CN108012543B

CN108012543B - 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸

Info

Publication number: CN108012543B
Application number: CN201680032765.0A
Authority: CN
Inventors: K.詹森; M.L.莱特; A.V.赖泽; R.P.奥林斯基; P.尼尔森; L.鲍恩斯加尔德
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2015-06-16
Filing date: 2016-06-13
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2036-06-13
Also published as: EP3310908B1; CN108012543A; EP3310908A1; US10858637B2; WO2016202739A1; US20180171313A1

Abstract

本发明涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽。本发明还涉及编码这些多肽的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；包括这些多核苷酸的组合物和使用这些多肽或这些组合物的方法。

Description

具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸

对序列表的引用

本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

背景技术

技术领域

本发明涉及具有脂肪酶活性的多肽、编码这些多肽的多核苷酸、产生这些多肽的方法、以及使用这些多肽的方法。

相关技术说明

脂肪酶是重要的生物催化剂，其已显示可用于各种应用并且大量的不同脂肪酶已经被鉴定并且许多已被商品化。

脂肪酶已经被用于组合物中，从而用于通过水解甘油三酯以产生脂肪酸来去除脂质污渍。当前清洁和/或织物护理组合物包括许多活性成分，这些成分干扰脂肪酶去除脂质污渍的能力。因此，需要可以在用于清洁的组合物的严苛环境中起作用的脂肪酶。本申请的目的是提供具有有利特征的脂肪酶，如当应用在清洁剂组合物中时具有改进的性能的脂肪酶。

来自许多细菌物种的胞外脂肪酶需要特定的立体分子伴侣的协助。

脂肪酶依赖于分子伴侣以折叠成酶活性构象。

这样的分子伴侣可以按高亲和力结合其底物脂肪酶以在体外形成1:1复合物，该复合物足够稳定以允许两种蛋白质的共纯化和共免疫沉淀。在完成折叠过程之后，这些复合物必须被溶解以释放活化的脂肪酶。

编码脂肪酶及其分子伴侣蛋白的基因通常在操纵子内编码；这表明每个分子伴侣蛋白与其同源脂肪酶特异性相互作用。

来自厦门加利西亚单胞菌(Gallaecimonas xiamenensis)(uniprot:K2JZA4)的已知的脂肪酶与本申请的SEQ ID NO:2的成熟多肽具有84％的一致性。相同的厦门加利西亚单胞菌(G.xiamenensis)脂肪酶的分子伴侣蛋白(uniprot:K2JK28)与本申请的SEQ ID NO:3的成熟多肽具有55％的一致性。Qiliang Lai等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志].2012年，12月，第194卷，第24期，第6937页披露了厦门加利西亚单胞菌的两个序列，并示于本申请的SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中。

发明内容

在补充有橄榄油的琼脂平板上的筛选中，发现革兰氏阴性细菌的菌株食五环芳烃加利西亚单胞菌(Gallaecimonas pentaromativorans)对甘油三酸酯降解为阳性。鉴定到具有其分子伴侣蛋白的相同的操纵子中编码的脂肪酶。

因此，本发明涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽，连同涉及以下分离的多肽，这些分离的多肽具有以下能力：作为具有脂肪酶活性的多肽的分子伴侣起作用。

因此，本发明在第一方面涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性；

(b)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核酸70至927或者(i)的全长互补体杂交；

(c)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟脂肪酶多肽编码序列具有至少85％序列一致性；

(d)一种多肽，该多肽是SEQ ID No:2的变体，该多肽包括取代和/或缺失和/或插入，其中该变体具有脂肪酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42个位置中的一个或多个氨基酸取代，和/或一个或多个氨基酸缺失，和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；以及

(e)一种多肽，该多肽是(a)、(b)、(c)或(d)的多肽中任一个的片段，其中该片段具有脂肪酶活性并包括至少200个氨基酸。

在第二方面，本发明涉及具有作为第一方面的多肽的分子伴侣起作用的能力的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％序列一致性；

(b)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中-高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的核酸971至1786或者(i)的全长互补体杂交；

(c)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟分子伴侣多肽编码序列具有至少60％序列一致性；

(d)一种多肽，该多肽是SEQ ID No：3的变体，该多肽包括取代和/或缺失和/或插入，其中该变体包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代，和/或一个或多个氨基酸缺失，和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；以及

(e)一种多肽，该多肽是(a)、(b)、(c)或(d)的多肽中任一个的片段，并且具有该成熟多肽的长度的至少90％。

在第三方面，本发明涉及包括根据第一方面的具有脂肪酶活性的多肽和任选地根据第二方面的具有作为分子伴侣起作用的能力的多肽的组合物。

本发明还涉及用于水解脂质的方法、用于清洁物体的方法、编码第一或第二方面的多肽的分离的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

序列表概述

本发明涉及一组序列。为方便起见，将其列于以下；

SEQ ID NO:1是如分离自食五环芳烃加利西亚单胞菌(Gallaecimonaspentaromativorans)的多顺反子操纵子的DNA序列。

SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的脂肪酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是如从SEQ ID NO:1推导的分子伴侣的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是编码SEQ ID NO:2的脂肪酶的密码子优化DNA序列。

SEQ ID NO:5是编码SEQ ID NO:3的分子伴侣的密码子优化DNA序列。

SEQ ID NO:6是编码大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的DNA序列。

SEQ ID NO:7是大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8是编码分子伴侣融合蛋白(Chap-MBP)的DNA序列。

SEQ ID NO:9是分子伴侣蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:19是不同的引物和接头。

SEQ ID NO:20是厦门加利西亚单胞菌(Gallaecimonas xiamenensis)脂肪酶(uniprot:K2JZA4)。

SEQ ID NO:21是厦门加利西亚单胞菌(G.xiamenensis)脂肪酶的分子伴侣蛋白(uniprot:K2JK28)。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

分子伴侣：分子伴侣是协助其他蛋白折叠或展开的蛋白。大多数新合成的蛋白可以在分子伴侣不存在的情况下折叠；然而，本发明的脂肪酶需要分子伴侣进行正确折叠。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即来自相同基因)或外源的(即来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。这些控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。在最低限度上，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及生产多肽的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接到供给其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指在该成熟多肽的氨基(N-)和/或羧基(C-)末端缺失一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一方面，该片段包含至少200，至少225，至少250，至少275，或者甚至至少280个氨基酸-例如281，282，283，或284个氨基酸。在一方面，该片段包含SEQ ID NO:2的成熟多肽(即氨基酸1至285)的长度的至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、多肽、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质上相关的一种或多种(例如，若干)或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的EC 3.1.1类中的一种酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)、角质酶活性(EC 3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)。出于本发明的目的，脂肪酶活性是重折叠脂肪酶的活性，并根据实例部分中所述的程序确定(脂肪酶测定：对脂肪酸pNP酯的水解活性)。在一方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的多肽的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的脂肪酶活性。

低温：“低温”是5℃-35℃，如5℃-30℃、5℃-25℃、5℃-20℃、5℃-15℃、或5℃-10℃的温度。在另一个实施例中，“低温”是10℃-35℃，如10℃-30℃、10℃-25℃、10℃-20℃、或10℃-15℃的温度。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，具有脂肪酶活性的成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至285。在一方面，具有作为脂肪酶分子伴侣起作用的能力的成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸1至271。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸和/或编码具有作为脂肪酶分子伴侣起作用的能力的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，该脂肪酶成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸70至927。SEQ ID NO:1的核苷酸1至69编码信号肽。

在一方面，具有作为脂肪酶分子伴侣起作用的能力的多肽的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸971至1786。SEQ ID NO:1的核苷酸929至970编码信号肽。

核酸构建体:术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接:术语“可操作地连接”意指将控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的构型。

亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指如下的脂肪酶，对该脂肪酶进行取代以产生本发明的脂肪酶的变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

序列一致性:用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人，2000，TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志].48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：

(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人，2000，见上文)(优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：

(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

严格条件：非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。中- 高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的片段。

在一方面，子序列包含至少600，至少675，至少750，至少825，或甚至至少840个氨基酸-例如843，846，849，或852个核苷酸。

在一方面，子序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸70至927的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、和至少95％。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置包括取代的具有脂肪酶活性的多肽，即本发明的变体也是本发明的多肽。取代意指将占据一个位置的氨基酸用不同的氨基酸置换；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:2的脂肪酶活性的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一方面，脂肪酶活性根据脂肪酶测定法测量：如在此所述的对脂肪酸pNP酯的水解活性。

洗涤性能：在本发明背景下，使用术语“洗涤性能”作为酶去除存在于待清洁的物体上的脂质或含脂质污渍的能力。洗涤性能可以通过计算在以下方法部分中的AMSA说明中定义的所谓G/(B+R)值来定量。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。

野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的脂肪酶。“野生型”脂肪酶可以在宿主细胞中进行重组表达。

发明详细说明

具有脂肪酶活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(b)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下、中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核酸70至927，或(i)的全长互补体杂交；

(c)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟脂肪酶多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)一种多肽，该多肽是在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的变体；以及

(e)一种多肽，该多肽是(a)、(b)、(c)或(d)的多肽中任一个的片段。

在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少70％的脂肪酶活性。

在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少75％的脂肪酶活性。

在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少80％的脂肪酶活性。

在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少85％的脂肪酶活性。

在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少90％的脂肪酶活性。

在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少95％的脂肪酶活性。

在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少100％的脂肪酶活性。

本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至285或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟脂肪酶多肽编码序列，或(i)的全长互补体(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning,A LaboratoryManual[分子克隆实验指南]，第二版，Cold Spring Harbor[冷泉港]，纽约)。

在另一方面，该多肽是SEQ ID NO:2的多肽的片段。该片段可以包含至少250个氨基酸残基、例如、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、或至少280个氨基酸残基。在一方面，该片段包含SEQ ID NO:2的成熟多肽(即氨基酸1至285)的长度的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。

SEQ ID NO:1的位置70至927的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA。

类似地，SEQ ID NO:1的位置971至1786的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:3的多肽或其片段可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码多肽的DNA，这些多肽具有以下能力：作为具有脂肪酶活性的多肽的分子伴侣起作用。

此类探针可以用于遵循标准DNA印迹程序与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度是至少100个核苷酸，例如长度至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA，对从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ IDNO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该载体材料。

出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸与对应于以下各项的经过标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1的核酸70至927或核酸971至1786；(ii)SEQ ID NO:1的任何成熟脂肪酶多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。在另一方面，该核酸探针由SEQ ID NO:1的至少15个并且多达1000个核苷酸组成。在另一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；或其片段。在又另一方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:3的多肽或其片段的多核苷酸。

在另一个实施例中，本发明涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽，该分离的多肽由与SEQ ID NO:1的成熟脂肪酶多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码。

在另一个实施例中，本发明涉及具有作为SEQ ID NO:2的多肽的分子伴侣起作用的能力的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(b)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下、中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下，或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核酸971至1786或(i)的全长互补体杂交；

(c)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟分子伴侣多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)一种多肽，该多肽是在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:3的变体；以及

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代的SEQ ID NO:2的脂肪酶多肽的变体或其片段。在一个实施例中，向SEQ ID NO:2的多肽中引入的氨基酸取代的数目是1-50、1-40、1-30、1-20、1-10或1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代的SEQ ID NO:3的分子伴侣多肽的变体或其片段。在一个实施例中，向SEQ ID NO:3的多肽中引入的氨基酸取代的数目是1-50、1-40、1-30、1-20、1-10或1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。

这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-末端的或羧基末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域，有利于纯化的小的延伸。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代在本领域是已知的并且例如由H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New York[H.Neurath和R.L.Hill，1979，在蛋白质，学术出版社，纽约]中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸改变具有如下此种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可以根据本领域已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，1989,Science[科学]244:1081-1085)。在后种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见Hilton等人,1996,J.Biol.Chem[生物化学杂志].271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如是由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57所披露的那些；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；US5223409；WO92/06204)，以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986、Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人，1993，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可以进一步包括两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.MicrobiolBiotechnol.[工业微生物与生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；以及Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989，Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。

考虑到如上所述的具有脂肪酶活性的本发明的多肽还可以为用于产生脂肪酶变体的一个或多个(例如若干个)取代提供基础。因此，该多肽还应是亲本脂肪酶。

具有脂肪酶活性的多肽和具有作为分子伴侣起作用的能力的多肽的来源

本发明的具有脂肪酶活性的多肽和/或具有作为分子伴侣起作用的能力的多肽可以从任何属的微生物获得。

具有脂肪酶活性的多肽可以是微生物脂肪酶。在一个优选的方面，该多肽是细菌脂肪酶。在一个更优选的方面，该多肽是加利西亚单胞菌属物种(Gallaecimonas sp)脂肪酶。在甚至更优选的方面，该多肽是食五环芳烃加利西亚单胞菌(Gallaecimonaspentaromativorans)脂肪酶，例如SEQ ID NO:2脂肪酶，SEQ ID NO:2的成熟多肽，与SEQ IDNO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；或其片段。

SEQ ID NO:2的脂肪酶依赖于分子伴侣以折叠成酶活性构象。该分子伴侣多肽可以是微生物的分子伴侣。在一个优选的方面，该分子伴侣多肽是细菌的分子伴侣。在一个更优选的方面，该分子伴侣是加利西亚单胞菌属物种(Gallaecimonas sp)的分子伴侣。在甚至更优选的方面，该分子伴侣多肽是食五环芳烃加利西亚单胞菌(Gallaecimonaspentaromativorans)的分子伴侣，例如SEQ ID NO:3的分子伴侣，与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，或其片段。

将理解的是，对于以上提到的物种，本发明涵盖其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称。本领域普通技术人员将容易地识别适当等同物的身份。

细菌和真菌物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，Sambrook等人，1989，见上文)。

多肽的制备

本发明还涉及用于获得具有脂肪酶活性的多肽的方法，这些方法包括：(a)向亲本脂肪酶(例如，野生型)中对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置的一个或多个(例如，若干个)位置处引入取代；并且(b)回收该变体。

此外，本发明还涉及用于获得具有作为具有脂肪酶活性的多肽的分子伴侣起作用的能力的多肽的方法，这些方法包括：(a)向亲本分子伴侣(例如，野生型)中对应于SEQ IDNO:3的多肽的位置的一个或多个(例如，若干个)位置处引入取代；并且(b)回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许该质粒的粘性末端以及插入物彼此连接。参见例如，Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人.，1990，Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，US2004/0171154；Storici等人，2001，Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino，1996，Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学简讯]43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的许多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004，Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如是由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57所披露的那些；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；US5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这个或这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

该多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述在Gilbert等人，1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在Sambrook等人，1989见上文。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列与编码多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由Romanos等人，1992，见上文描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导序列，对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子序列与编码多肽的多核苷酸的5’-末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该多肽编码序列的3-’末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含相对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。

从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，见上文描述。

控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

也可能令人希望的是添加调节序列，这些调节序列调节相对于宿主细胞的生长的多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地包含一个或多个选择性标记，这些标记容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。

载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与相应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组。

对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene[基因]98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞以增加多肽的生产。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的多肽的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌，以及浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，该细胞是大肠杆菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞(参见，例如Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829、或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见，例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见，例如Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见，例如Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见，例如Gong等人，2004，Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见，例如Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见，例如Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)，或接合(参见，例如Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质转化(参见，例如Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)或接合(参见，例如Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人所定义的，在：Ainsworthand Bisby’s Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典]，第8版，1995，国际CAB，大学出版社(University Press)，剑桥，英国)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)、和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Skinner、Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)所描述那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母、或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞、或解脂耶罗维亚酵母细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，见上文)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。

真菌细胞能以本身已知的方式的通过涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及细胞壁的再生的过程进行转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474，以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母:Becker和Guarente，在阿贝尔森，J.N.和Simon、M.I.，编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷、第182-187页，Academic Press Inc.[学术出版社有限公司]，纽约；Ito等人，1983，J.Bacteriol[细菌学杂志]，153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生多肽的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该多肽。具有脂肪酶活性的多肽和分子伴侣多肽可以在相同的宿主细胞中表达。可替代地，具有脂肪酶活性的多肽和分子伴侣多肽可以在单独的宿主细胞中表达。

使用本领域已知的方法在适合于生产该多肽的营养培养基中培养该宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于该多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。脂肪酶活性测定的实例是本领域中已知的，包括如在实例中所描述的平板测定和pNP测定。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包括但不限于：收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从该营养介质回收该多肽。

可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽，这些程序包括但不限于：色谱(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法、和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。

分子伴侣可以按高亲和力与其底物脂肪酶结合，在体外形成1:1复合物，该复合物允许来自发酵液的两种蛋白质的共纯化。

在替代性方面，不回收多肽，而是使用表达该多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。

组合物

也考虑到包括本发明的多肽的组合物。这类组合物优选地包括具有脂肪酶活性的多肽和分子伴侣多肽。然而，也考虑仅包括具有脂肪酶活性的多肽的组合物或仅包括分子伴侣蛋白多肽的组合物。

在一方面，本发明涉及包括具有脂肪酶活性的分离的多肽的组合物，该多肽与SEQID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

在一方面，本发明涉及包括具有脂肪酶活性的分离的多肽的组合物，该多肽与SEQID NO:20的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

在某些方面，本发明涉及组合物，这些组合物包括具有脂肪酶活性的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，以及包括具有作为该脂肪酶多肽的分子伴侣起作用的能力的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

在某些方面，本发明涉及组合物，这些组合物包括具有脂肪酶活性的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，以及包括具有作为该脂肪酶多肽的分子伴侣起作用的能力的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

在某些方面，本发明涉及组合物，这些组合物包括具有脂肪酶活性的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，以及包括具有作为该脂肪酶多肽的分子伴侣起作用的能力的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

在某些方面，本发明涉及组合物，这些组合物包括具有脂肪酶活性的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，以及包括具有作为该脂肪酶多肽的分子伴侣起作用的能力的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

包括脂肪酶及其同源的分子伴侣的本发明的这类组合物优选地包括脂肪酶:分子伴侣的摩尔比为至少1:4、至少1:3、至少1:2、至少1:1、至少1.5:1.0、至少2:1、至少3:1、或甚至至少4:1、以及优选地比率为不超过4:1、不超过3:1、不超过2:1、不超过1:1、不超过1:2、不超过1:3、以及甚至不超过1:4。

下文阐述的组合物组分的非限制性列表适合用于这些组合物中，并且在此的方法可以合宜地并入本发明的某些实施例中，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清洁的底物，或用以在与香料、着色剂、染料或类似物一起的情况下修饰该组合物的美感。掺入任何组合物中的任何此类组分的水平是除了先前引用的用于掺入的任何材料之外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁操作的性质。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

除非另外指出，以百分比计的量是按该组合物的重量计(wt％)。适合的组分材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下披露，此类其他组分的适合实例以及使用水平发于US5576282、US6306812、和US6326348中，通过引用将这些文献结合在此。

因此，在某些实施例中，本发明不包含以下辅助材料中的一种或多种：表面活性剂、皂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、另外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以是如下文详述的存在的：

洗涤剂组合物

在一方面，本发明涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括：

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)助洗剂。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)助洗剂，其中该助洗剂是氨基聚羧酸盐基螯合剂，该螯合剂优选地选自下组，该组由以下各项组成：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)、以及谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)表面活性剂。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)表面活性剂，其中该表面活性剂是(直链烷基)苯磺酸钠(LAS)。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)表面活性剂，其中该表面活性剂是烷基硫酸钠(AS)。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)表面活性剂，其中该表面活性剂是月桂基乙醚硫酸钠(AEOS)。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)表面活性剂，其中该表面活性剂是醇乙氧基化物(AEO)。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)表面活性剂，其中该表面活性剂是α-烯烃磺酸盐(AOS)。

(a)本发明的脂肪酶；

(b)表面活性剂；以及

(c)助洗剂。

(a)本发明的脂肪酶；

(b)表面活性剂；以及

(c)助洗剂，其中该助洗剂是氨基聚羧酸盐基螯合剂，该螯合剂优选地选自下组，该组由以下各项组成：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)、以及谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)。

(a)本发明的脂肪酶；

(b)表面活性剂，其中该表面活性剂是(直链烷基)苯磺酸钠(LAS)；以及

(a)本发明的脂肪酶；

(b)表面活性剂，其中该表面活性剂是烷基硫酸钠(AS)；以及

(a)本发明的脂肪酶；

(b)表面活性剂，该表面活性剂是月桂基乙醚硫酸钠(AEOS)；以及

(a)本发明的脂肪酶；

(b)表面活性剂，该表面活性剂是醇乙氧基化物(AEO)；以及

(a)本发明的脂肪酶；

(b)表面活性剂，该表面活性剂是α-烯烃磺酸盐(AOS)；以及

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)漂白催化剂。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)漂白催化剂，其中该漂白催化剂是锰催化剂、优选地是三氮杂环壬烷合锰(MnTACN)。

(a)本发明的脂肪酶；

(b)漂白催化剂；以及

(c)表面活性剂。

(a)本发明的脂肪酶；以及

(b)漂白催化剂，其中该漂白催化剂是锰催化剂、优选地是三氮杂环壬烷合锰(MnTACN)；以及

(c)表面活性剂。

(a)本发明的脂肪酶；

(b)漂白催化剂；以及

(c)表面活性剂，其中该表面活性剂是选自下组，该组由以下各项组成：(直链烷基)苯磺酸钠(LAS)、烷基硫酸钠(AS)、月桂基乙醚硫酸钠(AEOS)、醇乙氧基化物(AEO)和α-烯烃磺酸盐(AOS)。

(a)本发明的脂肪酶；

(b)漂白催化剂，其中该漂白催化剂是锰催化剂、优选地是三氮杂环壬烷合锰(MnTACN)；

(c)表面活性剂，其中该表面活性剂是选自下组，该组由以下各项组成：(直链烷基)苯磺酸钠(LAS)、烷基硫酸钠(AS)、月桂基乙醚硫酸钠(AEOS)、醇乙氧基化物(AEO)和α-烯烃磺酸盐(AOS)；以及

(d)助洗剂。

(a)本发明的脂肪酶；

(d)助洗剂，其中该助洗剂是氨基聚羧酸盐基螯合剂，该螯合剂优选地选自下组，该组由以下各项组成：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)、以及谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)。

表面活性剂

根据本发明的组合物可以包括表面活性剂或表面活性剂系统，其中该表面活性剂可以选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。当存在时，表面活性剂典型地以从0.1wt％至60wt％、从0,2wt％到40wt％、从0,5wt％至30wt％、从1wt％至50wt％、从1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从3wt％至5wt％、从5wt％至40wt％、从5wt％至30wt％、从5wt％至15wt％、从3wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从8wt％至12wt％、从10wt％至12wt％或从20wt％至25wt％的水平存在。

适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。

适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一方面为C_10-13烷基苯磺酸盐。适合的烷基苯磺酸盐(LAS)可以通过将可商购获得的直链烷基苯(LAB)磺化来获得；适合的LAB包括低2-苯基LAB，例如

或

其他适合的LAB包括高2-苯基LAB，例如

适合的阴离子去污表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成途径(如HF)也可以是适合的。在一方面，使用LAS的镁盐。

适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一方面，为C_8-18烷基硫酸盐，或主要为C₁₂烷基硫酸盐。

另外的适合的硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，在一方面为烷基乙氧基化硫酸盐，在一方面为C_8-18烷基烷氧基化硫酸盐，在另一方面为C_8-18烷基乙氧基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是C_8-18烷基乙氧基化硫酸盐，具有从0.5至10、或从0.5至7、从0.5至5或从0.5至3的平均烷乙基化度。

烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的、取代或未取代的。

去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一方面为中链分支的阴离子去污表面活性剂，在一方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一方面，中链分支是C_1-4烷基，典型地为甲基和/或乙基。

阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。

适合的非离子去污表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：C₈-C₁₈烷基乙氧基化物，如

C₆-C₁₂烷基苯酚烷氧基化物，其中该烷氧基化物单元可以是乙烯氧基单元，丙烯氧基单元或其混合物；C₁₂-C₁₈醇和C₆-C₁₂烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如普朗尼克

C₁₄-C₂₂中链分支的醇；C₁₄-C₂₂中链分支的烷基烷氧基化物，典型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。

适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。

在一方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一方面为C_8-18烷基烷氧基化醇，例如C_8-18烷基乙氧基化醇，该烷基烷氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一方面，烷基烷氧基化醇可以是C_8-18烷基乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7，更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子表面活性剂包括

非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。

适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物、及其混合物。

适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(R)(R₁)(R₂)(R₃)N⁺X^-，其中R是直链或支链的、取代或未取代的C_6-18烷基或烯基部分，R₁和R₂独立地选自甲基或乙基部分，R₃是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单-C_6-18烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度适合的阳离子去污表面活性剂是单-C_8-10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物、单C_10-12烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-C₁₀烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。

阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。

适合的两性表面活性剂/兼性离子表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱(如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱)、或其组合。本发明的胺中和的阴离子表面活性剂-阴离子表面活性剂以及辅助的阴离子助表面活性剂可以按酸形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明洗涤剂组合物的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，例如，NaOH或KOH。用于中和本发明的阴离子表面活性剂和处于其酸形式的辅助阴离子表面活性剂或助表面活性剂的另外优选的试剂包括氨、胺、或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行到完全或部分的程度，例如，阴离子表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离子表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。

半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物。

包含一种或多种阴离子表面活性剂以及另外一种或多种非离子表面活性剂、并任选地与另外的表面活性剂例如阳离子表面活性剂的混合物的表面活性剂系统可以是优选的。优选的阴离子与非离子表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。

在本发明的某些实施例中，该组合物选自如下的表面活性剂或表面活性剂系统：十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂醇醚硫酸钠、C12-14烷醇聚醚-7、C12-15烷醇聚醚-7、C12-15烷醇聚醚硫酸钠、以及C14-15烷醇聚醚-4。

皂

此处的组合物可包括皂。不受理论的限制，可令人希望的是包括皂，因为它部分充当表面活性剂并且部分充当助洗剂，并且可用于抑制泡沫，并且此外，可以有利地与组合物的多种阳离子化合物相互作用以增强用本发明组合物处理的纺织品织物的柔软性。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤洗涤剂中使用的任何皂。在一个实施例中，这些组合物包含从0wt％至20wt％、从0.5wt％至20wt％、从4wt％至10wt％、或从4wt％至7wt％的皂。

在此有用的皂的实例包括油酸皂、棕榈酸皂、棕榈仁脂肪酸皂、及其混合物。典型的皂处于具有不同链长和取代度的脂肪酸皂混合物的形式。一种这样的混合物是拔顶棕榈仁脂肪酸。

在一个实施例中，该皂选自游离脂肪酸。适合的脂肪酸是饱和和/或不饱和的并且可以从天然来源如植物或动物酯(例如，棕榈仁油、棕榈油、椰子油、巴巴苏油、红花油、妥尔油、蓖麻油、牛油和鱼油、油脂、及其混合物)中获得，或合成地制备(例如，经由石油的氧化或者经由费托法(Fisher Tropsch process)氢化一氧化碳)。

用于在本发明组合物中使用的适合的饱和脂肪酸的实例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。适合的不饱和脂肪酸种类包括：棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和蓖麻油酸。优选的脂肪酸的实例是饱和Cn脂肪酸、饱和Ci₂-Ci₄脂肪酸、和饱和或不饱和的Cn至Ci₈脂肪酸、及其混合物。

当存在时，织物软化阳离子辅助表面活性剂与脂肪酸的重量比优选地是从约1:3至约3:1，更优选地从约1:1.5至约1.5:1，最优选地约1:1。

在此的皂和非皂阴离子表面活性剂的水平是以酸式基础指定的按洗涤剂组合物的重量计的百分比。然而，正如本领域中通常理解的，在实践中使用钠、钾或链烷醇铵碱如氢氧化钠或单乙醇胺中和阴离子表面活性剂和皂。

助水溶物

本发明的组合物可以包括一种或多种助水溶物。助水溶物是以下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，助水溶物具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，助水溶物的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，CurrentOpinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12：121-128的综述。助水溶物并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶物显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶物改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特征。助水溶物常规在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。助水溶物在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高粘度。

洗涤剂可以包含从0wt％至10wt％，如从0wt％至5wt％、0.5wt％至5wt％、或从3wt％至5wt％的助水溶物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶物。助水溶物的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。

助洗剂：

本发明的组合物可以包括一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂系统或其混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包括从0wt％至65wt％、至少1wt％、从2wt％至60wt％或从5wt％至10wt％的助洗剂。在洗涤餐具清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是40wt％至65wt％或50wt％至65wt％。该组合物可以是基本上不含助洗剂；基本上不含意指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。

助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

清洁组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的特定实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PH DA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。

螯合剂和晶体生长抑制剂

在此的组合物可以包括螯合剂和/或晶体生长抑制剂。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合剂及其混合物。适合的分子包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐氢氧化物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、亚乙基二胺四丙酸(EDTP)、羧甲基菊粉以及2-膦羧基丁烷1,2,4-三羧酸(

AM)及其衍生物。典型地，该组合物可以包括从0.005wt％至15wt％或从3.0wt％至10wt％的螯合剂或晶体生长抑制剂。

漂白组分

适合用于并入本发明的方法和组合物中的漂白组分包括多于一种漂白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。通常，当使用漂白组分时，本发明的组合物可以包括从0wt％至30wt％、从0.00001wt％至90wt％、0.0001wt％至50wt％、从0.001wt％至25wt％或从1wt％至20wt％。适合的漂白组分的实例包括：

(1)预形成的过酸：适合的预形成的过酸包括但不限于选自下组的化合物，该组由以下各项组成：预形成的过氧酸或其盐，典型地是过氧羧酸或其盐、或过氧硫酸或其盐。

预形成的过氧酸或其盐优选是过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁴选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁴基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；且Y是实现电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Y选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁴是直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、及其盐，或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有从30℃至60℃范围内的熔点。

预形成的过氧酸或其盐还可以是过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁵选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁵基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且Z是达到电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Z选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁵是直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01wt％至50wt％、或从0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)，过碳酸盐，过硫酸盐，过磷酸盐，过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自下组的那些，该组由以下各项组成：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05wt％至40wt％或1wt％至30wt％的量存在并且典型地被掺入进此类组合物中作为可以被包衣的结晶固体。适合的包衣包括：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％、或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

(3)术语漂白活化剂在此意指经由过水解作用与过氧化氢反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。在此待使用的适合漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的漂白活化剂是具有R-(C＝O)-L的那些，其中R是烷基基团(优选是支链的)，当该漂白活化剂是疏水的时候，具有从6个至14个碳原子，或从8个至12个碳原子，并且当该漂白活化剂是亲水的时，具有小于6个碳原子或小于4个碳原子；并且L为离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS))、和/或披露于WO98/17767中的那些。漂白活化剂的家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋精)具有它是环境友好的优点。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。适合的漂白活化剂还披露于WO 98/17767中。尽管可以使用任何适合的漂白活化剂，但是在本发明的一方面，主题清洁组合物可以包括NOBS、TAED或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以0.1wt％至60wt％、0.5wt％至40wt％或0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％、或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。

(4)二酰基过氧化物-优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：R¹-C(O)-OO-(O)C-R²，其中R¹表示C₆-C₁₈烷基，优选地是包含具有至少5个碳原子的直链并且任选地包含一个或多个取代基(例如-N⁺(CH₃)₃、-COOH或-CN)和/或一个或多个在烷基的相邻碳原子之间插入的中断部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)的C₆-C₁₂烷基基团，并且R²表示与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，以使得R¹和R²一起包含总共8个至30个碳原子。在一个优选方面，R¹和R²是直链的未取代的C₆-C₁₂烷基链。最优选地，R¹和R²是相同的。二酰基过氧化物(其中R¹和R²均是C₆-C₁₂烷基基团)是特别优选的。优选地，R基团(R₁或R₂)中的至少一个、最优选地仅有一个在α位不包含分枝的或下垂的环，或优选在α位或β位都不包含分枝的或下垂的环，或最优选在α位或β位或γ位都不包含分枝的或下垂的环。在一个进一步优选的实施例中，DAP可以是不对称的，以使得R1酰基优选地迅速水解以产生过酸，但是R2酰基的水解缓慢。

四酰基过氧化物漂白种类优选选自具有以下通式的四酰基过氧化物：R³-C(O)-OO-C(O)-(CH₂)n-C(O)-OO-C(O)-R³，其中R³表示C₁-C₉烷基，或C₃-C₇基团，并且n表示从2至12或4至10(包括端值)的整数。

优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、至少10ppm、或至少50ppm的洗涤液的量存在。在一个优选实施例中，这些漂白种类以足够提供按重量计从0.5ppm至300ppm、从30ppm至150ppm的洗涤液的量存在。

优选地，漂白组分包括漂白催化剂(5和6)。

(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将该氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺盐阳离子和聚离子；亚胺两性离子；改性的胺；改性的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-磷酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。

适合的亚胺鎓阳离子及聚离子包括但不限于，N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如Tetrahedron[四面体](1992),49(2),423-38所述的进行制备(参见例如化合物4，第433页)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US5360569所述的进行制备(例如第11栏，实例1)；以及正辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US5360568所述的进行制备(例如第10栏，实例3)。

适合的亚胺鎓兼性离子包括但不限于，N-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US5576282所述的进行制备(例如第31栏，实例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US5817614所述的进行制备(例如，第32栏，实例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如WO 05/047264所述的进行制备(例如，第18页，实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。

适合的改性胺氧转移催化剂包括但不限于1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇，其可依照描述于Tetrahedron Letters[四面体通讯](1987)，28(48)，6061-6064中的方法制备。适合的改性氧化胺氧传递催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧基-N-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。

适合的N-磺酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于根据有机化学杂志(Journal ofOrganic Chemistry)(1990),55(4),1254-61中描述的程序制备的3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物。

适合的N-膦酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2,4,6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可依照描述于Journal ofthe Chemical Society,Chemical Communications[化学学会杂志，化学通讯](1994)，(22)，2569-70中的方法制备。

适合的N-酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于可以根据Polish Journal ofChemistry[波兰化学杂志](2003)，77(5)，577-590中描述的程序制造的[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺。

适合的噻二唑二氧化物氧传递催化剂包括但不限于可以根据US5753599(第9栏，实例2)中所述的方法制备的3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物。

适合的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(Z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-N-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可依照Tetrahedron Letters[四面体通讯](1994)，35(34)，6329-30中所述的方法制备。

适合的环状糖酮氧传递催化剂包括但不限于如在US6649085(第12栏，实例1)中制备的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。

优选地，所述漂白催化剂包含亚胺鎓和/或羰基官能团，并且通常能够在接受氧原子，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子后形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包括过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包括环状亚胺鎓官能团，优选其中该环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环大小。优选地，漂白催化剂包括芳基亚胺鎓官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在另一方面，该洗涤剂组合物包括具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0、或不大于-3.5的logP_o/w的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logP_o/w的方法。

典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至0.30、从0.05至0.25或从0.10至0.20的X_SO的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定X_SO的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在这一实例中，X_SO是过氧亚胺正离子漂白种类的X_SO。

优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：n和m独立地是从0至4，优选n和m均是0；每个R¹独立地选自取代的或未取代的选自下组的基团，该组由以下各项组成：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基；并且任何两个连位的R¹取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R²独立地选自取代的或未取代的独立地选自下组的基团，该组由以下各项组成：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基、羧基烷基以及酰胺基团；任何R²可以与任何其他的R²结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕R²可以合并以形成羰基；并且任何两个R²可以合并以形成取代的或未取代的稠合的不饱和部分；R³是C₁至C₂₀取代的或未取代的烷基；R⁴是氢或Q_t-A部分，其中：Q是分支或未分支的烯烃，t＝0或1，并且A是选自下组的阴离子基团，该组由以下各项组成：OSO₃ ^-、SO₃ ^-、CO₂ ^-、OCO₂ ^-、OPO₃ ^2-、OPO₃H^-和OPO₂ ^-；R⁵是氢或-CR¹¹R¹²-Y-G_b-Y_c-[(CR⁹R¹⁰)_y-O]_k-R⁸部分，其中：每个Y独立地选自下组，该组由以下各项组成：O、S、N-H、或N-R⁸；并且每个R⁸独立地选自下组，该组由以下各项组成：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论是取代的还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个G独立地选自下组，该组由以下各项组成：CO、SO₂、SO、PO和PO₂；R⁹和R¹⁰独立地选自下组，该组由以下各项组成：H和C₁-C₄烷基；R¹¹和R¹²独立地选自下组，该组由以下各项组成：H和烷基，或者当放一起时可以结合形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是从1至6的整数；k是从0至20的整数；R⁶是H，或是烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代或未取代的；并且X，如果存在的话，是适合的电荷平衡反离子，优选地当R⁴是氢时，X是存在的，适合的X包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲氧硫酸盐(methosulphate)、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、硼四氟化物以及磷酸盐。

在本发明的一个实施例中，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：

其中R¹³是包含从三个至24个碳原子(包括分支的碳原子)的支链烷基或包含从一个至24个碳原子的直链烷基；优选地，R¹³是包含从八个至18个碳原子的支链烷基或包含从八个至十八个碳原子的直链烷基；优选地，R¹³选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基；优选地，R¹³选自下组，该组由以下各项组成：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异-十三基和异-十五烷基。

优选地，除了漂白催化剂、特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包括过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与一种漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。

当存在时，基于该组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从0.1wt％至60wt％、从0.5wt％至40wt％或从0.6wt％至10wt％的量存在于该组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。

可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或2:1至10:1。

(6)包含金属的漂白催化剂–可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的包含金属的漂白催化剂是以下催化系统，该催化系统包括一种具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，一种具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及一种对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于US 4430243中。优选的催化剂描述于WO 09/839406、US 6218351和WO00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为交联桥多齿N-供体配体的配体。

可用于本发明组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物，具体地是Me3-TACN，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2’,2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲基亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。这些漂白催化剂也可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。

如果希望的话，可以借助锰化合物催化在此的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于US 5576282中的基于锰的催化剂。

在此有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于US 5597936；US 5595967中。通过已知的程序可容易地制备此类钴催化剂，例如像US 5597936和US 5595967中传授的程序。

在此的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(US 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“MRL”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调整在此的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL种类，并且将典型地在洗涤液中提供从0.005ppm至25ppm、从0.05ppm至10ppm、或从0.1ppm至5ppm的MRL。

即成的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂二环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属MRL，例如像US 6225464和WO 00/32601中传授的程序。

(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化的酞菁锌、磺化的酞菁铝、呫吨染料及其混合物。用于在本发明的这些组合物中使用的优选漂白组分包括过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活化剂与漂白催化剂相组合的反应而原位产生。优选的漂白组分包括漂白催化剂，优选以上所述的有机漂白催化剂。

特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。

示例性漂白系统还描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。

织物调色剂

该组合物可以包括织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土轭合物、以及颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：属于以下比色指数(C.I.)分类的染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物。

在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：比色指数(染工和着色师学会(Society of Dyers and Colorists)，布拉德福德，英国)编号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71、直接紫51及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或其混合物。

适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下各项组成：包含轭合色原体的聚合物(染料-聚合物轭合物)以及与色原体共聚合进聚合物主链中的聚合物，及其混合物。

在另一方面，适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下各项组成：在

(美利肯(Milliken))名称之下的织物实质性着色剂，从至少一种反应性染料和选自下组的聚合物形成的染料-聚合物轭合物，该组由以下各项组成：包含选自由羟基部分、一级胺部分、二级胺部分、硫醇部分及其混合物组成的组的部分的聚合物。在再另一方面，适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下各项组成：

紫色CT，与活性蓝、活性紫或活性红染料轭合的羧甲基纤维素(CMC)，如与C.I.反应性蓝19(由Megazyme，Wicklow,Ireland[麦格酶，威克洛，爱尔兰]，以产品名AZO-CM-CELLULOSE，产品代码S-ACMC下售卖)轭合的CMC、烷氧基化的三苯基-甲烷聚合物着色剂，烷氧基化的噻吩聚合物着色剂、及其混合物。

优选的调色染料包括发现于WO 08/87497中的增白剂。这些增白剂可以由以下结构(I)表征：

其中R₁和R₂可以独立地选自：

a)[(CH₂CR’HO)_x(CH₂CR”HO)_yH]

其中R’选自下组，该组由以下各项组成：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下各项组成：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；

b)R₁＝烷基、芳基或芳基烷基，并且R₂＝[(CH₂CR’HO)_x(CH₂CR”HO)_yH]

其中R’选自下组，该组由以下各项组成：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下各项组成：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；

c)R₁＝[CH₂CH₂(OR₃)CH₂OR₄]并且R₂＝[CH₂CH₂(O R₃)CH₂O R₄]

其中R₃选自下组，该组由以下各项组成：H、(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；并且其中z＝0至10；

其中R₄选自下组，该组由以下各项组成：(C₁-C₁₆)烷基、芳基基团、及其混合物；以及

d)其中R1和R2可以独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油甲醚、异丁基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、2-乙基己基缩水甘油醚、以及缩水甘油十六烷基醚的氨基加成产物，随后为从1至10个环氧烷单位的加成。

本发明的优选增白剂可以由以下结构(II)表征：

其中R’选自下组，该组由以下各项组成：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下各项组成：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。

本发明的另外优选的增白剂可以由以下结构(III)表征：

典型地包括具有一共5个EO基团的混合物。适合的优选分子是在结构I中的具有在上文中“部分a”中的以下下垂基团的那些。

表1

R1

R2

R’

R”

x

y

R’

R”

x

y

a

H

3

1

H

0

1

b

H

2

1

H

1

c＝b

H

1

H

2

1

d＝a

H

0

1

H

3

1

使用的另外的增白剂包括描述于US 2008/34511(联合利华(Unilever))中的那些。优选的试剂是“紫色13”。

适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组包括至少一种阳离子/碱性染料和绿土、及其混合物。在另一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组由一种阳离子/碱性染料和一种粘土组成，该阳离子/碱性染料选自下组，该组由以下各项组成：C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕色1至23、CI碱性黑1至11，并且该粘土选自下组，该组由以下各项组成：蒙脱石粘土、水辉石粘土、皂石粘土及其混合物。仍在另一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组由以下各项组成：蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595轭合物，蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015轭合物，蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555轭合物，蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040轭合物，蒙脱石碱性红R1C.I.45160轭合物，蒙脱石C.I.碱性黑2轭合物，锂蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595轭合物，锂蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015轭合物，锂蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555轭合物，锂蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040轭合物，锂蒙脱石碱性红R1 C.I.45160轭合物，锂蒙脱石C.I.碱性黑2轭合物，皂石碱性蓝B7 C.I.42595轭合物，皂石碱性蓝B9 C.I.52015轭合物，皂石碱性紫V3C.I.42555轭合物，皂石碱性绿G1 C.I.42040轭合物，皂石碱性红R1 C.I.45160轭合物，皂石C.I.碱性黑2轭合物以及它们的混合物。

适合的颜料包括选自下组的颜料，该组由以下各项组成：黄士酮、阴丹酮、包含1至4个氯原子的含氯阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中该酰亚胺基团可以是未取代的或被C1-C3-烷基或苯基或杂环基团取代的，并且其中该苯基和杂环基团可以另外地带有不赋予在水中的溶解性的取代基)、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可以包含高达2个氯原子的酞菁铜、多氯-酞菁铜或每个分子包含高达14个溴原子的多溴氯-酞菁铜，及其混合物。

在另一方面，适合的颜料包括选自下组的颜料，该组由以下各项组成：群青(C.I.颜料蓝29)、群青紫(C.I.颜料紫15)及其混合物。

上述织物调色剂可以组合使用(可以使用织物调色剂的任何混合物)。适合的调色剂更详细地描述于US 7208459中。染料在本发明的组合物中的优选水平是0.00001wt％至0.5wt％、或0.0001wt％至0.25wt％。优选在水中用于处理和/或清洁步骤的染料的浓度是从1ppb至5ppm、10ppb至5ppm或20ppb至5ppm。在优选的组合物中，表面活性剂的浓度将是从0.2至3g/l。

胶囊化物

该组合物可以包括一种胶囊化物。在一方面，胶囊化物包括一个核心，具有内表面和外表面的包壳，所述包壳封装所述核心。

在所述胶囊化物的一个方面，所述核心可以包括一种选自下组的材料，该组由以下各项组成：香料；增亮剂；染料；驱昆虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂，在一方面，是石蜡；酶；抗细菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)及其混合物；并且所述包壳可以包括一种选自下组的材料，该组由以下各项组成：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选地包含其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚醋；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一方面，所述氨基塑料可以包括聚脲、聚氨酯、和/或聚脲聚氨酯，在一方面，所述聚脲可以包括聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一方面，所述多糖可以包括藻朊酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物；水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。

在所述胶囊化物的一个方面，所述核心可以包括香料。

在所述胶囊化物的一个方面，所述包壳可以包括三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。

在一方面，披露了适合的胶囊化物可以包括核心材料和包壳，所述包壳至少部分地包围所述核心材料。所述胶囊化物的85％或90％可以具有从0.2MPa至10MPa、从0.4MPa至5MPa、从0.6MPa至3.5MPa、或从0.7MPa至3MPa的抗断强度；并且具有从0至30％、从0至20％、或从0至5％的有益试剂泄露。

在一方面，所述胶囊化物的85％或90％可以具有从1至80微米、从5至60微米、从10至50微米、或从15至40微米的粒度。

在一方面，所述胶囊化物的85％或90％可以具有从30至250nm、从80至180nm、或从100至160nm的颗粒壁厚。

在一方面，所述胶囊化物的核心材料可以包括一种选自由香料原材料组成的组的材料，和/或任选地包括一种选自下组的材料，该组由以下各项组成：植物油，包括纯净植物油和/或共混植物油，包括蓖麻油(caster oil)、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油(castoroil)、柠檬油及其混合物；植物油的酯，酯，包括己二酸二丁酯、酞酸二丁酯、己二酸丁基苄酯、己二酸辛基苄酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯及其混合物；直链或支链烃，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化的萘(包括二丙基萘)、石油精(包括煤油)、矿物油及其混合物；芳香族溶剂，包括苯、甲苯及其混合物；硅酮油；及其混合物。

在一方面，所述胶囊化物的壁材料可以包括适合的树脂，该树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适合的胺包括三聚氰胺、脲、苯并胍胺、甘脲、及其混合物。适合的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化的羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺及其混合物。适合的脲包括二羟甲基脲、甲基化的二羟甲基脲、脲-间苯二酚、及其混合物。

在一方面，在将胶囊化物添加至组合物之前、期间或之后，适合的甲醛清除剂可以与例如处于胶囊浆料中的胶囊化物一起使用和/或添加至这种组合物中。适合的胶囊可以通过US2008/0305982；和/或US2009/0247449的以下传授来制成。

在一个优选方面，该组合物还可以包括沉积助剂，优选由下组组成，该组包括阳离子或非离子聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟基乙基纤维素、聚乙烯甲醛、槐树豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚乙二醇对苯二甲酸酯，以及包含甲基丙烯酸二甲胺乙酯的聚合物，任选地具有一种或多种选自下组的单体，该组包括丙烯酸和丙烯酰胺。

香料

在一方面，该组合物包括包含选自下组的一种或多种香料原材料的香料，该组由以下各项组成：1,1’-氧基双-2-丙醇；1,4-环己烷二羧酸，二乙酯；(乙氧基甲氧基)环十二烷；1,3-壬二醇，单乙酸酯；(3-甲基丁氧基)乙酰乙酸，2-丙烯基酯；β-甲基环十二烷乙醇；2-甲基-3-[(1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚-2-基)氧]-1-丙醇；十五内酯；α-甲基-苯甲醇酯；反式-3-乙氧基-1,1,5-三甲基环己烷；4-(1,1-二甲基乙基)环己醇乙酸酯；十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；β-甲基苯丙醛；β-甲基-3-(1-甲基乙基)苯丙醛；4-苯基-2-丁酮；2-甲基甲基丁酸，乙酯；苯甲醛；2-甲基甲基丁酸，1-甲基乙酯；二氢-5-戊基-2(3H)呋喃酮；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；十二醛；十一醛；2-乙基-α,α-二甲基苯丙醛；癸醛；α,α-二甲基苯乙醇乙酸酯；2-(苯基亚甲基)辛醛；2-[[3-[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-2-甲基亚丙基]氨基]苯甲酸，甲基酯；1-(2,6,6-三甲基-3-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-戊基环戊酮；3-氧代-2-戊基环戊乙酸，甲基酯；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；2-庚基环戊酮；1-(4-甲基苯基)乙酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；苯乙醇；2H-1-苯并吡喃-2-酮；4-甲氧基苯甲醛；10-十一烯醛；丙酸，苯基甲基酯；β-甲基苯戊醇；1,1-二乙氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯；α，α-二甲基苯乙醇；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；乙酸，苯基甲基酯；环己基丙酸，2-丙烯基酯；己酸，2-丙烯基酯；1,2-二甲氧基-4-(2-丙烯基)苯；1,5-二甲基-二环[3.2.1]辛烷-8-酮肟；4-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；3-丁烯-2-醇；2-[[[2,4(或3,5)-二甲基-3-环己烯-1-基]亚甲基]氨基]苯甲酸，甲基酯；8-环十六烯-1-酮；甲基紫罗兰酮；2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇；2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚；(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇；2-羟基-苯甲酸，(3Z)-3-己烯酯；2-十三碳烯腈；4-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基-3-丁烯-2-酮；四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃；乙酰乙酸，(2-甲基丁氧基)-，2-丙烯基酯；苯甲酸，2-羟基-，3-甲基丁基酯；2-丁烯-1-酮，1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-，(Z)-；环戊酸，2-己基-3-氧代-，甲基酯；苯丙醛，4-乙基-.α.,.α.-二甲基-；3-环己烯-1-吡咯甲醛，3-(4-羟基-4-甲基戊基)-；乙酮，1-(2,3,4,7,8,8a-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3a,7-亚甲基桥薁-5-基)-，[3R-(3.α.,3a.β.,7.β.,8a.α.)]-；十一醛，2-甲基-2H-吡喃-2-酮，6-丁四氢化-；苯丙醛，4-(1,1-二甲基乙基)-.α.-甲基-；2(3H)-呋喃酮，5-庚二氢-；苯甲酸，2-[(7-羟基-3,7-二甲基亚辛基)氨基]-，甲基；苯甲酸，2-羟基-，苯基甲基酯；萘，2-甲氧基-；2-环戊烯-1-酮，2-己基-；2(3H)-呋喃酮，5-庚二氢-；环氧乙烷羧酸，3-甲基-3-苯基-，乙基酯；2-氧二环[2.2.2]辛烷，1,3,3-三甲基-；苯戊醇，.γ.-甲基-；3-辛醇，3,7-二甲基-；3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈；3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇；萜品醇乙酸酯；2-甲基-6-亚甲基-7-辛烯-2-醇，二氢衍生物；3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-亚甲基桥-1H-茚-6-醇丙酸酯；3-甲基-2-丁烯-1-醇乙酸酯；(Z)-3-己烯-1-醇乙酸酯；2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇；4-(八氢-4,7-亚甲基桥-5H-茚-5-亚基)-丁醛；3-2,4-二甲基-环己烯-1-吡咯甲醛；1-(1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；2-羟基-苯甲酸，甲基酯；2-羟基-苯甲酸，己基酯；2-苯氧基-乙醇；2-羟基-苯甲酸，戊基酯；2,3-庚二酮；2-己烯-1-醇；6-辛烯-2-醇，2,6-二甲基-；大马酮(α，β，γ或δ及其混合物)，4,7-亚甲基桥-1H-茚-6-醇，3a,4,5,6,7,7a-六氢-，乙酸酯；9-十一烯醛；8-十一烯醛；异环柠檬醛；乙酮，1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-；3-环己烯-1-吡咯甲醛，3,5-二甲基-；3-环己烯-1-吡咯甲醛，2,4-二甲基-；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-，乙酸酯；铃兰醛(p-t-Bucinal)，和环戊酮，2-[2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙基]-和1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯及其混合物。

在一方面，该组合物可以包括胶囊化的香料颗粒，该颗粒包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或改性的聚乙烯醇。在一方面，胶囊化物包括(a)至少部分水溶的固体基质，包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉；以及(b)由该固体基质包封的香料油。

在另一方面，该香料可以是与多胺(优选聚乙烯亚胺)预复合的，以形成席夫碱(Schiff base)。

聚合物

组合物可以包括一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

该组合物可以包括一种或多种两亲清洁聚合物，例如具有以下一般结构的化合物：双((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)(CH₃)-N⁺-C_xH_2x-N⁺-(CH₃)-双((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)，其中n＝从20至30，并且x＝从3至8，或其硫酸化的或磺化的变体。

该组合物可以包括两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，这些聚合物具有平衡的亲水和疏水特性，使得它们从织物和表面去除油脂颗粒。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施例包括一个核心结构和与那个核心结构连接的多个烷氧基化基团。这些可以包括烷氧基化的聚烯属烃亚胺(polyalkylenimine)，优选具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。

在此，烷氧基化的聚羧酸酯(例如从聚丙烯酸酯制备的那些)可用于提供另外的油脂去除性能。此类材料描述于WO 91/08281和PCT 90/01815中。化学上地，这些材料包括聚丙烯酸酯，每7-8个丙烯酸脂单位具有一个乙氧基侧链。侧链具有化学式-(CH₂CH₂O)_m(CH₂)_nCH₃，其中m是2-3并且n是6-12。侧链是酯连接至聚丙烯酸酯“主链”，以提供“梳子状”聚合物类型结构。分子量可以不同，但典型地处于2000至50,000的范围内。此类烷氧基化的聚羧酸酯可以包括在此的组合物的从0.05wt％至10wt％。

本发明的类异戊二烯衍生的表面活性剂，以及它们与其他辅助表面活性剂和其他佐剂成分一起形成的混合物特别适合与两亲接枝共聚物一起使用，优选地该两亲接枝共聚物包括(i)聚乙二醇主链；以及(ii)和至少一种下垂物部分，该下垂物部分选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其混合物。优选的两亲接枝共聚物是由BASF[巴斯夫]供应的Sokalan HP22。适合的聚合物包括随机接枝共聚物，优选聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多重聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量优选是6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。

羧酸酯聚合物

本发明的组合物还包括一种或多种羧酸酯聚合物，例如马来酸酯/丙烯酸酯随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一方面，该羧酸酯聚合物是具有从4,000Da至9,000Da，或从6,000Da至9,000Da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。

污物释放聚合物

本发明的组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物具有如由以下结构(I)、(II)或(III)之一所定义的结构：

(I)-[(OCHR¹-CHR²)_a-O-OC-Ar-CO-]_d

(II)-[(OCHR³-CHR⁴)_b-O-OC-sAr-CO-]_e

(III)-[(OCHR⁵-CHR⁶)_c-OR⁷]_f

其中：

a、b和c是从1至200；

d、e和f是从1至50；

Ar是1,4-取代的亚苯基；

sAr是1,3-取代的亚苯基，该亚苯基在5位上被SO₃Me取代；

Me是Li，K，Mg/2，Ca/2，Al/3，铵，单-、二-、三-、或四烷基铵，其中烷基是C₁-C₁₈烷基或C₂-C₁₀羟基烷基，或其混合物；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地选自H或C₁-C₁₈正-或异-烷基；以及

R⁷是直链或支链的C₁-C₁₈烷基，或直链或支链的C₂-C₃₀烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C₈-C₃₀芳基，或C₆-C₃₀芳基烷基。

适合的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如Repel-o-tex聚合物，包括Repel-o-tex、SF-2和SRP6，由罗地亚(Rhodia)供应。其他适合的去污聚合物包括Texcare聚合物，包括Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，由科莱恩(Clariant)供应。其他适合的去污聚合物是Marloquest聚合物，例如MarloquestSL，由萨索尔(Sasol)供应。

纤维素聚合物

本发明的组合物还包括一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一方面，纤维素聚合物选自下组，该组包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素、及其混合物。在一方面，羧甲基纤维素具有从0.5至0.9的羧甲基取代度以及从100,000Da至300,000Da的分子量。

酶

该组合物可以包括提供清洁性能和/或织物护理益处的一种或多种酶。适合的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶和淀粉酶、或其混合物。典型的组合是酶混合物，可以包含例如蛋白酶和脂肪酶连同淀粉酶。当存在于组合物中时，前述另外的酶可以按组合物的重量计以从0.00001wt％至2wt％、从0.0001wt％至1wt％或从0.001wt％至0.5wt％酶蛋白的水平存在。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶

适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。

其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme Premium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(Kao Corporation))。

蛋白酶

适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程学]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是获得于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及获得自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如获得自解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：

Duralase^Tm、Durazym^Tm、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

以及

(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：

Purafect

Preferenz^Tm、

Purafect

Effectenz^Tm、

以及

(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-BrocasesN.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶

适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶(如描述于EP 258 068和EP 305 216中)、来自腐质霉(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO 96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)(这些假单胞菌属中的一些现在重命名为伯克氏菌属(Burkholderia))的脂肪酶(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene))(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)、来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(WO 10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(Pseudomonas mendocina)(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)脂肪酶(WO 11/084417)、来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)、以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(WO 12/137147)的脂肪酶。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。

淀粉酶

可以与本发明的酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包含在WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中所示的获得自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和在WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ IDNO:6中的获得自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

另外的适合的淀粉酶是具有在WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的变体的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

能被使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下一个或多个位置具有取代、缺失或插入的变体的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476，使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置中具有缺失的那些，例如位置181和182、182和183、或183和184。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。

其他可以使用的淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712的SEQID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2或WO 01/66712的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是具有C末端截短和/或在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体，以及在选自下组的一个或多个位置中另外具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是在所有这些位置中另外具有取代的变体。

其他的实例是淀粉酶变体，例如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase及Preferenz S100(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。

其他酶

在一方面，其他优选的酶包括微生物衍生的展现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，包括对于芽孢杆菌属的成员而言内源的细菌多肽，具有与US7141403中的氨基酸序列SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，以及其混合物。适合的内切葡聚糖酶是在商标名

和

(诺维信公司)下售卖的。

其他优选的酶包括在商标名

下售卖的果胶裂解酶，以及在商标名

下售卖的甘露聚糖酶(诺维信公司)，以及

(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。

非尘颗粒可以例如如US 4106991和US 4661452中所披露来制造，并且可以任选地通过本领域中已知的方法来涂布。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有从12个至20个碳原子并且存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。受保护的酶可以根据EP 238216中披露的方法来制备。

染料转移抑制剂

本发明的组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于组合物中时，染料转移抑制剂可以按从0.0001wt％至10wt％、从0.01wt％至5wt％或从0.1wt％至3wt％的水平存在。

增亮剂

本发明的组合物还可包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增亮剂。

该组合物可以包括C.I.荧光增亮剂260，处于具有以下结构的α-晶体形式：

在一方面，增亮剂是冷水可溶性增亮剂，例如处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260。在一方面，增亮剂主要处于α-晶体形式，这意味着典型地至少50wt％、至少75wt％、至少90wt％、至少99wt％、或甚至基本上全部的C.I.荧光增亮剂260是处于α-晶体形式。

增亮剂典型地是处于微粒化微粒形式，具有从3至30微米、从3微米至20微米、或从3至10微米的加权平均初级粒度。

该组合物可以包括处于β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260，并且(i)处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260与(ii)处于β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的重量比可以是至少0.1或至少0.6。BE 680847涉及用于制得处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的方法。

可以用于本发明中的商业光学增亮剂可以划分为多个亚组，这些亚组包括但不是必须限制于：二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸、次甲基菁、二苯并噻吩-5,5-二氧化物、唑类、5元和6元环杂环的衍生物以及其他混杂剂。此类增亮剂的实例披露于“荧光增亮剂的生产和应用”，M.佐赫劳德尼克(Zahradnik)，由纽约约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,NewYork)出版(1982)。可以用于本发明组合物的光学增亮剂的具体非限制性实例是在US4790856和US 3646015中鉴定的那些。

另外适合的增亮剂具有以下结构：

适合的荧光增亮剂水平包括从0.01wt％、从0.05wt％、从0.1wt％或从0.2wt％的较低水平至0.5wt％或0.75wt％的较高水平。

在一方面，增亮剂可以装载在粘土上以形成颗粒。硅酸盐-本发明的组合物还可以包含硅酸盐，例如硅酸钠或硅酸钾。该组合物可以包括从0wt％至小于10wt％硅酸盐，至9wt％、或至8wt％、或至7wt％、或至6wt％、或至5wt％、或至4wt％、或至3wt％、或甚至至2wt％，并且从高于0wt％、或从0.5wt％、或从1wt％起的硅酸盐。适合的硅酸盐是硅酸钠。

分散剂

本发明的组合物还可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。

酶稳定剂

用于组合物中的酶可以通过各种技术来稳定。在此使用的酶可以通过钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。常规的稳定剂的实例是，例如，丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。在包括蛋白酶的水性组合物的情况下，可以添加可逆蛋白酶抑制剂，例如包括硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸及其衍生物的硼化合物，或例如甲酸钙、甲酸钠和1,2-丙二醇的化合物，以进一步改进稳定性。

溶剂

适合的溶剂包括水和其他溶剂，例如亲脂性流体。适合的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其他硅酮、烃、乙二醇醚、甘油衍生物(例如甘油醚)、全氟化的胺、全氟化的和氢氟醚溶剂、低挥发性非氟化的有机溶剂、二醇溶剂、其他环境友好型溶剂及其混合物。

结构化剂/增稠剂

结构化液体可以从内部结构化，由此结构由初级成分(例如，表面活性剂材料)形成，和/或通过使用次级成分(例如，聚合物、粘土和/或硅酸盐材料)提供三维基质结构而从外部结构化。该组合物可以包括从0.01wt％至5wt％、或从0.1wt％至2.0wt％的结构化剂。该结构化剂典型地选自下组，该组由以下各项组成：甘油二酯和甘油三酯、硬脂酸乙二醇双酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、疏水改性的碱性可膨胀的乳液(例如Polygel W30(3VSigma))、生物聚合物，黄原胶、吉兰糖胶、及其混合物。适合的结构化剂包括氢化的蓖麻油及其非乙氧基化的衍生物。适合的结构化剂披露于US 6855680中。此类结构化剂具有螺纹样结构化系统，该系统具有一系列纵横比。其他适合的结构化剂和用于制得它们的方法描述于WO 10/034736中。

调节剂

本发明的组合物可以包括高熔点脂肪化合物。在此有用的高熔点脂肪化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自下组，该组由以下各项组成：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物、及其混合物。此类具有低熔点的化合物并非旨在被包括在此部分中。高熔点化合物的非限制性实例发现于International Cosmetic Ingredient Dictionary[国际化妆品成分词典]，第五版，1993，以及CTFA Cosmetic Ingredient Handbook[CTFA化妆品成分手册]，第二版，1992中。

鉴于提供改进的调节益处(如在施用至湿发的过程中的湿滑感、柔和以及对干发的保湿感)，高熔点脂肪化合物被以从0.1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1.5wt％至16wt％、从1.5wt％至8wt％的水平包括在该组合物中。

本发明的组合物可以包含阳离子聚合物。在组合物中阳离子聚合物的浓度典型地范围为从0.05wt％至3wt％、从0.075wt％至2.0wt％、或从0.1wt％至1.0wt％。在预期使用该组合物的pH下，适合的阳离子聚合物将具有至少0.5meq/gm、至少0.9meq/gm、至少1.2meq/gm、至少1.5meq/gm、或小于7meq/gm、以及小于5meq/gm的阳离子电荷密度，该pH的范围将大体上是从pH 3至pH 9、或在pH 4与pH 8之间。在此，聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数目与聚合物的分子量之比。此类适合的阳离子聚合物的平均分子量将大体上是在10,000与1000万之间、在50,000与500万之间、或在100,000与300万之间。

用于在本发明的组合物中使用的适合的阳离子聚合物包含阳离子含氮部分，例如季铵或阳离子质子化的氨基部分。可以将任何阴离子反离子与阳离子聚合物关联使用，只要聚合物保持溶解于水中、组合物中、或组合物的凝聚相中，并且只要反离子在物理和化学上与组合物的主要成分相容或以另外的方式不会不适当地损害组合物性能、稳定性或美感。此类反离子的非限制性实例包括卤化物(例如，氯化物、氟化物、溴化物、碘化物)、硫酸盐和甲基硫酸盐。

此类聚合物的非限制性实例描述于CTFA化妆品成分词典，第三版，埃斯特林(Estrin)、克罗斯利(Crosley)、和海恩斯(Haynes)编写(化妆品、化妆用具以及香水联合公司(The Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.)，华盛顿(1982))。

用于在该组合物中使用的其他适合的阳离子聚合物包括多糖聚合物，阳离子瓜尔豆胶衍生物，含四价氮的纤维素醚，合成聚合物，醚化纤维素、瓜尔豆胶和淀粉的共聚物。当使用的时候，在此的阳离子聚合物可溶解于组合物中或可溶解于组合物中的复合凝聚相中，该凝聚相是由上文所述的阳离子聚合物和阴离子、两性和/或兼性离子表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合凝聚物还可以与组合物中其他带电荷的材料形成。适合的阳离子聚合物描述于US 3962418；US 3958581；和US 2007/0207109中。

本发明的组合物可以包括作为调节剂的非离子聚合物。在此具有大于1000的分子量的聚亚烷基乙二醇(polyalkylene glycol)是有用的。具有以下通式的那些是有用的：

其中R⁹⁵选自下组，该组由以下各项组成：H、甲基及其混合物。调节剂，并且特别是硅酮，可以被包括在组合物中。用于本发明的组合物中的调节剂典型地包括形成乳化液体颗粒的水不溶性、水分散性、非挥发性的液体。用于在该组合物中使用的适合的调节剂是通常表征为以下项的那些调节剂：硅酮(例如，硅酮油、阳离子硅酮、硅酮胶、高折射性硅酮、以及硅酮树脂)、有机调节油(例如，烃油、聚烯烃、以及脂肪酯)或其组合，或者以另外方式在于此的水性表面活性剂基质中形成液体分散颗粒的那些调节剂。此类调节剂应该在物理和化学上是与组合物的主要组分相容的，并且不应该以另外的方式不适当地损害组合物稳定性、美感或性能。

在组合物中调节剂的浓度应该足以提供所希望的调节益处。这种浓度可以随着调节剂、所希望的调节性能、调节剂颗粒的平均大小、其他组分的类型和浓度以及其他类似因素而变化。

硅酮调节剂的浓度范围典型地是从0.01wt％至10wt％。适合的硅酮调节剂以及对于硅酮的任选的悬浮剂的非限制性实例描述于美国再公告专利号34,584；US 5104646；US5106609；US 4152416；US 2826551；US 3964500；US 4364837；US6607717；US 6482969；US5807956；US 5981681；US 6207782；US 7465439；US 7041767；US 7217777；US 2007/0286837A1；US 2005/0048549A1；US 2007/0041929A1；GB849433；DE 10036533中，将所有文献通过引用结合于此；Chemistry and Technology of Silicones[硅酮的化学与技术]，纽约：Academic Press[学术出版社](1968)；通用电气硅酮橡胶产品数据列表SE 30，SE 33，SE 54和SE 76；硅酮化合物，Petrarch Systems，Inc.[彼特拉克系统公司](1984)；以及Encyclopedia of Polymer Science and Engineering[聚合物科学与工程化百科全书]，第15卷，第2版，第204-308页，John Wiley&Sons，Inc.[约翰威利父子公司](1989)中。

本发明的组合物还可以包括从0.05wt％至3wt％的至少一种有机调节油作为调节剂，单独或与其他调节剂例如硅酮(在此所述的)组合。适合的调节油包括烃油、聚烯烃、以及脂肪酯。还适合用于在此的组合物中的是在US 5674478和US 5750122或在US 4529586；US 4507280；US 4663158；US 4197865；US 4217914；US 4381919；以及US 4422853中所描述的调节剂。

卫生学与恶臭味

本发明的组合物还可以包括蓖麻酸锌、百里酚、季铵盐(例如

)、聚乙烯亚胺(例如来自BASF[巴斯夫公司]的

)及其锌复合物、银和银化合物(尤其是被设计为缓慢释放Ag⁺或纳米银分散体的那些)中的一种或多种。

益生素

这些组合物可以包括益生素，如描述于WO 09/043709中的那些。

增泡剂

如果高的起泡是希望的，增泡剂(例如C₁₀-C₁₆烷醇酰胺或C₁₀-C₁₄烷基硫酸酯)可以典型地以1wt％至10wt％的水平掺入组合物中。C₁₀-C₁₄单乙醇和二乙醇酰胺阐述了此类增泡剂的典型的类别。此类增泡剂与高的起泡辅助表面活性剂(例如，以上提及的氧化胺、甜菜碱、以及磺基甜菜碱(sultaine))一起使用也是有利的。如果希望的话，水溶性镁和/或钙盐(例如MgCl₂、MgSO₄、CaCl₂、CaSO₄等)可以典型地以0.1wt％至2wt％的水平添加，以提供另外的泡沫并且以增强油脂去除性能。

泡沫抑制剂

用于减少或抑制泡沫形成的化合物可以掺入本发明的组合物中。泡沫抑制在如在US 4489455和US 4489574中描述的所谓“高浓度清洁工艺”中以及在前载式(front-loading-style)洗涤机中可能是特别重要的。多种多样的材料可以用作泡沫抑制剂，并且泡沫抑制剂对于本领域的技术人员而言是熟知的。参见，例如Kirk Othmer Encyclopediaof Chemical Technology[柯克·奥思默化工百科全书]，第三版，第7卷，第430-447页(John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司]，1979)。泡沫抑制剂的实例包括单羧基脂肪酸以及其中的可溶盐，高分子量烃例如石蜡，脂肪酸酯(例如，脂肪酸甘油三酯)，单价醇的脂肪酸酯，脂肪族C₁₈-C₄₀酮(例如硬脂酮)，N-烷基化的氨基三嗪，优选具有约100℃之下的熔点的蜡烃，硅酮泡沫抑制剂，以及二级醇。泡沫抑制剂描述于US 2954347；US 4265779；US4265779；US 3455839；US 3933672；US 4652392；US 4978471；US 4983316；US 5288431；US4639489；US 4749740；US 4798679；US 4075118；EP 89307851.9；EP 150872；以及DOS 2,124,526中。

对于有待用于自动洗衣机中的任何洗涤剂组合物，泡沫不应该形成到它们溢出洗涤机的程度。当使用时，泡沫抑制剂优选是以“泡沫抑制量”存在的。“泡沫抑制量”意指组合物的配制者可以选择这种泡沫控制剂的量，这个量将充分地控制泡沫以导致用于自动洗衣机中的低起泡衣物洗涤剂。

在此的组合物将通常包含从0wt％至10wt％的泡沫抑制剂。当用作泡沫抑制剂时，单羧基脂肪酸以及其中的盐将典型地以高至5wt％的量存在。优选地，使用从0.5wt％至3wt％的脂肪单羧酸酯泡沫抑制剂。典型地以高至2.0wt％的量使用硅酮泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的量。通常以从0.1wt％至2wt％的范围的量使用单硬脂酰磷酸酯泡沫抑制剂。典型地以从0.01wt％至5.0wt％的范围的量使用烃泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的水平。典型地以0.2wt％至3wt％使用醇泡沫抑制剂。

在此的组合物可以在宽的pH范围内具有清洁活性。在某些实施例中，这些组合物具有从pH 4至pH 11.5的清洁活性。在其他实施例中，这些组合物从pH 6至pH 11、从pH 7至pH 11、从pH 8至pH 11、从pH 9至pH 11、或从pH 10至pH 11.5具有活性。

在此的组合物可以在宽范围的温度(例如从10℃或更低至90℃)内具有清洁活性。优选地，该温度将是低于50℃或40℃或甚至30℃。在某些实施例中，对于这些组合物来说的最适温度范围是从10℃至20℃、从15℃至25℃、从15℃至30℃、从20℃至30℃、从25℃至35℃、从30℃至40℃、从35℃至45℃、或从40℃至50℃。

组合物的形式

在此描述的组合物被有利地用在例如洗衣应用、硬表面清洁、餐具洗涤应用、连同化妆品应用(如义齿、牙齿、头发和皮肤)中。本发明的组合物具体是固体或液体清洁和/或处理组合物。在一方面，本发明涉及一种组合物，其中该组合物的形式选自下组，该组由以下各项组成：一种规则的、压缩的或浓缩的液体；一种凝胶；一种膏；一种皂条；一种常规的或压缩的粉末；一种粒状固体；一种具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；一种具有一个或多个室的袋；一种单个或多个室单位剂型；或其任何组合。

该组合物的形式可以将多个室(例如像可水溶的袋)中或片剂的不同层中的组分物理地彼此分离。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

袋可以被配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。所述内部体积可以分成袋的室。优选的膜是高分子材料，优选被制成膜或薄片的形式的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司出售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同(US 2009/0011970A1)。

水溶性膜-本发明的组合物还可以被包封于水溶性膜之内。优选地，优选的膜材料是聚合物材料。膜材料可以是例如通过聚合物材料的铸造、吹塑、挤出或吹胀挤塑来获得，如本领域中已知的。适合用于用作袋材料的优选的聚合物、共聚物或其衍生物是选自：聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、丙烯酰胺、丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙烯乙酸酯、聚羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然胶(例如黄原胶和卡拉胶(carragum))。更优选的聚合物选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸脂共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，并且最优选地选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)、及其组合。优选地，聚合物在袋材料(例如，PVA聚合物)中的水平是至少60wt％。聚合物可以具有任何重均分子量，优选是从约1.000至1.000.000、从约10.000至300.000、从约20.000至150.000。聚合物的混合物还可以用作袋材料。

天然地，不同的膜材料和/或不同厚度的膜可以用于制作本发明的室。在选择不同的膜中的益处是所得的室可以展现不同溶解度或释放特征。

优选的膜材料是在MonoSol商标名称M8630、M8900、H8779下已知的PVA膜，以及描述于US 6166117和US 6787512中的那些，以及具有相应溶解度和变形特征的PVA膜。

在此的膜材料还可以包括一种或多种添加剂成分。例如，可以有益的是添加增塑剂，例如甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。其他添加剂包括有待被递送至洗涤用水的功能性洗涤剂添加剂，例如有机聚合物分散剂等。

制造组合物的方法

本发明的组合物可以被配制为任何适合的形式，并且可通过被配制者所选择的任何方法来制备，这些方法的非限制性实例描述于申请人的实例中以及US 4990280；US20030087791 A1；US 20030087790 A1；US 20050003983 A1；US 20040048764 A1；US4762636；US 6291412；US 20050227891 A1；EP 1070115 A2；US 5879584；US 5691297；US5574005；US 5569645；US 5565422；US 5516448；US 5489392；US 5486303中，将所有文献通过引用结合在此。本发明的组合物或根据本发明制备的组合物包括清洁和/或处理组合物，该组合物包括但不限于用于在织物和家居护理领域中处理织物、硬质表面和任何其他表面的组合物，该织物和家居护理领域包括：空气护理(包括空气清新剂和气味递送系统)、汽车护理、餐具洗涤、织物调理(包括软化和/或清新)、衣物洗涤、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬质表面清洁和/或处理(包括地板和马桶清洁剂)、颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手工餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器洗碗剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型：汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载基质的组合物(例如添加干燥剂的片层)。优选的是用于清洁和/或处理纺织品和/或硬质表面(最优选为纺织品)的组合物和方法。组合物优选地是在洗涤过程的预处理步骤中或主要洗涤步骤中(最优选用于纺织品洗涤步骤)使用的组合物。

如在此所用的，术语“织物和/或硬质表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指出，该子集包括颗粒或粉末形式通用型或“重负荷”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手工餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；织物调节组合物(包括软化和/或清新)，可以处于液体、固体和/或干燥剂片层形式；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载基质的组合物(例如添加干燥剂的片层)。所有的可应用的此类组合物可以是处于标准的、浓缩的或甚至高度浓缩的形式，甚至到此类组合物可以在某些方面呈非水性的程度。

使用方法

本发明包括在织物和/或家居护理领域中用于清洁任何表面(包括处理纺织品或硬表面或其他表面)的方法。在本发明的一方面，该方法包括在洗涤过程的预处理步骤或主要洗涤步骤(最优选用于在纺织品洗涤步骤中使用或可替代地用于在餐具洗涤(包括手动以及自动/机械餐具洗涤两者)中使用)中接触有待处理的表面的步骤。在本发明的一个实施例中，将脂肪酶变体和其他组分顺序地添加到用于清洁和/或处理表面的方法中。可替代地，同时地添加脂肪酶变体和其他组分。

如在此所用的，洗涤包括但不限于擦洗和机械搅拌。洗涤可以用泡沫组合物进行(如在WO 08/101958中所述)，和/或通过施加交变压力(压力/真空)作为擦洗和机械搅拌的附加方法或替代方式来进行。对此类表面或织物进行干燥可以通过在家庭或工业环境中采用的通用手段的任一种来完成。本发明的清洁组合物理想地适用于在洗衣以及餐具洗涤应用中使用。因此，本发明包括用于清洁物体(包括但不限于织物、餐具、刀具以及厨具)的方法。该方法包括使有待清洁的物体与所述清洁组合物接触的步骤，该清洁组合物包括申请人的清洁组合物、清洁添加剂或其混合物中的至少一个实施例。织物可以包括能够在常规消费者或公共机构使用条件下被洗涤的大多数任何织物。该溶液可以具有从8至10.5的pH。可以在溶液中以从500ppm至15.000ppm的浓度使用该组合物。水温范围典型地是从5℃至90℃。水与织物之比典型地是从1:1至30:1。

在一方面，本发明涉及使用多肽用于生产一种组合物的方法，该多肽与SEQ IDNO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％一致性。在一方面，本发明涉及该组合物用于清洁物体的用途。

在一方面，本发明涉及生产组合物的方法，该方法包括添加与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％一致性的多肽，和表面活性剂。在一方面，本发明涉及用于清洁表面的方法，该方法包括使待清洁的表面上存在的脂质污渍与该清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及用于水解存在于表面上的污渍和/或污渍中的脂质的方法，该方法包括使污渍和/或污渍与清洁组合物接触。

植物

本发明还涉及植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该多肽。该多肽可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将包含该多肽的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、适口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式有机体拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

同样包括于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的后代。

表达多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于生产多肽的条件下，培养包括了编码该多肽的多核苷酸的一种转基因植物或植物细胞；并且(b)回收该多肽。

本发明的优选实施例

在下面的一组项目中描述了本发明的优选实施例。

1.一种具有脂肪酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(c)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟脂肪酶多肽编码序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)一种多肽，该多肽是SEQ ID No：2的变体，该多肽包括取代和/或缺失和/或插入，其中该变体具有脂肪酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42个位置中的一个或多个氨基酸取代，和/或一个或多个氨基酸缺失，和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；以及

2.根据项目1所述的多肽，其中该片段具有脂肪酶活性并且包括至少225氨基酸，如至少250、至少275或至少280个氨基酸。

3.根据项目2所述的多肽，其中该片段具有脂肪酶活性并包括281、282、283、或284个氨基酸。

4.根据项目1所述的多肽，其中该变体包括取代，优选地在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置中的保守取代。

5.根据项目1至4中任一项所述的多肽，其中该多肽具有SEQ ID NO:2的多肽的至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的脂肪酶活性。

6.根据项目1所述的多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至285或由其组成。

7.根据项目1所述的多肽，其中该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核酸70至927。

8.具有作为如项目1至7中任一项所述的多肽的分子伴侣起作用的能力的分离的多肽，选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(c)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟分子伴侣多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)一种多肽，该多肽是SEQ ID No：3的变体，该多肽包括取代和/或缺失和/或插入，其中该变体包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代，和/或一个或多个氨基酸缺失，和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；以及

9.根据项目8所述的多肽，其中该变体包括取代，优选地在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置中的保守取代。

10.根据项目8所述的多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸1至271或由其组成。

11.根据项目8所述的多肽，其中该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核酸971至1786。

12.一种组合物，该组合物包括具有脂肪酶活性的多肽，其中该具有脂肪酶活性的多肽是选自下组，该组由以下各项组成：

a)根据项目1至7中任一项所述的多肽；以及

b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

13.一种组合物，该组合物包括具有脂肪酶活性的多肽，其中该具有脂肪酶活性的多肽与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

14.如项目12所述的组合物，该组合物进一步包括根据项目8至11中任一项所述的多肽。

15.如项目13所述的组合物，该组合物进一步包括根据项目8至11中任一项所述的多肽。

16.如项目12所述的组合物，该组合物进一步包括具有作为分子伴侣起作用的能力的多肽，其中该具有作为分子伴侣起作用的能力的多肽与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

17.如项目13所述的组合物，该组合物进一步包括具有作为分子伴侣起作用的能力的多肽，其中该具有作为分子伴侣起作用的能力的多肽与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

18.如项目12至17中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括至少一种表面活性剂，至少一种表面活性剂系统，至少一种皂，或其任何混合物。

19.如项目18所述的组合物，其中该表面活性剂或表面活性剂系统是选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂或其任何混合物。

20.如项目12至19中任一项所述的组合物，其中该组合物进一步包括选自下组的一种或多种另外的酶，该组由以下各项组成：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、α-淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶、和过氧化物酶。

21.如项目12至20中任一项所述的组合物，其中该组合物是衣物清洁组合物、餐具清洁组合物、硬表面清洁组合物和/或个人护理清洁组合物。

22.如项目12至21中任一项所述的组合物，其中该组合物配制为一种常规的、压缩的或浓缩的液体；一种凝胶；一种膏；一种皂条；一种常规的或压缩的粉末；一种粒状固体；一种具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；一种具有一个或多个室的袋；一种单个或多个室单位剂型；或其任何组合。

23.一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括如项目1至7中任一项所述的多肽或如项目12至22中任一项所述的组合物以及至少一种螯合剂；至少一种磺化聚合物；至少一种助水溶物；至少一种助洗剂和/或共助洗剂；至少一种香料；和/或至少一种漂白系统。

24.如项目23所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物是液体衣物洗涤剂组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、液体餐具洗涤洗涤剂组合物、或粉末餐具洗涤洗涤剂组合物。

25.根据项目23至24所述的洗涤剂组合物在衣物洗涤、手动餐具洗涤或自动餐具洗涤中的用途。

26.根据项目25所述的用途，其中所述用途是在低温下衣物洗涤或自动餐具洗涤，如低于60℃、如低于55℃、如低于50℃、如低于45℃、如低于40℃、如低于35℃、如低于30℃、如低于25℃、如低于20℃、如低于15℃。

27.一种洗涤的方法，该方法包括使用根据项目23至24中任一项所述的洗涤剂组合物洗涤织物，优选地在40℃或更低的温度下、或更优选地在30℃或更低的温度下、或甚至更优选地在20℃或更低的温度下进行该洗涤。

28.一种使用如项目23至24中任一项所述的洗涤剂组合物在自动餐具洗涤机器中的餐具洗涤方法，该方法包括以下步骤：将所述洗涤剂组合物添加在所述自动餐具洗涤机器中的洗涤组合物室内，并且在主洗涤循环期间释放所述洗涤剂组合物。

29.用于水解脂质的方法，该方法包括使脂质与如项目1至7中任一项所述的多肽、如项目12至22中任一项所述的组合物或如项目23至24中任一项所述的洗涤剂组合物接触。

30.用于清洁物体的方法，该方法包括使存在于有待清洁的物体上的脂质污渍与根据项目1至7中任一项所述的多肽、如项目12至22中任一项所述的组合物或如项目23至24中任一项所述的洗涤剂组合物接触。

31.用于清洁物品的方法，该方法包括使存在于有待清洁的物品上的脂质污渍与根据项目1至7中任一项所述的多肽、如项目12至22中任一项所述的组合物或如项目23或24中任一项所述的洗涤剂组合物接触。

32.一种编码根据项目1至7中任一项所述的多肽或根据项目8至10中任一项所述的多肽的分离的多核苷酸。

33.如项目32所述的多核苷酸，其中修饰该多核苷酸以对应于旨在用于多肽的重组生产的宿主细胞的密码子使用。

34.一种核酸构建体或表达载体，包括可操作地连接至一个或多个控制序列的如项目16所述的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多肽在表达宿主中的产生。

35.一种包括根据项目32或33中任一项所述的多核苷酸的核酸构建体。

36.一种表达载体，包括编码根据项目1至7中任一项所述的多肽和/或根据项目8至11中任一项所述的多肽的多核苷酸。

37.一种宿主细胞，包括编码根据项目1至7中任一项所述的多肽和/或根据项目8至11中任一项所述的多肽的多核苷酸。

38.一种产生根据项目1至7中任一项所述的多肽和/或根据项目8至11中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：(a)在适合多肽表达的条件下培养如项目37所述的宿主细胞；并且(b)回收该多肽。

39.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括可操作地连接至一个或多个控制序列的如项目32至33中任一项所述的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多肽的产生。

40.一种产生如项目1至10中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如项目39所述的重组宿主细胞；并且

(b)回收该多肽。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

培养基和溶液

除非另外指明，用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。可商购的酶Lipolase^TM和Lipex^TM获自诺维信公司。

Lipolase^TM包括来自疏棉状嗜热丝孢菌的、在米曲霉中表达的野生型三酰基甘油脂肪酶。

Lipex^TM包括衍生自野生型疏棉状嗜热丝孢菌三酰基甘油脂肪酶的、具有突变T231R和N233R的并且在米曲霉中表达的三酰基甘油脂肪酶。

脂肪酶测定：对脂肪酸pNP酯的水解活性

可以在动力学测定中，使用对硝基苯基酰基酯作为底物，来确定针对不同脂肪酸的水解活性。将以下这些底物在DMSO中的100mM储备溶液在测定缓冲液(对于pH 5，使用50mM乙酸盐，0.4％TritonX-100；对于pH 7，50mM HEPES，0.4％TritonX-100，以及对于pH9，50mM Tris，0.4％TritonX-100)中稀释至1mM的终浓度：对硝基苯基丁酸酯(C3)、对硝基苯基己酸酯(C6)、对硝基苯基癸酸酯(C10)、对硝基苯基月桂酸酯(C12)和对硝基苯基棕榈酸酯(C16)(所有都来自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；目录号：C3:N-9876、C6:N-0502、C10:N-0252、C12:N-2002、C16:N-2752)。

在对应于存在10ppm TritonX-100的测定pH的缓冲液中，将用于测定的样品和适当的对照(缓冲液(阴性)、LipexTM(阳性))，按0.01mg/ml；5x10-3mg/ml；2.5x10-4mg/ml；和1.25x10-4mg/ml的以下终浓度添加至96孔NUNC平板(目录号：260836)中的底物溶液中。为了评估Ca⁺⁺的影响，将2mM CaCl2(终浓度)添加至一半的样品中。

可以在Spectra max 190(分子设备股份有限公司(Molecular Devices GmbH))上，以10秒间隔，在320nm，pH 5，和405nm，pH 7与9处监测由对硝基苯基酰水解而释放的对硝基苯酚，持续5分钟。

实例1：脂肪酶及其分子伴侣的鉴定

在食五环芳烃加利西亚单胞菌(Gallaecimonas pentaromativorans)型菌株(DSM21945)中鉴定编码本发明脂肪酶及其内在分子伴侣的多顺反子操纵子(SEQ ID NO:1)。两个开放阅读框被单个胞嘧啶分开。

实例2：来自食五环芳烃加利西亚单胞菌(Gallaecimonas pentaromativorans)的脂肪酶的克隆和表达。

食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pentaromativorans)脂肪酶在大肠杆菌中由合成基因表达。该合成基因基于SEQ ID NO:1和为了在大肠杆菌中表达而优化的密码子设计。该表达的DNA序列是编码全长蛋白(SEQ ID NO:2)成熟部分的SEQ ID NO：4。

表达载体

设计用于大肠杆菌的任何表达载体将适合在大肠杆菌表达菌株中表达食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pectoromativorans)脂肪酶。在这种情况下，使用pIVT2(图1)作为表达载体。该基因的表达由T7启动子驱动(Methods in Enzymology[酶学方法]，第185卷，第60-89页)。pIVT2载体包含两个核糖体识别位点，Shine-Dalgarn位点，T7终止子，氨苄青霉素抗性基因(AmpR)以便使可能选择大肠杆菌中的转化体，以及大肠杆菌复制起点(Col E1起点)。

表达克隆

获得对应于编码的脂肪酶的成熟部分的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。使用以下引物((F-脂肪酶和R-脂肪酶)和标准分子学方法将对应于编码的脂肪酶的成熟部分的插入物进行PCR扩增。

F-脂肪酶：

5’-AAGGAGATAAACATATGTCAGGTTATACCCAGACCAAATATCCGAT-3’(SEQ ID NO:10)

R-脂肪酶：

5’-GGTTAGTTAGAAGCTTACAGACCCAGATTTTTCAGACGATTTGCC-3’(SEQ ID NO:11)

将NdeI限制性位点并入正向引物(F-脂肪酶)，并且将HindIII限制性位点并入反向引物(R-脂肪酶)，以便于使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒(BD生物科学公司(BDBiosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州，美国)，将该片段直接克隆到表达载体pIVT2中。表达载体pIVT2用相同的限制酶(NdeI和HindIII)消化。根据IN-FUSION^TM克隆试剂盒说明进行克隆方案。根据生产商的方案将处理的质粒和插入物转化进One

TOP10F^TM化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州，美国)中。将插入物整合到载体中，并且使用可商购的载体引物(M13_Fw(-20)和M13_Rv(-27))通过对分离的质粒进行测序来验证插入物的核苷酸序列。根据生产商的方案，将没有PCR错误的代表性质粒表达克隆转化到BL21(DE3)感受态细胞(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))中。

大肠杆菌细胞内表达

包含附加体质粒表达克隆的重组大肠杆菌BL21(DE3)克隆在液体培养物中生长。根据生产商提供的方案(使用BL21(DE3)(C2527)进行蛋白表达)进行脂肪酶表达。简而言之，用10ml的新鲜生长的培养物接种1L是液体培养基(具有氨苄青霉素)。在37℃孵育。250rpm直到OD₆₀₀达到0.4-0.8。添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至终浓度400μM，并继续在30℃，250rpm发酵4小时。通过离心沉淀细胞并将获得的细胞沉淀重悬于pH7.5的50mM Tris缓冲液中。在17,500PSI，使用细胞破碎机(TS series Bench Top model，Constant Systems，英国)通过细胞裂解来促进胞内表达的脂肪酶的释放。通过离心将总裂解物分成可溶和不溶样品，并且通过SDS-page评估总蛋白表达。在不溶样品中发现脂肪酶为包涵体。将不溶样品在50mM Tris pH 7.5中洗涤两次，并如实例5所述纯化酶(SEQ IDNO:2)。

实例3：来自食五环芳烃加利西亚单胞菌(Gallaecimonas pentaromativorans)的分子伴侣的克隆和表达

食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pentaromativorans)分子伴侣在大肠杆菌中由合成基因表达。该合成基因基于SEQ ID NO:1(食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pentaromativorans)多顺反子操纵子)和为了在大肠杆菌中表达而优化的密码子设计。用于表达的DNA序列是SEQ ID NO:5。食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pectoromativorans)分子伴侣的成熟部分的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中。

编码大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的基因衍生自大肠杆菌菌株K12。核酸序列示于SEQID NO:6中。对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:7中。

表达载体

设计用于大肠杆菌的任何表达载体将能够支持大肠杆菌表达菌株中食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pentaromativorans)的表达。这样的实例是可商购的基于pET的表达系统和大肠杆菌表达菌株BL21或BL21(DE3)(生命技术公司(LifeTechnologies))或XJAutolysis(Zymoresearch公司)。

在这种情况下，使用pIVT3(图2)作为表达载体。该基因的表达由T7启动子驱动。pIVT3载体包含两个核糖体识别位点，Shine-Dalgarn位点，T7终止子，卡那霉素抗性基因(KanR)以便使可能选择大肠杆菌中的转化体，以及大肠杆菌复制起点(Col E1起点)。6号组氨酸标签在阅读框内位于AvrII限制性位点的5’。

表达克隆

将编码食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.Pentaromativorans)分子伴侣的成熟部分的基因与编码大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的基因的3’末端融合。42个碱基对长的接头序列AATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAAC(SEQ ID NO:12)

是占据编码分子伴侣和麦芽糖结合蛋白的基因之间。在表达载体pIVT3上编码的6x组氨酸标签在阅读框内被融合到大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的成熟核苷酸序列的5’末端。该融合蛋白的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO:8。该融合蛋白的氨基酸序列示于SEQ IDNO:9。

获得编码食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pentaromativorans)分子伴侣的成熟部分的合成基因(SEQ ID NO:5)。使用以下引物(F-分子伴侣和R-分子伴侣)和标准分子方法将对相应于编码的分子伴侣的成熟部分的插入物进行PCR扩增。将HindIII限制性位点并入反向引物(R-分子伴侣)中以便于使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒(BD生物科学公司(BDBiosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州，美国)，将该片段直接克隆到表达载体pIVT3中。用于将食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pentaromativorans)分子伴侣融合到大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的接头序列包括在正向引物(F-分子伴侣)中。

F-分子伴侣：

5’-5’-AATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACGGTCTGCTGTATCTGGTTTTTCCGG-3’(SEQ ID NO:13)

R-分子伴侣：

5’-TGGTTAGTTAGAAGCTTACTGCATACCATTGCTCAGCCACA-3’(SEQ ID NO:14)

使用以下引物和标准分子方法，将对应于编码的大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)的成熟部分的核苷酸序列从大肠杆菌K12基因组DNA进行PCR扩增。将AvrII限制性位点并入正向引物(F-MBP)中以便于使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒(BD生物科学公司(BDBiosciences))，将该片段直接克隆到表达载体pIVT3中。用于将食五环芳烃加利西亚单胞菌(G.pentaromativorans)分子伴侣融合到大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的接头序列包括在反向引物(R-MBP)中。

F-MBP：5’-CCATCACCACCCTAGGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGA-3’(SEQ IDNO:15)

R-MBP：5’-GTTGTTGTTATTGTTATTGTTGTTGTTGTTCGAGCTCGAATTAGTCTGCGCGTCTTTCAGGGCTTCATCGACAGTCTGACGACCGCTGGC-3’(SEQ ID NO:16)

使用先前用于PCR扩增单个PCR产物(F-MBP和R-分子伴侣)的侧翼引物，通过重叠延伸PCR将两个PCR产物剪接成单个扩增子。表达载体pIVT3用相同的限制酶(AvrII和HindIII)消化。根据IN-FUSION^TM克隆试剂盒说明进行克隆方案。根据生产商的方案将处理的质粒和扩增子转化进One

TOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(Invitrogen)，，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州，美国)中。将插入物整合入载体中，并且使用可商购的载体引物(M13_Fw(-20)和M13_Rv(-27))(生命技术公司(LifeTechnologies))以及以下测序引物(Seq1、Seq2和Seq3)，通过对分离的质粒进行测序来验证插入物的核苷酸序列。

Seq1：5’-CAAGCTGATTGCTTACCCGATC-3’(SEQ ID NO:17)

Seq2：5’-AAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTG-3’(SEQ ID NO:18)

Seq3：5’-GCAGATATTAATGCAGCACTGGC-3’(SEQ ID NO:19)

根据生产商的方案，将没有PCR错误的代表性质粒表达克隆转化到BL21(DE3)感受态细胞(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))中。

实例4：重组大肠杆菌的发酵

通过用10ml的新鲜生长的培养物接种1L的液体培养基(具有卡那霉素)，将包含附加体质粒表达克隆的重组大肠杆菌BL21(DE3)克隆在液体培养物中生长。在37℃孵育250rpm直到OD₆₀₀达到0.4-0.8。添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至终浓度400μM，并继续在30℃，250rpm发酵4小时。通过离心沉淀细胞并将获得的细胞沉淀重悬于pH7.5的50mM Tris缓冲液中。在17,500PSI，使用细胞破碎机(TS series Bench Top model，Constant Systems，英国)通过细胞裂解来释放胞内表达的分子伴侣。通过离心将总裂解物分成可溶和不溶样品，并且通过SDS-page评估总蛋白表达。在可溶样品中并且作为包涵体，均发现了分子伴侣。该可溶样品被用于进一步工作，并且将该融合蛋白(SEQ ID NO:9)如实例中所述进行纯化。

实例5：纯化和重折叠

通过离心收获表达分子伴侣融合蛋白的细胞，并且重悬于50mM Tris(pH 7.5)的50mL(每升细胞培养物)中。随后，将这些细胞在17,500psi下，在细胞破碎机(ConstantSystems LTD)中破碎。将裂解物在4℃以10,000g离心10分钟以去除细胞碎片，并用0.2μmNalgene^TM Rapid-Flow^TM无菌一次性过滤器过滤。

将无菌上清液应用于用50mM HEPES(pH 8)平衡的15ml His-Trap excel柱(通用电气医疗集团(GE healthcare))。用5倍柱体积(CV)洗涤柱后，将分子伴侣融合蛋白用50mMHEPES(pH 8)，0.8M咪唑洗脱。汇集具有高A280吸光度的级分。

将收获为包涵体的脂肪酶蛋白质溶解在50mM HEPES(pH 7.5)+8M尿素+73mM二硫赤藓糖醇(来自1L培养物的10ml缓冲液/包涵体)中。在Superdex200柱上进行重折叠。将柱在2CV 50mM HEPES(pH 7.5)，300mM NaCl，0.75M精氨酸中平衡，并且然后装载1/3CV的50mMHEPES(pH 7.5)、300mM NaCl、0.75M精氨酸、1mM L-谷胱甘肽以及纯化的LIF。

将10ml的再溶解的脂肪酶蛋白注射到柱上并与分子伴侣一起进行重折叠。收集级分并检查橄榄油板(1.25％橄榄油，0.008％亮绿，1％琼脂糖，0.07％聚乙烯醇，50mMHEPES(pH 7.2))上的活性。将20μl等分试样的不同级分、缓冲液(阴性对照)、和Lipolase^TM和Lipex^TM(阳性对照)各自分配到直径为3mm的冲孔中并且在室温下孵育4-6小时。通过在冲孔周围出现蓝色环来将活性可视化，表明由于源自橄榄油甘油三酯水解的游离脂肪酸的存在，导致pH下降。

实例6：酶表征

底物特异性：

当使用如在此披露的“脂肪酶测定：对脂肪酸pNP酯的水解活性”进行测试时，本发明的脂肪酶对更短链的酰基酯具有最高的活性，在三个测试的pH值5、7和9下，对于pNP-己酸酯(C6)作为底物具有最大的活性(参见下表2)。随着pNP酰基酯的脂肪酸链更短和更长，活性降低，并且在任何测试的pH值下测量到对于pNP-棕榈酸酯(C16)没有活性。

表2：使用pNP酰基酯对不同脂肪酸链长度的本发明的脂肪酶的活性。

Ca⁺⁺依赖性

当使用如在此披露的“脂肪酶测定：对脂肪酸pNP酯的水解活性”进行测试时，活性是Ca⁺⁺依赖性的，并且当没有钙存在时，活性显著降低。

表3：在添加或不添加2mM CaCl₂和0.01mg/mL酶浓度的情况下，在pH 7下比较对 pNP-己酸酯(C6)的脂肪酶活性

实例7：通过差示扫描量热法测定Td。

使用一台VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡塔韦,新泽西州，美国)通过差示扫描热量测定(DSC)测定本发明脂肪酶的热稳定性。在200K/小时的恒定的程序化加热速率下，加热在缓冲液(50mM Hepes，pH 8.0)中的酶溶液(大约0.5mg/ml)后获得的热分析图(Cp对T)中，将热变性温度Td(℃)当作变性峰(主要的吸热峰)的顶端。

将样品溶液和参比溶液(大约0.2ml)从10℃下的储存条件下装载到量热仪中(参比溶液：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃至100℃进行DSC扫描。以大约+/-1℃的精确度确定变性温度。

与分子伴侣融合蛋白复合时，脂肪酶的热稳定性高，Td值在79.9-94.1℃的范围内。在类似实验条件下的非平行试验中，测量Lipolase的热稳定性，具有77.0℃的Td值。

实例8：相对的洗涤性能

为了评估具有不同浓度的表面活性剂(pH 8、9和10)的洗涤剂在衣物洗涤中的洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。

AMSA平板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压衣物洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，将平板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special methodembodiments)”段落。

在不同pH的甘氨酸缓冲液中并且在具有不同表面活性剂水平和具有不同pH的标准洗涤剂中进行衣物洗涤实验。实验条件在以下指定：

表4：洗涤剂缓冲液

表5：洗涤剂组合物(wt％)

用NaOH或柠檬酸进行最后调节至指定pH。通过添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺:Mg²⁺＝4:1)，将水硬度调节至15°°dH。

洗涤之后，将纺织品在自来水中沖洗并且使用滤纸将过量的水从纺织品中去除，并且之后立即将纺织品在85℃下干燥5min。

将洗涤性能测量为所洗涤的脏纺织品的颜色变化。该污渍是与姜黄混合的奶油。姜黄包含着色剂姜黄素，其作为pH指示剂通过具有pH依赖性颜色变化起作用。脂肪酶活性导致游离脂肪酸从乳脂酰基甘油酯释放并且这导致pH降低并且由此导致姜黄素pH指示剂的颜色变化。脂肪酶洗涤性能因此可以被表示为当用白光照亮时，从所洗涤的脏纺织品反射的光的变色程度。

使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，[Kodak柯达]，Midtager 29，DK-2605

，丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤的脏纺织品的图像。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。可以通过将RGB值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值(Int)：

归因于脂肪酶活性的颜色变化被测量为相对于总反射光的强度(Int)，绿光(G)的反射的增加。相对于参比脂肪酶(Lipolase^TM)，脂肪酶的洗涤性能(RP(洗涤))被计算为：RP(洗涤)＝(G/(B+R)(测试的脂肪酶)-G/(B+R)(无酶))/(G/(B+R)(参比脂肪酶)-G/(B+R)(无酶))，并将结果呈现于下表6中。

表6：本发明的脂肪酶的相对洗涤性能

这些结果证明，在存在表面活性剂的所有情况下，本发明的脂肪酶与参比脂肪酶Lipolase相比具有改进的洗涤性能。在pH 9和10时，改进的性能特别大。

实例8：在脂质包衣纤维素上的活性

性能(即水解活性)通过测量在标准洗涤剂中，在增加的表面活性剂水平下，由本发明的脂肪酶的纯化蛋白样品和参比脂肪酶Lipex释放4-甲基伞形酮(4-MU)来确定。

在初始底物制备步骤中，将纤维素(Avicel)用甘油三酯和4-甲基伞形酮油酸(4-MU油酸)的混合物来包衣。在该测定中，包衣的纤维素纤维在缓冲液、洗涤剂溶液和脂肪酶溶液中悬浮。通过测量在Ex:365nm和Em:445nm下作为时间函数的荧光来监测在纤维素悬浮液中的脂肪酶活性。

表7：标准洗涤剂组合物(wt％)

用于孵育的HEPES缓冲液是基于以下储备溶液：1M HEPES、5mM CaCl₂、50ppmTriton X-100。用4M NaOH调节至pH 8.5。

通过将668uL的4-MU-油酸原液(4mg/mL 4-甲基伞形酮油酸在己烷中)和3.03mL橄榄油原液移液至在用于旋转蒸发器的圆底烧瓶中的100mL己烷中来制备包衣的纤维素纤维，并且适当混合，之后添加10g纤维素纤维。将烧瓶安装到旋转蒸发器上，并且通过在减压和恒混合(通过旋转)下蒸发去除己烷，以确保底物在纤维素上均匀地包衣。完全去除己烷以后，将包衣的纤维素纤维转至棕色烧瓶中并将材料在避光-20℃下储存直至使用。

通过将180uL的底物悬浮液转移至黑色微孔微量滴定板(例如Nunclon surface，具有黑底的96孔黑色板，NUNC 137101)的各孔中进行测定。在移液时重要的是要保持底物悬浮液恒定、充分的混合以确保相同量的包衣的纤维素纤维被转移至微量滴定板的各孔中。

以添加20uL的孵育溶液来开始测定。应在添加洗涤剂工作溶液(1.835g标准洗涤剂(表4)，100ml 1M HEPES缓冲液，通过向测试系统添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺:Mg²⁺＝4:1)，将水硬度调节至15°dH，并且最终使用Milli Q水调节至500mL，并且用4M NaOH将pH调节至pH8.5)之后，立即添加酶孵育溶液。对于空白，添加20uL脂肪酶孵育缓冲液。

在酶添加之后从1至6分钟，通过每隔30秒测量在Ex：365nm和Em：445nm处的荧光(动态模式)来获得酶活性。在第一次测量之前通过摇动5秒钟来混合板，但是在接下来的测量之间不再这样做。在室温下，即在大约20℃下进行测定。

酶添加后，使用1-6分钟时间窗，将活性计算为荧光对比时间的图的斜率(单位：RFU/秒，其中RFU是相对荧光信号单位)，并将结果呈现在下表8中。

表8：通过脂质包衣的纤维素测定确定脂肪酶活性

¹：比较总表面活性剂水平与典型的高级商业EU洗涤剂中的表面活性剂的估计平均水平(定义为100％表面活性剂水平)

这些结果证明，与参比脂肪酶Lipolase相比，本发明的脂肪酶具有更高的动力学活性。

序列表

<110> 诺维信公司(Novozymes A/S)

<120> 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸

<130> 13125-WO-PCT

<150> EP15172368.1

<151> 2015-06-16

<160> 21

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1786

<212> DNA

<213> 食五环芳烃加利西亚单胞菌

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1786)

<223> WT 食五环芳烃加利西亚单胞菌脂肪酶和分子伴侣的多顺反子操纵子的DNA序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(69)

<223> 脂肪酶分泌信号的DNA序列1..69 bp

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (70)..(927)

<223> 成熟脂肪酶的DNA序列70..927 bp

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (929)..(970)

<223> 分子伴侣分泌信号的DNA序列929..970 bp

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (971)..(1786)

<223> 成熟分子伴侣的DNA序列 971.. 1786 bp

<400> 1

atgtcactca agtctctgtt tttggggctg gcgctgctgt gcgccttgcc tgtccaaccg 60

gccgctgcca gcggctatac ccaaaccaaa taccctatcg ttctggttca cggccttttt 120

gggtttgatt cactggctgg ggtcgattat tggtacggca taccgcaggc ccttagccaa 180

gacggcgcca cggtctatgt ggtgaacgtg tcggcggcca acagcaccga agtgcggggc 240

gaacagttgc tggtgcaaat cgataacatc ctggcgctta ccggcgccaa gaaggtcaac 300

ctgattggcc attcccacgg cggccccact gcccgctatg cggcgtccat cagcccgggc 360

aaggtggcgt cggtcacttc ggtgggcggc gttaactggg gctcgcgctt tgccgatgcc 420

ctgcgcggta ccattgcgcc cggtagcgtg tcggaaagcg tgattggcgc cgccgccaac 480

gccttttcga gcattatcga gttcctctct ggcactccgg ccgacccgca agactcggtg 540

gcggcgctca atgccctgac caccgccggc tcgctggcct ttaacgccag ctaccccgaa 600

ggcatgccca gccaatattg cggccagggc cagatgcagg ccgccaacgg cgtttattac 660

ttctcctgga gtggcgccag cccgctcacc aatgtgctgg acgttaccga cgccgccctg 720

ggcctcacct ccctggtgtt tggcgaaagc aacgacggcc tggtgtctag ctgctcaagc 780

cacttgggta aggtgatccg tgacgactac gccatgaacc acctcgatga ggttaaccag 840

accttcggcc tggtcagcct gtttgaaacc aaccccaaga cgctttatcg caaccaggca 900

aacaggctca aaaacctggg gctttaacat gaagcccttc acgatcatgg tgccggtgtt 960

ggcggtggcc ggcctcttgt acctggtgtt tcccgagcgc caccccatgg cgccggtaaa 1020

ggctgccgcc agcctggctg acacccaggt tgatggcgcc gtgggcagcc gctaccgcat 1080

gagcgccgct ctaaaagccc gctttgacta ctggctgagc gccgtgggcg aattgccgct 1140

ctcggcgctg ccaggcaagc tggcccagtc gctgcgccag gacggctggg ccgaggcgga 1200

tatcaacgcg gcgctggccg cctttgccca ctaccagcag tatctggacg ccttaagtga 1260

ggttgccaag cctcaggcgg ctgcggccgc cgagctaaag gcagcctggg ccgagcggga 1320

cgccctgcgc cgccagtttt acgcggaggc tgagatcaag ctgctgtggg gcgacgaggc 1380

ggcggtggag gatttcaccc tgcgccgcct ggagatccag agtctcgggc tgagcgaagg 1440

cgaacagctc aaatgggagg aagacgccct ggcccaggca ccggcaacgg tgcagcaagc 1500

ctacggcccc agcctgaagt tggcgcagtt gcagcagatg aacggggcca gccgtgacca 1560

actggcagcc cagtatggcg acggcgccgc cgaccggctg atggccgcca aggcgcagca 1620

gcaggggtgg cagggcaagg tggcagccta ccgtgacaag gtaaaaagcc tggcggcgct 1680

acccagcgcc gagaaggccc aggccctggc cgaataccag gcgcgccact tctcggccaa 1740

cgagttaaag cgcttgcggg tgtggctcag taacggcatg caataa 1786

<210> 2

<211> 285

<212> PRT

<213> 食五环芳烃加利西亚单胞菌

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(285)

<223> WT 食五环芳烃加利西亚单胞菌脂肪酶的成熟肽序列1..285

<400> 2

Ser Gly Tyr Thr Gln Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Leu

1 5 10 15

Phe Gly Phe Asp Ser Leu Ala Gly Val Asp Tyr Trp Tyr Gly Ile Pro

20 25 30

Gln Ala Leu Ser Gln Asp Gly Ala Thr Val Tyr Val Val Asn Val Ser

35 40 45

Ala Ala Asn Ser Thr Glu Val Arg Gly Glu Gln Leu Leu Val Gln Ile

50 55 60

Asp Asn Ile Leu Ala Leu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asn Leu Ile Gly

65 70 75 80

His Ser His Gly Gly Pro Thr Ala Arg Tyr Ala Ala Ser Ile Ser Pro

85 90 95

Gly Lys Val Ala Ser Val Thr Ser Val Gly Gly Val Asn Trp Gly Ser

100 105 110

Arg Phe Ala Asp Ala Leu Arg Gly Thr Ile Ala Pro Gly Ser Val Ser

115 120 125

Glu Ser Val Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ala Phe Ser Ser Ile Ile Glu

130 135 140

Phe Leu Ser Gly Thr Pro Ala Asp Pro Gln Asp Ser Val Ala Ala Leu

145 150 155 160

Asn Ala Leu Thr Thr Ala Gly Ser Leu Ala Phe Asn Ala Ser Tyr Pro

165 170 175

Glu Gly Met Pro Ser Gln Tyr Cys Gly Gln Gly Gln Met Gln Ala Ala

180 185 190

Asn Gly Val Tyr Tyr Phe Ser Trp Ser Gly Ala Ser Pro Leu Thr Asn

195 200 205

Val Leu Asp Val Thr Asp Ala Ala Leu Gly Leu Thr Ser Leu Val Phe

210 215 220

Gly Glu Ser Asn Asp Gly Leu Val Ser Ser Cys Ser Ser His Leu Gly

225 230 235 240

Lys Val Ile Arg Asp Asp Tyr Ala Met Asn His Leu Asp Glu Val Asn

245 250 255

Gln Thr Phe Gly Leu Val Ser Leu Phe Glu Thr Asn Pro Lys Thr Leu

260 265 270

Tyr Arg Asn Gln Ala Asn Arg Leu Lys Asn Leu Gly Leu

275 280 285

<210> 3

<211> 271

<212> PRT

<213> 食五环芳烃加利西亚单胞菌

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(271)

<223> WT 食五环芳烃加利西亚单胞菌分子伴侣的成熟肽序列1..271

<400> 3

Gly Leu Leu Tyr Leu Val Phe Pro Glu Arg His Pro Met Ala Pro Val

1 5 10 15

Lys Ala Ala Ala Ser Leu Ala Asp Thr Gln Val Asp Gly Ala Val Gly

20 25 30

Ser Arg Tyr Arg Met Ser Ala Ala Leu Lys Ala Arg Phe Asp Tyr Trp

35 40 45

Leu Ser Ala Val Gly Glu Leu Pro Leu Ser Ala Leu Pro Gly Lys Leu

50 55 60

Ala Gln Ser Leu Arg Gln Asp Gly Trp Ala Glu Ala Asp Ile Asn Ala

65 70 75 80

Ala Leu Ala Ala Phe Ala His Tyr Gln Gln Tyr Leu Asp Ala Leu Ser

85 90 95

Glu Val Ala Lys Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Ala

100 105 110

Trp Ala Glu Arg Asp Ala Leu Arg Arg Gln Phe Tyr Ala Glu Ala Glu

115 120 125

Ile Lys Leu Leu Trp Gly Asp Glu Ala Ala Val Glu Asp Phe Thr Leu

130 135 140

Arg Arg Leu Glu Ile Gln Ser Leu Gly Leu Ser Glu Gly Glu Gln Leu

145 150 155 160

Lys Trp Glu Glu Asp Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Thr Val Gln Gln

165 170 175

Ala Tyr Gly Pro Ser Leu Lys Leu Ala Gln Leu Gln Gln Met Asn Gly

180 185 190

Ala Ser Arg Asp Gln Leu Ala Ala Gln Tyr Gly Asp Gly Ala Ala Asp

195 200 205

Arg Leu Met Ala Ala Lys Ala Gln Gln Gln Gly Trp Gln Gly Lys Val

210 215 220

Ala Ala Tyr Arg Asp Lys Val Lys Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ser Ala

225 230 235 240

Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Arg His Phe Ser Ala

245 250 255

Asn Glu Leu Lys Arg Leu Arg Val Trp Leu Ser Asn Gly Met Gln

260 265 270

<210> 4

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成基因

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(858)

<223> 成熟脂肪酶的DNA序列 1..858 bp

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(858)

<223> 编码成熟脂肪酶的密码子优化的DNA序列 1..858 bp

<400> 4

tcaggttata cccagaccaa atatccgatt gttctggttc atggtctgtt tggttttgat 60

agcctggcag gcgttgatta ttggtatggt attccgcagg cactgagcca ggatggtgca 120

accgtttatg ttgttaatgt tagcgcagca aatagcaccg aagttcgtgg tgaacagctg 180

ctggttcaga ttgataatat tctggcactg accggtgcca aaaaagttaa tctgattggt 240

catagccatg gtggtccgac cgcacgttat gcagcaagca ttagtccggg taaagttgca 300

agcgttacca gcgttggtgg tgttaattgg ggtagccgtt ttgcagatgc actgcgtggc 360

accattgcac cgggtagcgt tagcgaaagc gttattggtg cagcagcaaa tgcctttagc 420

agcattattg aatttctgag cggtacaccg gcagatccgc aggatagcgt tgcagcactg 480

aatgcactga ccaccgcagg tagcctggcc tttaatgcaa gctatccgga aggtatgccg 540

agccagtatt gtggtcaggg tcagatgcag gcagccaatg gtgtttatta ctttagctgg 600

tcaggtgcaa gtccgctgac caatgttctg gatgttaccg atgcagccct gggtctgacc 660

agcctggttt ttggtgaaag caatgatggt ctggttagca gctgtagcag ccatctgggt 720

aaagtgattc gtgatgatta tgcaatgaac cacctggatg aagtgaatca gacctttggc 780

ctggttagcc tgtttgaaac caatccgaaa accctgtatc gtaatcaggc aaatcgtctg 840

aaaaatctgg gtctgtaa 858

<210> 5

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成基因

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(816)

<223> 成熟分子伴侣的DNA序列 1..816 bp

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(816)

<223> 编码成熟分子伴侣的密码子优化的DNA序列1..816 bp

<400> 5

ggtctgctgt atctggtttt tccggaacgt catccgatgg caccggttaa agcagcagca 60

agcctggcag atacccaggt tgatggtgca gttggtagcc gttatcgtat gagcgcagca 120

ctgaaagcac gttttgatta ttggctgagc gcagttggtg aactgccgct gagtgcactg 180

cctggtaaac tggcacagag cctgcgtcag gatggttggg ctgaagcaga tattaatgca 240

gcactggcag catttgcaca ttatcagcag tatctggatg cactgagcga agttgcaaaa 300

ccgcaggcag cagcagccgc tgaactgaaa gccgcatggg cagaacgtga tgcactgcgt 360

cgtcagtttt atgcagaagc cgaaattaaa ctgctgtggg gtgatgaagc agcagttgaa 420

gattttaccc tgcgtcgcct ggaaattcag agcctgggtc tgagtgaagg tgaacagctg 480

aaatgggaag aagatgcact ggcccaggca ccggcaaccg ttcagcaggc atatggtccg 540

agcctgaaac tggcgcagct gcagcagatg aatggtgcaa gccgtgatca gctggcagca 600

cagtatggtg atggtgccgc agatcgtctg atggcagcaa aagcacagca gcagggttgg 660

cagggcaaag ttgcagcata tcgtgataaa gttaaaagtc tggcagccct gccgagcgca 720

gaaaaagcgc aggcactggc cgaatatcag gcacgtcatt ttagcgcaaa cgaactgaaa 780

cgtctgcgtg tgtggctgag caatggtatg cagtaa 816

<210> 6

<211> 1101

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1101)

<223> 编码大肠杆菌成熟麦芽糖结合蛋白的DNA序列

1..1098 bp

<400> 6

Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala

1 5 10 15

Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr

20 25 30

Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Ala Ala Ala Gly Gly Cys

35 40 45

Thr Ala Thr Ala Ala Cys Gly Gly Thr Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly

50 55 60

Ala Ala Gly Thr Cys Gly Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr

65 70 75 80

Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys Cys Gly Gly Ala

85 90 95

Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Thr Gly

100 105 110

Ala Gly Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Thr

115 120 125

Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Cys Cys Ala

130 135 140

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly

145 150 155 160

Gly Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr

165 170 175

Thr Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys

180 185 190

Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr

195 200 205

Ala Cys Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr

210 215 220

Gly Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys

225 230 235 240

Cys Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Gly Thr Thr Cys Cys

245 250 255

Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Cys

260 265 270

Gly Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Cys Cys

275 280 285

Gly Thr Ala Cys Gly Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala

290 295 300

Ala Gly Cys Thr Gly Ala Thr Thr Gly Cys Thr Thr Ala Cys Cys Cys

305 310 315 320

Gly Ala Thr Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Cys Gly

325 330 335

Thr Thr Ala Thr Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala

340 345 350

Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys

355 360 365

Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys

370 375 380

Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Gly

385 390 395 400

Cys Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr

405 410 415

Gly Ala Ala Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ala Ala Gly

420 425 430

Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Cys Ala

435 440 445

Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Gly Thr Ala

450 455 460

Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly

465 470 475 480

Ala Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly

485 490 495

Gly Thr Thr Ala Thr Gly Cys Gly Thr Thr Cys Ala Ala Gly Thr Ala

500 505 510

Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Ala Cys

515 520 525

Gly Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly

530 535 540

Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Cys Thr Gly Gly

545 550 555 560

Cys Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly

565 570 575

Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Ala Cys Cys

580 585 590

Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Ala

595 600 605

Cys Ala Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys

610 615 620

Gly Ala Thr Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Gly Cys Ala Gly

625 630 635 640

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ala

645 650 655

Ala Gly Gly Cys Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Gly

660 665 670

Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Thr

675 680 685

Gly Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr

690 695 700

Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly

705 710 715 720

Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly Gly

725 730 735

Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Ala

740 745 750

Gly Gly Gly Thr Cys Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Ala

755 760 765

Cys Cys Gly Thr Thr Cys Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys

770 775 780

Thr Gly Ala Gly Cys Gly Cys Ala Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ala Ala

785 790 795 800

Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Ala Ala Cys

805 810 815

Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly

820 825 830

Ala Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Ala Ala Ala Ala Cys Thr Ala

835 840 845

Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala

850 855 860

Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Gly Thr Thr Ala

865 870 875 880

Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys Thr

885 890 895

Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly Thr Ala Gly Cys Gly Cys Thr Gly

900 905 910

Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly

915 920 925

Ala Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys

930 935 940

Ala Cys Gly Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys

945 950 955 960

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala

965 970 975

Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys

980 985 990

Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly

995 1000 1005

Thr Cys Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr

1010 1015 1020

Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Gly

1025 1030 1035

Gly Thr Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys

1040 1045 1050

Ala Gly Cys Gly Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Gly Ala Cys Thr

1055 1060 1065

Gly Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly

1070 1075 1080

Ala Ala Ala Gly Ala Cys Gly Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr

1085 1090 1095

Thr Ala Ala

1100

<210> 7

<211> 366

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(366)

<223> （大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的）成熟肽序列1.366

<400> 7

Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly

1 5 10 15

Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly

20 25 30

Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro

35 40 45

Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His

50 55 60

Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr

65 70 75 80

Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala

85 90 95

Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala

100 105 110

Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr

115 120 125

Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys

130 135 140

Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu

145 150 155 160

Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr

165 170 175

Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu

180 185 190

Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr

195 200 205

Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met

210 215 220

Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val

225 230 235 240

Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys

245 250 255

Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn

260 265 270

Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu

275 280 285

Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu

290 295 300

Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr

305 310 315 320

Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met

325 330 335

Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser

340 345 350

Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr

355 360 365

<210> 8

<211> 1986

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 8

atgaaacatc atcaccatca ccaccctagg aaaatcgaag aaggtaaact ggtaatctgg 60

attaacggcg ataaaggcta taacggtctc gctgaagtcg gtaagaaatt cgagaaagat 120

accggaatta aagtcaccgt tgagcatccg gataaactgg aagagaaatt cccacaggtt 180

gcggcaactg gcgatggccc tgacattatc ttctgggcac acgaccgctt tggtggctac 240

gctcaatctg gcctgttggc tgaaatcacc ccggacaaag cgttccagga caagctgtat 300

ccgtttacct gggatgccgt acgttacaac ggcaagctga ttgcttaccc gatcgctgtt 360

gaagcgttat cgctgattta taacaaagat ctgctgccga acccgccaaa aacctgggaa 420

gagatcccgg cgctggataa agaactgaaa gcgaaaggta agagcgcgct gatgttcaac 480

ctgcaagaac cgtacttcac ctggccgctg attgctgctg acgggggtta tgcgttcaag 540

tatgaaaacg gcaagtacga cattaaagac gtgggcgtgg ataacgctgg cgcgaaagcg 600

ggtctgacct tcctggttga cctgattaaa aacaaacaca tgaatgcaga caccgattac 660

tccatcgcag aagctgcctt taataaaggc gaaacagcga tgaccatcaa cggcccgtgg 720

gcatggtcca acatcgacac cagcaaagtg aattatggtg taacggtact gccgaccttc 780

aagggtcaac catccaaacc gttcgttggc gtgctgagcg caggtattaa cgccgccagt 840

ccgaacaaag agctggcgaa agagttcctc gaaaactatc tgctgactga tgaaggtctg 900

gaagcggtta ataaagacaa accgctgggt gccgtagcgc tgaagtctta cgaggaagag 960

ttggcgaaag atccacgtat tgccgccacc atggaaaacg cccagaaagg tgaaatcatg 1020

ccgaacatcc cgcagatgtc cgctttctgg tatgccgtgc gtactgcggt gatcaacgcc 1080

gccagcggtc gtcagactgt cgatgaagcc ctgaaagacg cgcagactaa ttcgagctcg 1140

aacaacaaca acaataacaa taacaacaac ggtctgctgt atctggtttt tccggaacgt 1200

catccgatgg caccggttaa agcagcagca agcctggcag atacccaggt tgatggtgca 1260

gttggtagcc gttatcgtat gagcgcagca ctgaaagcac gttttgatta ttggctgagc 1320

gcagttggtg aactgccgct gagtgcactg cctggtaaac tggcacagag cctgcgtcag 1380

gatggttggg ctgaagcaga tattaatgca gcactggcag catttgcaca ttatcagcag 1440

tatctggatg cactgagcga agttgcaaaa ccgcaggcag cagcagccgc tgaactgaaa 1500

gccgcatggg cagaacgtga tgcactgcgt cgtcagtttt atgcagaagc cgaaattaaa 1560

ctgctgtggg gtgatgaagc agcagttgaa gattttaccc tgcgtcgcct ggaaattcag 1620

agcctgggtc tgagtgaagg tgaacagctg aaatgggaag aagatgcact ggcccaggca 1680

ccggcaaccg ttcagcaggc atatggtccg agcctgaaac tggcgcagct gcagcagatg 1740

aatggtgcaa gccgtgatca gctggcagca cagtatggtg atggtgccgc agatcgtctg 1800

atggcagcaa aagcacagca gcagggttgg cagggcaaag ttgcagcata tcgtgataaa 1860

gttaaaagtc tggcagccct gccgagcgca gaaaaagcgc aggcactggc cgaatatcag 1920

gcacgtcatt ttagcgcaaa cgaactgaaa cgtctgcgtg tgtggctgag caatggtatg 1980

cagtaa 1986

<210> 9

<211> 660

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 9

Lys His His His His His His Pro Arg Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu

1 5 10 15

Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val

20 25 30

Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His

35 40 45

Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp

50 55 60

Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp

85 90 95

Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu

100 105 110

Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys

115 120 125

Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu

130 135 140

Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu

145 150 155 160

Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr

165 170 175

Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val

180 185 190

Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile

195 200 205

Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala

210 215 220

Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala

225 230 235 240

Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu

245 250 255

Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser

260 265 270

Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe

275 280 285

Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys

290 295 300

Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu

305 310 315 320

Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly

325 330 335

Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val

340 345 350

Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu

355 360 365

Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn

370 375 380

Asn Asn Asn Asn Asn Gly Leu Leu Tyr Leu Val Phe Pro Glu Arg His

385 390 395 400

Pro Met Ala Pro Val Lys Ala Ala Ala Ser Leu Ala Asp Thr Gln Val

405 410 415

Asp Gly Ala Val Gly Ser Arg Tyr Arg Met Ser Ala Ala Leu Lys Ala

420 425 430

Arg Phe Asp Tyr Trp Leu Ser Ala Val Gly Glu Leu Pro Leu Ser Ala

435 440 445

Leu Pro Gly Lys Leu Ala Gln Ser Leu Arg Gln Asp Gly Trp Ala Glu

450 455 460

Ala Asp Ile Asn Ala Ala Leu Ala Ala Phe Ala His Tyr Gln Gln Tyr

465 470 475 480

Leu Asp Ala Leu Ser Glu Val Ala Lys Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala

485 490 495

Glu Leu Lys Ala Ala Trp Ala Glu Arg Asp Ala Leu Arg Arg Gln Phe

500 505 510

Tyr Ala Glu Ala Glu Ile Lys Leu Leu Trp Gly Asp Glu Ala Ala Val

515 520 525

Glu Asp Phe Thr Leu Arg Arg Leu Glu Ile Gln Ser Leu Gly Leu Ser

530 535 540

Glu Gly Glu Gln Leu Lys Trp Glu Glu Asp Ala Leu Ala Gln Ala Pro

545 550 555 560

Ala Thr Val Gln Gln Ala Tyr Gly Pro Ser Leu Lys Leu Ala Gln Leu

565 570 575

Gln Gln Met Asn Gly Ala Ser Arg Asp Gln Leu Ala Ala Gln Tyr Gly

580 585 590

Asp Gly Ala Ala Asp Arg Leu Met Ala Ala Lys Ala Gln Gln Gln Gly

595 600 605

Trp Gln Gly Lys Val Ala Ala Tyr Arg Asp Lys Val Lys Ser Leu Ala

610 615 620

Ala Leu Pro Ser Ala Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Glu Tyr Gln Ala

625 630 635 640

Arg His Phe Ser Ala Asn Glu Leu Lys Arg Leu Arg Val Trp Leu Ser

645 650 655

Asn Gly Met Gln

660

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 10

aaggagataa acatatgtca ggttataccc agaccaaata tccgat 46

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 11

ggttagttag aagcttacag acccagattt ttcagacgat ttgcc 45

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 接头

<400> 12

aattcgagct cgaacaacaa caacaataac aataacaaca ac 42

<210> 13

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 13

aattcgagct cgaacaacaa caacaataac aataacaaca acggtctgct gtatctggtt 60

tttccgg 67

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 14

tggttagtta gaagcttact gcataccatt gctcagccac a 41

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 15

ccatcaccac cctaggaaaa tcgaagaagg taaactggta atctgga 47

<210> 16

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 16

gttgttgtta ttgttattgt tgttgttgtt cgagctcgaa ttagtctgcg cgtctttcag 60

ggcttcatcg acagtctgac gaccgctggc 90

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 17

caagctgatt gcttacccga tc 22

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 18

aagagttcct cgaaaactat ctgctg 26

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 19

gcagatatta atgcagcact ggc 23

<210> 20

<211> 312

<212> PRT

<213> 厦门加利西亚单胞菌

<400> 20

Met Ser Leu Lys Pro Leu Ala Leu Gly Leu Ala Leu Leu Cys Ala Ala

1 5 10 15

Pro Ala Ser Gln Ala Ala Phe Trp His Ser Ser Ser Gly Tyr Thr Gln

20 25 30

Thr His Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Leu Phe Gly Phe Asp Ser

35 40 45

Leu Ala Gly Val Asp Tyr Trp Tyr Gly Ile Pro Ser Ala Leu Ser Lys

50 55 60

Asp Gly Ala Lys Val Tyr Val Val Asn Val Ser Ala Ala Asn Ser Thr

65 70 75 80

Glu Val Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Gln Ile Asp Asn Ile Leu Ala

85 90 95

Leu Thr Gly Ala Asp Lys Val Asn Leu Ile Gly His Ser His Gly Gly

100 105 110

Pro Thr Ala Arg Tyr Ala Ala Ser Met Ser Pro Asp Lys Val Ala Ser

115 120 125

Val Thr Ser Val Gly Gly Val Asn Trp Gly Ser Ser Phe Ala Asp Ala

130 135 140

Val Arg Gly Ala Ile Pro Gln Asp Ser Leu Ser Glu Asp Ile Ile Ala

145 150 155 160

Gly Ala Phe Asn Ala Phe Ala Gly Ile Ile Glu Phe Leu Ser Gly Thr

165 170 175

Pro Ala Asp Pro Gln Asp Ala Val Ala Ala Leu Glu Ser Leu Thr Thr

180 185 190

Ala Gly Thr Leu Ala Phe Asn Ala Arg Tyr Pro Glu Gly Met Pro Ser

195 200 205

Gln Tyr Cys Gly Gln Gly Asp Glu Gln Ala Gly Asn Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Tyr Ser Trp Ser Gly Ala Ser Thr Val Thr Asn Val Leu Asp Ile Ser

225 230 235 240

Asp Ala Gly Leu Leu Ala Thr Ser Leu Val Phe Ser Glu Pro Gly Asp

245 250 255

Gly Leu Val Ser Ser Cys Ser Ser His Leu Gly Lys Val Ile Arg Asp

260 265 270

Asn Tyr Gly Met Asn His Leu Asp Glu Val Asn Gln Thr Phe Gly Leu

275 280 285

Val Asn Leu Phe Glu Thr Asn Pro Lys Thr Leu Phe Arg Thr Gln Ala

290 295 300

Asn Arg Leu Lys Asn Leu Gly Leu

305 310

<210> 21

<211> 278

<212> PRT

<213> 厦门加利西亚单胞菌

<400> 21

Met Val Leu Ala Leu Thr Gly Ala Gly Thr Leu Phe Trp Ser Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Pro Lys Gly Pro Ser Ala Pro Val Ala Ser Leu Ala Gly Thr

20 25 30

Gln Thr Asp Gly Ala Leu Gly Pro Gly Phe Val Leu Asp Gly Ala Leu

35 40 45

Lys Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Leu Ser Thr Leu Gly Glu Leu Gly Leu

50 55 60

Ala Ala Leu Pro Glu Arg Leu Ala Gln Ser Leu Arg Glu Ala Gly Trp

65 70 75 80

Ser Glu Ala Asp Ile Gly Gln Ala Leu Ala Ala Phe Ala Arg Tyr Gln

85 90 95

Gln Tyr Leu Lys Ala Met Gly Ser Leu Ala Met Pro Ser Arg Ala Ser

100 105 110

Ala Gly Glu Leu Gln Ala Ala Trp Ala Glu Arg Asp Ala Leu Arg Gly

115 120 125

Gln Phe Phe Ser Ala Glu Glu Ile Ala Ala Leu Trp Gly Ala Asp Lys

130 135 140

Gly Leu Glu Glu Leu Thr Leu Arg Arg Leu Glu Ile Gln Ala Leu Asp

145 150 155 160

Leu Asp Pro Gln Ala Arg Gln Asp Trp Leu Asp Asp Glu Leu Ala Lys

165 170 175

Ala Pro Pro Glu Val Gln Arg Ala Leu Gly Pro Ser Gln Arg Leu Ser

180 185 190

Arg Leu Gly Thr Met Glu Gly Ala Ser Arg Asp Gln Leu Ala Ala Glu

195 200 205

Phe Gly Asp Gln Val Ala Asp Arg Leu Glu Gln Val Lys Ala Ala Arg

210 215 220

Gln Asp Trp Gln Gln Arg Val Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Ala Glu Arg

225 230 235 240

Leu Gln Gly Leu Pro Gln Ala Glu Arg Gln Glu Ala Leu Ala His Tyr

245 250 255

Gly Asp Gln His Phe Thr Gln Ala Glu Gln Arg Arg Leu Asp Val Trp

260 265 270

Leu Arg His Gln Leu Gln

275

Claims

1.一种具有脂肪酶活性的分离的多肽，该分离的多肽与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有100%序列一致性，其中该多肽获得自食五环芳烃加利西亚单胞菌（Gallaecimonaspentaromativorans）的菌株。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 1的核酸70至927。

3.具有作为如权利要求1至2中任一项所述的多肽的分子伴侣起作用的能力的分离的多肽，其中该多肽与SEQ ID NO: 3的成熟多肽具有100%序列一致性。

4.根据权利要求3所述的多肽，其中该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 1的核酸971至1786。

5.一种组合物，该组合物包括根据权利要求1至2中任一项所述的多肽。

6.根据权利要求5所述的组合物，该组合物进一步包括根据权利要求3至4中任一项所述的多肽。

7.根据权利要求5或6中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括至少一种表面活性剂，至少一种表面活性剂系统，或其任何混合物。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述至少一种表面活性剂是至少一种皂。

9.根据权利要求7所述的组合物，其中该表面活性剂或表面活性剂系统是选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂或其任何混合物。

10.根据权利要求5或6中任一项所述的组合物，其中该组合物进一步包括选自下组的一种或多种另外的酶，该组由以下各项组成：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶和氧化酶。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述糖酶选自下组：淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶和甘露聚糖酶，且所述氧化酶选自下组：漆酶和过氧化物酶。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述淀粉酶是α-淀粉酶。

13.根据权利要求5或6中任一项所述的组合物，其中该组合物是衣物清洁组合物、硬表面清洁组合物和/或个人护理清洁组合物。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述硬表面清洁组合物是餐具清洁组合物。

15.根据权利要求5或6中任一项所述的组合物，其中该组合物配制为常规的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；粒状固体；具有两个或更多个层的均匀或多层片剂；单个或多个室单位剂型；或其任何组合。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述单个或多个室单位剂型是具有一个或多个室的袋。

17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述粒状固体是常规的或压缩的粉末。

18.一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括如权利要求1至2中任一项所述的多肽或如权利要求5至17中任一项所述的组合物；至少一种助洗剂和/或共助洗剂；和/或至少一种香料。

19.根据权利要求18所述的洗涤剂组合物，其中所述至少一种助洗剂和/或共助洗剂选自至少一种螯合剂、至少一种磺化聚合物、至少一种助水溶物和至少一种漂白系统。

20.根据权利要求18或19所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物是液体衣物洗涤剂组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、液体餐具洗涤剂组合物、或粉末餐具洗涤剂组合物。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的洗涤剂组合物在衣物洗涤、手动餐具洗涤或自动餐具洗涤中的用途。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述用途是在低温下衣物洗涤或自动餐具洗涤。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于60ºC。

24.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于55ºC。

25.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于50ºC。

26.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于45ºC。

27.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于40ºC。

28.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于35ºC。

29.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于30ºC。

30.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于25ºC。

31.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于20ºC。

32.根据权利要求22所述的用途，其中所述低温为低于15ºC。

33.一种洗涤的方法，该方法包括使用根据权利要求18至20中任一项所述的洗涤剂组合物洗涤织物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中在40ºC或更低的温度下进行该洗涤。

35.根据权利要求33所述的方法，其中在30ºC或更低的温度下进行该洗涤。

36.根据权利要求33所述的方法，其中在20ºC或更低的温度下进行该洗涤。

37.一种使用如权利要求18至20中任一项所述的洗涤剂组合物在自动餐具洗涤机器中的餐具洗涤方法，该方法包括以下步骤：将所述洗涤剂组合物添加在所述自动餐具洗涤机器中的洗涤组合物室内，并且在主洗涤循环期间释放所述洗涤剂组合物。

38.用于水解脂质的方法，该方法包括使脂质与根据权利要求1至2中任一项所述的多肽、根据权利要求5至17中任一项所述的组合物或根据权利要求18至20中任一项所述的洗涤剂组合物接触。

39.用于清洁物体的方法，该方法包括使存在于有待清洁的物体上的脂质污渍与根据权利要求1至2中任一项所述的多肽、根据权利要求5至17中任一项所述的组合物或根据权利要求18至20中任一项所述的洗涤剂组合物接触。

40.一种编码根据权利要求1至2中任一项所述的多肽或根据权利要求3至4中任一项所述的多肽的分离的多核苷酸。

41.根据权利要求40所述的多核苷酸，其中修饰该多核苷酸以对应于旨在用于多肽的重组生产的宿主细胞的密码子使用。

42.一种核酸构建体或表达载体，包括可操作地连接至一个或多个控制序列的根据权利要求40所述的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多肽在表达宿主中的产生。

43.一种包括根据权利要求40或41中任一项所述的多核苷酸的核酸构建体。

44.一种表达载体，包括编码根据权利要求1至2中任一项所述的多肽和/或根据权利要求3至4中任一项所述的多肽的多核苷酸。

45.一种宿主细胞，包括编码根据权利要求1至2中任一项所述的多肽和/或根据权利要求3至4中任一项所述的多肽的多核苷酸。

46.一种产生根据权利要求1至2中任一项所述的多肽和/或根据权利要求3至4中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：（a）在适合多肽表达的条件下培养根据权利要求45所述的宿主细胞；并且（b）回收该多肽。

47.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括可操作地连接至一个或多个控制序列的根据权利要求40至41中任一项所述的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多肽的产生。

48.一种产生如权利要求1至4中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养根据权利要求47所述的重组宿主细胞；并且

(b)回收该多肽。