ES2876941T3 - Producción de preparaciones de beta-lactoglobulina - Google Patents
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Abstract
Método de preparación de una composición comestible que comprende beta-lactoglobulina (BLG) en forma cristalizada, comprendiendo el método las etapas de a) proporcionar una disolución de proteína de lactosuero que comprende BLG y al menos una proteína de lactosuero adicional, dicha disolución de proteína de lactosuero: - está sobresaturada con respecto a BLG y tiene un pH en el intervalo de 5-6, - comprende BLG en una cantidad de como máximo el 85% p/p en relación con la cantidad total de proteína, y en el que: - la disolución de proteína de lactosuero tiene una conductividad de como máximo 5 mS/cm, o - la razón entre la conductividad expresada en mS/cm y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero expresada en % en peso total de proteína en relación con el peso total de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 0,3, b) cristalizar BLG en la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada en modo de disolución de proteínas por adición de sal, y c) opcionalmente, separar los cristales de BLG a partir de la disolución de proteína de lactosuero restante.
Description
DESCRIPCIÓN
Producción de preparaciones de beta-lactoglobulina
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo método de producción de composiciones que contienen betalactoglobulina cristalizada.
Antecedentes de la invención
El concepto de fraccionamiento de proteínas de la leche es bien conocido en la técnica y se ha desarrollado durante las últimas décadas en una serie de tecnologías para preparar composiciones enriquecidas con diversas especies de proteínas de la leche, teniendo cada una propiedades y características específicas.
El aislamiento de beta-lactoglobulina (BLG) a partir de suero de leche o lactosuero es el tema de varias publicaciones e implica normalmente múltiples etapas separación y, a menudo, técnicas cromatográficas para llegar a un producto de beta-lactoglobulina purificado.
Por ejemplo, de Jongh et al. (Mild Isolation Procedure Discloses New Protein Structural Properties of p-Lactoglobulin, J Dairy Sci., vol. 84(3), 2001, páginas 562-571) describieron la purificación de BLG a partir de leche recién ordeñada por coagulación ácida a baja temperatura de caseína y sometiendo el lactosuero ácido obtenido a una combinación de cromatografía de afinidad (DEAE Sepharose) y cromatografía de permeación en gel. Se indicó que la composición de BLG obtenida contenía 0,985 g de beta-lactoglobulina por 1 g de proteína.
Slack et al. (Journal of Food Processing and Preservation, vol. 10, 1986, páginas 19-30) exploraron un enfoque diferente y prepararon precipitados enriquecidos en BLG ajustando el pH de lactosuero ácido desmineralizado y lactosuero dulce a pH 4,65 y separando el precipitado formado mediante centrifugación y decantación. Los sedimentos de precipitado obtenidos se describieron como relativamente insolubles y que contenían una cantidad significativa de impurezas de proteínas en la BLG adicional. No se observó formación de cristales. Cabe señalar que los precipitados de BLG que pueden formarse a pH 4,65 no son cristales de BLG.
Palmer (Crystalline Globulin from Cow's Milk, J. Biol. Chem., vol. 104, 1934, páginas 359-372) notificó un procedimiento laborioso y que requería mucho tiempo para producir cristales de proteínas basándose en lactosuero ácido usando varias secuencias de precipitación de sales de proteínas no deseadas, ajustes de pH y diálisis para retirar otras proteínas no deseadas. Finalmente, cuando se había obtenido una disolución de BLG altamente purificada, se cristalizó la BLG. El procedimiento duró más de 12 días y requirió la adición de tolueno. Por tanto, los procedimientos dados a conocer por Palmer son incompatibles con la producción segura de alimentos y proporciona productos que son claramente no comestibles.
Aschaffenburg et al. (Improved Method for the Preparation of Crystalline beta-Lactoglobulin y alpha-Lactalbumin from Cow's Milk, Bioch., vol. 65, 1957, páginas 273-277) dan a conocer un procedimiento mejorado en relación con el procedimiento del procedimiento de Palmer, mejora que permite la preparación de cristales de beta-lactoglobulina en el orden de unos pocos días en vez de semanas. Sin embargo, el método mejorado requiere todavía la retirada de proteínas no deseadas antes de la cristalización y emplea además tolueno para la cristalización, lo que lo hace incompatible con la producción segura de alimentos.
El documento JP H10 218755 A da a conocer la producción de composiciones cosméticas que contienen un inhibidor de la producción de melanina que comprende BLG como principio activo. Por ejemplo, el documento sugiere además que la BLG puede aislarse mediante el siguiente procedimiento: se añade ácido clorhídrico a la leche para precipitar la caseína seguido por filtración para obtener el lactosuero. Se ajusta el pH del lactosuero a 6,0 y se añade a sulfato de amonio en una cantidad de semisaturación; se retira la proteína precipitada mediante precipitación de proteínas por adición de sal y se recupera un filtrado. Se satura el filtrado con sulfato de amonio y se recupera la proteína precipitada. Se vuelve a disolver la proteína recuperada en agua y se dializa a pH 5,2 para separar los cristales, y se prepara p-lactoglobulina en una proporción de aproximadamente 1,8 g a partir de 1 l de lactosuero. Sin embargo, las etapas del procedimiento general del procedimiento propuesto descrito en el documento JP H10 218755 A son insuficientes para conducir a la formación de cristales de BLG. Por tanto, el documento no contiene una divulgación que permita la cristalización de BLG o de cristales de BLG.
El documento US 2 790 790 da a conocer un procedimiento para la precipitación de proteínas a partir de una disolución, y más particularmente para la precipitación fraccionada de proteínas relativamente no conjugadas a partir de una disolución acuosa mediante el uso de cloruro de sodio como precipitante. Se sugiere que el procedimiento es útil para aislar BLG mediante precipitación inducida por NaCI a pH 3,6-3,8. En el ejemplo II del documento se sugiere que el precipitado de NaCI puede dializarse de la manera habitual para formar p-lactoglobulina cristalina. Sin embargo, el documento US 2 790 790 no demuestra que la formación de cristales de BLG a pH 3,6-3,8 sea realmente posible y no contiene ninguna referencia al significado de “la manera habitual” de dializar un precipitado
de BLG. Por tanto, el documento no contiene una divulgación que permita la cristalización de BLG o de cristales de BLG.
Larson et al. (B. L. Larson y D. C. Gillespie, Origin of the major specific proteins of milk, J. Biol. Chem., 1957, 227: 565-573) dan a conocer un método de fraccionamiento de proteína de lactosuero en dos etapas de precipitación inducida por sulfato de amonio. El método implica además la cristalización de BLG en una disolución de BLG altamente purificada y emplea tolueno durante la diálisis y, por tanto, no produce un producto que sea aceptable como producto alimenticio comestible.
Sumario de la invención
Por accidente, los presentes inventores hicieron el sorprendente descubrimiento de que pueden prepararse cristales de BLG altamente puros directamente en una disolución de proteína de lactosuero en bruto que contiene cantidades significativas de otras proteínas de lactosuero además de BLG y sin el uso de disolventes orgánicos tales como el tolueno. Esto es contrario al conocimiento general común en la técnica que enseña que las proteínas deben estar altamente purificadas antes de que pueda esperarse su cristalización, y no todas las proteínas pueden cristalizarse. Este descubrimiento tiene el potencial de cambiar la manera en que se manipula y fracciona la proteína de lactosuero en la industria lechera y facilita una producción eficiente y en condiciones suaves de BLG altamente purificada que es segura para su uso como ingrediente alimentario.
Por tanto, la invención se refiere a un método de preparación de una composición comestible que comprende betalactoglobulina (BLG) en forma cristalizada, comprendiendo el método las etapas de
a) proporcionar una disolución de proteína de lactosuero que comprende BLG y al menos una proteína de lactosuero adicional, dicha disolución de proteína de lactosuero está sobresaturada con respecto a BLG y tiene un pH en el intervalo de 5-6, y comprende BLG en una cantidad de como máximo el 85% p/p en relación con la cantidad total de proteína,
y en el que:
- la disolución de proteína de lactosuero tiene una conductividad de como máximo 5 mS/cm, o
- la razón entre la conductividad (expresada en mS/cm) y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero (expresada en % en peso total de proteína en relación con el peso total de la disolución de proteína de lactosuero) es de como máximo 0,3,
b) cristalizar BLG en la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada en modo de disolución de proteínas por adición de sal, y
c) opcionalmente, separar los cristales de BLG a partir de la disolución de proteína de lactosuero restante. Los presentes inventores han hallado además que las composiciones de proteína de lactosuero comestibles en forma de polvo que contienen cristales de BLG tienen densidades aparentes significativamente mayores que las composiciones comparables de la técnica anterior. Esto es ventajoso ya que facilita la manipulación del polvo y lo hace menos pulverulento.
Por tanto, el método de la invención puede proporcionar una composición comestible que comprende betalactoglobulina en forma cristalizada, que puede obtenerse, por ejemplo, mediante uno o más métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, la composición comestible puede ser un polvo que contiene cristales de BLG y que tiene una densidad aparente de al menos 0,40 g/ml. Alternativamente, la composición comestible puede ser una suspensión líquida o suspensión espesa que contiene cristales de BLG.
En el contexto de la presente invención, un producto seco tal como, por ejemplo, un polvo que comprende “cristales de BLG” contiene el producto obtenido a partir del secado de una suspensión de cristales de BLG y la estructura cristalina de los cristales de BLG húmedos puede haberse distorsionado durante el procedimiento de secado y puede haber perdido, al menos parcialmente, sus características de difracción de rayos X. En la misma línea, los términos “cristal de BLG seco” y “cristal de BLG secado” se refieren a la partícula obtenida a partir del secado de un cristal de BLG húmedo y esta partícula seca no necesita tener una estructura cristalina en sí misma. Sin embargo, los presentes inventores han observado que, cuando se vuelven a suspender los cristales de BLG secados en agua desmineralizada fría (4°C) en la razón en peso de 2 partes de agua con respecto a 1 parte de cristales de BLG secados, el cristal de BLG se rehidrata y recupera sustancialmente la misma estructura cristalina (tipo de grupo espacial y dimensión de la celda unitaria) que antes del secado.
La BLG es bien conocida por ser una gran fuente de aminoácidos esenciales, incluyendo, por ejemplo, leucina, y la composición de BLG comestible proporcionada por la presente invención tiene, por tanto, varios usos nutricionales
interesantes.
También se da a conocer un cristal de BLG aislado que tiene un grupo espacial ortorrómbico P 2i 2i 2i y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 (±5%) A, b = 68,68 (±5%) A y c = 156,65 (±5%) A; y en el que el cristal tiene los ángulos integrales de la celda unitaria a=90°, p=90° y y=90°.
También se da a conocer el uso de la composición comestible, tal como se define en el presente documento, como ingrediente alimentario.
Se divulga además un producto alimenticio que comprende la composición comestible, tal como se define en el presente documento, y una fuente de grasas y/o una fuente de hidratos de carbono.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra dos cromatogramas superpuestos de una disolución de proteína de lactosuero en bruto (línea continua) basada en lactosuero dulce y las aguas madres resultantes después de la cristalización (línea discontinua). La diferencia entre las líneas continuas y discontinuas es debida a los cristales de BLG retirados.
La figura 2 es una fotografía de microscopio de los cristales de BLG recuperados del ejemplo 1.
La figura 3 es un cromatograma del cristal de BLG recuperado del ejemplo 1.
La figura 4 es un gráfico de la relación entre la conductividad de la disolución de proteína de lactosuero y el rendimiento obtenido de los cristales de BLG recuperados.
La figura 5 es un gráfico de la relación entre la temperatura y conductividad de la disolución de proteína de lactosuero y el rendimiento obtenido de los cristales de BLG recuperados.
La figura 6 ilustra la relación entre el contenido total de proteína (mostrado indirectamente por los grados Brix que es proporcional al contenido de proteína) de la disolución de proteína de lactosuero y el rendimiento obtenido de los cristales de BLG recuperados.
La figura 7 muestra cromatogramas de la alimentación 1 del ejemplo 3 (línea continua) y las aguas madres (línea discontinua) obtenidos después de la cristalización y retirada de cristales de BLG.
La figura 8 es una fotografía de microscopio de una muestra tomada durante las fases tempranas de la cristalización de la alimentación 1 del ejemplo 3.
La figura 9 es una fotografía de microscopio de una muestra tomada después de completarse la cristalización de la alimentación 1 del ejemplo 3.
La figura 10 muestra el cromatograma de cristales de BLG lavados obtenidos de la alimentación 1 del ejemplo 3. La figura 11 muestra cromatogramas de la alimentación 2 del ejemplo 3 (línea continua) y las aguas madres (línea discontinua) obtenidos después de la cristalización y retirada de cristales de BLG.
La figura 12 muestra una imagen de la alimentación 2 del ejemplo 3 antes (imagen de la izquierda) y después (imagen de la derecha) de la cristalización.
La figura 13 muestra una fotografía de microscopio de los cristales de BLG, tanto completos como fragmentados, obtenidos de la alimentación 2 del ejemplo 3.
Las figuras 14 y 15 muestran que aumentar la conductividad o alterar el pH de una suspensión de cristales de BLG provoca la disolución de los cristales de BLG.
La figura 17 muestra una imagen de la alimentación 3 del ejemplo 3 antes (imagen de la izquierda) y después (imagen de la derecha) de la cristalización.
La figura 18 es una fotografía de microscopio de los cristales de BLG recuperados de la alimentación 3 del ejemplo 3.
La figura 19 muestra un cromatograma del cristal de BLG recuperado de la alimentación 3 del ejemplo 3 sin ninguna etapa de lavado.
La figura 20 muestra el impacto del aumento de la conductividad sobre el rendimiento de los cristales de BLG recuperados.
La figura 21 es una fotografía de microscopio de cristales de BLG formados a una conductividad de 4,20 mS/cm. La figura 22 muestra una fotografía de microscopio de cristales de BLG de las fases tempranas de la cristalización de una disolución de proteína de lactosuero basada en SPC.
La figura 23 ilustra la diferencia en la densidad aparente de un aislado de proteína de lactosuero (WPI) convencional y una composición de BLG de alta pureza de la invención, cuya composición contiene cristales de BLG.
La figura 24 es una fotografía de un filtro centrífugo en el que se han separado los cristales de BLG de la alimentación 1 del ejemplo 3 a partir de las aguas madres.
La figura 25 es una fotografía de submuestras de las seis muestras de bebidas bajas en fósforo del ejemplo 8. De izquierda a derecha se muestran las submuestras A, B, C, D, E y F.
La figura 26 es una ilustración esquemática de la variante del procedimiento de cristalización del ejemplo 10 que usa DCF para la separación de los cristales de BLG a partir de las aguas madres.
La figura 27 muestra tres fotografías de la torta de filtro obtenida de la separación del cristal de BLG y las aguas madres usando una centrífuga de filtro.
Descripción detallada
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
Tal como se mencionó anteriormente, la invención se refiere a un método de preparación de una composición comestible que comprende beta-lactoglobulina (BLG) en forma cristalizada, comprendiendo el método las etapas de a) proporcionar una disolución de proteína de lactosuero que comprende BLG y al menos una proteína de lactosuero adicional, dicha disolución de proteína de lactosuero está sobresaturada con respecto a BLG y tiene un pH en el intervalo de 5-6, y comprende BLG en una cantidad de como máximo el 85% p/p en relación con la cantidad total de proteína,
y en el que:
- la disolución de proteína de lactosuero tiene un conductividad de como máximo 5 mS/cm, o
- la razón entre la conductividad (expresada en mS/cm) y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero (expresada en % en peso total de proteína en relación con el peso total de la disolución de proteína de lactosuero) es de como máximo 0,3,
b) cristalizar BLG en la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada en modo de disolución de proteínas por adición de sal, y
c) opcionalmente, separar los cristales de BLG a partir de la disolución de proteína de lactosuero restante. En el contexto de la presente invención, el término “composición comestible” se refiere a una composición que es segura para el consumo y uso humanos como ingrediente alimentario y que no contiene cantidades problemáticas de componentes tóxicos, tales como tolueno u otros disolventes orgánicos no deseados. La BLG es la proteína más predominante en lactosuero y suero de leche bovinos y existe en diversas variantes genéticas, estando las principales en la leche de vaca marcadas como A y B. La BLG es una proteína lipocalina, y puede unirse a muchas moléculas hidrófobas, lo que sugiere un papel en su transporte. También se ha demostrado que la BLG puede unirse al hierro a través de sideróforos y podría tener un papel en la lucha contra los patógenos. Falta un homólogo de BLG en la leche materna humana.
La BLG bovina es una proteína relativamente pequeña de aproximadamente 162 residuos de aminoácido con un peso molecular de aproximadamente 18,3-18,4 kDa. En condiciones fisiológicas es predominantemente dimérica, pero se disocia para dar un monómero por debajo de aproximadamente pH 3, conservando su estado nativo tal como se determina usando RMN. En cambio, la BLG también se produce en las formas de agregación tetramérica, octamérica y otras multiméricas en una variedad de condiciones naturales.
Las disoluciones de BLG pueden formar geles en diversas condiciones, cuando la estructura nativa está lo suficientemente desestabilizada como para permitir la agregación. Con calentamiento continuo a pH bajo y fuerza iónica baja, se forma un gel transparente “de hebras finas” en el que se ensamblan las moléculas de proteína para dar fibras rígidas largas.
En el contexto de la presente invención, el término “BLG” o “beta-lactoglobulina” ser refiere a BLG de especies de mamíferos, por ejemplo, en formas nativas y/o glicosiladas, e incluye las variantes genéticas que se producen de manera natural.
En el contexto de la presente invención, el término “cristal” se refiere a un material sólido cuyos constituyentes (tales como átomos, moléculas o iones) están dispuestos en una estructura microscópica altamente ordenada, formando una red cristalina que se extiende en todas las direcciones. Los cristales de BLG son cristales de proteína que contienen principalmente BLG dispuesta en una estructura microscópica altamente ordenada, formando una red cristalina que se extiende en todas las direcciones. Los cristales de BLG pueden ser, por ejemplo, monolíticos o policristalinos y pueden ser, por ejemplo, cristales intactos, fragmentos de cristales o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los fragmentos de cristal se forman cuando se someten cristales intactos a cizalladura mecánica durante el procesamiento. Los fragmentos de cristales también tienen la estructura microscópica altamente ordenada del cristal pero pueden carecer de la superficie uniforme y/o los bordes o esquinas uniformes de un cristal intacto. Véase, por ejemplo, la figura 18 para un ejemplo de muchos cristales de BLG intactos y la figura 13 para un ejemplo de fragmentos de cristales de BLG. En ambos casos, el cristal de BLG o los fragmentos de cristales pueden identificarse de manera visual como estructuras bien definidas, compactas y coherentes usando microscopía de luz. El cristal de BLG o los fragmentos de cristales son, a menudo, al menos parcialmente transparentes. Los cristales de proteína se conocen además por ser birrefringentes, y esta propiedad óptica puede usarse para identificar partículas desconocidas que tienen estructura cristalina. Por otro lado, los agregados de BLG no cristalinos aparecen como escasamente definidos y no transparentes y como grumos abiertos o porosos de tamaño irregular.
En el contexto de la presente invención, el término “cristalizar” se refiere a la formación de cristales de proteína. Por ejemplo, la cristalización puede suceder de manera espontánea o iniciarse mediante la adición de semillas de cristalización.
La composición comestible proporcionada por el método de la invención comprende BLG en forma cristalizada, y opcionalmente en forma tanto cristalizada como aislada. Una composición comestible que comprende BLG en forma aislada comprende al menos el 80% (p/p) de BLG en relación con los sólidos totales. Una composición comestible que comprende BLG en forma cristalizada comprende al menos algunos cristales de BLG, y preferiblemente una cantidad significativa de cristales de BLG.
Los cristales de BLG pueden observarse a menudo mediante microscopía y pueden alcanzar incluso un tamaño que los hace visibles a simple vista.
En el contexto de la presente invención, un líquido que está “sobresaturado” o “sobresaturado con respecto a BLG” contiene una concentración de BLG disuelta que está por encima del punto de saturación de la BLG en ese líquido en las condiciones físicas y químicas dadas. El término “sobresaturado” se conoce bien en el campo de la cristalización (véase, por ejemplo, Gerard Coquerela, “Crystallization of molecular systems from solution: phase diagrams, supersaturation and other basic concepts”, Chemical Society Reviews, págs. 2286-2300, número 7, 2014), y la sobresaturación puede determinarse mediante varias técnicas de medición diferentes (por ejemplo, mediante espectroscopía o análisis del tamaño de partícula). En el contexto de la presente invención, la sobresaturación con respecto a BLG se determina mediante el siguiente procedimiento.
Procedimiento para someter a prueba si un líquido en un conjunto específico de condiciones está sobresaturado con respecto a BLG:
a) Transferir una muestra de 50 ml del líquido que va a someterse a prueba a un tubo de centrífuga (n.° de catálogo de VWR 525-0402) que tiene una altura de 115 mm, un diámetro interno de 25 mm y una capacidad de 50 ml. Debe tenerse cuidado de mantener la muestra y las fracciones posteriores de la misma en las condiciones físicas y químicas originales del líquido durante las etapas a) - h).
b) Se centrifuga inmediatamente la muestra a 3000 g durante 3,0 minutos con un máx. de 30 segundos de aceleración y un máx. de 30 segundos de desaceleración.
c) Inmediatamente después de la centrifugación, se transfiere tanto como sea posible del sobrenadante (sin alterar el sedimento si se ha formado un sedimento) a un segundo tubo de centrífuga (mismo tipo que en la etapa a)). d) Tomar una submuestra de 0,05 ml del sobrenadante (submuestra A).
e) Añadir 10 mg de cristales de BLG (BLG pura al menos al 98% en relación con los sólidos totales) que tienen un tamaño de partícula de como máximo 200 micrómetros a un segundo tubo de centrífuga y agitar la mezcla.
f) Dejar reposar el segundo tubo de centrífuga durante 60 minutos a la temperatura original.
g) Inmediatamente después de la etapa f), centrifugar el segundo tubo de centrífuga a 500 g durante 10 minutos y
luego tomar otra submuestra de 0,05 ml del sobrenadante (submuestra B).
h) Recuperar el sedimento de la centrifugación de la etapa g), si es que lo hay, resuspenderlo en agua MilliQ e inspeccionar inmediatamente la suspensión para determinar la presencia de cristales que sean visibles mediante microscopía.
i) Determinar la concentración de BLG en las submuestras A y B usando el método expuesto en el ejemplo 9.9; los resultados se expresan como el % de BLG p/p en relación con el peso total de las submuestras. La concentración de BLG de la submuestra A se denomina Cblg,a y la concentración de BLG de la submuestra B se denomina Cblg,b. j) El líquido del que se tomó la muestra de la etapa a) estaba sobresaturado (en las condiciones específicas) si Cblg,b es menor que Cblg,a y si se observan cristales en la etapa i).
En el contexto de la presente invención, los términos “líquido” y “disolución” abarcan composiciones que contienen una combinación de partículas líquidas y sólidas o semisólidas, tales como, por ejemplo, cristales de proteína u otras partículas de proteína. Por tanto, un “líquido” o una “disolución” puede ser una suspensión o incluso una suspensión espesa. Sin embargo, un “líquido” y una “disolución” son preferiblemente bombeables.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el método no contiene la separación de la etapa c) y proporciona una composición comestible que comprende tanto cristales de BLG como la proteína de lactosuero adicional. Si esta variante del método incluye además el secado de la etapa f), proporciona una composición seca que contiene cristales de BLG y la proteína de lactosuero adicional, es decir, un WpC o WPI en el que al menos una parte de la BLG está presente en forma de cristales de BLG. Preferiblemente, el método contiene las etapas a), b) y f) en secuencia directa.
Si la alimentación de proteína de lactosuero es un concentrado de proteína de lactosuero (WPC), un aislado de proteína de lactosuero (WPI), un concentrado de proteína de suero (SPC) o un aislado de proteína de suero (SPI), la variante del método anterior permite preparar un WPC, WPI, SPC o SPI en forma líquida o seca, en el que al menos una parte de la BLG está en forma cristalina.
Los términos “concentrado de proteína de lactosuero” y “concentración de proteína de suero” se refieren a composiciones secas o acuosas en las que se contiene una cantidad total de proteína del 20-89% (p/p) en relación con los sólidos totales.
Un WPC o un SPC contiene preferiblemente:
el 20-89% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
el 15-70% (p/p) de BLG en relación con la proteína total,
el 8-50% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y
el 0-40% (p/p) de CMP en relación con la proteína.
Alternativamente, pero también preferiblemente, un WPC o un SPC puede contener:
el 20-89% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
el 15-90% (p/p) de BLG en relación con la proteína total,
el 4-50% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y
el 0-40% (p/p) de CMP en relación con la proteína.
Preferiblemente, un WPC o un SPC contiene:
el 20-89% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
el 15-80% (p/p) de BLG en relación con la proteína total,
el 4-50% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y
el 0-40% (p/p) de CMP en relación con la proteína.
Más preferiblemente, un WPC o un SPC contiene:
el 70-89% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
el 30-90% (p/p) de BLG en relación con la proteína total,
el 4-35% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y
el 0-25% (p/p) de CMP en relación con la proteína.
Los términos “aislado de proteína de lactosuero” y “aislado de proteína de suero” se refieren a composiciones secas o acuosas en las que se contiene una cantidad total de proteína del 90-100% (p/p) en relación con los sólidos totales.
Un WPI o un SPI contiene preferiblemente:
el 90-100% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
el 15-70% (p/p) de BLG en relación con la proteína total,
el 8-50% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y
el 0-40% (p/p) de CMP en relación con la proteína total.
Alternativamente, pero también preferiblemente, un WPI o un SPI puede contener:
el 90-100% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
el 30-95% (p/p) de BLG en relación con la proteína total,
el 4-35% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y
el 0-25% (p/p) de CMP en relación con la proteína total.
Más preferiblemente, un WPI o un SPI puede contener:
el 90-100% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
el 30-90% (p/p) de BLG en relación con la proteína total,
el 4-35% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y
el 0-25% (p/p) de CMP en relación con la proteína total.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el método comprende además una etapa d) de lavar los cristales de BLG, por ejemplo, los cristales de BLG separados obtenidos de la etapa c).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el método comprende además una etapa e) de recristalizar los cristales de BLG, por ejemplo, los cristales de BLG obtenidos de la etapa c) o d).
Por ejemplo, el método puede comprender, o incluso consistir en, las etapas a), b), c), d) y e). Alternativamente, el método puede comprender, o incluso consistir en, las etapas a), b), c) y e).
En algunas realizaciones particularmente preferidas de la invención, el método comprende además una etapa f) de secar una composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e).
Por ejemplo, el método puede comprender, o incluso consistir en, las etapas a), b) y f). Alternativamente, el método puede comprender, o incluso consistir en, las etapas a), b), c) y f). Alternativamente, el método puede comprender, o incluso consistir en, las etapas a), b), c), d) y f). Alternativamente, el método puede comprender, o incluso consistir en, las etapas a), b), c), d), e) y f).
Tal como se mencionó, la etapa a) de la presente invención implica proporcionar una disolución de proteína de lactosuero que comprende BLG y al menos una proteína de lactosuero adicional.
En el contexto de la presente invención, el término “proteína de lactosuero” se refiere a una proteína que se halla en el lactosuero o en el suero de leche. La proteína de lactosuero de la disolución de proteína de lactosuero puede ser un subconjunto de especies de proteínas halladas en el lactosuero o suero de leche o puede ser el conjunto completo de especies de proteínas halladas en el lactosuero o/y en el suero de leche. Sin embargo, la disolución de
proteína de lactosuero siempre contiene BLG.
En el contexto de la presente invención, el término “proteína adicional” significa una proteína que no es BLG. La proteína adicional que está presente en la disolución de proteína de lactosuero comprende normalmente una o más de las proteínas distintas de BLG que se hallan en el suero de leche o lactosuero. Los ejemplos no limitativos de tales proteínas son alfa-lactoalbúmina, albúmina sérica bovina, inmunoglobulinas, caseinomacropéptido (CMP), osteopontina, lactoferrina y proteínas de la membrana de glóbulo de grasa de leche.
Por tanto, la disolución de proteína de lactosuero puede contener preferiblemente al menos una proteína de lactosuero adicional seleccionada del grupo que consiste en alfa-lactoalbúmina, albúmina sérica bovina, inmunoglobulinas, caseinomacropéptido (CMP), osteopontina, lactoferrina, proteínas de la membrana de glóbulo de grasa de leche y combinaciones de los mismos.
La alfa-lactoalbúmina (ALA) es una proteína presente en la leche de casi todas las especies de mamíferos. La ALA forma la subunidad reguladora del heterodímero de lactosa sintasa (LS) y la p-1,4-galactosiltransferasa (beta4Gal-T1) forma el componente catalítico. Juntas, estas proteínas permiten que LS produzca lactosa transfiriendo restos de galactosa a la glucosa. Como multímero, la alfa-lactoalbúmina se une fuertemente a los iones calcio y zinc y puede poseer actividad bactericida o antitumoral. Una de las principales diferencias estructurales con la beta-lactoglobulina es que la ALA no tiene ningún grupo tiol libre que pueda servir como punto de partida para una reacción de agregación covalente. Como resultado, la ALA pura no formará geles tras la desnaturalización y acidificación.
En el contexto de la presente invención, el término “ALA” o “alfa-lactoalbúmina” se refiere a alfa-lactoalbúmina de especies de mamíferos, por ejemplo en formas nativas y/o glicosiladas, e incluye las variantes genéticas que se producen de manera natural.
En algunas realizaciones de la invención, la disolución de proteína de lactosuero comprende como máximo el 10% (p/p) de caseína en relación con la cantidad total de proteína, preferiblemente como máximo el 5% (p/p), más preferido como máximo el 1% (p/p) e incluso más preferido como máximo el 0,5% de caseína en relación con la cantidad total de proteína. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero no contiene ninguna cantidad detectable de caseína.
El término “suero de leche” se refiere al líquido que permanece cuando la caseína y los glóbulos de grasa de leche se han retirado de la leche, por ejemplo, mediante microfiltración o ultrafiltración de poro grande. El suero de leche también puede denominarse “lactosuero ideal”.
El término “proteína de suero de leche” o “proteína de suero” se refiere a la proteína que está presente en el suero de leche.
El término “lactosuero” se refiere al sobrenadante líquido que queda después de que se ha precipitado y retirado la caseína de la leche. Por ejemplo, la precipitación de caseína puede lograrse mediante la acidificación de la leche y/o mediante el uso de enzima rennet.
Existen varios tipos de lactosuero, tales como “lactosuero dulce”, que es el producto de lactosuero producido mediante la precipitación de caseína basada en rennet, y “lactosuero ácido” o “lactosuero agrio”, que es el producto de lactosuero producido mediante la precipitación de caseína basada en ácidos. Por ejemplo, la precipitación de caseína basada en ácidos puede lograrse mediante la adición de ácidos alimentarios o por medio de cultivos bacterianos.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 5% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 10% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 15% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 20% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Lo más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 30% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 1% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 2% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 3% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Lo más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 4% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína.
En aún otras realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 35% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 40% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender, por ejemplo, al menos el 45% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 50% (p/p) de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende proteína de lactosuero adicional en el intervalo del 5-90% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender proteína de lactosuero adicional en el intervalo del 10-80% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. La disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender, por ejemplo, proteína de lactosuero adicional en el intervalo del 20-70% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende proteína de lactosuero adicional en el intervalo del 30-70% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína.
Tal como se mencionó, los presentes inventores han hallado que es posible cristalizar BLG sin el uso de disolventes orgánicos. Este enfoque de purificación también puede usarse para refinar las preparaciones que contienen proteína de lactosuero, preparaciones que ya han sido sometidos a alguna purificación de BLG, y proporciona métodos sencillos para aumentar incluso adicionalmente la pureza de la BLG. Por tanto, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende proteína de lactosuero adicional en el intervalo del 1-20% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender proteína de lactosuero adicional en el intervalo del 2-15% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender, por ejemplo, proteína de lactosuero adicional en el intervalo del 3-10% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 5% (p/p) de ALA en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 10% (p/p) de ALA en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 15% (p/p) de ALA en relación con la cantidad total de proteína. Alternativamente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 20% (p/p) de ALA en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 25% (p/p) de ALA en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 30% (p/p) de ALA en relación con la cantidad total de proteína. La disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende preferiblemente al menos el 35% (p/p) de ALA en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 40% (p/p) de ALA en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende ALA en el intervalo del 5-95% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende ALA en el intervalo del 5-70% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender ALA en el intervalo del 10-60% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. La disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende preferiblemente ALA en el intervalo del 12-50% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferido, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender ALA en el intervalo del 20-45% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón en peso entre BLG y ALA de al menos 0,01. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón en peso entre BLG y ALA de al menos 0,5. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón en peso entre BLG y ALA de al menos 1, tal como, por ejemplo, al menos 2. Por ejemplo, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede tener una razón en peso entre BLG y ALA de al menos 3.
Las cantidades y concentraciones de BLG y otras proteínas en la disolución de proteína de lactosuero y la alimentación de proteína de lactosuero se refieren todas a proteína disuelta y no incluyen proteína precipitada o cristalizada.
En el contexto de la presente invención, el término “razón en peso” entre el componente X y el componente Y significa el valor obtenido mediante el cálculo mx/my, en la que mx es la cantidad (peso) de componentes X y my es la
cantidad (peso) de componentes Y.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón en peso entre BLG y ALA en el intervalo de 0,01-20. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón en peso entre BLG y ALA en el intervalo de 0,2-10. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón en peso entre BLG y ALA en el intervalo de 0,5 4. Por ejemplo, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede tener una razón en peso entre BLG y ALA en el intervalo de 1-3.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 1% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 2% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 5% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 10% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 12% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Por ejemplo, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 15% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. La disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender, por ejemplo, al menos el 20% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Alternativamente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender al menos el 30% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína.
La disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende como máximo el 85% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender, por ejemplo, como máximo el 80% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender como máximo el 78% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender como máximo el 75% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende BLG en el intervalo del 10-85% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende BLG en el intervalo del 10-80% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Lo más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender BLG en el intervalo del 20-70% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. En otras realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende BLG en el intervalo del 15-85% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende BLG en el intervalo del 15-80% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína. Lo más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) puede comprender BLG en el intervalo del 30-70% (p/p) en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 0,4% (p/p) de BLG en relación con el peso de la disolución de proteína de lactosuero. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero comprende al menos el 1,0% (p/p) de BLG. Más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero comprende al menos el 2,0% (p/p) de BLG. Es incluso más preferido que la disolución de proteína de lactosuero comprenda al menos el 4% (p/p) de BLG.
Se prefieren incluso más concentraciones de BLG mayores y, preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero comprende al menos el 6% (p/p) de BLG. Más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero comprende al menos el 10% (p/p) de BLG. Es incluso más preferido que la disolución de proteína de lactosuero comprenda al menos el 15% (p/p) de BLG.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende BLG en el intervalo del 0,4-40% (p/p) en relación con el peso de la disolución de proteína de lactosuero. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero comprende BLG en el intervalo del 1-35% (p/p). Más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero comprende BLG en el intervalo del 4-30% (p/p). Es incluso más preferido que la disolución de proteína de lactosuero comprenda BLG en el intervalo del 10-25% (p/p).
Puede usarse cualquier fuente de proteína de lactosuero adecuada para preparar la disolución de proteína de lactosuero. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero comprende, o incluso consiste en, un concentrado de proteína de suero de leche, un concentrado de proteína de lactosuero, un aislado de proteína de suero de leche, un aislado de proteína de lactosuero o una combinación de los mismos.
Se prefiere que la disolución de proteína de lactosuero sea una disolución de proteína de lactosuero desmineralizada.
En este contexto, el término desmineralizado significa que la conductividad de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 15 mS/cm, y preferiblemente de como máximo 10 mS/cm, e incluso más preferiblemente de como máximo 8 mS/cm. La conductividad del permeado de UF de una disolución de proteína de lactosuero desmineralizada es preferiblemente de como máximo de 7 mS/cm, más preferiblemente de como máximo 4 mS/cm e incluso más preferiblemente de como máximo 1 mS/cm.
Se prefiere particularmente que la disolución de proteína de lactosuero sea un concentrado de proteína de suero de leche desmineralizado, un aislado de proteína de suero de leche desmineralizado, un concentrado de proteína de lactosuero desmineralizado o un aislado de proteína de lactosuero desmineralizado.
En algunas realizaciones particularmente preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero comprende, o incluso consiste en, un concentrado de proteína de suero de leche, un concentrado de proteína de lactosuero, un aislado de proteína de suero de leche, un aislado de proteína de lactosuero desmineralizados y con el pH ajustado, o una combinación de los mismos.
Por ejemplo, la disolución de proteína de lactosuero puede comprender, o incluso consistir en, un concentrado de proteína de suero de leche desmineralizado. Alternativamente, la disolución de proteína de lactosuero puede comprender, o incluso consistir en, un concentrado de proteína de lactosuero desmineralizado. Alternativamente, la disolución de proteína de lactosuero puede comprender, o incluso consistir en, un aislado de proteína de suero de leche desmineralizado. Alternativamente, la disolución de proteína de lactosuero puede comprender, o incluso consistir en, un aislado de proteína de lactosuero desmineralizado.
En el contexto de la presente invención, los términos “concentrado de proteína de lactosuero” y “concentrado de proteína de suero de leche” se refieren a preparaciones de lactosuero o suero de leche, preparaciones que contienen proteína en el intervalo de aproximadamente el 20-89% (p/p) en relación con los sólidos totales.
En el contexto de la presente invención, los términos “aislado de proteína de lactosuero” y “aislado de proteína de suero de leche” se refieren a preparaciones de lactosuero o suero de leche, preparaciones que contienen al menos el 90% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales.
La proteína de la disolución de proteína de lactosuero se deriva preferiblemente de leche de mamífero, y preferiblemente de la leche de un rumiante, tal como, por ejemplo, vaca, oveja, cabra, búfala, camella, llama, yegua y/o cierva. La proteína derivada de leche bovina (vaca) es particularmente preferida. Por tanto, la BLG y la proteína de lactosuero adicional son preferiblemente BLG bovina y proteína de lactosuero bovina.
La proteína de la disolución de proteína de lactosuero está preferiblemente tan cerca de su estado nativo como sea posible y, preferiblemente, se ha sometido únicamente a tratamientos térmicos en condiciones suaves, si es que se ha sometido a alguno.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la BLG de la disolución de proteína de lactosuero tiene un grado de lactosilación de como máximo 1. Preferiblemente, la BLG de la disolución de proteína de lactosuero tiene un grado de lactosilación de como máximo 0,6. Más preferiblemente, la BLG de la disolución de proteína de lactosuero tiene un grado de lactosilación de como máximo 0,4. Incluso más preferiblemente, la BLG de la disolución de proteína de lactosuero tiene un grado de lactosilación de como máximo 0,2. Lo más preferiblemente, la BLG de la disolución de proteína de lactosuero tiene un grado de lactosilación de como máximo 0,1, tal como, por ejemplo, preferiblemente de como máximo 0,01.
El grado de lactosilación de BLG se determina según Czerwenka et al. (J. Agric. Food Chem., vol. 54, n.° 23, 2006, páginas 8874-8882).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero tiene un índice de furosina de como máximo 80 mg/100 g de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero tiene un índice de furosina de como máximo 40 mg/100 g de proteína. Más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero tiene un índice de furosina de como máximo 20 mg/100 g de proteína. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero tiene un índice de furosina de como máximo 10 mg/100 g de proteína. Lo más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero tiene un índice de furosina de como máximo 5 mg/100 g de proteína, tal como, por ejemplo, preferiblemente un índice de furosina de 0 mg/100 g de proteína.
La disolución de proteína de lactosuero contiene normalmente otros componentes además de proteína. La disolución de proteína de lactosuero puede contener otros componentes que se hallan normalmente en el lactosuero o suero de leche, tales como, por ejemplo, minerales, hidratos de carbono y/o lípidos. Alternativa o adicionalmente, la disolución de proteína de lactosuero puede contener componentes que no son nativos del lactosuero o suero de leche. Sin embargo, tales componentes no nativos deben ser preferiblemente seguros para su uso en la producción
de alimentos y también preferiblemente para el consumo humano.
El presente método es particularmente ventajoso para separar BLG de disoluciones de proteína de lactosuero en bruto que contienen otros sólidos además de BLG.
La disolución de proteína de lactosuero puede contener, por ejemplo, hidratos de carbono, tales como, por ejemplo, lactosa, oligosacáridos y/o productos de hidrólisis de la lactosa (es decir, glucosa y galactosa). La disolución de proteína de lactosuero puede contener, por ejemplo, hidratos de carbono en el intervalo del 0-40% (p/p), tal como en el intervalo del 1-30% (p/p), o en el intervalo del 2-20% (p/p).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero contiene como máximo el 20% (p/p) de hidratos de carbono, preferiblemente como máximo el 10% (p/p) de hidratos de carbono, más preferiblemente como máximo el 5% (p/p) de hidratos de carbono e incluso más preferiblemente como máximo el 2% (p/p) de hidratos de carbono.
La disolución de proteína de lactosuero también puede comprender lípidos, por ejemplo, en forma de triglicérido y/u otros tipos de lípidos, tales como fosfolípidos.
En algunas realizaciones de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 15% (p/p) en relación con los sólidos totales. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 10% (p/p) en relación con los sólidos totales. Más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 6% (p/p) en relación con los sólidos totales. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 1,0% (p/p) en relación con los sólidos totales. Lo más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 0,5% (p/p) en relación con los sólidos totales.
La cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es normalmente de al menos el 1% (p/p) en relación con el peso de la disolución de proteína de lactosuero. Preferiblemente, la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de al menos el 5% (p/p). Más preferido, la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de al menos el 10% (p/p). Incluso más preferido, la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de al menos el 15% (p/p).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo del 1-50% (p/p). Preferiblemente, la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo del 5-40% (p/p). Más preferido, la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo del 10-30% (p/p). Incluso más preferido, la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo del 15-25% (p/p).
La cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero se determina según el ejemplo 9.2.
La disolución de proteína de lactosuero se prepara normalmente sometiendo una alimentación de proteína de lactosuero a uno o más ajustes que forman la disolución de proteína de lactosuero que está sobresaturada con respecto a BLG.
La alimentación es preferiblemente un WPC, un WPI, un SPC, un SPI o una combinación de los mismos.
En el contexto de la presente invención, el término “alimentación de proteína de lactosuero” se refiere a la composición que se transforma en la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada con respecto a BLG. La alimentación de proteína de lactosuero es normalmente un líquido acuoso que comprende BLG y al menos una proteína de lactosuero adicional, pero normalmente no está sobresaturada con respecto a BLG.
Las realizaciones relacionadas con la composición química de la disolución de proteína de lactosuero se aplican igualmente a la alimentación de proteína de lactosuero, sin embargo, normalmente se ajusta al menos un parámetro de la alimentación de proteína de lactosuero para evitar la sobresaturación o al menos la cristalización espontánea. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada se prepara sometiendo la alimentación de proteína de lactosuero a uno o más de los siguientes ajustes:
- ajustar el pH,
- reducir la conductividad
- reducir la temperatura
- aumentar la concentración de proteína
- añadir un agente que reduce la actividad de agua
- modificar la composición de iones
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica ajustar el pH de la alimentación de proteína de lactosuero a un pH en el intervalo de 5-6.
Todos los valores de pH se miden usando un electrodo de vidrio para pH y se normalizan a 25°C.
Preferiblemente, el pH de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo de 5,1-6,0.
En la invención, el pH de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo de 5,0-6,0. Preferiblemente, el pH de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo de 5,1-6,0. Más preferiblemente, el pH de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo de 5,1-5,9. Incluso más preferido, el pH de la disolución de proteína de lactosuero puede estar en el intervalo de 5,2-5,9. Lo más preferiblemente, el pH de la disolución de proteína de lactosuero está en el intervalo de 5,2-5,8.
El pH se ajusta preferiblemente usando ácidos y/o bases alimentarios aceptables. Los ácidos alimentarios aceptables son particularmente preferidos, tales como, por ejemplo, ácidos carboxílicos. Los ejemplos útiles de tales ácidos son, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido cítrico o ácido glucónico, y/o mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el pH se ajusta usando una lactona, tal como, por ejemplo, D-glucono-delta-lactona, que se hidroliza lentamente y al mismo tiempo reduce el pH del líquido acuoso que la contiene. El pH objetivo después de que haya finalizado la hidrólisis de la lactona puede calcularse de manera precisa.
Los ejemplos útiles de bases alimentarias aceptables son, por ejemplo, fuentes de hidróxidos, tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, sales de ácidos alimentarios, tales como, por ejemplo, citrato de trisodio, y/o combinaciones de los mismos.
En otras realizaciones preferidas de la invención, el pH se ajusta mediante la adición de material de intercambio catiónico en su forma H+. El material de intercambio catiónico de tipo perla/tipo partícula grande se retira fácilmente de la disolución de proteína de lactosuero antes de la cristalización o incluso después de la cristalización. El ajuste de pH mediante la adición de material de intercambio catiónico en su forma H+ es particularmente ventajoso en la presente invención, ya que redujo el pH sin añadir contraiones negativos que afectan significativamente a la conductividad de la alimentación de proteína de lactosuero.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica reducir la conductividad de la alimentación de proteína de lactosuero.
Los valores de conductividad mencionados en el presente documento se han normalizado a 25°C, a menos que se especifique lo contrario.
Los inventores han hallado que reducir la conductividad de la disolución de proteína de lactosuero conduce a un mayor rendimiento de los cristales de BLG. La conductividad mínima obtenible de la disolución de proteína de lactosuero depende de la composición de la fracción de proteína y la fracción de lípido (si la hay). Algunas especies de proteínas, tales como, por ejemplo, caseinomacropéptido (CMP), contribuyen más a la conductividad que otras especies de proteínas. Por tanto, es preferible que la conductividad de la alimentación de proteína de lactosuero se lleve cerca del nivel en el que la proteína y los contraiones de la proteína son los principales factores contribuyentes a la conductividad. La reducción de la conductividad implica a menudo la retirada de al menos algunos de los iones libres pequeños que están presentes en la fase líquida y no están estrechamente unidos a las proteínas.
A menudo, se prefiere que la disolución de proteína de lactosuero tenga una conductividad de como máximo 10 mS/cm. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero tiene una conductividad de como máximo 5 mS/cm. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero tiene una conductividad de como máximo 4 mS/cm.
Se prefieren incluso más conductividades menores y dan lugar a mayores rendimientos de los cristales de BLG. Por tanto, la disolución de proteína de lactosuero tiene preferiblemente una conductividad de como máximo 3 mS/cm. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero tiene conductividad de como máximo 1 mS/cm. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero tiene conductividad de como máximo 0,5 mS/cm.
La conductividad de la alimentación de proteína de lactosuero se reduce preferiblemente mediante diálisis o diafiltración. Es particularmente preferida la diafiltración mediante ultrafiltración, ya que permite separar por lavado las sales y pequeñas moléculas cargadas mientras que se retienen las proteínas. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la misma unidad de UF se usa para la UF/diafiltración y la concentración posterior de la alimentación de proteína de lactosuero.
Los presentes inventores han observado indicios de que la razón entre la conductividad (expresada en mS/cm) y la cantidad total de proteína en la disolución de proteína de lactosuero (expresada en % en peso total de proteína en relación con el peso total de la disolución de proteína de lactosuero) puede mantenerse ventajosamente en o por debajo de un determinado umbral para facilitar la cristalización de BLG.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 0,3. Preferiblemente, la razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 0,25. Preferiblemente, la razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 0,20. Más preferiblemente, la razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 0,18. Incluso más preferiblemente, la razón entre the conductividad y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 0,12. Lo más preferiblemente, la razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 0,10.
Por ejemplo, se prefiere que la razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero sea de aproximadamente 0,07 o incluso menor.
Los presentes inventores han hallado además que la alimentación de proteína de lactosuero puede acondicionarse ventajosamente para proporcionar una disolución de proteína de lactosuero que tiene una conductividad del permeado de UF de como máximo 10 mS/cm. La conductividad del permeado de UF es una medida de la conductividad de la fracción de moléculas pequeñas de un líquido y se mide según el ejemplo 9.10. Cuando se usa el término “conductividad” en el presente documento como tal, se refiere a la conductividad del líquido en cuestión. Cuando se usa el término “conductividad del permeado de UF”, se refiere a la conductividad de la fracción de moléculas pequeñas de un líquido y se mide según el ejemplo 9.10.
Preferiblemente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 7 mS/cm. Más preferiblemente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero puede ser de como máximo 5 mS/cm. Incluso más preferiblemente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero puede ser de como máximo 3 mS/cm.
Pueden usarse conductividades del permeado de UF incluso menores, y son particularmente preferidas si debe obtenerse un alto rendimiento de b Lg . Por tanto, preferiblemente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 1,0 mS/cm. Más preferiblemente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero puede ser de como máximo 0,4 mS/cm. Incluso más preferiblemente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero puede ser de como máximo 0,1 mS/cm. Lo más preferiblemente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero puede ser de como máximo 0,04 mS/cm.
Pueden alcanzarse conductividades del permeado de UF incluso menores, por ejemplo, se usa agua MilliQ como diluyente durante la diafiltración (el agua MilliQ tiene una conductividad de aproximadamente 0,06 pS/cm) Por tanto, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero puede ser de como máximo 0,01 mS/cm. Alternativamente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero puede ser de como máximo 0,001 mS/cm. Alternativamente, la conductividad del permeado de UF de la disolución de proteína de lactosuero puede ser de como máximo 0,0001 mS/cm.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica reducir la temperatura de la alimentación de proteína de lactosuero.
Por ejemplo, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero puede implicar reducir la temperatura de la alimentación de proteína de lactosuero hasta al menos 5°C, preferiblemente al menos 10°C e incluso más preferido al menos 15°C. Por ejemplo, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero puede implicar reducir la temperatura de la alimentación de proteína de lactosuero hasta al menos 20°C.
La temperatura de la alimentación de proteína de lactosuero puede reducirse, por ejemplo, hasta como máximo 30°C, preferiblemente como máximo 20°C e incluso más preferiblemente hasta como máximo 10°C. Los inventores han hallado que temperaturas incluso menores proporcionan un mayor grado de sobresaturación, por tanto, la temperatura de la alimentación de proteína de lactosuero puede reducirse, por ejemplo, hasta como máximo 5°C, preferiblemente como máximo 2°C e incluso más preferiblemente hasta como máximo 0°C. La temperatura puede ser incluso menor de 0°C, sin embargo, preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero debe permanecer
bombeable, por ejemplo, en forma de una suspensión helada.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero es una suspensión helada antes del inicio de la cristalización de BLG. Alternativa o adicionalmente, la disolución de proteína de lactosuero de cristalización puede convertirse en o mantenerse como una suspensión helada durante la cristalización de BLG de la etapa b).
En algunas realizaciones particularmente preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica aumentar la concentración total de proteína de la alimentación de proteína de lactosuero. La alimentación de proteína de lactosuero puede someterse, por ejemplo, a una o más etapas de concentración de proteína, tales como ultrafiltración, nanofiltración, ósmosis inversa y/o evaporación y, por tanto, concentrarse para obtener la disolución de proteína de lactosuero.
La ultrafiltración es particularmente preferida, ya que permite la concentración selectiva de proteína mientras que las concentraciones de sales e hidratos de carbono no se ven casi afectadas. Tal como se mencionó anteriormente, se usa preferiblemente la ultrafiltración tanto para la diafiltración como para la concentración de la alimentación de proteína de lactosuero.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la concentración de BLG de la disolución de proteína de lactosuero está por debajo del nivel en el que se produce la cristalización espontánea de BLG. Por tanto, se prefiere a menudo detener las modificaciones de la alimentación de proteína de lactosuero cuando la disolución de proteína de lactosuero está en la región metaestable, es decir, en la región sobresaturada en la que los cristales de BLG pueden crecer cuando se usa siembra pero en la que la cristalización no comienza de manera espontánea.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica la adición de uno o más agente(s) reductor(es) de la actividad de agua a la alimentación de proteína de lactosuero. Los ejemplos útiles, pero no limitativos, de tales agentes reductores de la actividad de agua son polisacáridos y/o polietilenglicol (PEG).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica modificar la composición de iones de la alimentación de proteína de lactosuero, por ejemplo, mediante intercambio iónico, mediante la adición de nuevas especies iónicas, mediante diálisis o diafiltración.
Normalmente, la disolución de proteína de lactosuero se prepara combinando dos o más de las etapas de procedimiento anteriores para crear la sobresaturación.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica someter la alimentación de proteína de lactosuero a al menos:
- concentración, por ejemplo, usando ultrafiltración, nanofiltración u ósmosis inversa, a una temperatura por encima de 10°C, y
- posteriormente, enfriamiento hasta una temperatura por debajo de 10°C.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica someter la alimentación de proteína de lactosuero a al menos:
- concentración a un pH por encima de 6,0, y
- posteriormente, reducción del pH mediante la adición de un ácido (por ejemplo, GDL o un material de intercambio catiónico en forma H+).
En aún otras realizaciones preferidas de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica someter la alimentación de proteína de lactosuero a al menos:
- reducción de la conductividad, por ejemplo, mediante diafiltración usando una membrana que retenga al menos la BLG.
En realizaciones preferidas adicionales de la invención, la preparación de la disolución de proteína de lactosuero implica someter la alimentación de proteína de lactosuero a una combinación de al menos:
- ajuste del pH a 5-6,
- reducción de la conductividad mediante diafiltración usando una membrana que retenga al menos la BLG,
- concentración de la proteína, por ejemplo, usando ultrafiltración, nanofiltración u osmosis inversa, a una temperatura por encima de 10°C, y
- finalmente, enfriamiento hasta una temperatura por debajo de 10°C.
Los presentes inventores han hallado además que el rendimiento de BLG del presente método puede mejorarse controlando la razón molar entre la suma de sodio+potasio y la suma de calcio y magnesio. Una mayor cantidad relativa de calcio y magnesio parece aumentar sorprendentemente el rendimiento de BLG y, por tanto, aumenta la eficiencia de la recuperación de BLG del presente método.
En algunas realizaciones preferidas de la presente invención, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón molar entre Na K y Ca Mg de como máximo 4. Más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón molar entre Na K y Ca Mg de como máximo 2. Incluso más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón molar entre Na K y Ca Mg de como máximo 1,5 e incluso más preferiblemente de como máximo 1,0. Lo más preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) tiene una razón molar entre Na K y Ca Mg de como máximo 0,5, tal como, por ejemplo, de como máximo 0,2.
La razón molar entre Na K y Ca Mg se calculó como (mNa+mK)/(moa+mMg), en la que mNa es el contenido de Na elemental en moles, mK es el contenido de K elemental en moles, moa es el contenido de Ca elemental en moles y mMg es el contenido de Mg elemental en moles.
Se prefiere particularmente que la disolución de proteína de lactosuero se haya sobresaturado con respecto a BLG mediante disolución de proteínas por adición de sal y que, por tanto, BLG pueda cristalizarse a partir de la disolución de proteína de lactosuero en modo de disolución de proteínas por adición de sal.
En algunas realizaciones de la invención, la disolución de proteína de lactosuero tiene un bajo contenido de proteína desnaturalizada, particularmente si el producto de BLG comestible de la presente invención también debe un grado de desnaturalización de proteína. Preferiblemente, la disolución de proteína de lactosuero tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 2%, preferiblemente de como máximo el 1,5%, más preferiblemente de como máximo el 1,0% y lo más preferiblemente de como máximo el 0,8%.
La etapa b) del método implica cristalizar al menos parte de la BLG de la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada.
La cristalización de la etapa b) tiene lugar en modo de disolución de proteínas por adición de sal, es decir, en un líquido que tiene una fuerza iónica y una conductividad bajas. Esto es lo contrario al modo de precipitación de proteínas por adición de sal, en el que se añaden cantidades significativas de sales a una disolución para provocar la cristalización.
La cristalización de BLG de la etapa b) puede implicar, por ejemplo, uno o más de los siguientes:
- esperar a que tenga lugar la cristalización,
- añadir semillas de cristalización,
- aumentar los grados de sobresaturación de BLG incluso adicionalmente, y/o
- estimular de manera mecánica.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa b) implica añadir semillas de cristalización a la disolución de proteína de lactosuero. Los inventores han hallado que la adición de semillas de cristalización permite controlar cuándo y dónde tiene lugar la cristalización de BLG para evitar la obstrucción repentina del equipo del procedimiento y paradas involuntarias durante la producción. Por ejemplo, a menudo es deseable evitar la aparición de la cristalización mientras se concentra la alimentación de proteína de lactosuero.
En principio, puede usarse cualquier material de siembra que inicie la cristalización de BLG. Sin embargo, para la siembra se prefiere que se usen cristales de BLG hidratados o cristales de BLG secados para evitar la adición de impurezas adicionales a la disolución de proteína de lactosuero.
Las semillas de cristalización pueden estar en forma seca o pueden formar parte de una suspensión cuando se añaden a la disolución de proteína de lactosuero. Por ahora, se prefiere añadir una suspensión que contiene las semillas de cristalización, por ejemplo, cristales de BLG, ya que parece proporcionar una aparición más rápida de la cristalización. Se prefiere que una suspensión de este tipo que contiene semillas de cristalización tenga un pH en el intervalo de 5-6 y una conductividad de como máximo 10 mS/cm.
En algunas realizaciones de la invención, al menos algunas de las semillas de cristalización están ubicadas en una fase sólida que se pone en contacto con la disolución de proteína de lactosuero.
Las semillas de cristalización tienen preferiblemente un tamaño de partícula más pequeño que el tamaño deseado de los cristales de BLG. El tamaño de las semillas de cristalización puede modificarse retirando las semillas más grandes mediante tamizado u otros procedimientos de fraccionamiento del tamaño. También puede emplearse reducción del tamaño de partícula, por ejemplo, por medio de trituración, antes del fraccionamiento del tamaño de partícula.
En algunas realizaciones de la invención, al menos el 90% (p/p) de las semillas de cristalización tienen un tamaño de partícula (medido mediante análisis por tamizado) en el intervalo de 0,1-600 micrómetros. Por ejemplo, al menos el 90% (p/p) de las semillas de cristalización pueden tener un tamaño de partícula en el intervalo de 1-400 micrómetros. Preferiblemente, al menos el 90% (p/p) de las semillas de cristalización pueden tener un tamaño de partícula en el intervalo de 5-200 micrómetros. Más preferiblemente, al menos el 90% (p/p) de las semillas de cristalización pueden tener un tamaño de partícula en el intervalo de 5-100 micrómetros.
El tamaño de partícula y la dosificación de las semillas de cristalización puede adaptarse para proporcionar la cristalización de BLG óptima.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, las semillas de cristalización se añaden a la alimentación de proteína de lactosuero antes de obtener la sobresaturación con respecto a BLG, pero preferiblemente de una manera que al menos algunas semillas de cristalización estén todavía presentes cuando se alcance la sobresaturación. Por ejemplo, esto puede lograrse mediante la adición de semillas de cristalización cuando la alimentación de proteína de lactosuero está cerca de la sobresaturación, por ejemplo, durante el enfriamiento, la concentración y/o el ajuste del pH, y para alcanzar la sobresaturación antes de que las semillas de cristalización se disuelvan completamente.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa b) implica aumentar el grado de sobresaturación de BLG incluso adicionalmente, preferiblemente hasta un grado en el que la cristalización de BLG se inicie inmediatamente, es decir, en como máximo 20 minutos y preferiblemente en como máximo 5 minutos. Esto también se refiere a la zona de nucleación en la que las unidades cristalinas se forman de manera espontánea y comienza el procedimiento de cristalización.
El grado de sobresaturación puede aumentarse, por ejemplo, mediante uno o más de los siguientes:
- aumentar la concentración de proteína de la disolución de proteína de lactosuero adicionalmente,
- enfriar la disolución de proteína de lactosuero adicionalmente,
- llevar la disolución de proteína de lactosuero más cerca del pH óptimo para la cristalización de BLG, - reducir la conductividad incluso adicionalmente.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa b) implica esperar a que se formen los cristales de BLG. Esto puede durar varias horas y es normalmente para una disolución de proteína de lactosuero que está sólo ligeramente sobresaturada con respecto a BLG y a la que no se le han añadido semillas de cristalización.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la provisión de la disolución de proteína de lactosuero (etapa a) y la cristalización de BLG (etapa b) tiene lugar en dos etapas independientes.
Sin embargo, en otras realizaciones preferidas de la invención, la etapa b) implica el ajuste adicional de la disolución de proteína de lactosuero de cristalización para aumentar el grado de sobresaturación de BLG, o al menos mantener la sobresaturación. El ajuste adicional da como resultado un rendimiento aumentado de los cristales de BLG.
Tal ajuste adicional puede implicar uno o más de:
- aumentar la concentración de proteína de la disolución de proteína de lactosuero de cristalización incluso adicionalmente,
- enfriar la disolución de proteína de lactosuero de cristalización hasta una temperatura incluso menor, - llevar la disolución de proteína de lactosuero de cristalización incluso más cerca del pH óptimo para la cristalización de BLG,
- reducir la conductividad de la disolución de proteína de lactosuero de cristalización incluso adicionalmente.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la disolución de proteína de lactosuero de cristalización se mantiene en la zona metaestable durante la etapa b) para evitar la formación espontánea de nuevas unidades cristalinas.
Los inventores han determinado la estructura de la red cristalina de los cristales de BLG aislados mediante cristalografía de rayos X y no han hallado un cristal similar en la técnica anterior.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, al menos algunos de los cristales de BLG obtenidos durante la etapa b) tienen un grupo espacial ortorrómbico P 212121.
Preferiblemente, al menos algunos de los cristales de BLG obtenidos tienen un grupo espacial ortorrómbico P 212121 y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 (±5%) A, b = 68,68 (±5%) A y c = 156,65 (±5%) A; y los ángulos integrales de la celda unitaria a=90°, p=90° y y=90°
En algunas realizaciones preferidas de la invención, al menos algunos de los cristales de BLG obtenidos tienen un grupo espacial ortorrómbico P 212121 y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 (±2%) A, b = 68,68 (±2%) A y c = 156,65 (±2%) A; y los ángulos integrales de la celda unitaria a=90°, p=90° y y=90°
Incluso más preferido, al menos algunos de los cristales de BLG obtenidos pueden tener un grupo espacial ortorrómbico P 212121 y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 (±1%) A, b = 68,68 (±1%) A y c = 156,65 (±1%) A; y los ángulos integrales de la celda unitaria a=90°, p=90° y y=90°.
Lo más preferiblemente, al menos algunos de los cristales de BLG obtenidos tienen un grupo espacial ortorrómbico P 212121 y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 A, b = 68,68 A y c = 156,65 A; y los ángulos integrales de la celda unitaria a=90°, p=90° y y=90°
En algunas realizaciones particularmente preferidas de la invención, el método contiene una etapa c) de separar al menos algunos de los cristales de BLG de la disolución de proteína de lactosuero restante. Esto es especialmente preferido cuando se desea la purificación de BLG.
Por ejemplo, la etapa c) puede comprender separar los cristales de BLG para dar un contenido de sólidos de al menos el 30% (p/p). Preferiblemente, la etapa c) comprende separar los cristales de BLG para dar un contenido de sólidos de al menos el 40% (p/p). Incluso más preferiblemente, la etapa c) comprende separar los cristales de BLG para dar un contenido de sólidos de al menos el 50% (p/p).
Los inventores han hallado que el alto contenido de sólidos es ventajoso para la purificación de BLG, ya que la porción acuosa que se adhiere a los cristales de BLG separados contiene normalmente las impurezas que deben evitarse. Adicionalmente, el alto contenido de sólidos reduce el consumo de energía para convertir los cristales de BLG separados en un producto seco, tal como, por ejemplo, un polvo, y aumenta el rendimiento de BLG obtenido de la unidad de secado con una capacidad dada.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa c) comprende separar los cristales de BLG para dar un contenido de sólidos de al menos el 60%. Preferiblemente, la etapa c) comprende separar los cristales de BLG para dar un contenido de sólidos de al menos el 70%. Incluso más preferiblemente, la etapa c) comprende separar los cristales de BLG para dar un contenido de sólidos de al menos el 80%.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la separación de la etapa c) implica una o más de las siguientes operaciones:
- centrifugación,
- decantación,
- filtración,
- sedimentación,
- combinaciones de las anteriores.
Estas operaciones unitarias son bien conocidas por el experto en la técnica y se implementan fácilmente. Por ejemplo, la separación por filtración puede implicar el uso de filtración a vacío, filtración de flujo cruzado dinámico (DCF), un prensa de filtrado o una centrífuga de filtro.
Pueden emplearse diferentes tamaños de poro para la filtración basándose en el resultado deseado. Preferiblemente, el filtro permite que pasen la proteína de lactosuero nativa y agregados pequeños, pero retiene los cristales de BLG. El filtro tiene preferiblemente un tamaño de poro nominal de al menos 0,1 micrómetros. Por
ejemplo, el filtro puede tener un tamaño de poro nominal de al menos 0,5 micrómetros. Incluso más preferiblemente, el filtro puede tener un tamaño de poro nominal de al menos 2 micrómetros.
También pueden usarse filtros que tienen tamaños de poro más grandes y, de hecho, se prefieren si principalmente los cristales grandes deben separarse de un líquido que contiene cristales de BLG. En algunas realizaciones de la invención, el filtro tiene un tamaño de poro nominal de al menos 5 micrómetros. Preferiblemente, el filtro tiene un tamaño de poro nominal de al menos 20 micrómetros. Incluso más preferiblemente, el filtro puede tener un tamaño de poro de al menos 40 micrómetros.
Por ejemplo, el filtro puede tener un tamaño de poro en el intervalo de 0,03-5000 micrómetros, tal como, por ejemplo, 0,1-5000 micrómetros. Preferiblemente, el filtro puede tener un tamaño de poro en el intervalo de 0,5-1000 micrómetros. Incluso más preferiblemente, el filtro puede tener un tamaño de poro en el intervalo de 5 800 micrómetros, tal como, por ejemplo, en el intervalo de 10-500 micrómetros o en el intervalo de 50 500 micrómetros.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el filtro tiene un tamaño de poro en el intervalo de 0,03 100 micrómetros. Preferiblemente, el filtro puede tener un tamaño de poro en el intervalo de 0,1-50 micrómetros. Más preferiblemente, el filtro puede tener un tamaño de poro en el intervalo de 4-40 micrómetros. Incluso más preferiblemente, el filtro puede tener un tamaño de poro en el intervalo de 5-30 micrómetros, tal como en el intervalo de 10-20 micrómetros.
Una ventaja de usar filtros que tienen un tamaño de poro más grande de 1 micrómetro es que las bacterias y otros microorganismos también se retiran al menos parcialmente durante la separación y, opcionalmente, también durante el lavado y/o la recristalización. Por tanto, el presente método permite producir BLG de alta pureza con una carga bacteriana muy baja, pero evitando el daño térmico de la proteína.
Otra ventaja de usar filtros que tienen un tamaño de poro más grande de 1 micrómetro es que la retirada de agua y el secado posterior se vuelven más fáciles y consumen menos energía.
La disolución de proteína de lactosuero restante que se separa de los cristales de BLG puede recircularse a la alimentación de proteína de lactosuero durante la preparación de la disolución de proteína de lactosuero.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa c) emplea una centrífuga de filtro. En otras realizaciones preferidas de la invención, la etapa c) emplea una centrífuga decantadora. Los resultados iniciales (véase el ejemplo 13) han demostrado que el uso de una centrífuga de filtro y/o una centrífuga decantadora para separar los cristales de BLG a partir de las aguas madres proporciona un funcionamiento más robusto del método que, por ejemplo, la filtración a vacío.
A menudo se prefiere secar una torta de filtro formada con un gas de secado para reducir el contenido de humedad de la torta de filtro y, preferiblemente, para poder desprender la torta de filtro del filtro. El uso de un gas de secado puede formar parte de la etapa de separación o, alternativamente, la etapa de secado final si la torta de filtro se convierte directamente en una composición de BLG comestible seca.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa c) emplea una unidad de DCF.
Las pruebas iniciales (véase el ejemplo 12) han demostrado que usando una unidad de DCF con un tamaño de poro de membrana en el intervalo de 0,03-5 micrómetros, y preferiblemente en el intervalo de 0,3-1,0 micrómetros, ofrece una separación eficiente de los cristales de BLG, y los inventores han observado que la unidad de DCF puede hacerse funcionar durante una duración suficiente para separar los cristales de lotes incluso grandes de disolución de proteína de lactosuero que contiene cristales de BLG.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa c) se realiza usando una unidad de DCF dotada de una membrana que puede retener los cristales de BLG, el permeado de DCF se recircula para formar parte de la disolución de proteína de lactosuero o la alimentación de proteína de lactosuero y el retenido de DCF puede recuperarse o devolverse al tanque de cristalización. Preferiblemente, el permeado de DCF se trata, por ejemplo, mediante ultrafiltración/diafiltración para hacerlo sobresaturado con respecto a BLG antes de mezclarlo con la disolución de proteína de lactosuero o la alimentación de proteína de lactosuero.
Ventajosamente, estas realizaciones no requieren que la temperatura de las corrientes líquidas se aumente por encima de 15°C y, por tanto, son menos propensas a contaminación microbiana que las variantes del método que requieren mayores temperaturas. Otra ventaja industrial de estas realizaciones es que el nivel de sobresaturación se controla fácilmente y puede mantenerse en un nivel en el que no se produzca la cristalización espontánea no deseada. Por tanto, la temperatura de las corrientes líquidas durante estas realizaciones del método es preferiblemente de como máximo 15°C, más preferido de como máximo 12°C e incluso más preferido de como máximo 10°C, y lo más preferido de como máximo 5°C.
Estas realizaciones se ejemplifican en el ejemplo 10 y se ilustran en la figura 26. Estas realizaciones pueden implementarse como métodos discontinuos o un método continuo.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el método comprende una etapa d) de lavar los cristales de BLG, por ejemplo, los cristales de BLG separados de c). El lavado puede consistir en un único lavado en múltiples etapas de lavado.
El lavado de la etapa d) implica preferiblemente poner en contacto los cristales de BLG con un líquido de lavado sin disolver completamente los cristales de BLG y, posteriormente, separar los cristales de BLG restantes del líquido de lavado.
El líquido de lavado se selecciona preferiblemente para evitar la completa disolución de los cristales de BLG, y puede comprender, por ejemplo, o incluso consistir esencialmente en, agua desmineralizada fría, agua del grifo fría o permeado de ósmosis inversa frío.
El líquido de lavado puede tener un pH en el intervalo de 5-6, preferiblemente en el intervalo de 5,0-6,0 e incluso más preferiblemente en el intervalo de 5,1-6,0, tal como, por ejemplo, en el intervalo de 5,1-5,9.
El líquido de lavado puede tener una conductividad de como máximo 0,1 mS/cm, preferiblemente de como máximo 0,02 mS/cm e incluso más preferiblemente de como máximo 0,005 mS/cm.
Pueden usarse líquidos de lavado que tienen conductividades incluso menores. Por ejemplo, el líquido de lavado puede tener una conductividad de como máximo 1 pS/cm. Alternativamente, el líquido de lavado puede tener una conductividad de como máximo 0,1 pS/cm, tal como, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 pS/cm.
Preferiblemente, se realiza una etapa de lavado a baja temperatura para limitar la disolución de BLG cristalizada. La temperatura del líquido de lavado es preferiblemente de como máximo 30°C, más preferiblemente de como máximo 20°C e incluso más preferiblemente de como máximo 10°C.
Por ejemplo, puede realizarse una etapa de lavado a como máximo 5°C, más preferiblemente a como máximo 2°C, tal como, por ejemplo, a aproximadamente 0°C. Pueden usarse temperaturas menores de 0°C siempre que el líquido de lavado no se congele a esa temperatura, por ejemplo, debido a la presencia de uno o más depresores del punto de congelación.
En algunas realizaciones de la invención, el líquido de lavado contiene BLG, por ejemplo, en una cantidad de al menos el 1% (p/p) y preferiblemente en una cantidad de al menos el 3% (p/p), tal como, por ejemplo, en una cantidad del 4% (p/p).
El lavado de la etapa d) normalmente disuelve como máximo el 80% (p/p) de la cantidad inicial de cristales de BLG, preferiblemente como máximo el 50% (p/p) e incluso más preferiblemente como máximo el 20% (p/p) de la cantidad inicial de cristales de BLG. Preferiblemente, el lavado de la etapa d) disuelve como máximo el 15% (p/p) de la cantidad inicial de cristales de BLG, más preferiblemente como máximo el 10% (p/p) e incluso más preferiblemente como máximo el 5% (p/p) de la cantidad inicial de cristales de BLG.
La razón en peso entre la cantidad total de líquido de lavado y la cantidad inicial de cristales de BLG separados es, a menudo, de al menos 1, preferiblemente al menos 2 y más preferiblemente al menos 5. Por ejemplo, la razón en peso entre la cantidad de líquido de lavado y la cantidad inicial de cristales de BLG separados puede ser de al menos 10. Alternativamente, la razón en peso entre la cantidad total de líquido de lavado y la cantidad inicial de cristales de BLG separados puede ser de al menos 20, tal como, por ejemplo, de al menos 50 o al menos 100. El término “cantidad total de líquido de lavado” se refiere a la cantidad total de líquido de lavado usada durante todo el procedimiento.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la una o más secuencias de lavado tienen lugar en la misma disposición de filtro o en una disposición de filtro similar que la separación de cristales de BLG. Una torta de filtro que contiene principalmente cristales de BLG se añade una o más secuencias de líquido de lavado que se retira a través del filtro mientras que la parte restante de los cristales de BLG permanece en la torta de filtro.
En realizaciones particularmente preferidas de la invención, la separación de la etapa c) se realiza usando un filtro que retiene los cristales de BLG. Posteriormente, la torta de filtro se pone en contacto con una o más cantidades de líquido de lavado que se mueve a través de la torta de filtro y el filtro. A menudo se prefiere que cada cantidad de líquido de lavado sea de como máximo 10 veces el volumen de la torta de filtro, preferiblemente de como máximo 5 veces el volumen de la torta de filtro, más preferiblemente de como máximo 1 vez el volumen de la torta de filtro, incluso más preferiblemente de como máximo 0,5 veces el volumen de la torta de filtro, tal como, por ejemplo, de como máximo 0,2 veces el volumen de la torta de filtro. El volumen de la torta de filtro incluye tanto sólidos como fluidos (líquidos y gases) de la torta de filtro. Preferiblemente, la torta de filtro se lava de esta manera al menos 2
veces, preferiblemente al menos 4 veces e incluso más preferiblemente al menos 6 veces.
El líquido de lavado usado de la etapa d) puede recircularse, por ejemplo, a la alimentación de proteína de lactosuero o a la disolución de proteína de lactosuero, donde la BLG separada por lavado puede aislarse de nuevo. El método puede comprender además una etapa e) que implica una etapa de recristalización que comprende:
- disolver los cristales de BLG separados en un líquido de recristalización,
- ajustar el líquido de recristalización para obtener sobresaturación con respecto a BLG,
- cristalizar la BLG en el líquido de recristalización ajustado sobresaturado, y
- separar los cristales de BLG del líquido de recristalización ajustado restante.
La etapa e) puede comprender una única secuencia de recristalización o múltiples secuencias de recristalización. En algunas realizaciones de la invención, los cristales de BLG de la etapa c) o d) se recristalizan al menos 2 veces. Por ejemplo, los cristales de BLG pueden recristalizarse al menos 3 veces, tal como, por ejemplo, al menos 4 veces. Las etapas de lavado y recristalización pueden combinarse en cualquier secuencia y pueden realizarse múltiples veces, si se requiere.
Los cristales de BLG separados de la etapa c) pueden someterse, por ejemplo, a la secuencia de procedimiento:
- una o más etapas de lavado (etapa d), seguido por
- una o más etapas de recristalización (etapa e).
Alternativamente, los cristales de BLG separados de la etapa c) pueden someterse a la secuencia de procedimiento:
- una o más etapas de recristalización (etapa e), seguido por
- una o más etapas de lavado (etapa d).
También es posible combinar múltiples etapas de lavado y recristalización, por ejemplo, en la secuencia:
- una o más etapas de lavado (etapa d),
- una o más etapas de recristalización (etapa e),
- una o más etapas de lavado (etapa d), y
- una o más etapas de recristalización (etapa e).
O, por ejemplo, en la secuencia:
- una o más etapas de recristalización (etapa e),
- una o más etapas de lavado (etapa d),
- una o más etapas de recristalización (etapa e).
- una o más etapas de lavado (etapa d)
En algunas realizaciones de la invención, el método implica además someter la BLG separada a etapas de enriquecimiento de BLG adicionales, por ejemplo, basándose en cromatografía o filtración selectiva. Sin embargo, en otras realizaciones preferidas de la invención, el método no contiene etapas de enriquecimiento de BLG adicionales después de la etapa b). Por el término “etapa de enriquecimiento de BLG adicional” se entiende una etapa de procedimiento que enriquece en BLG en relación con la cantidad total de proteína, etapa que no está relacionada con la cristalización de BLG o la manipulación de cristales de BLG. Un ejemplo de una etapa de enriquecimiento de BLG adicional de este tipo es la cromatografía de intercambio iónico. El lavado de cristales de BLG y/o la recristalización de BLG no se consideran “etapas de enriquecimiento de BLG adicionales”.
En algunas realizaciones particularmente preferidas de la invención, el método implica una etapa de secado f), en la que una composición que contiene BLG derivada de la etapas b), c), d) o e) se convierte en una composición seca.
En el contexto de la presente invención, el término “seco” significa que la composición o el producto en cuestión comprende como máximo el 6% (p/p) de agua y preferiblemente incluso menos.
En el contexto de la presente invención, el término “composición que contiene BLG” se usa para describir la composición que se somete al secado de la etapa f).
En el contexto de la presente invención, una “composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e)” significa una composición que comprende al menos parte de la BLG de la etapa b), c), d) o e). En algunas realizaciones preferidas de la invención, la “composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e)” se obtiene directamente de la etapa b), c), d) o e). Sin embargo, en otras realizaciones preferidas de la invención, la “composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e)” es el resultado del procesamiento adicional de la composición obtenida directamente de la etapa b), c), d) o e).
A menudo se prefiere que la composición que contiene BLG contenga una cantidad significativa de la BLG presente en la composición obtenida directamente de la etapa b), c), d) o e). En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) comprende al menos el 50% (p/p) de la BLG obtenida de la etapa b), c), d) o e), preferiblemente al menos el 70% e incluso más preferiblemente al menos el 80%.
Preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) comprende al menos el 85% (p/p) de la BLG obtenida de la etapa b), c), d), o e). Más preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) comprende al menos el 90% (p/p) de la BLG obtenida de la etapa b), c), d) o e). Incluso más preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) comprende al menos el 95% (p/p) de la BLG obtenida de la etapa b), c), d) o e). Lo más preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) comprende el 100% (p/p) de la BLG obtenida de la etapa b), c), d) o e).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa de secado implica uno o más de secado por pulverización, secado por congelación, secado centrífugo instantáneo (“spin-flash”), secado rotatorio y/o secado en lecho fluidizado.
En algunas realizaciones particularmente preferidas de la invención, la etapa de secado implica una composición que contiene BLG que todavía contiene cristales de BLG y en la que el polvo resultante contiene cristales de BLG. Estas realizaciones se prefieren si la composición de BLG comestible debe tener una densidad mayor que el polvo de proteína de lactosuero secado convencional.
Tal como se documenta en el ejemplo 7, los presentes inventores han descubierto que es posible secar por pulverización una suspensión de cristales de BLG y retener al menos parte de la estructura cristalina cuando los cristales de BLG secados se vuelven a suspender en agua desmineralizada fría. Es particularmente ventajoso evitar la exposición de la composición que contiene BLG que contiene cristales de BLG a un régimen de tratamiento térmico que disuelva una cantidad significativa del cristal de BLG antes de la pulverización. Por tanto, si el precalentamiento de la composición que contiene BLG que contiene cristales de BLG se usa antes de la pulverización, se prefiere controlar con cuidado la carga de calor.
En algunas realizaciones de la invención, la composición que contiene BLG que contiene cristales de BLG tiene una temperatura de como máximo 70°C cuando alcanza la salida del dispositivo de pulverización (por ejemplo, una boquilla o un atomizador), preferiblemente de como máximo 60°C, más preferiblemente de como máximo 50°C. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene BLG que contiene cristales de BLG tiene una temperatura de como máximo 40°C cuando alcanza la salida del dispositivo de pulverización, preferiblemente de como máximo 30°C, más preferiblemente de como máximo 20°C, incluso más preferiblemente de como máximo 10°C y lo más preferiblemente de como máximo 5°C.
El dispositivo de pulverización del secador por pulverización es el dispositivo, por ejemplo, la boquilla o el atomizador, que convierte la disolución o suspensión que va a secarse en gotas que entran en la cámara de secado del secador por pulverización.
Se prefiere particularmente que la composición que contiene BLG que contiene cristales de BLG tenga una temperatura en el intervalo de 0-50°C cuando alcanza la salida del dispositivo de pulverización, preferiblemente en el intervalo de 2-40°C, más preferiblemente en el intervalo de 4-35°C y lo más preferiblemente en el intervalo de 5-10°C cuando alcanza la salida del dispositivo de pulverización.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 20% cuando alcanza la salida del dispositivo de pulverización, preferiblemente de al menos el 40%, más preferiblemente de al menos el 60%, incluso más preferiblemente de al menos el 80% y lo más preferiblemente de al menos el 90%, tal como, por ejemplo, preferiblemente del 97-100%. La composición que contiene BLG puede ser un aislado de BLG, por ejemplo, contiene BLG en una cantidad de más del 90% (p/p) en relación con la proteína
total o puede contener cantidades significativas de otras proteínas y, por tanto, contener BLG en una cantidad de como máximo el 90% (p/p) en relación con la proteína total.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene BLG puede tener la composición de proteína de un WPC o WPI líquido tradicional o un SPC o SPI líquido tradicional, tal como se describen en el presente documento, pero tener una cristalinidad de BLG de al menos el 20% cuando se alcanza la salida del dispositivo de pulverización, preferiblemente de al menos el 40%, más preferiblemente de al menos el 60%, incluso más preferiblemente de al menos el 80% y lo más preferiblemente de al menos el 90%, tal como, por ejemplo, preferiblemente del 97-100%.
La temperatura de entrada del gas del secador por pulverización está preferiblemente en el intervalo de 140-220°C, más preferiblemente en el intervalo de 160-200°C e incluso más preferiblemente en el intervalo de 170-190°C, tal como, por ejemplo, preferiblemente de aproximadamente 180°C. La temperatura de salida del gas del secador por pulverización está preferiblemente en el intervalo de 50-95°C, más preferiblemente en el intervalo de 70-90°C e incluso más preferiblemente en el intervalo de 80-88°C, tal como, por ejemplo, preferiblemente de aproximadamente 85°C. Como regla general, se dice que los sólidos que se someten a secado por pulverización se calientan hasta una temperatura que es 10-15°C menor que la temperatura de salida del gas.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el secador por pulverización está preferiblemente en el intervalo de 50-85°C, más preferiblemente en el intervalo de 60-80°C e incluso más preferiblemente en el intervalo de 65-75°C, tal como, por ejemplo, preferiblemente de aproximadamente 70°C.
El concepto de secar por pulverización una suspensión de cristales de BLG no se ha dado a conocer en la técnica anterior.
En el presente documento se da conocer un método de producción de una composición en polvo comestible secada por pulverización que comprende BLG, dicha composición que comprende cristales de BLG secados, comprendiendo el método las etapas de:
- proporcionar una composición líquida que contiene BLG que comprende cristales de BLG y que tiene preferiblemente una cristalinidad de b Lg de al menos el 20%, comprendiendo preferiblemente dicha composición líquida que contiene BLG al menos el 10% (p/p) de sólidos totales y comprendiendo preferiblemente al menos el 5% (p/p) de BLG, y
- atomizar la composición líquida que contiene BLG en la cámara de secado de un secador por pulverización en funcionamiento para convertir la composición líquida que contiene BLG que comprende cristales de BLG en un polvo.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene BLG que va a secarse se mezcla con un aislado de BLG seco para aumentar el contenido de sólidos hasta un nivel en el que la mezcla pueda secarse mediante secado en lecho fluidizado. Esto también se denomina retromezclado y permite un secado muy rentable del producto de BLG. Estas realizaciones son particularmente preferidas para composiciones que contienen BLG que contienen cristales de BLG.
Una ventaja del presente método es que la composición que contiene BLG que va a secarse puede tener un contenido de sólidos muy alto antes de la etapa de secado y, por tanto, tiene que retirarse menos agua y se consume menos energía en la operación de secado.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) tiene un contenido de sólidos de al menos el 20% (p/p). Preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) tiene un contenido de sólidos de al menos el 30% (p/p). Más preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) tiene un contenido de sólidos de al menos el 40% (p/p). Incluso más preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) tiene un contenido de sólidos de al menos el 50% (p/p), tal como, por ejemplo, de al menos el 60% (p/p).
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) tiene un contenido de sólidos en el intervalo del 20-80% (p/p). Preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) tiene un contenido de sólidos en el intervalo del 30-70% (p/p). Más preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) tiene un contenido de sólidos en el intervalo del 40-65% (p/p). Incluso más preferiblemente, la composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e) tiene un contenido de sólidos en el intervalo del 50-65% (p/p), tal como, por ejemplo, de aproximadamente el 60% (p/p).
Los presentes inventores han hallado que cuanto mayor es la cristalinidad de la composición que contiene BLG, menos agua se une a la composición que contiene BLG, y puede lograrse un mayor contenido de sólidos totales de la composición que contiene BLG antes de la etapa de secado.
Por tanto, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 10% (p/p). Preferiblemente, la BLG de la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de al menos el 20% (p/p). Más preferiblemente, la BLG de la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de al menos el 30% (p/p). Incluso más preferiblemente, la BLG de la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de al menos el 40% (p/p).
A menudo se prefieren cristalinidades incluso mayores. Por tanto, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la BLG de la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de al menos el 50% (p/p). Preferiblemente, la BLG de la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de al menos el 60% (p/p). Más preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 70% (p/p). Incluso más preferiblemente, la BLG de la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de al menos el 80% (p/p). Lo más preferido, la BLG de la composición que contiene BLG tiene una cristalinidad de al menos el 90% (p/p), preferiblemente de al menos el 95% (p/p), más preferiblemente de al menos el 97% (p/p) e incluso más preferiblemente de al menos el 99% (p/p).
Los inventores han hallado que un contenido reducido de agua tiende a aumentar la cristalinidad de BLG de una composición. Por tanto, las composiciones que tienen una alta razón de agua:BLG (por ejemplo, una suspensión de cristales de BLG al 4% en agua) tienden a tener una cristalinidad de BLG menor que las composiciones que tienen una menor razón de agua:BLG (por ejemplo, una torta de filtro o cristales aislados húmedos) en las mismas condiciones.
El método de la presente invención puede hacerse funcionar usando temperaturas suaves que no dañan el valor nutricional ni de la BLG ni de las otras proteínas de lactosuero de la disolución de proteína de lactosuero.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la BLG no se somete a una temperatura por encima de 90°C durante el método. Preferiblemente, la BLG no se somete a una temperatura por encima de 80°C durante el método. Incluso más preferido, la BLG no se somete a una temperatura por encima de 75°C durante el método. Cabe señalar que incluso aunque el secado por pulverización a menudo emplea temperaturas superiores a 150°C, el corto tiempo de exposición y la evaporación de agua simultánea significa que las proteínas secadas por pulverización no experimentan temperaturas por encima de 50-70°C.
Los inventores han observado indicios de que un calentamiento prolongado durante la etapa de secado reduce la cantidad de BLG que está en forma cristalina. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la exposición al calor durante la etapa de secado se mantiene lo suficientemente baja como para proporcionar un grado de desnaturalización de BLG de como máximo el 10%, preferiblemente de como máximo el 4%, más preferiblemente de como máximo el 1%, incluso más preferiblemente de como máximo el 0,4% e incluso más preferido de como máximo el 0,1%. Lo más preferiblemente, la etapa de secado no da como resultado una desnaturalización detectable de la BLG en absoluto.
El grado de desnaturalización provocado por la etapa de secado se calcula determinando el contenido de BLG (en relación con los sólidos totales) en la composición de BLG que va a secarse (cantes de la etapa f) en la etapa f) y el contenido de BLG (en relación con los sólidos totales) en la composición secada redisuelta y usando la fórmula:
Grado de desnaturalización — ((cantes de la etapa f - cdespués de la etapa f)/cantes de la etapa f)*100% También se da a conocer un método de preparación de una composición comestible que comprende betalactoglobulina (BLG) en forma cristalizada, comprendiendo el método las etapas de
a) proporcionar una disolución de proteína de lactosuero que comprende BLG y al menos una proteína de lactosuero adicional, dicha disolución de proteína de lactosuero está sobresaturada con respecto a BLG y tiene un pH en el intervalo de 5-6, comprendiendo dicha disolución de proteína de lactosuero:
- el 70-100% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
- el 30-90% (p/p) de BLG en relación con la proteína total, y preferiblemente el 30-70% (p/p) de BLG, - el 4-50% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y preferiblemente el 8-35% (p/p) de ALA, - el 0-25% (p/p) de CMP en relación con la proteína,
- al menos el 10% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la disolución de proteína de lactosuero, b) cristalizar la BLG en la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada, preferiblemente mediante la adición de semillas de cristalización, y
f) secar la composición que contiene BLG que se obtiene directamente de la etapa b), teniendo
preferiblemente dicha composición que contiene BLG una cristalinidad de BLG de al menos el 30%, método que no contiene las etapas c), d) o e).
La disolución de proteína de lactosuero es preferiblemente una disolución de proteína de lactosuero desmineralizada y tiene preferiblemente una razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de como máximo 0,3 y/o una conductividad del permeado de UF de como máximo 7 mS/cm.
En estas divulgaciones, los cristales de BLG no se separan de la disolución de proteína de lactosuero, pero se secan y dan como resultado una composición de BLG comestible de alta densidad en forma de polvo.
También se da a conocer un método de preparación de una composición comestible que comprende betalactoglobulina (BLG) en forma cristalizada, comprendiendo el método las etapas de
a) proporcionar una disolución de proteína de lactosuero que comprende BLG y al menos una proteína de lactosuero adicional, dicha disolución de proteína de lactosuero está sobresaturada con respecto a BLG y tiene un pH en el intervalo de 5-6, comprendiendo dicha disolución de proteína de lactosuero:
- el 70-100% (p/p) de proteína en relación con los sólidos totales,
- el 30-90% (p/p) de BLG en relación con la proteína total, y preferiblemente el 30-70%,
- el 4-50% (p/p) de ALA en relación con la proteína total, y preferiblemente el 8-35%,
- el 0-25% (p/p) de CMP en relación con la proteína total,
- al menos el 10% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la disolución de proteína de lactosuero, b) cristalizar la BLG en la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada, preferiblemente mediante la adición de semillas de cristalización,
c) separar los cristales de BLG a partir de la disolución de proteína de lactosuero restante,
d) opcionalmente, lavar los cristales de BLG separados obtenidos de la etapa c),
e) opcionalmente, recristalizar los cristales de BLG obtenidos de la etapa c) o d), y
f) secar una composición que contiene BLG derivada de, y preferiblemente obtenida directamente de, la etapa c), d), o e), composición que contiene BLG que comprende cristales de BLG y que tiene preferiblemente una cristalinidad de BLG de al menos el 30%.
La disolución de proteína de lactosuero es preferiblemente una disolución de proteína de lactosuero desmineralizada y tiene preferiblemente una razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de como máximo 0,3 y/o una conductividad del permeado de UF de como máximo 7 mS/cm.
Estas divulgaciones son particularmente útiles para elaborar composiciones de BLG comestibles bajas en minerales y bajas en fósforo en forma de polvos de alta densidad.
En algunas realizaciones preferidas, el presente método se implementa como un procedimiento discontinuo. Alternativamente, y algunas veces preferiblemente, el método puede implementarse como un procedimiento semicontinuo. En otras realizaciones preferidas, el método se implementa como un procedimiento continuo.
Una ventaja del presente método es que es mucho más rápido que los métodos comparables para la cristalización de BLG de la técnica anterior. La duración del ajuste inicial de la alimentación de proteína de lactosuero hasta completarse la separación de la etapa c) puede ser de como máximo 10 horas, preferiblemente de como máximo 4 horas, más preferiblemente de como máximo 2 horas e incluso más preferiblemente de como máximo 1 hora.
En el contexto de la presente invención, el término “cristal de BLG aislado” se refiere a un cristal de BLG que se ha separado de la disolución en la que se formó, pero que todavía contiene agua interna, es decir, agua que hidrata las moléculas de BLG del cristal.
Un cristal de BLG aislado que puede obtenerse mediante el método de la presente invención tiene preferiblemente un grupo espacial ortorrómbico P 212121.
Preferiblemente, el cristal de BLG aislado tiene un grupo espacial ortorrómbico P 212121 y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 (±5%) A, b = 68,68 (±5%) A y c = 156,65 (±5%) A; y que tiene los ángulos integrales de la
celda unitaria a=90° (±2%), p=90° (±2%) y y=90° (±2%).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el cristal de BLG aislado tiene un grupo espacial ortorrómbico P 2i 2i 2i y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 (±2%) A, b = 68,68 (±2%) A y c = 156,65 (±2%) A; y tiene los ángulos integrales de la celda unitaria a=90° (±1%), p=90° (±1%) y y=90° (±1%).
Incluso más preferido, el cristal de BLG aislado puede tener un grupo espacial ortorrómbico P 212121 y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 (±1%) A, b = 68,68 (±1%) A y c = 156,65 (±1%) A; y tiene los ángulos integrales de la celda unitaria a=90° (±0,5%), p=90° (±0,5%) y y=90° (±0,5%). Lo más preferiblemente, el cristal de BLG aislado tiene un grupo espacial ortorrómbico P 212121 y las dimensiones de la celda unitaria a=68,68 A, b = 68,68 A y c = 156,65 A; y tiene los ángulos integrales de la celda unitaria a=90°, p=90° y y=90°
Por ejemplo, el cristal de BLG aislado puede comprender al menos el 20% (p/p) de BLG y como máximo el 80% (p/p) de agua. Preferiblemente, el cristal de BLG aislado puede comprender al menos el 40% (p/p) de BLG y agua en el intervalo del 0-60% (p/p). Incluso más preferiblemente, el cristal de BLG aislado comprende BLG en el intervalo del 40-60% (p/p) y agua en el intervalo de aproximadamente el 40 - aproximadamente el 60% (p/p).
Los presentes inventores han hallado que, sorprendentemente, los cristales de BLG que pueden obtenerse mediante el método de la presente invención tienen la capacidad de recuperar su estructura cristalina original después de haberse secado y rehidratado. Esto es particularmente ventajoso en aplicaciones que se benefician de la estructura cristalina de BLG.
El método de la presente invención puede proporcionar una composición de BLG comestible que comprende al menos el 90% (p/p) de BLG en relación con los sólidos totales.
El método de la presente invención puede proporcionar una composición de BLG comestible que comprende cristales de BLG secados, al menos el 20% (p/p) de BLG en relación con los sólidos totales y que tiene preferiblemente una cristalinidad con respecto a BLG de al menos el 20%.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la BLG de la composición de BLG comestible tiene un grado de lactosilación de como máximo 1. Preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene un grado de lactosilación de como máximo 0,6. Más preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene un grado de lactosilación de como máximo 0,4. Incluso más preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene un grado de lactosilación de como máximo 0,2. Lo más preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene un grado de lactosilación de como máximo 0,1, tal como, por ejemplo, preferiblemente de como máximo 0,01.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la BLG de la composición de BLG comestible comprende al menos el 90% (p/p) de BLG no lactosilada, preferiblemente al menos el 95% (p/p) de BLG no lactosilada e incluso más preferiblemente al menos el 98% (p/p) de BLG no lactosilada.
El porcentaje de BLG no lactosilada se determinada según el ejemplo 9.1.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 10% (p/p). Preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 20% (p/p). Más preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 30% (p/p). Incluso más preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 40% (p/p).
A menudo se prefieren cristalinidades incluso mayores. Por tanto, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 50% (p/p). Preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 60% (p/p). Más preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 70% (p/p). Incluso más preferiblemente, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 80% (p/p). Lo más preferido, la BLG de la composición de BLG comestible tiene una cristalinidad de al menos el 90% (p/p) y preferiblemente de al menos el 95% (p/p).
La cristalinidad de BLG en un líquido que tiene un pH en el intervalo de 5-6 se mide según el ejemplo 9.7. La cristalinidad de BLG en un material en polvo se mide según el ejemplo 9.8. Si la composición comestible es un producto seco, pero no en forma de polvo, debe convertirse en un polvo, por ejemplo, mediante trituración o molienda, antes de someterse al método del ejemplo 9.8. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible es un WPC, WPI, SPC o SPI, en el que al menos parte de la BLG está en forma cristalina. Por ejemplo, la composición de BLG comestible puede comprender como máximo el 90% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína y tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 10%. Por ejemplo, la composición de BLG comestible puede comprender como máximo el 80% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína y tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 10%. Por ejemplo, la composición de BLG
comestible puede comprender el 30-70% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína y tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 10%.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende como máximo el 90% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína y tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 30%. Preferiblemente, la composición de BLG comestible puede comprender como máximo el 80% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína y tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 30%. Incluso más preferiblemente, la composición de BLG comestible puede comprender el 30-70% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína y tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 30%.
Los presentes inventores han hallado que la presente invención permite preparar un producto de proteína de lactosuero comestible que tiene un contenido muy bajo de fósforo y otros minerales, que es ventajoso para pacientes que padecen enfermedades renales o de lo contrario tienen un funcionamiento renal reducido.
La composición de BLG comestible es preferiblemente una composición baja en fósforo.
En el contexto de la presente invención, el término “baja en fósforo” se refiere a una composición, por ejemplo, un líquido, un polvo u otro producto alimenticio, que tiene un contenido total de fósforo de como máximo 100 mg de fósforo por 100 g de proteína. Preferiblemente, una composición baja en fósforo tiene un contenido total de como máximo 80 mg de fósforo por 100 g de proteína. Más preferiblemente, una composición baja en fósforo puede tener un contenido total de como máximo 50 mg de fósforo por 100 g de proteína. Incluso más preferiblemente, una composición baja en fósforo puede tener un contenido total de fósforo de como máximo 20 mg de fósforo por 100 g de proteína. Incluso más preferiblemente, una composición baja en fósforo puede tener un contenido total de fósforo de como máximo 5 mg de fósforo por 100 g de proteína.
Las composiciones bajas en fósforo obtenidas mediante el método según la presente invención pueden usarse como ingrediente alimentario para la producción de un producto alimenticio para grupos de pacientes que tienen un funcionamiento renal reducido.
Por tanto, en algunas realizaciones particularmente preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende como máximo 80 mg de fósforo por 100 g de proteína. Preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende como máximo 30 mg de fósforo por 100 g de proteína. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende como máximo 20 mg de fósforo por 100 g de proteína. Incluso más preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende como máximo 10 mg de fósforo por 100 g de proteína. Lo más preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende como máximo 5 mg de fósforo por 100 g de proteína. El contenido de fósforo se refiere a la cantidad total de fósforo elemental de la composición en cuestión y se determina según el ejemplo 9.5.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible es una composición baja en minerales.
En el contexto de la presente invención, el término “baja en minerales” se refiere a una composición, por ejemplo, un líquido, un polvo u otro producto alimenticio, que tiene al menos uno, preferiblemente dos e incluso más preferiblemente todos, de los siguientes:
- un contenido de cenizas de como máximo el 1,2% (p/p) en relación con los sólidos totales,
- un contenido total de calcio y magnesio de como máximo el 0,3% (p/p) en relación con los sólidos totales, - un contenido total de sodio y potasio de como máximo el 0,10% (p/p) en relación con los sólidos totales, - un contenido total de fósforo de como máximo 100 mg de fósforo por 100 g de proteína.
Preferiblemente, una composición baja en minerales tiene al menos uno, preferiblemente dos o más e incluso más preferiblemente todos, de los siguientes:
- un contenido de cenizas de como máximo el 0,7% (p/p) en relación con los sólidos totales,
- un contenido total de calcio y magnesio de como máximo el 0,2% (p/p) en relación con los sólidos totales, - un contenido total de sodio y potasio de como máximo el 0,08% (p/p) en relación con los sólidos totales, - un contenido total de fósforo de como máximo 80 mg de fósforo por 100 g de proteína.
Incluso más preferiblemente, una composición baja en minerales tiene al menos uno, preferiblemente dos o más e
incluso más preferiblemente todos, de los siguientes:
- un contenido de cenizas de como máximo el 0,5% (p/p) en relación con los sólidos totales,
- un contenido total de calcio y magnesio de como máximo el 0,15% (p/p) en relación con los sólidos totales, - un contenido total de sodio y potasio de como máximo el 0,06% (p/p) en relación con los sólidos totales, - un contenido total de fósforo de como máximo 50 mg de fósforo por 100 g de proteína.
Se prefiere particularmente que una composición baja en minerales tenga lo siguiente:
- un contenido de cenizas de como máximo el 0,5% (p/p) en relación con los sólidos totales,
- un contenido total de calcio y magnesio de como máximo el 0,15% (p/p) en relación con los sólidos totales, - un contenido total de sodio y potasio de como máximo el 0,06% (p/p) en relación con los sólidos totales, - un contenido total de fósforo de como máximo 50 mg de fósforo por 100 g de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de proteína de al menos el 25% (p/p) en relación con los sólidos totales de la composición de BLG comestible. Preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de proteína de al menos el 50% (p/p) en relación con los sólidos totales de la composición de BLG comestible. Más preferido, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de proteína de al menos el 75% (p/p) en relación con los sólidos totales de la composición de BLG comestible. Incluso más preferido, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de proteína de al menos el 90% (p/p) en relación con los sólidos totales de la composición de BLG comestible.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la cantidad total de proteína de la composición de BLG comestible está en el intervalo del 25-100% (p/p) en relación con los sólidos totales. Preferiblemente, la cantidad total de proteína de la composición de BLG comestible está en el intervalo del 50-100% (p/p). Más preferido, la cantidad total de proteína de la composición de BLG comestible está en el intervalo del 75-100% (p/p) en relación con los sólidos totales. Incluso más preferido, la cantidad total de proteína de la composición de BLG comestible está en el intervalo del 90-100% (p/p) en relación con los sólidos totales.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende al menos el 75% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Preferiblemente, la composición de BLG comestible puede comprender al menos el 90% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible puede comprender al menos el 95% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Incluso más preferiblemente, la composición de BLG comestible puede comprender al menos el 97% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína. Lo más preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende aproximadamente el 100% (p/p) de BLG en relación con la cantidad total de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible contiene como máximo el 10% (p/p) de hidratos de carbono, preferiblemente como máximo el 5% (p/p) de hidratos de carbono, más preferiblemente como máximo el 1% (p/p) de hidratos de carbono e incluso más preferiblemente como máximo el 0,1% (p/p) de hidratos de carbono.
La composición de BLG comestible también puede comprender lípidos, por ejemplo, en forma de triglicérido y/u otros tipos de lípidos, tales como fosfolípidos.
En algunas realizaciones de la invención, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 1% (p/p) en relación con los sólidos totales. Preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 0,5% (p/p) en relación con los sólidos totales. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 0,1% (p/p) en relación con los sólidos totales. Incluso más preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 0,05% (p/p) en relación con los sólidos totales. Lo más preferiblemente, la composición de BLG comestible comprende una cantidad total de lípidos de como máximo el 0,01% (p/p) en relación con los sólidos totales.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible es una composición seca y, por ejemplo, un polvo. Se prefiere particularmente que la composición de BLG comestible sea un polvo secado por pulverización.
Los presentes inventores han observado que cuando se secan las composiciones de BLG comestibles en forma de
polvo obtenidas mediante el método de la presente invención, en las que al menos parte de la BLG estaba en forma cristalina, tienen una densidad mayor que la composición de BLG comparable sin cristales de BLG (véase el ejemplo 7). Este efecto de alta densidad también se observó muy sorprendentemente para composiciones de BLG comestibles en forma de polvo que se obtienen a partir de suspensiones de cristales de BLG secados por pulverización.
Por tanto, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente de al menos 0,40 g/ml. Preferiblemente, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente de al menos 0,45 g/ml. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente de al menos 0,50 g/ml. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en forma de polvo tenga una densidad aparente de al menos 0,6 g/ml. La composición de BLG comestible en forma de polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente de al menos 0,7 g/ml.
La ventaja de la densidad aparente se aplica tanto a polvos de composiciones de BLG comestibles en las que la BLG es casi la única proteína presente como a polvos de composiciones de BLG comestibles en las que la concentración de BLG no se ha enriquecido en relación con las otras proteínas que estaban presentes en la disolución de proteína de lactosuero. Por tanto, la invención proporciona polvos de alta densidad tanto de BLG aislada como de proteína de lactosuero en bruto, que comprenden cantidades significativas de ALA y otras proteínas de lactosuero además de BLG.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente de al menos 0,45 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente de al menos 0,50 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición.. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en forma de polvo tenga una densidad aparente de al menos 0,6 g/ml y comprenda al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. La composición de BLG comestible en forma de polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente de al menos 0,7 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente de al menos 0,45 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente de al menos 0,50 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en forma de polvo tenga una densidad aparente de al menos 0,6 g/ml y comprenda al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. La composición de BLG comestible en forma de polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente de al menos 0,7 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición.
La composición de BLG comestible en forma de polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente en el intervalo de 0,40-1,5 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,45-1,0 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo puede tener una densidad aparente en el intervalo de 0,50-0,9 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en polvo tenga una densidad aparente en el intervalo de 0,6-0,9 g/ml y comprenda al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. La composición de BLG comestible en polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente en el intervalo de 0,6-0,8 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición.
Los inventores han hallado que los polvos de alta densidad que pueden obtenerse mediante el método de la presente invención permiten ventajosamente un envasado y una logística más rentables del polvo, ya que se requiere menos material de envasado por kg de polvo y puede transportarse más polvo (masa) en un contenedor o camión dado.
La composición de BLG comestible en forma de polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente en el intervalo de 0,40-1,5 g/ml. Preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,45-1,0 g/ml. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo puede tener una densidad aparente en el intervalo de 0,50-0,9 g/ml. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en polvo tenga una densidad aparente en el intervalo de 0,6-0,9 g/ml. La composición de BLG comestible en polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente en el intervalo de 0,6-0,8 g/ml.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,50-1,5 g/ml. Preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo
tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,55-1,0 g/ml. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo puede tener una densidad aparente en el intervalo de 0,60-1,0 g/ml. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en polvo tenga una densidad aparente en el intervalo de 0,65-1,0 g/ml. La composición de BLG comestible en polvo puede tener preferiblemente una densidad aparente en el intervalo de 0,70-1,0 g/ml.
La composición de BLG comestible en forma de polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente en el intervalo de 0,40-1,5 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,45-1,0 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo puede tener una densidad aparente en el intervalo de 0,50-0,9 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en polvo tenga una densidad aparente en el intervalo de 0,6-0,9 g/ml y comprenda al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. La composición de BLG comestible en polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente en el intervalo de 0,6-0,8 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición.
La composición de BLG comestible en forma de polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente en el intervalo de 0,40-1,5 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,45-1,0 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo puede tener una densidad aparente en el intervalo de 0,50-0,9 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en polvo tenga una densidad aparente en el intervalo de 0,6-0,9 g/ml y comprenda al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. La composición de BLG comestible en polvo puede tener, por ejemplo, una densidad aparente en el intervalo de 0,6-0,8 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,50-1,5 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,55-1,0 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo puede tener una densidad aparente en el intervalo de 0,60-1,0 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en polvo tenga una densidad aparente en el intervalo de 0,65-1,0 g/ml y comprenda al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. La composición de BLG comestible en polvo puede tener preferiblemente una densidad aparente en el intervalo de 0,70-1,0 g/ml y comprende al menos el 70% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible en forma de polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,50-1,5 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo tiene una densidad aparente en el intervalo de 0,55-1,0 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible en polvo puede tener una densidad aparente en el intervalo de 0,60-1,0 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. Es incluso más preferido que la composición de BLG comestible en polvo tenga una densidad aparente en el intervalo de 0,65-1,0 g/ml y comprenda al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición. La composición de BLG comestible en polvo puede tener preferiblemente una densidad aparente en el intervalo de 0,70-1,0 g/ml y comprende al menos el 80% (p/p) de proteína en relación con el peso total de la composición.
La densidad aparente de un polvo se mide según el ejemplo 9.3.
Los presentes inventores han observado indicios de que las composiciones de BLG obtenidas mediante el método de la presente invención tienen mejor estabilidad a largo plazo que composiciones de BLG similares. Este es particularmente el caso cuando parte de la BLG está presente en forma de cristales de BLG, que parece que ofrecen una mejor estabilidad en almacenamiento de las moléculas de BLG.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG seca tiene un índice de furosina de como máximo 80 mg/100 g de proteína después de 60 días a 30°C, preferiblemente de como máximo 60 mg/100 g de proteína, más preferiblemente de como máximo 40 mg/100 g de proteína e incluso más preferiblemente de como máximo 20 mg/100 g de proteína. Lo más preferiblemente, la composición de BLG seca tiene un índice de furosina de como máximo 10 mg/100 g de proteína después de 60 días a 30°C.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG seca tiene un índice de furosina de como máximo 80 mg/100 g de proteína, preferiblemente de como máximo 60 mg/100 g de proteína, más preferiblemente de como máximo 40 mg/100 g de proteína e incluso más preferiblemente de como máximo 20 mg/100 g de proteína. Lo más preferiblemente, la composición de BLG seca tiene un índice de furosina de como máximo 10 mg/100 g de proteína. Preferiblemente, la composición de BLG seca tiene un índice de furosina de 0 mg/100 g de proteína.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la BLG de la composición de BLG seca tiene un grado de lactosilación de como máximo 1 después de 60 días a 30°C, preferiblemente de como máximo 0,6, más preferiblemente de 0,2, incluso más preferiblemente de como máximo 0,1 y lo más preferiblemente de como máximo 0,01.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible es una composición líquida. Una composición líquida de BLG comestible comprende preferiblemente al menos el 20% (p/p) de agua, más preferiblemente al menos el 30% (p/p) de agua, incluso más preferiblemente al menos el 40% (p/p).
La composición líquida de BLG comestible puede comprender, por ejemplo, agua en el intervalo del 20-90% (p/p), más preferiblemente agua en el intervalo del 30-80% (p/p), incluso más preferiblemente al menos el 40% (p/p). Los presentes inventores han hallado que las composiciones de BLG comestibles obtenidas mediante el método de la presente invención tienen un grado de desnaturalización de proteína sorprendentemente bajo, incluso si se ha usado secado por pulverización para preparar una composición de polvo de BLG comestible (véase el ejemplo 11). Por tanto, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 2%. Preferiblemente, la composición de BLG comestible tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 1,5%. Más preferiblemente, la composición de BLG comestible tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 1,0%. Incluso más preferiblemente, la composición de BLG comestible tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 0,8%. Incluso más preferiblemente, la composición de BLG comestible tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 0,5%.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible es un polvo seco, y preferiblemente un polvo secado por pulverización, y tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 2% y preferiblemente de como máximo el 1,5%. Más preferiblemente, la composición seca de BLG comestible, por ejemplo en forma de un polvo secado por pulverización, tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 1,0%. Incluso más preferiblemente, la composición seca de BLG comestible, por ejemplo en forma de un polvo secado por pulverización, tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 0,8%. Incluso más preferiblemente, la composición seca de BLG comestible, por ejemplo en forma de un polvo secado por pulverización, tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 0,5%.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende:
- como máximo el 6% (p/p) de agua,
- al menos el 80% de proteína total en relación con los sólidos totales,
- al menos el 95% de BLG en relación con la proteína total, y
dicha composición de BLG comestible:
- es un polvo seco, y
- tiene una densidad aparente de al menos 0,50 g/ml y preferiblemente de al menos 0,60 g/ml.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende:
- como máximo el 6% (p/p) de agua,
- al menos el 80% de proteína total en relación con los sólidos totales,
- al menos el 95% de BLG en relación con la proteína total, y
dicha composición de BLG comestible:
- es un polvo seco,
- tiene una densidad aparente de al menos 0,50 g/ml y preferiblemente de al menos 0,60 g/ml, y - tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 20% y preferiblemente de al menos el 40%.
En realizaciones preferidas adicionales de la invención, la composición de BLG comestible comprende:
- como máximo el 6% (p/p) de agua,
- al menos el 80% de proteína total en relación con los sólidos totales,
- al menos el 95% de BLG en relación con la proteína total, y
dicha composición de BLG comestible:
- es un polvo seco,
- tiene una densidad aparente de al menos 0,50 g/ml y preferiblemente de al menos 0,60 g/ml, y
- tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 2% y preferiblemente de como máximo el 1,0%.
En realizaciones preferidas adicionales de la invención, la composición de BLG comestible comprende:
- como máximo el 6% (p/p) de agua,
- al menos el 80% de proteína total en relación con los sólidos totales,
- al menos el 95% de BLG en relación con la proteína total,
- como máximo 80 mg de fósforo por 100 g de proteína.
dicha composición de BLG comestible:
- es un polvo seco.
En aún realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende:
- como máximo el 6% (p/p) de agua,
- al menos el 90% de proteína total en relación con los sólidos totales,
- al menos el 97% de BLG en relación con la proteína total,
- como máximo 50 mg de fósforo por 100 g de proteína.
dicha composición de BLG comestible:
- es un polvo seco.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende:
- como máximo el 6% (p/p) de agua,
- al menos el 80% de proteína total en relación con los sólidos totales y preferiblemente al menos el 90% de proteína total en relación con los sólidos totales,
- el 30-70% de BLG en relación con la proteína total,
- el 8-25% (p/p) de ALA en relación con la proteína total,
dicha composición de BLG comestible:
- es un polvo seco, y
- tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 20% y preferiblemente de al menos el 40%.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende:
- el 20-80% (p/p) de agua y preferiblemente el 20-60% (p/p) de agua,
- al menos el 80% de proteína total en relación con los sólidos totales y preferiblemente al menos el 90% de proteína total,
- al menos el 95% de BLG en relación con la proteína total,
- como máximo 80 mg de fósforo por 100 g de proteína.
dicha composición de BLG comestible:
- tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 20%, preferiblemente de al menos 40, y
- opcionalmente, tiene un grado de desnaturalización de proteína de como máximo el 2% y preferiblemente de como máximo el 1,0%.
Las composiciones comestibles obtenidas mediante el método de la presente invención según estas realizaciones son particularmente útiles para preparar composiciones de BLG comestibles en forma secada, y son particularmente adecuadas para el secado por pulverización y la preparación de un polvo de proteína de lactosuero de alta densidad que tiene el perfil normal de concentración de especies de proteína de lactosuero, pero la proteína de lactosuero contiene al menos parte de la BLG en forma de cristales de BLG secados.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible comprende:
- el 20-80% (p/p) de agua y preferiblemente el 20-60% (p/p) de agua,
- al menos el 80% de proteína total en relación con los sólidos totales y preferiblemente al menos el 90% de proteína total en relación con los sólidos totales,
- el 30-70% de BLG en relación con la proteína total,
- el 8-25% (p/p) de ALA en relación con la proteína total,
dicha composición de BLG comestible:
- tiene una cristalinidad de BLG de al menos el 20% y preferiblemente de al menos el 40%.
Las composiciones comestibles obtenidas mediante el método de la presente invención según estas realizaciones son particularmente útiles para preparar composiciones de BLG comestibles en forma secada, y son particularmente adecuadas para el secado por pulverización y la preparación de un polvo de proteína de lactosuero de alta densidad que tiene el perfil normal de concentración de muestras de proteína de lactosuero, pero la proteína de lactosuero contiene al menos parte de la BLG en forma de cristales de b Lg secados.
La composición de BLG comestible obtenida mediante el método de la presente invención puede usarse como ingrediente alimentario.
Por ejemplo, puede preferirse usar una composición de BLG comestible baja en fósforo, tal como se define en el presente documento, como ingrediente alimentario en la producción de un producto alimenticio bajo en fósforo. En algunas realizaciones particularmente preferidas de la invención, el producto alimenticio es un producto alimenticio bajo en fósforo que comprende como máximo 100 mg de fósforo por 100 g de proteína, preferiblemente como máximo 80 mg de fósforo por 100 g de proteína, más preferiblemente como máximo 40 mg de fósforo por 100 g de proteína e incluso más preferiblemente como máximo 20 mg de fósforo por 100 g de proteína.
La BLG tiene un perfil de aminoácidos favorable y contribuye preferiblemente con una parte significativa a la proteína del producto alimenticio. Esto es particularmente interesante si el producto alimenticio es un producto alimenticio bajo en minerales o bajo en fósforo. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible contribuye a al menos el 25% (p/p) de la cantidad total de proteína del producto alimenticio o a al menos el 50% (p/p), más preferiblemente a al menos el 80% (p/p) e incluso más preferido a al menos el 90% (p/p). Puede ser incluso lo más preferido que la composición de BLG comestible contribuya con toda la proteína del producto
alimenticio.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de BLG comestible baja en fósforo contribuye a al menos el 25% (p/p) de la cantidad total de proteína del producto alimenticio bajo en fósforo o a al menos el 50% (p/p), más preferiblemente a al menos el 80% (p/p) e incluso más preferido a al menos el 90% (p/p). Puede ser incluso lo más preferido que la composición de BLG comestible baja en fósforo contribuya con toda la proteína del producto alimenticio bajo en fósforo.
Los ejemplos no limitativos del producto alimenticio son, por ejemplo, un producto lácteo, un dulce, una bebida, una barrita energética, una composición nutricional enteral, un producto de panadería.
Puede preferirse que el producto alimenticio sea una bebida. La bebida comprende preferiblemente:
- una composición de BLG comestible, tal como se define en el presente documento, para proporcionar una cantidad total de BLG de al menos el 1% (p/p), preferiblemente de al menos el 5% (p/p), más preferiblemente de al menos el 8% (p/p) e incluso más preferiblemente de al menos el 12% (p/p),
- un edulcorante, por ejemplo, un edulcorante de azúcar y/o un edulcorante distinto de azúcar,
- al menos un ácido alimentario, por ejemplo, ácido cítrico, u otros ácidos alimentarios adecuados,
- opcionalmente, un agente aromatizante, y
- como máximo 80 mg de fósforo/100 g de proteína,
que tiene un pH en el intervalo de 2,5-4,0.
Los presentes inventores se han dado cuenta de que la preparación de bebidas o líquidos ácidos, altos en proteínas y bajos en minerales a partir de una composición seca de BLG comestible que comprende cristales de BLG no es trivial. La composición seca de BLG comestible que comprende cristales de BLG crea un pH en el intervalo de 5-6 cuando se resuspende en agua, y la adición de ácidos o sales para cambiar el pH o aumentar la conductividad también aumenta la carga mineral del líquido/bebida resultante.
Sin embargo, los inventores han hallado que si se usan un ácido carboxílico, una lactona, un anhídrido de ácido carboxílico o una combinación de los mismos para reducir el pH, no se añaden minerales innecesarios y se obtiene un mejor control de la composición mineral de la bebida/líquido.
Ejemplos
Ejemplo 1: Cristalización de beta-lactoglobulina a partir de un concentrado de proteína de lactosuero en bruto Protocolo:
Se usó retenido de UF reducido en lactosa derivado de lactosuero dulce de un procedimiento de producción de queso convencional y filtrado a través de un filtro de 1,2 micrómetros como alimentación para el procedimiento de cristalización de BLG. Se acondicionó la alimentación de lactosuero dulce en un sistema de ultrafiltración usando una membrana de tipo Koch HFK-328 con un espaciador de 46 milésimas de pulgada, una presión de alimentación de 1,5-3,0 bar, usando una concentración de alimentación del 21% de ST (sólidos totales) ± 5 y agua depurada (agua filtrada por ósmosis inversa para obtener una conductividad de como máximo 0,05 mS/cm) como medio de diafiltración. La temperatura de la alimentación y del retenido durante la ultrafiltración fue de aproximadamente 12°C. A continuación se ajustó el pH añadiendo HCl para obtener un pH de aproximadamente 5,40. La diafiltración continuó hasta que la caída en la conductividad del retenido fue inferior a 0,03 mS/cm durante un periodo de 20 min. A continuación se concentró el retenido hasta aproximadamente el 30% de ST (aproximadamente el 23,1% de proteína total en relación con el peso total del retenido concentrado). Se centrifugó una muestra del retenido concentrado a 3000 g durante 5 minutos, pero no se formó sedimento visible. Se sometió el sobrenadante a análisis mediante HPLC. La composición de la alimentación se muestra en la tabla 1.
Se sembró el retenido concentrado con 0,5 g/l de material de cristales de BLG puro obtenido de una cristalización de BLG espontánea (tal como se describe en el ejemplo 3 en el contexto de la alimentación 2). Se preparó el material de siembra lavando una suspensión de cristales de BLG 5 veces en agua MilliQ, recogiendo los cristales de BLG después de cada lavado. Después de lavar, se secaron por congelación los cristales de BLG, se trituraron usando una mano de mortero y un mortero y luego se hicieron pasar a través de un tamiz de 200 micrómetros. Por tanto, las semillas de cristalización tenían un tamaño de partículas de menos de 200 micrómetros.
Se transfirió el retenido concentrado a un tanque de cristalización de 300 l en el que se enfrió hasta
aproximadamente 4°C, y se mantuvo a esta temperatura durante la noche con agitación suave. A la mañana siguiente, se transfirió una muestra del retenido concentrado enfriado a un tubo de ensayo y se inspeccionó tanto visualmente como por microscopía. Se habían formado de manera evidente durante la noche cristales que sedimentaron rápidamente. Se enfrió adicionalmente una muestra de laboratorio de la mezcla que comprendía tanto los cristales como las aguas madre hasta 0°C en un baño de agua helada. Se separaron por centrifugación las aguas madres y los cristales a 3000 g durante 5 minutos, y se tomaron muestras del sobrenadante y del sedimento para análisis mediante HPLC. Se lavaron una vez los cristales en agua depurada fría y luego se centrifugaron de nuevo antes del secado por congelación del sedimento.
Tabla 1 - Concentración de componentes seleccionados de la alimentación normalizada al 95% (p/p) de sólidos totales.
Se hicieron pasar las muestras usando las siguientes condiciones:
Tampón A: agua MilliQ, el 0,1% p/p de TFA
Tampón B: acetonitrilo de calidad para HPLC, el 0,085% p/p de TFA
Flujo: 1 ml/min
Gradiente: 0-30 minutos, el 82-55% de A y el 18-45% de B; 30-32 minutos, el 55-10% de A y el 45-90% de B; 32,5 37,5 minutos, el 10% de A y el 90% de B; 38-48 minutos, el 10-82% de A y el 90-18% de B.
Tratamiento de datos:
Como todas las muestras se trataron de la misma forma, se puede comparar directamente el área de los picos de BLG para obtener un rendimiento relativo. Como los cristales sólo contienen BLG y todas las muestras han sido tratadas de la misma forma, la concentración de alfa-lactoalbúmina (ALA) y, por tanto, el área de ALA, deben ser la misma en todas las muestras, por tanto, se usa el área de ALA antes y después de la cristalización como un factor de corrección (cf) cuando se calcula el rendimiento relativo.
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cTa - 7 ------- 1 .---------------------------------------area cíe a l d0 cri3t£I¡iE£ICi¿fj
El rendimiento relativo se calcula mediante la siguiente ecuación:
Resultados:
La figura 1 muestra los cromatogramas superpuestos de antes y después de la cristalización de BLG de un lactosuero dulce. La muestra “antes de la cristalización” se representa por la línea negra continua y la muestra “después de la cristalización” por la línea discontinua. Es evidente que se ha producido una gran disminución en la concentración de BLG y, usando el cálculo del rendimiento tal como se describió previamente, se determinó que el rendimiento de BLG retirada era del 64,5% (p/p).
Se investigó la suspensión de cristales por microscopía; tal como puede observarse a partir de la figura 2, la muestra contenía cristales hexagonales, teniendo muchos un tamaño considerablemente mayor de 200 micrómetros, lo que indica que los cristales observados no son sólo los cristales de siembra. Los cristales se desmenuzaron fácilmente cuando se presionaron con una aguja, lo que confirmó que eran cristales de proteína.
La figura 3 muestra el cromatograma de un producto de cristal lavado y, en este caso, la BLG constituye el 98,9% del área total del cromatograma. La pureza del producto de BLG puede aumentarse aún más mediante lavado adicional.
Conclusión:
Este ejemplo demuestra que, sorprendentemente, es posible cristalizar BLG selectivamente a partir de un concentrado de proteína del lactosuero en bruto que contiene más del 48% de proteína distinta de BLG en relación con la proteína total, y que el aislado de cristales de BLG obtenido tiene una pureza extremadamente alta. Este descubrimiento facilita un nuevo enfoque para la separación industrial de proteínas de la leche, en la que se separa la BLG de los otros componentes de proteína de una forma suave que evita preferiblemente la prolongada exposición a altas temperaturas y productos químicos problemáticos.
Ejemplo 2: La influencia de la conductividad y la temperatura sobre el rendimiento de BLG
Protocolo:
Usando la misma alimentación, sistema experimental y analítico que en el ejemplo 1, se tomaron muestras del retenido (aproximadamente el 13,9% (p/p) de proteína total) durante la diafiltración por UF a diferentes niveles de conductividad para investigar la influencia de la conductividad sobre el rendimiento de cristales de BLG. Se enfriaron las muestras hasta 4°C y se mantuvieron a esta temperatura durante la noche (sin embargo, los inventores han observado que 30 minutos, o incluso menos, pueden ser suficientes para que se alcance el equilibrio) y luego se enfriaron tres de las muestras hasta 0°C en agua helada y se mantuvieron a esa temperatura durante al menos 1 hora para mostrar los efectos de la temperatura sobre el rendimiento. Los resultados para las muestras a 4°C pueden observarse en la figura 4.
Después de completarse la diafiltración, se tomaron muestras a Brix 21, 24 y 32,5 durante la concentración. En primer lugar, se enfriaron estas muestras hasta 4°C y se mantuvieron a esa temperatura durante la noche. Se midió el rendimiento de cristales de BLG tal como se describe en el ejemplo 1. A continuación se enfriaron las muestras hasta 0°C en agua helada y se mantuvieron a esa temperatura durante al menos 1 hora. Posteriormente, se midió de nuevo el rendimiento de cristales de BLG.
Resultados:
Cuando se representa gráficamente el rendimiento relativo de BLG frente a la conductividad en las muestras tal como se observa en la figura 4, existe una clara correlación entre una conductividad menor y un rendimiento relativo de BLG mayor.
En la figura 5, que se muestra el rendimiento de tres de las muestras que varían en cuanto a conductividad a dos temperaturas (4°C y 0°C), puede observarse que cuanto menor es la temperatura, mayor es el rendimiento de BLG. Se espera que reducir la temperatura aumente aún más el rendimiento.
La figura 6 muestra la influencia de la concentración de proteína sobre el rendimiento relativo de BLG tanto a 4°C como a 0°C. La figura muestra una clara correlación entre la concentración de proteína, mostrada en este caso a través de una medición de Brix, y el rendimiento relativo de BLG, lo que indica que el rendimiento relativo continúa aumentando a medida que aumenta la concentración de proteína.
Conclusión:
Los inventores han observado que varios parámetros afectan a la eficiencia del procedimiento de cristalización. A un valor de pH dado, puede aumentarse el rendimiento de BLG disminuyendo la conductividad, aumentando la concentración de BLG y disminuyendo la temperatura.
Ejemplo 3: Cristalización de BLG en tres tipos de disoluciones de proteína de lactosuero
Protocolo:
Usando el mismo sistema experimental y analítico que en el ejemplo 1, se sometieron a prueba tres tipos diferentes de material de partida que contenían proteína de lactosuero como alimentaciones para la cristalización. Sin embargo, no se usó siembra en el experimento realizado con la alimentación 2. Las alimentaciones 1 y 2 se basaron en lactosuero dulce y se habían reducido en grasa mediante una membrana Synder FR antes del tratamiento tal como se describe en el ejemplo 1. La alimentación 3 se derivó de un lactosuero ácido.
La composición de las tres alimentaciones puede observarse a continuación en la tabla 2, la tabla 3 y la tabla 4. Se cristalizó la alimentación 3 al 21% de ST (proteína total del 13,3% p/p en relación con el peso total de la alimentación), una concentración significativamente menor que las otras dos (proteína total del 26,3% (p/p) en la alimentación 1 y del 25,0% (p/p) en la alimentación 2).
Se centrifugó la suspensión de la alimentación 1 cristalizada en un filtro Maxi-Spin con una membrana CA de 0,45 micrómetros a 1500 g durante 5 minutos, luego se añadieron 2 volúmenes de agua MilliQ a la torta de filtro antes de centrifugar de nuevo. Se analizó la torta de filtro resultante por HPLC. En la figura 24 se muestra una fotografía del filtro Maxi-Spin que contiene el sedimento (torta de filtro) de la alimentación 1 cristalizada. Se lavó el sedimento de la alimentación 2 con 2 volúmenes de agua MilliQ y se centrifugó de nuevo en condiciones convencionales antes de que el sedimento se analizara por HPLC. El sedimento de la alimentación 3 se analizó sin lavar.
Se diluyeron cristales preparados a partir de la alimentación 2 hasta el 10% de ST y se ajustó el pH a pH 7 usando NaOH 1 M para revertir la cristalización. Se añadió NaCl a una suspensión de cristales de la alimentación 2, el 36% de ST, para revertir la cristalización.
Tabla 2 - La concentración de componentes seleccionados de la alimentación 1 (concentrado de proteína de lactosuero basado en lactosuero dulce). BDL = por debajo del límite de detección en muestra húmeda
Tabla 3 - La concentración de componentes seleccionados de la alimentación 2 (concentrado de proteína de lactosuero reducido en ALA basado en lactosuero dulce). BDL = por debajo del límite de detección en muestra húmeda no normalizada.
Tabla 4 - La concentración de componentes seleccionados de la alimentación 3 (concentrado de proteína de lactosuero basado en lactosuero ácido).
Resultados:
Alimentación 1:
En la figura 7, pueden observarse los cromatogramas de la composición de proteína de la alimentación (línea continua) y las aguas madres (línea discontinua). Es evidente que se recuperó una gran parte de BLG como cristales mediante el procedimiento. El rendimiento (calculado tal como se describe en el ejemplo 1) de BLG aislada es de aproximadamente el 65% con respecto a la cantidad total de BLG en la alimentación.
La figura 8 es una fotografía de microscopio de una muestra tomada durante las fases tempranas del periodo de cristalización. La figura 9 es una fotografía de microscopio de una muestra que se tomó cuando se había completado la cristalización. Es evidente a partir de estas dos imágenes que los cristales de BLG son relativamente frágiles. Parece que algunos de los cristales se rompen durante la agitación y se convierten de la forma hexagonal o rómbica en fragmentos de cristal que todavía parecen muy compactos y bien definidos, pero tienen formas más irregulares. La figura 10 muestra el cromatograma de los cristales de BLG que se separaron y lavaron sobre un filtro centrífugo. Tal como se observa en la figura, la pureza es muy alta y la retirada de otras proteínas de lactosuero es extremadamente eficiente.
Alimentación 2:
En la figura 11 pueden observarse la composición de proteína de la alimentación 2 (línea continua) y las aguas madre obtenidas (línea discontinua). Es evidente que se ha retirado una gran parte de BLG, y el rendimiento calculado fue del 82% en relación con la cantidad total de BLG en la alimentación 2.
La figura 12 muestra la alimentación 2 antes (imagen de la izquierda) y después (imagen de la derecha) de la cristalización. Durante la cristalización, la alimentación se transformó de un líquido transparente (en el que el imán de agitación era visible) en un líquido opaco blanco lechoso.
La figura 13 muestra una fotografía de microscopio de los cristales de BLG. Pueden observarse formas hexagonales, aunque la mayoría de los cristales están fracturados.
La figura 16 es el cromatograma del sedimento aislado de cristales de BLG después de lavarse con 2 volúmenes de agua MilliQ. El cromatograma muestra claramente que los cristales contienen b Lg en una pureza muy alta.
Las figuras 14 y 15 muestran los resultados de o bien aumentar la conductividad (añadiendo NaCl) o bien alterar el pH (ajustando el pH a 7 mediante la adición de NaOH) de manera que el entorno ya no favorezca la estructura cristalina. En ambos casos, la suspensión blanca lechosa se convierte en un líquido transparente a medida que se disuelven los cristales de BLG.
La composición mineral de la preparación de cristales obtenida a partir de la alimentación 2 se proporciona en la Tabla 5. Se observó que la razón de fósforo con respecto a proteína era muy baja, lo que hace adecuada la preparación de cristales como fuente de proteína para pacientes que tienen enfermedades renales.
Alimentación 3:
En la figura 17 se muestran los cromatogramas de la composición de proteína de la alimentación 3 (línea continua) y las aguas madre resultantes (línea discontinua). Es evidente que se aisló una gran parte de BLG (un rendimiento calculado del 70,3% en relación con la cantidad total de BLG en la alimentación). Si el contenido de proteína hubiera sido mayor antes de la cristalización, el rendimiento obtenido habría sido incluso mayor.
La figura 18 es una fotografía de microscopio de los cristales de BLG aislados a partir de la alimentación 3 (sustancialmente libre de CMP). Los cristales tenían una forma rectangular a diferencia de hexagonal. Los cristales rectangulares parecían más robustos que los hexagonales. La figura 19 muestra un cromatograma del sedimento de cristales aislado sin lavar; el cromatograma muestra claramente que los cristales eran cristales de BLG a pesar de tener una forma rectangular en lugar de una forma hexagonal (compárense, por ejemplo, las formas cristalinas rectangulares de la figura 18 con las formas cristalinas hexagonales de la figura 2).
Tabla 6 - La concentración de componentes seleccionados de la preparación de cristales obtenida a partir de la alimentación 3.
La preparación de cristales derivada de la alimentación 3 contenía 45 mg de P/100 g de proteína. Se observó que la razón de fósforo con respecto a proteína era muy baja, lo que hace adecuada la preparación de cristales como fuente de proteína para pacientes que tienen enfermedades renales.
Conclusión:
Las tres alimentaciones fueron adecuadas para el procedimiento de cristalización de BLG. Se disolvieron fácilmente los cristales de BLG añadiendo sal o aumentando el pH o la temperatura. El nuevo método permite preparar preparaciones de BLG con contenidos de fósforo muy bajos, lo que hace adecuadas las preparaciones como fuentes de proteína para pacientes que tienen enfermedades renales.
Ejemplo 4: La influencia del pH sobre el rendimiento de cristales de BLG
Protocolo:
Se usó el mismo protocolo y sistema experimental que en el ejemplo 1 (usando concentrados de proteína de lactosuero dulce reducidos en grasa), con la excepción de que el pH se ajustó a los niveles descritos en la Tabla 8 para cada uno de los experimentos. La concentración de proteína al principio de la etapa de cristalización era de aproximadamente el 24% (p/p).
Se ajustó el pH con o bien una disolución diluida de NaOH (>4%) o bien una disolución diluida de HCl (>3,6%) para investigar el impacto del pH sobre el procedimiento de cristalización y el rendimiento obtenido. Después de la cristalización, se separaron por centrifugación los cristales de BLG tal como se describe en el ejemplo 1.
Tabla 7 - Los intervalos de concentración de componentes seleccionados de las alimentaciones usadas para el ejemplo 4.
Tabla 8 - pH objetivo de las muestras
Resultados:
Se calcularon los rendimientos tal como se describe en el ejemplo 1. Cabe señalar que las muestras de partida se tomaron antes de la adición del material de siembra. Por tanto, si las muestras no estaban sobresaturadas con respecto a BLG, el material de siembra se disolvería y contribuiría a la concentración total de BLG, en cuyo caso aparecería que el rendimiento de BLG era negativo.
Tabla 9 - Rendimientos calculados de las muestras basados en mediciones mediante HPLC.
Conclusión:
Este experimento demuestra que la cristalización de BLG en el modo de disolución de proteínas por adición de sal fue posible en el intervalo de pH de 5-6.
Ejemplo 5: Investigación del impacto de aumentar los niveles de conductividad
Protocolo:
Se usó el mismo protocolo y sistema experimental que en el ejemplo 1, con la excepción de que las muestras se tomaron a diferentes conductividades. Se acondicionó el material de partida mostrado en la tabla 10 y se usó como alimentación para el procedimiento de cristalización. Antes de la UF, se tomaron muestras del material de partida y se añadió NaCl para aumentar la conductividad, y para investigar bajo qué niveles de conductividad eran capaces de crecer los cristales de BLG. El contenido de proteína durante la cristalización era de aproximadamente el 16,7% (p/p).
Tabla 10 - Intervalos de composición de las alimentaciones usadas en el ejemplo 5.
Resultados:
Se trataron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1. La figura 20 muestra los rendimientos calculados a diferentes conductividades en el retenido. El punto a 3,53 mS/cm era el material de partida después del ajuste del pH. Todos los puntos por encima de 3,53 fueron un resultado de la adición de NaCl para aumentar la conductividad. Los puntos inferiores a 3,53 fueron un resultado de la diafiltración en el sistema de Uf . No se consideró significativo el rendimiento a 4,93 mS/cm, que estaba próximo a cero.
La muestra de retenido que tenía una conductividad de 4,93 mS/cm tenía una conductividad del permeado de UF de aproximadamente 5,7 mS/cm. La muestra de retenido que tenía una conductividad de 3,53 mS/cm tenía una conductividad del permeado de UF de aproximadamente 4,35 mS/cm.
A partir de la figura 20 puede observarse que los cristales de BLG se formaron en la alimentación a conductividades por debajo de 4,93 mS/cm (a 4°C y un contenido total de proteína de aproximadamente el 16,7% (p/p)). A una conductividad en el retenido de aproximadamente 2 mS/cm y la conductividad del permeado de UF de
aproximadamente 1,6 mS/cm, se obtuvo un rendimiento de BLG de aproximadamente el 75%.
La figura 21 es una fotografía de microscopio de los cristales formados a 4,20 mS/cm en el retenido que muestra las características esperadas del cristal de BLG.
Conclusión:
La alimentación específica del ejemplo 5 permitió formar cristales de BLG por debajo de 4,93 mS/cm (correspondiente a una conductividad del permeado de UF de 5,75 mS/cm y una razón entre la conductividad y la cantidad total de proteína de 0,057). Se espera que el límite superior de la conductividad dependa de la concentración de proteína y la composición de proteína. Por ejemplo, se espera que una mayor concentración de proteína y/o un aumento del contenido de las proteínas altamente cargadas u otras macromoléculas (por ejemplo, CMP) aumente el límite superior de la conductividad a la que es posible la cristalización de BLG.
Ejemplo 6: Cristalización de BLG en un concentrado de proteína de suero
Se preparó un concentrado de proteína de suero (SPC) sometiendo una leche desnatada a microfiltración usando una membrana Synder FR y una temperatura de procedimiento de aproximadamente 50°C. El retenido obtenido contenía sustancialmente toda la caseína y grasa residual y contenía además alguna proteína de suero, lactosa y minerales. El permeado contenía moléculas que podían permear a través de la membrana, incluyendo proteína de suero, lactosa y minerales, pero sustancialmente ni caseína ni grasa. A continuación se preparó el permeado para la cristalización tal como se describe en el ejemplo 1 (véase la Tabla 11 para la composición de la alimentación) y se caracterizaron los cristales de BLG obtenidos tal como se describe en el ejemplo 1. Sin embargo, en lugar de realizar todas las operaciones de UF a 12°C, se aumentó la temperatura del retenido desde 12°C hasta 25°C cuando la conductividad del retenido se aproximó a 1 mS/cm. Se aumentó la temperatura para evitar la cristalización espontánea de BLG durante la concentración por UF.
Tabla 11 - La concentración de componentes seleccionados de la alimentación (concentrado de proteína de suero). BDL = por debajo del límite de detección en muestra húmeda no normalizada.
Similar a las cristalizaciones de los ejemplos 1-5, la BLG de la alimentación de SPC formó cristales que pudieron separarse con una pureza muy alta (confirmada por cromatografía como en los ejemplos previos) y proporcionó un rendimiento de BLG del 70% en relación con la cantidad total de BLG de la alimentación de SPC. En la figura 22, se muestran los cristales de BLG de las fases tempranas de la cristalización. Tal como se ha observado previamente, los cristales tienen una forma rectangular o cuadrada, a diferencia de la forma hexagonal observada, por ejemplo, en el ejemplo 2.
Ejemplo 7: Preparación de cristales de BLG secados por pulverización y determinación de la densidad aparente Se separó una parte de los cristales de BLG producidos en el ejemplo 3 (usando la alimentación 2) en una centrífuga decantadora a 1200 g, 5180 RPM, dif. de 110 RPM, con un espaciador de 64 milésimas de pulgada (milésima de pulgada significa 1/1000 pulgadas) y un flujo de 25-30 l/h. A continuación se mezcló 1:1 la fase de cristales de BLG con agua depurada y luego se separó de nuevo en la centrífuga decantadora usando los mismos parámetros. Luego se mezcló la fase de cristales de BLG con agua depurada para convertirla en una suspensión que contenía aproximadamente el 25% de materia seca y que tenía una cristalinidad de BLG de aproximadamente 80, y
posteriormente se secó en un secador por pulverización de planta piloto con una temperatura de entrada de 180°C y una temperatura de salida de 85°C sin precalentamiento. La temperatura de las corrientes de líquido hasta el secado por pulverización era de 10-12°C. El polvo resultante muestreado en la salida tenía un contenido de agua del 4,37% (p/p).
La cristalinidad de BLG en la suspensión era de aproximadamente el 90%.
Los inventores también han separado satisfactoriamente una suspensión de cristales de BLG y las aguas madre en una centrífuga decantadora a 350 g, 2750 RPM, dif. de 150 RPM, con un espaciador de 64 milésimas de pulgada y un flujo de 75 l/h. Posteriormente se mezcló 1:2 la fase de cristales de BLG con agua depurada. A continuación se mezcló la fase de cristales de BLG con agua depurada para convertirla en una suspensión más diluida, y posteriormente se secó en un secador por pulverización de planta piloto usando los mismos parámetros que se han descrito anteriormente.
A continuación se midió la densidad aparente del polvo secado por pulverización según el ejemplo 9.3 y se comparó con la densidad aparente de un WPI convencional secado en el mismo equipo. Se halló que el WPI convencional tenía una densidad aparente (basada en 625 compactaciones) de 0,39 g/ml, que es el extremo superior del intervalo normal para un polvo de WPI. Sin embargo, la preparación de cristales de BLG secados por pulverización tenía una densidad aparente de 0,68 g/ml, más del 75% superior a la densidad aparente del WPI convencional (véase, por ejemplo, la figura 23). Esto es verdaderamente sorprendente y proporciona varias ventajas tanto logísticas como relacionadas con la aplicación.
Tabla 12 - La concentración de componentes seleccionados de la preparación de cristales de BLG secados por pulverización del ejemplo 7. BDL = por debajo del límite de detección
Una muestra de la preparación de cristales de BLG secados por pulverización se resuspendió posteriormente en agua desmineralizada fría y los cristales de BLG todavía eran claramente visibles por microscopía. La adición de ácido cítrico o NaCl provocó que se disolvieran los cristales de BLG y transformaran la suspensión opaca de cristales en un líquido transparente.
Los inventores han observado indicios de que el calentamiento prolongado durante la etapa de secado reduce la cantidad de BLG que está en forma cristalina. Por tanto, se prefiere que la exposición al calor de la preparación de cristales de BLG sea tan baja como sea posible.
Conclusión:
Este ejemplo demuestra que las suspensiones que comprenden cristales de BLG pueden secarse por pulverización y que los cristales de BLG están todavía presentes en el polvo resuspendido secado por pulverización si se controla el calentamiento durante la etapa de secado.
Los inventores hallaron además que la densidad aparente de un polvo de proteína de lactosuero que contiene cristales de BLG es considerablemente superior a la obtenida mediante secado por pulverización normal de corrientes de proteína disueltas. Los polvos de alta densidad permiten un envasado y una logística más rentables del polvo, ya que se requiere menos material de envasado por kg de polvo y puede transportarse más polvo (masa) por contenedor o camión dado.
También parece que el polvo de alta densidad es más fácil de manipular y menos esponjoso y pulverulento durante la fabricación y el uso.
Ejemplo 8: Bebida de proteína baja en fósforo
Se prepararon seis muestras de bebida baja en fósforo usando el producto de BLG purificado del ejemplo 3 (la preparación de cristales obtenida a partir de la alimentación 3). Se mezclaron todos los ingredientes secos con agua desmineralizada para obtener 10 kg de cada muestra y se dejó que se hidrataran durante 1 hora a 10°C.
Tabla 13 - Composición de las seis muestras de bebida.
Se tomaron las submuestras de las seis muestras para medir la turbidez en un turbidímetro Turbiquant® 3000 IR y la viscosidad en un dispositivo Vicoman de Gilson. Los resultados se muestran en la tabla a continuación.
Tabla 14 - Viscosidad y turbidez medidas de las seis muestras de bebida.
En la figura 25 se muestra una fotografía de los tubos de ensayo que contienen submuestras de las seis muestras de bebida baja en fósforo. De izquierda a derecha, las submuestras eran la muestra A, B, C, D, E y F. La inspección visual de los tubos de ensayo verificó las mediciones de turbidez y documentó que todas las muestras de bebida eran transparentes y que, particularmente, las muestras C y D (pH 3,0) eran muy claras. Las bajas viscosidades demuestran que las muestras de bebida eran fácilmente bebibles.
Todos los ingredientes usados para preparar la bebida eran bajos en fósforo y no contenían minerales innecesarios. Por tanto, las bebidas obtenidas tenían un contenido de fósforo de aproximadamente 45 mg de P/100 g de proteína y, generalmente, tenían un contenido de minerales muy bajo. Por tanto, las seis bebidas eran adecuadas para su uso como bebidas de proteína para pacientes con enfermedad renal.
Ejemplo 9 - Métodos de análisis
Ejemplo 9.1: Determinación de BLG lactosilada frente a BLG no lactosilada:
Cuantificación de la cantidad de BLG lactosilada y BLG nativa realizada usando CL-EM.
Los análisis se realizaron en un dispositivo de EM 6410 Triple Quad de Agilent Technologies acoplado a un dispositivo de HPLC serie HP1200 también de Agilent Technologies. Para la separación antes de la ionización, se aplicó una columna Symmetry300™ C18 (WAT106172: partículas de fase sólida de 5 pm, dimensiones de la columna 2,1x150 mm) y las proteínas se detectaron a 214 nm. Antes de analizar las muestras, se filtraron a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Todas las muestras se hicieron pasar por duplicado.
Los análisis se realizaron usando las siguientes condiciones:
HPLC
Tampón A: el 99,9% de agua MilliQ con el 0,1% de TFA
Tampón B: el 9,9% de agua MilliQ, el 90% de acetonitrilo, el 0,1% de TFA
Flujo: 0,3 ml/min
Gradiente:
0-20 min: el 85-60% de A y el 15-40% de B,
20-45 min: el 60-50% de A y el 40-50% de B,
45-55 min: el 0% de A y el 100% de B,
55-70 min el 85% de A y el 15% de B,
Carga: 40 pl
La temperatura de la columna se estableció a 60°C.
Espectroscopia de masas:
Se detectaron iones con una m/z de 100-2000 y los datos resultantes se evaluaron en el software MassHunter Workstation, Ver. B.04.00. Usando deconvolución, se agruparon todas las formas de la misma especie (masa). Se sometieron las masas entre 18 kDa y 20 kDa a investigación adicional. La masa intacta de BLG-A es 18,361 kDa y de BLG-B es 18,276, una lactosilación añade 324 Da a la masa de la proteina, examinando este área de masa pueden detectarse hasta 5 lactosilaciones por proteina. La cuantificación relativa se realiza comparando la intensidad de señal para cada masa, ignorando la discriminación por ionización de las diferentes especies.
Ejemplo 9.2: Determinación de proteína total
El contenido total de proteina (proteina verdadera) de una muestra se determina:
1) Determinando el nitrógeno total de la muestra siguiendo la norma ISO 8968-1 /2|IDF 020-1/2 - Milk - Determination of nitrogen content - Parte 1/2: Determination of nitrogen content using the Kjeldahl method.
2) Determinando el nitrógeno no proteico de la muestra siguiendo la norma ISO 8968-4|IDF 020-4 - Milk -Determination of nitrogen content - Parte 4: Determination of non-protein-nitrogen content.
3) Calculando la cantidad total de proteina como (mnitrógeno total - mnitrógeno no proteico) *6,38.
Ejemplo 9.3: Determinación de la densidad a granel y densidad aparente
La densidad de un polvo seco se define como la razón entre el peso y el volumen del polvo que se analiza usando un volúmetro Stampf especial (es decir, una probeta graduada) en condiciones especificadas. La densidad normalmente se expresa en g/ml o kg/l.
En este método, se compacta una muestra de polvo secado en una probeta graduada. Después de un número especificado de asentamientos, se lee el volumen del producto y se calcula la densidad.
Se pueden definir tres tipos de densidades por este método:
■ Densidad libremente asentada, que es la masa dividida entre el volumen de polvo después de que se haya transferido a la probeta graduada especificada.
■ Densidad a granel, que es la masa dividida entre el volumen de polvo después de 100 asentamientos según las condiciones especificadas en esta norma.
■ Densidad aparente, que es la masa dividida entre el volumen de polvo después de 625 asentamientos según las condiciones especificadas en esta norma.
El método usa una probeta graduada especial, de 250 ml, graduada de 0-250 ml, peso de 190 ± 15 g (J. Engelsmann A. G. 67059 Ludwigshafen/Rh) y un volúmetro Stampf, por ejemplo, J. Engelsmann A. G.
Se determinan la densidad a granel y la densidad aparente del producto secado por el siguiente procedimiento. Pretratamiento:
Se almacena la muestra que va a medirse a temperatura ambiente.
A continuación se mezcla minuciosamente la muestra rotando y girando repetidamente el recipiente (evitar destruir las partículas). El recipiente no se llena más de 2/3.
Procedimiento:
Pesar 100,0 ± 0,1 gramos de polvo y transferirlos a la probeta graduada. Se lee el volumen V0 en ml.
Si no caben 100 g de polvo en la probeta, la cantidad debe reducirse hasta 50 ó 25 gramos.
Fijar la probeta graduada al volúmetro Stampf y dejar que se asiente 100 asentamientos. Nivelar la superficie con la espátula y leer el volumen V100 en ml.
Cambiar el número de asentamientos a 625 (incluidos los 100 asentamientos). Después de asentar, nivelar la superficie y leer el volumen V625 en ml.
Cálculo de densidades:
Calcular las densidades a granel y aparente expresadas en g/ml según la siguiente fórmula:
Densidad aparente = M/V
en la que M designa la muestra pesada en gramos y V designa el volumen después de 625 asentamientos en ml. Ejemplo 9.4: Determinación del contenido de agua de un polvo
El contenido de agua de un producto alimenticio se determina según la norma ISO 5537:2004 (Dried milk -Determination of moisture content (Método de referencia)). NMKL es una abreviatura de “Nordisk Metodikkomité for N^ringsmidler”.
Ejemplo 9.5: Determinación de las cantidades totales de calcio, magnesio, sodio, potasio, fósforo
Se determina la cantidad total de calcio, magnesio, sodio, potasio y fósforo usando un procedimiento en el que, en primer lugar, se descomponen las muestras usando digestión por microondas y luego se determina la cantidad total de mineral(es) usando un aparato de ICP.
Aparato:
El microondas es de Anton Paar y el ICP es un dispositivo Optima 2000DV de PerkinElmer Inc.
Materiales:
HNO31 M,
Itrio en HNO3 al 2%,
Patrones adecuados para calcio, magnesio, sodio, potasio y fósforo en HNO3 al 5%.
Pretratamiento:
Pesar una determinada cantidad de polvo y transferir el polvo a un tubo de digestión de microondas. Añadir 5 ml de HNO31 M. Digerir las muestras en el microondas según las instrucciones del microondas. Poner los tubos digeridos en una campana extractora, quitar la tapa y dejar que se evaporen los gases volátiles.
Procedimiento de medición:
Transferir la muestra pretratada a digiTUBE usando una cantidad conocida de agua Milli-Q. Añadir una disolución de itrio en HNO3 al 2% al tubo de digestión (aproximadamente 0,25 ml por 50 ml de muestra diluida) y diluir hasta un volumen conocido usando agua Milli-Q. Analizar las muestras en el ICP usando el procedimiento descrito por el fabricante.
Se prepara una muestra ciega diluyendo una mezcla de 10 ml de HNO31 M y 0,5 ml de disolución de itrio en HNO3 al 2% hasta un volumen final de 100 ml usando agua Milli-Q.
Se preparan al menos 3 muestras convencionales que tienen concentraciones que agrupan las concentraciones de muestra esperadas.
Ejemplo 9.6: Determinación del índice de furosina:
Se determina el índice de furosina tal como se describe en “Maillard Reaction Evaluation by Furosine Determination During Infant Cereal Processing”, Guerra-Hernandez et al., Journal of Cereal Science 29 (1999) 171-176 y se determina la cantidad total de proteína según el ejemplo 9.2. El índice de furosina se notifica en la unidad de mg de furosina por 100 g de proteína.
Ejemplo 9.7: Determinación de la cristalinidad de BLG en un líquido
Se usa el siguiente método para determinar la cristalinidad de BLG en un líquido que tiene un pH en el intervalo de 5-6.
a) Transferir una muestra de 10 ml del líquido en cuestión a un filtro Maxi-Spin con una membrana CA de 0,45 micrómetros de tamaño de poro.
b) Centrifugar inmediatamente el filtro a 1500 g durante 5 min manteniendo la centrífuga a 2°C.
c) Añadir 2 ml de agua MilliQ fría (2°C) en el lado del retenido del filtro centrífugo e inmediatamente centrifugar el filtro a 1500 g durante 5 min mientras se mantiene lo centrifugado enfriado a 2°C, recoger el permeado (permeado A), medir el volumen y determinar la concentración de BLG mediante HPLC usando el método brevemente expuesto en el ejemplo 9.9.
d) Añadir 4 ml de NaCl 2 M en el lado del retenido del filtro, agitar rápidamente y dejar reposar la mezcla durante 15 minutos a 25°C.
e) Centrifugar inmediatamente el filtro a 1500 g durante 5 min y recoger el permeado (permeado B).
f) Determinar el peso total de BLG en el permeado A y el permeado B usando el método brevemente expuesto en el ejemplo 9.9 y convertir los resultados en peso total de b Lg en lugar de porcentaje en peso. El peso de BLG en el permeado A se denomina mpermeado a y el peso de BLG en el permeado B se denomina mpermeado b.
g) La cristalinidad del líquido con respecto a BLG se determina como:
cristalinidad — mpermeado B/(mpermeado A+mpermeado b)*100%
Ejemplo 9.8: Determinación de la cristalinidad de BLG en un polvo seco
Este método se usa para determinar la cristalinidad de BLG en un polvo seco.
a) Se mezclan 5,0 gramos de la muestra en polvo con 20,0 gramos de agua MilliQ fría (2°C) y se deja reposar durante 5 minuto a 2°C.
b) Transferir la muestra del líquido en cuestión a un filtro Maxi-Spin con una membrana CA de 0,45 micrómetros. c) Centrifugar inmediatamente el filtro a 1500 g durante 5 min manteniendo la centrífuga a 2°C.
d) Añadir 2 m de agua Milli-Q fría (2°C) en el lado del retenido del filtro centrífugo y centrifugar inmediatamente el filtro a 1500 g durante 5 min, recoger el permeado (permeado A), medir el volumen y determinar la concentración de BLG mediante HPLC usando el método brevemente expuesto en el ejemplo 9.9, y convertir los resultados en peso total de BLG en lugar de porcentaje en peso. El peso de BLG en el permeado A se denomina mpermeado a.
f) A continuación se calcula la cristalinidad de BLG en el polvo usando la siguiente fórmula:
en la que mBLG total es la cantidad total de BLG en la muestra en polvo de la etapa a).
Si la cantidad total de BLG de la muestra en polvo es desconocida, esta puede determinarse suspendiendo otros 5 g
de muestra en polvo (de la misma fuente de polvo) en 20,0 gramos de agua MilliQ, ajustando el pH a 7,0 mediante la adición de NaOH acuoso, dejando reposar la mezcla durante 1 hora a 25°C con agitación y finalmente determinando la cantidad total de BLG de la muestra en polvo usando el ejemplo 9.9.
Ejemplo 9.9: Determinación de la cantidad total de BLG, ALA y CMP en un líquido acuoso
Se analizó el contenido de alfa-lactoalbúmina, beta-lactoglobulina y CMP por análisis mediante HPLC a 0,4 ml/min. Se inyectan 25 pl de muestra filtrada en 2 columnas TSKgel3000PWxl (7,8 mm x 30 cm, To-sohass, Japón) conectadas en serie con una precolumna PWxl unida (6 mm x 4 cm, To-sohass, Japón) equilibrada en el eluyente (que consiste en 465 g de agua MilliQ, 417,3 g de acetonitrilo y 1 ml de ácido trifluoroacético) y usando un detector de UV a 210 nm.
Se realizó la determinación cuantitativa del contenido de alfa-lactoalbúmina nativa (Calfa), beta-lactoglobulina (Cbeta) y caseinomacropéptido (Ccmp) comparando las áreas de pico obtenidas para las proteínas convencionales correspondientes con las de las muestras.
Se determinó la cantidad total de proteína adicional (proteína distinta de BLG) restando la cantidad de BLG de la cantidad total de proteína (determinada según el ejemplo 9.2).
Ejemplo 9.10: Determinación de la conductividad del permeado de UF
Se transfieren 15 ml de muestra a unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 con un corte de 3 kDa (3000 NMWL) y se centrifugan a 4000 g durante 20-30 minutos o hasta que se acumule un volumen suficiente de permeado de UF para medir la conductividad en la parte inferior de las unidades de filtro.
La conductividad se mide inmediatamente después de la centrifugación. La manipulación de muestras y la centrifugación se realizan a la temperatura de la fuente de la muestra.
Ejemplo 9.11: Determinación del grado de desnaturalización de proteína de una composición de proteína de lactosuero
Se sabe que la proteína de lactosuero desnaturalizada tiene una menor solubilidad a pH 4,6 que a pH 7,0 y el grado de desnaturalización de una composición de proteína de lactosuero se determina midiendo la cantidad de proteína soluble a pH 4,6 en relación con la cantidad total de proteína a pH 7,0.
Más específicamente, la composición de proteína de lactosuero que va a analizarse (por ejemplo, un polvo o una disolución acuosa) se convierte en:
- una primera disolución acuosa que contiene el 5,0% (p/p) de proteína total y que tiene un pH de 7,0, y
- una segunda disolución acuosa que contiene el 5,0% (p/p) de proteína total y que tiene un pH de 4,6.
Se hacen ajustes de pH usando NaOH (ac.) al 3% (p/p) o HCl (ac.) al 5% (p/p).
Se determina el contenido total de proteína (PpH 7,0) de la primera disolución acuosa según el ejemplo 9.2.
La segunda disolución acuosa se almacena durante 2 h a temperatura ambiente y posteriormente se centrifuga a 3000 g durante 5 minutos. Se recupera una muestra de sobrenadante y se analiza según el ejemplo 9.2 para determinar la proteína total (SpH 4,6).
El grado de desnaturalización de proteína, D, de la composición de proteína de lactosuero se calcula como:
D = ((PpH 7,0-SpH 4,6)/PpH 7,0)*100%
Ejemplo 9.12: Detección de cristales de BLG secados en un polvo
Puede identificarse la presencia de cristales de BLG secados en un polvo de la siguiente forma:
Se resuspende una muestra del polvo que va a analizarse y se mezcla suavemente en agua desmineralizada que tiene una temperatura de 4°C en una razón en peso de 2 partes de agua con respecto a 1 parte de polvo, y se deja rehidratar durante 1 hora a 4°C.
Se inspecciona la muestra rehidratada por microscopía para identificar la presencia de cristales, preferiblemente usando luz polarizada plana para detectar birrefringencia.
Se separa la materia de tipo cristal y se somete a cristalografía de rayos X para verificar la existencia de estructura
cristalina, y preferiblemente también verificar que la red cristalina (grupo espacial y dimensiones de la celda unitaria) corresponda a la de un cristal de BLG.
Se analiza la composición química de la materia de tipo cristal separada para verificar que sus sólidos consisten principalmente en BLG.
Ejemplo 10: Cristalización por filtración de flujo cruzado dinámico basada en UF
Se preparó la alimentación para el tanque de cristalización tal como se describe en el ejemplo 1, con la excepción de que la diafiltración se llevó a cabo a pH 5,92 y el ST final fue del 20%.
Después de acondicionarse la alimentación (puede observarse la composición de alimentación en la tabla 15), se transfirió a un tanque de cristalización de 300 l y el pH se ajustó inicialmente hasta pH 5,80 y la temperatura se mantuvo a 10-12°C. Después del ajuste del pH, se añadió material de siembra que se había producido del mismo modo tal como se describe en el ejemplo 1, pero que se origina a partir de una producción de cristalización no espontánea. Se sembró la alimentación con material de siembra hasta una concentración de 0,5 g de material de siembra por litro de alimentación. Después de la siembra, se estableció la temperatura en la manta de refrigeración a 5°C, se ajustó lentamente el pH a 5,50 y se dejó cristalizar la mezcla durante aproximadamente una hora, después de lo cual se conectó la unidad de DCF (filtración de flujo cruzado dinámico) al tanque de cristalización tal como se muestra en la figura 26. Se dotó la unidad DCF de membranas cerámicas Kerafol con un tamaño de poro de 500 nm, se estableció la TMP (presión transmembrana) a 0,4 bar y la velocidad de giro de la membrana era de 32 Hz.
Se devolvió el retenido de la DCF al tanque de cristalización, mientras que el permeado se usó como la alimentación en una unidad de UF (ultrafiltración) equipada con una membrana de tipo Koch HFK-328 con un espaciador de 46 milésimas de pulgada. En la unidad de UF, se dejó que las temperaturas aumentaran hasta, pero no por encima de, 12°C. Se ajustó la cantidad de agua de diafiltración añadida de manera que el retenido que salía de la UF, que vuelve al tanque de cristalización, fuera aproximadamente el 21% de ST, mientras que los minerales se retiraron de las aguas madre (ML).
Continuó la diafiltración en las ML hasta que la diferencia en la conductividad entre el permeado y el agua de diafiltración fuera inferior a 50 pS/cm. En este momento, se ajustó la cantidad de agua de diafiltración de manera que el retenido fuera aproximadamente el 30% de ST. La cantidad de ST en las ML disminuye cuando BLG se retira como cristales; esta retirada continua de exceso de agua y minerales permite impulsar el rendimiento global, ya que parece que la concentración de otras proteínas durante la cristalización de BLG tiene un efecto limitado, si lo tiene, sobre la solubilidad de BLG en los intervalos que se han explorado.
La composición del permeado de ML de la DCF puede observarse en la Tabla 16. Los 300 l iniciales de la alimentación se habían reducido hasta aproximadamente 100 l de ML. Basándose en la conservación de masa, se calculó que el rendimiento relativo de BLG era del 92%.
Tabla 15 - Componentes seleccionados de la alimentación usada en el ejemplo 10.
Tabla 16 - Composición de proteína de las aguas madre finales obtenidas en el ejemplo 10.
Conclusión:
Retirando continuamente el exceso de minerales y agua de la matriz donde tiene lugar la cristalización de BLG, puede mejorarse significativamente el rendimiento de BLG y puede llevarse a cabo el procedimiento a bajas temperaturas.
Ejemplo 11: Grado de desnaturalización de proteína de diferentes productos de proteína de lactosuero
Se compararon el grado de desnaturalización de proteína de un producto comercial y cuatro composiciones de BLG comestibles obtenidas mediante el método de la invención. Las muestras se describen a continuación.
Se prepararon las muestras B-E de la siguiente forma:
Se preparó una suspensión de cristales tal como se describe en el ejemplo 12 y se separó tal como se describe en el ejemplo 7. Se tomó parte de la suspensión de BLG separada y se dividió en cuatro partes.
Muestra B: Se redisolvió la primera parte de la suspensión de cristales de BLG separada sin ningún secado ajustando el pH de la suspensión de cristales de BLG a 7,01 usando NaOH al 3%; y luego se diluyó la muestra hasta 6 Brix para preparar una disolución de aproximadamente el 5% de proteína.
Muestra C: Se secó por congelación la segunda parte de la suspensión de cristales de BLG separada. A continuación se resuspendió el polvo en agua depurada, se ajustó el pH a 7,09 usando NaOH al 3% y luego se diluyó la muestra hasta 6 Brix para preparar una disolución de aproximadamente el 5% de proteína.
Muestra D: Se redisolvió la tercera parte de la suspensión de cristales de BLG separada ajustando el pH a 7,0 usando NaOH al 3%, luego se secó por congelación. A continuación se resuspendió el polvo secado por congelación en agua depurada y se midió que el pH era de 7,07. A continuación se diluyó la muestra hasta 6 Brix para preparar una disolución de aproximadamente el 5% de proteína.
Muestra E: Se trató la cuarta parte de la suspensión de cristales de BLG separada y se secó por pulverización tal como se describe en el ejemplo 7. A continuación se resuspendió el polvo en agua depurada y se ajustó el pH a 7,04 usando NaOH al 3%. A continuación se diluyó la muestra hasta 6 Brix para preparar una disolución de aproximadamente el 5% de proteína.
Se determinó el grado de desnaturalización de proteína de cada muestra según el ejemplo 9.11 y los resultados se presentan en la tabla 17.
Tabla 17 - Comparación del grado de desnaturalización de proteína de un producto de WPI disponible comercialmente (Bipro) con 4 productos de BLG de la invención.
Conclusión:
Independientemente del método de secado, las composiciones de BLG comestibles obtenidas mediante el método de la invención tienen un grado sorprendentemente bajo de proteína desnaturalizada; sólo una décima parte de lo que puede hallarse en el WPI disponible comercialmente usado para la comparación. Es particularmente sorprendente que el producto de suspensión de cristales de BLG secados por pulverización tenga todavía el grado más bajo de desnaturalización de todos los productos.
Ejemplo 12: Separación de cristales por filtración de flujo cruzado dinámico
Se usó el retenido de UF reducido en lactosa derivado de lactosuero dulce de un procedimiento de producción de queso convencional, filtrado a través de un filtro de 1,2 micrómetros, como alimentación para el procedimiento de cristalización. Se acondicionó la alimentación de lactosuero dulce en un sistema de ultrafiltración usando una membrana de tipo Koch HFK-328 con un espaciador de 46 milésimas de pulgada, una presión de alimentación de 1,5-3,0 bar, usando una concentración de alimentación del 10% de ST (sólidos totales) ± 5 y agua depurada (agua filtrada por ósmosis inversa para obtener una conductividad de como máximo 0,05 mS/cm) como medio de diafiltración. La temperatura de la alimentación y del retenido durante la ultrafiltración era aproximadamente 12°C. A continuación se ajustó el pH añadiendo HCl para obtener un pH de aproximadamente 5,60. La diafiltración continuó hasta que la conductividad del retenido fue inferior a 1,30 mS/cm. A continuación se calentó la alimentación hasta 25°C antes de concentrar el retenido hasta aproximadamente el 27% de ST (aproximadamente el 21% de proteína total en relación con el peso total del retenido concentrado). La conductividad del permeado era de 0,33 mS/cm al final de la concentración. Se centrifugó una muestra del retenido concentrado a 3000 g durante 5 minutos, pero no se formó sedimento visible.
Se transfirió el retenido concentrado a un tanque de cristalización de 300 l en el que se enfrió hasta aproximadamente 6°C y se mantuvo a esa temperatura durante la noche con agitación suave. A la mañana siguiente, el retenido había cristalizado. Se separaron por centrifugación a 3000 g durante 5 minutos las aguas madres y los cristales, y se tomaron muestras del sobrenadante y del sedimento para el análisis mediante HPLC. Se calculó que el rendimiento de BLG de este procedimiento era del 67%.
Se usó la suspensión de cristales del tanque de 300 l para una alimentación en un sistema Andritz DCF 152S
usando una membrana de disco con un tamaño de poro de 500 nm. Se realizó la filtración a 8°C, la velocidad de giro era de 32 Hz y la presión transmembrana era de 0,4 bar. El sistema funciona como una filtración de extremo muerto donde se acumula retenido en la cámara de filtración, a diferencia de una unidad mayor donde se retiraría continuamente el retenido. Se realizó la filtración de un modo estable durante algo más de 40 minutos, momento en el que los sólidos que se habían acumulado en la cámara de filtración empezaron a influir en la filtración.
La cantidad de masa de cristales aumentó significativamente durante la operación de DFC.
Conclusión:
La DCF proporciona un medio estable y eficiente para separar los cristales de las ML. Si se necesita, podría añadirse líquido de lavado a la DCF.
Ejemplo 13: Separación de cristales usando una centrífuga de filtración
Usando la misma alimentación y el mismo procedimiento de cristalización que en el ejemplo 12, se sometió a prueba la separación en una centrífuga de filtración HZ 25/0.1 provista de una tela de filtro con un tamaño de poro de aproximadamente 20 micrómetros.
Prueba 1: se alimentaron 4 l de la alimentación a la centrífuga de filtro que funcionó a 60 g. Después de que se hubiera añadido toda la alimentación, se aceleró la centrífuga hasta 250 g para secar la torta de filtro. La torta contenía el 47,6% de ST; la composición de la torta se muestra en la tabla 18.
Después de la limpieza, se alimentó la centrífuga con 7 l de la misma alimentación que se ha descrito anteriormente a 60 g. A continuación se aceleró la centrífuga hasta 250 g para deshidratar durante aproximadamente 5 minutos, antes de que se desacelerara de nuevo hasta 60 g, y se añadieron 0,25 l de agua depurada para lavar. Después de añadir el agua de lavado, se aceleró de nuevo la centrífuga hasta 250 g para deshidratar. Se midió que los St de la torta eran el 47%. La torta se muestra en la figura 27A. La composición de la torta, la fracción de m L y el líquido de lavado después del lavado se muestran en la tabla 18. Después de que la torta se hubiera deshidratado, se intentó desprender de los lados de la centrífuga; la capa superior ardió sin llama y se cayó a través del tubo destinado tal como se observa en la figura 27C, pero la capa subyacente estaba demasiado húmeda y pegajosa como para desprenderse apropiadamente tal como se observa en la figura 27B.
Tabla 18 - Concentración de componentes seleccionados de las composiciones proporcionadas en el ejemplo 13.
Conclusión:
Las centrífugas de filtro proporcionan una opción interesante para obtener una torta de BLG que es tan pura que ALA y CMP están por debajo del nivel requerido para la cuantificación incluso sin lavar. Aplicando incluso un pequeño volumen de medio de lavado a la torta de filtro, puede reducirse aún más el contenido de minerales en la torta, tal como se observa por la composición de proteína del agua de lavado en la tabla 18. El contenido de proteína distinta de BLG de la torta también se reduce lavando tal como puede observarse a partir del agua de lavado usada. El agua de lavado usada contiene una razón de ALA:BLG que es mayor que la razón en la torta de filtro. Esto indica
que la etapa de lavado tiene una mayor tendencia a retirar ALA (y probablemente otras proteínas distintas de BLG) que BLG.
Las tortas de filtro que se produjeron en este caso no eran desprendibles, pero aún permeables. Esto permite la opción de añadir un gas seco a una temperatura dada para reducir el contenido de humedad de la torta de filtro hasta un grado en el que sea desprendible, como la capa superior. Alternativamente, la torta de filtro podría redisolverse dentro de la centrífuga añadiendo la cantidad adecuada de ácido, base o sal en una disolución acuosa en un sistema de estilo centrífuga de sifón.
Ejemplo 14: Impacto de la composición de minerales de la disolución de proteína de lactosuero
Se investigó el impacto de la razón molar entre cationes metálicos monovalentes y divalentes sobre el rendimiento de BLG en este ejemplo.
Se compararon dos muestras:
Muestra A: que tiene un sobrepeso de Na+ (fuente: Na2SO4)
Muestra B: que tiene un sobrepeso de Ca2+ (fuente: CaSO4)
Se ajustó el mismo tipo de material de partida que el usado en el ejemplo 1 con ácido sulfúrico al 2,5%. Se ajustó el pH de las muestras a aproximadamente pH 5,4; el pH preciso se notifica en la tabla 20. El volumen original de cada muestra era de 250 ml. Se dializaron las dos muestras en otro recipiente de 24 l contra aproximadamente 24 l de agua depurada fría. Para todos los procedimientos de diálisis, se usó el tubo de diálisis OrDial D-Clean MWCO 3500 (número de artículo 63034405). Se agitaron continuamente los recipientes durante los procedimientos de diálisis, y tuvo lugar la diálisis en un enfriador a 4°C. La primera diálisis tuvo lugar durante la noche.
Para retirar el exceso de iones después de la primera diálisis, se transfirieron las bolsas de diálisis a un recipiente que contenía 2 l de solución salina. Las concentraciones eran las siguientes:
Muestra A: Na2SO4 (sulfato de sodio) 0,059 M,
Muestra B: CaSO4 (sulfato de calcio) 0,059 M.
La primera diálisis de sal tuvo lugar durante la noche. La conductividad, el pH y Brix después de la primera diálisis de sal se notifican en la tabla 20. Se cambiaron las disoluciones de sal a unas recién preparadas y la diálisis continuó durante el fin de semana.
Después de la segunda diálisis de sal, se transfirieron los tubos a un recipiente de 24 l lleno de aproximadamente 24 l de agua depurada fría y se dializaron durante la noche para retirar el exceso de iones antes de la cristalización. Después de la última etapa de diálisis, la concentración de proteína fue un poco más baja de lo que se prefería. Por tanto, se concentraron las muestras en un sistema de laboratorio de UF Pellicon XL usando una membrana de corte de 10 kDa y una bomba peristáltica funcionando a 75 ml/h. El contenido de minerales de las muestras, junto con el material de partida, se muestran en la tabla 19.
A continuación se sembraron las muestras con 0,5 g/l del material de siembra previamente descrito y se dejó que cristalizaran a 4°C durante la noche. Al día siguiente, fue visible el precipitado de cristal en todas las muestras. Se prepararon muestras de HPLC de cada una de las muestras centrifugando cada muestra a 3000 g durante 5 minutos, seguido de análisis de una muestra del sobrenadante. Los resultados se muestran en la tabla 21.
Tabla 19 - Concentraciones de componentes minerales seleccionados en el material de partida y las muestras A y B del ejemplo 14.
Tabla 20 - pH, conductividad y grados Brix en diversas fases durante la preparación de las muestras A y B.
Tabla 21 - Concentración de BLG en muestras con diferentes razones entre cationes monovalentes y divalentes.
Conclusión:
La tabla 21 documenta que queda una cantidad residual más pequeña de BLG en las aguas madres (y se obtiene un rendimiento más alto de cristales de BLG separados) si se evita una alta razón molar entre cationes monovalentes y divalentes. Puede controlarse la razón molar entre cationes monovalentes y divalentes y, en la práctica, Na+K frente a Ca+Mg, para mejorar el rendimiento de BLG del presente método.
Claims (16)
1. Método de preparación de una composición comestible que comprende beta-lactoglobulina (BLG) en forma cristalizada, comprendiendo el método las etapas de
a) proporcionar una disolución de proteína de lactosuero que comprende BLG y al menos una proteína de lactosuero adicional, dicha disolución de proteína de lactosuero:
- está sobresaturada con respecto a BLG y tiene un pH en el intervalo de 5-6,
- comprende BLG en una cantidad de como máximo el 85% p/p en relación con la cantidad total de proteína, y en el que:
- la disolución de proteína de lactosuero tiene una conductividad de como máximo 5 mS/cm, o
- la razón entre la conductividad expresada en mS/cm y la cantidad total de proteína de la disolución de proteína de lactosuero expresada en % en peso total de proteína en relación con el peso total de la disolución de proteína de lactosuero es de como máximo 0,3,
b) cristalizar BLG en la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada en modo de disolución de proteínas por adición de sal, y
c) opcionalmente, separar los cristales de BLG a partir de la disolución de proteína de lactosuero restante.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa d) de lavar los cristales de BLG, por ejemplo, los cristales separados obtenidos de la etapa c).
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa e) de recristalizar los cristales de BLG, por ejemplo, los cristales de BLG obtenidos de la etapa c) o d).
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa f) de secar una composición que contiene BLG derivada de la etapa b), c), d) o e).
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 5% p/p de alfa-lactoalbúmina (ALA) en relación con la cantidad total de proteína.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 15% p/p de proteína de lactosuero adicional en relación con la cantidad total de proteína.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución de proteína de lactosuero de la etapa a) comprende al menos el 0,4% p/p de BLG en relación con el peso de la disolución de proteína de lactosuero.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución de proteína de lactosuero comprende un concentrado de proteína de suero de leche, un concentrado de proteína de lactosuero, aislado de proteína de suero de leche y/o aislado de proteína de lactosuero.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución de proteína de lactosuero sobresaturada se prepara sometiendo una alimentación de proteína de lactosuero a uno o más de los siguientes ajustes:
- ajustar el pH,
- reducir la conductividad
- reducir la temperatura
- aumentar la concentración de proteína, y
- añadir un agente que reduce la actividad de agua.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cristalización de BLG de la etapa b) implica uno o más de los siguientes:
- esperar a que tenga lugar la cristalización,
- añadir semillas de cristalización,
- aumentar los grados del grado de sobresaturación de BLG incluso adicionalmente, y/o
- estimular de manera mecánica.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la etapa c) comprende separar los cristales de BLG para dar un contenido de sólidos de al menos el 30% p/p, preferiblemente al menos el 40% p/p e incluso más preferiblemente al menos el 50% p/p.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en el que el lavado en la etapa d) implica poner en contacto los cristales de BLG separados con un líquido de lavado sin disolver completamente los cristales de BLG y separar posteriormente los cristales de BLG restantes del líquido de lavado.
13. Método según la reivindicación 12, en el que el lavado de la etapa d) disuelve como máximo el 80% p/p de la cantidad inicial de cristales de BLG, preferiblemente como máximo el 50% p/p e incluso más preferiblemente como máximo el 20% p/p de la cantidad inicial de cristales de BLG.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3-13, en el que la etapa de recristalización implica:
- disolver los cristales de BLG separados en un líquido de recristalización,
- ajustar el líquido de recristalización para obtener sobresaturación con respecto a BLG,
- cristalizar BLG en el líquido de recristalización ajustado sobresaturado, y
- separar los cristales de BLG del líquido de recristalización ajustado restante.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3-14, en el que los cristales de BLG de la etapa d) se recristalizan al menos 2 veces.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-15, en el que la etapa de secado implica uno o más de secado por pulverización, secado por congelación, secador centrífugo instantáneo (“spin-flash”), secado rotatorio y/o secado en lecho fluidizado.
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