JP2022188055A - 新規のベータ－ラクトグロブリン調製物の製造ならびに関連する方法、使用および食品 - Google Patents

新規のベータ－ラクトグロブリン調製物の製造ならびに関連する方法、使用および食品 Download PDF

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Abstract

【課題】単離ベータ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）を含む食用組成物を調製する方法、および食用ＢＬＧ組成物を提供する。【解決手段】方法は、ａ）ＢＬＧおよび少なくとも１種の追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供するステップであって、前記ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、かつ５～６の範囲のｐＨを有し、前記ホエイタンパク質溶液は、最大５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、および／または前記ホエイタンパク質溶液の導電率（ｍＳ／ｃｍ）とタンパク質の総量（前記ホエイタンパク質溶液の総重量に対する総タンパク質の重量％で表される）との間の比は、最大０．３である、ステップと、ｂ）塩溶モードにおいて、前記過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化させるステップと、ｃ）残存するホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離するステップを備える方法である。【選択図】図２

Description

本発明は、単離ベータ－ラクトグロブリン組成物および／または結晶化したベータ－ラクトグロブリンを含む組成物を製造する新規の方法に関する。本発明は、新規のベータ－ラクトグロブリン組成物、これらの組成物の使用およびこれらの組成物を含む食品にさらに関する。
乳タンパク質の分画の概念は、当分技術野で公知であり、特定の特性および特徴をそれぞれ有する様々な乳タンパク質種に富む組成物を調製するための一連の技術に過去数十年で発展している。
乳清またはホエイからのベータ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の単離は、多くの刊行物の主題であり、典型的には、精製されたベータ－ラクトグロブリン生成物を得るために多数の分離ステップおよび多くの場合にクロマトグラフィー技術を伴う。
例えば、ｄｅ Ｊｏｎｇｈら（Ｍｉｌｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｅｓ Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ β－Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８４（３），２００１，ｐａｇｅｓ ５６２－５７１）は、カゼインの低温酸凝固ならびに得られた酸ホエイをアフィニティクロマトグラフィー（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）およびゲル浸透クロマトグラフィーの組合わせにかけることによる、新たに搾乳された乳からのＢＬＧの精製を説明した。得られたＢＬＧ組成物は、タンパク質１ｇ当たりベータ－ラクトグロブリン０．９８５ｇを含むと述べられた。
Ｓｌａｃｋら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１０，１９８６，ｐａｇｅｓ １９－３０）は、様々なアプローチを調査し、脱塩酸ホエイおよびスイートホエイのｐＨをｐＨ４．６５に調整し、形成された沈殿物を遠心分離およびデカンテーションにより分離することにより、ＢＬＧ強化沈殿物を調製した。得られた沈殿物ペレットは、比較的不溶性であると説明されており、追加のＢＬＧ中に相当量のタンパク質不純物を含んだ。結晶の形成は、観察されなかった。ｐＨ４．６５で形成され得るＢＬＧ沈殿物は、ＢＬＧ結晶ではないことに留意すべきである。
Ｐａｌｍｅｒ（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｏｗ’ｓ Ｍｉｌｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１０４，１９３４，ｐａｇｅｓ３５９－３７２）は、望ましくないタンパク質の塩析沈殿、ｐＨ調整および他の望ましくないタンパク質を除去するための透析のいくつかのシーケンスを使用して、酸ホエイをベースとしてタンパク質結晶を製造するための面倒で時間がかかるプロセスを報告した。最後に、高純度のＢＬＧ溶液が得られた場合、ＢＬＧが結晶化された。このプロセスは、１２日を超えて続き、さらにトルエンの添加を必要とした。従って、Ｐａｌｍｅｒにより開示された手順は、安全な食品製造と相容れず、明らかに食用でない生成物が生じる。
Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇら（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｂｅｔａ－Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ａｌｐｈａ－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｏｗ’ｓ Ｍｉｌｋ，Ｂｉｏｃｈ．，ｖｏｌ．６５，１９５７，ｐａｇｅｓ２７３－２７７）は、Ｐａｌｍｅｒのプロセスと比較して改善されたプロセスを開示し、この改善により、数週間ではなく数日ほどでベータ－ラクトグロブリン結晶の調製が可能である。しかしながら、この改善された方法は、依然として結晶化前に望ましくないタンパク質の除去を必要とし、さらに結晶化のためにトルエンを用い、このトルエンの使用により、この方法は、安全な食品製造と相容れない。
特開平１０－２１８７５５号公報は、有効成分としてＢＬＧを含むメラニン生成阻害剤を含む化粧品組成物の製造を開示している。この文献では、ＢＬＧが例えば下記のプロセスによって単離され得ることがさらに示唆されている：乳に塩酸を添加してカゼインを沈殿させ、続いてろ過してホエイを得る。このホエイのｐＨを６．０に調整し、硫酸アンモニウムを半飽和量で添加し、沈殿したタンパク質を塩析により除去し、ろ液を回収する。このろ液を硫酸アンモニウムで飽和させ、沈殿したタンパク質を回収する。回収したタンパク質を水に再度溶解させ、ｐＨ５．２で透析して結晶を分離し、β－ラクトグロブリンをホエイ１Ｌから約１．８ｇの割合で調製する。しかしながら、特開平１０－２１８７５５号公報で説明されている提案されたプロセスの一般的なプロセスステップは、ＢＬＧ結晶を形成するには不十分である。従って、この文献は、ＢＬＧの結晶化またはＢＬＧ結晶を可能にする開示を含まない。
米国特許第２７９０７９０号明細書は、溶液からのタンパク質の沈殿プロセスを開示しており、より具体的には、沈殿剤としての塩化ナトリウムの使用による水溶液からの比較的非共役のタンパク質の分別沈殿のための沈殿プロセスを開示している。このプロセスは、ｐＨ３．６～３．８でのＮａＣｌ誘導沈殿によるＢＬＧの単離に有用であると示唆されている。この文献の実施例ＩＩでは、ＮａＣｌ沈殿物を通常の方法で透析して、結晶性Ｂ－ラクトグロブリンを形成し得ることが示唆されている。しかしながら、米国特許第２７９０７９０号明細書は、ｐＨ３．６～３．８でのＢＬＧ結晶の形成が実際に可能であることを実証しておらず、ＢＬＧ沈殿物を透析する「通常の方法」の意味への言及も含まれていない。従って、この文献は、ＢＬＧの結晶化およびＢＬＧ結晶を可能にする開示を含まない。
偶然にも、本発明者らは、トルエン等の有機溶媒を使用することなく、ＢＬＧに加えて他のホエイタンパク質の相当量を含む粗ホエイタンパク質溶液中で高純度のＢＬＧ結晶を直接調製し得るという驚くべき発見をした。これは、タンパク質を結晶化させることを望み得る前に、このタンパク質を高度に精製しなければならないこと、および全てのタンパク質が結晶化され得るわけではないことを教示する当技術分野での共通の一般常識に反する。
この発見は、乳業界における、ホエイタンパク質を取り扱って分別する方法を変える可能性を有し、食品成分として安全に使用される高純度ＢＬＧの効率的かつ穏やかな製造を開くものである。
そのため、本発明の一態様は、結晶化形態および／または単離形態でベータ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）を含む食用組成物を調製する方法であって、
ａ）ＢＬＧおよび少なくとも１種の追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供するステップであって、前記ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、かつ５～６の範囲のｐＨを有する、ステップと、
ｂ）この過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化させるステップと、
ｃ）任意選択で、残存するホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離するステップと
を含む方法に関する。
本発明者らは、ＢＬＧ結晶を含む粉末形態の食用ホエイタンパク質組成物が、先行技術の同等の組成物と比べて有意に高い嵩密度を有することをさらに発見した。これは、この粉末の取扱いを容易にして埃っぽさを少なくすることから有利である。
そのため、本発明の別の態様は、例えば、本明細書で説明された１つまたは複数の方法によって得ることができる、結晶化形態および／または単離形態でベータ－ラクトグロブリンを含む食用組成物に関する。この食用組成物は、例えば、ＢＬＧ結晶を含み、かつ少なくとも０．４０ｇ／ｍＬの嵩密度を有する粉末であり得る。代わりに、この食用阻止物は、ＢＬＧ結晶を含む液体懸濁液またはスラリーであり得る。
本発明に関連して、「ＢＬＧ結晶」を含む乾燥製品（例えば、粉体）は、ＢＬＧ結晶の懸濁液の乾燥から得られる生成物を含み、この湿ったＢＬＧ結晶の結晶構造は、この乾燥プロセス中に歪んでいる場合があり、Ｘ線回折の特徴を少なくとも部分的に喪失している場合がある。同じように、用語「乾燥ＢＬＧ結晶」および「乾燥されたＢＬＧ結晶」は、湿ったＢＬＧ結晶の乾燥から得られる粒子を指し、この乾燥粒子は、それ自体が結晶構造を有する必要はない。しかしながら、本発明者らは、乾燥ＢＬＧ結晶を冷（４℃）脱塩水に水２部対乾燥ＢＬＧ結晶１部の重量比で再懸濁させる場合、このＢＬＧ結晶が再水和し、乾燥前と実質的に同一の結晶構造（空間群の種類および単位格子の寸法）を回復することを観察した。
ＢＬＧは、必須アミノ酸（例えば、ロイシンを含む）の大きい供給源であることが公知であり、従って、本発明により提供される食用ＢＬＧ組成物は、いくつかの興味深い栄養学的用途を有する。
本発明のさらなる態様は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１ならびに単位格子の寸法ａ＝６８．６８（±５％）Å、ｂ＝６８．６８（±５％）Åおよびｃ＝１５６．６５（±５％）Åを有する単離ＢＬＧ結晶に関し、この結晶は、単位格子の整数角α＝９０°、β＝９０°およびγ＝９０°を有する。
さらに、本発明のある態様は、食品成分としての、本明細書で定義された食用組成物の使用に関する。
本発明のさらなる態様は、本明細書で定義された食用組成物と、脂肪源および／または炭水化物源とを含む食品に関する。
図１は、スイートホエイをベースとする粗ホエイタンパク質溶液（実線）および結晶化後に得られた母液（破線）の２つの重ね合わせたクロマトグラムを示す。実線と破線との間の差異は、取り出されたＢＬＧ結晶に起因する。 図２は、実施例１から回収したＢＬＧ結晶の顕微鏡写真である。 図３は、実施例１から回収したＢＬＧ結晶のクロマトグラムである。 図４は、ホエイタンパク質溶液の導電率と、回収したＢＬＧ結晶の得られた収率との間の関係のプロットである。 図５は、ホエイタンパク質溶液の温度および導電率と、回収したＢＬＧ結晶の得られた収率との間の関係のプロットである。 図６は、ホエイタンパク質溶液の総タンパク質含有量（このタンパク質含有量に比例するＢｒｉｘ度により間接的に示される）と、回収したＢＬＧ結晶の得られた収率との間の関係を示す。 図７は、実施例３の原材料（ｆｅｅｄ）１（実線）ならびに結晶化およびＢＬＧ結晶の取り出し後に得られた母液（破線）のクロマトグラムを示す。 図８は、実施例３の原材料１の結晶化の初期段階中に採取した試料の顕微鏡写真である。 図９は、実施例３の原材料１の結晶化の完了後に採取した試料の顕微鏡写真である。 図１０は、実施例３の原材料１から得られた洗浄したＢＬＧ結晶のクロマトグラムを示す。 図１１は、実施例３の原材料２（実線）ならびに結晶化およびＢＬＧ結晶の取り出し後に得られた母液（破線）のクロマトグラムを示す。 図１２は、結晶化前（左側の写真）および後（右側の写真）の実施例３の原材料２の写真を示す。 図１３は、実施例３の原材料２から得られたＢＬＧ結晶（全体よび断片の両方）の顕微鏡写真を示す。 図１４は、ＢＬＧ結晶スラリーの導電率の上昇またはｐＨの変更によりＢＬＧ結晶が溶解することを示す。 図１５は、ＢＬＧ結晶スラリーの導電率の上昇またはｐＨの変更によりＢＬＧ結晶が溶解することを示す。 図１７は、結晶化前（左側の写真）および後（右側の写真）の実施例３の原材料３の写真を示す。 図１８は、実施例３の原材料３から回収したＢＬＧ結晶の顕微鏡写真である。 図１９は、いかなる洗浄ステップも伴わない実施例３の原材料３の回収したＢＬＧ結晶のクロマトグラムを示す。 図２０は、回収したＢＬＧ結晶の収率への導電率の増加の影響を示す。 図２１は、４．２０ｍＳ／ｃｍの導電率で形成されたＢＬＧ結晶の顕微鏡写真を示す。 図２２は、ＳＰＣベースのホエイタンパク質溶液の結晶化の初期段階からのＢＬＧ結晶の顕微鏡写真を示す。 図２３は、標準的なホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）の嵩密度と、ＢＬＧ結晶を含む本発明の高純度ＢＬＧ組成物の嵩密度との差異を示す。 図２４は、実施例３、原材料１のＢＬＧ結晶が母液から分離されているスピンフィルタの写真である。 図２５は、実施例８の６種の低リン飲料試料の部分試料の写真である。左から右に、部分試料は、試料Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦである。 図２６は、母液からのＢＬＧ結晶の分離のためにＤＣＦを使用する、実施例１０の結晶化プロセスの変形形態を示す概略図である。 図２７は、フィルタ遠心分離器を使用したＢＬＧ結晶と母液との分離から得られたフィルタケーキの３枚の写真を示す。
上述したように、本発明のある態様は、結晶化形態および／または単離形態でベータ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）を含む食用組成物を調製する方法であって、
ａ）ＢＬＧおよび少なくとも１種の追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供するステップであって、前記ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、かつ５～６の範囲のｐＨを有する、ステップと、
ｂ）この過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化させるステップと、
ｃ）任意選択で、残存するホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離するステップと
を含む方法に関する。
本発明に関連して、用語「食用組成物」は、ヒトが消費しかつ食品成分として使用するのに安全であり、および毒性成分（例えば、トルエンまたは他の望ましくない有機溶媒）の問題となる量を含まない組成物に関する。ＢＬＧは、ウシホエイおよび乳清中で最も優性なタンパク質であり、いくつかの遺伝子バリアントで存在し、牛乳中における主なものは、ＡおよびＢと標識されている。ＢＬＧは、リポカリンタンパク質であり、多くの疎水性分子に結合し得、この疎水性分子の輸送における役割を示唆する。ＢＬＧは、シデロホアを介して鉄に結合し得ることも分かっており、病原体への対処において役割を有し得る。ＢＬＧの同族体は、ヒトの母乳で欠如している。
ウシＢＬＧは、分子量が約１８．３～１８．４ｋＤａである、約１６２個のアミノ酸残基の比較的小さいタンパク質である。生理学的条件下では、このウシＢＬＧは、主に二量体であるが、約ｐＨ３未満で単量体に解離し、ＮＭＲを使用して決定されるように、この単量体の天然状態を保持する。反対に、ＢＬＧは、様々な天然条件下において四量体、八量体および他の多量体凝集形態でも生じる。
凝集を可能にするように天然構造が十分に不安定化されている場合、ＢＬＧ溶液は、様々な条件下でゲルを形成し得る。低ｐＨおよび低イオン強度での長期にわたる加熱下で透明な「微細鎖状」ゲルが形成され、このゲル中では、タンパク質分子が長くて硬い繊維に集合する。
本発明に関連して、用語「ＢＬＧ」または「ベータ－ラクトグロブリン」は、例えば、天然形態および／またはグリコシル化形態における哺乳動物種由来のＢＬＧに関し、天然に存在する遺伝子バリアントを含む。
本発明に関連して、用語「結晶」は、構成要素（例えば、原子、分子またはイオン）が非常に規則的な微視的構造で配置されている固体材料に関し、全方向に延びる結晶格子を形成する。ＢＬＧ結晶は、非常に規則的な微視的構造で配置されているＢＬＧを主に含むタンパク質結晶であり、全方向に延びる結晶格子を形成する。ＢＬＧ結晶は、例えば、モノリシックまたは多結晶質であり得、かつ例えば無傷の結晶、結晶の断片またはこれらの組合わせであり得る。結晶の断片は、例えば、無傷の結晶が加工中に機械的剪断にかけられる場合に形成される。結晶の断片は、結晶の非常に規則的な微視的構造も有するが、無傷な結晶の均一な表面および／または均一な縁もしくは角を欠いている場合がある。例えば、多くの無傷のＢＬＧ結晶の一例については図１８を、ＢＬＧ結晶の断片の一例については図１３を参照されたい。両方の場合において、ＢＬＧ結晶または結晶断片は、光顕微鏡を使用して明確に定義されたコンパクトでコヒーレントな構造として視覚的に識別され得る。ＢＬＧ結晶または結晶断片は、少なくとも部分的に透明であることが多い。タンパク質結晶は、複屈折性であることがさらに知られており、この光学特性を使用して、結晶構造を有する未知の粒子を同定し得る。他方では、非結晶性ＢＬＧ凝集体は、明確に定義されておらず、不透明であり、かつ不規則なサイズの目の粗いまたは多孔質の塊として見える。
本発明に関連して、用語「結晶化させる」は、タンパク質結晶の形成に関する。結晶化は、例えば、自発的に起き得るか、または結晶化種の添加によって開始され得る。
本食用組成物は、結晶化形態および／または単離形態でＢＬＧを含む。単離形態でＢＬＧを含む食用組成物は、総固形物に対して少なくとも８０％（重量／重量）のＢＬＧを含む。結晶化形態でＢＬＧを含む食用組成物は、少なくともいくつかのＢＬＧ結晶、好ましくは相当量のＢＬＧ結晶を含む。
ＢＬＧ結晶は、多くの場合に顕微鏡で観察され得、さらに目に見えるサイズに達する場合がある。
本発明に関連して、「過飽和」または「ＢＬＧに関して過飽和」である液体は、所与の物理的条件および化学的条件において、この液体中のＢＬＧの飽和点を超える濃度の溶解ＢＬＧを含む。用語「過飽和」は、結晶化の分野で公知であり（例えば、Ｇｅｒａｒｄ Ｃｏｑｕｅｒｅｌａ，“Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｐｈａｓｅ ｄｉａｇｒａｍｓ，ｓｕｐｅｒｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂａｓｉｃ ｃｏｎｃｅｐｔｓ”，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｐ．２２８６－２３００，Ｉｓｓｕｅ ７，２０１４を参照されたい）、過飽和を多くの異なる測定技術により（例えば、分光法または粒径分析により）決定し得る。本発明に関連して、ＢＬＧに関する過飽和は、下記の手順により決定される。
ＢＬＧに関して特定の条件で液体が過飽和であるかどうかを試験する手順：
ａ）試験する液体の試料５０ｍｌを高さ１１５ｍｍ、内径２５ｍｍおよび容量５０ｍＬの遠心分離チューブ（ＶＷＲカタログ番号５２５－０４０２）に移す。ステップａ）～ｈ）中、試料およびその後のその画分をこの液体の元々の物理的条件および化学的条件で保つように注意すべきである。
ｂ）この試料を最大３０秒の加速および最大３０秒の減速で３．０分にわたり３０００ｇで直ちに遠心分離する。
ｃ）遠心分離の直後に、（ペレットが形成されている場合、このペレットを乱すことなく）上清を可能な限り多く第２の遠心分離チューブ（（ステップａ）と同じタイプ）に移す。
ｄ）この上清の部分試料０．０５ｍＬを採取する（部分試料Ａ）。
ｅ）第２の遠心分離チューブに、最大２００ミクロンの粒径を有するＢＬＧ結晶（総固形物に対して少なくとも９８％の純ＢＬＧ）１０ｍｇを添加し、この混合物を撹拌する。
ｆ）この第２の遠心分離チューブを元々の温度で６０分にわたり放置する。
ｇ）ステップｆ）の直後に、この第２の遠心分離チューブを１０分にわたり５００ｇで遠心分離し、次いで上清の別の部分試料０．０５ｍＬを採取する（部分試料Ｂ）。
ｈ）ステップｇ）の遠心分離ペレットが存在する場合、このペレットを回収し、このペレットをｍｉｌｌｉＱ水に再懸濁させ、顕微鏡により見える結晶の存在に関してこの懸濁液を直ちに検査する。
ｉ）実施例９．９で概説する方法を使用して、部分試料Ａ中のおよび部分試料Ｂ中のＢＬＧの濃度を決定し、結果を部分試料の総重量に対する重量／重量％ ＢＬＧとして表す。部分試料ＡのＢＬＧの濃度は、ＣＢＬＧ，Ａと称され、部分試料ＢのＢＬＧの濃度は、ＣＢＬＧ，Ｂと称される。
ｊ）ｃＢＬＧ，ＢがｃＢＬＧ，Ａと比べて低く、かつステップｉ）で結晶が観察される場合、ステップａ）の試料を採取した液体は、（この特定の条件で）過飽和であった。
本発明に関連して、用語「液体」および「溶液」は、液体と、固体または半固体の粒子（例えば、タンパク質結晶または他のタンパク質粒子）との組合わせを含む組成物を包含する。従って、「液体」または「溶液」は、懸濁液であり得、さらにスラリーであり得る。しかしながら、「液体」および「溶液」は、好ましくは、ポンプ輸送可能である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本方法は、ステップｃ）の分離を含まず、ＢＬＧ結晶および追加のホエイタンパク質の両方を含む食用組成物が生成される。この方法の変形形態がステップｆ）の乾燥させることをさらに含む場合、ＢＬＧ結晶および追加のホエイタンパク質を含む乾燥組成物（即ちＢＬＧの少なくとも一部がＢＬＧ結晶の形態で存在するＷＰＣまたはＷＰＩ）が生成される。好ましくは、この方法は、直接的な順番でステップａ）、ｂ）およびｆ）を含む。
本ホエイタンパク質原材料がホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、血清タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）または血清タンパク質単離物（ＳＰＩ）である場合、上記の方法の変形形態により、ＢＬＧの少なくとも一部が結晶形態である液体形態または乾燥形態でＷＰＣ、ＷＰＩ、ＳＰＣまたはＳＰＩを調製することが可能になる。
用語「ホエイタンパク質濃縮物」および「血清タンパク質濃縮物」は、総固形物に対して２０～８９％（重量／重量）のタンパク質の総量を含む乾燥組成物または水性組成物に関する。
ＷＰＣまたはＳＰＣは、好ましくは、
総固形物に対して２０～８９％（重量／重量）のタンパク質、
総タンパク質に対して１５～７０％（重量／重量）のＢＬＧ、
総タンパク質に対して８～５０％（重量／重量）のＡＬＡ、および
タンパク質に対して０～４０％（重量／重量）のＣＭＰ
を含む。
代わりに、しかしまた好ましくは、ＷＰＣまたはＳＰＣは、
総固形物に対して２０～８９％（重量／重量）のタンパク質、
総タンパク質に対して１５～９０％（重量／重量）のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４～５０％（重量／重量）のＡＬＡ、および
タンパク質に対して０～４０％（重量／重量）のＣＭＰ
を含み得る。
好ましくは、ＷＰＣまたはＳＰＣは、
総固形物に対して２０～８９％（重量／重量）のタンパク質、
総タンパク質に対して１５～８０％（重量／重量）のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４～５０％（重量／重量）のＡＬＡ、および
タンパク質に対して０～４０％（重量／重量）のＣＭＰ
を含む。
より好ましくは、ＷＰＣまたはＳＰＣは、
総固形物に対して７０～８９％（重量／重量）のタンパク質、
総タンパク質に対して３０～９０％（重量／重量）のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４～３５％（重量／重量）のＡＬＡ、および
タンパク質に対して０～２５％（重量／重量）のＣＭＰ
を含む。
用語「ホエイタンパク質単離物」および「血清タンパク質単離物」は、総固形物に対して９０～１００％（重量／重量）のタンパク質の総量を含む乾燥組成物または水性組成物に関する。
ＷＰＩまたはＳＰＩは、好ましくは、
総固形物に対して９０～１００％（重量／重量）のタンパク質、
総タンパク質に対して１５～７０％（重量／重量）のＢＬＧ、
総タンパク質に対して８～５０％（重量／重量）のＡＬＡ、および
総タンパク質に対して０～４０％（重量／重量）のＣＭＰ
を含む。
代わりに、しかしまた好ましくは、ＷＰＩまたはＳＰＩは、
総固形物に対して９０～１００％（重量／重量）のタンパク質、
総タンパク質に対して３０～９５％（重量／重量）のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４～３５％（重量／重量）のＡＬＡ、および
総タンパク質に対して０～２５％（重量／重量）のＣＭＰ
を含み得る。
より好ましくは、ＷＰＩまたはＳＰＩは、
総固形物に対して９０～１００％（重量／重量）のタンパク質、
総タンパク質に対して３０～９０％（重量／重量）のＢＬＧ、
総タンパク質に対して４～３５％（重量／重量）のＡＬＡ、および
総タンパク質に対して０～２５％（重量／重量）のＣＭＰ
を含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本方法は、ＢＬＧ結晶（例えば、ステップｃ）から得られた分離されたＢＬＧ結晶）を洗浄するステップｄ）をさらに含む。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本方法は、ＢＬＧ結晶（例えば、ステップｃ）またはｄ）から得られたＢＬＧ結晶）を再結晶化させるステップｅ）をさらに含む。
本方法は、例えば、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）を含み得るかまたはこれらからなり得る。代わりに、本方法は、ステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｅ）を含み得るかまたはこれらからなり得る。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、本方法は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物を乾燥ステップｆ）をさらに含む。
本方法は、例えば、ステップａ）、ｂ）およびｆ）を含み得るかまたはこれらからなり得る。代わりに、本方法は、ステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｆ）を含み得るかまたはこれらからなり得る。代わりに、本方法は、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｆ）を含み得るかまたはこれらからなり得る。代わりに、本方法は、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）を含み得るかまたはこれらからなり得る。
上述したように、本発明のステップａ）は、ＢＬＧおよび少なくとも追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供することを伴う。
本発明に関連して、用語「ホエイタンパク質」は、ホエイまたは乳清中に見出されるタンパク質に関する。本ホエイタンパク質溶液のホエイタンパク質は、ホエイもしくは乳清中に見出されるタンパク質種のサブセットであり得るか、またはホエイおよび／もしくは乳清中に見出されるタンパク質種の完全なセットであり得る。しかしながら、このホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧを常に含む。
本発明に関連して、用途「追加のタンパク質」は、ＢＬＧではないタンパク質を意味する。本ホエイタンパク質溶液中に存在する追加のタンパク質は、典型的には、乳清またはホエイ中に見出される非ＢＬＧタンパク質の１種または複数を含む。そのようなタンパク質の非限定的な例は、アルファ－ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、カゼイノ－マクロペプチド（ＣＭＰ）、オステオポンチン、ラクトフェリンおよび乳脂肪球膜タンパク質である。
従って、本ホエイタンパク質溶液は、好ましくは、アルファ－ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）、オステオポンチン、ラクトフェリン、乳脂肪球膜タンパク質およびこれらの組合わせからなる群から選択される少なくとも１種の追加のホエイタンパク質を含み得る。
アルファ－ラクトアルブミン（ＡＬＡ）は、ほとんど全ての哺乳動物種の乳中に存在するタンパク質である。ＡＬＡは、ラクトースシンターゼ（ＬＳ）ヘテロ二量体の調節サブユニットを形成し、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ベータ４Ｇａｌ－Ｔ１）は、触媒成分を形成する。まとめると、これらのタンパク質は、ガラクトース部分をグルコースに導入することにより、ＬＳがラクトースを産生することを可能にする。多量体として、アルファ－ラクトアルブミンは、カルシウムイオンおよび亜鉛イオンに強く結合し、かつ殺菌活性または抗腫瘍活性を有し得る。ベータ－ラクトグロブリンとの主な構造上の差異の１つは、ＡＬＡが、共有結合性の凝集反応の出発点として作用し得るチオール基を全く有しないことである。結果として、純粋なＡＬＡは、変性および酸性化の際にゲルを形成しないであろう。
本発明に関連して、用語「ＡＬＡ」または「アルファ－ラクトアルブミン」は、例えば、天然形態および／またはグリコシル化形態における哺乳動物種由来のアルファ－ラクトアルブミンに関し、天然に存在する遺伝子バリアントを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本ホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大１０％（重量／重量）、タンパク質の総量に対して好ましくは最大５％（重量／重量）、より好ましくは最大１％（重量／重量）、さらにより好ましくは最大０．５％のカゼインを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液は、検出可能な量のカゼインを全く含まない。
用語「乳清」は、例えば、精密ろ過または大きい細孔の限外ろ過により、カゼインおよび乳脂肪球を乳から除去している場合に残る液体に関する。乳清は、「理想的なホエイ」とも称され得る。
用語「乳清タンパク質」または「血清タンパク質」は、乳清中に存在するタンパク質に関する。
用語「ホエイ」は、乳のカゼインを沈殿させて除去した後に残る液体上清に関する。カゼイン沈殿は、例えば、乳の酸性化および／またはレンネット酵素の使用により達成され得る。
カゼインのレンネットに基づく沈殿により製造されるホエイ製品である「スイートホエイ」およびカゼインの酸に基づく沈殿により製造されるホエイ製品である「酸性ホエイ」または「サワーホエイ」等、いくつかのタイプのホエイが存在する。カゼインの酸に基づく沈殿は、例えば、食用酸の添加または細菌培養により達成され得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパクの総量に対して少なくとも５％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含む。より好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２０％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含む。最も好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含み得る。
本発明の他の好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含む。最も好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含み得る。
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３５％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４０％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含み得る。より好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して少なくとも４５％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含み得る。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５０％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５～９０％（重量／重量）の範囲の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０～８０％（重量／重量）の範囲の追加のホエイタンパク質を含み得る。ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して２０～７０％（重量／重量）の範囲の追加のホエイタンパク質を含み得る。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して３０～７０％（重量／重量）の範囲の追加のホエイタンパク質を含む。
上述したように、本発明者らは、有機溶媒を使用することなくＢＬＧを結晶化させ得ることを発見した。この精製アプローチは、ホエイタンパク質を含む調製物（この調製物は、数回のＢＬＧ精製に既にかけられている）を精製するためにも使用され得、ＢＬＧの純度をさらに増加させる単純な方法を提供する。そのため、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１～２０％（重量／重量）の範囲の追加のホエイタンパク質を含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２～１５％（重量／重量）の範囲の追加のホエイタンパク質を含み得る。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して３～１０％（重量／重量）の範囲の追加のホエイタンパク質を含み得る。
本発明のいくつかの実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５％（重量／重量）のＡＬＡを含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０％（重量／重量）のＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５％（重量／重量）のＡＬＡを含む。代わりに、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２０％（重量／重量）のＡＬＡを含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２５％（重量／重量）のＡＬＡを含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０％（重量／重量）のＡＬＡを含む。ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、好ましくは、タンパク質の総量に対して少なくとも３５％（重量／重量）のＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４０％（重量／重量）のＡＬＡを含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５～９５％（重量／重量）の範囲のＡＬＡを含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５～７０％（重量／重量）の範囲のＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０～６０％（重量／重量）の範囲のＡＬＡを含み得る。ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、好ましくは、タンパク質の総量に対して１２～５０％（重量／重量）の範囲のＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２０～４５％（重量／重量）の範囲のＡＬＡを含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が少なくとも０．０１である。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が少なくとも０．５である。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が少なくとも１、例えば少なくとも２である。例えば、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が少なくとも３であり得る。
ホエイタンパク質溶液およびホエイタンパク質原材料中のＢＬＧおよび他のタンパク質の量および濃度は、全て溶解したタンパク質を指し、沈殿または結晶化したタンパク質を含まない。
本発明に関連して、成分Ｘと成分Ｙとの間の用語「重量比」は、計算ｍＸ／ｍＹ（式中、ｍＸは、成分Ｘの量（重量）であり、ｍＹは、成分Ｙの量（重量）である）により得られる値を意味する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が０．０１～２０の範囲である。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が０．２～１０の範囲である。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が０．５～４の範囲である。例えば、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が１～３の範囲である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１％（重量／重量）のＢＬＧを含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２％（重量／重量）のＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５％（重量／重量）のＢＬＧを含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１２％（重量／重量）のＢＬＧを含む。例えば、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して少なくとも２０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。代わりに、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大９５％（重量／重量）のＢＬＧを含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大９０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。より好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して最大８５％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、例えば、タンパク質の総量に対して最大８０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大７８％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大７５％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１～９５％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５～９０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含み得る。より好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０～８５％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０～８０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。最も好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２０～７０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含み得る。
本発明の他の好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０～９５％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１２～９０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含み得る。より好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１５～８５％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１５～８０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。最も好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して３０～７０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、このホエイタンパク質溶液の重量に対して少なくとも０．４％（重量／重量）のＢＬＧを含む。好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、少なくとも１．０％（重量／重量）のＢＬＧを含む。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、少なくとも２．０％（重量／重量）のＢＬＧを含む。このホエイタンパク質溶液が少なくとも４％（重量／重量）のＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
より高濃度のＢＬＧがさらにより好ましく、好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、少なくとも６％（重量／重量）のＢＬＧを含む。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、少なくとも１０％（重量／重量）のＢＬＧを含む。このホエイタンパク質溶液が少なくとも１５％（重量／重量）のＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、このホエイタンパク質溶液の重量に対して０．４～４０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、１～３５％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、４～３０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含む。このホエイタンパク質溶液が１０～２５％（重量／重量）の範囲のＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
任意の適切なホエイタンパク質源を使用して本ホエイタンパク質溶液を調製し得る。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、このホエイタンパク質溶液は、乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、ホエイタンパク質単離物またはこれらの組合わせを含むかまたはこれらからなる。
本ホエイタンパク質溶液は、脱塩ホエイタンパク質溶液であることが好ましい。
これに関連して、用語脱塩は、本ホエイタンパク質溶液の導電率が最大１５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは最大１０ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大８ｍＳ／ｃｍであることを意味する。脱塩ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、好ましくは、最大７ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは最大４ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大１ｍＳ／ｃｍである。
本ホエイタンパク質溶液は、脱塩乳清タンパク質濃縮物、脱塩乳清タンパク質単離物、脱塩ホエイタンパク質濃縮物または脱塩ホエイタンパク質単離物であることが特に好ましい。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液は、脱塩されてｐＨが調整された乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、ホエイタンパク質単離物またはこれらの組合わせを含むかまたはこれらからなる。
本ホエイタンパク質溶液は、例えば、脱塩乳清タンパク質濃縮物を含み得るかまたはこれからなり得る。代わりに、このホエイタンパク質溶液は、脱塩ホエイタンパク質濃縮物を含み得るかまたはこれからなり得る。代わりに、このホエイタンパク質溶液は、脱塩乳清タンパク質単離物み得るかまたはこれからなり得る。代わりに、このホエイタンパク質溶液は、脱塩ホエイタンパク質単離物を含み得るかまたはこれからなり得る。
本発明に関連して、用語「ホエイタンパク質濃縮物」および「乳清タンパク質濃縮物」は、ホエイまたは乳清の調製物に関し、この調製物は、総固形物に対して約２０～８９％（重量／重量）の範囲のタンパク質を含む。
本発明に関連して、用語「ホエイタンパク質単離物」および「乳清タンパク質単離物」はホエイまたは乳清の調製物に関し、この調製物は、総固形物に対して少なくとも９０％（重量／重量）のタンパク質を含む。
用語「から本質的になる」および「から本質的になっている」は、対象の請求項または特徴が、特定の材料またはステップと、特許請求される本発明の基本的で新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものとを包含すること意味する。
本ホエイタンパク質溶液のタンパク質は、好ましくは、哺乳動物の乳由来であり、好ましくは反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ラクダ、ラマ、雌ウマおよび／またはシカ）の乳由来である。ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）（ウシ（ｃｏｗ））の乳由来のタンパク質が特に好ましい。従って、ＢＬＧおよび追加のホエイタンパク質は、好ましくは、ウシＢＬＧおよびウシホエイタンパク質である。
本ホエイタンパク質溶液のタンパク質は、好ましくは、その天然状態に可能な限り近く、好ましくはたとえあったとしても緩やかな加熱処理にかけられているのみである。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大１である。好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大０．６である。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大０．４である。さらにより好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大０．２である。最も好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大０．１、例えば好ましくは最大０．０１である。
ＢＬＧのラクトシル化度は、Ｃｚｅｒｗｅｎｋａ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．２３，２００６，ｐａｇｅｓ８８７４－８８８２）に従って決定される。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液は、フロシン値が最大８０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、フロシン値が最大４０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、フロシン値が最大２０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。さらにより好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、フロシン値が最大１０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。最も好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、フロシン値が最大５ｍｇ／タンパク質１００ｇであり、例えば好ましくはフロシン値が０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。
本ホエイタンパク質溶液は、典型的には、タンパク質に加えて他の成分を含む。このホエイタンパク質溶液は、ホエイまたは乳清中に通常見出される他の成分（例えば、ミネラル、炭水化物および／または脂質）を含み得る。代わりにまたは加えて、このホエイタンパク質溶液は、ホエイまたは乳清に固有でない成分を含み得る。しかしながら、そのような非天然成分は、好ましくは、食品製造での使用に対して安全であるべきであり、同様に好ましくはヒトによる消費に対しても安全であるべきである。
本方法は、ＢＬＧ以外の固体を含む粗ホエイタンパク質溶液からＢＬＧを分離するのに特に有利である。
本ホエイタンパク質溶液は、例えば、炭水化物、例えばラクトース、オリゴ糖ならびに／またはラクトースの加水分解生成物（即ちグルコースおよびガラクトース）を含み得る。このホエイタンパク質溶液は、例えば、０～４０％（重量／重量）の範囲、例えば１～３０％（重量／重量）の範囲または２～２０％（重量／重量）の範囲で炭水化物を含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液は、最大２０％（重量／重量）の炭水化物、好ましくは最大１０％（重量／重量）の炭水化物、より好ましくは最大５％（重量／重量）の炭水化物、さらにより好ましくは最大２％（重量／重量）の炭水化物を含む。
本ホエイタンパク質溶液は、脂質、例えばトリグリセリドおよび／または他の脂質型（例えば、リン脂質）の形態で脂質も含み得る。
本発明のいくつかの実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、総固形物に対して最大１５％（重量／重量）の脂質の総量を含む。好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、総固形物に対して最大１０％（重量／重量）の脂質の総量を含む。より好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、総固形物に対して最大６％（重量／重量）の脂質の総量を含む。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、総固形物に対して最大１．０％（重量／重量）の脂質の総量を含む。最も好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、総固形物に対して最大０．５％（重量／重量）の脂質の総量を含む。
本ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、典型的には、このホエイタンパク質溶液の重量に対して少なくとも１％（重量／重量）である。好ましくは、このホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも５％（重量／重量）である。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも１０％（重量／重量）である。さらにより好ましくは、このホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも１５％（重量／重量）である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、１～５０％（重量／重量）の範囲である。好ましくは、このホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、５～４０％（重量／重量）の範囲である。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、１０～３０％（重量／重量）の範囲である。さらにより好ましくは、このホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、１５～２５％（重量／重量）の範囲である。
本ホエイタンパク質溶液のタンパク質の総量は、実施例９．２に従って決定される。
本ホエイタンパク質溶液は、典型的には、ホエイタンパク質原材料を、ＢＬＧに関して過飽和であるホエイタンパク質溶液が形成される１つまたは複数の調整にかけることにより調製される。
この原材料は、好ましくは、ＷＰＣ、ＷＰＩ、ＳＰＣ、ＳＰＩまたはこれらの組合わせである。
本発明に関連して、用語「ホエイタンパク質原材料」は、ＢＬＧに関して過飽和のホエイタンパク質溶液に変換される組成物に関する。このホエイタンパク質原材料は、典型的には、ＢＬＧと、少なくとも１種のホエイタンパク質とを含む水性液体であるが、通常、ＢＬＧに関して過飽和ではない。
本ホエイタンパク質溶液の化学組成に関する実施形態は、本ホエイタンパク質原材料にも同様に当てはまるが、典型的には、このホエイタンパク質原材料の少なくとも１つのパラメータは、過飽和または少なくとも自発的結晶化を回避するように設定されている。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本過飽和ホエイタンパク質溶液は、本ホエイタンパク質原材料を下記の調整：
－ ｐＨを調整すること、
－ 導電率を減少させること、
－ 温度を低下させること、
－ タンパク質濃度を増加させること、
－ 水分活性を減少させる薬剤を添加すること、
－ イオン組成を変更すること
の１つまたは複数にかけることによって調製される。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料のｐＨを５～６の範囲のｐＨに調製することを伴う。
全てのｐＨ値は、ｐＨガラス電極を使用して測定され、２５℃に正規化される。
本ホエイタンパク質溶液は、例えば、４．９～６．１の範囲のｐＨを有し得る。このホエイタンパク質溶液のｐＨは、例えば、５．０～６．１の範囲であり得る。代わりに、このホエイタンパク質溶液のｐＨは、５．１～６．１の範囲であり得る。好ましくは、このホエイタンパク質溶液のｐＨは、５．１～６．０の範囲である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液のｐＨは、５．０～６．０の範囲である。好ましくは、このホエイタンパク質溶液のｐＨは、５．１～６．０の範囲である。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液のｐＨは、５．１～５．９の範囲である。さらにより好ましくは、このホエイタンパク質溶液のｐＨは、５．２～５．９の範囲であり得る。最も好ましくは、このホエイタンパク質溶液のｐＨは、５．２～５．８の範囲である。
ｐＨは、好ましくは、食品に許容される酸および／または塩基を使用して調整される。例えば、カルボン酸等の食品に許容される酸が特に好ましい。そのような酸の有用な例は、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸もしくはグルコン酸および／またはこれらの混合物である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ｐＨは、ラクトン（例えば、Ｄ－グルコノ－デルタ－ラクトン）を使用して調整され、このラクトンは、緩やかに加水分解し、同時にこのラクトンを含む水性液体のｐＨを低下させる。ラクトンの加水分解が終了した後の標的ｐＨは、正確に算出され得る。
食品に許容される塩基の有用な例は、例えば、水酸化物源、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、食用酸の塩（例えば、クエン酸三ナトリウム）および／またはこれらの組合わせである。
本発明の他の好ましい実施形態では、ｐＨは、陽イオン交換材料のそのＨ＋型での添加により調整される。結晶化前または結晶化後でも、ビーズ型／大粒子型の陽イオン交換材料は、本ホエイタンパク質溶液から容易に除去される。陽イオン交換材料のそのＨ＋型での添加によるｐＨの調整は、ホエイタンパク質原材料の導電率に顕著に影響を及ぼす負の対イオンを添加することなくｐＨを低下させることから、本発明で特に有利である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料の導電率を減少させることを伴う。
本明細書で言及する導電率の値は、別途明記しない限り、２５℃に正規化されている。
本発明者らは、本ホエイタンパク質溶液の導電率を減少させることによりＢＬＧ結晶の収率が高くなることを発見した。このホエイタンパク質溶液の得られる最小の導電率は、タンパク質画分および脂質画分（存在する場合）の組成に依存する。カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）等のいくつかのタンパク質種は、他のタンパク質種と比べて導電率への寄与が高い。従って、本ホエイタンパク質原材料の導電率を、タンパク質およびこのタンパク質の対イオンが導電率の主な一因であるレベルまで近づけることが好ましい。この導電率の減少は、液相中に存在し、かつタンパク質に強く結合していない小さい遊離イオンの少なくとも一部の除去を伴うことが多い。
本ホエイタンパク質溶液は、最大１０ｍＳ／ｃｍの導電率を有することが好ましいことが多い。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、このホエイタンパク質溶液は、最大５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、最大４ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
導電率が低いほどさらに好ましく、ＢＬＧ結晶の収率が高くなる。そのため、本ホエイタンパク質溶液は、好ましくは、最大３ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、このホエイタンパク質溶液は、最大１ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、最大０．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
好ましくは、本ホエイタンパク質原材料の導電率は、透析または透析ろ過により減少される。限外ろ過による透析ろ過は、タンパク質を保持しつつ塩および小さい荷電分子を洗い流すことが可能であることから特に好ましい。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、同じＵＦユニットがＵＦ／透析ろ過およびそれに続くホエイタンパク質原材料の濃縮に使用される。
本発明者らは、ＢＬＧの結晶化を促進するために、導電率（ｍＳ／ｃｍで表される）と、本ホエイタンパク質溶液中のタンパク質の総量（このホエイタンパク質溶液の総重量に対する総タンパク質の重量％で表される）との間の比が特定の閾値以下に保持され得ることが有利であるという徴候を発見した。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．３である。好ましくは、本ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．２５である。好ましくは、本ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．２０である。より好ましくは、本ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．１８である。さらにより好ましくは、本ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．１２である。最も好ましくは、本ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．１０である。
例えば、本ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、約０．０７以下であることが好ましい。
本発明者らは、ＵＦ透過液の導電率が最大１０ｍＳ／ｃｍであるホエイタンパク質溶液を生成するように本ホエイタンパク質原材料を有利に条件付け得ることをさらに発見した。ＵＦ透過液の導電率は、液体の小分子画分の導電率の尺度であり、実施例９．１０に従って測定される。用語「導電率」がそのように本明細書で使用される場合、この用語は、対象の液体の導電率を指す。用語「ＵＦ透過液の導電率」が使用される場合、この用語は、液体の小分子画分の導電率を指し、実施例９．１０に従って測定される。
好ましくは、本ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大７ｍＳ／ｃｍである。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大５ｍＳ／ｃｍであり得る。さらにより好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大３ｍＳ／ｃｍであり得る。
さらに低いＵＦ透過液の導電率を使用し得、ＢＬＧの高い収率を得るべき場合に特に好ましい。そのため、好ましくは、本ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大１．０ｍＳ／ｃｍである。より好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大０．４ｍＳ／ｃｍであり得る。さらにより好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大０．１ｍＳ／ｃｍであり得る。最も好ましくは、このホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大０．０４ｍＳ／ｃｍであり得る。
例えば、透析ろ過中に希釈剤としてＭｉｌｌｉＱ水（ＭｉｌｌｉＱは、約０．０６μＳ／ｃｍの導電率を有する）を使用して、さらに低いＵＦ透過液の導電率を達成し得る。そのため、本ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大０．０１ｍＳ／ｃｍであり得る。代わりに、このホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大０．００１ｍＳ／ｃｍであり得る。代わりに、このホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大０．０００１ｍＳ／ｃｍであり得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料の温度を低下させることを伴う。
例えば、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料の温度を少なくとも５℃、好ましくは少なくとも１０℃、さらにより好ましくは少なくとも１５℃まで低下させることを伴い得る。例えば、このホエイタンパク質溶液の調製は、このホエイタンパク質原材料の温度を少なくとも２０℃まで低下させることを伴い得る。
本ホエイタンパク質原材料の温度を例えば最大３０℃、好ましくは最大２０℃、さらにより好ましくは最大１０℃まで低下させ得る。さらに低い温度により過飽和の度合いが高くなり、そのため、本ホエイタンパク質原材料の温度を例えば最大５℃、好ましくは最大２℃、さらにより好ましくは最大０℃まで低下させ得ることを本発明者らは発見した。この温度は、０℃よりも低い場合さえあるが、好ましくは、本ホエイタンパク質溶液は、例えば、氷スラリーの形態でポンプ輸送可能なままであるべきである。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧ結晶化の初期化前に氷スラリーである。代わりにまたは加えて、結晶化するホエイタンパク質溶液は、ステップｂ）のＢＬＧ結晶化中に氷スラリーに変換され得るか、または氷スラリーとして維持され得る。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料の総タンパク質濃度を増加させることを伴う。このホエイタンパク質原材料を例えば１つまたは複数のタンパク質濃縮ステップ（例えば、限外ろ過、ナノろ過、逆浸透および／もしくは蒸発）にかけることができ、それにより濃縮して、このホエイタンパク質溶液を得ることができる。
限外ろ過は、タンパク質の選択的濃縮を可能にし、同時に塩および炭水化物の濃縮にほぼ影響を与えないことから特に好ましい。上述したように、限外ろ過は、好ましくは、本ホエイタンパク質原材料の透析ろ過および濃縮の両方に使用される。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液のＢＬＧの濃度は、ＢＬＧの自発的結晶化が起こるレベルよりも低い。従って、本ホエイタンパク質溶液が順安定領域にある場合、即ち播種が使用される場合にＢＬＧ結晶が成長し得るが、結晶化が自発的に始まらない過飽和領域にある場合、本ホエイタンパク質原材料の変更を停止することが好ましいことが多い。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質の溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料への１種または複数の水分活性減少剤の添加を伴う。
そのような水分活性減少剤の有用であり非限定的な例は、多糖および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、例えば、イオン交換により、新たなイオン種を添加することにより、透析または透析ろ過により、本ホエイタンパク質原材料のイオン組成を変更することを伴う。
典型的には、過飽和を生じさせるための上記のプロセスステップの２つ以上を組み合わせることにより、本ホエイタンパク質溶液を調製する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料を少なくとも：
－ １０℃を超える温度で例えば限外ろ過、ナノろ過または逆浸透を使用して濃縮すること、および
－ 続いて１０℃未満の温度まで冷却すること
にかけることを伴う。
本発明の他の好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料を少なくとも
－ ６．０超のｐＨで濃縮すること、および
－ 続いて酸（例えば、ＧＤＬまたはＨ＋型での陽イオン交換材料）の添加によりｐＨを低下させること
にかけることを伴う。
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料を少なくとも：
－ 例えば、少なくともＢＬＧを保持する膜を使用する透析ろ過により導電率を減少させること
にかけることを伴う。
本発明のさらに好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の調製は、本ホエイタンパク質原材料を少なくとも：
－ ｐＨを５～６に調整すること、
－ 少なくともＢＬＧを保持する膜を使用する透析ろ過により導電率を減少させること、
－ １０℃を超える温度で例えば限外ろ過、ナノろ過または逆浸透を使用してタンパク質を濃縮すること、および
－ 最後に、１０℃未満の温度まで冷却すること
の組合わせにかけることを伴う。
本発明者らは、ナトリウム＋カリウムの合計対カルシウムおよびマグネシウムの合計のモル比を制御することにより、本方法のＢＬＧ収率を改善し得ることをさらに発見した。カルシウムおよびマグネシウムのより高い相対量により、驚くべきことにＢＬＧの収率が増加し、従って本方法のＢＬＧ回収の効率が増加すると思われる。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大４である。より好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大２である。さらにより好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大１．５、さらにより好ましくは最大１．０である。最も好ましくは、ステップａ）のホエイタンパク質溶液は、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大０．５、例えば最大０．２である。
Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比は（ｍＮａ＋ｍＫ）／（ｍＣａ＋ｍＭｇ）として算出され、式中、ｍＮａは、ｍｏｌでの元素Ｎａの含有量であり、ｍＫは、ｍｏｌでの元素Ｋの含有量であり、ｍＣａは、ｍｏｌでの元素Ｃａの含有量であり、ｍＭｇは、ｍｏｌでの元素Ｍｇの含有量である。
本ホエイタンパク質溶液は、塩溶によりＢＬＧに関して過飽和であり、従って、ＢＬＧは、塩溶モードにおいてこのホエイタンパク質溶液から結晶化され得ることが特に好ましい。
本発明のいくつかの実施形態では、特に本発明の食用ＢＬＧ製品がある程度のタンパク質変性も有するはずである場合、本ホエイタンパク質溶液は、変性タンパク質の含有量が低い。好ましくは、このホエイタンパク質溶液は、タンパク質変性の度合いが最大２％、好ましくは最大１．５％、より好ましくは最大１．０％、最も好ましくは最大０．８％である。
本方法のステップｂ）は、本過飽和ホエイタンパク質溶液のＢＬＧの少なくとも一部を結晶化させることを伴う。
ステップｂ）の結晶化は、塩溶モード（即ちイオン強度および導電率が低い液体中）で起こることが特に好ましい。これは、結晶化を誘発するために相当量の塩が溶液に添加される塩析モードとは対照的である。
ステップｂ）のＢＬＧの結晶化は、例えば、下記：
－ 結晶化が起こるのを待つこと、
－ 結晶化種の添加、
－ ＢＬＧの過飽和の度合いをさらに増加させること、および／または
－ 機械的刺激
の１つまたは複数を伴い得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｂ）は、本ホエイタンパク質溶液に結晶化種を添加することを伴う。本発明者らは、結晶化種の添加により、プロセス装置の突然の目詰まりおよび製造中での意図しない停止を回避するために、ＢＬＧ結晶化が起こる時期および場所を制御し得ることを発見した。例えば、本ホエイタンパク質原材料を濃縮しつつ、結晶化の開始を回避することが望ましいことが多い。
原則として、ＢＬＧの結晶化を開始するあらゆる種材料を使用し得る。しかしながら、本ホエイタンパク質溶液へのさらなる不純物の添加を回避するために、播種には水和ＢＬＧ結晶または乾燥ＢＬＧ結晶を使用することが好ましい。
この結晶化種は、乾燥形態であり得るか、または本ホエイタンパク質溶液に添加された場合に懸濁液の一部を形成し得る。この結晶化種（例えば、ＢＬＧ結晶）を含む懸濁液の添加は、それにより結晶化がより早く開始されると思われることから、現在のところ好ましい。ｐＨが５～６の範囲であり、かつ導電率が最大１０ｍＳ／ｃｍである結晶化種を含むような懸濁液が好ましい。
本発明のいくつかの実施形態では、この結晶化種の少なくとも一部は、本ホエイタンパク質溶液と接触する固相上に位置する。
この結晶化種は、好ましくは、ＢＬＧ結晶の所望のサイズと比べて粒径が小さい。この結晶化種のサイズを、ふるい分けまたは他のサイズ分別プロセスによって最大の種を除去することにより変更し得る。この粒径分別前に例えば粉砕による粒径の減少も用い得る。
本発明のいくつかの実施形態では、この結晶化種の少なくとも９０％（重量／重量）は、（ふるい分け分析により測定した）粒径が０．１～６００ミクロンの範囲である。例えば、この結晶化種の少なくとも９０％（重量／重量）は、粒径が１～４００ミクロンの範囲であり得る。好ましくは、この結晶化種の少なくとも９０％（重量／重量）は、粒径が５～２００ミクロンの範囲であり得る。より好ましくは、この結晶化種の少なくとも９０％（重量／重量）は、粒径が５～１００ミクロンの範囲であり得る。
結晶化種の粒径および投与量を、ＢＬＧの最適な結晶化をもたらすように調整し得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ＢＬＧに関して過飽和を得る前に、しかし好ましくは過飽和が達成された場合に少なくともいくつかの結晶化種が依然として存在するように、この結晶化種を本ホエイタンパク質原材料に添加する。これは、例えば、（例えば、冷却、濃縮および／またはｐＨ調整中に）本ホエイタンパク質原材料が過飽和に近く、かつ結晶化種が完全に溶解する前に過飽和に達しそうである場合、結晶化種を添加することにより達成され得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｂ）は、好ましくは、ＢＬＧの結晶化が直ちに（即ち最大２０分、好ましくは最大５分で）始まる程度までＢＬＧの過飽和の度合いをさらに増加させることを伴う。これは、結晶が自発的に生じて結晶化プロスを開始する核形成ゾーンとも称される。
過飽和の度合いは、例えば、下記：
－ 本ホエイタンパク質溶液のタンパク質濃度をさらに増加させること、
－ このホエイタンパク質溶液をさらに冷却すること、
－ このホエイタンパク質溶液をＢＬＧ結晶化に最適なｐＨに近づけること、
－ 導電率をさらに減少させること
の１つまたは複数によって増加され得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｂ）は、ＢＬＧ結晶が生じるのを待つことを伴う。これには数時間かかる場合があり、典型的には、ＢＬＧに関してごくわずかに過飽和であり、かつ結晶化種が添加されていないホエイタンパク質溶液用である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ホエイタンパク質溶液の提供（ステップａ）およびＢＬＧの結晶化（ステップｂ）は、２つの別々のステップとして起こる。
しかしながら、本発明の他の好ましい実施形態では、ステップｂ）は、ＢＬＧの過飽和の度合いを上昇させるか、または少なくとも過飽和を維持するために、ホエイタンパク質溶液の結晶化のさらなる調整を伴う。さらなる調整により、ＢＬＧ結晶の収率が増加する。
そのようなさらなる調整は、
－ 結晶化するホエイタンパク質溶液のタンパク質濃度をさらに増加させること、
－ 結晶化するホエイタンパク質溶液をさらに低い温度まで冷却すること、
－ 結晶化するホエイタンパク質溶液をＢＬＧ結晶化に最適なｐＨにさらに近づけること、
－ 結晶化するホエイタンパク質溶液の導電率をさらに減少させること
の１つまたは複数を伴い得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、結晶化するホエイタンパク質溶液は、ステップｂ）中に順安定領域内に維持されて、新たな結晶の自発的形成が回避される。
本発明者らは、単離ＢＬＧ結晶の結晶格子構造をＸ線結晶学により決定しており、先行技術で同様の結晶を見出していない。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｂ）中に得られるＢＬＧ結晶の少なくとも一部は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１を有する。
好ましくは、得られたＢＬＧ結晶の少なくとも一部は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１と、単位格子の寸法ａ＝６８．６８（±５％）Å、ｂ＝６８．６８（±５％）Åおよびｃ＝１５６．６５（±５％）Åと、単位格子の整数角α＝９０°、β＝９０°およびγ＝９０°とを有する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、得られたＢＬＧ結晶の少なくとも一部は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１と、単位格子の寸法ａ＝６８．６８（±２％）Å、ｂ＝６８．６８（±２％）Åおよびｃ＝１５６．６５（±２％）Åと、単位格子の整数角α＝９０°、β＝９０°およびγ＝９０°とを有する。
さらにより好ましくは、得られたＢＬＧ結晶の少なくとも一部は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１と、単位格子の寸法ａ＝６８．６８（±１％）Å、ｂ＝６８．６８（±１％）Åおよびｃ＝１５６．６５（±１％）Åと、単位格子の整数角α＝９０°、β＝９０°およびγ＝９０°とを有し得る。
最も好ましくは、得られたＢＬＧ結晶の少なくとも一部は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１と、単位格子の寸法ａ＝６８．６８Å、ｂ＝６８．６８Åおよびｃ＝１５６．６５Åと、単位格子の整数角α＝９０°、β＝９０°およびγ＝９０°とを有する。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、本方法は、残存するホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶の少なくとも一部を分離するステップｃ）を含む。これは、ＢＬＧの精製が望ましい場合に特に好ましい。
ステップｃ）は、例えば、少なくとも３０％（重量／重量）の固形分までＢＬＧ結晶を分離することを含み得る。好ましくは、ステップｃ）は、少なくとも４０％（重量／重量）の固形分までＢＬＧ結晶を分離することを含む。さらにより好ましくは、ステップｃ）は、少なくとも５０％（重量／重量）の固形分までＢＬＧ結晶を分離することを含む。
本発明者らは、分離されたＢＬＧ結晶に付着する水性部分が概して避けるべき不純物を含むことから、高い固形分がＢＬＧの精製に有利であることを発見した。加えて、この高い固形分は、分離されたＢＬＧ結晶を乾燥生成物（例えば、粉末）に変換するためのエネルギー消費を削減し、所与の容量を有する乾燥装置から得られるＢＬＧ収率を増加させる。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ）は、少なくとも６０％の固形分までＢＬＧ結晶を分離することを含む。好ましくは、ステップｃ）は、少なくとも７０％の固形分までＢＬＧ結晶を分離することを含む。さらにより好ましくは、ステップｃ）は、少なくとも８０％の固形分までＢＬＧ結晶を分離することを含む。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ）の分離は、下記の操作：
－ 遠心分離、
－ デカンテーション、
－ ろ過、
－ 沈降、
－ 上記の組合わせ
の１つまたは複数を伴う。
これらの単位操作は、当業者に公知であり、かつ容易に実行される。ろ過による分離は、例えば、真空ろ過、動的クロスフローろ過（ＤＣＦ）、ろ過プレスまたはフィルタ遠心分離機の使用を伴い得る。
所望の結果に基づいて、ろ過のために様々な孔径を利用し得る。好ましくは、フィルタは、天然ホエイタンパク質および小さい凝集体を通過させるが、ＢＬＧ結晶を保持する。このフィルタは、好ましくは、名目上の孔径が少なくとも０．１ミクロンである。このフィルタは、例えば、名目上の孔径が少なくとも０．５ミクロンであり得る。さらにより好ましくは、このフィルタは、名目上の孔径が少なくとも２ミクロンであり得る。
孔径がより大きいフィルタも使用し得、ＢＬＧ結晶を含む液体から主に大きい結晶が分離されるべきである場合に実際に好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、このフィルタは、名目上の孔径が少なくとも５ミクロンである。好ましくは、このフィルタは、名目上の孔径が少なくとも２０ミクロンである。さらにより好ましくは、このフィルタは、孔径が少なくとも４０ミクロンであり得る。
このフィルタは、例えば、孔径が０．０３～５０００ミクロン、例えば０．１～５０００ミクロンの範囲であり得る。好ましくは、このフィルタは、細孔が０．５～１０００ミクロンの範囲であり得る。さらにより好ましくは、このフィルタは、細孔が５～８００ミクロンの範囲、例えば１０～５００ミクロンの範囲または５０～５００ミクロンの範囲であり得る。
本発明のいくつかの実施形態では、このフィルタは、細孔が０．０３～１００ミクロンの範囲である。好ましくは、このフィルタは、細孔が０．１～５０ミクロンの範囲であり得る。より好ましくは、このフィルタは、細孔が４～４０ミクロンの範囲であり得る。さらにより好ましくは、このフィルタは、細孔が５～３０ミクロンの範囲、例えば１０～２０ミクロンの範囲であり得る。
細孔が１ミクロンよりも大きいフィルタを使用することの利点は、分離中ならびに任意選択で洗浄および／または再結晶中にも細菌および他の微生物が少なくとも部分的に除去されることである。従って、本方法により、非常に低い細菌負荷でありながらタンパク質の熱損傷が回避されている高純度のＢＬＧの製造が可能となる。
細孔が１ミクロンよりも大きいフィルタを使用することの別の利点は、水の除去およびそれに続く乾燥がより容易になり、エネルギー消費がより少なくなることである。
ＢＬＧ結晶から分離された、残存するホエイタンパク質溶液を本ホエイタンパク質溶液の調製中に本ホエイタンパク質原材料に再利用し得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ）は、フィルタ遠心分離機を利用する。本発明の他の好ましい実施形態では、ステップｃ）は、デカンター遠心分離機を利用する。初期の結果（実施例１３を参照されたい）は、母液からＢＬＧ結晶を分離するためにフィルタ遠心分離機および／またはデカンター遠心分離機を使用することにより、例えば真空ろ過と比べて本方法の頑強な操作がもたらされることを示した。
多くの場合、形成されたフィルタケーキを乾燥ガスで乾燥させて、このフィルタケーキの含水量を減少させることが好ましく、このフィルタケーキをフィルタから剥がすことを可能にすることが好ましい。乾燥ガスの使用は、分離ステップの一部を形成し得るか、または代わりにこのフィルタケーキを乾燥食用ＢＬＧ組成物に直接変換する場合に最終乾燥ステップの一部を形成し得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ）は、ＤＣＦ装置を利用する。
初期の試験（実施例１２を参照されたい）は、膜孔径が０．０３～５ミクロンの範囲、好ましくは０．３～１．０ミクロンの範囲であるＤＣＦ装置を使用することにより、ＢＬＧ結晶の効率的な分離が提供されることを示し、本発明者らは、ＢＬＧ結晶を含むホエイタンパク質溶液のさらに大きいバッチから結晶を分離するのに十分な持続期間にわたりＤＣＦ装置を稼働させ得ることを観察した。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ結晶を保持し得る膜を備えたＤＣＦ装置を使用してステップｃ）を実施し、ＤＣＦ透過液を、本ホエイタンパク質溶液または本ホエイタンパク質原材料の一部を形成するために再利用し、ＤＣＦ保持液を回収し得るか、または結晶タンクに戻し得る。好ましくは、例えば、本ホエイタンパク質溶液または本ホエイタンパク質原材料と混合する前に、ＤＣＦ透過液をＢＬＧに関して過飽和にする限外ろ過／透析ろ過により、ＤＣＦ透過液を処理する。
有利には、これらの実施形態は、液体流の温度が１５℃を超えて上昇することを必要とせず、従ってより高い温度を必要とする方法の変形形態と比べて微生物汚染されにくい。これらの実施形態の別の産業上の利点は、過飽和レベルが容易に制御され、望ましくない自発的結晶化が起こらないレベルで保持され得ることである。従って、本方法のこれらの実施形態中の液体流の温度は、好ましくは、最大１５℃、より好ましくは最大１２℃、さらにより好ましくは最大１０℃、最も好ましくは最大５℃である。
これらの実施形態を実施例１０で例示しかつ図２６に示す。これらの実施形態をバッチ法または連続法として実行し得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本方法は、ＢＬＧ結晶（例えば、ｃ）の分離されたＢＬＧ結晶）を洗浄するステップｄ）を含む。この洗浄は、１回の洗浄ステップからなり得るか、または複数回の洗浄ステップからなり得る。
ステップｄ）の洗浄は、好ましくは、ＢＬＧ結晶を完全に溶解させることなくＢＬＧ結晶と洗浄液とを接触させ、続いて残存するＢＬＧ結晶を洗浄液から分離することを伴う。
この洗浄液は、好ましくは、ＢＬＧ結晶の完全な溶解を回避するように選択され、例えば冷脱塩水、冷水道水または逆浸透の冷浸透液を含み得るかまたはこれらから本質的になり得る。
この洗浄液は、ｐＨが５～６の範囲、好ましくは５．０～６．０の範囲、さらにより好ましくは５．１～６．０の範囲、例えば５．１～５．９の範囲であり得る。
この洗浄液は、導電率が最大０．１ｍＳ／ｃｍ、好ましくは最大０．０２ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大０．００５ｍＳ／ｃｍであり得る。
導電率がさらに低い洗浄液を使用し得る。例えば、この洗浄液は、導電率が最大１マイクロＳ／ｃｍであり得る。代わりに、この洗浄液は、導電率が最大０．１マイクロＳ／ｃｍ、例えば約０．０５マイクロＳ／ｃｍであり得る。
結晶化したＢＬＧの溶解を制限するために、洗浄するステップを好ましくは低温で実施する。洗浄液の温度は、好ましくは、最大３０℃、より好ましくは最大２０℃、さらにより好ましくは最大１０℃である。
洗浄するステップを例えば最大５℃、より好ましくは最大２℃、例えば約０℃で実施し得る。例えば、１種または複数の凝固点降下剤の存在に起因して洗浄液が凍結しない限り、０℃よりも低い温度を使用し得る。
本発明のいくつかの実施形態では、洗浄液は、例えば、少なくとも１％（重量／重量）の量、好ましくは少なくとも３％（重量／重量）の量、例えば４％（重量／重量）の量でＢＬＧを含む。
ステップｄ）の洗浄により、概してＢＬＧ結晶の初期量の最大８０％（重量／重量）、好ましくは最大５０％（重量／重量）、さらにより好ましくはＢＬＧ結晶の初期量の最大２０％（重量／重量）が溶解する。好ましくは、ステップｄ）の洗浄により、ＢＬＧ結晶の初期量の最大１５％（重量／重量）、より好ましくは最大１０％（重量／重量）、さらにより好ましくはＢＬＧ結晶の初期量の最大５％（重量／重量）が溶解する。
洗浄液の総量と、分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、少なくとも１であることが多く、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも５である。例えば、洗浄液の量と、分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、少なくとも１０であり得る。代わりに、洗浄液の総量と、分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、少なくとも２０、例えば少なくとも５０または少なくとも１００であり得る。
用語「洗浄液の総量」は、プロセス全体中に使用される洗浄液の総量に関する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、１回または複数回の洗浄シーケンスをＢＬＧ結晶分離と同一のフィルタ配置または類似のフィルタ配置で行う。主にＢＬＧ結晶を含むフィルタケーキに、フィルタを通して除去される洗浄液の１回または複数回のシーケンスを添加し、ＢＬＧ結晶の残存部分は、このフィルタケーキ中に留まる。
本発明の特に好ましい実施形態では、ステップｃ）の分離を、ＢＬＧ結晶を保持するフィルタを使用して実施する。続いて、フィルタケーキを、このフィルタケーキおよびフィルタを通って移動する洗浄液の１回または複数回の量と接触させる。洗浄液の各回の量は、このフィルタケーキの体積の最大１０倍、好ましくはこのフィルタケーキの体積の最大５倍、より好ましくはこのフィルタケーキの体積の最大１倍、さらにより好ましくはこのフィルタケーキの体積の最大０．５倍、例えばこのフィルタケーキの体積の最大０．２倍であることが好ましいことが多い。このフィルタケーキの体積は、このフィルタケーキの固体ならびに流体（液体および気体）の両方を含む。このフィルタケーキを好ましくは少なくとも２回、好ましくは少なくとも４回、さらにより好ましくは少なくとも６回このように洗浄する。
ステップｄ）からの使用済洗浄液を例えば本ホエイタンパク質原材料に再利用し得るか、またはＢＬＧを洗い流したホエイタンパク質を再度単離し得る。
本方法は、
－ 分離されたＢＬＧ結晶を再結晶液に溶解させること、
－ この再結晶液を調整して、ＢＬＧに関して過飽和を得ること、
－ この過飽和の調整された再結晶液中でＢＬＧを結晶化させること、および
－ 残存する調整された再結晶液からＢＬＧ結晶を分離すること
を含む再結晶ステップを含むステップｅ）をさらに伴い得る。
ステップｅ）は、１回の再結晶シーケンスまたは複数回の再結晶シーケンスの何れかを含み得る。
本発明のいくつかの実施形態では、ステップｃ）またはｄ）のＢＬＧ結晶を少なくとも２回再結晶化させる。例えば、このＢＬＧ結晶を少なくとも３回、例えば少なくとも４回再結晶化させ得る。
洗浄ステップおよび再結晶ステップを任意の順序で組み合わせ得、必要に応じて複数回実施し得る。ステップｃ）の分離されたＢＬＧ結晶は、例えば、下記のプロセス順序：
－ 洗浄の１回または複数回のステップ（ステップｄ）、続いて
－ 再結晶の１回または複数回のステップ（ステップｅ）
にかけられ得る。
代わりに、ステップｃ）の分離されたＢＬＧ結晶は、下記のプロス順序：
－ 再結晶の１回または複数回のステップ（ステップｅ）、続いて
－ 洗浄の１回または複数回のステップ（ステップｄ）
にかけられ得る。
例えば、下記の順序で洗浄および再結晶の複数回のステップを組み合わせることも可能である：
－ 洗浄の１回または複数回のステップ（ステップｄ）、
－ 再結晶の１回または複数回のステップ（ステップｅ）、
－ 洗浄の１回または複数回のステップ（ステップｄ）、および
－ 再結晶の１回または複数回のステップ（ステップｅ）。
または、例えば下記の順序：
－ 再結晶の１回または複数回のステップ（ステップｅ）、
－ 洗浄の１回または複数回のステップ（ステップｄ）、
－ 再結晶の１回または複数回のステップ（ステップｅ）、
－ 洗浄の１回または複数回のステップ（ステップｄ）
である。
本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、分離されたＢＬＧを例えばクロマトグラフィーまたは選択ろ過に基づくさらなるＢＬＧ富化ステップにかけることをさらに伴う。しかしながら、本発明の他の好ましい実施形態では、本方法は、ステップｂ）後にさらなるＢＬＧ富化ステップを含まない。用語「さらなるＢＬＧ富化ステップ」は、タンパク質の総量に対してＢＬＧを富化させるプロセスステップを意味し、このステップは、ＢＬＧの結晶化またはＢＬＧ結晶の取扱いに関係しない。そのようなさらなるＢＬＧ富化ステップの例は、イオン交換クロマトグラフィーである。ＢＬＧ結晶の洗浄および／またはＢＬＧの再結晶は、「さらなるＢＬＧ富化ステップ」と見なされない。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、本方法は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物を乾燥組成物に変換させる乾燥ステップｆ）を伴う。
本発明に関連して、用語「乾燥」は、対象の組成物または生成物が最大６％（重量／重量）の水、好ましくはさらに少ない水を含むことを意味する。
本発明に関連して、用語「ＢＬＧ含有組成物」は、ステップｆ）の乾燥にかけられる組成物を説明するために使用される。
本発明に関連して、「ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物」は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）由来のＢＬＧの少なくとも一部を含む組成物を意味する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、「ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物」は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）から直接得られる。しかしながら、本発明の他の好ましい実施形態では、「ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物」は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）から直接得られる組成物のさらなる処理の結果である。
このＢＬＧ含有組成物は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）から直接得られる組成物中に存在するＢＬＧの相当量を含むことが好ましいことが多い。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）から得られるＢＬＧの少なくとも５０％（重量／重量）、好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％を含む。
好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）から得られるＢＬＧの少なくとも８５％（重量／重量）を含む。より好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）から得られるＢＬＧの少なくとも９０％（重量／重量）を含む。さらにより好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）から得られるＢＬＧの少なくとも９５％（重量／重量）を含む。最も好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）から得られるＢＬＧの１００％（重量／重量）を含む。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、乾燥ステップは、噴霧乾燥、凍結乾燥、スピンフラッシュ乾燥機、回転乾燥および／または流動床乾燥の１つまたは複数を伴う。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、乾燥ステップは、ＢＬＧ結晶が溶解しているＢＬＧ含有組成物を伴い、得られた粉末は、ステップｂ）またはこの乾燥ステップ前の再結晶により形成されたＢＬＧ結晶を含まない。この実施形態は、本食用ＢＬＧ組成物が例えば従来の乾燥ホエイタンパク質粉末のそれに類似しているべきである場合に好ましい。
ＢＬＧ結晶は、例えば、
－ 温度を上昇させること、
－ 例えば１種または複数の塩の添加によって導電率を増加させること、
－ ｐＨを例えば５～６の範囲外に変更すること、
－ 例えば希釈によってＢＬＧの濃度を低下させること、または
－ 上記の組合わせ
によって溶解され得る。
噴霧乾燥は、ＢＬＧ結晶を含まないＢＬＧ含有組成物を乾燥させる現在好ましい方法である。
本発明の他の特に好ましい実施形態では、乾燥ステップは、依然としてＢＬＧ結晶を含むＢＬＧ含有組成物を伴い、得られた粉末は、ＢＬＧ結晶を含む。この実施形態は、本食用ＢＬＧ組成物が従来の乾燥ホエイタンパク質粉末と比べて高密度であるべき場合に好ましい。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、乾燥ステップは、依然としてＢＬＧ結晶を含むＢＬＧ含有組成物を伴い、得られた粉末は、ＢＬＧ結晶を含む。この実施形態は、本食用ＢＬＧ組成物が従来の乾燥ホエイタンパク質粉末と比べて高密度であるべき場合に好ましい。
実施例７で実証されているように、本発明者らは、ＢＬＧ結晶のスラリーを噴霧乾燥させ得、乾燥ＢＬＧ結晶を冷脱塩水に再懸濁させる場合に結晶構造の少なくとも一部を保持し得ることを発見した。ＢＬＧ結晶を含むＢＬＧ含有組成物を、噴霧前にＢＬＧ結晶の相当量を溶解する加熱処理レジメに曝すことを回避することが特に有利である。そのため、ＢＬＧ結晶を含むＢＬＧ含有組成物の予備加熱を噴霧前に使用する場合、熱負荷を慎重に制御することが好ましい。
本発明のいくつかの実施形態では、ＢＬＧ結晶を含むＢＬＧ含有組成物は、噴霧装置の出口（例えば、ノズルまたは噴霧器）に達する場合に温度が最大７０℃、好ましくは最大６０℃、より好ましくは最大５０℃である。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ＢＬＧ結晶を含むＢＬＧ含有組成物は、噴霧装置の出口に達する場合に温度が最大４０℃、好ましくは最大３０℃、より好ましくは最大２０℃、さらにより好ましくは最大１０℃、最も好ましくは最大５℃である。
噴霧乾燥の噴霧装置は、乾燥させる溶液または懸濁液を、噴霧乾燥機の乾燥チャンバに入る小滴に変換する装置（例えば、ノズルまたは噴霧器）である。
ＢＬＧ結晶を含むＢＬＧ含有組成物は、噴霧装置の出口に達する場合に温度が０～５０℃の範囲、好ましくは２～４０℃の範囲、より好ましくは４～３５℃の範囲、最も好ましくは噴霧装置の出口に達する場合に５～１０℃の範囲であることが特に好ましい。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ＢＬＧ含有組成物は、噴霧装置の出口に達する場合にＢＬＧの結晶化度が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、例えば好ましくは９７～１００％である。ＢＬＧ含有組成物は、例えば、総タンパク質に対して９０％（重量／重量）超の量でＢＬＧを含むＢＬＧ単離物であり得るか、または他のタンパク質の相当量を含み得、従って総タンパク質に対して最大９０％（重量／重量）の量でＢＬＧを含み得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ＢＬＧ含有組成物は、本明細書で説明したような従来の液体ＷＰＣもしくはＷＰＩまたは従来の液体ＳＰＣもしくはＳＰＩのタンパク質組成を有し得るが、噴霧装置の出口に達する場合にＢＬＧの結晶化度が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、例えば好ましくは９７～１００％であり得る。
噴霧乾燥機のガスの入口温度は、好ましくは、１４０～２２０℃の範囲、より好ましくは１６０～２００℃の範囲、さらにより好ましくは１７０～１９０℃の範囲、例えば好ましくは約１８０℃である。この噴霧乾燥機からのガスの出口温度は、好ましくは、５０～９５℃の範囲、より好ましくは７０～９０℃の範囲、さらにより好ましくは８０～８８℃の範囲、例えば好ましくは約８５℃である。経験則で、噴霧乾燥にかけられる固体は、ガスの出口温度と比べて１０～１５℃低い温度まで加熱されると言われている。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、噴霧乾燥機は、好ましくは、５０～８５℃の範囲、より好ましくは６０～８０℃の範囲、さらにより好ましくは６５～７５℃の範囲、例えば好ましくは約７０℃である。
ＢＬＧ結晶の懸濁液を噴霧乾燥させるという概念は、先行技術で開示されておらず、それ自体が本発明の別の態様である。
従って、本発明のある態様は、ＢＬＧを含む噴霧乾燥した食用粉末組成物を製造する方法であって、前記組成物は、乾燥したＢＬＧ結晶を含み、
－ ＢＬＧ結晶を含み、かつ好ましくは少なくとも２０％のＢＬＧの結晶化度を有する液体ＢＬＧ含有組成物を提供するステップであって、前記液体ＢＬＧ含組成物は、好ましくは、少なくとも１０％（重量／重量）の総固形物を含み、かつ好ましくは少なくとも５％（重量／重量）のＢＬＧを含む、ステップと、
－ この液体ＢＬＧ含有組成物を作動中の噴霧乾燥機の乾燥チャンバ中に噴霧して、ＢＬＧ結晶を含む液体ＢＬＧ含有組成物を粉末に変換するステップと
を含む方法に関する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、乾燥させるＢＬＧ含有組成物を乾燥ＢＬＧ単離物と混合し、この混合物が流動床乾燥により乾燥され得るレベルまで固形分を上昇させる。これは、逆混合とも称され、ＢＬＧ製品の費用効率が非常に高い乾燥を可能にする。この実施形態は、ＢＬＧ結晶を含むＢＬＧ含有組成物に特に好ましい。
本方法の利点は、乾燥させるＢＬＧ含有組成物が乾燥ステップ前に非常に高い固形分を有し得、従って除去すべき水が少なく、乾燥作業で消費されるエネルギーが少ないことである。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、少なくとも２０％（重量／重量）の固形分を有する。好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、少なくとも３０％（重量／重量）の固形分を有する。より好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、少なくとも４０％（重量／重量）の固形分を有する。さらにより好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、少なくても５０％（重量／重量）、例えば少なくとも６０％（重量／重量）の固形分を有する。
本発明の他の好ましい実施形態では、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、２０～８０％（重量／重量）の範囲の固形分を有する。好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、３０～７０％（重量／重量）の範囲の固形分を有する。より好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、４０～６５％（重量／重量）の範囲の固形分を有する。さらにより好ましくは、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物は、５０～６５％（重量／重量）の範囲、例えば約６０％（重量／重量）の固形分を有する。
本発明者らは、本ＢＬＧ含有組成物の結晶化度が高いほど、このＢＬＧ含有組成物に結合した水が少なく、このＢＬＧ含有組成物のより高い総固形分が乾燥ステップ前に達成され得ることを発見した。
そのため、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ＢＬＧ含有組成物は、少なくとも１０％（重量／重量）のＢＬＧの結晶化度を有する。好ましくは、本ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも２０％（重量／重量）である。より好ましくは、本ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも３０％（重量／重量）である。さらにより好ましくは、本ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも４０％（重量／重量）である。
さらに高い結晶化度が好ましい場合が多い。そのため、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも５０％（重量／重量）である。好ましくは、本ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも６０％（重量／重量）である。より好ましくは、食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも７０％（重量／重量）である。さらにより好ましくは、本ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも８０％（重量／重量）である。最も好ましくは、本ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも９０％（重量／重量）、好ましくは少なくとも９５％（重量／重量）、より好ましくは少なくとも９７％（重量／重量）、さらにより好ましくは少なくとも９９％（重量／重量）である。
本発明者らは、含水量の減少により組成物のＢＬＧの結晶化度が増加する傾向があることを発見した。そのため、水：ＢＬＧ比が高い組成物（例えば、水中に４％ＢＬＧ結晶の懸濁液）は、同一条件での水：ＢＬＧ比がより低い組成物（例えば、フィルタケーキまたは湿った単離結晶）と比べてＢＬＧの結晶化度が低い傾向がある。
本発明の方法を、ＢＬＧの栄養価も本ホエイタンパク質溶液の他のホエイタンパク質の栄養価も損なわない穏やかな温度を使用して実施し得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ＢＬＧは、本方法中に９０℃超の温度に曝されない。好ましくは、ＢＬＧは、本方法中に８０℃を超える温度に曝されない。さらにより好ましくは、ＢＬＧは、本方法中に７５℃を超える温度に曝されない。たとえ噴霧乾燥が１５０℃を超える温度を用いることが多くても、短い曝露時間および同時に起こる水の蒸発は、噴霧乾燥したタンパク質が５０～７０℃を超える温度を経験しないことを意味することに留意すべきである。
本発明者らは、乾燥ステップ中の長時間の加熱により、結晶形態であるＢＬＧの量が減少するという徴候を発見した。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、乾燥ステップ中の熱曝露は、ＢＬＧの変性の度合いが最大１０％となるように十分に低く保たれ、好ましくは最大４％、より好ましくは最大１％、さらにより好ましくは最大０．４％、さらにより好ましくは最大０．１％となるように十分に低く保たれる。最も好ましくは、乾燥ステップによるＢＬＧの検出可能な変性は全くない。
乾燥ステップにより引き起こされる変性の度合いを、乾燥させるＢＬＧ組成物中の（総固形物に対する）ＢＬＧ含有量（ステップｆ中のｃステップｆ前）および再溶解させて乾燥させた組成物中の（総固形物に対する）ＢＬＧ含有量を決定し、式：
変性の度合い＝（（ｃステップｆ前－ｃステップｆ後）／ｃステップｆ前）＊１００％
を使用することにより算出する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態は、結晶化形態でベータ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）を含む食用組成物を調製する方法であって、
ａ）ＢＬＧおよび少なくとも１種の追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供するステップであって、前記ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、かつ５～６の範囲のｐＨを有し、前記ホエイタンパク質溶液は、
－ 総固形物に対して７０～１００％（重量／重量）のタンパク質、
－ 総タンパク質に対して３０～９０％（重量／重量）のＢＬＧ、好ましくは３０～７０％（重量／重量）のＢＬＧ、
－ 総タンパク質に対して４～５０％（重量／重量）のＡＬＡ、好ましくは８～３５％（重量／重量）のＡＬＡ、
－ タンパク質に対して０～２５％（重量／重量）のＣＭＰ、
－ このホエイタンパク質溶液の総重量に対して少なくとも１０％（重量／重量）のタンパク質
を含む、ステップと、
ｂ）好ましくは結晶化種の添加により、この過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化させるステップと、
ｆ）ステップｂ）から直接得られたＢＬＧ含有組成物を乾燥させるステップであって、前記ＢＬＧ含有組成物は、好ましくは、少なくとも３０％のＢＬＧの結晶化度を有する、ステップと
を含み、ステップｃ）、ｄ）またはｅ）を含まない方法に関する。
このホエイタンパク質溶液は、好ましくは、脱塩ホエイタンパク質溶液であり、好ましくは導電率とタンパク質の総量との間の比が最大０．３であり、および／またはＵＦ透過液の導電率が最大７ｍＳ／ｃｍである。
この実施形態では、このホエイタンパク質溶液から分離されていないＢＬＧ結晶は、乾燥され、高密度の食用ＢＬＧ組成物を粉末形態でもたらす。
本発明は、この実施形態によって得ることができる食用組成物にさらに関する。
本発明の他の好ましい実施形態は、結晶化形態でベータ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）を含む食用組成物を調製する方法であって、
ａ）ＢＬＧおよび少なくとも１種の追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供するステップであって、前記ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、かつ５～６の範囲のｐＨを有し、前記ホエイタンパク質溶液は、
－ 総固形物に対して７０～１００％（重量／重量）のタンパク質、
－ 総タンパク質に対して３０～９０％（重量／重量）のＢＬＧ、好ましくは３０～７０％のＢＬＧ、
－ 総タンパク質に対して４～５０％（重量／重量）のＡＬＡ、好ましくは８～３５％のＡＬＡ、
－ 総タンパク質に対して０～２５％（重量／重量）のＣＭＰ、
－ このホエイタンパク質溶液の総重量に対して少なくとも１０％（重量／重量）のタンパク質
を含む、ステップと、
ｂ）好ましくは結晶化種の添加により、この過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化させるステップと、
ｃ）残存するホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離するステップと、
ｄ）任意選択で、ステップｃ）から得られた分離されたＢＬＧ結晶を洗浄するステップと、
ｅ）任意選択で、ステップｃ）またはｄ）から得られたＢＬＧ結晶を再結晶化させるステップと、
ｆ）ステップｃ）、ｄ）またはｅ）に由来し、好ましくはステップｃ）、ｄ）またはｅ）から直接得られたＢＬＧ含有組成物を乾燥させるステップであって、ＢＬＧ含有組成物は、ＢＬＧ結晶を含み、かつ好ましくは少なくとも３０％のＢＬＧの結晶化度を有する、ステップと
を含む方法に関する。
このホエイタンパク質溶液は、好ましくは、脱塩ホエイタンパク質溶液であり、好ましくは導電率とタンパク質総量との間の比が最大０．３であり、および／またはＵＦ透過液の導電率が最大７ｍＳ／ｃｍである。
この実施形態は、高密度粉末の形態での低ミネラルおよび低リンの食用ＢＬＧ組成物の製造に特に有用である。
本発明は、この実施形態によって得ることができる食用組成物にさらに関する。
本発明のさらに他の好ましい実施形態は、単離形態でベータ－ラクトグロブリンを含む食用組成物を調製する方法であって、
ａ）ＢＬＧおよび少なくとも１種の追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供するステップであって、前記ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、かつ５～６の範囲のｐＨを有し、前記ホエイタンパク質溶液は、
－ 総固形物に対して７０～１００％（重量／重量）のタンパク質、
－ 総タンパク質に対して３０～９０％（重量／重量）のＢＬＧ、好ましくは３０～７０％（重量／重量）のＢＬＧ、
－ 総タンパク質に対して５～５０％（重量／重量）のＡＬＡ、好ましくは８～３５％（重量／重量）のＡＬＡ、
－ 総タンパク質に対して０～２５％（重量／重量）のＣＭＰ、
－ このホエイタンパク質溶液の総重量に対して少なくとも１０％（重量／重量）のタンパク質
を含む、ステップと、
ｂ）好ましくは結晶化種の添加により、この過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化させるステップと、
ｃ）残存するホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離するステップと、
ｄ）任意選択で、ステップｃ）から得られた分離されたＢＬＧ結晶を洗浄するステップと、
ｅ）任意選択で、ステップｃ）またはｄ）から得られたＢＬＧ結晶を再結晶化させるステップと、
ｆ）ステップｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物を乾燥させるステップであって、ＢＬＧ含有組成物は、ＢＬＧ結晶を含まない、ステップと
を含む方法に関する。
このホエイタンパク質溶液は、好ましくは、脱塩ホエイタンパク質溶液であり、好ましくは導電率とタンパク質の総量との間の比が最大０．３であり、および／またはＵＦ透過液の導電率が最大７ｍＳ／ｃｍである。
この実施形態では、ＢＬＧ結晶は、乾燥させる前に溶解している。
本発明は、この実施形態によって得ることができる食用組成物にさらに関する。
いくつかの好ましい実施形態では、本方法をバッチプロセスとして実行する。代わりにおよびときに好ましくは、この方法をセミバッチプロセスとして実行し得る。他の好ましい実施形態では、この方法を連続プロセスとして実行する。
本方法の利点は、この方法が先行技術のＢＬＧ結晶化のための同等の方法と比べてはるかに早いことである。ホエイタンパク質原材料の最初の調整からステップｃの分離の完了までの持続期間は、最大１０時間、好ましくは最大４時間、より好ましくは最大２時間、さらにより好ましくは最大１時間であり得る。
本発明のさらなる態様は、本明細書で説明した方法から得ることができる単離ＢＬＧ結晶に関する。
本発明に関連して、用語「単離ＢＬＧ結晶」は、ＢＬＧ結晶において、このＢＬＧ結晶が形成された溶液から分離されているが、依然として内部水を含み得るＢＬＧ結晶（即ち結晶の水和ＢＬＧ分子）に関する。
この単離ＢＬＧ結晶は、好ましくは、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１を有する。
好ましくは、この単離ＢＬＧ結晶は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１ならびに単位格子の寸法ａ＝６８．６８（±５％）Å、ｂ＝６８．６８（±５％）Åおよびｃ＝１５６．６５（±５％）Åを有し、かつ単位格子の整数角α＝９０°（±２％）、β＝９０°（±２％）およびγ＝９０°（±２％）を有する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、この単離ＢＬＧ結晶は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１ならびに単位格子の寸法ａ＝６８．６８（±２％）Å、ｂ＝６８．６８（±２％）Åおよびｃ＝１５６．６５（±２％）Åを有し、かつ単位格子の整数角α＝９０°（±１％）、β＝９０°（±１％）およびγ＝９０°（±１％）を有する。
さらにより好ましくは、この単離ＢＬＧ結晶は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１ならびに単位格子の寸法ａ＝６８．６８（±１％）Å、ｂ＝６８．６８（±１％）Åおよびｃ＝１５６．６５（±１％）Åを有し得、かつ単位格子の整数角α＝９０°（±０．５％）、β＝９０°（±０．５％）およびγ＝９０°（±０．５％）を有し得る。
最も好ましくは、この単離ＢＬＧ結晶は、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１ならびに単位格子の寸法ａ＝６８．６８Å、ｂ＝６８．６８Åおよびｃ＝１５６．６５Åを有し、かつ単位格子の整数角α＝９０°、β＝９０°およびγ＝９０°を有する。
この単離ＢＬＧ結晶は、例えば、少なくとも２０％（重量／重量）のＢＬＧおよび最大８０％（重量／重量）の水を含み得る。好ましくは、この単離ＢＬＧ結晶は、少なくとも４０％（重量／重量）のＢＬＧおよび０～６０％（重量／重量）の範囲の水を含み得る。さらにより好ましくは、この単離ＢＬＧ結晶は、４０～６０％（重量／重量）の範囲のＢＬＧおよび約４０～約６０％（重量／重量）の範囲の水を含む。
本発明者らは、本発明のＢＬＧ結晶が、驚くべきことに、乾燥させて再水和させた後にこのＢＬＧ結晶の元々の結晶構造を回復する能力を有することを発見した。これは、ＢＬＧの結晶構造から利益を得る用途で特に有利である。
本発明のさらなる態様は、ベータ－ラクトグロブリンを含む食用組成物（例えば、本明細書で定義した方法によって得ることができる食用組成物）に関する。
本発明の別の態様は、総固形物に対して少なくとも９０％（重量／重量）のＢＬＧを含む食用ＢＬＧ組成物に関する。そのような食用ＢＬＧ組成物は、本明細書で定義された方法によって得ることができ得る。
本発明のさらなる態様は、乾燥したＢＬＧ結晶を含み（総固形物に対して少なくとも２０％（重量／重量）のＢＬＧ）、かつ好ましくは少なくとも２０％のＢＬＧに関する結晶化度を有する食用ＢＬＧ組成物に関する。乾燥したＢＬＧ結晶を含むそのような食用ＢＬＧ組成物は、本明細書で定義された方法によって得ることができ得る。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大１である。好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大０．６である。より好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大０．４である。さらにより好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大０．２である。最も好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、ラクトシル化度が最大０．１、例えば好ましくは最大０．０１である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、少なくとも９０％（重量／重量）の非ラクトシル化ＢＬＧ、好ましくは少なくとも９５％（重量／重量）の非ラクトシル化ＢＬＧ、さらにより好ましくは少なくとも９８％（重量／重量）の非ラクトシル化ＢＬＧを含む。
非ラクトシル化ＢＬＧの百分率は、実施例９．１に従って決定される。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも１０％（重量／重量）である。好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも２０％（重量／重量）である。さらに好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも３０％（重量／重量）である。さらにより好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも４０％（重量／重量）である。
さらに高い結晶化度が好ましい場合が多い。そのため、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも５０％（重量／重量）である。好ましくは、この食用ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも６０％（重量／重量）である。より好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも７０％（重量／重量）である。さらにより好ましくは、この食用ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも８０％（重量／重量）である。最も好ましくは、この食用ＢＬＧ含有組成物のＢＬＧは、結晶化度が少なくとも９０％（重量／重量）、好ましくは少なくとも９５％（重量／重量）である。
ｐＨが５～６の範囲である液体中におけるＢＬＧの結晶化度は、実施例９．７に従って測定される。粉末状物質中におけるＢＬＧの結晶化度は、実施例９．８に従って測定される。本食用組成物が乾燥製品であるが、粉末の形態ではない場合、この食用組成物は、実施例９．８の方法にかける前に例えば粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）または粉砕（ｍｉｌｌｉｎｇ）により、粉末に変換しなければならない。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、ＷＰＣ、ＷＰＩ、ＳＰＣまたはＳＰＩであり、ここで、ＢＬＧの少なくとも一部は、結晶形態である。この食用ＢＬＧ組成物は、例えば、タンパク質の総量に対して最大９０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得、かつ少なくとも１０％のＢＬＧの結晶化度を有する。例えば、この食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して最大８０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得、かつ少なくとも１０％のＢＬＧの結晶化度を有し得る。この食用ＢＬＧ組成物は、例えば、タンパク質の総量に対して３０～７０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得、かつ少なくとも１０％のＢＬＧの結晶化度を有し得る。
本発明の他の好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して最大９０％（重量／重量）のＢＬＧを含み、かつ少なくとも３０％のＢＬＧの結晶化度を有する。好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して最大８０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得、かつ少なくとも３０％のＢＬＧの結晶化度を有し得る。さらにより好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して３０～７０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得、かつ少なくとも３０％のＢＬＧの結晶化度を有し得る。
本発明者らは、本発明により、リンおよび他のミネラルの含有量が非常に低い食用ホエイタンパク質製品を調製することが可能となり、この食用ホエイタンパク質製品が、腎疾患に罹患しているかまたは別の方法で腎機能が低下している患者に有利であることを発見した。
本食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、低リン組成物である。
本発明に関連して、用語「低リン」は、リンの総含有量がタンパク質１００ｇ当たりリン最大１００ｍｇである組成物（例えば、液体、粉末または別の食品）に関する。好ましくは、低リン組成物は、総含有量がタンパク質１００ｇ当たりリン最大８０ｍｇである。より好ましくは、低リン組成物は、総含有量がタンパク質１００ｇ当たりリン最大５０ｍｇであり得る。さらにより好ましくは、低リン組成物は、リンの総含有量がタンパク質１００ｇ当たりリン最大２０ｍｇであり得る。さらにより好ましくは、低リン組成物は、リンの総含有量がタンパク質１００ｇ当たりリン最大５ｍｇであり得る。本発明に係る低リン組成物は、腎機能が低下している患者群のための食品を製造するための食品成分として使用され得る。
そのため、本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質１００ｇ当たりリン最大８０ｍｇを含む。好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質１００ｇ当たりリン最大３０ｍｇを含む。より好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質１００ｇ当たりリン最大２０ｍｇを含む。さらにより好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質１００ｇ当たりリン最大１０ｍｇを含む。最も好ましくは、この食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質１００ｇ当たりリン最大５ｍｇを含む。
リンの含有量は、対象の組成物の元素リンの総量に関連し、実施例９．５に従って決定される。
本発明の他の好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、低ミネラル組成物である。
本発明に関連して、「低ミネラル」は、下記：
－ 総固形物に対して最大１．２％（重量／重量）の灰含有量、
－ 総固形物に対して最大０．３％（重量／重量）のカルシウムおよびマグネシウムの総含有量、
－ 総固形物に対して最大０．１０％（重量／重量）のナトリウムおよびカリウムの総含有量、
－ タンパク質１００ｇ当たりリン最大１００ｍｇのリンの総含有量
の少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらにより好ましくは全てを有する組成物（例えば、液体、粉末または別の食品）に関する。
好ましくは、低ミネラル組成物は、下記：
－ 総固形物に対して最大０．７％（重量／重量）の灰含有量、
－ 総固形物に対して最大０．２％（重量／重量）のカルシウムおよびマグネシウムの総含有量、
－ 総固形物に対して最大０．０８％（重量／重量）のナトリウムおよびカリウムの総含有量、
－ タンパク質１００ｇ当たりリン最大８０ｍｇのリンの総含有量
の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、さらにより好ましくは全てを有する。
さらにより好ましくは、低ミネラル組成物は、下記：
－ 総固形物に対して最大０．５％（重量／重量）の灰含有量、
－ 総固形物に対して最大０．１５％（重量／重量）のカルシウムおよびマグネシウムの総含有量、
－ 総固形物に対して最大０．０６％（重量／重量）のナトリウムおよびカリウムの総含有量、
－ タンパク質１００ｇ当たりリン最大５０ｍｇのリンの総含有量
の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、さらにより好ましくは全てを有する。
低ミネラル組成物が下記：
－ 総固形物に対して最大０．５％（重量／重量）の灰含有量、
－ 総固形物に対して最大０．１５％（重量／重量）のカルシウムおよびマグネシウムの総含有量、
－ 総固形物に対して最大０．０６％（重量／重量）のナトリウムおよびカリウムの総含有量、
－ タンパク質１００ｇ当たりリン最大５０ｍｇのリンの総含有量
を有することが特に好ましい。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、この食用ＢＬＧ組成物の総固形物に対して少なくとも２５％（重量／重量）のタンパク質の総量を含む。好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、この食用ＢＬＧ組成物の総固形物に対して少なくとも５０％（重量／重量）のタンパク質の総量を含む。より好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、この食用ＢＬＧ組成物の総固形物に対して少なくとも７５％（重量／重量）のタンパク質の総量を含む。さらにより好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、この食用ＢＬＧ組成物の総固形物に対して少なくとも９０％（重量／重量）のタンパク質の総量を含む。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物のタンパク質の総量は、総固形物に対して２５～１００％（重量／重量）の範囲である。好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物のタンパク質の総量は、５０～１００％（重量／重量）の範囲である。より好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物のタンパク質の総量は、総固形物に対して７５～１００％（重量／重量）の範囲である。さらにより好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物のタンパク質の総量は、総固形物に対して９０～１００％（重量／重量）の範囲である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して少なくとも７５％（重量／重量）のＢＬＧを含む。好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して少なくとも９０％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。より好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して少なくとも９５％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。さらにより好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して少なくとも９７％（重量／重量）のＢＬＧを含み得る。最も好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質の総量に対して約１００％（重量／重量）のＢＬＧを含む。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、最大１０％（重量／重量）の炭水化物、好ましくは最大５％（重量／重量）の炭水化物、より好ましくは最大１％（重量／重量）の炭水化物、さらにより好ましくは最大０．１％（重量／重量）の炭水化物を含む。
本食用ＢＬＧ組成物は、脂質（例えば、トリグリセリドおよび／または他の脂質型（例えば、リン脂質）の形態）も含み得る。
本発明のいくつかの実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、総固形物に対して最大１％（重量／重量）の脂質の総量を含む。好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、総固形物に対して最大０．５％（重量／重量）の脂質の総量を含む。より好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、総固形物に対して最大０．１％（重量／重量）の脂質の総量を含む。さらにより好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、総固形物に対して最大０．０５％（重量／重量）の脂質の総量を含む。最も好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、総固形物に対して最大０．０１％（重量／重量）の脂質の総量を含む。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、乾燥組成物、例えば粉末である。本食用ＢＬＧ組成物は、噴霧乾燥された粉末であることが特に好ましい。
本発明者らは、乾燥時にＢＬＧの少なくとも一部が結晶形態である粉末形態の食用ＢＬＧ組成物が、ＢＬＧ結晶を含まない同等のＢＬＧ組成物と比べて高密度であることを観察した（実施例７を参照されたい）。非常に驚くべきことに、噴霧乾燥されたＢＬＧ結晶スラリーから得られた粉末形態の食用ＢＬＧ組成物の場合にもこの高密度効果が観察される。
そのため、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．４０ｇ／ｍＬである。好ましくは、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．４５ｇ／ｍＬである。より好ましくは、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．５０ｇ／ｍＬである。粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は嵩密度が少なくとも０．６ｇ／ｍＬであることがさらにより好ましい。粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が少なくとも０．７ｇ／ｍＬであり得る。
嵩密度の利点は、ＢＬＧが、存在するほぼ唯一のタンパク質である食用ＢＬＧ組成物の粉末と、ホエイタンパク質溶液中に存在した他のタンパク質と比較してＢＬＧの濃度が富化されていない食用ＢＬＧ組成物の粉末との両方に当てはまることである。従って、本発明は、単離ＢＬＧと、ＢＬＧに加えて相当量のＡＬＡおよび他のホエイタンパク質を含む粗ホエイタンパク質との両方の高密度粉末を提供する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．４５ｇ／ｍＬであり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。より好ましくは、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．５０ｇ／ｍＬであり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．６ｇ／ｍＬであり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含むことがさらにより好ましい。粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が少なくとも０．７ｇ／ｍＬであり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。
本発明の他の好ましい実施形態では、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．４５ｇ／ｍＬであり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。より好ましくは、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．５０ｇ／ｍＬであり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が少なくとも０．６ｇ／ｍＬであり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含むことがさらにより好ましい。粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が少なくとも０．７ｇ／ｍＬであり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。
粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が０．４０～１．５ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．４５～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。より好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５０～０．９ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．６～０．９ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含むことがさらにより好ましい。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が０．６～０．８ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。
本発明者らは、本発明の高密度粉末が、粉末１ｋｇ当たりに必要とされる包装材料がより少なく、かつ所与の容器またはトラックにより、より多くの粉末（質量）を輸送し得ることから、この粉末の費用効率がより高い包装および物流を有利に可能にすることを発見した。
粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が０．４０～１．５ｇ／ｍＬの範囲であり得る。好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．４５～１．０ｇ／ｍＬの範囲である。より好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５０～０．９ｇ／ｍＬの範囲であり得る。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は嵩密度が０．６～０．９ｇ／ｍＬの範囲であることがさらにより好ましい。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が０．６～０．８ｇ／ｍＬの範囲であり得る。
本発明の他の好ましい実施形態では、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５０～１．５ｇ／ｍＬの範囲である。好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５５～１．０ｇ／ｍＬの範囲である。より好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．６０～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり得る。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は嵩密度が０．６５～１．０ｇ／ｍＬの範囲であることがさらにより好ましい。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、嵩密度が０．７０～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり得る。
粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が０．４０～１．５ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．４５～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。より好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５０～０．９ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．６～０．９ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含むことがさらにより好ましい。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が０．６～０．８ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。
粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が０．４０～１．５ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．４５～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。より好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５０～０．９ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．６～０．９ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含むことがさらにより好ましい。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、嵩密度が０．６～０．８ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。
本発明の他の好ましい実施形態では、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５０～１．５ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５５～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。より好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．６０～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．６５～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含むことがさらにより好ましい。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、嵩密度が０．７０～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも７０％（重量／重量）のタンパク質を含む。
本発明の他の好ましい実施形態では、粉末形態の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５０～１．５ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．５５～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。より好ましくは、粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．６０～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、嵩密度が０．６５～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含むことがさらにより好ましい。粉末状の本食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、嵩密度が０．７０～１．０ｇ／ｍＬの範囲であり得、かつこの組成物の総重量に対して少なくとも８０％（重量／重量）のタンパク質を含む。
粉末の嵩密度は、実施例９．３に従って測定される。
本発明者らは、本発明に係るＢＬＧ組成物が類似のＢＬＧ組成物と比べて良好な長期安定性を有するという徴候を発見した。これは、ＢＬＧの少なくとも一部がＢＬＧ結晶の形態で存在する場合に特に当てはまり、ＢＬＧ分子のより良好な貯蔵安定性を提供すると思われる。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本乾燥ＢＬＧ組成物は、フロシン値が３０℃で６０日後に最大８０ｍｇ／タンパク質１００ｇ、好ましくは最大６０ｍｇ／タンパク質１００ｇ、より好ましくは最大４０ｍｇ／タンパク質１００ｇ、さらにより好ましくは最大２０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。最も好ましくは、本乾燥ＢＬＧ組成物は、フロシン値が３０℃で６０日後に最大１０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本乾燥ＢＬＧ組成物は、フロシン値が最大８０ｍｇ／タンパク質１００ｇ、好ましくは最大６０ｍｇ／タンパク質１００ｇ、より好ましくは最大４０ｍｇ／タンパク質１００ｇ、さらにより好ましくは最大２０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。最も好ましくは、本乾燥ＢＬＧ組成物は、フロシン値が最大１０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。好ましくは、本ＢＬＧ組成物は、フロシン値が０ｍｇ／タンパク質１００ｇである。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本乾燥ＢＬＧ組成物のＢＬＧは、ラクトシル化度が３０℃で６０日後に最大１、好ましくは最大０．６、より好ましくは０．２、さらにより好ましくは最大０．１、最も好ましくは最大０．０１である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、液体組成物である。液体の食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、少なくとも２０％（重量／重量）の水、より好ましくは少なくとも３０％（重量／重量）の水、さらにより好ましくは少なくとも４０％（重量／重量）を含む。
液体の本食用ＢＬＧ組成物は、例えば、２０～９０％（重量／重量）の範囲の水を含み得、より好ましくは３０～８０％（重量／重量）の範囲の水を含み得、さらにより好ましくは少なくとも４０％（重量／重量）を含み得る。
本発明者らは、たとえ食用ＢＬＧ粉末組成物の調製に噴霧乾燥を使用しても、本発明に係る食用ＢＬＧ組成物が、驚くべきことに、タンパク質変性の度合いが低いことを発見した（実施例１１を参照されたい）。
そのため、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが最大２％である。好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが最大１．５％である。より好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが最大１．０％である。さらにより好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが最大０．８％である。さらにより好ましくは、本食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが最大０．５％である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、乾燥粉末、好ましくは噴霧乾燥粉末であり、かつタンパク質変性の度合いが最大２％、好ましくは最大１．５％である。より好ましくは、例えば噴霧乾燥粉末の形態の本乾燥食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが最大１．０％である。さらにより好ましくは、例えば、噴霧乾燥粉末の形態の本乾燥食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが最大０．８％である。さらにより好ましくは、例えば、噴霧乾燥粉末の形態の本乾燥食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが最大０．５％である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、
－ 最大６％（重量／重量）の水、
－ 総固形物に対して少なくとも８０％の総タンパク質、
－ 総タンパク質に対して少なくとも９５％のＢＬＧ
を含み、前記食用ＢＬＧ組成物は、
－ 乾燥粉末であり、かつ
－ 嵩密度が少なくとも０．５０ｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも０．６０ｇ／ｍである。
本発明の他の好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、
－ 最大６％（重量／重量）の水、
－ 総固形物に対して少なくとも８０％の総タンパク質、
－ 総タンパク質に対して少なくとも９５％のＢＬＧ
を含み、前記食用ＢＬＧ組成物は、
－ 乾燥粉末であり、
－ 嵩密度が少なくとも０．５０ｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも０．６０ｇ／ｍＬであり、かつ
－ ＢＬＧの結晶化度が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％である。
本発明のさらに好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、
－ 最大６％（重量／重量）の水、
－ 総固形物に対して少なくとも８０％の総タンパク質、
－ 総タンパク質に対して少なくとも９５％のＢＬＧ、
を含み、前記食用ＢＬＧ組成物は、
－ 乾燥粉末であり、
－ 嵩密度が少なくとも０．５０ｇ／ｍＬ、好ましくは０．６０ｇ／ｍＬであり、かつ
－ タンパク質変性の度合いが最大２％、好ましくは最大１．０％である。
本発明のさらに好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、
－ 最大６％（重量／重量）の水、
－ 総固形物に対して少なくとも８０％の総タンパク質、
－ 総タンパク質に対して少なくとも９５％のＢＬＧ、
－ タンパク質１００ｇ当たりリン最大８０ｍｇ
を含み、前記食用ＢＬＧ組成物は、
－ 乾燥粉末である。
本発明のさらに好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、
－ 最大６％（重量／重量）の水、
－ 総固形物に対して少なくとも９０％の総タンパク質、
－ 総タンパク質に対して少なくとも９７％のＢＬＧ、
－ タンパク質１００ｇ当たりリン最大５０ｍｇ
を含み、前記食用ＢＬＧ組成物は、
－ 乾燥粉末である。
本発明の他の好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、
－ 最大６％（重量／重量）の水、
－ 総固形物に対して少なくとも８０％の総タンパク質、好ましくは総固形物に対して少なくとも９０％の総タンパク質、
－ 総タンパク質に対して３０～７０％のＢＬＧ、
－ 総タンパク質に対して８～２５％（重量／重量）のＡＬＡ
を含み、前記食用ＢＬＧ組成物は、
－ 乾燥粉末であり、かつ
－ ＢＬＧの結晶化度が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、
－ ２０～８０％（重量／重量）の水、好ましくは２０～６０％（重量／重量）の水、
－ 総固形物に対して少なくとも８０％の総タンパク質、好ましくは少なくとも９０％の総タンパク質、
－ 総タンパク質に対して少なくとも９５％のＢＬＧ、
－ タンパク質１００ｇ当たりリン最大８０ｍｇ
を含み、前記食用ＢＬＧ組成物は、
－ ＢＬＧの結晶化度が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０であり、かつ
－ 任意選択で、タンパク質変性の度合いが最大２％、好ましくは最大１．０％である。
これらの実施形態に係る食用組成物は、乾燥形態の食用ＢＬＧ組成物の調製に特に有用であり、高密度ホエイタンパク質粉末において、ホエイタンパク質種の通常の濃度プロファイルを有するが、乾燥したＢＬＧ結晶の形態でＢＬＧの少なくとも一部を含む高密度ホエイタンパク質粉末の噴霧乾燥および調製に特に適している。
本発明の他の好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、
－ ２０～８０％（重量／重量）の水、好ましくは２０～６０％（重量／重量）の水、
－ 総固形物に対して少なくとも８０％の総タンパク質、好ましくは総固形物に対して少なくとも９０％の総タンパク質、
－ 総タンパク質に対して３０～７０％のＢＬＧ、
－ 総タンパク質に対して８～２５％（重量／重量）のＡＬＡ
を含み、前記食用ＢＬＧ組成物は、
－ ＢＬＧの結晶化度が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％である。
この実施形態に係る食用組成物は、乾燥形態の食用ＢＬＧ組成物の調製に特に有用であり、高密度ホエイタンパク質において、ホエイタンパク質種の通常の濃度プロファイルを有するが、乾燥したＢＬＧ結晶の形態でＢＬＧの少なくとも一部を含む高密度ホエイタンパク質の噴霧乾燥および調製に特に適している。
さらに、本発明のある態様は、食品成分としての、本明細書で定義された食用ＢＬＧ組成物の使用に関する。
例えば、本明細書で定義された低リンの食用ＢＬＧ組成物を低リン食品の製造において食品成分として使用することが好ましい場合がある。
本発明のさらなる態様は、本明細書で定義された食用ＢＬＧ組成物と、例えば脂肪および／または炭水化物の供給源等の少なくとも追加の成分とを含む食品に関する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、この食品は、炭水化物およびタンパク質を含む乾燥食品（例えば、バー）であり、前記乾燥食品は、少なくとも１％（重量／重量）のＢＬＧ、好ましくは少なくとも５％を含み、
ｉ）ＢＬＧの結晶化度は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％であり、および／または
ｉｉ）タンパク質の総量の少なくとも９０％（重量／重量）がＢＬＧで構成されている。
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態では、この食品は、低リン食品において、タンパク質１００ｇ当たりリン最大１００ｍｇ、好ましくはタンパク質１００ｇ当たりリン最大８０ｍｇ、より好ましくはタンパク質１００ｇ当たりリン最大４０ｍｇ、さらにより好ましくはタンパク質１００ｇ当たりリン最大２０ｍｇを含む低リン食品である。
ＢＬＧは、有利なアミノ酸プロファイルを有し、好ましくはこの食品のタンパク質の相当な部分を占める。これは、この食品が低ミネラル食品または低リン食品である場合に特に興味深い。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本食用ＢＬＧ組成物は、この食品のタンパク質の総量の少なくとも２５％（重量／重量）を占めるか、または少なくとも５０％（重量／重量）、より好ましくは少なくとも８０％（重量／重量）、さらにより好ましくは少なくとも９０％（重量／重量）を占める。さらに、本食用ＢＬＧ組成物がこの食品の全タンパク質を占めることが最も好ましい場合がある。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本低リンの食用ＢＬＧ組成物は、低リン食品のタンパク質の総量の少なくとも２５％（重量／重量）を占めるか、または少なくとも５０％（重量／重量）、より好ましくは少なくとも８０％（重量／重量）、さらにより好ましくは少なくとも９０％（重量／重量）を占める。さらに、この低リンの食用ＢＬＧ組成物が低リン食品の全タンパク質を占めることが最も好ましい場合がある。
この食品の非限定的な例は、例えば、乳製品、キャンディ、飲料、プロテインバー、経腸栄養組成物、ベーカリー製品である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、この食品は、飲料である。この飲料は、好ましくは、
－ ＢＬＧの総量を少なくとも１％（重量／重量）、好ましくは少なくとも５％（重量／重量）、より好ましくは少なくとも８％（重量／重量）、さらにより好ましくは１２％（重量／重量）にするための、本明細書で定義された食用ＢＬＧ組成物、
－ 甘味料、例えば糖甘味料および／またはノンシュガー甘味料、
－ 少なくとも１種の食用酸、例えばクエン酸または他の適切な食用酸、
－ 任意選択の香味料、および
－ タンパク質１００ｇ当たりリン最大８０ｍｇ
を含み、かつ２．５～４．０の範囲のｐＨを有する。
本発明者らは、ＢＬＧ結晶を含む乾燥食用ＢＬＧ組成物からの、酸性で高タンパク質低ミネラルの飲料または液体の調製が容易でないことを認識した。ＢＬＧ結晶を含む乾燥食用ＢＬＧ組成物は、概して、水に懸濁された場合にｐＨが５～６となり、ｐＨを変化させるかまたは導電率を増加させるための酸または塩の付加により、得られる液体／飲料のミネラル負荷も増加する。
しかしながら、本発明者らは、ｐＨを低下させるためにカルボン酸、ラクトン、カルボン酸無水物またはこれらの組合わせを使用する場合、不必要なミネラルが添加されず、飲料／液体のミネラル組成のより良好な制御が得られることを発見した。
そのため、本発明のある態様は、成分として、ＢＬＧ結晶を含む食用ＢＬＧ組成物を使用する、酸性化された低ミネラル液体を製造する方法であって、
－ カルボン酸、ラクトン、カルボン酸無水物またはこれらの組合わせからなる群から選択される１種または複数の酸性化剤を提供するステップと、
－ ＢＬＧ結晶を含む食用ＢＬＧ組成物を１種または複数の酸性化剤ならびに任意選択の追加の成分（例えば、水、脂肪源および／または炭水化物源）と接触させるステップであって、前記１種または複数の酸性化剤は、ｐＨを２～４．５（好ましくは２．５～４．０）に調整するのに十分な量で使用され、ＢＬＧ結晶が溶解することを可能にする、ステップと
を含み、それにより液体を形成する方法に関する。
この液体を例えば飲料として使用し得るか、または別の食品を製造するための成分として使用し得る。
この方法で使用される食用ＢＬＧ組成物が例えば粉末として乾燥形態で提供される場合、酸性化剤を添加する前に食用ＢＬＧ組成物を水で再水和させることが好ましいことが多い。
この方法で使用される食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、タンパク質を１～３０％（重量／重量）にするのに十分な量で液体中に存在し、好ましくはタンパク質を２～２５％（重量／重量）、より好ましくはタンパク質を４～２０％（重量／重量）、さらにより好ましくはタンパク質を５～１６％（重量／重量）にするのに十分な量で存在する。
この方法で使用される食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％のＢＬＧの結晶化度を有する。
適切な酸性化剤の例は、
－ カルボン酸、例えば酢酸、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、グルコン酸、グルコン酸またはこれらの混合物、
－ ラクトン、例えばＤ－グルコノ－デルタ－ラクトン、
－ カルボン酸無水物
である。
いくつかの好ましい実施形態では、この方法で使用される、ＢＬＧ結晶を含む食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、低リン組成物であり、この方法で使用されるあらゆる他の成分は、好ましくは、最終液体も低リン組成物であるように選択される。
他の好ましい実施形態では、この方法で使用される、ＢＬＧ結晶を含む食用ＢＬＧ組成物は、好ましくは、低ミネラル組成物であり、この方法で使用されるあらゆる他の成分は、好ましくは、最終液体も低ミネラル組成物であるように選択される。
この方法を好ましくは１～６５℃の範囲の温度で実施し、好ましくは２～５０℃、より好ましくは３～２０℃の範囲、さらにより好ましくは４～１５℃の範囲の温度で実施する。
本発明を、具体的な実施形態を参照して上記で説明した。しかしながら、上記以外の他の実施形態も本発明の範囲内で同様に可能である。別途明記しない限り、本発明の様々な実施形態および態様の様々な特徴およびステップを、本明細書で説明したもの以外の方法で組み合わせ得る。
実施例１：粗ホエイタンパク質濃縮物からのベータ－ラクトグロブリンの結晶化
プロトコル：
標準的なチーズ製造プロセス由来のスイートホエイに由来しかつ１．２ミクロンのフィルタに通してろ過された、ラクトースが枯渇したＵＦ保持液をＢＬＧ結晶化プロセスの原材料として使用した。このスイートホエイ原材料は、２１％ＴＳ（総固形物）±５の原材料濃度および透析ろ過媒体としての洗練水（最大０．０５ｍＳ／ｃｍの導電率を得るために逆浸透によりろ過された水）を使用する、４６ミルスペーサー供給圧が１．５～３．０バールであるＫｏｃｈ ＨＦＫ－３２８型膜を使用する限外ろ過設定を必要条件とした。限外ろ過中の原材料および保持液の温度は、約１２℃であった。次いで、ＨＣｌを添加して約５．４０のｐＨを得ることにより、ｐＨを調整した。この保持液の導電率の低下が２０分の期間をかけて０．０３ｍＳ／ｃｍ未満となるまで透析ろ過を続けた。次いで、この保持液を約３０％ＴＳ（濃縮保持液の総重量に対して約２３．１％の総タンパク質）まで濃縮した。この濃縮保持液の試料を５分にわたり３０００ｇで遠心分離したが、目に見えるペレットは形成されなかった。上清をＨＰＬＣ分析にかけた。この原材料の組成を表１に示す。
この濃縮保持液に、自発的なＢＬＧ結晶化（原材料２に関連して実施例３で説明されている）から得られた０．５ｇ／Ｌの純粋なＢＬＧ結晶材料を播種した。この播種材料を、ＢＬＧ結晶スラリーをｍｉｌｌｉＱ水で５回洗浄し、各洗浄後にＢＬＧ結晶を集めることにより調製した。洗浄後、このＢＬＧ結晶を凍結乾燥させ、乳棒および乳鉢を使用して磨り砕き、次いで２００ミクロンの篩いに通した。従って、結晶化種は、粒度が２００ミクロン未満であった。
この濃縮保持液を３００Ｌの結晶化タンクに移し、約４℃まで冷却し、穏やかに撹拌しつつ、この温度で一晩保持した。翌朝、この冷却された濃縮保持液の試料を試験管に移し、目視と顕微鏡との両方で調べた。急速に沈降する結晶が一晩で明瞭に生じた。結晶と母液との両方を含む混合物の実験室用試料を氷水浴中で０℃までさらに冷却した。この母液および結晶を５分にわたる３０００ｇの遠心分離により分離し、上清およびペレットの試料をＨＰＬＣ分析のために採取した。結晶を冷洗練水で１回洗浄し、次いで再度遠心分離した後にペレットを凍結乾燥させた。
Figure 2022188055000002
ＨＰＬＣによるＢＬＧ相対収率の定量：
全ての試料を洗練水の添加により同程度に希釈した。これらの試料を、０．２２ミクロンのフィルタに通してろ過した。各試料に関して、同一の体積を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）５μｍ Ｃ４ ３００Å、ＬＣカラム２５０×４．６ｍｍ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ：００Ｇ－４１６７－Ｅ０）を備えたＨＰＬＣシステムにロードし、２１４ｎｍで検出した。
これらの試料を、下記の条件を使用して流した：
バッファーＡ：ＭｉｌｌｉＱ水、０．１重量／重量％のＴＦＡ
バッファーＢ：ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、０．０８５重量／重量％のＴＦＡ
流速：１ｍｌ／分
勾配：０～３０分 ８２～５５％Ａおよび１８～４５％Ｂ；３０～３２分 ５５～１０％Ａおよび４５～９０％Ｂ；３２．５～３７．５分 １０％Ａおよび９０％Ｂ；３８～４８分 １０～８２％Ａおよび９０～１８％Ｂ。
データ処理：
全ての試料を同一の方法で処理したことから、本発明者らは、ＢＬＧピークの面積を直接比較して相対収率を得ることができる。結晶はＢＬＧのみを含み、かつ試料を全て同一の方法で処理していることから、アルファ－ラクトアルブミン（ＡＬＡ）の濃度（従ってＡＬＡの面積）は、全ての試料で同一のはずであり、従って相対質量の算出時に結晶化の前後のＡＬＡの面積を補正係数（ｃｆ）として使用する。
Figure 2022188055000003
相対収率を、下記の式：
Figure 2022188055000004
により算出する。
結果：
図１は、スイートホエイからのＢＬＧの結晶化の前後の重ね合わせたクロマトグラムを示す。「結晶化前」試料を黒色の実線で表し、「結晶化後」試料を点線で表す。ＢＬＧ濃度の大幅な減少が生じたことが明らかであり、既に説明した収率計算を使用して、取り出されたＢＬＧの収率を６４．５％（重量／重量）と決定した。
結晶スラリーを顕微鏡で調べたところ、図２から分かるように、試料は六方晶を含み、多くは、サイズが２００ミクロンよりも大幅に大きく、これは、観測した結晶が播種結晶だけではないことを示す。結晶は、針を押し当てると容易に粉砕され、このことから、この結晶がタンパク質結晶であることを確認した。
図３は、洗浄した結晶生成物のクロマトグラムを示し、この場合、ＢＬＧは、クロマトグラムの総面積の９８．９％を占める。このＢＬＧ生成物の純度をさらなる洗浄によりさらに一層高めることができる。
結論：
この実施例から、驚くべきことに、総タンパク質に対して４８％を超える非ＢＬＧタンパク質を含む粗ホエイタンパク質濃縮物からＢＬＧを選択的に結晶化させることが可能であり、得られたＢＬＧ結晶単離物は、極めて高い純度を有することが実証される。この発見は、好ましくは、高温および問題のある化学物質への長時間の曝露を回避する穏やかな方法でＢＬＧが他のタンパク質成分から分離される、工業用乳タンパク質分離の新しいアプローチを切り開く。
実施例２：ＢＬＧの収率への導電率および温度の影響
プロトコル：
実施例１と同一の原材料、実験および分析の設定を使用して、様々な導電率レベルでのＵＦ透析ろ過中に保持液（約１３．９％（重量／重量）の総タンパク質）の試料を採取し、ＢＬＧ結晶の収率への導電率の影響を調べた。この試料を４℃まで冷却し、この温度で一晩保持し（しかしながら、本発明者らは、平衡に達するには３０分以下で十分あり得ることを観察した）、次いで３つの試料を氷水中で０℃まで冷却し、少なくとも１時間にわたりこの温度で保持して収率への温度の影響を示した。４℃での試料の結果を図４に見ることができる。
透析ろ過が完了した後、濃縮中に試料をＢｒｉｘ ２１、２４および３２．５で採取した。これらの試料を最初に４℃まで冷却し、この温度で一晩保持した。ＢＬＧ結晶の収率を、実施例１で説明したように測定した。次いで、試料を氷水中で０℃まで冷却し、少なくとも１時間にわたりこの温度で保持した。続いて、ＢＬＧ結晶の収率を再度測定した。
結果：
図４に示すように、これらの試料でのＢＬＧの相対収率対導電率をプロットすると、より低い導電率と、ＢＬＧのより高い相対収率との間に明白な相関関係が存在する。
図５では、様々な導電率の３つの試料の収率が２つの温度（４℃および０℃）で示されており、温度が低いほどＢＬＧの収率が高いことを見ることができる。さらに一層温度を下げると、収率が増加すると予想される。
図６は、４℃および０℃の両方でのＢＬＧの相対収率へのタンパク質濃度の影響を示す。この図は、タンパク質濃度（本明細書ではＢｒｉｘ測定により示される）と、ＢＬＧの相対収率との間の明白な相関関係を示し、タンパク質の濃度が増加するにつれて相対収率が増加し続けることを示す。
結論：
本発明者らは、いくつかのパラメータが結晶化プロセスの効率に影響を及ぼすことを観察した。所与のｐＨ値で導電率を低下させ、ＢＬＧの濃度を増加させ、かつ温度を低下させることにより、ＢＬＧの収率を増加させ得る。
実施例３：３種のホエイタンパク質溶液中でのＢＬＧの結晶化
プロトコル：
実施例１と同一の実験および分析の設定を使用し、結晶化の原材料として、異なる３種のホエイタンパク質含有原料を試験した。しかしながら、原材料２で実施した実験では播種を使用しなかった。原材料１および２はスイートホエイをベースとし、実施例１で説明した処理前にＳｙｎｄｅｒ ＦＲ膜により脂肪を減少させた。原材料３は、酸性ホエイに由来した。
これら３種の原材料の組成を下記の表２、表３および表４に見ることができる。原材料３を、他の２種（原材料１中での２６．３％（重量／重量）の総タンパク質および原材料２中での２５．０％（重量／重量））と比べて有意に低い濃度である２１％ＴＳ（この原材料の総重量に対して１３．３重量／重量％の総タンパク質）で結晶化させた。
結晶化した原材料１のスラリーを、５分にわたり１５００ｇで、０．４５ミクロンのＣＡ膜を備えたＭａｘｉ－Ｓｐｉｎフィルタ上で遠心分離し、次いでフィルタケーキに２倍容量のＭｉｌｌｉＱ水を添加した後に再度遠心分離した。得られたフィルタケーキをＨＰＬＣで分析した。結晶化した原材料１のペレット（フィルタケーキ）を保持するＭａｘｉ－Ｓｐｉｎフィルタの写真を図２４に示す。原材料２からのペレットを２倍容量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、標準的な条件下で再度遠心分離した後にペレットをＨＰＬＣで分析した。原材料３からのペレットを洗浄することなく分析した。
原材料２から作られた結晶を１０％ＴＳまで希釈し、１ＭのＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ７に調整して結晶化を反転させた。原材料２からの結晶スラリー（３６％ＴＳ）にＮａＣｌを添加して、結晶化を反転させた。
Figure 2022188055000005
Figure 2022188055000006
Figure 2022188055000007
結果：
原材料１：
図７では、原材料（実線）および母液（破線）のタンパク質組成のクロマトグラムを見ることができる。このプロセスによりＢＬＧの大部分が結晶として取り出されたことが明らかである。単離ＢＬＧの収率（実施例１で説明したように算出される）は、この原材料中のＢＬＧの総量に対して約６５％である。
図８は、結晶化期間の初期段階中に採取した試料の顕微鏡写真である。図９は、結晶化が完了した際に採取した試料の顕微鏡写真である。これら２枚の写真から、ＢＬＧ結晶が比較的脆いことが明らかである。結晶の一部は、撹拌中に壊れるように見え、六角形または菱形の形状から結晶片に変形し、この結晶片は、依然として非常にコンパクトで明確に見えるが、より不規則な形状を有する。
図１０は、スピンフィルタ上で分離して洗浄されたＢＬＧ結晶のクロマトグラムを示す。この図に見られるように、純度は、非常に高く、他のホエイタンパク質の除去は、極めて効率的である。
原材料２：
図１１では、原材料２（実績）および得られた母液（破線）のタンパク質組成を見ることができる。ＢＬＧの大部分が取り出されたことが明らかであり、算出された収率は、原材料２中のＢＬＧの総量に対して８２％であった。
図１２は、結晶化前（左側の写真）および後（右側の写真）の原材料２を示す。結晶化中、この原材料は、透明な液体（この液体中で撹拌磁石が目に見える）から乳白色の不透明な液体に変化した。
図１３は、ＢＬＧ結晶の顕微鏡写真を示す。結晶の大部分は、破砕されているが、六角形の形状を見ることができる。
図１６は、２倍容量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄した後のＢＬＧ結晶の単離ペレットのクロマトグラムである。このクロマトグラムは、結晶が非常に高い純度でＢＬＧを含むことを明確に示す。
図１４および図１５は、環境がもはや結晶構造にとって好都合ではないように（ＮａＣｌの添加により）導電率を上昇させたかまたは（ＮａＯＨの添加によりｐＨを７に調整することによって）ｐＨを変更した結果を示す。両方の場合において、乳白色の懸濁液は、ＢＬＧ結晶が溶解するにつれて透明な液体に戻る。
原材料２から得られた結晶調製物のミネラル組成を表５に示す。本発明者らは、リン対タンパク質の比が非常に低く、これにより、この結晶調製物が、腎疾患を患っている患者のタンパク源として適していることに留意する。
Figure 2022188055000008
原材料３：
図１７では、原材料３（実線）および得られた母液（破線）のタンパク質組成のクロマトグラムを示す。ＢＬＧの大分部が単離されたことが明らかである（この原材料中のＢＬＧの総量に対して７０．３％の算出した収率）。結晶化前にタンパク質含有量がより高かった場合、得られた収率は、さらに高かったであろう。
図１８は、原材料３（ＣＭＰを実質的に含まない）から単離されたＢＬＧ結晶の顕微鏡写真である。この結晶は、六角形ではなく長方形の形状を有した。この長方形の結晶は、六角形の結晶と比べて頑強に見えた。図１９は、洗浄されていない単離結晶ペレットのクロマトグラムを示し、このクロマトグラムは、結晶が、六角形ではなく長方形を有するにもかかわらずＢＬＧ結晶であったことを明確に示す（例えば、図１８の長方形の結晶形状と図２の六角形の結晶形状とを比較されたい）。
Figure 2022188055000009
原材料３に由来する結晶調製物は、Ｐ ４５ｍｇ／タンパク質１００ｇを含んだ。本発明者らは、リン対タンパク質の比が非常に低く、これにより、この結晶調製物が、腎疾患を患っている患者のタンパク源として適していることに留意する。
結論：
３種全ての原材料は、ＢＬＧ結晶化プロセスに適していた。ＢＬＧ結晶は、塩を添加するかまたはｐＨもしくは温度を上昇させることにより容易に溶解した。この新規の方法は、リンの含有量が非常に低いＢＬＧ調製物を調製することを可能にし、これにより、この調製物は、腎疾患を患っている患者のタンパク源として適したものになる。
実施例４ ＢＬＧ結晶の収率へのｐＨの影響
プロトコル：
各実験に関してｐＨを表８で説明するレベルに調整したことを除いて、（低脂肪スイートホエイタンパク質濃縮物を使用して）実施例１と同一のプロトコルおよび実験の設定を使用した。結晶化ステップの開始時のタンパク質濃度は、約２４％（重量／重量）であった。
結晶化プロセスおよび得られた収率へのｐＨの影響を調べるために、薄いＮａＯＨ溶液（＞４％）または薄いＨＣｌ（＞３．６％）溶液の何れかでｐＨを調整した。結晶化後、ＢＬＧ結晶を、実施例１で説明したように遠心分離により分離した。
Figure 2022188055000010
Figure 2022188055000011
結果：
収率を実施例１で説明したように算出した。播種材料の添加前に出発試料を採取したことに留意すべきである。従って、この試料がＢＬＧに関して過飽和でなかった場合、播種材料は、溶解して総ＢＬＧ濃度に寄与し、この場合、ＢＬＧ収率は、マイナスに見えるであろう。
Figure 2022188055000012
結論：
この実験は、塩溶モードでのＢＬＧの結晶化が５～６のｐＨ範囲で可能であったことを実証する。
実施例５：導電率のレベルの増加の影響の調査
プロトコル：
試料を様々な導電率で採取したことを除いて、実施例１と同一のプロトコルおよび実験の設定を使用した。表１０に示す原料を必要条件とし、結晶化プロセスの原材料として使用した。ＵＦ前に原料の試料を採取してＮａＣｌを添加し、導電率を増加させてＢＬＧ結晶が成長し得る導電率レベルを調べた。結晶化中のタンパク質含有量は、約１６．７％（重量／重量）であった。
Figure 2022188055000013
結果：
試料を、実施例１で説明したように処理した。図２０は、保持液の様々な導電率での算出された収率を示す。３．５３ｍＳ／ｃｍでの点がｐＨ調整後の原料であった。３．５３を超える全ての点は、導電率を増加させるためにＮａＣｌを添加した結果であった。３．５３未満の点は、ＵＦシステムによる透析ろ過の結果であった。４．９３ｍＳ／ｃｍでの収率は、ゼロに近く、有意と見なさなかった。
導電率が４．９３ｍＳ／ｃｍである保持液試料は、ＵＦ透過液の導電率が約５．７ｍＳ／ｃｍであった。導電率が３．５３ｍＳ／ｃｍである保持液試料は、ＵＦ透過液の導電率が約４．３５ｍＳ／ｃｍであった。
図２０から、ＢＬＧ結晶が、（４℃および約１６．７％（重量／重量）の総タンパク質含有量での）４．９３ｍＳ／ｃｍ未満の導電率で原材料中に形成されたことが分かる。約２ｍＳ／ｃｍの保持液の導電率および約１．６ｍＳ／ｃｍのＵＦ透過液の導電率で約７５％のＢＬＧ収率を得た。
図２１は、予想されるＢＬＧ結晶特性を示す、保持液中において４．２０ｍＳ／ｃｍで形成された結晶の顕微鏡写真である。
結論：
実施例５の具体的な原材料により、４．９３ｍＳ／ｃｍ（ＵＦ透過液の導電率５．７５ｍＳ／ｃｍおよび導電率とタンパク質の総量との間の比０．０５７に対応する）未満でＢＬＧ結晶の形成が可能になる。この導電率の上限は、タンパク質の濃度および組成に依存すると予想される。例えば、より高いタンパク質濃度および／または高荷電のタンパク質もしくは他の巨大分子（例えば、ＣＭＰ）の含有量の増加により、ＢＬＧの結晶化が可能である導電率の上限が上がると予想される。
実施例６：血清タンパク質濃縮物中でのＢＬＧの結晶化
Ｓｙｎｄｅｒ ＦＲ膜および約５０℃のプロセス温度を使用して、脱脂乳を精密ろ過にかけることにより、血清タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）を調製した。得られた保持液は、実質的に全てのカゼインおよび残留脂肪を含んでおり、いくつかの血清タンパク質、ラクトースおよびミネラルをさらに含む。透過液は、この膜を透過し得る分子（例えば、血清タンパク質、ラクトースおよびミネラル）を含むが、カゼインまたは脂肪を実質的に含まなかった。次いで、実施例１で説明したように結晶化のために透過液を調製し（原材料の組成については表１１を参照されたい）、実施例１で説明したように、得られたＢＬＧ結晶の特徴を明らかにした。しかしながら、全てのＵＦ操作を１２℃で実施する代わりに、保持液の導電率が１ｍＳ／ｃｍに近づくと、保持液の温度を１２℃から２５℃に上昇させた。ＵＦ濃縮中でのＢＬＧの自発的結晶化を回避するために温度を上昇させた。
Figure 2022188055000014
実施例１～５の結晶化と同様に、ＳＰＣ原材料のＢＬＧは、非常に高純度で分離され得る結晶を形成し（先の実施例のようにクロマトグラフィーで確認した）、ＳＰＣ原材料のＢＬＧの総量に対して７０％のＢＬＧ収率が得られた。図２２では、結晶化の初期段階からのＢＬＧ結晶を示す。既に見られるように、結晶は、例えば、実施例２で観察した六角形の形状とは対称的に長方形または正方形の形状を有する。
実施例７：噴霧乾燥したＢＬＧ結晶の調製および嵩密度の決定
実施例３（原材料２を使用する）で製造したＢＬＧ結晶の一部を６４ミルスペーサー（ミルは１／１０００インチを意味する）および２５～３０Ｌ／時間の流量で１２００ｇ、５１８０ＲＰＭ、１１０ＲＰＭ Ｄｉｆｆ．においてデカンター遠心分離機で分離した。次いで、ＢＬＧ結晶相を洗練水と１：１で混合し、次いで同じ設定を使用するデカンター遠心分離機で再度分離した。次いで、ＢＬＧ結晶相を洗練水と混合して、約２５％の乾燥物質を含みかつＢＬＧの結晶化度が約８０であるスラリーにし、続いてパイロットプラントの噴霧乾燥機（余熱なしで入口温度が１８０℃であり出口温度が８５℃である）で乾燥させた。噴霧乾燥までの流体流の温度は、１０～１２℃であった。出口でのサンプリングにより得られた粉末は、含水量が４．３７％（重量／重量）であった。
このスラリー中のＢＬＧの結晶化度は、約９０％であった。
本発明者らは、ＢＬＧ結晶のスラリーおよび母液を６４ミルスペーサーおよび７５Ｌ／時間の流速で３５０ｇ、２７５０ＲＰＭ、１５０ＲＰＭ Ｄｉｆｆ．においてデカンター遠心分離機でも問題なく分離した。続いて、ＢＬＧ結晶相を洗練水と１：２で混合した。次いで、ＢＬＧ結晶相を洗練水と混合して薄いスラリーにし、続いて上記と同一のパラメータを使用してパイロットプラントの噴霧乾燥機で乾燥させた。
次いで、噴霧乾燥した粉末の嵩密度を実施例９．３に従って測定し、同一の装置で乾燥させた標準ＷＰＩの嵩密度と比較した。標準ＷＰＩは、嵩密度（６２５回のスタンピングに基づく）が０．３９ｇ／ｍＬであることが分かり、これは、ＷＰＩ粉末の正常範囲の上限である。しかしながら、噴霧乾燥したＢＬＧ結晶調製物は、嵩密度が０．６８ｇ／ｍＬであり、標準ＷＰＩの嵩密度に比べて７５％高かった（例えば、図２３を参照されたい）。これは、実際に驚くべきことであり、多くの物流上の利点および用途関連の利点の両方をもたらす。
Figure 2022188055000015
続いて、噴霧乾燥したＢＬＧ結晶調製物の試料を冷脱塩水に再懸濁させ、ＢＬＧ結晶は、依然として顕微鏡で明確に見ることができた。クエン酸またはＮａＣｌの添加によりＢＬＧ結晶が溶解し、不透明な結晶懸濁液が透明な液体に変化した。
本発明者らは、乾燥ステップ中の長時間の加熱により、結晶形態であるＢＬＧの量が減少するという徴候を発見した。従って、ＢＬＧ結晶調製物の熱曝露は、可能な限り低いことが好ましい。
結論：
この実施例は、ＢＬＧ結晶を含むスラリーを噴霧乾燥し得ること、および乾燥ステップ中の加熱を制御する場合、ＢＬＧ結晶が、再懸濁した噴霧乾燥粉末中に依然として存在することを実証する。
本発明者らは、ＢＬＧ結晶を含むホエイタンパク質粉末の嵩密度は、溶解したタンパク質流の通常の噴霧乾燥により得られるものと比べて大幅に高いことをさらに発見した。高密度粉末は、粉末１ｋｇ当たりに必要とされる包装材料がより少なく、かつ所与の容器またはトラックにより、より多くの粉末（質量）を輸送し得ることから、この粉末の費用効率がより高い包装および物流を可能にする。
この高密度粉末は、製造および使用中での取扱いが容易でありかつふっくらさおよび埃っぽさがより少ないとも思われる。
実施例８：低リンタンパク質飲料
実施例３からの精製済ＢＬＧ生成物（原材料３から得た結晶調製物）を使用して、６種の低リン飲料試料を調製した。全ての乾燥成分を脱塩水と混合して各試料１０ｋｇを得、１０℃で１時間にわたり水和させた。
Figure 2022188055000016
これら６種の試料の部分試料を採取して、Ｔｕｒｂｉｑｕａｎｔ（登録商標）３０００ ＩＲ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒで濁度を測定し、Ｇｉｌｓｏｎによるｖｉｃｏｍａｎで粘度を測定した。結果を下記の表に示す。
Figure 2022188055000017
６種の低リン飲料試料の部分試料が入った試験管の写真を図２５に示す。左から右に、部分試料は、試料Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦであった。試験管の目視検査は、濁度測定値を検証し、全ての飲料試料が透明であり、特に試料ＣおよびＤ（ｐＨ３．０）が非常に透明であることを実証した。低粘度は、飲料試料を容易に飲むことができることを実証する。
飲料を調製するために使用される全ての成分は、リンが少なく、不必要なミネラルを含まなかった。従って、得られた飲料は、リン含有量がＰ約４５ｍｇ／タンパク質１００ｇであり、概してミネラル含有量が非常に低かった。従って、６種の飲料は、腎疾患患者のためのタンパク質飲料としての使用に適した。
実施例９ － 分析の方法
実施例９．１ ラクトシル化ＢＬＧ対非ラクトシル化ＢＬＧの決定：
ＬＣ－ＭＳを使用して実施した、ラクトシル化ＢＬＧおよび天然ＢＬＧの量の定量。
この分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＨＰ１２００シリーズＨＰＬＣと連結されたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの６４１０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＭＳで実施した。イオン化前の分離のためにＳｙｍｍｅｔｒｙ３００（商標）Ｃ１８カラム（ＷＡＴ１０６１７２：５μｍ固相粒子、カラム寸法２．１×１５０ｍｍ）にアプライし、タンパク質を２１４ｎｍで検出した。試料を分析する前に試料を０．２２ミクロンフィルタに通してろ過した。全ての試料を二重に流した。
この分析を、下記の条件を使用して実施した：
ＨＰＬＣ
バッファーＡ：９９．９％のＭｉｌｌｉＱ－ｖａｎｄおよび０．１％のＴＦＡ
バッファーＢ：９．９％のＭｉｌｌｉＱ－ｖａｎｄ、９０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡ
流量：０．３ｍＬ／分
勾配：
０～２０分：８５～６０％Ａおよび１５～４０％Ｂ
２０～４５分：６０～５０％Ａおよび４０～５０％Ｂ
４５～５５分：０％Ａおよび１００％Ｂ
５５～７０分 ８５％Ａおよび１５％Ｂ
ロード：４０μＬ
カラム温度を６０℃に設定した。
質量分析：
ｍ／ｚが１００～２０００であるイオンを検出し、得られたデータをＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖｅｒ．Ｂ．０４．００で評価した。デコンボリューションを使用して、同種（同質量）の全てのフォームをグループ化した。１８ｋＤａ～２０ｋＤａの質量をさらに調査した。ＢＬＧ－Ａの無傷の質量は、１８．３６１ｋＤａであり、ＢＬＧ－Ｂは、１８．２７６であり、ラクトシル化は、タンパク質の質量に３２４Ｄａを加え、この質量領域を調べることにより、１個のタンパク質当たり最大５個のラクトシル化を検出し得る。相対的定量を、異なる種のイオン化識別を無視して、各質量に対する信号強度を比較することにより行う。
実施例９．２：総タンパク質の決定
試料の総タンパク質含有量（真のタンパク質）を下記により決定する：
１）ＩＳＯ ８９６８－１／２｜ＩＤＦ ０２０－１／２－Ｍｉｌｋ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ－Ｐａｒｔ １／２：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｍｅｔｈｏｄに従う、試料の総窒素の決定。
２）ＩＳＯ ８９６８－４｜ＩＤＦ ０２０－４－Ｍｉｌｋ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ－Ｐａｒｔ ４：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔに従う、試料の非タンパク質窒素の決定。
３）（ｍ総窒素－ｍ非タンパク質窒素）＊６．３８としてのタンパク質の総量の算出。
実施例９．３：ルース密度（ｌｏｏｓｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）および嵩密度の決定
乾燥粉末の密度は、特定の条件下で特別なＳｔａｍｐｆ体積計（即ちメスシリンダ）を使用して分析される粉末の重量と体積との間の関係として定義される。この密度は、概して、ｇ／ｍｌまたはｋｇ／Ｌで表される。
この方法では、乾燥粉末の試料をメスシリンダに詰める。指定の回数タッピングした後、この製品の体積を読み取り、密度を算出する。
この方法により、下記の３種の密度を定義し得る：
・ 充填密度、指定のメスシリンダに移した後の粉末の体積で除算した質量である。
・ ルース密度、この標準器中での指定の条件に従う１００回のタッピング後の粉末の体積で除算した質量である。
・ 嵩密度、この標準器中での指定の条件に従う６２５回のタッピング後の粉末の体積で除算した質量である。
この方法は、特別のメスシリンダ（２５０ｍｌ、目盛り０～２５０ｍｌ、重量１９０±１５ｇ）（Ｊ．Ｅｎｇｅｌｓｍａｎｎ Ａ．Ｇ．６７０５９ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ／Ｒｈ）およびＳｔａｍｐｆ体積計（例えば、Ｊ．Ｅｎｇｅｌｓｍａｎｎ Ａ．Ｇ．）を使用する。
乾燥製品のルース密度および嵩密度を下記の手順により決定する。
前処理：
測定する試料を室温で保管する。
次いで、容器を繰り返し回転させて逆転させる（粒子の粉砕を回避する）ことにより、試料を完全に混合する。この容器は、２／３を超えて満たされていない。
手順：
粉末１００．０±０．１グラムを秤量し、メスシリンダに移す。体積Ｖ０をｍｌで読み取る。
粉末１００ｇがメスシリンダに収まらない場合、この量を５０グラムまたは２５グラムまで減少させるべきである。
このメスシリンダをＳｔａｍｐｆ体積計に取り付け、１００回タップする。スパチュラで表面を平らにし、体積Ｖ１００をｍｌで読み取る。
タブの数を６２５（１００回のタップを含む）に変更する。表面に平らにタッピングした後、Ｖ６２５をｍｌで読み取る。
密度の算出：
下記式：
嵩密度＝Ｍ／Ｖ
（式中、Ｍは、秤量した試料をグラムで示し、Ｖは、６２５回のタッピング後の体積をｍｌで示す）に従って、ｇ／ｍｌで表されるルース密度および嵩密度を算出する。
実施例９．４：粉末の含水量の決定
ＩＳＯ ５５３７：２００４（Ｄｒｉｅｄ ｍｉｌｋ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｃｏｎｔｅｎｔ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ））に従って食品の含水量を決定する。ＮＭＫＬは、「Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｍｅｔｏｄｉｋｋｏｍｉｔｅ ｆｏｒ Ｎａｅｒｉｎｇｓｍｉｄｌｅｒ」の略語である。
実施例９．５：カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、リンの総量の決定
マイクロ波消化を使用して試料を最初に分解し、次いでＩＣＰ装置を使用してミネラルの総量を決定する手順を使用して、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウムおよびリンの総量を決定する。
装置：
電子レンジは、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ製であり、ＩＣＰは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ製のＯｐｔｉｍａ ２０００ＤＶである。
材料：
１ＭのＨＮＯ３
２％ＨＮＯ３中のイットリウム
５％ＨＮＯ３中の、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウムおよびリンに適した標準
前処理：
特定の量の粉末を秤量し、この粉末をマイクロ波消化チューブに移す。１ＭのＨＮＯ３ ５ｍＬを添加する。電子レンジの指示に従って試料をマイクロ波で消化する。消化したチューブをヒューム戸棚に入れ、蓋を取り外して揮発性ヒュームを蒸発させる。
測定手順：
既知量のＭｉｌｌｉ－Ｑ水を使用して、前処理した試料をデジチューブに移す。この消化チューブにイットリウムの２％ＨＮＯ３溶液を添加し（希釈した試料５０ｍＬ当たり約０．２５ｍＬ）、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を使用して既知量まで希釈する。製造業者により説明される手順を使用して、ＩＣＰで試料を分析する。
Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を使用して、１ＭのＨＮＯ３ １０ｍＬおよびイットリウムの２％ＨＮＯ３溶液０．５ｍＬの混合物を１００ｍＬの最終体積まで希釈することにより、ブラインド試料を調製する。
予想される試料濃度を挟む濃度を有する少なくとも３つの標準試料を調製する。
実施例９．６：フロシン値の決定：
フロシン値を、“Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｕｒｏｓｉｎｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｉｎｆａｎｔ Ｃｅｒｅａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”，Ｇｕｅｒｒａ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９（１９９９）１７１－１７６で説明されているように決定し、タンパク質の総量を実施例９．２に従って決定する。フロシン値をタンパク質１００ｇ当たりのフロシンｍｇ単位で報告する。
実施例９．７：液体中におけるＢＬＧの結晶化度の決定
下記の方法を使用して、ｐＨが５～６の範囲である液体中におけるＢＬＧの結晶化度を決定する。
ａ）対象の液体の試料１０ｍＬを、０．４５ミクロンの孔径のＣＡ膜を有するＭａｘｉ－Ｓｐｉｎフィルタに移す。
ｂ）直ちにこのフィルタを５分にわたり１５００ｇで回転させる。遠心分離機を２℃で保持する。
ｃ）このスピンフィルタの保持液側に冷ｍｉｌｌｉＱ水（２℃）２ｍＬを添加し、直ちに遠心分離機を２℃に保持しつつ５分にわたり１５００ｇでフィルタを回転させ、透過液（透過液Ａ）を集め、体積を測定し、実施例９．９で概説する方法を使用してＨＰＬＣによりＢＬＧ濃度を決定する。
ｄ）このフィルタの保持液側に２ＭのＮａＣｌ ４ｍＬを添加し、迅速に撹拌し、この混合物を２５℃で１５分にわたり放置する。
ｅ）直ちにこのフィルタを５分にわたり１５００ｇで回転させ、透過液（透過液Ｂ）を集める。
ｆ）実施例９．９で概説する方法を使用して透過液Ａおよび透過液Ｂ中のＢＬＧ総重量を決定し、この結果を重量パーセントの代わりにＢＬＧの総重量に変換する。透過液Ａ中のＢＬＧの重量をｍ透過液Ａと称し、透過液Ｂ中のＢＬＧの重量をｍ透過液Ｂと称する。
ｇ）ＢＬＧに関する液体の結晶化度を、
結晶化度＝ｍ透過液Ｂ／（ｍ透過液Ａ＋ｍ透過液Ｂ）＊１００％
として決定する。
実施例９．８：乾燥粉末中におけるＢＬＧの結晶化度の決定
この方法を使用して、乾燥粉末中におけるＢＬＧの結晶化度を決定する。
ａ）粉末試料５．０グラムを冷ｍｉｌｌｉＱ水（２℃）２０．０グラムと混合し、２℃で５分にわたり放置する。
ｂ）対象の液体の試料を、０．４５ミクロンのＣＡ膜を有するＭａｘｉ－Ｓｐｉｎフィルタに移す。
ｃ）直ちにこのフィルタを５分にわたり１５００ｇで回転させる。遠心分離機を２℃で保持する。
ｄ）このスピンフィルタの保持液側に冷ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（２℃）２ｍＬを添加し、直ちに５分にわたり１５００ｇでフィルタを回転させ、透過液（透過液Ａ）を集め、体積を測定し、実施例９．９で概説する方法を使用してＨＰＬＣによりＢＬＧ濃度を決定し、この結果を重量パーセントの代わりにＢＬＧの総重量に変換する。透過液Ａ中のＢＬＧの重量をｍ透過液Ａと称する。
ｆ）次いで、粉末中におけるＢＬＧの結晶化度を下記式：
Figure 2022188055000018
（式中、Ｍ総ＢＬＧは、ステップａ）の粉末試料中のＢＬＧの総量である）を使用して算出する。
粉末試料のＢＬＧの総量が未知である場合、これを、（同一の粉末源からの）別の粉末試料５ｇをｍｉｌｌｉＱ水２０．０グラムに懸濁させ、水性ＮａＯＨの添加によりｐＨを７．０に調整し、この混合物を、撹拌しつつ２５℃で１時間にわたり放置し、最後に実施例９．９を使用して粉末試料のＢＬＧの総量を決定することにより、決定し得る。
実施例９．９：水性液体中におけるＢＬＧ、ＡＬＡおよびＣＭＰの総量の決定
アルファ－ラクトアルブミン、ベータ－ラクトグロブリンおよびＣＭＰの含有量を０．４ｍＬ／分でＨＰＬＣ分析により分析した。ろ過した試料２５マイクロＬを、溶出液（ＭｉｌｌｉＱ水４６５ｇ、アセトニトリル４１７．３ｇおよびトリフルオロ酢酸１ｍＬからなる）で平衡化した附属のプレカラムＰＷｘｌ（６ｍｍ×４ｃｍ、Ｔｏｓｏｈａｓｓ、日本）と直列に接続された２個のＴＳＫｇｅｌ３０００ＰＷｘｌ（７．８ｍｍ ３０ｃｍ、Ｔｏｓｏｈａｓｓ、日本）カラムに注入し、２１０ｎｍでＵＶ検出器を使用する。
対応する標準タンパク質に関して得られたピーク面積と、この試料のピーク面積とを比較することにより、天然のアルファ－ラクトアルブミン（Ｃアルファ）、ベータ－ラクトグロブリン（Ｃベータ）およびカゼイノマクロペプチド（ＣＣＭＰ）の含有量の定量的決定を実施した。
追加のタンパク質（非ＢＬＧタンパク質）の総量を、総タンパク質の量（実施例９．２に従って決定した）からＢＬＧの量を減算することにより決定した
実施例９．１０：ＵＦ透過液の導電率の決定
試料１５ｍＬを３ｋＤａカットオフ（３０００ＮＭＷＬ）のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔに移し、２０～３０分にわたり４０００ｇでまたは導電率を測定に十分な体積のＵＦ透過液がフィルタユニットの底部に蓄積されるまで遠心分離する。遠心分離の直後に導電率を測定する。試料の取扱いおよび遠心分離を試料の供給源の温度で実施する。
実施例９．１１：ホエイタンパク質組成物のタンパク質変性の度合いの決定
変性したホエイタンパク質は、ｐＨ７．０と比べてｐＨ４．６で溶解度が低いことが分かっており、ホエイタンパク質組成物の変性の度合いを、ｐＨ７．０でのタンパク質の総量に対するｐＨ４．６での可溶性タンパク質の量を測定することにより決定する。
より具体的には、分析するホエイタンパク質組成物（例えば、粉末または水溶液）を、
－ ５．０％（重量／重量）の総タンパク質を含みかつｐＨが７．０である第１の水溶液、および
－ ５．０％（重量／重量）の総タンパク質を含みかつｐＨが４．６である第２の水溶液
に変換する。
３％（重量／重量）のＮａＯＨ（水性）または５％（重量／重量）ＨＣｌ（水性）を使用してｐＨ調整を行う。
第１の水溶液の総タンパク質含有量（ＰｐＨ７．０）を実施例９．２に従って決定する。
第２の水溶液を室温で２時間にわたり保管し、それに続いて５分にわたり３０００ｇで遠心分離する。上清の試料を回収し、実施例９．２に従って分析して総タンパク質（ＳｐＨ４．６）を決定する。
ホエイタンパク質組成物のタンパク質変性の度合いＤを、
Ｄ＝（（ＰｐＨ７．０－ＳｐＨ４．６）／ＰｐＨ７．０）＊１００％
として算出する。
実施例９．１２：粉末中における乾燥ＢＬＧ結晶の検出
粉末中における乾燥したＢＬＧ結晶の存在を下記の方法で確認し得る：
分析する粉末の試料を再懸濁させ、温度が４℃である脱塩水と水２部対粉末１部の重量比で緩やかに混合し、４℃で１時間にわたり再水和させる。
再水和した試料を、好ましくは複屈折を検出するために平面偏光を使用して、結晶の存在を確認するために顕微鏡で調べる。
結晶様物質を分離し、Ｘ線結晶構造解析にかけて、結晶構造の存在を検証し、および好ましくは同様に結晶格子（空間群および単位格子の寸法）がＢＬＧ結晶のものと対応するかを検証する。
分離した結晶様物質の化学組成を分析して、この結晶様物質の固体が主にＢＬＧからなることを検証する。
実施例１０：ＵＦベースの動的クロスフローろ過による結晶化
透析ろ過をｐＨ５．９２で実行し、最終ＴＳが２０％であることを除いて、結晶化タンクのための原材料を、実施例１で説明したように調製した。
原材料を用意した後（この原材料の組成を表１５に見ることができる）、この原材料を３００Ｌの結晶化タンクに移し、ｐＨを最初にｐＨ５．８０に調整し、温度を１０～１２℃で保持した。ｐＨ調整後、実施例１で説明したのと同じ方法で製造されているが、非自発的な結晶化製造に由来する播種材料を添加した。この原材料に原材料１リットル当たり播種材料０．５ｇの濃度まで播種材料を播種した。播種後、冷却マントルの温度を５℃に設定し、ｐＨを５．５０に緩やかに調整し、混合物を約１時間にわたり結晶化させ、その後、図２６に示すように、この結晶化タンクにＤＣＦ（動的クロスフローろ過）ユニットを接続した。このＤＣＦユニットに、孔径が５００ｎｍであるＫｅｒａｆｏｌセラミック膜を取り付け、ＴＭＰ（膜透過圧）を０．４バールに設定し、この膜の回転速度は、３２Ｈｚであった。
ＤＣＦからの保持液を結晶化タンクに戻し、透過液を、４６ミルスペーサーを有するＫｏｃｈ ＨＦＫ－３２８型膜を備えたＵＦ（限外ろ過）ユニット中の原材料として使用した。ＵＦユニットでは、温度が上昇するが、１２℃を超えない。添加した透析ろ過水の量を、ＵＦから出て結晶化タンクに戻る保持液が約２１％ＴＳとなるように調整し、ミネラルを母液（ＭＬ）から除去した。
ＭＬの透析ろ過を、透過液と透析ろ過水との導電率の差が５０マイクロＳ／ｃｍ未満となるまで続けた。この時点で、透析ろ過水の量を、保持液が約３０％ＴＳとなるように調整した。ＢＬＧを結晶として取り出した場合、ＭＬ中のＴＳの量は、減少し、ＢＬＧ結晶化中の他タンパク質の濃度は、調査している範囲内でのＢＬＧの溶解度への影響があったとしても限定されていると思われることから、過剰な水およびミネラルをこのように連続除去することにより、全収率を高めることが可能となる。
ＤＣＦからのＭＬ透過液の組成を表１６に見ることができる。原材料の最初の３００Ｌは、ＭＬ約１００Ｌまで減少していた。質量保存に基づいてＢＬＧの相対収率を９２％と算出した。
Figure 2022188055000019
Figure 2022188055000020
結論：
ＢＬＧ結晶化が起こるマトリックスから過剰なミネラルおよび水を連続除去することにより、ＢＬＧの収率は、有意に改善され得、このプロセスを低温で実行し得る。
実施例１１：様々なホエイタンパク質製品のタンパク質変性の度合い
市販品および本発明の４種の食用ＢＬＧ組成物のタンパク質変性の度合いを比較した。試料を下記で説明する。
Figure 2022188055000021
試料Ｂ～Ｅを下記の方法で調製した：
実施例１２で説明されるように結晶スラリーを調整し、実施例７で説明したように分離した。一部の分離されたＢＬＧスラリーを取り出し、４分割した。
試料Ｂ：３％のＮａＯＨを使用してＢＬＧ結晶スラリーのｐＨを７．０１に調整することにより、分離したＢＬＧ結晶スラリーの第１の部分を全く乾燥させることなく再溶解させ、次いで試料をＢｘ６まで希釈して、約５％のタンパク質溶液を作った。
試料Ｃ：分離したＢＬＧ結晶スラリーの第２の部分を凍結乾燥させた。次いで、この粉末を洗練水に再懸濁させ、３％のＮａＯＨを使用してｐＨを７．０９に調整し、次いで試料をＢｒｉｘ６まで希釈して、約５％のタンパク質溶液を作った。
試料Ｄ：３％のＮａＯＨを使用してｐＨを７．０に調整することにより、分離したＢＬＧ結晶スラリーの第３の部分を再溶解させ、次いで凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥した粉末を洗練水に再懸濁させ、ｐＨを測定したところ７．０７であった。次いで、試料をＢｒｉｘ６まで希釈して、約５％のタンパク質溶液を作った。
試料Ｅ：分離したＢＬＧ結晶スラリーの第４の部分を、実施例７で説明したように処理して噴霧乾燥させた。次いで、粉末を洗練水に再懸濁させ、３％のＮａＯＨを使用してｐＨを７．０４に調整した。次いで、試料をＢｒｉｘ６まで希釈して、約５％のタンパク質溶液を作った。
各試料のタンパク質変性の度合いを実施例９．１１に従って決定し、結果を表１７に示す。
Figure 2022188055000022
結論：
乾燥方法にかかわらず、本発明の食用ＢＬＧ組成物は、タンパク質変性の度合いが驚くほど低く、比較に使用した市販のＷＰＩで見られるもののわずか１０分の１である。噴霧乾燥したＢＬＧ結晶スラリー製品は、依然として全てのタンパク質の変性の度合いが最低であることが特に驚くべきことである。
実施例１２：動的クロスフローろ過による結晶の分離
標準的なチーズ製造プロセス由来のスイートホエイに由来し、１．２ミクロンのフィルタに通してろ過された、ラクトースが枯渇したＵＦ保持液を、結晶化プロセスの原材料として使用した。このスイートホエイ原材料は、１０％ＴＳ（総固形物）±５の原材料濃度および透析ろ過媒体としての洗練水（最大０．０５ｍＳ／ｃｍの導電率を得るために逆浸透によりろ過された水）を使用する、供給圧が１．５～３．０バールである４６ミルスペーサーを備えたＫｏｃｈ ＨＦＫ－３２８型膜を使用する限外ろ過設定を必要条件とした。限外ろ過中の原材料および保持液の温度は、約１２℃であった。次いで、ＨＣｌを添加して約５．６０のｐＨを得ることにより、ｐＨを調整した。この保持液の導電率が１．３０ｍＳ／ｃｍ未満であるまで透析ろ過を続けた。次いで、この原材料を２５℃まで加熱した後、この保持液を約２７％ＴＳ（濃縮保持液の総重量に対して約２１％の総タンパク質）まで濃縮した。透過液の導電率は、濃縮の最後で０．３３ｍＳ／ｃｍであった。この濃縮保持液の試料を５分にわたり３０００ｇで遠心分離したが、目に見えるペレットは形成されなかった。
この濃縮保持液を３００Ｌの結晶化タンクに移し、この濃縮保持液を約６℃まで冷却し、緩やかに撹拌しつつ、一晩この温度で保持した。翌朝、この保持液は結晶化していた。５分にわたる３０００ｇでの遠心分離により母液と結晶とを分離し、上清およびペレットの試料をＨＰＬＣ分析のために採取した。このプロセスからのＢＬＧの収率を６７％と算出した。
３００Ｌのタンクからの結晶スラリーを、孔径が５００ｎｍである１枚のディスク膜を使用するＡｎｄｒｉｔｚ ＤＣＦ １５２Ｓシステムでの原材料に使用した。ろ過を８℃で行い、回転速度は、３２Ｈｚであり、膜間圧は、０．４バールであった。このシステムは、保持液が連続的に除去されるであろう大型ユニットと異なり、保持液がろ過チャンバ中に蓄積されるデッドエンドろ過として機能する。このろ過を、ろ過チャンバ中に蓄積された固体がろ過に影響を及ぼすようになり始めたちょうど４０分をかけて安定した方法で行った。
ＤＦＣの操作中、結晶質量の量は、有意に増加した。
結論．
ＤＣＦは、ＭＬから結晶を分離するための安定したかつ効率的な手段を提供する。必要に応じて、このＤＣＦに洗浄液を加えることができた。
実施例１３：ろ過遠心分離機を使用する結晶の分離
実施例１２と同一の原材料および同一の結晶化プロセスを使用して、孔径が約２０マイクロメートルであるろ紙を取り付けたＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＨＺ ２５／０．１で分離を試験した。
試験１：原材料４Ｌを、６０ｇで実行するフィルタ遠心分離機に供給した。全ての原材料を添加した後、この遠心分離機を２５０ｇに加速させてフィルタケーキを乾燥させた。このケーキは、４７．６％のＴＳを含んでおり、このケーキの組成を表１８に示す。
洗浄後、この遠心分離機に６０ｇで上記と同一の原材料７Ｌを供給した。次いで、この遠心分離機を２５０ｇまで加速させて約５分にわたり脱水し、その後、再度６０ｇまで減速させ、洗練水０．２５Ｌを添加して洗浄した。洗浄水を添加した後、この遠心分離機を再度２５０ｇまで加速させて脱水した。ケーキのＴＳを測定したところ４７％であった。このケーキを図２７Ａに示す。このケーキ、ＭＬ画分および洗浄後の洗浄液の組成を表１８に示す。このケーキを脱水した後、遠心分離機の側面から剥がそうと試みたが、図２７Ｃに示すように、最上層はくすぶり、意図したチューブを通って落ちたが、下層は、図２７Ｂに示すように、適切に剥がれるには湿り気が多くて粘着性が高かった。
Figure 2022188055000023
結論：
フィルタ遠心分離機は、たとえ洗浄しなくてもＡＬＡおよびＣＭＰが定量に必要なレベルを下回るほど純粋であるＢＬＧケーキを得るための興味深い選択肢を提供する。表１８中の洗浄水のタンパク質の組成により分かるように、フィルタケーキに適用される洗浄媒体の量がたとえ少量であっても、このケーキ中のミネラル含有量をさらに低下させ得る。使用した洗浄水から分かるように、ケーキの非ＢＬＧタンパク質の含有量も洗浄により低下する。使用した洗浄水は、フィルタケーキ中の比と比べて大きいＡＬＡ：ＢＬＧの比を含む。これは、洗浄するステップがＢＬＧと比べてＡＬＡ（およびおそらく他の非ＢＬＧタンパク質）を除去する傾向が大きいことを示す。
製造されたフィルタケーキは、剥離性ではなかったが、依然として透過性であった。これにより、フィルタケーキの含水量を上層のように隔離可能な程度まで低下させるために、所与の温度で乾燥ガスを加えるという選択肢が可能となる。代わりに、サイフォン遠心分離方式の設定で水溶液中の適切な量の酸、塩基または塩を添加することにより、この遠心分離機内でフィルタケーキを再溶解させ得た。
実施例１４：ホエイタンパク質溶液のミネラルの組成の影響
この実施例では、ＢＬＧの収率への一価の金属陽イオンと二価の金属陽イオンとの間のモル比の影響を調べた。
下記の２種の試料を比較した：
試料Ａ：過重量のＮａ＋（供給源：Ｎａ２ＳＯ４）を有する
試料Ｂ：過重量のＣａ２＋（供給源：ＣａＳＯ４）を有する。
実施例１で使用したのと同種の原料を２．５％の硫酸で調整した。試料のｐＨを約ｐＨ５．４に調整し、正確なｐＨを表２０で報告する。各試料の元の体積は、２５０ｍＬであった。これら２種の試料を冷洗練水 約２４Ｌに対して別の２４Ｌの容器中で透析した。全ての透析プロセスに関して、透析チューブＯｒＤｉａｌ Ｄ－Ｃｌｅａｎ ＭＷＣＯ ３５００（品番６３０３４４０５）を使用した。この容器を透析プロセス中に連続的に撹拌し、透析を４℃の冷却器中で行った。１回目の透析を一晩行った。
１回目の透析後に過剰なイオンを除去するために、透析バッグを、塩溶液２Ｌが入った容器に移した。濃度は、下記のとおりであった：
試料Ａ：Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）０．０５９Ｍ、
試料Ｂ：ＣａＳＯ４（硫酸カルシウム）０．０５９Ｍ。
１回目の塩透析を一晩行った。１回目の塩透析後の導電率、ｐＨおよびＢｒｉｘを表２０で報告する。塩溶液を新鮮なものに変え、透析を週末にかけて続けた。
２回目の塩透析後、チューブを、冷洗練水 約２４Ｌが満たされた２４Ｌの容器に移し、一晩透析して過剰なイオンを除去した後に結晶化させた。
最後の透析ステップ後、タンパク質濃度は、好ましい濃度と比べて少し低かった。従って、１０ｋＤａのカットオフ膜および７５ｍＬ／時間で作動する蠕動ポンプを使用するＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ＵＦ実験室設定で試料を濃縮した。試料のミネラル含有量を原料と一緒に表１９に示す。
次いで、試料に、既に説明した播種材料０．５ｇ／Ｌを播種し、一晩４℃で結晶化させた。次いで、翌日、結晶沈殿物が全ての試料で見られた。各試料のＨＰＬＣ試料を、５分にわたり３０００ｇで各試料を遠心分離することにより調製し、続いて上清の試料を分析した。結果を表２１に示す。
Figure 2022188055000024
Figure 2022188055000025
Figure 2022188055000026
結論：
表２１から、一価の陽イオンと二価の陽イオンとの高モル比が回避される場合、より少ない残留量のＢＬＧが母液に残る（および高収率の分離されたＢＬＧ結晶が得られる）ことが実証される。一価の陽イオンと二価の陽イオンとの間のモル比（実際にはＮａ＋Ｋ対Ｃａ＋Ｍｇ）を制御して、本方法のＢＬＧの収率を改善し得る。
図１は、スイートホエイをベースとする粗ホエイタンパク質溶液（実線）および結晶化後に得られた母液（破線）の２つの重ね合わせたクロマトグラムを示す。実線と破線との間の差異は、取り出されたＢＬＧ結晶に起因する。 図２は、実施例１から回収したＢＬＧ結晶の顕微鏡写真である。 図３は、実施例１から回収したＢＬＧ結晶のクロマトグラムである。 図４は、ホエイタンパク質溶液の導電率と、回収したＢＬＧ結晶の得られた収率との間の関係のプロットである。 図５は、ホエイタンパク質溶液の温度および導電率と、回収したＢＬＧ結晶の得られた収率との間の関係のプロットである。 図６は、ホエイタンパク質溶液の総タンパク質含有量（このタンパク質含有量に比例するＢｒｉｘ度により間接的に示される）と、回収したＢＬＧ結晶の得られた収率との間の関係を示す。 図７は、実施例３の原材料（ｆｅｅｄ）１（実線）ならびに結晶化およびＢＬＧ結晶の取り出し後に得られた母液（破線）のクロマトグラムを示す。 図８は、実施例３の原材料１の結晶化の初期段階中に採取した試料の顕微鏡写真である。 図９は、実施例３の原材料１の結晶化の完了後に採取した試料の顕微鏡写真である。 図１０は、実施例３の原材料１から得られた洗浄したＢＬＧ結晶のクロマトグラムを示す。 図１１は、実施例３の原材料２（実線）ならびに結晶化およびＢＬＧ結晶の取り出し後に得られた母液（破線）のクロマトグラムを示す。 図１２は、結晶化前（左側の写真）および後（右側の写真）の実施例３の原材料２の写真を示す。 図１３は、実施例３の原材料２から得られたＢＬＧ結晶（全体よび断片の両方）の顕微鏡写真を示す。 図１４は、ＢＬＧ結晶スラリーの導電率の上昇またはｐＨの変更によりＢＬＧ結晶が溶解することを示す。 図１５は、ＢＬＧ結晶スラリーの導電率の上昇またはｐＨの変更によりＢＬＧ結晶が溶解することを示す。 図１６は、実施例３の原材料２由来のＢＬＧ結晶の単離ペレットのクロマトグラムを示す。 図１７は、実施例３の原材料３のタンパク質（実線）および得られた母液（破線）のクロマトグラムを示す。 図１８は、実施例３の原材料３から回収したＢＬＧ結晶の顕微鏡写真である。 図１９は、いかなる洗浄ステップも伴わない実施例３の原材料３の回収したＢＬＧ結晶のクロマトグラムを示す。 図２０は、回収したＢＬＧ結晶の収率への導電率の増加の影響を示す。 図２１は、４．２０ｍＳ／ｃｍの導電率で形成されたＢＬＧ結晶の顕微鏡写真を示す。 図２２は、ＳＰＣベースのホエイタンパク質溶液の結晶化の初期段階からのＢＬＧ結晶の顕微鏡写真を示す。 図２３は、標準的なホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）の嵩密度と、ＢＬＧ結晶を含む本発明の高純度ＢＬＧ組成物の嵩密度との差異を示す。 図２４は、実施例３、原材料１のＢＬＧ結晶が母液から分離されているスピンフィルタの写真である。 図２５は、実施例８の６種の低リン飲料試料の部分試料の写真である。左から右に、部分試料は、試料Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦである。 図２６は、母液からのＢＬＧ結晶の分離のためにＤＣＦを使用する、実施例１０の結晶化プロセスの変形形態を示す概略図である。 図２７は、フィルタ遠心分離器を使用したＢＬＧ結晶と母液との分離から得られたフィルタケーキの３枚の写真を示す。

Claims (42)

  1. 結晶化形態および／または単離形態でベータ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）を含む食用組成物を調製する方法において、
    ａ）ＢＬＧおよび少なくとも１種の追加のホエイタンパク質を含むホエイタンパク質溶液を提供するステップであって、前記ホエイタンパク質溶液は、
    － ＢＬＧに関して過飽和であり、かつ５～６の範囲のｐＨを有し、
    － 最大９０％（重量／重量）の量でＢＬＧを含む、ステップと、
    ｂ）好ましくは塩溶モードにおいて、前記過飽和ホエイタンパク質溶液中でＢＬＧを結晶化させるステップと、
    ｃ）任意選択で、前記残存するホエイタンパク質溶液からＢＬＧ結晶を分離するステップと
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、ＢＬＧ結晶、例えばステップｃ）から得られた前記分離された結晶を洗浄するステップｄ）をさらに含むことを特徴とする方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法において、ＢＬＧ結晶、例えばステップｃ）またはｄ）から得られた前記ＢＬＧ結晶を再結晶化させるステップｅ）をさらに含むことを特徴とする方法。
  4. 請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に由来するＢＬＧ含有組成物を乾燥させるステップｆ）をさらに含むことを特徴とする方法。
  5. 請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法において、ステップａ）の前記ホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５％（重量／重量）のＡＬＡを含むことを特徴とする方法。
  6. 請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、ステップａ）の前記ホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５％（重量／重量）の追加のホエイタンパク質を含むことを特徴とする方法。
  7. 請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、ステップａ）の前記ホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１％（重量／重量）のＢＬＧを含むことを特徴とする方法。
  8. 請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、ステップａ）の前記ホエイタンパク質溶液は、前記ホエイタンパク質溶液の重量に対して少なくとも０．４％（重量／重量）のＢＬＧを含むことを特徴とする方法。
  9. 請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法において、前記ホエイタンパク質溶液は、乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物および／またはホエイタンパク質単離物を含むことを特徴とする方法。
  10. 請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法において、前記ホエイタンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大０．３であることを特徴とする方法。
  11. 請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法において、前記ホエイタンパク質溶液のＵＦ透過液の導電率は、最大７ｍＳ／ｃｍであることを特徴とする方法。
  12. 請求項１乃至１１の何れか１項に記載の方法において、前記過飽和ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質原材料を下記の調整：
    － ｐＨを調整すること、
    － 導電率を減少させること、
    － 温度を低下させること、
    － タンパク質濃度を増加させること、および
    － 水分活性を減少させる薬剤を添加すること
    の１つまたは複数にかけることによって調製されることを特徴とする方法。
  13. 請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法において、前記ホエイタンパク質溶液の前記調製は、前記ホエイタンパク質原材料のｐＨを調製することを伴うことを特徴とする方法。
  14. 請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、前記ホエイタンパク質溶液の前記調製は、前記ホエイタンパク質原材料の導電率を減少させることを伴うことを特徴とする方法。
  15. 請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法において、前記ホエイタンパク質の前記調製は、前記ホエイタンパク質原材料の温度を低下させることを伴うことを特徴とする方法。
  16. 請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、前記ホエイタンパク質溶液の前記調製は、前記ホエイタンパク質原材料の総タンパク質濃度を増加させることを伴うことを特徴とする方法。
  17. 請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法において、ステップｂ）のＢＬＧの結晶化は、下記：
    － 結晶化が起こるのを待つこと、
    － 結晶化種の添加、
    － ＢＬＧの過飽和度の度合いをさらに増加させること、および／または
    － 機械的刺激
    の１つまたは複数を伴うことを特徴とする方法。
  18. 請求項１乃至１７の何れか１項に記載の方法において、ステップｃ）は、前記ＢＬＧ結晶を少なくとも３０％（重量／重量）、好ましくは少なくとも４０％（重量／重量）、さらにより好ましくは少なくとも５０％（重量／重量）の固形分まで分離することを含むことを特徴とする方法。
  19. 請求項２乃至１９の何れか１項に記載の方法において、ステップｄ）における前記洗浄は、前記ＢＬＧ結晶を完全に溶解させることなく、前記分離されたＢＬＧ結晶を洗浄液と接触させ、かつ続いて前記残存するＢＬＧ結晶を前記洗浄液から分離することを伴うことを特徴とする方法。
  20. 請求項１９に記載の方法において、ステップｄ）の前記洗浄は、ＢＬＧ結晶の最初の量の最大８０％（重量／重量）、好ましくは最大５０％（重量／重量）、さらにより好ましくはＢＬＧ結晶の最初の量の最大２０％（重量／重量）を溶解させることを特徴とする方法。
  21. 請求項３乃至２０の何れか１項に記載の方法において、前記再結晶ステップは、
    － 前記分離されたＢＬＧ結晶を再結晶液に溶解させること、
    － 前記再結晶液を調整して、ＢＬＧに関して過飽和を得ること、
    － 前記過飽和の調整された再結晶液中でＢＬＧを結晶化させること、および
    － 前記残存する調整された再結晶液からＢＬＧ結晶を分離すること
    を伴うことを特徴とする方法。
  22. 請求項３乃至２１の何れか１項に記載の方法において、ステップｄ）のＢＬＧ結晶は、少なくとも２回再結晶化されることを特徴とする方法。
  23. 請求項４乃至２２の何れか１項に記載の方法において、前記乾燥ステップは、噴霧乾燥、凍結乾燥、スピンフラッシュ乾燥機、回転乾燥および／または流動床乾燥の１つまたは複数を伴うことを特徴とする方法。
  24. 食用ＢＬＧ組成物において、請求項１乃至２３の何れか１項に記載の１つまたは複数のプロセスによって得ることができることを特徴とする食用ＢＬＧ組成物。
  25. 食用ＢＬＧ組成物において、総固形物に対して少なくとも９０％（重量／重量）のＢＬＧを含むことを特徴とする食用ＢＬＧ組成物。
  26. 請求項２５に記載の食用ＢＬＧ組成物において、少なくとも１０％のＢＬＧの結晶化度を有することを特徴とする食用ＢＬＧ組成物。
  27. 請求項２４乃至２６の何れか１項に記載の食用ＢＬＧ組成物において、タンパク質の総量に対して最大９０％（重量／重量）のＢＬＧを含み、かつ少なくとも１０％のＢＬＧの結晶化度を有することを特徴とする食用ＢＬＧ組成物。
  28. 請求項２４乃至２７の何れか１項に記載の食用ＢＬＧ組成物において、乾燥組成物であることを特徴とする食用ＢＬＧ組成物。
  29. 請求項２８に記載の乾燥ＢＬＧ組成物において、少なくとも０．４ｇ／ｍＬの嵩密度を有する粉末、好ましくは噴霧乾燥粉末の形態であることを特徴とする乾燥ＢＬＧ組成物。
  30. 請求項２８または２９に記載の乾燥ＢＬＧ組成物において、
    － タンパク質の総量に対して少なくとも２０％（重量／重量）のＢＬＧ、および
    － 少なくとも１０％のＢＬＧの結晶化度
    を含むことを特徴とする乾燥ＢＬＧ組成物。
  31. 請求項２４乃至２７の何れか１項に記載の食用ＢＬＧ組成物において、液体組成物であることを特徴とする食用ＢＬＧ組成物。
  32. 請求項２４乃至３１の何れか１項に記載の食用ＢＬＧ組成物において、低ミネラル組成物であることを特徴とする食用ＢＬＧ組成物。
  33. 請求項２４乃至３２の何れか１項に記載の食用ＢＬＧ組成物において、低リン組成物であることを特徴とする食用ＢＬＧ組成物。
  34. 請求項２４乃至３３の何れか１項に記載の食用ＢＬＧ組成物の使用において、食品成分としてのものであることを特徴とする使用。
  35. 請求項２４乃至３３の何れか１項に記載の低リンの食用ＢＬＧ組成物の使用において、低リン食品の製造における食品成分としてのものであることを特徴とする使用。
  36. 食品において、請求項２４乃至３３の何れか１項に記載の食用ＢＬＧ組成物と、例えば脂肪および／または炭水化物の供給源等の少なくとも追加の成分とを含むことを特徴とする食品。
  37. 請求項３６に記載の食品において、炭水化物およびタンパク質を含む乾燥食品であり、前記乾燥食品は、少なくとも１％（重量／重量）のＢＬＧを含み、
    ｉ）前記ＢＬＧは、少なくとも１０％の結晶化度を有し、および／または
    ｉｉ）タンパク質の総量の少なくとも９０％（重量／重量）は、ＢＬＧによって構成されることを特徴とする食品。
  38. 請求項３６または３７に記載の食品において、タンパク質１００ｇ当たり最大８０ｍｇのリンを含む低リン食品であることを特徴とする食品。
  39. 請求項３６乃至３８の何れか１項に記載の食品において、乳製品、キャンディ、飲料、プロテインバーまたは経腸栄養組成物であることを特徴とする食品。
  40. 請求項３６乃至３９の何れか１項に記載の食品において、
    － 少なくとも１％（重量／重量）のＢＬＧの総量を提供するための、請求項２４乃至３３の何れか１項に記載の食用製品、
    － 甘味料、
    － 少なくとも１種の食用酸、
    － ２．５～４．０の範囲のｐＨを有すること、および
    － タンパク質１００ｇ当たり最大８０ｍｇのリン
    を含む飲料の形態であることを特徴とする食品。
  41. 単離ＢＬＧ結晶において、斜方晶の空間群Ｐ２１２１２１ならびに単位格子の寸法ａ＝６８．６８（±５％）Å、ｂ＝６８．６８（±５％）Åおよびｃ＝１５６．６５（±５％）Åを有し、かつ単位格子の整数角α＝９０°、β＝９０°およびγ＝９０°を有することを特徴とする単離ＢＬＧ結晶。
  42. 請求項４１に記載の単離ＢＬＧ結晶において、少なくとも２０％（重量／重量）のＢＬＧおよび最大約８０％（重量／重量）の水を含むことを特徴とする単離ＢＬＧ結晶。
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