에, 높은 고체 함량이 BLG의 정제에 유리하다는 것을 발견하였다. 추가로, 높은 고체 함량은 분리된 BLG 결정을 건조 생성물, 예컨대 분말로 전환시키기 위한 에너지 소비를 감소시키고, 주어진 용량으로 건조 유닛으로부터 수득되는 BLG 수율을 증가시킨다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 c)는 BLG 결정을 적어도 60%의 고체 함량으로 분리하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 단계 c)는 BLG 결정을 적어도 70%의 고체 함량으로 분리하는 것을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는 단계 c)는 BLG 결정을 적어도 80%의 고체 함량으로 분리하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 단계 c)의 분리는 다음의 작업 중 하나 이상을 포함한다:
- 원심 분리,
- 디캔테이션,
- 여과,
- 침강,
- 상기의 조합.
이러한 유닛 작업은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 용이하게 수행된다. 여과에 의한 분리는, 예를 들어 진공 여과, 동적 교차-흐름 여과(DCF), 여액 프레스 또는 필터 원심 분리기의 사용을 포함할 수 있다.
여과를 위해 상이한 세공 크기가 원하는 결과에 기반하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 필터는 천연 유장 단백질 및 소형 응집체는 통과시키지만, BLG 결정은 보유한다. 필터는 바람직하게는 적어도 0.1 미크론의 공칭 세공 크기를 갖는다. 필터는, 예를 들어 적어도 0.5 미크론의 공칭 세공 크기를 가질 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 필터는 적어도 2 미크론의 공칭 세공 크기를 가질 수 있다.
큰 세공 크기를 갖는 필터가 또한 사용될 수 있고, 실제로 주로 큰 결정이 BLG 결정을 함유하는 액체로부터 분리되어야 할 경우 바람직하다. 본 발명의 일부 구현예에서 필터는 적어도 5 미크론의 공칭 세공 크기를 갖는다. 바람직하게는, 필터는 적어도 20 미크론의 공칭 세공 크기를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 필터는 적어도 40 미크론의 세공 크기를 가질 수 있다.
필터는, 예를 들어 0.03 내지 5000 미크론, 예컨대 0.1 내지 5000 미크론 범위의 세공 크기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 필터는 0.5 내지 1000 미크론 범위의 세공 크기를 가질 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 필터는 5 내지 800 미크론 범위, 예컨대 10 내지 500 미크론 범위 또는 50 내지 500 미크론 범위의 세공 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 필터는 0.03 내지 100 미크론 범위의 세공 크기를 갖는다. 바람직하게는, 필터는 0.1 내지 50 미크론 범위의 세공 크기를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 필터는 4 내지 40 미크론 범위의 세공 크기를 가질 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 필터는 5 내지 30 미크론 범위, 예컨대 10 내지 20 미크론 범위의 세공 크기를 가질 수 있다.
1 미크론 초과의 세공 크기를 갖는 필터를 사용하는 것의 장점은 박테리아 및 기타 다른 미생물이 또한 분리 동안 및 선택적으로 또한 세척 및/또는 재결정화 동안 적어도 부분적으로 제거된다는 점이다. 따라서, 본 발명의 방법은 매우 낮은 박테리아 로드를 갖지만 단백질의 열 손상을 방지하는 고 순도 BLG를 생성할 수 있게 한다.
1 미크론 초과의 세공 크기를 갖는 필터를 사용하는 것의 또 다른 장점은 물의 제거 및 후속 건조가 더 용이하고 덜 에너지 소비적이라는 점이다.
BLG 결정으로부터 분리되는 잔류 유장 단백질 용액을 유장 단백질 용액의 제조 동안 유장 단백질 공급물로 재순환시킬 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 c)는 필터 원심 분리기를 사용한다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 단계 c)는 디캔터 원심분리기를 사용한다. 초기 결과(실시예 13 참조)는 모액으로부터 BLG 결정을 분리하기 위하여 필터 원심 분리기 및/또는 디캔터 원심분리기를 사용하는 것이 예를 들어 진공 여과보다 방법의 보다 강력한 작업을 제공한다는 것을 나타내었다.
종종 형성된 필터 케이크를 건조 기체로 건조시켜 필터 케이크의 수분 함량을 감소시키고, 바람직하게는 필터 케이크가 필터로부터 박리되게 할 수 있는 것이 바람직하다. 건조 기체의 사용은 분리 단계 또는 대안적으로, 필터 케이크가 건조 식용 BLG 조성물로 직접 전환될 경우 최종 건조 단계의 부분을 형성할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 c)는 DCF 유닛을 사용한다.
초기 시험은(실시예 12 참조) 0.03 내지 5 미크론 범위, 및 바람직하게는 0.3 내지 1.0 미크론 범위의 막 세공 크기를 갖는 DCF 유닛의 사용이 BLG 결정의 효율적인 분리를 제공하는 것으로 나타났으며, 본 발명자들은 DCF 유닛이 심지어 BLG 결정을 함유하는 유장 단백질 용액의 큰 배치로부터 결정을 분리시키기에 충분한 기간 동안 수행될 수 있다는 것을 알게 되었다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 c)는 BLG 결정을 보유할 수 있는 막이 장착된 DCF 유닛을 사용하여 수행되고, DCF 투과액은 재순환되어 유장 단백질 용액 또는 유장 단백질 공급물의 부분을 형성하고, DCF 투석유물은 회수되거나 결정화 탱크로 복귀될 수 있다. 바람직하게는, DCF 투과액은 예를 들어 한외여과/정용여과에 의해 처리되어 그것이 BLG에 대해 과포화되게 한 후, 유장 단백질 용액 또는 유장 단백질 공급물과 혼합된다.
유리하게는, 이러한 구현예는 액체 스트림의 온도가 15℃ 초과로 상승되도록 요구하지 않으므로, 더 높은 온도를 필요로 하는 변법보다 미생물 오염이 덜 생긴다. 이러한 구현예의 또 다른 산업적 장점은 과포화의 수준이 쉽게 제어되고, 원하지 않는 자발적인 결정화가 일어나지 않는 수준에서 유지될 수 있다는 점이다. 따라서, 방법의 이러한 구현예 동안 액체 스트림의 온도는 바람직하게는 최대 15℃, 보다 바람직하게는 최대 12℃, 훨씬 더 바람직하게는 최대 10℃, 가장 바람직하게는 최대 5℃이다.
이러한 구현예는 실시예 10에 예시되어 있고, 도 26에 예시되어 있다. 이러한 구현예는 배치 방법 또는 연속 방법으로 시행될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 방법은 BLG 결정, 예를 들어 c)의 분리된 BLG 결정을 세척하는 단계 d)를 포함한다. 세척은 단일 세척 또는 다중 세척 단계로 구성될 수 있다.
단계 d)의 세척은 바람직하게는 BLG 결정의 완전한 용해 없이 BLG 결정을 세척액과 접촉시키고, 이후에 세척액으로부터 잔류 BLG 결정을 분리하는 것을 포함한다.
세척액은 바람직하게는 BLG 결정의 완전한 용해를 피하도록 선택되며, 예를 들어 저온 탈염수, 저온 수돗물, 또는 저온 역삼투 투과액을 포함하거나, 심지어 이것으로 구성될 수 있다.
세척액은 5 내지 6 범위, 바람직하게는 5.0 내지 6.0 범위, 훨씬 더 바람직하게는 5.1 내지 6.0 범위, 예컨대 5.1 내지 5.9 범위의 pH를 가질 수 있다.
세척액은 최대 0.1 mS/cm, 바람직하게는 최대 0.02 mS/cm, 훨씬 더 바람직하게는 최대 0.005 mS/cm의 전도율을 가질 수 있다.
훨씬 더 낮은 전도율을 갖는 세척액이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세척액은 최대 1 microS/cm의 전도율을 가질 수 있다. 대안적으로, 세척액은 최대 0.1 microS/cm, 예컨대 약 0.05 microS/cm의 전도율을 가질 수 있다.
세척 단계는 바람직하게는 저온에서 수행되어 결정화된 BLG의 용해를 제한한다. 세척액의 온도는 바람직하게는 최대 30℃, 보다 바람직하게는 최대 20℃, 훨씬 더 바람직하게는 최대 10℃이다.
세척 단계는, 예를 들어 최대 5℃, 보다 바람직하게는 최대 2℃, 예컨대 약 0℃에서 수행될 수 있다. 0℃ 미만의 온도가 세척액이 상기 온도에서, 예를 들어 1종 이상의 빙점 억제제(들)의 존재로 인해 얼지 않는 한 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 세척액은 BLG를 예를 들어 적어도 1%(w/w)의 양, 및 바람직하게는 적어도 3%(w/w)의 양, 예컨대 4%(w/w)의 양으로 함유한다.
단계 d)의 세척은 통상적으로 최대 80%(w/w)의 BLG 결정의 초기 양, 바람직하게는 최대 50%(w/w), 훨씬 더 바람직하게는 최대 20%(w/w)의 BLG 결정의 초기 양을 용해시킨다. 바람직하게는, 단계 d)의 세척은 최대 15%(w/w)의 BLG 결정의 초기 양, 보다 바람직하게는 최대 10%(w/w), 훨씬 더 바람직하게는 최대 5%(w/w)의 BLG 결정의 초기 양을 용해시킨다.
세척액의 총량과 분리된 BLG 결정의 초기 양 사이의 중량비는 종종 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 5이다. 예를 들어, 세척액의 양과 분리된 BLG 결정의 초기 양 사이의 중량비는 적어도 10일 수 있다. 대안적으로, 세척액의 총량과 분리된 BLG 결정의 초기 양 사이의 중량비는 적어도 20, 예컨대 적어도 50 또는 적어도 100일 수 있다.
용어 "세척액의 총량"은 전체 공정 동안 사용된 세척액의 총량에 관한 것이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 하나 이상의 세척 시퀀스가 BLG 결정 분리로서 동일한 필터 배치 또는 유사한 필터 배치에서 수행된다. BLG 결정을 주로 함유하는 필터 케이크가 세척액의 하나 이상의 시퀀스에 첨가되며, 이것은 BLG 결정의 잔류 부분이 필터 케이크에 머무르는 동안 필터를 통해 제거된다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 단계 c)의 분리는 BLG 결정을 보유하는 필터를 사용하여 수행된다. 이후에, 필터 케이크를 필터 케이크 및 필터를 통해 이동하는 하나 이상의 정량의 세척액과 접촉시킨다. 세척액의 각각의 양은 필터 케이크의 부피의 최대 10배, 바람직하게는 필터 케이크의 부피의 최대 5배, 보다 바람직하게는 필터 케이크의 부피의 최대 1배, 훨씬 더 바람직하게는 필터 케이크의 부피의 최대 0.5배, 예컨대 필터 케이크의 부피의 최대 0.2배인 것이 종종 바람직하다. 필터 케이크의 부피는 필터 케이크의 고체 및 유체(액체 및 기체) 둘 다를 포함한다. 필터 케이크는 바람직하게는 이러한 방식으로 적어도 2회, 바람직하게는 적어도 4회, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 6회 세척된다.
단계 d)로부터 사용된 세척액은, 예를 들어 유장 단백질 공급물 또는 유장 단백질 용액으로 재순환될 수 있고, 여기서 세척 제거된 BLG가 다시 단리될 수 있다.
방법은 또한
- 분리된 BLG 결정을 재결정화 액체에 용해시키고,
- 재결정화 액체를 조정하여 BLG에 대해 과포화를 수득하고,
- BLG를 과포화된 조정된 재결정화 액체에서 결정화시키고,
- 잔류 조정된 재결정화 액체로부터 BLG 결정을 분리하는 것
을 포함하는 재결정화 단계를 포함하는 단계 e)를 포함할 수 있다.
단계 e)는 단일 재결정화 시퀀스 또는 다중 재결정화 시퀀스를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단계 c) 또는 d)의 BLG 결정은 적어도 2회 재결정화된다. 예를 들어, BLG 결정은 적어도 3회, 예컨대 적어도 4회 재결정화될 수 있다.
세척 및 재결정화 단계는 임의의 순서로 조합될 수 있고, 필요할 경우, 다수회 수행될 수 있다.
단계 c)의 분리된 BLG 결정은, 예를 들어 다음의 공정 순서를 겪을 수 있다:
- 하나 이상의 세척 단계(단계 d), 그 다음
- 하나 이상의 재결정화 단계(단계 e).
대안적으로, 단계 c)의 분리된 BLG 결정은, 다음의 공정 순서를 겪을 수 있다:
- 하나 이상의 재결정화 단계(단계 e), 그 다음
- 하나 이상의 세척 단계(단계 d).
또한, 세척 및 재결정화의 다수의 단계를 예를 들어 다음의 순서로 조합할 수 있다:
- 하나 이상의 세척 단계(단계 d),
- 하나 이상의 재결정화 단계(단계 e),
- 하나 이상의 세척 단계(단계 d), 및
- 하나 이상의 재결정화 단계(단계 e).
또는 예를 들어 다음의 순서로 조합할 수 있다:
- 하나 이상의 재결정화 단계(단계 e),
- 하나 이상의 세척 단계(단계 d),
- 하나 이상의 재결정화 단계(단계 e),
- 하나 이상의 세척 단계(단계 d).
본 발명의 일부 구현예에서, 방법은 또한 분리된 BLG에 예를 들어 크로마토그래피 또는 선택적 여과를 바탕으로 하는 추가의 BLG 강화 단계를 수행하는 것을 포함한다. 그러나, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서 방법은 단계 b) 후 추가의 BLG 강화 단계를 함유하지 않는다. 용어 "추가의 BLG 강화 단계"는 단백질의 총량에 대해 BLG를 강화시키는 공정 단계를 의미하며, 단계는 BLG의 결정화 또는 BLG 결정의 취급과 관련이 없다. 이러한 추가의 BLG 강화 단계의 한 예는 이온 교환 크로마토그래피이다. BLG 결정의 세척 및/또는 BLG의 재결정화는 "추가의 BLG 강화 단계"로 간주되지 않는다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서, 방법은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물을 건조 조성물로 전환시키는 건조 단계 f)를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "건조"는 해당 조성물 또는 생성물이 최대 6%(w/w)의 물을 포함하거나 바람직하게는 훨씬 덜 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "BLG-함유 조성물"을 사용하여 건조 단계 f)가 수행되는 조성물을 기재한다.
본 발명의 맥락에서, "단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물"은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터의 BLG의 적어도 일부를 포함하는 조성물을 의미한다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, "단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물"은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 직접 수득된다. 그러나, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서 "단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물"은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 직접 수득된 조성물의 추가의 가공 처리의 결과이다.
BLG-함유 조성물은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 직접 수득된 조성물에 존재하는 상당량의 BLG를 함유하는 것이 종종 바람직하다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 수득된 BLG를 적어도 50%(w/w), 바람직하게는 적어도 70%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80% 포함한다.
바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 수득된 BLG를 적어도 85%(w/w) 포함한다. 보다 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 수득된 BLG를 적어도 90%(w/w) 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 수득된 BLG를 적어도 95%(w/w) 포함한다. 가장 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 수득된 BLG를 100%(w/w) 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 건조 단계는 분무 건조, 동결 건조, 스핀-플래시 건조, 회전 건조, 및/또는 유동층 건조 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서, 건조 단계는 BLG 결정이 용해되고 생성된 분말이 단계 b) 또는 건조 단계 전 재결정화에 의해 형성된 BLG 결정을 함유하지 않는 BLG-함유 조성물을 포함한다. 식용 BLG 조성물이 예를 들어 통상적인, 건조된 유장 단백질 분말의 것과 유사하여야 할 경우, 이러한 구현예가 바람직하다.
BLG 결정은, 예를 들어
*- 온도를 증가시키거나,
- 예를 들어, 1종 이상의 염의 첨가에 의해 전도율을 증가시키거나,
- pH를 예를 들어 5 내지 6 범위 밖으로 변경시키거나,
- 예를 들어, 희석에 의해 BLG의 농도를 감소시키거나,
- 또는 상기의 조합
에 의해 용해될 수 있다.
분무-건조는 BLG 결정을 함유하지 않는 BLG-함유 조성물을 건조시키는 현재 바람직한 방법이다.
본 발명의 다른 특히 바람직한 구현예에서, 건조 단계는 BLG 결정을 여전히 함유하는 BLG-함유 조성물을 포함하며, 여기서 생성된 분말은 BLG 결정을 함유한다. 이러한 구현예는, 식용 BLG 조성물이 통상적인 건조된 유장 단백질 분말훨씬 더 높은 밀도를 가져야 할 경우 바람직하다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서, 건조 단계는 BLG 결정을 여전히 함유하는 BLG-함유 조성물을 포함하며, 여기서 생성된 분말은 BLG 결정을 함유한다. 이러한 구현예는, 식용 BLG-조성물이 통상적인 건조된 유장 단백질 분말훨씬 더 높은 밀도를 가져야 할 경우 바람직하다.
실시예 7에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 BLG 결정의 슬러리를 분무 건조시키고, 건조된 BLG 결정이 저온 탈염수에 재현탁될 때 결정 구조의 적어도 일부를 보유할 수 있다는 것을 발견하였다. BLG 결정을 함유하는 BLG-함유 조성물을 분무 전에 상당량의 BLG 결정을 용해시키는 열 처리 방식에 노출시키는 것을 방지하는데 특히 유리하다. 따라서, BLG 결정을 함유하는 BLG-함유 조성물의 예열이 분무 전에 사용될 경우, 열-부하를 조심스럽게 제어하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 구현예에서, BLG 결정을 함유하는 BLG-함유 조성물은 분무 장치(예를 들어, 노즐 또는 애터마이저)의 출구에 도달했을 때 최대 70℃, 바람직하게는 최대 60℃, 보다 바람직하게는 최대 50℃의 온도를 갖는다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, BLG 결정을 함유하는 BLG-함유 조성물은 분무 장치의 출구에 도달했을 때, 최대 40℃, 바람직하게는 최대 30℃, 보다 바람직하게는 최대 20℃, 훨씬 더 바람직하게는 최대 10℃, 및 가장 바람직하게는 최대 5℃의 온도를 갖는다.
분무-건조기의 분무 장치는 건조될 용액 또는 현탁액을 분무-건조기의 건조 챔버로 들어가는 액적으로 전환시키는 장치, 예를 들어 노즐 또는 애터마이저이다.
BLG 결정을 함유하는 BLG-함유 조성물은 분무 장치의 출구에 도달했을 때 0 내지 50℃ 범위, 바람직하게는 분무 장치의 출구에 도달했을 때 2 내지 40℃ 범위, 보다 바람직하게는 4 내지 35℃ 범위, 가장 바람직하게는 5 내지 10℃ 범위의 온도를 갖는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, BLG-함유 조성물은 분무 장치의 출구에 도달했을 때 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%, 예컨대 바람직하게는 97 내지 100%의 BLG의 결정도를 갖는다. BLG-함유 조성물은 BLG 단리물이거나, 예를 들어 총 단백질에 대해 90%(w/w) 초과의 양으로 BLG를 함유하거나, 또는 상당한 양의 기타 다른 단백질을 함유하고, 따라서 총 단백질에 대해 최대 90%(w/w)의 양으로 BLG를 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, BLG-함유 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 통상적인 액체 WPC 또는 WPI 또는 통상적인 액체 SPC 또는 SPI의 단백질 조성을 갖지만, 분무 장치의 출구에 도달했을 때 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%, 예컨대 바람직하게는 97 내지 100%의 BLG의 결정도를 가질 수 있다.
분무-건조기의 기체의 주입구 온도는 바람직하게는 140 내지 220℃ 범위, 보다 바람직하게는 160 내지 200℃ 범위, 훨씬 더 바람직하게는 170 내지 190℃ 범위, 예컨대 바람직하게는 약 180℃ 이다. 분무-건조기로부터 기체의 출구 온도는 바람직하게는 50 내지 95℃ 범위, 보다 바람직하게는 70 내지 90℃ 범위, 훨씬 더 바람직하게는 80 내지 88℃ 범위, 예컨대 바람직하게는 약 85℃ 이다. 경험상, 분무-건조되는 고체는 기체 출구 온도보다 10 내지 15℃ 낮은 온도까지 가열된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 분무-건조기는 바람직하게는 50 내지 85℃ 범위, 보다 바람직하게는 60 내지 80℃ 범위, 훨씬 더 바람직하게는 65 내지 75℃ 범위, 예컨대 바람직하게는 약 70℃ 이다.
BLG 결정의 현탁액의 분무-건조의 개념은 선행 기술에 개시되어 있지 않으며, 그 자체가 본 발명의 별도의 양태이다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 BLG를 포함하는 분무-건조된 식용 분말 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 조성물은 건조된 BLG 결정을 포함하고, 상기 방법은:
- BLG 결정을 포함하고, 바람직하게는 적어도 20%의 BLG의 결정도를 갖는 액체 BLG-함유 조성물을 제공하고, 상기 액체 BLG-함유 조성물은 바람직하게는 적어도 10%(w/w)의 총 고체를 포함하고, 바람직하게는 적어도 5%(w/w)의 BLG를 포함하는 것인 단계, 및
- 작동 분무-건조기의 건조 챔버로 액체 BLG-함유 조성물을 분무하여 BLG 결정을 포함하는 액체 BLG-함유 조성물을 분말로 전환시키는 단계
를 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 건조될 BLG-함유 조성물을 건조 BLG 단리물과 혼합하여 고체 함량을 혼합물이 유동층 건조에 의해 건조될 수 있는 수준까지 상승시킨다. 이것은 또한 역 혼합으로 칭해지며, BLG 생성물의 매우 비용 효율적인 건조를 허용한다. 이러한 구현예가 BLG 결정을 함유하는 BLG-함유 조성물에 특히 바람직하다.
본 방법의 장점은 건조될 BLG-함유 조성물이 건조 단계 전에 매우 높은 고체 함량을 가질 수 있고 따라서 더 적은 물이 제거되고, 더 적은 에너지가 건조 작업에서 소비된다는 것이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 적어도 20%(w/w)의 고체 함량을 갖는다. 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 적어도 30%(w/w)의 고체 함량을 갖는다. 보다 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 적어도 40%(w/w)의 고체 함량을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 적어도 50%(w/w)의, 예컨대 적어도 60%(w/w)의 고체 함량을 갖는다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 20 내지 80%(w/w) 범위의 고체 함량을 갖는다. 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 30 내지 70%(w/w) 범위의 고체 함량을 갖는다. 보다 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 40 내지 65%(w/w) 범위의 고체 함량을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 b), c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물은 50 내지 65%(w/w) 범위, 예컨대 약 60%(w/w)의 고체 함량을 갖는다.
본 발명자들은 BLG-함유 조성물의 결정도가 높을수록, 더 적은 물이 BLG-함유 조성물에 결합하고, BLG-함유 조성물의 더 높은 총 고체 함량이 건조 단계 전에 달성될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, BLG-함유 조성물은 적어도 10%(w/w)의 BLG의 결정도를 갖는다. 바람직하게는, BLG-함유 조성물의 BLG는 적어도 20%(w/w)의 결정도를 갖는다. 보다 바람직하게는 BLG-함유 조성물의 BLG는 적어도 30%(w/w)의 결정도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는 BLG-함유 조성물의 BLG는 적어도 40%(w/w)의 결정도를 갖는다.
훨씬 더 높은 결정도가 종종 바람직하다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 BLG-함유 조성물의 BLG는 적어도 50%(w/w)의 결정도를 갖는다. 바람직하게는, BLG-함유 조성물의 BLG는 적어도 60%(w/w)의 결정도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 70%(w/w)의 결정도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, BLG-함유 조성물의 BLG는 적어도 80%(w/w)의 결정도를 갖는다. 가장 바람직하게는, BLG-함유 조성물의 BLG는 적어도 90%(w/w), 바람직하게는 적어도 95%(w/w), 보다 바람직하게는 적어도 97%(w/w), 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%(w/w)의 결정도를 갖는다.
본 발명자들은 물의 감소된 함량이 조성물의 BLG의 결정도를 증가시키는 경향이 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 높은 물:BLG 비를 갖는 조성물(예를 들어, 물 중 4%의 BLG 결정의 현탁액)은 동일한 조건에서 낮은 물:BLG 비를 갖는 조성물(예를 들어, 필터 케이크 또는 촉촉한 단리된 결정)보다 낮은 BLG의 결정도를 갖는 경향이 있다.
본 발명의 방법은 유장 단백질 용액의 BLG 또는 기타 다른 유장 단백질의 영양학적 가치를 손상시키지 않는 온화한 온도를 사용하여 작동될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, BLG는 방법 동안 90℃ 초과의 온도에 처하지 않는다. 바람직하게는, BLG는 방법 동안 80℃ 초과의 온도에 처하지 않는다. 훨씬 더 바람직하게는, BLG는 방법 동안 75℃ 초과의 온도에 처하지 않는다. 분무-건조가 종종 150℃ 초과의 온도를 사용하더라도, 짧은 노출 시간 및 물의 동시 증발은 분무-건조된 단백질이 50 내지 70℃ 초과의 온도를 경험하지 않는다는 것을 의미한다는 것을 인지하여야 한다.
본 발명자들은 건조 단계 동안 연장된 가열이 결정 형태인 BLG의 양을 감소시키는 징후를 보았다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 건조 단계 동안 열 노출은 최대 10%, 바람직하게는 최대 4%, 보다 바람직하게는 최대 1%, 훨씬 더 바람직하게는 최대 0.4%, 훨씬 더 바람직하게는 최대 0.1%의 BLG의 변성도를 제공하도록 충분히 낮게 유지되어야 한다. 가장 바람직하게는, 건조 단계는 BLG의 검출가능한 변성을 전혀 초래하지 않는다.
건조 단계에 의해 유발되는 변성도는 단계 f)에서 건조될 BLG-조성물 중 BLG 함량(총 고체에 대해)(c단계 f 전) 및 재용해된 건조된 조성물 중 BLG 함량(총 고체에 대해)을 측정하고, 하기 식:
변성도 = ((c단계 f 전 - c단계 f 후)/c단계 f 전) * 100%
을 사용함으로써 계산된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예는 베타-락토글로불린(BLG)을 결정화된 형태로 포함하는 식용 조성물의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
a) BLG 및 적어도 1종의 추가의 유장 단백질을 포함하는 유장 단백질 용액을 제공하고, 상기 유장 단백질 용액은 BLG에 대해 과포화되고, 5 내지 6 범위의 pH를 갖고, 상기 유장 단백질 용액은:
- 총 고체에 대해 70 내지 100%(w/w)의 단백질,
- 총 단백질에 대해 30 내지 90%(w/w)의 BLG 및 바람직하게는 30 내지 70%(w/w)의 BLG
- 총 단백질에 대해 4 내지 50%(w/w)의 ALA 및 바람직하게는 8 내지 35%(w/w)의 ALA,
- 단백질에 대해 0 내지 25%(w/w)의 CMP,
- 유장 단백질 용액의 총 중량에 대해 적어도 10%(w/w)의 단백질
을 포함하는 것인 단계,
b) 바람직하게는 결정화 시드의 첨가에 의해 과포화된 유장 단백질 용액에서 BLG를 결정화시키는 단계, 및
f) 단계 b)로부터 직접 수득된 BLG-함유 조성물을 건조시키고, 상기 BLG-함유 조성물은 바람직하게는 적어도 30%의 BLG의 결정도를 갖는 것인 단계
를 포함하고, 상기 방법은 단계 c), d) 또는 e)를 함유하지 않는다.
유장 단백질 용액은 바람직하게는 탈염된 유장 단백질 용액이고, 바람직하게는 최대 0.3의 전도율과 단백질의 총량 사이의 비 및/또는 최대 7 mS/cm의 UF 투과액 전도율을 갖는다.
이러한 구현예에서, BLG 결정은 유장 단백질 용액으로부터 분리되지 않지만, 건조되어 고 밀도 식용 BLG 조성물을 분말 형태로 생성한다.
또한, 본 발명은 이러한 구현예에 의해 수득가능한 식용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예는 베타-락토글로불린(BLG)을 결정화된 형태로 포함하는 식용 조성물의 제조 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
a) BLG 및 적어도 1종의 추가의 유장 단백질을 포함하는 유장 단백질 용액을 제공하고, 상기 유장 단백질 용액은 BLG에 대해 과포화되고, 5 내지 6 범위의 pH를 갖고, 상기 유장 단백질 용액은:
- 총 고체에 대해 70 내지 100%(w/w)의 단백질,
- 총 단백질에 대해 30 내지 90%(w/w)의 BLG 및 바람직하게는 30 내지 70%,
- 총 단백질에 대해 4 내지 50%(w/w)의 ALA 및 바람직하게는 8 내지 35%,
- 총 단백질에 대해 0 내지 25%(w/w)의 CMP
- 유장 단백질 용액의 총 중량에 대해 적어도 10%(w/w)의 단백질
을 포함하는 것인 단계,
b) 바람직하게는 결정화 시드의 첨가에 의해 과포화된 유장 단백질 용액에서 BLG를 결정화시키는 단계,
c) 잔류 유장 단백질 용액으로부터 BLG 결정을 분리하는 단계,
d) 선택적으로, 단계 c)로부터 수득된 분리된 BLG 결정을 세척하는 단계,
e) 선택적으로, 단계 c) 또는 d)로부터 수득된 BLG 결정을 재결정화시키는 단계, 및
f) 단계 c), d), 또는 e)로부터 유래된 및 바람직하게는 직접 수득된 BLG-함유 조성물을 건조시키고, BLG-함유 조성물은 BLG 결정을 포함하고, 바람직하게는 적어도 30%의 BLG의 결정도를 갖는 것인 단계
를 포함한다.
유장 단백질 용액은 바람직하게는 탈염된 유장 단백질 용액이고, 바람직하게는 최대 0.3의 전도율과 단백질의 총량 사이의 비 및/또는 최대 7 mS/cm의 UF 투과액 전도율을 갖는다.
이러한 구현예는 낮은 무기물 및 낮은 인 식용 BLG 조성물을 고 밀도 분말 형태로 제조하기에 특히 유용하다.
또한, 본 발명은 이러한 구현예에 의해 수득가능한 식용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예는 베타-락토글로불린을 단리된 형태로 포함하는 식용 조성물의 제조 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
a) BLG 및 적어도 1종의 추가의 유장 단백질을 포함하는 유장 단백질 용액을 제공하고, 상기 유장 단백질 용액은 BLG에 대해 과포화되고, 5 내지 6 범위의 pH를 갖고, 상기 유장 단백질 용액은:
- 총 고체에 대해 70 내지 100%(w/w)의 단백질,
- 총 단백질에 대해 30 내지 90%(w/w)의 BLG 및 바람직하게는 30 내지 70%(w/w)의 BLG,
- 총 단백질에 대해 5 내지 50%(w/w)의 ALA 및 바람직하게는 8 내지 35%(w/w)의 ALA,
- 총 단백질에 대해 0 내지 25%(w/w)의 CMP,
- 유장 단백질 용액의 총 중량에 대해 적어도 10%(w/w)의 단백질
을 포함하는 것인 단계,
b) 바람직하게는 결정화 시드의 첨가에 의해 과포화된 유장 단백질 용액에서 BLG를 결정화시키는 단계,
c) 잔류 유장 단백질 용액으로부터 BLG 결정을 분리하는 단계,
d) 선택적으로, 단계 c)로부터 수득된 분리된 BLG 결정을 세척하는 단계,
e) 선택적으로, 단계 c) 또는 d)로부터 수득된 BLG 결정을 재결정화시키는 단계, 및
f) 단계 c), d), 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물을 건조시키고, BLG-함유 조성물은 BLG 결정을 포함하지 않는 것인 단계
를 포함한다.
유장 단백질 용액은 바람직하게는 탈염된 유장 단백질 용액이고, 바람직하게는 최대 0.3의 전도율과 단백질의 총량 사이의 비 및/또는 최대 7 mS/cm의 UF 투과액 전도율을 갖는다.
이러한 구현예에서, BLG 결정은 건조 전에 용해된다.
또한, 본 발명은 이러한 구현예에 의해 수득가능한 식용 조성물에 관한 것이다.
일부 바람직한 구현예에서 본 방법은 배치 공정으로 시행된다. 대안적으로, 및 때때로 바람직하게는, 방법은 반-배치 공정으로 시행될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서 방법은 연속 공정으로 시행된다.
본 방법의 장점은 선행 기술의 BLG 결정화를 위한 필적할 만한 방법보다 훨씬 더 빠르다는 것이다. 유장 단백질 공급물의 초기 조정으로부터 단계 c의 분리의 완결까지의 시간은 최대 10시간, 바람직하게는 최대 4시간, 보다 바람직하게는 최대 2시간, 훨씬 더 바람직하게는 최대 1시간일 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 본원에 기재된 방법으로부터 수득가능한 단리된 BLG 결정에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "단리된 BLG 결정"은 그것이 형성된 용액으로부터 분리되었지만 여전히 내부 물, 즉 결정의 BLG 분자를 수화시키는 물을 함유할 수 있는 BLG 결정에 관한 것이다.
단리된 BLG 결정은 바람직하게는 사방정계 공간군 P 21 21 21을 갖는다.
바람직하게는, 단리된 BLG 결정은 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68(±5%) Å, b = 68.68(±5%) Å, 및 c = 156.65(±5%) Å을 갖고; 단위 격자 필수 각 α=90°(±2%), β=90°(±2%), 및 γ=90°(±2%)를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 단리된 BLG 결정은 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68(±2%) Å, b = 68.68(±2%) Å, 및 c = 156.65(±2%) Å을 갖고; 단위 격자 필수 각 α=90°(±1%), β=90°(±1%), 및 γ=90°(±1%)를 갖는다.
훨씬 더 바람직하게는 단리된 BLG 결정은 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68(±1%) Å, b = 68.68(±1%) Å, 및 c = 156.65(±1%) Å을 가질 수 있고; 단위 격자 필수 각 α=90°(±0.5%), β=90°(±0.5%), 및 γ=90°(±0.5%)를 가질 수 있다.
가장 바람직하게는 단리된 BLG 결정은 사방정계 공간군 P 21 21 21 및 단위 격자 치수 a = 68.68 Å, b = 68.68 Å, 및 c = 156.65 Å을 갖고; 단위 격자 필수 각 α=90°, β=90°, 및 γ=90°를 갖는다.
단리된 BLG 결정은, 예를 들어 적어도 20%(w/w)의 BLG 및 최대 80%(w/w)의 물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단리된 BLG 결정은 적어도 40%(w/w)의 BLG 및 0 내지 60%(w/w) 범위의 물을 포함할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 단리된 BLG 결정은 40 내지 60%(w/w) 범위의 BLG 및 약 40 내지 약 60%(w/w) 범위의 물을 포함한다.
본 발명자들은 본 발명의 BLG 결정이 놀랍게도 건조되고 재수화된 후에 그의 원래 결정 구조를 재개하는 능력을 갖는다는 것을 발견하였다. 이것은 BLG의 결정 구조로부터 이점을 얻는 용도에 특히 유리하다.
본 발명의 또 다른 양태는 베타-락토글로불린을 포함하는 식용 조성물, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 식용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 총 고체에 대해 적어도 90%(w/w)의 BLG를 포함하는 식용 BLG 조성물에 관한 것이다. 이러한 식용 BLG 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 건조된 BLG 결정, 총 고체에 대해 적어도 20%(w/w)의 BLG를 포함하고, 바람직하게는 BLG에 대해 적어도 20%의 결정도를 갖는 식용 BLG 조성물에 관한 것이다. 건조된 BLG 결정을 포함하는 이러한 식용 BLG 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물의 BLG는 최대 1의 락토실화도를 갖는다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 최대 0.6의 락토실화도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 최대 0.4의 락토실화도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 최대 0.2의 락토실화도를 갖는다. 가장 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 최대 0.1, 예컨대 바람직하게는 최대 0.01의 락토실화도를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 90%(w/w)의 비-락토실화된 BLG, 바람직하게는 적어도 95%(w/w)의 비-락토실화된 BLG, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 98%(w/w)의 비-락토실화된 BLG를 포함한다.
비-락토실화된 BLG의 백분율은 실시예 9.1에 따라 결정된다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 10%(w/w)의 결정도를 갖는다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 20%(w/w)의 결정도를 갖는다. 보다 바람직하게는 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 30%(w/w)의 결정도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 40%(w/w)의 결정도를 갖는다.
훨씬 더 높은 결정도가 종종 바람직하다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 50%(w/w)의 결정도를 갖는다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 60%(w/w)의 결정도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 70%(w/w)의 결정도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 80%(w/w)의 결정도를 갖는다. 가장 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 BLG는 적어도 90%(w/w) 및 바람직하게는 적어도 95%(w/w)의 결정도를 갖는다.
5 내지 6 범위의 pH를 갖는 액체 중 BLG의 결정도는 실시예 9.7에 따라 측정된다. 분말화된 물질 중 BLG의 결정도는 실시예 9.8에 따라 측정된다. 식용 조성물이 건조 생성물이지만 분말 형태가 아닐 경우, 그것은 실시예 9.8의 방법을 겪기 전에, 예를 들어, 분쇄 또는 밀링(milling)에 의해 분말로 전환되어야 한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 WPC, WPI, SPC, 또는 SPI이며, 여기서 BLG의 적어도 일부는 결정 형태로 존재한다. 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 단백질의 총량에 대해 최대 90%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있고, 적어도 10%의 BLG의 결정도를 갖는다. 예를 들어, 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 최대 80%(w/w)의 BLG를 포함하고, 적어도 10%의 BLG의 결정도를 가질 수 있다. 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 단백질의 총량에 대해 30 내지 70%(w/w)의 BLG를 포함하고, 적어도 10%의 BLG의 결정도를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 최대 90%(w/w)의 BLG를 포함하고, 적어도 30%의 BLG의 결정도를 갖는다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 최대 80%(w/w)의 BLG를 포함하고, 적어도 30%의 BLG의 결정도를 가질 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 30 내지 70%(w/w)의 BLG를 포함하고, 적어도 30%의 BLG의 결정도를 가질 수 있다.
본 발명자들은 본 발명이 신장병에 걸렸거나 다른 감소된 신장 기능을 갖는 환자에게 유리한 매우 낮은 함량의 인 및 기타 다른 무기물을 갖는 식용 유장 단백질 생성물을 제조할 수 있게 한다는 것을 발견하였다.
식용 BLG 조성물은 바람직하게는 낮은 인 조성물이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "낮은 인"은 단백질 100 g 당 최대 100 mg의 인의 인의 총 함량을 갖는 조성물, 예를 들어 액체, 분말 또는 또 다른 식료품에 관한 것이다. 바람직하게는, 낮은 인 조성물은 단백질 100 g 당 최대 80 mg의 인의 총 함량을 갖는다. 보다 바람직하게는, 낮은 인 조성물은 단백질 100 g 당 최대 50 mg의 인의 총 함량을 가질 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 낮은 인 조성물은 단백질 100 g 당 최대 20 mg의 인의 인의 총 함량을 가질 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 낮은 인 조성물은 단백질 100 g 당 최대 5 mg의 인의 인의 총 함량을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 낮은 인 조성물은 감소된 신장 기능을 갖는 환자 그룹을 위한 식료품의 제조를 위한 식품 성분으로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 단백질 100 g 당 최대 80 mg의 인을 포함한다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질 100 g 당 최대 30 mg의 인을 포함한다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질 100 g 당 최대 20 mg의 인을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질 100 g 당 최대 10 mg의 인을 포함한다. 가장 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질 100 g 당 최대 5 mg의 인을 포함한다.
인의 함량은 해당 조성물의 원소 인의 총량에 관한 것이며, 실시예 9.5에 따라 측정된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 낮은 무기물 조성물이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "낮은 무기물"은 다음:
- 총 고체에 대해 최대 1.2%(w/w)의 재 함량,
- 총 고체에 대해 최대 0.3%(w/w)의 칼슘 및 마그네슘의 총 함량,
- 총 고체에 대해 최대 0.10%(w/w)의 나트륨 및 칼륨의 총 함량,
- 단백질 100 g 당 최대 100 mg의 인의 인의 총 함량
중 적어도 하나, 바람직하게는 둘, 훨씬 더 바람직하게는 전부를 갖는 조성물, 예를 들어 액체, 분말 또는 또 다른 식료품에 관한 것이다.
바람직하게는, 낮은 무기물 조성물은 다음:
- 총 고체에 대해 최대 0.7%(w/w)의 재 함량,
- 총 고체에 대해 최대 0.2%(w/w)의 칼슘 및 마그네슘의 총 함량,
- 총 고체에 대해 최대 0.08%(w/w)의 나트륨 및 칼륨의 총 함량,
- 단백질 100 g 당 최대 80 mg의 인의 인의 총 함량
중 적어도 하나, 바람직하게는 둘 이상, 훨씬 더 바람직하게는 전부를 갖는다.
훨씬 더 바람직하게는, 낮은 무기물 조성물은 다음:
- 총 고체에 대해 최대 0.5%(w/w)의 재 함량,
- 총 고체에 대해 최대 0.15%(w/w)의 칼슘 및 마그네슘의 총 함량,
- 총 고체에 대해 최대 0.06%(w/w)의 나트륨 및 칼륨의 총 함량,
- 단백질 100 g 당 최대 50 mg의 인의 인의 총 함량
중 적어도 하나, 바람직하게는 둘 이상, 훨씬 더 바람직하게는 전부를 갖는다.
낮은 무기물 조성물이 다음:
- 총 고체에 대해 최대 0.5%(w/w)의 재 함량,
- 총 고체에 대해 최대 0.15%(w/w)의 칼슘 및 마그네슘의 총 함량,
- 총 고체에 대해 최대 0.06%(w/w)의 나트륨 및 칼륨의 총 함량,
- 단백질 100 g 당 최대 50 mg의 인의 인의 총 함량
을 갖는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 식용 BLG 조성물의 총 고체에 대해 적어도 25%(w/w)의 단백질의 총량을 포함한다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 식용 BLG 조성물의 총 고체에 대해 적어도 50%(w/w)의 단백질의 총량을 포함한다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 식용 BLG 조성물의 총 고체에 대해 적어도 75%(w/w)의 단백질의 총량을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 식용 BLG 조성물의 총 고체에 대해 적어도 90%(w/w)의 단백질의 총량을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물의 단백질의 총량은 총 고체에 대해 25 내지 100%(w/w) 범위이다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 단백질의 총량은 50 내지 100%(w/w) 범위이다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 단백질의 총량은 총 고체에 대해 75 내지 100%(w/w) 범위이다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물의 단백질의 총량은 총 고체에 대해 90 내지 100%(w/w) 범위이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 적어도 75%(w/w)의 BLG를 포함한다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 적어도 90%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 적어도 95%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 적어도 97%(w/w)의 BLG를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 단백질의 총량에 대해 약 100%(w/w)의 BLG를 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 최대 10%(w/w)의 탄수화물, 바람직하게는 최대 5%(w/w)의 탄수화물, 보다 바람직하게는 최대 1%(w/w)의 탄수화물, 훨씬 더 바람직하게는 최대 0.1%(w/w)의 탄수화물을 함유한다.
또한, 식용 BLG 조성물은 지질을 예를 들어 트리글리세라이드 및/또는 기타 다른 지질 유형, 예컨대 인지질 형태로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서 식용 BLG 조성물은 총 고체에 대해 최대 1%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 총 고체에 대해 최대 0.5%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 총 고체에 대해 최대 0.1%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 총 고체에 대해 최대 0.05%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다. 가장 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 총 고체에 대해 최대 0.01%(w/w)의 지질의 총량을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 건조 조성물, 및 예를 들어 분말이다. 식용 BLG 조성물은 분무-건조된 분말인 것이 특히 바람직하다.
본 발명자들은 건조될 때 BLG의 적어도 일부가 결정 형태인 분말 형태의 식용 BLG 조성물이 BLG 결정이 없는 비교용 BLG 조성물훨씬 더 높은 밀도를 갖는다는 것을 알게 되었다(실시예 7 참조). 이러한 고 밀도 효과는 매우 놀랍게도 분무-건조된 BLG 결정 슬러리로부터 수득된 분말 형태의 식용 BLG 조성물에 대해 또한 관찰된다.
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 적어도 0.40 g/mL의 벌크 밀도를 갖는다. 바람직하게는 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 적어도 0.45 g/mL의 벌크 밀도를 갖는다. 보다 바람직하게는 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 적어도 0.50 g/mL의 벌크 밀도를 갖는다. 분말 형태의 식용 BLG 조성물이 적어도 0.6 g/mL의 벌크 밀도를 갖는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말 형태의 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 적어도 0.7 g/mL의 벌크 밀도를 가질 수 있다.
벌크 밀도의 장점은 BLG가 거의 존재하는 유일한 단백질인 식용 BLG 조성물의 분말과 BLG의 농도가 유장 단백질 용액에 존재하는 기타 다른 단백질에 대해 강화되지 않은 식용 BLG 조성물의 분말 둘 다에 적용된다. 따라서, 본 발명은 상당한 양의 ALA 및 BLG 이외의 기타 다른 유장 단백질을 포함하는 단리된 BLG 및 조 유장 단백질 둘 다의 고 밀도 분말을 제공한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 적어도 0.45 g/mL의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 적어도 0.50 g/mL의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다. 분말 형태의 식용 BLG 조성물이 적어도 0.6 g/mL의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말 형태의 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 적어도 0.7 g/mL의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 적어도 0.45 g/mL의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 적어도 0.50 g/mL의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 분말 형태의 식용 BLG 조성물이 적어도 0.6 g/mL의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말 형태의 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 적어도 0.7 g/mL의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다.
분말 형태의 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 0.40 내지 1.5 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.45 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.50 내지 0.9 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 분말화된 식용 BLG 조성물이 0.6 내지 0.9 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말화된 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 0.6 내지 0.8 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다.
본 발명자들은 본 발명의 고 밀도 분말이 유리하게는 분말 1 kg 당 더 적은 포장 재료가 요구되고 주어진 용기 또는 트럭에 의해 더 많은 분말(질량)이 운반될 수 있기 때문에 분말의 보다 비용 효율적인 포장 및 물류를 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
분말 형태의 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 0.40 내지 1.5 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있다. 바람직하게는, 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.45 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖는다. 보다 바람직하게는 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.50 내지 0.9 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있다. 분말화된 식용 BLG 조성물이 0.6 내지 0.9 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말화된 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 0.6 내지 0.8 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 0.50 내지 1.5 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖는다. 바람직하게는, 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.55 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖는다. 보다 바람직하게는 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.60 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있다. 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.65 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말화된 식용 BLG 조성물은 바람직하게는 0.70 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있다.
분말 형태의 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 0.40 내지 1.5 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.45 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.50 내지 0.9 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다. 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.6 내지 0.9 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말화된 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 0.6 내지 0.8 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다.
분말 형태의 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 0.40 내지 1.5 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.45 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.50 내지 0.9 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.6 내지 0.9 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말화된 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 0.6 내지 0.8 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 0.50 내지 1.5 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.55 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.60 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다. 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.65 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말화된 식용 BLG 조성물은 바람직하게는 0.70 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 70%(w/w)의 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서 분말 형태의 식용 BLG 조성물은 0.50 내지 1.5 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.55 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.60 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다. 분말화된 식용 BLG 조성물은 0.65 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 갖고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 분말화된 식용 BLG 조성물은 바람직하게는 0.70 내지 1.0 g/mL 범위의 벌크 밀도를 가질 수 있고, 조성물의 총 중량에 대해 적어도 80%(w/w)의 단백질을 포함한다.
분말의 벌크 밀도는 실시예 9.3에 따라 측정된다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 BLG 조성물이 유사한 BLG 조성물훨씬 더 우수한 장기 안정성을 갖는다는 징후를 발견하였다. 이것은 BLG의 적어도 일부가 BLG 분자의 보다 우수한 저장 안정성을 제공하는 것으로 보이는 BLG 결정의 형태로 존재하는 경우에 특히 그러하다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 건조 BLG 조성물은 30℃에서 60일 후 최대 80 mg/100 g(단백질), 바람직하게는 최대 60 mg/100 g(단백질), 보다 바람직하게는 최대 40 mg/100 g(단백질), 훨씬 더 바람직하게는 최대 20 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다. 가장 바람직하게는, 건조 BLG 조성물은 30℃에서 60일 후 최대 10 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 건조 BLG 조성물은 최대 80 mg/100 g(단백질), 바람직하게는 최대 60 mg/100 g(단백질), 보다 바람직하게는 최대 40 mg/100 g(단백질), 훨씬 더 바람직하게는 최대 20 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다. 가장 바람직하게는, 건조 BLG 조성물은 최대 10 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다. 바람직하게는 건조 BLG 조성물은 0 mg/100 g(단백질)의 푸로신가를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 건조 BLG 조성물의 BLG는 30℃에서 60일 후 최대 1, 바람직하게는 최대 0.6, 보다 바람직하게는 0.2, 훨씬 더 바람직하게는 최대 0.1, 및 가장 바람직하게는 최대 0.01의 락토실화도를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 액체 조성물이다. 액체 식용 BLG 조성물은 바람직하게는 적어도 20%(w/w)의 물, 보다 바람직하게는 적어도 30%(w/w)의 물, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 40%(w/w)를 포함한다.
액체 식용 BLG 조성물은, 예를 들어 20 내지 90%(w/w) 범위의 물, 보다 바람직하게는 30 내지 80%(w/w) 범위의 물, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 40%(w/w)를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 식용 BLG 조성물이 놀랍게도 낮은 단백질 변성도를 갖는다는 것을 발견하였으며, 심지어 분무-건조를 사용하여 식용 BLG 분말 조성물을 제조하였다(실시예 11 참조).
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 최대 2%의 단백질 변성도를 갖는다. 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 최대 1.5%의 단백질 변성도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 최대 1.0%의 단백질 변성도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 최대 0.8%의 단백질 변성도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 식용 BLG 조성물은 최대 0.5%의 단백질 변성도를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은 건조 분말, 및 바람직하게는 분무-건조된 분말이고, 최대 2%, 바람직하게는 최대 1.5%의 단백질 변성도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 예를 들어 분무-건조된 분말 형태의 건조 식용 BLG 조성물은 최대 1.0%의 단백질 변성도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 예를 들어 분무-건조된 분말 형태의 건조 식용 BLG 조성물은 최대 0.8%의 단백질 변성도를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 예를 들어 분무-건조된 분말 형태의 건조 식용 BLG 조성물은 최대 0.5%의 단백질 변성도를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은:
- 최대 6%(w/w)의 물
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질
- 총 단백질에 대해 적어도 95%의 BLG
를 포함하고, 상기 식용 BLG 조성물은:
- 건조 분말이고,
- 적어도 0.50 g/mL, 바람직하게는 적어도 0.60 g/mL의 벌크 밀도를 갖는다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은:
- 최대 6%(w/w)의 물
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질
- 총 단백질에 대해 적어도 95%의 BLG
를 포함하고, 상기 식용 BLG 조성물은:
- 건조 분말이고,
- 적어도 0.50 g/mL, 바람직하게는 적어도 0.60 g/mL의 벌크 밀도를 갖고,
- 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%의 BLG의 결정도를 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은:
- 최대 6%(w/w)의 물
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질
- 총 단백질에 대해 적어도 95%의 BLG
를 포함하고, 상기 식용 BLG 조성물은:
- 건조 분말이고,
- 적어도 0.50 g/mL, 바람직하게는 적어도 0.60 g/mL의 벌크 밀도를 갖고,
- 최대 2%, 바람직하게는 최대 1.0%의 단백질 변성도를 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은:
- 최대 6%(w/w)의 물
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질,
- 총 단백질에 대해 적어도 95%의 BLG,
- 단백질 100 g 당 최대 80 mg의 인
을 포함하고, 상기 식용 BLG 조성물은:
- 건조 분말이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은:
- 최대 6%(w/w)의 물
- 총 고체에 대해 적어도 90%의 총 단백질,
- 총 단백질에 대해 적어도 97%의 BLG,
- 단백질 100 g 당 최대 50 mg의 인
을 포함하고, 상기 식용 BLG 조성물은:
- 건조 분말이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은:
- 최대 6%(w/w)의 물
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질, 바람직하게는 총 고체에 대해 적어도 90%의 총 단백질,
- 총 단백질에 대해 30 내지 70%의 BLG,
- 총 단백질에 대해 8 내지 25%(w/w)의 ALA
를 포함하고, 상기 식용 BLG 조성물은:
- 건조 분말이고,
- 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%의 BLG의 결정도를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은:
- 20 내지 80%(w/w)의 물, 바람직하게는 20 내지 60%(w/w)의 물,
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질, 및 바람직하게는 적어도 90%의 총 단백질
- 총 단백질에 대해 적어도 95%의 BLG,
- 단백질 100 g 당 최대 80 mg의 인
을 포함하고, 상기 식용 BLG 조성물은:
- 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40의 BLG의 결정도를 갖고,
- 선택적으로, 최대 2%, 바람직하게는 최대 1.0%의 단백질 변성도를 갖는다.
이러한 구현예에 따른 식용 조성물이 건조된 형태의 식용 BLG 조성물을 제조하는 데 특히 유용하고, 유장 단백질 종 유장 단백질의 일반적인 농도 프로파일을 갖지만 건조된 BLG 결정 형태로 BLG의 적어도 일부를 함유하는 고 밀도 유장 단백질 분말의 분무-건조 및 제조에 특히 적합하다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 식용 BLG 조성물은:
- 20 내지 80%(w/w)의 물, 바람직하게는 20 내지 60%(w/w)의 물,
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질, 바람직하게는 총 고체에 대해 적어도 90%의 총 단백질,
- 총 단백질에 대해 30 내지 70%의 BLG,
- 총 단백질에 대해 8 내지 25%(w/w)의 ALA
를 포함하고, 상기 식용 BLG 조성물은:
- 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%의 BLG의 결정도를 갖는다.
이러한 구현예에 따른 식용 조성물이 건조된 형태의 식용 BLG 조성물을 제조하는 데 특히 유용하고, 유장 단백질 종 유장 단백질의 일반적인 농도 프로파일을 갖지만, BLG의 적어도 일부를 건조된 BLG 결정 형태로 함유하는 고 밀도 유장 단백질 분말의 분무-건조 및 제조에 특히 적합하다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 식품 성분으로서 본원에 정의된 바와 같은 식용 BLG 조성물의 용도에 관한 것이다.
예를 들어, 낮은 인 식료품의 제조에 식품 성분으로서 본원에 정의된 바와 같은 낮은 인, 식용 BLG 조성물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 정의된 바와 같은 식용 BLG 조성물 및 적어도 추가의 성분, 예컨대 지방 및/또는 탄수화물의 공급원을 포함하는 식료품에 관한 것이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식료품은 탄수화물 및 단백질을 포함하는 건조 식료품, 예를 들어 바(bar)이고, 상기 건조 식료품은 적어도 1%(w/w)의 BLG, 바람직하게는 적어도 5%를 포함하고, 여기서:
i) BLG의 결정도는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%이고/이거나
ii) 단백질의 총량의 적어도 90%(w/w)가 BLG에 의해 구성된다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 구현예에서 식료품은 단백질 100 g 당 최대 100 mg의 인, 바람직하게는 단백질 100 g 당 최대 80 mg의 인, 보다 바람직하게는 단백질 100 g 당 최대 40 mg의 인, 훨씬 더 바람직하게는 단백질 100 g 당 최대 20 mg의 인을 포함하는 낮은 인 식료품이다.
BLG는 바람직한 아미노산 프로파일을 갖고, 바람직하게는 식료품의 단백질의 중요한 부분에 기여한다. 이것은 식료품이 낮은 무기물 또는 낮은 인 식료품일 경우, 특히 흥미롭다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식용 BLG 조성물은 식료품의 단백질의 총량의 적어도 25%(w/w) 또는 적어도 50%(w/w), 보다 바람직하게는 적어도 80%(w/w), 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%(w/w)에 기여한다. 심지어 식용 BLG 조성물이 식료품의 모든 단백질에 기여하는 것이 가장 바람직할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 낮은 인, 식용 BLG 조성물은 낮은 인 식료품의 단백질의 총량의 적어도 25%(w/w) 또는 적어도 50%(w/w), 보다 바람직하게는 적어도 80%(w/w), 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%(w/w)에 기여한다. 심지어 낮은 인, 식용 BLG 조성물이 낮은 인 식료품의 모든 단백질에 기여하는 것이 가장 바람직할 수 있다.
식료품의 비제한적인 예는, 예를 들어 유제품, 캔디, 음료, 단백질 바, 장내 영약학적 조성물, 빵제품이다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서 식료품은 음료이다. 음료는 바람직하게는:
- 적어도 1%(w/w), 바람직하게는 적어도 5%(w/w), 보다 바람직하게는 적어도 8%(w/w), 훨씬 더 바람직하게는 적어도 12%(w/w)의 BLG의 총량으로 제공되는 본원에 정의된 바와 같은 식용 BLG 조성물,
- 감미료, 예를 들어 당 감미료 및/또는 비-당 감미료,
- 적어도 1종의 식품 산, 예를 들어 시트르산 또는 기타 다른 적합한 식품 산,
- 선택적으로, 향미제, 및
- 최대 80 mg(인)/100 g(단백질)
을 포함하고, 2.5 내지 4.0 범위의 pH를 갖는다.
본 발명자들은 BLG 결정을 포함하는 건조 식용 BLG 조성물로부터 산성 고 단백질, 낮은 무기물, 음료 또는 액체의 제조가 사소하지 않다는 것을 인식하였다. BLG 결정을 포함하는 건조 식용 BLG 조성물은 통상적으로 물에 재현탁될 때 5 내지 6 범위의 pH를 형성하고, pH를 변경시키거나 전도율을 증가시키기 위한 산 또는 염의 첨가는 또한 생성된 액체/음료의 무기물 로드를 증가시킨다.
그러나, 본 발명자들은 카르복실산, 락톤, 카르복실산 무수물, 또는 이들의 조합을 사용하여 pH를 저하시킬 경우, 불필요한 무기물이 첨가되지 않고, 음료/액체의 무기물 조성의 보다 우수한 제어가 수득되게 한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 성분으로서 BLG 결정을 포함하는 식용 BLG 조성물을 사용한 산성화된, 낮은 무기물 액체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
- 카르복실산, 락톤, 카르복실산 무수물, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 산성화제(들)를 제공하는 단계,
- BLG 결정을 포함하는 식용 BLG 조성물을 1종 이상의 산성화제(들), 및 선택적으로 추가의 성분, 예컨대 물, 지방 공급원 및/또는 탄수화물 공급원과 접촉시키고, 상기 1종 이상의 산성화제(들)는 pH를 2 내지 4.5, 및 바람직하게는 2.5 내지 4.0으로 조정하기에 충분한 양으로 사용되고, BLG 결정이 용해되게 하여 액체를 형성하는 단계
를 포함한다.
액체는 예를 들어 음료로서 사용될 수 있거나, 또 다른 식료품의 제조를 위한 성분으로서 사용될 수 있다.
방법에 사용되는 식용 BLG 조성물이 건조 형태로, 예를 들어 분말로서 제공될 경우, 산성화제의 첨가 전에 그것을 물에 재수화시키는 것이 종종 바람직하다.
방법에 사용되는 식용 BLG 조성물은 바람직하게는 1 내지 30%(w/w)의 단백질, 바람직하게는 2 내지 25%(w/w)의 단백질, 보다 바람직하게는 4 내지 20%(w/w)의 단백질, 훨씬 더 바람직하게는 5 내지 16%(w/w)의 단백질을 제공하기에 충분한 양으로 액체에 존재한다. 방법에 사용되는 식용 BLG 조성물은 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70%의 BLG의 결정도를 갖는다.
적합한 산성화제(들)의 예는:
- 카르복실산, 예컨대 아세트산, 말레산, 타르타르산, 락트산, 시트르산, 글루콘산, 또는 이들의 혼합물,
- 락톤, 예컨대 D-글루코노-델타-락톤,
- 카르복실산 무수물이다.
일부 바람직한 구현예에서 방법에 사용되는 BLG 결정을 포함하는 식용 BLG 조성물은 바람직하게는 낮은 인 조성물이고, 방법에 사용되는 임의의 기타 다른 성분은 바람직하게는 최종 액체가 또한 낮은 인 조성물이도록 선택된다.
다른 바람직한 구현예에서 방법에 사용되는 BLG 결정을 포함하는 식용 BLG 조성물은 바람직하게는 낮은 무기물 조성이고, 방법에 사용되는 임의의 기타 다른 성분은 바람직하게는 최종 액체가 또한 낮은 무기물 조성물이도록 선택된다.
방법은 바람직하게는 1 내지 65℃ 범위, 바람직하게는 2 내지 50℃, 보다 바람직하게는 3 내지 20℃ 범위, 훨씬 더 바람직하게는 4 내지 15℃ 범위의 온도에서 수행된다.
본 발명은 특정 구현예를 참조로 상기에 기재되었다. 그러나, 상기 기재한 것과 다른 구현예가 본 발명의 범주 내에서 동등하게 가능할 수 있다. 본 발명의 다양한 구현예 및 양태의 상이한 특성 및 단계는 달리 언급되지 않는 한 본원에 기재된 것과 다른 방식으로 조합될 수 있다.
도 1은 감미 유장을 기재로 하는 조 유장 단백질 용액(실선) 및 결정화 후 생성된 모액(점선)의 2개의 중첩된 크로마토그램을 나타낸다. 실선과 점선 사이의 차이는 제거된 BLG 결정으로 인한 것이다.
도 2는 실시예 1로부터 회수된 BLG 결정의 현미경 사진이다.
도 3은 실시예 1로부터의 회수된 BLG 결정의 크로마토그램이다.
도 4는 유장 단백질 용액의 전도율과 회수된 BLG 결정의 수득된 수율 사이의 관계의 플롯이다.
도 5는 온도와 유장 단백질 용액의 전도율 및 회수된 BLG 결정의 수득된 수율 사이의 관계의 플롯이다.
도 6은 유장 단백질 용액의 총 단백질 함량(단백질 함량과 비례하는 도 브릭스(Brix)에 의해 간접적으로 나타냄)과 회수된 BLG 결정의 수득된 수율 사이의 관계를 예시한다.
도 7은 실시예 3의 공급물 1(실선) 및 BLG 결정의 결정화 및 제거 후 수득된 모액(점선)의 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 실시예 3의 공급물 1의 결정화의 초기 단계 동안 취해진 샘플의 현미경 사진이다.
도 9는 실시예 3의 공급물 1의 결정화의 완료 후 취해진 샘플의 현미경 사진이다.
도 10은 실시예 3의 공급물 1로부터 수득된 세척된 BLG 결정의 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 실시예 3의 공급물 2(실선) 및 BLG 결정의 결정화 및 제거 후 수득된 모액(점선)의 크로마토그램을 나타낸다.
도 12는 결정화 전(좌측 사진) 및 후(우측 사진)의 실시예 3의 공급물 2의 사진을 나타낸다.
도 13은 실시예 3의 공급물 2로부터 수득된 전체 및 단편화된 것 둘 다의 BLG 결정의 현미경 사진을 나타낸다.
도 14 및 15는 전도율의 상승 또는 BLG 결정 슬러리의 pH의 변경이 BLG 결정을 용해시킨다는 것을 나타낸다.
도 16 및 17은 결정화 전(좌측 사진) 및 후(우측 사진)의 실시예 3의 공급물 3의 사진을 나타낸다.
도 18은 실시예 3의 공급물 3으로부터 회수된 BLG 결정의 현미경 사진이다.
도 19는 임의의 세척 단계 없이 실시예 3의 공급물 3의 회수된 BLG 결정의 크로마토그램을 나타낸다.
도 20은 회수된 BLG 결정의 수율에 대한 전도율 증가의 영향을 나타낸다.
도 21은 4.20 mS/cm의 전도율에서 형성된 BLG 결정의 현미경 사진이다.
도 22는 SPC-기재 유장 단백질 용액의 결정화의 초기 단계로부터 BLG 결정의 현미경 사진을 나타낸다.
도 23은 표준 유장 단백질 단리물(WPI) 및 본 발명의 고 순도 BLG 조성물의 벌크 밀도의 차이를 예시하며, 조성물은 BLG 결정을 함유한다.
도 24는 실시예 3, 공급물 1의 BLG 결정이 모액으로부터 분리된 스핀 필터의 사진이다.
도 25는 실시예 8의 6개의 낮은 인 음료 샘플의 서브-샘플의 사진이다. 좌측에서 우측으로 서브-샘플은 샘플 A, B, C, D, E 및 F이다.
도 26은 모액으로부터 BLG 결정의 분리를 위해 DCF를 사용하는 실시예 10의 결정화 공정 변법의 개략도이다.
도 27은 필터 원심 분리기를 사용한 BLG 결정 및 모액의 분리로부터 수득된 필터 케이크의 3개의 사진을 나타낸다.
도 2는 실시예 1로부터 회수된 BLG 결정의 현미경 사진이다.
도 3은 실시예 1로부터의 회수된 BLG 결정의 크로마토그램이다.
도 4는 유장 단백질 용액의 전도율과 회수된 BLG 결정의 수득된 수율 사이의 관계의 플롯이다.
도 5는 온도와 유장 단백질 용액의 전도율 및 회수된 BLG 결정의 수득된 수율 사이의 관계의 플롯이다.
도 6은 유장 단백질 용액의 총 단백질 함량(단백질 함량과 비례하는 도 브릭스(Brix)에 의해 간접적으로 나타냄)과 회수된 BLG 결정의 수득된 수율 사이의 관계를 예시한다.
도 7은 실시예 3의 공급물 1(실선) 및 BLG 결정의 결정화 및 제거 후 수득된 모액(점선)의 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 실시예 3의 공급물 1의 결정화의 초기 단계 동안 취해진 샘플의 현미경 사진이다.
도 9는 실시예 3의 공급물 1의 결정화의 완료 후 취해진 샘플의 현미경 사진이다.
도 10은 실시예 3의 공급물 1로부터 수득된 세척된 BLG 결정의 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 실시예 3의 공급물 2(실선) 및 BLG 결정의 결정화 및 제거 후 수득된 모액(점선)의 크로마토그램을 나타낸다.
도 12는 결정화 전(좌측 사진) 및 후(우측 사진)의 실시예 3의 공급물 2의 사진을 나타낸다.
도 13은 실시예 3의 공급물 2로부터 수득된 전체 및 단편화된 것 둘 다의 BLG 결정의 현미경 사진을 나타낸다.
도 14 및 15는 전도율의 상승 또는 BLG 결정 슬러리의 pH의 변경이 BLG 결정을 용해시킨다는 것을 나타낸다.
도 16 및 17은 결정화 전(좌측 사진) 및 후(우측 사진)의 실시예 3의 공급물 3의 사진을 나타낸다.
도 18은 실시예 3의 공급물 3으로부터 회수된 BLG 결정의 현미경 사진이다.
도 19는 임의의 세척 단계 없이 실시예 3의 공급물 3의 회수된 BLG 결정의 크로마토그램을 나타낸다.
도 20은 회수된 BLG 결정의 수율에 대한 전도율 증가의 영향을 나타낸다.
도 21은 4.20 mS/cm의 전도율에서 형성된 BLG 결정의 현미경 사진이다.
도 22는 SPC-기재 유장 단백질 용액의 결정화의 초기 단계로부터 BLG 결정의 현미경 사진을 나타낸다.
도 23은 표준 유장 단백질 단리물(WPI) 및 본 발명의 고 순도 BLG 조성물의 벌크 밀도의 차이를 예시하며, 조성물은 BLG 결정을 함유한다.
도 24는 실시예 3, 공급물 1의 BLG 결정이 모액으로부터 분리된 스핀 필터의 사진이다.
도 25는 실시예 8의 6개의 낮은 인 음료 샘플의 서브-샘플의 사진이다. 좌측에서 우측으로 서브-샘플은 샘플 A, B, C, D, E 및 F이다.
도 26은 모액으로부터 BLG 결정의 분리를 위해 DCF를 사용하는 실시예 10의 결정화 공정 변법의 개략도이다.
도 27은 필터 원심 분리기를 사용한 BLG 결정 및 모액의 분리로부터 수득된 필터 케이크의 3개의 사진을 나타낸다.
실시예
실시예 1: 조 유장 단백질 농축물로부터 베타-락토글로불린의 결정화
프로토콜:
표준 치즈 제조 공정으로부터의 감미 유장으로부터 유래되고, 1.2 미크론 필터를 통해 여과된 락토스 감손 UF 투석유물을 BLG 결정화 공정을 위한 공급물로서 사용하였다. 감미 유장 공급물을 21% TS(총 고체)±5의 공급물 농도, 및 정용여과 매질로서 폴리싱된 물(최대 0.05 mS/cm의 전도율을 수득하기 위하여 역삼투에 의해 여과된 물)을 사용하여 1.5 내지 3.0 bar의 46 mil 스페이서 공급물 압력을 갖는 코치(Koch) HFK-328 유형 막을 사용하여 한외여과 장비 상에서 컨디셔닝하였다. 한외여과 동안 공급물 및 투석유물의 온도는 약 12℃이었다. 이어서, HCl을 첨가하여 약 5.40의 pH를 수득함으로써 pH를 조정하였다. 투석유물의 전도율의 강하가 20분에 동안 0.03 mS/cm 미만이 될 때까지 정용여과를 계속하였다. 이어서, 투석유물을 약 30% TS로 농축하였다(농축된 투석유물의 총 중량에 대해 약 23.1%의 총 단백질). 농축된 투석유물의 샘플을 5분 동안 3000 g에서 원심분리하였지만, 눈에 보이는 펠렛이 형성되지 않았다. 상청액에 HPLC 분석을 수행하였다. 공급물의 조성을 표 1에 나타내었다.
농축된 투석유물을 (공급물 2의 맥락에서 실시예 3에 기재된 바와 같이) 자발적인 BLG 결정화로부터 수득된 0.5 g/L의 순수한 BLG 결정 물질로 시딩하였다. 시딩 물질은, BLG 결정 슬러리를 밀리큐 워터에서 5회 세척하고, 각각의 세척 후 BLG 결정을 수집함으로써 제조되었다. 세척 후, BLG 결정을 동결 건조시키고, 막자 및 막자사발을 사용하여 분쇄시킨 후, 200 미크론의 체를 통해 통과시켰다. 따라서, 결정화 시드는 200 미크론 미만의 입자 크기를 가졌다.
농축된 투석유물을 300 L 결정화 탱크로 옮기고, 여기서 그것을 약 4℃까지 냉각시키고, 완만한 교반과 함께 이 온도에서 밤새 유지시켰다. 다음날 아침, 냉각된 농축 투석유물의 샘플을 시험 관으로 옮기고, 가시적으로 및 현미경 관찰 둘 다로 조사하였다. 신속한 침전 결정이 밤새 명확하게 형성되었다. 결정 및 모액 둘 다를 포함하는 혼합물의 실험실 샘플을 빙수조에서 0℃까지 더 냉각시켰다. 모액 및 결정을 5분 동안 원심 분리 3000 g에 의해 분리하고, 상청액 및 펠렛의 샘플을 HPLC 분석을 위해 취하였다. 결정을 저온 폴리싱된 물에서 한번 세척한 후, 펠렛의 동결-건조 전에 다시 원심분리하였다.
| 공급물 95% TS로 표준화됨 | ||
| 단백질 조성 (총 단백질에 대한 % w/w) | ||
| ALA | 17.7 | |
| BLG | 51.6 | |
| CMP | 19.5 | |
| 기타 다른 성분(표준화된 공급물의 총 중량에 대한 % w/w) | ||
| Ca | 0.357 | |
| K | 0.200 | |
| Mg | 0.058 | |
| Na | 0.045 | |
| P | 0.280 | |
| 지방 | 5.6 | |
| 단백질 | 79 | |
HPLC에 의한 BLG 상대 수율 정량화:
폴리싱된 물을 첨가하여 모든 샘플에 동일한 정도의 희석을 수행하였다. 샘플을 0.22 미크론 필터를 통해 여과하였다. 각각의 샘플에 대해 동일한 부피를 페노메넥스 주피터(Phenomenex Jupiter)® 5 μm C4 300 Å, LC 컬럼 250 Х 4.6 mm (부품 번호:00G-4167-E0)를 갖는 HPLC 시스템 상에 로딩하고, 214 nm에서 검출하였다.
다음의 조건을 사용하여 샘플을 수행하였다:
완충제 A: 밀리큐 워터, 0.1%w/w의 TFA
완충제 B: HPLC 등급 아세토니트릴, 0.085%w/w의 TFA
흐름: 1 ml/분
구배: 0 내지 30분 82 내지 55% A 및 18 내지 45% B; 30 내지 32분 55 내지 10% A 및 45 내지 90% B; 32.5 내지 37.5분 10% A 및 90% B; 38 분 내지 48분 10 내지 82% A 및 90 내지 18% B.
데이터 처리:
모든 샘플이 동일한 방식으로 처리되었기 때문에, BLG 피크의 면적을 직접 비교하여 상대 수율을 얻을 수 있다. 결정이 단지 BLG만을 함유하고, 모든 샘플이 동일한 방식으로 처리되었기 때문에, 알파-락트알부민(ALA)의 농도 및 따라서 ALA의 면적은 모든 샘플에서 동일하여야 하므로, 결정화 전후의 ALA의 면적은 상대 수율을 계산할 때 보정 계수(cf)로서 사용되었다.
상대 수율은 다음의 식에 의해 계산된다:
결과:
도 1은 감미 유장으로부터 BLG의 결정화 전후로부터의 중첩된 크로마토그램을 나타낸다. "결정화 전" 샘플은 검은색 실선으로 나타내고, "결정화 후" 샘플은 점선으로 나타냈다. BLG의 농도의 큰 감소가 일어나고, 상기 기재된 바와 같은 수율 계산을 사용하여 제거된 BLG의 수율은 64.5%(w/w)로 결정되었다.
결정 슬러리를 현미경 관찰에 의해 조사하였으며; 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 샘플은 6각형 결정을 함유하고, 다수가 200 미크론을 상당히 초과하는 크기를 가졌으며, 이는 관찰된 결정이 단지 시딩 결정만이 아니라는 것을 지시하였다. 결정은 니들로 압착될 때 쉽게 산산이 부서졌으며, 이것은 그것이 단백질 결정이라는 것을 확인해 주었다.
도 3은 세척된 결정 생성물의 크로마토그램을 나타내고, 이 경우, BLG는 크로마토그램의 전체 면적의 98.9%를 구성한다. BLG 생성물의 순도는 추가의 세척에 의해 훨씬 더 증가될 수 있다.
결론:
본 실시예는 놀랍게도 총 단백질에 대해 48% 초과의 비-BLG 단백질을 함유하는 조 유장 단백질 농축물로부터 선택적으로 BLG를 결정화시킬 수 있고, 수득된 BLG 결정 단리물은 매우 높은 순도를 갖는다는 것을 입증하였다. 이러한 발견은 바람직하게는 고온 및 문제가 있는 화학 물질에 대한 장기간의 노출을 방지하는 완만한 방식으로 BLG가 기타 다른 단백질 성분으로부터 분리되는, 산업적 우유 단백질 분리를 위한 새로운 접근법을 가능하게 한다.
실시예 2: BLG의 수율에 대한 전도율 및 온도의 영향
프로토콜:
실시예 1에서와 동일한 공급물, 실험 및 분석 설정을 사용하여, 투석유물의 샘플(약 13.9%(w/w)의 총 단백질)을 UF 정용여과 동안 상이한 전도율 수준에서 취하여 BLG 결정의 수율에 대한 전도율의 영향을 조사하였다. 샘플을 4℃까지 냉각시키고, 이 온도에서 밤새 유지시킨 후(그러나, 본 발명자들은 30분 또는 그 이하가 평형화에 도달하기에 충분할 수 있다는 것을 알게 되었다) 3개의 샘플을 빙수에서 0℃까지 냉각시키고, 이 온도에서 적어도 1시간 동안 유지시켜 수율에 대한 온도의 영향을 관찰하였다. 4℃ 샘플에 대한 결과는 도 4에서 알 수 있다.
정용여과가 완료된 후, 샘플을 농축 동안 브릭스 21, 24 및 32.5에서 취하였다. 이러한 샘플을 먼저 4℃까지 냉각시키고, 이 온도에서 밤새 유지시켰다. BLG 결정의 수율을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 이어서, 샘플을 빙수에서 0℃까지 냉각시키고, 이 온도에서 적어도 1시간 동안 유지시켰다. 이후에, BLG 결정의 수율을 다시 측정하였다.
결과:
도 4에서 보여지는 바와 같이, BLG의 상대 수율 대 샘플에서 전도율을 플롯팅할 때, 낮은 전도율과 높은 BLG의 상대 수율 사이에 명확한 상관관계가 있다.
도 5에서, 전도율이 상이한 3개의 샘플의 수율이 2개의 온도(4 및 0℃에서 나타나있고, 온도가 낮을수록, BLG의 수율이 높다는 것을 알 수 있다. 온도를 훨씬 더 저하시키면 수율이 증가할 것으로 예상된다.
도 6은 4 및 0℃둘 다에서 BLG의 상대 수율에 대한 단백질 농도의 영향을 나타낸다. 상기 도면은 브릭스 측정을 통해 여기서 나타난 단백질 농도와 BLG의 상대 수율 사이에 명확한 상관관계를 나타내며, 이것은 단백질 농도가 증가할수록 상대 수율이 계속 증가한다는 것을 지시한다.
결론:
본 발명자들은 다수의 파라미터가 결정화 공정의 효율에 영향을 미친다는 것을 관찰하였다. 주어진 pH 값에서 BLG의 수율은 전도율을 감소시키고, BLG의 농도를 증가시키고, 온도를 감소시킴으로써 증가될 수 있다.
실시예 3: 3가지 유형의 유장 단백질 용액 중 BLG의 결정화
프로토콜:
실시예 1에서와 동일한 실험 및 분석 설정을 사용하여, 3가지 상이한 유형의 유장 단백질-함유 원료를 공급물로서 결정화에 대해 시험하였다. 그러나, 공급물 2를 사용하여 수행된 실험에는 시딩이 사용되지 않았다. 공급물 1 및 2는 감미 유장을 기재로 하고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 처리 전에 신더(Synder) FR 막을 통해 지방-감소되었다. 공급물 3은 산 유장으로부터 유래되었다.
3개의 공급물의 조성을 하기 표 2, 표 3 및 표 4에서 알 수 있다. 공급물 3을 21% TS(공급물의 총 중량에 대해 13.3%의 총 단백질), 다른 2개보다 상당히 더 낮은 농도(공급물 1에서 26.3%(w/w) 및 공급물 2에서 25.0%(w/w)의 총 단백질)에서 결정화시켰다.
결정화된 공급물 1의 슬러리를 0.45 미크론 CA 막을 갖는 맥시-스핀 필터 상에서 1500 g에서 5분 동안 원심분리한 후, 2 부피의 밀리큐 워터를 필터 케이크에 첨가한 후, 다시 원심분리하였다. 생성된 필터 케이크를 HPLC에 의해 분석하였다. 결정화된 공급물 1의 펠렛(필터 케이크)을 보유한 맥시-스핀 필터의 사진이 도 24에 나타나있다. 공급물 2로부터의 펠렛을 2 부피의 밀리큐 워터로 세척하고, 표준 조건하에 다시 원심분리한 후, 펠렛을 HPLC에 의해 분석하였다. 공급물 3으로부터의 펠렛을 세척없이 분석하였다.
공급물 2로부터의 결정을 10% TS로 희석하고, 1 M NaOH를 사용하여 pH를 pH 7로 조정하여 결정화를 반전시켰다. NaCl을 공급물 2로부터의 결정 슬러리, 36% TS에 첨가하여 결정화를 반전시켰다.
| 공급물 1 (95% TS로 표준화됨) 단백질 조성(총 단백질에 대한 % w/w) |
|
| ALA | 23.0 |
| BLG | 55.1 |
| CMP | 20.5 |
| 기타 다른 성분(표준화된 공급물의 총 중량에 대한 % w/w) | |
| Ca | 0.387 |
| K | 0.290 |
| Mg | 0.066 |
| Na | 0.068 |
| P | 0.207 |
| 지방 | BDL |
| 단백질 농도 | 90 |
| 95% TS로 표준화된 공급물 2 단백질 조성(총 단백질에 대한 % w/w) |
|
| ALA | 12.2 |
| BLG | 70.0 |
| CMP | 17.1 |
| 기타 다른 성분(표준화된 공급물의 총 중량에 대한 % w/w) | |
| Ca | 0.387 |
| K | 0.204 |
| Mg | 0.066 |
| Na | 0.051 |
| P | 0.174 |
| 지방 | BDL |
| 단백질 농도 | 89 |
| 95% TS로 표준화된 공급물 3 단백질 조성(총 단백질에 대한 % w/w) |
|
| ALA | 24.0 |
| BLG | 63.6 |
| 기타 다른 유장 단백질 | 12.4 |
| 기타 다른 성분(표준화된 공급물의 총 중량에 대한 % w/w) | |
| Ca | 0.205 |
| K | 0.051 |
| Mg | 0.013 |
| Na | 0.108 |
| P | 0.240 |
| 지방 | 5.1 |
| 단백질 농도 | 79 |
결과:
공급물 1:
도 7에서, 공급물(실선) 및 모액(점선)의 단백질 조성의 크로마토그램을 볼 수 있다. BLG의 상당 부분이 공정에 의해 결정으로 회수되었음이 분명하였다. 단리된 BLG의 수율(실시예 1에 기재된 바와 같이 계산됨)은 공급물 중 BLG의 총량에 대해 약 65%였다.
도 8은 결정화기의 초기 단계 동안 취해진 샘플의 현미경 사진이다. 도 9는 결정화가 종결될 때 취해진 샘플의 현미경 사진이다. 2개의 사진으로부터 BLG 결정이 상대적으로 부서지기 쉽다는 것이 명확하다. 결정의 일부는 교반 동안 부서진 것으로 보이며, 6각형 또는 마름모 형상으로부터 결정 단편으로 전환되고, 이것은 여전히 매우 치밀하고 윤곽이 분명한 것으로 나타났지만, 보다 불규칙한 형상을 가졌다.
도 10은 스핀 필터 상에서 분리 및 세척된 BLG 결정의 크로마토그램을 나타낸다. 도면에서 보여지는 바와 같이, 순도가 매우 높고, 다른 유장 단백질의 제거가 매우 효율적이다.
공급물 2:
도 11에서, 공급물 2(실선) 및 수득된 모액(점선)의 단백질 조성을 볼 수 있다. BLG의 상당 부분이 제거되었다는 것이 분명하며, 계산된 수율은 공급물 2 중 BLG의 총량에 대해 82%였다.
도 12는 결정화 전(좌측 사진) 및 후(우측 사진)의 공급물 2를 나타낸다. 결정화 동안 공급물은 투명한 액체(교반 자석이 보임)로부터 유백색의 불투명한 액체로 변환되었다.
도 13은 BLG 결정의 현미경 사진을 나타낸다. 결정의 대부분은 파열되었지만 6각형 형상은 볼 수 있다.
도 16은 2 부피의 밀리큐 워터로 세척된 후 BLG 결정의 단리된 펠렛의 크로마토그램이다. 크로마토그램은 결정이 BLG를 매우 높은 순도로 함유한다는 것을 명확하게 나타낸다.
도 14 및 15는 전도율(NaCl의 첨가에 의해)을 상승시키거나 pH를(NaOH의 첨가에 의해 pH를 7로 조정함으로써) 조정하여 환경이 더 이상 결정질 구조를 선호하지 않게 된 결과를 나타낸다. 두 경우에, 유백색 현탁액은 BLG 결정이 용해될 때 투명한 액체로 변했다.
공급물 2로부터 수득된 결정 제제의 무기물 조성이 표 5에 제공되어 있다. 본 출원인은 단백질에 대한 인의 비가 매우 낮아서 결정 제제가 신장 질환을 갖는 환자를 위한 단백질 공급원으로서 적합하다는 것을 인지하였다.
| 공급물 2로부터 수득된 결정 제제의 조성 | 95% TS로 표준화된 조성에 대한 % w/w |
| Ca | 0.119 |
| K | 0.047 |
| Mg | 0.019 |
| Na | BDL |
| P | BDL(0.026 미만) |
| 총 단백질 | 93.4 |
공급물 3:
도 17에는 공급물 3(실선) 및 생성된 모액(점선)의 단백질 조성의 크로마토그램이 나타내어져 있다. BLG의 상당 부분이 단리된 것이 분명하다(공급물 중 BLG의 총량에 대해 70.3%의 계산 수율). 단백질 함량이 결정화 전에 더 높을 경우, 수득된 수율은 훨씬 더 높았다.
도 18은 공급물 3(실질적으로 CMP를 함유하지 않음)으로부터 단리된 BLG 결정의 현미경 사진이다. 결정은 6각형이 아닌 직사각형 형상을 가졌다. 직사각형 결정은 6각형 결정훨씬 더 강력한 것으로 보였다. 도 19는 세척 없이 단리된 결정 펠렛의 크로마토그램을 나타내고; 크로마토그램은 결정이 6각형 형상 대신 직사각형 형상을 가짐에도 불구하고, BLG 결정이라는 것을 명확하게 나타낸다(예를 들어, 도 18의 직사각형 결정 형상과 도 2의 6각형 결정 형상을 비교).
| 공급물 3으로부터 수득된 결정 제제의 조성 | 95% TS로 표준화된 결정 제제에 대한 % w/w |
| Ca | 0.103 |
| K | BDL |
| Mg | 0.006 |
| Na | 0.035 |
| P | 0.041 |
| 총 단백질 | 90 |
공급물 3으로부터 유래된 결정 제제는 45 mg P/100 g(단백질)을 함유하였다. 본 출원인은 단백질에 대한 인의 비가 매우 낮아서 결정 제제가 신장 질환을 갖는 환자를 위한 단백질 공급원으로서 적합하다는 것을 인지하였다.
결론:
3개의 공급물 모두 BLG 결정화 공정에 적합하였다. BLG 결정은 염을 첨가하거나, pH 또는 온도를 상승시킴으로써 쉽게 용해되었다. 신규 방법은 제제가 신장 질환을 갖는 환자를 위한 단백질 공급원으로서 적합하게 하는 매우 낮은 함량의 인을 갖는 BLG 제제를 제조할 수 있게 하였다.
실시예 4 BLG 결정 수율에 대한 pH의 영향
프로토콜:
pH를 각각의 실험에 대해 표 8에 기재된 수준으로 조정한 것을 제외하고는, 실시예 1에서와 동일한 프로토콜 및 실험 설정(지방-감소된 감미 유장 단백질 농축물을 사용함)을 사용하였다. 결정화 단계의 개시시 단백질 농도는 약 24%(w/w)였다.
묽은 NaOH 용액(4% 초과) 또는 묽은 HCl(3.6% 초과) 용액을 사용하여 pH를 조정하여 결정화 공정 및 수득된 수율에 대한 pH의 영향을 조사하였다. 결정화 후, BLG 결정을 실시예 1에 기재된 바와 같이 원심 분리에 의해 분리하였다.
| 95% TS로 표준화된 사용된 공급물 총 단백질의 단백질 조성%(%) |
|
| ALA | 10 내지 15 |
| BLG | 60 내지 70 |
| CMP | 12 내지 17 |
| 기타 다른 성분(표준화된 공급물의 총 중량에 대한 % w/w) | |
| Ca | 0.36 내지 0.45 |
| K | 0.18 내지 0.22 |
| Mg | 0.04 내지 0.08 |
| Na | 0.02 내지 0.06 |
| P | 0.17 내지 0.20 |
| 지방 | BDL |
| 단백질 농도 | 89 내지 91 |
| 샘플 | 표적 pH |
| 1 | 4.80 |
| 2 | 5.20 |
| 3 | 5.50 |
| 4 | 5.80 |
| 5 | 6.00 |
| 6 | 6.20 |
결과:
실시예 1에 기재된 바와 같이 수율을 계산하였다. 출발 샘플을 시딩 물질의 첨가 전에 취했다는 것에 유의하여야 한다. 따라서, 샘플이 BLG에 대해 과포화되지 않을 경우, 시딩 물질이 용해되고, 총 BLG 농도에 기여하였으며, 이 경우 BLG 수율은 음의 값으로 나타났다.
| 샘플 | pH | 총 BLG의 수율 (%) |
| 1 | 4.84 | -2.7 |
| 2 | 5.20 | 50.0 |
| 3 | 5.44 | 82.0 |
| 4 | 5.73 | 62.1 |
| 5 | 5.93 | 40.9 |
| 6 | 6.12 | -1.6 |
결론:
이 실험은 염용 방식의 BLG의 결정화가 5 내지 6의 pH 범위에서 가능하다는 것을 입증하였다.
실시예 5: 전도율의 수준 증가의 영향 조사
프로토콜:
샘플을 상이한 전도율에서 취한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 프로토콜 및 실험 설정을 사용하였다. 표 10에 나타낸 원료를 컨디셔닝하고, 결정화 공정을 위한 공급물로서 사용하였다. UF 전, 원료의 샘플을 취하고, NaCl을 첨가하여 전도율을 증가시키고, BLG 결정이 성장할 수 있는 전도율 수준을 조사하였다. 결정화 동안 단백질 함량은 약 16.7%(w/w)였다.
| 95% TS로 표준화된 사용된 공급물 단백질 조성(총 단백질에 대한 % w/w) |
|
| ALA BLG CMP |
12.4 64.5 19.8 |
| 기타 다른 성분(표준화된 공급물의 총 중량에 대한 % w/w) | |
| Ca K Mg Na P 지방 단백질 농도 |
0.523 0.534 0.085 0.160 0.235 BDL 86 |
결과:
샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 도 20은 투석유물에서 상이한 전도율에서의 계산된 수율을 나타낸다. 3.53 mS/cm에서의 점은 pH 조정 후 원료였다. 3.53 초과의 모든 점은 NaCl을 첨가하여 전도율을 증가시킨 결과였다. 3.53 미만의 점은 UF 시스템 상 정용여과의 결과였다. 4.93 mS/cm에서의 수율은 0에 가까웠으며 중요하지 않은 것으로 생각되었다.
4.93 mS/cm의 전도율을 갖는 투석유물 샘플은 약 5.7 mS/cm의 UF 투과액 전도율을 가졌다. 3.53 mS/cm의 전도율을 갖는 투석유물 샘플은 약 4.35 mS/cm의 UF 투과액 전도율을 가졌다.
도 20으로부터, BLG 결정이 4.93mS/cm 미만의 전도율에서 (4및 약 16.7%(w/w)의 총 단백질 함량에서) 공급물에 형성되었다는 것을 알 수 있다. 약 2 mS/cm의 투석유물의 전도율 및 약 1.6mS/cm의 UF 투과액 전도율에서 약 75%의 BLG 수율이 수득되었다.
도 21은 예상된 BLG 결정 특징을 나타내는 투석유물에서 4.20 mS/cm에서 형성된 결정의 현미경 사진이다.
결론:
실시예 5의 특정 공급물은 4.93 mS/cm(UF 투과액 전도율 5.75 mS/cm 및 전도율과 단백질의 총량 사이의 비 0.057에 상응함) 미만에서 BLG 결정을 형성할 수 있게 하였다. 전도율의 상한은 단백질 농도 및 단백질 조성에 따라 달라지는 것으로 예상된다. 예를 들어, 고도로 하전된 단백질 또는 기타 다른 거대분자(예를 들어, CMP)의 더 높은 단백질 농도 및/또는 증가된 함량이 전도율의 상한을 상승시키는 것으로 예상되며, 이에 의해 BLG 결정화가 가능하다.
실시예 6: 혈청 단백질 농축물에서 BLG의 결정화
신더 FR 막 및 약 50℃의 공정 온도를 사용하여 탈지유를 미세여과시켜 혈청 단백질 농축물(SPC)을 제조하였다. 수득된 투석유물은 실질적으로 모든 카제인 및 잔여 지방을 함유하고, 또한 일부 혈청 단백질, 락토스 및 무기물을 함유하였다. 투과액은 막을 통해 침투할 수 있는, 혈청 단백질, 락토스 및 무기물을 포함하지만, 카제인 또는 지방을 실질적으로 포함하지 않는 분자를 함유하였다. 이어서, 실시예 1에 기재된 바와 같은 결정화를 위하여 투과액을 제조하고(공급물의 조성에 대해 표 11 참조), 수득된 BLG 결정을 실시예 1에 기재된 바와 같이 특성화하였다. 그러나, 12℃에서 모든 UF 작업을 수행하는 대신, 투석유물의 전도율이 1 mS/cm에 접근하였을 때 투석유물의 온도를 12에서 25℃까지 증가시켰다. 온도를 증가시켜 UF 농축 동안 BLG의 자발적인 결정화를 방지하였다.
| 공급물 95% TS로 표준화됨 단백질 조성(총 단백질에 대한 % w/w) |
|
| ALA | 23.5 |
| BLG | 66.7 |
| 기타 다른 유장 단백질 | 9.8 |
| 기타 다른 성분 (표준화된 공급물의 총 중량에 대한 % w/w) | |
| Ca | 0.292 |
| K | BDL |
| Mg | 0.042 |
| Na | BDL |
| P | 0.149 |
| 지방 | BDL |
| 단백질 농도 | 91 |
실시예 1 내지 5의 결정화와 유사하게, SPC 공급물의 BLG는 매우 높은 순도로 분리되는(이전 실시예에서와 같이 크로마토그래피에 의해 확인됨) 결정을 형성하고, SPC 공급물의 BLG의 총량에 대해 70%의 BLG의 수율을 제공하였다. 도 22에는, 결정화의 초기 단계로부터의 BLG 결정이 나타나있다. 이전에 보여진 바와 같이, 결정은 예를 들어 실시예 2에서 관찰된 6각형 형상이 아닌 직사각형 또는 정사각형 형상을 가졌다.
실시예 7: 분무-건조된 BLG 결정의 제조 및 벌크 밀도의 측정
실시예 3에서 (공급물 2를 사용하여) 제조된 BLG 결정의 부분을 디캔터 원심분리기 상에서 1200 g, 5180 RPM, 110 RPM Diff.에서 64 mil 스페이서(mil은 1/1000 인치를 의미함) 및 25 내지 30 L/h의 유속으로 분리하였다. 이어서, BLG 결정 상을 폴리싱된 물과 1:1로 혼합한 후, 동일한 설정을 사용하여 디캔터 원심분리기 상에서 다시 분리하였다. 이어서, BLG 결정 상을 폴리싱된 물과 혼합하여 약 25%의 건조물을 함유하고, 약 80의 BLG의 결정도를 갖는 슬러리로 만든 후, 시험 공장 분무 건조기 상에서 임의의 예열없이 180℃의 주입구 온도 및 85℃의 출구 온도로 건조시켰다. 분무-건조 될 때까지 액체 스트림의 온도는 10 내지 12℃ 였다. 출구에서 샘플링된 생성된 분말은 4.37%(w/w)의 수분 함량을 가졌다.
슬러리 중 BLG의 결정도는 약 90%였다.
본 발명자들은 또한 디캔터 원심분리기 상에서 350 g, 2750 RPM, 150 RPM Diff.에서 64 mil 스페이서 및 75 L/h의 유속으로 BLG 결정의 슬러리 및 모액을 성공적으로 분리하였다. 이후에 BLG 결정 상을 폴리싱된 물과 1:2로 혼합하였다. 이어서, BLG 결정 상을 폴리싱된 물과 혼합하여 더 묽은 슬러리로 만든 후, 상기 기재된 바와 같은 동일한 파라미터를 사용하여 시험 공장 분무 건조기 상에서 건조시켰다.
이어서, 분무-건조된 분말의 벌크 밀도를 실시예 9.3에 따라 측정하고, 동일한 장비 상에서 건조된 표준 WPI의 벌크 밀도와 비교하였다. 표준 WPI는 WPI 분말에 대해 정상 범위의 하이 엔드인 0.39 g/mL의 벌크 밀도(625 스탬핑을 기반으로 함)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 분무-건조된 BLG 결정 제제는 표준 WPI의 벌크 밀도보다 75% 초과의 더 높은 벌크 밀도 0.68 g/mL를 가졌다(예를 들어 도 23 참조). 이것은 정말로 놀랍고, 다수의 물류 및 응용 관련 이점 둘 다를 제공한다.
| 분무 건조된 BLG 결정 분말 단백질 조성(총 단백질에 대한 % w/w) |
|
| ALA | 0.7 |
| BLG | 97.4 |
| CMP | BDL |
| 기타 다른 성분(BLG 결정 분말의 총 중량에 대한 % w/w) | |
| Ca | 0.118 |
| K | 0.026 |
| Mg | 0.017 |
| Na | BDL |
| P | BDL |
| 물 | 3.8 |
| 단백질 농도 | 94 |
분무-건조된 BLG 결정 제제의 샘플을 이후에 저온 탈염수에 재현탁시키고, BLG 결정은 현미경 관찰에 의해 여전히 명확하게 보였다. 시트르산 또는 NaCl의 첨가는 BLG 결정을 용해시키고, 불투명한 결정 현탁액을 투명한 액체로 변환시켰다.
본 발명자들은 건조 단계 동안 연장된 가열이 결정 형태인 BLG의 양을 감소시키는 징후를 관찰하였다. 따라서, BLG 결정 제조의 열 노출은 가능한 한 낮은 것이 바람직하다.
결론:
본 실시예는 BLG 결정을 포함하는 슬러리가 분무-건조될 수 있고, 건조 단계 동안 가열이 제어될 경우, BLG 결정이 재현탁된 분무-건조된 분말에 여전히 존재한다는 것을 입증하였다.
또한, 본 발명자들은 BLG 결정을 함유하는 유장 단백질 분말의 벌크 밀도가 용해된 단백질 스트림의 일반적인 분무-건조에 의해 수득된 것보다 상당히 더 높다는 것을 발견하였다. 고 밀도 분말은 분말 1 kg 당 더 적은 포장재가 요구되고, 주어진 용기 또는 트럭에 의해 더 많은 분말(질량)이 운반될 수 있기 때문에 분말의 보다 비용 효율적인 포장 및 물류를 허용한다.
또한, 고 밀도 분말은 제조 및 사용 동안 취급하기가 더 쉬우며, 덜 푹신푹신하고 먼지가 적은 것으로 보인다.
실시예 8: 낮은 인 단백질 음료
실시예 3으로부터 정제된 BLG 생성물(공급물 3으로부터 수득된 결정 제제)을 사용하여 6개의 낮은 인 음료 샘플을 제조하였다. 모든 건조 성분을 탈염수와 혼합하여 각각의 샘플 10 kg을 수득하고, 1시간 동안 10℃에서 수화시켰다.
| 성분(% w/w) | 음료 샘플 | |||||
| A | B | C | D | E | F | |
| 실시예 3, 공급물 3으로부터의 건조된 정제된 BLG | 5.0 | 10.0 | 5.0 | 10.0 | 5.0 | 10.0 |
| 시트르산 | pH 3.5까지 | pH 3.5까지 | pH 3.0까지 | pH 3.0까지 | pH 4.0까지 | pH 4.0까지 |
| 수크로스 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10 | 10 |
| 탈염수 | 100%까지 | 100%까지 | 100%까지 | 100%까지 | 100%까지 | 100%까지 |
6개의 샘플의 서브-샘플을 취하여 터비퀀트(Turbiquant)® 3000 IR 탁도계 상에서 혼탁도 및 길슨(Gilson)에 의한 비코만(vicoman) 상에서 점도를 측정하였다. 결과를 하기 표에 나타내었다.
| 샘플 | 점도(Cp) | NTU |
| A | 1.42 | 36.2 |
| B | 2.37 | 46.3 |
| C | 2.69 | 4.9 |
| D | 2.70 | 5.0 |
| E | 1.45 | 63.1 |
| F | 2.25 | 82.1 |
6개의 낮은 인 음료 샘플의 서브-샘플을 함유하는 시험관의 사진이 도 25에 나타나있다. 좌측부터 우측으로 서브-샘플은 샘플 A, B, C, D, E, 및 F였다. 시험관의 육안 조사는 혼탁도 측정을 확인하고, 모든 음료 샘플이 투명하고, 특히 샘플 C 및 D(pH 3.0)가 매우 투명하다는 것을 입증하였다. 낮은 점도는 음료 샘플을 용이하게 마실 수 있다는 것을 입증하였다.
음료의 제조에 사용된 모든 성분은 인이 낮고, 불필요한 무기물을 함유하지 않았다. 따라서 수득된 음료는 약 45 mg P/100 g(단백질)의 인 함량을 갖고 일반적으로 매우 낮은 무기물 함량을 가졌다. 따라서, 6개의 음료는 신장 질환 환자를 위한 단백질 음료로서 사용하기에 적합하였다.
실시예 9 - 분석 방법
실시예 9.1 락토실화된 BLG 대 비-락토실화된 BLG의 측정:
LC-MS를 사용하여 수행된 락토실화된 BLG 및 천연 BLG의 양의 정량화.
애질리언트 테크놀로지즈(Agilent Technologies)로부터의 HP1200 시리즈 HPLC와 커플링된 애질리언트 테크놀로지즈로부터의 6410 트리플 쿼드(Triple Quad) MS 상에서 분석을 수행하였다. 이온화 전 분리를 위하여 시메트리(Symmetry)300™ C18 컬럼(WAT106172: 5 μm 고체 상 입자, 컬럼 치수 2.1 Х 150 mm)을 적용하고, 단백질을 214 nm에서 검출하였다. 샘플을 분석하기 전, 그것을 0.22 미크론 필터를 통해 여과하였다. 모든 샘플을 2회 수행하였다.
다음의 조건을 사용하여 분석을 수행하였다:
HPLC
완충제 A: 0.1%의 TFA를 갖는 99.9%의 밀리큐-밴드(MilliQ-vand)
완충제 B: 9.9%의 밀리큐-밴드, 90%의 아세토니트릴, 0.1%의 TFA
유속: 0.3 mL/분
구배:
0 내지 20분: 85 내지 60% A 및 15 내지 40% B
20 내지 45분: 60 내지 50% A 및 40 내지 50% B
45 내지 55분: 0% A 및 100% B
55 내지 70분: 85% A 및 15% B
로드: 40 μL
컬럼 온도는 60℃로 설정되었다.
질량 분광학:
100 내지 2000의 m/z를 갖는 이온이 검출되고, 생성된 데이터를 매스헌터 워크스테이션 소프트웨어(MassHunter Workstation Software), 버전 B.04.00에서 평가하였다. 디콘볼레이션을 사용하여, 동일한 종(질량)의 모든 형태를 그룹화하였다. 18 kDA와 20 kDa 사이의 질량은 추가로 조사하였다. BLG-A의 온전한 질량은 18.361 kDa이고, BLG-B는 18.276이고, 락토실화는 324 Da를 단백질 질량에 부가하고, 이러한 질량 영역을 시험함으로써, 단백질 당 최대 5개의 락토실화가 검출될 수 있다. 상대 정량화는 각각의 질량에 대한 신호 강도를 비교하고, 다른 종의 이온화 차별을 무시함으로써 이루어졌다.
실시예 9.2: 총 단백질의 측정
샘플의 총 단백질 함량(진성 단백질)을 다음에 의해 측정하였다:
1) ISO 8968-1/2|IDF 020-1/2- 우유 - 질소 함량의 측정 - 파트 1/2: 켈달(Kjeldahl)법을 사용한 질소 함량의 측정에 따라 샘플의 총 질소를 측정함.
2) ISO 8968-4|IDF 020-4- 우유 - 질소 함량의 측정 - 파트 4: 비-단백질-질소 함량의 측정에 따라 샘플의 비-단백질 질소를 측정함.
3) (m총 질소 - m비-단백질-질소)*6.38로서 단백질의 총량을 계산함.
실시예 9.3: 루스 밀도 및 벌크 밀도의 측정
건조 분말의 밀도는 특정 조건 하에 특수 스탬프(Stampf) 체적계(즉, 측정 실린더)를 사용하여 분석된 분말의 중량과 부피 사이의 관계로서 정의된다. 밀도는 통상적으로 g/ml 또는 kg/L로 표현된다.
이 방법에서, 건조된 분말의 샘플을 측정 실린더에 충전하였다. 명시된 수의 탭핑 후 생성물의 부피가 판독되고, 밀도가 계산되었다.
밀도의 3가지 유형이 이러한 방법에 의해 정의될 수 있다:
■ 명시된 측정 실린더로 옮겨진 후, 질량을 분말의 부피로 나눈 것인 퍼드 (Poured) 밀도.
■ 이러한 표준물에서 명시된 조건에 따라 100회 탭핑 후 질량을 분말의 부피로 나눈 것인 루스 밀도.
■ 이러한 표준물에서 명시된 조건에 따라 625회 탭핑 후 질량을 분말의 부피로 나눈 것인 벌크 밀도.
방법은 0 내지 250 ml의 눈금이 매겨진 중량 190±15 g의 250 ml 특수 측정 실린더(J. Engelsmann A. G. 67059 Ludwigshafen/Rh) 및 스탬프 체적계, 예를 들어 제이. 엔젤스만 에이.지.를 사용하였다.
건조된 생성물의 루스 밀도 및 벌크 밀도는 다음의 절차에 의해 측정되었다.
전처리:
측정될 샘플을 실온에서 보관하였다.
이어서, 샘플은 용기를 반복적으로 회전 및 터닝시킴으로써(입자의 파쇄 방지) 철저하게 혼합되었다. 용기는 2/3를 초과하여 충전되지 않았다.
절차:
100.0 ± 0.1 g의 분말을 칭량하고, 그것을 측정 실린더로 옮겼다. 부피 V0는 ml로 읽혔다.
100 g의 분말이 실리더에 들어가지 않을 경우, 양을 50 또는 25 g으로 감소시켜야 한다.
측정 실린더를 스탬프 체적계에 고정하고, 100회 탭핑하였다. 스페튤라로 표면을 평평하게 하고, 부피 V100를 ml로 판독하였다.
탭핑 수를 625(100회 탭핑 포함)로 변경하였다. 탭핑 후, 표면을 평평하게 하고, 부피 V625를 ml로 판독하였다.
밀도의 계산:
하기 식에 따라 g/ml로 표현되는 루스 및 벌크 밀도를 계산하였다:
벌크 밀도 = M/V
상기 식에서, M은 칭량된 샘플(g)을 나타내고, V는 625회 탭핑 후 부피(ml)를 나타낸다.
실시예 9.4: 분말의 수분 함량의 측정
식료품의 수분 함량은 ISO 5537:2004(건조유 - 수분 함량의 측정(참고 방법))에 따라 측정되었다. NMKL은 "식량에 관한 북유럽위원회(Nordisk Metodikkomite for Naeringsmidler)"에 대한 약어이다.
실시예 9.5: 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 칼륨, 인의 총량 측정
샘플을 먼저 마이크로웨이브 삭임을 사용하여 분해시킨 후, 무기물(들)의 총량을 ICP 장치를 사용하여 측정하는 절차를 사용하여 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 칼륨, 및 인의 총량을 측정하였다.
장치:
마이크로웨이브는 앤턴 파르(Anton Paar)로부터의 것이고, ICP는 퍼킨엘머 인크.(PerkinElmer Inc.)로부터의 옵티마(Optima) 2000DV이다.
물질:
1 M HNO3
2% HNO3 중 이트륨
5% HNO3 중 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 칼륨, 및 인에 적합한 표준물
전처리:
분말의 특정량을 칭량하고, 분말을 마이크로웨이브 삭임 관으로 옮겼다. 5 mL의 1 M HNO3를 첨가하였다. 마이크로웨이브 지침에 따라 마이크로웨이브에서 샘플을 삭임(digest)하였다. 삭임 관을 퓸 컵보드(fume cupboard)에 넣고, 뚜껑을 제거하고, 휘발성 퓸이 증발되게 하였다.
측정 절차:
공지된 양의 밀리큐 워터를 사용하여 전처리된 샘플을 디지튜브(digitube)로 옮겼다. 2% HNO3 중 이트륨의 용액을 삭임 관에 첨가하고(희석된 샘플 50 mL 당 약 0.25 mL), 밀리큐 워터를 사용하여 공지된 부피로 희석하였다. 제조사에 의해 기재된 절차를 사용하여 ICP 상에서 샘플을 분석하였다.
10 mL의 1 M HNO3 및 2% HNO3 중 이트륨의 0.5 mL 용액의 혼합물을 밀리큐 워터를 사용하여 100 mL의 최종 부피로 희석함으로써 블라인드 샘플을 제조하였다.
예상되는 샘플 농도를 괄호 안에 제시한 농도를 갖는 적어도 3개의 표준 샘플을 제조하였다.
실시예 9.6: 푸로신가의 측정:
푸로신가는 문헌["Maillard Reaction Evaluation by Furosine Determination During Infant Cereal Processing", Guerra-Hernandez et al, Journal of Cereal Science 29 (1999) 171-176]에 기재된 바와 같이 측정되었으며, 단백질의 총량은 실시예 9.2에 따라 측정되었다. 푸로신가는 단백질 100 g 당 단위 mg의 프로신으로 보고되었다.
실시예 9.7: 액체 중 BLG의 결정도 측정
하기 방법을 사용하여 5 내지 6 범위의 pH를 갖는 액체에서 BLG의 결정도를 측정하였다.
a) 해당 액체의 10 mL의 샘플을 0.45 미크론 세공 크기의 CA 막을 갖는 맥시-스핀 필터로 옮겼다.
b) 원심분리기를 2℃에서 유지시키면서, 즉시 1500 g에서 5분 동안 필터를 스피닝하였다.
c) 2 mL의 저온 밀리큐 워터(2℃를 스핀 필터의 투석유물 측에 첨가하고, 즉시 원심분리기를 2℃에서 냉각된 채로 유지시키면서 1500 g에서 5분 동안 필터를 스피닝하고, 투과액(투과액 A)을 수집하고, 부피를 측정하고, 실시예 9.9에 개괄된 방법을 사용하여 HPLC를 통해 BLG 농도를 측정하였다.
d) 4 mL의 2 M NaCl을 필터의 투석유물 측에 첨가하고, 신속하게 교반하고, 혼합물을 25℃에서 15분 동안 정치시켰다.
e) 즉시 1500 g에서 5분 동안 필터를 스피닝하고, 투과액(투과액 B)을 수집하였다.
f) 실시예 9.9에 개괄된 방법을 사용하여 투과액 A 및 투과액 B 중 BLG의 총 중량을 측정하고, 결과를 중량% 대신 BLG의 총 중량으로 전환시켰다. 투과액 A 중 BLG의 중량을 m투과액 A로 칭하고, 투과액 B 중 BLG의 중량을 m투과액 B로 칭하였다.
g) BLG에 대한 액체의 결정도를 다음과 같이 결정하였다:
결정도 = m투과액 B/( m투과액 A+ m투과액 B)*100%
실시예 9.8: 건조 분말 중 BLG의 결정도의 측정
이 방법을 사용하여 건조 분말 중 BLG의 결정도를 측정하였다.
a) 5.0 g의 분말 샘플을 20.0 g의 저온 밀리큐 워터(2℃와 혼합하고, 2℃에서 5분 동안 정치시켰다.
b) 해당 액체의 샘플을 0.45 미크론 CA 막을 갖는 맥시-스핀 필터로 옮겼다.
c) 원심분리기를 2℃에서 유지시키면서 즉시 1500 g에서 5분 동안 필터를 스피닝하였다.
d) 2 mL의 저온 밀리큐 워터(2℃를 스핀 필터의 투석유물 측에 첨가하고, 즉시 1500 g에서 5분 동안 필터를 스피닝하고, 투과액(투과액 A)을 수집하고, 부피를 측정하고, 실시예 9.9.에 개괄된 방법을 사용하여 HPLC를 통해 BLG 농도를 측정하고, 결과를 중량% 대신 BLG의 총 중량으로 전환시켰다. 투과액 A 중 BLG의 중량은 m투과액 A로 칭하였다.
f) 이어서, 분말 중 BLG의 결정도를 하기 식을 사용하여 계산하였다:
상기 식에서, mBLG 총은 단계 a)의 분말 샘플 중 BLG의 총량이다.
분말 샘플의 BLG의 총량이 공지되어 있지 않을 경우, 이것은 또 다른 5 g 분말 샘플(동일한 분말 공급원으로부터의 것)을 20.0 g의 밀리큐 워터에 현탁시키고, 수성 NaOH를 첨가하여 pH를 7.0 으로 조정하고, 혼합물을 교반하에 1시간 동안 25℃에서 정치시키고, 마지막으로 실시예 9.9를 사용하여 분말 샘플의 BLG의 총량을 측정함으로써 측정될 수 있다.
실시예 9.9: 수성 액체 중 BLG, ALA, 및 CMP의 총량의 측정
알파-락트알부민, 베타-락토글로불린 및 CMP의 함량을 0.4mL/분에서 HPLC 분석에 의해 분석하였다. 25 ㎕의 여과된 샘플을 210 nm에서 UV 검출기를 사용하여 용리액(465 g의 밀리큐 워터, 417.3 g의 아세토니트릴 및 1 mL의 트리플루오로아세트산으로 구성됨)에서 평형화된 부착된 전치컬럼 PWxl(6 mm Х 4 cm, 토소하스 (Tosohass), 일본)과 직렬로 연결된 2개의 TSKgel3000PWxl(7.8 mm 30 cm, 토소하스, 일본) 컬럼으로 주입하였다.
천연 알파-락트알부민(C알파), 베타-락토글로불린(C베타), 및 카제이노마크로펩티드(CCMP)의 함량의 정량적 측정은 상응하는 표준 단백질에 대해 수득된 피크 면적과 샘플의 것을 비교함으로써 수행되었다.
추가의 단백질(비-BLG 단백질)의 총량은 총 단백질의 양(실시예 9.2에 따라 측정됨)으로부터 BLG의 양을 뺌으로써 측정되었다.
실시예 9.10: UF 투과액 전도율의 측정
15 mL의 샘플을 3 kDa 컷 오프(3000 NMWL)를 갖는 아미콘(Amicon) 울트라-15 원심 필터 유닛으로 옮기고, 4000 g에서 20 내지 30분 동안 또는 전도율 측정을 위한 충분한 부피의 UF 투과액이 필터 유닛의 바닥 부분에 축적될 때까지 원심분리하였다. 원심 분리 직후 전도율을 측정하였다. 샘플 취급 및 원심 분리를 샘플의 공급원의 온도에서 수행하였다.
실시예 9.11: 유장 단백질 조성물의 단백질 변성도의 측정
변성된 유장 단백질은 pH 7.0에서보다 pH 4.6에서 더 낮은 용해도를 갖는 것으로 공지되어 있고, 유장 단백질 조성물의 변성도는 pH 7.0에서 단백질의 총량에 대한 pH 4.6에서 가용성 단백질의 양을 측정함으로써 결정되었다.
보다 구체적으로, 분석될 유장 단백질 조성물(예를 들어, 분말 또는 수용액)을
- 5.0%(w/w)의 총 단백질을 함유하고, 7.0의 pH를 갖는 제1 수용액
- 5.0%(w/w)의 총 단백질을 함유하고, 4.6의 pH를 갖는 제2 수용액
으로 전환시켰다.
pH 조정은 3%(w/w)의 NaOH(aq) 또는 5%(w/w)의 HCl(aq)을 사용하여 이루어졌다.
제1 수용액의 총 단백질 함량(PpH 7.0)을 실시예 9.2에 따라 측정하였다.
제2 수용액을 실온에서 2시간 동안 저장한 후, 3000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액의 샘플을 회수하고, 실시예 9.2에 따라 분석하여 총 단백질(SpH 4.6)을 결정하였다.
유장 단백질 조성물의 단백질 변성도, D를 다음과 같이 계산하였다:
D = ((PpH 7.0 - SpH 4.6)/ PpH 7.0)*100%
실시예 9.12: 분말 중 건조된 BLG 결정의 검출
분말 중 건조된 BLG 결정의 존재는 다음의 방식으로 확인될 수 있다:
분석될 분말의 샘플을 재현탁시키고, 4℃의 온도를 갖는 탈염수에서 2부의 물 대 1부의 분말의 중량비로 약하게 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 재수화시켰다.
재수화된 샘플을 현미경 관찰에 의해 조사하여 바람직하게는 복굴절을 검출하기 위하여 평면 편광을 사용하여 결정의 존재를 확인하였다.
결정-유사 물질을 분리하고, x-선 결정학을 수행하여 결정 구조의 존재를 확인하고, 바람직하게는 또한 결정 격자(공간군 및 단위 격자 치수)가 BLG 결정의 것에 상응한다는 것을 확인하였다.
분리된 결정-유사 물질의 화학 조성을 분석하여 그의 고체가 주로 BLG로 이루어져 있음을 확인하였다.
실시예 10: UF-기재 동적 교차 유동 여과에 의한 결정화
정용여과를 pH 5.92에서 수행하고, 최종 TS가 20%인 것을 제외하고는, 결정화 탱크에 대한 공급물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
공급물을 컨디셔닝한 후(공급물 조성은 표 15에서 알 수 있음), 그것을 300 L 결정화 탱크로 옮기고, pH를 초기에 pH 5.80으로 조정하고, 온도를 10 내지 12℃에서 유지시켰다. pH 조정 후, 실시예 1에 기재된 바와 동일한 방식으로 제조되었지만, 비-자발적인 결정화 생성으로부터 기인한 시딩 물질을 첨가하였다. 공급물에 공급물 1 리터 당 0.5 g의 시딩 물질의 농도로 시딩 물질을 시딩하였다. 시딩 후, 냉각 맨틀 상 온도를 5℃로 설정하고, pH를 5.50으로 서서히 조정하고, 혼합물을 약 1시간 동안 결정화시킨 후, DCF(동적 교차 유동 여과) 유닛을 도 26에 나타낸 바와 같은 결정화 탱크에 연결하였다. DCF 유닛에 500 nm의 세공 크기를 갖는 케라폴(Kerafol) 세라믹 막을 장착하고, TMP(트랜스 막 압력)를 0.4 bar로 설정하고, 막의 회전 속도는 32 Hz였다.
46 mil의 스페이서를 갖는 코치 HFK-328 유형 막이 장착된 UF(한외여과) 유닛에서 투과액을 공급물로서 사용하면서 DCF로부터의 투석유물을 결정화 탱크로 복귀시켰다. UF 유닛에서, 온도를 12℃까지, 그러나 이를 초과하지 않도록 상승시켰다. 첨가된 정용여과 물의 양을 조정하여 무기물이 모액(ML)으로부터 제거되는 동안 UF로부터 나오고 다시 결정화 탱크로 가는 투석유물이 약 21% TS이도록 하였다.
투과액과 정용여과 물 사이의 전도율 차가 50 microS/cm 미만이 될 때까지 ML에 대한 정용여과를 계속하였다. 이때, 정용여과 물의 양을 조정하여 투석유물이 약 30% TS이도록 하였다. BLG가 결정으로서 제거될 때 ML 중 TS의 양은 감소되었고; 과량의 물 및 무기물의 이러한 연속적인 제거는 BLG 결정화 동안 기타 다른 단백질의 농도가, 존재하더라도, 탐구될 범위의 BLG의 용해도에 대해 제한된 효과를 갖는 것으로 보이므로 전체 수율을 이끌 수 있다.
DCF로부터의 ML 투과액의 조성을 표 16에서 볼 수 있다. 공급물의 초기 300 L를 약 100 L의 ML로 감소시켰다. 질량 보존에 기초하여, BLG의 상대 수율은 92%로 계산되었다.
| 공급물 95% TS로 표준화됨 단백질 조성(총 단백질에 대한 % w/w) |
|
| ALA | 22.9 |
| BLG | 50.2 |
| CMP 및 기타 다른 단백질 | 26.5 |
| 기타 다른 성분(표준화된 공급물의 총 중량에 대한 % w/w) | |
| Ca | 0.387 |
| K | 0.350 |
| Mg | 0.058 |
| Na | 0.245 |
| P | 0.210 |
| 지방 | BDL |
| 단백질 | 90 |
| 95% TS로 표준화된 최종 ML 단백질 조성(총 단백질에 대한 % w/w) |
||
| ALA | 42.9 | |
| BLG | 6.8 | |
| CMP 및 기타 다른 단백질 | 50.3 | |
결론:
BLG 결정화가 일어나는 매트릭스로부터 과량의 무기물 및 물을 계속 제거함으로써, BLG 수율이 상당히 개선될 수 있고, 공정이 저온에서 수행될 수 있다.
실시예 11: 상이한 유장 단백질 생성물의 단백질 변성도
상업용 제품 및 본 발명의 4가지 식용 BLG 조성물의 단백질 변성도를 비교하였다. 샘플은 하기에 기재되어 있다.
샘플 B 내지 E를 하기 방식으로 제조하였다:
결정 슬러리를 실시예 12에 기재된 바와 같이 제조하고, 실시예 7에 기재된 바와 같이 분리하였다. 약간의 분리된 BLG 슬러리를 취하고, 4 부분으로 나누었다.
샘플 B: 분리된 BLG 결정 슬러리의 제1 부분을 3% NaOH를 사용하여 BLG 결정 슬러리의 pH를 7.01로 조정함으로써 임의의 건조 없이 재용해시키고; 이어서, 샘플을 Bx 6으로 희석하여 약 5% 단백질 용액을 제조하였다.
샘플 C: 분리된 BLG 결정 슬러리의 제2 부분을 동결 건조시켰다. 이어서, 분말을 폴리싱된 물에 재현탁시키고, 3% NaOH를 사용하여 pH를 7.09로 조정한 후, 샘플을 브릭스 6으로 희석하여 약 5% 단백질 용액을 제조하였다.
샘플 D: 분리된 BLG 결정 슬러리의 제3 부분을 3% NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정함으로써 재용해시킨 후, 동결 건조시켰다. 이어서, 동결 건조된 분말을 폴리싱된 물에 재현탁시키고, pH는 7.07인 것으로 측정되었다. 이어서, 샘플을 브릭스 6으로 희석하여 약 5% 단백질 용액을 제조하였다.
샘플 E: 분리된 BLG 결정 슬러리의 제4 부분을 실시예 7에 기재된 바와 같이 처리하고 분무 건조시켰다. 이어서, 분말을 폴리싱된 물에 재현탁시키고, 3% NaOH를 사용하여 pH를 7.04로 조정하였다. 이어서, 샘플을 브릭스 6으로 희석하여 약 5% 단백질 용액을 제조하였다.
각각의 샘플의 단백질 변성도를 실시예 9.11에 따라 측정하고, 결과를 표 17에 나타내었다.
| 샘플 | pH 7에서 총 단백질 농도 | pH 4.6에서 가용성 단백질의 총 농도 | 단백질 변성도 (%) |
| A: BiPro(상업적으로 입수가능한 WPI) | 5.11 | 4.54 | 11.15 |
| B: BLG 결정 슬러리 그 자체(건조 안됨) | 4.62 | 4.56 | 1.30 |
| C: 동결 건조된 BLG 결정 슬러리 | 4.74 | 4.69 | 1.05 |
| D: 재용해되고(pH 7) 냉동 건조된 BLG 결정 | 4.74 | 4.69 | 1.05 |
| E: 분무 건조된 BLG 결정 슬러리 | 4.75 | 4.71 | 0.84 |
결론:
건조 방법에도 불구하고, 본 발명의 식용 BLG 조성물은 놀라울 정도로 낮은 정도의 변성 단백질을 갖고; 비교용으로 사용된 상업적으로 입수가능한 WPI에서 발견될 수 있는 것의 단지 10분의 1이었다. 분무-건조된 BLG 결정 슬러리 생성물이 모든 생성물 중에서 여전히 최저의 변성도를 갖는다는 것은 특히 놀라운 일이다.
실시예 12: 동적 교차-흐름 여과에 의한 결정 분리
1.2 미크론 필터를 통해 여과된, 표준 치즈 제조 공정으로부터의 감미 유장으로부터 유래된 락토스-감손 UF 투석유물을 결정화 공정을 위한 공급물로서 사용하였다. 감미 유장 공급물을 10% TS(총 고체)±5의 공급물 농도, 및 정용여과 매질로서 폴리싱된 물(최대 0.05 mS/cm의 전도율을 수득하기 위하여 역삼투에 의해 여과된 물)을 사용하여 46 mil 스페이서, 1.5 내지 3.0 bar의 공급물 압력을 갖는 코치 HFK-328 유형 막을 사용하여 한외여과 장비 상에서 컨디셔닝하였다. 한외여과 동안 공급물 및 투석유물의 온도는 약 12℃였다. 이어서, HCl를 첨가하여 약 5.60의 pH를 수득함으로써 pH를 조정하였다. 투석유물의 전도율이 1.30 mS/cm 미만이 될 때까지 정용여과를 계속하였다. 이어서, 공급물을 25℃까지 가열한 후, 투석유물을 약 27% TS(농축된 투석유물의 총 중량에 대해 약 21%의 총 단백질)로 농축하였다. 투과액 전도율은 최종 농도에서 0.33 mS/cm였다. 농축된 투석유물의 샘플을 3000 g에서 5분 동안 원심분리하였으나, 눈에 보이는 펠렛이 형성되지 않았다.
농축된 투석유물을 300 L 결정화 탱크로 옮기고, 여기서 그것을 약 6℃까지 냉각시키고, 이 온도에서 완만하게 교반하면서 밤새 유지시켰다. 다음날 아침, 투석유물이 결정화되었다. 모액 및 결정을 3000 g에서 5분 동안 원심 분리에 의해 분리하고, 상청액 및 펠렛의 샘플을 HPLC 분석에 의해 취하였다. 이러한 공정으로부터 BLG의 수율을 67%로 계산되었다.
300 L 탱크로부터의 결정 슬러리를 500nm의 세공 크기를 갖는 1개의 디스크 막을 사용하여 Andritz DCF 152S 시스템에서 공급물로 사용하였다. 여과를 8℃에서 수행하고, 회전 속도는 32 Hz이고, 막전위 압력은 0.4 bar였다. 시스템은 전량(dead end) 여과로서 작용하고, 여기서 투석유물은 투석유물이 계속해서 제거되는 더 큰 유닛과 달리, 여과 챔버에 구축되었다. 여과는 단지 40분 동안 안정적인 방식으로 수행되었으며, 이때 여과 챔버에 구축된 고체가 여과에 영향을 미치기 시작하였다.
결정 질량의 양은 DFC 작업 동안 상당히 증가하였다.
결론.
DCF는 결정을 ML로부터 분리하는 안정적이고 효율적인 수단을 제공한다. 필요할 경우, 세척액이 DCF에 첨가될 수 있었다.
실시예 13: 여과 원심분리기를 사용한 결정 분리
실시예 12에서와 동일한 공급물 및 동일한 결정화를 사용하여, 약 20 마이크로미터의 세공 크기를 갖는 필터 클로스가 장착된 여과 원심분리기 HZ 25/0.1 상에서 분리를 시험하였다.
시험 1: 4 L의 공급물을 필터 원심 분리기에 공급하고, 이것을 60 g에서 작동시켰다. 모든 공급물이 첨가된 후, 원심분리기를 건조 필터 케이크에 대해 250 g으로 가속시켰다. 케이크는 47.6%의 TS를 함유하고; 케이크의 조성물은 표 18에 나타나있다.
세척 후, 원심분리기에 상기 기재된 바와 동일한 공급물 7 L를 60 g에서 공급하였다. 이어서, 탈수를 위해 원심분리기를 약 5분 동안 250 g으로 가속시킨 후, 그것을 다시 60 g으로 감속시키고, 0.25 L의 폴리싱된 물을 세척을 위해 첨가하였다. 세척수가 첨가된 후, 원심분리기를 다시 탈수를 위해 250 g으로 가속시켰다. 케이크의 TS는 47%인 것으로 측정되었다. 케이크는 도 27A에 나타나있다. 세척 후, 케이크, ML 분획 및 세척액의 조성이 표 18에 나타나있다. 케이크를 탈수시킨 후, 그것을 원심분리기의 양태에서 박리시키려고 시도하였으며; 상부 층은 도 27C에서 보여지는 바와 같이 연기가 나고, 의도된 관을 통해 떨어졌지만, 하부 층은 도 27B에서 보여지는 바와 같이, 적절하게 박리하기에 너무 축축하고 끈적거렸다.
| 결정화 공급물 | 원심분리 후 ML (시험 1) |
필터 케이크, 세척 없음 (시험 1) |
원심분리 후 ML (시험 2) |
필터 케이크, 세척함 (시험 2) |
세척 후 세척수 (시험 2) |
|
| 단백질1): | ||||||
| ALA | 1.50 | 1.67 | BDL | 1.52 | BDL | 1.07 |
| BLG | 12.4 | 4.10 | 46.9 | 5.80 | 47.9 | 3.80 |
| CMP | 3.56 | 3.84 | BDL | 3.3 | BDL | BDL |
| 기타 다른 성분2): | ||||||
| Ca | 0.410 | 0.410 | 0.161 | 0.529 | 0.149 | 0.558 |
| K | 0.315 | 0.315 | 0.073 | 0.424 | 0.068 | 0.445 |
| Mg | 0.075 | 0.075 | 0,025 | 0.098 | 0.024 | 0.103 |
| Na | 0.078 | 0.078 | BDL | 0.109 | BDL | 0.139 |
| P | 0.181 | 0.181 | BDL | 0.275 | BDL | 0.289 |
| 총 단백질 | 90 | 90 | 91 | 86 | 93 | 88 |
1) 용액의 중량에 대한 단백질 조성%(w/w)
2) 기타 다른 선택된 성분의 농도(95% 총 고체로 표준화된 조성물의 총 중량에 대한 % w/w)
결론:
필터 원심 분리기는 ALA 및 CMP가 심지어 세척 없이도 정량화에 필요한 수준 미만으로 매우 순수한 BLG 케이크를 수득하기 위한 흥미로운 옵션을 제공한다. 소량의 세척 매질을 필터 케이크에 적용함으로써, 표 18에서 세척수의 단백질 조성에 의해 알 수 있는 바와 같이, 케이크 중 무기물 함량을 훨씬 더 저하시킬 수 있다. 케이크의 비-BLG 단백질의 함량은 또한 사용된 세척수로부터 알 수 있는 바와 같이 세척에 의해 저하된다. 사용된 세척수는 필터 케이크에서의 비훨씬 더 큰 ALA:BLG 사이의 비를 함유하였다. 이것은 세척 단계가 BLG보다 ALA(및 적절하게는 기타 다른 비-BLG 단백질)를 제거하는 경향이 더 크다는 것을 지시한다.
여기서 제조된 필터 케이크는 박리가능하지 않지만, 여전히 침투가능하였다. 이것은 주어진 온도에서 건조 기체를 첨가하는 옵션이 상부 층과 같이, 필터 케이크의 습포 함량을 그것이 박리될 수 있는 정도로 저하할 수 있게 한다. 대안적으로 사이펀 원심분리기 스타일 장치에서 알맞은 양의 산, 염기 또는 수용액 중 염을 첨가함으로써 필터 케이크를 원심분리기 내부에서 재용해시킬 수 있었다.
실시예 14: 유장 단백질 용액의 무기물 조성의 영향
BLG의 수율에 대한 1가와 2가 금속 양이온 사이의 몰 비의 영향을 이 실시예에서 조사하였다.
2가지 샘플을 비교하였다:
샘플 A: 과량의 Na+(공급원: Na2SO4)를 가짐
샘플 B: 과량의 Ca2+(공급원: CaSO4)를 가짐
실시예 1에서 사용된 것과 동일한 유형의 원료를 2.5% 황산으로 조정하였다. 샘플의 pH를 약 pH 5.4로 조정하고; 정확한 pH를 표 20에 보고하였다. 각각의 샘플의 원래 부피는 250 mL였다. 2가지 샘플을 약 24 L의 저온 폴리싱된 물에 대해 또 다른 24 L 용기에서 투석하였다. 모든 투석 공정을 위하여, 투석 관 OrDial D-클린 MWCO 3500(물품 번호 63034405)을 사용하였다. 용기를 투석 공정 동안 계속 교반하고, 투석을 4℃에서 냉각기에서 수행하였다. 제1 투석을 밤새 수행하였다.
제1 투석 후 과량의 이온을 제거하기 위하여, 투석 백을 2 L의 염 용액을 함유하는 용기로 옮겼다. 농도는 다음과 같았다:
샘플 A: Na2SO4(나트륨 설페이트) 0.059 M,
샘플 B: CaSO4(칼슘 설페이트) 0.059 M.
제1 염 투석을 밤새 수행하였다. 제1 염 투석 후 전도율, pH 및 브릭스를 표 20에 보고하였다. 염 용액을 새로운 것으로 바꾸고, 투석을 주말 내내 계속하였다.
제2 염 투석 후, 24 L 용기로 옮겨진 관에 약 24 L의 저온 폴리싱된 물을 충전하고, 밤새 투석하여 결정화 전 과량의 이온을 제거하였다.
마지막 투석 단계 후, 단백질 농도는 바람직한 것보다 약간 더 낮았다. 따라서, 샘플을 10 kDa 컷 오프 막 및 75 mL/h로 작동하는 연동 펌프를 사용하여 Pellicon XL UF 실험실 장치 상에서 농축하였다. 원료와 함께 샘플의 무기물 함량을 표 19에 나타내었다.
이어서, 샘플에 상기 기재된 시딩 물질 0.5 g/L를 시딩하고, 4에서 밤새도록 결정화시켰다. 이어서, 다음 날, 결정 침전물이 모든 샘플에서 보였다. 각각의 샘플을 3000 g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액의 샘플을 분석함으로써 각각의 샘플의 HPLC 샘플을 제조하였다. 결과를 표 21에 나타내었다.
| 성분 | 원료 (% w/w) |
샘플 A 결정화 전 (% w/w) |
샘플 A 변화1) (%) |
샘플 B 결정화 전 (% w/w) |
샘플 B 변화1) (%) |
| 칼슘 | 0.45 | 0.13 | -71 | 0.82 | 82 |
| 클로라이드 | 0.21 | 시험되지 않음 | 시험되지 않음 | 시험되지 않음 | 시험되지 않음 |
| 칼륨 | 0.60 | 0.04 | -93 | 0.06 | -90 |
| 마그네슘 | 0.08 | 0.02 | -75 | 0.02 | -75 |
| 나트륨 | 0.14 | 0.59 | 321 | 0.08 | -43 |
| 인 | 0.22 | 0.21 | -5 | 0.24 | 9 |
| 단백질 | 86.9 | 87.8 | 1 | 86.2 | -1 |
1) 변화는 원료에서 주어진 성분의 농도에 대한 것임.
| 샘플 | 단계 | pH | 전도율(mS/cm) | 브릭스 (°) |
| A | pH 조정 | 5.41 | 3.52 | 21.9 |
| A | 제1 염 투석 후 | 5.45 | 6.48 | 15.4 |
| A | 제2 염 투석 후 | 5.51 | 5.76 | 12.3 |
| A | 투석을 통한 과량의 이온의 제거 후 | 5.48 | 0.883 | 9.5 |
| A | 실험실 UF를 통한 단백질 농축 후 | 5.48 | 1.622 | 16.4 |
| A | 최종 pH 조정 | 5.42 | ||
| B | pH 조정 | 5.41 | 3.52 | 21.9 |
| B | 제1 염 투석 후 | 5.37 | 1.55 | 14.4 |
| B | 제2 염 투석 후 | 5.41 | 1.251 | 12.4 |
| B | 투석을 통한 과량의 이온의 제거 후 | 5.32 | 0.643 | 11.3 |
| B | 실험실 UF를 통한 단백질 농축 후 | 5.32 | 0.891 | 11.9 |
| B | 최종 pH 조정 | 5.42 |
| 샘플 | BLG(% w/w) |
| A(높은 Na+) - 분리 전 BLG 결정을 갖는 유장 단백질 용액 | 6.47 |
| A(높은 Na+) - 결정의 분리 후 모액 | 3.94 |
| B(높은 Ca2+) - 분리 전 BLG 결정을 갖는 유장 단백질 용액 | 3.56 |
| B(높은 Ca2+) - 결정의 분리 후 모액 | 2.22 |
결론:
표 21은 1가와 2가 양이온 사이의 높은 몰 비가 회피될 경우, 모액에 더 적은 잔량의 BLG가 잔류한다(그리고, 더 높은 수율의 분리된 BLG 결정이 수득된다)는 것을 입증하였다. 1가와 2가 양이온 사이의 몰 비 및 실제로 Na+K 대 Ca+Mg를 제어하여 본 발명의 방법의 BLG의 수율을 개선시킬 수 있다.
Claims (26)
- 베타-락토글로불린(BLG)을 단리된 형태로 포함하는 식용 조성물의 제조 방법으로서, 방법은
a) BLG 및 적어도 1종의 추가의 유장 단백질을 포함하는 유장 단백질 용액을 제공하고, 상기 유장 단백질 용액은 BLG에 대해 과포화되고, 5 내지 6 범위의 pH를 갖고,
여기서,
- 유장 단백질 용액은 최대 5 mS/cm의 전도율을 갖거나, 또는
- 전도율(mS/cm로 표현됨)과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량(유장 단백질 용액의 총 중량에 대한 총 단백질 중량%로 표현됨) 사이의 비가 최대 0.3이거나, 또는
- 유장 단백질 용액은 최대 5 mS/cm의 전도율을 갖고, 전도율(mS/cm로 표현됨)과 유장 단백질 용액의 단백질의 총량(유장 단백질 용액의 총 중량에 대한 총 단백질 중량%로 표현됨) 사이의 비가 최대 0.3인, 단계,
b) 과포화된 유장 단백질 용액에서 염용 방식으로 BLG를 결정화시키는 단계, 및
c) 잔류 유장 단백질 용액으로부터 BLG 결정을 분리하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제 1항에 있어서,
- BLG 결정을 세척하는 단계 d), 또는
- BLG 결정을 재결정화시키는 단계 e), 또는
- BLG 결정을 세척하는 단계 d)와 BLG 결정을 재결정화시키는 단계 e)
를 더 포함하는, 방법. - 제 1항에 있어서, 단계 c)로부터 유래된 BLG-함유 조성물을 건조시키는 단계 f)를 더 포함하는, 방법.
- 제 2항에 있어서, 단계 d) 또는 e)로부터 유래된 BLG-함유 조성물을 건조시키는 단계 f)를 더 포함하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 유장 단백질 용액은 유청 단백질 농축물, 유장 단백질 농축물, 유청 단백질 단리물, 유장 단백질 단리물, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 유장 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 2% w/w의 BLG를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 a)의 유장 단백질 용액은 유장 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 4% w/w의 BLG를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 과포화된 유장 단백질 용액은 유장 단백질 공급물에 다음의 조정 중 하나 이상을 수행하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법:
- pH의 조정,
- 전도율의 감소,
- 온도의 감소,
- 단백질 농도의 증가, 및
- 수분 활성도를 감소시키는 작용제의 첨가. - 제 1항에 있어서, 단계 c)는 BLG 결정을 적어도 30% w/w의 고체 함량으로 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 c)는 BLG 결정을 적어도 40% w/w의 고체 함량으로 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 3항에 있어서, 건조 단계는 BLG 결정이 용해된 BLG-함유 조성물을 포함하고, 생성된 분말은 단계 b)에 의해 또는 건조 단계 전 재결정화에 의해 형성된 BLG 결정을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 11항에 있어서, BLG 결정은
- 온도를 증가시키거나,
- 전도율을 증가시키거나,
- pH를 5 내지 6 범위 밖의 pH로 변경시키거나,
- BLG의 농도를 감소시키거나, 또는
- 상기의 조합
에 의해 용해되는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 3항에 있어서, 건조 단계는 분무 건조, 동결 건조, 스핀-플래시 건조, 회전 건조, 및 유동층 건조 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 3항에 있어서, BLG-함유 조성물은 BLG 결정을 함유하지 않고 분무 건조에 의해 건조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 따른 방법에 의해 수득가능한 식용 BLG 조성물로서,
식용 BLG 조성물은 총 단백질에 대해 적어도 90% w/w의 양으로 BLG를 포함하는, 식용 BLG 조성물. - 제 15항에 있어서, 식용 BLG 조성물은 제 3항에 따른 방법에 의해 수득가능한 것을 특징으로 하는, 식용 BLG 조성물.
- 제 15항에 있어서, 식용 BLG 조성물은 분무 건조 분말인 것을 특징으로 하는 식용 BLG 조성물.
- 제 15항에 있어서, 식용 BLG 조성물은 제 11항에 따른 방법에 의해 수득가능한 것을 특징으로 하는, 식용 BLG 조성물.
- 제 15항에 있어서, 식용 BLG 조성물은 제 14항에 따른 방법에 의해 수득가능한 것을 특징으로 하는, 식용 BLG 조성물.
- 제 15항에 있어서, 식용 BLG 조성물은
- 최대 6% w/w의 물,
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질,
- 총 단백질에 대해 적어도 95%의 BLG
를 포함하고,
상기 식용 BLG 조성물은
- 건조 분말이고,
- 적어도 0.50 g/mL의 벌크 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는, 식용 BLG 조성물. - 제 15항에 있어서, 식용 BLG 조성물은
- 최대 6% w/w의 물,
- 총 고체에 대해 적어도 80%의 총 단백질,
- 총 단백질에 대해 적어도 95%의 BLG,
- 단백질 100 g 당 최대 80 mg의 인
을 포함하고,
상기 식용 BLG 조성물은
- 건조 분말인 것을 특징으로 하는, 식용 BLG 조성물. - 제 15항에 있어서, 총 단백질에 대해 적어도 95% w/w의 양으로 BLG를 포함하는, 식용 BLG 조성물.
- 제 15항에 있어서, 총 단백질에 대해 적어도 97% w/w의 양으로 BLG를 포함하는, 식용 BLG 조성물.
- 제 15항에 있어서, 적어도 0.4 g/mL의 벌크 밀도를 갖는 분말의 형태인, 식용 BLG 조성물.
- 제 24항에 있어서, 분말은 분무 건조 분말인 것을 특징으로 하는, 식용 BLG 조성물.
- 제 15항에 있어서, 최대 2%의 단백질 변성도를 갖는, 식용 BLG 조성물.
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