MXPA98006200A - Composicion novedosa de mejorador de pan - Google Patents

Abstract

Esta invención describe una composición de mejorador de pan que contiene celobiohidrolasa asícomo su uso en la fabricación de pan.

Description

COMPOSICIÓN NOVEDOSA DE MEJORADOR DE PAN f tnl?9 de la Invención Esta invención se relaciona con el uso de una enzima en la preparación de pan como actividad mejoradora de pan. Antecedentes de la Invención Una actividad mejoradora de pan es aquélla que mejora cualquier propiedad del producto cocido (en particular, el volumen del pan y/o la estructura de la miga del pan) , y/o mejora cualquier propiedad de la masa. En toda esta especificación, el término "volumen de pan" se entenderá como "volumen de producto cocido" cuando el contenido así lo indique . Se agrega una composición mejoradora de pan a una masa, además de los ingredientes básicos que son generalmente harina, agua, levadura y sal. Una de las características más importantes del pan que está influida por enzimas es el volumen del pan. Para obtener mayores volúmenes de pan, se pueden agregar composiciones con enzimas amilolíticas y/o hemicelulasas. Las hemicelulasas son enzimas capaces de hidrolizar los polisacáridos no provenientes de almidón en la harina. La mayoría de las composiciones disponibles comercialmente se originan de hongos, como Aspergillus o Trichoderma . Estas composiciones son mezclas no purificadas de distintas actividades de enzima. Hasta ahora, se ha determinado que las endoxilanasas y arabinofuranosidasas contribuyen a las actividades de las composiciones mejoradoras de pan. El uso de preparaciones de hemicelulasa en la fabricación de pan resulta en un rendimiento de horno y volumen de pan mejorados y una estructura de grano mejorada al producto cocido terminado. Sin embargo, cuando se utilizan preparaciones de hemicelulasa en concentraciones más altas, la pasta se puede volver inconsistente y pegajosa. Esto limita el uso de preparaciones de hemicelulasa. Aunque se puede resolver este problema al agregar oxidasa de glucosa, la necesidad de agregar enzima extra adicional es una desventaja. Una situación mejor sería contar con una enzima que tenga una actividad mejoradora de pan sin efectos colaterales negativos en la masa. Esto indica la posibilidad de que los emulsionantes puedan ser reemplazados completamente por enzimas. La resistencia de los consumidores a los aditivos químicos es cada vez mayor, por lo tanto, existe una necesidad constante de reemplazar emulsionantes por otros aditivos más aceptados por los consumidores como las enzimas. Esta invención provee el uso de una CeloBioHidrolasa (CBH) que tiene una actividad mejoradora de pan para fabricar pan. La CeloBioHidrolasa es preferentemente CBH- I. Los efectos más importantes son un volumen de pan mejorado y una estructura de miga mejorada, sin malas propiedades de manejo de masa debido a la condición pegajosa de la masa. Preferentemente, la CBH es de origen microbiano, más preferentemente se usa CHB de origen micó ico. Por ejemplo, se puede obtener CBH de Trichoderma o Aspergillus . Se puede obtener CBH-I de T. reesei , T. longibrachiatum y T. viride . Se ha hecho una descripción de celobiohidrolasa I y II de Trichoderma reesei en EP-B 0 137 280 y US 4.894.338, respectivamente. Se ha identificado también CBH I en Agaricus bisporus, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma viride y Humicola grísea . Esta invención también describe una composición con una actividad mejoradora de pan, que contiene CBH en una cantidad eficaz cuando es agregada a otros ingredientes básicos de la masa. La composición además puede contener cantidades eficaces de a-amilasa y/o endo-xilanasa. Por "cantidad eficaz" se entiende una cantidad de enzima suficiente para causar un efecto apreciable en el efecto esperado, en el caso de CBH esto sería un efecto apreciable del volumen de pan mejorado o de la estructura de la miga mejorada. El hecho que CBH tiene un efecto en la cocción es sorprendente porque CBH actúa sobre la celulosa que sólo constituye el 0,3% de la harina de trigo. CBH hidroliza los enlaces 1, 4-ß-D-glucosídicos de la celulosa, lo que provoca la liberación de celobiosa. Una explicación posible sería que CBH actúa sobre las interfaces celulosa - xilano en las paredes celulares del endosperma. Como se mencionó anteriormente, es conocido el uso de una preparación comercial de las endo-xilanasas de Trichoderma y Aspergillus . Aunque esas preparaciones contienen CBH, la cantidad de CBH es insuficiente para contribuir a mejorar la pasta o pan. De acuerdo con esta invención, se puede utilizar CBH solo o junto con otras enzimas que tienen una actividad mejoradora de pan, preferentemente endo-xilanasa. Se puede obtener endo-xilanasa de Apergillus o Trichoderma . En general, el uso de la composición de la invención resultará en una masa con buenas propiedades de manejo, mientras que el producto final cocido tendrá un volumen y una estructura de miga mejorados. Mediante el uso de CBH, es posible lograr una optimización controlada de los mejoradores de pan o las composiciones mejoradoras de pan. Sumario de la Invención Se observará que el experto en el arte podrá determinar las cantidades óptimas que se pueden agregar a la masa. Se puede utilizar una composición de la invención junto con los componentes y enzimas mejoradores de pan comunes, por ejemplo, xilanasa, a-amilasa, endo-xilanasa, arabinofuranosidasa, ß-amilasa , glucoseoxidasa, proteasa o lipasa. Por lo tanto, se puede agregar CBH en una composición mejoradora de pan. Por "composición mejoradora de pan" , se entiende una composición que contiene sustancias distintas de aquéllas utilizadas convencionalmente en la cocción (por ejemplo, harina, agua, levadura, optativamente sal) , y que se puede utilizar para mejorar las propiedades de la masa y/o el producto cocido. También se puede incorporar CBH en una premezcla. Por "premezcla", se entiende una mezcla de agentes de cocción, en general incluyen harina, que se prepara para facilitar el manejo en los procesos de preparaciones de masa. En general, una premezcla no contendrá el agua necesaria para preparar la masa. La masa de la invención contiene al menos 0,5 mg de CBH por kg de harina, preferentemente 1 mg/kg de harina, más preferentemente más de 5 mg de CBH por kg. de harina, aún más preferentemente más de 10 mg de CBH por kg. de harina. En general, la cantidad de CBH es menor a 100 mg de CBH por kg. de harina, preferentemente menos de 50 mg de CBH por kg. de harina.

Figuras Figura 1, Sec. Id. Nr. 5. Figura 2, Sec. Id. Nr. 8.

Figura 3 : Se indica el volumen de pan como función de la dosificación de CBH-1.

Ejemplo 1 Se obtuvo CBH-1 de una cepa de Trichoderma . Se cultivó la cepa en un medio con celulosa para inducir las enzimas degradantes de celulosa. Luego de la fermentación, se filtró el caldo, se filtró en forma estéril, se sometió a una ultrafiltración y se secó por rociado. Se suspendió 0,5 kg. del producto del proceso en 2 1 de 50 mM de NaAc, pH 5, y se centrifugó la mezcla durante 15 minutos a 4000 rpm. Se ultrafiltró el sobrenadante claro hasta que la conductividad fue menor a 2 mS. Se cargó 3 gr. de proteína en una columna A DEAE (Biogel A), equilibrada en 50 mM de NaAc, pH5. Se eluyeron las fracciones enriquecidas de CBH-I en un gradiente lineal de 0% a 100% de B en A, en el cual A es un buffer con 50 mM de NaAc, pH 5, y B es ÍM de NaCl en el Buffer A, y se ajusta el pH a 5. Se ultrafiltraron las fracciones enriquecidas de CBH-1 hasta que conductividad fue menor a la conductividad de 10 mM de NaAc, pH 3,6. Luego, se cargó la muestra de CBH I en una columna Mono S, equilibrada en 10 M de NaAc, pH 3,6. Se eluyó CBH I en un gradiente lineal de 0% a 100% de B en A, seguido de un gradiente de 10% a 100% de B en A, en el cual A es 10 mM de NaAc, pH 3, 6, y B es ÍM de NaCl en A. Se determinó la concentración de proteína en cada fracción eluida mediante un análisis de aminoácidos cuantitativo. El producto purificado contenía 7 mg de proteína/ml y era puro, según SDS-gelectroforesis. Ejemplo 2 Se probó CBH-1 (Ver Ejemplo 1) en un ensayo de cocción de escala completa con la siguiente receta: Harina 2000 g Kolibri (Meneba) y 500 g Ibis (Meneba) ; 1305 g agua,- 50 g levadura en bloque, Konings gist®; 50 g sal; 12, 5 g azúcar; 25 ppm ácido ascórbico; 20 ppm Fermizyme® (TM) P200 (a-amilasa micótica, obtenible' de Gist-brocades) . • Optativamente, Fermizyme® HS 2000 y/o CBH-1 ( Trichoderma) , ver Tabla 1. Los ingredientes se mezclaron juntos y se utilizaron para formar tres masas de 900 gramos. Se fermentaron estas masas. La primera fermentación duró 30 minutos y la segunda 40 minutos a 30 °C. Luego de modelar la masa, se hizo una fermentación final durante 70 minutos a 35 °C. El pan luego se coció durante 30 minutos a 250 °C. Se dejaron enfriar las hogazas y se determinó el volumen por el volumen de desplazamiento de colza. Se determinaron también otras propiedades . Los resultados obtenidos se indican en la Tabla 1. Cada prueba de cocción se realizó por triplicado. Estas pruebas por triplicado se realizaron en paralelo. Se indica la evaluación de las hogazas como valor promedio de los resultados obtenidos de 3 hogazas. Panaderos calificados juzgaron las características de la masa y la estructura de la miga.

TABLA 1 - = muy poco I - = poco 10 0 = neutral + = bueno ++ « muy bueno +++ = excelente Fermizyme® HS2000 es una preparación de endo-xilanasa de A. niger obtenible de Gist-brocades. Según los resultados en la Tabla 1, CBH-1 mejora las propiedades de manejo de la masa y la estructura de la miga del pan, tanto cuando es usada sola como con Fermizyme® HS2000. Ejemplo 3 Se clonó un gen que codifica una CBH de A . niger , y se preparó una muestra de CBH por expresión de la enzima clonada, como se describe en el Ejemplo 5. Se realizó una prueba de cocción mediante el mismo protocolo que el descripto en el Ejemplo 2. Se agregó 2,5 mg de la CBH de A . niger expresada por kg. de harina. Esto resultó en un aumento volumen de la hogaza del 10%, propiedades de manejo de masa mejoradas y estructura de miga mejorada, comparado con la referencia cuando no se agregó CBH. Ejemplo 4 Se llevó a cabo el ensayo de cocción del Ejemplo 2, pero la harina utilizada fue harina Kluut (Meneba) y se usó un tipo distinto de mezclador. Se agregó CBH-1 (Ver Ejemplo 1) de Tri choderma, además de una preparación de Trichoderma disponible comercialmente (hemicelulasa) . Se probó la preparación de hemicelulasa a 15 ppm (la dosificación recomendada fue 3 a 20 ppm) . Como se ve en la Fig.3, se pudo obtener un aumento considerable en volumen, aparte del aumento causado por la preparación de hemicelulasa. El volumen de la referencia, cuando no se agregó hemicelulasa y CBH-1, fue 2554 ml . Ejemplo 5 Cepas E. coli LE 392 (Murray, 1977) : E14 (mcrA) , hsdR514, supE44, supF58, lacYl, o ? (laclzy) 6, gralK2, galT22, metBl , trpR55. Ejemplo 5.1. Identificación de una celobiohidrolasa de A. niger Se cultivó A . niger. N402 en un medio mínimo (MM) de Aspergillus (contenido por litro: 6,0 g de NaN03, 1,5 g de KH2P04, 0,5 g de MgS04, 7H20, 0,5 g de KCl, pH 6,0) y lml de una solución Vishniac (Vishniac y Santer, 1957) (contenido por litro: 10 g de EDTA, 4,4 g de ZnS04.7H20, 1,0 g de MnCl2.4 H2O, 0,32 g de CoCl2.6H20, 0,32 g de CuS04.5H20, 0,22 g (NH4)6M07024 .4H20, 147 g de CaCl2.2H20, 1,0 g de FeS04.7H20, pH 4,0), complementado con 1,5% de arabinoxilan de trigo. Se inoculó el medio con esporas de 1*106 por ml, y se cultivó el micelio durante 96 horas a 30 °C y 250 rpm en un agitador New Brunswick orbital . Se recolectó el filtrado del cultivo luego de filtrar el micelio por Myracloth (gasa de nylon) con un embudo Buchner y una succión leve. Se ajustó el pH del filtrado del cultivo a pH - 6,0 con 0,1 M de NaOH después de haber diluido el filtrado del cultivo al agregar 2 volúmenes de agua Millipore. Se equilibró DEAE-Sephadex A-50 en 50mM de un buffer de acetato de sodio pH 5,0, y se agregó al filtrado del cultivo. Luego de agitar durante 30-60 minutos a 4°C, se pasó DEAE-Sephadex junto con el filtrado del cultivo por un embudo con un soporte dé filtro de vidrio, y se trasvasó DEAE-Sephadex A-50 a una columna. Se eluyó primero esta columna con 50 mM de un buffer de acetato de sodio, pH 5,0, luego con 50 mM de un buffer de acetato de sodio, pH 5,0 + 0,5 M de NaCl. Las fracciones que presentaron una actividad a-arabinofuranosidasa, detectada mediante el substrato cromogénico 4-metilumbeliferil-a-L-arabinofuranosida (detecta a-arabinofuranosidasas) , se agruparon y desalinizaron por diálisis con agua Millipore, y luego se sometieron a diálisis contra 20 mM de un buffer de piperazina - HCl, pH 5,0. Luego de la diálisis, se cargó la muestra en un columna de Flujo Rápido de DEAE-Sefarosa, y esta columna se eluyó primero con 3 volúmenes de 20 M de un buffer de piperazina - HCl, pH 5,0, y luego con un gradiente lineal de 0,5 M de NaCl en un buffer de piperazina - HCl, pH 5,0. Se detectó la proteína eluida por la medición constante de la absorción de UV a 280 nm. Se recolectaron las fracciones de 10 ml que se sometieron a ensayos para determinar la actividad de a-arabinofuranosidasa en para-nitrofenil-a-L-arabinofurano-sida (PNP-A) (Sigma N-3641) . Se constató una actividad a-arabinofuranosidasa en las fracciones 11 -27, 41-47 y 52-61. Se agruparon las fracciones 41-47 y se sometieron luego a diálisis contra 100 mM de un buffer de piperazina - HCl, pH 5,0, y se cargó toda la muestra (200 ml) en una columna de Flujo Rápido de DEAE-Sefarosa (Pharmacia) para concentrar la proteína en un pico único mediante con 1 M de un gradiente de NaCl en un buffer de piperazina - HCl, pH 5,0. Se agruparon las fracciones con proteínas (20 ml) y se sometieron primero a diálisis con agua Millipore, luego con 20 mM de un buffer de piperazina - HCl, pH 5,0, y se concentraron finalmente con un concentrador Speed Vac a 6 ml . Se cargó esta preparación en una columna Sephacryl S-300, que se eluyó con 20 mM de un buffer de piperazina -HCl, pH 5,0, 0,1 M de NaCl. Se agruparon las fracciones con una actividad en PNP-A, se sometieron a diálisis con 10 mM de un buffer de piperazina - HCl, pH 5,0, y se concentraron finalmente con un concentrador Speed Vac a 2 ml . Luego, se cargó esta muestra en una columna Superdex 75 (columna Hiload 16/60) (Pharmacia) , que se equilibró y eluyó con 20 mM de un buffer de piperazina - HCl, pH 5,0, 0,1 M de NaCl. Se sometió a diálisis las fracciones con una actividad a-arabinofuranosidasa en 10 M de un buffer de acetato de sodio, pH 3,5. Se hizo la purificación final en una columna de intercambio de cationes Mono S (HR) 5/5, Pharmacia) . Se equilibró la columna con un buffer de acetato de sodio, pH 3,5, en el cual se cargó la muestra.

Se eluyó proteína con 27 ml de 1 M de un gradiente lineal de NaCl en 10 mM de un buffer de acetato de sodio, pH 3,5.

Se eluyó la enzima a 100 mM de NaCl. Se envió la enzima purificada a EUROSEQUENCE (Gronigen, Holanda) . Se aplicó a un gel SDS-PAGE y se realizó un análisis de secuencia interna de la proteína esencialmente como se describe en Rosenfeld et al (Rosenfeld, J., Cadevielle, J. , Guillemot, J. Ferrara, P. (1992) Anal. Biochem 203 : 173-179) . Se realizaron secuencias de aminoácidos con un secuenciador automatizado (Modelo 477 A, Applied Biosystems) , acoplado a un HPLC (Modelo 120 A ABI) para el análisis de los aminoácidos de feniltiodantoina (PTH) . Se determinaron las siguientes secuencias internas: Leu -Tyr- Leu - Met - Ser - Asp - Asp - Ser - Asn - Tyr - Glu - Leu - Phe - Lys. SEC. ID. NO. 1 Leu - Gly - Asn - Thr - Asp - Phe - Tyr - Gly - Pro - Gly - Leu - Thr - Val - Asp - Thr - Asn - Ser - Pro - Phe - Thr - Val - Val - Thr - Gln. SEC. ID. No. 2 Lo que es sorprendente, la secuencia de aminoácido parcial del fragmento interno de la enzima aislada (SEC.

ID. No. 1) mostró una gran identidad con CBH I de Agaricus bisporus , es decir, 11 de 13 residuos fueron idénticos.

Esto fue el primer indicio de celobiohidrolasas en Aspergillus. Ejemplo 5.2. Aislación de clones de ADNc para celobiohidrolasa de A. niger. Ejemplo 5.2.1. Generación de sonda La enzima CBH I de A. bisporus es codificada por el gen ce!2 (EMBL. Acc. No. Z50094) . Se designaron los dos siguientes oligonucleótidos para PCR la región codificadora de cel2 : 5' - GTC GGT ACC AAC ATG GCC G-3' (19- mer) (SEC. ID. No. 3) 5' - ACT CAG AAA CAT TGG CTA TAG - 3' (21- mer) (SEC. ID. No. 4) Se utilizaron estos oligonucleótidos, descriptos en las SEC. ID. Nos. 3 y 4, en PCR (Saiki et al, 1988) con ADN plásmido con secuencias ce!2 de Agaricus bisporus como modelo. Para PCR, se combinó 2 ng de ADN plásmido con 5 µl de un buffer de reacción *10 (200 mM Tris-HCl, pH 8,4; 500 mM KCl); 3 µl de 50 mM de MgCl2; 4,0 µl de 1,25 mM de cada uno de los cuatro trifosfatos deoxinucleótidos y 50 pmol de los oligonucleótidos en un volumen final de 50 µl . Se mezcló la mezcla de la reacción y se agregó 0,5 µl de polimerasa TAQ (5 U/µl) (Life Technologies) . Se desnaturalizó el ADN con calor al incubarlo durante 5 minuto a 95 °C, seguido de 25 ciclos de 1 minuto a 95 °C, 1 minuto a 52 °C y 1 minuto a 72 °C. Luego de estos 25 ciclos, se incubó la mezcla durante 5 minutos a 72 °C. El análisis de la reacción reveló un producto diferenciado de 1,5 kb, que tenía el tamaño esperado . Ejemplo 5.2.2. Rotulación-32P de un fragmento de PCR de 1,5 kb Se aisló el fragmento de 1,5 kb obtenido por PCR y se rotuló según la descripción de EP-A-0 463 706, Ejemplos 2.2 y 7.1. Ejemplo 5.2.3. Rastreo de la biblioteca de ADNc de A. niger N400 por clones de ADNc de celobiohidrolasa La construcción de la biblioteca de ADNc de A . niger se describe en WO 96/06935 (Ejemplo 3) . Para rastrear la biblioteca de ADNc de A . niger N400 por clones de ADNc cbh, se colocó 5*103 pfu por plato de topagarosa NZYCM con 0,7% de agarosa en platos NZYCM (1,5% agar) de 85 mm de diámetro como se describe (Maniatis et al, 1982, pp.64), con E. Coli LE392 como bacteria de revestimiento . Luego de incubar las platos durante toda una noche a 37 °C, se tomaron dos reproducciones de cada una en filtros HybondN (Amersham) , como se describe en Maniatis et al (1982, pp.320-321) . Se hibiidizó previamente los filtros a 65 °C durante 2 horas en un buffer de prehibridización con: 6xSSC, 0,5% SDS, 5xsolución de Denhardt, 0,01 M EDTA y 100 µg/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado al calor (Boerhinger Mannheim) . Luego de una prehibridización de dos horas, se reemplazó el buffer de la prehibridización por un buffer de prehibridización idéntico al buffer de prehibridización, pero con el fragmento de PCR de 1,5 kb rotulado 32p que contiene secuencias ce!2 de Agaricus bisporus, preparado según el Ejemplo 5.2.2. Se hibridizaron los filtros durante 18 horas a temperatura de 60 °C. Luego de la hibridización, se lavó primero los filtros a 60°C durante 30 minutos en 4* SSC / 0,5% SDS, seguido de dos lavados a 60°C durante 30 minutos en 2 * SSC / 0,5% SDS. Se envolvieron los filtros secados con aire en una hoja de papel Whatman 3MM, se hicieron marcas con tinta radioactiva, y se cubrió el papel Whatman y los filtros con Sarán Wrap. Se identificó las placas hibridizantes al exponerlas a una película radiográfica Kodak XAR durante 72 horas a -70°C con una pantalla intensificadora. Se constataron unas cincuenta placas hibridizantes positivas, por duplicado, por plato. Se recogieron 12 placas positivas del plato con una pipeta Pasteur, y se eluyeron los fagos del tapón de agar en 1 ml de un buffer SM con 20 µl de cloroformo, como se describe en Maniatis et al (1982, pp. 64) . Se purificaron los fagos obtenidos al repetir el procedimiento descripto anteriormente con reproducciones del filtro de platos con 50-100 placas de los fagos aislados. Luego de la purificación, se propagó los fagos al colocar 5xl03 fagos en un medio NZYCM. Luego de una incubación toda la noche a 37 °C, se obtuvo placas confluentes, de las cuales se eluyó los fagos al agregar 5 ml de un buffer SM y al almacenar el plato durante 2 horas a 4°C con una agitación intermitente. Luego de recolectar el sobrenadante con una pipeta, se removió las bacterias de la solución por centrifugación a 4.000 x g durante 10 minutos a 4 o C. Se agregó 0,3% de cloroformo al sobrenadante y se determinó la cantidad de pfu. Estos stocks de fagos contenían aproximadamente 107 pfu/ml . Ejemplo 5.2.4. Análisis de restricción de clones de ADNc cbh Se convirtió los clones Uni-ZAP XR recombinantes que contenían ADNc cbh en fagemidos Bluescript por superinfección con el fago ayudante filamentoso ExAssist™, incluido en el kit de síntesis de ADNc - ZAP™ de Stratagene, según las instrucciones del fabricante. Luego, se aisló el ADN fagemido como se describe en Sambrook et al (1989, pp 1.25 - 1.28) . Se sometió el ADN aislado de 8 clones de ADNc cbh a un análisis de restricción con las siguientes enzimas de restricción: EcoRI y Xhol . Se asimiló el ADN durante 2 horas a 37°C en una mezcla de la reacción compuesta por las siguientes soluciones: 2 µl de una solución de ADN (>> lµg) ,- 2µl de un buffer 10 * React apropiado (Life Technologies) ; 10 U de cada enzima Restriction (Life Technologies) y agua destilada estéril para dar un volumen final de 20 µl . Luego de agregar 4 µl de un buffer de carga de ADN, se cargó las muestras en 0,7% de un gel de TAE-agarosa. Se separó los fragmentos de ADN por electroforesis a 80 V durante 1.5 horas. El análisis de restricción de los clones de ADNc aislados reveló dos tipos de plásmidos: uno con insertos de 1,2 kb y otro con insertos de 1,8 kb. Ejemplo 5.2.5. Análisis de secuencia del clon CBHA-C9 de ADNc cbh de A. niger Se determinó la secuencia de clones de ADNc cbh de A . niger al subclonar fragmentos de uno de los clones positivos del Ejemplo 5.2.4 con un inserto de 1,8 kb, llamado CBHA-C9, en pBluescript SK (SEC. ID. No. 5) . Se efectuó reacciones de secuenciación con el kit de secuenciación del ciclo del cebador rotulado por fluorescencia ThermoSequenase (Amersham) con cebadores de secuenciación universales. Se analizó las reacciones de secuenciación en un secuenciador ALFexpress (Pharmacia) . Se realizó un análisis de secuencia con el programa Winstar (LaserGene) , y dio la secuencia indicada en la Figura 1 / SEC. ID. No. 5. Se muestra en la Fig. 2 / SEC. ID. No. 8 la secuencia de aminoácido de la región codificadora, correspondiente a los nucleótidos 49 a 1404. La región codificadora codifica la enzima primigenia (aminoácido 18 a 452) más su presecuencia (aminoácido 1 a 17) . La proteína no contiene un péptido de enlace ni un campo de enlace de celulosa. Ejemplo 5.2.6. Rastreo de la biblioteca genómica de A. niger por el gen cJb A Para rastrear la biblioteca genómica de A . niger, construida según Harmsen et al (1990) , se colocó 3xl03 pfu por plato para el gen cbhA en topagarosa NZYCM con 0,7% de agarosa en 5 platos NZYCM (1,5% agar) de 85 mm de diámetro, como se describe (Maniatis et al, 1982, pp.64), con E. Coli LE392 como bacteria de revestimiento. Luego de incubar las platos durante toda una noche a 37 °C, se tomaron dos reproducciones de cada una en filtros HybondN (Amersham) , como se describe en Maniatis et al (1982, pp.320-321) . Se hibridizó previamente los filtros a 68 °C durante 2 horas en un buffer de prehibridización con: 6xSSC, 0,5% SDS, dxsolución de Denhardt, 0,01 M EDTA y 100 µg/ml de - ADN de esperma de arenque desnaturalizado al calor (Boerhinger Mannheim) . Luego de una prehibridización de dos horas, se reemplazó el buffer de la prehibridización por un buffer de prehibridización idéntico al buffer de prehibridización, pero con el inserto de 1,8 kb rotulado 32p del clon CBHA-C9 de ADNc, preparado según el Ejemplo 5.2.2. Se hibridizaron los filtros durante 18 horas a temperatura de 68 °C. Luego de la hibridización, se lavó primero los filtros a 68°C durante 30 minutos, en 4* SSC / 0,1% SDS, seguido de un segundo lavado a 68 °C durante 30 minutos en 2 * SSC / 0,1% SDS. Luego, se lavó los filtros dos veces a 68 °C durante 30 minutos con 0,1*SEC / 0,1% SDS. Se envolvió los filtros secados con aire en una hoja de papel Whatman 3MM, se hicieron marcas con tinta radioactiva, y se cubrió el papel Whatman y los filtros con Sarán Wrap. Se identificó las placas hibridizantes al exponerlas a una película radiográfica Kodak XAR durante 72 horas a -70°C con una pantalla intensificadora. Se constató dos a tres placas hibridizantes positivas, por duplicado, por plato. Se recogieron 5 placas positivas del plato con una pipeta Pasteur, y se eluyeron los fagos del tapón de agar en 1 ml de un buffer SM con 20 µl de cloroformo, como se describe en Maniatis et al (1982, pp. 64) . Se purificó los fagos obtenidos al repetir el procedimiento descripto anteriormente con reproducciones del filtro de platos con 50-100 placas de los fagos aislados. Ejemplo 5.3. Expresión de ADNc cibA en A. niger Ejemplo 5.3.1. Construcción de un cásete de expresión de cJbhA Se utilizó el clon CBHA-C9 de ADNc del Ejemplo 5.2.5. para construir un plásmido de expresión. Se realizó todas las asimilaciones con 1-3 µg de ADN, 2 µl del buffer 10 * React apropiado (Life Techologies) , 10 U de enzima Restriction (Life Technologies) y agua destilada estéril para dar un volumen final de 20 µl . Se incubó las asimilaciones a 37 °C durante 1-2 horas. Luego, se cargó las muestras en 0,7% de un gel de agarosa en un buffer de TAE, y se separó los fragmentos de ADN por electroforesis a 80 V. Luego de la electroforesis, se cortó la banda apropiada y se aisló el fragmento de ADN con el kit GeneClean™ (Biogel 101 Inc.), según las instrucciones del fabricante. Se efectuó ligaduras en 10 * de un buffer de ligadura (Promega) , 50-100 ng de ADN vector, una cantidad excedente multiplicada por tres de ADN inserto, 1 U de T4-ligasa, resultante en un volumen final de 10 µl . Luego de una incubación toda la noche a 15°C, se utilizó 4 µl de la mezcla para transformar células competentes de E. coli DH5a preparadas de la siguiente manera: 200 µl de un cultivo toda la noche de E. coli DH5a, precultivado en un medio LB (medio LB cada 1000 ml : 10 g de tripticasa peptona (Life Technologies) , 5 g de extracto de levadura (Life Technologies), 10 g de NaCl, 0,5 mM de Tris-HCL pH 7,5). Se incubó este cultivo en un agitador orbital a 37 °C hasta que su densidad correspondió a un O.D. 600 de 0,15 - 0,2. Luego, se recolectó las bacterias por centrifugación a 3000 rpm a 4°C. Luego de remover el sobrenadante, se mantuvo las células en hielo permanentemente. Se lavó el pellet bacteriano en 40 ml de un buffer de transferencia K-MES (cada 100 ml : 6 ml de 1 M CaCl2, 0,5 ml de 1 M MgCl2, 4 ml de 0,5 M K-MES pH 6,0, 0,5 ml 1 M de MnCl2) al volver a suspender estas células, seguido de una centrifugación, como se describió anteriormente. Por último, las células se volvieron a suspender en 10 ml de K-MES / glicerol (= buffer de transferencia K-MES + 15% glicerol) . Las partes alícuotas (50 µl) se usaron inmediatamente para la transformación o se congelaron a -70 °C. Se usó células competentes de E. coli DH5a en experimentos de transformación al combinar 50 µl de la suspensión de las células con 4,5 µl de la mezcla de ligadura. Luego de una incubación de 30 minutos en hielo, se incubó las células durante 2 minutos a 42 °C. Luego, se agregó 1 ml de un medio LB y se incubó las células a 37°C durante 1 hora. Se recolectó las bacterias por centrifugación a 14.000 g cada 20 segundos. Luego de remover el sobrenadante, se volvió a suspender las células en 100 µl de un medio LB. Se colocó la suspensión bacteriana resultante en un medio LB con 100 µg/ml de ampicilina y 50 µg/ml de X-gal y 60 µg/ml de IPTG, en el caso de rastreo azul/blanco. Se cultivó una selección de 2-12 de las colonias resultantes toda la noche en un medio LB con 100 µg/ml de ampicilina. Se aisló ADN plásmido de los cultivos por el método de lisis alcalino, descripto por Maniatis et al (1982, pp. 368-369), utilizado en el análisis de restricción del Ejemplo 5.2.4. para seleccionar un clon que fije el plásmido seleccionado. Los métodos descriptos anteriormente se utilizaron para construir el plásmido de expresión de cbhA designado como pIM3006. Se asimiló el plásmido promH, que contiene el promotor de A . niger pkiA, con Sstl y Nsil y se ligó en Pcbha-C9 asimilado de Sstl - Nsil . Luego de la linealización del plásmido resultante, que contiene la fusión pkih - cbhA, con Sstl , se asimiló parcialmente esta construcción con Bglll. Se ligó el fragmento de Sstl -BgrlII de 2,4 kb en un plásmido asimilado de BamHl - Sstl que portaba un fragmento de BamHl -HindIII que contenía el terminador del gen de Aspergillus nidulans trpC. El sitio de restricción de Bglll se halla aproximadamente a 150 bp por debajo del codón de detención putativo. Se designa la construcción resultante como pIM3006. Se aisló ADN plásmido a gran escala de 100 ml de cultivos de E. coli DH5a que contenían el plásmido pIM3006 de expresión final cultivado en un medio LB con 100 µg/ml de ampicilina mediante el kit Nucleobond PC-100 (Nagel) , según las instrucciones del fabricante. Ejemplo 5.3.2. Introducción de la construcción de la expresión de cbhA. en A. niger 752.1 por cotransformación y rastreo de transformadores para la expresión del gen cbhA de A. niger Se introdujo el plásmido pIM3006, obtenido en el Ejemplo 3.1., en A niger por cotransformación de A . niger 752.1 con A . niger pyrA como marcador selectivo en el plásmido pGW635 (Goosen et al, 1989), y el plásmido pIM3006 como plásmido cotransformador . Se preparó protoplastos de micelio al cultivar A . niger 752.1 en un medio mínimo complementado con 0,5% de extracto de levadura, 0,2% de ácidos casamino, 50 mM de glucosa, 1,5 M de leucina y 10 mM de uridina durante 18 horas a 30 °C. Se realizó la preparación de los protoplastos de A . niger 752.1 y el procedimiento de transformación según Goosen et al, 1987. Se analizó los transformadores PYR+ resultantes para determinar la expresión del gen cbhA de A . niger por SDS-PAGE. Se analizó los transformadores para determinar la formación del producto del gen cbhA de A . niger, la proteína CBHA. Se usó 12 de estos transformadores en un experimento de cultivo para analizar la expresión de CBHA. Se cultivó los transformadores en 50 ml de un medio mínimo (medio por litro: 15 g de KH2P04, 0,5 g de KCl, 0,5 g MgS04.7H20, 6 g de NaN03, y lml de una solución Vishniac pH 6,0 (Vishniac y Santer, 1957) con 4% de fructosa, 0,1% de extracto de levadura y 1,5 mM de leucina durante 30 horas a 30 °C. Luego del crecimiento, se removió el micelio por filtración y se analizó el filtrado del cultivo por SDSPAGE. El transformador 752.1 : :pIM3006-55 fue el mejor productor de CBHA (aprox. 20 µg/ml"1) . Ejemplo 5.3.3. Purificación de la enzima CBHA Se inoculó un matraz Erlenmeyer de 11 con 300 ml de un medio (contenido por litro: 4 g de NH4C1, 1,5 g de KH2P04, 0,5 g de KCl, 0,5 g de MgS04.7H20, 1 ml de una solución de sales Vishniac (contenido por litro: 10 g de EDTA, 4,4 g de ZnS04.7H20, 1,0 g de MnCl2.4 H20, 0,32 g de CoCl2.6H20, 0,32 g de CuS04.5H20, 0,22 g (NH4)6M07024 .4H20, 147 g de CaCl2.2H20, 1,0 g de FeS04.7H20, pH 4,0 (Vishniac y Santer, 1957)), pH 5,0, complementado con 0,2% de extracto de levadura ultrafiltrado (Life Technologies), 0,5% de ácidos casamino (Life Technologies) , 10 mM de leucina y 5% de sucrosa como fuente-C) , con 2 * 109 esporas de la cepa 752.1: :pIM3006-55, y se cultivó durante 6 horas a 30 °C. Luego, se agregó todo este cultivo a un medio de 1,7 1 en un fermentador (BTS06) de 3 litros Applikon, controlado por una unidad Bioprocessor ADI 1020 (Applikon) . Se controló la temperatura de la fermentación a 30°, y se permitió bajar el pH a pH 3 , 0 , el cual se mantuvo al agregar 5 N de NaOH. Se drenó 1,9 1 del caldo de cultivo del fermentador 30 horas después de la inoculación. Se separó los micelios del caldo de cultivo por filtración. Se llenó nuevamente el fermentador con 2 1 de medio de cultivo fresco y se cultivó durante otras 30 horas, como se mencionó anteriormente. Luego de esta segunda corrida, se separó los micelios del caldo de cultivo por filtración. Se combinó los filtrados del cultivo de ambas corridas, y se agregó piperazina a una concentración final de 10 mM. Se ajustó el pH a pH 5,5 con 10 N de NaOH. Luego, se aplicó el filtrado en una columna de intercambio de aniones Streamline™ (Pharmacia) . Luego de la carga, se lavó la columna con 10 mM de piperazina-HCl (pip-HCl) pH 5,5. Se eluyó la enzima de la columna al aplicar un pulso de sal con 10 mM de pip-HCl pH 5,5 / 1 M NaCl . Se recolectó fragmentos de 15 ml y se detectó una actividad CBH mediante el substrato cromogénico 4-metilumbelliferril-ß-D-celobiosida (detecta celobiohidrolasas) (Sigma M-6018) . La mayor parte de la actividad CBH se detectó en las fracciones 2, 3 y 4. Estas fracciones se agruparon y sometieron a diálisis en 10 mM de pip-HCl pH 5,5.

Listado de Secuencias ) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: GIST-BROCADES (B) STREET: Wateringseweg I (C) CIUDAD: Delft (E) PAÍS: HOLANDA (F) CÓDIGO POSTAL: 2611 XT (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIÓN NOVEDOSA MEJORADORA DE PAN (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv) FORMULARIO A LEER POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE SOPORTE : FLOPPY DISK (B) COMPUTADORA: COMPATIBLE CON IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MC-DOS (D) SOFTWARE : Patente # 1 . 0 , Versión # 1 , 25 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. No. 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO.l Leu Tyr Leu Met Ser Asp Asp Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. No. 2: (iii) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (C) LONGITUD: 24 aminoácidos (D) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (iv) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO .2 Leu Gly Asn Thr Asp Phe Tyr Gly Pro Gly Leu Thr Val Asp Thr Asn 1 5 10 15 Ser Pro Phe Thr Val Val Thr Gln 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. No. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CANTIDAD DE HILERAS: Única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO .3 GTCCGTACCA ACATGGCC (2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. No. 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (Á) LONGITUD: 21 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CANTIDAD DE HILERAS: Única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO .4 ACTCAGAAAC ATTGGCTATA G (2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. No. 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1701 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CANTIDAD DE HILERAS: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) ORIGEN NATURAL: (A) ORGANISMO: Aspergillus niger (B) HILERA: N402 (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO .5 - - CGAAATCACT AAAAGGAGAC GACTAGAGTC TTATACAATC TCATTACAAT GCATCAACGT 60 GCCCTTCTCT TCTCAGCCCT GCTGACGGCT GTTCGCGCCC AGCAAGCCGG AACGCTCACß 120 GAGGAAGTCC ATCCTTCCTT GACCTGGCAG AAATGCACTT CTGAAGGCAG CTGCACtGAA ?ao CAGAGTGGCT CAGTTGTCAT TGACTCGAAC TGGCGCTGG? CCCATGCCGT CAATGACAGC 240 ACCAATTGCT ACACTGGCAA CACCTGGGAT GCAACTCTCT OCCCTGATGA TGAGACCTCT 300 GCGGCCAACT GCGCCCTGGA CGGAGCAGAC TACGAGTCCA CCGACGOTGT CACCACXD?C 360 GGTGATTCAT TGACACTGAA ATTCGTCACT sscTCCAATo TGGGCTCGCO GTGOTATCTA 420 ATGGACACGA sCGACGAGGG ATACCAGACG TTCAACTTGC TTGACGCAGA GTTCACTTTC 480 GACGTTGATG TGTCTAACCT CCCATGTGGG CTAAACGGCG CGTTGTACTT CACTGCAATG 540 GACGCCGATG GTGGAGTCTC AAAATACCCT GCCAATAAGG CTGGAGCCAA GTACGGAACA 600 GGATACTGTG ACTCCCAATG CCCCCGGGAC CTGAAATTCA TCGACGGACA AGCCAACGTC 660 GATGGCTGGG AACCTTCTAG CAACAATGAC AACACAGGTA TCGCCAATCA CGOTfCTTGC 720 TGCCCTGAAA TGGATATCTG GGAGGCAAAC AAGATCTCGA CCGCATTGAC ACCCCATCCT 780 TGTGACAGCA GCGAACAGAC CATGTstGAG GGTAACsACT sCGGTGsAAC CTACTCGGAT 840 GATCGCTACG GAGGAACCTO CGACCCTGAC GGCTGCGACT TCAACCCTTA TCGCATGGGC 900 AACGACTCTT TCTACGGTCC TGGCAAGACC ATCGACACCG GATCCAAGAT GACGGTrGTG 960 ACCCAGTTCA TCACTGATGG CTCTGGCTCC CTCAGCGAGA TCAAGCGTTA CtACGTGCAG 1020 AACGGAAATG TTATAGCGAA CGCTGATTCC AACATCTCTO GAOTGACTGG AAACTCGATC 1080 ACAACGGACT tCTGCACTGC GCAGAAGA?G GCCTTTGGCG ACGAGGATAT ATTCsCTGAG 1140 CACAATGGAC TTGCTGGAAT CAGTGATGCC ATGTCTTCCA tosttctcAT CTTGAGCTTG 1200 TGGGATGATT ACTATGCCAG CAT?GAGTGG CTCGACAGCG ACTATCCCGA GAACOCTACC 1260 GCTACCGACC CAGGTGTTGC ACGCGGAACA TGCGACTCGG AATCAGGCCT CCCTGCGACA 1320 GTCGAGGGGG CGCATCCCGA TTCTTCGGTG ACCTTCTCAA ACATCAAGTT CGGTCCCATC 1380 AACTCGACCT TCAGCGCTTC CGCATAAGGG GAAGTGCAGG CTTCAGAGCC TCAATTACAT 1440 CCCACAAGCC GAACACAACA GGACAGGTTC CTGGAACGG? ATATGGGAGA GTTGCGGGCT 1500 TGTAAATAGT CCGAAAAGTG GTCACTGCTT TTGTGTATCG GGCTGTCTTC CCATTTTATT 1560 TTCATTCACT CCAGATTGAT TGATGCAGAT CTTGTTTGTT GATTCTTTCA CTTCGTGCTG 1620 TGACTTTTTG TACCTAACTT CACATTCGTT TCTTTTCTGT TTTTGAOtCC ACTCAATCCA 1680 AGAGACAGTT GTTCCTTTGC T 1701 (2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. No. 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CANTIDAD DE HILERAS: Única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO .6 GAYGAYAGYA AYTAYGARTT RTTYAA (2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. No. 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (Á) LONGITUD: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CANTIDAD DE HILERAS: Única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO.7 GTRAANGGRC TRTTNGTRTC (2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. No. 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 452 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO .8 Met Hiß Gln Arg Ala Leu Leu Phe Ser Ala Leu Leu Thr Ala Val Arg 1 5 10 15 Ala Gln Gln Ala Gly Thr Leu Thr Glu Glu Val Hlß Pro Ser Leu Thr 20 25 30 Trp Gln Lyß Cys Thr Ser Glu Gly Ser Cyß Thr Glu Cln Ser Gly Ser 35 40 4S Val Val He ?ßp Ser Aßn Trp ?rg Trp Thr Hlß Ser Val ?ßn ?ßp Ser 50 55 60 ! i Thr ?ßn Cyß Tyr Thr Gly ?ßn Thr Trp ?ßp ?la Thr Leu Cyß Pro ?ßp 65 70 75 80 Aap Glu Thr Cys Ala ?la Aßn Cyß Ala Leu Aßp Gly Ala Aßp Tyr Glu 85 90 95 Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Aßp Gly Aßp Ser Leu Thr Leu Lyß Phe 100 105 110 Val Thr Gly Ser Aßn Val Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Met Aßp Thr Ser 115 120 125 Asp Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Aßn Leu Leu Aßp Ala Glu Phe Thr Phe 130 135 140 Aßp Val Aßp Val Ser Aßn Leu Pro Cyß Gly Leu Aßn Gly Ala Leu Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Ala Met Asp Ala Aßp Gly Gly Val Ser Lyß Tyr Pro Ala Aßn 165 170 175 Lys ?la Gly Ala Lyß Tyr Gly Thr Gly Tyr Cya Aßp Ser aln Cyß Pro 180 185 190 Arg Asp Leu Lys Phe He Aßp Gly Gln ?la ?ßn Val ?op Gly Trp Glu 195 200 205 Pro Ser Ser ?sn ?ßn ?ßp ?sn Thr Gly He Gly ?ßn His Gly Ser Cys 210 215 220 Cys Pro Glu Met ?sp He Trp Glu ?la ?an Lyß He Ser Thr ?la Leu 225 230 235 240 Thr Pro His Pro Cys ?ßp Ser Ser Glu Gln Thr Met Cyß Glu Gly ?ßn 245 250 i 2S5 ?ßp Cyß Gly Gly Thr Tyr Ser Aßp ?ßp ?xg Tyr Gly Gly Thr Cyß ?ßp 260 265 270 Pro ?ßp Gly Cys ?ßp Phe ?ßn Pro Tyr Arg Met Gly ?ßn Aßp Ser Phe 275 280 285 i Tyr Gly Pro Gly Lys Thr He Aßp Thr Gly Ser Lyß Met Thr Val Val 290 295 300 Thr Gln Phe He Thr Aßp Gly Ser Gly Ser Leu Ser Glu He Lys Arg 30S 310 315 320 Tyr Tyr Val Gln ?sn Gly ?ßn Val He ?la ?ßn ?la ?ßp Ser ?ßn He 325 330 335 Ser Gly Val Thr Gly ?ßn Ser He Thr Thr ?ßp Phe Cyß Thr ?la Gln 340 345 350 Lys Lys ?la Phe Gly ?ßp Glu ?ßp He Phe ?la Glu Hiß Asn Gly Leu 355 360 365 Ala Gly He Ser Aßp Ala Met Ser Ser Met Val Leu He Leu Ser Leu 370 375 380 Trp Aap Aap Tyr Tyr Ala Ser Met Clu Trp Leu Asp Ser Asp Tyr Pro 385 390 195 400 Glu Aan Ala Thr Ala Thr Aap Pro Gly al Ala Arg Gly Thr Cys Aap 405 410 415 Ser Glu Ser Gly Val Pro Ala Thr Val Glu Gly ?la Hiß Pro ?ßp Ser 420 425 430 Ser Val Thr Phe Ser ?ßn He Lyß Phe Oly Pro He ?sn Ser Thr Phe 435 440 44S Ser ?la Ser ?la 450 Referencias Goosen, T., Engelenburg, F. van, Debets, F., Swart, K., Bos, K., Briek, H. van den (1989). Mol. Gen. Genet. 219: 282 - 288. Harmsen, J. A.M. et al., (1990). Curr. Genet. 18: 161 - 166. Maniatis, T., E. F. Fritsch, J. Sambrook (1982): Molecular cloning, a laboratory manual; Cold Spring Harbour Laboratory, New York. Murray, N. (1977): Mol. Gen. Genet. 150: 53 - 58. Saiki, R.K. et al (1988): Science, 239, 487 - 491. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) en: Molecular cloning, a laboratory manual; Cold Spring Harbour Laboratory, New York. Visniac, W., Santer, M. (1957), Bact. Rev. 21: 195 - 213.

Claims (12)

1. -
2. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se reclama como propiedad y por tanto se considera como novedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una composición con una actividad mejoradora de pan, caracterizada porque contiene celobiohidrolasa (CBH) en una cantidad eficaz. 2. Una composición, de acuerdo con la reivindicación l, caracterizada porque contiene CBH en una forma esencialmente libre de cualquier otro material micótico.
3. 3. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque contiene CBH expresado de un gen clonado .
4. 4. Una composición, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque CBH es CBH de Aspergillus o Trichoderma .
5. 5. Una composición, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene a-amilasa y/o endo-xilasa en una cantidad eficaz.
6. 6. Un método para obtener una composición, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque CBH es purificada de un hongo.
7. 7. Un método para obtener una composición, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque CBH es expresada de un gen clonado.
8. 8. El uso de (CBH), una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composición preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 6 o 7, para mejorar: (i) las propiedades de manejo de una masa; (ii) el volumen de pan; y/o (iii) la estructura de la miga del pan.
9. 9. El uso de (CBH), una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composición preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 6 o 7, para actuar sobre los polisacáridos en la pared celular en la harina de trigo.
10. 10. Una masa, caracterizada porque contiene al menos 0,5 mg, preferentemente al menos 5 mg, de CBH por kg. de harina.
11. 11. Un proceso para producir una masa, de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque consiste en mezclar (i) harina, (ii) agua, (iii) levadura y (iv) CBH en una cantidad eficaz para formar una masa, o complementar una masa con CBH.
12. 12. Un proceso, de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque consiste en agregar endo-xilanasa y/o a-amilasa.