CN115624083A - 新颖β-乳球蛋白制剂的生产及相关方法、用途和食品产品 - Google Patents

Abstract

本申请涉及新颖β‑乳球蛋白制剂的生产及相关方法、用途和食品产品。本发明涉及生产分离的β‑乳球蛋白组合物和/或含有结晶β‑乳球蛋白的组合物的新方法。本发明还涉及新的β‑乳球蛋白组合物、这些组合物的用途和包含这些组合物的食品产品。

Description

新颖β-乳球蛋白制剂的生产及相关方法、用途和食品产品

本申请是申请日为2017年12月22日，申请号为201780084095.1，发明名称为“新颖β-乳球蛋白制剂的生产及相关方法、用途和食品产品”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生产分离的β-乳球蛋白组合物和/或含有结晶β-乳球蛋白的组合物的新方法。本发明还涉及新的β-乳球蛋白组合物、这些组合物的用途和包含这些组合物的食品产品。

背景技术

乳蛋白质分级的概念在本领域中是熟知的，并且在过去几十年中已经得以发展到一系列制备富含各种乳蛋白种类的组合物的技术，每种乳蛋白种类具有特定的特性和特征。

从奶清或乳清中分离β-乳球蛋白(BLG)是许多出版物的主题，并且典型地涉及多个分离步骤和通常的色谱技术以获得纯化的β-乳球蛋白产物。

例如，de Jongh等人(Mild Isolation Procedure Discloses New ProteinStructural Properties ofβ-Lactoglobulin[轻度分离程序揭示了β-乳球蛋白的新蛋白质结构特性],J Dairy Sci.[乳品科学杂志],第84卷(3),2001,第562-571页)描述了通过对酪蛋白进行低温酸凝结以及通过使获得的酸乳清经受亲和色谱(DEAE琼脂糖)和凝胶渗透色谱的组合来从新鲜挤得的乳中纯化BLG。据称获得的BLG组合物中每1g蛋白质含有0.985gβ-乳球蛋白。

Slack等人(Journal of Food Processing and Preservation[食品加工和保存杂志],第10卷,1986,第19-30页)探索了一种不同的途径，并通过将脱矿物质的酸乳清和甜乳清的pH调节至pH 4.65以及通过离心和倾析将形成的沉淀分离来制备富含BLG的沉淀。获得的沉淀颗粒被描述为相对不溶，并且在另外的BLG中含有显著量的蛋白质杂质。没有观察到晶体形成。应注意，可在pH 4.65下形成的BLG沉淀不是BLG晶体。

Palmer(Crystalline Globulin from Cow's Milk[来自牛乳的结晶球蛋白],J.Biol.Chem.[生物化学杂志],第104卷,1934,第359-372页)报道了使用几个序列的对不需要的蛋白质的盐沉淀、pH调节和透析(以去除其他不需要的蛋白质)产生基于酸乳清的蛋白质晶体的费力费时的工艺。最后，当获得高度纯化的BLG溶液时，BLG结晶。所述工艺持续超过12天，并且需要添加甲苯。因此，Palmer中披露的程序与安全食品生产不相容，并且提供了明显不可食用的食品产品。

Aschaffenburg等人(Improved Method for the Preparation of Crystallinebeta-Lactoglobulin and alpha-Lactalbumin from Cow's Milk[改进的从牛乳制备结晶β-乳球蛋白和α乳白蛋白的方法],Bioch.[生物化学],第65卷,1957,第273-277页)披露了一种相对于Palmer方法的改进工艺，所述改进允许在几天而不是几周的数量级上制备β-乳球蛋白晶体。然而，改进的方法仍然需要在结晶之前除去不需要的蛋白质，并且还使用甲苯以便结晶，这使得它与安全食品生产不相容。

JP H10 218755 A披露了含有黑色素产生抑制剂的化妆品组合物的生产，所述黑色素产生抑制剂包含BLG作为活性成分。所述文件还表明BLG例如可以通过以下过程分离：向乳中添加盐酸以沉淀酪蛋白，然后过滤以获得乳清。将乳清的pH调节至6.0，并以半饱和量添加硫酸铵；通过盐析除去沉淀的蛋白质，并回收滤液。将滤液用硫酸铵饱和，并回收沉淀的蛋白质。将回收的蛋白质再次溶解在水中并在pH 5.2下透析以分离晶体，并且从1L乳清以约1.8g的比例制备β-乳球蛋白。然而，JP H10 218755 A中描述的所提出工艺的一般工艺步骤不足以导致BLG晶体的形成。因此，所述文件不包含BLG或BLG晶体结晶的实现披露。

US 2 790 790披露了一种从溶液中沉淀蛋白质的工艺，以及更具体地为通过使用氯化钠作为沉淀剂从水溶液中分级沉淀相对未缀合的蛋白质。表明所述工艺可用于在pH3.6-3.8下通过NaCl诱导的沉淀分离BLG。在所述文献的实例II中，表明可以按通常方式对NaCl沉淀透析以形成结晶B-乳球蛋白。然而，US 2 790 790没有证实在pH 3.6-3.8下形成BLG晶体实际上是可能的，并且没有提及对BLG沉淀透析的“通常方式”的含义。因此，所述文件不包含BLG或BLG晶体结晶的实现披露。

发明内容

偶然地，诸位发明人惊奇地发现，可以在粗乳清蛋白溶液中并且在不使用有机溶剂如甲苯的情况下直接制备高纯度BLG晶体，所述粗乳清蛋白溶液除了BLG之外还含有显著量的其他乳清蛋白。这与本领域的普通常识相反，所述普通常识传授蛋白质在人们希望使它们结晶之前必须经高度纯化，并且并非所有蛋白质都能结晶。

这一发现有可能改变乳清蛋白在乳制品行业中的处理和分级方式，并开创了可以安全地用作食品成分的高度纯化BLG的高效温和生产。

因此，本发明的一方面涉及一种制备包含处于结晶和/或分离形式的β-乳球蛋白(BLG)的可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白的乳清蛋白溶液，所述乳清蛋白溶液关于BLG过饱和，并且具有在5-6范围内的pH，

b)在所述过饱和的乳清蛋白溶液中使BLG结晶，以及

c)任选地，将BLG晶体与剩余的乳清蛋白溶液分离。

诸位发明人还发现，含有BLG晶体的处于粉末形式的可食用乳清蛋白组合物具有比现有技术的可比组合物显著更高的堆积密度。这是有利的，因为它简化了粉末的处理并使得灰尘更少。

因此，本发明的另一方面涉及一种可食用组合物，其包含例如可通过本文所述的一种或多种方法获得的处于结晶和/或分离形式的β-乳球蛋白。可食用组合物可以例如是含有BLG晶体并且堆积密度为至少为0.40g/mL的粉末。可替代地，可食用组合物可以是含有BLG晶体的液体悬浮液或浆料。

在本发明的上下文中，包含“BLG晶体”的干燥产物例如粉末含有通过对BLG晶体悬浮液干燥获得的产物，而湿BLG晶体的晶体结构在干燥工艺期间可能已经变形并且可至少部分地失去其X射线衍射特征。同样，术语“干燥BLG晶体”和“干燥的BLG晶体”是指通过对湿BLG晶体干燥获得的颗粒，并且此干燥颗粒本身不需要具有晶体结构。然而，诸位发明人观察到当将干燥的BLG晶体以重量比率2份水对1份干燥BLG晶体重悬浮在冷(4℃)脱矿物质水中时，BLG晶体再水合并恢复如干燥前基本相同的晶体结构(空间群类型和晶胞大小)。

熟知BLG是必需氨基酸(包括例如亮氨酸)的重要来源，并且因此本发明提供的可食用BLG组合物具有几种令人关注的营养用途。

本发明的另一方面涉及一种分离的BLG晶体，其具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

并且其中晶体具有晶胞积分角α＝90°、β＝90°、以及γ＝90°。

本发明的又一个方面涉及如本文定义的可食用组合物作为食品成分的用途。

本发明的另一方面涉及一种食品产品，其包含如本文定义的可食用组合物和脂肪来源和/或碳水化合物来源。

本申请提供了以下内容：

1)一种制备包含处于结晶和/或分离形式的β-乳球蛋白(BLG)的可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白的乳清蛋白溶液，所述乳清蛋白溶液：

-关于BLG过饱和，并且具有在5-6范围内的pH，

-包含至多90％(w/w)的量的BLG，

b)在所述过饱和的乳清蛋白溶液中优选以盐溶模式使BLG结晶，以及

c)任选地，将BLG晶体与剩余的乳清蛋白溶液分离。

2)根据1)所述的方法，其进一步包括步骤d)洗涤BLG晶体，例如，从步骤c)获得的分离的晶体。

3)根据1)或2)所述的方法，其进一步包括步骤e)使BLG晶体例如从步骤c)或d)获得的BLG晶体重结晶。

4)根据前述任一项所述的方法，其进一步包括步骤f)干燥来自步骤b)、c)、d)或e)的含有BLG的组合物。

5)根据前述任一项所述的方法，其中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少5％(w/w)的ALA。

6)根据前述任一项所述的方法，其中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少15％(w/w)的另外的乳清蛋白。

7)根据前述任一项所述的方法，其中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少1％(w/w)的BLG。

8)根据前述任一项所述的方法，其中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于所述乳清蛋白溶液的重量而言至少0.4％(w/w)的BLG。

9)根据前述任一项所述的方法，其中，所述乳清蛋白溶液包含奶清蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物、奶清蛋白分离物和/或乳清蛋白分离物。

10)根据前述任一项所述的方法，其中，所述乳清蛋白溶液的电导率与蛋白质总量的比率是至多0.3。

11)根据前述任一项所述的方法，其中，所述乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率是至多7mS/cm。

12)根据前述任一项所述的方法，其中，通过对乳清蛋白进料进行以下调节中的一项或多项来制备所述过饱和的乳清蛋白溶液：

-调节pH，

-降低电导率

-降低温度

-增加蛋白质浓度，以及

-添加降低水分活度的药剂。

13)根据前述任一项所述的方法，其中，所述乳清蛋白溶液的制备涉及调节所述乳清蛋白进料的pH。

14)根据前述任一项所述的方法，其中，所述乳清蛋白溶液的制备涉及降低所述乳清蛋白进料的电导率。

15)根据前述任一项所述的方法，其中，所述乳清蛋白溶液的制备涉及降低所述乳清蛋白进料的温度。

16)根据前述任一项所述的方法，其中，所述乳清蛋白溶液的制备涉及增加所述乳清蛋白进料的总蛋白质浓度。

17)根据前述任一项所述的方法，其中，步骤b)的BLG结晶涉及以下中的一项或多项：

-等待结晶发生，

-添加晶种，

-更进一步增加BLG的过饱和度，和/或

-机械刺激。

18)根据1)-17)中任一项所述的方法，其中，步骤c)包括将所述BLG晶体分离至固体含量为至少30％(w/w)，优选至少40％(w/w)，以及甚至更优选至少50％(w/w)。

19)根据2)-19)中任一项所述的方法，其中，步骤d)中的洗涤涉及使分离的BLG晶体与洗涤液接触而不完全溶解所述BLG晶体，以及随后将剩余的BLG晶体与所述洗涤液分离。

20)根据19)所述的方法，其中，步骤d)的洗涤溶解BLG晶体的初始量的至多80％(w/w)，优选BLG晶体的初始量的至多50％(w/w)、以及甚至更优选至多20％(w/w)。

21)根据3)-20)中任一项所述的方法，其中，所述重结晶步骤涉及：

-将分离的BLG晶体溶解在重结晶液中，

-调节所述重结晶液以获得关于BLG的过饱和，

-在过饱和的经调节的重结晶液中使BLG结晶，以及

-将BLG晶体与剩余的经调节的重结晶液分离。

22)根据3)-21)中任一项所述的方法，其中，使步骤d)的BLG晶体重结晶至少2次。

23)根据4)-22)中任一项所述的方法，其中，所述干燥步骤涉及喷雾干燥、冷冻干燥、旋转闪蒸干燥器、旋转干燥和/或流化床干燥中的一种或多种。

24)一种可食用BLG组合物，所述组合物可通过一种或多种根据1)-23)中任一项所述的方法获得。

25)一种可食用BLG组合物，其包含相对于总固体而言至少90％(w/w)的BLG。

26)根据25)所述的且BLG结晶度为至少10％的可食用BLG组合物。

27)根据24)-26)中任一项所述的可食用BLG组合物，其包含相对于蛋白质总量而言至多90％(w/w)的BLG，并且具有至少10％的BLG结晶度。

28)根据24)-27)中任一项所述的可食用BLG组合物，其中，所述组合物是干燥组合物。

29)根据28)所述的干燥BLG组合物，其处于堆积密度为至少0.4g/mL的粉末形式，优选为经喷雾干燥的粉末形式。

30)根据28)或29)所述的干燥BLG组合物，其包含

-相对于蛋白质总量而言至少20％(w/w)的BLG，以及

-至少10％的BLG结晶度。

31)根据24)-27)中任一项所述的可食用BLG组合物，其中，所述组合物是液体组合物。

32)根据24)-31)中任一项所述的可食用BLG组合物，其中，所述组合物是低矿物质组合物。

33)根据24)-32)中任一项所述的可食用BLG组合物，其中，所述组合物是低磷组合物。

34)根据24)-33)中任一项所述的可食用BLG组合物作为食品成分的用途。

35)根据24)-33)中任一项所述的低磷可食用BLG组合物作为低磷食品产品生产中的食品成分的用途。

36)一种食品产品，其包含根据24)-33)中任一项所述的可食用BLG组合物和至少一种另外的成分，所述至少一种另外的成分例如像脂肪来源和/或碳水化合物来源。

37)根据36)所述的食品产品，其是包含碳水化合物和蛋白质的干燥食品产品，所述干燥食品产品包含至少1％(w/w)的BLG，其中：

i)所述BLG具有至少10％的结晶度，和/或

ii)BLG占蛋白质总量的至少90％(w/w)。

38)根据36)-37)中任一项所述的食品产品，其是每100g蛋白质包含至多80mg磷的低磷食品产品。

39)根据36)-38)中任一项所述的食品产品，其是乳制品、糖果、饮料、蛋白质棒或肠内营养组合物。

40)处于饮料形式的根据36)-39)中任一项所述的食品产品：

-包含根据24)-33)中任一项所述的可食用产品，以提供至少1％(w/w)的BLG总量，

-甜味剂，

-至少一种食用酸，

-具有在2.5-4.0范围内的pH，以及

-每100g蛋白质至多80mg磷。

41)一种分离的BLG晶体，其具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

以及具有晶胞积分角α＝90°、β＝90°、以及γ＝90°。

42)根据41)所述的分离的BLG晶体，其包含至少20％(w/w)的BLG和至多约80％(w/w)的水。

附图说明

图1示出了基于甜乳清的粗乳清蛋白溶液(实线)和结晶后得到的母液(虚线)的两个叠加色谱图。实线和虚线之间的差异是由于去除了BLG晶体。

图2是来自实例1的所回收的BLG晶体的显微镜照片。

图3是来自实例1的所回收的BLG晶体的色谱图。

图4是乳清蛋白溶液的电导率与获得的所回收BLG晶体的产率之间的关系图。

图5是乳清蛋白溶液的温度和电导率与获得的所回收BLG晶体的产率之间的关系图。

图6展示了乳清蛋白溶液的总蛋白质含量(通过与蛋白质含量成比例的白利糖度间接显示)与获得的所回收BLG晶体的产率之间的关系。

图7示出了实例3的进料1(实线)和在结晶和除去BLG晶体后获得的母液(虚线)的色谱图。

图8是在实例3的进料1的结晶的早期阶段期间拍摄的样品显微镜照片。

图9是在完成实例3的进料1的结晶之后拍摄的样品显微镜照片。

图10示出了从实例3的进料1获得的经洗涤BLG晶体的色谱图。

图11示出了实例3的进料2(实线)和在结晶和除去BLG晶体后获得的母液(虚线)的色谱图。

图12示出了实例3的进料2在结晶之前(左侧图片)和之后(右侧图片)的图片。

图13示出了从实例3的进料2获得的BLG晶体的整体和碎片的显微镜照片。

图14和图15示出提高电导率或改变BLG晶体浆料的pH导致BLG晶体溶解。

图16是用2个体积的MilliQ水洗涤后分离的BLG晶体沉淀物的色谱图。色谱图清楚地示出晶体含有非常高纯度的BLG。

图17示出了进料3(实线)和所得母液(虚线)的蛋白质组成的色谱图。

图18是从实例3的进料3回收的BLG晶体的显微镜照片。

图19示出了实例3的进料3的所回收BLG晶体(没有任何洗涤步骤)的色谱图。

图20示出了增加电导率对所回收的BLG晶体的产率的影响。

图21是以4.20mS/cm的电导率形成的BLG晶体的显微镜照片。

图22示出了来自基于SPC的乳清蛋白溶液的结晶早期阶段的BLG晶体的显微镜照片。

图23展示了标准乳清蛋白分离物(WPI)和本发明的高纯度BLG组合物的堆积密度差异，所述组合物含有BLG晶体。

图24是旋转过滤器的照片，其中实例3进料1的BLG晶体已与母液分离。

图25是实例8的六种低磷饮料样品的子样品的照片。从左到右，子样品是样品A、B、C、D、E和F。

图26是实例10的结晶工艺变体的示意图示，所述结晶工艺变体使用DCF以将BLG晶体与母液分离。

图27示出了使用过滤式离心机分离BLG晶体和母液获得的滤饼的三张照片。

具体实施方式

如上所述，本发明的一方面涉及一种制备包含处于结晶和/或分离形式的β-乳球蛋白(BLG)的可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白的乳清蛋白溶液，所述乳清蛋白溶液关于BLG过饱和，并且具有在5-6范围内的pH，

b)在所述过饱和的乳清蛋白溶液中使BLG结晶，以及

c)任选地，将BLG晶体与剩余的乳清蛋白溶液分离。

在本发明的上下文中，术语“可食用组合物”涉及对人类消费以及用作食品成分安全并且不包含问题量的有毒组分(如甲苯)或其他不需要的有机溶剂的组合物。BLG是牛乳清和奶清中最主要的蛋白质，并且存在于几种遗传变体中，牛乳中的主要蛋白质被标记为A和B。BLG是脂质运载蛋白，并且可以结合许多疏水性分子，表明BLG在所述疏水性分子的运输过程中起作用。还显示BLG能够通过铁载体结合铁，并可能在对抗病原体方面具有作用。BLG的同源物在人类母乳中是缺乏的。

牛BLG是一种相对较小的蛋白质，约有162个氨基酸残基，分子量约为18.3-18.4kDa。在生理条件下，它主要是二聚体，但是在低于约pH 3下解离成单体，保留其天然状态，如使用NMR测定的。相反，BLG还在各种自然条件下以四聚体、八聚体和其他多聚体聚集形式存在。

当天然结构足够不稳定以允许聚集时，BLG溶液可在各种条件下形成凝胶。在低pH和低离子强度下长期加热时，形成透明的‘细链’凝胶，其中蛋白质分子组装成长硬纤维。

在本发明的上下文中，术语“BLG”或“β-乳球蛋白”涉及来自哺乳动物物种的例如处于天然和/或糖基化形式的BLG，并且包括天然存在的遗传变体。

在本发明的上下文中，术语“晶体”涉及固体材料，其成分(例如原子、分子或离子)以高度有序的微观结构排列，形成在所有方向上延伸的晶格。BLG晶体是蛋白质晶体，其主要含有以高度有序的微观结构排列的BLG，形成在所有方向上延伸的晶格。BLG晶体可以是例如单片或多晶的，并且可以例如是完整晶体、晶体碎片或其组合。晶体碎片例如是当完整晶体在加工过程中经受机械剪切时形成的。晶体碎片也具有高度有序的晶体微观结构，但可能缺少完整晶体的均匀表面和/或均匀边缘或角落。参见例如图18，为许多完整BLG晶体的实例，以及图13为BLG晶体碎片的实例。在两种情况下，BLG晶体或晶体碎片可以使用光学显微镜在视觉上鉴定为明确的、紧凑的和连贯的结构。BLG晶体或晶体碎片通常是至少部分透明的。此外，已知蛋白质晶体是双折射的，并且此光学特性可用于将未知颗粒鉴定为具有晶体结构。另一方面，非结晶BLG聚集体显现为非明确的、不透明的，以及显现为不规则尺寸的开放或多孔块状物。

在本发明的上下文中，术语“结晶”涉及蛋白质晶体的形成。结晶可以例如自发发生或通过添加晶种引发。

可食用组合物包含处于结晶和/或分离形式的BLG。包含处于分离形式的BLG的可食用组合物包含相对于总固体而言至少80％(w/w)的BLG。包含结晶形式的BLG的可食用组合物包含至少一些BLG晶体，并且优选显著量的BLG晶体。

BLG晶体通常可以通过显微镜观察，并且甚至可以达到使眼睛看见它们的尺寸。

在本发明的上下文中，“过饱和”或“关于BLG过饱和”的液体含有溶解的BLG的浓度，在给定的物理和化学条件下所述浓度高于该液体中BLG的饱和点。术语“过饱和”在结晶领域是熟知的(参见例如Gérard Coquerela,“Crystallization of molecular systemsfrom solution:phase diagrams,supersaturation and other basic concepts[分子系统从溶液结晶：相图、过饱和和其他基本概念]”,Chemical Society Reviews[化学学会评论],第2286-2300页,第7期,2014)，并且可以通过许多不同的测量技术(例如通过光谱或粒度分析)确定过饱和。在本发明的上下文中，通过以下程序确定关于BLG的过饱和。

测试在一组特定条件下液体是否关于BLG过饱和的程序：

a)将50ml待测液体样品转移到高度为115mm、内径为25mm、以及容量为50mL的离心管(VWR目录号525-0402)中。在步骤a)–h)期间，应注意使样品及其后续级分保持在液体的原始物理和化学条件下。

b)立即将样品以3000g离心3.0分钟，最大30秒加速和最大30秒减速。

c)离心后立即将上清液尽可能多地转移(如果形成沉淀，则不干扰沉淀)到第二离心管(与步骤a中的类型相同)

d)取上清液的0.05mL子样品(子样品A)

e)将具有至多200微米粒度的10mg BLG晶体(相对于总固体而言至少98％纯的BLG)添加至第二离心管中并搅拌混合物。

f)将第二离心管在原始温度下静置60分钟。

g)在步骤f)之后，立即将第二离心管以500g离心10分钟，然后再取0.05mL上清液子样品(子样品B)。

h)如果存在，则回收步骤g)的离心沉淀，将其重悬于milliQ水中并立即检查悬浮液中是否存在可通过显微镜看见的晶体。

i)使用实例9.9中概述的方法测定子样品A和B中BLG的浓度-结果表示为相对于子样品的总重量而言的％BLG w/w。子样品A的BLG浓度称为C_BLG,A，并且子样品B的BLG浓度称为C_BLG,B。

j)如果C_BLG,B低于C_BLG,A并且如果在步骤i)中观察到晶体，则从中获取步骤a)的样品的液体是过饱和的(在特定条件下)。

在本发明的上下文中，术语“液体”和“溶液”涵盖含有液体和固体或半固体颗粒(例如蛋白质晶体或其他蛋白质颗粒)的组合的组合物。因此，“液体”或“溶液”可以是悬浮液或甚至是浆料。然而，“液体”和“溶液”优选是可泵送的。

在本发明的一些优选实施例中，所述方法不包括步骤c)的分离，并提供了可食用组合物，所述可食用组合物包含BLG晶体和另外的乳清蛋白二者。如果此方法变体还包括步骤f)的干燥，则其提供了含有BLG晶体和另外的乳清蛋白(即WPC或WPI)的干燥组合物，其中至少一部分BLG以BLG晶体的形式存在。优选地，所述方法以直接顺序包括步骤a)、b)和f)。

如果乳清蛋白进料是乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)、血清蛋白浓缩物(SPC)或血清蛋白分离物(SPI)，则上述方法变体可以制备处于液体或干燥形式的WPC、WPI、SPC或SPI，其中至少一部分BLG处于晶体形式。

术语“乳清蛋白浓缩物”和“血清蛋白浓缩物”涉及干燥或水性组合物，所述干燥或水性组合物含有相对于总固体而言20％-89％(w/w)的蛋白质总量。

WPC或SPC优选含有：

相对于总固体而言20％-89％(w/w)的蛋白质，

相对于总蛋白质而言15％-70％(w/w)的BLG，

相对于总蛋白质而言8％-50％(w/w)的ALA，以及

相对于蛋白质而言0-40％(w/w)的CMP。

可替代地，也可以是优选的，WPC或SPC可以含有：

相对于总固体而言20％-89％(w/w)的蛋白质，

相对于总蛋白质而言15％-90％(w/w)的BLG，

相对于总蛋白质而言4％-50％(w/w)的ALA，以及

相对于蛋白质而言0-40％(w/w)的CMP。

优选地，WPC或SPC含有：

相对于总固体而言20％-89％(w/w)的蛋白质，

相对于总蛋白质而言15％-80％(w/w)的BLG，

相对于总蛋白质而言4％-50％(w/w)的ALA，以及

相对于蛋白质而言0-40％(w/w)的CMP。

更优选地，WPC或SPC含有：

相对于总固体而言70％-89％(w/w)的蛋白质，

相对于总蛋白质而言30％-90％(w/w)的BLG，

相对于总蛋白质而言4％-35％(w/w)的ALA，以及

相对于蛋白质而言0-25％(w/w)的CMP。

术语“乳清蛋白分离物”和“血清蛋白分离物”涉及干燥或水性组合物，所述干燥或水性组合物含有相对于总固体而言90％-100％(w/w)的蛋白质总量。

WPI或SPI优选含有：

相对于总固体而言90％-100％(w/w)的蛋白质，

相对于总蛋白质而言15％-70％(w/w)的BLG，

相对于总蛋白质而言8％-50％(w/w)的ALA，以及

相对于总蛋白质而言0-40％(w/w)的CMP。

可替代地，也可以是优选的，WPI或SPI可以含有：

相对于总固体而言90％-100％(w/w)的蛋白质，

相对于总蛋白质而言30％-95％(w/w)的BLG，

相对于总蛋白质而言4％-35％(w/w)的ALA，以及

相对于总蛋白质而言0-25％(w/w)的CMP。

更优选地，WPI或SPI可以含有：

相对于总固体而言90％-100％(w/w)的蛋白质，

相对于总蛋白质而言30％-90％(w/w)的BLG，

相对于总蛋白质而言4％-35％(w/w)的ALA，以及

相对于总蛋白质而言0-25％(w/w)的CMP。

在本发明的一些优选实施例中，所述方法还包括步骤d)洗涤BLG晶体，例如，从步骤c)获得的分离的BLG晶体。

在本发明的一些优选实施例中，所述方法还包括步骤e)使BLG晶体例如从步骤c)或d)获得的BLG晶体重结晶。

所述方法可以例如包括如下项或甚至由如下项组成：步骤a)、b)、c)、d)和e)。可替代地，所述方法可以包括如下项或甚至由如下项组成：步骤a)、b)、c)和e)。

在本发明的一些特别优选的实施例中，所述方法还包括步骤f)干燥来自步骤b)、c)、d)或e)的含有BLG的组合物。

所述方法可以例如包括如下项或甚至由如下项组成：步骤a)、b)、和f)。

可替代地，所述方法可以包括如下项或甚至由如下项组成：步骤a)、b)、c)和f)。

可替代地，所述方法可以包括如下项或甚至由如下项组成：步骤a)、b)、c)、d)以及f)。

可替代地，所述方法可以包括如下项或甚至由如下项组成：步骤a)、b)、c)、d)、e)和f)。

如所述的，本发明的步骤a)涉及提供乳清蛋白溶液，其包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白。

在本发明的上下文中，术语“乳清蛋白”涉及在乳清或奶清中发现的蛋白质。乳清蛋白溶液的乳清蛋白可以是乳清或奶清中发现的蛋白质种类的子集，或者它可以是乳清或/和奶清中发现的蛋白质种类的完全集。然而，乳清蛋白溶液总是含有BLG。

在本发明的上下文中，术语“另外的蛋白质”意指不是BLG的蛋白质。存在于乳清蛋白溶液中的另外的蛋白质典型地包含一种或多种在奶清或乳清中发现的非BLG蛋白质。此类蛋白质的非限制性实例是α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白巨肽(CMP)、骨桥蛋白、乳铁蛋白和乳脂肪球膜蛋白。

因此，乳清蛋白溶液可优选含有至少一种另外的乳清蛋白，所述至少一种另外的乳清蛋白选自下组，该组由以下组成：α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白巨肽(CMP)、骨桥蛋白、乳铁蛋白、乳脂肪球膜蛋白及其组合。

α-乳白蛋白(ALA)是存在于几乎所有哺乳动物物种的乳中的蛋白质。ALA形成乳糖合酶(LS)异源二聚体的调节亚基，并且β-1,4-半乳糖基转移酶(β4Gal-T1)形成催化组分。总之，这些蛋白质使LS能够通过将半乳糖部分转移至葡萄糖来产生乳糖。作为多聚体，α-乳白蛋白强烈结合钙离子和锌离子，并且可具有杀细菌或抗肿瘤活性。与β-乳球蛋白的主要结构差异之一是ALA没有任何可用作共价聚集反应起始点的游离硫醇基团。结果是，纯ALA在变性和酸化时不会形成凝胶。

在本发明的上下文中，术语“ALA”或“α-乳白蛋白”涉及来自哺乳动物物种的例如处于天然和/或糖基化形式的α-乳白蛋白，并且包括天然存在的遗传变体。

在本发明的一些实施例中，乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至多10％(w/w)的酪蛋白，相对于蛋白质总量而言优选至多5％(w/w)、更优选至多1％(w/w)、以及甚至更优选至多0.5％的酪蛋白。在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液不含有任何可检测量的酪蛋白。

术语“奶清”是指当例如通过微滤或大孔超滤从乳中除去酪蛋白和乳脂肪球时残留的液体。奶清也可称为“理想乳清”。

术语“奶清蛋白”或“血清蛋白(serum protein)”涉及存在于奶清中的蛋白质。

术语“乳清”涉及在沉淀并除去乳的酪蛋白后留下的液体上清液。酪蛋白沉淀可以例如通过酸化乳和/或使用凝乳酶来完成。

存在几种类型的乳清：例如“甜乳清”，其是通过基于凝乳酶的酪蛋白沉淀产生的乳清产物；以及“酸乳清”(“acid whey”或“sour whey”)，其是通过基于酸的酪蛋白沉淀产生的乳清产物。基于酸的酪蛋白沉淀可以例如通过添加食品酸或通过细菌培养来完成。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少5％(w/w)的另外的乳清蛋白。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少10％(w/w)的另外的乳清蛋白。更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少15％(w/w)的另外的乳清蛋白。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少20％(w/w)的另外的乳清蛋白。最优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少30％(w/w)的另外的乳清蛋白。

在本发明的其他优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少1％(w/w)的另外的乳清蛋白。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少2％(w/w)的另外的乳清蛋白。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少3％(w/w)的另外的乳清蛋白。最优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少4％(w/w)的另外的乳清蛋白。

在本发明的又其他优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少35％(w/w)的另外的乳清蛋白。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少40％(w/w)的另外的乳清蛋白。更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以例如包含相对于蛋白质总量而言至少45％(w/w)的另外的乳清蛋白。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少50％(w/w)的另外的乳清蛋白。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在5％-90％(w/w)范围内的另外的乳清蛋白。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言在10％-80％(w/w)范围内的另外的乳清蛋白。步骤a)的乳清蛋白溶液可以例如包含相对于蛋白质总量而言在20％-70％(w/w)范围内的另外的乳清蛋白。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在30％-70％(w/w)范围内的另外的乳清蛋白。

如所述，诸位发明人发现可以在不使用有机溶剂的情况下使BLG结晶。此纯化途径也可用于精制含有乳清蛋白的制剂，所述制剂已经历某种BLG纯化；并提供了更进一步提高BLG纯度的简单方法。因此，在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在1％-20％(w/w)范围内的另外的乳清蛋白。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言在2％-15％(w/w)范围内的另外的乳清蛋白。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以例如包含相对于蛋白质总量而言在3％-10％(w/w)范围内的另外的乳清蛋白。

在本发明的一些实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少5％(w/w)的ALA。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少10％(w/w)的ALA。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少15％(w/w)的ALA。可替代地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少20％(w/w)的ALA。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少25％(w/w)的ALA。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少30％(w/w)的ALA。步骤a)的乳清蛋白溶液优选包含相对于蛋白质总量而言至少35％(w/w)的ALA。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少40％(w/w)的ALA。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在5％-95％(w/w)范围内的ALA。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在5％-70％(w/w)范围内的ALA。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言在10％-60％(w/w)范围内的ALA。步骤a)的乳清蛋白溶液优选包含相对于蛋白质总量而言在12％-50％(w/w)范围内的ALA。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言在20％-45％(w/w)范围内的ALA。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液中BLG与ALA之间的重量比率是至少0.01。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液中BLG与ALA之间的重量比率是至少0.5。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液中BLG与ALA之间的重量比率是至少1，例如至少2。例如，步骤a)的乳清蛋白溶液的BLG与ALA之间的重量比率可以是至少3。

乳清蛋白溶液和乳清蛋白进料中BLG和其他蛋白质的量和浓度均指溶解的蛋白质，而不包括沉淀或结晶的蛋白质。

在本发明的上下文中，术语在组分X与组分Y之间的“重量比率”意指通过计算m_X/m_Y获得的值，其中m_X是组分X的量(重量)，并且m_Y是组分Y的量(重量)。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液中BLG与ALA之间的重量比率在0.01-20的范围内。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液中BLG与ALA之间的重量比率在0.2-10的范围内。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液中BLG与ALA之间的重量比率在0.5-4的范围内。例如，步骤a)的乳清蛋白溶液中BLG与ALA之间的重量比率在1-3的范围内。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少1％(w/w)的BLG。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少2％(w/w)的BLG。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少5％(w/w)的BLG。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少10％(w/w)的BLG。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至少12％(w/w)的BLG。例如，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少15％(w/w)的BLG。步骤a)的乳清蛋白溶液可以例如包含相对于蛋白质总量而言至少20％(w/w)的BLG。可替代地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至少30％(w/w)的BLG。

在本发明的一些特别优选的实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言至多95％(w/w)的BLG。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至多90％(w/w)的BLG。更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以例如包含相对于蛋白质总量而言至多85％(w/w)的BLG。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以例如包含相对于蛋白质总量而言至多80％(w/w)的BLG。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至多78％(w/w)的BLG。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言至多75％(w/w)的BLG。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在1％-95％(w/w)范围内的BLG。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言在5％-90％(w/w)范围内的BLG。更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言10％-85％(w/w)的BLG。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在10％-80％(w/w)范围内的BLG。最优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言在20％-70％(w/w)范围内的BLG。

在本发明的其他优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在10％-95％(w/w)范围内的BLG。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言在12％-90％(w/w)范围内的BLG。更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言15％-85％(w/w)的BLG。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于蛋白质总量而言在15％-80％(w/w)范围内的BLG。最优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液可以包含相对于蛋白质总量而言在30％-70％(w/w)范围内的BLG。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于乳清蛋白溶液的重量而言至少0.4％(w/w)的BLG。优选地，乳清蛋白溶液包含至少1.0％(w/w)的BLG。更优选地，乳清蛋白溶液包含至少2.0％(w/w)的BLG。甚至更优选的是，乳清蛋白溶液包含至少4％(w/w)的BLG。

更高浓度的BLG是甚至更优选的，并且优选地乳清蛋白溶液包含至少6％(w/w)的BLG。更优选地，乳清蛋白溶液包含至少10％(w/w)的BLG。甚至更优选的是，乳清蛋白溶液包含至少15％(w/w)的BLG。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于乳清蛋白溶液的重量而言在0.4％-40％(w/w)范围内的BLG。优选地，乳清蛋白溶液包含在1％-35％(w/w)范围内的BLG。更优选地，乳清蛋白溶液包含在4％-30％(w/w)范围内的BLG。甚至更优选的是乳清蛋白溶液包含在10％-25％(w/w)范围内的BLG。

任何合适的乳清蛋白来源可用于制备乳清蛋白溶液。在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液包含以下项或甚至由以下项组成：奶清蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物、奶清蛋白分离物、乳清蛋白分离物或其组合。

优选的是，乳清蛋白溶液是脱矿物质的乳清蛋白溶液。

在本文的上下文中，术语脱矿物质意指乳清蛋白溶液的电导率是至多15mS/cm，以及优选至多10mS/cm，以及甚至更优选至多8mS/cm。脱矿物质的乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率优选是至多7mS/cm，更优选至多4mS/cm，以及甚至更优选至多1mS/cm。

特别优选的是，乳清蛋白溶液是脱矿物质的奶清蛋白浓缩物、脱矿物质的奶清蛋白分离物、脱矿物质的乳清蛋白浓缩物、或脱矿物质的乳清蛋白分离物。

在本发明的一些特别优选的实施例中，乳清蛋白溶液包含以下项或甚至由以下项组成：脱矿物质且经pH调节的奶清蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物、奶清蛋白分离物、乳清蛋白分离物或其组合。

乳清蛋白溶液可以例如包含以下项或甚至由以下项组成：脱矿物质的奶清蛋白浓缩物。可替代地，乳清蛋白溶液可以包含以下项或甚至由以下项组成：脱矿物质的乳清蛋白浓缩物。可替代地，乳清蛋白溶液可以包含以下项或甚至由以下项组成：脱矿物质的奶清蛋白分离物。可替代地，乳清蛋白溶液可以包含以下项或甚至由以下项组成：脱矿物质的乳清蛋白分离物。

在本发明的上下文中，术语“乳清蛋白浓缩物”和“奶清蛋白浓缩物”涉及乳清或奶清的制剂，所述制剂含有相对于总固体而言在大约20％-89％(w/w)范围内的蛋白质。

在本发明的上下文中，术语“乳清蛋白分离物”和“奶清蛋白分离物”涉及乳清或奶清的制剂，所述制剂含有相对于总固体而言至少90％(w/w)的蛋白质。

术语“本质上由……组成”(“consists essentially of”和“consistingessentially of”)意指所讨论的权利要求或特征包括指定的材料或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的一种或多种基本新颖特征的那些。

乳清蛋白溶液的蛋白质优选来自哺乳动物乳，以及优选来自反刍动物乳，反刍动物例如母牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、美洲驼、母马和/或鹿。来自牛(母牛)乳的蛋白质是特别优选的。因此，BLG和另外的乳清蛋白优选是牛BLG和牛乳清蛋白。

乳清蛋白溶液的蛋白质优选尽可能接近其天然状态，并且如果可以的话，优选仅经历温和的热处理。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的BLG具有至多1的乳糖基化程度。优选地，乳清蛋白溶液的BLG具有至多0.6的乳糖基化程度。更优选地，乳清蛋白溶液的BLG具有至多0.4的乳糖基化程度。甚至更优选地，乳清蛋白溶液的BLG具有至多0.2的乳糖基化程度。最优选地，乳清蛋白溶液的BLG具有至多0.1、例如优选至多0.01的乳糖基化程度。

BLG的乳糖基化程度是根据Czerwenka等人(J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志],第54卷,第23期,2006,第8874-8882页)来确定的。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液具有至多80mg/100g蛋白质的糠氨酸值。优选地，乳清蛋白溶液具有至多40mg/100g蛋白质的糠氨酸值。更优选地，乳清蛋白溶液具有至多20mg/100g蛋白质的糠氨酸值。甚至更优选地，乳清蛋白溶液具有至多10mg/100g蛋白质的糠氨酸值。最优选地，乳清蛋白溶液具有至多5mg/100g蛋白质的糠氨酸值，例如，优选0mg/100g蛋白质的糠氨酸值。

除蛋白质外，乳清蛋白溶液典型地还含有其他组分。乳清蛋白溶液可以含有通常在乳清或奶清中发现的其他组分，例如矿物质、碳水化合物和/或脂质。可替代地或另外地，乳清蛋白溶液可含有乳清或奶清的非天然组分。然而，此类非天然组分应优选对于食品生产用途是安全的，并且优选也对于人类消费是安全的。

本方法特别有利于从含有除BLG之外的其他固体的粗乳清蛋白溶液中分离BLG。

乳清蛋白溶液可以例如含有碳水化合物，例如乳糖、乳糖的寡糖和/或水解产物(即葡萄糖和半乳糖)。乳清蛋白溶液可以例如含有在0-40％(w/w)范围内例如在1％-30％(w/w)范围内或在2％-20％(w/w)范围内的碳水化合物。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液含有至多20％(w/w)的碳水化合物，优选至多10％(w/w)的碳水化合物，更优选至多5％(w/w)的碳水化合物，以及甚至更优选至多2％(w/w)的碳水化合物。

乳清蛋白溶液也可以包括脂质，例如处于甘油三酯和/或其他脂质类型(如磷脂)形式的脂质。

在本发明的一些实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于总固体而言至多15％(w/w)的脂质总量。优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于总固体而言至多10％(w/w)的脂质总量。更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于总固体而言至多6％(w/w)的脂质总量。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于总固体而言至多1.0％(w/w)的脂质总量。最优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液包含相对于总固体而言至多0.5％(w/w)的脂质总量。

相对于乳清蛋白溶液的重量，乳清蛋白溶液的蛋白质总量通常是至少1％(w/w)。优选地，乳清蛋白溶液的蛋白质总量是至少5％(w/w)。更优选地，乳清蛋白溶液的蛋白质总量是至少10％(w/w)。甚至更优选地，乳清蛋白溶液的蛋白质总量是至少15％(w/w)。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的蛋白质总量在1％-50％(w/w)的范围内。优选地，乳清蛋白溶液的蛋白质总量在5％-40％(w/w)的范围内。更优选地，乳清蛋白溶液的蛋白质总量在10％-30％(w/w)的范围内。甚至更优选地，乳清蛋白溶液的蛋白质总量在15％-25％(w/w)的范围内。

根据实例9.2测定乳清蛋白溶液的蛋白质总量。

乳清蛋白溶液典型地通过对乳清蛋白进料进行一次或多次调节来制备，所述一次或多次调节形成关于BLG过饱和的乳清蛋白溶液。

进料优选为WPC、WPI、SPC、SPI或其组合。

在本发明的上下文中，术语“乳清蛋白进料”涉及转化为关于BLG过饱和的乳清蛋白溶液的组合物。乳清蛋白进料典型地是包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白的水性液体，但通常不是关于BLG过饱和的。

与乳清蛋白溶液的化学组成相关的实施例同样适用于乳清蛋白进料，然而典型地将乳清蛋白进料的至少一个参数设定为避免过饱和或至少自发结晶。

在本发明的一些优选实施例中，通过对乳清蛋白进料进行以下调节中的一项或多项来制备过饱和的乳清蛋白溶液：

-调节pH，

-降低电导率

-降低温度

-增加蛋白质浓度

-添加降低水分活度的药剂

-修饰离子组成

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及将乳清蛋白进料的pH调节至在5-6范围内的pH。

使用pH玻璃电极测量所有pH值，并将其归一化至25℃。

乳清蛋白溶液可以例如具有在4.9-6.1范围内的pH。乳清蛋白溶液的pH可以例如在5.0-6.1的范围内。可替代地，乳清蛋白溶液的pH可以在5.1-6.1的范围内。优选地，乳清蛋白溶液的pH在5.1-6.0的范围内。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的pH在5.0-6.0的范围内。优选地，乳清蛋白溶液的pH在5.1-6.0的范围内。更优选地，乳清蛋白溶液的pH在5.1-5.9的范围内。甚至更优选地，乳清蛋白溶液的pH可以在5.2-5.9的范围内。最优选地，乳清蛋白溶液的pH在5.2-5.8的范围内。

优选使用食品可接受的酸和/或碱调节pH。食品可接受的酸是特别优选的，例如羧酸。此类酸的有用实例是例如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸或葡糖酸、和/或它们的混合物。

在本发明的一些优选实施例中，使用内酯调节pH，所述内酯例如D-葡糖酸-δ-内酯，其缓慢水解并同时降低含有它的水性液体的pH。可以精确计算内酯水解结束后的目标pH。

食品可接受的碱的有用实例是例如氢氧化物来源，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙；食用酸的盐，例如三柠檬酸钠；和/或其组合。

在本发明的其他优选实施例中，通过添加H⁺形式的阳离子交换材料来调节pH。在结晶之前或甚至在结晶之后容易从乳清蛋白溶液中除去珠粒型/大颗粒型阳离子交换材料。通过添加H⁺形式的阳离子交换材料来调节pH在本发明中是特别有利的，因为它在不添加显著影响乳清蛋白进料的电导率的负反离子的情况下降低了pH。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及降低乳清蛋白进料的电导率。

除非另有说明，否则本文所述的电导率值已归一化至25℃。

诸位发明人已经发现降低乳清蛋白溶液的电导率导致BLG晶体的更高产率。乳清蛋白溶液的最小可获得的电导率取决于蛋白质级分和脂质级分(如果有的话)的组成。一些蛋白质种类，例如酪蛋白巨肽(CMP)比其他蛋白质种类对电导率的贡献更大。因此，优选的是，使乳清蛋白进料的电导率接近其中蛋白质和蛋白质的反离子是电导率主要贡献者的水平。电导率的降低通常涉及去除至少一些存在于液相中并且不与蛋白质紧密结合的小自由离子。

通常优选乳清蛋白溶液具有至多10mS/cm的电导率。在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液具有至多5mS/cm的电导率。优选地，乳清蛋白溶液具有至多4mS/cm的电导率。

更低的电导率是甚至更优选的，并且产生更高的BLG晶体产率。因此，乳清蛋白溶液优选具有至多3mS/cm的电导率。在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液具有至多1mS/cm的电导率。优选地，乳清蛋白溶液具有至多0.5mS/cm的电导率。

乳清蛋白进料的电导率优选通过透析或渗滤来降低。通过超滤来渗滤是特别优选的，因为它允许在保留蛋白质的同时洗掉盐和小带电分子。在本发明的一些优选实施例中，相同的UF单元用于UF/渗滤以及随后对乳清蛋白进料的浓缩。

诸位发明人已经发现有迹象表明，乳清蛋白溶液中电导率(以mS/cm表示)与蛋白质总量(以相对于乳清蛋白溶液的总重量而言的％wt.总蛋白质表示)之间的比率可以有利地保持在某个阈值或低于某个阈值以促进BLG的结晶。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率是至多0.3。优选地，乳清蛋白溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率是至多0.25。优选地，乳清蛋白溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率是至多0.20。更优选地，乳清蛋白溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率是至多0.18。甚至更优选地，乳清蛋白溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率是至多0.12。最优选地，乳清蛋白溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率是至多0.10。

例如优选的是，乳清蛋白溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率是约0.07，或甚至更低。

诸位发明人还发现乳清蛋白进料可以有利地经调节以提供具有至多10mS/cm的UF渗透物电导率的乳清蛋白溶液。UF渗透物电导率是液体的小分子级分的电导率的量度，并且根据实例9.10测量。当在本文中使用术语“电导率”时，它指代所讨论的液体的电导率。当使用术语“UF渗透物电导率”时，它指代液体的小分子级分的电导率，并且根据实例9.10测量。

优选地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率是至多7mS/cm。更优选地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率可以是至多5mS/cm。甚至更优选地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率可以是至多3mS/cm。

如果应获得高产率的BLG，则可以使用甚至更低的UF渗透物电导率且是特别优选的。因此，优选地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率是至多1.0mS/cm。更优选地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率可以是至多0.4mS/cm。甚至更优选地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率可以是至多0.1mS/cm。最优选地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率可以是至多0.04mS/cm。

甚至可以达到更低的UF渗透物电导率，例如，在渗滤期间使用MilliQ水作为稀释剂(MilliQ水具有约0.06μS/cm的电导率)。因此，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率可以是至多0.01mS/cm。可替代地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率可以是至多0.001mS/cm。可替代地，乳清蛋白溶液的UF渗透物电导率可以是至多0.0001mS/cm。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及降低乳清蛋白进料的温度。

例如，乳清蛋白溶液的制备可涉及将乳清蛋白进料的温度降低至至少5℃，优选至少10℃，以及甚至更优选至少15℃。例如，乳清蛋白溶液的制备可涉及将乳清蛋白进料的温度降低至至少20℃。

乳清蛋白进料的温度可以例如降低到至多30℃，优选至多20℃，以及甚至更优选到至多10℃。诸位发明人已发现甚至更低的温度提供更高过饱和度，因此，乳清蛋白进料的温度可以例如降低到至多5℃，优选至多2℃，以及甚至更优选到至多0℃。温度可甚至低于0℃，但优选乳清蛋白溶液应例如以冰浆的形式保持可泵送。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液是在BLG结晶起始之前的冰浆。可替代地或另外地，使乳清蛋白溶液结晶可在步骤b)的BLG结晶期间转变为冰浆或保持为冰浆。

在本发明的一些特别优选的实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及增加乳清蛋白进料的总蛋白质浓度。乳清蛋白进料可以例如经历一个或多个蛋白质浓缩步骤，例如超滤、纳米过滤、反渗透和/或蒸发，从而浓缩以获得乳清蛋白溶液。

超滤是特别优选的，因为它允许选择性地浓缩蛋白质，而盐和碳水化合物的浓度几乎不受影响。如上所述，超滤优选用于乳清蛋白进料的渗滤和浓缩二者。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的BLG浓度低于发生BLG自发结晶的水平。因此通常优选的是，当乳清蛋白溶液处于亚稳定区即在过饱和区中时，终止乳清蛋白进料的修饰，在过饱和区中在使用接种时BLG晶体可以生长但结晶不会自发开始。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及向乳清蛋白进料中添加一种或多种水分活度降低剂。

此类水分活度降低剂的有用但非限制性的实例是多糖和/或聚乙二醇(PEG)。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及修饰乳清蛋白进料的离子组成，例如，通过离子交换、通过添加新的离子种类、通过透析或渗滤来修饰。

典型地，通过组合上述工艺步骤中两个或更多个来制备乳清蛋白溶液以产生过饱和。

在本发明的一些优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及使乳清蛋白进料至少经历：

-在高于10℃的温度下例如使用超滤、纳滤或反渗透来浓缩，以及

-随后冷却至低于10℃的温度。

在本发明的其他优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及使乳清蛋白进料至少经历

-在高于6.0的pH下浓缩，以及

-随后通过添加酸(例如GDL或H⁺形式的阳离子交换材料)降低pH在本发明的又其他优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及使乳清蛋白进料至少经历：

-例如使用至少保留BLG的膜通过渗滤降低电导率。

在本发明的另外的优选实施例中，乳清蛋白溶液的制备涉及使乳清蛋白进料经历至少以下项的组合：

-将pH调节至5-6，

-使用至少保留BLG的膜通过渗滤降低电导率，

-在高于10℃的温度下例如使用超滤、纳滤或反渗透来浓缩蛋白质，以及

-最后，冷却至低于10℃的温度。

诸位发明人还发现，可以通过控制钠+钾的总和与钙和镁的总和之间的摩尔比率来改进本方法的BLG产率。出人意料的是，较高的钙和镁相对量似乎增加了BLG的产率，并因此提高了本方法的BLG回收效率。

在本发明的一些优选实施例中，步骤a)的乳清蛋白溶液中Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比率为至多4。更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液中Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比率为至多2。甚至更优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液中Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比率为至多1.5，并且甚至更优选为至多1.0。最优选地，步骤a)的乳清蛋白溶液中Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比率为至多0.5，例如至多0.2。

Na+K与Ca+Mg的摩尔比率计算为(m_Na+m_K)/(m_Ca+m_Mg)，其中m_Na是元素Na以mol计的含量，m_K是元素K以mol计的含量，m_Ca是元素Ca以mol计的含量，以及m_Mg是元素Mg以mol计的含量。

特别优选的是，乳清蛋白溶液通过盐溶关于BLG过饱和，因此BLG可以以盐溶模式从乳清蛋白溶液中结晶。

在本发明的一些实施例中，特别是如果本发明的可食用BLG产品也具有蛋白质变性程度，则乳清蛋白溶液具有低含量的变性蛋白质。优选地，乳清蛋白溶液具有至多2％、优选至多1.5％、更优选至多1.0％、以及最优选至多0.8％的蛋白质变性程度。

所述方法的步骤b)涉及使过饱和乳清蛋白溶液的至少一些BLG结晶。

特别优选的是，步骤b)的结晶以盐溶模式进行，即在具有低离子强度和低电导率的液体中进行。这与盐析模式相反，盐析模式中将显著量的盐添加至溶液中以引发结晶。

步骤b)的BLG结晶可以例如涉及以下中的一项或多项：

-等待结晶发生，

-添加晶种，

-更进一步增加BLG的过饱和度，和/或

-机械刺激。

在本发明的一些优选实施例中，步骤b)涉及将晶种添加至乳清蛋白溶液中。诸位发明人已经发现，添加晶种可以控制BLG结晶发生的时间和地点，以避免工艺设备的突然堵塞和生产过程中的意外停止。例如，通常希望在浓缩乳清蛋白进料时避免结晶起始。

原则上，可以使用任何引发BLG结晶的种子材料。然而，优选的是，使用水合BLG晶体或干燥的BLG晶体进行接种，以避免向乳清蛋白溶液中添加另外的杂质。

晶种可以是干燥形式，或者当添加至乳清蛋白溶液时可以形成悬浮液的一部分。添加含有晶种例如BLG晶体的悬浮液目前是优选的，因为它显现提供更快的结晶起始。优选的是，这种含有晶种的悬浮液具有在5-6范围内的pH和至多10mS/cm的电导率。

在本发明的一些实施例中，至少一些晶种位于固相上，所述固相与乳清蛋白溶液接触。

晶种优选具有比BLG晶体的所需尺寸更小的粒度。晶种的尺寸可以通过筛分或其他尺寸分级过程除去最大的种子来改变。也可以在粒度分级之前减小粒度(例如通过研磨)。

在本发明的一些实施例中，至少90％(w/w)的晶种具有在0.1-600微米范围内的粒度(通过筛分分析测量)。例如，至少90％(w/w)的晶种可具有在1-400微米范围内的粒度。优选地，至少90％(w/w)的晶种可具有在5-200微米范围内的粒度。更优选地，至少90％(w/w)的晶种可具有在5-100微米范围内的粒度。

可以调整晶种的粒度和剂量以提供BLG的最佳结晶。

在本发明的一些优选实施例中，在获得关于BLG的过饱和之前，但优选以达到过饱和时仍存在至少一些晶种的方式，将晶种添加至乳清蛋白进料中。这可以例如通过在乳清蛋白进料接近过饱和时(例如在冷却、浓缩和/或pH调节期间)添加晶种来完成，在晶种完全溶解之前达到过饱和。

在本发明的一些优选实施例中，步骤b)涉及更进一步提高BLG的过饱和度，优选达到BLG的结晶立即(即在至多20分钟内、以及优选至多5分钟内)开始的程度。这也称为成核区，在成核区中微晶自发形成并开始结晶过程。

过饱和度可以例如通过以下中的一项或多项来增加：

-进一步增加乳清蛋白溶液的蛋白质浓度

-进一步冷却乳清蛋白溶液

-使乳清蛋白溶液更接近BLG结晶的最佳pH

-进一步降低电导率。

在本发明的一些优选实施例中，步骤b)涉及等待形成BLG晶体。这可能需要几个小时，并且典型地是针对如下乳清蛋白溶液，其关于BLG仅略微过饱和并且尚未向其中添加晶种。

在本发明的一些优选实施例中，提供乳清蛋白溶液(步骤a)和BLG的结晶(步骤b)作为两个单独的步骤进行。

然而，在本发明的其他优选实施例中，步骤b)涉及使乳清蛋白溶液结晶的另外调节，以提高BLG的过饱和度或至少保持过饱和。另外的调节导致BLG晶体的产率增加。

这种另外的调节可涉及以下中的一项或多项：

-更进一步增加结晶乳清蛋白溶液的蛋白质浓度

-将结晶乳清蛋白溶液冷却至甚至更低的温度

-使结晶乳清蛋白溶液甚至更接近BLG结晶的最佳pH

-更进一步降低结晶乳清蛋白溶液的电导率。

在本发明的一些优选实施例中，在步骤b)期间，使结晶乳清蛋白溶液保持在亚稳定区中，以避免新微晶的自发形成。

诸位发明人已经通过X射线晶体学确定了分离的BLG晶体的晶格结构，并且在现有技术中尚未发现类似的晶体。

在本发明的一些优选实施例中，在步骤b)期间获得的至少一些BLG晶体具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁。

优选地，获得的BLG晶体中的至少一些具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

和晶胞积分角α＝90°、β＝90°、以及γ＝90°。

在本发明的一些优选实施例中，获得的BLG晶体中的至少一些具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

以及晶胞积分角α＝90°、β＝90°、以及γ＝90°。

甚至更优选地，获得的BLG晶体中的至少一些可具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

以及晶胞积分角α＝90°、β＝90°、以及γ＝90°。

最优选地，获得的BLG晶体中的至少一些具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，晶胞大小

以及

以及晶胞积分角α＝90°、β＝90°、以及γ＝90°。

在本发明的一些特别优选的实施例中，所述方法包括步骤c)：将至少一些BLG晶体与剩余的乳清蛋白溶液分离。当需要纯化BLG时，这是尤其优选的。

步骤c)可以例如包括将BLG晶体分离至固体含量为至少30％(w/w)。优选地，步骤c)包括将BLG晶体分离至固体含量为至少40％(w/w)。甚至更优选地，步骤c)包括将BLG晶体分离至固体含量为至少50％(w/w)。

诸位发明人已发现高固体含量有利于BLG的纯化，因为粘附于分离的BLG晶体的水性部分典型地含有应避免的杂质。另外，高固体含量降低了将分离的BLG晶体转变为干燥产物(例如粉末)的能量消耗，并且增加了从具有给定容量的干燥单元获得的BLG产率。

在本发明的一些优选实施例中，步骤c)包括将BLG晶体分离至固体含量为至少60％。优选地，步骤c)包括将BLG晶体分离至固体含量为至少70％。甚至更优选地，步骤c)包括将BLG晶体分离至固体含量为至少80％。

在本发明的一些优选实施例中，步骤c)的分离涉及以下操作中的一项或多项：

-离心，

-倾析，

-过滤，

-沉降，

-以上的组合。

这些单元操作对于本领域技术人员来说是熟知的并且易于实现。通过过滤的分离可以例如涉及使用真空过滤、动态错流过滤(DCF)、滤液压榨机或过滤式离心机。

基于期望的结果，可以采用用于过滤的不同孔径。优选地，过滤器允许天然乳清蛋白和小聚集体通过但保留BLG晶体。过滤器优选具有至少0.1微米的标称孔径。过滤器可例如具有至少0.5微米的标称孔径。甚至更优选地，过滤器可具有至少2微米的标称孔径。

也可以使用具有较大孔径的过滤器，并且如果主要将大晶体与含有BLG晶体的液体分离的话这种过滤器实际上是优选的。在本发明的一些实施例中，过滤器具有至少5微米的标称孔径。优选地，过滤器具有至少20微米的标称孔径。甚至更优选地，过滤器可具有至少40微米的孔径。

过滤器可例如具有0.03-5000微米范围内(例如0.1-5000微米)的孔径。优选地，过滤器可具有在0.5-1000微米范围内的孔径。甚至更优选地，过滤器可具有在5-800微米范围内的孔径，例如在10-500微米范围内或在50-500微米范围内的孔径。

在本发明的一些优选实施例中，过滤器具有在0.03-100微米范围内的孔径。优选地，过滤器可具有在0.1-50微米范围内的孔径。更优选地，过滤器可具有在4-40微米范围内的孔径。甚至更优选地，过滤器可具有在5-30微米范围内的孔径，例如在10-20微米范围内的孔径。

使用孔径大于1微米的过滤器的优点是在分离过程中以及任选地在洗涤和/或重结晶过程中细菌和其他微生物也至少部分地被除去。因此，本方法可以在非常低的细菌负荷但避免蛋白质的热损伤的情况下产生高纯度BLG。

使用孔径大于1微米的过滤器的另一个优点是去除水和随后的干燥变得更容易并且能量消耗更少。

在制备乳清蛋白溶液期间，可以将与BLG晶体分离的剩余乳清蛋白溶液再循环到乳清蛋白进料中。

在本发明的一些优选实施例中，步骤c)使用过滤式离心机。在本发明的其他优选实施例中，步骤c)使用沉降式离心机。初步结果(参见实例13)已经示出，使用过滤式离心机和/或沉降式离心机以将BLG晶体与母液分离提供了比例如真空过滤更稳健的方法操作。

通常优选的是用干燥气体干燥形成的滤饼，以降低滤饼的水分含量以及优选可以使滤饼从过滤器上剥离。干燥气体的使用可以形成分离步骤的一部分，或可替代地如果滤饼直接转变为干燥可食用BLG组合物，则可以形成最终干燥步骤。

在本发明的一些优选实施例中，步骤c)采用DCF单元。

初步测试(参见实例12)已经示出，使用具有膜孔径在0.03-5微米范围内以及优选在0.3-1.0微米范围内的DCF单元提供了BLG晶体的高效分离，并且诸位发明人已观察到DCF单元可以运行足够的时间以从甚至大批量的含有BLG晶体的乳清蛋白溶液中分离晶体。

在本发明的一些优选实施例中，使用配备有能够保留BLG晶体的膜的DCF单元进行步骤c)，将DCF渗透物再循环以形成乳清蛋白溶液或乳清蛋白进料的一部分，并且可以将DCF渗余物回收或者返回结晶槽。优选地，例如通过超滤/渗滤处理DCF渗透物，以使其在与乳清蛋白溶液或乳清蛋白进料混合之前使其关于BLG过饱和。

有利地，这些实施例不要求液体流的温度升高到高于15℃，因此与需要更高温度的方法变体相比，不易受微生物污染。这些实施例的另一个工业优点是过饱和水平容易控制，并且可以保持在不发生不需要的自发结晶的水平。因此，在所述方法的这些实施例期间，液体流的温度优选为至多15℃，更优选至多12℃，以及甚至更优选至多10℃，以及最优选至多5℃。

这些实施例在实例10中举例说明并在图26中展示。这些实施例可以作为批处理方法或连续方法实现。

在本发明的一些优选实施例中，所述方法包括步骤d)：洗涤BLG晶体，例如c)的分离的BLG晶体。洗涤可以包括单次洗涤或多次洗涤步骤。

步骤d)的洗涤优选涉及使BLG晶体与洗涤液接触而不完全溶解所述BLG晶体，以及随后将剩余的BLG晶体与所述洗涤液分离。

优选将洗涤液选择为避免BLG晶体完全溶解，并且洗涤液可以例如包括如下项或甚至本质上由如下项组成：冷脱矿物质水、冷自来水或冷反渗透渗透物。

洗涤液的pH可以在5-6的范围内，优选在5.0-6.0的范围内，以及甚至更优选在5.1-6.0的范围内，例如在5.1-5.9的范围内。

洗涤液的电导率可以是至多0.1mS/cm，优选至多0.02mS/cm，以及甚至更优选至多0.005mS/cm。

可以使用具有甚至更低电导率的洗涤液。例如，洗涤液可具有至多1μS/cm的电导率。可替代地，洗涤液的电导率可以是至多0.1μS/cm，例如约0.05μS/cm。

洗涤步骤优选在低温下进行以限制结晶BLG的溶解。洗涤液的温度优选是至多30℃，更优选至多20℃，以及甚至更优选至多10℃。

洗涤步骤可以是例如在至多5℃下进行，更优选在至多2℃下进行，例如在约0℃下进行。到目前为止，可以使用低于0℃的温度，使得例如由于存在一种或多种冰点降低剂，洗涤液在该温度下不会冻结。

在本发明的一些实施例中，洗涤液含有至少1％(w/w)的量、以及优选至少3％(w/w)的量例如4％(w/w)的量的BLG。

步骤d)的洗涤典型地溶解BLG晶体的初始量的至多80％(w/w)，优选BLG晶体的初始量的至多50％(w/w)、以及甚至更优选至多20％(w/w)。优选步骤d)的洗涤溶解BLG晶体的初始量的至多15％(w/w)，更优选BLG晶体的初始量的至多10％(w/w)、以及甚至更优选至多5％(w/w)。

洗涤液的总量与分离的BLG晶体的初始量之间的重量比率通常是至少1，优选至少2，以及更优选至少5。例如，洗涤液的量与分离的BLG晶体的初始量之间的重量比率可以是至少10。可替代地，洗涤液的总量与分离的BLG晶体的初始量之间的重量比率可以是至少20，例如至少50或至少100。

术语“洗涤液的总量”涉及在整个过程中使用的洗涤液的总量。

在本发明的一些优选实施例中，一个或多个洗涤序列以与BLG晶体分离相同的过滤器排列或类似的过滤器排列进行。将主要含有BLG晶体的滤饼添加至一个或多个洗涤液序列，通过过滤器除去洗涤液，而剩余的BLG晶体部分留在滤饼中。

在本发明的特别优选的实施例中，使用保留BLG晶体的过滤器进行步骤c)的分离。随后，使滤饼与一个或多个数量的洗涤液接触，所述洗涤液移动通过滤饼和过滤器。通常优选的是，洗涤液的每个数量是滤饼的体积的至多10倍，优选是滤饼体积的至多5倍，更优选是滤饼体积的至多1倍，甚至更优选是滤饼体积的至多0.5倍，例如滤饼体积的至多0.2倍。滤饼的体积包括滤饼的固体和流体(液体和气体)。将滤饼优选以这种方式洗涤至少2次，优选至少4次，以及甚至更优选至少6次。

来自步骤d)的用过的洗涤液可以例如再循环到乳清蛋白进料或乳清蛋白溶液中，在那可以再次将洗出的BLG分离。

所述方法还可以包括步骤e)，所述步骤涉及重结晶步骤，所述重结晶步骤包括：

-将分离的BLG晶体溶解在重结晶液中，

-调节所述重结晶液以获得关于BLG的过饱和，

-在过饱和的经调节的重结晶液中使BLG结晶，以及

-将BLG晶体与剩余的经调节的重结晶液分离。

步骤e)可以包括单个重结晶序列或多个重结晶序列。

在本发明的一些实施例中，使步骤或c)或d)的BLG晶体重结晶至少2次。例如，可以使BLG晶体重结晶至少3次，例如至少4次。

洗涤和重结晶步骤可以按任何顺序组合，并且如果需要可以多次进行。

步骤c)的分离的BLG晶体可以例如经历加工序列：

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)，随后进行

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)。

可替代地，步骤c)的分离的BLG晶体可以经历以下加工序列：

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)，随后进行

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)。

也可以将洗涤和重结晶的多个步骤组合，例如，按顺序：

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)，

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)，

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)，和

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)。

或者例如按顺序：

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)，

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)，

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)。

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)

在本发明的一些实施例中，所述方法还涉及使分离的BLG经受例如基于色谱法或选择性过滤的另外的BLG富集步骤。然而，在本发明的其他优选实施例中，所述方法在步骤b)之后不包含另外的BLG富集步骤。术语“另外的BLG富集步骤”意指相对于蛋白质总量而言富集BLG的工艺步骤，所述步骤与BLG的结晶或BLG晶体的处理无关。这种另外的BLG富集步骤的实例是离子交换色谱法。不认为洗涤BLG晶体和/或BLG的重结晶是“另外的BLG富集步骤”。

在本发明的一些特别优选的实施例中，所述方法涉及干燥步骤f)，其中将来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物转变为干燥组合物。

在本发明的上下文中，术语“干燥”意指所讨论的组合物或产品包含至多6％(w/w)以及优选甚至更少的水。

在本发明的上下文中，术语“含有BLG的组合物”用于描述经受步骤f)干燥的组合物。

在本发明的上下文中，“来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物”意指来自步骤b)、c)、d)、或e)的包含至少一些BLG的组合物。在本发明的一些优选实施例中，“来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物”是直接从步骤b)、c)、d)、或e)获得的。然而，在本发明的其他优选实施例中，“来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物”是对直接从步骤b)、c)、d)、或e)获得的组合物进行进一步加工的结果。

通常优选的是，含有BLG的组合物含有在直接从步骤b)、c)、d)、或e)获得的组合物中存在的显著量的BLG。在本发明的一些优选实施例中，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物包含至少50％(w/w)、优选至少70％、以及甚至更优选至少80％的从步骤b)、c)、d)、或e)获得的BLG。

优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物包含至少85％(w/w)的从步骤b)、c)、d)、或e)获得的BLG。更优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物包含至少90％(w/w)的从步骤b)、c)、d)、或e)获得的BLG。甚至更优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物包含至少95％(w/w)的从步骤b)、c)、d)、或e)获得的BLG。最优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物包含100％(w/w)的从步骤b)、c)、d)、或e)获得的BLG。

在本发明的一些优选实施例中，干燥步骤涉及喷雾干燥、冷冻干燥、旋转闪蒸干燥、旋转干燥和/或流化床干燥中的一种或多种。

在本发明的一些特别优选的实施例中，干燥步骤涉及如下含有BLG的组合物，其中BLG晶体已溶解，并且其中所得粉末不含有通过步骤b)或通过在干燥步骤之前重结晶形成的BLG晶体。如果所述可食用BLG组合物应类似于具有例如常规干燥乳清蛋白粉末的可食用BLG组合物，这些实施例是优选的。

BLG晶体可以例如通过以下方式来溶解：

-升温，

-例如通过添加一种或多种盐增加电导率，

-改变pH，例如超出5-6的范围，

-例如通过稀释降低BLG的浓度，

-或上述的组合。

喷雾干燥是目前优选的干燥不含BLG晶体的含有BLG的组合物的方法。

在本发明的其他特别优选的实施例中，干燥步骤涉及仍含有BLG晶体的含有BLG的组合物，并且其中所得粉末含有BLG晶体。如果所述可食用BLG组合物应具有比常规干燥乳清蛋白粉末更高的密度，则这些实施例是优选的。

在本发明的一些特别优选的实施例中，干燥步骤涉及仍含有BLG晶体的含有BLG的组合物，并且其中所得粉末含有BLG晶体。如果所述可食用BLG组合物应具有比常规干燥乳清蛋白粉末更高的密度，则这些实施例是优选的。

如实例7中所记载的，诸位发明人发现当干燥的BLG晶体重悬浮在冷脱矿物质水中时，可以对BLG晶体的浆料进行喷雾干燥并保留至少一些晶体结构。特别有利的是避免将含有BLG晶体的含有BLG的组合物暴露于热处理方案中，所述热处理方案在喷雾之前溶解显著量的BLG晶体。因此，如果在喷雾之前采用对含有BLG晶体的含有BLG的组合物的预热，则优选小心地控制热负荷。

在本发明的一些实施例中，含有BLG晶体的含有BLG的组合物在到达喷雾装置的出口(例如喷嘴或雾化器)时具有至多70℃、优选至多60℃、更优选至多50℃的温度。在本发明的一些优选实施例中，含有BLG晶体的含有BLG的组合物在到达喷雾装置的出口时具有至多40℃、优选至多30℃、更优选至多20℃、甚至更优选至多10℃、以及最优选至多5℃的温度。

喷雾干燥器的喷雾装置是例如装置如喷嘴或雾化器，其将待干燥的溶液或悬浮液转变为进入喷雾干燥器干燥室的液滴。

特别优选的是，含有BLG晶体的含有BLG的组合物在到达喷雾装置的出口时具有在0-50℃范围内的温度，优选在到达喷雾装置的出口时具有在2℃-40℃范围内、更优选在4℃-35℃范围内、以及最优选在5℃-10℃范围内的温度。

在本发明的一些优选实施例中，含有BLG的组合物在到达喷雾装置的出口时具有至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、甚至更优选至少80％、以及最优选至少90％例如优选97％-100％的BLG结晶度。含有BLG的组合物可以是BLG分离物，例如含有相对于总蛋白质而言超过90％(w/w)的量的BLG，或者它可含有显著量的其他蛋白质并因此含有相对于总蛋白质而言至多90％(w/w)的量的BLG。

在本发明的一些优选实施例中，含有BLG的组合物可以具有如本文所述的传统液体WPC或WPI或者传统液体SPC或SPI的蛋白质组合物，但是当到达喷雾装置的出口时具有至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、甚至更优选至少80％、以及最优选至少90％(例如优选97％-100％)的BLG结晶度。

喷雾干燥器的气体的入口温度优选在140℃-220℃的范围内，更优选在160℃-200℃的范围内，以及甚至更优选在170℃-190℃的范围内，例如优选约180℃。来自喷雾干燥器的气体的出口温度优选在50℃-95℃的范围内，更优选在70℃-90℃的范围内，以及甚至更优选在80℃-88℃的范围内，例如优选约85℃。根据经验，经受喷雾干燥的固体据称被加热到比气体出口温度低10℃-15℃的温度。

在本发明的一些优选实施例中，喷雾干燥器优选在50℃-85℃的范围内，更优选在60℃-80℃的范围内，以及甚至更优选在65℃-75℃的范围内，例如优选约70℃。

喷雾干燥BLG晶体悬浮液的概念在现有技术中尚未披露，并且本身就是本发明的独立方面。

因此，本发明的一个方面涉及生产经喷雾干燥的可食用粉末组合物的方法，所述可食用粉末组合物包含BLG，所述组合物包含干燥的BLG晶体，所述方法包括以下步骤：

-提供包含BLG晶体且优选具有至少20％BLG结晶度的液体含BLG组合物，所述液体含BLG组合物优选包含至少10％(w/w)的总固体，以及优选包含至少5％(w/w)的BLG，以及

-将液体含BLG组合物雾化到操作喷雾干燥器的干燥室中，以将包含BLG晶体的液体含BLG组合物转变成粉末。

在本发明的一些优选实施例中，将待干燥的含有BLG的组合物与干燥的BLG分离物混合，以将固体含量提高到可通过流化床干燥来干燥混合物的水平。这也称为回混，并且允许非常成本有效地干燥BLG产品。对于含有BLG晶体的含有BLG的组合物，这些实施例是特别优选的。

本方法的一个优点是待干燥的含有BLG的组合物在干燥步骤之前可具有非常高的固体含量，因此在干燥操作中必须除去较少的水并消耗较少的能量。

在本发明的一些优选实施例中，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物具有至少20％(w/w)的固体含量。优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物具有至少30％(w/w)的固体含量。更优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物具有至少40％(w/w)的固体含量。甚至更优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物具有至少50％(w/w)例如至少60％(w/w)的固体含量。

在本发明的其他优选实施例中，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物具有在20％-80％(w/w)范围内的固体含量。优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物具有在30％-70％(w/w)范围内的固体含量。更优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物具有在40％-65％(w/w)范围内的固体含量。甚至更优选地，来自步骤b)、c)、d)、或e)的含有BLG的组合物具有在50％-65％(w/w)范围内例如约60％(w/w)的固体含量。

诸位发明人发现，含有BLG的组合物的结晶度越高，与含有BLG的组合物结合的水越少，并且在干燥步骤之前可以实现含有BLG的组合物的更高的总固体含量。

因此，在本发明的一些优选实施例中，含有BLG的组合物具有至少10％(w/w)的BLG结晶度。优选地，含有BLG的组合物的BLG具有至少20％(w/w)的结晶度。更优选地，含有BLG的组合物的BLG具有至少30％(w/w)的结晶度。甚至更优选地，含有BLG的组合物的BLG具有至少40％(w/w)的结晶度。

甚至更高的结晶度通常是优选的。因此，在本发明的一些优选实施例中，含有BLG的组合物的BLG具有至少50％(w/w)的结晶度。优选地，含有BLG的组合物的BLG具有至少60％(w/w)的结晶度。更优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至少70％(w/w)的结晶度。甚至更优选地，含有BLG的组合物的BLG具有至少80％(w/w)的结晶度。最优选地，含有BLG的组合物的BLG具有至少90％(w/w)、优选至少95％(w/w)、更优选至少97％(w/w)、以及甚至更优选至少99％(w/w)的结晶度。

诸位发明人已发现水含量降低倾向于增加组合物的BLG结晶度。因此，在相同的条件下，具有高水:BLG比率的组合物(例如4％BLG晶体在水中的悬浮液)倾向于具有比具有较低水:BLG比率的组合物(例如滤饼或潮湿分离的晶体)更低的BLG结晶度。

本发明的方法可以使用温和的温度操作，所述温度不会损害乳清蛋白溶液的BLG和其他乳清蛋白的营养价值。

在本发明的一些优选实施例中，BLG在所述方法期间不经受高于90℃的温度。优选地，BLG在所述方法期间不经受高于80℃的温度。甚至更优选地，BLG在所述方法期间不经受高于75℃的温度。应注意的是，即使喷雾干燥通常采用超过150℃的温度，短的暴露时间和水的同时蒸发意味着经喷雾干燥的蛋白质不会经历高于50℃-70℃的温度。

诸位发明人已经看到在干燥步骤期间延长的加热减少了晶体形式的BLG的量的迹象。在本发明的一些优选实施例中，干燥步骤期间的热暴露保持足够低以使BLG的变性程度为至多10％，优选至多4％，更优选至多1％，甚至更优选至多0.4％，以及甚至更优选至多0.1％。最优选地，干燥步骤根本不会导致BLG的可检测的变性。

由干燥步骤引起的变性程度是通过测定有待在步骤f)中干燥的BLG-组合物中的BLG含量(c_步骤f前)(相对于总固体而言)和在重溶解的干燥组合物中的BLG含量(相对于总固体而言)以及使用以下公式来计算：

变性程度＝((c_步骤f前-c_步骤f后)/c_步骤f前)*100％

本发明的一些优选实施例涉及制备包含结晶形式的β-乳球蛋白(BLG)的可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白的乳清蛋白溶液，所述乳清蛋白溶液关于BLG过饱和，并且具有在5-6范围内的pH，所述乳清蛋白溶液包含：

-相对于总固体而言70％-100％(w/w)的蛋白质，

-相对于总蛋白质而言30％-90％(w/w)的BLG，以及优选30％-70％(w/w)的BLG

-相对于总蛋白质而言4％-50％(w/w)的ALA，以及优选8％-35％(w/w)的ALA，

-相对于蛋白质而言0-25％(w/w)的CMP，

-相对于乳清蛋白溶液的总重量而言至少10％(w/w)的蛋白质，

b)在过饱和乳清蛋白溶液中优选通过添加晶种使BLG结晶，以及

f)干燥直接从步骤b)获得的含有BLG的组合物，所述含有BLG的组合物优选具有至少30％的BLG结晶度，

该方法不包括步骤c)、d)或e)。

乳清蛋白溶液优选是脱矿物质的乳清蛋白溶液，并且优选其电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.3和/或UF渗透物电导率为至多7mS/cm。

在这些实施例中，BLG晶体不与乳清蛋白溶液分离，而是经干燥并产生处于粉末形式的高密度可食用BLG组合物。

本发明还涉及可通过这些实施例获得的可食用组合物。

本发明的其他优选实施例涉及制备包含处于结晶形式的β-乳球蛋白(BLG)的可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白的乳清蛋白溶液，所述乳清蛋白溶液关于BLG过饱和，并且具有在5-6范围内的pH，所述乳清蛋白溶液包含：

-相对于总固体而言70％-100％(w/w)的蛋白质，

-相对于总蛋白质而言30％-90％、以及优选30％-70％(w/w)的BLG

-相对于总蛋白质而言4％-50％、以及优选8％-35％(w/w)的ALA

-相对于总蛋白质而言0-25％(w/w)的CMP。

-相对于乳清蛋白溶液的总重量而言至少10％(w/w)的蛋白质，

b)在过饱和乳清蛋白溶液中优选通过添加晶种使BLG结晶，

c)将BLG晶体与剩余的乳清蛋白溶液分离，

d)任选地，洗涤从步骤c)获得的分离的BLG晶体，

e)任选地，使从步骤c)或d)获得的BLG晶体重结晶，以及

f)干燥含有BLG的组合物，所述含有BLG的组合物来自并且优选直接获得自步骤c)、d)或e)，所述含有BLG的组合物包含BLG晶体，并且优选具有至少30％的BLG结晶度。

乳清蛋白溶液优选是脱矿物质的乳清蛋白溶液，并且优选其电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.3和/或UF渗透物电导率为至多7mS/cm。

这些实施例特别适用于制备高密度粉末形式的低矿物质和低磷可食用BLG组合物

本发明还涉及可通过这些实施例获得的可食用组合物。

本发明的又其他优选的实施例涉及制备包含分离形式的β-乳球蛋白的可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白的乳清蛋白溶液，所述乳清蛋白溶液关于BLG过饱和，并且具有在5-6范围内的pH，所述乳清蛋白溶液包含：

-相对于总固体而言70％-100％(w/w)的蛋白质，

-相对于总蛋白质而言30％-90％(w/w)的BLG，以及优选30％-70％(w/w)的BLG，

-相对于总蛋白质而言5％-50％(w/w)的ALA，以及优选8％-35％(w/w)的ALA，

-相对于总蛋白质而言0-25％(w/w)的CMP。

-相对于乳清蛋白溶液的总重量而言至少10％(w/w)的蛋白质，

b)在过饱和乳清蛋白溶液中优选通过添加晶种使BLG结晶，

c)将BLG晶体与剩余的乳清蛋白溶液分离，

d)任选地，洗涤从步骤c)获得的分离的BLG晶体，

e)任选地，使从步骤c)或d)获得的BLG晶体重结晶，以及

f)干燥来自步骤c)、d)、或e)的含有BLG的组合物，所述含有BLG的组合物不包含BLG晶体。

乳清蛋白溶液优选是脱矿物质的乳清蛋白溶液，并且优选其电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.3和/或UF渗透物电导率为至多7mS/cm。

在这些实施例中，在干燥之前BLG晶体溶解。

本发明还涉及可通过这些实施例获得的可食用组合物。

在一些优选实施例中，本方法以批处理的方式实现。可替代地，并且有时优选地，所述方法可以实施为半批处理。在其他优选的实施例中，所述方法实施为连续过程。

本方法的一个优点是它比现有技术的BLG结晶的可比方法快得多。从最初调节乳清蛋白进料到完成步骤c的分离的持续时间可以是至多10小时，优选至多4小时，更优选至多2小时，以及甚至更优选至多1小时。

本发明的另外的方面涉及可从本文所述方法获得的分离的BLG晶体。

在本发明的上下文中，术语“分离的BLG晶体”涉及如下BLG晶体，其已经与形成它的溶液分离但仍可含有内部水，即晶体的水合BLG分子。

分离的晶体优选具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁。

优选地，分离的BLG晶体具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

并且具有晶胞积分角α＝90°(±2％)、β＝90°(±2％)、以及γ＝90°(±2％)。

在本发明的一些优选实施例中，分离的BLG晶体具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

并且具有晶胞积分角α＝90°(±1％)、β＝90°(±1％)、以及γ＝90°(±1％)。

甚至更优选地，分离的BLG晶体可具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

并且具有晶胞积分角α＝90°(±0.5％)、β＝90°(±0.5％)、以及γ＝90°(±0.5％)。

最优选地，分离的BLG晶体具有斜方晶系空间群P 2₁ 2₁ 2₁，以及晶胞大小

以及

并且具有晶胞积分角α＝90°、β＝90°、以及γ＝90°。

分离的BLG晶体可以例如包含至少20％(w/w)的BLG和至多80％(w/w)的水。优选地，分离的BLG晶体可以包含至少40％(w/w)的BLG和0-60％(w/w)范围内的水。甚至更优选地，分离的BLG晶体包含40％-60％(w/w)范围内的BLG和约40％-约60％(w/w)的水。

诸位发明人已经发现，本发明的BLG晶体在干燥和再水合后出人意料地具有恢复其原始晶体结构的能力。这在受益于BLG晶体结构的应用中是特别有利的。

本发明的又一方面涉及包含β-乳球蛋白的可食用组合物，例如可通过如本文定义的方法获得的可食用组合物。

本发明的另一方面涉及可食用BLG组合物，其包含相对于总固体而言至少90％(w/w)的BLG。这种可食用BLG组合物可通过如本文定义的方法获得。

本发明的另外的方面涉及可食用BLG组合物，其包含干燥BLG晶体，相对于总固体而言至少20％(w/w)的BLG，并且优选具有关于BLG至少20％的结晶度。这种包含干燥BLG晶体的可食用BLG组合物可通过如本文定义的方法获得。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物的BLG具有至多1的乳糖基化程度。优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至多0.6的乳糖基化程度。更优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至多0.4的乳糖基化程度。甚至更优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至多0.2的乳糖基化程度。最优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至多0.1、例如优选至多0.01的乳糖基化程度。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物的BLG包含至少90％(w/w)的非乳糖基化BLG，优选至少95％(w/w)的非乳糖基化BLG，以及甚至更优选至少98％(w/w)的非乳糖基化BLG。

根据实例9.1测定非乳糖基化BLG的百分比。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物的BLG具有至少10％(w/w)的结晶度。优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至少20％(w/w)的结晶度。更优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至少30％(w/w)的结晶度。甚至更优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至少40％(w/w)的结晶度。

甚至更高的结晶度通常是优选的。因此，在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物的BLG具有至少50％(w/w)的结晶度。优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至少60％(w/w)的结晶度。更优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至少70％(w/w)的结晶度。甚至更优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至少80％(w/w)的结晶度。最优选地，可食用BLG组合物的BLG具有至少90％(w/w)、以及优选至少95％(w/w)的结晶度。

根据实例9.7测量pH在5-6范围内的液体中的BLG的结晶度。根据实例9.8测量粉末材料中BLG的结晶度。如果可食用组合物是干燥产品而不是粉末形式，则必须将其例如通过研磨或碾磨转变为粉末，之后进行实例9.8的方法。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物是WPC、WPI、SPC或SPI，其中至少一些BLG是晶体形式。可食用BLG组合物可以是例如包含相对于蛋白质总量而言至多90％(w/w)的BLG，并且具有至少10％的BLG结晶度。例如，可食用BLG组合物可以包含相对于蛋白质总量而言至多80％(w/w)的BLG，并且具有至少10％的BLG结晶度。可食用BLG组合物可以例如包含相对于蛋白质总量而言30％-70％(w/w)的BLG，并且具有至少10％的BLG结晶度。

在本发明的其他优选实施例中，可食用BLG组合物包含相对于蛋白质总量而言至多90％(w/w)的BLG，并且具有至少30％的BLG结晶度。优选地，可食用BLG组合物可以包含相对于蛋白质总量而言至多80％(w/w)的BLG，并且具有至少30％的BLG结晶度。甚至更优选地，可食用BLG组合物可以包含相对于蛋白质总量而言30％-70％(w/w)的BLG，并且具有至少30％的BLG结晶度。

诸位发明人发现，本发明使得可以制备具有非常低的磷和其他矿物质含量的可食用乳清蛋白产品，这对于患有肾脏疾病或不然具有降低的肾功能的患者是有利的。

可食用BLG组合物优选为低磷组合物。

在本发明的上下文中，术语“低磷”涉及总的磷含量为至多100mg磷/100g蛋白质的组合物，例如液体、粉末或其他食品产品。优选地，低磷组合物具有至多80mg总的磷含量/100g蛋白质。更优选地，低磷组合物可以具有至多50mg总的磷含量/100g蛋白质。甚至更优选地，低磷组合物可以具有至多20mg磷的总的磷含量/100g蛋白质。甚至更优选地，低磷组合物可以具有至多5mg磷的总的磷含量/100g蛋白质。根据本发明的低磷组合物可用作用于生产肾功能降低患者群食品的食品产品成分。

因此，在本发明的一些特别优选的实施例中，可食用BLG组合物包含至多80mg磷/100g蛋白质。优选地，可食用BLG组合物包含至多30mg磷/100g蛋白质。更优选地，可食用BLG组合物包含至多20mg磷/100g蛋白质。甚至更优选地，可食用BLG组合物包含至多10mg磷/100g蛋白质。最优选地，可食用BLG组合物包含至多5mg磷/100g蛋白质。

磷含量涉及所讨论的组合物的元素磷的总量，并根据实例9.5测定。

在本发明的其他优选实施例中，可食用BLG组合物是低矿物质组合物。

在本发明的上下文中，术语“低矿物质”涉及具有以下项中的至少一项、优选两项、以及甚至更优选全部项的组合物，例如液体、粉末或其他食品产品：

-相对于总固体而言至多1.2％(w/w)的灰分含量，

-相对于总固体而言至多0.3％(w/w)的钙镁总含量，

-相对于总固体而言至多0.10％(w/w)的钠钾总含量，

-至多100mg磷/100g蛋白质的总的磷含量。

优选地，低矿物质组合物具有以下项中的至少一项、优选两项或更多项、以及甚至更优选全部项：

-相对于总固体而言至多0.7％(w/w)的灰分含量，

-相对于总固体而言至多0.2％(w/w)的钙镁总含量，

-相对于总固体而言至多0.08％(w/w)的钠钾总含量，

-至多80mg磷/100g蛋白质的总的磷含量。

甚至更优选地，低矿物质组合物具有以下项中的至少一项、优选两项或更多项、以及甚至更优选全部项：

-相对于总固体而言至多0.5％(w/w)的灰分含量，

-相对于总固体而言至多0.15％(w/w)的钙镁总含量，

-相对于总固体而言至多0.06％(w/w)的钠钾总含量，

-至多50mg磷/100g蛋白质的总的磷含量。

特别优选的是，低矿物质组合物具有以下项：

-相对于总固体而言至多0.5％(w/w)的灰分含量，

-相对于总固体而言至多0.15％(w/w)的钙镁总含量，

-相对于总固体而言至多0.06％(w/w)的钠钾总含量，

-至多50mg磷/100g蛋白质的总的磷含量。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物包含相对于可食用BLG组合物的总固体而言至少25％(w/w)的蛋白质总量。优选地，可食用BLG组合物包含相对于可食用BLG组合物的总固体而言至少50％(w/w)的蛋白质总量。更优选地，可食用BLG组合物包含相对于可食用BLG组合物的总固体而言至少75％(w/w)的蛋白质总量。甚至更优选地，可食用BLG组合物包含相对于可食用BLG组合物的总固体而言至少90％(w/w)的蛋白质总量。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物的蛋白质总量相对于总固体而言在25％-100％(w/w)的范围内。优选地，可食用BLG组合物的蛋白质总量在50％-100％(w/w)的范围内。更优选地，可食用BLG组合物的蛋白质总量相对于总固体而言在75％-100％(w/w)的范围内。甚至更优选地，可食用BLG组合物的蛋白质总量相对于总固体而言在90％-100％(w/w)的范围内。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物包含相对于蛋白质总量而言至少75％(w/w)的BLG。优选地，可食用BLG组合物可以包含相对于蛋白质总量而言至少90％(w/w)的BLG。更优选地，可食用BLG组合物可以包含相对于蛋白质总量而言至少95％(w/w)的BLG。甚至更优选地，可食用BLG组合物可以包含相对于蛋白质总量而言至少97％(w/w)的BLG。最优选地，可食用BLG组合物包含相对于蛋白质总量而言约100％(w/w)的BLG。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物含有至多10％(w/w)的碳水化合物，优选至多5％(w/w)的碳水化合物，更优选至多1％(w/w)的碳水化合物，以及甚至更优选至多0.1％(w/w)的碳水化合物。

可食用BLG组合物也可以包含脂质，例如处于甘油三酯和/或其他脂质类型(如磷脂)形式的脂质。

在本发明的一些实施例中，可食用BLG组合物包含相对于总固体而言至多1％(w/w)的脂质总量。优选地，可食用BLG组合物包含相对于总固体而言至多0.5％(w/w)的脂质总量。更优选地，可食用BLG组合物包含相对于总固体而言至多0.1％(w/w)的脂质总量。甚至更优选地，可食用BLG组合物包含相对于总固体而言至多0.05％(w/w)的脂质总量。最优选地，可食用BLG组合物包含相对于总固体而言至多0.01％(w/w)的脂质总量。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物是干燥组合物，以及例如粉末。特别优选的是，可食用BLG组合物是经喷雾干燥的粉末。

诸位发明人观察到处于粉末形式(其中至少一些BLG在干燥时处于晶体形式)的可食用BLG组合物的密度高于没有BLG晶体的可比BLG组合物的密度(参见实例7)。对于从经喷雾干燥的BLG晶体浆料中获得的处于粉末形式的可食用BLG组合物，也非常出人意料地观察到这种高密度效果。

因此，在本发明的一些优选实施例中，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.40g/mL的堆积密度。优选地，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.45g/mL的堆积密度。更优选地，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.50g/mL的堆积密度。甚至更优选的是，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.6g/mL的堆积密度。处于粉末形式的可食用BLG组合物可以例如具有至少为0.7g/mL的堆积密度。

堆积密度的优点均适用于其中BLG几乎是唯一存在的蛋白质的可食用BLG组合物粉末和其中BLG浓度相对于乳清蛋白溶液中存在的其他蛋白质而言未富集的可食用BLG组合物粉末。因此，本发明提供了分离的BLG和粗乳清蛋白二者的高密度粉末，所述粗乳清蛋白除了BLG之外还包含显著量的ALA和其他乳清蛋白。

在本发明的一些优选实施例中，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.45g/mL的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。更优选地，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.50g/mL的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。甚至更优选的是，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.6g/mL的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。处于粉末形式的可食用BLG组合物可以例如具有至少0.7g/mL的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。

在本发明的其他优选实施例中，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.45g/mL的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。更优选地，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.50g/mL的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。甚至更优选的是，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有至少0.6g/mL的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。处于粉末形式的可食用BLG组合物可以例如具有至少0.7g/mL的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。

处于粉末形式的可食用BLG组合物可以例如具有在0.40-1.5g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。优选地，粉末状可食用BLG组合物具有在0.45-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。更优选地，粉末状可食用BLG组合物可具有在0.50-0.9g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状可食用BLG组合物具有在0.6-0.9g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。粉末状可食用BLG组合物可以例如具有在0.6-0.8g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。

诸位发明人已经发现，本发明的高密度粉末有利地允许粉末的更具成本效益的包装和物流，因为每kg粉末需要更少的包装材料，并且更多的粉末(质量)可以通过给定的容器或卡车运输。

处于粉末形式的可食用BLG组合物可以例如具有在0.40-1.5g/mL范围内的堆积密度。优选地，粉末状可食用BLG组合物具有在0.45-1.0g/mL范围内的堆积密度。更优选地，粉末状可食用BLG组合物可具有在0.50-0.9g/mL范围内的堆积密度。甚至更优选的是，粉末状可食用BLG组合物具有在0.6-0.9g/mL范围内的堆积密度。粉末状可食用BLG组合物可以例如具有在0.6-0.8g/mL范围内的堆积密度。

在本发明的其他优选实施例中，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有在0.50-1.5g/mL范围内的堆积密度。优选地，粉末状可食用BLG组合物具有在0.55-1.0g/mL范围内的堆积密度。更优选地，粉末状可食用BLG组合物可具有在0.60-1.0g/mL范围内的堆积密度。甚至更优选的是，粉末状可食用BLG组合物具有在0.65-1.0g/mL范围内的堆积密度。粉末状可食用BLG组合物可以优选具有在0.70-1.0g/mL范围内的堆积密度。

处于粉末形式的可食用BLG组合物可以例如具有在0.40-1.5g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。优选地，粉末状可食用BLG组合物具有在0.45-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。更优选地，粉末状可食用BLG组合物可具有在0.50-0.9g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状可食用BLG组合物具有在0.6-0.9g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。粉末状可食用BLG组合物可以例如具有在0.6-0.8g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。

处于粉末形式的可食用BLG组合物可以例如具有在0.40-1.5g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。优选地，粉末状可食用BLG组合物具有在0.45-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。更优选地，粉末状可食用BLG组合物可具有在0.50-0.9g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状可食用BLG组合物具有在0.6-0.9g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。粉末状可食用BLG组合物可以例如具有在0.6-0.8g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。

在本发明的其他优选实施例中，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有在0.50-1.5g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。优选地，粉末状可食用BLG组合物具有在0.55-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。更优选地，粉末状可食用BLG组合物可具有在0.60-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状可食用BLG组合物具有在0.65-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。粉末状可食用BLG组合物可以优选具有在0.70-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少70％(w/w)的蛋白质。

在本发明的其他优选实施例中，处于粉末形式的可食用BLG组合物具有在0.50-1.5g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。优选地，粉末状可食用BLG组合物具有在0.55-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。更优选地，粉末状可食用BLG组合物可具有在0.60-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状可食用BLG组合物具有在0.65-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。粉末状可食用BLG组合物可以优选具有在0.70-1.0g/mL范围内的堆积密度，并且包含相对于组合物的总重量而言至少80％(w/w)的蛋白质。

根据实例9.3测量粉末的堆积密度。

诸位发明人已经看到有迹象表明，根据本发明的BLG组合物具有比相似的BLG组合物更好的长期稳定性。当至少一些BLG以BLG晶体的形式存在时，尤其如此，这似乎提供了BLG分子的更好的储存稳定性。

在本发明的一些优选实施例中，干燥BLG组合物在30℃下60天后具有至多80mg/100g蛋白质、优选至多60mg/100g蛋白质、更优选至多40mg/100g蛋白质、以及甚至更优选至多20mg/100g蛋白质的糠氨酸值。最优选地，干燥BLG组合物在30℃下60天后具有至多10mg/100g蛋白质的糠氨酸值。

在本发明的一些优选实施例中，干燥BLG组合物具有至多80mg/100g蛋白质、优选至多60mg/100g蛋白质、更优选至多40mg/100g蛋白质、以及甚至更优选至多20mg/100g蛋白质的糠氨酸值。最优选地，干燥BLG组合物具有至多10mg/100g蛋白质的糠氨酸值。优选地，干燥BLG组合物具有0mg/100g蛋白质的糠氨酸值。

在本发明的一些优选实施例中，干燥BLG组合物的BLG在30℃下60天后具有至多1、优选至多0.6、更优选0.2、甚至更优选至多0.1、以及最优选至多0.01的乳糖基化程度。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物是液体组合物。液体可食用BLG组合物优选包含至少20％(w/w)的水，更优选至少30％(w/w)的水，甚至更优选至少40％(w/w)的水。

液体可食用BLG组合物可以例如包含在20％-90％(w/w)范围内的水，更优选在30％-80％(w/w)范围内的水，甚至更优选至少40％(w/w)的水。

诸位发明人发现，根据本发明的可食用BLG组合物具有出人意料地低的蛋白质变性程度，即使喷雾干燥也已用于制备可食用BLG粉末组合物也如此(参见实例11)。

因此，在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物具有至多2％的蛋白质变性程度。优选地，可食用BLG组合物具有至多1.5％的蛋白质变性程度。更优选地，可食用BLG组合物具有至多1.0％的蛋白质变性程度。甚至更优选地，可食用BLG组合物具有至多0.8％的蛋白质变性程度。甚至更优选地，可食用BLG组合物具有至多0.5％的蛋白质变性程度。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物是干燥粉末，以及优选是经喷雾干燥的粉末，并且具有至多2％、以及优选至多1.5％的蛋白质变性程度。更优选地，例如处于经喷雾干燥粉末形式的干燥可食用BLG组合物具有至多1.0％的蛋白质变性程度。甚至更优选地，例如处于经喷雾干燥粉末形式的干燥可食用BLG组合物具有至多0.8％的蛋白质变性程度。甚至更优选地，例如处于经喷雾干燥粉末形式的干燥可食用BLG组合物具有至多0.5％的蛋白质变性程度。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物包含：

-至多6％(w/w)的水

-相对于总固体而言至少80％的总蛋白质

-相对于总蛋白质而言至少95％的BLG，并且

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末，并且

-具有至少0.50g/mL、以及优选至少0.60g/mL的堆积密度。

在本发明的其他优选实施例中，可食用BLG组合物包含：

-至多6％(w/w)的水

-相对于总固体而言至少80％的总蛋白质

-相对于总蛋白质而言至少95％的BLG，并且

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末，

-具有至少0.50g/mL、以及优选至少0.60g/mL的堆积密度，并且

-具有至少20％、以及优选至少40％的BLG结晶度。

在本发明的进一步优选的实施例中，可食用BLG组合物包含：

-至多6％(w/w)的水

-相对于总固体而言至少80％的总蛋白质

-相对于总蛋白质而言至少95％的BLG，并且

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末，

-具有至少0.50g/mL、以及优选至少0.60g/mL的堆积密度，并且-具有至多2％、以及优选至多1.0％的蛋白质变性程度。

在本发明的进一步优选的实施例中，可食用BLG组合物包含：

-至多6％(w/w)的水

-相对于总固体而言至少80％的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少95％的BLG，

-至多80mg磷/100g蛋白质。

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末。

在本发明的又优选的实施例中，可食用BLG组合物包含：

-至多6％(w/w)的水

-相对于总固体而言至少90％的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少97％的BLG，

-至多50mg磷/100g蛋白质。

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末。

在本发明的其他优选实施例中，可食用BLG组合物包含：

-至多6％(w/w)的水

-相对于总固体而言至少80％的总蛋白质，以及优选相对于总固体而言至少90％的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言30％-70％的BLG，

-相对于总蛋白质而言8％-25％(w/w)的ALA，

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末，并且

-具有至少20％、以及优选至少40％的BLG结晶度。

在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物包含：

-20％-80％(w/w)的水，以及优选20％-60％(w/w)的水，

-相对于总固体而言至少80％的总蛋白质，以及优选至少90％的总蛋白质

-相对于总蛋白质而言至少95％的BLG，

-至多80mg磷/100g蛋白质。

所述可食用BLG组合物：

-具有至少20％、优选至少40％的BLG结晶度，以及

-任选地具有至多2％、以及优选至多1.0％的蛋白质变性程度。

根据这些实施例的可食用组合物特别可用于制备处于干燥形式的可食用BLG组合物，并且特别适用于喷雾干燥和制备如下高密度乳清蛋白粉末，所述高密度乳清蛋白粉末具有乳清蛋白种类乳清蛋白的正常浓度分布但含有至少一些处于干燥BLG晶体形式的BLG。

在本发明的其他优选实施例中，可食用BLG组合物包含：

-20％-80％(w/w)的水，以及优选20％-60％(w/w)的水，

-相对于总固体而言至少80％的总蛋白质，以及优选相对于总固体而言至少90％的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言30％-70％的BLG，

-相对于总蛋白质而言8％-25％(w/w)的ALA，

所述可食用BLG组合物：

-具有至少20％、以及优选至少40％的BLG结晶度。

根据这些实施例的可食用组合物特别可用于制备处于干燥形式的可食用BLG组合物，并且特别适用于喷雾干燥和制备如下高密度乳清蛋白粉末，所述高密度乳清蛋白粉末具有乳清蛋白种类乳清蛋白的正常浓度分布但含有至少一些处于干燥BLG晶体形式的BLG。

本发明的又一个方面涉及如本文所定义的可食用BLG组合物作为食品成分的用途。

例如，优选使用如本文所定义的低磷可食用BLG组合物作为低磷食品生产中的食品产品成分。

本发明的另一方面涉及一种食品产品，其包含如本文所定义的可食用BLG组合物和至少一种另外的成分，例如脂肪来源和/或碳水化合物来源。

在本发明的一些优选实施例中，食品产品是包含碳水化合物和蛋白质的干燥食品，例如棒，所述干燥食品包含至少1％(w/w)、优选至少5％的BLG，其中：

i)BLG结晶度是至少20％，优选至少40％，和/或

ii)BLG包含至少90％(w/w)的蛋白质总量。

在本发明的一些特别优选的实施例中，食品产品是低磷食品，其包含至多100mg磷/100g蛋白质，优选至多80mg磷/100g蛋白质，更优选至多40mg磷/100g蛋白质，以及甚至更优选至多20mg磷/100g蛋白质。

BLG具有有利的氨基酸谱，并且优选地贡献食品产品的显著部分的蛋白质。如果食品产品是低矿物质或低磷食品，这是特别有趣的。在本发明的一些优选实施例中，可食用BLG组合物占食品产品蛋白质总量的至少25％(w/w)，或至少50％(w/w)，更优选至少80％(w/w)，以及甚至更优选至少90％(w/w)。甚至可能最优选的是，可食用BLG组合物贡献食品产品的所有蛋白质。

在本发明的一些优选实施例中，低磷可食用BLG组合物占低磷食品产品蛋白质总量的至少25％(w/w)，或至少50％(w/w)，更优选至少80％(w/w)，以及甚至更优选至少90％(w/w)。甚至可能最优选的是，低磷可食用BLG组合物贡献低磷食品产品的所有蛋白质。

食品产品的非限制性实例是例如乳制品、糖果、饮料、蛋白质棒、肠内营养组合物、烘焙产品。

在本发明的一些优选实施例中，食品产品是饮料。饮料优选包含：

-如本文所定义的可食用BLG组合物，以提供至少1％(w/w)、优选至少5％(w/w)、更优选至少8％(w/w)、以及甚至更优选至少12％(w/w)的BLG总量，

-甜味剂，例如糖甜味剂和/或非糖甜味剂，

-至少一种食用酸，例如柠檬酸或其他合适的食用酸，

-任选地，调味剂，和

-至多80mg磷/100g蛋白质

pH值范围为2.5-4.0。

诸位发明人已经认识到，从包含BLG晶体的干燥可食用BLG组合物制备酸性高蛋白质低矿物质饮料或液体并非不重要的。包含BLG晶体的干燥可食用BLG组合物在重悬浮于水中时典型地产生在5-6范围内的pH，并且添加酸或盐以改变pH或增加电导率也增加了所得液体/饮料的矿物质负荷。

然而，诸位发明人已经发现，如果使用羧酸、内酯、羧酸酐或其组合来降低pH，则不添加不必要的矿物质，并且可以更好地控制饮料/液体的矿物质组成。

因此，本发明的一个方面涉及使用包含BLG晶体作为成分的可食用BLG组合物生产酸化的低矿物质液体的工艺，所述工艺包括以下步骤：

-提供一种或多种选自下组的酸化剂，该组由以下组成：羧酸、内酯、羧酸酐或其组合，

-使包含BLG晶体的可食用BLG组合物与一种或多种酸化剂和任选的其他成分(例如水、脂肪来源和/或碳水化合物来源)接触，所述一种或多种酸化剂的用量足以将pH调节至2-4.5、以及优选2.5-4.0，并使BLG晶体溶解，

从而形成液体。

液体可以例如用作饮料，或者它可以用作生产其他食品产品的成分。

如果在所述工艺中使用的可食用BLG组合物以干燥形式例如作为粉末提供，则通常优选的是使其在水中再水合然后添加酸化剂。

在所述工艺中使用的可食用BLG组合物优选以足以提供1％-30％(w/w)蛋白质、优选2％-25％(w/w)蛋白质、更优选4％-20％(w/w)蛋白质、以及甚至更优选5％-16％(w/w)蛋白质的量存在于液体中。

在所述工艺中使用的可食用BLG组合物优选具有至少30％、优选至少50％、以及甚至更优选至少70％的BLG结晶度。

一种或多种合适的酸化剂的实例是：

-羧酸，例如乙酸、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、葡糖酸或它们的混合物，

-内酯，例如D-葡糖酸-δ-内酯，

-羧酸酐。

在一些优选实施例中，在所述工艺中使用的包含BLG晶体的可食用BLG组合物优选是低磷组合物，并且优选选择在所述工艺中使用的任何其他成分，使得最终液体也是低磷组合物。

在其他优选实施例中，在所述工艺中使用的包含BLG晶体的可食用BLG组合物优选是低矿物质组合物，并且优选选择在所述工艺中使用的任何其他成分，使得最终液体也是低矿物质组合物。

所述工艺优选在1℃-65℃范围内、优选2℃-50℃、更优选在3℃-20℃范围内、甚至更优选在4℃-15℃范围内的温度下进行。

上文已参考多个具体实施例对本发明进行了描述。然而，除上文描述以外的其他实施例同样有可能在本发明的范围之内。除非另有说明，否则本发明的各种实施例和方面的不同特征和步骤可以按照除本文描述的这些以外的其他方式进行结合。

实例

实例1：来自粗乳清蛋白浓缩物的β-乳球蛋白的结晶

方案：

使用从标准奶酪生产过程中的甜乳清衍生的且通过1.2微米过滤器过滤的乳糖耗尽的UF渗余物作为BLG结晶过程的进料。在使用具有进料压力为1.5-3.0巴的46mil间隔器的科氏公司(Koch)HFK-328型膜的超滤设置上，使用21％TS(总固体)±5的进料浓度和精加工水(通过反渗透过滤的水以获得至多0.05mS/cm的电导率)作为渗滤介质来调节甜乳清进料。超滤期间进料和渗余物的温度为约12℃。然后通过添加HCl调节pH以获得约5.40的pH。渗滤持续进行直到20min时间内渗余物的电导率下降低于0.03mS/cm。然后将渗余物浓缩至约30％TS(相对于浓缩渗余物的总重量而言，总蛋白质为约23.1％)。将浓缩的渗余物的样品以3000g离心5分钟，但没有形成可见的沉淀物。对上清液进行HPLC分析。进料的组成示于表1中。

向浓缩的渗余物中接种0.5g/L从自发BLG结晶获得的纯BLG晶体材料(如进料2背景下实例3中所述)。通过在milliQ水中洗涤BLG晶体浆料5次、在每次洗涤后收集BLG晶体来制备接种材料。洗涤后，将BLG晶体冷冻干燥，用杵和研钵研磨，然后通过200微米筛。因此，晶种的粒度小于200微米。

将浓缩的渗余物转移到300L结晶槽中，在该结晶槽中其被冷却至约4℃并在此温度下伴随温和搅拌下保持过夜。第二天早上，将冷却的浓缩渗余物的样品转移到试管中，并在视觉和显微镜下检查。在一夜之间明显形成快速沉降的晶体。将包含晶体和母液的混合物的实验室样品在冰水浴中进一步冷却至0℃。通过3000g离心5分钟分离母液和晶体，并取出上清液和沉淀的样品用于HPLC分析。将晶体在冷的精加工水中洗涤一次，然后再次离心，然后冷冻干燥沉淀物。

表1标准化至95％(w/w)总固体的所选进料组分浓度

通过HPLC进行BLG相对产率定量：

通过添加精加工水对所有样品进行相同程度的稀释。将样品通过0.22微米过滤器过滤。对于每个样品，将相同体积加载到具有Phenomenex

5μm C4

LC柱250x4.6mm(部件号：00G-4167-E0)的HPLC系统上，并在214nm下检测。

使用以下条件运行样品：

缓冲液A：MilliQ水，0.1％w/w TFA

缓冲液B：HPLC级乙腈，0.085％w/w TFA

流量：1ml/min

梯度：0-30分钟82％-55％A和18％-45％B；30-32分钟55％-10％A和45％-90％B；32.5-37.5分钟10％A和90％B；38-48分钟10％-82％A和90％-18％B。

数据处理：

由于所有样品都以相同的方式处理，我们可以直接比较BLG峰的面积以获得相对产量。由于晶体仅含有BLG且样品均以相同方式处理，因此所有样品中α-乳白蛋白(ALA)的浓度以及因此ALA的面积应相同，因此在计算相对产率时在结晶之前和之后ALA的面积用作校正因子(cf)。

相对产率由以下方程式计算：

结果：

图1示出在来自甜乳清的BLG结晶之前和之后的重叠色谱图。“结晶之前”样品由实线黑线表示，而“结晶之后”样品由虚线表示。显然，发生了BLG浓度的大幅下降，并且使用如前所述的产率计算，确定去除的BLG的产率为64.5％(w/w)。

通过显微镜研究晶体浆料；从图2中可以看出，样品含有六边形晶体，许多晶体的尺寸远大于200微米，这表明观察到的晶体不仅是接种晶体。当用针压制时晶体容易破碎，这证实它们是蛋白质晶体。

图3示出经洗涤的晶体产物的色谱图，并且在这种情况下，BLG占色谱图总面积的98.9％。通过进一步的洗涤可以更进一步提高BLG产物的纯度。

结论：

此实例出人意料地证实，可以从粗乳清蛋白浓缩物(其包含相对于总蛋白而言超过48％的非BLG蛋白)中选择性地使BLG结晶，并且所获得的BLG晶体分离物具有极高的纯度。这一发现开创了工业乳蛋白分离的新途径，其中BLG以优选避免长时间暴露于高温和有问题的化学品的温和方式与其他蛋白质组分分离。

实例2：电导率和温度对BLG产率的影响

方案：

使用与实例1中相同的进料、实验和分析设置，在UF渗滤期间在不同电导率水平下取得渗余物样品(约13.9％(w/w)总蛋白质)以研究电导率对BLG晶体产率的影响。将样品冷却至4℃并在此温度下保持过夜(然而，诸位发明人已观察到30分钟或甚至更短可能足以达到平衡)，然后将三种样品在冰水中冷却至0℃，并在此温度下保持至少1小时，以显示温度对产率的影响。4℃样品的结果可以在图4中看到。

渗滤完成后，在浓缩期间在白利糖度21、24和32.5下取得样品。首先将这些样品冷却至4℃并在此温度下保持过夜。如实例1中所述测量BLG晶体的产率。然后将样品在冰水中冷却至0℃并在此温度下保持至少1小时。随后，再次测量BLG晶体的产率。

结果：

当绘制BLG的相对产率与样品中的电导率(如图4所示)时，较低电导率和BLG的较高相对产率之间存在明显的相关。

在图5中，示出了在两个温度(4℃和0℃)下电导率不同的三种样品的产率，可以看出温度越低，BLG的产率越高。更进一步降低温度预计会增加产率。

图6示出蛋白质浓度对BLG在4℃和0℃下的相对产率的影响。所述图示出了蛋白质浓度(此处通过白利糖度测量显示)与BLG相对产率之间的明确相关，表明随着蛋白质浓度增加，相对产率继续增加。

结论：

诸位发明人已经观察到许多参数影响结晶过程的效率。在给定的pH值下，通过降低电导率，增加BLG的浓度和降低温度可以提高BLG的产率。

实例3：BLG在三种乳清蛋白溶液中的结晶

方案：

使用与实例1中相同的实验和分析设置，测试作为结晶进料的三种不同类型的含有乳清蛋白的原料。然而，在用进料2进行的实验中没有使用接种。进料1和进料2是基于甜乳清，并且在如实例1中所述的处理之前通过Synder FR膜进行了减脂。进料3来自酸乳清。

三种进料的组成可在下表2、表3和表4中看到。进料3以21％TS(相对于进料的总重量，总蛋白质为13.3％w/w)结晶，此浓度显著低于其他两者(进料1中的总蛋白质为26.3％(w/w)，进料2中的为25.0％(w/w))。

将结晶的进料1的浆料在具有0.45微米CA膜的Maxi-旋转过滤器上以1500g离心5分钟，然后将2个体积的MilliQ水添加至滤饼中，之后再次离心。通过HPLC分析所得的滤饼。保持结晶进料1的沉淀物(滤饼)的Maxi-旋转过滤器的照片示于图24中。将来自进料2的沉淀物用2个体积的MilliQ水洗涤并在标准条件下再次离心，然后通过HPLC分析沉淀物。在未洗涤的情况下分析来自进料3的沉淀物。

将由进料2制成的晶体稀释至10％TS，并使用1M NaOH将pH调节至pH 7以逆转结晶。将NaCl添加至来自进料2的晶体浆料(36％TS)以逆转结晶。

表2进料1(基于甜乳清的乳清蛋白浓缩物)的所选组分的浓度。湿样品中BDL＝低于检测限

表3进料2(基于甜乳清的ALA减少的乳清蛋白浓缩物)的所选组分的浓度。湿的非标准样品中BDL＝低于检测限。

表4进料3(基于酸乳清的乳清蛋白浓缩物)的所选组分的浓度。

结果：

进料1：

在图7中，可以看到进料(实线)和母液(虚线)的蛋白质组成的色谱图。显然，通过所述工艺将大部分BLG作为晶体回收。相对于进料中BLG总量而言，分离的BLG的产率(如实例1中所述计算)是约65％。

图8是在结晶时期的早期阶段期间拍摄的样品显微镜照片。图9是在结晶结束时拍摄的样品显微镜照片。从这两张照片可以清楚地看出，BLG晶体相对脆弱。一些晶体在搅拌过程中显现破裂，并且从六边形或菱形转变为晶体碎片，其仍然显现非常紧凑且轮廓分明但具有更不规则的形状。

图10示出在旋转过滤器上分离和洗涤的BLG晶体的色谱图。如图所示，纯度非常高，且其他乳清蛋白的去除效率极高。

进料2：

在图11中，可以看到进料2(实线)和获得的母液(虚线)的蛋白质组成。显然，已经除去了大部分BLG，并且相对于进料2中BLG的总量而言计算的产率为82％。

图12示出结晶之前(左图)和之后(右图)的进料2。在结晶期间，进料从透明液体(其中可见搅拌磁体)转变为乳白色不透明液体。

图13示出BLG晶体的显微镜照片。虽然大部分晶体是断裂的，但可以看到六边形形状。

图16是用2个体积的MilliQ水洗涤后分离的BLG晶体沉淀物的色谱图。色谱图清楚地示出晶体含有非常高纯度的BLG。

图14和图15示出了提高电导率(通过添加NaCl)或改变pH(通过添加NaOH将pH调节至7)的结果，使得环境不再有利于晶体结构。在两种情况下，当BLG晶体溶解时，乳白色悬浮液变成透明液体。

从进料2获得的晶体制剂的矿物质组成提供于表5中。我们注意到磷与蛋白质的比率非常低，这使得晶体制剂适合作为患有肾病的患者的蛋白质来源。

进料3：

在图17中，显示了进料3(实线)和所得母液(虚线)的蛋白质组成的色谱图。显然，分离出大部分BLG(相对于进料中BLG的总量而言，计算的产率为70.3％)。如果在结晶之前蛋白质含量较高，则获得的产率会更高。

图18是从进料3(基本上不含CMP)分离的BLG晶体的显微镜照片。与六边形相反，晶体具有矩形形状。矩形晶体似乎比六边形晶体更稳固。图19示出在未洗涤的情况下分离的晶体沉淀物的色谱图；色谱图清楚地示出晶体是BLG晶体，但具有矩形形状而不是六边形形状(比较例如图18的矩形晶体形状与图2的六边形晶体形状)。

表6从进料3获得的晶体制剂中的所选组分的浓度。

来自进料3的晶体制剂含有45mg P/100g蛋白质。我们注意到磷与蛋白质的比率非常低，这使得晶体制剂适合作为患有肾病的患者的蛋白质来源。

结论：

所有三种进料都适用于BLG结晶过程。通过添加盐或提高pH或温度，使BLG晶体易于溶解。所述新方法使得制备具有非常低的磷含量的BLG制剂成为可能，这使得所述制剂适合作为患有肾病的患者的蛋白质来源。

实例4 pH对BLG晶体产率的影响

方案：

使用与实例1相同的方案和实验设置(使用减脂的甜乳清蛋白浓缩物)，不同之处在于对于每个实验将pH调节至表8中所述的水平。结晶步骤开始时的蛋白质浓度为约24％(w/w)。

将pH用稀NaOH溶液(>4％)或稀HCl(>3.6％)溶液调节，以研究pH对结晶过程和获得的产率的影响。结晶之后，如实例1所述，通过离心分离BLG晶体。

表7用于实例4的进料的所选组分的浓度范围。

表8样品的目标pH

样品	目标pH
		1	4.80
2	5.20
		3	5.50
4	5.80
		5	6.00
6	6.20

结果：

如实例1中所述计算产率。应注意，在添加接种材料之前取得起始样品。因此，如果样品关于BLG不是过饱和的，则接种材料将溶解并贡献于总BLG浓度，在这种情况下BLG产率显现是负的。

表9基于HPLC测量计算的样品产率。

结论：

此实验证实，在5-6的pH范围内，可以在盐溶模式中实现BLG的结晶。

实例5：研究增加电导率水平的影响

方案：

使用与实例1中相同的方案和实验设置，不同之处在于以不同的电导率取得样品。对表10中所示的原料进行调节并用作结晶过程的进料。在UF之前，取得原料样品并添加NaCl以增加电导率，并研究在什么样的电导率水平下BLG晶体能够生长。结晶期间的蛋白质含量为约16.7％(w/w)。

表10实例5中使用的进料的组成范围。

结果：

如实例1中所述处理样品。图20示出渗余物中不同电导率下计算的产率。在pH调节后，3.53mS/cm处的点是原料。大于3.53的所有点都是添加NaCl以增加电导率的结果。小于3.53的点是在UF系统上渗滤的结果。4.93mS/cm处的产率接近于零并且不被认为是显著的。

电导率为4.93mS/cm的渗余物样品的UF渗透物电导率为约5.7mS/cm。电导率为3.53mS/cm的渗余物样品的UF渗透物电导率为约4.35mS/cm。

从图20中可以看出，BLG晶体在进料中在低于4.93mS/cm的电导率下形成(在4℃下，总蛋白质含量为约16.7％(w/w))。在渗余物中的电导率为约2mS/cm且UF渗透物电导率为约1.6mS/cm时，获得约75％的BLG产率。

图21是在渗余物中在4.20mS/cm下形成的晶体的显微镜照片，示出预期的BLG晶体特征。

结论：

实例5的特定进料使得可以形成低于4.93mS/cm的BLG晶体(对应于UF渗透物电导率5.75mS/cm，并且电导率与蛋白质总量之间的比率为0.057)。预计电导率的上限取决于蛋白质浓度和蛋白质组成。例如，预期较高蛋白质浓度和/或高电荷蛋白质或其他大分子(例如CMP)的含量增加会提高可使BLG结晶的电导率的上限。

实例6：在血清蛋白浓缩物中使BLG结晶

通过对脱脂乳用Synder FR膜进行微滤并经受约50℃的处理温度来制备血清蛋白浓缩物(SPC)。获得的渗余物基本上含有所有酪蛋白和残余脂肪，并且还含有一些血清蛋白、乳糖和矿物质。渗透物含有能够透过膜的分子，包括血清蛋白、乳糖和矿物质，但基本上没有酪蛋白或脂肪。然后如实例1中所述制备渗透物用于结晶(关于进料的组成参见表11)，并如实例1中所述表征所得BLG晶体。然而，代替在12℃下进行所有UF操作，当渗余物的电导率接近1mS/cm时，渗余物的温度从12℃升高到25℃。升高温度以避免在UF浓缩期间BLG的自发结晶。

表11进料(血清蛋白浓缩物)的所选组分的浓度。湿的非标准样品中BDL＝低于检测限。

与实例1-5的结晶相似，SPC进料的BLG形成可以按非常高的纯度(通过如前述实例中的色谱法确认)分离的晶体并且提供相对于SPC进料的BLG总量而言70％的BLG产率。在图22中，示出来自结晶早期阶段的BLG晶体。如前所示，晶体具有矩形或正方形形状，与例如在实例2中观察到的六边形形状相反。

实例7：经喷雾干燥的BLG晶体的制备和堆积密度的测定

将实例3中产生(使用进料2)的一部分BLG晶体在沉降式离心机上以1200g、5180RPM、110RPM Diff.(用64mil间隔器(mil意为1/1000英寸))以及25-30L/h的流量分离。然后将BLG晶相与精加工水以1:1混合，然后使用相同的设置在沉降式离心机上再次分离。然后将BLG晶相与精加工水混合，以使其成为含有约25％干物质且具有约80的BLG结晶度的浆料，随后在中试装置喷雾干燥器上以180℃的入口温度和85℃的出口温度干燥，无需任何预热。直到喷雾干燥时，液体流的温度为10℃-12℃。在出口取样的所得粉末的含水量为4.37％(w/w)。

浆料中的BLG结晶度为约90％。

诸位发明人还在沉降式离心机上以350g、2750RPM、150RPM Diff.(用64mil间隔器)和75L/h的流速成功地分离了BLG晶体和母液的浆料。随后将BLG晶相与精加工水以1:2混合。然后将BLG晶相与精加工水混合以使其成为更薄的浆料，随后使用与上述相同的参数在中试装置喷雾干燥器上干燥。

然后根据实例9.3测量经喷雾干燥的粉末的堆积密度，并与在相同设备上干燥的标准WPI的堆积密度进行比较。发现标准WPI具有0.39g/mL的堆积密度(基于625个冲压)，此堆积密度处于WPI粉末的正常范围的高端。然而，经喷雾干燥的BLG晶体制剂的堆积密度为0.68g/mL，比标准WPI的堆积密度高出大于75％(参见例如图23)。这确实出人意料，并提供了许多与物流和应用相关的优势。

表12实例7的经喷雾干燥的BLG晶体制剂的所选组分的浓度。BDL＝低于检测限

随后将经喷雾干燥的BLG晶体制剂的样品重悬浮在冷的脱矿物质水中，并且通过显微镜仍可清楚地看到BLG晶体。添加柠檬酸或NaCl使BLG晶体溶解并将不透明的晶体悬浮液转变成透明液体。

诸位发明人已经看到在干燥步骤期间延长的加热减少了晶体形式的BLG的量的迹象。因此，优选的是，BLG晶体制剂的热暴露尽可能低。

结论：

此实例证实，可以对包含BLG晶体的浆料进行喷雾干燥，并且如果控制在干燥步骤期间的加热，BLG晶体仍然存在于重悬浮的喷雾干燥粉末中。

诸位发明人还发现含有BLG晶体的乳清蛋白粉末的堆积密度远高于通过溶解的蛋白质流的正常喷雾干燥获得的堆积密度。高密度粉末允许粉末的更具成本效益的包装和物流，因为每kg粉末需要更少的包装材料，并且更多的粉末(质量)可以通过给定的容器或卡车运输。

在制造和使用过程中，高密度粉末还显现更易于处理并且蓬松度和灰尘均较少。

实例8：低磷蛋白质饮料

使用来自实例3的纯化BLG产物(从进料3获得的晶体制剂)制备六种低磷饮料样品。将所有干燥成分与脱矿物质水混合，以获得10kg各样品，并在10℃下水合1小时。

表13六种饮料样品的组成。

取得六种样品的子样品以在

3000 IR浊度计上测量浊度，并在Gilson的vicoman上测量粘度。结果示于下表中。

表14测量的六种饮料样品的粘度和浊度。

样品	粘度(Cp)	NTU
			A	1.42	36.2
B	2.37	46.3
			C	2.69	4.9
D	2.70	5.0
			E	1.45	63.1
F	2.25	82.1

包含六种低磷饮料样品的子样品的试管照片示出在图25中。从左到右，子样品为样品A、B、C、D、E和F。试管的视觉检查验证了浊度测量，并记录到所有饮料样品都是透明的并且特别是样品C和D(pH 3.0)非常清澈。低粘度证实饮料样品易于饮用。

用于制备饮料的所有成分都是低磷并且不含有不必要的矿物质。因此，所得饮料的磷含量为约45mg P/100g蛋白质，通常具有非常低的矿物质含量。因此，这六种饮料适合用作肾病患者的蛋白质饮料。

实例9-分析方法

实例9.1乳糖基化BLG与非乳糖基化BLG的测定：

使用LC-MS定量乳糖基化BLG和天然BLG的量。

分析是在与来自Agilent Technologies的HP1200系列HPLC偶联的也来自AgilentTechnologies的6410 Triple Quad MS上进行。对于离子化之前的分离，应用Symmetry300^TMC18柱(WAT106172：5μm固相颗粒，柱大小2.1x150mm)，并在214nm处检测蛋白质。在分析样品之前，将它们通过0.22微米过滤器过滤。所有样品均以重复形式运行。

使用以下条件进行分析：

HPLC

缓冲液A：具有0.1％TFA的99.9％MilliQ-vand

缓冲液B：9.9％MilliQ-vand，90％乙腈，0.1％TFA

流量：0.3mL/min

梯度：

0-20min：85％-60％A和15％-40％B

20-45min：60％-50％A和40％-50％B

45-55min：0％A和100％B

55-70min 85％A和15％B

上样：40μL

柱温度设定为60℃。

质谱：

检测到m/z为100-2000的离子，并在MassHunter Workstation软件(版本B.04.00)中评价得到的数据。使用去卷积将所有形式的相同种类(质量)分组。进一步查询18kDa与20kDa之间的质量。BLG-A的完整质量为18.361kDa，并且BLG-B为18.276kDa，乳糖基化为蛋白质质量增加324Da，通过检查此质量区域，可以检测到高达5个乳糖基化的蛋白质。通过比较每个质量的信号强度，忽略不同种类的电离区别来进行相对定量。

实例9.2：总蛋白质的测定

通过以下方式测定样品的总蛋白质含量(真蛋白质)：

1)根据ISO 8968-1/2|IDF 020-1/2-乳-测定氮含量-第1/2部分：用凯氏定氮法测定氮含量，来测定样品的总氮。

2)根据ISO 8968-4|IDF 020-4-乳-测定氮含量-第4部分：非蛋白质氮含量的测定，来测定样品的非蛋白质氮。

3)将蛋白质总量计算为(m_总氮–m_非蛋白氮)*6.38。

实例9.3：疏松密度和堆积密度的测定

干燥粉末的密度定义为粉末的重量与体积之间的关系，其在特定条件下使用特殊的Stampf体积计(即量筒)进行分析。密度典型地以g/ml或kg/L表示。

在此方法中，将干燥粉末的样品在量筒中振实。在指定数量的振实之后，读取产品的体积并计算密度。

此方法可以定义三种类型的密度：

■浇注密度，即质量除以转移到指定量筒后的粉末体积。

■疏松密度，即根据此标准规定的条件，质量除以100次振实后的粉末体积。

■堆积密度，即根据此标准规定的条件，质量除以625次振实后的粉末体积。

所述方法使用250ml、0-250ml刻度、190±15g重量的特殊量筒(J.EngelsmannA.G.67059路德维希港(Ludwigshafen)/Rh)和例如J.Engelsmann A.G.的Stampf体积计。

干燥产品的疏松密度和堆积密度通过以下程序来确定。

预处理：

将待测量的样品储存在室温下。

然后通过反复旋转和转动容器(避免破碎颗粒)彻底混合样品。容器的填充量不超过2/3。

程序：

称取100.0±0.1克粉末并将其转移到量筒中。体积V₀以ml读取。

如果100g粉末不能都放入量筒，则应减少至50或25克。

将量筒固定到Stampf体积计上，然后振实100次。用抹刀调平表面，读取体积V₁₀₀(ml)。

将振实次数改变为625(包括100次振实)。振实表面后，读取体积V₆₂₅(ml)。

密度计算：

根据以下公式计算以g/ml表示的疏松密度和堆积密度：

堆积密度＝M/V

其中M表示以克为单位的称重样品，而V表示以ml计的在625次振实后的体积。

实例9.4：粉末的含水量的测定

根据ISO 5537：2004(奶粉-含湿量的测定(参考方法))测定食品产品的含水量。NMKL是“北欧食品分析委员会(Nordisk Metodikkomité for

)”的缩写。

实例9.5：钙、镁、钠、钾、磷总量的测定

使用以下程序测定钙、镁、钠、钾和磷的总量：首先使用微波消解分解样品，然后使用ICP设备测定一种或多种矿物质的总量。

设备：

微波炉来自安东帕(Anton Paar)，并且ICP是来自珀金埃尔默公司(PerkinElmerInc.)的Optima 2000DV。

材料：

1M HNO₃

钇于2％HNO₃中

针对在5％HNO₃中钙、镁、钠、钾和磷的适当标准品

预处理：

称出一定量的粉末，并将粉末转移到微波消解管中。添加5mL 1M HNO₃。根据微波说明消解微波炉中的样品。将消解的管放入通风橱中，取出盖并让挥发性烟气蒸发。

测量程序：

使用已知量的Milli-Q水将预处理的样品转移至消解管。将钇于2％HNO₃中的溶液添加至消解管中(每50mL稀释的样品添加约0.25mL)，并使用Milli-Q水稀释至已知体积。使用制造商描述的程序在ICP上分析样品。

通过使用Milli-Q水稀释10mL 1M HNO₃和0.5mL钇于2％HNO₃中的溶液的混合物至终体积100mL来制备盲样。

制备至少3个标准样品，其浓度包括预期的样品浓度。

实例9.6：糠氨酸值的测定：

如在“Maillard Reaction Evaluation by Furosine Determination DuringInfant Cereal Processing[在婴儿谷物加工过程中通过糠氨酸测定进行美拉德反应评价]”,Guerra-Hernandez等人,Journal of Cereal Science[谷物科学杂志]29(1999)171–176中所述测定糠氨酸值，并且根据实例9.2测定蛋白质总量。报道了每100g蛋白质的单元mg糠氨酸中的糠氨酸值。

实例9.7：液体中的BLG结晶度的测定

以下方法用于测定在pH在5-6范围内的液体中的BLG结晶度。

a)将10mL所讨论液体的样品转移至具有0.45微米孔径CA膜的Maxi-旋转过滤器。

b)立即以1500g旋转过滤器5min。将离心机保持在2℃

c)向旋转过滤器的渗余物侧添加2mL冷的milliQ水(2℃)，并且立即将过滤器以1500g旋转5min，同时保持在2℃离心冷却，收集渗透物(渗透物A)，测量体积，并使用实例9.9中概述的方法通过HPLC确定BLG浓度。

d)将4mL 2M NaCl添加至过滤器的渗余物侧，快速搅拌并使混合物在25℃下静置15分钟。

e)立即将过滤器以1500g旋转5min并收集渗透物(渗透物B)

f)使用实例9.9中概述的方法测定渗透物A和渗透物B中BLG的总重量，并将结果转变为BLG的总重量而不是重量百分比。渗透物A中BLG的重量称为m_渗透物A，渗透物B中BLG的重量称为m_渗透物B。

g)液体关于BLG的结晶度确定为：

结晶度＝m_渗透物B/(m_渗透物A+m_渗透物B)*100％

实例9.8：干燥粉末中的BLG结晶度的测定

此方法用于测定干燥粉末中的BLG结晶度。

a)将5.0克粉末样品与20.0克冷的milliQ水(2℃)混合，并在2℃下静置5分钟。

b)将所讨论液体的样品转移至具有0.45微米CA膜的Maxi-旋转过滤器。

c)立即以1500g旋转过滤器5min。将离心机保持在2℃

d)向旋转过滤器的渗余物侧添加2mL冷的milli-Q水(2℃)，并且立即将过滤器以1500g旋转5min，收集渗透物(渗透物A)，测量体积，并使用实例9.9中概述的方法通过HPLC测定BLG浓度。并将结果转变为BLG的总重量而不是重量百分比。渗透物A中BLG的重量称为m_渗透物A

f)然后使用以下公式计算粉末中的BLG结晶度：

其中m_总BLG是步骤a)的粉末样品中的BLG总量。

如果粉末样品的BLG总量未知，这可以通过将另外5g粉末样品(来自相同粉末来源)悬浮在20.0克milliQ水中、通过添加水性NaOH将pH调节至7.0、将混合物在25℃下在搅拌下放置1小时、以及最后使用实例9.9测定粉末样品的BLG总量来确定。

实例9.9：水性液体中BLG、ALA和CMP的总量的测定

通过HPLC分析以0.4mL/min分析α-乳白蛋白，β-乳球蛋白和CMP的含量。将25微升过滤的样品注射到2个TSKgel3000PWxl(7.8mm 30cm，Tosohass，日本)柱上，这些柱与在洗脱剂(由465g MilliQ水、417,3g乙腈和1mL三氟乙酸组成)中平衡的附接前置柱PWxl(6mm×4cm，东曹株式会社(Tosohass)，日本)串联连接，并使用210nm的UV检测器。

通过将针对相应标准蛋白质获得的峰面积与样品的那些峰面积相比，进行天然α-乳白蛋白(C_α)、β-乳球蛋白(C_β)和酪蛋白巨肽(C_CMP)的含量的定量测定。

通过从蛋白质总量(根据实例9.2测定)中减去BLG的量来确定另外的蛋白质(非BLG蛋白质)的总量

实例9.10：UF渗透物电导率的测定

将15mL样品转移至具有3kDa截止量(3000NMWL)的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，并以4000g离心20-30分钟，或直至用于测量电导率的足够体积的UF渗透物积累在过滤器单元的底部中。离心后立即测量电导率。样品处理和离心在样品来源的温度下进行。

实例9.11：乳清蛋白组合物的蛋白质变性程度的测定

已知变性的乳清蛋白在pH 4.6下比在pH 7.0时具有更低的溶解度，并且乳清蛋白组合物的变性程度是通过测量相对于pH 7.0时的蛋白质总量而言在pH 4.6时可溶性蛋白质的量来确定。

更具体地，待分析的乳清蛋白组合物(例如粉末或水溶液)转变为：

-含有5.0％(w/w)总蛋白质且pH为7.0的第一水溶液，和

-含有5.0％(w/w)总蛋白质且pH为4.6的第二水溶液。

使用3％(w/w)NaOH(aq)或5％(w/w)HCl(aq)进行pH调节。

根据实例9.2测定第一水溶液的总蛋白质含量(P_{pH 7.0})。

将第二水溶液在室温下储存2h，随后以3000g离心5分钟。回收上清液的样品并根据实例9.2进行分析以确定总蛋白质(S_{pH 4.6})。

乳清蛋白组合物的蛋白质变性程度D计算如下：

D＝((P_{pH 7.0}-S_{pH 4.6})/P_{pH 7.0})*100％

实例9.12：检测粉末中干燥的BLG晶体

粉末中干燥的BLG晶体的存在可以通过以下方式鉴定：

将待分析的粉末样品重悬浮，并在温度为4℃的脱矿物质水中以2份水对1份粉末的重量比率轻轻混合，并使其在4℃下再水合1小时。

通过显微镜检查再水合的样品以鉴定晶体的存在，优选使用平面偏振光来检测双折射。

将晶体状物质分离并进行X射线晶体学研究以验证晶体结构的存在，并且优选地还验证晶格(空间群和晶胞大小)对应于BLG晶体的晶格。

分析分离的晶体状物质的化学组成以验证其固体主要由BLG组成。

实例10：通过基于UF的动态错流过滤进行结晶

如实例1中所述制备结晶槽的进料，不同之处在于渗滤是在pH 5.92下进行并且最终TS为20％。

在进料被调节后(进料组成可以在表15中看到)，将其转移到300L结晶槽中，并且最初将pH调节至pH 5.80并将温度保持在10℃-12℃。调节pH后，添加接种材料，所述接种材料以与实例1中所述相同的方式生产，但是源自非自发的结晶生产。用接种材料对进料接种至每升进料0.5g接种材料的浓度。接种后，将冷却罩上的温度设定为5℃，将pH缓慢调节至5.50，并使混合物结晶约一小时，之后将DCF(动态错流过滤)单元连接至结晶槽，如图26所示。DCF单元配有孔径为500nm的Kerafol陶瓷膜，将TMP(跨膜压力)设定为0.4巴，且膜的旋转速度为32Hz。

来自DCF的渗余物返回到结晶槽，而渗透物在配备具有46mil间隔器的科氏公司(Koch)HFK-328型膜的UF(超滤)单元中用作进料。在UF单元中，使温度升高至但不高于12℃。调节添加的渗滤水的量，使得在从母液(ML)中除去矿物质时从UF出来的返回到结晶槽的渗余物为约21％TS。

ML上的渗滤持续，直到渗透物与渗滤水之间的电导率差异低于50μS/cm。此时，调节渗滤水的量使得渗余物为约30％TS。当BLG作为晶体被去除时，ML中TS的量减少；这种连续去除多余的水和矿物质使得有可能提高总产量，因为显现在BLG结晶期间其他蛋白质的浓度对在已探索的范围内的BLG溶解度具有有限的影响(如果有的话)。

来自DCF的ML渗透物的组成可以在表16中看到。进料的最初300L已减少到大约100L的ML。基于质量守恒，BLG的相对产率计算为92％。

表15实例10中使用的进料的所选组分。

表16实例10中获得的最终母液的蛋白质组成。

结论：

通过从发生BLG结晶的基质中连续除去过量的矿物质和水，可以显著提高BLG产率，并且所述工艺可以在低温下进行。

实例11：不同乳清蛋白产品的蛋白质变性程度

比较了商业产品和本发明的四种可食用BLG组合物的蛋白质变性程度。样品如下所述。

样品
	A：BiPro(可商购的WPI；戴维斯柯公司(Davisco)，美国)
B：BLG晶体浆料原样-无干燥(本发明)
	C：经冷冻干燥的BLG晶体浆料(本发明)
D：将BLG晶体重溶解(pH 7)并冷冻干燥
	E：经喷雾干燥的BLG晶体浆料(本发明)

样品B-E按以下方式制备：

如实例12中所述制备晶体浆料，并如实例7中所述进行分离。取出一些分离的BLG浆料并分成四部分。

样品B：通过使用3％NaOH将BLG晶体浆料的pH调节至7.01，来将分离的BLG晶体浆料的第一部分在没有任何干燥的情况下重溶解；然后将样品稀释至Bx 6，以制成约5％的蛋白质溶液。

样品C：将分离的BLG晶体浆料的第二部分冷冻干燥。然后将粉末重悬浮在精加工水中，使用3％NaOH将pH调节至7.09，并且然后将样品稀释至白利糖度6以制备约5％的蛋白质溶液。

样品D：通过使用3％NaOH将pH调节至7.0来将分离的BLG晶体浆料的第三部分重溶解，然后冷冻干燥。然后将经冷冻干燥的粉末重悬浮在精加工水中，并且测得pH为7.07。然后将样品稀释至白利糖度6，以制成约5％的蛋白质溶液。

样品E：处理分离的BLG晶体浆料的第四部分，并喷雾干燥，如实例7中所述。然后将粉末重悬浮在精加工水中，并使用3％NaOH将pH调节至7.04。然后将样品稀释至白利糖度6，以制成约5％的蛋白质溶液。

根据实例9.11测定每种样品的蛋白质变性程度，结果呈现于表17中。

表17比较可商购的WPI产品(Bipro)与本发明的4种BLG产品的蛋白质变性程度。

结论：

无论干燥方法如何，本发明的可食用BLG组合物具有出人意料的低变性蛋白质程度；在用于比较的可商购WPI中可以发现仅为上述程度的十分之一。特别出人意料的是，经喷雾干燥的BLG晶体浆料产品仍然具有所有产品中的最低变性程度。

实例12：通过动态错流过滤分离晶体

使用从标准奶酪生产过程中的甜乳清衍生的且通过1.2微米过滤器过滤的乳糖耗尽的UF渗余物作为结晶过程的进料。在使用具有进料压力为1.5-3.0巴的46mil间隔器的科氏公司(Koch)HFK-328型膜的超滤设置上，使用10％TS(总固体)±5的进料浓度和精加工水(通过反渗透过滤的水以获得至多0.05mS/cm的电导率)作为渗滤介质来调节甜乳清进料。超滤期间进料和渗余物的温度为约12℃。然后通过添加HCl调节pH以获得约5.60的pH。渗滤持续进行直到渗余物的电导率低于1.30mS/cm。然后将进料加热至25℃，之后将渗余物浓缩至约27％TS(相对于浓缩渗余物的总重量而言总蛋白质为约21％)。在浓缩结束时，渗透物电导率为0.33mS/cm。将浓缩的渗余物的样品以3000g离心5分钟，但没有形成可见的沉淀物。

将浓缩的渗余物转移到300L结晶槽中，在该结晶槽中其被冷却至约6℃并在此温度下伴随温和搅拌下保持过夜。第二天早上，渗余物已结晶。通过3000g离心5分钟分离母液和晶体，并取出上清液和沉淀的样品用于HPLC分析。此过程的BLG产率计算为67％。

来自300L罐的晶体浆料用于进料和安德里兹公司(Andritz)DCF 152S系统，所述系统使用一个具有500nm孔径的盘膜。过滤在8℃下运行，旋转速度为32Hz，并且跨膜压力为0.4巴。系统作为死端过滤运行，其中渗余物在过滤室中积聚，不像在更大的单元中渗余物会被连续移除。过滤以稳定的方式运行刚好超过40分钟，此时在过滤室中积聚的固体开始影响过滤。

在DFC操作期间，晶体质量的量显著增加。

结论.

DCF为将晶体与ML分离提供了稳定而有效的手段。如果需要，可以将洗涤液添加到DCF中。

实例13：使用过滤式离心机进行晶体分离

使用与实例12中相同的进料和相同的结晶工艺，在装有孔径为约20微米的过滤布的过滤式离心机HZ 25/0.1上测试分离。

测试1：将4L进料供给到以60g运行的过滤式离心机中。在添加所有进料后，将离心机加速至250g以用于干燥滤饼。滤饼含有47.6％的TS；滤饼的组成示于表18中。

清洁后，向离心机(60g)中供给7L与上述相同的进料。然后将离心机加速至250g以脱水约5分钟，之后再次减速至60g，并添加0.25L精加工水进行洗涤。添加洗涤水后，再次将离心机加速至250g进行脱水。滤饼的TS测量为47％。滤饼示于图27.A中。滤饼、ML级分和洗涤后的洗涤液的组成示于表18中。在滤饼脱水后，试图将其从离心机的侧面剥离；如图27.C所示，顶层确实累积并通过预定的管掉落，但是下层太潮湿且粘稠以至于不能适当剥离，如图27.B所示。

表18实例13中提供的组合物的所选组分的浓度。

¹⁾相对于溶液的重量而言的蛋白质组成％(w/w)

²⁾其他所选组分的浓度(相对于组合物的总重量而言标准化至95％总固体的％w/w)

结论：

过滤式离心机为获得BLG滤饼提供了一个有趣的选择，所述BLG滤饼非常纯以使得即使未洗涤，ALA和CMP也低于定量所需的水平。通过将甚至少量洗涤介质施加到滤饼上，滤饼中的矿物质含量可以进一步降低，如表18中洗涤水的蛋白质组成所示。如从使用的洗涤水中所示，通过洗涤也降低了滤饼的非BLG蛋白质的含量。使用的洗涤水含有的ALA:BLG之间的比率大于在滤饼中的比率。这表明与BLG相比，洗涤步骤具有更大的去除ALA(和可能的其他非BLG蛋白)的趋势。

这样生产的滤饼不可剥离，但仍具有渗透性。这使得能够选择在给定温度下添加干燥气体以将滤饼的水分含量降低到像顶层那样可剥离的程度。可替代地，通过在虹吸离心机型设置中在水溶液中添加适量的酸、碱或盐，可以将滤饼重溶解在离心机内。

实例14：乳清蛋白溶液的矿物质组成的影响

在此实例中研究了一价与二价金属阳离子之间的摩尔比率对BLG产率的影响。

两个样品进行了比较：

样品A：具有超重的Na⁺(来源：Na₂SO₄)

样品B：具有超重的Ca²⁺(来源：CaSO₄)

用2.5％硫酸调节与实例1中所用的相同类型的原料。将样品的pH调节至约pH5.4；表20中报告了精确的pH。每个样品的原始体积为250mL。将两个样品在另一个24L容器中针对大约24L冷的精加工水透析。对于所有透析过程，使用透析管OrDial D-Clean MWCO3500(项目号63034405)。在透析过程中连续搅拌容器，并且透析在4℃的冷却器中进行。第一次透析过夜进行。

为了在第一次透析后除去过量的离子，将透析袋转移到含有2L盐溶液的容器中。浓度如下：

样品A：Na₂SO₄(硫酸钠)0.059M，

样品B：CaSO₄(硫酸钙)0.059M。

第一次盐透析过夜进行。第一次盐透析后的电导率、pH和白利糖度记录在表20中。将盐溶液改为新鲜盐溶液，并历经周末继续进行透析。

在第二次盐透析后，将管转移到装有大约24L冷的精加工水的24L容器中并透析过夜以除去过量离子，之后结晶。

在最后一次透析步骤后，蛋白质浓度略低于优选的浓度。因此，使用10kDa截留膜和以75mL/h运行的蠕动泵将样品在Pellicon XL UF实验室设置上浓缩。样品的矿物质含量与原料一起示于表19中。

然后用0.5g/L前述接种材料接种样品，并在4℃下结晶过夜。然后第二天，在所有样品中都可以看到晶体沉淀。通过将每个样品以3000g离心5分钟来制备每个样品的HPLC样品，然后分析上清液的样品。结果示于表21中。

表19实例14的原料以及样品A和B中的所选矿物质组分的浓度。

¹⁾所述变化与原料中给定组分的浓度有关

表20样品A和B制备过程中各阶段的pH、电导率和白利糖度。

表21一价与二价阳离子之间的比率不同的样品中BLG的浓度。

结论：

表21记录了如果避免一价与二价阳离子之间的高摩尔比率，则在母液中留下较少残余量的BLG(并且获得分离的BLG晶体的较高产率)。可以控制一价与二价阳离子之间的摩尔比率，并且实际上可以控制Na+K与Ca+Mg，以提高本发明的方法的BLG产率。

Claims (10)

1.一种制备包含处于结晶形式的β-乳球蛋白(BLG)的可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含BLG和至少一种另外的乳清蛋白的乳清蛋白溶液，所述乳清蛋白溶液：

-关于BLG过饱和，并且具有在5-6范围内的pH，

b)在所述过饱和的乳清蛋白溶液中以盐溶模式使BLG结晶，以及

c)任选地，将BLG晶体与剩余的乳清蛋白溶液分离。

2.一种生产经喷雾干燥的包含BLG的可食用粉末组合物的方法，所述组合物包含干燥的BLG晶体，所述方法包括以下步骤：

-提供液体含BLG组合物，所述液体含BLG组合物包含BLG晶体且优选具有至少20％BLG结晶度，所述液体含BLG组合物优选包含至少10％w/w的总固体，以及优选包含至少5％w/w的BLG，以及

-将所述液体含BLG组合物雾化到操作喷雾干燥器的干燥室中，以将包含BLG晶体的所述液体含BLG组合物转变成粉末。

3.一种可食用BLG组合物，包含：

-相对于所述可食用BLG组合物的总固体而言至少50％w/w的蛋白质总量，更优选相对于所述可食用BLG组合物的总固体而言至少75％w/w的蛋白质总量，以及甚至更优选相对于所述可食用BLG组合物的总固体而言至少90％w/w的蛋白质总量，并且

其中所述可食用BLG组合物的BLG具有至少20％w/w、更优选至少40％w/w，以及最优选至少60％w/w的结晶度。

4.一种可食用BLG组合物，包含：

-至多6％w/w的水，

-相对于总固体而言至少80％w/w的总蛋白质、最优选相对于总固体而言至少90％w/w的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少95％w/w的BLG、最优选相对于总蛋白质而言至少97％w/w的BLG，并且

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末，并且优选是经喷雾干燥的粉末，并且

-具有至少0.45g/mL、以及优选至少0.50g/mL的堆积密度。

5.一种可食用BLG组合物，包含：

-至多6％w/w的水，

-相对于总固体而言至少80％w/w的总蛋白质、最优选相对于总固体而言至少90％w/w的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少95％w/w的BLG、最优选相对于总蛋白质而言至少97％w/w的BLG，并且

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末，并且优选是经喷雾干燥的粉末，

-具有至多2％、以及优选至多1.0％的蛋白质变性程度。

6.一种可食用BLG组合物，包含：

-至多6％w/w的水，

-相对于总固体而言至少80％w/w的总蛋白质、最优选相对于总固体而言至少90％w/w的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少95％w/w的BLG、最优选相对于总蛋白质而言至少97％w/w的BLG，

-至多80mg磷/100g蛋白质，最优选至多50mg磷/100g蛋白质，并且

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末，并且优选是经喷雾干燥的粉末。

7.一种可食用BLG组合物，包含：

-至多6％w/w的水，

-相对于总固体而言至少80％w/w的总蛋白质、最优选相对于总固体而言至少90％w/w的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少95％w/w的BLG、最优选相对于总蛋白质而言至少97％w/w的BLG，并且

所述可食用BLG组合物：

-是干燥粉末，并且优选是经喷雾干燥的粉末，

-在30℃60天后具有至多80mg/100g蛋白质的糠氨酸值、并且最优选在30℃60天后具有至多40mg/100g蛋白质的糠氨酸值。

8.一种可食用BLG组合物，包含：

-至多6％w/w的水，

-相对于总固体而言至少80％w/w的总蛋白质、最优选相对于总固体而言至少90％w/w的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少95％w/w的BLG、最优选相对于总蛋白质而言至少97％w/w的BLG，并且

所述可食用BLG组合物是干燥粉末，并且优选是经喷雾干燥的粉末，并且

其中所述可食用BLG组合物的BLG具有至多1、以及甚至更优选至多0.4的乳糖基化程度。

9.一种可食用BLG组合物，包含：

-至多6％w/w的水，

-相对于总固体而言至少80％w/w的总蛋白质、最优选相对于总固体而言至少90％w/w的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少95％w/w的BLG、最优选相对于总蛋白质而言至少97％w/w的BLG，并且

所述可食用BLG组合物具有至多2％、并且优选至多1.0％的蛋白质变性程度。

10.一种可食用BLG组合物，包含：

-至多6％w/w的水，

-相对于总固体而言至少80％w/w的总蛋白质、最优选相对于总固体而言至少90％w/w的总蛋白质，

-相对于总蛋白质而言至少95％w/w的BLG、最优选相对于总蛋白质而言至少97％w/w的BLG，

-至多80mg磷/100g蛋白质，最优选至多50mg磷/100g蛋白质。

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