ES2234067T3 - Composicion para mejorar el pan. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION EXPONE UNA COMPOSICION PARA MEJORAR EL PAN, QUE CONTIENE CELOBIOHIDROLASA Y SU USO EN LA FABRICACION DEL PAN.
Description
Composición para mejorar el pan.
La presente invención se refiere a la utilización
de una enzima en la fabricación de pan como actividad de mejora del
pan.
Una actividad de mejora del pan es aquella que
mejora cualquier propiedad del producto horneado (particularmente el
volumen del pan y/o la estructura de la miga de pan), y/o mejora
cualquier propiedad de la masa. A lo largo de esta especificación el
término "volumen de pan" debe interpretarse como volumen del
producto horneado cuando corresponda.
Además de los ingredientes básicos, generalmente
harina, agua, levadura y sal, a la masa se añade una composición de
mejora del pan.
Una de las características más importantes del
pan es su volumen, en el que influyen las enzimas. Para obtener un
gran volumen en el pan se pueden añadir composiciones que contengan
hemicelulasa y/o enzimas amilolíticas. Las hemicelulasas se definen
como aquellas enzimas capaces de hidrolizar los polisacáridos sin
almidón en la harina. Las composiciones comercialmente disponibles
proceden en su mayoría de hongos, tales como Aspergillus o
Trichoderma. Estas composiciones son mezclas impuras de
distintas actividades enzimáticas. Hasta ahora se han identificado
endo-xilanasas y arabinofuranosidasas que
contribuyen a la actividad de las composiciones de mejora del
pan.
La utilización de las preparaciones de
hemicelulasa en la fabricación del pan proporciona al producto
horneado acabado un mayor crecimiento en el horno, mejoran el
volumen del pan y proporcionan una mejor textura de grano. Sin
embargo, cuando se utilizan preparaciones de hemicelulasa a
concentraciones más altas, la masa puede volverse floja y pegajosa.
Esto limita la utilización de las preparaciones de hemicelulasa.
Aunque el problema pueda superarse mediante la adición de
glucosaoxidasa, la necesidad de añadir una enzima adicional es un
inconveniente. Mejor sería disponer de una enzima con actividad de
mejora del pan que no tuviera ningún efecto secundario negativo
sobre la masa. Esto plantea la posibilidad de que los emulsionantes
puedan ser sustituidos completamente por enzimas. La resistencia de
los consumidores a los aditivos químicos está creciendo y por ello
existe la necesidad constante de reemplazar los emulsionantes por
aditivos aceptados por los consumidores tales como las enzimas.
La presente invención, tal como se describe en
las reivindicaciones adjuntas, proporciona la utilización de una
CeloBioHidrolasa (CBH) con actividad de mejora del pan para su
fabricación. Preferentemente, la CeloBioHidrolasa es
CBH-I. Los efectos más importantes son un volumen
mejorado del pan y una estructura mejorada de la miga que no vienen
acompañados de incómodas propiedades referidas a la manipulación de
la masa porque ésta se vuelva pegajosa. Preferentemente, la CBH es
de origen microbiano, con más preferencia se utiliza CBH de hongos.
Por ejemplo la CBH puede obtenerse a partir de Trichoderma o
Aspergillus. La CBH-I puede obtenerse de
T. reesei, T. longibrachiatum y T. viride.
Celobiohidrolasas I y II procedentes de Trichoderma reesei
han sido descritas en EP-B 0 137 280 y US 4.894.338,
respectivamente. La CBH I ha sido identificada también en
Agaricus bisporus, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma
viride y Humicola grisea. La presente invención también
describe una composición con actividad de mejora del pan, que
comprende CBH en una cantidad efectiva cuando se añade a otros
ingredientes básicos de la masa. La composición puede comprender
también cantidades efectivas de \alpha-amilasa y/o
endo-xilanasa.
Por "cantidad efectiva" se entiende una
cantidad de enzima que es suficiente para proporcionar un efecto
mensurable sobre el efecto pretendido, en el caso de CBH se trataría
de un efecto mensurable del volumen mejorado del pan o de la
estructura mejorada de la miga.
El hecho de que la CBH tenga un efecto en la
cocción es sorprendente porque la CBH actúa sobre la celulosa que
constituye solamente el 0,3% de la harina de trigo. La CBH hidroliza
los enlaces
1,4-\beta-D-glicosídicos
en la celulosa provocando la liberación de celobiosa. Una
explicación posible sería que la CBH actúa sobre las interfases
celulosa-xilano en las paredes celulares del
endosperma.
Como ya se ha mencionado anteriormente, la
utilización de preparaciones comerciales de
endo-xilanasas de Trichoderma y
Aspergillus es conocida. Aunque se encuentren trazas de CBH
en estas preparaciones, la cantidad de CBH es insuficiente para
contribuir a la mejora de la masa o del pan. De acuerdo con la
presente invención, la CBH puede utilizarse sola o en combinación
con otras enzimas con actividad de mejora del pan, preferentemente
endo-xilanasa. La endo-xilanasa
puede obtenerse a partir de Aspergillus o Trichoderma.
Generalmente, la utilización de la composición de la invención
producirá una masa con buenas propiedades de manipulación, mientras
que el producto horneado final tendrá un volumen y una estructura de
miga mejorados.
Con la utilización de la CBH es posible una
optimización controlada de los productos de mejora del pan, o de las
composiciones de mejora del pan.
Se entenderá que una especialista es capaz de
encontrar las cantidades óptimas que puedan añadirse a la masa.
Una composición de la invención puede utilizarse
en combinación con los constituyentes normales de mejora del pan y
enzimas, por ejemplo xilanasas, \alpha-amilasa,
endo-xilanasa, arabinofuranosidasa,
\beta-amilasa, glucosaoxidasa, proteasa o lipasa.
La CBH por tanto puede incorporarse en una composición de mejora del
pan. Por "composición de mejora del pan" se entiende una
composición que comprende sustancias distintas de las que se
utilizan convencionalmente en la cocción (es decir, harina, agua,
levadura, opcionalmente sal), y que pueden emplearse para mejorar
las propiedades de la masa y/o del producto horneado.
La CBH puede incorporarse igualmente en una
premezcla. Por "premezcla" debe entenderse una mezcla de
agentes de cocción, incluyendo generalmente harina, que se prepara
para facilitar la manipulación en los procesos de preparación de la
masa. Normalmente, una premezcla no contendrá el agua necesaria para
preparar la masa.
La masa de la invención contiene al menos 0,5 mg
de CBH por kilogramo de harina, preferentemente 1 mg/kg de harina,
con más preferencia más de 5 mg de CBH por kilogramo de harina,
incluso con más preferencia más de 10 mg de CBH por kilogramo de
harina. En general, la cantidad de CBH es inferior a 100 mg de CBH
por kilogramo de harina, preferentemente es inferior a 50 mg de CBH
por kilogramo de harina.
Figura 1: Sec. Id. Nº 5
Figura 2: Sec. Id. Nº 8
Figura 3: El volumen de pan en función de la
cantidad de CBH-I
Se obtuvo CBH-I a partir de una
cepa Trichoderma. La cepa se cultivó en un medio que contenía
celulosa para producir enzimas de degradación de celulosa. Después
de la fermentación se filtró el caldo, se filtró en estéril, se
sometió a ultrafiltración y se secó por aspersión. 0,5 kg del
producto de este proceso se suspendieron en 2 l de NaAc 50 mM a pH 5
y se centrifugó la mezcla durante 15 minutos a 4.000 rpm. El
sobrenadante claro se ultrafiltró hasta llegar a una conductividad
inferior a 2 mS.
Se cargaron aproximadamente 3 gramos de proteína
en una columna A DEAE (Biogel A) equilibrada en NaAc 50 mM pH 5. Las
fracciones enriquecidas de CBH I se eluyeron según un gradiente
lineal del 0% al 100% de B en A, en el cual A es un tampón que
contiene NaAc 50 mM pH 5 y B es NaCl 1M en el Tampón A, el pH se
ajusta a 5.
Las fracciones enriquecidas de
CBH-I se ultrafiltraron hasta que la conductividad
fuese inferior a la conductividad de NaAc 10 mM pH 3,6. La muestra
de CBH-I se cargó entonces en una columna Mono S que
estaba equilibrada en NaAc 10 mM pH 3,6. La CBH-I se
eluyó según un gradiente lineal del 0% al 10% de B en A, seguido por
un gradiente del 10% al 100% de B en A, donde A es NaAc 10 mM pH 3,6
y B es NaCl 1M en A. La concentración de proteína en cada fracción
eluída se determinó mediante la utilización de un análisis
cuantitativo de aminoácidos. El producto purificado contenía 7 mg de
proteína/ml y era puro según se estimó por electrofóresis en gel
SDS.
Se ensayó la CBH-I (ver el
Ejemplo 1) en un ensayo de cocción a gran escala utilizando la
receta siguiente:
- \text{*} 2.000 g de harina Kolibri - (Meneba) y 500 g de Ibis (Meneba);
- \text{*} 1.305 g de agua;
- \text{*} 50 g de levadura en bloque, Konings gist®;
- \text{*} 50 g de sal;
- \text{*} 12,5 g de azúcar;
- \text{*} 25 ppm de ácido ascórbico;
- \text{*} 20 ppm de Fermizime® - (TM) P200 (á-amilasa de hongo, disponible de Gist-Brocades);
- \text{*} opcionalmente Fermizyme® HS 2000 y/o CBH-I (Trichoderma), ver Tabla 1.
Se mezclaron conjuntamente los ingredientes y se
utilizaron para formar tres masas de 900 gramos. Se fermentaron
estas masas. La primera fermentación durante 30 minutos y la segunda
durante 40 minutos a 30ºC. Después de darle forma a la masa, se
realizó una fermentación final durante 70 minutos a 35ºC. Se horneó
entonces el pan durante 30 minutos a 250ºC. Posteriormente se
dejaron enfriar las barras de pan y se determinó el volumen del pan
mediante el método de desplazamiento de semillas de colza. Se
determinaron también otras propiedades.
Los resultados obtenidos figuran en la Tabla
1.
Cada ensayo de cocción se realizó por triplicado.
Estas pruebas triplicadas se llevaron a cabo en paralelo. La
evaluación de las barras de pan se da en valor promedio de los
resultados obtenidos de 3 barras. Las características de la masa y
de la estructura de la miga fueron estimadas por panaderos
cualificados.
Fermizyme® HS2000 es una preparación de
endo-xilanasa de A. niger de la firma
Gist-Brocades. Como puede verse a partir de los
resultados en la Tabla 1, la CBH-I mejora las
propiedades de manipulación de la masa así como la estructura de la
miga de pan, tanto cuando se utiliza sola como en combinación con
Fermizyme® HS2000.
Se clonó un gen que codificaba una CBH procedente
de A. niger y se preparó una muestra de CBH mediante la
expresión de la enzima clonada tal como se describe en el Ejemplo
5.
Se realizó un ensayo de cocción utilizando el
mismo protocolo descrito en el Ejemplo 2. Se añadieron 2,5 mg de la
CBH de A. niger expresada por kilogramo de harina. Esto
resultó en un incremento de volumen de la barra de pan del 10%, en
unas propiedades mejoradas de manipulación de la masa y en una
estructura mejorada de la miga en comparación con la referencia
donde no se añadía CBH.
Se realizó un ensayo de cocción tal como se
describe en el Ejemplo 2, excepto que la harina empleada era harina
Kluut (Meneba) y que se utilizó un mezclador de distinto tipo. Se
añadió CBH-I (ver Ejemplo 1) procedente de
Trichoderma además de una preparación de Trichoderma
(hemicelulasa) comercial. La preparación de hemicelulasa se ensayó a
15 ppm (la cantidad recomendada era de 3 a 20 ppm). Tal como se
muestra en la Figura 3, puede obtenerse un incremento significativo
en volumen además del ocasionado por la preparación de hemicelulasa.
El volumen de la referencia, donde no se añadía ni hemicelulasa ni
CBH-I, era de 2.554 ml.
Cepas:
- E. coli LE 392 (Murray, 1977):
- e14^{-} (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacY1, ó \Delta(lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55
Ejemplo
5.1
Se cultivó A. niger N402 en un medio
mínimo (MM) de Aspergillus (contiene por litro: 6,0 g de
NaNO_{3}, 1,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g de KCl, pH 6,0 y 1 ml de una
solución Vishniac (Vishniac and Santer, 1957, contiene por litro: 10
g de EDTA, 4,4 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,0 g de
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,32 g de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O,
0,32 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,22 g
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O, 1,47 g de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 1,0 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, pH
4,0) y se completó con un 1,5% de arabinoxilano de trigo. Este medio
se inoculó con 1x10^{6} esporas por ml y se cultivó el micelio
durante 96 horas a 30ºC y 250 rpm en un batidor orbital New
Brunswick. Se recogió el filtrado del cultivo después de filtrar el
micelio en un Myracloth (gasa de nylon) utilizando un embudo Büchner
y aspiración suave. Se ajustó el pH del filtrado del cultivo a pH
6,0 con NaOH 0,1M, después de lo cual el filtrado del cultivo se
diluyó mediante adición de 2 volúmenes de agua Millipore.
DEAE-Sephadex
A-50 fue equilibrado en un tampón de acetato sódico
50 mM a pH 5,0 y se añadió al filtrado del cultivo. A los
30-60 minutos de agitación a 4ºC, se pasaron el
DEAE-Sephadex junto con el filtrado del cultivo por
un embudo con un soporte de filtro de vidrio y se transfirió el
DEAE-Sephadex A-50 a una columna.
Esta columna primero se eluyó con un tampón de acetato sódico 50 mM
a pH 5,0, luego con un tampón de acetato sódico 50 mM a pH 5,0 +
NaCl 0,5M. Las fracciones que contenían la actividad
\alpha-arabinofuranosidasa, detectada utilizando
el sustrato cromogénico
4-metilumbeliferil-\alpha-L-arabinofuranósido
(detecta las \alpha-arabinofuranosidasas) (Sigma
M-9519), se juntaron y desalaron mediante diálisis
contra agua Millipore y posteriormente se dializaron contra un
tampón piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0. Después de la
diálisis, la muestra se cargó en una columna de Flujo Rápido
DEAE-Sefarosa, esta columna primero se eluyó con 3
volúmenes de un tampón de piperazina-HCl 20 mM a pH
5,0 y luego con un gradiente lineal de NaCl 0,5M en tampón
piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0. La detección de la
proteína eluída se realizó por medición continua de la absorción UV
a 280 nm. Se recogieron las fracciones de 10 ml sobre
para-nitrofenil-\alpha-L-arabinofuranósido
(PNP-A) (Sigma N-3641), que fueron
analizadas en cuanto a su actividad
\alpha-arabinofuranosidasa. Se encontró actividad
\alpha-arabinofuranosidasa en las fracciones
11-27, 41-47 y
52-61. Se juntaron las fracciones
41-47 y posteriormente se dializaron contra un
tampón de piperazina-HCl 100 mM a pH 5,0 y se cargó
la muestra completa (200 ml) en una columna DEAE Sefarosa FF
(Pharmacia) para concentrar la proteína a un único valor máximo
mediante un gradiente NaCl 1M en tampón
piperazina-HCl 200 mM a pH 5,0. Las fracciones que
contenían la proteína se juntaron (20 ml) y primero se dializaron
contra agua Millipore, después contra piperazina-HCl
20 mM a pH 5,0 y finalmente se concentraron en un concentrador Speed
Vac a 6 ml. Esta preparación se cargó en una columna Sephacryl
S-300, la cual se eluyó con
piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0, NaCl 0,1M. Las
fracciones que tenían actividad sobre PNP-A se
juntaron, se dializaron contra piperazina-HCl 10 mM
a pH 5,0 y se concentraron en un concentrador Speed Vac a 2 ml. Esta
muestra se cargó entonces en una columna (columna Hiload 16/60)
Superdex 75 (Pharmacia) que se equilibró y eluyó con
piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0, NaCl 0,1M. Las
fracciones que tenían actividad de
\alpha-arabinofuranosidasa se dializaron contra un
tampón de acetato sódico 10 mM a pH 3,5. La purificación final se
realizó en una columna de intercambio catiónico Mono S (HR 5/5,
Pharmacia). La columna se equilibró con un tampón de acetato sódico
10 mM a pH 3,5 en la cual se cargó la muestra. La proteína se eluyó
utilizando 27 ml de un gradiente lineal de NaCl 1M en tampón acetato
sódico 10 mM a pH 3,5. La enzima se eluyó en aproximadamente 100 mM
de NaCl.
La enzima purificada se envió a EUROSEQUENCE
(Groningen, Holanda). Allí se aplicó a un gel de
SDS-PAGE y se realizó esencialmente un análisis de
secuencia interna de la proteína tal como el descrito en Rosenfeld y
col. (Rosenfeld, J., Cadevielle, J., Guillemot, J., Ferrara, P.
(1992) Anal. Biochem. 203: 173-179).
Se estudiaron las secuencias de aminoácidos
utilizando un secuenciador automatizado (Modelo 477A, Applied
Biosystems) acoplado a HPLC (Modelo 120A ABI) para el análisis de
los aminoácidos feniltiodantoina (PTH). Se determinaron las
secuencias internas siguientes:
- Leu-Tyr-Leu-Met-Ser-Asp-Asp-Ser-Asn-Tyr-Glu-Leu-Phe-Lys
- (SEC. ID. NO. 1)
- Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Phe-Tyr-Gly-Pro-Gly-Leu-Thr-Val-Asp-Thr-Asn-Ser-Pro-Phe-Thr-Val-Val- Thr-Gln
- (SEC. ID. NO. 2)
De forma sorprendente, la secuencia parcial de
aminoácidos del fragmento interno de la enzima aislada (SEC. ID. NO.
1) mostró una alta identidad con el CBH-I de
Agaricus bisporus, es decir que 11 de 13 residuos eran
idénticos. Esto fue la primera indicación de celobiohidrolasas en
Aspergillus.
Ejemplo
5.2
Ejemplo
5.2.1
La enzima CBH-I de A.
bisporus es codificada por el gen cel2 (EMBL Acc. No. Z50094).
Los dos oligonucleótidos siguientes fueron destinados al PCR, región
de codificación del cel2:
5'-GTC GGT ACC AAC ATG GCC
G-3'
\hskip2.36cm(19-mer) (SEC. ID. NO. 3)
5'-ACT CAG AAA CAT TGG CTA
TAG-3'
\hskip2cm(21-mer) (SEC. ID. NO. 4)
Estos oligonucleótidos, tal como están descritos
en las SEC. ID. NOs. 3 y 4, fueron utilizados en PCR (Saiki y col.,
1988) utilizando ADN de plásmido que contenía secuencias cel2 de
Agaricus bisporus como molde.
Para un PCR se combinaron 2 ng de plásmido de ADN
con 5 \mul 10xtampón reactivo (200 mM Tris-HCl, pH
8,4; 500 mM KCl); 3 \mul de MgCl_{2}50 mM; 4,0 \mul 1,25 mM de
cada uno de los cuatro trifosfatos desoxinucleótidos y 50 pmol de
oligonucleótidos en un volumen final de 50 \mul. Se mezcló la
mezcla de reacción y se añadieron 0,5 \mul de
TAQ-polimerasa (5 U/\mul) (Life Technologies). El
ADN fue desnaturalizado térmicamente mediante incubación durante 5
minutos a 95ºC seguido por 25 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a
52ºC y 1 minuto a 72ºC. Después de estos 25 ciclos la mezcla fue
incubada durante 5 minutos a 72ºC. El análisis de los productos de
reacción reveló un producto discreto de 1,5 kb, que era el tamaño
esperado.
Ejemplo
5.2.2
El fragmento de 1,5 kb obtenido por PCR se aisló
y marcó tal como se describe en
EP-A-0 463 706, Ejemplos 2.2 y
7.1.
Ejemplo
5.2.3
La construcción de la biblioteca de ADNc de A.
niger viene descrita en WO 96/06935 (Ejemplo 3).
Para cribar la biblioteca de ADNc N400 de A.
niger con el fin de obtener los clones de ADNc cbh,
5x10^{3} pfu por placa fueron colocados en placas topagarosa
NZYCM, que contenían un 0,7% de agarosa en placas NZYCM (1,5% agar)
de 85 mm de diámetro como las descritas en Maniatis y col., 1982,
pp. 64, utilizando E. coli LE392 como bacteria de placa.
Después de incubar las placas durante toda la
noche a 37ºC se realizaron dos réplicas de cada una en filtros
HybondN (Amersham) tal como se describe en Maniatis y col. (1982,
pp. 320-321).
Los filtros se prehibridaron a 65ºC durante dos
horas en un tampón de hibridación que contenía 6 x SSC, 0,5% SDS, 5
x solución Denhardt, 0,01 M EDTA y 100 \mug/ml de ADN de esperma
de arenque desnaturalizado térmicamente (Boerhinger Mannheim).
Después de dos horas de prehibridación, el tampón de prehibridación
fue sustituido por un tampón de hibridación que era idéntico al de
prehibridación, pero que contenía el fragmento marcado ^{32}P PCR
de 1,5 kb con las secuencias cel2 de Agaricus bisporus y se
preparó tal como se describe en el Ejemplo 5.2.2. Los filtros fueron
hibridizados durante 18 horas a una temperatura de 60ºC.
Después de la hibridación, los filtros se lavaron
primero a 60ºC durante 30 minutos en 4 x SSC/0,5% SDS, seguido por
dos etapas de lavado a 60ºC durante 30 minutos en 2 x SSC/0,5% SDS.
Los filtros secados al aire se extrajeron en una hoja de papel
Whatman 3MM, se marcaron con tinta radioactiva y se cubrieron el
papel Whatman y los filtros con Saran Wrap. Las placas de
hibridación se identificaron por exposición a película de
rayos-X Kodak XAR durante 72 horas a -70ºC
utilizando una pantalla de intensificación.
Se encontraron aproximadamente cincuenta pocillos
de hibridación positiva por cada placa, que aparecieron en
duplicado. Se seleccionaron doce pocillos positivos de la placa con
una pipeta Pasteur y se eluyeron los fagos del obturador de agar en
1 ml de tampón SM que contenía 20 \mul de cloroformo, tal como se
describe en Maniatis y col. (1982, p. 64). Los fagos obtenidos
fueron purificados por repetición del procedimiento descrito
anteriormente mediante la utilización de réplicas filtradas
procedentes de las placas que contenían 50-100
pocillos de fagos aislados.
Después de la purificación los fagos se colocaron
en placas de 5x10^{3} fagos en un medio NZYCM. Después de
incubación durante toda la noche a 37ºC se obtuvieron unas placas
confluyentes, a partir de las cuales se eluyeron los fagos mediante
la adición de 5 ml de tampón SM y se almacenaron las placas durante
2 horas a 4ºC con agitación intermitente. Después de recoger el
sobrenadante con una pipeta, se eliminaron las bacterias de la
solución mediante centrifugación a 4.000g durante 10 minutos a 4ºC.
Se añadió al sobrenadante cloroformo al 0,3% y se determinó el
número de pfu. Estos almacenamientos de fagos contienen
aproximadamente 10^{7} pfu/ml.
Ejemplo
5.2.4
Clones recombinantes Uni-ZAP XR
que contenían cbh ADNc se convirtieron en fagómidos
Bluescript por superinfección con el fago filamentoso auxiliar
ExAssist^{TM}, que está incluido en el kit de síntesis
ZAP^{TM}-ADNc de Stratagene, siguiendo las
instrucciones del fabricante.
El ADN del fagómido fue posteriormente aislado
tal como se describe en Sambrook y col. (1989, pp.
1.25-1.28).
Se sometió a análisis de restricción el ADN
aislado de ocho clones de cbh ADNc utilizando las enzimas de
restricción siguientes: EcoRI y XhoI. El ADN fue
digerido durante 2 horas a 37ºC en una mezcla de reacción compuesta
por las soluciones siguientes: 2 \mul (>>1 \mug) de
solución de ADN; 2 \mul del tampón adecuado 10xReact (Life
Technologies); 10 U de cada enzima de restricción (Life
Technologies) y agua destilada estéril hasta conseguir un volumen
final de 20 \mul. Después de la adición de 4 \mul de un tampón
de carga de ADN, se cargaron las muestras en un 0,7% de gel
TAE-agarosa. Los fragmentos de ADN se separaron por
electroforesis a 80 V durante 1,5 horas. El análisis de restricción
de los clones de ADNc aislados revelaron dos tipos de plásmido; uno
que contenía injertos de 1,2 kb, los demás injertos de 1,8 kb.
Ejemplo
5.2.5
La secuencia de los clones cbh ADNc de
A. niger se determinó mediante subclonación de los fragmentos
procedentes de uno de los clones positivos del Ejemplo 5.2.4 con un
injerto de 1,8 kb, llamado CBHA-C9, en pBluescript
SK (SEC. ID. Nº. 5). Las reacciones de secuenciación se realizaron
por medio del kit secuenciador de marcado fluorescente de ciclo
principal ThermoSequenase (Amersham) con cebadores universales de
secuenciación. Las reacciones de secuenciación se analizaron en un
secuenciador ALFexpress (Pharmacia). El análisis de la
secuencia se realizó mediante el programa Winstar (LaserGene) y
produjo la secuencia tal como se muestra en la Figura 1/SEC. ID. NO.
5. La secuencia de aminoácidos de la región codificante,
correspondiente a los nucleótidos 49 a 1404, se muestra en la Figura
2/SEC. ID. NO. 8. La región codificante que codifica la enzima
nativa (aminoácido 18 a 452) más su presecuencia (aminoácido 1 a
17). La proteína no contiene ningún péptido enlazante, ni tampoco
ningún campo ligante de celulosa.
Ejemplo
5.2.6
Para cribar la biblioteca genómica de A.
niger construida tal como se describe en Harmsen y col. (1990),
para obtener el gen cbhA, se colocaron 3 x 10^{3} pfu por
placa en placas en top-agarosa NZYCM que contenía un
0,7% de agarosa sobre cinco placas de NZYCM (1,5% agar) de 85 mm de
diámetro tal como se describe en Maniatis y col., 1982, pp. 64,
utilizando E. coli LE392 como bacteria de placa.
Después de incubar durante toda la noche las
placas a 37ºC se realizaron dos réplicas de cada una en filtros
HybondN (Amersham) tal como viene descrito en Maniatis y col. (1982,
pp. 320-321).
Los filtros fueron prehibridizados a 68ºC durante
dos horas en un tampón de prehibridación que contenía: 6xSSC, 0,5%
de SDS, una solución 5xDenhardt, EDTA 0,01 M y 100 \mug/ml de ADN
de esperma de arenque desnaturalizado térmicamente (Boerhinger
Mannheim). Después de dos horas de prehibridación, el tampón de
prehibridación fue sustituido por un tampón de hibridación que era
idéntico al tampón de prehibridación, pero que contenía el injerto
marcado con ^{32}P de 1,8 kb procedente del clon
CBHA-C9 de ADNc y se preparó tal como se describe en
el Ejemplo 5.2.2. Los filtros fueron hibridizados durante 18 horas a
una temperatura de 68ºC.
Después de la hibridación, los filtros se lavaron
primero a 68ºC durante 30 minutos en 4xSSC/0,1% de SDS, seguido por
un segundo lavado a 68ºC durante 30 minutos en 2xSSC/0,1% de SDS.
Los filtros se lavaron entonces dos veces a 68ºC durante 30 minutos
con 0,1xSSC/0,1% de SDS. Los filtros secados al aire se extrajeron
en un papel Whatman 3 MM, se hicieron marcas de manipulación con
tinta radioactiva y se cubrieron el papel Whatman y los filtros con
Saran Wrap. Las placas de hibridación se identificaron mediante
exposición a película de rayos-X Kodak XAR durante
72 horas a -70ºC utilizando una pantalla de intensificación.
Se encontraron de dos a tres pocillos de
hibridación positiva por cada placa, que aparecieron en duplicado.
Cinco de ellos fueron recogidos de la placa utilizando una pipeta
Pasteur y se eluyeron los fagos del obturador de agar en 1 ml de
tampón SM que contenía 20 \mul de cloroformo, tal como se describe
en Maniatis y col. (1982, pp. 64). Los fagos obtenidos fueron
purificados por repetición del procedimiento descrito anteriormente
utilizando réplicas de filtro procedentes de las placas que
contenían 50-100 pocillos de los fagos aislados.
Ejemplo
5.3
Ejemplo
5.3.1
El clon CBHA-C9 de ADNc del
Ejemplo 5.2.5 se utilizó para construir un plásmido de expresión.
Todas las digestiones se realizaron mediante 1-3
\mug de ADN, 2 \mul del tampón adecuado 10xReact (Life
Technologies), 10 U de enzima Restriction (Life Technologies) y agua
destilada estéril hasta obtener un volumen final de 20 \mul. Las
digestiones se incubaron a 37ºC durante 1-2 horas.
Las muestras digeridas se cargaron en un gel de agarosa al 0,7% en
un tampón TAE y los fragmentos de ADN fueron separados
posteriormente mediante electroforesis a 80 V. Después de la
electroforesis se cortó la banda correspondiente y el fragmento de
ADN se aisló utilizando el kit GeneClean^{TM} (Biogel 101 Inc.) de
acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las ligaciones se
realizaron en un tampón 10xligante (Promega), 50-100
ng del vector de ADN, un exceso molar del triple de ADN de injerto,
1 U de T4-Ligasa que resultaron en un volumen final
de 10 \mul. Después de incubación durante toda la noche a 15ºC, 4
\mul de la mezcla se utilizaron para transformar las células
competentes DH5\alpha de E. coli preparadas como sigue: 200
\mul de un cultivo precultivado durante toda una noche de
DH5\alpha de E. coli en un medio LB (medio LB por cada
1.000 ml: 10 g de peptona tripticasa (Life Technologies), 5 g de
extracto de levadura (Life Technoligies), 10 g de NaCl, 0,5 mM
Tris-HCl a pH 7,5. Este cultivo se incubó en un
agitador orbital a 37ºC hasta que su densidad correspondiera a un
O.D. 600 de 0,15-0,2. Se recogieron entonces las
bacterias mediante centrifugación a 3.000 rpm a 4ºC. Después de
desechar el sobrenadante, las células se mantuvieron constantemente
en hielo. El aglomerado bacteriano se lavó en 40 ml de tampón de
transferencia K-MES (por cada 100 ml: 6 ml de
CaCl_{2}1M, 0,5 ml de MgCl_{2}1M, 4 ml de K-MES
0,5M a pH 6,0, 0,5 ml de MnCl_{2}1M) mediante resuspensión de
estas células seguida por centrifugación tal como se ha descrito
anteriormente. Finalmente, las células fueron sometidas a
resuspensión en 10 ml de K-MES/glicerol (= tampón de
transferencia K-MES + 15% de glicerol). Partes
alícuotas (50 \mul) se utilizaron bien sea en el momento para la
transformación o bien se congelaron a -70ºC.
Las células competentes DH5\alpha de E.
coli se utilizaron en los experimentos de transformación por
combinación de 50 \mul de la suspensión de células con 4,5 \mul
de la mezcla de ligación. Después de un período de incubación de 30
minutos en hielo, se incubaron las células durante 2 minutos a 42ºC.
Luego se añadió 1 ml de medio LB y se incubaron las células a 37ºC
durante 1 hora. Posteriormente se recogieron las bacterias por
centrifugación a 14.000 g durante 20 segundos, después de desechar
el sobrenadante las células se resuspendieron en 100 \mul de medio
LB. La suspensión bacteriana resultante se colocó en placas en medio
LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 50 \mug/ml de
X-gal y 60 \mug/ml de IPTG en el caso de cribado
azul/blanco.
Una selección de 2-12 de las
colonias resultantes se cultivó durante una noche en un medio LB que
contenía 100 \mug/ml de ampicilina. De los cultivos se aisló el
ADN de plásmido mediante el método de lisis alcalina descrito en
Maniatis y col. (1982, pp. 368-369), que se utilizó
en el análisis de restricción tal como se describe en el Ejemplo
5.2.4 para seleccionar un clon con el plásmido deseado.
Los métodos anteriormente descritos se utilizaron
para construir el plásmido de expresión cbhA designado por
pIM3006. El plásmido promH, que contenía el promotor pkiA de
A. niger, fue digerido con SstI y NsiI y se
ligó dentro del pCBHA-C9 digerido por
SstI-NsiI. Después de linealización del plásmido
resultante, que contenía la fusión de pkiA-cbhA,
utilizando SstI, este constructo fue parcialmente digerido
utilizando BglII. El fragmento SstI-BglII de
2,4 kb se ligó dentro de un plásmido digerido por
BamHI-SstI que llevaba un fragmento
BamHI-HindIII y que contenía el terminador del gen
trpC de Aspergillus nidulans. El lugar de restricción
de BglII caía aproximadamente a 150 pb "aguas abajo" del
codón de parada putativo. El constructo resultante se designó como
pIM3006.
Se aisló el ADN de plásmido a gran escala a
partir de los cultivos de 100 ml de DH5\alpha de E. coli
que contenían el plásmido de expresión final pIM3006 cultivado en un
medio LB con 100 \mug/ml de ampicilina utilizando el kit
PC-100 Nucleobond (Nagel) siguiendo las
instrucciones de los fabricantes.
Ejemplo
5.3.2
El plásmido pIM3006, obtenido en el Ejemplo 3.1,
fue introducido en A. niger por cotransformación del 752.1 de
A. niger utilizando pyrA de A. niger como
marcador selectivo sobre el plásmido pGW635 (Goosen y col., 1989) y
el plásmido pIM3006 como plásmido cotransformante.
Se prepararon protoplastos a partir de micelio
mediante cultivo de 752.1 de A. niger sobre un medio mínimo
completado por un 0,5% de extracto de levadura, un 0,2% de
casaminoácidos, glucosa 50 mM , leucina 1,5 mM y uridina 10 mM
durante 18 horas a 30ºC. La preparación de protoplastos de 752.1 de
A. niger y el procedimiento de transformación se realizaron
tal como se describe en Goosen y col., 1987. Los transformantes
PYR^{+} resultantes se analizaron en cuanto a la expresión del gen
cbhA de A. niger mediante
SDS-PAGE.
Se analizaron los transformantes en cuanto a la
formación del producto genético cbhA de A. niger, la
proteína CBHA. Se utilizaron doce de estos transformantes en un
experimento de cultivo para analizar la expresión de CBHA. Los
transformantes se cultivaron en 50 ml de medio mínimo (medio por
litro: 15 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de KCl, 0,5 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g de NaNO_{3}, 1 ml de solución
Vishniac (Vishniac and Santer, 1957), a pH 6,0) que contenía un 4%
de D-fructosa, un 0,1% de extracto de levadura y
leucina 1,5 mM durante 30 horas a 30ºC. Después del cultivo, se
eliminó el micelio por filtración y se analizó el filtrado del
cultivo por medio de SDS-PAGE. El transformante
752.1::pIM3006-55 fue el mejor productor de CBHA
(aprox. 20 \mug ml^{-1}).
Ejemplo
5.3.3
Un matraz Erlenmeyer de 1 litro que contenía 300
ml de medio (medio por litro: 4 g de NH_{4}Cl, 1,5 g de
KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de KCl, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O,
1 ml de una solución de sal Vishniac (contiene por litro 10 g de
EDTA, 4,4 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,0 g de
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,32 g de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O,
0,32 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,22 g
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O, 1,47 g de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 1,0 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, pH
de 4,0 (Vishniac and Santer, 1957), de pH 5,0 completado con un 0,2%
de extracto ultrafiltrado de levadura (Life Technologies), un 0,5%
de casaminoácidos (Life Technologies), leucina 10 mM y un 5% de
sacarosa como fuente-C) fue inoculado con 2x10^{9}
esporas de la cepa 752.1::pIM3006-55 y se cultivó
durante 6 horas a 30ºC. La totalidad de este cultivo se añadió
entonces a 1,7 litro de medio en un fermentador Applikon de 3 litros
(BTS06) que estaba controlado por una unidad Bioprocesadora ADI 1020
(Applikon). La temperatura de fermentación estaba controlada a 30ºC
y se dejó caer el pH hasta un pH de 3,0 al cual se mantuvo mediante
adición de NaOH 5N. Se drenó desde el fermentador 1,9 litros de
caldo de cultivo 30 horas después de la inoculación. Los micelios se
separaron del caldo de cultivo por filtración. Se volvió a llenar el
fermentador con 2 litros de medio de cultivo fresco y se cultivó
durante otras 30 horas tal como se describe más arriba. Después de
esta segunda operación, los micelios se separaron del caldo de
cultivo por filtración. Los filtrados de cultivo procedentes de
ambas operaciones se combinaron y se añadió piperazina a una
concentración final de 10 mM. El pH se ajustó a un pH de 5,5 con
NaOH 10N. Se colocó entonces el filtrado de cultivo en una columna
de intercambio aniónica Streamline^{TM} (Pharmacia). Después de
cargarla, la columna se lavó con piperazina-HCl
(pip-HCl) 10 mM a pH 5,5. La enzima fue eluída de la
columna aplicando un pulso salino utilizando pip-HCl
10 mM a pH 5,5/NaCl 1M. Se recogieron fracciones de 15 ml y se
detectó la actividad CBH mediante un sustrato cromogénico
4-metilumbeliferil-\beta-D-celobiósido
(detecta las celobiohidrolasas) (Sigma M-6018). La
mayoría de la actividad de CBH estaba presente en las fracciones 2,
3 y 4. Se juntaron estas fracciones y se dializaron contra
pip-HCl 10 mM a pH 5,5.
Goosen, T., Engelenburg, F. van,
Debets, F., Swart, K., Bos, K., Briek,
H. van den, (1989) Mol. Gen. Genet. 219:
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Curr. Genet. 18: 161-166.
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Labatory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Labatory Press,
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Visniac, W. and Santer, M. (1957),
Bact. Rev. 21: 195-213.
Claims (10)
1. Utilización de celobiohidrolasa (CBH) en una
cantidad efectiva para mejorar:
- (i)
- las propiedades de manipulación de una masa;
- (ii)
- el volumen del pan; y/o
- (iii)
- la estructura de la miga de pan
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque la CBH está incluida en una composición
que comprende además otras enzimas con actividad de mejora del
pan.
3. Utilización según la reivindicación 2,
caracterizada porque la composición comprende además los
constituyentes usuales de mejora del pan.
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la CBH se
encuentra en una forma sustancialmente exenta de otro material
fúngico.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la CBH se
expresa a partir de un gen clonado.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la CBH es
una CBH de Aspergillus o Trichoderma.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, caracterizada porque la composición
que comprende la CBH comprende además una
\alpha-amilasa y/o endo-xilanasa
en una cantidad efectiva.
8. Masa que comprende al menos 0,5 mg de CBH por
kg de harina.
9. Proceso para producir una masa según la
reivindicación 8, que comprende la mezcla de (i) harina, (ii) agua,
(iii) levadura y (iv) CBH en una cantidad efectiva para formar una
masa, o que complete una masa con CBH.
10. Proceso según la reivindicación 9 que
comprende además la adición de endo-xilanasa y/o
\alpha-amilasa.
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