KR20060118577A - 단백질 - Google Patents

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KR20060118577A
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Abstract

트리글리세라이드와 비교시 극성 지질 상에 높은 비율의 활성을 지닌 진균성 야생형 지질분해효소에 있어서, 상기 바람직하게는 적어도 4 이상의 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성을 지님을 특징으로 하는 지질분해효소. 바람직하게는 본 발명에 따른 지질분해효소는 적어도 1.5 이상의 당지질:트리글리세라이드 가수분해 활성을 지닌다. 하나의 바람직한 실시태양에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 (a) 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산; (b) 유전자 코드의 분해에 의한 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열에 관련된 핵산; 및 (c) 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7에 나타난 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 이상의 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 진균성 지질분해효소를 인코드하는 핵산을 포함한다.
Figure 112006054255786-PCT00029
진균성 야생형 지질분해효소, 인지질, 당지질, 가수분해 활성, 트리글리세라이드

Description

단백질{Protein}
본 발명은 신규한 진균성 지질분해효소 및 하나 이상의 신규한 진균성 지질분해효소를 인코드하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 진균성 지질분해효소를 제조하는 방법 및 그의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 개선된 식료품의 제조, 특히 개선된 베이커리 제품의 제조에 관한 것이다. 특히 본 발명은 베이커리 제품을 포함한 식품에 개선된 특성을 부여하는 것이 가능한 신규한 진균성 지질분해효소를 제공한다.
식품 및/또는 사료 산업 적용에 있어서 지질분해효소(E.C. 3.1.1.x)의 유익한 용도는 수년간 알려져 왔다.
예를 들어 EP 0 585 988에서는 반죽에 리파제 첨가가 부패방지 효과의 개선을 야기함이 청구되었다. 반죽에 첨가시 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus)로부터 수득된 리파제가 쇼트닝/지방과 함께 사용시 수득된 빵의 질을 개선시킬 수 있음이 제안되었다. WO94/04035는 개선된 빵 연도(softness)가 반죽에 어떠한 추가적 지방/오일을 첨가하지 않고 반죽에 리파제를 첨가함으로서 수득될 수 있음을 개시하고 있다. Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinki는 외인성 리파제가 빵 부피를 변형시킬 수 있음을 나타내고 있다.
말가루 내의 리파제용 기질은 1.5∼3% 외인성 밀 지질이고, 이는 극성 및 비극성 지질의 복합 혼합물이다. 극성 지질은 당지질과 인지질로 분류될 수 있다. 이들 지질은 2개의 지방산과 극성기로 에스테르화된 글리세롤로 구성된다. 극성기는 이들 지질의 표면 활성에 기여한다. 이들 지질 내의 하나의 지방산의 효소 분해는 훨씬 더 높은 표면 활성을 지닌 지질을 유도한다. 높은 표면 활성을 지닌 DATEM과 같은 유화제는 반숙에 첨가시 매우 기능적임이 잘 알려져 있다.
지질분해효소는 상업적으로 유용한 기능성을 제공하는 식료품 내에 강력한 유화제 분자의 형성을 유발할 수 있는 식품 내에 존재하는 지질로부터 하나 이상의 지방산을 가수분해한다. 가장 유의적인 유화제 특성에 기여하는 분자는 리소-인지질, 리소-당지질 및 모노-글리세라이드 분자와 같은 부분적 가수분해 산물이다. 극성 지질 가수분해 산물 즉, 리소-인지질 및 리소-당지질이 특히 유리하다. 빵 제조시 정위치 유래 유화제와 같은 것이 DATEM과 같은 추가 유화제와 동등한 기능성을 제공할 수 있다.
그러나 지질분해효소의 활성은 자유 지방산의 축적을 유발할 수 있고, 이는 식료품 내의 해로운 기능을 유도할 수 있다. 이러한 지질분해효소의 고유의 활성은 그의 기능성을 제한한다.
빵 부피 상의 부정적인 효과는 과잉 투여에 의해 설명된다. 과잉 투여는 반죽을 너무 걸쭉하게 하여 감소된 부피를 유발하는 글루텐 탄성의 감소를 유도할 수 있다. 더욱이 또는 대안으로 리파제와 같은 것은 반죽에 첨가된 쇼트닝, 오일 또는 우유를 분해하여 반죽 및 베이크된 제품 내의 불쾌취를 유발할 수 있다. 과잉 투여 및 불쾌취는 반죽 내의 자유 지방산, 특히 짧은 사슬 지방산의 축적에 의한 것이다.
원료 물질 또는 식품 내 높은 농도의 자유 지방산(FFA)의 존재는 일반적으로 질적 결함으로 인식되고 식품 가공업자 및 고객은 일반적으로 식품 설명서 내에 최대 FFA 농도를 포함시킬 것이다. 과도한 FFA 농도의 결과적인 효과는 감각수용성 및/또는 기능적 결함이될 수 있다.
EP 1. 193 314에서 발명자들은 당지질 상에 활성인 지질분해효소의 이용이 빵 제조시 특히 유익하게 적용되고 부분적 가수분해 산물로서 리소-당지질이 매우 높은 유화제 기능성을 지니고 자유 지방산의 해로운 축적과 비교시 높은 비율의 양 성적 유화제 기능성을 명백히 유발하는 것으로 나타남을 발견하였다. 그러나 상기 효소는 또한 트리글리세라이드 상에 유의적인 비-선택성 활성을 지니는 것으로 나타났고 이는 무익하게 높은 자유 지방산을 유발하였다.
높은 트리글리세라이드 활성의 이러한 문제점은 발명자들이 반죽 내 극성 지질(당지질 및 인지질) 상에 활성이나 트리글리세라이드 또는 1-모노-글리세라이드 상에 비활성인 지질분해효소를 선택함으로서 개선된 기능성이 달성될 수 있음을 발견한 WO 02/094123에 개시되어 있다.
리파제 효소의 상업적으로 바람직한 원료는 아스페르길루스종(Aspergillus spp.) 및 푸사리움종(Fusarium spp.)과 같은 사상 진균이다. 사상 진균으로부터 분리된 리파제는 산업적으로 적용가능한 특성을 지니는 것으로 나타났고 또한 아스페르길루스 오리제(Aspergillus oryzae), 푸사리움 및 효모와 같은 이형적 생성 시스템 내에서 발현하는 것이 일반적인 것으로 나타났다.
푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로부터의 리파제가 EP 0 130 064에서 확인되었고 식품 적용에 있어서의 푸사리움 옥시스포룸 리파제의 적용은 Hoshino et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56: 660-664에서 제안되었다.
EPO 869 167는 푸사리움 옥시스포룸 리파제의 클로닝 및 발현 및 베이킹시 그의 용도를 기술하고 있다. 상기 효소는 포스포리파제 활성을 지닌 것으로 기술되어 있다. 이러한 효소는 Lipopan FTM으로 Novozymes A/S (Denmark)에 의해 판매되고 있다.
WO 02/00852는 푸사리움 베네나툼(F. venenatum), 푸사리움 술푸레움(F. sulphureum), 아스페르길루스 베르켈레이아눔(A. berkeleyanum), 푸사리움 쿨모룸(F. culmorum) 및 푸사리움 솔라니(F. solani)로부터 분리된 5가지 리파제 효소 및 그의 인코딩 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 있다. 5가지 효소 모두 트리아실글리세롤 가수분해 활성, 포스포리파제 및 갈락토리파제 활성을 지닌 것으로 기술되어 있다. 이들 효소 중 3가지는 EP 0 869 167에 나타난 푸사리움 옥시스포룸 효소와 동등한 활성을 지닌다: 푸사리움 베네나툼, 푸사리움 술푸레움, 푸사리움 쿨모룸.
따라서 Lipopan FTM를 포함한 일부 푸사리움 리파제는 인지질 및 당지질을 포함한 극성 지질 상에 부가적 활성을 지닌 것으로 나타남이 분명하다. EP 0 869 167에서 포스포리파제로 기술되었으나 푸사리움 옥시스포룸으로부터의 리파제는 높은 리파제 활성을 지닌다. 본 효소는 글리코리파제 활성도 지닌다. 그러나 극성 지질 상의 유의적인 활성에도 불구하고 본 효소의 이용에 의해 달성되는 기능성은 높은 리파제(즉, 트리글리세라이드) 활성에 의해 제한된다.
Nagao et al (J. Biochem 116 (1994) 536-540)은 푸사리움 헤테로스포룸(F. heterosporum)으로부터의 리파제를 기술하고 있다; 효소는 트리글리세라이드를 가수분해하는 리파제(E.C. 3.1.1.3)로 우세하게 기능한다. 이는 본 발명에 따른 효소와 매우 다르다.
야생형 모효소와 비교시 극성 지질 상에 증가된 활성을 지닌, 특이적 아미노산 치환 및 융합을 지닌 지질분해효소 변이체가 제조되었다. WOO1/39602는 SP979로 표기되는 이러한 변이체를 기술하고 있고, 이는 테르모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus) 리파제와 EP 0 869 167에 기술된 푸사리움 옥시스포룸 리파제의 융합이다. 이러한 변이체는 트리글리세라이드와 비교시 인지질 및 당지질 상에 유의적으로 높은 비율의 활성을 지니는 것으로 나타났다.
그러나 본 발명 이전에는 트리글리세라이드와 비교시 극성 지질 상에 높은 비율의 활성을 지닌 천연 진균성 지질분해효소, 특히 푸사리움종으로부터의 지질분해효소가 인식되지 않았다.
발명의 요약
광범위한 관점에서 본 발명은 트리글리세라이드와 비교시 극성 지질(인지질 및/또는 당지질) 상에 높은 비율의 활성, 특히 트리글리세라이드와 비교시 당지질 상에 높은 비율의 활성을 지닌 진균성 지질분해효소에 관한 것이다.
또다른 광범위한 관점에서 본 발명은 트리글리세라이드와 비교시 극성 지질(인지질 및/또는 당지질) 상에 높은 비율의 활성, 특히 트리글리세라이드와 비교시 당지질 상에 높은 비율의 활성을 지닌 야생형 진균성 지질분해효소에 관한 것이다.
또다른 광범위한 관점에서 본 발명은 여기서 나타난 신규한 진균성 지질분해효소를 인코드하는 핵산에 관한 것이다.
또다른 광범위한 관점에서 본 발명은 본 발명의 진균성 지질분해효소를 식료품의 하나 이상의 성분에 첨가하는 것을 포함한, 식료품, 바람직하게는 계란-주성분 식료품의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 진균성 지질분해효소를 반죽의 하나 이상의 성분에 첨가하고 반죽을 형성하도록 혼합시키는 것을 포함한 반죽의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 광범위한 관점은 본 발명의 진균성 지질분해효소를 반죽에 첨가하는 것을 포함한, 반죽으로부터의 베이크된 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 방법은 진균성 지질분해효소를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한 재조합 핵산으로 숙주 세포를 형질전환시켜 숙주가 진균성 지질분해효소의 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 것이 가능하게 되고, 상기 핵산이 발현되는 조건 하에서 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 상기 진균성 지질분해효소를 채취하는 것을 포함한, 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 제조 방법이 제공된다.
또다른 광범위한 관점에서 본 발명은 저온에서 활성을 유지하는 지질분해효소 즉, 저온 지질분해효소인 지질분해효소를 제공한다.
본 발명의 관점은 청구항 및 하기 설명에 나타나 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 관한 또다른 관점은 본 발명의 서열을 포함한 컨스트럭트; 본 발명에 사용하기 위한 서열을 포함한 벡터; 본 발명에서 사용하기 위한 서열을 포함한 플라스미드; 본 발명에서 사용하기 위한 서열을 포함한 형질전환 세포; 본 발명에서 사용하기 위한 서열을 포함한 형질전환 조직; 본 발명에서 사용하기 위한 서열을 포함한 형질전환 기관; 본 발명에서 사용하기 위한 서열을 포함한 형질전환 숙주; 본 발명에서 사용하기 위한 서열을 포함한 형질전환 생물체를 포함한다. 또한 본 발명은 상기한 것의 전이 방법을 포함 하여, 숙주 세포 내에서의 발현과 같이 이를 이용한 본 발명에서 사용하기 위한 뉴클레오타이드 서열의 발현 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 숙주 세포로부터의 분리와 같이 뉴클레오타이드 서열의 분리 방법을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열에 관한 또다른 관점은 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 컨스트럭트; 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 벡터; 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 플라스미드; 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 세포; 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 조직; 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 기관; 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 숙주; 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 생물체를 포함한다. 또한 본 발명은 상기한 것의 전이 후 상기 서열의 정제 방법을 포함하여, 숙주 세포 내에서의 발현과 같이 이를 이용한 본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 서열의 정제 방법을 포함한다.
참고로 이들 및 본 발명의 또다른 관점은 적당한 섹션 표제하에서 논의된다. 그러나 각 섹션 하의 지침은 각각의 특정한 섹션에 항상 한정적인 것은 아니다.
하나의 관점에서 본 발명은 트리글리세라이드와 비교시 극성 지질 상에 높은 비율의 활성을 지닌 야생형 진균성 지질분해효소를 제공한다.
하나의 관점에서 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열을 포함한 진균성 지질분해효소를 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열을 포함한 진균성 지질분해효소를 인코드하는 핵산을 제공한다.
서열번호 1은 도 37에 나타나 있고, 서열번호 2는 도 38에 나타나 있고, 서열번호 4는 도 40에 나타나 있고, 서열번호 6은 도 42에 나타나 있다.
또다른 관점에서 본 발명은
(a) 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산;
(b) 유전자 코드의 분해에 의한 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열에 관련된 핵산; 및
(c) 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7에 나타난 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 이상의 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산으로
구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 진균성 지질분해효소를 인코드하는 핵산을 제공한다.
서열번호 3은 도 39에 나타나 있고, 서열번호 5는 도 41에 나타나 있고, 서열번호 7은 도 43에 나타나 있다.
또다른 관점에서 본 발명은 예를 들어 반죽, 베이크된 제품, 계란, 계란-주성분 제품, 국수 제품, 치즈 제품, 토르티야 제품, 동물 사료 제품, 식물유 또는 식용유와 같은 식료품의 제조시 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 제공한다. 대안으로, 식료품으로의 본 발명의 효소의 첨가는 자유 지방산의 낮은 축적을 지닌 개선된 유화를 유도한다.
또다른 관점에서 본 발명은 반죽에 상기 지질분해효소를 첨가하고 (선택적으로는) 하나 이상의 하기를 위해 베이크된 제품을 제조하기 위해 반죽을 베이크하는 것을 포함한, 반죽 및/또는 베이크된 제품의 제조시 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 제공한다: 반죽의 끈적임 감소; 반죽의 기계능(machinability)의 개선; 베이크된 제품의 베이크 동안 발포 감소; 빵 부피 및/또는 연도 개선; 베이크된 제품 및/또는 반죽의 저장 수명 연장; 베이크된 제품 및/또는 반죽의 부패방지 효과 개선; 베이크된 제품의 부스러기 구조 개선; 베이크된 제품의 구멍 이질성 감소; 베이크된 제품의 구멍 동질성 개선; 베이크된 제품의 평균 구멍 크기 감소; 반죽의 글루텐 인덱스 증가; 베이크된 제품의 풍미 및/또는 향미 개선; 베이크된 제품의 빵껍질 색 개선.
유리하게는, 본 발명에 따른 효소는 낮은 pH에서 통상의 지질분해효소보다 더 높은 활성을 지니고 통상의 지질분해효소보다 낮은 pH 신 반죽 환경에서 사용하기에 더욱 유리하게 적당하다.
본 발명의 또다른 관점에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소를 반죽에 첨가하고 (선택적으로는) 베이크된 제품을 제조하기 위해 반죽을 베이크하는 것을 포함한 반죽 및/또는 베이크된 제품의 제조 방법이 제공된다.
또다른 관점에서 본 발명은 질감을 개선시키고, 평균 입자 크기를 감소시키고, 평균 입자 분포를 감소시키고, 열 안정성을 개선시키고, 마이크로파 성능 및/또는 안정성을 개선시키기 위한 계란-주성분 제품의 제조시 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소를 계란 또는 계란-주성분 제품에 첨가하는 것으로 포함한, 계란 또는 계란-주성분 제품의 처리 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 관점에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소를 국수, 국수 반죽 또는 국수-주성분 제품에 첨가하는 것을 포함한, 국수, 국수 반죽 또는 국수-주성분 제품의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 하나의 관점에서 색/황변 개선, 착색 특성 안정화, 광도 감소, 지방 함량 감소, 질감 및 교합성(저작성) 개선, 물 활성 감소, 파손 감소, 핵심 견고성 증가 및 가공 동안 형태 유지 개선 중의 하나를 위한 국수 또는 국수-줏어분 제품의 제조시 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용이 제공된다.
본 발명의 또다른 관점에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소를 토르티야 또는 토르티야 반죽에 첨가하는 것을 포함한 토르티야 또는 토르티야 반죽의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 관점은 토르티야의 회전성(rollability)의 개선, 토르티야의 유연성의 증가, 토르티야 및/또는 토르티야 반죽의 부패방지 성질의 개선, 연도의 개선 및/또는 토르티야 및/또는 토르티야 반죽 내 불쾌취의 감소를 위한 토르티야 및/또는 토르티야 반죽의 제조시 본 발명의 진균성 지질분해효소의 이용이 제공한다.
토르티야 및/또는 국숙 내의 지질분해효소의 기능성은 DATEM과 같은 유화제와 혼합함으로서 개선된다.
본 발명의 또다른 관점에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소를 치즈 또는 치즈-주성분 제품에 첨가하는 것을 포함한, 우유, 치즈 우유, 치즈 또는 치즈-주성분 제품의 처리 방법이 제공된다.
본 발명은 풍미, 질감 및/또는 안정성의 개선, 치즈 내 오일-오프(oil-off) 효과의 감소 및/또는 치즈 제조시 치즈 산출량의 증가 중 하나 이상을 위한 치즈 또는 치즈-주성분 제품의 제조시 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 더욱 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소를 동물 사료에 첨가하는 것을 포함한, 동물 사료의 처리 방법이 제공된다.
본 발명은 사료 이용 및/또는 전환 효율, 체중 증가, 소화성 질서 축적, 건조물질의 대사성(metabolisability) 및 취미 중의 하나 이상을 증진시키기 위한 동물 사료 제조시 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 더욱 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 부분적 가수분해 산물 즉, 리소-인지질을 생성하기 위해 효소로 인지질(즉, 레시틴)을 처리함으로서 리소-인지질, 예를 들어 리소레시틴(lysolecithin)을 제조하는 방법에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소로 인지질(즉, 레시틴)을 처리함는 것을 포함한, 리소-인지질, 예를 들어 리소레시틴의 제조 방법이 제공된다.
또다른 관점에서 본 발명은 부분적 가수분해 산물 즉, 리소-당지질을 생성하기 위해 본 발명에 따른 지질분해효소로 당지질(즉, 디갈락토실 디글리세라이드(DGDG) 또는 모노갈락토실 디글리세라이드(MGDG))을 처리함으로서 리소-당지질(예를 들어 디갈락토실 모노글리세라이드(DGMG) 또는 모노갈락토실 모노글리세라이드(MGMG))을 제조하는 방법에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명에 따른 지질분해효소로 당지질(즉, 디갈락토실 디글리세라이드(DGDG) 또는 모노갈락토실 디글리세라이드(MGDG))을 처리하는 것을 포함한, 리소-당지질(예를 들어 디갈락토실 모노글리세라이드(DGMG) 또는 모노갈락토실 모노글리세라이드(MGMG))을 제조하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명은 극성 지질(즉, 인지질 및/또는 당지질의 주요 부분을 가수분해하기 위해 식용유 또는 식물유를 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소로 처리하는 것을 포함한, 식물유 또는 식용유의 효소적 해교(degumming) 방법을 제공한다.
의심의 여지를 방지하기 위해 당업자는 식용유의 효소적 처리를 수행하는 적당한 방법론을 알고있다(예를 들어 EP 0 869 167). 알려진 방법은 알려진 효소가 본 발명에 따른 효소로 대체되는 조건으로 본 발명의 수행시 적당하게 이용된다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물유 또는 식용유 내의 인지질 함량을 감소시키는 반면 기름의 트리글리세라이드 함량을 유지시키고/또는 자유 지방산의 축적을 방지하거나 감소시키기 위한 식물유 또는 식용유 제조시 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 자유 아실기를 가수분해하기 위한 인지질의 처리를 포함한, 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 인지질의 주요 부분을 가수분해하고, 가수분해된 인지질을 함유한 수성상을 기름으로부터 분리하기 위해 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소로 기름을 처리하는 것을 포함한, 식용유 내 인지질 함량을 감소시키는 방법에서 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 저온에서 활성을 유지하는 즉, 저온 지질분해효소인 지질분해효소를 제공한다. 본 발명의 또다른 관점은 여기서 기술된 방법 및 이용에서의 저온 지질분해효소 즉, 본 발명의 진균성 지질분해효소의 이용을 포함한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 트리글리세라이드보다 극성 지질(즉, 당지질 및/또는 인지질) 상에 더 높은 비율의 활성을 지닌다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 트리글리세라이드보다 인지질 상에 더 높은 비율의 활성을 지닌다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 트리글리세라이드보다 당지질 상에 더 높은 비율의 활성을 지닌다.
적당하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 트리글리세라이드보다 당지질과 인지질 모두에 더 높은 비율의 활성을 지닌다.
더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 트리글리세라이드보다 디갈락토실 디글리세라이드(DGDG) 상에 더 높은 비율의 활성을 지닌다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 DGDG 또는 MGDG를 각각 DGMG 또는 MGMG로 가수분해한다.
여기서 언급된 "극성 지질 상에 더 높은 비율의 활성"이라는 용어는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소가 통상의 효소 Lipopan FTM (Novozymes A/S, 덴마크)과 비교시 더 높은 극성 지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율을 지님 의미한다.
여기서 사용된 "극성 지질"이라는 용어는 인지질 및/또는 당지질을 의미한다. 바람직하게는 여기서 사용된 "극성 지질"이라는 용어는 인지질과 당지질 모두를 의미한다.
여기서 언급된 "당지질 상에 더 높은 비율의 활성" 및 "인지질 상에 더 높은 비율의 활성"이라는 용어는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소가 각각 통상의 효소 Lipopan FTM (Novozymes A/S, 덴마크)으로 달성되는 상응하는 비율보다 더 높은당지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율 또는 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율을 지님을 의미한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 지질분해효소는 적어도 4 이상의 극성 지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율을 지닌다. 적당하게는 극성 지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 5 이상이다. 적당하게는 극성 지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 8 이상, 바람직하게는 9 이상, 더욱 바람직하게는 10 이상, 훨씬 더 바람직하게는 15 이상이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 적어도 4 이상의 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율을 지닌다. 적당하게는 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 5 이상이다. 적당하게는 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 8 이상, 바람직하게는 9 이상, 더욱 바람직하게는 10 이상, 훨씬 더 바람직하게는 15 이상이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 적어도 1.5 이상, 바람직하게는 적어도 1.8 이상, 바람직하게는 적어도 2 이상, 바람직하게는 적어도 3 이상, 바람직하게는 적어도 4 이상의 당지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율을 지닌다. 적당하게는 당지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 4 이상이다. 적당하게는 당지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 5 이상이다.
또다른 관점에서 본 발명은 적어도 4 이상의 극성 지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율을 지닌 진균성 지질분해효소를 제공한다. 적당하게는 극성 지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 5 이상이다. 적당하게는 극성 지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 8 이상, 바람직하게는 9 이상, 더욱 바람직하게는 10 이상, 훨씬 더 바람직하게는 15 이상이다.
또다른 관점에서 본 발명은 적어도 4 이상의 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율을 지닌 진균성 지질분해효소를 제공한다. 적당하게는 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 5 이상이다. 적당하게는 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율은 8 이상, 바람직하게는 9 이상, 더욱 바람직하게는 10 이상, 훨씬 더 바람직하게는 15 이상이다.
또다른 관점에서 본 발명은 따른 적어도 1.5 이상, 바람직하게는 적어도 1.8 이상, 바람직하게는 적어도 2 이상, 바람직하게는 적어도 3 이상, 바람직하게는 적어도 4 이상, 바람직하게는 5 이상, 바람직하게는 10 이상, 바람직하게는 15 이상의 당지질:트리글리세라이드 가수분해 활성 비율을 지닌 진균성 지질분해효소를 제공한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 트리글리세라이드 리파제 활성(E.C. 3.1.1.3)과 비교시 극성 지질(즉, 포스포리파제 A2(E.C. 3.1.1.4) 활성 및/또는 포스포리파제 A1(E.C. 3.1.1.32) 활성 및/또는 글리코리파제(E.C. 3.1.1.26) 활성)에 대해 적어도 1.5배 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 2배 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 3배 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 4배 이상의 활성을 지닌다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 트리글리세라이드 리파제 활성(E.C. 3.1.1.3)과 비교시 적어도 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 3배 이상, 더욱 바람직하게는 4배 이상의 글리코리파제(E.C. 3.1.1.26) 활성을 지닌다.
바람직하게는 실시예 3에 상세하게 설명된 미니베이킹(minibaking) 분석을 이용하여 최적 빵 부피를 제공하는 용량에서 트리글리세라이드(TG) 비융에 대한 DGDG의 가수분해 비율은 적어도 1.7% 이상, 바람직하게는 1.8% 이상, 바람직하게는 적어도 2% 이상, 바람직하게는 적어도 3% 이상, 바람직하게는 적어도 4% 이상, 바람직하게는 적어도 5% 이상, 바람직하게는 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 바람직하게는 적어도 40% 이상, 바람직하게는 적어도 50% 이상이다.
여기서 사용된 "글리코리파제 활성"이라는 용어는 "갈락토리파제 활성"을 포함한다.
효소의 글리코리파제 활성, 포스포리파제 활성 및 트리글리세라이드 리파제 활성은 하기 나타난 분석을 이용하여 측정될 수 있다.
갈락토리파제 활성의 측정(글리코리파제 활성 분석):
기질:
0.6% 디갈락토실디글리세라이드(시그마 D 4651), 0.4% Triton-X 100(시그마 X-100) 및 5 mM CaCl2가 0.05M HEPES 완충액 pH 7에 용해되었다.
분석 절차:
400 μL 기질이 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 첨가되었고 37℃에서 5분간 Eppendorf Thermomixer에 놓였다. t= 0분에서 50 μL 효소 용액이 첨가되었다. 또한 효소 대신 물이 블랭크로 분석되었다. 표본은 37℃에서 10분간 Eppendorf Thermomixer에서 10*100 rpm으로 혼합되었다. t=10분에서 반응을 종결시키기 위해 에펜도르프 튜브는 99℃에서 10분간 또다른 thermomixer에 놓였다.
표본 내 자유 지방산은 WAKO GmbH사의 NEFA C 키트를 이용하여 분석되었다. pH 7에서의 효소 활성 GLU는 분석 조건 하에서 분당 생성된 지방산의 마이크로몰로 계산되었다.
포스포리파제 활성의 측정(포스포리파제 활성 분석):
포스포리파제 활성은 비교가능한 결과를 제공하는 2개의 다른 방법을 이용하여 측정되었다. 이들 방법은 본 발명에 따른 포스포리파제 활성을 측정하는데 이용될 수 있다. 바람직하게는 PLU 분석이 어떠한 효소의 포스포리파제 활성을 측정하는데 이용된다.
포스포리파제 활성의 측정을 위한 "PLU 분석"
기질:
0.6% L-α 포스파티딜콜린 95% 식물(Avanti #441601), 0.4% Triton-X 100(시그마 X-100) 및 5 mM CaCl2가 0.05M HEPES 완충액 pH 7에 용해되었다.
분석 절차:
400 μL 기질이 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 첨가되었고 37℃에서 5분간 Eppendorf Thermomixer에 놓였다. t= 0분에서 50 μL 효소 용액이 첨가되었다. 또한 효소 대신 물이 블랭크로 분석되었다. 표본은 37℃에서 10분간 Eppendorf Thermomixer에서 10*100 rpm으로 혼합되었다. t=10분에서 반응을 종결시키기 위해 에펜도르프 튜브는 99℃에서 10분간 또다른 thermomixer에 놓였다.
표본 내 자유 지방산은 WAKO GmbH사의 NEFA C 키트를 이용하여 분석되었다. pH 7에서의 효소 활성 PLU-7은 분석 조건 하에서 분당 생성된 지방산의 마이크로몰로 계산되었다.
포스포리파제 활성의 측정을 위한 "TIPU 분석"
1 TIPU(적정 포스포리파제 유니트)는 효소 함량으로 정의되고, 이는 분석 조건에서 분당 1 μmol 자유 지방산을 유리시킨다.
포스포리파제 A1 및 A2는 각각 위치 1 및 2로부터 자유 지방산의 해리로서 레시틴의 리소-레시틴로의 전환을 촉매한다. 알칼리 소모가 유리된 지방산 함량과 동일하기 때문에 포스포리파제 활성은 효소작용시 레시틴으로부터 유리된 지방산의 연속적 적정에 의해 측정될 수 있다.
기질:
4% 레시틴, 4% Triton-X 100 및 6 mM CaC12: 12 g 레시틴 분말(Avanti Polar Lipids #44160) 및 12 g Triton-X 100 (Merck 108643)이 적당히 분산되었다. 자석 교반 동안 200 ml 탈염수, 3.0 ml의 0.6 M CaC12(p.a. Merck 1.02382)가 첨가되었다. 부피는 탈염수로 300 mL로 조정되었고 에멀젼은 Ultra Thurax를 이용하여 균질화되었다. 기질은 매일 신선하게 제조되었다.
분석 절차:
효소 용액은 300 μL 효소의 첨가로 0.06과 0.18 ml/분 사이의 적정 곡선 상의 기울기를 제공하도록 제조되었다.
알려진 활성의 대조군 표본이 포함된다.
표본은 탈염수에 용해되었고 300 rpm에서 15분간 교반되었다. 0.05 M NaOH로 pH가 7.0으로 적정되기 전까지 25.00 ml 기질이 10∼15분간 37.0℃로 자동 온도 조절되었다. 300 μL 효소 용액이 기질에 첨가되었고 pH-Stat titrator (Phm 290, Mettler Toledo)를 이용하여 0.05 M NaOH로의 연속적 적정이 수행되었다. 2개 활성 측정이 각각의 스케일링 상에서 이루어졌다.
8분 후 적정은 중지되었고 적정 곡선의 기울기는 5분과 7분 사이에서 계산되었다. 검출 한계는 3 TIPU/ml 효소 용액이다.
계산:
포스포리파제 활성(TIPU/g 효소)는 하기 방법으로 계산되었다:
Figure 112006054255786-PCT00001
여기서
α는 반응시간의 5분과 7분 사이의 적정 곡선의 기울기이다(ml/분).
N은 사용된 NaOH의 노르말 농도이다.
V1은 효소가 용해된 부피이다(ml).
m은 V1에 첨가된 효소 함량이다(g).
V2는 기질에 첨가된 효소 용액의 부피이다(ml).
트리글리세라이드 리파제 활성의 측정: 기질로서 트리글리세라이드(트리부티린) 기반 분석(LIPU):
트리부티린(tributyrin) 기반 리파제 활성은 Food Chemical Codex, Forth Edition, National Academy Press, 1996, p 803에 따라 측정되고, 변형시 표본은 글리신 완충액 대신 탈이온수에 용해되고, pH stat 세트 포인트는 7 대신 5.5이다.
1 LIPU는 분석 조건 하에서 분당 1 몰 부티르산을 유리시킬 수 있는 효소의 양으로 정의된다.
갈락토리피드(GLU), 인지질(PLU) 및 트리글리세라이드(LIPU) 상의 활성에 대한 분석에 기반하여 PLU/LIPU 및 GLU/LIPU 비율을 계산하는 것이 가능하다.
Lipopan FTM의 분석 및 푸사리움 헤테로스포룸(표본 209) 유래의 본 발명에 따른 지질분해효소(실시예 3 참조)는 하기 결과를 제공하였다.
Lipopan FTM 및 표본 209에 대한 상대 활성 비율은 하기와 같다.
Figure 112006054255786-PCT00002
적당하게는 여기서 사용된 "상승작용" 또는 "상승 효과"는 각 성분(즉, 효소)이 개별적으로 사용될 때보다 그 조합이 더 놓은 효과를 생성하는 것을 의미한다. 상승작용은 각 성분(즉, 효소)의 개별적 첨가 및 그 조합으로 생성물 즉, 반죽 및/또는 베이크된 제품을 제조하고 그 효과를 비교함으로서 측정된다.
여기서 사용된 "진균성 지질분해효소"라는 용어는 효소의 자연-발생적 원료가 진균임을 의미한다. 의심의 여지를 방지하기 위해 이러한 용어는 진균성 숙주(천연 또는 비-천연 진균)에서 발현되거나 비-진균성 숙주(즉, 예를 들어 박테리아 또는 효모)에서 발현되는 진균으로부터 분리된 진균성 효소를 포함한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 야생형 효소이다.
여기서 사용된 "천연" 및 "야생형"이라는 용어는 자연-발생적 효소를 의미한다. 즉, 내인성으로 생성된 성숙 단백질 서열(동시- 및 후-발현 분열 이벤트)과 비교시 내인성 유전자 코드로부터 발현되고 그의 내인성 숙주 생물체로부터 분리된 효소 및/또는 돌연변이되지 않은 이형적으로 생성된 효소. 본 발명의 천연 및 야생형 단백질은 이형적 발현을 위해 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드되고, 또한 숙주에서의 발현을 위해 선택된 비-내인성 신호 펩타이드를 포함한다.
여기서 사용된 "비-내인성 신호 펩타이드"라는 용어는 동시-번역 분열 전에 지질분해효소의 초기 폴리펩타이드 사슬 내에 자연적으로 존재하지 않는 신호 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 지질분해효소에 있어서 예를 들어 프로-펩타이드와 같은 비-내인성 신호 펩타이드의 일부 또는 전체는 성숙 폴리펩타이드에 부착되어 유지되고 - 이는 여기서 사용된 "야생형"이라는 용어에 포함된다.
상기 논의된 바와 같이 여기서 사용된 "천연" 또는 "야생형"이라는 용어는 자연-발생적 효소를 의미한다. 그러나 이는 자연 발생적 성숙 지질분해효소와 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한 합성적 또는 화학적으로 합성된 폴리펩타이드의 이용을 배제하지 않는다.
여기서 사용된 "변이체"라는 용어는 성숙 단백질 서열 내의 천연 또는 야생형 서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변경(즉, 아미노산 삭제, 첨가 또는 치환)을 유발하는 비-내인성 유전자 코드로부터 발현된 단백질을 의미한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 저온에서 활성을 유지하는 즉, 저온 지질분해효소인 지질분해효소이다.
"저온 지질분해효소"라는 용어는 5∼15℃에서 유의적인 활성을 지니고, 바람직하게는 10℃에서 유의적인 활성을 지닌 효소를 의미한다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 따른 저온 지질분해효소는 WO2004/064987에 개시된 X가 하나 이상의 하기 아미노산 잔기인 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하는 지질분해효소가 아니다: L, A, V, I5 F5 Y, H5 Q5 T5 N5 M 또는 S.
본 발명에 따른 저온 지질분해효소는 NEFA C 방법에 의한 자유 지방산의 측정에 의해 측정시 지질분해효소의 적정 pH의 20% 이내의 pH에서 레시틴 기질 상에 적어도 5% 이상, 바람직하게는 적어도 7% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 10% 이상의 상대 활성을 지닌 효소이다. 실시예 6은 지질분해효소에 대한 pH 최적조건을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 저온 지질분해효소는 NEFA C 방법에 의한 자유 지방산의 측정에 의해 측정시(실시예 5 참조, pH 7에서 수행됨) 지질분해효소의 적정 pH의 20% 이내의 pH에서 20℃에서 기질화된 레시틴 상에 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 15% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 25% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 30% 이상의 상대 활성을 지닌 효소이다. 실시예 6은 지질분해효소에 대한 pH 최적조건을 측정하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명에 따른 저온 지질분해효소는 실시예 9에 기술되고 도 24 및25에 나타난 분석을 이용하여 20 U/g 난황과 동일한 효소 용량에서 480분의 반응시간 후 적어도 1% 이상, 바람직하게는 적어도 1.5% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 2% 이상의 자유 지방산을 유리시키는 것이 가능함이 특징인 5℃에서 난황 레시틴의 유의적인 활성은 나타낸다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 사상 진균으로부터 수득 가능하다. 더욱 바람직하게는 진균성 지질분해효소는 푸사리움종(Fusarium spp.)으로부터 수득 가능하다. 바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heteroporum) 또는 푸사리움 세미텍툼(Fusarium semitectum)으로부터 수득 가능하다. 적당하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 또는 푸사리움 세미텍툼(IBT 9507)으로부터 수득 가능하다.
따라서 하나의 관점에서 바람직하게는 본 발명에 따른 지질분해효소는 사상 진균성 지질분해효소, 바람직하게는 사상 진균성 야생형 지질분해효소이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6에 나타난 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95% 이상, 바람직하게는 적어도 98% 이상, 바람직하게는 적어도 99% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열 포함한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7에 나타난 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95% 이상, 바람직하게는 적어도 98% 이상, 바람직하게는 적어도 99% 이상의 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열 포함한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 푸사리움 단백질로부터의 아미노산 서열 또는 그의 일부와 융합된 테르모마이세스 단백질로부터의 아미노산 서열 또는 그의 일부를 포함한 융합 단백질이 아니다. 특히 바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 푸사리움 옥시포룸(Fusarium oxysporum) 단백질로부터의 아미노산 서열 또는 그의 일부와 융합된 테르모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus) 단백질로부터의 아미노산 서열 또는 그의 일부를 포함한 융합 단백질이 아니다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 테르모마이세스 라누기노수스로부터 수득된 것이 아니고/또는 테르모마이세스 라누기노수스로부터 수득된 효소의 변이체가 아니다.
바람직하게는 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 또는 푸사리움 세미텍툼(IBT 9507)의 발효 액체배지로부터 분리된다.
적당하게는 상기 효소는 액체 크로마토그리패에 의해 정제된다.
정제된 진균성 지질분해효소의 아미노산 서열은 Edman 분해 및 MALDI-TOF 분석에 의해 측정된다.
푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83로부터의 진균성 지질분해효소의 베이킹 효과는 Lipopan FTM보다 우수한 것으로 나타났고 이는 트리글리세라이드와 비교시 극성 지질, 특히 디갈락토실 디글리세라이드(DGDG)와 같은 당지질 상에 증가된 비율의 활성과 상호관련된다.
더욱이 푸사리움 세미텍툼 IBT 9507로부터의 지질분해효소는 매우 좋은 결과로 반죽 슬러리 내 밀가루 액체 상의 활성에 대해 시험되었다.
푸사리움 세미텍툼 IBT 9507로부터의 지질분해효소는 Lipopan FTM와 비교시 반죽 내의 갈락토리피드 상에 유의적인 활성을 나타내었고 트리글리세라이드 상에는 상대적으로 적은 활성을 나타내었다.
적당하게는 여기서 사용된 "식료품"이라는 용어는 인간 및/또는 동물 소비에 적당한 물질을 의미한다.
적당하게는 여기서 사용된 "식료품"이라는 용어는 즉석으로 소비되는 식료품을 의미한다. 그러나 대안으로 또는 이에 더하여 여기서 사용된 식료품이라는 용어는 식료품의 제조에 사용되는 하나 이상의 식품 재료를 의미한다. 예로서 식료품이라는 용어는 반죽으로부터 베이크된 제품뿐만 아니라 상기 베이크된 제품의 제조에 사용된 반죽 모두를 포함한다.
바람직한 관점에서 본 발명은 하나 이상의 하기로부터 선택된 것으로 정의된 식료품을 제공한다: 마요네즈, 샐러드 드레싱, 소스, 아이스크림, 계란 분말, 변형된 난황 및 그로부터 제조된 제품을 포함하나 이에 한정적이지 않은 계란, 계란-주성분 제품; 빵, 케이크, 단 반죽 제품, 조각으로 잘려진 반죽, 액체 반죽, 머핀, 도넛, 비스킷, 크래커 및 쿠키를 포함한 베이크된 제품; 초콜릿, 사탕, 카라멜, 할라와(halawa), 무설탕 또는 설탕으로 감미된 껌, 풍선껌, 소프트 풍선껌, 추잉껌을 포함한 검 및 푸딩을 포함한 과자류; 셔벗을 포함한 냉동 제품, 바람직하게는 아이스크림 및 아이스 밀크를 포함한 냉동 유제품; 치즈, 버터, 우유, 커피 크림, 휘핑 크림, 커스터드 크림, 우유 음료수 및 요거트를 포함한 유제품; 무스, 휘핑 채소 크림; 식용 기름 및 지방, 통기 또는 비-통기 휘핑 제품, 오일-인-워터(oil-in-water) 에멀젼, 워터-인-오일 에멀젼, 마가린, 쇼트닝 및 저지방 및 극저지방 스프레드를 포함한 스프레드; 드레싱, 마요네즈, 딥, 크림-주성분 소스, 크림 주성분 수프, 음료수, 향신료 에멀젼 및 소스.
하나의 관점에서 본 발명에 따른 식료품은 빵, 프라이드 제품, 스낵, 케이크, 파이, 브라우니, 쿠키, 국수, 인스턴트 국수, 토르티야, 크래커, 전맥크래커, 프레츨 및 감자칩과 같은 스낵 품목 및 파스트와 같은 반죽 제품 또는 베이크된 제품이다.
또다른 관점에서 본 발명에 따른 식료품은 동물 사료이다.
하나의 관점에서 바람직하게는 식료품은 하나 이상의 하기로부터 선택된다: 마요네즈, 샐러드 드레싱, 소스, 아이스크림, 계란 분말, 변형된 난황 및 그로부터 제조된 제품을 포함한 계란, 계란-주성분 제품.
여기서 논의된 적용, 특히 베이커리 적용과 같은 식품 적용의 일부에서 본 발명에 따른 지질분해효소는 예를 들어 모노글리세라이드, 지방산의 모노- 및 디글리세라이드의 디아세틸 주석산 에스테르, 소듐 스테아로일 락틸레이트(sodium stearoly lactylate, SSL) 및 레시틴을 포함한 하나 이상의 통상적인 유화제와 함께 사용된다.
본 발명에 따른 지질분해효소는 지방 추가 빵 조리법에서 특히 바람직하다: 이는 짧은 사슬 트리글리세라이드에 대해 감소된 자유 지방산 축적, 불쾌취의 감소 또는 방지를 유발하는 트리글리세라이드 상에 본 발명의 지질분해효소의 낮은 활성에 기인하는 것으로 고려된다.
이러한 정황하에서 "지방 추가"라는 용어는 밀가루 반죽에 지질 또는 지방에 추가되지 않음을 나타내는데 사용된다.
더욱이 또는 대안으로, 본 발명에 따른 효소는 하나 이상의 다른 적당한 식품 등급 효소와 함께 사용된다. 따라서 본 발명의 지질분해효소 이외에 적어도 하나 이상의 또다른 효소가 베이크된 제품 및/또는 반죽에 첨가되는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 또다른 효소는 엔도- 또는 엑소아밀라제, 풀룰라나제와 같은 전분 분해 효소, 가지제거효소, 크실라나제를 포함한 헤미세룰라나제, 셀룰라나제, 산화환원효소 즉, 글루코스 산화효소, 피라노스 산화효소, 설프하이드릴(sulfhydryl) 산호효소 또는 예를 들어 헥소오스 산화효소(HOX)와 같은 말토오스를 산화시키는 것과 같은 탄수화물 산호효소, 리파제, 포스포리파제 및 헥소오스 산화제, 프로테아제 및 아실트랜스퍼라제(예를 들어 WO04/064987에 기술된 것과 같은)을 포함한다.
본 발명의 지질분해효소가 식품 제조시 알파 아밀라제와 조합하여 사용되는 것이 특히 바람직하다. 특히 아밀라제는 미-말토제닉 엑소아밀라제 활성, 특히 글루칸 1,4-알파-말토테트라하이드롤라제(EC 3.2. 1.60) 활성(WO05/003339에 기술됨)을 지닌 폴리펩타이드와 같은 비-말토제닉 아밀라제이다. 적당한 비-말토제닉 아밀라제는 PowersoftTM(Danisco A/S, 덴마크로부터 구입 가능)로 통상 구입 가능하다. NovamylTM(Novozymes A/S, 덴마크)와 같은 말토제닉 아밀라제도 사용된다. 하나의 실시태양에서 알파 아밀라제와 본 발명의 지질분해효소의 결합된 사용은 반죽 및/또는 빵, 케이크, 도넛, 케이크 도넛 또는 베이글과 같은 베이크된 제품의 제조에 사용된다. 또한 알파 아밀라제와 본 발명의 지질분해효소의 결합은 밀 및/또는 옥수수 토르티야와 같은 토르티야의 제조 방법에 사용하기에 바람직한 것으로 고려된다.
또다른 바람직한 실시태양에서 본 발명에 따른 지질분해효소는 식품의 제조시 크실라나제와 결합하여 사용된다. GRINDAMYLTM 및 POWERBake 7000은 Danisco A/S사로부터 구입 가능한 통상 구입 가능한 크실라나제의 예이다. 크실라나제 효소의 또다른 예는 WO03/020923 및 WO01/42433에 나타나 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 지질분해효소는 크실라나제와 알파 아밀라나제와 결합하여 사용된다. 적당하게는 알파 아밀라제는 말토제닉 또는 비-말토제닉 알파 아밀라제(GRINDAMYLTM 또는 POWERSoft, Danisco A/S로부터 통상 구입 가능) 또는 그의 결합이다.
또한 본 발명의 지질분해효소는 예를 들어 헥소오스 산화효소(HOX)와 같은 말토오스 산화 효소(MOX)와 같은 산화 효소와 결합하여 사용된다. 적당한 방법은 WO03/099016에 기술되어 있다. 통상 구입 가능한 말토오스 산화 효소 GRINDAMYLTM 및 SUREBake는 Danisco A/S로부터 구입 가능하다.
선택적으로는 비-말토제닉 엑소아밀라제 및/또는 말토제닉 아밀라제와 같은 알파 아밀라제 및/또는 말토오스 산화 효소(MOX)는 본 발명에 따른 효소와 결합하여 반죽, 베이크된 제품, 토르티야, 케이크, 인스턴트 국수/프라이드 스낵 식품 또는 치즈와 같은 유제품의 제조 방법에 사용된다.
본 발명에 따른 지질분해효소는 일반적으로 당분야에 알려진 방법에 의해 식료품 또는 다른 조성물 내에 포함된다. 이러한 방법은 식료품 또는 조성물에 직접 지질분해효소를 첨가, 안정화제 및/또는 담체와 결합하여 지질분해효소를 첨가, 지질분해효소 및 안정화제 및/또는 담체를 포함한 혼합물을 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명에 사용되는 적당한 안정화제는 무기염(NaCl, 황산암모늄), 소르비톨, 유화제 및 세정제(Tween 20, Tween 80, 트리글리세라이드가 없는 Panodan AB100, 폴리글리세롤에스테르, 소르비탄모놀레이트와 같은), 기름(평지씨유, 해바라기씨유 및 대두유와 같은), 펙틴, 트레할로스 및 글리세롤을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 적당한 담체는 전분, 밀 찌꺼기, 밀가루, NaCl 및 구연산염을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
글루텐 인덱스는 Perten Instruments(스웨덴)의 Glutomatic 2200에 의해 측정된다. 글루텐 인덱스를 측정하기 위해: 가공 직후 15 g의 반죽이 측량되고 Glutomatic에 놓이고 10분간 2% NaCl 용액으로 세척된다. 이후 세척된 반죽은 Gluten Index Centrifuge 2015로 옮겨지고 2개의 글루텐 분획이 측량되고 글루텐 인덱스가 하기 식에 따라 계산된다:
글루텐 인덱스 = (체 상에 잔존하는 글루텐 중량 x 100)/글루텐 총 중량
바람직하게는 반죽 내 글루텐 인덱스는 폴리펩타이드를 첨가하지 않은 반죽에 대해 적어도 5% 이상까지 증가되고, 글루텐 인덱스는 상기 언급된 Glutomatic 2200으로 측정된다.
더욱 바람직한 관점은 수반된 청구항 및 하기 설명 및 실시예에 나타나 있다.
장점
예상외로 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소가 이전에 확인된 진균으로부터의 지질분해효소(특히 LipopanFTM)와 비교시 극성 지질(인지질 및/또는 당지질):트리글리세라이드 상에 훨씬 더 높은 비율의 활성을 지닌다. 이는 본 발명 이전에 알려진 진균으로부터의 야생형 지질분해효소의 어떤 것도 이러한 활성을 나타내지 않기 때문에 특히 놀랍다. 지질분해효소 변이체(즉, 비-천연 돌연변이유발 및/또는 다른 변경된 방법으로 노출된 것)를 조사하는 연구가 수행되었으나 진균으로부터의 천연, 야생형 효소가 이러한 매우 유익한 특성을 보유할 수 있음이 인식되지 않았다.
확인된 효소는 베이킹 적용에 사용시 우수한 기능성을 지닌 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용은 진균으로부터의 다른 지질분해효소, 특히 LipopanFTM과 비교시 반죽 및/또는 베이크된 제품에 유의적으로 개선된 특성을 유발한다.
유리하게는 저온에서 활성을 유지하는 즉, 저온 지질분해효소인 지질분해효소는 저온 적용시 사용에 적당하고, 따라서 기질 가열의 필요성을 제거시킨다. 이는 난황의 효소적 처리, 식용유의 효소적 해교와 같은 적용 및 예를 들어 치즈 제조 전 치즈 우유의 처리와 같은 우유 또는 유제품의 처리시 특히 유리하다. 낮은 작동 온도에서의 유의적인 활성의 유지가 효소적 처리시 미생물, 특히 박테리아 오염의 위험이 감소되어 수행될 수 있게 하는 저온 지질분해효소 이용의 또다른 장점은 식료품 및/또는 동물 사료에서 발견된다. 더욱이 효소의 안정성이 저온에서 더욱 큰 경우; 이는 산업적인 적용시 효소의 효과적인 용량 및 효소의 더욱 긴 효과적인 작용 수명을 가능하게 한다.
기술적 효과
예를 들어 빵, 스팀 번(steam bun) 및 US 화이트 팬 브레드와 같은 베이크된 제품의 경우 본 발명의 지질분해효소의 첨가는 하나 이상의 하기를 유발한다: 개선된 빵 부피 및 연도, 연장된 저장수명 및/또는 부패방지 효과, 개선된 부스러기 구조, 감소된 구멍 이질성, 감소된 평균 구멍 크기, 증가된 글루텐 인덱스, 개선된 풍미 및/또는 향미 및 개선된 빵껍질 색.
유리하게는 본 발명에 따른 효소는 반죽 및/또는 베이크된 제품과 같은 식료품 내의 유화제를 대체하는데 사용된다.
본 발명에 따른 지질분해효소는 DATEM, SSL, CSL, 모노글리세라이드, 폴리소르베이트 및 Tween과 같은 유화제와 상승작용을 지닌다. 따라서 본 발명에 따른 지질분해효소는 하나 이상의 유화제와 결합하여 사용된다. 유리하게는 하나 이상의 유화제와 결합된 본 발명에 따른 지질분해효소의 이용은 본 발명에 따른 효소가 사용되지 않는 경우 필요한 양과 비교시 사용되는 유화제 총량을 감소시킨다.
또한 본 발명에 따른 지질분해효소는 하이드로콜로이드, 구아(Guar), 크산 및 펙틴 및 헥소오스 산화효소와 같은 말토오스 산화 효소와 상승작용을 지닌다.
예를 들어 도넛, 케이크 도넛, 베이글, 스낵 케이크 및 머핀의 경우 본 발명의 지질분해효소의 이용은 하나 이상의 알파-아밀라제, 말토제닉 알파-아밀라제 및 비-말토제닉 알파-아밀라제와 결합하여 사용시 상승 효과를 유발한다.
예를 들어 케이크, 스폰지 케이크 및 팜 케이크의 경우 본 발명의 지질분해효소의 이용은 구아와 같은 하나 이상의 하이드로콜로이드 및/또는 DATEM과 같은 하나 이상의 유화제와 결합하여 사용시 상승 효과를 유발한다.
예를 들어 비스킷의 경우 본 발명에 따른 지질분해효소의 이용은 특히 차가운 경우 개선된 회전성 및 조작 특성을 부여한다(차가운 회전성).
유리하게는 예를 들어 마요네즈 및 다른 계란-주성분 제품에서 본 발명에 따른 지질분해효소의 이용은 개선된 질감, 감소된 평균 입자 크기 및/또는 감소된 평균 입자 분포, 개선된 열 안정성, 개선된 마이크로파 성능 및/또는 안정성을 유도한다.
케이크에 있어서 본 발명의 이용은 유리하게는 개선된 연도, 부피, 개선된 저장 특성 및 저장수명을 유도한다.
예를 들어 국수 또는 국수-제품 즉, 인스턴트 국수의 경우 본 발명의 지질분해효소는 하나 이상의 하기 특성을 부여한다: 개선된 착색/황변, 더욱 안정한 착색 특성, 감소된 광도, 감소된 지방 함량, 개선된 질감 및 교합성(저작성), 감소된 물 활성, 감소된 파손, 증가된 핵심 견고성 및 개선된 가공 동안의 형태 유지.
바람직하게는 본 발명의 지질분해효소는 국수 또는 국수 제품 예를 들어 인스턴트 국수의 지방 함량을 감소시키는데 사용된다.
예를 들어 토르티야에서 본 발명에 따른 효소의 이용은 하나 이상의 하기를 유발한다: 예를 들어 유연성을 증가시킴으로서 감소된 토르티야 회전성, 개선된 부패방지 특성, 개선된 연도 및/또는 감소된 불쾌취.
유리하게는 개선된 회전성 및/또는 유연성은 회전시 감소된 토르티야 분열 가능성을 유도한다.
예를 들어 치즈 및/또는 치즈-주성분 제품에서 본 발명에 따른 효소의 이용은 하나 이상의 하기를 유발한다: 개선된 풍미, 질감 및/또는 안정성, 치즈에서 오일링-오프 효과의 감소 및/또는 치즈 산출량의 증가.
여기서 사용된 "오일링 오프 효과"라는 용어는 치즈가 용해시 유리되는 자유 오일을 나타낸다.
본 발명에 따른 지질분해효소는 저지방 치즈를 제조하는데 사용된다. 유리하게는 본 발명의 효소는 우유에서 지방을 안정화시키고/또는 풍미를 증가시킨다.
본 발명의 하나의 장점은 효소가 저온에서 기능한다(실제로 높은 기능성을 지님)는 것이다. 이는 효소가 첨가되는 용도에 따라 다르게 많은 장점을 지닐 수 있다. 예를 들어 치즈 제조시 이러한 기능성은 효소적 처리 동안 미생물 오염 및 미생물 성장의 위험을 감소시킨다. 이러한 원인은 치즈가 효소적 처리 동안 차갑게 유지될 수 있기 때문이다. 따라서 본 발명에 따른 지질분해효소는 개선된 풍미를 위해 저온에서 치즈의 제조에 특히 적당하다.
예를 들어 동물 사료의 경우 본 발명에 따른 효소는 유리하게는 하나 이상의 하기를 유발한다: 동물 내에서 증가된 사료 이용/전환 효율, 개선된 동물 체중 증가, 개선된 사료의 소화율, 개선된 사료로부터의 동물 질소 축적, 개선된 사료 건조 물질의 대사성 및 개선된 사료 취미성.
식물유와 같은 식용유의 해교시 본 발명의 지질분해효소는 저온에서 높은 활성을 지닌다. 이는 유리하게는 효소 처리동안 또는 그 전에 기름 가열의 요구를 감소시킨다. 이는 본 처리에 효과를 나타내는데 필요한 에너지 양을 감소시키는 유리한 효과를 지닌다. 본 발명에 따른 효소는 트리글리세라이드와 비교시 인지질의 감소 선택성을 개선시킨다. 식용유(식물유와 같은)에서 본 발명에 따른 효소는 인지질과 비교시 트리글리세라이드 상에 감소된 가수분해 활성을 지닌다. 이는 트리글리세라이드가 더 적게 가수분해되게 하고, 이는 기름 산출량에 잇어서의 적은 손실 및/또는 기름 내의 감소된 자유 지방산 축적을 유도한다(통상의 지질분해/포스포리파제 효소와 비교시).
용도
본 발명에 따른 효소는 많은 적용을 지닌다.
특히 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 식료품의 제조에 유용하다.
예를 들어 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 계란 또는 계란-주성분 제품의 처리에 특히 유용하다.
포스포리파제, 특히 포스포리파제 A2(E.C. 3.1.1.4)는 계란 또는 계란-주성분 제품의 처리를 위해 수년간 사용되었다(예를 들어 미국특허 제4,034,124호 및 Dutihl & Groger 1981 J. Sci. Food Agric. 32, 451-458 참조). 계란 또는 계란-주성분 제품의 처리 동안 포스포리파제 활성은 극성 리소레시틴의 축적을 유발하고, 이는 유화제로서 작용할 수 있다.
본 발명에 따른 진균성 지질분해효소로의 계란 또는 계란-주성분 제품의 처리는 안정성, 저온살균과 같은 가열 처리 조건하에서의 열 안정성을 개선시키고 실질적인 농화를 유발할 수 있다. 계란-주성분 제품은 케이크, 마요네즈, 샐러드 드레싱, 소스, 아이스크림 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 빵, 케이크, 단 반죽 제품, 조각으로 잘린 반죽, 액체 반죽, 머핀, 도넛, 비스킷, 크래커 및 쿠키를 포함한 반죽으로부터 제조된 베이크된 제품의 제조시 유용하다.
또한 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 빵 또는 다른 베이크된 제품에 개선된 특성을 제공하기 위해 빵-개선 첨가제 즉, 반죽 조성물, 반죽 첨가제, 반죽 조절제, 프리-믹스 및 밀가루에 통상적으로 첨가되는 유사 제제 및/또는 빵 또는 다른 베이크된 제품 제조 공정 동안의 반죽에 사용된다.
따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소를 포함한 빵-개선 조성물 및/또는 반죽-개선 조성물; 및 또한 이러한 빵-개선 및/또는 반죽-개선 조성물을 포함한 반죽 또는 베이크된 제품에 관한 것이다.
빵-개선 조성물 및/또는 반죽-개선 조성물은 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소 이외에 다른 물질을 포함하고, 이러한 물질은 반죽 및/또는 베이크된 제품의 성질을 개선시키기 위해 베이킹시 통상적으로 사용된다.
빵-개선 조성물 및/또는 반죽-개선 조성물은 하나 이상의 하기 성분과 같은 하나 이상의 통상적인 베이킹제를 포함한다:
우유 분말, 글루텐, 유화제, 입자화 지방, 산화제, 아미노산, 당, 염, 밀가루 또는 전분.
적당한 유화제의 예는: 모노글리세라이드, 지방산의 모노- 및 디글리세라이드의 디아세틸 주석산 에스테르, 당 에스테르, 소듐 스테아로일 락틸레이트(SSL) 및 레시틴이다.
빵 및/또는 반죽 개선 조성물은 엔도- 또는 엑소아밀라제, 풀룰라나제와 같은 전분 분해 효소, 가지제거효소, 크실라나제를 포함한 헤미셀룰라나제, 셀룰라나제, 산화환원효소 즉, 글루코스 산화효소, 피라노스 산화효소, 설프하이드릴 산화효소 또는 예를 들어 헥소오스 산화효소(HOX)와 같은 말토오스를 산화시키는 것과 같은 탄수화물 산호효소, 리파제, 포스포리파제 및 헥소오스 산화제, 프로테아제 및 아실트랜스퍼라제(예를 들어 WO04/064987에 기술된 것과 같은)를 포함한 하나 이상의 적당한 다른 식품 등급 효소와 같은 또다른 효소를 더욱 포함한다.
여기서 사용된 "개선된 성질"이라는 용어는 본 발명의 진균성 지질분해효소의 작용에 의해 개선되는 성질을 나타낸다. 특히 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용은 하나 이상의 하기 특성을 유발한다: 증가된 빵 제품 부피, 개선된 베이크된 제품의 부스러기 구조; 베이크된 제품의 부패-방지 성질; 증가된 강도, 증가된 안정성, 감소된 끈적임 및/또는 개선된 반죽의 기계능.
개선된 성질은 본 발명에 따른 지질분해효소의 첨가 없이 제조된 반죽 및/또는 베이크된 제품과 비교시 증가된다.
여기서 사용된 "베이크된 제품"이라는 용어는 반죽으로부터 제조된 제품을 포함한다. 본 발명에 의해 유리하게 제조된 베이크된 제품(백색, 라이트 또는 다크 형태에 관계없이)의 예는 하나 이상의 하기를 포함한다: 일반적으로 로프 또는 롤 또는 토스트 형태의 빵(백색, 통밀 및 호밀 빵을 포함), 프렌치 바게트-형태 빵, 피타(pitta) 빵, 토르티야, 타코스, 케이크, 팬케이크, 비스킷, 크리스피 빵, 파스타, 국수 등.
본 발명에 따른 반죽은 발효된 반죽 또는 발효될 반죽이다. 반죽은 중탄산나트륨 등의 첨가 또는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)(베이커의 효모) 배양액과 같은 적당한 효모 배양액의 첨가와 같은 다양한 방법으로 발효된다.
또한 본 발명은 바람직하게는 두럼(durum) 밀가루 또는 비교 가능한 품질의 밀가루로부터 제조된 파스타 반죽을 제조하기 위한 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소의 이용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 진균성 지질분해효소는 식물유 또는 식용유의 효소적 해교에 이용하기에 적당하다. 식물유 또는 식용유의 가공시 식용유 또는 식물유는 극성 지질(즉, 인지질 및/또는 당지질)의 주요 부분을 가수분해하기 위해 본 발명에 따른 진균성 지질분해효소로 처리된다. 바람직하게는, 지방성 아실기는 극성 지질로부터 가수분해된다. 해교 공정은 일반적으로 극성 지질 즉, 당지질 및/또는 인지질의 주요 부분(즉, 50% 이상)의 가수분해에 의해 식용유 내에서 극성 지질, 특히 인지질 함량의 감소를 유발한다. 일반적으로 가수분해된 극성 지질(즉, 인지질 및/또는 당지질)을 함유한 수성상은 기름으로부터 분리된다. 적당하게는 식용유 또는 식물유(본 발명에 따른 효소로 전-처리된)는 50∼250 ppm의 인 함량을 지닌다.
더욱이 본 발명은 치즈 제품의 처리를 위한 본 발명에 따른 지질분해효소의 이용을 지시한다.
또한 본 발명에 따른 지질분해효소는 동물 사료의 제조에 사용하기에 특히 적당하다.
당업자가 인식하는 바와 같이 여기서 사용된 "해교(degumming)"라는 용어는 포스파티드(phophatide)(레시틴, 인지질 및 흡장된 기름과 같은)를 가수분해 가능한 포스파티드로 전환시킴으로서 기름을 정제하는 것을 의미한다. 해교된 기름은 더욱 유동적이고 따라서 해교되지 않은 기름보다 더 우수한 조작 성질을 지닌다.
하기 표는 일반적인 지침을 위한 것이고 다른 적용에 필요한 본 발명에 따른 지질분해효소의 용량 수준의 개요를 제공한다. 또한 표는 예를 들어 유화제와 결합하여 사용시 본 발명에 따른 지질분해효소에 대한 용량 수준에 대한 지침을 제공한다. 물론 당업자에게 명백한 바와 같이 효소 용량, 반응 온도 및 반응 시간의 최적화는 제공된 적용에 대해 일반적인 실험을 이용하여 용이하게 결정된다.
Figure 112006054255786-PCT00003
분리된
하나의 관점에서 바람직하게는 서열은 분리된 형태이다. "분리된"이라는 용어는 자연과 있는 그대로 관련되고 자연 내에서 발견되는 것과 같은 서열을 지닌 적어도 하나 이상의 다른 성분으로부터 서열이 실질적으로 유리되는 것을 의미한다.
정제된
하나의 관점에서 바람직하게는 서열은 정제된 형태이다. "정제된"이라는 용어는 매우 순수한 상태 - 즉, 적어도 약 90% 이상의 순도 또는 적어도 약 95% 이상 또는 적어도 약 98% 이상의 순도를 의미한다.
뉴클레오타이드 서열
본 발명의 범위는 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
여기서 사용된 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체이다(그의 일부와 같은). 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 스트랜스를 나타내는 이중-스트랜드 또는 단일-스트랜드인 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원이다.
본 발명과 관련하여 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직하게는 이는 DNA, 더욱 바람직하게는 본 발명을 코드하는 cDNA 서열을 의미한다.
바람직한 실시태양에서 본 발명의 그 자체 범위와 관련하고 이에 의해 포함되는 경우 뉴클레오타이드 서열은 그의 자연 환경 내에 있고 그의 자연 환경 내에 있는 자연적으로 관련된 서열(들)과 결합시 본 발명에 따른 고유의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 용이한 참고를 위해 이러한 바람직한 실시태양을 "비-고유 뉴클레오타이드 서열"이라고 명명한다. 이러한 관점에서 "고유 뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 고유의 환경 내에 존재하고 자연적으로 관련된 전체 프로모터에 실시가능하게 결합시 프로모터도 그의 고유 환경 내에 존재하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 그러나 본 발명의 범위에 포함된 아미노산 서열은 그의 고유 생물체 내의 뉴클레오타이드 서열의 발현 후 분리되고/또는 정제될 수 있다. 그러나 바람직하게는 본 발명의 범위에 포함된 아미노산 서열은 그의 고유 생물체 내의 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현되나 뉴클레오타이드 서열은 생물체 내에서 자연적으로 관련된 프로모터의 조절 하에 있지 않다.
뉴클레오타이드 서열의 제조
일반적으로 본 발명의 범위에 포함된 뉴클레오타이드 서열은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다(즉, 재조합 DNA). 그러나 본 발명의 대안적 실시태양에서 뉴클레오타이드 서열은 당분야에 잘 알려진 화학적 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다(Caruthers MH et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 및 Horn T et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
여기서 한정된 특정 성질을 지닌 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 효소를 생성하는 세포 또는 생물체로부터 확인되고/또는 분리되고/또는 정제된다. 뉴클레오타이드 서열의 확인 및/또는 분리 및/또는 정제를 위한 다양한 방법이 당분야에 잘 알려져 있다. 예로서 적당한 서열이 확인되고/또는 분리되고/또는 정제되면 많은 서열을 제조하는 PCR 증폭 기술이 이용된다.
또다른 예로서 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 효소를 생성하는 생물체로부터의 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 이용하여 구축된다. 효소의 아미노산 서열 또는 효소의 아미노산 서열의 일부가 알려진 경우 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 합성되고 생물체로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터 효소-인코딩 클론을 확인하는데 이용된다. 대안으로 또다른 알려진 효소 유전자에 상동적인 서열을 포함한 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 효소-인코딩 클론을 확인하는데 이용될 수 있다. 후자의 경우 낮은 스트린전시의 하이브리디제이션 및 세척 조건이 이용된다.
대안으로, 효소-인코딩 클론은 게놈 DNA의 단편을 플라스미드와 같은 발현 벡터 내에 삽입하고, 수득된 게놈 DNA로 효소-음성 박테리아를 형질전환시킨 후 형질전환된 박테리아를 효소에 대한 기질을 포함한 한천 플레이트에 도말하여 효소를 발현하는 클론이 확인되게 함으로서 확인될 수 있다.
또다른 대안으로 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 수립된 표준 방법 즉, Beucage S.L. et al(1981) Tetrahedron Letters 22, p1859-1869에 의해 기술된 포스포로아미디트(phosphoroamidite) 방법 또는 Matthes et al(1984) EMBO J. 3, p801-805에 의해 기술된 방법에 의해 합성적으로 제조된다. 포스포로아미디트 방법에서 올리고뉴클레오타이드가 합성된다 즉, 자동 DNA 합성기에서 정제되고, 어닐되고, 라이게이트되고 적당한 벡터 내에서 클론된다.
뉴클레오타이드 서열은 표준 기술에 따라 합성, 게놈 또는 cDNA 기원(적당한)의 단편을 라이게이트함으로서 제조된, 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원이다. 각각의 라이게이트된 단편은 전체 뉴클레오타이드 서열의 다양한 부분에 상응한다. 또한 DNA 서열은 예를 들어 미국특허 제4,683,202호 또는 Saiki R K et al(Science(1988) 239, pp487-491)에 기술된 바와 같이 특정 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된다.
본래 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드되는 아미노산의 일부 또는 전부에 대해 삼중자 코돈 용법이 변화하여 본래 뉴클레오타이드 서열에 대해 낮은 상동성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 생성하나 본래 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 것과 동일한 아미노산 또는 변이 아미노산을 인코드하는 유전자 코드 내 퇴화(degeneracy)에 의해 뉴클레오타이드 서열이 용이하게 제조된다. 예를 들어 대부분의 아미노산의 경우 유전자 코드의 퇴화는 삼중자 코돈 내 세 번째 위치 존재하고(동요 위치)(참고로 Stryer, Lubert, Biochemistry, Third Edition, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7 참조), 따라서 모든 삼중자 코돈이 세 번째 위치에서 "동요되는" 뉴클레오타이드 서열은 본래 뉴클레오타이드 서열의 약 66% 동일하다. 그러나 수정된 뉴클레오타이드 서열은 본래 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 변이된 초기 아미노산 서열을 인코드한다.
따라서 본 발명은 삼중자 코돈을 인코드하는 적어도 하나 이상의 아미노산에 대한 대안적 삼중자 코돈 용법을 지니나 본래 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드되는 폴리펩타이드와 동일하거나 변이된 폴리펩타이드 서열을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
더욱이 일반적으로 특정한 생물체는 삼중자 코돈이 아미노산을 인코드하는데 사용되는 성향을 지닌다. 바람직한 코돈 표는 광범위하게 이용 가능하고 코돈 최적화된 유전자를 제조하는데 이용될 수 있다. 이러한 코돈 최적화 기술은 이형적 숙주 내 트랜스유전자의 발현을 최적화하는데 일반적으로 이용된다.
아미노산 서열
또한 본 발명의 범위는 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 효소의 아미노산 서열을 포함한다.
여기서 사용된 "아미노산 서열"이라는 용어는 "폴리펩타이드"라는 용어 및/또는 "단백질"이라는 용어와 동의어이다. 일부의 경우 "아미노산 서열"이라는 용어는 "펩타이드"라는 용어와 동의어이다. 일부의 경우 "아미노산 서열"이라는 용어는 "효소"라는 용어와 동의어이다.
아미노산 서열은 적당한 원료로부터 제조/분리되거나 합성적으로 제조되거나 재조합 DNA 기술의 이용에 의해 제조된다.
본 발명에 포함된 효소는 다른 효소와 컨쥬게이트되어 사용된다. 따라서 본 발명은 본 발명의 효소와 본 발명에 따른 또다른 효소인 또다른 효소를 포함한 효소의 결합도 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 그 자체 범위와 관련하고 그에 포함되는 경우 아미노산 서열은 고유 효소가 아니다. 이러한 관점에서 "고유 효소"라는 용어는 그의 고유 환경 내에 있고 고유 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현되는 경우 전체 효소를 의미한다.
동일성/상동성
또한 본 발명은 효소의 아미노산 서열 또는 이러한 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열의 상동체의 이용을 포함한다.
여기서 "상동체"라는 용어는 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열과 특정한 상동성을 지닌 실재를 의미한다. 여기서 "상동성"이라는 용어는 "동일성"과 동등하다. 이들 용어는 여기서 상호교환가능하게 사용될 것이다.
이러한 정황하에서 상동적 아미노산 서열은 서열에 대해 적어도 92% 이상, 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로 상동체는 피험 아미노산 서열과 동일한 활성 사이트를 포함할 것이다. 상동성이 유사성의 표현으로 고려되더라도 본 발명의 정황하에서 서열 동일성의 표현으로 표시되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상동적 아미노산 서열은 적어도 30개, 더욱 바람직하게는 40개 인접 아미노산의 구역에 대해 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상의 동일성을 지닌 것이다.
이러한 정황하에서 상동적 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(피험 서열)에 대해 적어도 92% 이상, 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일반적으로 상동체는 활성 사이트를 코드하는 피험 서열과 동일한 서열을 포함할 것이다. 상동성이 유사성의 표현으로 고려되더라도 본 발명의 정황하에서 서열 동일성의 표현으로 표시되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상동적 뉴클레오타이드 서열은 적어도 30개, 바람직하게는 40개, 더욱 바람직하게는 60개 인접 아미노산의 구역에 대해 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상의 동일성을 지닌 것이다.
아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열에 있어서, 상동성 비교는 눈으로 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 수단으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2 이상의 서열 사이의 % 상동성을 계산할 수 있다.
% 상동성은 인접 서열에 대해 계산되고 즉, 하나의 서열은 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내의 각각의 아미노산은 한번에 하나의 잔기씩 다른 서열 내의 상응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 매우 적은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이는 매우 단순하고 일관성 있는 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍 내에서 하나의 삽입 또는 삭제가 하기 아미노산 잔기를 정렬로부터 제거되게 하고, 따라서 전체 정렬이 수행될 때 % 상동성의 큰 감소를 잠재적으로 유발할 것임이 고려되지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 득점에 부당하게 패널티를 과하지 않고 가능한 삽입 및 삭제를 고려하도록 최적 정렬을 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.
그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내에 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 동일한 수의 아미노산의 경우 가능한 적은 갭을 지닌 서열 정렬이 - 2개의 비교 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하는 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 득점을 달성할 것이다. "친화성 갭 코스트(Affine gap cost)"는 일반적으로 갭의 존재에 대해 매우 높은 코스트 및 갭 내 각각의 하위 잔기에 대한 적은 패널티를 부과하는데 사용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 무론 높은 갭 패널티는 적은 갭으로 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교에 이러한 소프트웨어를 이용시 디폴트 수치를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit package를 이용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해 -12이고 각 확장(extension)에 대해 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 먼저 갭 패널티를 고려하여 최적 정렬의 생성을 요구한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit package(Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST package(Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18 참조), FASTA(Altschul et al, 1990 J MoI. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparison tools을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색으로 이용 가능하다(Ausubel et ah, 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 내지 7-60 참조).
그러나 일부의 적용에 있어서 GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequence로 명명된 새로운 기구도 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하는데 이용 가능하다(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).
최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전부가 아닌(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 점수를 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다(추가 상세한 설명은 사용자 설명서 참조). 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
대안으로, 백분율 상동성은 CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1), 237-244)와 유사한 알고리즘에 기반하여 DNASISTM(Hitachi Software) 내의 다수의 정렬 특징을 이용하여 계산된다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면 % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 일반적으로 소프트웨어는 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고 수적인 결과를 생성한다.
또한 서열은 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 물질을 유발하는 아미노산 잔기의 삭제, 삽입 또는 치환을 지닌다. 계획적인 아미노산 치환은 아미노산 특성 내의 유사성(잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성)에 기반하여 이루어지고, 따라서 기능적인 그룹에 아미노산을 함께 분류하는 것이 유용하다. 아미노산은 그의 측쇄 단독의 특성에 기반하여 함께 분류될 수있다. 그러나 돌연변이 데이터를 포함시키는 것이 유용하다. 이렇게 유래된 아미노산 세트는 구조적 원인으로 인해 보존되게 된다. 이들 세트는 벤다이어그램(Livingstone CD. and Barton GJ. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218)의 형태로 기술될 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어 일반적으로 수용되는 아미노산의 벤다이어그램 분류를 기술한 하기 표에 따라 이루어진다.
Figure 112006054255786-PCT00004
또한 본 발명은 발생하는 상동적 치환(치환 및 교체는 모두 여기서 현존하는 아미노산 잔기와 대안적 잔기의 상호교환을 의미하는데 사용됨) 즉, 염기성에 대해 염기성, 산성에 대해 산성, 극성에 대해 극성과 같은 유사성-대-유사성(like-for-like) 치환을 포함한다. 또한 한 분류의 잔기로부터 또다른 잔기 또는 오르니틴(이하 Z로 표기), 디아미노뷰티르산(diaminobutyric acid) 오르니틴(이하 B로 표기), 노르류신 오르니틴(이하 O로 표기), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비자연적 아미노산의 함유물 관련 대안 잔기로 비-상동적 치환이 발생한다.
또한 교체는 비자연적 아미노산에 의해 이루어진다.
변이 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 간격 외에 메틸기, 에틸기 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함한, 서열의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입되는 적당한 간격(spacer) 그룹을 포함한다. 추가적인 변이의 형태는 펩토이드(peptoid) 형태로 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하고, 이는 당업자에 의해 잘 이해될 것이다. 의심의 여지를 회피하기 위해 α-탄소 치환기가 α-탄소 보다는 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이 아미노산을 나타내는데 "펩토이드 형태"가 사용된다. 펩토이드 형태 내에 펩타이드를 제조하는 방법은 예를 들어 Simon RJ et al., PNAS(1992) 89(20), 9367-9371 및 Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995) 13(4), 132-134와 같이 당분야에 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 합성적 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드로의 많은 다른 형태의 변형이 당분야에 알려져 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본 및/또는 분자의 3' 및/또는 5'말단에서의 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해 여기서 기술된 뉴클레오타이드 서열이 당분야에 유용한 어떠한 방법에 의해 변형됨이 이해된다. 뉴클레오타이드 서열의 생체 내 활성 또는 수명을 증가시키기 위해 이러한 변형이 수행된다.
또한 본 발명은 여기서 제공된 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 단편의 이용을 포함한다. 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 서열은 다른 생물체 내의 유사한 코딩 서열을 확인하는 프로브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 서열에 100% 상동적이지 않으나 본 발명의 범위 내에 있는 폴리뉴클레오타이드는 많은 방법에 의해 수득될 수 있다. 여기에 기술된 서열의 다른 변이체는 예를 들어 다른 집단으로부터의 개체와 같은 광범위한 개체로부터 DNA 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 더욱이 다른 상동체가 수득되고 이러한 상동체 및 그의 단편은 일반적으로 서열목록에 나타난 서열을 선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능할 것이다. 이러한 서열은 다른 종으로부터 제조된 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA를 프로브하고, 중간 내지 높은 스트린전시 조건 하에서 첨부된 서열목록 내의 어느 한 서열의 모두 또는 일부를 포함하는 프로브로 이러한 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 유사한 고려는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열의 종 상동체 및 대립유전자 변이체를 수득하는데 적용된다.
또한 변이체 및 스트레인/종 상동체는 본 발명의 서열 내에서 보존된 아미노산 서열을 인코드하는 변이체 및 상동체 내에 서열을 타겟하도록 고안된 프라이머를 이용하는 퇴화(degenerate) PCR을 이용하여 수득된다. 보존된 서열은 예를 들어 일부 변이체/상동체로부터의 아미노산 서열을 정렬시킴으로서 예측될 수 있다. 서열 정렬은 당분야에 알려진 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 GCG Wisconsin PileUp 프로그램이 널리 이용된다.
퇴화 PCR에 사용되는 프라이머는 하나 이상의 퇴화 위치를 포함하고 알려진 서열에 대해 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝하는데 사용되는 것 보다 더 낮은 스트린전시 조건에서 사용될 것이다.
대안으로, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 특성화된 서열의 자리 지정 돌연변이유발에 의해 수득된다. 이는 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대해 코돈 우선권을 최적화하는데 침묵 코돈 서열 변화가 필요할 때 유용하다. 제한 폴리펩타이드 인식 사이트를 도입시키거나 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드의 성질 또는 기능을 변화시키기 위해 다른 서열 변화가 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 서열)는 프라이머 즉, PCR 프라이머, 대안적 증폭 반응용 프라이머, 프로브 즉, 방사성 또는 비-방사성 표지를 이용한 통상적 방법에 의해 노출 표지로 표지된 프로브를 제조하는데 사용되고 또는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 클론된다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 적어도 15 이상, 바람직하게는 적어도 20 이상, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40 이상의 뉴클레오타이드 길이이고 또한 여기서 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함된다.
본 발명에 따른 DNA 폴리뉴클레오타이드 및 프로브와 같은 폴리뉴클레오타이드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 유용한 어떠한 방법에 의해서도 제조된다. 또한 이들은 표준 기술에 의해 클론된다.
일반적으로 프라이머는 한 번에 하나의 뉴클레오타이드에 원하는 핵선 서열의 계단식 제조를 포함한 합성적 방법에 의해 제조될 것이다. 자동화된 기술을 이용하여 이를 달성하기 위한 기술은 당분야에서 용이하게 이용된다.
더 긴 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 재조합 방법, 예를 들어 PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 이용하여 제조될 것이다. 프라이머는 적당한 제한 효소 인식 사이트를 포함하여 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있도록 고안된다.
생물학적 활성
바람직하게는 변이 서열은 여기서 제공된 서열에 적어도 생물학적으로 활성적이다.
여기서 사용된 "생물학적으로 활성"은 자연 발생적 서열의 유사한 구조적 기능(동일한 정도일 필요는 없음) 및/또는 유사한 조절 기능(동일한 정도일 필요는 없음) 및/또는 유사한 생화학적 기능(동일한 정도일 필요는 없음)을 지닌 서열을 나타낸다.
하이브리디제이션
또한 본 발명은 본 발명의 핵산 서열에 상보적인 서열 또는 본 발명의 서열 또는 그에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열을 포함한다.
여기서 사용된 "하이브리디제이션"이라는 용어는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술에서 수행되는 증폭 과정뿐만 아니라 "염기 짝짓기를 통해 핵산 스트랜드를 상보적 스트랜드와 결합시키는 공정"을 포함한다.
또한 본 발명은 여기서 제공된 서열 또는 그의 유도체, 단편에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열의 이용을 포함한다.
또한 "변이체"라는 용어는 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
바람직하게는 "변이체"라는 용어는 스트린전트 조건(즉, 50℃ 및 0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3구연산염 pH 7.0})하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는 "변이체"라는 용어는 높은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3구연산염 pH 7.0})하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다(여기서 제공된 것의 상보적 서열을 포함).
또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다(여기서 제공된 것의 상보적 서열을 포함).
또한 중간 내지 최대 스트린전시 조건 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 관점에서 본 발명은 스트린전트 조건(즉, 50℃ 및 0.2xSSC) 하에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 관점에서 본 발명은 높은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC) 하에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
재조합
하나의 관점에서 본 발명에 사용되는 서열은 재조합 서열 - 즉, 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 서열이다.
이들 재조합 DNA 기술은 당업자의 능력 내에 있다. 이러한 기술은 예를 들어 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press와 같은 문헌에서 설명되어 있다.
합성
하나의 관점에서 본 발명에 사용되는 서열은 합성 서열 - 시험관 내에서의 화학적 또는 효소적 합성에 의해 제조된 서열이다. 이는 숙주 생물체 - 메틸영양체성 효모 피키아(Pichia) 및 한세눌라(Hansenula)와 같은 -에 대한 최적 코돈 용법으로 제조된 서열을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
효소의 발현
본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 복제가능 벡터 내로 도입된다. 벡터는 효소의 형태로 적합 숙주 세포 내 및/또는 그로부터 뉴클레오타이드 서열을 복제하고 발현하는데 사용된다.
발현은 제어 서열 즉, 조절 서열을 이용하여 조절된다.
뉴클레오타이드의 발현에 의한 숙주 재조합 세포에 의해 제조된 효소는 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 분비되거나 세폰내적으로 포함된다. 코딩 서열은 특정한 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 코딩 서열 물질의 분비를 지시하는 신호 서열을 지니도록 고안될 수 있다.
발현 벡터
"발현 벡터"라는 용어는 생체 내 또는 시험관 내 발현을 가능하게 하는 컨스트럭트를 의미한다.
바람직하게는 발현 벡터는 적당한 숙주 생물체의 게놈 내로 도입된다. 바람직하게는 "도입된"이라는 용어는 게놈 내로의 안정한 도입을 포함한다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적당한 숙주 생물체에 의해 뉴클레오타이드 서열의 발현을 제공하는 것이 가능하도록 뉴클레오타이드 서열이 조절 서열에 실시가능하게 결합된 벡터 내에 존재한다.
여기서 제공된 폴리펩타이드의 발현을 제공하기 위해 본 발명에서 사용되는 벡터는 하기 기술된 바와 같은 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된다.
벡터 즉, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터의 선택은 도입되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 사용되는 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 - 항생제 저항성 즉, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라시클린 저항성을 부여하는 유전자와 같은 -를 포함한다. 대안으로, 선택은 동시-형질전환에 의해 달성된다(WO91/17243에 기술됨).
벡터는 예를 들어 RNA의 제조를 위해 시험관 내에서 사용되거나 숙주 세포를 트랜스펙트하거나 형질전환시키거나 형질도입시키거나 감염시키는데 사용된다.
따라서 또다른 실시태양에서 본 발명은 복제가능 벡터 내로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 도입시키고, 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입시키고, 벡터의 복제를 야기하는 조건 하에서 숙주 세포를 생장시킴으로서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법을 제공한다.
벡터는 벡터가 의문의 숙주 세포 내에서 복제되게 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 더욱 포함한다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제의 기원이다.
조절 서열
일부 적용시 본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 선택된 숙주 세포에 의해서와 같이 뉴클레오타이드 서열의 발현을 제공하는 것이 가능한 조절 서열에 실시 가능하게 결합된다. 예로서 본 발명은 이러한 조절 서열에 실시가능하게 결합된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함한 벡터를 포함한다 즉 벡터는 발현 벡터이다.
"실시가능하게 결합된"이라는 용어는 기술된 성분이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병렬을 나타낸다. 코딩 서열에 "실시 가능하게 결합된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되는 방식으로 라이게이트된다.
"조절 서열"이라는 용어는 프로모터 및 인핸서 및 다른 발현 조절 신호를 포함한다.
"프로모터"라는 용어는 당분야의 일반적 의미 즉, RNA 중합효소 결합 사이트로 사용된다.
본 발명의 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열의 증가된 발현은 이형적 조절 구역 즉, 프로모터, 분비 리더 및 터미네이터 구역의 선택에 의해 달성된다.
바람직하게는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적어도 프로모터에 실시가능하게 결합된다.
박테리아, 진균 또는 효모 숙주 내에서 뉴클레오타이드 서열의 전사를 지시하기 위한 적당한 프로모터의 예는 당분야에 잘 알려져 있다.
컨스트럭트
"컨스트럭트"라는 용어는 - "컨쥬게이트", "카세트" 및 "하이브리드"와 같은 용어와 동의어인 - 프로모터에 직접 또는 간접적으로 부착된 본 발명에 따른 이용을 위한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
간접적 부착의 예는 프로모터와 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 매개하는 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론 등의 인트론 서열과 같은 적당한 간격 그룹의 제공이다. 직접 또는 간접적 부착을 포함한 본 발명에 관련된 "융합된"이라는 용어에 대해서도 동일하다. 일부의 경우 본 용어는 야생형 유전자 프로모터와 일반적으로 결합된 단백질을 코드하는 뉴클레오타이드 서열의 자연적 결합 및 이들 모두 그의 자연 환경 내에 존재하는 경우를 포함하지 않는다.
컨스트럭트는 유전자 컨스트럭트의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하거나 발현한다.
일부의 적용에 있어서 바람직하게는 컨스트럭트는 프로모터에 실시 가능하게 결합된 적어도 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 포함한다.
숙주 세포
"숙주 세포"라는 용어는 - 본 발명에 관련하여 - 상기 기술되고 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 효소의 재조합 생성에 사용되는 뉴클레오타이드 서열 또는 발현 벡터를 포함한 어떠한 세포도 포함한다.
따라서 본 발명의 또다른 실시태양은 본 발명의 효소를 발현하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환되거나 트랜스펙트된 숙주 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 벡터에 적합한 것으로 선택되고 예를 들어 원핵성(예를 들어 박테리아성), 진균성, 효모 또는 식물 세포이다. 바람직하게는 숙주 세포는 인간 세포는 아니다.
적당한 박테리아성 숙주 생물체의 예는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아이다.
본 발명의 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열의 성질 및/또는 발현되는 단백질의 부차적인 처리에 대한 바람직함에 따라 다르게 효모 또는 다른 진균과 같은 진핵성 숙주가 바람직하다. 일반적으로 효모 세포가 조작하기에 용이하기 때문에 진균 세포보다 바람직하다. 그러나 일부 단백질은 효모 세포로부터 불충분하게 분비되거나 일부의 경우 적당히 처리되지 않는다. 이러한 경우 다른 진균 숙주 생물체가 선택되어야 한다.
적당한 숙주 세포- 효모, 진균 및 식물 숙주 세포와 같은 -의 이용은 본 발명의 재조합 발현 생성물 상에 최적의 생물학적 활성을 부여하기 때문에 후-발현 변형(즉, 미리스토일레이션(myristoylation), 당화, 절단, 라피데이션(lapidation) 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화)을 제공한다.
숙주 세포는 프로테아제 결함 또는 프로테아제 마이너스 스트레인이다.
숙주 세포의 유전자형은 발현을 개선시키도록 변형된다.
숙주 세포 변형의 예는 프로테아제 결손, 희박한 tRNA의 보충 및 이황결합 형성을 증가시키기 위한 세포질 내 환원 포텐셜의 변형을 포함한다.
예를 들어 Kane(Curr Opin Biotechnol (1995), 6, 494-500 "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E. coli")에서 예시되고/기술된 바와 같이 숙주 세포 E. coli는 이형성 단백질의 발현을 개선시키기 위해 희박한 rRNA를 과발현한다. 숙주 세포는 환원 효소의 수에 결함이 있고 따라서 Bessette(Proc Natl Acad Sd USA (1999), 96, 13703-13708 " Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm")에 예시되고/기술된 바와 같이 안정한 이황결합의 형성에 유리하다.
생물체
본 발명에 관련한 "생물체"라는 용어는 본 발명에 따른 효소를 코드하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 그로부터 수득된 생성물을 포함할 수 있고/또는 생물체 내에 존재시 프로모터가 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는 어떠한 생물체도 포함한다.
적당한 생물체는 원핵생물, 진균, 효모 또는 식물을 포함한다.
본 발명과 관련한 "형질전환 생물체"라는 용어는 본 발명에 따른 효소를 코드하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 그로부터 수득된 생성물을 포함하고/또는 프로모터가 생물체 내에서 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는 어떠한 생물체도 포함한다.
"형질전환 생물체"라는 용어는 그의 자연 환경 내에도 존재하는 고유의 프로모터의 조절 하에 있는 경우 그의 자연 환경 내의 고유의 뉴클레오타이드 코딩 서열을 포함하지 않는다.
따라서 본 발명의 형질전환 생물체는 본 발명에 따른 효소를 코드하는 뉴클레오타이드 서열 중의 어느 하나 또는 그의 결합, 본 발명에 따른 컨스트럭트, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 플라스미드, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 조직 또는 그의 생성물을 포함한 생물체를 포함한다.
또한 예를 들어 형질전환 생물체는 이형적 프로모터의 조절 하에서 본 발명의 효소를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
숙주 세포/생물체의 형질전환
상기 나타난 바와 같이 숙주 생물체는 원핵성 또는 진핵성 생물체가 될 수 있다. 적당한 원핵성 숙주의 예는 대장균(E. coli) 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)를 포함한다.
원핵성 숙주의 형질전환 상의 지침은 당분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Sambrook et al(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 참조. 원핵성 숙주가 사용되는 경우 뉴클레오타이드 서열은 인트론의 제거와 같이 형질전환 전에 적당히 변형될 필요가 있다.
사상 진균 세포는 당분야에 알려진 다양한 방법 - 원형질체의 형성 및 원형질체의 형질전환 후 잘 알려진 방법으로 세포벽을 재생시키는 것을 포함한 방법과 같은 -을 이용하여 형질전환된다. 숙주 미생물로서 아스페르길루스(Aspergillus)의 이용이 EP 0 238 023에 기술되어 있다.
또다른 숙주 생물체는 식물이 될 수 있다. 식물을 형질전환하는데 사용되는 일반적 기술의 조사는 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 의한 논문에 나타나 있다. 식물 형질전환에 대한 또다른 지침은 EP-A-0449375에 나타나 있다.
진균, 효모 및 식물의 형질전환에 대한 일반적 지침은 하기 섹션에 제공된다.
형질전환된 진균
숙주 생물체는 진균이다 - 사상 진균과 같은 -. 이러한 적당한 숙주의 예는 테르모마이세스(Thermomyces), 아크레모니움(Acremonium), 아스페르길루스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 뮤코(Mucor), 뉴로스포라(Neurospora), 트리코더마(Trichoderma) 등의 속을 포함한다.
사상 진균의 형질전환 상의 지침은 사상 진균의 형질전환에 대한 표준 기술을 나타내는 US-A-5741665에 보고되어 있고, 진균을 배양하는 것은 당분야에 잘 알려져 있다. N. crassa에 적용된 기술의 광범위한 조사는 Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A:79-143에 나타나 있다.
사상 진균의 형질전환 상의 또다른 지침은 US-A-567407에 보고되어 있다.
하나의 관점에서 숙주 생물체는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)와 같은 아스페르길루스속이 될 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환 아스페르길루스는 예를 들어 Turner G. 1994(Vector for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp.641-666)의 지침에 따라 제조될 수 있다.
사상 진균 내의 유전자 발현은 Punt et al.(2002) Trends Biotechnol 2002 May;20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997) 17(4):273-306에서 보고되었다.
형질전환된 효모
또다른 실시태양에서 형질전환 생물체는 효모가 될 수 있다.
효모 내에서의 이형적 유전자 발현 원리의 보고는 예를 들어 Methods Mol Biol(1995), 49:341-54 및 Curr Opin Biotechnol(1997) Oct;8(5):554-60에서 제공된다.
이러한 관점에서 효모 - 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(FEMS Microbiol Rev(2000 24(1):45-66 참조) 종과 같은 -가 이형적 유전자 발현에 대한 운반체로서 사용된다.
사카로마이세스 세레비시에 내의 이형적 유전자 발현 및 유전자 생성물의 분비 원리의 보고는 E Hinchcliffe E Kenyy(1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous gene", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)에 의해 제공된다.
효모의 형질전환의 경우 일부 형질전환 프로토콜이 개발되었다. 예를 들어 본 발명에 따른 형질전환 사카로마이세스는 Hinnen et al.,(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, JD (1978, Nature, London, 275, 104); 및 Ito, H et al(1983, J Bacteriology 153, 163-168)의 지침을 따라 제조될 수 있다.
형질전환된 효모 세포는 다양한 선택성 마커 - 영양요구성 마커 우성 항생제 저항성 마커와 같은 -를 이용하여 선택된다.
형질전환된 식물/식물 세포
본 발명에 적당한 숙주 생물체는 식물이다. 일반적 기술의 보고는 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 의한 논문에 나타나 있다.
배양 및 생성
본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 인코드된 효소의 생성을 수행하고 세포 및/또는 배양 배지로부터 효소의 회수를 촉진시키는 조건 하에서 배양된다.
세포를 배양하는데 사용되는 배지는 의문의 숙주 세포를 생장시키고 효소의 발현을 수득하기에 적당한 어떠한 통상의 배지도 된다.
재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 세포의 표면 상에 디스플레이된다.
효소는 숙주 세포로부터 분비되고 잘-알려진 절차를 이용하여 배양 배지로부터 편리하게 회수된다.
분비
종종 발현 숙주로부터 효소가 더욱 용이하게 회수되는 배양 배지 내로 효소가 분비되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 분비 리더 서열이 원하는 발현 숙주에 기반하여 선택된다. 하이브리드 신호 서열도 본 발명의 상황에 따라 사용된다.
이형적 분비 리더 서열의 일반적인 예는 진균성 아밀로글루코시다제(AG) 유전자(glaA - 아스페르길루스로부터의 18 및 24 아미노산 버전 모두), a-인자 유전자(효모 즉, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스 및 한세눌라) 또는 α-아밀라제 유전자(바실러스)로부터 기원한 것이다.
예로서 E. coli 내의 이형적 단백질 분비는 Methods Enzymol (1990) 182:132-43에서 보고되었다.
검출
아미노산 서열의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 당분야에 알려져 있다. 예는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역측정법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다.
다양한 표지 및 컨쥬게이션 기술이 당업자에 의해 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다.
Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ), Promega(Madison, WI) 및 US Biochemical Corp(Cleveland, OH)와 같은 많은 회사가 이러한 절차를 위한 상품화된 키트 및 프로토콜을 공급한다.
적당한 수용체 분자 또는 표지는 기질, 조인자, 억제제, 자기입자뿐만 아니라 방사선핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 색소유전제를 포함한다. 이러한 표지의 이용을 나타내는 특허는 US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; US-A-4,275,149 및 US-A-4,366,241을 포함한다.
또한 재조합 면역글로불린은 US-A-4,816,567에 나타난 바와 같이 제조된다.
융합 단백질
본 발명에 따른 이용에 사용되는 아미노산 서열은 추출 및 정제에 도움을 주기 위해 융합 단백질로서 제조된다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한 융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하기 위해 융합 단백질 파트너와 목적 단백질 서열 사이의 단백질분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다.
바람직하게는 융합 단백질은 단백질 서열의 활성을 방해하지 않을 것이다.
E. coli 내의 유전자 융합 발현 시스템은 Curr Opin Biotechnol(1995) 6(5):501-6에서 조사되었다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 아미노산 서열은 융합 단백질을 인코드하는 이형적 서열에 라이게이트된다. 예를 들어 물질 활성에 영향을 미치는 것이 가능한 약제에 대한 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위해 통상적으로 상품화된 항체에 의해 인식되는 이형적 에피토프를 발현하는 키메라 물질을 인코드하는 것이 유용하다.
대규모 적용
본 발명의 하나의 실시태양에서 아미노산 서열은 대규모 적용에 사용된다.
바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 생물체의 배양 후 총 세포 배양 부피의 리터 당 1 g 내지 2 g의 양으로 제조된다.
바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 생물체의 배양 후 총 세포 배양 부피의 리터 당 100 mg 내지 900 mg의 양으로 제조된다.
바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 생물체의 배양 후 총 세포 배양 부피의 리터 당 250 mg 내지 500 mg의 양으로 제조된다.
식품
본 발명의 조성물은 식품으로서 - 또는 식품의 제조에 - 사용된다. "식품"이라는 용어는 광범위한 의미로 사용되고 - 인체용 식품뿐만 아니라 동물용 식품(즉, 사료)도 포함한다. 바람직한 관점에서 식품은 인간 소비용이다.
식품은 용액 또는 고형의 형태이다 - 용도 및/또는 적용 모드 및/또는 투여 모드에 따라 다르게.
식품 성분
본 발명의 조성물은 식품 성분으로서 사용된다.
여기서 사용된 "식품 성분"이라는 용어는 기능성 식품 또는 식료품이거나 이들이 될 수 있는 포뮬레이션을 포함하고 예를 들어 산성화 또는 유화를 필요로하는 다양한 제품 내에서 낮은 수준으로 사용될 수 있는 포뮬레이션을 포함한다.
식품 성분은 용액 또는 고형의 형태이다 - 용도 및/또는 적용 모드 및/또는 투여 모드에 따라 다르게.
식품 제품
본 발명의 조성물은 과자류 제품, 유제품, 가금류 제품, 어류 제품 및 베이커리 제품 중의 하나 이상과 같은 식품 제품의 제조시 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 지질분해효소를 또다른 식품 성분과 혼합하는 것을 포함한 식품 또는 식품 성분의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 도면을 참고하여 실시예에 의해 기술된다.
도 1은 IEC 크로마토그래피 후 수득된 리파제 활성(빗금쳐진 부분으로 표시, 풀 B로 표기) 및 단백질(점선)의 프로파일을 나타낸 것이다.
도 2는 겔(NU- PAGE, 4-12%, Mes-완충액, 제조사 미국 Novex에 의해 기술된 바와 같이 제조)에 적용된 후 쿠마시 염색된 정제된 진균성 지질분해효소(레인 3 - 5)를 나타낸 것이다.
도 3은 크로마토그램 #61을 나타낸 것이다.
도 4는 Butyl Sepharose 컬럼(P: Pool #172-174 lOOU/mL 1:10로 희석; Std = 표준 단백질 시리즈)으로부터의 분획의 SDS-PAGE를 나타낸 것이다.
도 5는 1) Chr #61 분획 9, 2) 풀 #172-#174, 3) Chr. #61 분획 14, 4) 대조군, 5) 리파제 #3044로의 미니 베이킹 실험을 나타낸 것이다.
도 6은 BS8948-2로부터의 반죽 지질 디갈락토실디글리세라이드(DGDG) 및 디갈락토실모노글리세라이드(DGMG)의 GLC 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 F. heterosporum의 일본 균주(Nagao et al. 1994)의 리파제에 대한 모든 CBS 펩타이드의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸 것이다. 동일하고 유사한(잘-보존된) 아미노산은 각각 * 및 ·로 정렬 아래에 표시되어 있다.
도 8은 합성 알파-신호 서열과 융합된 합성 F. heterosporum (CBS 782.83) 지질분해효소 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 번역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열 위에 나타나 있다. 제한 효소 사이트 Eco RI 및 Bam HI를 포함한 뉴클레오타이드는 밑줄쳐 있고 번역 시작 및 종결 코돈은 이중으로 밑줄쳐 있다. 화살촉은 알파-신호 서열과 지질분해효소 유전자 사이의 융합 위치를 표시한다. 화살은 유전자의 조립에 사용되는 프라이머를 나나탠다.
도 9는 합성 알파-신호 서열(알파 ss)과 융합된 합성 F. heterosporum (CBS 782.83) 지질분해효소 유전자(LIPASE)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다. URA3, 한세눌라 내에의 선택을 위한 우라실 보완을 위한 오르티딘-5'-인산-디카르복실라제 유전자. HARS, 한세눌라 내 복제를 위한 자동 복제 서열. FMD-P, 한세눌라 내 발현을 위한 FMD 프로모터.
도 10은 F. heterosporum 지질분해효소 유전자를 포함한 선택된 한세눌라 폴리모르파(Hasenula polymorpha) 클론의 포스포리파제 활성을 나타낸 것이다. 기질로서 레시틴이 사용되었고 자유 지방산은 NEFA 키트(Roche)를 이용하여 측정되었다.
도 11은 포스포리파제 표본 205 및 Lipopan FTM이 증가된 용량(PLU)으로 베이크된 미니빵을 나타낸 것이다.
도 12는 반죽 지질의 GLC 분석을 나타낸 것이다. DGDG = 디갈락토실디글리세라이드. DGMG = 디갈락토실모노글리세라이드. 총 = DGDG + DGMG (실시예 3)
도 13은 A) 참고물질: 1. 분획화된 밀가루 지질, 2. 가수분해된 DGDG, 3. DGDG, B) 반죽으로부터 추출된 지질: 4. 대조군, 5. 2000 PLU-7/kg 표본 205 및 6. 40 ppm Lipopan FTM의 HPTLC 크로마토그램.
도 14 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소로 처리된 반죽 내의 디갈락토실-모노글리세라이드 이성체의 GLC 분석을 나타낸 것이다.
도 15는 다양한 온도의 pH 7.0에서 레시틴 기질 상의 10분간의 효소작용에 의해 측정된 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소 활성 및 NEFA C 방법에 의한 자유 지방산의 부차적 측정을 나타낸 것이다.
도 16은 37℃ 및 pH 7.0에서 레시틴 기질(CaCl2 없이) 상의 10분간의 효소작용에 의해 3 TIPU/ml 및 다양한 온도의 50 mM 인산염 완충액(50 mM 인산염 완충액, pH 7.0) 내에서의 30분간의 인큐베이션 후 측정된 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소 활성 및 NEFA C 방법에 의한 자유 지방산의 부차적 측정을 나타낸 것이다.
도 17은 37℃ 및 다양한 pH(50 mM 인산염 완충액, pH 7.0)에서 레시틴 기질(CaCl2 없이) 상의 10분간의 효소작용 후 측정된 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소 활성 및 NEFA C 방법에 의한 자유 지방산의 부차적 측정을 나타낸 것이다.
도 18은 37℃ 및 pH 7.0에서 레시틴 기질(CaCl2 없이) 상의 10분간의 효소작용에 의해 3 TIPU/ml 및 다양한 pH의 50 mM 인산염 완충액(50 mM 인산염 완충액) 내에서의 30분간의 인큐베이션 후 측정된 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소 활성 및 NEFA C 방법에 의한 자유 지방산의 부차적 측정을 나타낸 것이다.
도 19a 및 19b는 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소의 SDS-PAGE에 의해 측정된 분자량의 측정을 나타낸 것이다.
도 20는 본 발명에 따른 지질분해효소에 대한 온도 최적조건을 나타낸 것이다. 효소 반응은 다양한 온도에서 수행되었다.
도 21은 A: 30℃, B: 40℃ 및 C: 50℃의 반응시간에 따른 효소-변형된 난황 내 레시틴 함량을 나타낸 것이다. 레시틴 함량은 LC/MS-MS에 의해 분석되었고 난황 백분율로서 표현된다.
도 22는 A: 30℃, B: 40℃ 및 C: 50℃의 반응시간에 따른 효소-변형된 난황 내 리소-레시틴 함량을 나타낸 것이다. 리소-레시틴 함량은 LC/MS-MS에 의해 분석되었고 난황 백분율로서 표현된다.
도 23은 A: 30℃, B: 40℃ 및 C: 50℃의 반응시간에 따른 효소-변형된 난황 내 자유 지방산 함량을 나타낸 것이다. 자유 지방산 함량은 NEFA C 방법에 의해 분석되었고 난황 백분율로서 표현된다.
도 24는 난황의 본 발명에 따른 지질분해효소로의 효소적 전환을 나타낸 것이다(실시예 4). 반응시간에 따른 리소-레시틴(A), 자유 지방산(C) 및 레시틴(C)의 함량. 오차선은 2반복 측정(n=2)의 표준 오차이다. 레시틴 및 리소레시틴의 함량은 LC/MS-MS에 의해 측정되었고 자유 지방산의 함량은 NEFA C 방법에 의해 측정되었다. 결과는 난황의 백분율로 표현된다.
도 25는 난황의 Novozymes A/S사의 Lecitase Ultra 포스포리파제로의 효소적 전환을 나타낸 것이다(실시예 4). 반응시간에 따른 리소-레시틴(A), 자유 지방산(C) 및 레시틴(C)의 함량. 오차선은 2반복 측정(n=2)의 표준 오차이다. 레시틴 및 리소레시틴의 함량은 LC/MS-MS에 의해 측정되었고 자유 지방산의 함량은 NEFA C 방법에 의해 측정되었다. 결과는 난황의 백분율로 표현된다.
도 26은 변형된 난황으로부터의 지질 추출물의 TLC 분석(용매는 클로로포름:메탄올:물(65:24:4)임)을 나타낸 것이다. 1: PC 및 LPC 표준물질. 2: 10℃, 240분에서의 본 발명에 따른 지질분해효소, 3: 20℃, 240분에서의 본 발명에 따른 지질분해효소, 4: 53℃, 240분에서의 본 발명에 따른 지질분해효소, 5: 20℃, 1440 분에서의 본 발명에 따른 지질분해효소, 6: 10℃, 4시간에서의 Lecitase Ultra, 7: 20℃, 240분에서의 Lecitase Ultra, 8: 53℃, 4시간에서의 Lecitase Ultra, 9: 20℃, 1440분에서의 Lecitase Ultra, 10: 대조군 표준. TLC 플레이트의 좌측에 기입된 화합물은 콜레스테롤(C), 트리글리세라이드(TG), 디아실글리세라이드(DG), 자유 지방산(FFA), 모노아실글리세라이드(MG), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 리소-포스파티딜에탄올아민(LPE) 및 리소-포스파티딜콜린(LPC)이다.
도 27은 각각 본 발명에 따른 지질분해효소 및 Lecitase Ultra 포스포리파제로의 난황의 효소작용 동안 리소-레시틴과 자유 지방산 내의 변화 사이의 관계를 나타낸 것이다(실시예 4). 결과는 523의 리소-레시틴의 분자량 및 283의 자유 지방산의 분자량에 기반한 것이다. 자유 지방산은 NEFA C 방법에 의해 측정되었다. 리소-레시틴 및 레시틴은 LC/MS-MS에 의해 측정되었다.
도 28은 변형된 난황으로부터의 지질 추출물의 HPTLC 분석(용매는 p-에테르:MTBE:아세트산(50:50:1)임)을 나타낸 것이다(실시예 4). TLC 플레이트의 좌측에 기입된 화합물은 트리글리세라이드(TG), 자유 지방산(FFA), 1,3 디아실글리세라이드(1,3 DG), 1,2 디아실글리세라이드(1,2 DG), 콜레스테롤(C), 모노아실글리세라이드(MG), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 리소-포스파티딜에탄올아민(LPE) 및 리소-포스파티딜콜린(LPC)이다.
도 29는 Sanofa A/S사로부터의 효소-변형된 난황으로 제조된 마요네즈의 TLC 분석(용매 Ⅳ)을 나타낸 것이다(실시예 5).
도 30은 전자렌지에서 열-처리된 Sanofa A/S사로부터의 효소-변형된 난황으로 제조된 마요네즈를 나타낸 것이다. 표본 1은 효소 용액 대신 물이 첨가된 대조군이고, 표본 2는 본 발명의 지질분해효소 30 U/g을 포함하고, 표본 3은 Lecitase Ultra 30 U/g을 포함하였다.
도 31은 본 발명에 따른 지질분해효소 단독 또는 Panodan A2020 DATEM 유화제와 결합하여 다른 농도로 베이크되고 순수 Lipopan FTM 또는 순수 DATEM 뿐만 아니라 Lipopan FTM와 DATEM의 결합에 대해 시험된 하드 크러스티 롤(hard crusty roll)의 특정 빵 부피를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명에 따른 지질분해효소 단독 또는 Panodan A2020 DATEM 또는 SSL P 55 유화제와 결합하여 다른 농도로 베이크되고 순수 Lipopan FTM, 순수 DATEM 또는 순수 SSL P 55 뿐만 아니라 Lipopan FTM/SSL P 55 또는 Lipopan FTM/DATEM의 결합에 대해 시험된 하드 크러스티 롤(hard crusty roll)의 특정 빵 부피를 나타낸 것이다.
도 33은 F. semitectum(IBT 9507)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 5) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호: 4)을 나타낸 것이다. 추론된 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열 위에 나타나 있다. 화살은 cDNA의 증복에 사용된 프라이머를 나타낸다.
도 34는 α-신호 서열(알파 ss)에 융합된 F. semitectum 리파제 유전자(Lipase)를 포함한 한세눌라 발현 벡터 pDB14-alp-sem의 개략도를 나타낸 것이다. AP(R), URA3, 선택을 위한 우라실 보완에 대한 오르티딘-5' 인산-디카르복실라제 유전자, HARS, 한세눌라 내 복제를 위한 자동 복제 서열, FMD-P, 한세눌라 내 발현을 위한 FMD 프로모터.
도 35는 온도에 따른 푸사리움 세미텍툼 IBT9507으로부터의 지질분해효소의 포스포리파제 활성을 나타낸 것이다.
도 36은 pH에 따른 푸사리움 세미텍툼 IBT9507으로부터의 지질분해효소의 포스포리파제 활성을 나타낸 것이다.
도 37은 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 진균성 지질분해효소의 아미노산 서열(서열번호: 1)을 나타낸 것이다.
도 38은 N 말단 신호 서열(밑줄친)을 포함한 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 진균성 지질분해효소의 아미노산 서열(서열번호: 1)을 나타낸 것이다(서열번호: 2).
도 39는 본 발명에 따른 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 진균성 지질분해효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 3)을 나타낸 것이다.
도 40은 푸사리움 세미텍툼 유래의 지질분해효소의 아미노산 서열(서열번호: 4)을 나타낸 것이다.
도 41은 푸사리움 세미텍툼 유래의 지질분해효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 5)을 나타낸 것이다.
도 42는 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소 효소의 아미노산 서열(서열번호: 6)을 나타낸 것이다(EAEA는 본래 α-인자 신호 서열로부터의 프로-펩타이드임).
도 43은 α-인자 신호 서열을 포함한 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소 효소의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 7)을 나타낸 것이다.
(실시예 1) 푸사리움 헤테로스포룸 지질분해효소의 발현, 정제, 서열분석 및 베이킹
발효
푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 균주는 Centraalbureau voor Schimmelcultures(네덜라드)로부터 구입되었다.
생장 배지
글루코스-효모 추출 한천
효모 추출물 4g/L
KH2PO4 1 g/L
MgSO4, 7H2O 0.5 g/L
글루코스 15 g/L
한천 20 g/L
글루코스는 가압증기멸균 후 첨가되었다.
1.4 전-발효 배지
대두 분말 50 g/L
일수화글루코스 50 g/L
KH2PO4 2 g/L
Na2HPO4 3 g/L
대두유 1 g/L
배지는 격벽이 있는 500 mL 진탕 플라스크 내에서 제조되었고 진탕 플라스크 당 100 mL가 첨가되었다. 대두유는 각 플라스크에 개별적으로 첨가되었다.
글루코스는 가압증기멸균 후 첨가되었다.
생성 배지
펩톤 10 g/L
Tween TM-80 12 g/L
MgSO4, 7H2O 2 g/L
CaCl2, 2H2O 0.1 g/L
배지는 격벽이 있는 500 mL 진탕 플라스크 내에서 제조되었고 진탕 플라스크 당 100 mL가 첨가되었다. Tween TM-80은 각 플라스크에 개별적으로 첨가되었다.
pH는 가압증기멸균 전에 6.0으로 적정되었다.
배양 조건
푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83은 글루코스-효모 추출물 한천 플레이트 상 접정되었고, 이는 포자가 발달할 때까지 24℃에서 인큐베이트되었다.
전-발효 배지를 포함한 진탕 플라스크는 포자를 잘 형성하는 배양액을 포함한 한천 플레이트 4 ㎠로 접종되었다. 진탕 플라스크는 30℃ 및 200 RPM으로 인큐베이트되었다. 성장 3일 후 30 생성 배지 진탕 플라스크는 각각 전-발효 진탕 플라스크로부터의 발효 액상배지 5 mL로 접정되었다. 생성 배지 진탕 플라스크는 30℃ 및 200 RPM으로 인큐베이트되었다.
생성 배지 진탕 플라스크는 성장 2, 3 및 4일 후 채취되었다.
생물량은 원심분리 후 Gelman Laboratory로부터의 0.2 ㎛ 필터(VacuCap 90 Filter Unit w/0.2 ㎛ Supor Membrane)를 통해 상청액의 멸균 여과에 의해 제거되었다. 여과 후 여과물은 -80℃에서 동결되었고 분석전까지 보관되었다.
분석 절차
포스포리파제 활성은 상기 기술된 "PLU 분석"에 따라 측정되었다.
적용
TLC 분석
TLC-플레이트는 1/2시간 동안 가열 찬장(110℃) 내에서 활성화되었다.
100 mL 유동 완충액이 덮개가 있는 크로마토그래피 챔버 내로 주입되었다. 용매 증기로 챔버를 포화시키기 위해 챔버 벽이 여과지(Whatman 2)로 도포되었다.
TLC-플레이트는 프레임 내에 놓였고 표본은 바닥에서 2 cm 위의 TLC 플레이트에 도포되었다. 이후 TLC 플레이트는 선택된 유동 완충액으로 TLC 챔버 내에 놓였다. 유동 완충액이 플레이트의 바닥에서 14 cm까지 도달하면 TLC 플레이트가 수거되었고 증기 보드 내에서 건조된 후 10분간 110℃의 가열 찬장에 놓였다.
이후 TLC-플레이트는 현상액에 침수되었고 15분간 110℃의 가열 찬장에 놓였다.
유동-완충액:
Nr.Ⅳ:클로로포름:메탄올:H2O(65:25:4)
Nr.Ⅰ:P-에테르:메틸-터셔리-부틸 에테르(MTBE):아세트산(60:40:1)
현상 완충액(바나듐산염-완충액):
32 g Na2CO3 및 300 mL H2O(1 M)
18.2 g 바나듐산오산화인(V2O5)이 첨가되고 약한 가열로 용해되고 6분간 "BACO-LINE" 오븐에서 베이크되었다.
용액은 대기에서 냉각되었다.
460 mL의 2.5 M H2SO4(460 mL H2O + 61 mL H2SO4)이 조심스럽게 첨가되었다.
물은 1000 mL로 첨가되었다.
가스 크로마토그래피
WCOT 융합된 실리카 컬럼 12.5 m x 0.25 mm TD x 0.1 μm 5% 페닐-메틸-실리콘(Crompack사의 CP SiI 8 CB)로 장착된 Perkin Elmer 8420 Capillary Gas Chromatography.
담체: 헬륨
주입: 분할하여 1.5 ㎕
검출기: FID. 385℃
오븐 프로그램: 1 2 3 4
오븐 온도[℃] 80 200 240 360
등온, 시간[분] 2 0 0 10
온도 비율 [℃/분] 20 10 12
표본 제조: 50 mg의 밀 지질이 내부 표준 헵타데칸, 2 mg/mL을 포함한 12 mL 펩탄:피리딘 2: 1에 용해되었다. 50 ㎕의 표본이 크림프 바이알에 옮겨졌다. 100 ㎕의 MSFA(N-메틸-N-트리메틸실릴-트리플루오르아세트아미드)가 첨가되었고 반 응물은 90℃에서 15분간 인큐베이트되었다.
계산: 모노-디-트리글리세라이드, 자유 지방산 및 갈락토리피드에 대한 반응 인자는 이들 성분의 참고물 혼합물로부터 측정되었다. 이들 반응 인자에 기반하여 반죽 내 지질이 계산되었다.
미니 베이킹 시험
하기 성분이 50 g의 Brabrender 혼합 주발에 첨가되고 30℃에서 5분간 반죽되었다: 밀가루 50 g, 건조 효모 10 g, 설탕 0.8 g, 염 0.8 g, 70 ppm 아스코르브산 및 물(400 Brabrender 유니트의 반죽 농도에). 휴지 시간은 34℃에서 10분이었다. 반죽은 반죽 당 15 g으로 측량되었다. 이후 반죽이 목재 플레이트와 플렉시글라스 프레임 사이에서 회전되는 특정 체에 몰드되었다. 반죽은 34℃에서 45분간 얇게 가공되었고 Voss 가정용 오븐에서 225℃로 8분간 베이크되었다.
베이킹 후 빵은 대기 온도로 20분간 냉각되었다. 빵은 측량되었고 부피는 평지-씨 전치 방법에 의해 측정되었다. 또한 빵은 절단되고 부스러기 및 빵껍질이 평가되었다.
지표 베이킹 시험(하드 크러스트 롤)
밀가루, 데니쉬 리폼(Danish reform) 1500 g, 압축 효모 90 g, 설탕 24 g, 염 24 g, 물 400 Brabrender 유니트 + 2%가 갈고리가 달린 Hobart 믹서에서 저속으로 2분간, 고속으로 9분간 반죽되었다. 반죽 온도는 26℃이었다. 반죽은 1350 g으로 측량되었다. 반죽은 30℃에서 10분간 휴지되었고 Fortuna 몰더 상에서 몰드되었다. 이후 반죽은 34℃에서 45분간 적당히 부풀게 되었다. 반죽은 220℃에서 18분간 Bago-오븐에서 베이크되었고 12초간 증기처리되었다.
냉각 후 롤은 측량되었고 롤 부피는 평지씨 전치 방법에 의해 측정되었다.
특정 빵 부피
Figure 112006054255786-PCT00005
결과 및 토론
발효
발효 표본은 포스포리파제 활성에 대해 분석되었고, 결과는 표 1에 나타나 있다.
발효 결과
ID 생물체 표본 표지 PLU-7
172 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 배지 D 2일 35
173 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 배지 D 3일 33
174 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 배지 4일 26
배지 D = 생성 배지
포스포리파제 활성은 2, 3 및 4일에 거의 동일하게 나타났고, 따라서 모든 표본은 집합되었고 JBS-2254-97-3로 명명되었다.
정제 및 서열분석
음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 비가공 추출물로부터의 포스포리파제의 정제:
컬럼(Q-Sepharose FF5 1.5 X 2.8 cm, 5 mL 겔)이 제조사에 의해 기술된 바와 같이 제조된 후 20 mM tris/HCl 완충액, 0.1 M NaCl, pH 7.5 (완충액 A)으로 평형되었다. 표본(15 mL)이 0.1 M NaCl에 첨가되었고 3.5 mL/분의 유속으로 컬럼에 적용되었다. 지질분해효소는 완충액 A 내에서 0-0.6 M NaCl의 직선 기울기로 용출되었다(도 1 참조). 3.5 mL의 분획이 전체 작동 동안 수집되었다. 각 분획의 10 ㎕이 스팟 플레이트 분석되었다. 리파제 활성은 트리부티린 및 레시틴 스팟 플레이트 분석에 의해 측정되었다(각 분획의 10 ㎕가 구멍으로 옮겨지고 플레이트는 40℃에서 인큐베이트되었음. 아가로스 겔 내의 할로에(haloe) 형성은 시간에 따라 발생함. 효소가 없는 블랭크도 비교를 위해 구멍 중 하나에 첨가되었음). 이후 지질분해 활성을 포함한 분획은 SDS-PAGE(도 2 참조) 및 N-말단 분석되었다.
MALDI-TOF 및 아미노산 서열분석에 의한 효소적 지문분석
단백질은 디티오트레이톨로 환원되었고 시스테인 잔기는 요오드아세트아미드를 이용한 카르복시메틸화에 의해 보호되었다. 단백질은 트립신에 의해 분열되었고 트립신분해 펩타이드의 단편 패턴은 MALDI-TOF 분석에 의해 조사되었다. 펩타이드는 C18-역상 HPLC 컬럼 상에서 크로마토그래피에 의해 분리되었고, 정제 정도는 MALDI-TOF 분에 의해 모니터되었다. 아미노산 서열은 TR6452로 앞서 상세히 기술된 Edman 분해에 의해 측정되었다.
푸사리움 헤테로스포룸 지질분해효소의 전체 아미노산 서열이 측정되었다. 트립신으로의 분해는 매우 특정한 펩타이드를 제공하고, 따라서 MW(MALDI-TOF)이 측정될 수 있었다. 또한 모든 펩타이드에 대한 아미노산 서열은 Edman 분해에 의해 측정되었다. Edman 분해에 의해 측정된 아미노산 서열은 푸사리움 헤테로스포룸 지질분해효소의 폴리펩타이드 사슬의 99.64%를 포함한다.
MALDI-TOF 및 Edman 분해 연구의 요약은 하기 표 2에 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00006
푸사리움 헤테로스포룸 지질분해효소의 완전한 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타나 있다(도 37 참조).
적용 시도
Pool #172-174로 표지된 푸사리움 헤테로스포룸의 3개 표본으로부터의 2 리터 풀이 Amicon Ultra Filtration 유니트 상에서 초미세여과(10 kDa 필터)에 의해 농축되었다. 보전물의 250 ml는 약 100 PLU-7/ml을 포함하였다. 보전물은 1 M 암모늄-아세테이트로 적정되었고 27 ml Butyl Sepharose 컬럼(2.5 cm id) 상에 적용되었고 pH 7.4의 20 mM TEA 내의 1 M NH4-아세테이트 A-완충액 및 pH 7.4의 20 mM TEA B-완충액으로 용출되었다. 정제로부터의 크로마토그램(#61)은 도 3에 나타나 있다.
크로마토그램 #61로부터의 분획은 도 4에 나타난 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석되었다.
이러한 크로마토그래피로부터의 분획 10 mL가 수집되었고 표 3에 나타난 포스포리파제 활성에 대해 분석되었다. 이들 결과는 크로마토그램의 주요 피크 내에서 용출된 분획 내 높은 양의 포스포리파제 활성을 나타낸다. 적은 양의 활성은 컬럼에 결합되지 않고 앞부분에서 용출된다. SDS 겔이 정밀하게 작동되지 않더라도 분획이 일부 단백질을 포함하고 분획 14 및 15는 하나의 주요 밴드를 포함한 것으로 관찰되었고, 이는 진균성 지질분해효소로 예측된다.
크로마토그램 #61 PLU-7
분획 8 32
분획 9 89
분획 10 69
분획 11 51
분획 12 39
분획 13 81
분획 14 23
분획 15 17
크로마토그램 #61로부터의 분획 9 및 분획 14는 미니 베이킹 시험에 사용되었고 또한 비-정제된 pool #72-174는 미니 베이킹 시험에 시험되었다. 이러한 베이킹 실험으로부터의 결과는 표 4에 나타나 있다. 이는 푸사리움 헤테로스포룸로 CBS 782.83으로부터의 정제된 지질분해효소가 개선된 빵 부피 측면에서 매우 우수한 베이킹 결과를 제공함을 명백히 나타낸다. 또한 빵의 부스러기 구조는 도 5에 나타난 바와 같이 푸사리움 헤테로스포룸 지질분해효소에 의해 매우 우수하게 개선되었고 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia) #3044로부터의 리파제보다 우수한 것으로 조사되었다.
표본 효소 PLU-7/50 g 밀가루 빵 부피, mL/g
1 Chr #61 분획 9 100 U 4.33
2 Pool #172 100 U 4.33
3 Chr #61 분획 14 100 U 4.60
4 대조군 0 3.29
5 리파제, #3044 40 ppm 4.38
이러한 미니-베이킹 실험으로부터의 반죽은 물-포화-부탄올로 추출되었고 지질은 TLC에 의해 분석되었다. TLC 분석은 리파제 #3044가 푸사리움 헤테로스포룸으로부터의 지질분해효소 표본보다 트리글리세라이드 상에 더욱 활성적인 것으로 확인되었다. 용매 Ⅳ 내의 TLC는 성분(DGMG)를 나타내고, 이는 리파제 #3044로 가수분해시킨 트리글리세라이드와 비교시 푸사리움 헤테로스포룸으로 처리된 반죽 지질 표본에서 명백하게 더 높다.
또한 푸사리움 헤테로스포룸으로부터의 정제된 분획은 표 5에 나타난 결과로 지표 베이킹 실험에서 시험되었다.
지표 베이킹 시험시 푸사리움 헤테로스포룸으로부터의 정제된 크로마토그래피 분획의 이용 및 빵 부피 상의 효과
번호 특정 부피 (ccm/g)
1 대조군 5.11
2 500U F. het. Pool #172-#174 6.28
3 1000U F. het. Pool #172-#174 6.79
4 400 ppm #3044 (슈도모나스) 5.27
5 2000U F. het. Pool #172-#174 6.24
6 4000U F. het. Pool #172-#174 4.95
7 1000U 2254-97 C61 6.95
8 400 ppm #3016 (LipopanFTM) 6.97
이러한 베이킹 시험으로부터의 반죽은 물-포화-부탄올로 추출되었고 반죽 지질은 표 6에 나타난 결과로 GLC 분석되었다.
반죽 지질의 GLC 분석. GL = 글리세롤. FFA = 자유 지방산. MGMG = 모노갈락토실모노글리세라이드. DAG = 디글리세라이드. DGMG = 디갈락토실모노글리세라이드. MGDG = 모노갈락토실디글리세라이드. DGDG = 디갈락토실디글리세라이드. TRI = 트리글리세라이드
GL FFA MGMG DAG DGMG MGDG DGDG TRI
대조군 0.120 0.152 0.0015 0.0771 0.0195 0.0644 0.172 0.770
500U F. het. Pool #172-#174 0.121 0.250 0.012 0.059 0.057 0.030 0.139 0.792
1000U F. het. Pool #172-#174 0.121 0.277 0.018 0.056 0.087 0.010 0.102 0.738
400 ppm #3044 0.127 0.368 0.002 0.132 0.022 0.066 0.173 0.276
2000U F. het. Pool #172-#174 0.122 0.320 0.018 0.060 0.119 0.013 0.062 0.723
4000U F. het. Pool #172-#174 0.128 0.332 0.021 0.065 0.146 0.010 0.033 0.739
1000U 2254-97 C61 0.125 0.287 0.019 0.067 0.088 0.016 0.099 0.655
400 ppm #3016 0.124 0.284 0.017 0.058 0.086 0.014 0.101 0.723
트리글리세라이드 가수분해와 비교시 DGDG 가수분해의 비율은 표 7에 나타나있다.
또한 갈락토리피드의 GLC 분석이 도 6에 그래프로 나타나 있다.
GLC 결과는 푸사리움 헤테로스포룸에 의해 반죽 내에서 생성된 DGMG의 양이 40 ppm LipopanFTM에 의해 생성된 양보다 더 높음을 확인하였다. 또한 결과는 DGDG보다 MGDG의 더 높은 정도의 가수분해를 나타낸다. 또한 결과는 P. cepacia로 부터의 #3044와 유사한 일반 트리글리세라이드-가수분해 효소와 비교시 가수분해된 트리글리세라이드의 함량이 낮음을 나타낸다. 지표 규모 베이킹 결과 및 지질 분석은 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83으로부터의 지질분해효소가 반죽 내 명백한 디갈락토실디글리세라이드(DGDG) 상의 가수분해 활성 및 디갈락토실모노글리세라이드(DGMG)의 형성을 지님을 확인시켰다.
푸사리움 헤테로스포룸로부터의 정제된 크로마토그래피 분획의 트리글리세라이드 가수분해 대비 DGDG 가수분해의 비율
dTRI dDGDG dDGDG/dTRI
대조군
500U F. het. Pool #172-#174 0 0.033 n/a
1000U F. het. Pool #172-#174 0.032 0.07 2.19
400 ppm #3044 0.494 0 n/a
2000U F. het. Pool #172-#174 0.047 0.11 2.34
4000U F. het. Pool #172-#174 0.031 0.139 4.4
1000U 2254-97 C61 0.115 0.073 0.63
400 ppm #3016 0.047 0.071 1.5
4. 결론
본 연구에서 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83로부터의 진균성 지질분해효소가 진탕 플라스크 내에서의 형성에 의해 제조되었다. 본 효소는 정제되었고 아미노산 서열은 측정되었다. 본 효소는 F. oxysporum(LipopanFTM)로부터의 통상의 리파제에 대해 약 83% 상동성을 지닌다. 효소는 개선된 빵 부피 및 개선된 부스러기 구조의 측면에서 베이킹 시도에 매우 우수한 결과를 제공하였다. 반죽으로부터의 지질 분석은 본 효소가 갈락토모노글리세라이드의 생성 동안 갈락토리피즈 상에 활성적임을 확인시켰다. 용량의 어떠한 최적조건 없이 베이킹 결과는 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83로부터의 진균성 지질분해효소가 통상의 효소 LipopanFTM와 동일한 적어도 동일함을 나타내고, 트리글리세라이드에 대한 비교 DGDG 활성은 본 효소가 LipopanFTM와 비교시 반죽 환경 내에서 우수한 효소 활성을 지님을 나타낸다.
(실시예 2) 한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha ) 내에서의 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83)으로부터의 지질분해효소를 인코드하는 합성 유전자의 구축 및 발현
푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83)로부터의 진균성 지질분해효소의 아미노산 서열이 측정되었고 한세눌라 폴리모르파 내에서의 합성 지질분해효소를 고안하고 클론하는데 사용되었다. 높은 발현을 부여하기 위해 합성 유전자의 코돈이 한세눌라 폴리모르파의 코돈 우선권에 따라 최적화되었다. 코돈 최적화 알파-인자 신호 서열이 합성되었고 합성 지질분해효소 유전자 전면에 클론되었다. 조립된 컨스트럭트는 발현 벡터 pB14 내로 전이되었고 한세눌라 폴리모르파 내로 형질전환되었다. pB14는 항생제 저상성 부여 유전자가 없는 플라스미드이고 따라서 생산 시설에 사용될 수 있다.
많은 지질분해효소 생성 푸사리움 균주가 트리글리세라이드와 비교시 갈락토리피드 및/또는 인지질 상에 높은 비율의 활성을 지닌 것에 대해 선별되었다.
여러 균주가 목적 지질분해효소를 생성하는 것으로 선택되었다. 이들 중에 하나가 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83)이다. 따라서 이러한 균주로부터의 지질분해효소가 분리되었고 아미노산 서열이 측정되었다. 아미노산 서열은 한세눌라 폴리모르파 내에서의 발현을 위한 합성 유전자를 고안하고 구축하는데 사용된 핵산 서열로 역으로 번역되었다.
실험
본 연구에 사용된 한세눌라 균주는 Rhein Biotech GmbH(Dusseldorf, 독일)로부터 구입된 우라실-영양요구성 한세눌라 폴리모르파 균주 RB11(odc1)이었다.
MALDI0-TOF에 의한 효소적 지문분석 및 아미노산 서열분석
지질분해효소 활성을 지닌 단백질이 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83)로부터 분리되었다. 단백질은 디티오트레이톨로 환원되었고 시스테인 잔기는 요오드아세트아미드를 이용한 카르복시메틸화에 의해 보호되었다. 단백질은 트립신에 의해 분열되었고 트립신분해 펩타이드의 단편 패턴은 MALDI-TOF 분석에 의해 조사되었다. 펩타이드는 C18-역상 HPLC 컬럼 상에서 크로마토그래피에 의해 분리되었고, 정제 정도는 MALDI-TOF 분에 의해 모니터되었다. 아미노산 서열은 TR6452로 앞서 상세히 기술된 Edman 분해에 의해 측정되었다.
합성 지질분해효소 유전자의 고안 및 구축
펩타이드 단편의 아미노산 서열은 푸사리움 헤테로스포룸의 일본 균주(Nagao et al. 1994)와의 정렬에 의해 배열되었다. 이렇게 수득된 완전한 아미노산 서열은 모든 가능한 코돈을 나타내기 위해 핵산 서열로 역으로 번역되었다. 각 코돈에 있어서 한세눌라 폴리모르파 내 발현에 가장 적당한 코돈이 한세눌라 폴리모르파 내에서 발현되는 유전자의 코돈 우선권 표에 따라 선택되었다. 각각 약 100 뉴클레오타이드 길이의 완전한 유전자를 포함한 합성 올리고뉴클레오타이드가 합성되었고, 본 유전자는 PCR에 의해 조립되었다. 유전자의 최종 증폭을 위해 프레임 융합을 가능하게 하도록 알파-인자 신호 서열의 3'-말단으로부터 최대 5' 뉴클레오타이드로 고안된 업스트림 프라이머(apls.cbss) 및 클로닝 목적을 위한 Bam HI 제한 효소 사이트로 고안된 다운스트림 프라이머(cbss.t)가 사용되었다(표 8).
효모 알파 교배 인자로부터의 신호 서열을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열이 올리고뉴클레오타이드에 의해 적당한 코돈으로 유사하게 합성되었고 PCR에 의해 증폭되었다. 알파-신호 서열의 최종 증폭을 위해 클로닝 목적을 위한 Eco RI 제한 효소 사이트로 고안된 업스트림 프라이머(alpsynt) 및 프레임 융합을 가능하게 하도록 합성 지질분해효소 유전자의 5'-말단으로부터 최대 5' 뉴클레오타이드로 고안된 다운스트림 프라이머(cbss.apls)가 사용되었다(표 8).
합성 알파-인자 신호 서열을 합성 지질분해효소에 융합시키기 위해 2개의 단편이 혼합되었고 외부 프로모터 alpsynt 및 cbss.t로 재-증폭되었다(표 8). PCR 생성물은 벡터 pCR 2.1-TOPO(Invitrogen) 내로 클론되었고 삽입물의 뉴클레오타이드 서열이 BigDye Terminator v3.0 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems) 및 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)를 이용하여 측정되었다.
Figure 112006054255786-PCT00007
한세눌라 폴리모르파 내 지질분해효소의 발현
한세눌라 내에서 합성 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 지질분해효소 유전자를 발현시키기 위해 결합된 알파-신호 서열/지질분해효소 유전자가 항생제 저항성을 부여하는 유전자가 없는 플라스미드인 한세눌라 발현 벡터 pB14 내로 FMD-프로모터 후면에 삽입되었다. E. coli 내에서 조립된 프로모터의 예측되는 구조의 정합 후 플라스미드는 일렉트로포레이션에 적격 한세눌라 폴리모르파 세포 내로 형질전환되었다. 형질전환체는 YND 플레이트 상에서 선택되었고 콜로니는 YND의 액체 배지 내에서 1:200의 희석의 3 및 8 계대에 의해 유전자의 다중 도입에 대해 더욱 선택되었다. 최종적으로 선택된 배양액은 YPD 배지 내로 2회 옮겨짐으로서 안정화되었다. 높은 발현체를 더욱 선택하기 위해 높은 수준의 발현을 나타내는 각 배양액이 단일 콜로니에 대해 플레이트되었고, 이들 각각은 발현 수준에 대해 분석되었다.
지질분해효소 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 선택된 클론이 24℃에서 2일간 1.8% 글리세롤 및 0.2% 글루코스를 지닌 YPD 내에서 성장되었다.
효소 활성
배양 배지 표본은 기질로서 레시틴 또는 DGDG로 지질분해효소 활성에 대해 분석되었고 유리 자유 지방산의 측정을 위해 마이크로 역가에 대해 적당한 부피로 규모 축소된 NEFA 키트(Roche)를 이용하여 분석되었다.
결과
MALDI-TOF에 의한 효소적 지문분석 및 아미노산 서열분석
푸사리움 헤테로스포룸 지질분해효소의 전체 아미노산 서열이 측정되었다(서열번호: 1 - 도 37 참조). 트립신으로의 분해는 MW(MALDI-TOF)가 결론적으로 측정될 수 있는 매우 특이적인 펩타이드를 제공하였다. 모든 펩타이드에 대한 아미노산 서열도 Edman 분해에 의해 측정되었다. Edman 분해에 의해 측정된 아미노산 서열은 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 지질분해효소의 폴리펩타이드 사슬의 99.64%를 포함한다. 모든 펩타이드의 아미노산 서열은 푸사리움 헤테로스포룸의 일본 균주(Nagao et al. 1994 J. Biochem. 116: 536-540)의 리파제와 정렬되었고 따라서 성숙 단백질의 아미노산을 확인시키는 펩타이드의 순서를 나타내었다. 정렬은 도 7에 나타나 있다. MALDI-TOF 및 Edman 분해의 요약은 Nagao 서열로의 정렬에 따른 펩타이드 순서로 표 9에 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00008
다른 푸사리움 리파제의 확인
푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 지질분해효소의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열과 다른 푸사리움 리파제로부터의 서열과의 정렬은 푸사리움 리파제들 사이의 관계를 나타낸다(표 10).
다른 푸사리움 리파제와 비교시 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 지질분해효소의 아미노산 및 뉴클레오타이드 증명
리파제 증명 푸사리움 헤테로스포룸 (Nagao 상동) 푸사리움 옥시포룸 (LipopanFTM)
푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 아미노산(서열번호: 1) 58.7% 85.1%
푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 아미노산(서열번호: 1) 61.8% 69.2%
지질분해효소 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드 및 알파-신호 서열의 PCR에 의한 혼합 및 증폭은 DNA 단편을 유발하였고, 이는 클론되고 서열분석되었다. 정확한 서열을 포함한 단편이 표 8에 나타난 프라이머를 이용한 재-증폭에 의해 완전한 유전자를 조립하는데 사용되었다. 조립된 뉴클레오타이드 서열은 그의 번역된 아미노산 서열과 함께 도 8에 나타나 있고, 사용된 프라이머는 화살표로 나타나 있다.
조립된 유전자 컨스트럭트를 포함한 DNA 단편은 도입된 제한 효소 사이트를 이용하여 한세눌라 발현 벡터 pB14로 전이되었다. 수득된 플라스미드 pB14-alps.cbss는 도 9에 개략적으로 나타나 있다.
선택된 클론 내 진균성 지질분해효소 활성의 발현
선택 과정을 통한 클론은 지질분해효소의 발현에 대해 분석되었다. 2일 배양액의 상청액 10 ㎕ 표본은 10분간 DGDG 또는 레시틴으로 인큐베이트되었고 이들 반응액의 10 ㎕가 NEFA 키트로 분석되었다. 클론 3개의 단일 콜로니 분리 후 결과가 도 10에 나타나 있다.
푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 균주로부터의 지질분해효소의 아미노산 서열이 측정되었고 이러한 지질분해효소를 인코드하는 합성 유전자가 구축되었고 한세눌라 폴리모르파 내 발현을 위해 최적화되었다. 성숙 효소를 인코드한 유전자가 효소 교배 알파-인자로부터 유래한 합성 신호 서열과 융합되었다. 알파-신호 서열과 한세눌라 pB14 벡터의 FMD 프로모터와의 결합은 푸사리움 리파제의 발현에 적당하게 앞서 나타나 있다.
(실시예 3) 한세눌라 폴리모르파 내 푸사리움 헤테로스포룸(CBS 782.83) 지질분해효소의 발현 및 베이킹 시험시 생성물의 특성
사상 진균 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83으로부터의 지질분해효소-인코딩 유전자를 포함한 한세눌라 폴리모르파 균주 B14:8-3,8(DCDK0172)이 유가식(fed-batch mode)으로 발효되었다. 발효 160시간 후 포스포리파제 활성은 1200 U/mL에 도달하였다. 발효에 기반하여 3개 생성물이 생성되었고 다시 시험되었다. 생성물은 하기와 같이 명명되었다: 표본 205, -206 및 -209.
한세눌라 폴리모르파 내에서 발현된 푸사리움 헤테로스포룸로부터의 지질분해효소 표본 205는 소규모 베이킹 실험에 시험되었다. 베이킹 실험으로부터의 반죽은 GLC 및 HPTLC에 의해 분석되었다.
소규모 베이킹으로부터의 베이킹 결과는 지질분해효소 표본 205의 빵 부피 상의 매우 우수한 개선 및 부스러기 구조의 개선을 확인시켰다.
지질분해효소 분석은 디갈락토실모노글리세라이드(DGMG)의 축적과 동반된 디갈락토실디글리세라이드(DGDG) 상의 지질분해효소 표본 205의 강한 가수분해 활성을 확인시켰다.
본 효소는 반죽 내 트리글리세라이드 상에 단지 적은 정도의 활성을 지녔다.
표본 206 및 209는 지표 규모 베이킹 시험에서 시험되었고 증가된 빵 부피 및 개선된 부스러기 구조에 대해 지질분해효소의 우수한 베이킹 성능을 확인시켰다. 베이킹 시험으로부터 표본 206은 직선상 반죽 절차 내에서 표본 209와 비교시 더 좋은 한 입 분량을 수행함을 나타내었으나 2개의 제품은 서로 직접 비교시 그렇지 않았고 더 많은 베이킹 시험이 이를 확인시켜야 한다.
2. 실험
발효
미생물
실시예 2에 기술된 바와 같이 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83을 포함한 프로모터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르 균주가 본 연구에 사용되었다. 컨스트럭트에 사용된 프로모터는 한세눌라 폴리모르로부터의 포름산염 탈수소효소 프로모터이었다.
생장 배지 및 배양 조건
YNB-글리세롤 배지
진탕 플라스크 내에서 생물 반응로 발효 및 생장용 접종물 제조시 사용되는 배지는: 1.7 g/L Yeast Nitrogen Base(DIFCO5 Detroit, 미국, 0335-15-9), 5 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L 글리세롤 및 완충액으로서 0.1 M 2-[N-모르폴리노제탄술폰산(morpholinojethanesulfonic acid, MES)를 포함하였다. pH(MESt의 pKa)는 4 M NaOH로 6.1로 적정되었다(가압증기멸균 전에). Yeast Nitrogen Base 및 (NH4)2SO4는 가압증기멸균 후 배지로 여과-멸균되었다. 이러한 배지는 진탕 플라스크 내에서 생장용으로 사용되었다(500 mL의 총 부피의 진탕 플라스크 내 250 mL 배지).
영양 배지는 570 g/kg 글리세롤, 120 g/kg 포름산 및 95 g/kg Bacto 트립톤을 포함하였다.
pH는 25% (w/v) NH3-물을 첨가함으로서 조절되었다.
발효는 가정용 6L 발효기 내에서 유가식으로 수행되었다. 하기 발효 조건이 사용되었다: pH 5, 통기 1 vvm, 온도 26℃ 및 400∼700 rpm의 교반.
발효기는 약 10의 OD-600을 지니고 25℃ 및 180 rpm으로 생장된 YNB-글리세롤 배양액 2*250 mL로 접종되었다.
발효시 영양분 유속은 축적된 CO2 방출에 의해 조절되었고 하기 방정식에 기반하였다.
영양분 - 유속[g/h] = 0, AcCO 2 < 0.45
영양분 - 유속{g/h] = 1.33·V·AccCO 2 ,0.45≤AccCO 2 ≤3.25
양양분 - 유속[g/h] = 4.33·V,3.25≤AccCO 2
V : 발효 액체배지 부피[L]
AccCO 2 : 축적된 CO2 방출 [몰]
채취
발효는 16000 x g에서의 10분간 원심분리후 German Laboratory사의 0.2 ㎛ 필터(VacuCap 90 Filter Unit w 0.8/0.2 ㎛ Supor Membrane)를 통한 상청액의 멸균 여과에 의해 채취되었다.
분석 절차
리파제 활성의 측정
발효 표본(10 mL)은 9000 x g로 10분간 원심분리되었고 상청액이 앞서 기술된 "PLU 분석"에 따라 포스포리파제의 분석에 사용되었다.
생물량 생장
배양액 내의 생물량 농도는 미리 측량된 컨테이너 내에서 10 mL의 배양액을 9000 x g로 10분간 원심분리함으로서 측정되었다. 원심분리후 상청액이 회수되었고 생물량은 100℃에서 24시간 동안 건조된 후 측량되었다. 생물량 농도는 배양액 L 당 세포의 g 건중량으로 계산되었다.
효소 특성화 및 미니 베이킹
효소 및 밀가루
표본 205 : HET0401로부터의 표본 7(161시간 발효)
포스포리파제 Lipopan F, #2938
밀가루: Reform 2003055
미니베이킹
하기 성분이 50 g Brabrender 혼합 주발에 첨가되었고 30℃에서 5분간 반죽되었다: 밀가루 50 g, 건조 효모 10 g, 설탕 0.8 g, 염 0.8 g, 70 ppm 아스코르브산 및 물(400 Brabrender 유니트의 반죽 농도에). 휴지 시간은 34℃에서 10분이었다. 반죽은 반죽 당 15 g으로 측량되었다. 이후 반죽이 목재 플레이트와 플렉시글라스 프레임 사이에서 회전되는 특정 체에 몰드되었다. 반죽은 34℃에서 45분간 얇게 가공되었고 Voss 가정용 오븐에서 225℃로 8분간 베이크되었다.
베이킹 후 빵은 대기 온도로 20분간 냉각되었다. 빵은 측량되었고 부피는 평지-씨 전치 방법에 의해 측정되었다. 또한 빵은 절단되고 부스러기 및 빵껍질이 평가되었다.
지질 추출
충분히 가공된 반죽 10 g이 즉시 냉동되고 동결 건조되었다. 동결-건조된 반죽은 커피 제분기로 제분되었고 800 마이크론 체를 통과하였다. 1.5 g의 동결-건조된 반죽이 마개가 있는 15 mL 원심분리관 내로 측량되었다. 물 포화된 부탄올(WSB) 7.5 ml이 첨가되었다. 원심분리관은 10분간 끓인물 수조에 놓였다. 시험관은 Rotamix에 놓였고 대기 온도에서 20분간 45 rpm으로 회전되었다. 이후 10분간 다시 끓인물 수조에 놓였고 대기 온도에서 30분간 Rotamix를 가동시켰다. 시험관은 5분간 3500 g에서 원심분리되었다. 5 ml 상청액이 바이알로 옮겨졌다. WSB는 질소 증기 하에서 건조상태로 증발되었다.
가스 크로마토그래피
가스 크로마토그래피가 상기 실시예 1의 분석 절차조건 하에서 기술된 바와 같이 수행되었다.
HPTLC
장착기: LINOMAT 5, CAMAG 장착기
HPTLC 플레이트: 10 x 10 cm, Merck no. 1.05633
플레이트는 사용전에 180℃에서 20∼30분간 오븐에서 건조되었다.
적용: LINOMAT 5 장착기를 이용하여 CHC13:MeOH85:15 내의 1% 용액 l.O ㎕가 HPTLC 플레이트에 적용됨.
유동-완충액:
No. Ⅳ:클로로포름:메탄올:H2O(65:25:4)
No. Ⅰ: P-에테르:메틸-터셔리-부틸에테르(MTBE):아세트산(60:40:1)
적용/용출 시간: 유동 완충액 Ⅰ로 11분간, 유동 완충액 Ⅳ로 18분간.
플레이트는 180℃에서 10분간 오븐에서 건조되었고, 냉각되었고 16% H3PO4 내의 6% 아세트산구리로 발색되었다. 180℃에서 추가 10분간 건조되었고 직접 평가되었다.
베이킹 시험
시험 제품:
#3016 - 8700 LIPU/g 함유 Lipopan F
ID 균주/숙주 발효
표본 206 390 LIPU/g 함유 F. heterosporum/H. polymorpha
HET0401+HET0402
표본 209 950 LIPU/g 함유 F. heterosporum/H. polymorpha
HET0410
조리법:
Reform 밀가루:2003159로 수행된 하드 크러스티 롤
베이커 % 양, g
밀가루-reform 2003159 100 2000
물 58.5 1170
압출 효모 6 120
염 1.6 32
설탕 1.6 32
아스코르브산 lO ppm 0.02
표준 알파-아밀라제
GRINDAMYL™ A 1000 90 ppm 0.180
베이킹 절차:
Diosna 믹서 시스템
ㆍ 1분 느리게 건조 혼합
ㆍ 2분 느리게 + 4분 빠르게 혼합
ㆍ 반죽 온도: 26℃
ㆍ 측량: 1350 g
ㆍ 휴지: 가열 캐비닛 내에서 30℃로 10분
ㆍ 주형: Fortuna 3/17/7
ㆍ 가공: 34℃, 85% RH로 45분
ㆍ 베이킹: Bago 오븐: 220℃에서 13분, 13초 증기 + 5분 댐퍼 개방
ㆍ MIWE 스톤 데크: prog. nr 1
ㆍ 베이킹 후 롤은 측량 및 부피 측정정전 25분간 냉각됨.
결과 및 토론
발효 생리학 및 포스포리파제 생성
트립톤의 배치 및 HET0410의 영양분 배지로의 첨가는 HET0401-0402와 비교시 생물량의 빠른 생성 및 생물량의 높은 최종 수준을 유발하였다.
HET0401 및 HET0402는 포스포리파제 활성 발달에 대해 거의 동일한 반면 포스포리파제 생산성은 HET0410에서 유의적으로 높다.
채취
발효는 발효 168시간 후(HET0401-0402) 및 161시간 후(HET0410) 채취되었다. 생성물은 베이킹 시험에 사용되기 전까지 4℃에서 유지되었다. HET0401의 생성물 일부는 표본 205로 명명되었고 약 700 PLU-7/mL을 포함하였다. HET0401 및 HET0402로부터의 생성물 일부가 집합되었고 표본 206으로 명명되었다. 이러한 생성물은 약 390 PLU-7/mL을 포함하였다. HET0401 및 HET0402의 최종 생성물과 비교시 표본 206의 낮은 효소 활성은 보관 및 멸균 여과에 의해 유발된 것이다. HET0410의 생성물은 표본 209로 명명되었고 950 PLU-7/mL을 포함하였다.
효소 특성화 및 미니 베이킹
발효 HET0401로부터의 지질분해효소 표본 205이 미니베이킹 실험에 시험되었다.
다른 용량으로 대조군 및 Lipopan FTM과 비교되었다. 이러한 베이킹 시험으로부터의 빵의 특정 빵 부피는 표 11에 나타나 있다. 빵 사진은 도 11에 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00009
베이킹 결과는 빵 부피의 개선 상의 표본 205의 매우 우수한 효과를 확인시켰고 부피 효과는 표준 용량 40 ppm의 Lipopan FTM보다 우수하였다.
또한 도 11로부터 표본 205가 부스러기 구조 및 색에서의 우수한 개선에도 기여함이 나타났다.
이러한 베이킹 실험으로부터의 충분히 가공된 반죽이 동결-건조되었고 물 포화된 부탄올로 추출되었고 분리된 지질은 GLC 및 HPTLC에 의해 분석되었다.
반죽 지질의 GLC 분석(표 12)은 디갈락토실모노글리세라이드(DGMG)의 축적과 수반된 디갈락토실디글리세라이드(DGDG) 상의 지질분해효소 표본 205의 가수분해 효과를 확인시켰다. DGDG(mmol% = mmol/100 g 동결-건조 반죽) 및 DGMG(mmol%)의 총 몰수는 증가된 효소 용량에서 일정하게 유지되기 때문에 DGMG 상의 효소 활성은 매우 낮다(도 12). 또한 GLC 결과는 트리글리세라이드 상의 표본 205의 매우 낮은 활성을 나타낸다.
반죽 지질의 GLC 분석. FFA = 자유 지방산. MGMG = 모노갈락토실모노글리세라이드. DGMG = 디갈락토실모노글리세라이드. MGDG = 모노갈락토실디글리세라이드. DGDG = 디갈락토실디글리세라이드. TRI = 트리글리세라이드
표본(S-) % % % % % % mmol% mmol% mmol%
FFA MGMG DGMG MGDG DGDG TRI DGMG DGDG DGMG+ DGDG
0 U S-205 0.232 0.002 0.013 0.214 0.214 0.641 0.034 0.228 0.262
200 U S-205 0.321 0.007 0.038 0.193 0.193 0.660 0.074 0.205 0.279
500 U S-205 0.384 0.012 0.021 0.132 0.132 0.610 0.101 0.140 0.241
1000 U S-205 0.418 0.014 0.008 0.087 0.087 0.614 0.173 0.093 0.265
1500 U S-205 0.444 0.016 0.011 0.057 0.057 0.600 0.206 0.060 0.267
2000 U S-205 0.438 0.026 0.011 0.039 0.039 0.594 0.218 0.041 0.259
5000 U S-205 0.456 0.022 0.011 0.012 0.012 0.533 0.252 0.013 0.264
10000 U S-205 0.453 0.017 0.013 0.009 0.009 0.547 0.241 0.010 0.251
40 ppm Lipopan F 0.372 0.017 0.027 0.134 0.134 0.577 0.114 0.142 0.256
mmol% = mmol/100 g 동결-건조 반죽
베이킹 결과 및 지질 분석 비교시 최상의 베이킹 효과는 DGDG의 DGMG로의 완전한 가수분해에 의해 수득되지 않음이 관찰되었으나 결과는 DGDG의 DGMG로의 부분적 가수분해가 최상의 베이킹 성능을 제공함을 나타냈다.
높은 효소 용량은 많은 DGMG를 생성할 뿐만 아니라 부정적인 베이킹 효과를 제공하는 것으로 예측되는 많은 자유 지방산이 생성되고 이는 왜 DGDG의 부분적 가수분해만이 바람직한지에 대한 또다른 설명이 된다. 표 13은 표 12로부터 계산된 DGDG와 트리글리세라이드 가수분해 비율을 나타낸다. 결과는 최상의 베이킹 성능이 트리글리세라이드 활성에 대한 DGDG의 비율이 최상인 용량인 경우 수득됨을 나타낸다.
반죽 지질의 GLC 분석으로부터의 DGDG 및 트리글리세라이드 가수분해의 비율
표본(S-) dTRI dDGDG dDGDG/dTRI 빵 부피
mL/g
0 U S-205 3.56
200 U S-205 0 0.023 3.98
500 U S-205 0.031 0.088 2.84 4.87
1000 U S-205 0.027 0.135 0.030 5.05
1500 U S-205 0.041 0.168 4.1 5.13
2000 U S-205 0.047 0.187 3.98 4.82
5000 U S-205 0.108 0.215 1.99 5.05
10000 U S-205 0.094 0.218 2.3 4.51
40 ppm Lipopan F 0.064 0.086 1.34 4.57
지질 표본의 일부는 도 13에 나타난 바와 같이 HPTLC에 의해서도 분석되었다. 표본 4, 5 및 6은 베이킹 실험으로부터의 반죽 지질이다. HPTLC 분석은 지질분해효소 표본 205에 의한 DGDG의 가수분해 및 DGMG의 형성을 확인시켰다.
상기 기술된 분석을 이용한 Lipopan F 및 표본 209의 상대 극성 지질:트리글리세라이드 활성 비율은:
인지질/트리글리세라이드(PLU/LIPU) Lipopan F = 3
표본 209 = 9
갈락토리피드/트리글리세라이드(GLU/LIPU) Lipopan F = 1
표본 209 = 4
푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 지질분해효소는 빵 부피의 우수한 증가 및 부스러기 구조의 개선으로 소규모 베이킹 실험에서의 매우 우수한 효과를 제공하였다. 지질 분석은 DGMG의 축적을 수반하여 반죽 내의 DGDG 상의 강한 가수분해 활성을 확인시켰다. 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 지질분해효소는 반죽 내 트리글리세라이드 상에 낮은 활성을 나타내었다.
(실시예 4) 지질 구조 상의 활성의 특성화 및 한세눌라 폴리모르파에서 발현되는 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 지질분해효소의 위치 특이성
푸사리움 헤테로스포룸로부터의 본 발명에 따른 지질분해효소는 실시예 3에 기술된 바와 같이 한세눌라 폴리모르파에서 발현되었다.
분석 절차
포스포리파제 활성은 전술된 PLU 분석을 이용하여 측정되었다.
갈락토리파제 활성은 전술된 갈락토리파제 분석을 이용하여 측정되었다.
트리글리세라이드 상의 활성은 전술된 LIPU 분석을 이용하여 측정되었다.
해바라기유 상의 활성(LUSol, pH-stat pH 6):
시약:
8.4 g 아라비아고무가 100 ml 탈이온수에 용해되고 30 mM CaCl2 100 ml가 첨가된다. 36 g 해바라기유가 Turrax 혼합기(20000 rpm)로 혼합시키면서 천천히 첨가된다.
분석:
베이커 내 20 ml 해바라기유 에멀젼이 5분간 30℃에서 평형화된다. pH는 pH stat를 이용하여 6.3∼6.5로 적정된다. 2 ml 효소 용액이 첨가되고 0.05 N NaOH가 pH를 6.5로 유지시키면서 10분간 연속적으로 첨가된다. 시간 함수에 따른 0.05 N NaOH의 첨가에 대한 곡선 기울기가 계산된다.
1 LUSol은 효소 양으로 정의되고, 이는 분석 조건 하에서 분 당 1 μmol 지방산을 유리시킬 수 있다.
지질분해효소는 상기 기술된 절차에 따라 다른 기질 상의 활성에 대해 분석되었다. 결과는 표 14에 나타나 있다.
본 발명에 따른 푸사리움 헤테로스포룸 지질분해효소의 다른 지질 기질 상의 활성
활성 기질 pH 온도 유니트/ml
LIPU 트리부티린 5.5 30 754
LUSol 해바라기유 6.5 30 48
PLU-7 포스파티딜콜린 7 37 4650
GLU 디갈락토실디글리세라이드 7 37 1600
한세눌라 폴리모르파 내에서 발현된 푸사리움 헤테로스포룸으로부터의 지질분해효소는 반죽 내의 갈락토리피드 및 인지질의 sn-1 위치의 1차 지방산을 가수분해한다. 효소의 특이성은 빵 반죽에 다른 농도의 효소를 첨가함으로서 조사되었다. 충분히 가공된 반죽이 냉동되고 동결 건조되었고, 반죽 지질은 물 포화된 부탄올로 추출되었다.
반죽 지질은 GLC 및 HPLC 분석에 의해 분석되었다.
GLC 분석에 의해 디갈락토실디글리세라이드(DGDG) 및 디갈락토실모노글리세라이드(DGMG) 분석이 가능하였다. 또한 디갈락토실모노글리세라이드의 이성체(1:디갈락토실 1-모노글리세라이드 및 2:디갈락토실 2-모노글리세라이드, 하기 구조 참조)의 위치 분석이 가능하였다. 이들 성분은 GLC에 의해 분리되고 정량화되었다.
1: R1 = H 및 R2 = 지방 아실기
Figure 112006054255786-PCT00010
2: R1 = 지방 아실기 및 R2 = H
Figure 112006054255786-PCT00011
하드 크러스트 롤의 제조에 대한 베이킹 시험시 다른 용량의 지질분해효소가 첨가되었고 충분히 가공된 반죽 내의 갈락토리피드가 분석되었다. 디갈락토실모노글리세라이드의 이성체 함량은 표 15에 나타나 있고 도 15에 그래프로 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00012
결론
표 15 및 도 14의 결과로부터 디갈락토실디글리세라이드가 디갈락토실 2-모노글리세라이드의 생성동안 1-위치에서 1차로 가수분해되는 것으로 나타났다. 지질 내의 아실 지방산의 2 위치에서 1 위치로의 아실기 이동이 발생할 것임이 잘 알려져 있다. 이러한 아실기 이동은 온도에 따라 달라지고 시간에 따라서 디갈락토실-2-모노글리세라이드 및 디갈락토실 1-모노글리세라이드 사이의 평형이 발생할 것이다. 이러한 현상은 디갈락토실 1-모노글리세라이드 내의 적은 증가도 관찰된다는 사실을 설명한다.
(실시예 5) 푸사리움 헤테로스포룸 유래 지질분해효소의 온도 최적조건 및 안정성의 측정
푸사리움 헤테로스포룸에서 유래하고 한세눌라 폴리모르파 내에서 발현된 스프레이 건조된 효소의 효소 활성이 하기 기술된 바와 같이 일부 변형된 PLU-7에 따라 다양한 온도에서 측정되었다. 기질은 0.6% 포스파티딜콜린, 0.4% Triton X-100, 6 mM CaCl2 및 50 mM HEPES5, pH 7.0의 에멀젼이었다. 스프레이 건조된 지질분해효소 발효체는 탈염수로 3 TIPU/ml로 희석되었다. 400 ㎕의 기질이 10, 20, 30, 40, 50, 45, 50 및 60℃에서 5분간 항온유지되었고, 50 ㎕의 표본이 첨가되었다. 정확히 10분 후 추가 10분간 99℃에서의 인큐베이션에 의해 효소작용이 정지되었다. 최종적으로 자유 지방산 함량이 NEFA C 방법(Wako Chemicals GMbH, Neuss, 독일)에 의해 측정되었다. 발색 시약 A 및 B가 제조사의 프로토콜에 따라 제조되었다. 10 ㎕ 재분산 추출 지질 및 100 ㎕ 시약 A가 미량 역가판에 피펫되었고 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 200 ㎕ 시약 B가 미량 역가판에 첨가되었고 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 540 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 흡광도 판독 및 올레산에 기반한 표준 곡선을 이용하여 자유 지방산 함량이 측정되었다. 결과는 도 15에 나타나 있다.
스프레이 건조된 지질분해효소 발효체의 효소 안정성이 다양한 온도에서 측정되었다. 스프레이 건조된 효소 발효체는 50 mM 인산염 완충액, pH 7.0으로 3 TIPU/ml로 희석되었다. 20, 30, 37, 40 및 45℃에서의 30분간 인큐베이션 후 표본은 얼음 위에서 보관되었다. 이후에 포스포리파제 활성이 하기 기술된 바와 같이 변형된 PLU-7에 따라 측정되었다. 기질은 0.6% 포스파티딜콜린, 0.4% Triton X-100 및 5 인산염 완충액의 에멀젼이었다. CaCl2는 인산칼슘의 침전을 방지하기 위해 제거되었고 효소 활성에는 영향을 미치지 않는다. 400 ㎕의 기질이 37℃에서 5분간 항온유지되었고, 50 ㎕의 표본이 첨가되었다. 정확히 10분 후 추가 10분간 99℃에서의 인큐베이션에 의해 효소작용이 정지되었다. 최종적으로 자유 지방산 함량이 NEFA C 방법(Wako Chemicals GMbH, Neuss, 독일)에 의해 측정되었다. 발색 시약 A 및 B가 제조사의 프로토콜에 따라 제조되었다. 10 ㎕ 재분산 추출 지질 및 100 ㎕ 시약 A가 미량 역가판에 피펫되었고 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 200 ㎕ 시약 B가 미량 역가판에 첨가되었고 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 540 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 흡광도 판독 및 올레산에 기반한 표준 곡선을 이용하여 자유 지방산 함량이 측정되었다. 결과는 도 16에 나타나 있다.
(실시예 6) 푸사리움 헤테로스포룸 유래 지질분해효소의 pH 최적조건 및 안정성의 측정
푸사리움 헤테로스포룸에서 유래하고 한세눌라 폴리모르파 내에서 발현된 스프레이 건조된 효소의 효소 활성이 다양한 pH에서 측정되었다. 기질은 0.6% 포스파티딜콜린, 0.4% Triton X-100 및 50 mM 인산염 완충액 pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 및 10.0의 에멀젼이었다. CaCl2는 인산칼슘의 침전을 방지하기 위해 제거되었고 효소 활성에는 영향을 미치지 않는다. 스프레이 건조된 지질분해효소 발효체는 탈염수로 3 TIPU/ml로 희석되었다. 400 ㎕의 기질이 37℃에서 5분간 항온유지되었고, 50 ㎕의 표본이 첨가되었다. 정확히 10분 후 추가 10분간 99℃에서의 인큐베이션에 의해 효소작용이 정지되었다. 최종적으로 자유 지방산 함량이 NEFA C 방법(Wako Chemicals GMbH, Neuss, 독일)에 의해 측정되었다. 발색 시약 A 및 B가 제조사의 프로토콜에 따라 제조되었다. 10 ㎕ 재분산 추출 지질 및 100 ㎕ 시약 A가 미량 역가판에 피펫되었고 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 200 ㎕ 시약 B가 미량 역가판에 첨가되었고 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 540 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 흡광도 판독 및 올레산에 기반한 표준 곡선을 이용하여 자유 지방산 함량이 측정되었다. 결과는 도 17에 나타나 있다.
스프레이 건조된 지질분해효소 발효체의 효소 활성이 다양한 pH에서 측정되었다. 스프레이 건조된 지질분해효소 발효체는 pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 및 10.0의 50 mM 인산염 완충액으로 3 TIPU/ml로 희석되었다. 37℃에서의 30분간 인큐베이션 후 표본은 얼음 위에서 보관되었다. 이후에 포스포리파제 활성이 하기 기술된 바와 같이 변형된 PLU-7에 따라 측정되었다. 기질은 0.6% 포스파티딜콜린, 0.4% Triton X-100 및 5 인산염 완충액, pH 7의 에멀젼이었다. CaCl2는 인산칼슘의 침전을 방지하기 위해 제거되었고 효소 활성에는 영향을 미치지 않는다. 400 ㎕의 기질이 37℃에서 5분간 항온유지되었고, 50 ㎕의 표본이 첨가되었다. 정확히 10분 후 추가 10분간 99℃에서의 인큐베이션에 의해 효소작용이 정지되었다. 최종적으로 자유 지방산 함량이 NEFA C 방법(Wako Chemicals GMbH, Neuss, 독일)에 의해 측정되었다. 발색 시약 A 및 B가 제조사의 프로토콜에 따라 제조되었다. 10 ㎕ 재분산 추출 지질 및 100 ㎕ 시약 A가 미량 역가판에 피펫되었고 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 200 ㎕ 시약 B가 미량 역가판에 첨가되었고 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 540 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 흡광도 판독 및 올레산에 기반한 표준 곡선을 이용하여 자유 지방산 함량이 측정되었다. 결과는 도 18에 나타나 있다.
(실시예 7) 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 정제된 지질분해효소의 분자량 측정
푸사리움 헤테로스포룸에서 유래한 본 발명에 따른 정제된 지질분해효소는 SDS-PAGE 겔 상에서 처리되었다(도 19a 및 19b). Novex 표준 마커에 기반하여 분자량은 표 15에 나타난 바와 같이 계산되었다.
Figure 112006054255786-PCT00013
지질분해효소의 분자량은 29.9 kDa으로 계산되었다.
(실시예 8) 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 지질분해효소에 의한 다른 온도에서의 난황 내 레시틴의 리소레시틴으로의 효소적 전환의 특성화
지질분해효소는 자유 지방산의 유리에 의해 레시틴(포스파티딜콜린)에서 리소-레시틴(리소-포스파티딜콜린)으로 전환시킬 수 있다. 난황 내에서의 레시틴의 리소-레시틴으로의 효소적 전환은 리소레시틴이 레시틴보다 더 우수한 유화제이기 때문에 더욱 우수한 유화성을 창출한다. 난황의 우수한 유화성은 열 안정성 마요네즈 및 다른 식품의 제조 및 케이크 및 치즈 성숙과 같으나 이에 한정적이지 않은 식품 적용시 중요하다.
효소 제제:
발효 HET0420으로부터의 한세눌라 폴리모르파내에서 발현된 푸사리움 헤테로스포룸, CBS 782.83로부터의 지질분해효소가 소맥 전분 상에서 스프레이 건조되었다. 수득된 효소 제제는 전술된 TIPU 분석에 의해 측정된 1265 U/g의 포스포리파제 활성을 지녔다. 10%(w/v) 또는 20%(w/v) 효소 원액은 탈염수에 스프레이 건조된 효소 분말을 용해시킴으로서 제주되었다. 교반 15분 후 용액은 1370 x g에서 5분간 원심분리되었다. 상청액은 효소 원액으로 사용되었다.
효소작용:
난황 내 레시틴의 리소-레시틴으로의 효소적 전환을 위한 효소 용량의 최적 조합, 반응 온도 및 시간을 측정하기 위해 2개의 다른 실험이 수립되었다. 첫 번째로 효소작용은 하기 3개의 온도에서 본 발명에 따른 지질분해효소로 수행되었고: 30℃, 40℃ 및 50℃, 각각은 하기 4개의 용량으로 수행되었다: 5 U/난황, 10 U/난황, 20 U/난황 및 30 U/난황.
두 번째 실험에서 효소작용은 각각 본 발명에 따른 지질분해효소 및 Lecitase Ultra Novozymes A/S(덴마크)에 대해 하기 5개 온도: 5℃, 10℃, 15℃, 20℃ 및 53℃로 30 U/난황의 효소 용량으로 수행되었다. 53℃에서 60 U/난황의 효소 용량도 시험되었다.
두 실험에서 Dan/Eg(Christiansfeld, 덴마크)사의 10.0 g 저온살균 난황은 Wheaton 시험관으로 옮겨졌고 적당한 온도로 열 차단 항온유지되었다. 표본은 자력교반기 상에서 연속적으로 혼합되었다. t=0 시간에서 효소 원액이 표 16에 따라 난황에 첨가되었다. 각 실험은 2반복으로 수행되었다. 1.0 g 표본이 표 17에 따라 난황/효소 용액으로부터 채취되었다. 표 17에 따른 인큐베이션 시간 후 표본 내 효소 반응이 7.5 ml 유기용매(CHCl3:MeOH, 2:1)를 첨가함으로서 정지되었다.
Figure 112006054255786-PCT00014
Figure 112006054255786-PCT00015
지질 추출:
표본 내의 7.5 ml 유기용매(CHCl3:MeOH, 2:1) 첨가는 효소 반응을 정지시킬 뿐만 아니라 지질을 추출시킨다. 더욱이 분산되기 전 0.2 ml 탈염수가 Whirley 믹서를 이용하여 1분간 첨가되었다. 이후 표본은 110 x g로 10분간 원심분리되었다. 약 3 ml의 유기상이 또다른 시험관에 옮겨졌고 이러한 추출 지질은 다양한 방법으로 사용되었다. 표본은 -18℃에서 보관되었다.
자유 지방산의 측정:
100 ㎕의 추출 지질 용액이 50℃에서 질소 하에서 증발되었다. 1.0 탈염수가 첨가되었고 지질은 Whirley 믹서를 이용하여 분산되었다. 자유 지방산 함량은 WAKO Chemicals GmbH(Neuss, 독일)사의 NEFA C 키트를 사용하여 측정되었다. 발색 시약 A 및 B는 제조사 프로토콜에 따라 제조되었다. 10 ㎕의 재분산 추출 지질 및 100 ㎕ 용액 A가 미량 역가판에 피펫되었다. 플레이트는 37℃에서 15분간 인큐베이트되었다. 200 ㎕ 용액 B가 미량 역가판에 첨가되었고 플레이트는 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 540 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 자유 지방산 함량은 흡광도 판독 및 올레산 기반 표준 곡선을 이용하여 측정되었다.
LC/MS-MS에 의한 레시틴 및 리소-레시틴의 측정
재료
아세톤, 메탄올, 클로로포름은 모두 아일랜드 듀블린 Lab Scan사로부터 구입되었고, 에탄올 96%는 De Danske Spritfabrikker사로부터, 포름산은 독일 담스타드트 AppliChem사로부터 구입되었다.
기구
HPLC 시스템은 모두 Agilent Technologies(Waldbronn, 독일)사로부터 구입된 4차 펌프(G1311A), 모세관 펌프(G1376A), 자동표본주입기(G1377A) 및 컬럼 구획(G1316A)으로 구성되었다. LC Packings(Amsterdam, 네덜란드)사의 AcurateTM flowsplitter(ACM-CU-CR)가 컬럼 용출물을 질량분광계로 분할시키고 극성 메이크-업 용매을 도입시키는데 사용되었다. 질량분광계는 Thermo Finnigan(San Jose, CA, 미국)사의 LCQ Deca Ion Trap이었다.
컬럼은 Thermo Hypersil-Keystone사의 Hypersil SI, 100 x 4.6 mm id, 5 ㎛이었다.
크로미토그래피 및 MS 조건
이동상
A: --- 사용되지 않음
B: 클로로포름
C: 메탄올/포름산(1000/0.190)
D: 클로로포름/메탄올/물/포름산(300/550/150/0.190)
메이크-업: 에탄올 96%
Figure 112006054255786-PCT00016
주입 부피는 5 ㎕이었고 컬럼 온도는 45℃이었다.
유동 분할기
Figure 112006054255786-PCT00017
LC-유속: 0.60 ml/분
메이크-업 유속: 100 ㎕/분
ELSD/FC 관류: 100 cm x 0.100 mm id(SS)
MS 관류: 100 cm x 150 ㎛(FS-150-MS)
대략 분할은 20:1이다.
MS 조건
Figure 112006054255786-PCT00018
Figure 112006054255786-PCT00019
표준물지리 및 표본 제조
리소-포스파티딜콜린(LPC)(계란)(89865) 및 포스파티딜콜린(PC)(식물)(441601)이 Avanti Polar Lipids, Inc, Alabaster, AL, USA로부터 구입되었다. PC 및 LPC 원액(10 mg/20 ml CHCl3/MeOH)이 제조되었다. 그 희석액은 50 ㎍/ml∼2.5 ㎍/ml의 농도를 포함하도록 제조되었다.
1 g의 난황으로부터의 7.5 ㎕의 지질 추출액이 1.5 ml CHCl3:MeOH(1:1)에 재구성되었다.
TLC 분석:
TLC 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
다른 글리세라이드의 가시화를 위해 2 ㎕ 지질 추출액이 자동 TLC 샘플러 4(CAMAG)에 의해 3 mm 밴드로 HPTLC 실리카 60 플레이트(Merck)에 적용되었다. 실리카 플레이트는 유동 완충액 Ⅰ(P-에테르:메틸 터셔리 부틸 에테르:아세트산 (50:50:1))로 수평 전개 챔버(CAMAG) 내에 놓였다. 20 ml 유동 완충액이 가스상에 대해, 5ml는 통과를 위해 사용되었고, 플레이트는 적용 위치로부터 약 5 cm까지 용출되었다. 플레이트는 가열 찬장(160℃)에서 5분간 건조되었다. 최종적으로 TLC 플레이트는 전개 시약(16% H3PO4 수용액 내의 6% Cu(CH3COO)2) 내에 침수되었고 가열 찬장(160℃)에서 10분간 탄화되었다.
결과
난황 내 레시틴의 리소-레시틴으로의 효소적 전환에 대한 효소 용량, 반응 온도 및 시간의 최적 조합을 측정하기 위해 4가지의 다른 효소 용량이 3가지 다른 온도 및 5가지 다른 반응 시간에 대해 시험되었다.
사용된 4가지 효소 용량, 5 U/g, 10 U/g, 20 U/g 및 30 U/g 뿐만 아니라 사용된 반응시간, 30분, 60분, 120분, 240분 및 360분은 여기에 포함되지 않은 초기 시험에 기반하였다. 3가지 온도 30℃, 40℃ 및 50℃가 도 20에 나타난 지질분해효소에 대한 온도 최적 곡선에 기반하여 선택되었다.
효소 변형된 난황 내 레시틴 및 리소-레시틴의 함량이 HPLC에 의해 분석되었고 반응시간에 대해 도 21 및 도 22에 나타나 있다. 도 23에서 효소 변형된 난황 내 자유 지방산 함량은 반응시간에 대해 나타나 있다.
실험은 본 발명에 따른 지질분해효소에 의해 레시틴의 리소-레시틴으로의 전환이 30℃에서 120분간 20 U/g 난황의 지질분해효소를 사용하여 최적화되었음을 나타낸다. 20 U/g 난황의 용량은 120분 반응 내지 240분 반응으로 30 U/g 난황에서 LPC 농도의 관찰된 감소에 기인하여 선택된다.
이러한 결과에 기반하여 본 발명에 따른 지질분해효소 및 Lecitase Ultra가 30℃보다 낮은 온도에서 난황 지질 상에 영향을 미치는지 여부가 조사되었고 Lecitase Ultra가 현재 상업적으로 사용되는 온도인 53℃에서의 그의 활성이 비교되었다.
난황 내 레시틴의 리소-레시틴으로의 효소적 전환은 5가지 다른 온도(5℃, 10℃, 15℃, 2O℃ 및 53℃) 및 6가지 다른 반응 시간에서 시험되었다. 30 U/g 난황의 효소 용량이 효소 비용측면에서 상업적 관심사의 최대 용량이고 반응속도가 시험되는 온도에서 낮을 것으로 예측되기 때문에 본 용량이 시험되었다. 기술된 모든 효소 단위는 TIPU에 의해 측정되었다. 또한 30 U/g 난황이 추천된 Lecitase Ultra 용량이다. 더욱이 60 U/g 난황의 용량은 53℃에서 시험되었다. 사용된 반응시간은 60분, 120분, 240분 및 360분, 480분, 1440분이었다. 그러나 53℃에서 반응시간은 15분, 30분, 60분 및 90분, 120분 및 240분이었다. 또한 60 U/g을 이용한 53℃에서 표본은 330분 반응에서 채취되었다.
도 24 및 25에서 효소-변형 난황 내 리소-레시틴, 자유 지방산 및 레시틴의 함량이 각각 본 발명에 따른 지질분해효소 및 Lecitase Ultra 포스포리파제를 이용하여 반응시간에 대해 묘사되었다. 표본 내 레시틴 및 리소-레시틴 함량은 LC-MS에 의해 측정되었고, 자유 지방산 함량은 NEFA C 방법에 의해 측정되었다. 대조군 표본 내 FFA 함량(결과는 나타나 있지 않음) 및 실험동안의 리소-레시틴 및 레시틴의 총 잔존 함량이 도 24 및 25에 나타나 있다.
도 24는 본 발명에 따른 지질분해효소로의 난황의 효소작용 결과를 나타낸다. 53℃에서 지질분해효소의 활성은 30분 반응시간 후 중지되었고 30 U/g 난황으로 1.7%(w/w)의 LPC 농도에 도달하였다(도 24b). FFA 농도는 각각 30 U/g 난황 및 60 U/g 난황으로 1.0%(w/w) 및 1.3%(w/w)이었다. Lecitase Ultra를 사용한 경우 LPC 및 FFA의 함량은 15∼240분 lrks 동안 증가되었고(도 19) 30 U/g 난황으로 240분 반응 후 2.7% LPC(w/w)를 산출하였다. FFA 농도는 각각 30 및 60 U/g 난황을 사용한 반응 240분 후 1.4%(w/w) 및 2.1%(w/w)이었다. Lecitase Ultra 활성은 60 U/g 난황을 사용한 반응 330분 후 중지되었다. 본 발명의 지질분해효소는 Lecitase Ultra보다 높은 초기 반응 속도를 지녔다.
20℃ 및 53℃에서 초기 반응은 본 발명의 지질분해효소와 유사하였다(도 24). 5∼20℃ 온도에서 LPC 및 FFA의 함량은 실험 동안 증가하였다. 20℃ 이하의 온도에서 초기 속도가 온도 감소에 따라 현저하게 감소되었으나 20℃에서 30 U/g 난황으로의 반응 60분 후 3.3%(w/w)의 LPC 농도 및 1.6%(w/w)의 FFA 농도에 도달되었다. 이러한 농도는 Lecitase Ultra로의 53℃에서의 반응 240분과 유사하였다. 20℃에서의 반응 1440분 후 FFA 분석을 위한 무-용매-지질 추출물을 재현탁시키는 것은 불가능하였다. 5℃ 및 10℃에서 1440분 후 지질분해효소로의 표본은 교반을 불가능하게 하는 높은 점도를 지녔다. 이는 FFA의 결정화에 기인하는 것으로 판단되었다. 30℃, 30 U/g 난황에서의 120∼240분의 반응 내의 TN 6642에서 나타난 LPC 농도의 감소는 이들 실험에서 관찰되지 않았다.
난황의 Lecitase Ultra 포스포리파제의 효소작용은 53℃에서의 Lecitase Ultra의 초기 속도와 비교시 20℃ 및 그 이하 온도에서 초기 속도의 유의적인 감소를 제공한다. 20℃에서 30 U/g 난황으로의 반응 1440분 후 3.0%(w/w)의 LPC 농도 및 1.5%(w/w)의 FFA 농도에 도달되었다. 이러한 농도는 53℃에서의 반응 240분과 유사하였다.
도 26은 효소 변형 난황으로부터의 추출 지질의 TLC 분석을 나타낸다. 이러한 분석은 LC-MS의 결과를 확인시켰고 본 발명에 따른 지질분해효소 및 Lecitase Ultra 포스포리파제가 리소-레시틴 함량을 증가시킴을 나타내었다.
지질분해효소에 의해 촉매되는 효소 반응은 동일한 함량의 리소-레시틴 및 자유 지방산을 생성시킨다. 가능하고 원치하는 부반응은 트리아실글리세라이드의 가수분해이다. 효소 반응 동안 리소-레시틴 및 자유 지방산 함량 변화 사이의 관련성이 도 27에 나타나 있다.
Lecitase Ultra로 리소-레시틴 및 자유 지방산의 동일한 형성의 우수한 상호관련성이 존재한다(도 27). 그러나 Lecitase Ultra로 처리된 대부분의 표본에서는 매우 적은 반응이 존재하였다. 난황의 본 발명으로의 효소작용은 40 mM 이상의 리소-레시틴 농도 및 60 mM 이상의 자유 지방산 농도에서 형성된 리소-레시틴 당 하나 이상의 자유 지방산의 생성을 유발한다. Lecitase Ultra로의 최대 전환은 30 mM 리소-레시틴 및 25 mM 자유 지방산이다. 0.8 이하 또는 1.2(n/n) 이상의 리소-레시틴에 대한 자유 지방산 비율 및 1.0%(w/w) 이상의 LPC 함량을 지닌 표본이 표 18에 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00020
1.2(n/n) 이상의 리소-레시틴에 대한 자유 지방산 비율 및 1.0%(w/w) 이상의 LPC 함량을 지닌 표본은 연장된 반응시간 또는 1.0%(w/w) 이하의 PC를 함유한 표본 내에서 일반적으로 나타난다. 15℃에서의 지질분해효소 표본은 모든 표본 내에서 증가된 리소-레시틴에 대한 자유 지방산 비율을 지닌다. 이는 효소가 지연된 반응시간에 또는 PC 함량이 낮은 경우 기질 특이성을 변화시킴을 나타낸다. 이는 난황 내에서 발견되는 포스파티딜에탄올아민, 디갈락토실디아실글리세라이드 또는 트리아실글리세라이드의 가수분해에 기인할 수 있다. 0.8(n/n) 이하의 리소-레시틴에 대한 자유 지방산 비율 및 1.0%(w/w) 이상의 LPC 함량을 지닌 표본은 53℃의 반응 온도에서 일반적으로 나타난다. 이는 에스테르 교환반응에 의해 설명될 수 있다.
도 28은 본 발명의 지질분해효소가 연장된 반응시간 또는 낮은 농도의 PC에서 트리아실글리세라이드 및 1,3 디아실글리세라이드 상의 가수분해 활성을 지님을 나타낸다. 1,2 디아실글리세라이드의 축적은 리파제 활성이 1,3-특이적임을 나타낸다. 모노글리세라이드의 형성은 Lecitase Ultra가 20℃에서 트리- 또는 디아실글리세라이드 상에 가수분해 효과를 지님을 나타낸다. LPC 형성 수준이 유의적으로 다르기 때문에 본 발명의 지질분해효소 또는 Lecitase Ultra 포스포리파제가 가장 높은 정도의 트리아실글리세라이드 가수분해를 지니는 것은 불가능하다. 표 18A는 도 28의 레인 1-30의 피험체에 적용된 반응시간, 온도 및 용량을 나타낸다.
Figure 112006054255786-PCT00021
일반적인 실험을 이용하여 효소 용량, 반응온도 및 반응시간의 최적조건은 어떠한 제공된 우수한 적용으로 용이하게 측정됨은 당업자에게 명백할 것이다.
결론
레시틴의 리소-레시틴으로의 전환을 측정하기 위해 본 발명에 따른 지질분해효소 및 Lecitase Ultra 포스포리파제의 Dan/Eg A/S사의 난황의 효소작용이 수행되었다. 이는 효소 활성을 조사하기 위해 5가지 온도(5∼20℃ 및 53℃) 및 6가지 다른 반응시간(60∼1440분, 그러나 53℃에서는 15∼240분)에서 30 U/g 난황의 효소 용량을 사용하여 수행되었다. 53℃는 현재 Lecitase Ultra로의 난황 변형시 상업적으로 사용되는 온도이다.
본 발명에 따른 지질분해효소는 모든 시험 온도에서 Lecitase Ultra보다 더 높은 초기 반응 속도를 지녔다. 53℃에서 상기 지질분해효소로의 반응은 단지 반응 30분 후 중지되었다. 53℃의 30 U/g 난황의 용량에서 LPC 농도는 각각 지질분해효소의 경우 1.7(w/w) 및 Lecitase Ultra의 경우 2.7%(w/w)이었다. 3.3%(w/w) 농도의 LPC는 상기 지질분해효소로의 20℃에서의 반응 60분 후에만 도달되었다.
저온(5∼20℃)에서 상기 지질분해효소에 의한 레시틴의 리소-레시틴으로의 전환은 Lecitase Ultra보다 유의적으로 우수하였다. 상기 지질분해효소의 반응 속도는 15℃ 이상에서와 비교시 10℃ 이하에서 현저히 낮았다. 상기 지질분해효소는 5℃에서 활성적이었고 2%(w/w) 이상의 리소-레시틴 형성은 반응 24시간 후 검출 가능하였다. 또한 상기 지질분해효소로 처리된 표본은 더 높은 온도와 비교시 10℃ 이하에서 더욱 점성이 있었다.
상기 지질분해효소는 연장된 반응시간 또는 PC 함량이 낮은 경우 기질 특이성을 변화시키고 인지질 이외에 포스파티딜-에탄올아민, 디갈락토실 디아실글리세라이드 또는 트리아실글리세라이드를 가수분해하는 것으로 나타났다. 이는 낮은 효소 용량 및 짧은 반응시간을 이용하여 방지되고 의문의 생성물에 대한 처리 조건의 최적조건에 대한 요구를 실체화한다. 53℃에서 에스테르 교환반응은 리소-레시틴 당 1 이하의 등가 자유 지방산이 상기 지질분해효소 및 Lecitase Ultra에 의해 생성됨을 설명할 수 있다.
결론적으로 본 발명에 따른 지질분해효소는 저온에서 난황의 효소작용시 잠재적 후보가 된다. 또한 저온에서의 관찰된 활성은 다른 적용의 관심사가 된다.
(실시예 10) 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83 지질분해효소의 이용에 의한 마요네즈의 제조
마요네즈 제조:
실시예 4에서 기술된 6.25g 지질분해효소가 150 U/mL의 포스포리파제 활성에 상응하는 50 mL 탈염수 내에 용해되었다. 교반 15분 후 용액은 1370 x g로 5분간 원심분리되었다. 상청액은 표 19에 따라 Sanofa A/S사의 난황 150 g의 효소작용에 사용되었다. Sanofa A/S사의 또다른 난황 150 g은 표에 따라 Lecitase Ultra(Novozymes A/S, 덴마트)로 처리되었다. 효소작용은 느린 교반으로 30℃에서 18분간 수행되었다. 지질 추출은 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행되었다.
각각 본 발명에 따른 지질분해효소 및 Lecitase Ultra를 사용한 Sanofa A/S사의 난황의 효소작용. 사용된 지질분해효소 용액은 150 U/mL의 활성을 지녔고 Lecitase Ultra는 34500 U/mL의 포스포리파제 활성을 지녔다.
표본 난황 함량 첨가된 지질분해효소 첨가된 Lecitase Ultra 첨가된 탈염수 U/g 난황
대조군 150 g 30.0 mL 0
지질분해효소 150 g 30.0 mL 30
Lecitase Ultra 150 g 0.13 mL 29.9 mL 30
Koruma 믹서(Disho V60/10)를 이용하여 Sanofa A/S사의 효소-변형된 난황으로 마요네즈가 제조되었다. 가공 동안 마요네즈는 5분간 95℃로 가열되었다.
마요네즈 제조에 사용된 성분
성분 마요네즈 대조군 마요네즈 지질분해효소 마요네즈 Lecitase Ultra
물 34.5% 34.5% 34.5%
기름 50.0% 50.0% 50.0%
염 1.0% 1.0% 1.0%
설탕 3.0% 3.0% 3.0%
소르빈산칼륨 0.1% 0.1% 0.1%
Grindsted FF 1102 1.7% 1.7% 1.7%
난황 1 4.23%
난황 2 4.23%
난황 3 4.23%
식초 10% 4.00% 4.00% 4.00%
겨자 1.50% 1.50% 1.50%
총계 100% 100% 100%
TLC-분석:
TLC 분석은 상기 기술된 바와 같이 수행되었다.
마요네즈의 입자 크기 측정:
2.0 g 마요네즈 표본이 22.5 g 0.2% SDS에 용해되었고 300 rpm으로 최소 30분간 교반되었다. 이후 입자 크기 분포가 Malvern Mastersizer 상에서 측정되었다.
결과
효소-변형된 난황으로의 마요네즈 제조시 Sanofa A/S사의 난황이 사용되었다. 이러한 난황은 8% 염(Dan/Eg사의 난황 내 0%와 비교시)을 포함하였다. 초기 시험은 Sanofa A/S사의 난황 내의 높은 염 농도가 지질분해효소에 영향을 미치고, 따라서 30 U/g의 효소 용량이 20 U/g 대신 사용되었다.
효소 변형된 Sanofa A/S사의 난황으로부터의 추출 지질의 TLC 분석은(도 29) 본 발명에 따른 지질분해효소가 리소-레시틴 함량의 증가와 함께 레시틴 함량을 감소시키는 것으로 나타내었다(도 29). 이와 비교시 Lecitase Ultra를 사용하는 경우 레시틴의 리소-레시틴으로의 전환은 무시 가능하였다. TLC에 의해 나타난 레시틴의 리소-레시틴으로의 높은 전환은 효소 변형된 Sanofa A/S사의 난황으로부터의 추출 지질 상에서 이루어진 자유 지방산 측정과 잘 연관되었다(표 21). 상기 지질분해효소를 사용하여 유리된 자유 지방산 함량은 Lecitase Ultra를 사용하여 유리된 자유 지방산 함량 보다 3.5배 더 높았다.
효소 변형된 Sanofa A/S사의 난황 내 자유 지방산 함량. 자유 지방산 함량은 NEFA C 방법에 의해 분석되었고 난황의 백분율로 표기된다.
표본 자유 지방산 (%(w/w))
대조군 0.39
지질분해효소 2.4
Lecitase Ultra 0.68
다르게 효소 변형된 Sanofa A/S사의 난황의 유화성을 측정하기 위해 마요네즈 내 기름 방울의 크기 분포가 분석되었다. 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 지질분해효소로 처리된 난황으로 제조된 마요네즈는 Lecitase Ultra로 처리된 난황 또는 비-처리 난황으로 제조된 마요네즈와 비교시 가장 작은 평균 입자 크기뿐만 아니라 가장 정밀한 입자 크기 분포를 지녔다. 작은 평균 입자 크기뿐만 아니라 정밀한 입자 크기 분포는 우수한 유화성을 나타내고, 따라서 상기 지질분해효소로 변형된 난황은 최상의 유화성을 지녔다.
효소 변형된 Sanofa A/S사의 난황으로 제조된 마요네즈 내 입자 크기 분포
표본 평균 입자 크기 (㎛) 10% 분위수 (㎛) 90% 분위수 (㎛)
대조군 13.7 2.0 21.5
지질분해효소 4.4 1.2 7.3
Lecitase Ultra 13.3 1.8 21.9
효소 변형된 Sanofa A/S사의 난황으로 제조된 에멀젼의 열 안정성을 측정하기 위해 마요네즈가 4초간 전자렌지로 가열되었다. 도 30에 나타난 바와 같이 효소-변형된 난황을 함유한 마요네즈는 열 안정성 에멀젼을 생성한 반면 비-처리 난황을 함유한 대조군은 전자렌지 내의 열 처리시 분리되었고 따라서 에멀젼은 열 안정적이지 않았다.
결론
효소 변형된 Sanofa A/S사의 난황의 TLC 분석 및 자유 지방산 측정 및 효소 변형된 Sanofa A/S사의 난황으로 제조된 마요네즈의 입자 크기 분포 및 열 안정성 시험 결과는 잘 연관되었다. 본 발명에 따른 지질분해효소를 사용하여 변형된 난황은 레시틴의 리소-레시틴으로의 최대 전환율 및 최대 함량의 자유 지방산을 지녔다. 예측된 바와 같이 이러한 레시틴:리소-레시틴 비율 상의 변화는 마요네즈를 유발하였고, 이는 열 안정적이었고 최상의 최적 입자 크기 분포를 지녔다.
Lecitase Ultra를 사용하여 Sanofa A/S사의 난황을 변형시키는 것은 레시틴:리소-레시틴 비율 상의 큰 변화 또는 높은 함량의 자유 지방산을 유발하지 않았다. 이러한 명백히 적은 레시틴의 리소-레시틴으로의 전환은 마요네즈의 입자 크기 분포에 반영되었고, 이는 비-변형 난황과 유사하였다. Lecitase Ultra를 사용하여 발생된 레시틴:리소-레시틴 비율의 변화는 마요네즈를 열 안정적으로 만드는데 충분하였다.
30℃에서 120분간 30 U/g의 지질분해효소로 변형된 Sanofa A/S사의 난황은 레시틴의 리소-레시틴으로의 높은 전환율을 나타내었고, 이러한 난황으로 제조된 마요네즈는 열 안정적이었고 최적 입자 크기 분포를 지녔다. 이와 비교하여 30℃에서 120분간 30 U/g의 Lecitase Ultra로 처리된 Sanofa A/S사의 난황은 레시틴:리소-레시틴 비율 상의 단지 최소 변화만을 나타내었고, 제조된 마요네즈는 비-처리 난황으로 제조된 마요네즈와 유사한 입자 크기 분포를 지녔으나 실제로 열 안정적이었다. 따라서 본 발명에 따른 지질분해효소는 마요네즈 제조시 Lecitase Ultra보다 우수하였다.
(실시예 11) 하드 크러스티 롤의 제조시 유화제와 결합된 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소의 적용 시험
본 시험에서 하드 크러스티 롤의 베이킹시 본 발명에 따른 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소의 발효체가 단독으로 또는 Danisco A/S사의 유화제인 Panodan A2020 DATEM 및 GRINDSTED SSL P55와 결합하여 사용되었다. 특정 빵 부피 상의 효과가 Novozymes사의 Lipopan FTM의 단독 또는 유화제와 결합되어 특정 빵 부피 상의 효과와 비교되었다.
적용
하드 크러스티 롤은 하기 조리법 및 베이킨 절차를 이용하여 베이크되었다.
베이킹 조리법 함량 밀가루낸 베이커 %
밀가루-Danish Reform 2004002 2000 g 100
물 1140 g 57
압축 효모 120 g 6
염 32 g 1.6
설탕 32 g 1.6
아스코르브산 0 ppm 0
표준 알파 아밀라제/GRINDAMYLTM A 1000 from Danisco A/S
75 ppm 0.150
베이킹 절차
Diosna 믹서 시스템
1. 1분간 느리게 건조 혼합
2. 2분 느리게 + 4분 빠르게 혼합
3. 반죽 온도: 26℃
4. 반죽 측량: 1350 g
5. 휴지: 가열 캐비닛 내 30℃에서 10분
6. 주형: Fortuna 3/17/7 몰더
7. 가공: 34℃에서 45분, 85% RH.
8. Bago 오븐 내 베이킹: 220℃에서 13분, 13초 증기 + 5분 댐퍼 개방
9. MIWE 스톤 데크: prog. nr 1
10. 베이킹 후 롤은 측량 전 25분간 냉각되었음. 롤 부피는 평지씨 전치 방법에 의해 측정되었음.
특정 빵 부피:
특정 부피 = 빵 부피, ccm/빵 중량, g
스프레이 건조된 지질분해효소의 첨가는 밀가루 상에서 이루어졌다. 효소는 물, 아스코르브산 및 압축 효모와 함께 먼저 혼합한 후 밀가루에 첨가된다. 다른 건조 성분은 단계 1에서 혼합된다.
결과
푸사리움 헤테로스포룸 유래의 스프레이 건조된 지질분해효소는 Danisco A/S사의 Panodan M2020 DATEM와 결합하여 사용되었고 Lipopan FTM / DATEM 뿐만 아니라 정제 DATEM과의 결합에 대해 시험되었다. 결과는 표 23 및 도 31에 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00022
Figure 112006054255786-PCT00023
푸사리움 헤테로스포룸 유래의 동결 건조된 지질분해효소는 Panodan A2020 DATEM 및 GRINDSTED SSL P55와 결합하여 사용되었고 Lipopan FTM / SSL 또는 DATEM 뿐만 아니라 및 정제 Lipopan FTM, 정제 DATEM 및 정제 SSL과의 결합에 대해 시험되었다.
결과는 표 24 및 도 32에 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00024
결론
표 23 및 도 31의 결론은 본 발명에 따른 스프레이 건조된 지질분해효소의 최적 용량은 약 383 ppm 지질분해효소이고 생성물은 낮은 용량의 DATEM 유화제와 결합되어 낮은 용량으로 사용될 수 있다는 것이다. 평행 실험에서 574∼1912 ppm의 용량의 지질분해효소에서 특정 빵 부피가 감소됨이 나타났다(데이터는 나타내지 않음). 본 발명에 따른 383 ppm 지질분해효소의 성능은 40 ppm Lipopan FTM과 유사하다. 또한 유화제와 결합하여 사용시 본 발명에 따른 지질분해효소도 의 농도 상에서 수행된다. 전술된 TIPU 분석을 이용한 포스포리파제 활성 측정에 따라 10 ppm Lipopan FTM은 kg 밀가루 당 120 TIPU이고 본 발명의 96 ppm 지질분해효소는 kg 밀가루당 117 TIPU에 상응하였다.
더욱이 표 24 및 도 32의 시험에 기반하여 본 발명에 따른 지질분해효소가 SSL뿐만 아니라 DATEM과 결합하여 사용되어 낮은 농도의 유화제의 효과를 증가시킬 수 있다고 결론 내렸다. 본 발명에 따른 지질분해효소의 기능성은 동일하게 투여시 Lipopan FTM의 기능성과 비교될 수 있다. 또한 유화제와 결합된 포스포리파제 활성의 최적 수준은 kg 밀가루 당 약 100∼150 TIPU로 측정되었다.
따라서 본 발명에 따른 정제 지질분해효소의 최적 용량은 kg 밀가루 당 약 500 TIPU이고 유화제와 결합하여 지질분해효소의 농도는 kg 밀가루 당 평균 약 120 TIPU로 1/5 내지 1/4의 지질분해효소의 최적 수준이 되어야 한다.
(실시예 12) 소맥 토르티야의 제조시 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소의 적용 시험
본 발명에 따른 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소의 푸마르산(미국 절차)으로 제조된 소맥 토르티야의 회전성 상의 효과가 하기 실시예에서 설명된 바와 같이 시험되었다.
소맥 토르티야는 표 25의 성분을 사용하여 베이크되었다.
소맥 토르티야의 제조 조리법
조리법: 형태: 용량 (밀가루의 %) 그램
밀가루 클래식(No.2004068) 100 3000
설탕 1.0 30
지방(쇼트닝, 마가린, 기름) 쇼트닝 8.7 267
염 1.5 45
소르빈산칼륨 0.3 9
Ca-프로피온산 0.3 9
중탄산나트륨 0.9 27
산 푸마르산 0.8 24
물 48 144
소맥 토르티야 반죽 제조 절차:
1. 바람직한 반죽 온도: 32℃
2. 반죽은 Kemper 믹서로 대기 온도에서 수행됨.
3. 모든 건조 성분을 혼합 주발에 넣음(선택적으로 지질분해효소 및/ 또는 유화제 포함)
4. 혼합물 1분간 건조
5. 물 첨가
6. 혼합: 스피드 1로 11분
7. 측량: 1350 g x 3
8. 성형: 글리멕(glimek) 분할기 / 라운더 상의 반죽 볼 내로
9. 32℃에서 10분간 휴지
10. 베이킹: 하기 셋팅으로 토르티야 오븐 CFO 40내에서 수행:
상부: 230℃, 중간: 228℃ 및 하부: 160℃
11. 냉각: 20℃에서 12분, 80% RH
본 발명에 따른 지질분해효소는 농도를 증가시키면서 반죽에 첨가되었다(시험 3∼7번). 비교를 위해 대조군(시험 1번) 및 Danisco A/S사의 Panodan 205 유화제로의 시험(시험 2번)이 포함되었다. 표 25 참조.
지질분해효소, Panodan 205 및 L-시스테인 첨가시 먼저 혼합 과정에 첨가된다(단계 3 및 4 위). L-시스테인은 제조된 반죽의 신장성을 증가시키기 위해 첨가되어 베이킹 전 반죽의 압착 과정을 개선시킨다.
시험 셋-업
성분 시험 번호 지질분해효소 Panodan 205 L-시스테인 (ppm)
1 10
2 1.03% 10
3 100 ppm 10
4 200 ppm 10
5 400 ppm 10
6 1200 ppm 10
7 2400 ppm 10
토르티야는 가장 큰 지름의 나무 막대기로 시작하여 다른 지름의 다른 나무 막대기 주변을 회전시킴으로서 상온에서 냉각 회전성에 의해 평가되었다. 회전성은 베이크되지 않고 토르티야가 회전될 수 있는 나무 막대기의 수로 표시된다. 더 높은 수는 더 우수한 회전성을 나타낸다.
가시적 평가 관통
표본 회전성 힘(g)
1-7일 2-1-1 432
2-7일 1-1-1 421
3-7일 1-1-1 369
4-7일 2-2-2 439
5-7일 2-2-1 489
6-7일 2-1-2 448
7-7일 2-2-2 533
그 결과 대조군 시스템과 비교시 200 ppm 이상의 용량의 본 발명에 따른 지질분해효소가 개선된 회전성을 제공하는 것으로 간주되는 것으로 결론 내렸다. 전술된 TIPU 분석을 이용하여 회전성을 개선시키는데 필요한 활성 수준이 kg 밀가루 당 약 650 TIPU 단위에 상응하는 것으로 측정되었다. 그 결과 관통 시험에 작용된 힘은 높은 수준의 지질분해효소에서 증가되었고, 이는 토르티야의 저항성이 개선되었음을 의미하는 것으로 결론 내렸다. 관통 시험은 토르티야를 관통하고/베이크하기 위해 필요한 힘이 측정되는 Stable Micro System사의 질감 분석기 TAXT2를 이용하여 수행되었다.
이러한 실험은 하기 파라미터로 셋업되었다.
힘은 압축기로 측정된다.
시험-전 속도 10 mm/s
시험 속도 2 mm/s
시험 후 속도 10 mm/s
파열 시험 거리 1 mm
거리 25 mm
힘 1 g
시간 5초
로드 셀 5 kg
온도 20-22 deg C (상온)
(실시예 13) 한세눌라 폴리모르파 내의 푸사리움 세미텍툼(IBT9507) 유래의 지질분해효소를 인코드하는 합성 유전자의 분자적 클로닝, 서열 분석 및 이형적 발현
푸사리움 세미텍툼 지질분해효소 유전자의 단편은 다른 푸사리움 균주로부터의 지질분해효소의 단백질 서열에 정렬된 아미노산의 보존 블록으로터 고안된 프라이머로 PCR을 이용하여 게놈 DNA로부터 클론되었다. 퇴화 PCR 프라이머는 컴퓨터 프로그램 CODEHOP (Rose et al. 2003(Nucleic Acid Res., 18:3763-3766))을 이용하여 고안되었다.
유전자의 말단을 클론하기 위해 5'- 및 3'-RACE 방법(Frohman et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002)이 이용되었다. 총 RNA는 1% 해바리기유로 유도된 푸사리움 세미텍툼 균주의 배양액으로부터 분리되었고 사용된 프라이머는 CODEHOP 프라이머로 수득된 유전자 단편 서열로부터 고안되었다.
상기 절차에 의해 수득된 3개 단편은 인 실리코(in silico)로 조립되어 전체-길이 cDNA 서열을 나타내었다. 1236개 뉴클레오타이드 길이의 cDNA 서열 분석은 352개 아미노산을 포함한 오픈 리딩 프레임을 나타내었다(도 33).
한세눌라 내에서 푸사리움 세미텍툼 지질분해효소 유전자를 발현시키기 위해 유전자는 효모 α 교배 인자를 형성하는 신호 서열이 제공되었고 한세눌라 발현 벡터 pB14 내의 FMD-프로모터 뒤에 삽입되었다. 수득된 플라스미드, pB14-alp.sem(도 34에 개략적으로 나타남)은 일렉트로포레이션에 의해 적합한 한세눌라 폴리모르파 세포 내로 형질전환되었다. 형질전환체는 YND 플레이트 상에서 선택되었고 콜로니는 YND의 액체 배양액 내의 1:200 희석의 10 통과에 의해 유전자의 다중 도입에 대해 선택되었다. 최종적으로 선택된 배양액은 YPD 배지 내로 2회 이동되었다.
지질분해효소 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 선택된 클론이 37℃에서 2일간 1.8% 글리세롤 및 0.2% 글루코스를 포함한 YPD 내에서 생장되었다.
(실시예 14) 푸사리움 세미텍툼 지질분해효소의 활성을 위한 최적 pH 및 온도의 측정
실시예 8에 기술된 바와 같이 푸사리움 세미텍툼 IBT9507로부터 유래하고 한세눌라 폴리모르파 내에서 발현된 본 발명에 따른 지질분해효소는 포스포리파제 및 갈락토리파제 활성의 측정을 위해 반죽 슬러리 내에서 기능적 분석에 사용되었고 상기 효소의 활성은 다양한 pH 및 온도에 대해 조사되었다.
분석 절차
가스 크로마토그래피
0.8 g 밀가루가 덮개가 있는 12 ml 원심분리관 내로 측량된다. 효소를 함유한 1.5 ml 물이 첨가된다. 표본은 Whirley 상에서 혼합되고 30℃에서 60분간 가열 캐비닛 내에 놓인다. 6 ml n-부탄올:에탄올 9:1이 첨가되고 밀가루가 용매 내에 미세하게 분포될 때까지 표본이 혼합된다. 이후 시험관이 95℃에서 10분간 수조에 놓인다. 이후 다시 혼합되고 45 rpm으로 45분간 회전 장치 상에 놓인다. 이후 표본은 10분간 2000 g에서 원심분리되고 2 ml 상청액이 10 ml 드램 유리로 옮겨진다. 용매는 질소 증기하에서 70℃에서 증발된다. 분리된 지질은 GLC로 분석된다.
가스 크로마토그래프 및 갈라토리파제 활성 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
온도 최적조건
포스포리파제 활성
온도에 대한 활성 측정을 위해 포스포리파제 분석이 실시예 1과 동일하게 수행되었으나 온도는 30℃, 37℃, 45℃, 52℃ 또는 60℃로 셋팅되었다.
pH 최적조건
포스포리파제 활성
pH에 대한 활성 측정을 위해 포스포리파제 분석이 실시예 1과 동일하게 수행되었으나 0.6% L-α Phosphatidylcholine 95% Plant(Avanti #441601) 및 0.4% Triton-X 100(Sigma X-100)이 0.05 M 인산완충액 pH 5, pH 6, pH 5, pH 8 또는 pH 9에 용해되었다.
결과
푸사리움 세미텍툼 IBT9507 유래의 본 발명에 따른 지질분해효소가 포스포리파제 활성 PLU-7 및 갈락토리파제 활성 GLU에 대해 분석되었고 그 결과는 표 27에 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00025
푸사리움 세미텍툼 IBT9507는 기술된 절차에 따라 1 PLU-7을 0.8 g 밀가루에 첨가함으로서 반죽 슬러리 실험에서 시험되었다. 효소 대신 물이 포함된 대조군 표본 및 Lipopan FTM을 포함한 효본도 제조되었다. 반죽으로부터 추출된 지질은 GLC에 의해 분석되었고 그 결과는 표 28에 나타나 있다.
Figure 112006054255786-PCT00026
표 28의 결과는 푸사리움 세미텍툼 유래의 리파제가 Lipopan FTM과 비교시 갈락토리피드 상에 유의적인 활성을 지니고 트리글리세라이드 상에는 상대적으로 적은 활성을 지님을 나타낸다.
또한 푸사리움 세미텍툼 IBT9507이 온도(표 29) 및 pH(표 30)에 대한 활성에 대해 분석되었다.
Figure 112006054255786-PCT00027
Figure 112006054255786-PCT00028
표 29 및 30에 기입된 활성은 도 35 및 36에 그래프로 표현되었다.
결론
푸사리움 세미텍툼 유래의 본 발명에 따른 지질분해효소는 반죽 내 갈락토리피드 상에 매우 강한 활성을 나타내었고 트리글리세라이드 상의 활성은 Lipopan FTM의 트리글리세라이드 활성보다 적다. 상기 효소의 활성에 대한 온도 최적조건은 약 45℃이고 pH 최적조건은 7이다.
(실시예 15) 동물 사료에서의 본 발명에 따른 지질분해효소의 이용
본 발명에 따른 지질분해효소의 효율을 조사하기 위해 육계의 전체 사육기간 동안 다양한 용량 농도의 용량 수준이 사용되었다.
요약:
육계 사료 내 본 발명에 따른 지질분해효소의 첨가가 가금류의 활동을 개선시키고 영양분 유지를 개선시키며 질소 배설을 감소시키는데 효과적인 영양적 전략임을 나타낸다. 특히, 초기 조사는 본 발명에 따른 지질분해효소의 동물 사료로의 첨가가 체중 증가, 전환 효율 및 동물의 건조 물질 및 질소의 대사성을 개선시킨다.
처리 세목
처리수 8
처리 당 반복 0-21일, 13 반복 22-42일, 9 반복
반복 당 가금류 0-21일, 8 가금류/반복 (큰 옥사 내 6, 작은 옥사 내 2) 22-42일, 2 가금류/반복 (큰 옥사 내 2)
가금류 종 브로일러
가금류 품종 Ross 또는 Cobb
가금류 성별 수컷
시험 범위 0-42일
식이 형태(펠렛/매쉬) 메쉬
사용된 식이 항콕시듐제/성장 증진제 없음
가금류/사료가 측량된 연령 0, 21 및 42일/0, 21 및 42일
사육 밀도(가금류/m2)
광 프로그램 23시간 광 0-4일, 16시간 광 4-21일, 20시간 광 22-31일 및 23시간 광 32-42일
하우스 온도 프로그램
하우스 습도 프로그램
예방접종 프로그램 엘라코반(출발 급식)
예방접종 - 공기 교환/시간
식이 제형 및 급이 스케줄
성분 출발(%) 완료(%)
옥수수 55.55 59.22
호밀 5.00 9.00
SBM(48% CP) 33.47 24.79
대두유 1.85 3.06
염 0.41 0.33
DL 메티오닌 0.21 0.14
리신 HCL 0.05 0.10
석회암 1.18 1.15
인산이칼슘 1.48 1.41
Vit/Min 0.50 0.50
TiO2 0.30 0.30
총계 100.00 100.00
영양소 공급(계산된)
CP(%) 21.50 18.06
ME(kcal/kg) 3000.0 3125.0
ME(MJ/kg) 12.55 13.08
칼슘(%) 0.90 0.85
Phos(%) 0.68 0.63
Av.Phos(%) 0.40 0.38
지방(%) 4.48 5.73
섬유질(%) 2.59 2.48
Met(%) 0.55 0.43
Cys(%) 0.36 0.32
Met+Cys(%) 0.91 0.75
Lys(%) 1.20 1.00
Try(%) 0.25 0.20
Na(%) 0.18 0.15
사료는 본 발명에 따른 지질분해효소를 포함하거나 포함하지 않은 매쉬 상태로 제조된다.
식이 및 물은 임의로 제공된다. 시험 식이는 시험 기간동안 연속적으로 급이되었다. 사료 표본은 330 g/톤으로 본 발명에 따른 지질분해효소가 선택적으로 보충된다. 상기 효소는 사료를 혼합하는 동안 건조 효소로서 첨가된다.
관찰시:
생존개체 체중(옥사 기초): 0, 21 및 42일
체중 증가: 0-21일, 22-42일, 0-42일
사료 섭취량: 0-21일, 22-42일, 0-42일
FCR(식품 전환율): 0-21일, 22-42일, 0-42일
회장 함량 수집: 21 및 42일
사료 및 가금류용 총 옥사뿐만 아니라 분석기간 당 각 옥사에 대한 사망 가금류의 총 체중 및 개체수가 측정되었다. 회복되지 않은 사망에 대한 옥사 당 사료 소비가 측정되었다. 사료 전환 효율 데이터는 생존개체 체중 및 총 체중(사망개체 체중 포함) 당 총 소비로서 측정되었다.
시험 시작 전 동물은 나쁜 건강 상태의 징후 및 상처에 대해 조사된다. 부적당한 조건이 나타난 개체는 시험에서 제거된다.
시험 동물은 무작위 기술을 이용하여 처리군으로 할당된다. 동물 및 옥사는 시험 사료의 투여 시작 전 확인된다.
처리군으로부터의 데이터는 적당한 통계 시험을 이용하고 유의성을 나타내기 위해 0.05 이하의 확률 수준을 수용하여 상대 대조군과 비교된다.
체중, 사료 섭취량 및 사료 전환율이 편차 및 최소 유의적 차이 시험의 분석에 의해 분석된다.
동물
처리 수 : 2
반복 수 : 13∼21일 및 9∼42일
반복 당 동물 : 8∼21일 및 2∼42일
동물 종 : 브로일러
동물 품종 : Ross
성별 : 수컷
시험 동물 연령 : 0∼42일
시험 동물 체중 : ∼40 g
식이/하우징
식이 정보 : 상기 참조
식이 형태 : 매쉬
출발 항콕시듐제 : 없음
완료 항콕시듐제 : 없음
출발 성장 증진제 : 없음
완료 성장 증진제 : 없음
주요 측정
변수 : 체중 증가, 사료 전환, 영양분 소화력
시기 : 0-21일, 22-42일
효소/첨가제
사용된 효소(1) : 푸사리움 세미텍툼 및/또는 푸사리움 헤테로스포룸 유래의 지질분해효소 - 330 g/톤
(실시예 16) 중국 밀가루로 제조된 인스턴트 국수의 질 상의 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83의 효과 조사
도입
인스턴트 국수(IN) 시장은 동남아시아 및 유럽과 미국 등지에서 지난 5∼8년간 현격한 성장을 나타내었다. 이러한 성장은 전통적으로 쌀 및/또는 파스타에 기반을 둔 시장인 지역에서도 명백하게 나타난다(Food Navigator, 2000). IN에 대한 최근 유행은 주로 그의 매우 적당한 가격, 편리성 및 청결한 제조 절차에 의한 것일 수 있다.
평균 단백질 함령(9∼11%), 낮은 회분 수치(∼0.05%), 높은 L*(85) 광도 및 b*(>8.0) 황변 및 높은 전분 페이스트 점도(<750 BU)를 지닌 밀가루가 크림색/황색 인스턴트 국수(IN)를 생성하고 바람직한 질감 특성을 지닌다. 일부 다른 형태의 국수가 소비되나 각각은 최종 산물의 질 상에 영향을 미치는 특정한 밀가루의 질적 특성을 지닌다.
조리된 NT의 착색 및 질감의 중요성이 과소평가될 수 없고 소비자는 점점 식별하게되고 건강에 대한 관심이 질을 손상시키지 않고 저지방 대체물을 찾게 된다.
IN의 지방 함량 상의 효과를 평가하고 가공 동안 질감 및 착색의 변화를 조사하기 위해 본 발명에 따른 지질분해효소는 중국 밀가루에 대해 시험되었다.
재료 및 방법
IN 제조시 표준 Agrifood Technology 절차 및 확장된 평가 방법이 이러한 과제를 위해 이용되었다. 중국 밀가루는 대조군 밀가루로 사용되었고 각각의 시험일의 시작시 사용되었다. 중국 밀가루의 단백질 함량, 수분, 회분, 색, 습윤 글루텐 및 당화성 활성이 인증된 방법인 AACC(American Association for Clinical Chemistry)를 이용하여 측정되었다. 반죽 유동학 시험은: 패리노그램(farinogram), 익스텐소그램(extensogram)(45분 잡아당김), 알베오그램(alveogram) 및 아밀로그램(amylogram)을 포함하였다.
IN의 각 뱃치는 350 g 밀가루로 이루어졌고 1% 염화나트륨 및 0.2% 알칼리성 염(6:4 비율의 탄산칼륨:탄산나트륨)을 함유한 염 수용액 33 중랑부가 점차 첨가되면서 저속으로 혼합되었다. 투여되는 표본에 있어서 밀가루는 염 수용액의 첨가 전 측정된 함량의 성분과 함께 완전하게 혼합되었다.
부서지기 쉬운 반죽은 중간 속도에서 4분간 추가로 혼합되었고 8배로 펼쳐졌다. 쉬팅(sheeting)은 처음에는 강철 압축기로, 이후에는 2개의 플라스틱 홈이 있는 롤러로, 마지막으로는 5개의 매끄러운 스테인레스스틸 롤러로 각각의 롤 사이의 30% 감소 비율로 수행되었다. 최종 반죽 시트 두께는 1.35 mm이었다. 반죽 시트는 절단 전에 한번 더 펼쳐졌다. 단단하게 감긴 국수 가락은 2분간 증숙되고 180℃에서 1분간 양면이 야자유 내에서 튀겨졌다. 국수 블록은 냉각되었고 추가 분석을 위해 클립 밀봉 가방에 포장되었다.
표본은 분석을 위해 몇가지 제조 단계에서 수집되었다. 부스러기의 색 및 입자 크기가 각각 Minolta Chromameter 및 부척 달린 캘리퍼스를 이용하여 측정되었다. 반죽 시트 및 최종 산물의 색은 Minolta Chromameter로 기록되었고 디지털 사진이 모두 촬영되었다(나타내지 않음). 물 활성 측정은 증숙된 국수 상에 수행되었다. 증숙 직후 및 90℃의 오븐에서 건조함으로서 수분 함량을 완전히 제거시킨 후 - 수분 함량은 건조 전후 중량 차이를 건조 후 중량으로 나눔으로서 측정될 수 있음 - 모두에 대해 증숙된 국수의 중량을 측정함으로서 물 활성이 측정되었다.
최적 조리 시간, 조리 산출량, 조리 손실량(중량 측정 방법), 조리된 국수의 색 및 질감(견고성)이 당업자에 알려져 있는 표준 Agrifood Technology 절차를 이용하여 측정되었다. 또한 응집력, 탄력성 및 저작성을 측정하기 위해 조리된 국수 질감 상의 질감 프로파일 분석(TPA)이 수행되었다.
응집력은 첫 번째 변형 하에서 생성물이 어떻게 반응하는지에 대해 두 번째 변형을 어떻게 잘 저항하는가로서 정의된다. 이는 첫 번째 압축 동안의 작용 면적으로 나누어진 두 번째 압축 동안의 작용 면적으로서 측정되고 따라서 측정 단위는 없다. 이러한 경우 응집력은 IN에 대해 바람직하지 특성이 아닌 되직한(al-dente) 생성물과 관련된다.
탄력성은 생성물이 첫 번째 압축 동안 변형된 후 어떻게 잘 물리적으로 뒤로 튕겨지는가로서 정의된다. 탄력성은 여러 가지 방법으로 측정되나 가장 일반적으로는 두 번째 압축 상의 생성물의 검출된 길이의 거리에 의해 측정된다.
저작성은 고형 생성물에만 적용되고 탄력성이 곱해진 점착성으로서 계산된다. 저작성은 점착성과 상호 배타적이다.
각 적장량 비율을 나타내는 국수 블록은 커피 분쇄기로 분쇄되고 균질한 하위 표본이 산가수분해법(지방 함량을 측정하기 위한 다른 표준 방법도 사용됨)에 의해 지방 분석에 사용되었다.
결과 및 토론
밀가루의 단백질 함량 및 색(명도, L*에 대한)은 인스턴트 국수의 제조를 위한 수용 가능한 범위 내에 존재하였다. 수분 흡수는 IN 제조를 위한 고위 종료점 상에 다소 존재하였으나 국수 반죽이 매우 부서지기 쉽기 때문에 기계능에 영향을 미치지 않았다.
밀가루는 우수한 단일 신장성(익스텐소그램) 및 2축 신장성(알베오그램)을 지녔고, 이는 국수의 식감 상에 긍정적인 영향을 미친다. 아밀로그래프의 최대 점도는 870 BU이었고, 이는 IN에 바람직한 것이다.
지질분해효소의 두 번째 최대 용량을 함유한 IN의 조리 손실량은 대조군 및 본 발명에 따른 지질분해효소의 최소 함량을 함유한 IN보다 높았다. 최대 함량의 지질분해효소를 지닌 IN의 지방 함량은 대조군 및 최소 함량의 지질분해효소를 지닌 실험 IN보다 유의적으로 낮았다. 일부 실험 IN의 탄력성 및 저작성은 대조군보다 우수하였다. 이러한 데이터를 기반으로 지질분해효소가 다른 용량으로 조사되어야 한다.
결론
본 연구로부터 이루어질 수 있는 두드러진 요점은 하기와 같다:
본 발명에 따른 지질분해효소의 IN 내로의 첨가는 부스러기 크기, 반죽 끈적임, 기계능 또는 공정 특성 상에 명백한 영향을 미치지 않았다. 중요하게는 지질분해효소 용량의 증가는 IN의 지방 함량 감소를 유발하였다. 대조군과 비교시 지질분해효소는 용량 증가에 따라 국수 견고성을 증가시킨 반면 응집성은 영향을 받지 않았다. 지질분해효소는 조리된 국수의 황변 상에 긍정적인 효과를 지녔다.
따라서 지질분해효소는 IN 내의 지방 함량을 감소시켰고 질감을 개선시켰고 조리된 국수의 황변을 증가시켰다.
상기 명세서 내에 기술된 모든 문헌은 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이가 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관련하여 기술되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정적이지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 생화학 및 생명공학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수해하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 존재하게 된다.
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cacttatggt gcacctagag ttggcaacgc cgcactgtct 540 gctttcatct cgaaccaagc aggcggtgaa tttagagtca ctcacgacaa ggacccagtg 600 cctcggcttc cacctctgat cttcggttac agacacacta ccccagagta ctggctgtca 660 ggtggcggcg gagacaaggt ggactacgca atctccgacg tgaaggtctg cgagggagcc 720 gcaaacctca tgtgtaacgg cggtacactg ggactggaca tcgacgcaca cttgcactac 780 ttccaggcaa ctgatgcttg caacgccgga ggtttctcct ggaga 825 <210> 4 <211> 352 <212> PRT <213> Fusarium semitectum <400> 4 Met Arg Val Leu Ser Leu Leu Ser Val Ala Thr Phe Ala Val Ala Ser 1 5 10 15 Pro Leu Ser Val Glu Asp Tyr Ala Lys Ala Leu Asp Glu Arg Ala Val 20 25 30 Ala Val Ser Asn Gly Asp Phe Gly Asn Phe Lys Phe Tyr Ile Gln His 35 40 45 Gly Ala Ala Ser Tyr Cys Asn Ser Asn Ala Ala Ala Gly Ala Lys Ile 50 55 60 Thr Cys Gly Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Ser Asn Gly Ala Thr 65 70 75 80 Ile Val Ala Ser Phe Thr Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly Tyr Val 85 90 95 Ser Thr Asp Ser Ser Arg Lys Glu Ile Val Leu Ser Val Arg Gly Ser 100 105 110 Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn 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gaaactccca gctcgctggc ttcatctcga accaagctgg tggagagttc 840 cgcgttacca atgccaagga ccctgttccc agacttcccc ctctggtctt tggttaccga 900 cacacatccc ccgagtactg gctgtctggt gcgggaggtg acaaggttga ctacaccatc 960 aatgacatca aggtctgtga gggtgctgcc aacctcaagt gcaacggtgg aacccttgga 1020 ttggatattg atgctcacct gcactacttc caggagactg atgcttgctc tggtggcggt 1080 atctcttgga gaagccgaag atacagaagc gccaagcgtg aggacatctc tgagagggct 1140 gctcctatga cggatgctga gcttgagaag aagctcaaca actatgtcga gatggataag 1200 gagtatgtca agaacaatgc cgcacgcacg tcatagtatg acatttacgc ggatcct 1257 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 8 tccttggaca agagagccgt tggagtgacc tctactg 37 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 9 aggatccaat tctctccatg gcctatctcc aggagaaacc tccg 44 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 10 agaattcaaa cgatgagatt cccatccatc tttaccg 37 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 11 aggtcactcc aacggctctc ttgtccaagg aaacaccttc c 41

Claims (19)

  1. 트리글리세라이드와 비교시 극성 지질 상에 높은 비율의 활성을 지닌 진균성 야생형 지질분해효소
  2. 제 1항에 있어서, 상기 효소는 적어도 4 이상의 인지질:트리글리세라이드 가수분해 활성을 지님을 특징으로 하는 진균성 야생형 지질분해효소
  3. 제 1항에 있어서, 상기 효소는 적어도 1.5 이상의 당지질:트리글리세라이드 가수분해 활성을 지님을 특징으로 하는 진균성 야생형 지질분해효소
  4. 서열번호 1 또는 서열번호 2에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 90% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열을 포함한 진균성 야생형 지질분해효소
  5. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 사상 진균으로부터 수득 가능함을 특징으로 하는 진균성 야생형 지질분해효소
  6. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 푸사리움(Fusarium) 종으로부터 수득 가능함을 특징으로 하는 진균성 야생형 지질분해효소
  7. 제 6항에 있어서, 상기 효소는 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum)으로부터 수득 가능함을 특징으로 하는 진균성 야생형 지질분해효소
  8. 제 7항에 있어서, 상기 효소는 푸사리움 헤테로스포룸 CBS 782.83으로부터 수득 가능함을 특징으로 하는 진균성 야생형 지질분해효소
  9. 제 4항 내지 제 8항의 어느 한 항에 따른 진균성 지질분해효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열
  10. a) 서열번호 3에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산;
    b) 유전자 코드의 퇴화에 의해 서열번호 3의 뉴클레오타이드과 관련된 핵산; 및
    c) 서열번호 3에 나타난 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 이상의 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 진균성 지질분해효소를 인코드하는 핵산
  11. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 따른 진균성 지질분해효소를 하나 이상의 식료품 성분에 첨가하는 단계를 포함한 식료품의 제조 방법
  12. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 따른 진균성 지질분해효소를 반죽에 첨가하는 단계 및 반죽을 베이크하여 베이크된 제품을 제조하는 단계를 포함한 베이크된 제품의 제조 방법
  13. 제 11항에 있어서, 상기 식료품은 하나 이상의: 계란 또는 계란-주성분 제품; 베이크된 제품; 과자류; 냉동 제품; 치즈를 포함한 유제품; 무스; 휘핑 채소 크림; 식용 기름 및 지방; 통기 또는 비-통기 휘핑 제품; 오일-인-워터(oil-in-water) 에멀젼 및 워터-인-오일 에멀젼; 마가린; 쇼트닝; 저지방 및 극저지방 스프레드를 포함한 스프레드; 드레싱; 마요네즈; 딥; 크림-주성분 소스; 크림 주성분 수프; 음료수; 향신료 에멀젼 및 소스임을 특징으로 하는 방법
  14. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 따른 진균성 지질분해효소로 인지질을 처리하여 리소-인지질을 생성하는 단계를 포함한 리소-인지질의 제조 방법
  15. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 따른 진균성 지질분해효소로 당지질을 처리하여 리소-당지질을 생성하는 단계를 포함한 리소-당지질의 제조 방법
  16. 존재하는 극성 지질의 주요 부분을 가수분해하기 위해 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 따른 진균성 지질분해효소로 식용유 또는 식물유를 처리하는 단계를 포함한 식용유 또는 식물유의 효소적 해교 방법
  17. 제 11항에 따른 방법에 의해 수득된 식료품
  18. 제 12항에 따른 방법에 의해 수득된 베이크된 제품
  19. 명세서 및 도면을 참고로 일반적으로 기술된 진균성 지질분해효소
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US55914904P 2004-04-02 2004-04-02
US60/559,149 2004-04-02
PCT/IB2005/000875 WO2005087918A2 (en) 2004-03-12 2005-03-10 Fungal lipolytic enzymes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060118577A true KR20060118577A (ko) 2006-11-23
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US (2) US7622290B2 (ko)
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CA (1) CA2559164C (ko)
DE (1) DE602005023838D1 (ko)
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GB (1) GB0405637D0 (ko)
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SI (1) SI1722636T1 (ko)
WO (1) WO2005087918A2 (ko)
ZA (1) ZA200606745B (ko)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
EP1098988B9 (en) 1998-07-21 2007-10-24 Danisco A/S Foodstuff
US7312062B2 (en) 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
AU2002339115B2 (en) 2001-05-18 2007-03-15 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method of preparing a dough with an enzyme
MXPA05007653A (es) 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
US20050196766A1 (en) 2003-12-24 2005-09-08 Soe Jorn B. Proteins
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
GB0716126D0 (en) 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
WO2008090395A1 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Danisco A/S Production of a lipid acyltransferase from transformed bacillus licheniformis cells
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
KR101226156B1 (ko) 2004-07-16 2013-01-24 듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스 효소적 오일-탈검 방법
WO2007090829A2 (en) * 2006-02-06 2007-08-16 Novozymes A/S Screening method for selecting lipolytic enzymes as bakery improvers
WO2007096201A2 (en) * 2006-02-23 2007-08-30 Dsm Ip Assets B.V. Novel upases and uses thereof
DK2044188T3 (en) * 2006-07-14 2015-12-14 Novozymes As Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding them
EP2118299A1 (en) * 2007-01-11 2009-11-18 Danisco US, INC., Genencor Division Enzyme production in culture medium comprising raw glycerol
CN101589142B (zh) 2007-01-30 2012-06-06 三菱化学食品株式会社 甘油糖脂脂肪酶
DK2235151T3 (da) * 2007-12-21 2012-11-19 Dupont Nutrition Biosci Aps Fremgangsmåde til raffinering af spiseolie ved anvendelse af en lipid-acyltransferase
CN102016015B (zh) 2008-02-29 2014-09-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对短链脂肪酸具有高度特异性的脂肪酶及其用途
DK2387330T3 (en) 2009-01-16 2018-02-05 Dupont Nutrition Biosci Aps ENZYMATIC GENERATION OF FUNCTIONAL LIPIDS OUT OF CORN CHLIDE EXTRACT
CN102421302A (zh) 2009-03-31 2012-04-18 丹尼斯科公司 防止植物细胞壁材料溶解过程中提取物变暗和恶臭形成
GB0922467D0 (en) * 2009-04-24 2010-02-03 Danisco Feed supplement
MX2011012313A (es) * 2009-05-19 2011-12-12 Danisco Uso.
CA2766009A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Danisco A/S Variant lipolytic enzymes with improved expression, functionality and/or activity
WO2011114251A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Danisco A/S Foodstuff
PL2401923T3 (pl) 2010-06-30 2013-08-30 Loders Croklaan Bv Przetwarzanie olejów roślinnych
WO2012021735A2 (en) * 2010-08-11 2012-02-16 Menon & Associates, Inc. Pharmaceutical products from gungal strains
EP2486799A1 (en) * 2011-02-14 2012-08-15 DSM IP Assets B.V. Method to produce cake with lipolytic enzyme and alpha-amylase
WO2012130969A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Novozymes A/S Process for production of a baked product
US20140031272A1 (en) 2011-04-08 2014-01-30 Danisco Us Inc. Compositions
JP6216495B2 (ja) * 2011-04-19 2017-10-18 三菱ケミカルフーズ株式会社 小麦粉膨化食品の製造方法
US20140220217A1 (en) 2011-07-12 2014-08-07 Maraxi, Inc. Method and compositions for consumables
WO2013010037A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 Lyrical Foods, Inc. Methods and compositions for consumables
CN103889243A (zh) 2011-07-12 2014-06-25 马拉克西公司 用于消费品的方法和组合物
US20140287477A1 (en) * 2011-10-28 2014-09-25 Danisco Us Inc. Variant Maltohexaose-Forming Alpha-Amylase Variants
EP2825051B1 (en) * 2012-03-14 2016-02-24 Novozymes A/S Method of baking
US10039306B2 (en) 2012-03-16 2018-08-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US20150140168A1 (en) * 2012-04-25 2015-05-21 Novozymes A/S Method of Baking
WO2013181647A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Danisco Us Inc. Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms
US8442792B1 (en) 2012-10-26 2013-05-14 Elbex Video Ltd. Method and apparatus for calibrating intelligent AC outlets
CA3113417C (en) 2013-01-11 2023-03-07 Impossible Foods Inc. Non-dairy cheese replica comprising a coacervate
ES2930853T3 (es) 2013-01-11 2022-12-22 Impossible Foods Inc Sustituto de carne y método para aportar un sabor similar al de la carne a un sustituto de carne
CN105518130A (zh) 2013-06-21 2016-04-20 丹尼斯科美国公司 用于梭菌转化的组合物和方法
EP3117001B1 (en) * 2014-03-12 2019-02-20 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
KR102669270B1 (ko) 2014-03-31 2024-05-27 임파서블 푸즈 인크. 재조합 효모
GB201522603D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Dupont Nutrition Biosci Aps Composition
WO2017186891A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Puratos Nv Improved bakery products
BE1024782B1 (nl) * 2016-07-11 2018-07-02 Puratos Nv Verbeterde samenstelling voor bakkerijproducten
EP3547839A1 (en) * 2016-11-30 2019-10-09 Novozymes A/S Method of baking
WO2018114938A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Lipolytic enzyme variants
WO2018114912A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Lipolytic enzyme variants
EP3559221A1 (en) 2016-12-21 2019-10-30 DSM IP Assets B.V. Lipolytic enzyme variants
US10918113B2 (en) 2016-12-21 2021-02-16 Dsm Ip Assets B.V. Lipolytic enzyme variants
EP3461350A1 (en) 2017-09-28 2019-04-03 DuPont Nutrition Biosciences ApS A food composition with enhanced shelf stability
AU2018387151B2 (en) 2017-12-19 2024-05-02 International N&H Denmark Aps Improved enzymatic modification of phospholipids in food
WO2019121874A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Dupont Nutrition Biosciences Aps Composition comprising lecithin and triglycerides
CN110685020B (zh) * 2019-11-11 2020-09-04 南宁雄晋生物科技有限公司 一种用于天然彩色蚕丝脱胶固色的复合酶及其使用方法
EP4225046A1 (en) * 2021-05-07 2023-08-16 The Better Meat Company Enhanced aerobic fermentation methods for producing edible fungal mycelium blended meats and meat analogue compositions
WO2023092018A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Dupont Nutrition Biosciences Aps Improved enzymatic modification of galactolipids in food
CN115074180A (zh) * 2022-05-18 2022-09-20 中国农业科学院油料作物研究所 油料提质生香的预处理装置及方法
CN115152957B (zh) * 2022-06-30 2023-07-18 东莞市永恒食品有限公司 一种低糖黄油蛋卷及其制作方法
WO2024015974A1 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Improved enzymatic modification of phospholipids in food

Family Cites Families (253)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT110768B (de) 1927-09-29 1928-10-10 Patiag Patentverwertungs Und I Windkraftmaschine.
US2888385A (en) 1952-11-28 1959-05-26 Grandel Felix Process of making a preparation containing lipases and oxidases
US3260606A (en) 1964-04-29 1966-07-12 Taiyo Food Co Ltd Enzymatic treatment of egg
GB1092775A (en) 1965-07-07 1967-11-29 Knud Aunstrup Preparation of amyloglucosidase
US3368903A (en) 1966-02-18 1968-02-13 Vanderbilt Co R T Baked goods dough and method
CH461935A (fr) 1966-05-03 1968-08-31 Menzi Robert Procédé de fabrication de pâtes alimentaires séchées
DE1900959A1 (de) 1969-01-09 1970-08-27 Unilever Nv Verfahren zur Herstellung von Pflanzenphosphatiden mit universeller Emulgierkraft
US3634195A (en) 1969-09-08 1972-01-11 Miles Lab Production of lipase
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
GB1375783A (ko) 1972-02-04 1974-11-27
GB1442418A (en) 1972-12-14 1976-07-14 Procter & Gamble Method of cleansing polyester-containing fabrics
IL46862A (en) 1974-04-08 1977-12-30 Baxter Travenol Lab Lipolytic enzyme flavoring system for fat-containing food
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3973042A (en) 1974-05-10 1976-08-03 Cornell Research Foundation, Inc. Flavor development by microbial lipases in pasteurized milk blue cheese
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
GB1525929A (en) 1974-11-25 1978-09-27 Unilever Ltd Stabilised emulsions comprising phospholipoprotein
GB1577933A (en) 1976-02-11 1980-10-29 Unilever Ltd Fat process and composition
US4160848A (en) 1977-04-18 1979-07-10 Pennwalt Corporation Antistaling agent for bakery products
JPS6049477B2 (ja) 1977-04-19 1985-11-01 協和醗酵工業株式会社 グリセロ−ル酸化酵素およびその製造法ならびにグリセロ−ル酸化酵素を用いるグリセロ−ルの定量法
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
JPS5850719B2 (ja) 1978-10-18 1983-11-11 協和醗酵工業株式会社 トリグリセライドの定量方法
US4399218A (en) 1980-02-05 1983-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Method and reagent for the determination of glycerin
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
WO1982003873A1 (en) 1981-05-07 1982-11-11 Halling Peter James Fat processing
JPS6030488B2 (ja) 1982-11-10 1985-07-17 協和醗酵工業株式会社 生地の改良剤およびそれを含有してなる生地
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DK289083A (da) 1983-06-23 1984-12-24 Novo Industri As Lipase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
DK402583D0 (da) 1983-09-05 1983-09-05 Novo Industri As Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf
DK152763C (da) 1983-09-05 1988-10-24 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat
US4707364A (en) 1984-01-27 1987-11-17 Miles Laboratories, Inc. Composition for accelerating cheese aging
US4636468A (en) 1984-06-25 1987-01-13 Genencor, Inc. Lipolytic enzyme derived from a aspergillus microorganism having an accelerating effect on cheese flavor development
CA1262654A (en) 1984-08-10 1989-11-07 Takaoki Torigoe Food quality improving agent
NL8402979A (nl) 1984-09-28 1986-04-16 Tno Werkwijze voor het bestrijden van vaatverwelkingsziekten bij gewassen, in het bijzonder de iepeziekte.
JPS61181390A (ja) 1985-02-06 1986-08-14 Amano Pharmaceut Co Ltd 酵素によるグリセライドの製造法
US4689297A (en) 1985-03-05 1987-08-25 Miles Laboratories, Inc. Dust free particulate enzyme formulation
US5219733A (en) 1985-03-06 1993-06-15 Yoshikawa Oil & Fat Co., Ltd. Process for preparing fatty acid esters
DE3672270D1 (de) 1985-03-06 1990-08-02 Yoshikawa Oil & Fat Verfahren zur herstellung von fettsaeureestern.
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS61242542A (ja) 1985-04-22 1986-10-28 Fuji Oil Co Ltd チ−ズ風味材の製造法
US5310679A (en) 1985-05-13 1994-05-10 Artiss Joseph D Composition for reducing turbidity in samples of biological fluids
GB8514707D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
GB8514708D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
GB8525012D0 (en) 1985-10-10 1985-11-13 Cpc International Inc Carbohydrate refining process
GB2185990B (en) 1986-02-05 1990-01-24 Unilever Plc Margarine fat
US5536661A (en) 1987-03-10 1996-07-16 Novo Nordisk A/S Process for the production of protein products in aspergillus
US5874558A (en) 1986-03-17 1999-02-23 Novo Nordisk Nucleic acid encoding a recombinant humicola sp. lipase
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5766912A (en) 1986-03-17 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Humicola lipase produced in aspergillus
JPS62262997A (ja) 1986-05-02 1987-11-16 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ワツクスの製造方法
JPS6344892A (ja) 1986-08-13 1988-02-25 Kao Corp 油脂類のエステル交換反応方法
DK157560C (da) 1986-08-29 1990-06-11 Novo Nordisk As Enzymatisk detergentadditiv, detergent indeholdende det enzymatiske detergentadditiv og fremgangsmaade til vask af tekstiler.
DE3750450T2 (de) 1986-08-29 1995-01-05 Novo Industri As Enzymhaltiger Reinigungsmittelzusatz.
EP0260573A3 (de) 1986-09-18 1989-03-22 Lucas Meyer GmbH &amp; Co Verfahren zur Herstellung eines hydrolysierten Lecithins, sowie Anwendung des hydrolysierten Lecithins
US5273898A (en) 1986-10-17 1993-12-28 Noro Nordisk A/S Thermally stable and positionally non-specific lipase isolated from Candida
US5108457A (en) 1986-11-19 1992-04-28 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system with modified enzyme
KR900003014B1 (ko) 1986-12-27 1990-05-04 도오아 야꾸힌 고오교오 가부시끼가이샤 양식어(養殖魚)용 사료 첨가제
US5219744A (en) 1987-08-26 1993-06-15 Ajinomoto Co., Inc. Process for modifying fats and oils
ATE125865T1 (de) 1987-08-28 1995-08-15 Novo Nordisk As Rekombinante humicola-lipase und verfahren zur herstellung von rekombinanten humicola-lipasen.
ATE77203T1 (de) 1987-12-21 1992-07-15 Cultor Oy Methode zur verbesserung von mehlteig.
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
DK77788A (da) 1988-02-16 1989-08-17 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af kokosnoedolie
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
EP0334462B2 (en) 1988-03-25 2002-04-24 Genencor International, Inc. Molecular cloning and expression of genes encoding lipolytic enzymes
US5232846A (en) 1988-08-09 1993-08-03 Unitika Ltd. Method for producing a thermostable lipoprotein lipase from streptomyces
GB8906837D0 (en) 1989-03-23 1989-05-10 Unilever Plc Bread improvers
DE3920561A1 (de) 1989-06-23 1991-01-10 Knoll Ag Verfahren zur vermeidung von verdauungsstoerungen bei pflanzenfressenden tieren
US5213968A (en) 1989-08-21 1993-05-25 Nestec S.A. Process for preparing emulsifying agents
DE69004782T2 (de) 1989-09-29 1994-03-17 Unilever Nv Getrocknetes Lyso-Phospholipoprotein enthaltendes Nahrungsmittel.
US5677160A (en) 1989-10-30 1997-10-14 Henkel Corporation Fat splitting process
US5288619A (en) 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
JPH03262492A (ja) 1990-03-06 1991-11-22 P Macneil Gerald モノグリセリドの製造方法
DK19991D0 (da) 1991-02-06 1991-02-06 Novo Nordisk As Proteinpraeparationer
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
WO1991017243A1 (en) 1990-05-09 1991-11-14 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
US5814501A (en) 1990-06-04 1998-09-29 Genencor International, Inc. Process for making dust-free enzyme-containing particles from an enzyme-containing fermentation broth
EP0468731A1 (en) 1990-07-26 1992-01-29 Oriental Yeast Co., Ltd. Bread improver and method of producing bread
US5892013A (en) 1990-09-13 1999-04-06 Novo Nordisk A/S Lipase variants
DE69129988T2 (de) 1990-09-13 1999-03-18 Novo Nordisk As Lipase-varianten
US5869438A (en) 1990-09-13 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
CA2058056C (en) 1990-12-21 1996-11-05 Chiaki Saito Method of decreasing cholesterol concentration in food
PH31068A (en) 1991-03-07 1998-02-05 Ici Plc Process for the production of terephthalic acid.
DE4112440C1 (ko) 1991-04-16 1992-10-22 Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De
US5914306A (en) 1991-05-01 1999-06-22 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes
DE4115938A1 (de) 1991-05-16 1992-11-19 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen
CA2077020A1 (en) 1991-09-03 1993-03-04 Yoshikazu Isono Process for producing lipoprotein-containing substance having reduced lipid content and food containing substance thus produced
US5879920A (en) 1991-10-07 1999-03-09 Genencor International, Inc. Coated enzyme-containing granule
ES2082354T3 (es) 1991-11-11 1996-03-16 Akzo Nobel Nv Procedimiento para la preparacion de granulados de sal.
EP0558112A1 (en) 1992-02-25 1993-09-01 Unilever N.V. Enzymic diglyceride removal
CA2079839A1 (en) 1992-02-28 1993-08-29 Vincent Destefanis Calcium peroxide and ascorbic acid containing compositions as replacements for bromate in breadmaking
GB2267033B (en) 1992-03-07 1996-01-24 David Garnett Lysophospholipid Animal Feed Supplement
DK42092D0 (ko) 1992-03-27 1992-03-27 Novo Nordisk As
DK73592D0 (da) 1992-06-03 1992-06-03 Novo Nordisk As Nyt enzym
DK0575133T4 (da) 1992-06-16 2008-10-20 Sankyo Lifetech Company Ltd Hidtil ukendt Phospholipase A1, fremgangsmåde til fremstilling deraf og anvendelsen deraf
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
EP0580252A2 (en) 1992-07-20 1994-01-26 Quest International B.V. Improvements in or relating to pectin methyl esterase
EP0585988B1 (en) 1992-07-27 1996-03-13 Gist-Brocades N.V. Enzyme product and method for improving bread quality
DK104592D0 (da) 1992-08-21 1992-08-21 Novo Nordisk As Fremgangsmaade
DK0673429T3 (da) 1992-12-10 2002-10-07 Dsm Nv Fremstilling af heterologe proteiner i filamentøse svampe
US5763383A (en) 1992-12-22 1998-06-09 Novo Nordisk A/S Alkaline lipases
DK154292D0 (da) 1992-12-23 1992-12-23 Novo Nordisk As Nyt enzym
JP2937746B2 (ja) 1993-04-25 1999-08-23 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
ZA943640B (en) 1993-06-07 1995-01-26 Buckman Labor Inc Synergistically stabilized liquid enzymatic compositions
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
DE69429611D1 (de) 1993-10-29 2002-02-14 Dsm Nv Backverbesserende Zusammensetzungen
EP0652289A1 (en) 1993-11-05 1995-05-10 Unilever Plc Random interesterification of triglyceride fats
DE4339556C1 (de) 1993-11-19 1995-02-02 Metallgesellschaft Ag Verfahren zum Entschleimen von Pflanzenöl mittels Enzymen
DK0659344T3 (da) 1993-12-24 2001-10-29 Dsm Nv Tørgærsblanding
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
JP3670284B2 (ja) 1994-02-21 2005-07-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 固定化酵素調製品の製造方法および固定化酵素調製品の使用
AU1806795A (en) 1994-02-22 1995-09-04 Novo Nordisk A/S A method of preparing a variant of a lipolytic enzyme
US5834280A (en) 1994-05-03 1998-11-10 Novo Nordisk A/S Glucose oxidases obtained from a cladosporium
US5741665A (en) 1994-05-10 1998-04-21 University Of Hawaii Light-regulated promoters for production of heterologous proteins in filamentous fungi
DE69501228T2 (de) 1994-05-11 1998-05-07 Amano Pharma Co Ltd Ascorbatoxidase, dafür kodierendes Gen, Verfahren zu ihrer Herstellung und dieselbe verwendende Reagens-Zusammensetzung
MX9600483A (es) 1994-06-16 1997-06-28 Firmenich & Cie Composicion saborizante o sazonadora y proceso.
ATE197371T1 (de) 1994-06-17 2000-11-11 Dsm Nv Zusammensetzung zur brotverbesserung
US5830736A (en) 1994-10-26 1998-11-03 Novo Nordisk A/S Lipolytic enzyme
CN1167503A (zh) 1994-10-26 1997-12-10 诺沃挪第克公司 一种具有脂解活性的酶
JPH10507639A (ja) 1994-10-26 1998-07-28 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素界面活性剤組成物
GB2296011B (en) 1994-12-13 1999-06-16 Solvay Novel fusarium isolate and lipases, cutinases and enzyme compositions derived therefrom
US6093562A (en) * 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
JP3394975B2 (ja) 1995-02-22 2003-04-07 セレスター ユーエスエー インク 動物性脂肪からステロールおよび遊離脂肪酸を削減する方法
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
JP3359777B2 (ja) 1995-03-06 2002-12-24 日清製粉株式会社 油揚げ即席麺およびその製造方法
DE69628642T2 (de) 1995-03-30 2004-05-13 Novozymes A/S Alkalisches lypolitsches enzym
US5919746A (en) 1995-03-30 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
US5989599A (en) 1995-04-24 1999-11-23 Nestec S.A. Process for the interesterification of phospholipids
EP0743017B1 (en) 1995-05-15 2004-09-29 DSM IP Assets B.V. Application of phospholipases in animal feed
GB2301103B (en) 1995-05-23 1999-12-22 Danisco An enzyme system comprising ferulic acid esterase
WO1998044804A1 (en) 1997-04-09 1998-10-15 Danisco A/S Improved method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase
DE69623473T3 (de) 1995-06-07 2009-04-23 Danisco A/S Rekombinante hexose oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung
GB0112226D0 (en) * 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
CA2224203C (en) * 1995-06-07 2003-08-12 Jorn Borch Soe A method for improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
GB0211975D0 (en) 2002-05-24 2002-07-03 Danisco Method
US6936289B2 (en) * 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
US6495357B1 (en) 1995-07-14 2002-12-17 Novozyme A/S Lipolytic enzymes
JP4307549B2 (ja) 1995-07-14 2009-08-05 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 脂肪分解活性を有する修飾された酵素
DE19527274A1 (de) 1995-07-26 1997-01-30 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase
ES2221934T3 (es) 1995-08-11 2005-01-16 Novozymes A/S Nuevas enzimas lipoliticas.
WO1997011083A1 (en) 1995-09-22 1997-03-27 Medical Research Council Improvements in or relating to mutagenesis of nucleic acids
ATE212189T1 (de) 1995-12-01 2002-02-15 Unilever Nv Mikrowellen erhitzbare knusperige brötchen
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6344328B1 (en) 1995-12-07 2002-02-05 Diversa Corporation Method for screening for enzyme activity
US5756328A (en) 1995-12-20 1998-05-26 Cornell Research Foundation, Inc. Acyltransferase and cDNA encoding acyltransferase
US5942430A (en) 1996-02-16 1999-08-24 Diversa Corporation Esterases
US6001586A (en) 1996-03-29 1999-12-14 Genencor International, Inc. Compartmentalization method for screening microorganisms
WO1997041212A1 (en) 1996-04-25 1997-11-06 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
DE19620649A1 (de) 1996-05-22 1997-11-27 Roehm Gmbh Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus
JPH10155493A (ja) 1996-10-04 1998-06-16 Sankyo Co Ltd アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子
JP3182381B2 (ja) 1996-10-25 2001-07-03 日清製粉株式会社 麺類の機械製麺法
DE19648343C1 (de) 1996-11-22 1998-02-12 Roehm Gmbh Verfahren zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung
JP3582265B2 (ja) 1996-11-28 2004-10-27 味の素株式会社 改質穀粉及びこれを使用した穀粉加工食品
ES2183113T5 (es) * 1996-12-09 2010-03-31 Novozymes A/S Reduccion de componentes con contenido en fosfolipidos en aceites comestibles conteniendo una cantidad elevada de fosforo no hidratable con el uso de una fosfolipasa, de una fosfolipasa de un hongo filamentoso que presenta actividad de fosfolipasa a y/o b.
US6103505A (en) 1996-12-09 2000-08-15 Novo Nordisk A/S Method for reducing phosphorus content of edible oils
DE19701348A1 (de) 1997-01-16 1998-07-23 Roehm Gmbh Protein mit Phospholipaseaktivität
US5821102A (en) 1997-01-21 1998-10-13 Novo Nordisk Biotech Inc. Nucleic acids encoding polyeptides having absidia lipase activity
EP0882797B1 (en) 1997-06-04 2003-07-16 Loders Croklaan B.V. Preparation of symmetrical triglycerides aba
RU2140751C1 (ru) 1997-06-11 1999-11-10 Ассоциация "Ассоя" Пищевая добавка для производства хлеба и хлебобулочных изделий
JP4121186B2 (ja) 1997-06-16 2008-07-23 株式会社日立製作所 セラミックス管の検査方法及びその装置
EP0913468A3 (en) 1997-07-22 2001-06-13 Dsm N.V. Bread improving comüposition
DE69827712T3 (de) 1997-07-31 2009-07-09 Dsm Ip Assets B.V. Zusammensetzung für Brotverbesserung
DE69830119T2 (de) 1997-10-31 2006-02-23 Amano Enzyme Inc., Nagoya Teigzusammensetzung und derer Herstellung
US6156548A (en) 1997-12-23 2000-12-05 Novo Nordisk A/S Immobilization of enzymes with a fluidized bed for use in an organic medium
WO1999033964A1 (en) 1997-12-23 1999-07-08 Novo Nordisk A/S A process for immobilisation of enzymes
AU3247699A (en) 1998-02-17 1999-09-06 Novo Nordisk A/S Lipase variant
AU3026399A (en) 1998-04-08 1999-11-01 Novo Nordisk A/S An enzymatic oil-degumming process
US6815190B1 (en) * 1998-04-12 2004-11-09 Novozymes A/S Cutinase variants
ES2188143T5 (es) 1998-04-20 2008-11-01 Novozymes A/S Preparacion de masa y de productos horneados.
US6365204B1 (en) 1998-04-20 2002-04-02 Novozymes Preparation of dough and baked products
US6866837B2 (en) 1998-06-05 2005-03-15 Mallinckrodt Inc. Radiolabeled peptides for the diagnosis and treatment of breast and prostate tumors and metastases of such tumors
US20030074695A1 (en) * 1998-06-24 2003-04-17 Farese Robert V. Plant diacylglycerol O-acyltransferase and uses thereof
ATE442435T1 (de) * 1998-07-02 2009-09-15 Calgene Llc Diacylglyzerin-acyltransferase proteine
SE510497C2 (sv) 1998-07-15 1999-05-31 Biofeed Thailand Co Ltd Funktionellt födoämne innehållande mikroorganismer
EP1098988B9 (en) 1998-07-21 2007-10-24 Danisco A/S Foodstuff
JP3414652B2 (ja) 1998-10-12 2003-06-09 敷島製パン株式会社 小麦粉焼成品、その製造方法および品質改良剤
CN1085252C (zh) * 1998-11-05 2002-05-22 无锡轻工大学发酵工程发展公司 微生物脂肪酶酶法合成酯的方法
AU768657B2 (en) 1998-11-10 2003-12-18 Novozymes Japan, Ltd. Polypeptides having lysophospholipase activity and nucleic acids encoding same
US7312062B2 (en) * 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
RU2235775C2 (ru) 1998-11-27 2004-09-10 Новозимс А/С Способ получения варианта липолитического фермента и липолитический фермент (варианты)
EP1131416B1 (en) 1998-11-27 2009-09-02 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
PL199746B1 (pl) 1998-12-04 2008-10-31 Novozymes As Wariant kutynazy macierzystej, sekwencja DNA kodująca wariant kutynazy macierzystej, wektor zawierający sekwencję DNA, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania wariantu kutynazy macierzystej, sposób hydrolizy enzymatycznej cyklicznego oligomeru poli(tereftalanu etylenu), sposób barwienia poliestrowej tkaniny lub przędzy, kompozycja detergentowa i sposób polepszania wykończenia specjalnego przędzy lub tkaniny zawierającej PET
JP2000226335A (ja) 1998-12-04 2000-08-15 Amano Pharmaceut Co Ltd 経口用酵素製剤、酵素含有食材及び酵素製剤の服用方法
US6399121B1 (en) * 1999-03-16 2002-06-04 Novozymes A/S Process for producing cheese
NZ513959A (en) 1999-03-16 2003-08-29 Novozymes As Process for producing cheese
US6964944B1 (en) 1999-06-02 2005-11-15 Novozymes A/S Chemically modified lipolytic enzyme
EP1057415A1 (en) 1999-06-04 2000-12-06 Societe Des Produits Nestle S.A. Lipase-treated pasta and manufacturing process
US6511052B1 (en) * 1999-08-06 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Humidifying gas induction or supply system
US6254645B1 (en) 1999-08-20 2001-07-03 Genencor International, Inc. Enzymatic modification of the surface of a polyester fiber or article
US6337187B1 (en) * 1999-11-05 2002-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18891, a novel human lipase
EP1224267B1 (en) 1999-10-14 2011-01-05 Novozymes A/S Lysophospholipase from aspergillus
US6146869A (en) 1999-10-21 2000-11-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having phospholipase B activity and nucleic acids encoding same
GB2358784B (en) 1999-12-03 2004-06-30 Danisco Method of improving dough and bread quality
AU1723801A (en) 1999-12-03 2001-06-12 Danisco A/S Method of improving dough and bread quality
GB9928968D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Danisco Enzyme
US7078205B2 (en) * 2000-02-17 2006-07-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding melanoma associated antigen molecules, aminotransferase molecules, atpase molecules, acyltransferase molecules, pyridoxal-phosphate dependent enzyme molecules and uses therefor
DE10119972A1 (de) 2000-04-15 2002-05-23 Nikolaus Weber Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Fettsäuresterylestern aus Dämpferdestillaten der Fettraffination und Tallöl
AU2001254622A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Novozymes A/S Laccase mutants
US6558715B1 (en) * 2000-10-31 2003-05-06 Novozymes Biotech, Inc. Methods for using lipases in baking
EP2287296A1 (en) 2000-06-26 2011-02-23 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
US6432898B1 (en) 2000-10-31 2002-08-13 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having lipase activity and nucleic acids encoding same
US6506588B2 (en) 2000-06-26 2003-01-14 Novozymes, A/S Lipolytic enzymes
US6511837B2 (en) 2000-06-26 2003-01-28 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
US6509182B2 (en) 2000-06-26 2003-01-21 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
EP1298205A4 (en) 2000-07-03 2004-06-16 Mochida Pharm Co Ltd NEW LIPASE
EP1301080B1 (en) * 2000-07-06 2011-09-14 Novozymes A/S Method of preparing a dough, or a baked product made from a dough, with addition of lipolytic enzymes
EP1309677B2 (en) 2000-08-11 2012-04-11 Genencor International, Inc. Bacillus transformation, transformants and mutant libraries
WO2002000908A2 (en) * 2000-09-25 2002-01-03 Novozymes A/S Methods for processing crustacean material
US6660491B2 (en) * 2000-11-24 2003-12-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. Process for producing dietary sterol fatty acid esters
KR20030078065A (ko) 2001-02-21 2003-10-04 노보자임스 에이/에스 녹말 식품의 제법
AU2002339115B2 (en) 2001-05-18 2007-03-15 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method of preparing a dough with an enzyme
US6645749B2 (en) 2001-05-25 2003-11-11 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
US7630836B2 (en) 2001-05-30 2009-12-08 The Kitasato Institute Polynucleotides
DE50115482D1 (de) 2001-07-11 2010-06-24 Cognis Ip Man Gmbh Lipase/Acyltransferase aus Candida parapsilosis
ATE342374T1 (de) 2001-08-22 2006-11-15 Haerting Thomas Francis Verfahren zur herstellung von sterol- und stanolestern mittels enzymatischer transesterifikation in lösungsmittel- und wasserfreien medien
DE10142014B4 (de) * 2001-08-28 2004-11-11 Degussa Bioactives Deutschland Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin
GB0121387D0 (en) 2001-09-04 2001-10-24 Danisco Modified hydrolases
US7226771B2 (en) 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
SE0201581D0 (sv) 2002-05-29 2002-05-29 Scandinavian Biotechnology Res New improved acyltransferase
WO2003102118A2 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the pre-treatment of vegetable oils for physical refining
WO2004004467A1 (en) 2002-07-03 2004-01-15 Novozymes A/S Treatment of dough with a lipoxygenase and a lipolytic enzyme
PL214792B1 (pl) 2002-08-19 2013-09-30 Dsm Ip Assets B V Wyizolowane polinukleotydy, wektor, wyizolowane enzymy lipolityczne, sposób wytwarzania enzymów lipolitycznych, rekombinowane komórki gospodarza, sposób wytwarzania ciasta, sposób wytwarzania wyrobu piekarniczego oraz zastosowanie enzymu lipolitycznego
CA2403025A1 (en) 2002-10-08 2004-04-08 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Enzymes with lipase/acyltransferase activity
GB2379165A (en) 2002-10-22 2003-03-05 Dsm Nv Animal feed
JP4300839B2 (ja) 2002-11-14 2009-07-22 セイコーエプソン株式会社 画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラム
JP4851093B2 (ja) 2002-12-11 2012-01-11 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 洗剤組成物
ATE389731T1 (de) 2002-12-12 2008-04-15 Novozymes As Verfahren zur auswahl eines lipolytischen enzyms
JP2006511725A (ja) 2002-12-23 2006-04-06 ノボザイムス ノース アメリカ，インコーポレイティド ポリエステル布の処理方法
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
JP4778887B2 (ja) 2003-01-17 2011-09-21 ダニスコ エイ／エス 脂質アシルトランスフェラーゼの使用
MXPA05007653A (es) 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
WO2004064997A1 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Inotech Ag New microcapsules useful as extraction means in particular for extracting water or soil contaminants
WO2004097012A2 (en) 2003-04-28 2004-11-11 Novozymes A/S Phospholipase and method of producing it
EP1639102A2 (en) * 2003-06-19 2006-03-29 Novozymes A/S Phospholipase variants
WO2005005977A2 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Applera Corporation Fluorescent phospholipase assays and compositions
WO2005007818A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 Genencor International, Inc. Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof
JP4327536B2 (ja) 2003-09-01 2009-09-09 レシップ株式会社 券硬貨投入口及びそれを備えた券硬貨分離装置
DK2292743T3 (da) 2003-12-03 2013-11-25 Danisco Us Inc Perhydrolase
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
JP5697294B2 (ja) 2003-12-24 2015-04-08 デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエス 糖脂質アシル基転移酵素変異体及びその製造方法
BRPI0418107A (pt) 2003-12-24 2007-04-17 Danisco tratamento enzimático de óleos
EP1718724B1 (en) 2004-02-24 2008-08-27 Novozymes A/S Enzyme stabilization in liquid detergents
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
KR101226156B1 (ko) 2004-07-16 2013-01-24 듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스 효소적 오일-탈검 방법
EP1624047B1 (en) 2004-08-06 2006-10-18 De Smet Engineering N.V. Oil recuperation process
EP1794297B1 (en) 2004-09-21 2011-02-23 Novozymes A/S Subtilases
WO2006039541A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 Novozymes, Inc. Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
DE102005039836A1 (de) 2005-08-23 2007-03-01 Cognis Ip Management Gmbh Sterolesterpulver
EP1788080A1 (en) 2005-11-22 2007-05-23 Süd-Chemie Ag Use of a thermostable phospholipase in the degumming of an oil or fat, and a method for obtaining a thermostable phopholipase
CN101200754B (zh) 2007-12-07 2010-06-02 中国农业科学院油料作物研究所 无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法

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