JPH1052288A - フマル酸またはｌ−アスパラギン酸の製造法 - Google Patents
フマル酸またはｌ−アスパラギン酸の製造法Info
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- JPH1052288A JPH1052288A JP12708797A JP12708797A JPH1052288A JP H1052288 A JPH1052288 A JP H1052288A JP 12708797 A JP12708797 A JP 12708797A JP 12708797 A JP12708797 A JP 12708797A JP H1052288 A JPH1052288 A JP H1052288A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 マレイン酸を原料として、酵素法によりフマ
ル酸或いはＬ−アスパラギン酸を効率よく、且つ、高収
率で製造する。 【解決手段】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
生物を培養して得られるマレイン酸イソメラーゼを用い
てマレイン酸からフマル酸を製造する方法或いは、マレ
イン酸に更にアスパルターゼ及びアンモニアを加えてＬ
−アスパラギン酸を製造する際、培養液からマレイン酸
イソメラーゼ活性を有する微生物菌体を分離し、反応に
供するまでの工程の少なくとも一部を酸素制限下で行
う。
ル酸或いはＬ−アスパラギン酸を効率よく、且つ、高収
率で製造する。 【解決手段】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
生物を培養して得られるマレイン酸イソメラーゼを用い
てマレイン酸からフマル酸を製造する方法或いは、マレ
イン酸に更にアスパルターゼ及びアンモニアを加えてＬ
−アスパラギン酸を製造する際、培養液からマレイン酸
イソメラーゼ活性を有する微生物菌体を分離し、反応に
供するまでの工程の少なくとも一部を酸素制限下で行
う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はフマル酸またはＬ−
アスパラギン酸の製造法に関する。詳しくは、微生物起
源のマレイン酸イソメラーゼ、あるいは微生物起源のマ
レイン酸イソメラーゼ及びアスパルターゼを用いて、マ
レイン酸を原料としてフマル酸またはＬ−アスパラギン
酸を効率よく製造する方法に関する。
アスパラギン酸の製造法に関する。詳しくは、微生物起
源のマレイン酸イソメラーゼ、あるいは微生物起源のマ
レイン酸イソメラーゼ及びアスパルターゼを用いて、マ
レイン酸を原料としてフマル酸またはＬ−アスパラギン
酸を効率よく製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸は、主にフマル酸と
アンモニアに酵素を作用させて製造され、食品添加物、
輸液等に広く利用されている。酵素法によるフマル酸か
らのアスパラギン酸の製造法としては、大腸菌を用いた
方法（北原ら；Amino Acids発酵と代謝；１巻、p102(19
59)）、シュードモナス属菌を用いる方法（高橋ら；Ami
no Acids 発酵と代謝；７巻、p23(1963) 、米国特許第
3,310,475)、ブレビバクテリウム属菌を用いる方法（渡
辺ら；日本農芸化学会誌；３８巻、p434(1964)、特公昭
61-29718号）等が知られている。マレイン酸は、フマル
酸より安価に入手できるので、Ｌ−アスパラギン酸の原
料としてより有利である。マレイン酸を原料とするＬ−
アスパラギン酸の製造法としてはマレイン酸からアスパ
ラギン酸を生成する微生物菌体を用いてアスパラギン酸
を得る方法（特公昭42-11993、42-11994、42-11996号、
米国特許第3,391,059)が知られているが、これらの方法
は、アスパラギン酸対原料収率、生成速度などが十分と
はいえなかった。
アンモニアに酵素を作用させて製造され、食品添加物、
輸液等に広く利用されている。酵素法によるフマル酸か
らのアスパラギン酸の製造法としては、大腸菌を用いた
方法（北原ら；Amino Acids発酵と代謝；１巻、p102(19
59)）、シュードモナス属菌を用いる方法（高橋ら；Ami
no Acids 発酵と代謝；７巻、p23(1963) 、米国特許第
3,310,475)、ブレビバクテリウム属菌を用いる方法（渡
辺ら；日本農芸化学会誌；３８巻、p434(1964)、特公昭
61-29718号）等が知られている。マレイン酸は、フマル
酸より安価に入手できるので、Ｌ−アスパラギン酸の原
料としてより有利である。マレイン酸を原料とするＬ−
アスパラギン酸の製造法としてはマレイン酸からアスパ
ラギン酸を生成する微生物菌体を用いてアスパラギン酸
を得る方法（特公昭42-11993、42-11994、42-11996号、
米国特許第3,391,059)が知られているが、これらの方法
は、アスパラギン酸対原料収率、生成速度などが十分と
はいえなかった。
【０００３】また、マレイン酸を異性化してフマル酸を
製造し、これを原料としてＬ−アスパラギン酸を製造す
る方法が知られている。マレイン酸の異性化法として
は、主に化学的方法が提案されているが、反応平衡によ
りフマル酸への変換率が制約を受けること、高温反応の
ためマレイン酸或いはフマル酸の劣化がおこり、副生物
を生成し、収量が低下する等の問題がある。一方、マレ
イン酸イソメラーゼがマレイン酸を異性化してフマル酸
を生成することが報告されているが（K.Otsuka Agric.B
iol.Chem.,25,(9),p726(1961))、酵素学的性質の検討が
成されているにすぎず、工業的に酵素法を利用してフマ
ル酸を製造する検討はほとんどなされていない。
製造し、これを原料としてＬ−アスパラギン酸を製造す
る方法が知られている。マレイン酸の異性化法として
は、主に化学的方法が提案されているが、反応平衡によ
りフマル酸への変換率が制約を受けること、高温反応の
ためマレイン酸或いはフマル酸の劣化がおこり、副生物
を生成し、収量が低下する等の問題がある。一方、マレ
イン酸イソメラーゼがマレイン酸を異性化してフマル酸
を生成することが報告されているが（K.Otsuka Agric.B
iol.Chem.,25,(9),p726(1961))、酵素学的性質の検討が
成されているにすぎず、工業的に酵素法を利用してフマ
ル酸を製造する検討はほとんどなされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、酵素法によ
り、効率よく、且つ、高収率でマレイン酸からフマル酸
またはＬ−アスパラギン酸を製造する工業的有利な方法
の提供を目的とするものである。
り、効率よく、且つ、高収率でマレイン酸からフマル酸
またはＬ−アスパラギン酸を製造する工業的有利な方法
の提供を目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、酵素法に
より効率よくフマル酸を製造する方法につき検討を行
い、酸素存在下で培養されたマレイン酸イソメラーゼ活
性を有する微生物を、培養液から菌体分離する工程から
は、酸素との接触を制限して取り扱うことにより、高収
率でマレイン酸からフマル酸を製造することに成功し
た。また、マレイン酸に、マレイン酸イソメラーゼとア
スパルターゼ及びアンモニアを添加してＬ−アスパラギ
ン酸を製造する際にも、マレイン酸イソメラーゼ活性を
有する微生物を、酸素制限下で取り扱うことにより、高
収率でＬ−アスパラギン酸を製造することに成功した。
より効率よくフマル酸を製造する方法につき検討を行
い、酸素存在下で培養されたマレイン酸イソメラーゼ活
性を有する微生物を、培養液から菌体分離する工程から
は、酸素との接触を制限して取り扱うことにより、高収
率でマレイン酸からフマル酸を製造することに成功し
た。また、マレイン酸に、マレイン酸イソメラーゼとア
スパルターゼ及びアンモニアを添加してＬ−アスパラギ
ン酸を製造する際にも、マレイン酸イソメラーゼ活性を
有する微生物を、酸素制限下で取り扱うことにより、高
収率でＬ−アスパラギン酸を製造することに成功した。
【０００６】即ち、本発明の要旨はマレイン酸イソメラ
ーゼ活性を有する微生物を培養して得られるマレイン酸
イソメラーゼによりマレイン酸を異性化してフマル酸を
製造する方法において、培養液からマレイン酸イソメラ
ーゼ活性を有する微生物菌体を分離し異性化反応に供す
るまでの工程の少なくとも一部を酸素制限下で行うこと
を特徴とするフマル酸の製造法並びにマレイン酸イソメ
ラーゼ活性を有する微生物を培養して得られるマレイン
酸イソメラーゼ及びアスパルターゼ活性を有する微生物
を培養して得られるアスパルターゼの存在下、マレイン
酸もしくは無水マレイン酸またはマレイン酸塩と、アン
モニアまたはアンモニウム塩を反応させてＬ−アスパラ
ギン酸を製造する方法において、培養液からマレイン酸
イソメラーゼ活性を有する微生物菌体を分離し、反応に
供するまでの工程の少なくとも一部を酸素制限下で行う
ことを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造法に存す
る。
ーゼ活性を有する微生物を培養して得られるマレイン酸
イソメラーゼによりマレイン酸を異性化してフマル酸を
製造する方法において、培養液からマレイン酸イソメラ
ーゼ活性を有する微生物菌体を分離し異性化反応に供す
るまでの工程の少なくとも一部を酸素制限下で行うこと
を特徴とするフマル酸の製造法並びにマレイン酸イソメ
ラーゼ活性を有する微生物を培養して得られるマレイン
酸イソメラーゼ及びアスパルターゼ活性を有する微生物
を培養して得られるアスパルターゼの存在下、マレイン
酸もしくは無水マレイン酸またはマレイン酸塩と、アン
モニアまたはアンモニウム塩を反応させてＬ−アスパラ
ギン酸を製造する方法において、培養液からマレイン酸
イソメラーゼ活性を有する微生物菌体を分離し、反応に
供するまでの工程の少なくとも一部を酸素制限下で行う
ことを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造法に存す
る。
【０００７】マレイン酸イソメラーゼを用いてマレイン
酸を異性化してフマル酸を製造する方法、或いはマレイ
ン酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸を製造する方
法は、まず、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物を培養して多量の微生物を得、次いで、培養液から微
生物菌体を分離する。分離された微生物菌体は、そのま
ま、異性化反応に供するか、或いは、菌体を処理してマ
レイン酸イソメラーゼを分離精製した精製酵素或いは担
体に固定化した酵素等、酵素活性を有する任意の画分を
得て使用される。また、培養液から分離された菌体を、
反応に供する場合であっても、微生物の原料透過性を向
上させる目的で、或いは、夾雑する副反応酵素を抑える
目的で微生物菌体の処理を行った後、反応に供される。
本発明者らは、この過程で菌体あるいは酵素が酸素によ
って失活することを見出した。本発明は、菌体の分離か
ら異性化反応に至る上述の如き前処理工程の少なくとも
一部を、酸素制限下で行うものである。本発明に於て酸
素制限下とは菌体の接する水性媒体または雰囲気中の酸
素濃度を低減すること、好ましくは溶存酸素濃度を４ｐ
ｐｍ以下、或いは雰囲気中の酸素濃度を２％以下にする
ことであり、さらに好ましくは、溶存酸素濃度を０．５
ｐｐｍ以下、或いは雰囲気中の酸素濃度を０．２％以下
に低減することである。
酸を異性化してフマル酸を製造する方法、或いはマレイ
ン酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸を製造する方
法は、まず、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物を培養して多量の微生物を得、次いで、培養液から微
生物菌体を分離する。分離された微生物菌体は、そのま
ま、異性化反応に供するか、或いは、菌体を処理してマ
レイン酸イソメラーゼを分離精製した精製酵素或いは担
体に固定化した酵素等、酵素活性を有する任意の画分を
得て使用される。また、培養液から分離された菌体を、
反応に供する場合であっても、微生物の原料透過性を向
上させる目的で、或いは、夾雑する副反応酵素を抑える
目的で微生物菌体の処理を行った後、反応に供される。
本発明者らは、この過程で菌体あるいは酵素が酸素によ
って失活することを見出した。本発明は、菌体の分離か
ら異性化反応に至る上述の如き前処理工程の少なくとも
一部を、酸素制限下で行うものである。本発明に於て酸
素制限下とは菌体の接する水性媒体または雰囲気中の酸
素濃度を低減すること、好ましくは溶存酸素濃度を４ｐ
ｐｍ以下、或いは雰囲気中の酸素濃度を２％以下にする
ことであり、さらに好ましくは、溶存酸素濃度を０．５
ｐｐｍ以下、或いは雰囲気中の酸素濃度を０．２％以下
に低減することである。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を具
体的に説明する。本発明に用いられるマレイン酸イソメ
ラーゼ活性を有する微生物としては、本活性を有する微
生物であれば特に限定されるものではないが、アルカリ
ゲネス（Alcaligenes)属、シュードモナス(Pseudomona
s) 属、キサントモナス(Xanthomonas) 属、バチルス(Ba
cillus)属に属する微生物が好適に用いられる。特にア
ルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faecalis)（例
えば、IFO 12669 、同IFO 13110 、同IFO 13111 、同IA
M 1473）、アルカリゲネス ユウトロフス(Alcaligenes
eutrophus）、シュードモナス フルオレッセンス（Ps
eudomonas fluolescens)（例えばATCC 23728）、キサン
トモナス マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia)
（例えばATCC 13270）、バチルス ステアロサーモフィ
ラス（Bacillusstearothermophilus)〔例えば、同MI-10
1株（FERM P-14801)]、バチルス ブレビス（Bacillus
brevis)〔例えば、同MI-103株(FERM P-14803)〕等が好
適に用いられる。さらに、上記微生物の変異株もしくは
遺伝子組換えによる改変株、上記微生物のマレイン酸イ
ソメラーゼ遺伝子を他の微生物に導入することにより作
製された微生物等も使用することができる。
体的に説明する。本発明に用いられるマレイン酸イソメ
ラーゼ活性を有する微生物としては、本活性を有する微
生物であれば特に限定されるものではないが、アルカリ
ゲネス（Alcaligenes)属、シュードモナス(Pseudomona
s) 属、キサントモナス(Xanthomonas) 属、バチルス(Ba
cillus)属に属する微生物が好適に用いられる。特にア
ルカリゲネス フェカリス(Alcaligenes faecalis)（例
えば、IFO 12669 、同IFO 13110 、同IFO 13111 、同IA
M 1473）、アルカリゲネス ユウトロフス(Alcaligenes
eutrophus）、シュードモナス フルオレッセンス（Ps
eudomonas fluolescens)（例えばATCC 23728）、キサン
トモナス マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia)
（例えばATCC 13270）、バチルス ステアロサーモフィ
ラス（Bacillusstearothermophilus)〔例えば、同MI-10
1株（FERM P-14801)]、バチルス ブレビス（Bacillus
brevis)〔例えば、同MI-103株(FERM P-14803)〕等が好
適に用いられる。さらに、上記微生物の変異株もしくは
遺伝子組換えによる改変株、上記微生物のマレイン酸イ
ソメラーゼ遺伝子を他の微生物に導入することにより作
製された微生物等も使用することができる。
【０００９】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物の培養は、炭素源、窒素源、無機物、各種ビタミン等
を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源として
は、例えばマレイン酸、ブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽
糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール
類、クエン酸、マレイン酸等の有機酸類、廃糖蜜等、好
ましくはマレイン酸あるいはマレイン酸とその他の炭素
源を混合して用いる。窒素源としては、例えばアンモニ
ア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニ
ウム等の硝酸塩、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合し
て用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一
水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム等の無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、銅等が必要に応じ
て用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等
の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができ
る。更にマレイン酸イソメラーゼ活性を高めるために
は、マレイン酸、マロン酸、タートロン酸、シトラコン
酸、メサコン酸等を培地に添加してもよい。これらの添
加濃度は、通常１０〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１
００ｍＭである。
物の培養は、炭素源、窒素源、無機物、各種ビタミン等
を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源として
は、例えばマレイン酸、ブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽
糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール
類、クエン酸、マレイン酸等の有機酸類、廃糖蜜等、好
ましくはマレイン酸あるいはマレイン酸とその他の炭素
源を混合して用いる。窒素源としては、例えばアンモニ
ア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニ
ウム等の硝酸塩、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合し
て用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一
水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム等の無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、銅等が必要に応じ
て用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等
の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができ
る。更にマレイン酸イソメラーゼ活性を高めるために
は、マレイン酸、マロン酸、タートロン酸、シトラコン
酸、メサコン酸等を培地に添加してもよい。これらの添
加濃度は、通常１０〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１
００ｍＭである。
【００１０】培養条件は、通常、通気攪拌、振とう等に
より、好気的（空気等の酸素含有ガスの存在下）に行
う。この場合の圧力は減圧でも可能であるが、好ましく
は、常圧乃至加圧条件が採用される。温度は、マレイン
酸イソメラーゼ活性を有する微生物の生育し得る温度で
あれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについて
も該微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。
培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行う
ことができる。次いで培養液から菌体を分離回収する。
菌体回収は、通常の菌体分離方法が採用可能であるが、
好ましくは、遠心分離や限外濾過膜、マイクロフィルタ
ー等の膜での分離方法であり、雰囲気を酸素制限下にで
きる装置であれば、どのようなものでも良い。特に好ま
しいものとして、中空糸型限外濾過膜が挙げられる。
より、好気的（空気等の酸素含有ガスの存在下）に行
う。この場合の圧力は減圧でも可能であるが、好ましく
は、常圧乃至加圧条件が採用される。温度は、マレイン
酸イソメラーゼ活性を有する微生物の生育し得る温度で
あれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについて
も該微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。
培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行う
ことができる。次いで培養液から菌体を分離回収する。
菌体回収は、通常の菌体分離方法が採用可能であるが、
好ましくは、遠心分離や限外濾過膜、マイクロフィルタ
ー等の膜での分離方法であり、雰囲気を酸素制限下にで
きる装置であれば、どのようなものでも良い。特に好ま
しいものとして、中空糸型限外濾過膜が挙げられる。
【００１１】本発明の１つの方法は、菌体の分離時に、
菌体の保有する酵素が酸素により失活することを少なく
する条件、すなわち、酸素制限下で菌体分離を行うこと
である。酸素を低減させる手段は特に限定されるもので
はないが、例えば菌体の接する雰囲気または水性媒体を
不活性ガス置換する方法が挙げられる。具体的には、酸
素濃度を減少させた空気、窒素、二酸化炭素、アルゴ
ン、ヘリウムから選ばれる１種以上の不活性ガスでシー
ルした雰囲気中、または培養液中に該不活性ガスを流通
させること等で実現させることができる。この場合、不
活性ガスとしては、特に窒素ガスが安価に入手可能であ
ることから、工業的有利に使用される。酸素の低減は少
しでもそれなりの効果はあるが、好ましくは、水性媒体
は溶存酸素濃度４ｐｐｍ以下、より好ましくは０．５ｐ
ｐｍ以下、雰囲気中の酸素濃度は２％以下、より好まし
くは０．２％以下に維持するのがよい。
菌体の保有する酵素が酸素により失活することを少なく
する条件、すなわち、酸素制限下で菌体分離を行うこと
である。酸素を低減させる手段は特に限定されるもので
はないが、例えば菌体の接する雰囲気または水性媒体を
不活性ガス置換する方法が挙げられる。具体的には、酸
素濃度を減少させた空気、窒素、二酸化炭素、アルゴ
ン、ヘリウムから選ばれる１種以上の不活性ガスでシー
ルした雰囲気中、または培養液中に該不活性ガスを流通
させること等で実現させることができる。この場合、不
活性ガスとしては、特に窒素ガスが安価に入手可能であ
ることから、工業的有利に使用される。酸素の低減は少
しでもそれなりの効果はあるが、好ましくは、水性媒体
は溶存酸素濃度４ｐｐｍ以下、より好ましくは０．５ｐ
ｐｍ以下、雰囲気中の酸素濃度は２％以下、より好まし
くは０．２％以下に維持するのがよい。
【００１２】また、例えば、培養工程中の酸素または空
気等の酸素含有ガスの流通を培養終了前に停止すること
で、培養液中の溶存酸素量や培養容器内の酸素ガス含有
量を低減させる方法を採用することもできる。好ましく
は、培養終了前に酸素の供給を停止し、更に、前記不活
性ガスを培養液中に供給しながら、その後の遠心分離や
限外濾過膜、マイクロフィルター等の膜での分離を不活
性ガスの雰囲気中で行う方法が採用できる。
気等の酸素含有ガスの流通を培養終了前に停止すること
で、培養液中の溶存酸素量や培養容器内の酸素ガス含有
量を低減させる方法を採用することもできる。好ましく
は、培養終了前に酸素の供給を停止し、更に、前記不活
性ガスを培養液中に供給しながら、その後の遠心分離や
限外濾過膜、マイクロフィルター等の膜での分離を不活
性ガスの雰囲気中で行う方法が採用できる。
【００１３】本発明において、マレイン酸のフマル酸へ
の異性化反応或いはＬ−アスパラギン酸生成反応には、
上記培養液から分離した菌体はもちろんのこと、培養
液、菌体の破砕物もしくは抽出物等の処理物も用いるこ
とができる。菌体は、例えば、リン酸緩衝液等の緩衝液
（ｐＨ７）等で洗浄した後に使用してもよい。また、微
生物菌体より得られる粗酵素標品を用いてもよく、更に
精製した酵素標品を使用してもよい。更に、上記微生物
菌体、その破砕物もしくは抽出物、または精製酵素を担
体に固定化したものも使用することができる。本明細書
ではこれらのような、微生物菌体に由来しマレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する画分を「マレイン酸イソメラー
ゼ活性を有する微生物の処理物」と称する。
の異性化反応或いはＬ−アスパラギン酸生成反応には、
上記培養液から分離した菌体はもちろんのこと、培養
液、菌体の破砕物もしくは抽出物等の処理物も用いるこ
とができる。菌体は、例えば、リン酸緩衝液等の緩衝液
（ｐＨ７）等で洗浄した後に使用してもよい。また、微
生物菌体より得られる粗酵素標品を用いてもよく、更に
精製した酵素標品を使用してもよい。更に、上記微生物
菌体、その破砕物もしくは抽出物、または精製酵素を担
体に固定化したものも使用することができる。本明細書
ではこれらのような、微生物菌体に由来しマレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する画分を「マレイン酸イソメラー
ゼ活性を有する微生物の処理物」と称する。
【００１４】微生物菌体からマレイン酸イソメラーゼを
抽出、精製する方法は、公知の酵素の精製法のいずれの
方法も適用できる。例えば、菌体の破壊法としては、超
音波破砕、フレンチプレス、ホモジナイザー等を用いた
機械的破壊法、リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を
用いることができる。このようにして得られた菌体破壊
物の可溶性画分またはその分画物は、マレイン酸イソメ
ラーゼの粗酵素画分として使用することができる。ま
た、この粗酵素画分をさらに精製して得られる精製酵素
を用いてもよい。粗酵素画分からのマレイン酸イソメラ
ーゼの精製は、通常、（イ）沈澱法による分離、例えば
硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィーによる分離、例
えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー吸
着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
等、（ハ）電気泳動法による分離法、及びこれらの方法
の任意の組み合わせによって、実施することができる。
また、これら粗酵素画分、精製酵素、菌体あるいは菌体
破砕物等を、アルギン酸ナトリウム水溶液に懸濁し、
０．１−２Ｍ塩化カルシウム水溶液を滴下し、球状のア
ルギン酸カルシウムゲルを得る等の方法により、酵素を
安定化した固定化酵素として用いることも出来る。
抽出、精製する方法は、公知の酵素の精製法のいずれの
方法も適用できる。例えば、菌体の破壊法としては、超
音波破砕、フレンチプレス、ホモジナイザー等を用いた
機械的破壊法、リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を
用いることができる。このようにして得られた菌体破壊
物の可溶性画分またはその分画物は、マレイン酸イソメ
ラーゼの粗酵素画分として使用することができる。ま
た、この粗酵素画分をさらに精製して得られる精製酵素
を用いてもよい。粗酵素画分からのマレイン酸イソメラ
ーゼの精製は、通常、（イ）沈澱法による分離、例えば
硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィーによる分離、例
えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー吸
着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
等、（ハ）電気泳動法による分離法、及びこれらの方法
の任意の組み合わせによって、実施することができる。
また、これら粗酵素画分、精製酵素、菌体あるいは菌体
破砕物等を、アルギン酸ナトリウム水溶液に懸濁し、
０．１−２Ｍ塩化カルシウム水溶液を滴下し、球状のア
ルギン酸カルシウムゲルを得る等の方法により、酵素を
安定化した固定化酵素として用いることも出来る。
【００１５】菌体をそのまま反応に用いる場合は、菌体
の原料透過性を向上させるため、あるいは、夾雑する副
反応酵素の活性を抑制するための前処理が行われる。透
過性を向上させるための前処理としては、菌体を凍結し
たり或いは、例えば、TritonX-100やTween20 等の界面
活性剤を０．０１〜１重量／容量％含有するｐＨ６〜９
の水溶液に、氷温〜４５℃、５分〜２４時間菌体を保持
したり、菌体を超音波破砕することにより行われる。副
反応酵素の抑制は、例えば、０．５〜３０重量／容量％
のアスパラギン酸を含有するｐＨ８〜１１のアルカリ性
水溶液中で４０〜６０℃、５分〜２４時間、菌体を保持
することにより行われる。或いは、通常のカラム操作法
により精製しても良い。本発明の他の１つの方法は菌体
の前処理、或いは菌体からの処理物の調製を酸素制限下
に行うことである。酸素を低減させる手段は特に限定さ
れるものではないが、菌体分離の場合と同様、菌体の接
する溶液中に、不活性ガスを吹き込む方法が挙げられ
る。使用される不活性ガスとしては、前述と同様、窒
素、二酸化炭素、アルゴン、ヘリウムが挙げられる。或
いはまた、前処理反応系内を脱気することにより酸素を
制限することも可能である。酸素の低減はそれなりに効
果があるが、好ましくは、菌体が存在する水性媒体の溶
存酸素を４ｐｐｍ以下、より好ましくは０．５ｐｐｍ以
下に維持するのが良い。本発明では、菌体分離或いは菌
体の前処理のいずれか一方を酸素制限下に行うことが必
要であり、両者を酸素制限下で行っても良い。
の原料透過性を向上させるため、あるいは、夾雑する副
反応酵素の活性を抑制するための前処理が行われる。透
過性を向上させるための前処理としては、菌体を凍結し
たり或いは、例えば、TritonX-100やTween20 等の界面
活性剤を０．０１〜１重量／容量％含有するｐＨ６〜９
の水溶液に、氷温〜４５℃、５分〜２４時間菌体を保持
したり、菌体を超音波破砕することにより行われる。副
反応酵素の抑制は、例えば、０．５〜３０重量／容量％
のアスパラギン酸を含有するｐＨ８〜１１のアルカリ性
水溶液中で４０〜６０℃、５分〜２４時間、菌体を保持
することにより行われる。或いは、通常のカラム操作法
により精製しても良い。本発明の他の１つの方法は菌体
の前処理、或いは菌体からの処理物の調製を酸素制限下
に行うことである。酸素を低減させる手段は特に限定さ
れるものではないが、菌体分離の場合と同様、菌体の接
する溶液中に、不活性ガスを吹き込む方法が挙げられ
る。使用される不活性ガスとしては、前述と同様、窒
素、二酸化炭素、アルゴン、ヘリウムが挙げられる。或
いはまた、前処理反応系内を脱気することにより酸素を
制限することも可能である。酸素の低減はそれなりに効
果があるが、好ましくは、菌体が存在する水性媒体の溶
存酸素を４ｐｐｍ以下、より好ましくは０．５ｐｐｍ以
下に維持するのが良い。本発明では、菌体分離或いは菌
体の前処理のいずれか一方を酸素制限下に行うことが必
要であり、両者を酸素制限下で行っても良い。
【００１６】このようにして得られたマレイン酸イソメ
ラーゼ活性を有する微生物あるいはその処理物を用いて
マレイン酸をフマル酸に異性化する反応は、マレイン酸
水溶液に上述の微生物あるいはその処理物を添加し、ｐ
Ｈ５〜１０好ましくは６〜９、２０〜５０℃、好ましく
は２５〜３７℃の温度で、通常５〜１２０時間反応させ
る。マレイン酸水溶液のマレイン酸源としては、マレイ
ン酸以外に、その塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、
無水マレイン酸等も使用出来る。本反応液には、必要に
応じカルシウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩等の２
価金属塩を添加することができる。反応に用いるマレイ
ン酸水溶液のマレイン酸濃度は通常は０．００１〜４０
重量／容量％の範囲であり、バッチ反応時には１〜４０
重量／容量％、好ましくは１０〜３０重量／容量％であ
るが、連続反応時においては、マレイン酸濃度が０．０
０１〜１重量／容量％程度が好ましい。異性化反応に用
いる菌体またその処理物の使用量は、特に制限されるも
のではないが、菌体重量（湿菌体）として１〜３０重量
／容量％の範囲が好適に用いられる。尚、異性化反応時
においても、菌体（酵素）の失活を避けるため、前述の
酸素制限下に行うことが好ましい。
ラーゼ活性を有する微生物あるいはその処理物を用いて
マレイン酸をフマル酸に異性化する反応は、マレイン酸
水溶液に上述の微生物あるいはその処理物を添加し、ｐ
Ｈ５〜１０好ましくは６〜９、２０〜５０℃、好ましく
は２５〜３７℃の温度で、通常５〜１２０時間反応させ
る。マレイン酸水溶液のマレイン酸源としては、マレイ
ン酸以外に、その塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、
無水マレイン酸等も使用出来る。本反応液には、必要に
応じカルシウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩等の２
価金属塩を添加することができる。反応に用いるマレイ
ン酸水溶液のマレイン酸濃度は通常は０．００１〜４０
重量／容量％の範囲であり、バッチ反応時には１〜４０
重量／容量％、好ましくは１０〜３０重量／容量％であ
るが、連続反応時においては、マレイン酸濃度が０．０
０１〜１重量／容量％程度が好ましい。異性化反応に用
いる菌体またその処理物の使用量は、特に制限されるも
のではないが、菌体重量（湿菌体）として１〜３０重量
／容量％の範囲が好適に用いられる。尚、異性化反応時
においても、菌体（酵素）の失活を避けるため、前述の
酸素制限下に行うことが好ましい。
【００１７】生成したフマル酸は、限外濾過膜による分
離、遠心分離等により菌体またはその処理物と分離した
後、硫酸等電点沈澱法等の公知の方法で沈澱させ、水
洗、乾燥すれば結晶として採取できる。マレイン酸から
アスパラギン酸を製造する場合には、上記方法で製造さ
れたフマル酸をアスパルターゼ活性を有する微生物また
はその処理物の存在下で反応させることもできるし、ア
スパルターゼ活性を有する微生物またはその処理物をマ
レイン酸の異性化反応時に、マレイン酸イソメラーゼ活
性を有する微生物またはその処理物と共存させても良
い。
離、遠心分離等により菌体またはその処理物と分離した
後、硫酸等電点沈澱法等の公知の方法で沈澱させ、水
洗、乾燥すれば結晶として採取できる。マレイン酸から
アスパラギン酸を製造する場合には、上記方法で製造さ
れたフマル酸をアスパルターゼ活性を有する微生物また
はその処理物の存在下で反応させることもできるし、ア
スパルターゼ活性を有する微生物またはその処理物をマ
レイン酸の異性化反応時に、マレイン酸イソメラーゼ活
性を有する微生物またはその処理物と共存させても良
い。
【００１８】本発明において、効率よくＬ−アスパラギ
ン酸を製造するには、フマル酸製造時すなわち、酸素制
限下で菌体分離或いは前処理して得られたマレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する微生物或いはその処理物を添加
したマレイン酸水溶液に、更に、アスパルターゼとアン
モニアまたはアンモニウム塩を添加して反応させる。ア
スパルターゼはアスパルターゼ活性を有する微生物を培
養して得られる。かかる微生物としては、ブレビバクテ
リウム(Brevibacterium)属、エシェリヒア(Escherichi
a) 属、シュードモナス(Pseudomonas) 属、バチルス(Ba
cillus)属等の微生物が用いられる。例えば、ブレビバ
クテリウム フラバム(Brevibacteriumflavum)MJ-233(F
ERM BP-1497) 、同MJ-233 AB-41(FERM BP-1498)、ブレ
ビバクテリウム アンモニアゲネス ATCC 6872、エシェ
リヒア コリ(Escherichia coli)ATCC 11303、同ATCC 2
7325等が好適に用いられる。アスパルターゼ活性を有す
る微生物の培養には、肉エキス、酵母エキス、ペプトン
等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることが
出来る。炭素源としてはグルコースやエタノールを添加
することも出来る。更に培地には、必要に応じて、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、
硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の
硝酸塩、アンモニア等を窒素源として添加しても良く、
またリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガ
ン、亜鉛、銅等の無機物を添加しても良い。
ン酸を製造するには、フマル酸製造時すなわち、酸素制
限下で菌体分離或いは前処理して得られたマレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する微生物或いはその処理物を添加
したマレイン酸水溶液に、更に、アスパルターゼとアン
モニアまたはアンモニウム塩を添加して反応させる。ア
スパルターゼはアスパルターゼ活性を有する微生物を培
養して得られる。かかる微生物としては、ブレビバクテ
リウム(Brevibacterium)属、エシェリヒア(Escherichi
a) 属、シュードモナス(Pseudomonas) 属、バチルス(Ba
cillus)属等の微生物が用いられる。例えば、ブレビバ
クテリウム フラバム(Brevibacteriumflavum)MJ-233(F
ERM BP-1497) 、同MJ-233 AB-41(FERM BP-1498)、ブレ
ビバクテリウム アンモニアゲネス ATCC 6872、エシェ
リヒア コリ(Escherichia coli)ATCC 11303、同ATCC 2
7325等が好適に用いられる。アスパルターゼ活性を有す
る微生物の培養には、肉エキス、酵母エキス、ペプトン
等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることが
出来る。炭素源としてはグルコースやエタノールを添加
することも出来る。更に培地には、必要に応じて、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、
硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の
硝酸塩、アンモニア等を窒素源として添加しても良く、
またリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガ
ン、亜鉛、銅等の無機物を添加しても良い。
【００１９】Ｌ−アスパラギン酸の生成反応に使用する
アスパルターゼとしては、上記培養液から分離した菌体
はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕物もしくは抽出
物等の処理物も用いることができる。菌体は、例えば、
リン酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ７）等で洗浄した後に使
用してもよい。また、微生物菌体より得られる粗酵素標
品を用いてもよく、更に精製した酵素標品を使用しても
よい。更に、上記微生物菌体、その破砕物もしくは抽出
物、または精製酵素を担体に固定化したものも使用する
ことができる。菌体またはその処理物の使用量は特に制
限されるものではないが、通常、菌体重量（湿菌体）と
して１〜３０重量／容量％の範囲が好適に使用される。
アスパルターゼとしては、上記培養液から分離した菌体
はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕物もしくは抽出
物等の処理物も用いることができる。菌体は、例えば、
リン酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ７）等で洗浄した後に使
用してもよい。また、微生物菌体より得られる粗酵素標
品を用いてもよく、更に精製した酵素標品を使用しても
よい。更に、上記微生物菌体、その破砕物もしくは抽出
物、または精製酵素を担体に固定化したものも使用する
ことができる。菌体またはその処理物の使用量は特に制
限されるものではないが、通常、菌体重量（湿菌体）と
して１〜３０重量／容量％の範囲が好適に使用される。
【００２０】Ｌ−アスパラギン酸生成反応に用いられる
マレイン酸水溶液は、フマル酸生成に用いたと同様のマ
レイン酸源を用い、同様のマレイン酸濃度が選ばれる。
マレイン酸イソメラーゼ及びアスパルターゼを含有した
マレイン酸水溶液中に、更に、アンモニアまたはアンモ
ニウム塩が添加され、ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜９
で、２０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃に、５〜１
２０時間保持することにより酵素反応を進行させる。ア
ンモニウム塩としては、例えば塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等が好適に使用され
る。アンモニア或いはアンモニウム塩は、通常、マレイ
ン酸水溶液中の濃度が０．１〜５Ｍ／Ｌ程度となる量が
使用される。
マレイン酸水溶液は、フマル酸生成に用いたと同様のマ
レイン酸源を用い、同様のマレイン酸濃度が選ばれる。
マレイン酸イソメラーゼ及びアスパルターゼを含有した
マレイン酸水溶液中に、更に、アンモニアまたはアンモ
ニウム塩が添加され、ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜９
で、２０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃に、５〜１
２０時間保持することにより酵素反応を進行させる。ア
ンモニウム塩としては、例えば塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等が好適に使用され
る。アンモニア或いはアンモニウム塩は、通常、マレイ
ン酸水溶液中の濃度が０．１〜５Ｍ／Ｌ程度となる量が
使用される。
【００２１】Ｌ−アスパラギン酸生成反応時もマレイン
酸イソメラーゼの失活を避けるため、前述の酸素制限下
の条件で反応を行うことが好ましい。かくして生成した
Ｌ−アスパラギン酸は反応液中でアンモニウム塩として
存在しているので、限外濾過膜による分離、遠心分離等
の手段により、菌体或いはその処理物と分離した後、硫
酸等電点沈澱法などの公知の方法で沈澱させ、水洗、乾
燥させることにより、結晶として採取することができ
る。
酸イソメラーゼの失活を避けるため、前述の酸素制限下
の条件で反応を行うことが好ましい。かくして生成した
Ｌ−アスパラギン酸は反応液中でアンモニウム塩として
存在しているので、限外濾過膜による分離、遠心分離等
の手段により、菌体或いはその処理物と分離した後、硫
酸等電点沈澱法などの公知の方法で沈澱させ、水洗、乾
燥させることにより、結晶として採取することができ
る。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施
例に制約されるものではない。 実施例１ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ、ＮａＣｌ：５
ｇ、マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリスIFO 13
110 菌株を植菌し、空気雰囲気で、３０℃にて２４時間
振とう培養した。また、上記と同様の培地１０００ｍｌ
を３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２
０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液３０ｍｌ
を接種し、これを空気雰囲気で３０℃にて２４時間培養
した。得られた培養液に窒素（Ｎ 2 ）を０．２ｖｖｍの
速度で通気し、３０分後、中空糸型限外濾過膜（分画分
子量２００００：日東電工製）を用いて、Ｎ2 を０．２
ｖｖｍの速度で供給しながら濃縮分離し、集菌した菌体
を以下の反応に供試した。
明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施
例に制約されるものではない。 実施例１ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ、ＮａＣｌ：５
ｇ、マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリスIFO 13
110 菌株を植菌し、空気雰囲気で、３０℃にて２４時間
振とう培養した。また、上記と同様の培地１０００ｍｌ
を３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２
０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液３０ｍｌ
を接種し、これを空気雰囲気で３０℃にて２４時間培養
した。得られた培養液に窒素（Ｎ 2 ）を０．２ｖｖｍの
速度で通気し、３０分後、中空糸型限外濾過膜（分画分
子量２００００：日東電工製）を用いて、Ｎ2 を０．２
ｖｖｍの速度で供給しながら濃縮分離し、集菌した菌体
を以下の反応に供試した。
【００２３】（２）マレイン酸水溶液からのフマル酸生
成 マレイン酸１１６ｇ、５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ及びTr
itonX-100 １ｇに水を加え全量を１０００ｍｌとしたも
のを３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、上記の菌体
（イソメラーゼ菌３０ｇ）を添加し、３０℃で２４時間
反応させた。フマル酸は６５ｇ／ｌ得られ、常法通り遠
心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフマ
ル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６２ｇであ
った。
成 マレイン酸１１６ｇ、５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ及びTr
itonX-100 １ｇに水を加え全量を１０００ｍｌとしたも
のを３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、上記の菌体
（イソメラーゼ菌３０ｇ）を添加し、３０℃で２４時間
反応させた。フマル酸は６５ｇ／ｌ得られ、常法通り遠
心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフマ
ル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６２ｇであ
った。
【００２４】実施例２ マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養は実
施例１と同様に実施した。得られた培養液にアルゴン
（Ａｒ）を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中
空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工
製）を用いて、Ａｒを０．２ｖｖｍの速度で供給しなが
ら濃縮分離して集菌した菌体を実施例１と同じ条件でマ
レイン酸の異性化反応に供試した。３０℃で２４時間反
応させた結果、フマル酸は６４ｇ／ｌ得られ、常法通り
遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフ
マル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６１ｇで
あった。
施例１と同様に実施した。得られた培養液にアルゴン
（Ａｒ）を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中
空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工
製）を用いて、Ａｒを０．２ｖｖｍの速度で供給しなが
ら濃縮分離して集菌した菌体を実施例１と同じ条件でマ
レイン酸の異性化反応に供試した。３０℃で２４時間反
応させた結果、フマル酸は６４ｇ／ｌ得られ、常法通り
遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフ
マル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６１ｇで
あった。
【００２５】実施例３ マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養は実
施例１と同様に実施した。得られた培養液にヘリウム
（Ｈｅ）を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中
空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工
製）を用いて、Ｈｅを０．２ｖｖｍの速度で供給しなが
ら濃縮分離して集菌した菌体を、実施例１と同じ条件で
マレイン酸の異性化反応に供試した。３０℃で２４時間
反応させた結果、フマル酸は６４ｇ／ｌ得られ、常法通
り遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることにより
フマル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６１ｇ
であった。
施例１と同様に実施した。得られた培養液にヘリウム
（Ｈｅ）を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中
空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工
製）を用いて、Ｈｅを０．２ｖｖｍの速度で供給しなが
ら濃縮分離して集菌した菌体を、実施例１と同じ条件で
マレイン酸の異性化反応に供試した。３０℃で２４時間
反応させた結果、フマル酸は６４ｇ／ｌ得られ、常法通
り遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることにより
フマル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６１ｇ
であった。
【００２６】比較例１ マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養は実
施例１と同様に実施した。得られた培養液を直ちに、中
空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工
製）を用いて、濃縮分離して集菌した菌体を、実施例１
と同じ条件でマレイン酸の異性化反応に供試した。３０
℃で２４時間反応させた結果、フマル酸は４４ｇ／ｌ得
られ、常法通り遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げ
ることによりフマル酸を沈澱させた。得られたフマル酸
結晶は４１ｇであった。
施例１と同様に実施した。得られた培養液を直ちに、中
空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工
製）を用いて、濃縮分離して集菌した菌体を、実施例１
と同じ条件でマレイン酸の異性化反応に供試した。３０
℃で２４時間反応させた結果、フマル酸は４４ｇ／ｌ得
られ、常法通り遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げ
ることによりフマル酸を沈澱させた。得られたフマル酸
結晶は４１ｇであった。
【００２７】実施例４ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ、ＮａＣｌ：５
ｇ、マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリスIFO 12
669 菌株を植菌し、空気雰囲気で、３０℃にて２４時間
培養した。また、上記と同様の培地１０００ｍｌを３Ｌ
容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間
滅菌処理したものに、上記振とう培養液３０ｍｌを接種
し、これを３０℃にて２４時間培養した。得られた培養
液にＮ2 を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中
空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工
製）を用いて、Ｎ2 を０．２ｖｖｍの速度で供給しなが
ら濃縮分離して集菌した菌体を、以下の前処理に供試し
た。
養 肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ、ＮａＣｌ：５
ｇ、マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性
ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリスIFO 12
669 菌株を植菌し、空気雰囲気で、３０℃にて２４時間
培養した。また、上記と同様の培地１０００ｍｌを３Ｌ
容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間
滅菌処理したものに、上記振とう培養液３０ｍｌを接種
し、これを３０℃にて２４時間培養した。得られた培養
液にＮ2 を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中
空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工
製）を用いて、Ｎ2 を０．２ｖｖｍの速度で供給しなが
ら濃縮分離して集菌した菌体を、以下の前処理に供試し
た。
【００２８】（２）マレイン酸イソメラーゼ活性を有す
る微生物の前処理（リンゴ酸副生活性の除去） アスパラギン酸１００ｇ、アンモニア：１８０ｍｌ、塩
化カルシウム：２．２ｇ、Tween20 ：０．８ｇ（水で全
量１Ｌとする）よりなる組成液に３０分間Ｎ2を吹き込
みながら攪拌し、その後（１）で得られた集菌体を懸濁
し、Ｎ2 を０．０２ｖｖｍの速度で供給して攪拌し、Ｎ
2 シール下で４５℃、３時間インキュベートした。次い
で遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌体
を回収した。
る微生物の前処理（リンゴ酸副生活性の除去） アスパラギン酸１００ｇ、アンモニア：１８０ｍｌ、塩
化カルシウム：２．２ｇ、Tween20 ：０．８ｇ（水で全
量１Ｌとする）よりなる組成液に３０分間Ｎ2を吹き込
みながら攪拌し、その後（１）で得られた集菌体を懸濁
し、Ｎ2 を０．０２ｖｖｍの速度で供給して攪拌し、Ｎ
2 シール下で４５℃、３時間インキュベートした。次い
で遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌体
を回収した。
【００２９】（３）マレイン酸水溶液からのフマル酸生
成 マレイン酸１１６ｇ、５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ及びTr
itonX-100 １ｇに水を加え全量を１０００ｍｌとしたも
のを３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、回収した菌
体（イソメラーゼ菌３０ｇ）を添加し、３０℃で２４時
間反応させた。フマル酸は７４ｇ／ｌ得られ、常法通り
遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフ
マル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６９ｇで
あった。
成 マレイン酸１１６ｇ、５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ及びTr
itonX-100 １ｇに水を加え全量を１０００ｍｌとしたも
のを３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、回収した菌
体（イソメラーゼ菌３０ｇ）を添加し、３０℃で２４時
間反応させた。フマル酸は７４ｇ／ｌ得られ、常法通り
遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフ
マル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６９ｇで
あった。
【００３０】比較例２ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養及び菌体分離は実施例４と同様に実施した。 （２）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の前
処理 回収した菌体は、夾雑するリンゴ酸副生活性を以下の前
処理方法で除いた。すなわち、アスパラギン酸：１００
ｇ、アンモニア：１８０ｍｌ、塩化カルシウム：２．２
ｇ、Tween20 ：０．８ｇ（水で全量１Ｌとする）よりな
る組成液にＮ2を吹き込まずに集菌体を懸濁し、反応器
をシールすることなく４５℃、３時間インキュベートし
た。次いで遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）
して菌体を回収し、実施例４と同じ条件でマレイン酸の
異性化反応に供試した。３０℃で２４時間反応させた結
果、フマル酸は４９ｇ／ｌ得られ、常法通り遠心分離
後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を
沈澱させた。得られたフマル酸結晶は４５ｇであった。
養及び菌体分離は実施例４と同様に実施した。 （２）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の前
処理 回収した菌体は、夾雑するリンゴ酸副生活性を以下の前
処理方法で除いた。すなわち、アスパラギン酸：１００
ｇ、アンモニア：１８０ｍｌ、塩化カルシウム：２．２
ｇ、Tween20 ：０．８ｇ（水で全量１Ｌとする）よりな
る組成液にＮ2を吹き込まずに集菌体を懸濁し、反応器
をシールすることなく４５℃、３時間インキュベートし
た。次いで遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）
して菌体を回収し、実施例４と同じ条件でマレイン酸の
異性化反応に供試した。３０℃で２４時間反応させた結
果、フマル酸は４９ｇ／ｌ得られ、常法通り遠心分離
後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を
沈澱させた。得られたフマル酸結晶は４５ｇであった。
【００３１】実施例５ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養及び菌体の分離は実施例１と同様に実施した。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養 尿素：４ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：１４ｇ、ＫＨ2 ＰＯ
4 ：０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 ０：２０ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：
２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１
ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ
６．６）からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角
フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したも
のに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブ
レビバクテリウム フラバムAB-41 菌株を植菌し、３３
℃にて２４時間振とう培養した。
養及び菌体の分離は実施例１と同様に実施した。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養 尿素：４ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：１４ｇ、ＫＨ2 ＰＯ
4 ：０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 ０：２０ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：
２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１
ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ
６．６）からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角
フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したも
のに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブ
レビバクテリウム フラバムAB-41 菌株を植菌し、３３
℃にて２４時間振とう培養した。
【００３２】また、上記と同様の培地１０００ｍｌを２
Ｌ容のジャーファーメンターに入れ，１２０℃、２０分
間滅菌処理したものに、上記振とう培養液２０ｍｌと滅
菌済み５０％グルコース水溶液２００ｍｌを加え、これ
を３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心
分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した。
本菌体は、夾雑するリンゴ酸副生活性を以下の方法で除
いた。すなわち、アスパラギン酸：１００ｇ、アンモニ
ア：１８０ｍｌ、塩化カルシウム：２．２ｇ、Tween20
：０．８ｇ（水で全量１Ｌとする）よりなる組成液に
集菌体を懸濁し、４５℃、３時間振とうし、遠心分離
（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌体を回収し
た。
Ｌ容のジャーファーメンターに入れ，１２０℃、２０分
間滅菌処理したものに、上記振とう培養液２０ｍｌと滅
菌済み５０％グルコース水溶液２００ｍｌを加え、これ
を３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心
分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した。
本菌体は、夾雑するリンゴ酸副生活性を以下の方法で除
いた。すなわち、アスパラギン酸：１００ｇ、アンモニ
ア：１８０ｍｌ、塩化カルシウム：２．２ｇ、Tween20
：０．８ｇ（水で全量１Ｌとする）よりなる組成液に
集菌体を懸濁し、４５℃、３時間振とうし、遠心分離
（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌体を回収し
た。
【００３３】（３）マレイン酸とアンモニアからのアス
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）をマレイン酸１１６ｇ、アンモニア１３２
ｍｌに水を加えて１０００ｍｌ、ｐＨ８に調整し、３Ｌ
容のジャーファーメンターに移した反応液に添加し、窒
素ガスを０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８
時間反応させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はお
おむね０．２％に維持された。反応後、遠心分離により
菌体を分離した後、生成したＬ−アスパラギン酸アンモ
ニウムに、硫酸を加えてアスパラギン酸を沈澱させ、水
洗後乾燥させ、アスパラギン酸結晶を得た。得られた結
晶は１２７ｇであった。
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）をマレイン酸１１６ｇ、アンモニア１３２
ｍｌに水を加えて１０００ｍｌ、ｐＨ８に調整し、３Ｌ
容のジャーファーメンターに移した反応液に添加し、窒
素ガスを０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８
時間反応させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はお
おむね０．２％に維持された。反応後、遠心分離により
菌体を分離した後、生成したＬ−アスパラギン酸アンモ
ニウムに、硫酸を加えてアスパラギン酸を沈澱させ、水
洗後乾燥させ、アスパラギン酸結晶を得た。得られた結
晶は１２７ｇであった。
【００３４】実施例６ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養は実施例１と同様に実施した。得られた培養液にＡｒ
を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中空糸型限
外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工製）を用い
て、Ａｒを０．２ｖｖｍの速度で供給しながら濃縮分離
して集菌した菌体を、以下の反応に供試した。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養及び菌
体の分離は実施例５と同様に実施した。
養は実施例１と同様に実施した。得られた培養液にＡｒ
を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中空糸型限
外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工製）を用い
て、Ａｒを０．２ｖｖｍの速度で供給しながら濃縮分離
して集菌した菌体を、以下の反応に供試した。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養及び菌
体の分離は実施例５と同様に実施した。
【００３５】（３）マレイン酸とアンモニアからのアス
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）を、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し
た実施例５と同じ組成の反応液に添加し、窒素ガスを
０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％に維持された。反応後、菌体を分離し、生成し
たＬ−アスパラギン酸アンモニウムに、硫酸を加えてア
スパラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギ
ン酸結晶を得た。得られた結晶は１２６ｇであった。
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）を、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し
た実施例５と同じ組成の反応液に添加し、窒素ガスを
０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％に維持された。反応後、菌体を分離し、生成し
たＬ−アスパラギン酸アンモニウムに、硫酸を加えてア
スパラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギ
ン酸結晶を得た。得られた結晶は１２６ｇであった。
【００３６】実施例７ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養は実施例１と同様に実施した。得られた培養液にＨｅ
を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中空糸型限
外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工製）を用い
て、Ｈｅを０．２ｖｖｍの速度で供給しながら濃縮分離
して集菌した菌体を、以下の反応に供試した。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養及び菌
体の分離は実施例５と同様に実施した。
養は実施例１と同様に実施した。得られた培養液にＨｅ
を０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中空糸型限
外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工製）を用い
て、Ｈｅを０．２ｖｖｍの速度で供給しながら濃縮分離
して集菌した菌体を、以下の反応に供試した。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養及び菌
体の分離は実施例５と同様に実施した。
【００３７】（３）マレイン酸とアンモニアからのアス
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）を、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し
た実施例５と同じ組成の反応液に添加し、窒素ガスを
０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％に維持された。反応後、菌体を分離し、生成し
たＬ−アスパラギン酸アンモニウムに、硫酸を加えてア
スパラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギ
ン酸結晶を得た。得られた結晶は１２７ｇであった。
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）を、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し
た実施例５と同じ組成の反応液に添加し、窒素ガスを
０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％に維持された。反応後、菌体を分離し、生成し
たＬ−アスパラギン酸アンモニウムに、硫酸を加えてア
スパラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギ
ン酸結晶を得た。得られた結晶は１２７ｇであった。
【００３８】実施例８ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養は実施例１と同様に実施した。得られた培養液に窒素
ガスを０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中空糸
型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工製）を
用いて、Ｎ2 を０．２ｖｖｍの速度で供給しながら濃縮
分離して集菌した菌体を、実施例４と同様に前処理して
夾雑するリンゴ酸副生活性を除いた。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養及び菌
体の分離は実施例５と同様に実施した。
養は実施例１と同様に実施した。得られた培養液に窒素
ガスを０．２ｖｖｍの速度で通気し、３０分後、中空糸
型限外濾過膜（分画分子量２００００：日東電工製）を
用いて、Ｎ2 を０．２ｖｖｍの速度で供給しながら濃縮
分離して集菌した菌体を、実施例４と同様に前処理して
夾雑するリンゴ酸副生活性を除いた。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養及び菌
体の分離は実施例５と同様に実施した。
【００３９】（３）マレイン酸とアンモニアからのアス
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）を、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し
た実施例５と同じ組成の反応液に添加し、窒素ガスを
０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％に維持された。反応後、菌体を分離し、生成し
たＬ−アスパラギン酸アンモニウムに硫酸を加えてアス
パラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギン
酸結晶を得た。得られた結晶は１３０ｇであった。
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）を、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し
た実施例５と同じ組成の反応液に添加し、窒素ガスを
０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％に維持された。反応後、菌体を分離し、生成し
たＬ−アスパラギン酸アンモニウムに硫酸を加えてアス
パラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギン
酸結晶を得た。得られた結晶は１３０ｇであった。
【００４０】比較例３ （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養は実施例１と同様に実施した。得られた培養液をその
まま、中空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日
東電工製）を用いて、濃縮分離して集菌した菌体を、比
較例２と同様に前処理して夾雑するリンゴ酸副生活性を
除いた。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養及び菌
体の分離は実施例５と同様に実施した。
養は実施例１と同様に実施した。得られた培養液をその
まま、中空糸型限外濾過膜（分画分子量２００００：日
東電工製）を用いて、濃縮分離して集菌した菌体を、比
較例２と同様に前処理して夾雑するリンゴ酸副生活性を
除いた。 （２）アスパルターゼ活性を有する微生物の培養及び菌
体の分離は実施例５と同様に実施した。
【００４１】（３）マレイン酸とアンモニアからのアス
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）を、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し
た実施例５と同じ組成の反応液に添加し、窒素ガスを
０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％に維持された。反応後、菌体を分離し、生成し
たＬ−アスパラギン酸アンモニウムに硫酸を加えてアス
パラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギン
酸結晶を得た。得られた結晶は７５ｇであった。
パラギン酸生成 回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルター
ゼ菌６０ｇ）を、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し
た実施例５と同じ組成の反応液に添加し、窒素ガスを
０．２ｖｖｍの速度で流しながら３０℃で４８時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％に維持された。反応後、菌体を分離し、生成し
たＬ−アスパラギン酸アンモニウムに硫酸を加えてアス
パラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギン
酸結晶を得た。得られた結晶は７５ｇであった。
【００４２】
【発明の効果】本発明の製造法によれば、特殊な製造装
置等を用いることなく、効率よく、かつ高収率でマレイ
ン酸を原料としてフマル酸またはＬ−アスパラギン酸を
製造することができる。
置等を用いることなく、効率よく、かつ高収率でマレイ
ン酸を原料としてフマル酸またはＬ−アスパラギン酸を
製造することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８−３−１ 三菱 化学株式会社筑波研究所内
Claims (20)
- 【請求項１】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
生物を培養して得られるマレイン酸イソメラーゼにより
マレイン酸を異性化してフマル酸を製造する方法におい
て、培養液からマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
生物菌体を分離し異性化反応に供するまでの工程の少な
くとも一部を酸素制限下で行うことを特徴とするフマル
酸の製造法。 - 【請求項２】 培養液からマレイン酸イソメラーゼ活性
を有する微生物菌体を分離する工程を、酸素制限下で行
うことを特徴とする請求項１記載のフマル酸の製造法。 - 【請求項３】 培養液から分離されたマレイン酸イソメ
ラーゼ活性を有する微生物菌体を酸素制限下で前処理
し、異性化反応に供することを特徴とする請求項１記載
のフマル酸の製造法。 - 【請求項４】 培養液から菌体を分離する工程及び前処
理を行う工程を酸素制限下で行うことを特徴とする請求
項１記載のフマル酸の製造法。 - 【請求項５】 前処理が、培養液から分離された菌体か
らマレイン酸イソメラーゼの少なくとも一部を分離する
処理であることを特徴とする請求項３または４記載のフ
マル酸の製造法。 - 【請求項６】 前処理が、マレイン酸イソメラーゼ活性
を有する微生物を、アスパラギン酸を含有するアルカリ
性水溶液中で、加熱する処理であることを特徴とする請
求項３または４記載のフマル酸の製造法。 - 【請求項７】 前処理が、マレイン酸イソメラーゼ活性
を有する微生物を少なくとも０．０１〜１重量／容量％
の界面活性剤を含有するアルカリ性水溶液と接触させる
処理であることを特徴とする請求項３または４記載のフ
マル酸の製造法。 - 【請求項８】 菌体の接する水性媒体または雰囲気を不
活性ガス置換により酸素制限することを特徴とする請求
項１〜７のいずれか１項に記載のフマル酸の製造法。 - 【請求項９】 不活性ガスが窒素、二酸化炭素、アルゴ
ン、ヘリウムから選ばれることを特徴とする請求項８記
載のフマル酸の製造法。 - 【請求項１０】 菌体の接する水性媒体または雰囲気を
脱気することにより酸素制限することを特徴とする請求
項１〜７のいずれか１項に記載のフマル酸の製造法。 - 【請求項１１】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する
微生物を培養して得られるマレイン酸イソメラーゼ及び
アスパルターゼ活性を有する微生物を培養して得られる
アスパルターゼの存在下、マレイン酸もしくは無水マレ
イン酸またはマレイン酸塩と、アンモニアまたはアンモ
ニウム塩を反応させてＬ−アスパラギン酸を製造する方
法において、培養液からマレイン酸イソメラーゼ活性を
有する微生物菌体を分離し、反応に供するまでの工程の
少なくとも一部を酸素制限下で行うことを特徴とするＬ
−アスパラギン酸の製造法。 - 【請求項１２】 培養液からマレイン酸イソメラーゼ活
性を有する微生物菌体を分離する工程を、酸素制限下で
行うことを特徴とする請求項１１記載のＬ−アスパラギ
ン酸の製造法。 - 【請求項１３】 培養液から分離されたマレイン酸イソ
メラーゼ活性を有する微生物菌体を酸素制限下で前処理
し、反応に供することを特徴とする請求項１１記載のＬ
−アスパラギン酸の製造法。 - 【請求項１４】 培養液から菌体を分離する工程及び前
処理を行う工程を酸素制限下で行うことを特徴とする請
求項１１記載のＬ−アスパラギン酸の製造法。 - 【請求項１５】 前処理が、培養液から分離された菌体
からマレイン酸イソメラーゼの少なくとも一部を分離す
る処理であることを特徴とする請求項１３または１４記
載のＬ−アスパラギン酸の製造法。 - 【請求項１６】 前処理が、マレイン酸イソメラーゼ活
性を有する微生物を、アスパラギン酸を含有するアルカ
リ性水溶液中で、加熱する処理であることを特徴とする
請求項１３または１４記載のＬ−アスパラギン酸の製造
法。 - 【請求項１７】 前処理が、マレイン酸イソメラーゼ活
性を有する微生物を少なくとも０．０１〜１重量／容量
％の界面活性剤を含有するアルカリ性水溶液と接触させ
る処理であることを特徴とする請求項１３または１４記
載のＬ−アスパラギン酸の製造法。 - 【請求項１８】 菌体の接する水性媒体または雰囲気を
不活性ガス置換により酸素制限することを特徴とする請
求項１１乃至１７のいずれか１項に記載のＬ−アスパラ
ギン酸の製造法。 - 【請求項１９】 不活性ガスが窒素、二酸化炭素、アル
ゴン、ヘリウムから選ばれることを特徴とする請求項１
８記載のＬ−アスパラギン酸の製造法。 - 【請求項２０】 菌体の接する水性媒体または雰囲気を
脱気することにより酸素制限することを特徴とする請求
項１１乃至１７のいずれか１項に記載のＬ−アスパラギ
ン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12708797A JPH1052288A (ja) | 1996-05-22 | 1997-05-16 | フマル酸またはｌ−アスパラギン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-127198 | 1996-05-22 | ||
| JP12719896 | 1996-05-22 | ||
| JP12708797A JPH1052288A (ja) | 1996-05-22 | 1997-05-16 | フマル酸またはｌ−アスパラギン酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1052288A true JPH1052288A (ja) | 1998-02-24 |
Family
ID=26463121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12708797A Withdrawn JPH1052288A (ja) | 1996-05-22 | 1997-05-16 | フマル酸またはｌ−アスパラギン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1052288A (ja) |
-
1997
- 1997-05-16 JP JP12708797A patent/JPH1052288A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20040218 |