JPH09510363A - 非タンパク質プロテアーゼ抑制剤を使用するプロテアーゼ酵素の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 製造工程中に、約１ｘ１０^-4未満のＫｉを有する、ある種の非タンパク質性の溶解したプロテアーゼ抑制剤を使用することを含んでなる、プロテアーゼ酵素の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】 非タンパク質プロテアーゼ抑制剤を使用する プロテアーゼ酵素の製造 本発明は、製造工程中に、約１ｘ１０^-4未満のＫｉを有する、ある種の非タン パク質性の溶解したプロテアーゼ抑制剤を使用することを含んでなる、プロテア ーゼ酵素の製造法に関する。 発明の背景 プロテアーゼ含有洗剤組成物は良く知られている。また、その様な組成物の問 題点は、これらの組成物中に存在する第二の酵素、例えばリパーゼ、セルラーゼ 、アミラーゼ、およびその他、ならびにプロテアーゼ自体も、プロテアーゼによ り分解されることであることも知られている。洗剤組成物におけるこの問題を解 決するために、その様な組成物中にプロテアーゼ抑制剤を使用することを含む様 々な方法が研究されている。 洗浄組成物は、例えば米国特許第４，５６６，９８５号明細書、Bruno ら、１ ９８６年１月２８日公布（ベンズアミジンヒドロハライドを含有する液体洗浄組 成物）、ヨーロッパ特許公開第３７６，７０５号明細書、Cardinali ら、１９９ ０年７月４日公開（低級脂肪族アルコールおよび低級カルボン酸の塩および主と して非イオン系である界面活性剤系を使用）、ヨーロッパ特許公開第３８１，２ ６２号明細書、Aronson ら、１９９０年８月８日公開（反応し得るポリオールお よびホウ素化合物の混合物を使用）、ＷＯ９２／０３５２９明細書、Novo Nordi sk A/S、１９９２年３月５日公開（ペプチドまたはタンパク質型の可逆的プロテ アーゼ抑制剤を使用する）、ＷＯ９２／０５２３９明細書、Novo Nordisk A/S、 １９９２年４月２日公開（やはりペプチドまたはタンパク質 型の可逆的プロテアーゼ抑制剤を使用する）、ＷＯ９２／１９７０７明細書、１ ９９２年１０月３０日公開（メタ置換ボロン酸を含む液体洗剤）、米国特許第４ ，９０８，１５０号明細書、Hesselら、１９９０年３月１３日公布（特定の非イ オン系エチレングリコール含有共重合体を含む液体洗剤組成物）、ヨーロッパ特 許出願第９０／８７０２１２号明細書、１９９０年１１月１４日公開（ある種の 細菌性セリンプロテアーゼおよびリパーゼを含有液体洗剤組成物）、米国特許第 ５，１７８，７８９号明細書、Estell、１９９３年１月１２日公布（酵素と結合 する抑制剤を使用する液体洗剤）、および米国特許第５，０３９，４４６号明細 書、Estell、１９９１年８月１３日公布（特定の解離定数を有する抑制剤を使用 する液体洗剤）に記載されている。 洗剤組成物に有用なものを含むプロテアーゼ酵素の製造は文献に記載されてい る。その様なプロテアーゼ、および一般的にこれらのプロテアーゼを生産する細 菌の発酵が関与する製造法の例には、ヨーロッパ特許公開第１９９，４０４号明 細書、Venegas 、１９８６年１０月２９日公開、およびＷＯ９３／１３１２５明 細書、Novo Nordisk A/S、１９９３年７月８日公開がある。後者は、製造工程中 、液体生産媒体中で、不活性化され易いタンパク質を連続的に、および可逆的に 不活性化から保護し、タンパク質を生産媒体から分離し、タンパク質を脱保護し 、タンパク質生成物を回収する、タンパク質を微生物により製造する方法に関す る。 この方法はさらに、タンパク質を連続的に沈殿させることにより、タンパク質の 収率を増加させるのに有用であるといわれている。１箇所（１２頁）で、下記の 通り記載されている。 「下記のサブチリシンプロテアーゼに関して、この実施態様では、プロテアー ゼ抑制剤、例えばCI-1、CI-2、PSI 、Eglin B 、TSI-1 、SSI 、またはVSI 抑制 剤、これらの変形、またはこれらのいずれかの混合物、を使用してサブチリシン プロテアーゼを保護するのが好ましい」 「上記の実施態様で、当該のタンパク質、例えばプロテアーゼ、の脱保護は一 般的に、そのプロテアーゼを例えば洗浄液を製造する時に溶解させる洗剤組成物 に使用する場合、錯体を溶解させることにより行なわれる」 独国特許第、２，１３１，４５１号明細書、Nagase & Co.、１９７１年１２月 ３０日公開、にはアルカリ性プロテアーゼの製造法が記載されている。この方法 は、０．１〜１２％の水溶性ホウ酸塩を加える必要があるといわれている。その 中で（英語への翻訳で）下記の通り記載されている。 「プロテアーゼを生産する細菌の成長およびプロテアーゼの生産性は一般的に リン酸塩の添加により促進される。しかし、この場合、濾過および他の操作を極 めて困難にする高分子量の粘性化合物が副生成物として製造される。しかしここ で、水溶性のホウ酸塩、例えばホウ砂またはホウ酸、を培養基に少量加えること により、粘性化合物の形成が大幅に抑制され、同時にプロテアーゼの生産が促進 されることが分かった。アルカリ性プロテアーゼの製造でこれを行なうことによ り、濾過作用が大幅に改良され、したがって、濾過による酵素収率が大きく増加 した。この様に、「ホウ酸塩」の表現は、上記の様にホウ酸も含む。ホウ酸塩ま たはホウ酸の作用機構は完全には説明されていないが、ホウ酸塩またはホウ酸が 、アルカリ性プロテアーゼの生産に不利な影響を及ぼさずに、高分子量の粘性化 合物の形成を抑制することは確かである。」 そこでは、水溶性ホウ酸塩がプロテアーゼ自体に対して抑制効果を有するか否 かの考察や示唆はない。しかし、一定量のホウ酸塩が酵素の生産を実際に遅延さ せられることは示されている。 さらに、日本国特許公開公報平０１−２９６９８７号、１９８９年１１月３０ 日公開、にはプロテアーゼを生産できる微生物を、プロテアーゼに対する親和力 を示す物質（例えばケイ皮酸、ケイ皮酸エステル、バシトラシン、フェニルブチ ルアミン、フェニルホウ酸、アミノフェニルホウ酸、 フェニルアラニン、Ｎ−カルボベンズオキシフェニルアラニン、チロシン）を含 有する培地中で培養することを含んでなる方法が記載されている。好ましい方法 は、プロテアーゼに対する親和力を示す物質を吸着させた吸着剤（例えばシリカ 、アルミナ、Sepharose、架橋したポリメタクリレート）を含有する培地中で微 生物を培養し、吸着剤を分離し、吸着剤からプロテアーゼを回収することを含ん でなるといわれている。プロテアーゼに対する親和力を示す物質の存在下で、形 成されたプロテアーゼの自己分解を抑制しながらプロテアーゼを製造できること 、および吸着剤を使用することにより、形成されたプロテアーゼを容易に分離し 、精製できることが示されている。 酵素活性を抑制する能力の尺度として、通常は阻害定数（Ｋｉ）を使用するが 、Ｋｉが低いことはより強力な抑制剤を示す。タンパク分解酵素サブチリシンの 抑制に関する考察がPhilipp，M．およびBender，M.L.、“Kinetics of Subtilis in and Thiosubtilisin”、Molecular & Cellular Biochemistry，51,pp.5-32(1 983)に記載されている。ヨーロッパ特許出願第２９３，８８１号明細書、Kettne r ら、１９８８年１２月７日公開、には、特に製薬における、トリプシン状セリ ンプロテアーゼ、例えばトロンビン、プラズマカリクレインおよびプラズミン、 の抑制剤としてペプチドアルキルボロン酸が記載されている。 本発明により驚くべきことに、細菌からプロテアーゼ酵素を製造する発酵工程 の培地に、約１ｘ１０^-4未満のＫｉ値を有する、非タンパク質性の溶解したプロ テアーゼ抑制剤を加えることにより、製造工程が改良されることが分かった。驚 くべきことに、その様な非タンパク質性の溶解したプロテアーゼ抑制剤は、細菌 のプロテアーゼ生産能力を妨害することはない。しかし、理論に制約されること はないが、これらの抑制剤は、プロテアーゼのオートリシス（自己分解）、およ び／またはプロテアーゼの細菌自体に対する破壊および／または他の影響を制限 すると思われる。 そこで、本発明の目的は、プロテアーゼ酵素の製造法を提供することである。 さらなる目的は、その様な方法に使用する培地に溶解したプロテアーゼ酵素抑制 剤を加えることにより、プロテアーゼ酵素を製造する方法を提供することである 。もう一つの目的は、高収率および／または高純度および／またはより容易な精 製および／またはより安定したプロテアーゼ酵素および／または活性がより高い プロテアーゼ酵素が得られるプロテアーゼ酵素の製造法を提供することである。 プロテアーゼ酵素抑制剤により安定化したプロテアーゼ酵素を製造することも目 的の一つである。 本発明のこれらの、および他の目的を以下に詳細に説明する。 他に指示がない限り、百分率はすべて重量で表示し、測定はすべて２５℃で行 なう。記載する文献はその全体をここに参考として含める。 発明の概要 本発明は、製造工程に、１種またはそれより多い非タンパク質性の、溶解した 、約１ｘ１０^-4未満のＫｉ値を有するプロテアーゼ酵素抑制剤を取り入れること を含んでなる、プロテアーゼ酵素の製造法に関する。溶解したプロテアーゼ酵素 抑制剤のプロテアーゼ酵素に対するモル比が約１：１を超える様にする方法が好 ましい。好ましい方法は、Bacillus subtilisおよび／またはBacillus lichen iformis 細菌を含んでなる発酵ブロスを使用する。 発明の詳細な説明 （ａ）プロテアーゼ酵素 本発明の方法により製造されるプロテアーゼ酵素は、動物、植物または微生物 （好ましい）に由来するものでよい。セリンタンパク分解酵素が好ましい。特に 好ましいのは、Bacillus subtilisおよび／またはBacillus licheniformis か ら得られる細菌性セリンプロテアーゼ酵素である。 プロテアーゼ酵素の非限定的な例としては、Novo Industri A/S のAlcalase^R 、 Esperase^R、Savinase^R（デンマーク、コペンハーゲン）、Gist-brocades のMaxa tase^R、Maxacal^R、およびMaxapem 15^R（タンパク質処理したMaxacal^R）（オラン ダ、デルフト）、およびSigma Chemical Companyから市販されているサブチリシ ン ＢＰＮおよびＢＰＮ’がある。変性細菌性セリンプロテアーゼ、例えばヨー ロッパ特許出願第２５１，４４６号明細書、Wells ら、１９８８年１月７日公開 、に記載されている、Genencor International，Inc．（米国カルホルニア州、 サウス・サンフランシスコ）製の、ここで「プロテアーゼＢ」と呼ばれる酵素、 米国特許第５，０３０，３７８号明細書、Venegas、１９９１年７月９日公布、 に記載されている、ここで「プロテアーゼＡ」と呼ばれる変性細菌性セリンタン パク分解酵素、および「プロテアーゼ含有洗浄組成物」と題する米国特許出願第 ０８／１３６，７９７号明細書、Baeck ら、１９９３年１０月１４日提出（この 出願明細書全文をここに参考として含める）、に記載されているプロテアーゼ酵 素も好ましいプロテアーゼ酵素である。好ましいプロテアーゼ酵素は、Savinase^R 、Maxacal^R、Alcalase^R、ＢＰＮ’、プロテアーゼＡおよびＢ、ＵＳＳＮ０８／ １３６，７９７に記載されているプロテアーゼ、およびそれらの混合物からなる 群から選択される。 （ｂ）プロテアーゼ酵素抑制剤 本発明の方法は、溶解したプロテアーゼ酵素抑制剤を与えるために、発酵ブロ ス（aka、培地）中に、１種またはそれより多い非タンパク質性の、溶解した、 約１ｘ１０^-4未満のＫｉ値を有するプロテアーゼ酵素抑制剤の存在を必要とする 。溶解したプロテアーゼ酵素抑制剤のプロテアーゼ酵素に対するモル比は好まし くは約１：１を超え、より好ましくは約２：１を超え、最も好ましくは約２：１ 〜約１０：１の範囲内である（この範囲は、発酵工程の最後に存在するプロテア ーゼ酵素の量に基づいている）。ここで使用する用語「非タンパク質性の、溶解 したプロテアーゼ酵素抑制剤」は、すべての非タンパク質系の、発酵ブロス中に 溶 解し得る（全体的または部分的に）、製造されているプロテアーゼ酵素のタンパ ク分解活性の可逆的抑制剤を意味し、ペプチド系の抑制剤に関しては、その様な 抑制剤のどれもが約１０を超えるアミノ酸単位を含まない。 好ましい抑制剤は、Ｋｉが約１ｘ１０^-4未満、より好ましくは約１ｘ１０^-5未 満、最も好ましくは約１ｘ１０^-6未満、である抑制剤である。Ｋｉ値は、公知の 手順により測定される。例えば、プロテアーゼサブチリシンＢＰＮ’の潜在的抑 制剤は、サブチリシンＢＰＮ’と類似のプロテアーゼであるキモトリプシンに関 してDelMarにより記載されている様に、それらの、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ −Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドの加水分解を抑制する能力に基づいて評 価される［DelMarら、Analytical Biochemistry(1979)99，316-320］。スクシニ ル-Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ-ニトロアニリドおよび抑制剤を、 １７体積％のジメチルスルホキシドを含む緩衝水溶液（pH８．６）に加える。 既知量のサブチリシンＢＰＮ’を導入することにより測定を開始し、２５℃で分 光測光により監視する。ミハエリス−メンテンの条件に従う速度をLineweaverお よびBurkの方法により分析し、抑制剤結合定数Ｋｉを決定する［Biochemistry T hird Edition(1988)、Lubert Stryer 著、W.H. Freeman and Company, pp187-19 5］。 ここで使用する用語「可逆的抑制剤」とは、例えばここに全文を参考として含 める、Mahlerら、“Biological Chemistry，Second Edition”（Harper & Rowに より１９７１年に出版）、２９５〜２９９頁、に詳細に記載されている様な拮抗 的、非拮抗的(noncompetitive)およびuncompetitive 抑制剤を含む（ただしこれ らに限定されない）、プロテアーゼ酵素から放出することにより、タンパク分解 活性を回復することができるプロテアーゼ抑制剤を意味する。 製造するプロテアーゼ酵素に応じて、該プロテアーゼを可逆的に抑制すること に関して他の抑制剤よりも効果的なプロテアーゼ酵素抑制剤を選択することがで きる。既存のプロテアーゼは、トリプシン、サブチリシン、キモトリプシンおよ びエラスターゼ型プロテアーゼに分類することができ、その様な個々の酵素の製 造に使用されるプロテアーゼ酵素抑制剤は、製造される酵素のこれらの型のそれ ぞれに応じて適切に選択することができる。 ここで使用するのに好ましいプロテアーゼ酵素抑制剤には、ボロン酸化合物、 ペプチドアルデヒド化合物、ペプチドボロン酸化合物、ペプチドトリフルオロメ チルケトン化合物、およびそれらの混合物がある。好ましくは２〜約１０個、よ り好ましくは２〜約５個、のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体（例えばペ プチドアルデヒド化合物ではアルデヒド部分に、ペプチドトリフルオロメチルケ トン化合物ではトリフルオロメチルケトン部分に、およびペプチドボロン酸化合 物ではボロン酸含有部分に誘導されたカルボン酸末端）を含んでなるペプチドボ ロン酸化合物、ペプチドアルデヒド化合物、およびそれらの混合物が好ましい化 合物である。これらの化合物は、例えば、すべてここにその全文を参考として含 める、すべてThe Procter & Gamble Companyにより１９９４年３月３日に公開さ れたＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９４／０４６５１Ｅ、ＷＯ９４／０４６５２Ｅ、Ｗ Ｏ９４／０４６５３、ＷＯ９４／０４５４２、ＷＯ９４／０４５４３、ＷＯ９４ ／０４６５４各明細書、および１９９３年１１月５日にPanandikerおよびBjorkq uistにより提出された米国特許出願第０８／１４９，１７１号明細書に記載され ている。 ここで使用する用語「ペプチドアルデヒド」とは、ペプチド鎖を含んでなり、 該鎖のＣ末端がカルボキシル基からアルデヒド基に転化されている化合物を意味 する。ペプチドアルデヒドならびにそれらの製造法は、例えば、ここにその全文 を参考として含める、The Procter & Gamble Companyにより１９９４年３月３日 に公開されたＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９４／０４６５１Ｅ明細書に記載されてい る。ここで使用するのに好ましいペプチドアルデヒドは、２〜６個、最も好まし くは３ないし４個、のアミノ酸（アルデヒドに誘導された単位を含む）を含んで なる。 ペプチドアルデヒドとしては、例えば、Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＬｙｓＨ、Ｉｌｅ− Ｐｈｅ−ＬｙｓＨ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＡｒｇＨ、Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＡｒｇＨ、Ｌ ｙｓ−Ａｌａ−ＡｌａＨ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＰｒｏＨ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ Ｈ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＰｈｅＨ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＰｈｅＨ、Ｐｈｅ− Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＬｅｕＨ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｈ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐ ｈｅＨ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＴｙｒＨ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＶａｌＨおよびＡｌａ− Ｖａｌ−ＬｅｕＨ、がある。ここで使用するのに好ましいペプチドは、Ｌｙｓ− Ａｌａ−ＡｌａＨ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＰｒｏＨ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＬｅｕＨ、Ｇ ｌｙ−Ａｌａ−ＰｈｅＨ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＰｈｅＨ、およびＰｈｅ− Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＬｅｕＨである。Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＬｅｕＨが特に好 ましい。ここに記載するペプチドアルデヒドはすべて、好ましくはそれらのカル バミン酸メチルまたはメチル尿素Ｎ−末端保護された形態で使用する。 ここで使用する用語「ペプチドボロン酸」とは、ペプチド鎖を含んでなり、該 鎖のＣ末端がカルボキシル基からボロン酸含有基に転化されている化合物を意味 する。ペプチドボロン酸化合物ならびにそれらの製造法は、例えば、すべてここ にその全文を参考として含める、The Procter & Gamble Companyにより１９９４ 年３月３日に公開されたＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９４／０４５４２、ＷＯ９４／ ０４５４３、ＷＯ９４／０４６５４、およびＷＯ９４／０４６５３各明細書に記 載されている。ここで使用するのに好ましいペプチドボロン酸化合物は、２〜６ 個、最も好ましくは３ないし４個、のアミノ酸単位（ボロン酸に誘導された単位 を含む）を含んでなる。 ここで使用する用語「ペプチドトリフルオロメチルケトン」とは、ペプチド鎖 を含んでなり、該鎖のＣ末端がカルボキシル基からトリフルオロメチルケトン基 に転化されている化合物を意味する。ペプチドトリフルオロメチルケトン化合物 ならびにそれらの製造法は、例えば、ここにその全文を参考として含める、The Procter & Gamble Companyにより１９９４年３月３日に公開されたＰＣＴ特許公 開番号ＷＯ９４／０４６５２Ｅ明細書に記載されている。ここで使用するのに好 ましいペプチドトリフルオロメチルケトン化合物は、２〜６個、最も好ましくは ３ないし４個、のアミノ酸単位（トリフルオロメチルケトンに誘導された単位を 含む）を含んでなる。 ペプチドアルデヒド、ペプチドトリフルオロメチルケトン、およびペプチドボ ロン酸化合物中の該ペプチド鎖のＮ末端は、この分野で公知の適当な保護基によ り保護することができる。しかし、好ましい化合物は、カルバミン酸メチル（Ｃ Ｈ₃Ｏ−（Ｏ）Ｃ−）またはメチル尿素（ＣＨ₃Ｎ−（Ｏ）Ｃ−）基により保護さ れたペプチド鎖のＮ末端を有する。 例としては下記の化合物（サブチリシンＢＰＮ’に対するＫｉ値を示す）があ るが、これらに限定するものではない。化合物 Ｋ_i（Ｍ） １）ボロン酸化合物 ２）ペプチドボロン酸化合物 ３）ペプチドアルデヒド化合物 （ｃ）製造法 本発明の方法は、製造工程に、１種またはそれより多い非タンパク質性の、溶 解した、約１ｘ１０^-4未満のＫｉ値を有するプロテアーゼ酵素抑制剤を取り入れ ることを含んでなる、プロテアーゼ酵素の製造法である。本発明によりその様な プロテアーゼ酵素抑制剤を加えることができるプロテアーゼ酵素の製造法は、一 般的に発酵ブロスを使用してプロテアーゼ酵素を製造し、続いて一つまたはそれ より多い精製工程によりプロテアーゼ酵素を分離する。 ここで好ましい方法は、栄養媒体中におけるBacillus subtilisおよび／また はBacillus licheniformis 細菌の発酵を利用し、非タンパク質性の、溶解した 、約１ｘ１０^-4未満のＫｉ値を有するプロテアーゼ酵素抑制剤を含んでなる。ま た、発酵ブロス中、およびその後で（発酵ブロスから持ち越すことにより、およ び／または別に加えることにより）酵素の精製工程中の両方にプロテアーゼ抑制 剤を、含むのが好ましい。しかし、本発明の方法はプロテアーゼ酵素抑制剤を、 発酵工程中においてのみ、または発酵工程と他の製造工程のすべてにおいて使用 することができる。 本発明のプロテアーゼ酵素の製造法は、 （ａ）１種またはそれより多い非タンパク質性の、溶解した、約１ｘ１０^-4Ｍ未 満のＫｉを有するプロテアーゼ酵素抑制剤を含んでなる発酵ブロス中でプロテア ーゼ酵素を成長させること、および （ｂ）必要に応じて非タンパク質性の、溶解した、約１ｘ１０^-4未満のＫｉ値を 有するプロテアーゼ酵素抑制剤をさらに加え、工程（ａ）で製造されたプロテア ーゼ酵素を一つまたはそれより多い工程により精製し、プロテアーゼ酵素を濃縮 すること、 を含んでなる。より好ましい方法では、１種またはそれより多い溶解したプロテ アーゼ酵素抑制剤を、工程（ａ）または工程（ａ）および（ｂ）に、プロテアー ゼ酵素抑制剤のプロテアーゼ酵素に対するモル比が少なくとも約１：１になる様 に加える。 好ましい方法では、工程（ａ）の発酵ブロスにBacillus subtilisを使用して プロテアーゼ酵素を製造する。また、好ましい方法は、発酵ブロス中にプロテア ーゼ酵素抑制剤も取り入れることからなる。一般的に、（抑制剤濃度が増加する 場合）プロテアーゼ酵素を濃縮する前の、発酵工程におけるプロテアーゼ酵素抑 制剤濃度は約０．１mM未満、好ましくは約０．０５mM未満、であるのが望ましい 。また一般的に、プロテアーゼ酵素抑制剤は、最終的なプロテアーゼ酵素収量に 対して少なくとも約１：１、好ましくは少なくとも約２：１、最も好ましくは約 ２：１〜約１０：１、のモル比で使用するのが望ましい。また、プロテアーゼ酵 素抑制剤は、精製工程中に、プロテアーゼ酵素を濃縮する前に、典型的には約０ ．１mM未満（より好ましくは約０．０５mM未満）の濃度で存在するのが好ましい 。 また、本発明の方法により製造される、プロテアーゼ酵素抑制剤を含んでなる 乾燥または濃縮液体の形態におけるプロテアーゼ酵素の製造も好ましい。 （ｄ）洗剤組成物 有効量の、本発明により製造される１種またはそれより多いプロテアーゼ酵素 を、タンパク質系の汚れを除去する必要がある様々な表面を洗浄するのに有用な 組成物に配合する。その様な洗浄組成物には、硬質表面を洗浄するための、形態 において制限されていない（例えば液体および顆粒）洗剤組成物、織物を洗浄す るための、形態において制限されていない（例えば顆粒、液体およびバー処方） 洗剤組成物、食器洗い組成物（形態において制限されていない）、口内洗浄用の 、形態において制限されていない（例えば粉歯磨、練り歯磨および口内洗浄組成 物）組成物、入歯洗浄用の、形態において制限されていない（例えば液体、錠剤 ）組成物、およびコンタクトレンズ洗浄用の、形態において制限されていない（ 例えば液体、錠剤）組成物、がある。ここで使用する「有効量のプロテアーゼ酵 素」とは、特定の洗浄組成物で必要な酵素活性を達成するのに要するプロテアー ゼ酵素の量を意味する。その様な有効量は、当業者なら容易に確定することがで き、多くのファクター、例えば使用する特定の酵素、洗浄用途、洗浄組成物の特 定の組成、および液体または乾燥（例えば顆粒、バー）組成物が必要であるか、 およびその他により異なる。好ましくは、本発明の洗浄組成物は、約０．０００ １％〜約１０％の、より好ましくは約０．００１％〜約１％の、さらに好ましく は約０．０１％〜約０．１％の、１種またはそれより多いプロテアーゼ酵素を含 んでなる。本発明により製造されたプロテアーゼ酵素を使用できる様々な洗浄組 成物の幾つかの例を以下に詳細に説明する。他に指示がない限り、ここで使用す る部数、百分率および比率は重量で表示する。 ここで使用する「非布地洗浄組成物」には、硬質表面洗浄組成物、食器洗浄組 成物、口内洗浄組成物、入歯洗浄組成物およびコンタクトレンズ洗浄組成物があ る。 Ａ．硬質表面、食器および布地用洗浄組成物 本発明により製造されるプロテアーゼ酵素は、多くの洗剤組成物に使用できる 。例えば、本発明により製造したプロテアーゼ酵素は、様々な通常の成分と共に 使 用し、十分に処方された硬質表面洗浄剤、食器洗浄組成物、布地洗浄組成物、等 を製造することができる。その様な組成物は、液体、顆粒、バー、およびその他 の形態でよい。その様な組成物は、３０〜６０重量％もの界面活性剤を含有する 最近の「濃縮」洗剤として処方することができる。 本発明の洗浄組成物は、必要に応じて、および好ましくは、様々な陰イオン系 、非イオン系、双生イオン系、およびその他の界面活性剤を含有することができ る。その様な界面活性剤は、一般的に組成物の約５％〜３５％の量で存在する。 ここで有用な界面活性剤の例としては、通常のＣ₁₁〜Ｃ₁₈アルキルベンゼンス ルホネートおよび第１級およびランダムアルキルサルフェート、式ＣＨ₃（ＣＨ₂ ）ｘ（ＣＨＯＳＯ₃）^-Ｍ⁺）ＣＨ₃およびＣＨ₃（ＣＨ₂）ｙ（ＣＨＯＳＯ₃ ^-Ｍ⁺） ＣＨ₂ＣＨ₃（式中、ｘおよび（ｙ＋１）は少なくとも約７、好ましくは少なくと も約９、の整数であり、Ｍは水溶性付与陽イオン、特にナトリウム、である）の Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈第２級（２，３）アルキルサルフェート、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈アルキルアルコ キシサルフェート（特にＥＯ 1-5エトキシサルフェート）、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈アルキル アルコキシカルボキシレート（特にＥＯ 1-5エトキシカルボキシレート）、Ｃ₁₀ 〜Ｃ₁₈アルキルポリグリコシド、およびそれらの対応する硫酸化ポリグリコシド 、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈アルファ−スルホン化脂肪酸エステル、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈アルキルおよび アルキルフェノールアルコキシレート（特にエトキシレートおよび混合エトキシ ／プロポキシ）、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈ベタインおよびスルホベタイン（「サルタイン」） 、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈アミンオキシド、およびその他がある。アルキルアルコキシサルフ ェート（ＡＥＳ）およびアルキルアルコキシドカルボキシレート（ＡＥＣ）がこ こでは好ましい。（処方者の必要に応じて、その様な界面活性剤を上記のアミン オキシドおよび／またはベタインまたはサルタイン界面活性剤と組み合わせて使 用することも好ましい）他の通常の有用な界面活性剤は、標準書に記載されてい る。特に有用な界面活性剤には、ここに参考として含 める米国特許第５，１９４，６３９号明細書、Connorら、１９９３年３月１６日 公布、に記載されているＣ₁₀〜Ｃ₁₈Ｎ−メチルグルカミドがある。 他の活性成分、キャリヤー、ヒドロトロピー剤、処理助剤、染料または顔料、 液体処方用の溶剤、およびその他、を包含する、洗剤洗浄組成物に有用な非常に 様々な他の成分を本発明の組成物に含ませることができる。起泡性をさらに強化 したい場合、起泡促進剤、例えばＣ₁₀〜Ｃ₁₆アルコールアミド、を組成物に、一 般的に約１％〜約１０％の量で配合することができる。Ｃ₁₀〜Ｃ₁₄モノエタノー ルおよびジエタノールアミドはその様な起泡促進剤を代表する物質である。その 様な起泡促進剤を、高起泡性補助界面活性剤、例えば上記のアミンオキシド、ベ タインおよびサルタイン、と共に使用するのも有利である。必要に応じて、可溶 性マグネシウム塩、例えばＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄、およびその他を、一般的に約 ０．１％〜約２％の量で加え、さらに発泡させることもできる。 ここで液体洗剤組成物は、キャリヤーとして水および他の溶剤を含むこともで きる。メタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロパノールにより 代表される、低分子量の第１級または第２級アルコールが適当である。界面活性 剤を可溶化するには１価アルコールが好ましいが、ポリオール、例えば約２〜約 ６個の炭素原子および約２〜約６個の水酸基を含むポリオール（例えば１，３− プロパンジオール、エチレングリコール、グリセリン、および１，２−プロパン ジオール）も使用できる。組成物は約５％〜約９０％、一般的に約１０％〜約５ ０％、のその様なキャリヤーを含むことができる。 本発明の洗剤組成物は、水性洗浄作業に使用する際に、洗浄水のpHが約６．８ 〜約１１．０になる様に配合するのが好ましい。したがって、最終製品は一般的 にこの範囲で処方する。推奨される使用水準でpHを調整する技術には、緩衝液、 アルカリ、酸、およびその他の使用があり、当業者には良く知られている。 硬質表面洗浄組成物および布地洗浄組成物を処方する場合、処方者は、各種の ビルダーを約５〜約５０重量％の量で使用することができる。代表的なビルダー としては、１〜１０ミクロンのゼオライト、ポリカルボキシレート、例えばシト レートおよびオキシジサクシネート、層状ケイ酸塩、リン酸塩、およびその他が ある。他の通常のビルダーは標準的な処方集に記載されている。 同様に、処方者は、その様な組成物に、各種の追加酵素、例えばセルラーゼ、 リパーゼ、アミラーゼ、および本発明の方法により製造されたのではないプロテ アーゼ、を、一般的に約０．００１〜約１重量％の量で使用することができる。 洗濯洗剤分野では各種の洗剤用および布地用の酵素が良く知られている。 その様な組成物には、各種の漂白化合物、例えば過炭酸塩、過ホウ酸塩、等を 一般的に約１〜約１５重量％の量で使用することができる。必要に応じて、その 様な組成物は、やはりこの分野で公知の漂白活性剤、例えばテトラアセチルエチ レンジアミン、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート、およびその他を含むこ とができる。使用量は一般的に約１〜約１０重量％である。 その様な組成物には、各種の汚れ放出剤、特に陰イオン系オリゴマー型の汚れ 放出剤、各種のキレート化剤、特にアミノリン酸塩およびエチレンジアミンジコ ハク酸塩、各種の粘土汚れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン 、各種の分散剤、特にポリアクリル酸塩およびポリアスパラギン酸塩、各種の増 白剤、特に陰イオン系増白剤、各種の発泡抑制剤、特にシリコーンおよび第２級 アルコール、各種の布地軟化剤、特にスメクタイトクレー、およびその他を約１ 〜約３５重量％の量で使用することができる。その様な慣用の物質は、標準的な 処方集および公開された特許明細書に数多く詳細に記載されている。 本発明の洗浄組成物には、酵素安定剤も使用できる。その様な酵素安定剤には 、プロピレングリコール（好ましくは約１％〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好 ましくは約０．１％〜約１％）およびギ酸カルシウム（約０．１％〜約１％）が ある。 １．硬質表面洗浄組成物 ここで使用する「硬質表面洗浄組成物」とは、床、壁、浴室タイル、およびそ の他の硬質表面を洗浄するための液体および顆粒状洗剤組成物を意味する。硬質 表面洗浄組成物は、有効量の、本発明により製造される１種またはそれより多い プロテアーゼ酵素を、組成物の活性酵素の好ましくは約０．００１〜約１０重量 ％、より好ましくは約０．０１〜約５重量％、さらに好ましくは約０．０５〜約 １重量％、含むことができる。その様な硬質表面洗浄組成物は、本発明により製 造される１種またはそれより多いプロテアーゼ酵素に加えて、一般的に界面活性 剤および水溶性の金属イオン封鎖ビルダーを含んでなる。しかし、特殊な製品、 例えばスプレー式の窓クリーナー、では、界面活性剤がガラス表面上に被膜状／ 筋状の残留物を形成することがあるので、界面活性剤は使用されないことがある 。 界面活性剤成分は、存在する場合、本発明の組成物の０．１％位の少量でもよ いが、一般的には組成物は約０．２５％〜約１０％、より好ましくは約１％〜約 ５％、の界面活性剤を含む。 一般的に、組成物は約０．５％〜約５０％、好ましくは約１％〜約１０％、の 洗剤ビルダーを含む。 好ましくは、pHは約８〜１２にすべきである。調整が必要な場合、通常のpH調 整剤、例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは塩酸、を使用することが できる。 組成物は溶剤を含むことができる。有用な溶剤にはグリコールエーテル、例え ばジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチ ルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノ ヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレング リコールモノブチルエーテル、およびジオール、例えば２，２，４−トリメチル −１，３−ペンタンジオールおよび２−エチル-１，３−ヘキサンジオールがあ るが、これらに限定されるものではない。その様な溶剤は、使用する場合、一般 的に約０．５％〜約１５％、好ましくは約３％〜約１１％、の量で使用する。 さらに、表面に組成物を「希釈せずに(full strength)」塗布した後、表面を すすがない場合、本発明の組成物には、高揮発性溶剤、例えばイソプロパノール またはエタノール、を使用し、組成物を迅速に蒸発させることができる。揮発性 溶剤は、使用する場合、組成物中に具体的に約２％〜約１２％の量で存在する。 ２．食器洗浄組成物 食器洗浄組成物は、本発明により製造された１種またはそれより多いプロテア ーゼ酵素を含んでなることができる。ここで使用する「食器洗浄組成物」とは、 そればかりではないが顆粒状および液体を包含する食器洗浄用組成物を意味する 。 ３．布地洗浄組成物 布地洗浄組成物は、本発明により製造された１種またはそれより多いプロテア ーゼ酵素を含んでなることができる。ここで使用する「布地洗浄組成物」とは、 そればかりではないが顆粒状、液体およびバー形態を包含する、布地洗浄用組成 物を意味する。 ａ．顆粒状布地洗浄組成物 顆粒状布地洗浄組成物は、本発明により製造された１種またはそれより多いプ ロテアーゼ酵素を有効量で、好ましくは組成物の活性酵素の約０．００１〜約１ ０重量％、より好ましくは約０．００５〜約５重量％、さらに好ましくは約０． ０１〜約１重量％、含有することができる。顆粒状布地洗浄組成物は、１種また はそれより多いプロテアーゼ酵素に加えて、一般的に少なくとも１種の界面活性 剤、１種またはそれより多いビルダー、および場合により漂白剤を含んでなる。 ｂ．液体状布地洗浄組成物 液体状布地洗浄組成物は、本発明により製造された１種またはそれより多いプ ロテアーゼ酵素を有効量で、好ましくは組成物の活性酵素の約０．００５〜約５ 重量％、より好ましくは約０．０１〜約１重量％、含んでなることができる。そ の様な液体状布地洗浄組成物は一般的に、さらに陰イオン系界面活性剤、脂肪酸 、水溶性洗剤ビルダーおよび水を含んでなる。 ｃ．バー状布地洗浄組成物 汚れた布地の手洗いに適したバー状布地洗浄組成物は、本発明により製造され た１種またはそれより多いプロテアーゼ酵素を有効量で、好ましくは組成物の約 ０．００１〜約１０重量％、より好ましくは約０．０１〜約１重量％、含有する ことができる。プロテアーゼ酵素は、好ましくは組成物１グラムあたり約０．０ ０５〜約０．１、より好ましくは約０．０１２〜約０．０４、Anson 単位の活性 を与えるのに十分な量で配合する。 当業者は本発明の開示に基づいて、過度の実験を行なわずに、あるいは請求項 の精神または範囲から逸れることなく、プロテアーゼ酵素およびプロテアーゼ酵 素抑制剤を置き換えることができるので、下記の例は説明のためであって、本発 明を制限するものではない。 例１ 本発明の方法を使用し、不安定なサブチリシンＢＰＮ’変形を下記の様に製造 する。５０mlの２ｘＹＴ_CMP培地（ここにその全文を参考として含める、Sambroo kら、”Molecular cloning:A Laboratory Manual”、Cold Spring Harbor Labor atory Press により１９８９年に出版に記載されている）を、Bacillus subtili s 株BG2036中で、不安定サブチリシンＢＰＮ’変形で培養するここにその全文を 参考として含める、Yangら、”Cloning of the neutral protease gene of Baci llus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-deriv ed deletion mutation”、J．Bacteriol.,160:15-21(1984)に記載されている様 に）。培養基を２つの２５ml培養基に分割し、一方に、カルバミ ン酸メチルペプチドアルデヒドＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＬｅｕＨ抑制剤（Ｋｉ ＝７．５ｘ１０^-9）の１００％エタノール中１０mM溶液９０ulを加える。この種 の培養基に対する酵素の予想される発現水準は０．１mg/ml または３．６ｘ１０^-6 Ｍである）両培養基を３７℃、２５０ rpm振とうで２４時間成長させる。 結果は下記に示す通りである。 ¹⁾DelMarら、Anal．Biochem.，99，316-320(1979)に記載されているｐＮＡ検定 緩衝液 この方法の使用により、酵素の水準が約１０倍増加する。 例２ 本発明の方法を使用し、不安定なサブチリシンＢＰＮ’変形を下記の様に精製 する。１０mMのカルバミン酸メチルペプチドアルデヒドＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ −ＬｅｕＨ抑制剤（約１０倍過剰）を含む、不安定サブチリシンＢＰＮ’変形の ２ｘＹＴ_CMP培地中の培養基２５mlを３７℃、２５０ rpm振とうで一晩（１８時 間）成長させる。次いで細菌細胞を遠心分離（５Ｋ、１５分間）し、上澄みの透 明な発酵ブロス（“ＣＦＢ”）を新しい管に移す。ＣＦＢを希釈（１：１０）し 、ｐＮＡ検定を行なう。１０mMのＭＯＰＳ緩衝液pH７．０を含むPD-10 カラム(S ephadex G-25M、Pharmacia)を平衡化させ、次いで１mlのＣＦＢをカラムに載せ 、展開させ（溶離液は廃棄する）、続いて緩衝液２mlを加え（溶離液は廃棄する ）、さらに緩衝液２mlを加える（溶離液を１バッチとして集め、これを１：１０ に希釈し、ｐＮＡ検定を行なう）。溶離液を、上記の緩衝液で平衡化させたS-Se pharose Fast Flow(Pharmacia)のカラム０．５mlに加える。これを緩衝 液３mlで洗浄し、次いで１．５mlの１０mMＭＯＰＳpH７．０、０．３M ＮａＣｌ をカラムに加え、１バッチとして集める（これを１：１０に希釈し、、ｐＮＡ検 定を行なう）。 結果は下記に示す通りである。 抑制剤を含まない不安定サブチリシンＢＰＮ’変形はＰＤ−１０の段階で失わ れるので、本発明の方法により収率は著しく増加する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 製造工程中に、１ｘ１０^-4未満のＫｉ値を有する、１種またはそれより 多い非タンパク質性の溶解したプロテアーゼ酵素抑制剤を取り入れることを含ん でなる、プロテアーゼ酵素の製造法。 ２． （ａ）プロテアーゼ酵素を発酵ブロス中で成長させる工程、および （ｂ）前記プロテアーゼ酵素を一つまたはそれより多い工程で精製し、工程（ａ ）で製造されたプロテアーゼ酵素を濃縮する工程 を含んでなり、工程（ａ）、工程（ｂ）、または工程（ａ）および（ｂ）に、１ ｘ１０^-4未満のＫi値を有する、１種またはそれより多い非タンパク質性の溶解 したプロテアーゼ酵素抑制剤を加える、請求項１に記載の方法。 ３． （ａ）１種またはそれより多い非タンパク質性の、溶解した、１ｘ１０^-4 Ｍ未満のＫｉを有するプロテアーゼ酵素抑制剤を含んでなる発酵ブロス中でプ ロテアーゼ酵素を成長させる工程、および （ｂ）前記プロテアーゼ酵素を一つまたはそれより多い工程で精製して、工程（ ａ）で製造されたプロテアーゼ酵素を濃縮し、この精製に際して必要に応じて、 非タンパク質性の、溶解した、１ｘ１０^-4未満のＫｉ値を有するプロテアーゼ酵 素抑制剤をさらに追加することを含んでなる工程 を含んでなる、プロテアーゼ酵素の製造法。 ４． 非タンパク質性の溶解したプロテアーゼ酵素抑制剤が、ボロン酸化合物 、ペプチドアルデヒド化合物、ペプチドボロン酸化合物、ペプチドトリフルオロ メチルケトン化合物、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項 １〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５． プロテアーゼ酵素抑制剤が１ｘ１０^-5未満のＫｉ値を有する、請求項１ 〜４のいずれか１項に記載の方法。 ６． プロテアーゼ酵素抑制剤が発酵工程中に０．１mM未満の濃度で存在する 、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 ７． プロテアーゼ酵素抑制剤が、精製媒体中に、プロテアーゼ酵素を濃縮す る前に、０．１mM未満の濃度で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の 方法。 ８． プロテアーゼ酵素抑制剤が１ｘ１０^-6未満のＫｉ値を有し、抑制剤対プ ロテアーゼ酵素のモル比が少なくとも１：１である、請求項１〜７のいずれか１ 項に記載の方法。 ９． 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により製造され、製造工程で 使用された１種またはそれより多い非タンパク質性の溶解したプロテアーゼ酵素 抑制剤を含んでなる、乾燥または濃縮液の形態のプロテアーゼ酵素。 １０． 請求項９に記載の１種またはそれより多いプロテアーゼ酵素を含んで なる洗剤組成物。