PT1722636E - Enzimas lipolíticas fúngicas - Google Patents

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Jorn Borch Soe
Janne Brunstedt
Joern Dalgaard Mikkelsen
Henrik Pedersen
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Description

DESCRIÇÃO "ENZIMAS LIPOLÍTICAS FÚNGICAS"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas enzimas lipolíticas fúngicas e a um ou mais polinucleótidos codificando uma ou mais enzimas lipolíticas fúngicas novas. A invenção também se refere a métodos de produção de enzimas lipolíticas fúngicas e suas utilizações. A presente invenção refere-se, adicionalmente, à preparação de um género alimentício melhorado, em particular à preparação de produtos de panificação melhorados. Especificamente, a invenção proporciona novas enzimas lipolíticas fúngicas, enzimas que são capazes de conferirem características melhoradas a produtos alimentares, incluindo produtos de panificação.
ANTECEDENTES TÉCNICOS A utilização benéfica de enzimas lipolíticas (E.C.3.1,1.x) em alimentos e/ou aplicações industriais alimentares é conhecida há muitos anos.
Por exemplo, no documento ep 0585988 é reivindicado que a adição de lipase a massa, resultou num melhoramento no efeito antiendurecimento. É sugerido que uma lipase obtida de Rhizopus arrhizus, quando adicionada a massa, pode melhorar a qualidade 1 do pão resultante, quando utilizada em combinação com manteiga/gordura. 0 documento W094/04035 ensina que pode ser obtida uma macieza de pão melhorada através da adição de uma lipase a massa, sem a adição de qualquer gordura/óleo adicional à massa. Castello, P. ESEGP 89-10 Dez. de 1999, Helsínquia, mostra que as lipases exógenas podem modificar o volume do pão. O substrato para lipases em farinha de trigo é 1,5-3% de lípidos de trigo endógenos que são uma mistura complexa de lípidos polares e não polares. Os lípidos polares podem ser divididos em glicolípidos e fosfolípidos. Estes lípidos são compostos por glicerol esterificado com dois ácidos gordos e um grupo polar. O grupo polar contribui para a tensioactividade destes lípidos. A clivagem enzimática de um dos ácidos gordos nestes lípidos conduz a lípidos com uma tensioactividade muito superior. É sabido que emulsionantes, tal como DATEM, com tensioactividade elevada, são muito funcionais quando adicionados a massa.
As enzimas lipolíticas hidrolisam um ou mais dos ácidos gordos de lípidos presentes nos alimentos, o que pode resultar na formação de poderosas moléculas emulsionantes dentro do género alimentício que proporcionam uma funcionalidade comercialmente valiosa. As moléculas que contribuem com as características emulsionantes mais significativas são os produtos de hidrólise parcial, tais como moléculas de lisofosfolípidos, lisoglicolípidos e monoglicéridos. Os produtos de hidrólise de lípidos polares, nomeadamente lisofosfolípidos e lisoglicolípidos, são particularmente vantajosos. Na preparação de pão, tais emulsionantes derivados in situ podem conferir funcionalidade equivalente como emulsionantes adicionados, tal como DATEM. 2
Contudo, também se verificou que a actividade de enzimas lipoliticas resulta em acumulação de ácidos gordos livres, o que pode conduzir a funcionalidade prejudicial no género alimentício. Esta actividade inerente de enzimas lipoliticas limita a sua funcionalidade. 0 efeito negativo sobre o volume do pão é frequentemente explicado por sobredosagem. A sobredosagem pode conduzir a uma diminuição em elasticidade do glúten, o que resulta numa massa que é muito dura e, deste modo, resulta em volumes reduzidos. Adicionalmente, ou alternativamente, tais lipases podem degradar manteiga, óleo ou gordura láctea adicionados à massa, resultando em desaromatização na massa e no produto de panificação. A sobredosagem e desaromatização foram atribuídas à acumulação de ácidos gordos livres na massa, particularmente ácidos gordos de cadeia curta. A presença de elevados níveis de ácidos gordos livres (FFA) em matérias-primas ou produtos alimentares é, em geral, reconhecida como um defeito de qualidade e processadores alimentares e consumidores incluirão, habitualmente, um nível máximo de FFA nas especificações alimentares. Os efeitos resultantes de níveis excessivos de FFA podem ser em defeitos organolépticos e/ou funcionais.
No documento EP 1193314, a requerente verificou que a utilização de enzimas lipoliticas activas em glicolípidos era particularmente benéfica em aplicações de preparação de pão, uma vez que os produtos de hidrólise lisoglicolípidos têm funcionalidade emulsionante muito elevada, resultando, aparentemente, numa proporção superior de funcionalidade emulsionante positiva comparada à acumulação prejudicial de 3 ácidos gordos livres. Contudo, também se verificou que as enzimas têm uma actividade não selectiva significativa em triglicéridos que resultou em ácido gordo livre desnecessariamente elevado.
Este problema de elevada actividade de triglicérido foi abordado no documento WO 02/094123, onde a requerente verificou que, através da selecção de enzimas lipoliticas que eram activas nos lipidos polares (glicolipidos e fosfolipidos) numa massa, mas substancialmente não activas em triglicéridos ou 1-mono-glicéridos, poderia ser alcançada uma funcionalidade melhorada.
Uma fonte comercialmente preferida de enzimas lipases é fungos filamentosos, tais como Aspergillus spp. e Fusarium spp. Verificou-se que as lipases isoladas de fungos filamentosos têm caracteristicas industrialmente aplicáveis e também se verificou que era rotineira a expressão em sistemas de produção heterólogos, tais como em Aspergillus oryzae, Fusarium e levedura.
Uma lipase de Fusarium oxysporum foi identificada no documento EP 0130064 e a aplicação de lipases de F. oxysporum em aplicações alimentares foi sugerida em Hoshino et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56: 660-664. O documento EP 0869167 descreve a clonagem e expressão de uma lipase de Fusarium oxysporum e a sua utilização em panificação. A enzima é descrita como tendo actividade de fosfolipase. Esta enzima é, agora, comercializada pela Novozymes A/S (Dinamarca) como Lipopan F™. 4 0 documento WO 02/00852 divulga cinco enzimas lipases e os seus polinucleótidos de codificação, isolados de F. venenatutum, F. sulphureum, A. berkeleyanum, F. culmorum e F. solani. Todas as cinco enzimas são descritas como tendo actividade hidrolisante de triacilglicerol, fosfolipase e actividade de galactolipase. Três das enzimas têm actividade equivalente à enzima de F. oxysporum ensinada no documento EP 0869167: F. venenatum, F. sulphureum, F. culmorum.
Por conseguinte, é evidente que algumas lipases de Fusarium, incluindo Lipopan F™, verificaram ter actividade secundária em lipidos polares, incluindo fosfolipidos e glicolipidos. Embora descrita como uma fosfolipase no documento EP 0869167, a lipase de Fusarium oxysporum tem elevada actividade de lipase. A enzima também tem actividade de glicolipase. Contudo, não obstante a actividade significativa em lipidos polares, a funcionalidade alcançada por utilização da enzima é limitada, em virtude da elevada actividade de lipase (i. e., triglicérido).
Nagao et al. (J. Biochem 116 (1994) 536-540) descreve uma lipase de F. heterosporum; enzima que predominantemente funciona como uma lipase (E.C.3.1.1.3) para hidrolisar triglicéridos. Esta é muito diferente das enzimas de acordo com a presente invenção.
Foram produzidos variantes de enzimas lipoliticas, com substituições e fusões de aminoácidos especificas, alguns dos quais têm uma actividade melhorada nos lipidos polares, comparada com as enzimas parentais de tipo selvagem. O documento WO01/39602 descreve um tal variante, referido como SP979, que é uma fusão da lipase de Thermomyces lanuginosus e a lipase de 5
Fusarium oxysporum descrita no documento EP 0869167. Verificou-se que este variante tem uma proporção de actividade significativamente elevada em fosfolipidos e glicolipidos, comparada com triglicéridos.
Contudo, antes da presente invenção, não tinham sido ensinadas enzimas lipoliticas fúngicas naturais, particularmente de Fusarium spp., tendo uma elevada proporção de actividade em lipidos polares comparada com triglicéridos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Num amplo aspecto, a presente invenção refere-se a uma enzima lipolitica fúngica tendo uma proporção de actividade superior em lipidos polares (fosfolipidos e/ou glicolipidos), em comparação com triglicéridos, em particular uma proporção de actividade superior em glicolipidos, em comparação com triglicéridos.
Num amplo aspecto adicional, a presente invenção refere-se a enzima lipolitica fúngica de tipo selvagem tendo uma proporção de actividade superior em lipidos polares (fosfolipidos e/ou glicolipidos), em comparação com triglicéridos, em particular uma proporção de actividade superior em glicolipidos, em comparação com triglicéridos.
Ainda num aspecto amplo adicional, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico codificando uma nova enzima lipolitica fúngica como aqui ensinada. 6
Num amplo aspecto, a presente invenção refere-se a um método de preparação de um género alimentício, de um modo preferido, um género alimentício à base de ovo, o método compreendendo a adição de uma enzima lipolítica fúngica da presente invenção a um ou mais ingredientes do género alimentício. A presente invenção refere-se a um método de preparação de uma massa, o método compreendendo a adição de uma enzima lipolítica fúngica da presente invenção a um ou mais ingredientes da massa e a mistura, de modo a formar uma massa.
Outro amplo aspecto da presente invenção refere-se a um método de preparação de um produto de panificação a partir de uma massa, o método compreendendo a adição de uma enzima lipolítica fúngica da presente invenção à massa.
Também é proporcionado um método de preparação de uma enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção, o método compreendendo a transformação de uma célula hospedeira com um ácido nucleico recombinante, compreendendo uma sequência nucleotídica codificando para a enzima lipolítica fúngica, sendo a célula hospedeira capaz de expressar a sequência nucleotídica codificando para o polipéptido da enzima lipolítica fúngica, cultivo da célula hospedeira transformada sob condições onde o ácido nucleico é expresso e recolha da enzima lipolítica fúngica.
Num amplo aspecto adicional, a invenção proporciona uma enzima lipolítica que retém actividade a baixas temperaturas, í. e., é uma enzima lipolítica de baixa temperatura. 7
Os aspectos da presente invenção são apresentados nas reivindicações e no seguinte comentário.
Outros aspectos relacionados com a sequência nucleotidica que pode ser utilizada na presente invenção incluem: uma construção compreendendo as sequências da presente invenção; um vector compreendendo as sequências para utilização na presente invenção; um plasmideo compreendendo as sequências para utilização na presente invenção; uma célula transformada compreendendo as sequências para utilização na presente invenção; um tecido transformado compreendendo as sequências para utilização na presente invenção; um órgão transformado compreendendo as sequências para utilização na presente invenção; um hospedeiro transformado compreendendo as sequências para utilização na presente invenção; um organismo transformado compreendendo as sequências para utilização na presente invenção. A presente invenção também abrange métodos de expressão da sequência nucleotidica para utilização na presente invenção utilizando a mesma, tal como expressão numa célula hospedeira; incluindo métodos para transferência da mesma. A presente invenção abrange, adicionalmente, métodos de isolamento da sequência nucleotidica, tal como isolamento a partir de uma célula hospedeira.
Outros aspectos relacionados com a sequência de aminoácidos para utilização na presente invenção incluem: uma construção codificando a sequência de aminoácidos para utilização na presente invenção; um vector codificando a sequência de aminoácidos para utilização na presente invenção; um plasmideo codificando a sequência de aminoácidos para utilização na presente invenção; uma célula transformada expressando a sequência de aminoácidos para utilização na presente invenção; um tecido transformado expressando as sequências de aminoácidos para utilização na presente invenção; um órgão transformado expressando a sequência de aminoácidos para utilização na presente invenção; um hospedeiro transformado expressando as sequências de aminoácidos para utilização na presente invenção; um organismo transformado expressando a sequência de aminoácidos para utilização na presente invenção. A presente invenção também abrange métodos de purificação da sequência de aminoácidos para utilização na presente invenção utilizando a mesma, tal como expressão numa célula hospedeira; incluindo métodos de transferência da mesma e, depois, purificação da referida sequência.
Para facilidade de referência, estes e outros aspectos da presente invenção são, agora, discutidos em secções apropriadas. Contudo, os ensinamentos sob cada secção não estão necessariamente limitados a cada particular secção.
DIVULGAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma enzima lipolítica fúngica de tipo selvagem, tendo uma proporção de actividade superior em lipidos polares, comparada com triglicéridos.
Num aspecto, a presente invenção proporciona uma enzima lipolítica fúngica compreendendo uma sequência de aminoácidos, como mostrada na SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 6 ou uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 90% de identidade com aquelas e em que a enzima tem uma proporção de actividade superior em lipidos polares, comparada com triglicéridos. 9
Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona um ácido nucleico codificando uma enzima lipolitica fúngica compreendendo uma sequência de aminoácidos, como mostrada na SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 6 OU uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 90% de identidade com estas. SEQ ID N° 1 é mostrada na Figura 37, SEQ ID N° 2 é mostrada na Figura 38, SEQ ID N° 4 é mostrada na Figura 40 e SEQ ID N° 6 é mostrada na Figura 42.
Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona um ácido nucleico codificando uma enzima lipolitica fúngica, ácido nucleico que é seleccionado do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotidica mostrada na SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 7; b) um ácido nucleico que é relacionado com a sequência nucleotidica da SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 7 pela degenerescência do código genético; e c) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotidica que tem, pelo menos, 90% de identidade com a sequência nucleotidica mostrada na SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5 OU SEQ ID N° 7. SEQ ID N° 3 é mostrada na Figura 39; SEQ ID N° 5 é mostrada na Figura 41; e SEQ ID N° 7 é mostrada na Figura 43.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma enzima lipolitica fúngica, de acordo com a presente invenção, na preparação de um género alimentício, tais 10 como, por exemplo, uma massa, um produto de panificação, um ovo, um produto à base de ovo; um produto do tipo noodle, um produto de queijo, um produto de tortilha, um produto de alimentação para animais, um óleo vegetal ou um óleo comestível. De um modo vantajoso, a adição de uma enzima da presente invenção ao género alimentício pode conduzir a emulsificação melhorada, com acumulação inferior de ácidos gordos livres.
Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona a utilização de uma enzima lipolítica fúngica, de acordo com a presente invenção na preparação de uma massa e/ou um produto de panificação, compreendendo a adição da referida enzima lipolítica a uma massa e (opcionalmente) o cozimento da massa, de modo a preparar um produto de panificação para um ou mais dos seguintes: redução da adesividade da massa; melhoramento da maquinabilidade da massa; redução do empolamento durante o cozimento do produto de panificação; melhoramento do volume e/ou macieza do pão; prolongamento da validade do produto de panificação e/ou massa; melhoramento do efeito de antiendurecimento do produto de panificação e/ou massa; melhoramento da estrutura de miolo do produto de panificação; redução da heterogeneidade de poro do produto de panificação; melhoramento da homogeneidade de poro do produto de panificação; redução do tamanho médio de poro do produto de panificação; melhoramento do índice de glúten da massa; melhoramento do aroma e/ou odor do produto de panificação, melhoramento da cor da crosta do produto de panificação.
De um modo vantajoso, a enzima de acordo com a presente invenção pode ter uma actividade mais elevada do que enzimas lipolíticas convencionais, a um pH baixo e, assim, podem ser adequadas, de um modo mais vantajoso, para utilização num 11 ambiente de massa azeda de pH baixo do que enzimas lipoliticas convencionais.
Noutro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de preparação de uma massa e/ou um produto de panificação, compreendendo a adição de uma enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção a uma massa e (opcionalmente) o cozimento da massa, de modo a preparar o produto de panificação.
Num aspecto adicional da presente invenção proporciona a utilização de uma enzima lipolítica fúngica, de acordo com a presente invenção, na preparação de produtos à base de ovo para melhoramento de textura, redução de tamanho médio de partícula, redução de distribuição média de partícula, melhoramento de estabilidade ao calor, melhoramento de desempenho e/ou estabilidade de microondas.
Noutro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de tratamento de ovo ou produto à base de ovo, método que compreende a adição de uma enzima lipolítica fúngica, de acordo com a presente invenção, a um ovo ou produto à base de ovo.
Noutro aspecto da invenção, é proporcionado um método de preparação de noodles, ou uma massa de noodles ou um produto à base de noodles, método que compreende a adição de uma enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção, aos noodles, massa de noodles ou produto de tipo noodles.
Num aspecto da presente invenção, é proporcionada a utilização de uma enzima lipolítica fúngica, de acordo com a presente invenção, na preparação de um noodle ou um produto de 12 tipo noodle para um ou mais melhoramentos de cor/tom amarelado, estabilização de caracteristicas de cor, redução de brilho, redução de teor de gordura, melhoramento de textura e dentada (mastigabilidade), redução de actividade de água, redução de fractura, aumento de firmeza de núcleo e melhoramento de retenção de forma durante o processamento.
Noutro aspecto da invenção, é proporcionado um método de preparação de uma tortilha ou massa de tortilha, método que compreende a adição de uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção à tortilha ou massa de tortilha.
Um aspecto adicional da presente invenção proporciona a utilização da uma enzima lipolitica fúngica, de acordo com a presente invenção, na preparação de uma tortilha ou uma massa de tortilha para melhoramento da rolabilidade de uma tortilha, aumento da maleabilidade de uma tortilha, melhoramento de propriedades antiendurecimento da tortilha e/ou massa de tortilha, melhoramento de macieza e/ou redução de desaromatização na tortilha e/ou massa de tortilha. A funcionalidade da enzima lipolitica em tortilha e/ou noodles pode ser melhorada por combinação com emulsionantes, tal como DATEM.
Noutro aspecto da invenção, é proporcionado um método de tratamento de leite, leite de queijaria, queijo ou um produto à base de queijo, método que compreende a adição de uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção ao queijo ou produto à base de queijo. 13 A presente invenção ainda proporciona, adicionalmente, a utilização de uma enzima lipolitica fúngica, de acordo com a presente invenção, na preparação de um queijo ou um produto à base de queijo para um ou mais melhoramentos de aroma, textura e/ou estabilidade, diminuição no efeito de desolificação no queijo e/ou para aumentar o rendimento de queijo na produção de queijo.
Noutro aspecto da invenção, é proporcionado um método de tratamento de alimentos para animais, método que compreende a adição de uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção aos alimentos para animais. A presente invenção proporciona, adicionalmente, a utilização da uma enzima lipolitica fúngica, de acordo com a presente invenção, na preparação de uma alimentação para animais para melhoramento de um ou mais de: utilização de alimento e/ou eficiência de conversão, ganho de peso corporal, digestibilidade de absorção de azoto, metabolizabilidade de matéria seca e palatabilidade.
Num aspecto adicional da presente invenção é proporcionada a utilização da uma enzima lipolitica fúngica, de acordo com a presente invenção, num processo de preparação de um lisofosfolípido, por exemplo, lisolecitina por tratamento de um fosfolípido (e. g.f lecitina) com a enzima, de modo a produzir o produto de hidrólise parcial, í. e., o lisofosfolípido.
Noutro aspecto da presente invenção, é proporcionado um processo de preparação de um lisofosfolípido, por exemplo, lisolecitina, processo que compreende o tratamento de um 14 fosfolípido (e. g., lecitina) com a enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção.
Num aspecto adicional da presente invenção é proporcionada a utilização da uma enzima lipolítica fúngica, de acordo com a presente invenção, num processo de preparação de um lisoglicolipido, (por exemplo, digalactosil monoglicérido (DGMG) ou monogalactosil monoglicérido (MGMG)) por tratamento de um glicolipido (e. g., digalactosil diglicérido (DGDG) ou monogalactosil diglicérido (MGDG)) com a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, de modo a produzir o produto de hidrólise parcial, í. e., o lisoglicolipido.
Ainda num aspecto adicional é proporcionado um processo de preparação de um lisoglicolipido (por exemplo, digalactosil monoglicérido (DGMG) ou monogalactosil monoglicérido (MGMG)), processo que compreende o tratamento de um glicolipido (e. g., digalactosil diglicérido (DGDG) ou monogalactosil diglicérido (MGDG)) com uma enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção. A presente invenção também proporciona um processo de desengomagem enzimática de óleos vegetais ou comestíveis, compreendendo o tratamento do óleo vegetal ou comestível com enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção, de modo a hidrolisar uma parte importante dos lípidos polares (e. g., fosfolípido e/ou glicolipido).
Para evitar a dúvida, o especialista na técnica estaria consciente da metodologia adequada para efectuar o tratamento enzimático de óleos comestíveis (para exemplo ver o documento EP 0869167). O método conhecido pode ser adequadamente utilizado 15 quando se executa a presente invenção, sob condição de a enzima conhecida ser substituída pela enzima de acordo com a presente invenção.
Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona a utilização da uma enzima lipolítica fúngica, de acordo com a presente invenção, na preparação de um óleo vegetal ou óleo comestível para redução da quantidade de fosfolípido no óleo vegetal ou óleo comestível mantendo, simultaneamente, o teor de triglicérido do óleo e/ou prevenção ou redução da acumulação de ácidos gordos livres.
Ainda num aspecto adicional, a presente invenção proporciona a utilização de uma enzima lipolítica fúngica, de acordo com a presente invenção, num processo compreendendo o tratamento de um fosfolípido, de modo a hidrolisar grupos acilo gordos.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma enzima lipolítica fúngica, de acordo com a presente invenção, num processo para redução do teor de um fosfolípido num óleo comestível, compreendendo o tratamento do óleo com a enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção, de modo a hidrolisar uma parte importante do fosfolípido e separar uma fase aquosa contendo o fosfolípido hidrolisado do óleo.
Num aspecto adicional, a invenção proporciona uma enzima lipolítica que retém actividade a baixas temperaturas, i. e., uma enzima lipolítica de baixa temperatura. Aspectos adicionais da invenção incluem a utilização de uma enzima lipolítica de 16 baixa temperatura nos métodos e utilizações aqui descritos, i. e., da enzima lipolitica fúngica da presente invenção.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção tem uma proporção de actividade superior em lipidos polares (e. g., glicolipidos e/ou fosfolipidos) do que em triglicéridos.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção tem uma proporção de actividade superior em fosfolipidos do que em triglicéridos.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção tem uma proporção de actividade superior em glicolipidos do que em triglicéridos.
De um modo adequado, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção pode ter uma proporção de actividade superior tanto em glicolipidos como fosfolipidos do que em triglicéridos.
De um modo mais preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção tem uma proporção de actividade superior em digalactosil diglicérido (DGDG) do que em triglicéridos.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção hidrolisa DGDG ou MGDG em DGMG ou MGMG, respectivamente. 0 termo "proporção de actividade superior em lipidos polares", como aqui referida, significa que a enzima lipolitica 17 fúngica de acordo com a presente invenção tem uma proporção de actividade hidrolisante de lípido polar:triglicérido que é superior quando comparada com uma enzima comercial Lipopan F™ (Novozymes A/S, Dinamarca). 0 termo "lípidos polares", como aqui utilizado, significa fosfolipidos e/ou glicolipidos. De um modo preferido, o termo "lípidos polares", como aqui utilizado, significa fosfolipidos e glicolipidos.
Os termos "proporção de actividade superior em glicolipidos" e "proporção de actividade superior de fosfolipidos", como aqui referidos, significam que a enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção tem uma proporção de actividade hidrolisante de glicolipido:triglicérido ou uma proporção de actividade hidrolisante de fosfolipido:triglicérido, respectivamente, que é superior à taxa correspondente alcançada com a enzima comercial Lipopan F™ (Novozymes A/S, Dinamarca).
De um modo preferido, a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção pode ter uma proporção de actividade hidrolisante de lípido:triglicérido de, pelo menos, 4. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de lípido polar:triglicérido pode ser superior a 5. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de lípido polar: triglicérido pode ser superior a 8, de um modo preferido, superior a 9, de um modo mais preferido, superior a 10, de um modo ainda mais preferido, superior a 15.
De um modo preferido, a enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção pode ter uma proporção de actividade 18 hidrolisante de fosfolípido:triglicérido de, pelo menos, 4. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de lípido polar:triglicérido pode ser superior a 5. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de lipido polar: triglicérido pode ser superior a 8, de um modo preferido, superior a 9, de um modo mais preferido, superior a 10, de um modo ainda mais preferido, superior a 15.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção pode ter uma proporção de actividade hidrolisante de glicolipido:triglicérido de, pelo menos, 1,5, de um modo preferido, pelo menos 1,8, de um modo preferido, pelo menos 2, de um modo preferido, pelo menos 3, de um modo preferido, pelo menos 4. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de glicolipido:triglicérido pode ser superior a 4. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de glicolipido:triglicérido pode ser superior a 5. É aqui divulgada uma enzima lipolitica fúngica tendo uma actividade hidrolisante de lipido polar:triglicérido de, pelo menos, 4. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de lipido polar:triglicérido pode ser superior a 5. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de lipido polar:triglicérido pode ser superior a 8, de um modo preferido, superior a 9, de um modo mais preferido, superior a 10, de um modo ainda mais preferido, superior a 15. É aqui divulgada uma enzima lipolitica fúngica tendo uma actividade hidrolisante de fosfolípido:triglicérido de, pelo menos, 4. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de lípido polar:triglicérido pode ser superior a 5. Adequadamente, a proporção de actividade hidrolisante de lípido 19 polar: triglicérido pode ser superior a 8, de um modo preferido, superior a 9, de um modo mais preferido, superior a 10, de um modo ainda mais preferido, superior a 15. É aqui divulgada uma enzima lipolitica fúngica tendo uma proporção de actividade hidrolisante de glicolipido:triglicérido de, pelo menos, 1,5, de um modo preferido, pelo menos 1,8, de um modo preferido, pelo menos 2, de um modo preferido, pelo menos 3, de um modo preferido, pelo menos 4, de um modo preferido, superior a 5, de um modo preferido, superior a 10, de um modo preferido, superior a 15.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção tem, pelo menos, 1,5 vezes mais actividade contra lipidos polares (e. g., actividade de fosfolipase A2 (E .C.3.1.1.4) e/ou actividade de fosfolipase Al (E.C.3.1.1.32) e/ou actividade de glicolipase (E.C.3.1.1.26)), em comparação com actividade de triglicérido lipase (E.C.3.1.1.3), de um modo mais preferido, pelo menos 2 vezes, de um modo mais preferido, pelo menos 3 vezes, de um modo mais preferido, pelo menos 4 vezes.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção tem, pelo menos, 1,5 vezes mais actividade de glicolipase (E.C.3.1.1.26), em comparação com actividade de triglicérido lipase (E.C.3.1.1.3), de um modo mais preferido, pelo menos 2 vezes, de um modo mais preferido, pelo menos 3 vezes, de um modo mais preferido, pelo menos 4 vezes.
De um modo preferido, à dosagem que proporciona o volume do pão óptimo utilizando o ensaio de minicozimento detalhado no Exemplo 3, a taxa de hidrólise de DGDG para triglicérido (TG) é, 20 pelo menos, 1,7%, de um modo preferido, pelo menos 1,8%, de um modo preferido, pelo menos 2% de um modo preferido, pelo menos 3%, de um modo preferido, pelo menos 4%, de um modo preferido, pelo menos 5%, de um modo preferido, pelo menos 10%, de um modo preferido, pelo menos 20%, de um modo preferido, pelo menos 40%, de um modo preferido, pelo menos 50%. O termo "actividade de glicolipase", como aqui utilizado, abrange "actividade de galactolipase". A actividade de glicolipase, actividade de fosfolipase e actividade triacilglicérido lipase de uma enzima pode ser determinada utilizando os ensaios abaixo apresentados.
Determinação de actividade de galactolipase (ensaio de actividade de glicolipase):
Substrato:
Digalactosildiglicérido a 0,6% (Sigma D 4651), Triton-X 100 a 0,4% (Sigma X-100) e CaCl2 a 5 mM foram dissolvidos em tampão HEPES a 0,05 M, pH 7.
Processo de ensaio:
Foram adicionados 400 pL de substrato a um tubo Eppendorf de 1,5 mL e colocado num Eppendorf Thermomixer, a 37 °C, durante 5 minutos. No tempo t= 0 min., foram adicionados 50 pL de solução enzimática. Também foi analisado um branco com água, em vez de enzima. A amostra foi misturada, a 10*100 rpm, num 21
Eppendorf Thermomixer, a 37 °C, durante 10 minutos. No tempo t=10 min., o tubo Eppendorf foi colocado noutro Thermomixer, a 99 °C, durante 10 minutos, para parar a reacção.
Foi analisado ácido gordo livre nas amostras através da utilização do kit nefa C da WAKO GmbH. A actividade enzimática GLU, a pH 7, foi calculada como micromoles de ácido gordo produzido por minuto nas condições de ensaio.
Determinação de actividade de fosfolipase (ensaio de actividade de fosfolipase): A actividade de fosfolipase foi medida utilizando dois métodos diferentes que proporcionam resultados comparáveis. Qualquer destes métodos pode ser utilizado para determinar a actividade de fosfolipase de acordo com a presente invenção. De um modo preferido, o ensaio PLU é utilizado para determinação da actividade de fosfolipase de qualquer enzima. "Ensaio PLU" para determinação de actividade de fosfolipase
Substrato: L-α Fosfatidilcolina a 0,6%, 95% Planta (Avanti N° 441601), Triton-X 100 a 0,4% (Sigma X-100) e CaCl2 a 5 mM foram dissolvidos em tampão HEPES a 0,05 M, pH 7. 22
Processo de ensaio:
Foram adicionados 400 μΐι de substrato a um tubo Eppendorf de 1,5 mL e colocado num Eppendorf Thermomixer, a 37 °C, durante 5 minutos. No tempo t= 0 min., foram adicionados 50 pL de solução enzimática. Também foi analisado um branco com água, em vez de enzima. A amostra foi misturada, a 10*100 rpm, num Eppendorf Thermomixer, a 37 °C, durante 10 minutos. No tempo t=10 min., o tubo Eppendorf foi colocado noutro Thermomixer, a 99 °C, durante 10 minutos, para parar a reacção.
Foi analisado ácido gordo livre nas amostras através da utilização do kit NEFA C da WAKO GmbH. A actividade enzimática PLU-7, a pH 7, foi calculada como micromoles de ácido gordo produzido por minuto nas condições de ensaio. "Ensaio TIPU" para determinação de actividade de fosfolipase 1 TIPU (Unidade de Titulação de Fosfolipase) é definida como a quantidade de enzima que liberta 1 pmol de ácido gordo livre por minuto, nas condições de ensaio. A fosfolipase Al e A2 catalisam a conversão de lecitina em liso-lecitina, com libertação do ácido gordo livre da posição 1 e 2, respectivamente. A actividade de fosfolipase pode ser determinada por titulação continua dos ácidos gordos libertados da lecitina durante a acção enzimática, uma vez que o consumo de álcali iguala a quantidade de ácido gordo libertado. 23
Substrato:
Foram dispersos lecitina a 4%, Triton-X 100 a 4% e CaCÍ2 a 6 mM: 12 g de lecitina em pó (Avanti Polar Lipids N° 44160) e 12 g de Triton-X 100 (Merck 108643) em aprox. 200 mL de água desmineralizada, durante agitação magnética. Foram adicionados 3,0 mL de CaCl2 a 0,6 M (p.a. Merck 1. 02382). O volume foi ajustado para 300 mL com água desmineralizada e a emulsão foi homogeneizada utilizando um Ultra Thurax. O substrato foi preparado de fresco todos os dias.
Processo de ensaio:
Foi preparada uma solução enzimática para proporcionar um declive na curva de titulação entre 0,06 e 0,18 mL/min, com uma adição de 300 pL de enzima. É incluida uma amostra de controlo de actividade conhecida.
As amostras foram dissolvidas em água desmineralizada e agitadas, durante 15 min., a 300 rpm. 25,00 mL de substrato foram termostatados a 37,0 °C, durante 10-15 minutos, antes de o pH ter sido ajustado para 7,0 com NaOH a 0,05 M. Foram adicionados 300 pL de solução enzimática ao substrato e a titulação continua com NaOH a 0,05 M foi efectuada utilizando um titulador pH-Stat (Phm 290, Mettler Toledo). São realizadas duas determinações de actividade em cada pesagem. Após 8 minutos, a titulação é interrompida e o declive da curva de titulação é calculado entre 5 e 7 minutos. O limite de detecção é 3 TIPU/mL de solução enzimática. 24 Cálculos : A actividade de fosfolipase (TIPU/g de enzima) foi calculada da seguinte forma:
TIPU/g=-Q!2!_ m-V2 m-V2
Onde: α é o declive da curva de titulação entre 5 e 7 minutos de tempo de reacção (mL/min) N é a normalidade do NaOH utilizado (mol/L) VI é o volume no qual a enzima é dissolvida (mL) m é a quantidade de enzima adicionada a VI (g) V2 e o volume de solução enzimática adicionada ao substrato (mL)
Determinação de actividade de triacilglicérido lipase: ensaio baseado em triglicérido (tributirina) como substrato (LIPU): A actividade de lipase baseada em tributirina é medida de acordo com Food Chemical Codex, Quarta Edição, National Academy Press, 1996, p. 803, com as modificações de que a amostra é dissolvida em água desionizada, em vez de tampão de glicina e o ponto de referência de pH stat é 5,5 em vez de 7. 25 1 LIPU é definido como a quantidade de enzima que pode libertar 1 mol de ácido butírico por minuto nas condições de ensaio.
Com base nos ensaios para actividade em galactolipido (GLU), fosfolípido (PLU) e triglicérido (LIPU), é possível calcular as taxas PLU/LIPU e GLU/LIPU. A análise de Lipopan F™ e a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção derivada de Fusarium heterosporum (amostra 209) (ver o Exemplo 3) proporcionou os seguintes resultados.
As taxas de actividade relativa para Lipopan F™ e Amostra 209 são
Lipopan F Amostra 209
Fosfolípido/triglicérido PLU/LIPU 3 9
Galactolípido/triglicérido GLU/LIPU 1 4
Adequadamente, os termos "sinergia" ou "efeito sinérgico", como aqui utilizados, significam que a combinação produz um efeito melhor do que quando cada componente (í. e., enzima) é utilizado separadamente. A sinergia pode ser determinada através da preparação de um produto, e. g., uma massa e/ou produto de panificação, com a adição de cada componente (i. e., enzima), separadamente e em combinação, e comparação dos efeitos. 26 0 termo "enzima lipolítica fúngica", como aqui utilizado, significa que a fonte de ocorrência natural da enzima é um fungo. Para evitar dúvidas, contudo, este termo pode incluir uma enzima fúngica que seja isolada de um fungo, uma que seja expressa num hospedeiro fúngico (o fungo nativo ou não nativo) ou uma que seja expressa num hospedeiro não fúngico (e. g., num bacteriano ou, por exemplo, de levedura).
De um modo preferido, a enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção é uma enzima de tipo selvagem.
Os termos "natural" e "tipo selvagem", como aqui utilizados, significam uma enzima de ocorrência natural. Ou seja, uma enzima expressa a partir do código genético endógeno e isolada do seu organismo hospedeiro endógeno e/ou uma enzima heterologamente produzida que não tenha sido mutada (i. e., não contém deleções, adições ou substituições de aminoácidos), quando comparada com a sequência de proteína madura (após eventos de clivagem co-traducional ou pós-traducional) endogenamente produzida. As proteínas naturais e de tipo selvagem da presente invenção podem ser codificadas por polinucleótidos, com codões optimizados, para expressão heteróloga e também podem compreender um péptido sinal não endógeno, seleccionado para expressão nesse hospedeiro. 0 termo "péptido sinal não endógeno", como aqui utilizado, significa um péptido sinal não naturalmente presente na cadeia polipeptídica nascente da enzima lipolítica, antes de clivagem co-traducional. Na enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, a parte ou totalidade do péptido sinal não endógeno, por exemplo, um pró-péptido, pode permanecer conjugada ao 27 polipéptido maduro - este é abrangido pelo termo "de tipo selvagem", como aqui utilizado.
Como anteriormente mencionado, os termos "natural" e "tipo selvagem", como aqui utilizados, significam uma enzima de ocorrência natural. Contudo, isto não exclui a utilização de um polipéptido sintético ou quimicamente sintetizado, compreendido pela mesma sequência polipeptidica que a enzima lipolitica madura de ocorrência natural. 0 termo "variante", como aqui utilizado, significa uma proteina expressa a partir de um código genético não endógeno, resultando em uma ou mais alterações de aminoácidos (i. e., deleções, adições ou substituições de aminoácidos), quando comparada com a sequência natural ou de tipo selvagem dentro da sequência de proteina madura.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção é uma enzima lipolitica que retém actividade a uma baixa temperatura, i. e., é uma enzima lipolitica de baixa temperatura. 0 termo "uma enzima lipolitica de baixa temperatura" significa uma enzima que tem actividade significativa a 5-15 °C, de um modo preferido, uma enzima que tem actividade significativa a 10 °C.
Numa forma de realização, a enzima lipolitica de baixa temperatura de acordo com a presente invenção não é uma enzima lipolitica compreendendo o motivo GDSX da SEQuência de aminoácidos como divulgado no documento W02004/064987, em que X 28 é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S.
Uma enzima lipolítica de baixa temperatura, de acordo com a presente invenção, pode ser uma enzima que tenha uma actividade relativa de, pelo menos 5%, de um modo preferido, pelo menos 7%, de um modo mais preferido, pelo menos 10%, em substrato de lecitina, a 10 °C, a um pH dentro de 20% do pH óptimo da enzima lipolítica, como determinado pela determinação de ácidos gordos livres pelo método de NEFA c (ver o Exemplo 5, realizado a pH 7) . O Exemplo 6 proporciona um método para determinar o pH óptimo para uma enzima lipolítica.
Uma enzima lipolítica de baixa temperatura, de acordo com a presente invenção, pode ser uma enzima que tenha uma actividade relativa de, pelo menos, 10%, de um modo preferido, pelo menos 15%, de um modo mais preferido, pelo menos 20%, de um modo mais preferido, pelo menos 25% e, de um modo muito preferido, pelo menos 30%, em substrato de lecitina, a 20 °C, a um pH dentro de 20% do pH óptimo da enzima lipolítica, como determinado pela determinação de ácidos gordos livres pelo método de NEFA C (ver o Exemplo 5, realizado a pH 7) . O Exemplo 6 proporciona um método para determinação do pH óptimo para uma enzima lipolítica.
Uma enzima lipolítica de baixa temperatura, de acordo com a presente invenção, também pode mostrar uma actividade significativa de lecitina de gema de ovo, a 5 °C, caracterizada por ser capaz de libertação de pelo menos, 1%, de um modo preferido, pelo menos 1,5%, de um modo mais preferido, pelo menos 2% de ácido gordo livre, após um tempo de reacção de 480 minutos, a uma dosagem enzimática equivalente a 20 U/g de 29 gema de ovo, utilizando o ensaio descrito no Exemplo 9 e ilustrado nas Figuras 24 e 25.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção pode ser obtenível (obtida de um modo preferido) de um fungo filamentoso. De um modo mais preferido, a enzima lipolitica fúngica é obtenível (de um modo preferido, obtida) de Fusarium spp. De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção pode ser obtenível (obtida de um modo preferido) de Fusarium heterosporum ou Fusarium semitectum. Adequadamente, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção pode ser obtenível (obtida de um modo preferido) de Fusarium heterosporum (CBS 782.83) ou Fusarium semitectum (IBT 9507).
Assim, num aspecto, de um modo preferido, a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção é uma enzima lipolitica fúngica filamentosa, de um modo preferido, uma enzima lipolitica fúngica filamentosa de tipo selvagem.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos 90%, de um modo preferido, pelo menos 95%, de um modo preferido, pelo menos 98%, de um modo preferido, pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 OU SEQ ID N° 6.
De um modo preferido, o ácido nucleico codificando a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção, compreende uma sequência nucleotídica que tem, pelo menos 90%, de um modo preferido, pelo menos 95%, de um modo preferido, pelo menos 98%, de um modo preferido, pelo menos 99% de identidade com a 30 sequência nucleotídica mostrada na SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 7.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção não é uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma proteína de
Thermomyces, ou sua parte, fundida com uma sequência de aminoácidos de uma proteína de Fusarium, ou sua parte. Em particular, de um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção mão é uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma proteína de
Thermomyces lanuginosa, ou sua parte, fundida com uma sequência de aminoácidos de uma proteína de Fusarium oxysporum, ou sua parte.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção não é obtida de Thermomyces lanuginosa e/ou não é um variante de uma enzima obtida de Thermomyces lanuginosa.
De um modo preferido, a enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção é isolada de um caldo de fermentação de Fusarium heterosporum CBS 782.83 ou Fusarium semitectum (IBT 9507).
Adequadamente, a enzima pode ser purificada por cromatografia líquida. A sequência de aminoácidos da enzima lipolitica fúngica purificada pode ser determinada por análise de degradação de Edman e MALDI-TOF. 31
Uma enzima lipolítica parcialmente purificada de Fusarium heterosporum CBS 782.83 foi testada em testes de panificação a mini-escala e em testes de panificação à escala piloto, com resultados muito bons.
Verificou-se que os efeitos de panificação da enzima lipolítica fúngica de F. heterosporum CBS 782.83 eram superiores a Lipopan F™ e estes correlacionaram-se com uma proporção de actividade aumentada em lípidos polares, em particular glicolípidos, tal como digalactosil diglicérido (DGDG), em comparação com triglicéridos.
Adicionalmente, uma enzima lipolítica de Fusarium semitectum ibt 9507 foi testada para actividade em lípidos de farinha em pasta fluida de massa, com resultados muito bons.
Mostrou-se que a enzima lipolítica de F. semitectum IBT 9507 tem actividade significativa em galactolípidos numa massa e relativamente menos actividade em triglicéridos comparada com Lipopan F™.
Adequadamente, o termo "género alimentício", como aqui utilizado, significa uma substância que é adequada para consumo humano e/ou animal.
Adequadamente, o termo "género alimentício", como aqui utilizado, pode significar um género alimentício numa forma que seja pronta para consumo. Alternativamente ou adicionalmente, contudo, o termo género alimentício, como aqui utilizado, pode significar um ou mais materiais alimentares que sejam utilizados na preparação de um género alimentício. Apenas a título exemplificativo, o termo género alimentício abrange produtos de 32 panificação, produzidos a partir de massa, assim como a massa utilizada na preparação dos referidos produtos de panificação.
Num aspecto preferido, a presente invenção proporciona um género alimentício, como anteriormente definido, em que o género alimentício é seleccionado de um ou mais dos seguintes: ovos, produtos à base de ovo, incluindo mas não limitados a maionese, temperos de salada, molhos, gelados, ovo em pó, gema de ovo modificada e produtos preparados à base desta; produtos de panificação, incluindo pães, bolos, produtos de massa doce, massas laminadas, massas cruas líquidas, queques, dónutes, biscoitos, bolachas salgadas e bolachas; confeitaria, incluindo chocolate, bombons, caramelos, halawa, gomas, incluindo gomas sem açúcar e adoçadas com açúcar, pastilha elástica, pastilha elástica mole, pastilha elástica e pudins; produtos congelados, incluindo sorvetes, de um modo preferido, produtos lácteos congelados, incluindo gelado e gelado de leite; produtos lácteos, incluindo queijo, manteiga, leite, natas para café, natas batidas, creme custard, bebidas leite e iogurtes; mousses, cremes vegetais batidos; óleos e gorduras comestíveis, produtos batidos arejados e não arejados, emulsões de óleo-em-água, emulsões de água-em-óleo, margarina, manteiga e pastas para barrar, incluindo pastas para barrar pobres em matéria gorda e muito pobres em matéria gorda, temperos, maionese, molhos, molhos à base de natas, sopas à base de natas, bebidas, emulsões de especiarias e molhos.
Num aspecto, o género alimentício de acordo com a presente invenção pode ser um produto de massa ou um produto de panificação, tais como um pão, um produto frito, um lanche, bolos, tartes, bolos de chocolate, bolachas, noodles, noodles instantâneos, tortilhas, itens de lanche, tais como bolachas 33 salgadas, bolachas salgadas graham, pretzels e batatas fritas e pasta.
Noutro aspecto, o género alimentício de acordo com a presente invenção pode ser um alimento para animais.
Num aspecto, de um modo preferido, o género alimentício é seleccionado de um ou mais dos seguintes: ovos, produtos à base de ovo, incluindo maionese, temperos de salada, molhos, gelado, ovo em pó, gema de ovo modificada e produtos preparados à base desta.
Em algumas das aplicações aqui mencionadas, particularmente as aplicações alimentares, tais como as aplicações de panificação, a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção pode ser utilizada com um ou mais emulsionantes convencionais incluindo, por exemplo, monoglicéridos, ésteres de ácido diacetiltartárico de monoglicéridos e diglicéridos de ácidos gordos, estearoil lactilato sódico (SSL) e lecitinas. A enzima lipolítica de acordo com a presente invenção é especialmente preferida em receitas de pão com gordura adicionada; isto é considerado como sendo devido à baixa actividade da enzima lipolítica de acordo com a presente invenção em triglicéridos que resulta numa reduzida acumulação de ácidos gordos livres e, com respeito a triglicéridos de cadeia curta, redução ou ausência de odor libertado.
No presente contexto, o termo "gordura adicionada" é utilizado para indicar que não é adicionado lipido ou gordura à massa de farinha. 34
Adicionalmente ou alternativamente, a enzima de acordo com a presente invenção pode ser utilizada com uma ou mais outras enzimas de grau alimentar adequadas. Deste modo, está dentro do âmbito da presente invenção que, adicionalmente à enzima lipolitica da presente invenção, pode ser adicionada, pelo menos, uma enzima adicional ao produto de panificação e/ou à massa. Tais enzimas adicionais incluem enzimas de degradação de amido, tais como endoamilases ou exoamilases, pululanases, enzimas de desramificação, hemicelulases incluindo xilanases, celulases, oxidorredutases, e. g., glucose oxidase, piranose oxidase, sulfidrilo oxidase ou uma hidrato de carbono oxidase, tal como uma que oxidiza maltose, por exemplo, hexose oxidase (HOX), lipases, fosfolipases e hexose oxidase, proteases e aciltransferases (por exemplo, tal como aquelas descritas no documento WO04/064987) . É particularmente preferido, que, na produção de produtos alimentares, a enzima lipolitica da invenção seja utilizada em combinação com alfa-amilases. Em particular, a amilase pode ser uma amilase não maltogénica, tal como um polipéptido tendo actividade de exoamilase não maltogénica, em particular, actividade de glucano-1,4-alfa-maltotetra-hidrolase (EC 3.2. 1.60) (como divulgado no documento W005/003339). Uma amilase não maltogénica adequada está comercialmente disponível como POWERSoft™ (disponível a partir da Danisco A/S, Dinamarca) . As amilases maltogénicas, tais como Novamyl™ (Novozymes A/S, Dinamarca), também podem ser utilizadas. Numa forma de realização, a utilização combinada de alfa-amilases e da enzima lipolitica da invenção pode ser utilizada numa massa e/ou na produção de um produto de panificação, tais como pão, bolos, dónutes, bolos de dónute ou pães em forma de anel. A combinação de alfa-amilases e da enzima lipolitica da invenção também é 35 considerada como preferida para utilização em métodos de produção de tortilhas, tal como tortilhas de trigo e/ou milho.
Noutra forma de realização preferida, a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em combinação com uma xilanase na produção de produtos alimentares. GRINDAMYL™ e POWERBake 7000 são exemplos de enzimas de xilanase comercialmente disponíveis a partir da Danisco A/S. Outros exemplos de enzimas de xilanase podem ser verificados nos documentos WO03/020923 e WO01/42433.
De um modo preferido, a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em combinação com uma xilanase e uma alfa-amilase. Adequadamente, a alfa-amilase pode ser uma alfa-amilase maltogénica ou uma alfa-amilase não maltogénica (tal como GRINDAMYL™ ou POWERSoft, comercialmente disponíveis a partir da Danisco A/S) ou uma sua combinação. A enzima lipolitica da invenção também pode ser, de um modo preferido, utilizada em combinação com uma enzima oxidante, tal como uma enzima oxidante de maltose (MOX), por exemplo, hexose oxidase (HOX). Métodos adequados são descritos no documento W003/099016. Enzimas oxidantes de maltose comercialmente disponíveis GRINDAMYL™ e SUREBake estão disponíveis a partir da Danisco A/S. 36
Opcionalmente, uma alfa-amilase, tal como uma exoamilase não maltogénica e/ou uma amilase maltogénica, e/ou uma enzima oxidante de maltose (MOX), em combinação com a enzima de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada em métodos de preparação de uma massa, um produto de panificação, tortilha, bolo, alimento de tipo noodle instantâneo/lanche frito ou um produto lácteo, tal como queijo. A enzima lipolitica de acordo com a presente invenção é tipicamente incluída no género alimentício ou outra composição por métodos conhecidos na técnica. Tais métodos incluem a adição da enzima lipolitica directamente ao género alimentício ou composição, a adição da enzima lipolitica em combinação com um estabilizante e/ou veículo e a adição de uma mistura compreendendo a enzima lipolitica e um estabilizante e/ou veículo.
Estabilizantes adequados para utilização com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, sais inorgânicos (tais como NaCl, sulfato de amónio), sorbitol, emulsionantes e detergentes (tais como Tween 20, Tween 80, Panodan AB100 sem triglicéridos, éster de poliglicerol, monoleato de sorbitano), óleo (tais como óleo de semente de colza, óleo de semente de girassol e óleo de soja), pectina, trealose e glicerol.
Veículos adequados para utilização com a presente invenção incluem mas não estão limitados a amido, trigo moído, farinha de trigo, NaCl e citrato. O índice de glúten pode ser medido por meio de um Glutomatic 2200 da Perten Instruments (Suécia). Para medir o índice de glúten: imediatamente após fermentação, 15 g de massa 37 podem ser pesados e colocados no Glutomatic e lavados com 500 mL de solução de NaCl a 2%, durante 10 min. A massa lavada pode ser, depois, transferida para uma Glúten Index Centrifuge 2015 e as duas fracções de glúten pesadas e o índice de glúten calculado de acordo com a seguinte equação: índice de glúten: (peso de glúten permanecendo na peneira x 100)/peso total de glúten
De um modo preferido, o índice de glúten na massa é aumentado em, pelo menos 5%, em relação a uma massa sem adição do polipéptido, o índice de glúten pode ser determinado por meio de um aparelho Glutomatic 2200 anteriormente mencionado.
Aspectos preferidos adicionais são apresentados nas reivindicações anexas e na descrição e exemplos seguintes.
VANTAGENS
Surpreendentemente e inesperadamente, verificou-se que as enzimas lipolíticas fúngicas de acordo com a presente invenção têm uma proporção de actividade muito superior em lípidos polares (fosfolípidos e/ou glicolípidos):triglicéridos, comparada com enzimas lipolíticas anteriormente identificadas (particularmente LipopanF™) de fungos. Isto é particularmente surpreendente, em virtude de, antes da presente invenção, nenhuma das enzimas lipolíticas de tipo selvagem lipolítica conhecidas de fungos mostrarem esta actividade. Embora tenha sido efectuada pesquisa para investigar variantes de enzimas lipolíticas (í. e., aqueles que tinham sido expostos a 38 mutagénese não natural e/ou alterados de qualquer outro modo), não se tinha considerado que uma enzima natural de tipo selvagem de fungos pudesse possuir estas caracteristicas altamente benéficas.
Verificou-se que as enzimas identificadas, quando utilizadas em aplicações de panificação, têm funcionalidade superior. A utilização da enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção resulta, de um modo vantajoso, em propriedades significativamente melhoradas para a massa e/ou produtos de panificação, em comparação com outras enzimas lipoliticas de fungos, particularmente LipopanF™.
De um modo vantajoso, a enzima lipolitica que retém actividade a temperaturas inferiores, i. e., uma enzima lipolitica de baixa temperatura, pode ser adequada para utilização em aplicações de baixa temperatura, eliminando, deste modo, a necessidade de aquecer um substrato. Isto pode ser de uma particular vantagem em aplicações, tais como tratamento enzimático de gema de ovo, desengomagem enzimática de óleos comestíveis e no tratamento de leite ou produtos lácteos, por exemplo, tratamento de leite de queijaria antes da preparação de queijo. Uma vantagem adicional da utilização de uma enzima lipolitica de baixa temperatura pode ser verificada em géneros alimentícios e/ou alimentos para animais, onde a retenção de actividade significativa a baixas temperaturas de operação permite que o tratamento enzimático seja realizado com risco reduzido de contaminação microbiana, particularmente bacteriana. Adicionalmente, quando a estabilidade da enzima é maior a temperaturas inferiores, isto permite a dosagem eficiente de enzima e vida útil efectiva mais longa da enzima em aplicações industriais. 39
EFEITOS TÉCNICOS
Para produtos de panificação, tais como pão, brioches e pão de forma branco dos EUA, por exemplo, a adição de uma enzima lipolitica da presente invenção pode resultar em um ou mais dos seguintes: volume e macieza de pão melhorados, validade prolongada e/ou um efeito antiendurecimento, estrutura de miolo melhorada, heterogeneidade de poro reduzida, tamanho médio de poro reduzido, indice de glúten melhorado, aroma e/ou odor melhorado e cor da crosta melhorada.
De um modo vantajoso, a enzima de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para substituir emulsionantes em géneros alimentícios, tais como massa e/ou produtos de panificação. A enzima lipolitica de acordo com a presente invenção pode ter sinergia com emulsionantes, tais como DATEM, SSL, CSL, monoglicérido, polissorbatos e Tween. Deste modo, a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em combinação com um ou mais emulsionantes. De um modo vantajoso, a utilização da enzima lipolitica de acordo com a presente invenção, em combinação com um ou mais emulsionantes, pode reduzir a quantidade global de emulsionantes utilizados, em comparação com a quantidade necessária quando não é utilizada enzima de acordo com a presente invenção. A enzima lipolitica de acordo com a presente invenção também pode ter sinergia com hidrocolóides, Guar, xantano e pectina e com enzimas oxidantes de maltose, tal como hexose oxidase. 40
Para dónutes, bolos de dónute, bageles, bolos de lanche e queques, por exemplo, a utilização de uma enzima lipolítica da presente invenção pode resultar num efeito sinérgico, quando utilizada em combinação com um ou mais de alfa-amilases, alfa-amilase maltogénica e alfa-amilase não maltogénica.
Para bolos, pastéis e bolos de palma, por exemplo, a utilização da enzima lipolítica da presente invenção pode resultar num efeito sinérgico, quando utilizada em combinação com um ou mais de hidrocolóides, tal como Guar e/ou um ou mais emulsionantes, tal como DATEM.
Para biscoitos, por exemplo, a utilização de uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção confere propriedades de rolabilidade e manipulação melhoradas, particularmente quando a frio (rolabilidade a frio).
De um modo vantajoso, em maionese e outros produtos à base de ovo, por exemplo, a utilização de uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção pode conduzir a textura melhorada, tamanho médio de partícula reduzido e/ou distribuição média de partícula reduzida, estabilidade ao calor melhorada, desempenho e/ou estabilidade de microondas melhorados.
Em bolos, a utilização da presente invenção conduz, de um modo vantajoso, a macieza e volume melhorados, propriedades de conservação e validade melhoradas.
Para noodles ou produtos do tipo noodles, e. g., tipo noodles instantâneos, por exemplo, a enzima lipolítica da presente invenção pode conferir uma ou mais das seguintes características: cor/tom amarelado melhorado, características de 41 cor mais estáveis, brilho reduzido, teor de gordura reduzido, textura e dentada (mastigabilidade) melhoradas, actividade de água reduzida, fractura reduzida, firmeza de núcleo aumentada e retenção de forma melhorada durante processamento.
De um modo preferido, a enzima lipolitica da presente invenção pode ser utilizada para reduzir o teor de gordura de um noodle ou produto do tipo noodles, por exemplo, um noodle instantâneo.
Em tortilha, por exemplo, a utilização da enzima de acordo com a presente invenção pode resultar em um ou mais dos seguintes: rolabilidade reduzida da tortilha, por exemplo, através do aumento de maleabilidade, propriedades antiendurecimento melhoradas, macieza melhorada e/ou redução de desaromatização.
De um modo vantajoso, a rolabilidade e/ou maleabilidade melhoradas podem conduzir a uma probabilidade reduzida de a tortilha se separar quando rolada.
Em queijo e/ou produtos à base de queijo, por exemplo, a utilização da enzima de acordo com a presente invenção pode resultar em um ou mais dos seguintes: um aroma, textura e/ou estabilidade melhorados, uma diminuição no efeito de desolificação em queijo e/ou um aumento no rendimento em queijo. 0 termo "efeito de desolificação", como aqui utilizado, refere-se ao óleo livre libertado quando o queijo é derretido. A enzima lipolitica de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para produzir um queijo pobre em matéria gorda. De 42 um modo vantajoso, a enzima da presente invenção pode estabilizar gordura em leite e/ou pode melhorar o aroma.
Uma vantagem da presente invenção é que a enzima funciona (e, de facto, tem uma elevada funcionalidade) a uma baixa temperatura, isto pode ter um determinado número de vantagens, dependendo da utilização em que a enzima é colocada. Por exemplo, na preparação de queijo, esta funcionalidade pode reduzir o risco de contaminação microbiana e crescimento microbiano durante o tratamento enzimático. A razão para isto pode ser que o queijo pode permanecer refrigerado durante o tratamento enzimático. Deste modo, a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção pode ser particularmente adequada para maturação de queijo a baixa temperatura, para aroma melhorado.
Em alimentos para animais, por exemplo, a enzima de acordo com a presente invenção, de um modo vantajoso, pode resultar num ou mais dos seguintes: melhorada eficiência de utilização/conversão de alimento dentro do animal, melhorado aumento de peso corporal do animal, melhorada digestibilidade do alimento, melhorada absorção de azoto pelo animal, e. g., a partir do alimento, melhorada metabolizabilidade de matéria seca e melhorada palatabilidade de alimentação.
Em desengomagem de um óleo comestível, tal como um óleo vegetal, a enzima lipolitica da presente invenção tem uma elevada actividade a baixa temperatura. Isto pode, de um modo vantajoso, reduzir o requisito para aquecer óleo antes ou durante o tratamento enzimático. Isto tem o efeito vantajoso de redução da quantidade de energia necessária para efectuar o tratamento. A enzima de acordo com a presente invenção pode melhorar a selectividade da redução de fosfolípidos, em 43 comparação com triglicéridos. A enzima de acordo com a presente invenção, num óleo comestível (tal como um óleo vegetal), pode aí ter actividade hidrolítica reduzida em triglicéridos, em comparação com fosfolípidos. Isto pode conduzir a menos triglicérido a ser hidrolisado (comparado com uma enzima convencional/fosfolipase) e isto pode conduzir a menos perdas no rendimento em óleo e/ou uma reduzida acumulação de ácido gordo livre no óleo (comparada com uma enzima lipolítica/fosfolipase convencional).
UTILIZAÇÕES A enzima de acordo com a presente invenção tem muitas aplicações.
Em particular, a enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção pode ser útil na preparação de um género alimentício.
Por exemplo, a enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção pode ser particularmente útil no tratamento de ovo ou produtos à base de ovo.
As fosfolipases, particularmente fosfolipase A2 (E.C.3. 1. 1. 4), têm sido utilizadas há muito para o tratamento de ovo ou produtos à base de ovo (por exemplo, ver o documento US 4034124 e Dutihl & Groger 1981 J. Sei. Food Agric. 32, 451-458). A actividade de fosfolipase durante o tratamento de ovo ou produtos à base de ovo resulta na acumulação de lisolecitina polar que pode actuar como um emulsionante. 44 0 tratamento de ovo ou produtos à base de ovo com a enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção pode melhorar a estabilidade, estabilidade térmica sob tratamento de calor, tal como pasteurização e resultar em espessamento substancial. Os produtos à base de ovo podem incluir mas não estão limitados a bolos, maionese temperos de salada, molhos, gelados e semelhantes.
As enzimas lipolíticas fúngicas de acordo com a presente invenção são particularmente úteis na preparação de produtos de panificação, tal como aqueles preparados a partir de uma massa, incluindo pães, bolos, produtos de massa doce, massas laminadas, massas cruas líquidas, queques, dónutes, biscoitos, bolachas salgadas e bolachas.
As enzimas lipolíticas fúngicas de acordo com a presente invenção também podem ser utilizadas em aditivo de melhoramento de pão, e. g., composições de massa, aditivo de massa, condicionadores de massa, pré-misturas e preparações semelhantes adicionadas de modo convencional à farinha e/ou à massa durante processos para preparação de pão ou outros produtos de panificação, de modo a proporcionar propriedades melhoradas ao pão ou outros produtos de panificação.
Deste modo, a presente invenção refere-se, adicionalmente, a uma composição de melhoramento de pão e/ou uma composição de melhoramento de massa, compreendendo uma enzima lipolítica fúngica de acordo com a presente invenção; e também a uma massa ou produto de panificação compreendendo tal composição de melhoramento de pão e/ou melhoramento de massa. 45 A composição de melhoramento de pão e/ou composição de melhoramento de massa pode compreender, adicionalmente a uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção, outras substâncias, substâncias que são utilizadas de modo convencional em panificação, de modo a melhorar as propriedades de massa e/ou produtos de panificação. A composição de melhoramento de pão e/ou composição de melhoramento de massa pode compreender um ou mais agentes de panificação convencionais, tal como um ou mais dos seguintes constituintes:
Um leite em pó, glúten, um emulsionante, gordura granulada, um oxidante, um aminoácido, um açúcar, um sal, farinha ou amido. São exemplos de emulsionantes adequados: monoglicéridos, ésteres de ácido diacetiltartárico de monoglicéridos e diglicéridos de ácidos gordos, ésteres de açúcar, estearoil lactilato sódico (SSL) e lecitinas. A composição de melhoramento de pão e/ou de massa pode compreender, adicionalmente, outra enzima, tal como uma ou mais outras enzimas de grau alimentar adequadas, incluindo enzimas de degradação de amido, tais como endoamilases ou exoamilases, pululanases, enzimas de desramificação, hemicelulases incluindo xilanases, celulases, oxidorredutases, e. g., glucose oxidase, piranose oxidase, sulfidrilo oxidase ou uma hidrato de carbono oxidase, tal como uma que oxidiza maltose, por exemplo, hexose oxidase (HOX), lipases, fosfolipases e hexose oxidase, proteases e aciltransferases (por exemplo, tais como aquelas descritas no documento WO04/064987) . 0 termo "propriedades melhoradas", como aqui utilizado, significa qualquer propriedade que pode ser melhorada pela acção das enzimas lipoliticas fúngicas da presente invenção. Em particular, a utilização de uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção resulta numa ou mais das seguintes características: volume aumentado do produto de panificação; estrutura de miolo melhorada do produto de panificação; propriedades antiendurecimento no produto de panificação; resistência aumentada , estabilidade aumentada, adesividade reduzida e/ou maquinabilidade melhorada da massa.
As propriedades melhoradas são avaliadas por comparação com uma massa e/ou um produto de panificação preparado sem adição da enzima lipolitica de acordo com a presente invenção. 0 termo "produto de panificação", como aqui utilizado, inclui um produto preparado a partir de uma massa. Exemplos de produtos de panificação (quer do tipo branco, claro ou preto) que podem ser produzidos, de um modo vantajoso, pela presente invenção incluem um ou mais dos seguintes: pão (incluindo pão branco, de farinha integral e de centeio), tipicamente na forma de carcaças ou pãezinhos ou tosta, pão de tipo baguete Francesa, pão de pita, tortilhas, tacos, bolos, panquecas, biscoitos, pão estaladiço, pasta, noodles e semelhantes. A massa de acordo com a presente invenção pode ser uma massa levedada ou uma massa para ser submetida a levedação. A massa pode ser levedada de diversas formas, tal como através da adição de bicarbonato de sódio ou semelhantes, ou através da adição de cultura de levedura adequada, tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (levedura de panificação). 47 A presente invenção refere-se, adicionalmente, à utilização da enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção, de modo a produzir uma massa de pasta, de um modo preferido, preparada a partir de farinha dura ou uma farinha de qualidade comparável.
As enzimas lipoliticas fúngicas de acordo com a presente invenção são adequadas para utilização na desengomagem enzimática de óleos vegetais ou comestíveis. No processamento de óleo vegetal ou comestível, o óleo vegetal ou comestível é tratado com uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a presente invenção, de modo a hidrolisar uma parte importante dos lípidos polares (e. g., fosfolípido e/ou glicolípido). De um modo preferido, os grupos acilo gordos são hidrolisados dos lípidos polares. 0 processo de desengomagem, resulta tipicamente na redução do teor dos lípidos polares, particularmente de fosfolípidos, num óleo comestível, em virtude de hidrólise de uma parte importante (í. e., mais de 50%) do lípido polar, e. g., glicolípido e/ou fosfolípido. Tipicamente, a fase aquosa contendo o lípido polar hidrolisado (e. g., fosfolípido e/ou glicolípido) é separada do óleo. Adequadamente, o óleo comestível ou vegetal pode ter inicialmente (pré-tratamento com a enzima de acordo com a presente invenção) um teor de fósforo de 50-250 ppm.
Além disso, a presente invenção é dirigida à utilização de uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção para tratamento de produtos de queijo. A enzima lipolitica de acordo com a presente invenção também é particularmente adequada para utilização na preparação de um alimento para animais. 48
Como o especialista está consciente, o termo "desengomagem", como aqui utilizado, significa a refinação de óleo através da conversão de fosfatídeos (tal como lecitina, fosfolipidos e óleo ocluido) em fosfatídeos hidratáveis. 0 óleo que foi desengomado é mais fluido e tem, deste modo, melhores propriedades de manipulação do que o óleo que não foi desengomado. A seguinte tabela é meramente para orientação geral e proporciona uma visão geral do nível de dosagem para uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção que pode ser necessário em diferentes aplicações. A tabela proporciona, adicionalmente, orientação a respeito do nível de dosagem para uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, quando utilizada, por exemplo, em combinação com um emulsionante. Certamente, como seria evidente para o especialista na técnica, a optimização de dosagem enzimática, temperatura de reacção e tempo de reacção podem ser facilmente determinados, utilizando experimentação de rotina, para qualquer aplicação.
Aplicação Dosagem Dosagem óptima Gama de "óptima", em combinação dosagem, TIPU/kg de com TIPU/KG de farinha emulsionante farinha Pãezinhos 400 120 300-800 estaladiços Pão de tosta de 400 120 300-800 massa directa Fermentação longa de 120 75-250 massa directa 49 (continuação)
Aplicação Dosagem "óptima", TlPU/kg de farinha Dosagem óptima em combinação com emulsionante Gama de dosagem, TIPU/KG de farinha Mistura de velocidade elevada -processo Tweedy 120 300-800 Pastéis & massa de pão de forma dos EUA por cima de DATEM 120 75-400 Tortilha de trigo 700 Contém emulsionantes 400-2500 Bolos - pastéis 2000 Contém emulsionantes de bolos 1000-4000 Massa retardada (24 horas) 120 Contém emulsionantes 75-250 Brioches 200 150-500 noodles fritos instantâneos 200-10000
ISOLADO
Num aspecto, de um modo preferido, a sequência é numa forma isolada. 0 termo "isolado" significa que a sequência é, pelo menos, substancialmente livre de, pelo menos, um outro componente com o qual a sequência está naturalmente associada na natureza e como verificada na natureza. 50
PURIFICADO
Num aspecto, de um modo preferido, a sequência é numa forma purificada. 0 termo "purificado" significa que a sequência é num estado relativamente puro - e. g., pelo menos, cerca de 90% puro ou, pelo menos, cerca de 95% puro ou, pelo menos, cerca de 98% puro.
SEQUENCIA NUCLEOTIDICA O âmbito da presente invenção abrange sequências nucleotidicas codificando enzimas tendo as propriedades especificas como aqui se definem. O termo "sequência nucleotidica", como aqui utilizado, refere-se a uma sequência oligonucleotidica ou sequência polinucleotídica e seus variantes, homólogos, fragmentos e derivados (tal como as suas porções). A sequência nucleotidica pode ser de origem genómica ou sintética ou recombinante que pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples, representando a cadeia sentido ou anti-sentido. O termo "sequência nucleotidica", em relação à presente invenção, inclui ADN genómico, ADNc, ADN sintético e ARN. De um modo preferido, significa ADN, de um modo mais preferido, sequência de ADNc codificando para a presente invenção.
Numa forma de realização preferida, a sequência nucleotidica, quando relativa e quando abrangida pelo âmbito per se da presente invenção, não inclui a sequência nucleotidica nativa de acordo com a presente invenção, quando no seu ambiente 51 natural e quando está ligada à(s) sua(s) sequência(s) naturalmente associada(s) que também está/estão no seu/seus ambiente(s) natural/naturais. Para facilidade de referência, irá nomear-se esta forma de realização preferida de "sequência nucleotidica não nativa". A este respeito, o termo "sequência nucleotidica nativa", significa uma sequência nucleotidica completa que está no seu ambiente nativo e quando operativamente ligada a um promotor completo com o qual está naturalmente associada, promotor que também está no seu ambiente nativo. Contudo, a sequência de aminoácidos incluída no âmbito da presente invenção, pode ser isolada e/ou purificada após expressão de uma sequência nucleotidica no seu organismo nativo. De um modo preferido, contudo, a sequência de aminoácidos abrangida por âmbito da presente invenção pode ser expressa por uma sequência nucleotidica no seu organismo nativo, mas em que a sequência nucleotidica não está sob o controlo do promotor com que está naturalmente associada dentro desse organismo.
PREPARAÇÃO DA SEQUÊNCIA NUCLEOTIDICA
Tipicamente, a sequência nucleotidica abrangida por âmbito da presente invenção é preparada utilizando técnicas de ADN recombinante (i. e., ADN recombinante). Contudo, numa forma de realização alternativa da invenção, a sequência nucleotidica poderia ser sintetizada, na totalidade ou em parte, utilizando métodos químicos bem conhecidos na técnica (ver Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 e Horn T et al.r (1980) Nuc Acids Res Symp Seer 225-232).
Uma sequência nucleotidica codificando uma enzima que tem as propriedades específicas, como aqui se definem, pode ser 52 identificada e/ou isolada e/ou purificada a partir de qualquer célula ou organismo produzindo a referida enzima. São bem conhecidos na técnica, diversos métodos para a identificação e/ou isolamento e/ou purificação da SEQuências nucleotidicas. A titulo exemplificativo, podem ser utilizadas técnicas de amplificação por PCR para preparar mais de uma sequência, assim que uma sequência adequada tenha sido identificada e/ou isolada e/ou purificada. A titulo exemplificativo adicional, pode ser construída uma biblioteca de ADN genómico e/ou ADNc, utilizando ADN cromossómico ou ARN mensageiro a partir do organismo produzindo a enzima. Se a sequência de aminoácidos da enzima ou uma parte da sequência de aminoácidos da enzima for conhecida, sondas oligonucleotídicas marcadas podem ser sintetizadas e utilizadas para identificar clones codificando enzimas a partir da biblioteca genómica preparada a partir do organismo. Alternativamente, uma sonda oligonucleotídica marcada, contendo sequências homólogas a outro gene de enzima conhecido, poderia ser utilizada para identificar clones codificando enzimas. No último caso, são utilizadas condições de hibridação e lavagem de restringência inferior.
Alternativamente, os clones codificando enzimas poderiam ser identificados através da inserção de fragmentos de ADN genómico dentro de um vector de expressão, tal como um plasmideo, transformação de bactérias negativas para enzimas com a biblioteca de ADN genómico resultante e, depois, o plaqueamento das bactérias transformadas sobre placas de agar contendo um substrato para a enzima (e. g., maltose para uma enzima produzindo glucosidase (maltase)) permitindo, desse modo, aos clones expressarem a enzima a ser identificada. 53
Ainda numa alternativa adicional, a sequência nucleotidica codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, e. g., o método do fosforoamidito descrito por Beucage S.L. et al.r (1981) Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869 ou o método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p. 801-805. No método do fosforoamidito, os oligonucleótidos são sintetizados, e. g., num sintetizador de ADN automático, purificados, hibridados, ligados e clonados em vectores apropriados. A sequência nucleotidica pode ser de origem genómica e sintética mista, origem sintética e de ADNc mista ou origem genómica e de ADNc mista, preparada através da ligação de fragmentos de origem sintética, genómica ou de ADNc (conforme apropriado), de acordo com técnicas padrão. Cada fragmento ligado corresponde a diversas partes da totalidade da sequência nucleotidica. A sequência de ADN também pode ser preparada por reacção de polimerização em cadeia (PCR), utilizando iniciadores específicos, por exemplo, como descrito no documento US 4683202 ou em Saiki R K et ai., (Science (1988) 239, p. 487-491).
Em virtude da degenerescência no código genético, as sequências nucleotidicas podem ser facilmente produzidas, nas quais foi alterada a utilização de codão tripleto, para alguns ou a totalidade dos aminoácidos codificados pela sequência nucleotidica original produzindo, desse modo, uma sequência nucleotidica com baixa homologia para a sequência nucleotidica original mas que a codifica, ou um variante, sequência de aminoácidos que a codificada pela sequência nucleotidica original. Por exemplo, para a maioria dos aminoácidos, a degenerescência do código genético é na terceira posição no codão tripleto (posição wobble) (para referência, ver Stryer, 54
Lubert, Biochemistry, Terceira Edição, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7), por conseguinte, a sequência nucleotidica na qual todos os codões tripletos foram "wobbled" na terceira posição seria cerca de 66% idêntica à sequência nucleotidica original. Contudo, a sequência nucleotidica emendada codificaria para a mesma, ou um variante, sequência primária de aminoácidos que a sequência nucleotidica original.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se, adicionalmente, a qualquer sequência nucleotidica que tenha utilização de codão tripleto alternativa para, pelo menos, um codão tripleto codificando aminoácido, mas que a codifique, ou um variante, sequência polipeptidica que a sequência polipeptídica codificada pela sequência nucleotidica original.
Além disso, organismos específicos têm, tipicamente, um desequilíbrio quanto à utilização de codões tripleto para codificar aminoácidos. As tabelas de utilização de codão preferidas estão largamente disponíveis e podem ser utilizadas para preparar genes com codões optimizados. Tais técnicas de optimização de codão são rotineiramente utilizadas para optimizar a expressão de transgenes num hospedeiro heterólogo.
SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS O âmbito da presente invenção também abrange sequências de aminoácidos de enzimas tendo as propriedades específicas, como aqui se definem.
Como aqui utilizado, o termo "sequência de aminoácidos" é sinónimo com o termo "polipéptido" e/ou o termo "proteína". Em 55 alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinónimo com o termo "péptido". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinónimo com o termo "enzima". A sequência de aminoácidos pode ser preparada/isolada a partir de uma fonte adequada ou pode ser preparada sinteticamente ou pode ser preparada por utilização de técnicas de ADN recombinante. A enzima abrangida pela presente invenção, pode ser utilizada em conjunto com outras enzimas. Deste modo, a presente invenção também abrange uma combinação de enzimas, em que a combinação compreende a enzima da presente invenção e outra enzima, que pode ser outra enzima de acordo com a presente invenção.
De um modo preferido, a sequência de aminoácidos, quando relativa e abrangida pelo âmbito per se da presente invenção, não é uma enzima nativa. A este respeito, o termo "enzima nativa" significa uma enzima completa que está no seu ambiente nativo e quando tenha sido expressa pela sua sequência nucleotídica nativa.
IDENTIDADE/HOMOLOGIA A presente invenção também abrange a utilização de homólogos de qualquer sequência de aminoácidos de uma enzima ou de qualquer sequência nucleotídica codificando uma tal enzima.
Aqui, o termo "homólogo" significa uma entidade tendo uma determinada homologia com as sequências de aminoácidos e as 56 sequências nucleotídicas. Aqui, o termo "homologia" pode ser equiparado a "identidade". Estes termos serão aqui utilizados alternadamente.
No presente contexto, pressupõe-se que uma sequência de aminoácidos homóloga inclui uma sequência de aminoácidos que pode ser, pelo menos 92% idêntica, de um modo preferido, pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sitios activos, etc. - e. g., que a sequência de aminoácidos submetida. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de semelhança, (i. e., resíduos de aminoácidos tendo propriedades quimicas/funções semelhantes), no contexto da presente invenção prefere-se expressar a homologia em termos de identidade da SEQuência.
De um modo preferido, uma sequência de aminoácidos homóloga de acordo com a presente invenção é aquela que tem, pelo menos 90% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade, ao longo de uma região de, pelo menos, 30, de um modo mais preferido, 40 aminoácidos contíguos.
No presente contexto, uma sequência nucleotídica homóloga é considerada como incluindo uma sequência nucleotídica que pode ser, pelo menos, 92% idêntica, de um modo preferido, pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a uma sequência nucleotídica codificando uma enzima da presente invenção (a sequência submetida). Tipicamente, os homólogos compreenderão as mesmas sequências que codificam para os sítios activos, etc., como a sequência submetida. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de semelhança, (í. e., resíduos de aminoácidos tendo propriedades quimicas/funções semelhantes), no 57 contexto da presente invenção prefere-se expressar a homologia em termos de identidade da SEQuência.
De um modo preferido, uma sequência nucleotidica homóloga de acordo com a presente invenção é aquela que tem, pelo menos, 90% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade, ao longo de uma região de, pelo menos, 30, de um modo preferido, 40, de um modo mais preferido, 60, nucleótidos contíguos.
Para as sequências de aminoácidos e as sequências nucleotidicas, as comparações de homologia podem ser conduzidas a olho ou, mais habitualmente, com o auxilio de programas de comparação da SEQuências facilmente disponíveis. Estes programas de computador comercialmente disponíveis podem calcular a % de homologia entre duas ou mais sequências. A % de homologia pode ser calculada ao longo da SEQuências contíguas, í. e., uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido numa sequência é directamente comparado com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Este é denominado um alinhamento "sem lacunas". Tipicamente, tais alinhamentos sem lacunas são apenas realizados ao longo de um número relativamente curto de resíduos.
Embora este seja um método muito simples e consistente, não tem em consideração que, por exemplo, num par da SEQuências de outro modo idênticas, uma inserção ou deleção irá causar que os resíduos de aminoácidos seguintes sejam postos de fora de alinhamento resultando, deste modo, potencialmente, numa grande redução em % de homologia quando é realizado um alinhamento global. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação da 58 SEQuências são concebidos para produzirem alinhamentos óptimos que têm em consideração possíveis inserções e deleções, sem penalizarem excessivamente a pontuação global de homologia. Isto é alcançado através da inserção de "lacunas" no alinhamento da SEQuência, de modo a tentar maximizar-se a homologia local.
Contudo, estes métodos mais complexos atribuem "penalidades de lacuna" a cada lacuna que ocorre no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento da SEQuências com tão poucas lacunas quanto possível - reflectindo parentesco superior entre as duas sequências comparadas - irá alcançar uma pontuação mais elevada do que aquela com muitas lacunas. São tipicamente utilizados "custos de lacuna semelhantes" que cobram um custo relativamente elevado para a existência de uma lacuna e uma penalidade mais pequena para cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de pontuação de lacuna mais geralmente utilizado. Penalidades de lacuna elevadas irão, certamente, produzir alinhamentos optimizados com menos lacunas. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades de lacuna sejam modificadas. Contudo, prefere-se utilizar os valores predefinidos quando se utiliza esse software para comparações da SEQuência. Por exemplo, quando se utiliza o pacote GCG Wisconsin Bestfit, a penalidade de lacuna predefinida para sequências de aminoácidos é -12 para uma lacuna e -4 para cada extensão. 0 cálculo de % de homologia máxima, por conseguinte, requer primeiramente a produção de um alinhamento óptimo, tendo em consideração penalidades de lacuna. Um programa de computador adequado para efectuar um tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p. 387). Exemplos de outro software que pode realizar 59 comparações da SEQuência incluem mas não estão limitados ao pacote BLAST (Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al.r 1990 J.
Mol. Biol. 403-410) e a suite GENEWORKS de ferramentas de comparação. Tanto o BLAST como FASTA estão disponíveis para pesquisa desligada da rede e ligada à rede (ver Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60) .
Contudo, para algumas aplicações, prefere-se utilizar o programa GCG Bestfit. Uma nova ferramenta, denominada BLAST 2 Sequences, também está disponível para comparação da SEQuências de proteínas e nucleotídicas (ver FEMS Microhiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.gov) .
Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento não é tipicamente baseado numa comparação de pares tudo-ou-nada. Em vez disso, é utilizada, em geral, uma matriz de pontuação de semelhança à escala que atribui pontos a cada comparação de pares, com base em semelhança química ou distância evolutiva. Um exemplo de uma tal matriz geralmente utilizada é a matriz BL0SUM62 - a matriz predefinida para o conjunto de programas BLAST. Os programas GCG Wisconsin utilizam, em geral, quer os valores predefinidos públicos ou uma tabela de comparação de símbolo por medida, se fornecida (ver o manual do utilizador para detalhes adicionais). Para algumas aplicações, prefere-se utilizar os valores predefinidos públicos para o pacote GCG ou, no caso de outro software, a matriz predefinida, tal como BL0SUM62. 60
Alternativamente, a percentagem de homologias pode ser calculada utilizando o componente de múltiplo alinhamento em DNASIS™ (Hitachi software), com base num algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).
Depois do software ter produzido um alinhamento óptimo, é possivel calcular a % de homologia, de um modo preferido, a % de identidade da SEQuência. Tipicamente, o software faz isto como parte da comparação da SEQuências e gera um resultado numérico.
As sequências também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzam uma alteração silenciosa e resultem numa substância funcionalmente equivalente. Podem ser realizadas substituições de aminoácidos deliberadas com base na semelhança em propriedades de aminoácido (tais como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfifílica dos resíduos) e é, por conseguinte, útil agrupar aminoácidos entre si em grupos funcionais. Os aminoácidos podem ser agrupados entre si com base nas propriedades apenas da sua cadeia lateral. Contudo é mais útil incluir igualmente dados de mutação. Por razões estruturais, é provável que os conjuntos de aminoácidos deste modo derivados sejam conservados. Estes conjuntos podem ser descritos na forma de um diagrama de Venn (Livingstone C.D. e Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). As substituições conservativas podem ser realizadas, por exemplo, de acordo com a tabela abaixo, que descreve um agrupamento de aminoácidos de diagrama de Venn geralmente aceite. 61
CONJUNTO SUBCONJUNTO Hidrófobo FWYHKMILVAGC Aromático FWYH Alifático ILV Polar WYHKREDCSTNQ Carregado HKRED Positivamente carregado HKR Negativamente carregado ED Pequeno VCAGSPTND Muito pequeno AGS A presente invenção também abrange substituição homóloga (substituição e troca são aqui ambas utilizadas como significando a permuta de um residuo de aminoácido existente com um residuo alternativo) que pode ocorrer, i. e., substituição de semelhante-por-semelhante, tais como básico por básico, acidico por acidico, polar por polar, etc. A substituição não homóloga também pode ocorrer, i. e., de uma classe de residuo para outra ou, alternativamente, envolvendo a inclusão de aminoácidos não naturais, tais como ornitina (a seguir referida como Z), ornitina de ácido diaminobutírico (a seguir referida como B), ornitina de norleucina (a seguir referida como 0), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.
As trocas também podem ser realizadas por aminoácidos não naturais.
As sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos da sequência, incluindo grupos 62 alquilo, tais como grupos metilo, etilo ou propilo, adicionalmente a espaçadores de aminoácidos, tais como resíduos de glicina ou β-alanina. Uma forma adicional de variação envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptóide, será bem compreendida pelos especialistas na técnica. Para evitar a dúvida, "a forma peptóide" é utilizada para referir resíduos de aminoácidos variantes, em que o grupo substituinte α-carbono está no átomo de azoto do resíduo, em vez do α-carbono. Os processos para preparação de péptidos na forma peptóide são conhecidos na técnica, por exemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 e Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
As sequências nucleotídicas para utilização na presente invenção podem incluir dentro das mesmas nucleótidos sintéticos ou modificados. Um determinado número de diferentes tipos de modificação para oligonucleótidos é bem conhecido na técnica. Estes incluem estruturas de metilfosfonato e fosforotioato e/ou a adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3' e/ou 5' da molécula. Para efeitos da presente invenção, deve ser compreendido que as sequências nucleotídicas aqui descritas podem ser modificadas por qualquer método disponível na técnica. Tais modificações podem ser efectuadas, para melhorar a actividade in vivo ou duração de vida da SEQuências nucleotídicas da presente invenção. A presente invenção também abrange a utilização da SEQuências nucleotídicas que são complementares às sequências aqui apresentadas ou qualquer derivado, seu fragmento ou derivado. Se a sequência for complementar a um seu fragmento, então essa sequência pode ser utilizada como uma sonda, de modo 63 a identificar sequências codificantes semelhantes em outros organismos etc.
Os polinucleótidos que não são 100% homólogos às sequências da presente invenção, mas que se encontrem abrangidos pelo âmbito da invenção, podem ser obtidos de diversas maneiras. Outros variantes das sequências aqui descritas podem ser obtidos, por exemplo, através de sondagem de bibliotecas de ADN preparadas a partir de uma gama de indivíduos, por exemplo, indivíduos de populações diferentes. Adicionalmente, podem ser obtidos outros homólogos e tais homólogos e os seus fragmentos irão, em geral, ser capazes de selectivamente hibridarem com sequências mostradas na presente listagem da SEQuências. Tais sequências podem ser obtidas através de sondagem de bibliotecas de ADNc ou bibliotecas de ADN genómico, preparadas a partir de outras espécies e sondagem de tais bibliotecas com sondas compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das sequências na listagem da SEQuências anexa, sob condições de restringência média a elevada. Considerações semelhantes aplicam-se à obtenção de homólogos de espécies e variantes alélicos das sequências polipeptídicas ou nucleotídicas da invenção.
Os variantes e homólogos de estirpe/espécie também podem ser obtidos utilizando PCR degenerado que irá utilizar iniciadores concebidos para visar sequências dentro dos variantes e homólogos codificando sequências de aminoácidos conservadas, dentro das sequências da presente invenção. As sequências conservadas podem ser previstas, por exemplo, através do alinhamento das sequências de aminoácidos de diversos variantes/homólogos. Os alinhamentos da SEQuências podem ser realizados utilizando software de computador conhecido na técnica. Por exemplo, o programa GCG Wisconsin PileUp é largamente utilizado.
Os iniciadores utilizados em PCR degenerado irão conter uma ou mais posições degeneradas e irão ser utilizados em condições de restringência inferiores àquelas utilizadas para clonagem da SEQuências com iniciadores da SEQuência simples contra sequências conhecidas.
Alternativamente, tais polinucleótidos podem ser obtidos por mutagénese dirigida pontual da SEQuências caracterizadas. Isto pode ser útil onde, por exemplo, sejam requeridas alterações da SEQuência de codão silenciosas, de modo a optimizar preferências de codão para uma célula hospedeira particular, na qual as sequências polinucleotidicas estão sendo expressas. Podem desejar-se outras alterações da SEQuência, para introduzir sitios de reconhecimento de restrição enzimática, ou para alterar a propriedade ou função do polipéptido codificado pelos polinucleótidos.
Os polinucleótidos (sequências nucleotidicas) da invenção podem ser utilizados para produzir um iniciador, e. g., um iniciador de PCR, um iniciador para uma reacção de amplificação alternativa, uma sonda, e. g., marcada com um marcador revelador por meios convencionais, utilizando marcadores radioactivos ou não radioactivos, ou os polinucleótidos podem ser clonados em vectores. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos terão, pelo menos 15, de um modo preferido, pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 25, 30 ou 40 nucleótidos em comprimento e também estão abrangidos pelo termo polinucleótidos da invenção, como aqui utilizado. 65
Polinucleótidos, tais como polinucleótidos de ADN e sondas de acordo com a invenção podem ser produzidos recombinantemente, sinteticamente ou por qualquer meio disponível dos especialistas na técnica. Também podem ser clonados por técnicas padrão.
Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo uma preparação por etapas da sequência de ácido nucleico desejada, um nucleótido de cada vez. As técnicas para a sua realização, utilizando técnicas automatizadas, estão facilmente disponíveis na técnica.
Os polinucleótidos mais compridos irão, em geral, ser produzidos utilizando meios recombinantes, por exemplo, utilizando técnicas de clonagem de PCR (reacção de polimerização em cadeia). Os iniciadores podem ser concebidos de modo a conterem sítios de reconhecimento de restrição enzimática adequados, de modo que o ADN amplificado possa ser clonado num vector de clonagem adequado.
BIOLOGICAMENTE ACTIVO
De um modo preferido, as sequências variantes, etc., são, pelo menos, tão biologicamente activas como as sequências aqui apresentadas.
Como aqui utilizado, "biologicamente activo", refere-se a uma sequência tendo uma função estrutural semelhante (mas não necessariamente com o mesmo grau) e/ou função regulatória semelhante (mas não necessariamente com o mesmo grau) e/ou função bioquímica semelhante (mas não necessariamente com o mesmo grau) da sequência de ocorrência natural. 66
HIBRIDAÇAO A presente invenção também abrange sequências que são complementares às sequências de ácido nucleico da presente invenção ou sequências que são capazes de se hibridarem com as sequências da presente invenção ou com sequências que são complementares a estas. 0 termo "hibridação", como aqui utilizado, deverá incluir "o processo pelo qual uma cadeia de ácido nucleico se une com uma cadeia complementar através de emparelhamento de bases", assim como o processo de amplificação como efectuado em tecnologias de reacção de polimerização em cadeia (PCR). A presente invenção também abrange a utilização da SEQuências nucleotídicas que são capazes de hibridarem com sequências que são complementares às sequências aqui apresentadas, ou qualquer derivado, seu fragmento ou derivado. O termo "variante" também abrange sequências que são complementares a sequências que são capazes de hibridarem com sequências nucleotídicas aqui apresentadas.
De um modo preferido, o termo "variante" abrange sequências que são complementares a sequências que são capazes de hibridarem sob condições restringentes (e. g., 50 °C e 0,2xSSC {lxSSC = NaCl a 0,15 M, Na3citrato a 0,015 M, pH 7,0}) com sequências nucleotídica aqui apresentadas.
De um modo mais preferido, o termo "variante" abrange sequências que são complementares a sequências que são capazes de hibridarem sob condições de elevada restringência (e. g., 65 67 °C e 0,lxSSC {lxSSC = NaCl a 0,15 M, Na3citrato a 0,015 M, pH 7,0}) com sequências nucleotídica aqui apresentadas. A presente invenção também se refere a sequências nucleotidicas que podem hibridar com sequências nucleotidicas da presente invenção (incluindo sequências complementares daquelas aqui apresentadas). A presente invenção também se refere a sequências nucleotidicas que são complementares a sequências que se podem hibridar com sequências nucleotidicas da presente invenção (incluindo sequências complementares daquelas aqui apresentadas).
Também estão incluídas dentro do âmbito da presente invenção, sequências polinucleotídicas que são capazes de hibridarem com sequências nucleotidicas aqui apresentadas, sob condições de restringência intermédia a máxima.
Num aspecto preferido, a presente invenção abrange sequências nucleotidicas que podem hibridar com a sequência nucleotídica da presente invenção, ou com o seu complemento, sob condições restringentes (e. g., 50 °C e 0,2xSSC).
Num aspecto mais preferido, a presente invenção abrange sequências nucleotidicas que podem hibridar com a sequência nucleotídica da presente invenção, ou ao seu complemento, sob condições restringentes elevadas (e. g., 65 °C e 0,lxSSC). 68
RECOMBINANTE
Num aspecto, a sequência para utilização na presente invenção é uma sequência recombinante, í. e., uma sequência que foi preparada utilizando técnicas de ADN recombinante.
Estas técnicas de ADN recombinante estão dentro das capacidades do especialista na técnica. Tais técnicas são explicadas na literatura, por exemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Livros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
SINTÉTICO
Num aspecto, a sequência para utilização na presente invenção é uma sequência sintética, i. e., uma sequência que foi preparada por síntese química ou enzimática in vitro. Inclui, mas não está limitada a sequências preparadas com utilização óptima de codão para organismos hospedeiros - tais como as leveduras metilotróficas Pichia e Hansenula.
EXPRESSÃO DE ENZIMAS A sequência nucleotídica para utilização na presente invenção pode ser incorporada dentro de um vector replicável recombinante. 0 vector pode ser utilizado para replicar e expressar a sequência nucleotídica, na forma de enzima, em uma e/ou de uma célula hospedeira compatível. 69 A expressão pode ser controlada utilizando sequências de controlo, e. g., sequências requlatórias. A enzima produzida por uma célula hospedeira recombinante, por expressão da sequência nucleotidica, pode ser seqreqada ou pode estar contida intracelularmente, dependendo da sequência e/ou do vector utilizados. As sequências codificantes podem ser concebidas com sequências sinal que diriqem a secreção das sequências codificantes de substância, através de uma particular membrana celular procariótica ou eucariótica.
VECTOR DE EXPRESSÃO 0 termo "vector de expressão" significa uma construção capaz de expressão ín vivo ou in vitro.
De um modo preferido, o vector de expressão é incorporado dentro do genoma de um organismo hospedeiro adequado. 0 termo "incorporado", de um modo preferido, abrange incorporação estável dentro do genoma. A sequência nucleotidica da presente invenção pode estar presente num vector, no qual a sequência nucleotidica é ligada de um modo operativo a sequências regulatórias capazes de proporcionarem a expressão da sequência nucleotidica por um organismo hospedeiro adequado.
Os vectores para utilização na presente invenção podem ser transformados dentro de uma célula hospedeira adequada, como se descreve abaixo, de modo a proporcionar expressão de um polipéptido da presente invenção. 70 A escolha do vector, e. g., um vector de plasmídeo, cosmídeo ou fago irá, frequentemente, depender da célula hospedeira dentro da qual deve ser introduzido.
Os vectores para utilização na presente invenção podem conter um ou mais genes marcadores seleccionáveis, tal como um gene que confere resistência a antibióticos, e. g., resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Alternativamente, a selecção pode ser realizada por co-transformação (como descrita no documento W091/17243).
Os vectores podem ser utilizados in vitro, por exemplo, para a produção de arn ou utilizados para transfectar, transformar, transduzir ou infectar uma célula hospedeira.
Deste modo, numa forma de realização adicional, a invenção proporciona um método de preparação da SEQuências nucleotidicas da presente invenção, através da introdução de uma sequência nucleotidica da presente invenção dentro de um vector replicável, introdução do vector dentro de uma célula hospedeira compatível e cultivo da célula hospedeiro sob condições que conduzem a replicação do vector. 0 vector pode, adicionalmente, compreender uma sequência nucleotidica permitindo ao vector replicar-se na célula hospedeira em questão. São exemplos de tais sequências as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBUO, pEl94, pAMBl e piJ702. 71
SEQUÊNCIAS REGULATÓRIAS
Em algumas aplicações, a sequência nucleotídica para utilização na presente invenção é ligada de um modo operativo a uma sequência regulatória que é capaz de proporcionar a expressão da sequência nucleotídica, tal como pela célula hospedeira escolhida. A título exemplificativo, a presente invenção abrange um vector compreendendo a sequência nucleotídica da presente invenção ligada de um modo operativo a este tipo da SEQuência regulatória, i. e., o vector é um vector de expressão. 0 termo "ligado operativamente" refere-se a uma justaposição, em que os componentes descritos estão numa relação que lhes permite funcionarem no seu modo pretendido. Uma sequência regulatória "ligada de um modo operativo" a uma sequência codificante é ligada de tal modo que a expressão da sequência codificante é alcançada sob condição compatível com as sequências de controlo. 0 termo "sequências regulatórias" inclui promotores e estimuladores e outros sinais de regulação de expressão. 0 termo "promotor" é utilizado no sentido normal da técnica, e. g., um sítio de ligação de ARN polimerase. A expressão melhorada da sequência nucleotídica codificando a enzima da presente invenção também pode ser alcançada pela selecção de regiões regulatórias heterólogas, e. g., regiões promotoras, de secreção, condutoras e terminadoras. 72
De um modo preferido, a sequência nucleotidica de acordo com a presente invenção é ligada de um modo operativo a, pelo menos, um promotor.
Exemplos de promotores adequados para dirigirem a transcrição da sequência nucleotidica num hospedeiro bacteriano, fúngico ou de levedura, são bem conhecidos na técnica.
CONSTRUÇÕES 0 termo "construção" - que é sinónimo de termos, tais como "conjugado, "cassete" e "híbrido" - inclui uma sequência nucleotidica para utilização de acordo com a presente invenção directamente ou indirectamente conjugada a um promotor.
Um exemplo de uma conjugação indirecta é a disposição de um grupo espaçador adequado, tal como uma sequência intrónica, tal como o intrão Shl ou o intrão ADH, intermediário do promotor e da sequência nucleotidica da presente invenção. 0 mesmo é verdade para o termo "fundido", em relação à presente invenção, que inclui conjugação directa ou indirecta. Em alguns casos, os termos não abrangem a combinação natural da sequência nucleotidica codificando para a proteína normalmente associada ao promotor génico de tipo selvagem e quando estão ambos no seu ambiente natural. A construção pode mesmo conter ou expressar um marcador, que permite a selecção da construção genética.
Para algumas aplicações, de um modo preferido, a construção da presente invenção compreende, pelo menos, a sequência 73 nucleotídica da presente invenção ligada de um modo operativo a um promotor.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS 0 termo "célula hospedeira" - em relação à presente invenção, inclui qualquer célula que compreende a sequência nucleotídica ou um vector de expressão, como anteriormente descritos e que é utilizada na produção recombinante de uma enzima tendo as propriedades específicas, como aqui se definem.
Deste modo, uma forma de realização adicional da presente invenção proporciona células hospedeiras transformadas ou transfectadas com uma sequência nucleotídica que expressa a enzima da presente invenção. As células serão escolhidas para serem compatíveis com o referido vector e podem, por exemplo, ser células procarióticas (por exemplo, bacterianas), fúngicas, de levedura ou vegetais. De um modo preferido, as células hospedeiras não são células humanas. São exemplos de organismos hospedeiros bacterianos adequados espécies bacterianas Gram-positivas ou Gram-negativas.
Dependendo da natureza da sequência nucleotídica codificando a enzima da presente invenção e/ou a desejabilidade para processamento adicional da proteína expressa, podem ser preferidos hospedeiros eucarióticos, tais como leveduras ou outros fungos. Em geral, as células de levedura são preferidas em relação a células fúngicas, em virtude de serem mais fáceis de manipular. Contudo, algumas proteínas, ou são pobremente segregadas da célula de levedura ou, em alguns casos, não são 74 convenientemente processadas (e. g., hiperglicosilação em levedura). Nestes casos, deverá ser seleccionado um organismo hospedeiro fúngico diferente. A utilização de células hospedeiras adequadas - tais como células hospedeiras de levedura, fúngicas e de plantas - pode proporcionar modificações pós-traducionais (e. g., miristoilação, glicosilação, truncamento, lapidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina), visto que pode ser necessário conferir actividade biológica óptima em produtos de expressão recombinantes da presente invenção. A célula hospedeira pode ser uma estirpe deficiente em protease ou ter menos protease. 0 genótipo da célula hospedeira pode ser modificado, de modo a melhorar a expressão.
Exemplos de modificações de célula hospedeira incluem deficiência em protease, suplementação de ARNt raros e modificação do potencial redutor no citoplasma, de modo a melhorar a formação de ligação dissulfureto.
Por exemplo, a célula hospedeira E. coli pode sobreexpressar ARNt raros, de modo a melhorar a expressão de proteínas heterólogas, como exemplificado/descrito em Kane (Curr Opin Bíotechnol (1995), 6, 494-500 "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli") . A célula hospedeira pode ser deficiente num
determinado número de enzimas redutoras favorecendo, deste modo, a formação de ligações dissulfureto estáveis, como exemplificado/descrito em Bessette (Proc Natl Acad Sei USA 75 (1999), 96, 13703-13708 "Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm").
ORGANISMO O termo "organismo", em relação à presente invenção, inclui qualquer organismo que possa compreender a sequência nucleotidica codificando para a enzima de acordo com a presente invenção, e/ou produtos dela obtidos, e/ou em que um promotor pode permitir a expressão da sequência nucleotidica de acordo com a presente invenção quando presente no organismo.
Organismos adequados podem incluir um procariota, fungo, levedura ou uma planta. O termo "organismo transgénico", em relação à presente invenção, inclui qualquer organismo que compreende a sequência nucleotidica codificando para a enzima de acordo com a presente invenção, e/ou os produtos dela obtidos, e/ou em que um promotor pode permitir a expressão da sequência nucleotidica de acordo com a presente invenção dentro do organismo. De um modo preferido, a sequência nucleotidica é incorporada no genoma do organismo. O termo "organismo transgénico" não abrange sequências codificantes nucleotídicas nativas no seu ambiente natural, quando as mesmas estão sob o controlo do seu promotor nativo, que também está no seu ambiente natural.
Por conseguinte, o organismo transgénico da presente invenção inclui um organismo compreendendo qualquer uma, ou combinações da sequência nucleotidica codificando para a enzima 76 de acordo com a presente invenção, construções de acordo com a presente invenção, vectores de acordo com a presente invenção, plasmideos de acordo com a presente invenção, células de acordo com a presente invenção, tecidos de acordo com a presente invenção ou os seus produtos.
Por exemplo, o organismo transgénico também compreende a sequência nucleotidica codificando para a enzima da presente invenção, sob o controlo de um promotor heterólogo.
TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS/ORGANISMOS HOSPEDEIROS
Como indicado anteriormente, o organismo hospedeiro pode ser um organismo procariótico ou um organismo eucariótico. Exemplos de hospedeiros procarióticos adequados incluem E. coli e Bacillus subtilis.
Os ensinamentos sobre a transformação de hospedeiros procarióticos estão bem documentados na técnica, por exemplo, ver Sambrook et al. {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se for utilizado um hospedeiro procariótico, então a sequência nucleotidica pode necessitar de ser adequadamente modificada antes da transformação - tal como por remoção de intrões.
As células de fungos filamentosos podem ser transformadas utilizando diversos métodos conhecidos na técnica - tais como um processo envolvendo a formação de protoplastos e transformação dos protoplastos, seguida de regeneração da parede celular num modo conhecido. A utilização de Aspergíllus como um microrganismo hospedeiro é descrita no documento EP 0238023. 77
Outro organismo hospedeiro pode ser uma planta. Uma revisão das técnicas gerais utilizadas para transformação de plantas pode ser verificada em artigos por Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) e Christou (Agro-Food-Industry Ηί-Tech Março/Abril 1994 17-27).
Ensinamentos adicionais sobre transformação de plantas podem ser encontrados no documento EP-A-0449375.
Os ensinamentos gerais sobre a transformação de fungos, leveduras e plantas são apresentados nas seguintes secções.
FUNGO TRANSFORMADO
Um organismo hospedeiro pode ser um fungo - tal como um fungo filamentoso. Exemplos de tais hospedeiros adequados incluem qualquer membro pertencendo aos géneros Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora,
Trichoderma e semelhantes.
Os ensinamentos sobre a transformação de fungos são revistos no documento US-A-5741665 que refere que as técnicas padrão para transformação de fungos filamentosos e cultivo dos fungos são bem conhecidas na técnica. Uma extensa revisão de técnicas, como aplicadas a N. crassa é encontrada, por exemplo, em Davis e de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
Ensinamentos adicionais sobre transformação de fungos filamentosos são revistos no documento US-A-5674707.
Num aspecto, o organismo hospedeiro pode ser do género Aspergillus, tal como Aspergillus niger. 78
Um Aspergillus transgénico de acordo com a presente invenção também pode ser preparado seguindo, por exemplo, os ensinamentos de Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S. D., Kinghorn J. R. (Editores) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol. 29. Elsevier Amesterdão 1994. p. 641-666). A expressão génica em fungos filamentosos foi revista em Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20(5): 200-6,
Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4): 273-306.
LEVEDURA TRANSFORMADA
Noutra forma de realização, o organismo transgénico pode ser uma levedura.
Uma revisão dos princípios de expressão génica heteróloga em levedura é proporcionada em, por exemplo, Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, e Curr Opin Biotechnol (1997) Oct;8(5): 554-60. A este respeito, pode ser utilizada levedura - tais como as espécies Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris (ver FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), como um veiculo para expressão génica heteróloga.
Uma revisão dos princípios da expressão génica heteróloga em Saccharomyces cerevisiae e secreção de produtos génicos é proporcionada por E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 79 5, Anthony H Rose e J Stuart Harrison, Eds., 2a edição, Academic Press Ltd.).
Para a transformação de levedura, foram desenvolvidos vários protocolos de transformação. Por exemplo, uma
Saccharomyces transgénica de acordo com a presente invenção pode ser preparada seguindo os ensinamentos de Hinnen et al., (1978,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275, 104); e Ito, H et al. (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
As células de levedura transformadas podem ser seleccionadas utilizando diversos marcadores selectivos - tais como marcadores auxotróficos, marcadores de resistência a antibióticos dominantes.
PLANTAS TRANSFORMADAS/CÉLULAS VEGETAIS
Um organismo hospedeiro adequado para a presente invenção pode ser uma planta. Uma revisão das técnicas gerais pode ser encontrada em artigos por Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) e Christou (Agro-Food-Industry Hi
Tech Março/Abril 1994 17-27).
CULTIVO E PRODUÇÃO
As células hospedeiras transformadas com a sequência nucleotidica da presente invenção podem ser cultivadas sob condições conducentes à produção da enzima codificada e que 80 facilitem a recuperação da enzima a partir das células e/ou meio de cultura. 0 meio utilizado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para crescimento da célula hospedeira em questões e obtenção de expressão da enzima. A proteína produzida por uma célula recombinante pode ser apresentada na superfície da célula. A enzima pode ser segregada das células hospedeiras e pode ser convenientemente recuperada do meio de cultura, utilizando processos bem conhecidos.
SECREÇÃO
Frequentemente, é desejável que a enzima seja segregada do hospedeiro de expressão para dentro do meio de cultura, de onde a enzima pode ser mais facilmente recuperada. De acordo com a presente invenção, a sequência condutora de secreção pode ser seleccionada com base no hospedeiro de expressão desejado. Também podem ser utilizadas sequências sinal híbridas, com o contexto da presente invenção.
Exemplos típicos da SEQuências condutoras de secreção heterólogas são aqueles originários do gene de amiloglucosidase fúngica (AG) (glaA - as versões de 18 e 24 aminoácidos, e. g., de Aspergillus), o gene do factor α (leveduras, e. g., Saccharomyces, Kluyveromyces e Hansenula) ou o gene de a-amilase (Bacillus). 81 A título exemplificativo, a secreção de proteínas heterólogas em E. coli é revista em Methods Enzymol (1990) 182:132-43.
DETECÇÃO
Uma variedade de protocolos para detecção e medição da expressão da sequência de aminoácidos é conhecida na técnica. Exemplos incluem o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e triagem celular de activação fluorescente (FACS).
Uma ampla variedade de marcadores e técnicas de conjugação é conhecida dos especialistas na técnica e pode ser utilizada em diversos ensaios de ácidos nucleicos e aminoácidos.
Um determinado número de empresas, tais como a Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) e US Biochemical Corp (Cleveland, OH) fornecem kits comerciais para estes processos.
Moléculas ou marcadores repórter adequados incluem aqueles radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogénicos, assim como substratos, cofactores, inibidores, partículas magnéticas e semelhantes. As patentes ensinando a utilização de tais marcadores incluem os documentos US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350 ; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 e US-A-4366241.
Também, podem ser produzidas imunoglobulinas recombinantes, como mostrado no documento US-A-4816567. 82
PROTEÍNAS DE FUSÃO A sequência de aminoácidos para utilização de acordo com a presente invenção pode ser produzida como uma proteína de fusão, por exemplo, para auxiliar na extracção e purificação. Exemplos de agentes de proteínas de fusão incluem a glutationo-S-transferase (GST), 6xHis, GAL4 (domínios de ligação de ADN e/ou activação de transcrição) e (β-galactosidase). Também pode ser conveniente incluir um sítio de clivagem proteolítica entre o agente de proteína de fusão e a sequência de proteína de interesse, de modo a permitir a remoção da SEQuências de proteína de fusão.
De um modo preferido, a proteína de fusão não irá impedir a actividade da sequência de proteína.
Sistemas de expressão de fusão génica em E. coli foram revistos em Curr Opin Biotechnol (1995) 6(5):501-6.
Noutra forma de realização da invenção, a sequência de aminoácidos pode ser ligada a uma sequência heteróloga, de modo a codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, para rastreio de bibliotecas peptídicas para agentes capazes de afectarem a actividade de substância, pode ser útil codificar uma substância quimérica expressando um epitopo heterólogo que seja reconhecido por um anticorpo comercialmente disponível. 83
APLICAÇÃO DE GRANDE ESCALA
Numa forma de realização preferida da presente invenção, a sequência de aminoácidos é utilizada para aplicações de grande escala.
De um modo preferido, a sequência de aminoácidos é produzida numa quantidade de 1 g por litro a cerca de 2 g por litro do volume de cultura celular total, após cultivo do organismo hospedeiro.
De um modo preferido, a sequência de aminoácidos é produzida numa quantidade de 100 mg por litro a cerca de 900 mg por litro do volume de cultura celular total, após cultivo do organismo hospedeiro.
De um modo preferido, a sequência de aminoácidos é produzida numa quantidade de 250 mg por litro a cerca de 500 mg por litro do volume de cultura celular total, após cultivo do organismo hospedeiro.
ALIMENTO A composição da presente invenção pode ser utilizada como -ou na preparação de - um alimento. Aqui, o termo "alimento" é utilizado num sentido amplo - e abrange alimento para humanos, assim como alimento para animais (i. e., uma alimentação). Num aspecto preferido, o alimento é para consumo humano. 84 0 alimento pode ser na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.
INGREDIENTE ALIMENTAR A composição da presente invenção pode ser utilizada como um ingrediente alimentar.
Como aqui utilizado, o termo "ingrediente alimentar" inclui uma formulação que é ou pode ser adicionada a alimentos funcionais ou géneros alimentícios e inclui formulações que podem ser utilizadas a baixos níveis numa ampla variedade de produtos que requerem, por exemplo, acidificação ou emulsificação. 0 ingrediente alimentar pode ser na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.
PRODUTOS ALIMENTARES A composição da presente invenção pode ser utilizada na preparação de produtos alimentares, tais como um ou mais de: produtos de confeitaria, produtos lácteos, produtos de aves domésticas, produtos de peixe e produtos de panificação. A presente invenção também proporciona um método de preparação de um alimento ou um ingrediente alimentar, o método 85 compreendendo a mistura de uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção com outro ingrediente alimentar.
EXEMPLOS A presente invenção será, agora, descrita, apenas a título exemplificativo, na qual pode ser feita referência às seguintes figuras: A Figura 1 mostra perfis de actividade de lipase (indicados por áreas a sombreado, marcadas como agregado B) e proteína (linha quebrada) obtidos após cromatografia IEC. A Figura 2 mostra enzima lipolitica fúngica purificada (corredor 3-5) aplicada a um gel (NU-PAGE, 4-12%, tampão Mes, preparado como descrito pelo fabricante, Novex, USA), que foi, depois, corada com commassie. A Figura 3 mostra o cromatograma N° 61. A Figura 4 mostra SDS-PAGE de fracções da coluna de Butil Sepharose (P: Agregado N° 172-174, 100 U/mL, diluído 1:10; Std = série de proteína padrão). A Figura 5 mostra experiências de minicozimento com 1) Chr N° 61 frac. 9. 2) Agregado N° 172-N0 174. 3) Chr. N° 61 frac. 14. 4) Controlo. 5) Lipase N° 3044. A Figura 6 mostra análise de GLC de lípidos de massa digalactosildiglicérido (DGDG) e digalactosilmonoglicérido (DGMG) de BS8948-2 86 A Figura 7 mostra o alinhamento da SEQuências de aminoácidos de todos os péptidos CBS com a lipase da estirpe Japonesa de F. heterosporum (Nagao et ai. 1994). Aminoácidos idênticos e semelhantes (bem conservados) são marcados debaixo do alinhamento com * e , respectivamente. A Figura 8 mostra uma sequência nucleotidica e sequência de aminoácidos traduzida do gene sintético da enzima lipolitica de F. heterosporum (CBS 782.83) fundida à sequência sinal alfa sintética. A sequência de aminoácidos é apresentada por cima da sequência nucleotidica. Os nucleótidos contendo os sitios de restrição enzimática Eco RI e Bam Hl estão sublinhados e os codões de iniciação e terminação traducional estão duplamente sublinhados. Uma ponta de seta marca a posição da fusão entre a sequência sinal alfa e o gene de enzima lipolitica. As setas indicam os iniciadores utilizados para o agrupamento do gene. A Figura 9 mostra uma representação esquemática do vector de expressão pBl4 de Hansenula, contendo o gene sintético da enzima lipolitica de F. heterosporum (CBS 782.83) (LIPASE) fundido a uma sequência sinal alfa sintética (alfa ss). URA3, gene de orotidina-5'-fosfato-descarboxilase para complementação de uracilo para selecção em Hansenula. HARS, Sequência de replicação autónoma para replicação em Hansenula. FMD-P, promotor FMD para expressão em Hansenula. A Figura 10 mostra actividade de fosfolipase de clones de Hansenula polymorpha seleccionados, contendo o gene sintético da enzima lipolitica de F. heterosporum. A lecitina foi utilizada como substrato e o ácido gordo livre foi determinado utilizando o kit NEFA (Roche). 87 A Figura 11 mostra um mini-pão cozido com dosagem aumentada (PLU) de amostra 205 de fosfolipase e Lipopan F™. A Figura 12 mostra análise de lipidos de massa. DGDG= digalactosildiglicérido. DGMG digalactosilmonoglicérido. Soma= DGDG+DGMG (Exemplo 3). A Figura 13 mostra um cromatograma de HPTLC de A) Referências: 1. Lipido de farinha fraccionado, 2. DGDG Hidrolisado, 3. DGDG. B) Lipidos extraídos da massa: 4. Controlo, 5. 2000 PLU-7/kg de amostra 205 e 6. 40 ppm de Lipopan F™. A Figura 14 mostra análise de GLC do isómero digalactosilmonoglicérido em massa tratada com uma enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum. A Figura 15 mostra actividade de enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum, determinada por 10 minutos de acção enzimática em substrato de lecitina, pH 7,0, a diversas temperaturas e subsequente determinação de ácidos gordos livres pelo método NEFA C. A Figura 16 mostra actividade de enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum, determinada após 30 minutos de incubação em tampão de fosfatos a 50 mM, a 3 TlPU/mL e diversas temperaturas (tampão de fosfatos a 50 mM) por 10 minutos de acção enzimática em substrato de lecitina (sem CaCl2), a 37 °C e pH 7,0 e subsequente determinação de ácidos gordos livres pelo método de NEFA C. 88 A Figura 17 mostra actividade de enzima lipolitica derivada de Fusarium heterosporum, determinada após 10 minutos de acção enzimática em substrato de lecitina (sem CaCl2), a 37 °C e diversos pH (tampão de fosfatos a 50 mM) e subsequente determinação de ácidos gordos livres pelo método de NEFA C. A Figura 18 mostra actividade de enzima lipolitica derivada de Fusarium heterosporum, determinada após 30 minutos de incubação em tampão de fosfatos a 50 mM, a 3 TIPU/mL e diversos pH (tampão de fosfatos a 50 mM) por 10 minutos de acção enzimática em substrato de lecitina (sem CaCl2), a 37 °C e pH 7,0 e subsequente determinação de ácidos gordos livres pelo método de NEFA C.
As Figuras 19a e 19b mostram a determinação do peso molecular, como determinado por SDS-PAGE, de uma enzima lipolitica derivada de Fusarium heterosporum. A Figura 20 representa a temperatura óptima para uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção. A reacção enzimática foi efectuada a diversas temperaturas. A Figura 21 representa a quantidade de lecitina em gema de ovo modificada por enzima, em função do tempo de reacção a A: 30 °C, B: 40 °C e C: 50 °C. A quantidade de lecitina foi analisada por LC/MS-MS e é expressa como percentagem de gema de ovo. A Figura 22 representa a quantidade de liso-lecitina em gema de ovo modificada por enzima, em função do tempo de reacção a A: 30 °C, B: 40 °C e C: 50 °C. A quantidade de 89 lisolecitina foi analisada por LC/MS-MS e é expressa como percentagem de gema de ovo. A Figura 23 representa a quantidade de ácido gordo livre em gema de ovo modificada por enzima, em função do tempo de reacção a A: 30 °C, B: 40 °C e C: 50 °C. A quantidade de ácido gordo livre foi analisada pelo método de NEFA C e é expressa como percentagem de gema de ovo. A Figura 24 representa a conversão enzimática de gema de ovo com uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção (Exemplo 4). Quantidades de liso-lecitina (A), ácido gordo livre (B) e lecitina (C) e função do tempo de reacção. As barras de erro indicam o desvio-padrão das duplas determinações (n=2). A quantidade de lecitina e lisolecitina foi determinada por LC/MS-MS e a quantidade de ácido gordo livre foi determinada pelo método de NEFA C. Os resultados são expressos como percentagem de gema de ovo. A Figura 25 representa a conversão enzimática de gema de ovo com fosfolipase Lecitase® Ultra, a partir da Novozymes A/S (Exemplo 4). Quantidades de liso-lecitina (A), ácido gordo livre (B) e lecitina (C) e função do tempo de reacção. As barras de erro indicam o desvio-padrão das duplas determinações (n=2). A quantidade de lecitina e lisolecitina foi determinada por LC/MS-MS e a quantidade de ácido gordo livre foi determinada pelo método de NEFA C. Os resultados são expressos como percentagem de gema de ovo. A Figura 26 mostra análise de TLC (o solvente era clorofórmio:metanol:água (65:24:4)) de extracto de lípido a partir de gema de ovo modificada (Exemplo 4). 1: LPC e 90 padrão de LPC. 2: Enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, 10 °C, 240 min. 3: Enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, 20 °C, 240 min. 4: Enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, 53 °C, 240 min. 5: Enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, 20 °C, 1440 min. 6: Lecitase® Ultra, 10 °C, 4 h. 7: Lecitase® Ultra, 20 °C, 240 min. 8: Lecitase® Ultra, 53 °C, 4 h. 9: Lecitase® Ultra, 20 °C, 1440 min. 10: Amostra de controlo. Os compostos listados à esquerda da placa de tlc são colesterol (C), triacilglicérido (TG), diacilglicérido (DG), ácido gordo livre (FFA), monoacilglicérido (MG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC), liso-fosfatidiletanolamina (LPE) e liso-fosfatidilcolina (LPC) . A Figura 27 representa a relação entre alteração em liso-lecitina e teor de ácido gordo livre durante a acção enzimática de gema de ovo, com uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção e fosfolipases
Lecitase® Ultra, respectivamente (Exemplo 4) . Os resultados são baseados num peso molar de liso-lecitina de 523 e um peso molar de ácidos gordos livres de 283. O ácido gordo livre foi determinado pelo método de NEFA C. Lisolecitina e lecitina foram determinadas por LC/MS-MS. A Figura 28 mostra a análise de HPTLC (o solvente era p-éter:MTBE:ácido acético (50:50:1)) de extracto de lípido de gema de ovo modificada (Exemplo 4). Os compostos listados à esquerda da placa de TLC são triacilglicérido (TG), ácido gordo livre (FFA), 1,3 diacilglicérido (1,3 DG); 1,2 diacilglicérido (1,2 DG), colesterol (C), monoacilglicérido (MG), fosfatidiletanolamina (PE), 91 fosfatidilcolina (PC), liso-fosfatidiletanolamina (LPE) e liso-fosfatidilcolina (LPC). A Figura 29 mostra a análise de TLC (solvente IV) de maionese preparada com gema de ovo modificada por enzima a partir de Sanofa A/S (Exemplo 5). A Figura 30 mostra maionese preparada a partir de gema de ovo modificada por enzima a partir de Sanofa A/S, tratada pelo calor num forno microondas (Exemplo 5) . A amostra 1 era um controlo com água adicionada, em vez de solução enzimática, a amostra 2 continha 30 U/g de enzima lipolitica de acordo com a presente invenção e a amostra 3 continha 30 U/g de Lecitase® Ultra. A Figura 31 mostra o volume específico de pãezinhos de crosta dura, cozidos com diferentes concentrações de uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção, isoladamente ou em combinação com emulsionante DATEM Panodan® M2020 e testados contra uma combinação de Lipopan F™ e DATEM, assim como Lipopan F™ puro ou DATEM puro. A Figura 32 mostra o volume específico de pão de pãezinhos de crosta dura, cozidos com diferentes concentrações de uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção, isoladamente ou em combinação com emulsionante Panodan® A2020 DATEM ou SSL P 55 e testados contra uma combinação de Lipopan F™/SSL P 55 ou Lipopan™/DATEM, assim como Lipopan F pura, DATEM pura e SSL P 55 pura. A Figura 33 mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID N° 5) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID N° 4) do ADNc de 92 lipase de F. semitectum (IBT 9507) . A sequência de aminoácidos deduzida é apresentada por cima da sequência nucleotidica. As setas indicam os iniciadores utilizados para a amplificação do ADNc. A Figura 9 mostra uma representação esquemática do vector de expressão pDBl4-alp-sem de Hansenula, contendo o gene de lipase de F. semitectum (Lipase) fundido à sequência sinal α (alfa ss) . AP(R), URA3, gene de orotidina-5' fosfato-descarboxilase para complementação de uracilo para selecção. HARS, Sequência de replicação autónoma para replicação em Hansenula. FMD-P, promotor FMD para expressão em Hansenula. A Figura 35 mostra actividade de fosfolipase de uma enzima lipolitica de Fusaríum semitectum IBT9507, em função da temperatura. A Figura 36 mostra actividade de fosfolipase de uma enzima lipolitica de Fusaríum semitectum IBT9507, em função do pH. A Figura 37 mostra uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 1) de uma enzima lipolitica fúngica derivada de Fusarium heterosporum. A Figura 38 mostra uma sequência de aminoácidos de uma enzima lipolitica fúngica derivada de Fusarium heterosporum, compreendendo uma sequência sinal N-terminal (sublinhada) (SEQ ID N° 2). A Figura 39 mostra uma sequência nucleotidica (SEQ ID N° 3), codificando uma enzima lipolitica fúngica 93 derivada de Fusarium heterosporum de acordo com a presente invenção. A Figura 40 mostra uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 4) de uma enzima lipolitica derivada de Fusarium semitectum. A Figura 41 mostra uma sequência nucleotidica (SEQ ID N° 5), codificando uma enzima lipolitica derivada de Fusarium semitectum. A Figura 42 mostra uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 6) de uma enzima lipolitica derivada de Fusarium heterosporum (EAEA é um propéptido, originalmente proveniente da sequência sinal do factor a). A Figura 43 mostra uma sequência nucleotidica (SEQ ID N° 7) de uma enzima lipolitica derivada de Fusarium heterosporum, que inclui uma sequência sinal do factor a.
Exemplo 1. Expressão, purificação, sequenciação e ensaios de cozimento de uma enzima lipolitica de Fusarium heterosporum.
FERMENTAÇÃO A estirpe CBS 782.83 de Fusarium heterosporum foi obtida de Centraalbureau voor Schimmelcultures (Paises Baixos). 94
Meios de crescimento Ágar com extracto de levedura-glucose
Extracto de levedura 4 g/L KH2P04 1 g/L MgS04, 7H20 0, 5 g/L Glucose 15 g/L Ágar 20 g/L A glucose foi adicionada após autoclavagem. 1.4 Meio de pré-fermentação
Farinha de soja 50 g/L Glucose mono-hidratada 50 g/L KH2PO4 2 g/L Na2HP04 3 g/L Óleo de soja 1 g/L O meio foi preparado em balões de agitação de 500 mL com deflectores e foram adicionados 100 mL por balão de agitação. O óleo de soja foi adicionado a cada balão de vidro separadamente. A glucose foi adicionada após autoclavagem. 95
Meio de produção
Peptona
Tween TM-80
MgS04, 7H20
CaCl2, 2H20
10 g/L 12 g/L 2 g/L 0,1 g/L O meio foi preparado em balões de agitação de 500 mL com deflectores e foram adicionados 100 mL por balão de agitação. O Tween TM-80 foi adicionado a cada balão de vidro separadamente. O pH foi ajustado para 6,0, antes da autoclavagem.
Condições de cultura O Fusarium heterosporum CBS 782.83 foi inoculado em placas de ágar com extracto de levedura-glucose que foram incubadas, a 24 °C, até desenvolvimento de esporos.
Um balão de agitação contendo meio de pré-fermentação foi inoculado com placa de ágar de 4 cm2, contendo uma cultura bem esporulada. O balão de agitação foi incubado a 30 °C e 200 RPM. Após três dias de crescimento, 30 balões de agitação de meio de produção foram inoculados cada um com 5 mL de caldo de fermentação a partir do balão de agitação de pré-fermentação. Os balões de agitação de meio de produção foram incubados a 30 °C e 200 RPM. 96
Dez balões de agitação de meio de produção foram recolhidos após 2, 3 e 4 dias de crescimento. A biomassa foi removida por centrifugação, seguida de filtração estéril do sobrenadante, através de filtros de 0,2 pm (Unidade de Filtração VacuCap 90 w/0,2 pm de Membrana Supor) de Gelman Laboratory. Após filtração, o filtrado foi congelado a -80 °C e armazenado até análise.
PROCESSOS ANALÍTICOS A actividade de fosfolipase foi determinada de acordo com o "ensaio PLU", aqui anteriormente descrito.
APLICAÇÃO
Análise de tlc A placa de TLC foi activada numa estufa de aquecimento (110 °C), durante h h. 100 mL de tampão de corrida foram vertidos para dentro de uma câmara de cromatografia com tampa. As paredes da câmara foram cobertas com papel de filtro (Whatman 2), para saturar a câmara com o vapor de solvente. A placa de TLC foi colocada numa armação e a amostra foi aplicada sobre a placa de TLC, a 2 cm do fundo. A placa de TLC foi, depois, colocada na câmara de TLC com o tampão de corrida escolhido. Quando o tampão de corrida alcançou 14 cm a partir do fundo da placa, a placa de TLC foi retirada e seca numa câmara 97 colocada na estufa de aquecimento, a de exaustão e, depois, 110 °C, durante 10 minutos. A placa de TLC foi, depois, imersa no reagente de revelação e seca na estufa de aquecimento, a 110 °C, durante 15 minutos
Tampão de corrida: N° IV: Clorofórmio : Metanol : H20 (65: 25: 4) N° I : P-éter : éter metil-terc-butilico (MTBE) : Ácido acético (60: 40: 1)
Tampão de revelação (tampão de vanadato): 32 g de Na2C03 e 300 mL de H20 (1 M) 18,2 g de pentóxido de vanadato (V205) foram adicionados e dissolvidos durante aquecimento suave e cozidos num forno "BACO-LINE", durante 6 minutos. A solução foi arrefecida para a temperatura ambiente.
Cuidadosamente, são adicionados 460 mL de H2S04 a 2,5 M (460 mL de H20 + 61 mL de H2S04) .
Foi adicionada água para 1000 mL. 98
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa Capilar, Perkin Elmer 8420, equipado com coluna de sílica fundida, WCOT, 12,5 m x 0,25 mm ID x 0,1 pm, fenil-metil-silicone a 5% (CP Sil 8 CB, da Crompack).
Veículo: Hélio.
Injecção: 1,5 pL com separador.
Detector: FID. 385 °C.
Programa de forno: 1 2 3 4 Temperatura de forno [°C] 80 200 240 360 Isotérmico, tempo [min] 2 0 0 10 Taxa de temperatura [°C/min] 20 10 12 Preparação da amostra: 5C i mg de lípido de trigo foram dissolvidos em 12 mL de heptano: piridina 2: : 1, contendo um padrão interno heptadecano, 2 mg/mL . 500 pL da amostra foram transferidos para um frasquinho de vidro frisado. Foram adicionados 100 pL de MSTFA (N-Metil-N-trimetilsililtrifluoracetamida) e a reacção incubada, durante 15 minutos, a 90 °C. Cálculo: Factores de resposta para mono-di-triglicéridos, ácido gordo livre e galactolípidos foram determinados a partir de misturas de referência destes componentes. Os lípidos na massa foram calculados com base nestes factores de resposta. 99
Teste de mini-cozimento.
Os seguintes ingredientes foram adicionados uma tigela de amassadeira Brabrender de 50 g e amassados, durante 5 minutos, a 30 °C: 50 g de farinha, 10 g de levedura seca, 0,8 g de açúcar, 0,8 g de sal, 70 ppm de ácido ascórbico e água (para uma consistência de massa de 400 unidades de Brabender). O tempo de repouso foi de 10 min., a 34 °C. A massa foi pesada, 15 g por massa. Depois, moldada num dispositivo especial, onde a massa foi enrolada entre uma placa de madeira e uma armação de Plexiglas. As massas foram fermentadas em formas, durante 45 min., a 34 °C e cozidas num forno caseiro Voss, durante 8 min., 225 °C.
Após cozimento, os pães foram arrefecidos para a temperatura ambiente e após 20 min min., os pães foram pesados e o volume foi determinado pelo método de substituição de colza. Os pães também foram cortados e o miolo e a crosta avaliados.
Testes Piloto de Cozimento (Pãezinhos de Crosta Dura)
Farinha, Danish reform, 1500 g, Levedura Comprimida 90 g, açúcar 24 g, sal 24 g, água 400 unidades Brabender + 2% foram amassados numa amassadeira com gancho Hobart, durante 2 minutos, a baixa velocidade e 9 minutos a alta velocidade. A temperatura da massa era de 26 °C. A massa pesava 1350 gramas. A massa repousou, durante 10 minutos, a 30 °C e foi moldada num moldador Fortuna. A massa foi, depois, fermentada, durante 45 minutos, a 34 °C. A massa foi cozida num forno Bago, durante 18 minutos, a 220 °C e cozida ao vapor, durante 12 segundos. 100
Após arrefecimento, os pãezinhos foram pesados e o volume dos pãezinhos foi medido pelo método de substituição de colza.
Volume especifico de pão
Volume específico = Volume do pão, mL
Volume do pão, grama
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Fermentação
As amostras de fermentação foram analisadas para actividade de fosfolipase e os resultados são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1 Resultados de fermentação ID Organismo Rótulo de amostra PLU-7 172 Fusarium heterosporum CBS 782.83 aMeio D. dia 2 35 173 Fusarium heterosporum CBS 782.83 Meio D. dia 3 33 174 Fusarium heterosporum CBS 782.83 Meio D. dia 4 26 aMeio D = meio de produção 101
Verificou-se que a actividade de fosfolipase era quase idêntica nos dias 2, 3 e 4 e todas as amostras foram, por conseguinte, agregadas e denominadas JBS-2254-97-3.
Purificação e sequenciação
Purificação de fosfolipase a partir de extracto cru, utilizando cromatografia de permuta aniónica: A coluna (gel Q-Sepharose FF, 1,5 X 2,8 cm, 5 mL) foi preparada como descrito pelo fabricante (Amersham Bio.) e, depois, equilibrada em tampão tris a 20 mM/HCl, NaCl a 0,1 M, pH 7,5 (tampão A). À amostra (15 mL) foi adicionado NaCl a 0,1 Me aplicado à coluna, a um caudal de 3,5 mL/min. A enzima lipolitica foi eluida com um gradiente linear de NaCl a 0-0,6 M, em tampão A (Ver a Figura 1). Fracções de 3,5 mL foram recolhidas durante toda a corrida. 10 pL de cada fracção foram submetidos a ensaio de doseamento pontual em placa. A actividade de lipase foi determinada pelo ensaio de doseamento pontual de tributirina e lecitina em placa (10 pL de cada fracção foram transferidos para o poço e a placa foi incubada a 40 °C. A formação de halos nos géis de agarose ocorre em função do tempo. Um branco sem enzima também foi adicionado a um dos poços para comparação). As fracções contendo actividade lipolitica foram, depois, submetidas a análises de SDS-PAGE (Ver a Figura 2) e N-terminais. 102
Impressão digital enzimática por MALDI-TOF e sequenciação de aminoácidos A proteína foi reduzida com Ditiotreitol e os resíduos de cisteína foram protegidos por carboximetilação utilizando iodoacetamida. A proteína foi clivada por tripsina e o padrão de fragmentação dos péptidos tripticos foi examinado por análise de MALDI-TOF. Os péptidos foram separados por cromatografia numa coluna de HPLC de fase reversa - Cu e o grau de purificação foi monitorizado por análise de MALDI-TOF. A sequência de aminoácidos foi determinada por degradação de Edman, como anteriormente descrito em detalhe em TR6452. A sequência de aminoácidos completa da enzima lipolítica de Fusarium heterosporum foi determinada. A digestão com tripsina proporcionou péptidos muito específicos, onde o PM (MALDI-TOF) poderia ser determinado de forma conclusiva. As sequências de aminoácidos para a totalidade dos péptidos também foram determinadas por degradação de Edman. A sequência de aminoácidos determinada por degradação de Edman abrange 99,64% da cadeia polipeptidica da enzima lipolítica de F. heterosporum. 0 sumário dos estudos de MALDI-TOF e degradação de Edman é mostrado na Tabela 2. 103
Tabela 2 impressão digital enzimática e PM dos péptidos tripticos da enzima lipolitica de Fusarium heterosporum e determinação da sequência de aminoácidos completa por degradação de Edman.
Enzima lipolitica de Fusarium heterosporum (2254-97-3) N° De Sequência M+H calc M+H obs 1 1-13 AVGVTSTDFTNFK 1387,5 2 + 14-33 FYIQHGAAAYCNSGTAAGAK 2059,2 2059,0 3 + 34-59 ITCSNNGCPTIESNGVTWASFTGSK 2701,9 4 + 60-72 TGIGGYVSTDSSR 1300,4 5 + 73-73 K 147, 2 6 + 74-80 EIWAIR 780,0 780,0 7 81-86 GSSNIR 632, 7 8 + 87-128 NWLTNLDFDQSDCSLVSGCGVHSGFQN AWA EISAQASAAVAK 4514,8 9 129-130 AR 246,3 10 131-131 K 147,2 11 132-137 ANPSFK 663,8 12 + 138-158 WATGHSLGGAVATLSAANLR 1966,3 1966,1 13 + 159-173 AAGTPVDIYTYGAPR 1552,7 1552,6 14 + 174-192 VGNAALSAFISNQAGGEFR 1910,1 1910,0 15 193-197 VTHDK 599, 7 16 198-202 DPVPR 583, 7 17+ 203-211 LPPLIFGYR 1076,3 1076,3 18 + 212-226 HTTPEYWLSGGGGDK 1605,7 104 (continuação)
Enzima lipolitica de Fusarium heterosporum (2254-97-3) N° De Sequência M+H calc M+H obs 19 + 227-235 VDYAISDVK 1010,1 20a 236-274 VCEGAANLMCNGGTLGLDIDAHLHYFQ ATD ACNAGGFSW* 4231,5 4233,2 20b+ 236-275 VCEGAANLMCNGGTLGLDIDAHLHYFQ ATD ACNAGGFSW*R 4387,7 4387,8 + = Confirmado por sequenciação de Edman * = cobertura da SEQuência de Triptofano oxidado = 99,64% A sequência de aminoácidos completa da enzima lipolitica de Fusarium heterosporum é mostrada como SEQ ID N° 1 (ver a Figura 37).
Ensaios de aplicação
Um agregado de 2 litros das três amostras de F. heterosporum (Tabela 1), rotulado Agregado N° 172-174, foi concentrado por ultrafiltração (filtro de 10 kDa), numa unidade de Ultra Filtração Amicon. 250 mL do retentado continham aprox. 100 PLU-7/mL. O retentado foi ajustado para acetato de Amónio a 1 M e aplicado sobre uma coluna Butil Sepharose de 27 mL (2,5 cm id.) e eluido com tampão A, NH4-acetato a 1 M, em TEA a 20 mM, pH 7,4 e tampão B, TEA a 20 mM, pH 7,4. O cromatograma (N° 61) da purificação é mostrado na Figura 3. 105
As fracções do cromatograma N° 61 foram analisadas por SDS-PAGE, como mostrado na Figura 4.
Fracções de 10 mL desta cromatografia foram recolhidas e analisadas para actividade de fosfolipase, como mostrado na
Tabela 3. Estes resultados indicam uma quantidade bastante elevada de actividade de fosfolipase nas fracções eluidas no pico principal do cromatograma. Uma pequena quantidade de actividade não está ligada à coluna, mas é eluida na frente. Embora o gel de SDS não tivesse corrido assim tão bem, é observado que as fracções contêm diversas proteínas, mas as fracções 14 e 15 contêm uma banda principal que se espera que seja a enzima lipolítica fúngica.
Tabela 3
Cromatograma N° 61. PLU-7 Frac. 8 32 Frac. 9 89 Frac. 10 69 Frac. 11 51 Frac. 12 39 Frac. 13 81 Frac. 14 23 Frac. 15 17 A fracção 9 e fracção 14 do cromatograma N° 61 foram utilizadas para um teste de minicozimento e também o agregado não purificado N° 172-174 foi testado no teste de minicozimento. 106
Os resultados desta experiência de cozimento são mostrados na Tabela 4. Este claramente mostra que, em termos de volume do pão melhorado, a enzima lipolitica purificada de F. heterosporum CBS 782.83 proporciona resultados de cozimento muito bons. Igualmente, a amostra não purificada contribuiu para um volume do pão muito bom. A estrutura de miolo dos pães também foi muito melhorada pela enzima lipolitica de F. heterosporum, como indicado na Figura 5 e avaliada melhor do que uma lipase de Pseudomonas cepacia N° 3044.
Tabela 4
Amostra Enzima PLU-7/50 g de farinha Volume do pão, mL/g 1 Chr. N° 61 frac. 9 100 u 4,33 2 Agregado N° 172-174 100 u 4,33 3 Chr. N° 61 frac. 14 100 u 4,60 4 Controlo 0 3,29 5 Lipase, N° 3044 4 0 ppm 4,38 A massa desta experiência de minicozimento foi extractada com butanol saturado em água e os lipidos foram analisados por TLC. A análise de TLC confirmou que a Lipase N° 3044 é mais activa em triglicérido do que as amostras de enzima lipolitica de F. heterosporum. A quantidade de ácido gordo livre (FFA) também é superior com a lipase N° 3044. O TLC em solvente IV indica um componente (DGMG), que é claramente superior nas amostras de lipidos de massa tratada com F. Heterosporum, em comparação com uma lipase N° 3044 hidrolisando triglicéridos. 107
As fracções purificadas de F. heterosporum também foram testadas na experiência de cozimento piloto, com os resultados mostrados na Tabela 5.
Tabela 5 Utilização de fracções cromatográficas purificadas de Fusarium heterosporum em teste de cozimento piloto e efeitos sobre volume do pão. N° Volume específico (ccm/g) 1 Controlo 5,11 2 500 U, F. het., Agregado N° 172-N° 174 6,28 3 1000 U, F. het./ Agregado N° 172-N° 174 6,79 4 40 ppm N° 3044 (Pseudomonas) 5,27 5 2000 U, F. het., Agregado N° 172-N° 174 6,24 6 4000 U, F. het., Agregado N° 172-N° 174 4,95 7 1000 U, 2254-97 C61 6,95 8 40 ppm N° 3016 (LipopanF™) 6,97 A massa deste teste de cozimento foi extraída com butanol saturado em água e os lípidos de massa analisados por análise de GLC, com os resultados mostrados na Tabela 6. 108
Tabela 6 Análise de GLC de lípidos de massa. GL=glicerol. FFA= ácido gordo livre. MGMG=monogalactosilmonoglicérido. DAG= Diglicérido. DGMG digalactosilmonoglicérido. MGDG= monogalactosildiglicérido. DGDG=digalactosildiglicérido. TRI= triglicérido. GL FFA MGMG DAG DGMG MGDG DGDG TRI Controlo 0,120 0, 152 0,0015 0,0771 0,0195 0,0644 0,172 0, 770 500 U, F. het. Agregado N° 172-N0 174 0,121 0, 250 0,012 0,059 0, 057 0,030 0,139 0, 792 1000 U, F. het., Agregado N° 172-N0 174 0,121 0, 277 0, 018 0,056 0, 087 0, 010 0,102 0, 738 40 ppm N° 3044 0,127 0, 368 0, 002 0,132 0, 022 0, 066 0,173 0,276 2000 U, F. het., Agregado N° 172-N0 174 0,122 0, 320 0, 018 0,060 0, 119 0, 013 0, 062 0, 723 4000 U, F. het., Agregado N° 172-N0 174 0,128 0,332 0,021 0,065 0, 146 0,010 0,033 0, 739 1000 U, 2254-97 C61 0,125 0, 287 0, 019 0,067 0, 088 0, 016 0, 099 0, 655 40 ppm N° 3016 0,124 0, 284 0, 017 0,058 0, 086 0, 014 0,101 0, 723 A taxa de hidrólise de DGDG comparada com hidrólise de triglicérido é mostrada na Tabela 7. 109 A análise de GLC de galactolípidos também é ilustrada graficamente na Figura 6.
Os resultados de GLC confirmam que a quantidade de DGMG produzido na massa por F. heterosporum é superior à quantidade produzida por 40 ppm de Lipopan F (N° 3016). Os resultados também indicam um grau mais elevado de hidrólise de MGDG do que DGDG. Os resultados também indicam que a quantidade de triglicérido hidrolisado é baixa, comparada com uma enzima hidrolisando triglicérido normal como N° 3044 de P. cepacia. Os resultados de cozimento à escala piloto e a análise de lipido confirmaram que a enzima lipolitica de F. heterosporum CBS 782.83 tem clara actividade hidrolítica em digalactosildiglicérido (DGDG) e a formação de digalactosilmonoglicérido (DGMG) numa massa.
Tabela 7 Taxa de hidrólise de DGDG comparada com hidrólise de triglicérido de fracções cromatográficas purificadas de Fusarium heterosporum dTRI dDGDG dDGDG/dTRI Controlo 500 U, F. het., Agregado N° 172-N° 174 0 0,033 n/a 1000 U, F. het., Agregado N° 172-N° 174 0, 032 0,07 2,19 40 ppm N° 3044 0,494 0 n/a 2000 U, F. het., Agregado N° 172- 0,047 0,11 2,34 110 (continuação) dTRI dDGDG dDGDG/dTRI N° 174 4000 U, F. het., Agregado N° 172- 0, 031 0,139 4,4 N° 174 1000 U, 2254-97 C61 0,115 0,073 0,63 40 ppm N° 3016 0,047 0,071 1,5
4. CONCLUSÕES
Neste estudo, foi produzida uma enzima lipolitica fúngica de F. heterosporum CBS 782.83 por fermentação em balões de agitação. A enzima foi purificada e a sequência de aminoácidos foi determinada. A enzima tem cerca de 83% de homologia com uma lipase comercial de F. oxysporum (LipopanF™). Em termos de volume do pão melhorado e estrutura de miolo melhorada, a enzima proporcionou resultados muito bons no ensaio de cozimento. A análise de lipido de massa confirmou que a enzima era activa em galactolipidos durante produção de galactomonoglicéridos. Sem qualquer optimização de dosagem, os resultados de cozimento indicam que a enzima lipolitica fúngica de F. heterosporum CBS 782.83 é, pelo menos, equivalente à enzima comercial LipopanF e o DGDG comparativo para actividade de triglicéridos indica que esta enzima tem uma actividade enzimática superior num ambiente de massa, em comparação com LipopanF™. 111 EXEMPLO 2. Construção e expressão de um gene sintético codificando uma enzima lipolítica de Fusarium heterosporum (CBS 782.83) em Hansenula polymorpha. A sequência de aminoácidos de uma enzima lipolítica fúngica, isolada de Fusarium heterosporum (CBS 782.83), foi determinada e utilizada para conceber e clonar um gene sintético da enzima lipolítica, para expressão em Hansenula polymorpha. De modo a favorecer expressão elevada, os codões do gene sintético foram optimizados para estarem de acordo com as preferências de codão de Hansenula polymorpha. Foi igualmente sintetizada uma sequência sinal, com codões optimizados, do factor alfa e clonada na frente do gene sintético da enzima lipolítica. A construção agrupada foi transferida para dentro do vector de expressão pB 14 e transformada dentro de Hansenula polymorpha. 0 pB 14 é um plasmídeo sem genes, conferindo resistência a antibióticos e, por conseguinte, pode ser utilizado em instalações de produção.
Foi rastreado um determinado número de estirpes de Fusarium produzindo enzimas lipolíticas para actividade, com uma elevada proporção de actividade em galactolípidos e/ou fosfolípidos, quando comparada com triglicéridos. Várias das estirpes foram seleccionadas como produzindo enzimas lipolíticas de interesse. De entre estas, está o Fusarium heterosporum (CBS 782.83). A enzima lipolítica desta estirpe foi, por conseguinte, isolada e a sequência de aminoácidos foi determinada. A sequência de aminoácidos foi retrotraduzida para uma sequência de ácido nucleico que foi utilizada para conceber e construir um gene sintético para expressão em Hansenula polymorpha. 112
EXPERIMENTAL A estirpe de Hansenula utilizada neste estudo foi a estirpe RB11 (odcl) de Hansenula polymorpha uracilo-auxotrófica, obtida a partir de Rheln Blotech GmbH (Dusseldorf, Alemanha).
Impressão digital enzimática por MALDI-TOF e sequenciação de aminoácidos. A proteina tendo actividade de enzima lipolitica foi isolada de Fusarium heterosporum (CBS 782.83). A proteina foi reduzida com ditiotreitol e os resíduos de cisteina foram protegidos por carboximetilação utilizando iodoacetamida. A proteina foi clivada por tripsina e o padrão de fragmentação dos péptidos trípticos foi examinado por análise de MALDI-TOF. Os péptidos foram separados por cromatografia numa coluna de HPLC de fase reversa - Cie e o grau de purificação foi monitorizado por análise de MALDI-TOF. A sequência de aminoácidos foi determinada por degradação de Edman, como anteriormente descrito em detalhe em TR6452.
Concepção e construção de um gene sintético de enzima lipolitica.
As sequências de aminoácidos dos fragmentos peptidicos foram ordenadas por alinhamento com a estirpe Japonesa de F. heterosporum (Nagao et al. 1994). A sequência de aminoácidos completa, deste modo obtida, foi retro-traduzida numa sequência de ácido nucleico, de modo a revelar todos os codões possíveis. Para cada codão, o codão mais favorável para expressão em 113
Hansenula polymorpha foi escolhido de acordo com a tabela de preferência de codão de genes expressos em Hansenula polymorpha. Foram sintetizados oligonucleótidos sintéticos, cada de cerca de 100 nucleótidos de comprimento, compreendendo o gene completo e o gene foi agrupado por PCR. Para a amplificação final do gene, foi utilizado um iniciador a montante (alps.cbss), concebido com os nucleótidos mais em 5' a partir da extremidade 3' da sequência sinal do factor alfa, de modo a permitir a fusão em fase e um iniciador a jusante (cbss.t) concebido com um sitio de restrição enzimática Bam Hl, para objectivos de clonagem (Tabela 8) .
Uma sequência nucleotidica codificando a sequência sinal do factor de cruzamento alfa de levedura foi sintetizada de modo semelhante com codões favoráveis por oligonucleótidos e amplificada por PCR. Para a amplificação final da sequência sinal alfa foi utilizado um iniciador a montante (alpsynt), concebido com um sítio de restrição enzimática Eco RI para objectivos de clonagem e um iniciador a jusante (cbss.alps), concebido com as sequências mais em 5' a partir da extremidade 5' do gene sintético da enzima lipolítica, de modo a permitir a fusão em fase (Tabela 8).
De modo a fundir a sequência sinal do factor alfa ao gene sintético da enzima lipolítica, os dois fragmentos foram misturados e reamplifiçados com os iniciadores externos alpsynt e cbss.t (Tabela 8). O produto de PCR foi clonado dentro do vector pCR 2.1-T0P0 (Invitrogen) e a sequência nucleotidica dos insertos foi determinada utilizando um kit da SEQuenciação BigDye Terminator v3.0 cycle (Applied Biosystems) e um Analisador Genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). 114
Tabela 8. Sequências iniciadoras utilizadas para a amplificação e agrupamento do gene sintético da enzima lipolitica de F. heterosporum (CBS 782.83) e a sequência sinal alfa sintética. Os sitios de restrição enzimática introduzidos para objectivos de clonagem em cada iniciador estão sublinhados. Os nucleótidos incluídos permitindo a fusão do gene sintético da enzima lipolitica e sinal alfa sintético estão duplamente sublinhados.
Gene Sequência iniciadora Sitio de restrição CBSLip 5 '-alps.cbss 5’- TCCTTGGACAAGAGAGCCGTTGGAGTGACC TCTACTG Nenhum 3'-cbss.t 51- AGGATCCAATTCTCTCCATGGCCTATCTCCA GGAGAA ACCTCCG Bam Hl Sinal α 5 '-alpsynt 5'- AGAATTCAAACGATGAGATTCCCATCCATC TTTACCG Eco RI 3 '-cbss.alps 5'- AGGTCACTCCAACGGCTCTCTTGTCCAAGG AAACAC CTTCC Nenhum 115
Expressão de enzima lipolítica em Hansenula polymorpha.
De modo a expressar o gene sintético da enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.93) em Hansenula, o gene combinado da sequência sinal alfa/enzima lipolítica foi inserido atrás do promotor FMD dentro do vector de expressão pB 14 de Hansenula, um plasmídeo sem genes conferindo resistência a antibióticos. Após conformação da estrutura esperada do plasmídeo agrupado em E. coll, o plasmídeo foi transformado dentro de células competentes de Hansenula polymorpha por electroporação. Os transformantes foram seleccionados em placas de YND e as colónias foram adicionalmente seleccionadas para múltipla integração do gene por 3 e 8 sub-cultivos de diluições 1:200 em culturas líquidas de ynd. Finalmente, as culturas seleccionadas foram estabilizadas através de duas transferências em meio YPD. De modo a adicionalmente seleccionar para elevada expressão, todas as culturas mostrando elevado nível de expressão foram plaqueadas para colónias únicas, as quais foram todas ensaiadas para nível de expressão.
De modo a determinar o nível de expressão do gene da enzima lipolítica, os clones seleccionados foram cultivados em YPD, com glicerol a 1,8% e glucose a 0,2%, durante 2 dias, a 24 °C.
Actividade enzimática
Amostras do meio de cultura foram analisadas para actividade de enzima lipolítica, com lecitina ou DGDG como substratos e utilizando o kit NEFA (Roche), reduzido à escala para placas de microtitulação, para determinação dos ácidos gordos livres libertados. 116
RESULTADOS
Impressão digital enzimática por MALDI-TOF e sequenciação de aminoácidos. A sequência de aminoácidos completa da enzima lipolitica de Fusarium heterosporum foi determinada (Ver SEQ ID N° 1 - Figura 37) . A digestão com tripsina proporcionou péptidos muito específicos, onde o PM (MALDI-TOF) poderia ser determinado de forma conclusiva. As sequências de aminoácidos para a totalidade dos péptidos também foram determinadas por degradação de Edman. As sequências de aminoácidos determinadas por degradação de Edman abrangem 99,64% da cadeia polipeptídica da enzima lipolitica de F. heterosporum (CBS 782.83). As sequências de aminoácidos de todos os péptidos foram alinhadas à lipase da estirpe Japonesa de F. heterosporum (Nagao et al. 1994 J. Biochem. 116: 536-540) revelando, deste modo, a ordem dos péptidos identificando a sequência de aminoácidos da proteína madura. O alinhamento é mostrado na Figura 7. O sumário dos estudos de MALDI-TOF e degradação de Edman é mostrado na Tabela 9, com a ordem dos péptidos de acordo com o alinhamento com a sequência de Nagao. 117
Tabela 9. Impressão digital enzimática, determinação de PM da sequência de aminoácidos completa por degradação de Edman dos péptidos trípticos da enzima lipolítica de Fusarium heterosporum (CBS 782.83). As sequências peptídicas confirmadas por degradação de Edman são marcadas com +. Triptofano oxidado é marcado por *. Cobertura da SEQuência = 99,64%.
Fosfolipase de Fusarium heterosporum (2254-97- 3) Clivagem parcial N° De Sequência M+H calc M+H obs Péptidos M+H calc M+H obs 1 1-13 AVGVTSTDFTNFK 1387,5 2 + 14- 33 FYIQHGAAAYCNSGTAAGAK 2059,2 2059 1+2 3427 3427 3 + 34- 59 ITCSNNGCPTIESNGVTWASFTGSK 2701,9 4 + 60- 72 TGIGGYVSTDSSR 1300,4 3 + 4+5 4111 4112 5 + 73- 73 K 147,2 6 + 74- 80 EIWAIR 780,0 780, 0 4 + 5 + 6 2209 2209 7 81- 86 GSSNIR 632,7 8 + 87- 128 NWLTNLDFDQSDCSLVSGCGVHSGFQ NAAWAEISAQASAAVAK 4514,8 7 + 8 5129 5129 9 129- 130 AR 246,3 8 + 9 4743 4743 118 (continuação)
Fosfolipase de Fusarium heterosporum (2254-97-3) Clivagem parcial N° De Sequência M+H calc M+H obs Péptidos M+H calc M+H obs 10 131- 131 K 147,2 11 132- 137 ANPSFK 663,8 12 + 138- 158 WATGHSLGGAVATLSAANLR 1966,3 1966 10+11+12 2739 2739 13 + 159- 173 AAGTPVDIYTYGAPR 1552,7 1552 14 + 174- 192 VGNAALSAFISNQAGGEFR 1910,1 1910 15 193- 197 VTHDK 599, 7 16 198- 202 DPVPR 583,7 17 + 203- 211 LPPLIFGYR 1076,3 1076 15+16+17 2221 2221 18 + 212- 226 HTTPEYWLSGGGGDK 1605,7 19 + 227- 235 VDYAISDVK 1010,1 18 + 19 2596 2596 20a 236- 274 VCEGAANLMCNGGTLGLDIDAH LHYFQATDACNAGGFSW* 4231,5 4232 20b + 236- 275 VCEGAANLMCNGGTLGLDIDAHL HYFQATDACNAGGFSW*R 4387,7 4387 119
Identidade com outras lipases de Fusarium
Alinhamentos da sequência de aminoácidos e nucleotídica da enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.83) com sequências de outras lipases de Fusarium mostram as relações entre algumas das lipases de Fusarium (Tabela 10).
Tabela 10. Identidade de aminoácidos e nucleotídica de enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.83), em comparação com outras lipases de Fusarium. IDENTIDADES DE LIPASE F. heterosporum (Nagao, supra) F. oxysporum (Lipopan F™) Aminoácido de F. heterosporum (CBS 782.83) (SEQ ID N° 1) 58, 7% 85,1% Sequência nucleotídica de F. heterosporum (CBS 782.83) (SEQ ID N° 3) 61,8% 69,2% A mistura e amplificação por PCR dos oligonucleótidos sintéticos para o gene da enzima lipolítica e a sequência sinal alfa resultou em fragmentos de ADN que foram clonados e sequenciados. Os fragmentos contendo as sequências correctas foram utilizados para agrupar o gene completo por reamplificação, utilizando os iniciadores mostrados na Tabela 8. A sequência nucleotídica agrupada é mostrada na Figura 8, com a sua sequência de aminoácidos traduzida e os iniciadores utilizados são indicados com setas. 120 0 fragmento de ADN contendo a construção génica agrupada foi transferido para o vector de expressão pB 14 de Hansenula, utilizando os sítios de restrição enzimática introduzidos. 0 plasmídeo resultante pBl4-alps.cbss é esquematicamente mostrado na Figura 9.
Expressão de actividade de enzima lipolítica fúngica em clones seleccionados.
Os clones, que foram submetidos ao processo de selecção, foram analisados para expressão de enzima lipolítica. Amostras de 10 microlitros do sobrenadante de culturas de 2 dias foram incubadas com DGDG ou lecitina, durante 10 minutos e 10 microlitros destas reacções foram analisados com o kit NEFA. Os resultados após isolamento de colónia única de 3 dos clones são mostrados na Figura 10. A sequência de aminoácidos de uma enzima lipolítica da estirpe de Fusarium heterosporum (CBS 782.83) foi determinada e um gene sintético codificando esta enzima lipolítica foi construído e optimizado para expressão em Hansenula polymorpha. O gene que codificava a enzima madura foi fundido a uma sequência sinal sintética, derivada do factor de cruzamento alfa de levedura. Foi anteriormente demonstrado que a combinação da sequência sinal alfa com o promotor FMD do vector pB14 de Hansenula é adequada para expressão de lipases de Fusarium.
Exemplo 3: Expressão de uma enzima lipolítica de Fusarium heterosporum CBS 7S2.S3 em Hansenula polymorpha e caracterização do produto em ensaios de cozimento 121 A estirpe de Hansenula polymorpha B14:8-3,8 (DCDK0172), contendo um gene codificando a enzima lipolítica do fungo filamentoso Fusarium heterosporum CBS782.83, foi fermentada no modo semi-continuo. Após 160 horas de fermentação, a actividade de fosfolipase atingiu 1200 U/mL. Com base nas fermentações, foram preparados três produtos e adicionalmente testados. Os produtos são denominados o seguinte: amostra 205, amostra 206 e amostra 209.
Uma enzima lipolítica da amostra 205 de F. heterosporum expressa em H. polymorpha foi testada em experiências de cozimento de mini-escala. A massa da experiência de cozimento foi analisada por glc e hptlc.
Os resultados de cozimento do cozimento em mini-escala confirmam um melhoramento muito forte da enzima lipolítica da amostra 205 no volume do pão e melhoramento da estrutura de miolo. A análise de enzima lipolítica confirmou uma forte actividade hidrolítica de enzima lipolítica da amostra 205 em digalactosildiglicérido (DGDG), concomitante com a acumulação de digalactosilmonoglicérido (DGMG). A enzima teve apenas menor actividade em triglicéridos na massa.
As amostras 206 e 209 foram testadas em ensaios de cozimento à escala piloto e confirmaram o bom desempenho de cozimento das enzimas lipolíticas, em relação a volume do pão aumentado e estrutura de miolo melhorada. A partir dos ensaios de cozimento, é indicado que a amostra 206 tem um desempenho um pouco melhor, em comparação com a amostra 209 num processo de massa directa, contudo os dois produtos não foram comparados 122 directamente entre si e mais ensaios de cozimento têm que confirmar isto.
2. EXPERIMENTAL
Fermentação
Microrganismo A estirpe de H. polymorpha transformada com o plasmídeo contendo a lipolitica de F. heterosporum CBS 782.83, como descrito no EXEMPLO 2, foi utilizada neste estudo. 0 promotor utilizado na construção foi o promotor da formato desidrogenase de H. polymorpha. 123
Meios de crescimento e condições de cultura
Meio YNB-glicerol 0 meio utilizado para preparação de inoculo para as fermentações de biorreactor e para crescimento em balões de agitação continha: 1,7 g/L de Yeast Nitrogen Base (DIFCO, Detroit, EUA, 0335-15-9), 5 g/L de (NH4)2S04, 10 g/L de glicerol e ácido 2-[N-Morfolino]etanossulfónico (MES) a 0,1 M como um tampão. O pH foi ajustado para 6,1 (o pKa de MES) com NaOH a 4 M (antes de autoclavagem) . Yeast Nitrogen Base e (NH4)2S04 foram esterilizados por filtração para o meio após autoclavagem. Este meio foi utilizado para crescimento em balões de agitação (25 0 mL de meio num balão de agitação com um volume total de 500 mL).
Agar de YNB O meio definido utilizado para plaqueamento de culturas stock (mantido a -80 °C, em glicerol a 25% (p/v)) continha: 1,7 g/L de Yeast Nitrogen Base (DIFCO, Detroit, EUA, 0335-15-9), 5 g/L de (NH4)2S04, 10 g/L de glicerol e 20 g/L de ágar (DIFCO, Detroit, EUA, 0140-01). Yeast Nitrogen Base e (NH4)2S04 foram esterilizados por filtração para o meio após autoclavagem.
Meio YPD O meio rico foi utilizado para verificação de contaminação nos fermentadores. O meio continha: 10 g/L de extracto de levedura, 10 g/L de peptona e 20 g/L de glicerol. 124
Fermentações
Neste estudo, foram efectuadas três fermentações: HET0401, HET0402 e HET0410, todas com a estirpe anteriormente descrita. As variações entre as três fermentações estão na composição do meio em descontinuo e no meio de alimentação. Todos os outros parâmetros eram idênticos para as três fermentações. 0 meio em descontinuo (3 L) utilizado para a fermentação em fermentadores de 6 L continha: 13,3 g/L de NH4H2P04, 3,0 g/L de MgS04-H20, 3,3 g/L de KC1, 0,3 g/L de NaCl, 15 g/L de glicerol e 3 mL/L de ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, Paises Baixos), 1,0 g/L de CaCl2-2H20, 67 mg/L de (NH4) 2Fe (S04) 2'6h20, 5 mg/L de CuS04-5H20, 20 mg/L de ZnS04-7H20, 21 mg/L de MnS04-H20 e 67 mg/L de EDTA) , 0,65 mg/L de NiS04-6H20, 0.65 mg/L de CoCl2, 0,65 mg/L de H3B04, 0, 65 mg/L de Kl, 0,65 mg/L de Na2Mo04·2H20), 2 mg/L de D-biotina e 0,67 g/L de cloridrato de tiamina-cloreto.
Adicionalmente ao meio em descontínuo anteriormente descrito, a fermentação HET0402 continha 10 g/L de peptona no meio em descontinuo.
Adicionalmente ao meio em descontínuo anteriormente descrito, a fermentação HET0410 continha 10 g/L de
Bacto-triptona no meio em descontínuo.
Meios de alimentação HET0401 e HET0402: O meio de alimentação continha 635 g/kg de glicerol e 130 g/kg de ácido fórmico. 125
Meio de alimentação HET0410: 0 meio de alimentação continha 570 g/kg de glicerol, 120 g/kg de ácido fórmico e 95 g/kg de Bacto-triptona. O pH foi controlado através da adição de 25% (p/v) de NH3-água. A fermentação foi efectuada no modo semi-contínuo num fermentador de 6 L de construção própria. Foram utilizadas as seguintes condições de fermentação: pH 5, arejamento de 1 vvm, temperatura de 26 °C e agitação desde 400 a 700 rpm. O fermentador foi inoculado com 2*250 mL de cultura YNB-glicerol, crescida a 25 °C e 180 rpm e com uma OD-600 de, aproximadamente, 10. O caudal de alimentação na fermentação foi controlado pela evolução de C02 acumulado e com base nas seguintes equações:
Alimentação - caudal [g/h]=0, AcC02 <0,45
Alimentação - caudal [g/h]=l, 33 V AcC02, 0,45 <AccC02<3,25 Alimentação - caudal [g/h] =4,33 V, 3,25 £AccC02 V : O volume do caldo de fermentação [L]
AccC02 : A evolução de C02 acumulado [moles] 126
Colheita
As fermentações foram recolhidas por centrifugação, durante 10 minutos, a 16000 χ g, seguida de filtração estéril do sobrenadante através de filtros de 0,2 pm (Unidade de Filtração VacuCap 90 w/0,2 pm de Membrana Supor) do Gelman Laboratory. O produto foi mantido a 4 °C, até à sua utilização nos ensaios de cozimento.
Processos analíticos
Determinação de actividade de lipase
Uma amostra de fermentação (10 mL) foi centrifugada a 9000 χ g, durante 10 minutos e o sobrenadante foi utilizado para a análise de actividade de fosfolipase, de acordo com o "ensaio PLU", aqui anteriormente ensinado.
Crescimento de biomassa A concentração de biomassa num fluido de cultura foi determinada por centrifugação de 10 mL de fluido de cultura, a 9000 χ g, durante 10 minutos, num recipiente pré-pesado. Após centrifugação, o sobrenadante foi removido e a biomassa foi seca, durante 24 horas, a 100 °C e, depois, pesada. A concentração de biomassa foi calculada como g de peso seco de células por L de fluido de cultura. 127
Caracterização enzimática e mini-cozimento
Enzimas e farinha
Amostra 205: Amostra 7 (161 horas de fermentação) a partir de HET0401
Fosfolipase de Lipopan F, N° 2938 Farinha: Reform 2003055
Mini-cozimento
Os seguintes ingredientes foram adicionados a uma tigela de amassadeira Brabrender de 50 g e amassados, durante 5 minutos, a 30 °C: 50 g de farinha, 10 g de levedura seca, 0,8 g de açúcar, 0,8 g de sal, 70 ppm de ácido ascórbico e água (para uma consistência de massa de 400 unidades Brabender). O tempo de repouso foi de 10 min., a 34 °C. A massa foi pesada, 15 g por massa. Depois, moldada num dispositivo especial, onde a massa foi enrolada entre uma placa de madeira e uma armação de Plexiglas. As massas foram fermentadas em formas, durante 45 min., a 34 °C e cozidas num forno caseiro Voss, durante 8 min., 225 °C.
Após cozimento, os pães foram arrefecidos para temperatura ambiente e após 20 min min., os pães foram pesados e o volume foi determinado pelo método de substituição de colza.
Os pães também foram cortados e o miolo e crosta avaliados. 128
Extracção de lípido 10 g de massa totalmente fermentada foram imediatamente congelados e liofilizados. A massa liofilizada foi moída num moinho de café e passada através de uma tela de 800 mícrones. 1,5 g de massa liofilizada foram pesados num tubo de centrífuga de 15 mL com tampa de parafuso. Foram adicionados 7,5 mL de butanol saturado em água (WSB). O tubo de centrífuga foi colocado num banho-maria em ebulição, durante 10 min. Os tubos foram colocados num Rotamix e agitados a 45 rpm, durante 20 min., à temperatura ambiente. Depois, colocados em banho-maria em ebulição de novo durante 10 min. e agitados num Rotamix, durante 30 min., à temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados a 3500 g, durante 5 min., 5 mL de sobrenadante foram transferidos para dentro de um frasquinho de vidro. O WSB foi evaporado até à secura sob uma corrente de azoto.
Cromatografia gasosa A cromatografia gasosa foi realizada como descrito sob os processos analíticos no Exemplo 1 anterior.
HPTLC
Aplicador: Aplicador LINOMAT 5, CAMAG.
Placa de HPTLC: 10 x 10 cm, Merck n° 1.05633 A placa é seca antes de utilização, num forno a 180 °C, durante 20-30 minutos. 129
Aplicação: 1,0 pL de uma solução a 1% em CHC13 :MeOH85:15 é aplicada à placa de HPTLC utilizando aplicador LINOMAT 5.
Tampão de corrida: N° IV: Clorofórmio : Metanol : H20 (65:25:4) N° I : P-éter : metil-terc-butiléter (MTBE) : Ácido acético (60:40:1)
Tempo de Aplicação/Eluição: 11 minutos para tampão de corrida I e 18 minutos para tampão de corrida IV. A placa é seca num forno a 180 °C, durante 10 minutos, arrefecida e revelada em 6% de acetato cúprico em H3PO4 a 16%. Seca durante 10 minutos adicionais a 180 °C e avaliada directamente.
Ensaios de cozimento
Produtos testados:
Ns 3016 - Lípopan F contendo 8700 LIPU/g ID Estirpe/hospedeiro Fermentação
Amostra 206 contendo 390 F. heterosporum/H. polymorpha LIPU/g HET0401+HET0402
Amostra 209 contendo 950 LIPU/g F. heterosporum/H. polymorpha HET0410 130
Receita: Pãezinhos de crosta dura preparados com farinha Reform: 2003159. % de Quantidade, g panificação Farinha - Reform 2003159 100 2000 Água 58,5 1170 Levedura comprimida 6 120 Sal 1,6 32 Açúcar 1,6 32 Ácido ascórbico 10 ppm 0, 02 Alfa-amilase padrão GRINDAMYL™ A 1000 90 ppm 0,180
Processo de Cozimento:
Sistema de amassadeira Diosna • Amassar a seco, durante 1 min., lento • Amassar 2 min., lento + 4 min. rápido
• Temperatura da massa: 26 °C • Peso: 1350 g • Repouso: 10 min., a 30 °C, em estufa de aquecimento • Moldação: Fortuna 3/17/7 • Fermentação: 45 min., a 34 °C, 85% de HR. • Cozimento: Forno Bago: 13 min., a 220 °C, 13 s de vapor + 5 min. de registo aberto 131 • Bancada de pedra MIWE: prog. N° 1 • Após cozimento, os pãezinhos são arrefecidos, durante 25 min., antes de pesagem e medição de volume
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Fisiologia de fermentação e produção de fosfolipase A adição de triptona ao meio em descontinuo e de alimentação de HET0410 resultou numa produção mais rápida de biomassa e um nível de biomassa final superior, em comparação com HET0401-0402. HET0401 e HET0402 são quase idênticos, com respeito ao desenvolvimento de actividade de fosfolipase, ao passo que a produtividade de fosfolipase é significativamente superior em HET0410.
Colheita
As fermentações foram recolhidas após 168 horas (HET0401-0402) e 161 horas (HET0410) de fermentação. 0 produto foi mantido a 4 °C, até à sua utilização nos ensaios de cozimento. Algum do produto de HET0401 foi denominado amostra 205 e continha, aproximadamente, 700 PLU-7/mL. Algum do produto de HET0401 e HET0402 foi agregado e denominado amostra 206. Este produto continha, aproximadamente, 390 PLU-7/mL. A actividade enzimática mais baixa da amostra 206, comparativamente com o produto acabado de HET0401 e HET0402, pode ser causada pelo 132 armazenamento e filtração estéril. 0 produto de HET0410 foi denominado amostra 209 e continha, aproximadamente, 950 PLU-7/mL.
Caracterização enzimática e minicozimento A enzima lipolitica da amostra 205 da fermentação HET0401 foi testada numa experiência de minicozimento.
Em dosagem diferente e comparada com um controlo e Lipopan F™. O volume especifico de pão de pão deste teste de cozimento é mostrado na Tabela 11. Fotografias do pão são mostradas na figura 11.
Tabela 11 Enzima lipolitica de Fusarium heterosporum (amostra 205) em experiências de minicozimento. Efeito sobre o volume do pão.
Amostra Dosagem PLU-7/kg de Volume do pão, mL/g farinha 205 0 3,56 205 200 U/kg 3,98 205 500 U/kg 4, 87 205 1000 U/kg 5, 05 205 1500 U/kg 5,13 205 2000 U/kg 4, 82 205 5000 U/kg 5, 05 205 10000 U/kg 4,51 Lipopan F 4 0 ppm 4,57 133
Os resultados de cozimento confirmaram um efeito muito forte da amostra 205 sobre o melhoramento do volume do pão e o efeito de volume foi melhor do que Lipopan F™ numa dosagem padrão de 40 ppm.
Da Figura 11 também se verifica que a amostra 205 contribui para um forte melhoramento em estrutura de miolo e cor.
Massa totalmente fermentada desta experiência de cozimento foi liofilizada e extractada com butanol saturado em água e os lípidos isolados analisados por GLC e HPTLC. A análise de GLC dos lípidos de massa (Tabela 12) confirma o efeito hidrolítico da enzima lipolítica da amostra 205 sobre digalactosildiglicérido (DGDG), concomitante com uma acumulação de digalactosilmonoglicérido (DGMG). A actividade da enzima em DGMG é bastante baixa, em virtude de a quantidade molar total de DGDG (mmol% = mmol/100 g de massa liofilizada) e DGMG (mmol%) permanecer constante a dosagem enzimática aumentada (Figura 12). Os resultados de GLC também indicam uma actividade muito baixa da amostra 205 em triglicérido. 134
Tabela 12 Análise de GLC de lípidos de massa. FFA= ácido gordo livre. MGMG=monogalactosilmonoglicérido. DGMG digalactosilmonoglicérido. MGDG= monogalactosildiglicérido. DGDG=digalactosildiglicérido. TRI= triglicérido
Amostra (S-) o, 0 O. o o, o O, 0 O, o O, O mmol% mmol% mmol% FFA MGMG DGMG MGDG DGDG TRI DGMG DGDG DGMG+ DGDG 0 U S-205 0, 232 0, 002 0, 023 0,013 0,214 0,641 0,034 0,228 0,262 200 U S-205 0, 321 0, 007 0, 050 0,038 0,193 0,660 0, 074 0,205 0,279 500 U S-205 0, 384 0, 012 0,069 0,021 0,132 0,610 0,101 0,140 0,241 1000 U S-205 0, 418 0, 014 0, 117 0,008 0,087 0,614 0,173 0, 093 0,265 1500 U S-205 0, 444 0, 016 0, 140 0,011 0, 057 0,600 0,206 0,060 0,267 2000 U S-205 0, 438 0, 026 0, 148 0,011 0, 039 0,594 0,218 0, 041 0,259 5000 U S-205 0, 456 0, 022 0, 171 0,011 0, 012 0,533 0,252 0, 013 0,264 10000 U S-205 0, 453 0, 017 0, 163 0,013 0, 009 0,547 0,241 0, 010 0,251 40 ppm de Lipopan F 0,372 0, 017 0, 077 0,027 0, 134 0,577 0, 114 0, 142 0,256 mmol% = mmol/100 g de massa liofilizada
Comparando os resultados de cozimento e a análise de lipido, é interessante observar que o melhor efeito de cozimento não é obtido por uma hidrólise completa de DGDG em DGMG, mas os resultados indicam que uma hidrólise parcial de DGDG em DGMG pode proporcionar o melhor desempenho de cozimento. 135 A elevada dosagem enzimática produz mais DGMG, mas também é produzido mais ácido gordo livre que se espera que proporcione um efeito de cozimento negativo que poderá ser outra explicação porque apenas uma hidrólise parcial de DGDG é preferida. A Tabela 13 mostra a taxa de hidrólise de DGDG e triglicéridos, calculada a partir da Tabela 12. Os resultados ilustram que o melhor desempenho de cozimento é obtido quando uma dosagem onde a proporção de actividade de DGDG para triglicéridos é maior.
Tabela 13. Taxa de hidrólise de DGDG e triglicérido a partir da análise de GLC de lipidos de massa.
Amostra (S) dTRI dDGDG dDGDG/dTRI Volume do pão mL/g 0 U S-205 3,56 200 U S-205 0 0,023 3, 98 500 U S-205 0,031 0,088 2,84 4, 87 1000 U S-205 0,027 0,135 0,030 5, 05 1500 U S-205 0,041 0,168 4,1 5,13 2000 U S-205 0,047 0,187 3,98 CM OO 5000 U S-205 0,108 0,215 1,99 5, 05 10000 U S-205 0,094 0,218 2,3 4, 51 40 ppm de Lipopan F 0,064 0,086 1,34 4, 57
Algumas das amostras de lipidos também foram analisadas por HPTLC, como mostrado na Figura 13. As amostras 4, 5 e 6 são lipidos de massa da experiência de cozimento. A análise de HPTLC confirma a hidrólise de DGDG e formação de DGMG pela enzima lipolitica da amostra 205. 136 A proporção de actividade relativa de lípido polar:triglicérido de Lipopan F e Amostra 209, utilizando os ensaios anteriormente ensinados é:
Fosfolipido/triglicérido (PLU/LIPU) Lipopan F = 3
Amostra 209 = 9
Galactolipido/triglicérido (GLU/LIPU) Lipopan F = 1
Amostra 209 = 4 A enzima lipolitica de Fusarium heterosporum CBS 782.83 proporcionou efeitos muito fortes em experiências de cozimento à mini-escala, com forte aumento em volume do pão e melhoramento de estrutura de miolo. A análise de lipido confirma forte actividade hidrolitica em DGDG em massa, concomitante com a acumulação de DGMG. A enzima lipolitica de Fusarium heterosporum CBS 782.83 mostrou baixa actividade em triglicéridos numa massa.
Exemplo 4. Caracterização de actividade em substratos lipídicos e especificidade de posição de uma enzima lipolitica de Fusarium heterosporum CBS 782.83 expressa em Hansenula polymorpha.
Uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção de Fusarium heterosporum foi expressa em Hansenula polymorpha, como descrito no Exemplo 3. 137
Processos analíticos A actividade de fosfolipase foi determinada utilizando o ensaio PLU, aqui anteriormente descrito. A actividade de galactolipase foi determinada utilizando o ensaio de galactolipase aqui anteriormente descrito. A actividade em triglicérido (tributirina) foi determinada utilizando o ensaio LIPU, aqui anteriormente descrito.
Actividade em óleo de girassol (LUSol, pH-stat pH 6):
Reagentes: São dissolvidas 8,4 g de goma arábica em 100 mL de água desionizada e são adicionados 100 mL de CaCÍ2 a 30 mM. 36 g de óleo de girassol são lentamente adicionados durante a mistura, com uma misturadora Turrax (20000 rpm) .
Ensaio: São equilibrados 20 mL de emulsão de óleo de girassol numa proveta, a 30 °C, durante 5 min. O pH é ajustado para 6,3-6,5, utilizando um pH stat. São adicionados 2 mL de solução enzimática e NaOH a 0,05 N é continuamente adicionado, mantendo o pH a 6,5, durante 10 minutos. É calculado o declive da curva para a adição de 0,05 NaOH em função do tempo. 138 1 LUSol é definido como a quantidade de enzima que pode libertar 1 pmol de ácido gordo por min. nas condições de ensaio. A enzima lipolitica foi analisada para actividade em diferentes substratos, de acordo com processos anteriormente mencionados. Os resultados são mostrados na Tabela 14.
Tabela 14. Actividade de uma enzima lipolitica de Fusarium heterosporum de acordo com a presente invenção em diferentes substratos lipidicos.
Actividade Substrato pH Temperatura UNIDADE/mL LIPU Tributirina 5, 5 30 754 LUSol Óleo de girassol 6,5 30 48 PLU-7 Fosfatidilcolina 7 37 4650 GLU Digalactosildiglicérido 7 37 1600 A enzima lipolitica de Fusarium heterosporum expressa em Hansenula polymorha hidrolisa, principalmente, ácidos gordos na posição sn-1 de galactolipido e fosfolipidos na massa. A especificidade da enzima foi investigada através da adição de diferentes concentrações da enzima a uma massa de pão. A massa totalmente fermentada foi congelada e liofilizada e os lipidos de massa foram extraídos com butanol saturado em água.
Os lipidos de massa foram analisados por análise de GLC e de HPLC. 139
Através da análise de GLC foi possível analisar digalactosildiglicérido (DGDG) e digalactosilmonoglicérido (DGMG). Adicionalmente, foi possível analisar os isómeros de posição de digalactosilmonoglicérido (1:digalactosil 1-monoglicérido e 2: digalactosil 2-monoglicérido, ver a estrutura abaixo). Estes componentes foram separados e quantificados por GLC. 1: RI = H e R2= Acilo gordo
CK 2 OH
2: Rl = Acilo gordo e R2=H
CH2OH
OH 140
Num teste de cozimento para produção de pãezinhos de crosta dura, as dosagens da enzima lipolitica foram adicionadas e os galactolípidos na massa totalmente fermentada foram analisados. A quantidade dos isómeros de digalactosilmonoglicéridos é mostrada na Tabela 15 e ilustrada graficamente na Figura 14.
Tabela 15. Quantidade de isómeros de digalactosilmonoglicéridos num teste de cozimento utilizando enzima lipolitica de Fusarium heterosporum
Dosagem enzimática % de digalactosil 2- % de digalactosil 1- TIPU/kg de farinha monoglicérido, com monoglicérido, com base no peso seco de base no peso seco de massa massa 0 0,0102 0,0399 200 0,0092 0,0167 400 0,0071 0,0100 400 0,0067 0,0057 800 0,0103 0,0063 1000 0,0071 0,0060 1200 0,0081 0,0053 1500 0,0064 0,0057 2000 0,0084 0,0047 141
Conclusão
Dos resultados na Tabela 15 e Figura 14 conclui-se que, durante a produção de digalactosil 2-monoglicérido, o digalactosil diglicérido é principalmente hidrolisado na posição 1. Também se observa um aumento mais pequeno na quantidade de digalactosil 1-monoglicérido. É sabido que irá ocorrer a migração de acilo da posição 2 para 1 de ácido gordo acilo em lípidos. Esta migração de acilo depende da temperatura e, em função do tempo, irá ocorrer um equilíbrio entre digalactosil-2-monoglicérido e digalactosil 1-monoglicérido. Estes fenómenos explicam o facto de também ser observado um pequeno aumento em digalactosil 1-monoglicérido.
Exemplo 5. Determinação de temperatura óptima e estabilidade de enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporvm. A actividade enzimática de enzima lipolítica pulverizada a seco, derivada de F. Heterosporum e expressa em Hansenula Polymorpha, foi determinada a diversas temperaturas, de acordo com PLU-7, com modificações como se descrevem abaixo. 0 substrato era uma emulsão de fosfatidilcolina a 0,6%, Triton X-100 a 0,4%, CaCl2 a 6 mM e HEPES a 50 mM, pH 7,0. O fermento da enzima lipolítica pulverizada a seco foi diluído com água desmineralizada para 3 TIPU/mL. Foram termostatados 400 pL de substrato, durante 5 minutos, a 10, 20, 30, 40, 50, 45, 50 e 60 °C e foram adicionados 50 pL de amostra. Após exactamente 10 minutos, a acção enzimática foi interrompida através de incubação, a 99 °C, durante outros 10 minutos. Finalmente, a quantidade de ácidos gordos livres foi determinada pelo método 142 de NEFA C (Wako Chemicals GMbH, Neuss, Alemanha). Os reagentes de cor A e B foram preparados de acordo com o protocolo dos fabricantes. Foram pipetados 10 pL de lípido extraído redisperso e 100 pL de reagente A para uma placa de microtitulação e incubados a 37 °C, durante 10 minutos. Foram adicionados 200 pL de reagente B à placa de microtitulação e incubados, a 37 °C, durante 10 minutos. Foi medida a densidade óptica a 540 nm. A quantidade de ácido gordo livre foi determinada utilizando a absorvência vermelha e uma curva-padrão baseada em ácido oleico. Os resultados são mostrados na Figura 15. A estabilidade enzimática de fermento de enzima lipolítica pulverizada a seco, foi determinada a diversas temperaturas. O fermento de enzima lipolítica pulverizada a seco foi diluído com tampão de fosfatos a 50 mM, pH 7,0, para 3 TIPU/mL. Após 30 minutos de incubação a 20, 30, 37, 40 e 45 °C, a amostra foi armazenada sobre gelo. Subsequentemente, a actividade de fosfolipase foi determinada de acordo com PLU-7, com modificações como se descrevem abaixo. O substrato era uma emulsão de fosfatidilcolina a 0,6%, Triton X-100 a 0,4% e tampão de fosfatos a 50 mM. O CaCl2 foi deixado de fora de modo a prevenir a precipitação de fosfato de cálcio e não afecta a actividade enzimática. Foram termostatados 400 pL de substrato, durante 5 minutos, a 37 °C e foram adicionados 50 pL de amostra. Após exactamente 10 minutos, a acção enzimática foi interrompida através de incubação, a 99 °C, durante outros 10 minutos. Finalmente, a quantidade de ácidos gordos livres foi determinada pelo método de NEFA C (Wako Chemicals GMbH, Neuss, Alemanha). Os reagentes de cor A e B foram preparados de acordo com o protocolo dos fabricantes, Foram pipetados 10 pL de lípido extraído redisperso e 100 pL de reagente A para uma placa de microtitulação e incubados a 37 °C, durante 10 minutos. Foram 143 adicionados 200 pL de reagente B à placa de microtitulação e incubados, a 37 °C, durante 10 minutos. Foi medida a densidade óptica a 540 nm. A quantidade de ácido gordo livre foi determinada utilizando a absorvência vermelha e uma curva-padrão baseada em ácido oleico. Os resultados são mostrados na Figura 16.
Exemplo 6. Determinação de pH óptimo e estabilidade de enzima lipolitica derivada de Fusarium heterosporum. A actividade enzimática de enzima lipolitica pulverizada a seco derivada de F. heterosporum e expressa em Hansenula Polymorpha foi determinada a diversos pH. O substrato era uma emulsão de fosfatidilcolina a 0,6%, Triton X-100 a 0,4% e tampão de fosfatos a 50 mM, pH 4,0, 5,0, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 e 10,0. O CaCl2 foi deixado de for a, de modo a prevenir a precipitação de fosfato de cálcio e não afecta a actividade enzimática. O fermento da enzima lipolitica pulverizada a seco foi diluído com água desmineralizada para 3 TIPU/mL. Foram termostatados 400 pL de substrato, durante 5 minutos, a 37 °C e foram adicionados 50 pL de amostra. Após exactamente 10 minutos, a acção enzimática foi interrompida através de incubação, a 99 °C, durante outros 10 minutos. Finalmente, a quantidade de ácidos gordos livres foi determinada pelo método de NEFA C (Wako Chemicals GMbH, Neuss, Alemanha). Os reagentes de cor A e B foram preparados de acordo com o protocolo dos fabricantes. Foram pipetados 10 pL de lipido extraído redisperso e 100 pL de reagente A para uma placa de microtitulação e incubados a 37 °C, durante 10 minutos. Foram adicionados 200 pL de reagente B à placa de microtitulação e incubados, a 37 °C, durante 10 minutos. Foi medida a densidade óptica a 540 nm. A quantidade 144 de ácido gordo livre foi determinada utilizando a absorvência vermelha e uma curva-padrão baseada em ácido oleico. Os resultados são mostrados na Figura [17]. A estabilidade enzimática de fermento de enzima lipolitica pulverizada a seco foi determinada a diversos pH. 0 fermento de enzima lipolitica pulverizada a seco foi diluído com tampão de fosfatos a 50 mM, a pH 4,0, 5,0, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 e 10,0 para 3 TIPU/mL. Após 30 minutos de incubação a 37 °C, a amostra foi armazenada sobre gelo. Subseguentemente, a actividade de fosfolipase foi determinada de acordo com PLU-7, com modificações como se descrevem abaixo. O substrato era uma emulsão de fosfatidilcolina a 0,6%, Triton X-100 a 0,4% e tampão de fosfatos a 50 mM, pH 7. O CaCl2 foi deixado de for a, de modo a prevenir a precipitação de fosfato de cálcio e não afecta a actividade enzimática. Foram termostatados 400 pL de substrato, durante 5 minutos, a 37 °C e foram adicionados 50 pL de amostra. Após exactamente 10 minutos, a acção enzimática foi interrompida através de incubação, a 99 °C, durante outros 10 minutos. Finalmente, a quantidade de ácidos gordos livres foi determinada pelo método de NEFA C (Wako Chemicals GMbH, Neuss, Alemanha). Os reagentes de cor A e B foram preparados de acordo com o protocolo dos fabricantes. Foram pipetados 10 pL de lípido extraído redisperso e 100 pL de reagente A para uma placa de microtitulação e incubados a 37 °C, durante 10 minutos. Foram adicionados 200 pL de reagente B à placa de microtitulação e incubados, a 37 °C, durante 10 minutos. Foi medida a densidade óptica a 540 nm. A quantidade de ácido gordo livre, foi determinada utilizando a absorvência vermelha e uma curva-padrão baseada em ácido oleico. Os resultados são mostrados na Figura 18. 145
Exemplo 7. Determinação de peso molecular de enzima lipolítica purificada derivada de Fusarium heterosporum. A enzima lipolítica purificada de acordo com a presente invenção derivada de Heterosporum Fusarium foi corrida num gel de SDS-PAGE, Figuras 19a e 19b. Com base num marcador padrão Novex, o peso molecular foi calculado como mostrado na Tabela 15.
Tabela 15: Determinação do peso molecular da enzima lipolítica de acordo com a presente invenção.
Amostra Rf PM (kDa) log PM Cálculos Padrão Novex 0,91 3,0 0, 48 Log PM (kDa) = -5,30.Rf3 + 7, 50 · Rf2 - 5, 00-Rf + 2, 7986 0, 82 6,0 0, 78 r2 = 0, 9989 0, 71 14 1, 15 0, 66 17 1, 23 0,55 28 1, 45 0, 47 38 1, 58 0,38 49 1, 69 0,31 62 1, 79 0,23 98 cr» I—1 0,13 188 2, 27 Enzima lipolítica de presente invenção 0, acordo com 52 a log PM = -5,30-0,523 + 7, 50-0, 522 - 5, 00-0, 52 + 2, 80- ^ Pm = 29,9 kDa 0 peso da enzima lipolítica foi calculado como 29,9 kDa. 146
Exemplo 8. Determinação de ponto isoeléctrico (pi) de enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum. 0 ponto isoeléctrico (pi) de uma enzima lipolítica derivada de F. heterosporum foi determinado teoricamente, como base na sequência de aminoácidos SEQ id N° 6. 0 cálculo foi realizado utilizando o software Vector NTI Suite 9 da Informax (Invitrogen, CA, EUA) e resultou num pi de 6,40. EXEMPLO 9. Caracterização da conversão enzimática de lecitina em lisolecitina em gema de ovo a diferentes temperaturas por uma enzima lipolítica de Fusarium heterosporum CBS 782.83.
As enzimas lipolíticas podem converter lecitina (fosfatidilcolina) em liso-lecitina (liso-fosfatidilcolina), com libertação de um ácido gordo livre. A conversão enzimática de lecitina em liso-lecitina em gema de ovo cria melhores propriedades de emulsificação, em virtude da liso-lecitina ser um melhor emulsionante do que a lecitina. Boas propriedades de emulsificação de gemas de ovo são de importância aquando da preparação de maionese termoestável e outros alimentos e aplicações de alimento, tais como, mas não limitados a bolos e maturação de queijo. 147
Preparação de enzima:
Uma enzima lipolítica de Fusarium heterosporum, CBS 782.83, expressa em Hansenula polymorpha da fermentação HET0420 foi pulverizada a seco em amido de trigo. A preparação enzimática resultante teve uma actividade de fosfolipase de 1265 U/g, determinada pelo ensaio TIPU aqui descrito. Foi preparada uma solução-mãe de enzima a 10% (p/v) ou 20% (p/v) através da dissolução do pó de enzima pulverizada a seco em água desmineralizada. Após 15 minutos de agitação, a solução foi centrifugada durante cinco minutos, a 1370 x g. O sobrenadante foi utilizado como a solução-mãe de enzima.
Acção enzimática:
Foram implementadas duas experiências diferentes, de modo a determinar a combinação óptima de dosagem enzimática, temperatura e tempo de reacção para a conversão enzimática de lecitina em liso-lecitina em gema de ovo. Na primeira, a acção enzimática foi efectuada com uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção às três seguintes temperaturas: 30 °C, 40 °C e 50 °C, cada com as quatro dosagens seguintes: 5 U/g de gema de ovo, 10 U/g de gema de ovo, 20 U/g de gema de ovo e 30 U/g de gema de ovo.
Na segunda experiência, a acção enzimática foi efectuada para uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção e com Lecitase® Ultra, da Novozymes A/S (Dinamarca), respectivamente, às seguintes cinco temperaturas: 5 °C, 10 °C, 15 °C, 20 °C e 53 °C, com uma dosagem enzimática de 30 U/g de 148 gema de ovo. A 53 °C, a dosagem enzimática de 60 U/g de gema de ovo também foi testada.
Em ambas as experiências, 10,0 g de gema de ovo pasteurizada, de DaniEg (Christiansfeld, Dinamarca), foram transferidos para um tubo wheaton e colocados num bloco de aquecimento termostatado à temperatura apropriada. As amostras foram continuamente misturadas num agitador magnético. No tempo t=0, foi adicionada solução-mãe de enzima à gema de ovo de acordo com a Tabela 16. Cada experiência foi realizada em duplicado. Foram retiradas amostras de 1,0 g das soluções de gema de ovo/enzima de acordo com a Tabela 17. Após os tempos de incubação de acordo com a Tabela 17, a reacção enzimática nas amostras foi interrompida, através da adição de 7,5 mL de solvente orgânico (CHCI3: MeOH, 2: 1).
Tabela [16] : Foi adicionada solução-mãe de enzima a gema de ovo, de modo a serem obtidas diferentes dosagens enzimáticas, incluindo um controlo. Foi adicionada água desmineralizada para um total de 2,35 mL, de modo a por de parte qualquer diferença em volume após adição de diferentes volumes de solução-mãe de enzima.
Amostra Quantidade Actividade Actividade Volume de Volume de
de gema de enzimática enzimática solução- H20 desm. ovo de mãe de adicionado solução- enzima mãe adicionado Controlo 10,0 g 0 U - 0 mL 2,35 mL 10,0 g 50 U 127 U/mL 0,40 mL 1,95 mL 149 (continuação)
Amostra Quantidade Actividade Actividade Volume de Volume de de gema de enzimática enzimática solução- H20 desm. ovo de mãe de adicionado solução- enzima mãe adicionado
Lipolitica 10,0 g 100 u 127 U/mL 0,80 mL 1,55 mL Enzima 10,0 g 200 u 127 U/mL 1,60 mL 0,75 mL 10,0 g 300 u 127 U/mL 2,35 mL 0 mL 10,0 g 600 u 253 U/mL 2,35 mL 0 mL Lecitase® 10,0 g 300 u 3620 U/mL 83 pL 2,25 mL Ultra 10,0 g 300 u 3620 U/mL 165 pL 2,20 mL
Tabela [17] : Tempos de reacção na extracção de amostra nas diferentes experiências.
Temperatura de reacção Dosagem enzimática Tempo de reacção (min.) 5 c >C, 10 °C, 15 °C, 20 °C 30 U/g 60 120 240 360 480 1440 - 5, 10, 20 30 °C e 30 U/g 5, 10, 20 30 60 120 240 360 - 40 °C e 30 U/g 30 60 120 240 360 - 50 °C 5, 10, 20 30 60 120 240 360 - 53 °C e 30 U/g 15 30 60 90 120 240 - 30 U/g 53 °C 60 U/g 15 30 60 90 120 240 330 150
Extracção de lípido: A adição de 7,5 mL de solvente orgânico (CHCl3:MeOH, 2:1) à amostra, não apenas interrompeu a reacção enzimática, mas também extraiu os lipidos. Além disso, foram adicionados 0,2 mL de H20 desmineralizada à amostra, antes de a mesma ser dispersa, utilizando uma misturadora Whirley, durante 1 minuto. A amostra foi, depois, centrifugada durante dez minutos, a 110 x g. Aproximadamente 3 mL da fase orgânica foram transferidos para outro tubo e este lípido extraído foi utilizado para várias análises. As amostras foram armazenadas a -18 °C.
Determinação de ácidos gordos livres: 100 pL da solução de lípido extraído foi evaporada sob azoto, a 50 °C. Foi adicionado 1,0 mL de H20 desmineralizada e o lípido foi disperso utilizando uma misturadora Whirley. A quantidade de ácidos gordos livres foi determinada utilizando o kit NEFA C da WAKO Chemicals GMbH (Neuss, Alemanha) . Os reagentes de cor A e B foram preparados de acordo com o protocolo dos fabricantes. 10 pL de lípido extraído redisperso e 100 pL de solução A foram pipetados para uma placa de microtitulação. A placa foi incubada, a 37 °C, durante 15 minutos. Foram adicionados 200 pL de solução B à placa de microtitulação e a placa foi incubada, a 37 °C, durante 10 minutos. Foi medida a densidade óptica a 540 nm. A quantidade de ácido gordo livre foi determinada utilizando a absorvência vermelha e uma curva-padrão baseada em ácido oleico. 151
Determinação de lecitina e liso-lecitina por LC/MS-MS:
Materiais
Acetona, metanol, clorofórmio eram todos da Lab Scan, Dublin, Irlanda, etanol a 96% era da De Danske Spritfabrikker e o ácido fórmico era da AppliChem, Darmstadt, Alemanha.
Instrumentais 0 sistema de HPLC consistiu numa bomba quaternária (G1311A), uma bomba capilar (G1376A), um auto-amostrador (G1377A) e um compartimento de coluna (G1316A), todos da Agilent Technologies (Waldbronn, Alemanha). Um separador de caudal Acurate™ (ACM-CU-CR) da LC Packings (Amsterdam, Países Baixos) foi utilizado para separar o efluente de coluna para o espectrómetro de massa e introduzir solvente polar de reabastecimento. 0 espectrómetro de massa era um LCQ Deca Ion Trap da Thermo Finnigan (San Jose, CA, EUA). A coluna era uma Hypersil SI, 100 x 4,6 mm, id, 5 pm da Thermo Hypersil-Keystone.
Condições cromatográficas e MS
Fases móveis A: --- não utilizado B: Clorofórmio C: Metanol/Ácido Fórmico (1000/0,190) 152 D: Clorofórmio/Metanol/Água/Ácido Fórmico (300/550/150/0,190)
Reabastecimento: Etanol a 96%
Caudal [mL/min.] Tempo [min. ] B [ % ] C [%] D [%] 0,6 0 40 60 0 0,6 2 0 0 100 0,6 8 0 0 100 0,6 9 40 60 0 0,6 16 40 60 0 O volume de injecção era 5 pL e a temperatura de coluna era 45 °C.
Separador de caudal
_k. Caudal LC " Caudal de , _ b 1 w * -► ELSD/FC reabastecimento w V -► MS 0,60 mL/min. 100 pL/min.
Caudal de LC: Caudal de reabastecimento:
Tubagem de ELSD/FC: 100 cm x 0,100 mm id (SS)
Tubagem de MS: 100 cm x 150 pm (FS-150-MS) 153 A separação aproximada é 20:1
Condições de MS
Regulações de parâmetros de MS:
Parâmetro Valor Temp. capilar [°C] 325 Caudal gasoso de impulsão 70 Caudal gasoso auxiliar 4 Fonte ESI Polaridade Positiva Voltagem de fonte [kV] 6,0 Microvarrimentos SIM 5 Tempo Iónico 1 Max. SIM [ms] 200
Regulação de detector de MS:
Parâmetro Valor Duração [min] 15 Método Tune LPC_544_SIM_00.LCQTun e Evento 1 de Varrimento -Gamas SIM Intervalo de Massa LPC (16:0) - H+ 494,0 - 498,0 LPC (18:2) - H+ 517,0 - 527,0; 541,0 - 549,0 PC (34:2) - H+ 778,0 - 786,0 PC (36:4) - H+ 801,0 - 813,0 154
Preparação de padrão e amostra
Liso-fosfatidilcolina (LPC) (Ovo, galinha) (89865) e fosfatidilcolina (PC) (planta) (441601) eram da Avanti Polar LipidSf Inc, Alabaster, AL, EUA. Foi preparada uma solução-mãe de PC e LPC (10 mg/20 mL de CHCl3/MeOH) . Diluições desta foram preparadas para abranger as concentrações de 50 pg/mL a 2,5 pg/mL. 7,5 pL de extracto de lipido de 1 g de gema de ovo foram reconstituídos em 1,5 mL de CHCl3:MeOH (1:1).
Análise de TLC: A análise de TLC foi efectuada como descrito no Exemplo 1.
Para visualização dos diferentes glicéridos, 2 pL de extracto de lipido foram aplicados em bandas de 3 mm a uma placa de sílica 60 de HPTLC (Merck) por um amostrador automático TLC 4 (CAMAG). A placa de sílica foi colocada numa câmara de revelação horizontal (CAMAG) com tampão de corrida I (P-éter: éter metilbutílico terciário: ácido acético (50: 50: 1)). Foram utilizados 20 mL de tampão de corrida para a fase gasosa e 5 mL para o final e a placa foi eluída até aprox. 5 cm da posição de aplicação. A placa foi seca numa estufa de aquecimento (160 °C), durante 5 minutos. Finalmente, a placa de TLC foi imersa no reagente de revelação (6% de Cu(CH3COO)2 em 16% de H3PC>4 aquoso) e carbonizada numa estufa de aquecimento (160 °C), durante 10 minutos. 155
RESULTADOS
De modo a determinar a combinação óptima de dosagem enzimática, a temperatura e tempo de reacção para a conversão enzimática de lecitina em liso-lecitina em gema de ovo, quatro dosagens enzimáticas diferentes foram testadas a três temperaturas diferentes e cinco tempos de reacção diferentes.
As quatro dosagens enzimáticas utilizaram 5 U/g, 10 U/g, 20 U/g e 30 U/g, assim como os tempos de reacção utilizados, 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 240 minutos e 360 minutos, foram baseados em ensaios iniciais aqui não abrangidos. As três temperaturas, 30 °C, 40 °C e 50 °C foram escolhidas com base na curva de temperatura óptima para a enzima lipolitica, ver a Figura 20. A quantidade de lecitina e liso-lecitina na gema de ovo modificada por enzima foi analisada por HPLC e representada na Figura 21 e Figura 22 em função do tempo de reacção. Na Figura 23, a quantidade de ácido gordo livre em gema de ovo modificada por enzima é representada em função do tempo de reacção. A experiência mostra que a conversão de lecitina em liso-lecitina por uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção foi óptima utilizando 20 U/g de gema de ovo da enzima lipolitica, a 30 °C, durante 120 minutos. É escolhida a dosagem de 20 U/g de gema de ovo, em virtude de uma diminuição observada nos niveis de LPC a 30 U/g de gema de ovo, de 120 minutos de reacção a 240 minutos de reacção.
Com base neste resultado, foi examinado se a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção e Lecitase® Ultra 156 têm um efeito sobre lípidos de gema de ovo, a temperaturas inferiores a 30 °C e comparar as suas actividades a 53 °C, que é a temperatura actualmente utilizada industrialmente para Lecitase® Ultra. A conversão enzimática de lecitina em liso-lecitina na gema de ovo foi testada a cinco temperaturas diferentes (5 °C, 10 °C, 15 °C, 20 °C e 53 °C) e seis tempos de reacção diferentes. Foi testada uma dosagem enzimática de 30 U/g gema de ovo, porque esta seria a dosagem mais elevada de interesse comercial, em virtude do custo da enzima e porque se esperava que as taxas de reacção fossem baixas às temperaturas testadas. Todas as unidades enzimáticas mencionadas foram determinadas por TIPU. 30 U/g de gema de ovo também é a dosagem recomendada de Lecitase® Ultra. Adicionalmente, uma dosagem de 60 U/g gema de ovo foi testada a 53 °C. Os tempos de reacção utilizados foram 60 minutos, 120 minutos, 240 minutos e 360 minutos, 480 minutos e 1440 minutos. Contudo, a 53 °C, os tempos de reacção foram 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 90 minutos, 120 minutos e 240 minutos. A 53 °C, utilizando 60 U/g, uma amostra foi também retirada aos 330 minutos de reacção.
Nas Figuras 24 e 25, a quantidade de liso-lecitina, ácido gordo livre e lecitina em gema de ovo modificada por enzima é representa em função do tempo de reacção, utilizando a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção e fosfolipases de Lecitase® Ultra, respectivamente. Os teores de lecitina e liso-lecitina das amostras foram determinados por LC-MS e o teor de ácido gordo livre foi determinado pelo método de NEFA C. A quantidade de FFA nas amostras de controlo (resultados não mostrados) e a soma de liso-lecitina e lecitina permaneceu constante durante as experiências mostradas nas Figuras 24 e 25. 157 A Figura 24 mostra os resultados de acção enzimática de gema de ovo com a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção. A 53 °C, a actividade da enzima lipolitica cessou após 30 minutos de reacção, atingindo um nível de LPC de 1,7% (p/p) com 30 U/g de gema de ovo (Figura 24b) . Os níveis de FFA foram 1,0% (p/p) e 1,3% (p/p), com 30 U/g de gema de ovo e 60 U/g de gema de ovo, respectivamente. Utilizando Lecitase® Ultra, as quantidades de LPC e FFA aumentaram durante o período de 15-240 minutos (Figura 19), produzindo 2,7% de LPC (p/p) após 240 minutos de reacção com 30 U/g de gema de ovo. Os níveis de FFA foram 1,4% (p/p) e 2,1% (p/p) após 240 minutos de reacção, utilizando com 30 e 60 U/g de gema de ovo, respectivamente. A actividade de Lecitase® Ultra cessou após 330 minutos de reacção, utilizando 60 U/g de gema de ovo. A enzima lipolitica da presente invenção teve uma taxa de reacção inicial mais elevada do que Lecitase® Ultra.
A 20 °C e 53 °C, as taxas de reacção iniciais foram semelhantes às da enzima lipolitica da presente invenção (Figura 24) . A temperaturas de 5-20 °C, a quantidade de LPC e FFA aumentou durante a experiência. Embora, a temperaturas abaixo de 20 °C, a velocidade inicial diminuísse vincadamente com temperaturas decrescentes. A 20 °C, foi atingido um nível de 3,3% (p/p) e um nível de FFA de 1,6% (p/p) após 60 minutos de reacção com 30 U/g de gema de ovo. Este nível foi semelhante a 240 minutos de reacção a 53 °C com Lecitase® Ultra. Não foi possível ressuspender o extracto de lípido livre de solvente para a análise de FFA após 1440 de reacção a 20 °C. Após 1440 minutos, a 5 °C e 10 °C, as amostras com a enzima
lipolitica tinham uma elevada viscosidade que tornou a agitação impossível. Isto deveu-se, muito provavelmente, a cristalização de FFA. A diminuição nos níveis de LPC que se verificou em TN 158 6642, a 30 U/g de gema de ovo, 30 °C, de 120 a 240 minutos de reacção, não foi observada em qualquer destas experiências. A acção enzimática de gema de ovo com a fosfolipase Lecitase® Ultra proporciona velocidades iniciais significativamente decrescentes a 20 °C e temperaturas abaixo comparativamente com a velocidade inicial de Lecitase® Ultra a 53 °C (Figura 25). A 20 °C, foi atingido um nivel de 3,0% (p/p) e um nivel de FFA de 1,5% (p/p) após 1440 minutos de reacção com 30 U/g de gema de ovo. Este nível foi semelhante a 240 minutos de reacção a 53 °C. A Figura 26 mostra análise de TLC de lípido extraído de gema de ovo modificada por enzima. Esta análise confirmou os resultados de LC-MS e mostrou que a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção e a fosfolipase Lecitase® Ultra aumentaram a quantidade de liso-lecitina. A reacção enzimática, que é catalisada por enzimas lipolíticas, produz quantidades equivalentes de liso-lecitina e ácidos gordos livres. Uma possível e não desejada reacção secundária é a hidrólise de triacilglicéridos. A relação entre alteração em quantidade de liso-lecitina e ácidos gordos livres durante a reacção enzimática é mostrada na Figura 27.
Com Lecitase® Ultra há uma boa correlação de formação equivalente de lisolecitina e ácidos gordos livres (Figura 27) . Contudo, na maioria das amostras tratadas com Lecitase® Ultra, existiu muito pouca reacção. A acção enzimática de gema de ovo com a enzima lipolítica da presente invenção resulta em produção de mais do que um ácido gordo livre por liso-lecitina formada, a níveis de liso-lecitina acima de 40 mM e niveis de ácido gordo 159 livre acima de 60 mM. A conversão máxima com Lecitase® Ultra é 30 mM de liso-lecitina e 25 mM de ácido gordo livre. As amostras com uma proporção de ácido gordo livre para liso-lecitina abaixo de 0,8 ou acima de 1,2 (n/n) e teor de LPC acima de 1,0% (p/p) são mostradas na tabela 18.
Tabela 18: Amostras com proporções de ácido gordo livre (FFA) para liso-lecitina (LPC) abaixo de 0,8 ou acima de 1,2 (n/n) e teor de LPC acima de 1% (p/p). As amostras foram tratadas com enzima lipolitica ou Lecitase® Ultra. O FFA foi determinado pelo método de NEFA C. LPC e PC foram determinados por LC-MS.
Enzima Temp. (°C) Tempo de reacção (min.) AFFA/áLPC (n/n) % de LPC (p/p) % de FFA (p/p) % de PC (p/p) Enzima lipolitica 5 1440 1, 99 3, 0 2,9 2,0 Enzima lipolitica 10 480 1, 97 2,3 2,3 2,5 Enzima lipolitica 15 480 1, 48 4,1 3,5 0,6 Enzima lipolitica 15 360 1, 64 3, 6 3,4 1,0 Enzima lipolitica 15 1440 1, 98 4,2 4,7 0,1 Enzima lipolitica 20 60 0,67 3,3 1,6 2,0 20 360 1,30 4,7 3,6 0,3
Enzima lipolitica 160 (continuação)
Enzima Temp. (°C) Tempo de reacção (min.) AFFA/ALPC (n/n) % de LPC (p/p) % de FFA (p/p) % de PC (p/p) Enzima lipolitica 20 480 1, 43 5, 0 4,1 0,3 Lecitase® Ultra 20 1440 0, 72 3, 0 1,5 2,0 Enzima lipolitica 53 15 0, 69 1,5 0,9 3,7 Enzima lipolitica 53 60 0, 70 1,7 1,0 2,6 Enzima lipolitica 53 90 0, 71 1,8 1,0 2,7 Enzima lipolitica 53 240 0, 72 1,7 1,0 2,8 Enzima lipolitica 53 30 0, 72 1,8 1,0 3,0 Lecitase® Ultra 53 120 0, 61 2,4 1,1 2,3 Lecitase® Ultra 53 60 0, 62 1,6 0,9 2,9 Amostras com uma proporção * de ácido gordo livre para liso-lecitina acima de 1,2 (n/n) e teor de LPC acima de 1,0% (p/p) (Figura 27) são verificadas, em geral, a tempos de reacção prolongados ou em amostras contendo menos de 1,0% de PC (p/p). A amostra de enzima lipolitica a 15 °C tem proporções elevadas de ácido gordo livre para liso-lecitina em todas as amostras. Isto 161 indica que as enzimas alteram a especificidade de substrato a tempos de reacção prolongados ou quando o teor de PC é baixo. Isto poderia ser devido a hidrólise de fosfatidiletanolamina, digalactosil diacilglicérido ou triacilglicéridos que se encontram na gema de ovo. As amostras com uma proporção de ácido gordo livre para liso-lecitina abaixo de 0,8 (n/n) e teor de LPC acima de 1,0 (p/p) são verificadas, em geral, a uma temperatura de reacção de 53 °C (Tabela 18). Isto poderia ser explicado por interesterificações. A Figura 28 mostra que a enzima lipolitica da presente invenção tem actividade hidrolitica em triacilglicéridos e 1,3 diacilglicéridos a tempos de reacção prolongados ou concentrações baixas de PC. A acumulação de 1,2 diacilglicéridos mostra que a actividade de lipase é 1,3-especifica. A formação de monoglicéridos mostra que a Lecitase® Ultra teve um efeito hidrolitico sobre tricilglicéridos ou diacilglicéridos a 20 °C. Não é possível determinar se a enzima lipolitica da presente invenção ou a fosfolipase Lecitase® Ultra tem o grau mais elevado de hidrólise de triacilglicéridos, em virtude de os niveis de formação de LPC diferirem significativamente. Diminuindo a dosagem enzimática e tempo de reacção de enzima lipolitica poderia reduzir a hidrólise. A Tabela 18A mostra o tempo de reacção, temperatura e dosagem aplicados aos indivíduos dos corredores 1-30 na Figura 28.
Tabela 18A ' 2 3 4 $ 6 7 B 9 10 11 12 13 14 15 i$ 17 18 10 20 21 22 23 24 25 20 27 28 23 30 Enzima B K K. L B K K L B K K B K K K K L L L L B K K K L L L B K L ItqO <fe (h) 8 24 24 8 24 24 8 24 4 6 8 24 4 6 S 24 1 2 4 1 2 4 4 4 tatrahi» («CJ 5 3 5 3 10 10 10 10 13 15 13 20 20 20 20 20 20 20 20 20 53 53 53 53 53 53 51 S\ SI *»B^· <0/g) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 60 60 60 162
Será evidente para o especialista na técnica que, utilizando experimentação de rotina, a optimização de dosagem enzimática, temperatura de reacção e tempo de reacção podem ser facilmente determinados para qualquer aplicação alimentar.
Conclusão A acção enzimática de gema de ovo, da DanHg A/S, de uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção e a fosfolipase Lecitase® Ultra foi efectuada de modo a determinar a conversão de lecitina em liso-lecitina. Isto foi feito utilizando uma dosagem enzimática de 30 U/g de gema de ovo, a cinco temperaturas (5-20 °C e 53 °C) e seis tempos de reacção diferentes (60-1440 minutos, contudo a 53 °C, 15-240 min,) foi efectuado para examinar a actividade enzimática. 53 °C é a temperatura actualmente utilizada na indústria para modificação de gema de ovo com Lecitase® Ultra. A enzima lipolítica de acordo com a presente invenção teve uma taxa de reacção inicial mais elevada do que a Lecitase® Ultra a todas as temperaturas testadas. Uma reacção a 53 °C com enzima lipolítica cessou após apenas 30 minutos de reacção. A uma dosagem de 30 U/g de gema de ovo, a 53 °C, o nivel de LPC foi de 1,7 e 2,7% (p/p) com enzima lipolítica e Lecitase® Ultra, respectivamente. Um nível de 3,3% (p/p) de LPC foi atingido após apenas 60 minutos de reacção a 20 °C com enzima lipolítica. A temperaturas baixas (5-20 °C), a conversão de lecitina em liso-lecitina com enzima lipolítica foi significativamente melhor do que com Lecitase® Ultra. A velocidade de reacção da enzima lipolítica foi vincadamente inferior a 10 °C e abaixo, em 163 comparação com a 15 °C e acima. A enzima lipolitica era activa a 5 °C e formação de mais de 2% (p/p) de liso-lecitina era detectável após 24 horas de reacção. Igualmente, as amostras com a enzima lipolitica eram mais viscosas a 10 °C e abaixo, em comparação com temperaturas superiores.
Verificou-se que a enzima lipolitica altera a especificidade de substrato e hidrolisa fosfatidil-etanolamina, digalactosil diacilglicérido ou triacilglicéridos, adicionalmente a fosfolipidos, a tempos de reacção prolongados ou quando o teor de PC é baixo. Isto pode ser evitado através da utilização de uma dosagem enzimática inferior e tempos de reacção mais curtos e justifica a necessidade para optimização exaustiva de condições de tratamento para cada produto em questão. A 53 °C, as interesterificações podem explicar que seja produzido menos de um equivalente de ácido gordo livre por liso-lecitina com enzima lipolitica e Lecitase® Ultra.
Em conclusão, a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção é um candidato potencial para acção enzimática de gema de ovo a baixas temperaturas. A actividade observada a baixas temperaturas também é de interesse em outras aplicações. EXEMPLO 10. Produção de maionese por utilização de uma enzima lipolitica de Fusarium heterosporum CBS 782.83.
Produção de maionese: 6,25 g de enzima lipolitica, preparados como descrito no Exemplo 4, foram dissolvidos em 50 mL de H20 desmineralizada, correspondendo a uma actividade de fosfolipase de 150 U/mL. Após 164 15 minutos de agitação, a solução foi centrifugada durante cinco minutos, a 1370 x g. O sobrenadante foi utilizado para acção enzimática de 150 g de gema de ovo, da Sanofa A/S, de acordo com a Tabela 19. Outros 150 g de gema de ovo, da Sanofa A/S, foram tratados com Lecitase® Ultra (Novozymes A/S, Dinamarca) de acordo com a Tabela. As enzimações foram efectuadas a 30 °C, durante 180 minutos, com agitação lenta. A extracção de lipido foi efectuada como descrito no Exemplo 4.
Tabela 19: Acção enzimática de gema de ovo, da Sanofa A/S, utilizando enzima lipolitica de acordo com a presente invenção e Lecitase® Ultra, respectivamente. A solução de enzima lipolitica utilizada teve uma actividade de 150 U/mL e a Lecitase® Ultra teve uma actividade de fosfolipase de 34500 U/mL.
Amostra Quantidade de gema de ovo Enzima lipolitica adicionada Lecitase® Ultra adicionada h20 desm. adicionada U/g de gema de ovo Controlo 150 g 30,0 mL 0 Enzima lipolitica 150 g 30,0 mL 30 Lecitase® Ultra 150 g 0,13 mL 29,9 mL 30 165 A maionese com gema de ovo modificada por enzima, da Sanofa A/S, foi produzida utilizando uma misturadora Koruma (Disho V60/10). Durante o processamento, maionese foi aquecida para 95 °C, durante cinco minutos.
Tabela 20: Ingredientes utilizados para produzir maionese.
Ingrediente Controlo de maionese Maionese de Enzima lipolitica Maionese de Lecitase® Ultra Água 34, 5% 34,5% 34, 5% Óleo 50, 0% 50,0% 50, 0% Sal 1,0% 1,0% 1,0% Açúcar 3,0% 3,0% 3,0% Sorbato de Potássio 0,1% 0,1% 0,1% Grindsted FF 1102 1, 7% 1, 7% 1, 7% Gema de ovo 1 4,23% Gema de ovo 2 4,23% Gema de ovo 3 4,23% Vinagre 10% 4,00% 4, 00% 4,00% Mostarda 1,50% 1,50% 1,50% Soma 100% 100% 100%
Análise de TLC: A análise de TLC foi efectuada como descrito anteriormente. 166
Determinação de tamanho de partícula em maionese: 2,0 g de amostra de maionese foram dissolvidos em 22,5 g de SDS a 0,2% e agitados, durante um minimo de 30 minutos, a 300 rpm. A distribuição de tamanho de partícula foi, depois, medida num Malvern Mastersizer.
RESULTADOS
Para produção de maionese com gema de ovo modificada por enzima, foi utilizada gema de ovo da Sanofa A/S. Esta gema de ovo continha 8% de sal (em comparação com 0% em gema de ovo da DanEg) . Ensaios iniciais (não mostrados) mostraram que a concentração de sal superior em gema de ovo da Sanofa A/S influenciou a actividade lipolítica e, por conseguinte, foi utilizada uma dosagem enzimática de 30 U/g, em vez de 20 U/g. A análise de TLC de lípido extraído de gema de ovo modificada por enzima da Sanofa A/S (Figura 29), mostrou que a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção reduziu a quantidade de lecitina, concorrente com o aumento da quantidade de liso-lecitina (Figura 29). Em comparação, a conversão de lecitina em liso-lecitina, quando se utiliza Lecitase® Ultra, era negligenciável. A elevada conversão de lecitina em liso-lecitina mostrada por TLC correlacionou-se bem com a determinação de ácido gordo livre, preparado em lípido extraído de gema de ovo modificada por enzima da Sanofa A/S (Tabela 21). A quantidade de ácido gordo livre libertada utilizando enzima lipolítica foi 3,5 vezes superior à quantidade de ácido gordo livre libertada utilizando Lecitase® Ultra. 167
Tabela 21: Quantidade de ácido gordo livre em gema de ovo modificada por enzima da Sanofa A/S. A quantidade de ácido gordo livre foi analisada pelo método de NEFA C e é expressa como percentagem de gema de ovo.
Amostra Ácido gordo livre (% (p/p)) Controlo 0,39 Enzima lipolitica 2,4 Lecitase® Ultra 0,68 A distribuição de tamanho de goticulas de óleo em maionese foi analisada para avaliar as propriedades de emulsificação da gema de ovo diferentemente modificada por enzima da Sanofa A/S. Com se pode verificar, a maionese produzida com gema de ovo tratada com a enzima lipolitica de acordo com a presente invenção teve o menor tamanho médio de partícula, assim como a distribuição de tamanho de partícula mais estreita, em comparação com maionese produzida quer com gema de ovo tratada ou gema de ovo não tratada com Lecitase® Ultra. Um tamanho médio de partícula pequeno, assim como uma distribuição de tamanho de partícula estreita, indica boas propriedades de emulsificação, por este motivo a gema de ovo modificada com enzima lipolitica teve as melhores propriedades de emulsificação. 168
Tabela 22: Distribuição de tamanho de partícula em maionese preparada com gema de ovo modificada por enzima da Sanofa A/S.
Amostra Tamanho médio de Quantil de 10% Quantil de 90% partícula (um) (um) (um) Controlo 13, 7 2, 0 21,5 Enzima 4,4 1,2 7,3 lipolítica Lecitase® Ultra 13,3 1,8 21,9
De modo a avaliar a estabilidade ao calor de emulsões preparadas com gema de ovo modificada por enzima da Sanofa A/S, as maioneses foram aquecidas num forno microondas, durante 4 segundos. Como se pode verificar na Figura 30, a maionese contendo gema de ovo modificada por enzima, produziu emulsões termoestáveis, ao passo que o controlo contendo gema de ovo não tratada se separou após tratamento térmico no forno microondas e a emulsão não era, por conseguinte, termoestável.
Conclusão
Os resultados da análise de TLC e determinação de ácidos gordos livres de gema de ovo modificada por enzima da Sanofa A/S e a distribuição de tamanho de partícula e teste de estabilidade ao calor da maionese produzida com a gema de ovo modificada por enzima da Sanofa A/S correlacionaram-se bem. A gema de ovo modificada utilizando uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção teve a taxa de conversão mais elevada de lecitina em liso-lecitina e a quantidade mais elevada de ácido gordo livre. Como esperado, esta alteração na proporção de 169 lecitina:liso-lecitina resultou numa maionese que era termoestável e teve a distribuição de tamanho de partícula mais óptima. A utilização de Lecitase® Ultra para modificar gema de ovo da Sanofa A/S não resultou numa alteração muito grande na proporção de lecitina:liso-lecitina ou numa quantidade elevada de ácidos gordos livres. Esta conversão menos pronunciada de lecitina em liso-lecitina reflectiu-se na distribuição do tamanho de partícula da maionese que era semelhante àquela da gema de ovo não modificada. A alteração na proporção de lecitina:liso-lecitina que ocorreu utilizando Lecitase® Ultra foi, contudo, suficiente para tornar a maionese termoestável.
Gema de ovo da Sanofa A/S modificada com 30 U/g de enzima lipolítica, a 30 °C, durante 120 minutos, mostrou uma elevada taxa de conversão de lecitina em liso-lecitina e a maionese produzida com esta gema de ovo era termoestável e tinha uma distribuição de tamanho de partícula óptima. Em comparação, gema de ovo da Sanofa A/S, tratada com 30 U/g de Lecitase® Ultra, a 30 °C, durante 120 minutos, mostrou apenas uma pequena alteração na proporção de lecitina:lisolecitina e a maionese produzida tinha uma distribuição de tamanho de partícula semelhante a maionese com gema de ovo não tratada mas era, de facto, termoestável. Por este motivo, a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, foi superior a Lecitase® Ultra na produção de maionese. 170
Exemplo 11. Teste de aplicação de uma enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum em combinação com emulsionante para preparação de pãezinhos de crosta dura.
Neste teste, fermentos de enzima lipolítica de acordo com a presente invenção e derivada de Fusarium heterosporum foram utilizados isoladamente ou em combinação com Panodan® A2020 DATEM e GRINDSTED® SSL P55, ambos os emulsionantes da Danisco A/S, para o cozimento de pãezinhos de crosta dura. 0 efeito sobre o volume específico de pão foi comparado com o efeito de Lipopan F™ da Novozymes, isoladamente ou em combinação com emulsionante, sobre o volume específico de pão.
APLICAÇAO
Os pãezinhos de crosta dura foram cozidos utilizando a receita e processo de cozimento seguintes.
Receita de cozimento
Farinha - Danish Reform 2004002 Água
Levedura comprimida Sal Açúcar Ácido ascórbico
Amilase alfa padrão/GRINDAMYL™ .
Quantidade % de panificação de farinha 2000 g 100 1140 g 57 120 g 6 32 g 1,6 32 g 1,6 0 ppm 0 1000 da Danisco A/S 75 ppm 0,150 171
Processo de Cozimento
Sistema de amassadeira Diosna 1. Amassar a seco, durante 1 min., lento 2. Amassar 2 min., lento + 4 min. rápido
3. Temperatura de massa: 26 °C 4. Pesagem da massa: 1350 g 5. Repouso: 10 min., a 30 °C, em estufa de aquecimento 6. Moldação: Moldador Fortuna 3/17/7 7. Fermentação: 45 min., a 34 °C, 85% de HR. 8. Cozimento: Forno Bago: 13 min., a 220 °C, 13 s de vapor + 5 min. de registo aberto 9. Mesa de pedra MIWE: prog. N° 1 10. Após cozimento, os pãezinhos são arrefecidos, durante 25 min., antes de pesagem. O volume dos pãezinhos foi medido pelo método de substituição de colza.
Volume específico de pão:
Volume específico = Volume do pão, ccm/ peso do pão, g A adição de enzima lipolítica liofilizada é baseada em farinha. A enzima é adicionada a farinha, primeiro após misturar juntamente com água, ácido ascórbico e levedura comprimida. Todos os outros ingredientes desidratados são misturados na etapa 1. 172
RESULTADOS A enzima lipolítica liofilizada derivada de Fusarium heterosporum é utilizada em combinação com Panodan® M2020 DATEM da Danisco A/S e testada contra uma combinação de Lipopan F™/DATEM, assim como Lipopan F™ pura ou DATEM pura. Os resultados são mostrados na Tabela 23 e Figura 31.
Tabela 23
Amostra Controlo Lipopan F™
Enzima lipolitica PAN M2020 PAN M2020 +
Enzima lipolitica PAN M2020 + Enzima lipolitica
Quantidade Volume 10 ppm 30 ppm 40 ppm 96 ppm 191 ppm 287 ppm 383 ppm 478 ppm 0, 3% 0,15% 0,15% 96 ppm 0,15% 191 ppm especifico, g/ccm 5.89 5,98 7, 54 8,18 6,07 6,2 7, 06 8,13 8,01 7.89 6,5 7,68 8,29 173 (continuação)
Amostra PAN M2020 + Lipopan F™
Quantidade Volume especifico, g/ccm 0,15% 10 ppm 7,69 A enzima lipolitica liofilizada derivada de Fusarium heterosporum foi utilizada em combinação com Panodan® A2020 DATEM e GRINDSTED® SSL P55 e testada contra uma combinação de Lipopan F™/SSL ou Lipopan F™/DATEM, assim como Lipopan F™ pura, DATEM pura e SSL pura.
Os resultados são mostrados na Tabela 24 e Figura 32.
Tabela 24
Amostra Quantidade Volume especif Controlo 5,98 0,3% de Panodan® 0,3% 7,98 A2020 0,3% de SSL P 55 0,3% 7, 78 Lipopan F™ 15 ppm 6,42 40 ppm 7, 77 Lipopan F™ + 15 ppm 0,15% de Panodan® 0,15% 8, 44 A2020 g/ccm 174 (continuação)
Amostra Quantidade Volume específico, g/ccm
Lipopan F™ + 15 ppm 0,15% de SSL P 55 0,15% 8,62 Enzima lipolitica 43 ppm 5,93 86 ppm 6,43 Enzima lipolitica + 30 ppm 0,15% de Panodan® 0,15% 7,86 A2020 Enzima lipolitica + 43 ppm 0,15% de Panodan® 0,15% 7,86 A2020 Enzima lipolitica + 43 ppm GRINDSTED® SSL P55 0,15% 8,1
CONCLUSÃO A conclusão da Tabela 23 e Figura 31 é que uma dosagem óptima de enzima lipolitica liofilizada de acordo com a presente invenção é, aproximadamente, 383 ppm de enzima lipolitica e que o produto pode ser utilizado numa dosagem baixa em combinação com uma dosagem baixa do emulsionante DATEM. Numa experiência paralela demonstrou-se que, a dosagens de 574 ppm a 1912 ppm de enzima lipolitica, o volume específico de pão diminuiu (dados não mostrados) . 0 desempenho de 383 ppm de enzima lipolitica de acordo com a presente invenção é semelhante a 40 ppm de Lipopan F™. Quando utilizada em combinação com emulsionante, a enzima 175 lipolítica de acordo com a presente invenção também tem um desempenho ao nível de Lipopan F™. De acordo com a determinação de actividade de fosfolipase utilizando o ensaio TIPU aqui anteriormente descrito, 10 ppm de Lipopan F™ são aprox. 120 TIPU por kg de farinha e 96 pppm de enzima lipolítica da presente invenção correspondem a 117 TIPU por kg de farinha.
Adicionalmente, com base nos resultados do ensaio da Tabela 24 e Figura 32, conclui-se que uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em combinação com SSL assim como DATEM e, desse modo, reforçar o efeito de um nível baixo de emulsionante. A funcionalidade da enzima lipolítica de acordo com a presente invenção pode ser comparada à funcionalidade de Lipopan F™ quando doseadas de modo igual. De novo, o nível óptimo de actividade de fosfolipase em combinação com um emulsionante é determinado como sendo aprox. 100-150 TIPU por kg de farinha.
De forma conclusiva, uma dosagem óptima da enzima lipolítica pura de acordo com a presente invenção é em torno de 500 TIPU por kg de farinha e, em combinação com emulsionante, o nível de enzima lipolítica deve ser de 1/5 a H do nível óptimo de enzima lipolítica, significando aprox. 120 TIPU por kg de farinha. 176
Exemplo 12. Teste de aplicação de uma enzima lipolitica derivada de Fusarium heterosporum para preparação de tortilha de trigo.
Foi testado o efeito de uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção e derivada de Fusarium heterosporum sobre a rolabilidade de tortilha de trigo, preparada com ácido fumárico (processo US), como explicado no seguinte exemplo. A tortilha de trigo foi cozida utilizando os ingredientes na Tabela 25:
Tabela 25: Receita para preparação de tortilha de v.
Receita: Tipo: Dosagem (% de farinha) Gramas Farinha Clássica (N° 2004068) 100 3000 Açúcar 1,0 30 Gordura (manteiga, margarina, óleo) Manteiga 8,7 267 Sal 1,5 45 Sorbato de potássio 0, 3 9 Ca-propionato 0, 3 9 Bicarbonato de sódio 0, 9 27 Ácido Fumárico 0, 8 24 Água 48 144 177
Processo para preparação da massa de tortilha de trigo:
1. Temperatura de massa desejada: 32 °C 2. A amassadura é realizada à temperatura ambiente numa amassadeira Kemper. 3. Colocar todos os ingredientes desidratados na tigela de amassadeira (incluindo, opcionalmente, enzimas lipoliticas e/ou emulsionantes). 4. Amassar a seco, durante 1 min. 5. Adicionar Água 6. Amassar: 11 min., a velocidade 1 7. Pesagem: 1350 g x 3 8. Boleamento: em bolas de massa num separador/boleador glimek
9. Repousar durante 10 min., a 32 °C 10. Cozimento: num forno de tortilha CFO 40, com a seguinte regulação: Topo: 230 °C, meio: 228 °C e fundo: 160 °C.
11. Arrefecimento: 12 min., a 20 °C, 80% de HR
Uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção foi adicionada à massa a concentrações crescentes (Ensaio N° 3-7). Para comparação, foram incluídos um controlo (Ensaio N° 1) e um ensaio com o emulsionante Panodan® 205 da Danisco A/S (Ensaio N° 2). Ver a Tabela 26. A enzima lipolítica, Panodan® 205 e L-cisteína, quando adicionadas, são adicionadas ao primeiro processo de amassadura (etapas 3 e 4 anteriores) . A L-cisteína pode ser adicionada para aumentar a extensibilidade da massa preparada e, desse modo, melhorar o processo de pressão da massa antes do cozimento. 178
Tabela 26. Configuração de ensaio. ingredientes de Ensaio N2 Enzima lipolítica PANODAN® 205 L-cisteína (ppm) 1 10 2 1,03 % 10 3 100 ppm 10 4 200 ppm 10 5 400 ppm 10 6 1200 ppm 10 7 2400 ppm 10
As tortilhas são avaliadas por meio de um teste de rolabilidade a frio, à temperatura ambiente, onde a tortilha é rolada em torno de diferentes rolos de madeira de diferentes diâmetros, começando pelo pelo de madeira com o maior diâmetro. A rolabilidade é indicada pelo número de rolos de madeira em torno dos quais a tortilha pode ser enrolada, sem fracturar. Quanto mais alto o número, melhor a rolabilidade.
Avaliação visual Penetração Amostra Rolabilidade Força (g) 1-dia 7 2-1-1 432 2-dia 7 1-1-1 421 3-dia 7 1-1-1 369 4-dia 7 2-2-2 439 5-dia 7 2-2-1 489 6-dia 7 2-1-2 448 7-dia 7 2-2-2 533 179
Dos resultados, conclui-se que uma dosagem de 200 ppm, ou mais, de uma proteína lipolítica de acordo com a presente invenção parece proporcionar uma rolabilidade melhorada, comparada ao sistema de controlo. Utilizando o ensaio TIPU, aqui descrito anteriormente, foi determinado que o nível de actividade necessário, para melhorar a rolabilidade (numa dosagem de 200 ppm), corresponde a, aproximadamente, 650 TIPU unidades por kg de farinha. Destes resultados, também se pode concluir que a força para realizar o teste de penetração é aumentada a um nível superior de enzima lipolítica, significando que a resistência da tortilha é melhorada. O teste de penetração é conduzido pela utilização do analisador de textura TAXT2, produzido pela Stable Micro System, onde é medida a força necessária para penetrar/fracturar a tortilha.
Este equipamento é configurado com os seguintes parâmetros: A força é medida em Compressão
Velocidade de Pré-teste
Velocidade de Teste
Velocidade de Pós-teste
Dist. de Teste de
Ruptura
Distância
Força
Tempo Célula de Carga Temperatura 10 mm/s 2 mm/s 10 mm/s 1 mm 25 mm 1 g 5 s 5 kg 20-22 grau C (temperatura ambiente) 180
Exemplo 13. Clonagem molecular, análise da SEQuência e expressão heteróloga de um gene sintético codificando uma enzima lipolítica de Fusarium semitectum (IBT9507) em Hansenula polymorpha.
Um fragmento de um gene de enzima lipolítica de F. semitectum foi clonado a partir de ADN genómico utilizando PCR, com iniciadores concebidos a partir de blocos conservados de aminoácidos dentro sequências de proteína de enzimas lipolíticas de diferentes estirpes de Fusarium. Os iniciadores de PCR degenerados foram concebidos utilizando os programas de computador CODEHOP (Rose et ai. 2003 (Nucleic Acid Res., 18: 3763-3766) ) .
De modo a clonar as extremidades do gene, foram utilizados os métodos para RACE 5'- e 3'- (Frohman et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 8998-9002). RNA total foi isolado de uma cultura da estirpe de F. semitectum induzida com 1% de óleo de girassol e os iniciadores utilizados foram concebidos a partir da sequência do fragmento génico obtido com os iniciadores CODEHOP.
Os três fragmentos obtidos pelos processos anteriores foram agrupados in silico, de modo a revelar a sequência de ADNc de comprimento completo. A análise da sequência de ADNc de 1236 nucleótidos de comprimento mostrou uma fase de leitura aberta compreendendo 352 aminoácidos (Figura 33).
De modo a expressar o gene da enzima lipolítica de F. semitectum em Hansenula, o gene foi equipado com uma sequência sinal do factor de cruzamento α de levedura e inserida atrás do promotor FMD dentro do vector de expressão pB14 de 181
Hansenula. 0 plasmídeo resultante, pBl4-alp.sem (esquematicamente mostrado na Figura 34) foi transformado dentro de células competentes de Hansenula polymorpha por electroporação. Os transformantes foram seleccionados em placas de YND e as colónias foram adicionalmente seleccionadas para múltipla integração do gene por 10 sub-cultivos de diluições 1:200 em culturas liquidas de YND. Finalmente, as culturas seleccionadas foram transferidas duas vezes em meio YPD.
De modo a determinar o nivel de expressão do gene da enzima lipolitica, os clones seleccionados foram crescidos em YPD, com glicerol a 1,8% e glucose a 0,2%, durante 2 dias, a 37 °C.
Exemplo 14. Determinação de pH e temperatura óptimos para actividade de uma enzima lipolitica de Fusarium semitectum.
Uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção de
Fusarium semitectum IBT 9507 e expressa em Hansenula polymorpha, como descrito no Exemplo 8, foi utilizada em ensaios funcionais em pasta fluida de massa, para determinação de actividade de fosfolipase e galactolipase e a actividade desta enzima foi estudada em relação a variações em pH e temperatura.
PROCESSOS ANALÍTICOS
Cromatografia gasosa 0,8 gramas de farinha de Trigo são pesados num tubo de centrífuga de 12 mL com tampa. São adicionados 1,5 mL de água contendo a enzima. A amostra é misturada numa Whirley e colocada 182 numa estufa de aquecimento, a 30 °C, durante 60 minutos. São adicionados 6 mL de n-ButanolrEtanol 9:1 e a amostra é misturada, de novo, até a farinha estar finamente distribuída no solvente. Os tubos são, depois, colocados num banho-maria, a 95 °C, durante 10 minutos. Depois, misturados de novo e colocados num dispositivo de rotação, a 45 rpm, durante 45 minutos. A amostra é, depois, centrifugada a 2000 g, durante 10 minutos e 2 mL de sobrenadante são transferidos para um frasquinho de vidro de 10 mL. O solvente é evaporado a 70 °C, sob uma corrente de azoto. Os lípidos isolados são analisados por GLC. A Cromatografia Gasosa e o ensaio de activídade de Galactolipase foram realizados como descrito no Exemplo 1.
Temperatura óptima Activídade de fosfolipase
Para a determinação da activídade em função da temperatura, o ensaio de fosfolipase foi conduzido como no Exemplo 1, mas a temperatura foi regulada para 30 °C, 37 °C, 45 °C, 52 °C ou 60 °C. 183 pH óptimo
Actividade de fosfolipase
Para a determinação de actividade em função do pH, o ensaio de Fosfolipase foi conduzido como no Exemplo 1 mas a L-a Fosfatidilcolina a 0,6%, 95% Planta (Avanti N° 441601) e Triton-X 100 a 0,4% (Sigma X-100 ) foram dissolvidos em tampão de fosfatos a 0,05 M, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 ou pH 9.
RESULTADOS
Uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção de Fusarium semitectum IBT9507 foi analisada para actividade de fosfolipase PLU-7 e actividade de galactolipase GLU, com resultados mostrados na Tabela 27.
Tabela 27. Actividade enzimática de Fusarium semitectum.
Ensaio Actividade
Fosfolipase 0,8 PLU-7/mL
Galactolipase 1,3 GLU/mL
Foi testado Fusarium semitectum IBT9507 em experiências de pasta fluida de massa, através da adição de 1 PLU-7 a 0,8 gramas de farinha, de acordo com o processo mencionado. Também foi preparada uma amostra de controlo com água, em vez de enzima e 184 uma amostra com Lipopan F™. Os lípidos extraídos da massa foram analisados por GLC, com resultados mostrados na Tabela 28.
Tabela 28. GLC de lípido de massa, % baseada em peso de farinha. FFA = ácidos gordos livres, MGMG = monogalactosilmonoglicérido, DGMG = digalactosilmonoglicérido MGDG = monogalactosildiglicérido, DGDG = digalactosildiglicérido, TRI = triglicérido.
Enzima Dosagem % de % de % de % de % de % de FFA MGMG DGMG MGDG DGDG TRI Controlo 0 0, 148 0, 007 0,025 0,047 0,160 0,516 F. 1 PLU-7/g de 0,268 0,001 0,120 0,033 0, 045 0,446 semitectum farinha Lipopan F™ 1 PLU-7/g de 0,229 0, 027 0,090 0,016 0, 069 0, 415 farinha
Os resultados na Tabela 28 indicam que a lipase de F. semitectum tem actividade significativa em galactolípidos e relativamente menos actividade em triglicérido, em comparação com Lipopan F™. 0 Fusarium semitectum IBT9507 também foi analisado com respeito a actividade em função da temperatura (Tabela 29) e pH (Tabela 30) . 185
Tabela 29. Actividade de fosfolipase em função da temperatura para F. semitectum.
Temperatura, °C Actividade relativa, PLU 30 79 37 92 45 100 52 20 60 2
Tabela 30. Actividade de fosfolipase em função do pH para F. semitectum.
pH Actividade relativa, PLU 5 67 6 83 7 100 8 80 9 17
As actividades listadas nas Tabelas 29 e 30 também são ilustradas graficamente nas Figuras 35 e 36.
CONCLUSÃO A enzima lipolítica de acordo com a presente invenção de Fusarium semitectum mostrou actividade muito forte em galactolipidos em massa e a actividade em triglicérido é 186 inferior à actividade de triglicérido de Lipopan F™. A temperatura óptima para actividade desta enzima é aprox. 45 °C e o pH óptimo é 7.
Exemplo 15: Utilização de uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção em alimentos para animais
Avaliar a eficácia de uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, a diversos níveis de dose utilizados em alimentos normais, durante o período de produção completo de frangos para assar.
Sumário:
Os resultados preliminares sugerem que a adição de uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção nas dietas de frangos para assar é uma estratégia nutricional eficaz para melhorar o desempenho das aves, melhorar a retenção de nutriente e reduzir a excreção de azoto. Especificamente, investigações preliminares sugerem que a adição de uma enzima lipolítica de acordo com a presente invenção à dieta dos animais melhora o ganho de peso corporal, eficiência de conversão de alimento e metabolizabilidade de matéria seca e de azoto do animal.
Detalhes de tratamento Número de tratamentos 8 Replicados por Tratamento 0-21 d, 13 replicados 22-42 d, 9 replicados 187 (continuação)
Detalhes de tratamento Aves por Replicado 0-21 d, 8 aves/replicado (6 em gaiola grande, 2 em gaiola pequena) 22-42 d, 2 aves/replicado (2 em gaiola grande) Espécie de ave Frango para assar Raça de ave Ross ou Cobb Sexo de ave Macho Amplitude de ensaio 0-42 dias Forma de dieta (granulado/papa) Papa Coccidiostático de dieta/Promotor do crescimento utilizado Nenhum Idade a que as aves/alimentação são pesadas 0, 21 e 42 dias/ 0, 21 e 42 dias Densidade de criação (aves/m2) Programa de iluminação 23 h de luz, dias 0-4, 16 h de luz, dias 4-21, 20 h de luz, dias 22-31 e 23 h de luz, dias 32-42. Programa de temperatura de alojamento Programa de humidade de alojamento Programa de vacinação Elancoban (ração de arranque) Ventilação - Alterações de ar/hr 188
Formulação de dieta e programa de alimentação
Ingredientes Arranque (%) Finalização (%) Milho 55,55 59, 22 Centeio 5, 00 9, 00 SBM (48% de CP) 33,47 24, 79 Óleo de Soja 1, 85 3, 06 Sal 0, 41 0, 33 DL Metionina 0,21 0, 14 Lisina HC1 0, 05 0, 10 Calcário 1,18 1, 15 Fosfato Dicálcio 1, 48 1, 41 Vit/Min 0,50 0, 50 Ti02 0, 30 0, 30 TOTAL 100,00 100,00 Provisão de Nutrientes (calculada) CP (%) 21,50 18, 06 ME (kcal/kg) 3000,0 3125,0 ME (MJ/kg) 12,55 13, 08 Cálcio (%) 0, 90 0, 85 Fos. (%) 0,68 0, 63 Fos. Av. (%) 0, 40 0, 38 Gordura (%) 4, 48 5, 73 Fibra (%) 2,59 2, 48 Met (%) 0,55 0, 43 Cys (%) 0,36 0, 32 Met+Cys (%) 0, 91 0, 75 Lys (%) 1,20 1, 00 189 (continuação)
Try (%) Na (%) 0,25 0,18 0,20 0,15 A alimentação é preparada como uma papa, com ou sem uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção.
As dietas e água são oferecidas a d libitum. As dietas de teste são alimentadas continuamente durante todo o período de ensaio. As amostras de alimentação são, opcionalmente, suplementadas com uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção, a 330 g/tonelada. A enzima pode ser adicionada como uma enzima seca, enquanto se mistura a alimentação.
As observações são realizadas a:
Peso vivo (base de gaiola): dia 0, 21 e 42
Ganho de peso: 0-21 d, 22-42 d, 0-42 dias Consumo de Alimentação: 0-21 d, 22-42 d, 0-42 dias FCR (taxa de conversão de 0-21 d, 22-42 d, 0-42 dias alimento):
Recolha de conteúdo ileal: dia 21 e 42 São determinados os pesos de gaiola totais para alimentação e aves, assim como peso de mortalidade total e número de aves para cada gaiola por período analisado. O consumo de alimento por gaiola é determinado, não corrigido para mortalidade. Os dados de eficiência de conversão de alimento são determinados 190 como base de consumo total por peso vivo e peso total (incluindo peso de mortalidade) .
Antes do começo do estudo, os animais são examinados para sinais de problemas de saúde e lesão. Qualquer que pareça estar em mau estado é removido do estudo.
Os animais de estudo são atribuídos aos seus grupos de tratamento, utilizando uma técnica de aleatorização. Os animais e os seus galinheiros de armazenamento são identificados de modo único, antes do começo da administração da alimentação de teste.
Os dados dos grupos tratados são comparados com aqueles do seu grupo de controlo relevante, utilizando os testes estatísticos apropriados e aceitando um nível de probabilidade inferior a 0,05 como indicando significância.
Os pesos corporais, absorções de alimento e taxas de conversão de alimento são analisados por análise de variância e testes da diferença menos significativa.
Animais 2 Número de Tratamento Número de replicados
Animais por replicado 13 a 21 dias e 9 a 42 dias 8 a 21 dias e 2 a 42 dias
Espécie de Animal
Frango para assar
Raça de animal
Sexo
Idade de animais de teste
Ross
Macho 0-42 d 191
Pesos de animais de ' ~ 40 g teste
Dieta/Alojamento Informação de Dieta Forma de Dieta Coccidiostático de Arranque Coccidiostático de Finalização Promotor do Crescimento de Arranque Promotor do Crescimento de Finalização Medições Principais Realizadas : Ver anteriormente : Papa : Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum
Variáveis : ganho de peso, conversão de alimento, digestibilidade de nutriente
Quando Enzimas/aditivos Enzimas utilizadas (D : : 0-21 d, 22-42 d
Enzima lipolitica de Fusarium semitectum e/ou Fusarium heterosporum -330 g/Tonelada 192
Exemplo 16: Avaliação do efeito de uma enzima lipolítica de Fusarium heterosporum CBS 782.83 sobre a qualidade de tipo noodle instantâneo preparado a partir de farinha Chinesa.
Introdução 0 mercado de noodle instantâneo (IN) verificou um crescimento fenomenal nos últimos 5-8 anos no SE Asiático e, até certo ponto, na Europa e EUA. Este crescimento é evidente, mesmo em regiões que são tradicionalmente mercados baseados em arroz e/ou pasta (Food Navigator, 2000) . A recente popularidade de IN pode ser principalmente atribuída ao seu custo muito acessível, conveniência e processos de produção limpos. A farinha com um teor de proteína médio (9-11%), baixo valor de cinza (~0,50%), elevado brilho L* (85) e tom amarelado b* (> 8,0) e elevada viscosidade de pasta de amido (<750 BU) produz um noodle instantâneo (IN) de cor creme/amarela e tem as desejadas caracteristicas de sensação bucotáctil. Há vários tipos diferentes de noodles consumidos, cada com caracteristicas especificas de qualidade de farinha que produzem impacto na qualidade de produto acabado.
Cumprir as exigências do consumidor final constitui um desafio na indústria da farinha, em virtude do grande número de produtos acabados e ampla gama de expectativas dos clientes. Os ingredientes e aditivos especificamente concebidos, nas doses certas, desempenham um papel muito importante no melhoramento do paladar, textura, aparência, validade e/ou valor nutritivo do produto acabado final. 193
Embora a importância da cor e textura do IN cozinhado não possa ser subestimada, os clientes estão a ficar cada vez mais exigentes e preocupados com a saúde e estão a procurar alternativas pobres em matéria gorda, sem compromissos na qualidade.
Uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção foi testada em farinha Chinesa, para avaliar o efeito sobre o teor de gordura de IN e estudar as alterações à textura e cor durante o processamento.
Materiais e Métodos
Foram utilizados para este projecto o processo padrão da Agrifood Technology para a produção de IN e um método de avaliação alargada. A farinha Chinesa foi utilizada como a farinha de controlo e foi utilizada no início de cada dia. 0 teor de proteína, humidade, cinza, cor, glúten húmido e actividade diastática da farinha Chinesa foram medidos utilizando métodos aprovados pela AACC (American Association for Clinicai Chemistry) . Os testes de reologia de massa incluíram: farinograma, extensograma (45 min. de puxo), alveograma e amilograma. A produção de IN pode ser sumariada como se segue:
Cada lote de IN foi preparado a partir de 350 g de farinha e amassado a baixa velocidade, durante a qual foram gradualmente adicionadas 33 partes de solução salina aquosa contendo cloreto de sódio a 1% e sais alcalinos a 0,2% (carbonato de potássio: carbonato de sódio, na proporção de 6:4). Para amostras 194 doseadas, a farinha foi exaustivamente amassada com a quantidade medida de ingrediente, antes da adição da solução aquosa salgada. A massa quebradiça foi amassada durante 4 minutos adicionais, a velocidade média e laminada 8 vezes. A laminação começou com um compactador de aço, seguida de dois cilindros estriados de plástico e, finalmente, de cinco cilindros lisos de aço inoxidável, com uma relação de redução de 30% entre cada rolo. A espessura final de lâmina de massa era de 1,35 mm. A lâmina de massa foi laminada uma vez mais, antes do corte. O diferencial em velocidade entre os rolos de corte e a correia veiculoa resultou na formação de espirais estreitas. As cadeias de noodle estreitamente espiraladas, foram cozidas ao vapor, durante dois minutos, fritas em óleo de palma em ambos os lados, a 180 °C, durante 1 minuto. Os blocos do tipo noodle foram arrefecidos e embalados em sacos de selo de grampo para análises adicionais.
As amostras foram recolhidas em várias fases de produção para análises. A cor e tamanho de partícula do miolo foram medidos utilizando o Minolta Chromameter e o paquímetro , respectivamente. A cor da lâmina de massa e do produto final foi registada com o Minolta Chromameter e foi tirada uma fotografia digital de ambos (não mostrada) . Foram conduzidas medições de actividade de água nos noodles cozidos ao vapor. A actividade de água pode ser medida através da determinação do peso dos noodles cozidos ao vapor, imediatamente após cozimento ao vapor e após remoção completa do teor de água através da secagem num forno a 90 °C - o teor de água pode ser, depois, determinado através da divisão da diferença de peso, antes e após secagem, pelo peso após secagem. 195
Tempo óptimo de preparação, rendimento de preparação, perdas de preparação (método gravimétrico), cor e textura (firmeza) de noodles cozinhados foram medidos utilizando processos padrão da Agrifood Technology, conhecidos de um especialista na técnica. A análise do perfil de textura (TPA) também foi conduzida na textura de noodle cozinhado, para medir a coesividade, elasticidade e mastigabilidade. A coesividade é definida como quão bem o produto suporta uma segunda deformação relativamente a como se comportou sob a primeira deformação. É medida como a área de trabalho durante a segunda compressão dividida pela área de trabalho durante a primeira compressão e, por este motivo, não tem unidades de medição. Neste caso, a coesividade refere-se a produto "al-dente", que não é um atributo desejável para IN. A elasticidade é definida como quão bem um produto fisicamente volta ao mesmo lugar, após ter sido deformado durante a primeira compressão. A elasticidade é medida de diversas maneiras mas, de um modo muito típico, pela distância da altura detectada do produto na segunda compressão. A mastigabilidade apenas se aplica a produtos sólidos e é calculada como gomosidade multiplicada por elasticidade. A mastigabilidade é mutuamente exclusiva com gomosidade.
Um bloco do tipo noodle, representando cada taxa de dosagem, foi moído num moinho de café e uma subamostra homogénea foi utilizada para análise de gordura pelo método de hidrólise ácida (podem ser utilizados métodos padrão alternativos para determinar o teor de gordura). 196
Resultados e Discussão 0 teor de proteína e cor (com respeito a brilho, L*) da farinha estava dentro da gama aceitável para a produção de tipo noodles instantâneos. A absorção de água estava ligeiramente na extremidade superior para a produção de IN; contudo, uma vez que a massa de noodles é bastante quebradiça, não produziu impacto na maquinabilidade. A farinha tinha uma boa extensibilidade simples (extensograma) e biaxial (alveograma) que teria um impacto positivo nas qualidades de alimentação de noodles. A viscosidade máxima do amilógrafo era 870 BU que é desejável para IN. A perda de preparação de IN, contendo a segunda dose mais elevada de enzima lipolítica, foi superior à do controlo e o IN contendo a menor quantidade da enzima lipolítica de acordo com a presente invenção. O teor de gordura de IN, com a quantidade mais elevada da enzima lipolítica, foi significativamente inferior ao do controlo e o IN experimental com a menor quantidade de enzima lipolítica. A elasticidade e mastigabilidade de algum IN experimental foram melhores do que o controlo. Com base nestes dados, a enzima lipolítica deverá ser adicionalmente investigada a dosagens diferentes.
Conclusões
Alguns dos pontos relevantes que podem ser constituídos a partir deste estudo são: 197 A adição a IN de uma enzima lipolitica de acordo com a presente invenção não produziu um impacto dramático no tamanho de miolo, adesividade de massa, maquinabilidade ou caracteristicas de processamento. Facto importante, dosagens crescentes de enzima lipolitica resultaram numa redução no teor de gordura de IN. A enzima lipolitica melhorou a firmeza dos noodle a doses crescentes, em comparação com controlo, enquanto a coesividade não foi afectada. A enzima lipolitica teve um efeito positivo sobre o tom amarelado dos noodles cozinhados.
Deste modo, a enzima lipolitica reduziu o teor de gordura em IN, melhorou a textura e aumentou o tom amarelado dos noodles cozinhados.
Embora a invenção tenha sido descrita com respeito a formas de realização preferidas especificas, deverá ser compreendido que a invenção como reivindicada não deve estar indevidamente limitada a tais formas de realização especificas. De facto, pretende-se que várias modificações dos modos descritos para executar a invenção que sejam óbvias aos especialistas em bioquímica e biotecnologia ou áreas relacionadas estejam dentro do âmbito das seguintes reivindicações.
Lisboa, 19 de Novembro de 2010 198

Claims (2)

REIVINDICAÇÕES 1. Enzima lipolítica fúngica, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos como mostrada na SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 6, ou uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 90% de identidade com SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 6 e em que a enzima tem uma proporção de actividade superior em lipidos polares comparada com triglicéridos. 2. Sequência nucleotidica codificando uma enzima lipolítica fúngica de acordo com a reivindicação 1. 3. Ácido nucleico codificando uma enzima lipolítica fúngica, ácido nucleico que é seleccionado do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotidica mostrada na SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 7; b) um ácido nucleico que é relacionado com a sequência nucleotidica da SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 7 pela degenerescência do código genético; e c) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotidica que tem, pelo menos, 90% de identidade com a sequência nucleotidica mostrada na SEQ ID N° 3 OU SEQ ID N° 5 OU SEQ ID N° 7. 4. Método de preparação de um género alimentício, compreendendo a adição da enzima lipolítica fúngica de acordo com a reivindicação 1 a um ou mais ingredientes do género alimentício. 1 5. Método de preparação de um produto de panificação, compreendendo a adição de uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a reivindicação 1 a uma massa e o cozimento da massa, de modo a preparar o produto de panificação. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o género alimentício é um ou mais de: ovo ou um produto à base de ovo; um produto de panificação; confeitaria; um produto congelado; um produto lácteo incluindo um queijo; uma mousse; um creme vegetal batido; um óleo e gordura comestíveis; um produto batido arejado e não arejado; emulsões de óleo-em-água e emulsões de água-em-óleo; margarina; manteiga; uma pasta para barrar, incluindo pastas para barrar pobres em matéria gorda e muito pobres em matéria gorda; um tempero; maionese; um molho; um molho à base de natas; uma sopa à base de natas; uma bebida; uma emulsão de especiarias e um molho. 7. Método de preparação de um lisofosfolípido, compreendendo o tratamento de um fosfolípido com a enzima lipolitica fúngica de acordo com a reivindicação 1, de modo a produzir o lisofosfolípido. 8. Método de preparação de um lisoglicolípido, compreendendo o tratamento de um glicolípido com a enzima lipolitica fúngica de acordo com a reivindicação 1, de modo a produzir um lisoglicolípido. 9. Processo de desengomagem enzimática de óleos vegetais ou alimentares, compreendendo o tratamento do óleo vegetal ou alimentar com uma enzima lipolitica fúngica de acordo com a 2 reivindicação 1, de modo a hidrolisar uma parte importante dos lipidos polares aí presentes. 10. Composição de melhoramento de pão ou composição de melhoramento de massa, compreendendo a enzima lipolítica fúngica de acordo com a reivindicação 1. 11. Composição de melhoramento de pão ou composição de melhoramento de massa da reivindicação 10 compreendendo, adicionalmente, uma exoamilase ou endoamilase. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-6, em que a enzima lipolítica é utilizada em combinação com uma alfa-amilase. Lisboa, 19 de Novembro de 2010 3 1/28 FIG. 1 FIG.2 2/28 FIG. 3 t . . r·' ‘ 1 í - χ i ' * ‘ -Pli > - li . .·' &Λ. b Jr , w t«.. . r v · . . \ v t ’ , li* 1 l· i4í *· ‘«V Η *r 8 9 10 11 12 13 14 15 P Padrão IP:Agrupamento N2 172-174 100 U/mL diluído 1:10 P padrão Padrão. Série de proteína padrão FIG. 4 %, baseado em peso seco de massa Controlo Agrupamento NQ172-174 1000U F. hei Agrupamento N-172-174 40 ppm NQ 30440)2000U F. het. Agrupamento NQ172-1744000U F. het. Agrupamento NQ172-1741000U 2254-97 C61 FIG. oooo oooo bbbbP^V-iaP o w ^ o co to £ 0) 00 N) 40 ppm N-3016 Q r 0 Q. (D TI Q I 01 ro w -λ * Oi V CO \ K> CD Péptidos CBS De F. het-Nagao Péptidos CBS De F. het-Nagao Péptidos CBS De F. het-Nagao Péptidos CBS De F. het-Nagao Péptidos CBS De F. het-Nagao Péptidos CBS De F. het-Nagao Péptidos CBS De F. het-Nagao 4/28 1 50 (1) --------------------------------AVGVTSTDFTNFKFYIQH (1) MMLVLSLLSIIAFTAAGFVPSVDENTRVLEHRAVTVTTQDLSNFRFYLQH 51 100 (19) GAAAYCNSGTAAGAKITCSNNGCPTIE SNGVTWASFTGSKTGIGGYVST (51) ADAAYCNFNTAVGKPVHCSAGNCPDIEKDAAIWGSVVGTKTGIGAYVAT . ***** ** * . ** ** ** . **.* ******.**.* 101 150 (69) DS SRKEIWAIRGSSNIRNWLTNIDEDQSDCSLVSGCGVHSGFQNAWAEI (101) DNARKEIWSVRGSINVRNWITNFNFGQKTCDLVAGCGVHTGFLDAWEEV * ·******·.*★* * · *** « ** * * * *******·** ** *. 151 200 (119) SAQASAAVAKARKANPSFKWATGHSLGGAVATLSAANLRAAGTFVDIYT (151) AANVKAAVSAAKTANPTFKFWTGHSLGGAVATIAAAYLRKDGFPFDLYT itirk· -k * irkitoirk it * ★ * ** * * * · * -k * ** * * fc · ** 201 250 (169) YGAPRVGNAALSAFISNQAGGEFRVTHDKDPVPRLPPLIFGYRHTTPEYW (201) YGSPRVGNDFFANFVTQQTGAEYRVTHGDDPVPRLPPIVFGYRHTSPEYW **.***** . *...* *.*.**** ******** ****** **** 251 300 (219) LSGGGGDKVDYAISDVKVCE GAANIjMCNGGTLGLD IDAHLHYFQATDACN (251) LNGGP-LDKDYTVTEIKVCEGIANVMCNGGTIGLDILAHITYFQSMATCA ic *★ .···★*★*★ Ith · *********** *★» · Ά 301 334 (269) AGGFSWR--------------------------- (300) PIAIPWKRDMSDEELEKKLTQYSEMDQEFVKQMI * . FIG. 7 5/28 M R F P S I FTAVLFAAS SALAAPVN 23 AAXTÇAAACGATGAGATTCCCATCCATCTTTACCGCTGTXCTGTTCGCCGCTTCCTCCGCCCIGGCTGCCCCAGTCAACA 80 - — " * alpsynt TTXEDEXAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV 50 CTACCACTGAGGACGAGACTGCTCAGATTCCAGCTGAGGCTSTCATCGGTTACTCTGACCTGGAGGGTGACTTCGATGTT 160 AVLPFSNSINNGFLFINXIIASIAAKE 77 GCTGTTTXGCCATTCTCCAACTCCACCAACAACGGTTTCTTGTTCATCAACACTACCATTGCCTCCATTGCTGCCAAGGA 240 EGVS LD KR^AVGVI STD FTNFKFY IQH 103 GGAAGGTGTTTCCTTGGACAAGAGAGCCGTTGGAGTGACCTCTACTGACTTCACTAACXTTAAGTTCTACATTCAGCATG 320 ► alp3.cbsa 4-—-cbss. alps GAAAYCNSerAAGAKirCSNNGCPTXE 130 GTGCTGCCGCATACTGTAACTCCGGTACCGCCGCAGGXGCAAAGATCACTTGTTCGAATAACGGTTGCCCTACTATCGAG 400 SNGVTVVASFTGSKTGIGGYVSTDSSR 157 TCCAACGGCGIGACTGIGGTCGCCTCCrTCACTGGTTCGAAGACTGGCATCGGCGGTTACGTeTCCACCGATAGCTCGAG 480 KEIVVAIRGSSHIRNWLXNLDFDQSD 183 AAAAGAGATCGTGGTCGCAATCAGAGGTTCCAGCAACATCCGGAATTGGCTGACTAATCITGACTTTGACCAGTCCGACT 560 CSLVSGCGVHSGFQMAWAEISAQASAA 210 GTTCCCTTGTTTCGGGCTGTGGTGITCACTCCGGTTTCCAGAACGCTTGGGCCGAGATCTCCGCACAGGCCTCGGCTGCC 640 VAKARKANPSFKVVAXGHSLGGAVATX. 237 GXGGCAAAAGCTAGAAAGGCCAACCCATCCTTCAAGGTTGXCGCCACXGGCCACXCGCTCGGCGGCGCTGXGGCGACCCX 720 SAANLRAAGIPVDIYTYGAPRVGNAA 263 GXCCGCTGCCAACCXXCGAGCTGCAGGXACTCCAGTCGACAXCTACACXXAXGGXGCACCXAGAGXXGGCAACGCCGCAC 800 LSAF1 SHQAGGE FRVXHDKDPVPRLFP 290 TGTCTGCTTTCATCTCGAACCAAGCAGGCGGTGAATTTAGAGTCACTCACGACAAGGACCCAGTGCCXCGGCXTCCACCI 880 LIFGYRHTTPEYWLSGGGGDKVDYAIS 317 ctgatcttcggttacagacacactaccccagagtactggctgtcaggtggcggcggagacaaggtggactacgcaatctc 960 DVKVCE GAANLMCNGGTLGLDIDAHL 343 cgacgtgaaggtctgcgagggagccgcaaacctcatgtgtaacggcggtacactgggactggacatggacgcacacttgc 1040 HYPQATDACNAGGFSWR 360 actacxtccaggcaactgatgcttgcaacgccggaggtttctcctggagataggccaxggagagaattggatcct 1115 cbss. t -4- FIG.8 6/28 Eco RI(1) Actividade (mM/min)) Número de clone FIG. 10 0 Uamostra 205 200 Uamostra 205 500 Uamostra 205 1000 Uamostra 205 1500 Uamostra 205 2000 Uamostra 205 10000 Uamostra 205 40 ppm Lipopan F mMOL % 0 o p 0 0 0 α -L b IS) Oi 0 01 0 Oi 0 0 0 0 0 o OO (j)Q fii 8/28 Solvente IV de HPTLC FIG. 13 FIG. 14 FICB. 17 FIG. 19a Actividade relativa(% de actividade a 35 -C-) -iMG)A0l0)vl(»(0O ooooooooooo 30 35 -40 45 50 55 60 65 Temperatura (-C) FIG. 20 log de Pm (kDa) 0 0 -A a N) N 12/28 A. B. C. FIG. 21 13/28 A. % de lecitina (p/p) —^ % de lecitina (p/p) m % çje lecitina (p/p) FIG. 22 14/28 A. B. C. FIG. 23 15/28 A. % de lecitina (p/p) Q % de lecitina (p/p) ^ % de lecitina (p/p) 5°C 30 U/g 10°C 30 U/g 15°C 30 U/g 20“C 30 U/g 53°C 30 U/g 53°C 60 U/g 53° C 20°C 15°C 10°C 5°C FIG.24 Tempo de reacção (minutos) 16/28 A. % de lecitina (p/p) q % de lecitina (p/p) _ % de |ecitina (p/p) 5°C 30 U/g 10°C 30 U/g 15°C 30 U/g 20°C 30 U/g 53°C 30 U/g 53°C 60 U/g 61 5 = : 4; —*-53°C -*-20°C -^-15°C -^10°C —*-5°C 1- 04- 0 500 1000 Tempo de reacção (minutos)FIG. 25 1500 17/28 18/28 <υ i- > ο σ i- ο σ> ο Ό ϋ "(Β 160 140 120- 100- 80 60 40 20 ♦ KLM1 x = y δ Lecitase Ultra -20 J 0 20 40 60 80 100 120 140 160 (liso-lecitina) (mM) FIG. 27 TG FFA 1,3 DG 12 DG C MG ... , . ·' r ···; .i.'·} · ,r.- ‘//v. f'!,' vf*. .. . < 1 , i"’.' ?teff r«?·? 'V·/ v.vi í·'5* -ií»i*5·'^·2*& ·Sjf·-5»*·1¾- ,|φ'ι Pista 1 FIG. 28 30 Lecitina 19/28 Liso-lecitina Pista 1: controlo Pista 2: Enzima lipolítica Pista 3: Lecitase® Ultra Pista 4: Lecitina e liso-lecitina 29 20/28
1. Controlo 2. Enzima Npolítica 3. Lecitase® Ultra FIG. 30 Volume específico, ccm/g ϋΙ Φ N 00 Ui 01 0) 01 Nj 01 00 bl
2 1/28 n Q GO IV) Volume específico, ccm/g 01 ç» Nl oo uibiflòi^bioobiíD 43 ppm Ezima lipolítica 86 ppm Ezima lipolítica
Controlo 0,3% A2020 0,3% SSL P 55 15ppm LIPOPAN 40 ppm LIP0PAN 15 ppm LIPOPAN +0.15% A2020 15 ppm LIPOPAN+0.15% SSL P 55 30 ppm Ezima lipolítica +0.15% A2020 43 ppm Ezima lipolítica +0.15% A2020 43 ppm Ezima lipolítica +0,15% SSL P 55 to to \ to co 23/28 GGGGGGGATATCTTCGCCAGTTTCAGTGTTCAGTATCCTTTCTGAGGGAGTCGCACTTGTCACAGCTTGTCTATCACTTA go MRVLSLLSVATFAVASP 17 TACCCTTSATCCATACCCTTGCCTGTCAAGATGCGTGTCCTGTCACTCCTCTCAGTTGCCACCTTTGCTGTGGCCAGTCC 160 LSVEDYAKALDERAVAVSNGDFGNFK 43 TCTGAGCGTAGAGGACTACGCCAAGGCTCTCGATGAAAGAGCTGTTGCTGTCTCCAACGGTGACTTTGGTAACTTCAAGT 240 FYIQHGAASYCNSNAAAGAKITCGNNG 70 TCTACATCCAGCACGGTGCTGCTTCATACTGCAACTCCAATGCCGCAGCTGGTGCAAAGATCACCTGTGGAAACAATGGC 320 CPTVQSNGATIVASFTGSKTGIGGYVS 97 T6TCCAACAGTCCAGTCCAACGGTGCTACrATCeTCGCATCCTTCACTGGTTCCAAGACTGGCATCGGCG6TTACGTTTC 400 TDSSRKEIVLSVRGSIHIRNWLTNI.D 123 GACCGACTCTTCACGAAAGGAAATCGTCCTCTCCGTTCGAGGCAGCATAAACATTCGAAACTGGCTCACCAACCTCGACT 480 FGQEDCSLTSGCGVHSGFQNAWKEISA 150 TCGGCCAGGAGGACTGCAGCTTGACCTCAGGTTGTGGAGTACACAGCGGTTTCCAGAATGCCTGGAAAGAGATTTCCGCT 5 60 AATAAVAKARKANPSFKVIATGHSLG6 177 GCAGCAACCGCTGCTGTCGCAAAGGCCCGCAAGGCGAACCCTTCGTTCAAGGTCATTGCCACAGGCCACTCCCTTGGTGG 640 AVATLAGANLRVGGTPVDIY5CYGSPR 203 TGCCGTCGCTACACTCGCCGGCGCAAATCTTCGAGTTGGTGGAACACCCGTTGACATCTACACCTACGGCrCCCCCCGAG 720 VGNSQLAGFISNQAGGEFRVTNAKDPV 230 TTGGAAACTCCCAGCTCGCTGGCTTCATCTCGAACCAAGCTGGTGGAGAGTTCCGCGTTACCAAIGCCAAGGACCCTGT·!: 800 PRLPPLVFGYRHTSPEYWLSGAGGDKV 257 CCCAGACTTCCCCCTCTGGTCTTTGGTTACCGACACACATCCCCCGAGTACTGGCTGTCTGGTGCGGGAGGTGACAAGGr 880 BYT INDIKVCE GAANLKCNGGTLGLD 283 TGACTACACCATCAATGACATCAAGGTCTGTGAGGGTGCTGCCAAC:cTCAAGTGCAACGGTGGAACCCTTGGATTGGATA 960 IDAHLHYFQETDACSGGGISWRSRRYR 310 TTGATGGTCACCTGCACTACTTCCAGGAGACrGATGCTTGCTCTGGTGGCGGTATCTCTIGGAGAAGCCGAAGATACAGA 1040 SAKREDISERAAPMTDAELEKKLNNYV 337 AGCGCCAAGCGrGAGGACATCTCTGAGAGGGCTGCTCCTATGACGGATGCTGAGCTTGAGAAGAAGCTCAACAACTATGT 1120 EMDKEYVKNNAARTS 352 CGAGATGGAYAAGGAGTATGTCAAGAACAATGCCGCACGCACGTCATAGTAIGACATTTACGCAGTAATGATATACCACG 1200 1236 aataataagaatcacaaaataaaaaaaaaaaaaaaa FIG. 33 24/28 Asp 718 (5986) Eco RI (1) Pst I (564) Pst I (629) Λ/de 1(4531) Pst I (4468) Nco I (4237)
Asp 718 (1590) Nde I (2605) Sma I (3565) FIG. 34 Pst I Xho I (5714) Psí 1(5617) Xho I (5388) Hind\\\ (5227) Xba 1(5114)
Temperatura, - C FIG. 35 25/28
(SEQ ID N21) 1 avgvtstdft nfkfyiqhga aaycnsgtaa gakitcsnng cptiesngvt wasftgskt 61 giggyvstds srkeiwair gssnirnwlt nldfdqsdcs lvsgcgvhsg fqoawaeisa 121 gasaavakar kanpsfkwa tghslggava tlsaanlraa gtpvdiytyg aprvgnaals 181 afisnqagge frvthdkdpv prlpplifgy rhttpeywls ggggdkvdya isdvkvcega 241 anlmcnggtl gldidahlhy fqatdacnag gfswr FIG. 37 (SEQ ID N°- 2) 1 mrfpsiftav lfaassalaa pvntttedat aqipaeaviq ysdleqdfdv avlpfsnstn 61 ncrflflntti asiaakeeqy sldkravgvt stdftnfkfy iqhgaaaycn sgtaagakit 121 csnngcptie sngvtwasf tgsktgiggy vstdssrkei vvairgssni mwltnldfd 181 qsdcslvsgc gvhsgfqnaw aeisaqasaa vakarkanps fkwatghsl ggavatlsaa 241 nlraagtpvd iytygaprvg naalsafisn qaggefrvth dkdpvprlpp lifgyrhttp 301 eywlsggggd kvdyaisdvk vcegaanlmc nggtlgldid ahlhyfqatd acnaggfswr 361 * FIG. 38 26/28 ((SEQ ID Ns 3) 1 gocgttggag tgacctctao tgacttcacfc aactttaagt tctacattca gcatggtgct 61 gccgcatact gtaactccgg taccgccgca ggtgcaaaga tcacttgttc gaataacggt 121 tgccctacta tcgagtccaa cggcgtgact gtggtcgcct ccttcactgg ttcgaagact 181 ggcatcggcg gttacgtgtc caccgatagc tcgagaaaag agatcgtggt cgcaatcaga 241 ggttccagca acatccggaa ttggctgact aatcttgact ttgaccagtc cgactgttcc 301 cttgtttcgg gctgtggtgt tcactccggt ttccagaacg cttgggccga gatctccgca 361 caggcctcgg ctgccgtggc aaaagctaga aaggccaacc catccttcaa ggttgtcgcc 421 actggccact cgctcggcgg cgctgtggcg accctgtccg ctgccaacct tcgagctgca 481 ggtactccag tcgacatcta cacttatggt gcacctagag ttggcaacgc cgcactgtct 541 gctttcatct cgaaccaagc aggcggtgaa tttagagtca ctcacgacaa ggacccagtg 601 cctcggcttc cacctctgat cttcggttac agacacacta ccccagagta ctggctgtca 661 ggtggcggcg gagacaaggt ggactacgca atctecgacg tgaaggtctg cgagggagcc 721 gcaaacctca tgtgtaacgg cggtacactg ggactggaca tcgacgcaca cttgcactac 781 ttccaggcaa ctgatgcttg caacgccgga ggtttctcct ggaga FIG. 39 (SEQ ID N2 4) 1MRVLSLLSVA TFAVASPLSV EDYAKALDER AVAVSNGDFG NFKFYIQHGA ASYCNSNAAA 61 GAKITCGNNG CPTVQSNGAT XVASFTGSKT GIGGYVSTDS SRKEIVLSVR GS1NIRHWLT 121 NLDFGQEDCS LTSGCGVHSG FQNAWKEXSA AATAAVAKAR KANPSFKVXA TGHSLGGAVA 181 TLAGANLRVG GTPVDIYTYG SPRVGNSQLA GFISNQAGGE FRVTNAKDPV PRLPPLVFGY 241 RHTSPEYWL3 GAGGDKVDYT INDXKVCEGA ANLKCNGGTL GLDIDAHLHY FQETDACSGG 301 GISWRSRRYR SAKREDISER AAPMTDAELE KKLNNYVEMD KEYVKNNAAR TS FIG. 40 (SEQ ID Ns 5) 1 gggggggata 61 cacagcttgt 121 tgtcactcct 181 ccaaggctct 241 tctacatcca 301 tcacctgtgg 361 ccttcactgg 421 aaatcgtcct 481 tcggccagga 541 cctggaaaga 601 cttcgttcaa 661 gogcaaatet 721 ttggaaactc 781 ccaatgccaa 841 cccccgagta 901 tcaaggtctg 961 ttgatgctca 1021 ggagaagccg 1081 tgacggatgc 1141 tcaagaacaa 1201 aataataaga 27/28 tcttcgccag tttcagtgtt cagtatcctt tctgagggag tcgcacttgt ctatcactta tacccttgat ccataccctt gootgteaag atgcgtgtcc ctcagttgcc acctttgctg tggcoagtcc tctgagcgta gaggactacg cgatgaaaga gctgttgctg tctccaacgg tgactttggt aacttcaagt gcacggtgct gcttcatact gcaactccaa tgccgcagct ggtgcaaaga aaacaatggc tgtccaacag tccagtccaa cggtgctact atcgtcgcat ttccaagact ggcatcggcg gttacgtttc gaccgactct tcacgaaagg ctccgttcga ggcagcataa acattcgaaa ctggctcacc aacctcgact ggactgcagc ttgacctcag gttgtggagt acacagcggt ttccagaatg gatttccgct gcagcaaccg ctgctgtcgc aaaggcccgc aaggegaacc ggtcattgcc acaggccact cccttggtgg tgccgtcgct acactcgccg tcgagttggt ggaacacccg ttgaaatcta cacctacggc tccccccgag ccagctcgct ggcttcatct cgaaccaagc tggtggagag ttccgcgtta ggaccctgtt cccagacttc cccctctggt ctttggttac cgacacacat ctggctgtct ggtgcgggag gtgacaaggt tgactacacc atcaatgaca tgagggtgct gccaacctca agtgcaacgg tggaaccctt ggattggata cctgcactac ttccaggaga ctgatgcttg ctctggtggc ggtatctctt aagatacaga agcgccaagc gtgaggacat ctctgagagg gctgctccta tgagcttgag aagaagctca acaactatgt cgagatggat aaggagtatg tgccgcacgc acgtcatagt atgacattta cgcagtaatg atataccacg atcacaaaat aaaaaaaaaa aaaaaa FIG. 41 (SEQ ID N2 6) 1 EAEAAVGVTS TDFTNFKFYI QHGAAAYCNS GTAAGAKITC SNNGCPTIES 51 NGVTWASFT GSKTGIGGYV STDSSRKEIV VAIRGSSNIR NWLTNLDFDQ 101 SDCSLVSGCG VHSGFQNAWA EISAQASAAV AKARKANPSF KWATGHSLG 151 GAVATLSAAN LRAAGTFVDI YTYGAPRVGN AALSAFISNQ AGGEFRVTHD 201 KDPVPRLPPL IFGYRHTTPE YWLSGGGGDK VDYAISDVKV CEGAANLMCN 251 GGTLGLDIDA HLHYFQATDA CNAGGFSWR FIG. 42 28/28 (SEQ ID N5 7) 1 agaattcaaa cgatgagafct cccatccatc tttaccgctg ttctgttcgc cgcttcctcc 61 gccctggctg ccccagtcaa cactaccact gaggacgaga ctgctcagat tccagctgag 121 gctgtcatcg gttactctga cctggagggt gacttcgatg ttgctgtttt gecattctcc 181 aactccacca acaacggttt cttgttcatc aacactacca ttgcctccat tgctgccaag 241 gaggaaggtg tttccttgga caagagagct gttgctgtct ccaacggtga ctttggtaac 301 ttcaagttct acatccagca cggtgctgct tcatactgca actccaatgc cgcagctggt 361 gcaaagatca cctgtggaaa caatggctgt ccaacagtcc agtccaacgg tgctactatc 421 gtcgcatcct tcactggttc caagactggc atcggcggtt acgtttcgac cgactcttca 481 cgaaaggaaa tcgtcctetc cgttcgaggc agcataaaca ttcgaaactg gctcaccaac 541 ctcgacttcg gccaggagga ctgcagcttg acctcaggtt gtggagtaca cagcggtttc 601 cagaatgcct ggaaagagat ttccgctgca gcaaccgctg ctgtcgcaaa ggcccgcaag 661 gcgaaccctt cgttcaaggt cattgccaca ggccactccc ttggtggtgo cgtcgctaca 721 ctcgccggcg caaatcttcg agttggtgga acacccgttg acatctacac ctacggctcc 781 ccccgagttg gaaactccca gctcgctggc ttcatctcga accaagctgg tggagagttc 841 cgcgttacca atgccaagga ccctgttccc agacttcccc ctctggtctt tggttaccga 901 cacacatccc ccgagtactg gctgtctggt gcgggaggtg acaaggttga ctacaccatc 961 aatgacatca aggtctgtga gggtgctgcc aacctcaagt gcaacggtgg aacccttgga 1021 ttggatattg atgotcacet gcactacttc caggagactg atgcttgcto tggtggcggt 1081 atctcttgga gaagccgaag abacagaagc gccaagcgtg aggacatctc tgagagggct 1141 getcctatga cggatgctga gcttgagaag aagctcaaca actatgtcga gatggataag 1201 gagtatgtca agaacaatgc cgcacgcacg tcatagtatg acatttacgc ggatcct FIG. 43
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