JPH1033192A - フマル酸の製造法 - Google Patents
フマル酸の製造法Info
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- JPH1033192A JPH1033192A JP8194962A JP19496296A JPH1033192A JP H1033192 A JPH1033192 A JP H1033192A JP 8194962 A JP8194962 A JP 8194962A JP 19496296 A JP19496296 A JP 19496296A JP H1033192 A JPH1033192 A JP H1033192A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵素法によりマレイン酸からフマル酸を製造
するにあたり、工業的に利用できる程度に該酵素活性を
向上させる。 【解決手段】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
生物を１０〜１０００ｍＭの濃度でアスパラギン酸を添
加した培地で培養して得られる菌体を用いてマレイン酸
からフマル酸を製造する。
するにあたり、工業的に利用できる程度に該酵素活性を
向上させる。 【解決手段】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
生物を１０〜１０００ｍＭの濃度でアスパラギン酸を添
加した培地で培養して得られる菌体を用いてマレイン酸
からフマル酸を製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フマル酸の製造法に関
する。更に詳しくは、マレイン酸から異性化によるフマ
ル酸の製造法に関する。フマル酸は、医薬、食品、工業
原料として、広く利用されている。フマル酸からは、酵
素法等により例えば食品、医薬、工業原料として有用な
Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リンゴ酸、Ｌ−アラニンが製
造される。
する。更に詳しくは、マレイン酸から異性化によるフマ
ル酸の製造法に関する。フマル酸は、医薬、食品、工業
原料として、広く利用されている。フマル酸からは、酵
素法等により例えば食品、医薬、工業原料として有用な
Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リンゴ酸、Ｌ−アラニンが製
造される。
【０００２】
【従来の技術】マレイン酸の異性化によるフマル酸の製
造法としては、主に化学的方法が提案されている（米国
特許第２，８１６，９２３号、２，９５５，１３６号、
３，３３２，９９２号）が、反応平衡によりフマル酸へ
の変換率が制約を受けること、反応条件が高温反応であ
るが由にマレイン酸あるいはフマル酸劣化が起こり、副
生成物を生成し、収量が低くなるなどの問題点を有して
いる。
造法としては、主に化学的方法が提案されている（米国
特許第２，８１６，９２３号、２，９５５，１３６号、
３，３３２，９９２号）が、反応平衡によりフマル酸へ
の変換率が制約を受けること、反応条件が高温反応であ
るが由にマレイン酸あるいはフマル酸劣化が起こり、副
生成物を生成し、収量が低くなるなどの問題点を有して
いる。
【０００３】一方、酵素法では、マレイン酸イソメラー
ゼがマレイン酸を異性化してフマル酸を生成すること
が、知られている（Ｋ．Ｏｔｓｕｋａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５，（９），ｐ７２６（１９６
１））が、酵素学的性質について検討しているに過ぎ
ず、産業上の応用の観点からの検討はほとんどなされて
いない。
ゼがマレイン酸を異性化してフマル酸を生成すること
が、知られている（Ｋ．Ｏｔｓｕｋａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５，（９），ｐ７２６（１９６
１））が、酵素学的性質について検討しているに過ぎ
ず、産業上の応用の観点からの検討はほとんどなされて
いない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、工業
的に利用できる、高活性なマレイン酸イソメラーゼの存
在下、マレイン酸を異性化してフマル酸を製造する方法
を提供するものである。
的に利用できる、高活性なマレイン酸イソメラーゼの存
在下、マレイン酸を異性化してフマル酸を製造する方法
を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、酵素法に
より、効率よくフマル酸を製造する方法を確立すべく、
鋭意検討を行った結果、マレイン酸イソメラーゼ活性を
有する微生物を１０〜１０００ｍＭの濃度でＬ−アスパ
ラギン酸を添加した培地で培養して得られる菌体を用い
てマレイン酸からフマル酸を生成させることにより高効
率にフマル酸を製造可能なことを見いだし、本発明を完
成した。以下、本発明を詳細に説明する。
より、効率よくフマル酸を製造する方法を確立すべく、
鋭意検討を行った結果、マレイン酸イソメラーゼ活性を
有する微生物を１０〜１０００ｍＭの濃度でＬ−アスパ
ラギン酸を添加した培地で培養して得られる菌体を用い
てマレイン酸からフマル酸を生成させることにより高効
率にフマル酸を製造可能なことを見いだし、本発明を完
成した。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明に用いられるマレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する微生物としては、通常、アルカ
リゲネス属、シュードモナス属、キサントモナス属、バ
チルス属、セラチア属、アースロバクター属、エンテロ
バクター属、シトロバクター属に属する微生物等が用い
られる。具体的には、アルカリゲネス フェカリス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ１２
６６９，同ＩＦＯ １３１１１， 同ＩＡＭ １４７
３，アルカリゲネス ユウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ），シュウドモナス フル
オレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｌｅ
ｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ ２３７２８， キサントモナス
マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｒｕ
ｔｏｐｈｉｌｉａ）ＡＴＣＣ １３２７０、バチルス
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＭＩ−１０１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４８０１）、バチルス ブレビス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＭＩ−１０３（ＦＥＲＭ Ｐ−
１４８０３）、アースロバクター グロビホルミス（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｉ
ＡＭ１２１０２、アースロバクター パセンス（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ１２３４
３、アースロバクター ウレアファシエンス（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）ＩＡＭ１
２１４０等が好適に用いられる。さらに、工業的には、
上記微生物由来の遺伝子をコリネ型細菌等に組換えによ
り導入した遺伝子改変微生物を用いた方が好ましい。
ソメラーゼ活性を有する微生物としては、通常、アルカ
リゲネス属、シュードモナス属、キサントモナス属、バ
チルス属、セラチア属、アースロバクター属、エンテロ
バクター属、シトロバクター属に属する微生物等が用い
られる。具体的には、アルカリゲネス フェカリス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ１２
６６９，同ＩＦＯ １３１１１， 同ＩＡＭ １４７
３，アルカリゲネス ユウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ），シュウドモナス フル
オレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｌｅ
ｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ ２３７２８， キサントモナス
マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｒｕ
ｔｏｐｈｉｌｉａ）ＡＴＣＣ １３２７０、バチルス
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＭＩ−１０１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４８０１）、バチルス ブレビス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＭＩ−１０３（ＦＥＲＭ Ｐ−
１４８０３）、アースロバクター グロビホルミス（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｉ
ＡＭ１２１０２、アースロバクター パセンス（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ１２３４
３、アースロバクター ウレアファシエンス（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）ＩＡＭ１
２１４０等が好適に用いられる。さらに、工業的には、
上記微生物由来の遺伝子をコリネ型細菌等に組換えによ
り導入した遺伝子改変微生物を用いた方が好ましい。
【０００７】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物の培養には、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天
然栄養源を添加した用いた一般的な培地を用いる事がで
きる。該培地には、必要に応じ、窒素源として、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝
酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニアや、無機物とし
ては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガ
ン、亜鉛、銅等を添加して培養することもできる。
物の培養には、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天
然栄養源を添加した用いた一般的な培地を用いる事がで
きる。該培地には、必要に応じ、窒素源として、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝
酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニアや、無機物とし
ては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガ
ン、亜鉛、銅等を添加して培養することもできる。
【０００８】マレイン酸イソメラーゼ活性を高めるため
には、培地中にマレイン酸、またはマロン酸を添加する
ことが望ましい。マレイン酸、マロン酸の添加濃度は１
０〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭである。
培養は、通常、ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜９で、２
０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、５〜１
２０時間行う。
には、培地中にマレイン酸、またはマロン酸を添加する
ことが望ましい。マレイン酸、マロン酸の添加濃度は１
０〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭである。
培養は、通常、ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜９で、２
０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、５〜１
２０時間行う。
【０００９】本発明は、培地中に１０〜１０００ｍＭの
Ｌ−アスパラギン酸を存在させて、マレイン酸イソメラ
ーゼ活性含有菌体を培養することに特徴を有する。培地
中のＬ−アスパラギン酸の存在量は、好ましくは、２０
〜２００ｍＭ、さらに好ましくは３０〜１００ｍＭであ
る。Ｌ−アスパラギン酸は、フリーの酸のまま添加して
アンモニア、苛性ソーダ等でｐＨを上記範囲に調整して
も良いし、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−アスパ
ラギン酸カリウム等のＬ−アスパラギン酸塩を用いても
良い。また、ＤＬ−アスパラギン酸をＬ−アスパラギン
酸が所定量存在するように添加することもできる。
Ｌ−アスパラギン酸を存在させて、マレイン酸イソメラ
ーゼ活性含有菌体を培養することに特徴を有する。培地
中のＬ−アスパラギン酸の存在量は、好ましくは、２０
〜２００ｍＭ、さらに好ましくは３０〜１００ｍＭであ
る。Ｌ−アスパラギン酸は、フリーの酸のまま添加して
アンモニア、苛性ソーダ等でｐＨを上記範囲に調整して
も良いし、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−アスパ
ラギン酸カリウム等のＬ−アスパラギン酸塩を用いても
良い。また、ＤＬ−アスパラギン酸をＬ−アスパラギン
酸が所定量存在するように添加することもできる。
【００１０】培養した各菌体を用いてマレイン酸からフ
マル酸を生成させるに際しては、菌体をそのまま使用す
ることができるし、必要により、該菌体を超音波破砕等
で処理をした菌体破砕物や該破砕物を遠心分離した無細
胞抽出液、該無細胞抽出液を硫安分画法、イオン交換カ
ラム、ゲルろ過カラム等で精製した部分精製酵素、また
は該菌体や菌体破砕物をアクリルアミドモノマー、アル
ギン酸等の担体を用いて固定化した固定化物を用いるこ
ともできる。菌体を用いる場合、予め菌体を凍結した
り、上記緩衝液中にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅ
ｅｎ ２０等の界面活性剤を０．０１〜０．２％添加し
た液中で、１５〜４０℃の温度で、１０〜１２０分菌体
を処理することにより菌体の透過性を高めてから使用す
る事もできる。
マル酸を生成させるに際しては、菌体をそのまま使用す
ることができるし、必要により、該菌体を超音波破砕等
で処理をした菌体破砕物や該破砕物を遠心分離した無細
胞抽出液、該無細胞抽出液を硫安分画法、イオン交換カ
ラム、ゲルろ過カラム等で精製した部分精製酵素、また
は該菌体や菌体破砕物をアクリルアミドモノマー、アル
ギン酸等の担体を用いて固定化した固定化物を用いるこ
ともできる。菌体を用いる場合、予め菌体を凍結した
り、上記緩衝液中にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅ
ｅｎ ２０等の界面活性剤を０．０１〜０．２％添加し
た液中で、１５〜４０℃の温度で、１０〜１２０分菌体
を処理することにより菌体の透過性を高めてから使用す
る事もできる。
【００１１】反応に用いるマレイン酸水溶液のマレイン
酸濃度は、通常、１〜４０Ｗ／Ｖ％、好ましくは１０〜
３０Ｗ／Ｖ％であるが、例えば連続反応等においては、
マレイン酸濃度が０．００１〜１％程度でも可能な場合
もある。反応に用いる菌体またはその処理物の添加量
は、特に制限されるものではないが、菌体重量（湿菌
体）として１〜３０％が好適に用いられる。
酸濃度は、通常、１〜４０Ｗ／Ｖ％、好ましくは１０〜
３０Ｗ／Ｖ％であるが、例えば連続反応等においては、
マレイン酸濃度が０．００１〜１％程度でも可能な場合
もある。反応に用いる菌体またはその処理物の添加量
は、特に制限されるものではないが、菌体重量（湿菌
体）として１〜３０％が好適に用いられる。
【００１２】また、菌体を回収してからフマル酸生成反
応を行うすべての工程は、溶存酸素濃度制限下に行うこ
とが好ましい。溶存酸素濃度を制限する方法としては、
例えば、Ｎ2、Ａｒ、Ｈｅ等の不活性ガスにより系内を
シールする方法、又は系内に亜硫酸塩等の脱酸素剤を添
加する方法等が挙げられる。上記の方法で生成したフマ
ル酸は、限外ろ過膜分離、遠心分離等により菌体及びそ
の処理物と分離した後、硫酸等電点沈澱法等の公知の方
法で沈澱させ、水洗、乾燥する事により、結晶として採
取できる。
応を行うすべての工程は、溶存酸素濃度制限下に行うこ
とが好ましい。溶存酸素濃度を制限する方法としては、
例えば、Ｎ2、Ａｒ、Ｈｅ等の不活性ガスにより系内を
シールする方法、又は系内に亜硫酸塩等の脱酸素剤を添
加する方法等が挙げられる。上記の方法で生成したフマ
ル酸は、限外ろ過膜分離、遠心分離等により菌体及びそ
の処理物と分離した後、硫酸等電点沈澱法等の公知の方
法で沈澱させ、水洗、乾燥する事により、結晶として採
取できる。
【００１３】尚、本発明のフマル酸の製造法を利用し
て、アスパラギン酸を製造する場合には、上記、製造さ
れたフマル酸をアスパルターゼ活性を有する微生物また
はその処理物の存在下で反応させることもできるし、ア
スパルターゼ活性を有する微生物またはその処理物をフ
マル酸の異性化反応時に、マレイン酸イソメラーゼ活性
を有する微生物またはその処理物と共存させることが特
に好ましい。以下の実施例により本発明をさらに詳しく
説明する。
て、アスパラギン酸を製造する場合には、上記、製造さ
れたフマル酸をアスパルターゼ活性を有する微生物また
はその処理物の存在下で反応させることもできるし、ア
スパルターゼ活性を有する微生物またはその処理物をフ
マル酸の異性化反応時に、マレイン酸イソメラーゼ活性
を有する微生物またはその処理物と共存させることが特
に好ましい。以下の実施例により本発明をさらに詳しく
説明する。
【００１４】
［実施例１］ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５
ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリス ＩＦ
Ｏ １２６６９菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振と
う培養した。
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５
ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリス ＩＦ
Ｏ １２６６９菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振と
う培養した。
【００１５】リン酸１カリウム：２ｇ、リン酸２カリウ
ム：７ｇ、硫酸アンモニウム：１ｇ、硫酸マグネシウ
ム：０．１ｇ、酵母エキス：３ｇ、ポリペプトン：３
ｇ、マレイン酸ナトリウム１０ｇ、Ｌ−アスパラギン酸
ナトリウム：１０ｇ、蒸留水１０００ｍｌの培地１５０
０ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０
℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液３
０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４時間培養した。
得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、
４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に供試した。
ム：７ｇ、硫酸アンモニウム：１ｇ、硫酸マグネシウ
ム：０．１ｇ、酵母エキス：３ｇ、ポリペプトン：３
ｇ、マレイン酸ナトリウム１０ｇ、Ｌ−アスパラギン酸
ナトリウム：１０ｇ、蒸留水１０００ｍｌの培地１５０
０ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０
℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液３
０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４時間培養した。
得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、
４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に供試した。
【００１６】（２）マレイン酸水溶液からのフマル酸生
成 反応液＜マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍ
ｌ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ（水で全量を１０
００ｍｌにする）＞を３Ｌ容のジャーファーメンターに
移し、Ｎ２を０．２ｖｖｍの速度で１ｈｒバブリングし
た後に、回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ）を添加
して攪拌し、密閉して３０℃で２４時間反応させた。フ
マル酸は７２ｇ／ｌ得られ、常法通り遠心分離後、硫酸
によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を沈澱させ
た。得られたフマル酸結晶は６８ｇであった。
成 反応液＜マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍ
ｌ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ（水で全量を１０
００ｍｌにする）＞を３Ｌ容のジャーファーメンターに
移し、Ｎ２を０．２ｖｖｍの速度で１ｈｒバブリングし
た後に、回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ）を添加
して攪拌し、密閉して３０℃で２４時間反応させた。フ
マル酸は７２ｇ／ｌ得られ、常法通り遠心分離後、硫酸
によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を沈澱させ
た。得られたフマル酸結晶は６８ｇであった。
【００１７】［対照例１］Ｌ−アスパラギン酸無添加培
養 （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５
ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリス ＩＦ
Ｏ １２６６９菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振と
う培養した。
養 （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５
ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリス ＩＦ
Ｏ １２６６９菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振と
う培養した。
【００１８】リン酸１カリウム：２ｇ、リン酸２カリウ
ム：７ｇ、硫酸アンモニウム：１ｇ、硫酸マグネシウ
ム：０．１ｇ、酵母エキス：３ｇ、ポリペプトン：３
ｇ、マレイン酸ナトリウム：１０ｇ、蒸留水１０００ｍ
ｌの培地１０００ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンター
に入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記
振とう培養液３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４
時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒ
ｐｍ、１５分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に
供試した。
ム：７ｇ、硫酸アンモニウム：１ｇ、硫酸マグネシウ
ム：０．１ｇ、酵母エキス：３ｇ、ポリペプトン：３
ｇ、マレイン酸ナトリウム：１０ｇ、蒸留水１０００ｍ
ｌの培地１０００ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンター
に入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記
振とう培養液３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４
時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒ
ｐｍ、１５分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に
供試した。
【００１９】（２）マレイン酸水溶液からのフマル酸生
成 （１）で得られた菌体を実施例１（２）と同様の方法で
反応させた。フマル酸は、５８ｇ／ｌ得られ、同上の方
法によりフマル酸の結晶を得た。得られた結晶は５４ｇ
であった。
成 （１）で得られた菌体を実施例１（２）と同様の方法で
反応させた。フマル酸は、５８ｇ／ｌ得られ、同上の方
法によりフマル酸の結晶を得た。得られた結晶は５４ｇ
であった。
【００２０】［実施例２］ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５
ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、バチルス ブレビス ＭＩ−１０３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０３）を植菌し、３０℃にて２
４時間振とう培養した。
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５
ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、バチルス ブレビス ＭＩ−１０３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０３）を植菌し、３０℃にて２
４時間振とう培養した。
【００２１】リン酸１カリウム：２ｇ、リン酸２カリウ
ム：７ｇ、硫酸アンモニウム：１ｇ、硫酸マグネシウ
ム：０．１ｇ、酵母エキス：３ｇ、ポリペプトン：３
ｇ、マレイン酸ナトリウム：１０ｇ、Ｌ−アスパラギン
酸ナトリウム：１０ｇ、蒸留水１０００ｍｌの培地１５
００ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２
０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液
３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４時間培養し
た。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５
分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に供試した。
ム：７ｇ、硫酸アンモニウム：１ｇ、硫酸マグネシウ
ム：０．１ｇ、酵母エキス：３ｇ、ポリペプトン：３
ｇ、マレイン酸ナトリウム：１０ｇ、Ｌ−アスパラギン
酸ナトリウム：１０ｇ、蒸留水１０００ｍｌの培地１５
００ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２
０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液
３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４時間培養し
た。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５
分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に供試した。
【００２２】（２）マレイン酸水溶液からのフマル酸生
成 反応液＜マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍ
ｌ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ（水で全量を１０
００ｍｌにする）＞を３Ｌ容のジャーファーメンターに
移し、Ｎ２を０．２ｖｖｍの速度で１ｈｒバブリングし
た後に、回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ）を添加
して攪拌し、密閉して３０℃で３６時間反応させた。フ
マル酸は５３ｇ／ｌ得られ、常法通り遠心分離後、硫酸
によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を沈澱させ
た。得られたフマル酸結晶は５０ｇであった。
成 反応液＜マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍ
ｌ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ（水で全量を１０
００ｍｌにする）＞を３Ｌ容のジャーファーメンターに
移し、Ｎ２を０．２ｖｖｍの速度で１ｈｒバブリングし
た後に、回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ）を添加
して攪拌し、密閉して３０℃で３６時間反応させた。フ
マル酸は５３ｇ／ｌ得られ、常法通り遠心分離後、硫酸
によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を沈澱させ
た。得られたフマル酸結晶は５０ｇであった。
【００２３】［対照例２］Ｌ−アスパラギン酸無添加培
養 （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５
ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、バチルス ブレビス ＭＩ−１０３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０３）を植菌し、３０℃にて２
４時間振とう培養した。
養 （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５
ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、バチルス ブレビス ＭＩ−１０３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０３）を植菌し、３０℃にて２
４時間振とう培養した。
【００２４】リン酸１カリウム：２ｇ、リン酸２カリウ
ム：７ｇ、硫酸アンモニウム：１ｇ、硫酸マグネシウ
ム：０．１ｇ、酵母エキス：３ｇ、ポリペプトン：３
ｇ、マレイン酸ナトリウム：１０ｇ、蒸留水１０００ｍ
ｌの培地１５００ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンター
に入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記
振とう培養液３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４
時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒ
ｐｍ、１５分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に
供試した。
ム：７ｇ、硫酸アンモニウム：１ｇ、硫酸マグネシウ
ム：０．１ｇ、酵母エキス：３ｇ、ポリペプトン：３
ｇ、マレイン酸ナトリウム：１０ｇ、蒸留水１０００ｍ
ｌの培地１５００ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンター
に入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記
振とう培養液３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４
時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒ
ｐｍ、１５分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に
供試した。
【００２５】（２）マレイン酸水溶液からのフマル酸生
成 （１）で得られた菌体を実施例２（２）と同様の方法で
反応させた。フマル酸は、４１ｇ／ｌ得られ、同上の方
法によりフマル酸の結晶を得た。得られた結晶は３８ｇ
であった。
成 （１）で得られた菌体を実施例２（２）と同様の方法で
反応させた。フマル酸は、４１ｇ／ｌ得られ、同上の方
法によりフマル酸の結晶を得た。得られた結晶は３８ｇ
であった。
【００２６】
【発明の効果】本発明の方法によれば、酵素法により、
効率よく、かつ高収率でマレイン酸からフマル酸を製造
することができる。
効率よく、かつ高収率でマレイン酸からフマル酸を製造
することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/38 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｎ 1/38 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:05） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
生物を１０〜１０００ｍＭの濃度でＬ−アスパラギン酸
を存在させた培地で培養して得られる菌体を用いてマレ
イン酸からフマル酸を生成させることを特徴とするフマ
ル酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8194962A JPH1033192A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | フマル酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8194962A JPH1033192A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | フマル酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1033192A true JPH1033192A (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=16333234
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8194962A Pending JPH1033192A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | フマル酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1033192A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006197821A (ja) * | 2005-01-18 | 2006-08-03 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | 好気性細菌による高効率な有機酸の製造方法 |
-
1996
- 1996-07-24 JP JP8194962A patent/JPH1033192A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006197821A (ja) * | 2005-01-18 | 2006-08-03 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | 好気性細菌による高効率な有機酸の製造方法 |
| JP4537862B2 (ja) * | 2005-01-18 | 2010-09-08 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | 好気性細菌による高効率な有機酸の製造方法 |
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