ES2415873T3

ES2415873T3 - Lípido aciltransferasa

Info

Publication number: ES2415873T3
Application number: ES08709551T
Authority: ES
Inventors: Arno De Kreij; Susan Mampusti Madrid; Jørn Dalgaard MIKKELSEN; Jørn Borch SOE; Mark Turner; Jonathan Goodwins
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2013-07-29
Anticipated expiration: 2028-02-27
Also published as: WO2009024736A1; EA018153B1; EP2190296A2; EA201000323A1; GB0716126D0; EP2190296B1; CN101874039A; CA2695562C; PL2190864T3; WO2009024862A3; DK2190296T3; US8652809B2; MX2010001858A; AR067953A1; EP2190864A1; MX2010001856A; WO2009024862A2; ES2524307T3; SA08290513B1; AU2008290424B2

Abstract

Una lípido aciltransferasa, donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada comoSEQ ID No. 90.

Description

Lípido aciltransferasa

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a una lípido aciltransferasa.

5 La presente invención se refiere a un método para la producción in situ de un emulsionante dentro de un alimento mediante el uso de una lípido aciltransferasa.

La presente descripción se refiere además a un método para la producción in situ de un emulsionante dentro de un alimento mediante el uso de una lípido aciltransferasa, donde el método es tal que el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido en ácidos grasos libres del alimento.

10 La presente descripción se refiere además a un método para la producción in situ de al menos dos emulsionantes dentro de un alimento mediante el uso de una lípido aciltransferasa.

La presente invención también se refiere a un método para la producción in situ de un éster de carbohidrato y/o un éster de esterol y/o un éster de estanol y/o un éster de ácido hidroxi dentro de un alimento mediante el uso de una lípido aciltransferasa.

15 La presente descripción se refiere a una composición enzimática para comida y/o a una composición enzimática para piensos, que contiene una lípido aciltransferasa, y al uso de dicha composición en los métodos de la presente.

La presente descripción se refiere además a un método para identificar lípido aciltransferasas adecuadas y a las lípido aciltransferasas así identificadas.

La presente invención se refiere además a una lípido aciltransferasa inmovilizada.

20 Antecedentes Técnicos

Los beneficios del uso de fosfolipasas y lipasas (denominadas enzimas lipolíticas, (EC. 3.1.1.x), empleadas en aplicaciones industriales para alimentos y/o piensos, son conocidos desde hace muchos años.

Por ejemplo, en el documento EP 0 585 988 se reivindica que la adición de lipasa a una masa dio como resultado una mejora en el efecto anti-correosidad. Se sugiere que una lipasa obtenida de Rhizopus arrhizus, cuando es

25 añadida a una masa, puede mejorar la calidad del pan resultante si se usa en combinación con manteca/grasa. El documento WO94/04035 muestra que se puede obtener una suavidad mejorada añadiendo una lipasa a la masa sin añadir ninguna grasa/aceite a la masa. Castello, P. ESEGP 89-10 Dic. 1999 Helsinki, muestra que las lipasas exógenas pueden modificar el volumen del pan.

Las enzimas lipolíticas hidrolizan uno o más de los ácidos grasos de los lípidos presentes en el alimento, lo que

30 puede dar como resultado la formación de moléculas emulsionantes potentes dentro del alimento, que proporcionan una funcionalidad comercialmente valiosa. Las moléculas que contribuyen a las características emulsionantes más significativas son los productos de hidrólisis parcial, tales como moléculas de liso-fosfolípidos, liso-glicolípidos y mono-glicéridos. Los productos de hidrólisis de lípidos polares, tales como liso-fosfolípidos y liso-glicolípidos son particularmente ventajosos. En la fabricación del pan, dichos emulsionantes derivados in situ pueden proporcionar

35 una funcionalidad equivalente como emulsionantes, tal como el DATEM.

Sin embargo, la actividad de las enzimas lipolíticas también produce la acumulación de ácidos grasos libres, que pueden conducir a una funcionalidad negativa en el alimento. Esta actividad inherente de las enzimas lipolíticas limita su funcionalidad.

En la técnica se han propuesto numerosas soluciones a este problema. Sin embargo, éstas dan como resultado un

40 aumento significativo del contenido de ácidos grasos libres en el alimento, particularmente en alimentos con un alto contenido de agua, que incluyen, aunque sin limitación, masas de pan y yema de huevo.

Las fosfolipasas, particularmente la fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4), se han usado durante muchos años para el tratamiento de productos de huevo o basados en huevo (véase, por ejemplo, el documento US 4.034.124 y Dutihl & Groger 1981 J. Sci. Food Agric. 32, 451-458). La actividad de fosfolipasa durante el tratamiento de productos de 45 huevo o basados en huevo da como resultado la acumulación de lisolecitina polar, que puede actuar como un emulsionante. El tratamiento con fosfolipasa de productos de huevo o basados en huevo puede mejorar la estabilidad, la estabilidad térmica en tratamientos con calor tales como la pasteurización, y da como resultado un espesamiento sustancial. Los productos basados en huevo pueden incluir, aunque sin limitación, mayonesa, aliños para ensaladas, salsas, helados y similares. El uso de fosfolipasas da como resultado la acumulación de ácidos 50 grasos libres. La acumulación de ácidos grasos libres puede tener un efecto significativo sobre el sabor. Adicionalmente, la acumulación de ácidos grasos libres puede dar como resultado un aumento de la susceptibilidad a la oxidación, y por tanto dando problemas de caducidad, decoloración del producto y alteración de otras

características críticas del alimento como el sabor y la textura. Recientemente se han comercializado enzimas lipolíticas con una especificidad de sustrato más amplia para el tratamiento de yema de huevo y productos alimentarios relacionados. Éstas presentan la ventaja de que, al contrario de la mayoría de las fosfolipasas A2, no tienen su origen en una fuente de mamífero. Sin embargo, producen una acumulación significativa de ácidos grasos

5 libres, no solo debido a la hidrólisis de fosfolípidos, sino también de triglicéridos.

Como se ha mencionado anteriormente, otra área en la que las lipasas han sido usadas ampliamente es la industria panadera. El uso de fosfolipasas en panadería data de principios de la década de 1980.

El sustrato para lipasas en la harina de trigo es el 1,5-3% de lípidos de trigo endógenos, que son una mezcla compleja de lípidos polares y no polares. Los lípidos polares se pueden dividir en glicolípidos y fosfolípidos. Estos

10 lípidos están constituidos por glicerol esterificado con dos ácidos grasos y un grupo polar. El grupo polar contribuye a la actividad superficial de dichos lípidos. La ruptura enzimática de uno de los ácidos grasos en estos lípidos produce lípidos con una actividad superficial muy superior. Es bien conocido que los emulsionantes, tal como el DATEM, con una elevada actividad superficial, son altamente funcionales cuando se añaden a la masa.

Sin embargo, el uso de lipasas (E.C. 3.1.1.X) en productos de masa puede tener un efecto negativo sobre la

15 actividad de la levadura y/o un efecto negativo sobre el volumen del pan. El efecto negativo sobre el volumen del pan se explica a menudo por un exceso de dosis. Un exceso de dosis puede conducir a una disminución de la elasticidad de gluten, lo que da como resultado una masa demasiado rígida y, por tanto, produce volúmenes de pan menores. Adicionalmente, o alternativamente, dichas lipasas pueden degradar la manteca, el aceite o la grasa láctea añadidos a la masa, produciendo una modificación del sabor de la masa y del producto cocido. Se ha atribuido el

20 exceso de dosis y el sabor modificado a la acumulación de ácidos grasos libres en la masa.

En las solicitudes de patente EP 1 193 314, EP 0 977 869 y también en la WO 01/39602, se describe que el uso de enzimas lipolíticas activas con glicolípidos es particularmente beneficioso en la aplicación de panadería ya que se ha observado que los productos de hidrólisis parcial, los liso-glicolípidos, presentan una funcionalidad de emulsionante muy elevada, que aparentemente produce una mayor proporción de funcionalidad emulsionante positiva en

25 comparación con la acumulación negativa de ácidos grasos libres. Sin embargo, también se observó que las enzimas tienen una significativa actividad no selectiva sobre los triglicéridos, lo que produce un contenido en ácidos grasos libres innecesariamente elevado.

El mismo descubrimiento se presentó en el documento WO 00/32758, que describía variantes de enzimas lipolíticas con una actividad mejorada en fosfolípidos y/o glicolípidos, además de variantes que presentaban preferencia por

30 ácidos grasos de cadena larga en lugar de corta. Esta última característica, también descrita en WO 01/39602, se consideró de particular importancia para evitar los sabores modificados asociados a la acumulación de ácidos grasos de cadena corta. Sin embargo, se produce una cantidad significativa de ácidos grasos libres.

El problema de la elevada actividad de triglicéridos se abordó en la solicitud de patente WO02/094123 donde se muestra el uso de enzimas lipolíticas activas con lípidos polares (es decir, glicolípidos y fosfolípidos) en una masa,

35 pero sustancialmente inactivas con triglicéridos o 1-mono-glicéridos. Sin embargo, se produce una cantidad significativa de ácidos grasos libres.

Algunas enzimas lipolíticas tienen una actividad baja o nula sobre la forma liso de los lípidos polares (p.ej. glicolípidos/fosfolípidos). El uso de dichas enzimas se ha considerado preferible, ya que aseguran la acumulación de liso-lípidos altamente polares, lo que proporciona una funcionalidad óptima. Sin embargo, los ácidos grasos libres se

40 acumulan. Esta funcionalidad selectiva es característica de las enzimas de fosfolipasa A2, y las glicolipasas descritas en EP 0 977 869, EP 1 193 314 y WO01/396. Se han producido variantes de enzimas lipolíticas menos selectivas que tienen una menor actividad sobre lípidos liso-polares que la enzima original (WO03/060112). Sin embargo, se produce una cantidad significativa de ácidos grasos libres.

El documento WO00/05396 muestra un proceso para preparar un alimento que comprende un emulsionante, donde

45 el alimento se pone en contacto con una enzima de tal modo que la enzima genera un emulsionante a partir de un éster de ácido graso y se genera un segundo ingrediente funcional a partir de un segundo constituyente. La solicitud de patente WO 00/05396 muestra el uso en particular de una enzima lipasa o estearasa. En ninguna parte del documento WO 00/05396 aparece el uso específico de lípido aciltransferasa. Adicionalmente, en alimentos con un alto contenido en agua, el uso de estearasas y lipasas tal como se muestra en WO00/05396 produciría una

50 acumulación significativa de ácidos grasos libres.

Una desventaja asociada al uso de lipasas, incluyendo fosfolipasas y glicolipasas, puede provenir de la formación de ácidos grasos libres liberados de los lípidos. En las últimas dos décadas, el uso de enzimas lipolíticas en alimentos ha estado limitado debido al equilibrio entre la acumulación negativa de ácidos grasos libres y la producción de los liso-lípidos que proporcionan una funcionalidad positiva. Aunque se han probado numerosas estrategias en la

55 técnica, algunas de las cuales han proporcionado mejoras significativas en la funcionalidad, ninguna ha abordado y solucionado completamente el problema fundamental de la técnica, es decir, la acumulación significativa de ácidos grasos libres en alimentos preparados usando enzimas lipolíticas in situ.

La presencia de niveles elevados de ácidos grasos libres (FFA, del inglés "Free Fatty Acids") en los materiales de partida o en los productos alimentarios se reconoce generalmente como un defecto de calidad, y los procesadores y clientes de comida habitualmente incluyen un máximo nivel de FFA en las especificaciones del alimento. Los efectos resultantes de los niveles de exceso de FFA pueden ser defectos organolépticos y/o funcionales.

Un resultado de la lipólisis es la rancidez hidrolítica, con la formación de un característico sabor "jabonoso". Este sabor "jabonoso" es especialmente agudo con ácidos grasos de longitud intermedia (C8-C12), los cuales, aunque no están presentes en concentraciones elevadas, pueden ser constituyentes importantes de, por ejemplo, productos lácteos o aceites vegetales. Un defecto organoléptico más común es debido a los efectos combinados de enzimas lipolíticas y procesos de oxidación. Los ácidos grasos insaturados son más susceptibles a la oxidación enzimática cuando están sin esterificar que cuando están esterificados en lípidos de acilo.

Los defectos funcionales en alimentos debidos a altos niveles de FFA están reconocidos, pero son más difíciles de explicar. Sin pretender establecer ninguna teoría, la hidrólisis de lípidos no alterados en ácidos carboxílicos aumentará [H+] y producirá grupos carbonilo que puedan combinarse con otros compuestos o iones metálicos. Los ácidos grasos libres también se combinan con proteínas mediante interacciones hidrofóbicas y pueden formar complejos con almidón durante la cocción. Los FFA también pueden interferir con la acción de los agentes tensioactivos, tales como lípidos polares y emulsionantes. (Lipid in Cereal Technology, P.J. Barnes, Academic Press 1983.)

La solicitud de patente WO03/100044 describe una clase de acil transferasas conocidas como PDATs (o ATWAX). Estas enzimas usan un monoglicérido o un diglicérido como molécula aceptora, y fosfatidilcolina (PC) como molécula dadora para producir los siguientes productos: liso fosfatidilcolina y triacilglicerol y/o diacilglicerol.

En una realización, la presente invención se refiere a mejoras en la incorporación de proteínas de suero en productos alimentarios, para proporcionar mejores rendimientos sin perjudicar a las cualidades -tal como la texturade las composiciones y productos alimentarios.

Las composiciones de queso se preparan típicamente a partir de líquidos lácteos mediante procesos que incluye el tratamiento del líquido con un agente coagulante. El agente coagulante puede ser una enzima de cuajo, un ácido o un cultivo bacteriano adecuado, o puede incluir dicho cultivo. El cuajo resultante generalmente incorpora caseína transformada, grasas que incluyen grasa butírica natural, y aromatizantes que surgen especialmente cuando se usa un cultivo bacteriano. El cuajo puede separarse del suero líquido, que contiene proteínas solubles no afectadas por la coagulación y que por tanto no se incorporan al cuajo.

Por tanto, el suero es un sub-producto de fabricación en procesos comerciales que producen productos alimentarios, tal como los quesos. Tradicionalmente, el suero se desecha como residuo sin utilidad o se usa como fertilizante o pienso para animales, o se procesa en un ingrediente alimentario.

La incapacidad de las proteínas de suero para ser retenidas sustancialmente en el cuajo es un factor importante que contribuye a la falta de eficacia de la producción convencional de productos lácteos -tales como cuajos de queso- y a una reducción del rendimiento global en referencia a la incorporación de todos los sólidos proteicos que están presentes en los líquidos lácteos de partida a los cuajos de queso resultantes.

Se han producido numerosos intentos para incluir proteínas de suero en el queso, por ejemplo mediante tratamiento térmico de la leche, tratamiento térmico del suero o mediante filtración - tal como ultrafiltración.

También existen varias descripciones del uso de proteasas específicas para inducir la agregación de proteínas de suero. Se ha demostrado que una serina proteasa derivada de Bacillus licheniformis tiene la capacidad de inducir la agregación de proteínas de suero (US 5.523.237).

Sin embargo, sigue habiendo muchas dificultades asociadas a la adición de proteínas de suero en procesos como la fabricación de quesos. Por ejemplo, la incorporación de proteína de suero a los quesos se asocia al deterioro del sabor y la sensación en la boca del producto, y además tiende a interferir con el cuajo y el procesado posterior del producto. Las proteasas descritas previamente con capacidad para ser añadidas a la leche de queso para la hidrólisis de proteínas de suero dan como resultado un hidrólisis significativa de las caseínas, según se describe en Madsen, J.S. & Qvist, K.B. (1997) Hydrolysis of milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acid residues. J. Food Sci. 62, 579-582.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica para obtener métodos y composiciones que proporcionen una incorporación mejorada de proteínas de suero en los productos alimentarios, a la vez que mantengan las propiedades organolépticas, y otras propiedades, deseables. Dicha optimización daría como resultado un aumento de la eficacia, mayores rendimientos de productos alimentarios, y una reducción de los costes totales de materiales.

Las lipasa:colesterol aciltransferasas se conocen desde hace algún tiempo (véase, por ejemplo Buckley -Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). En particular, se han descubierto las glicerofosfolípido:colesterol aciltransferasas (GCATs), que, como las lecitina:colesterol aciltransferasas (LCATs) de plantas y/o mamíferos, catalizan la transferencia de ácidos grasos entre la fosfatidilcolina y el colesterol.

Upton y Buckley (TIBS 20, Mayo de 1995 páginas 178-179) y Bnunlik y Buckley (J. of Bacteriology Abril de 1996 páginas 2060-2064) muestran una lipasa/aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que tiene la capacidad de llevar a cabo la transferencia de acilo a aceptores de alcohol en medio acuoso.

Aspectos resumen de la presente invención

5 Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una lípido aciltransferasa, donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No. 90.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una lípido aciltransferasa según la reivindicación 1, donde la lípido aciltransferasa consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90.

Según un tercer aspecto se proporciona un método para la producción in situ de un emulsionante en un alimento,

10 donde el método comprende la etapa de añadir al alimento una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para la producción in situ de un emulsionante en un alimento, donde el método es tal que el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres en el alimento, y donde el método comprende la etapa de

15 añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción in situ de un emulsionante y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol en un alimento, donde el método es tal que el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres en el alimento, y donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

20 En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción in situ de un emulsionante y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol en un alimento, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

Según otro aspecto, se proporciona un método para la producción in situ de al menos dos emulsionantes en un alimento, donde el método comprende la etapa de añadir al alimento una lípido aciltransferasa.

25 Según un aspecto adicional, se proporciona un método para la producción in situ de al menos dos emulsionantes y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol en un alimento, donde el método es tal que los emulsionantes son producidos sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres en el alimento, y donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

Según un aspecto adicional, se proporciona un método para la producción in situ de al menos dos emulsionantes y

30 bien un éster de esterol y/o un éster de estanol en un alimento, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para la producción in situ de un éster de carbohidrato en un alimento, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En un otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción in situ de un éster de

35 carbohidrato junto con un emulsionante en un alimento, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción in situ de un emulsionante, y uno

o más ésteres de carbohidrato; un éster de esterol; un éster de estanol, un éster de proteína; un monoglicérido o un diglicérido en un alimento, y donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

40 Según un aspecto adicional, se proporciona un método de producción de un alimento que comprende un emulsionante, donde el método comprende la etapa de añadir al alimento una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para la producción de un alimento que comprende un emulsionante, donde el método es tal que el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar

45 sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres en el alimento, y donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción de un alimento que comprende un emulsionante y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol, donde el método es tal que el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres en el alimento, y donde

50 el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción de un alimento que comprende un emulsionante y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

Según aspecto adicional de la descripción, se proporciona un método para la producción de un alimento que comprende al menos dos emulsionantes, donde el método comprende la etapa de añadir al alimento una lípido aciltransferasa.

Según un aspecto adicional de la descripción, se proporciona un método para la producción de un alimento que comprende al menos dos emulsionantes y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol, donde el método es tal que los emulsionantes son producidos sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres en el alimento, y donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

Según un aspecto adicional, se proporciona un método para la producción de un alimento que comprende al menos dos emulsionantes y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para la producción de un alimento que comprende un éster de carbohidrato, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En un otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción de un alimento que comprende un éster de carbohidrato y un emulsionante, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción de un alimento que comprende un emulsionante y uno o más ésteres de carbohidrato; un éster de esterol; un éster de estanol; un éster de proteína; un monoglicérido o un diglicérido, y donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar un alimento a partir de una materia alimentaria que comprende un emulsionante, donde el emulsionante se genera a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende un emulsionante, donde el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres del alimento, y donde el emulsionante es generado a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende un emulsionante y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol, donde el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres del alimento, y donde el emulsionante y/o el éster de esterol y/o el éster de estanol es(son) generado(s) a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende un emulsionante y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol, donde el emulsionante y/o el éster de esterol y/o el éster de estanol es(son) generado(s) a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende al menos dos emulsionantes, donde los dos emulsionantes son generados a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

Según un aspecto adicional, se proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende al menos dos emulsionantes y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol, donde los emulsionantes son producidos sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres del alimento, y donde uno o ambos emulsionantes y/o el éster de esterol y/o el éster de estanol es(son) generado(s) a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

Según un aspecto adicional, se proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende al menos dos emulsionantes y bien un éster de esterol y/o un éster de estanol, donde uno o ambos emulsionantes y/o el éster de esterol y/o el éster de estanol es(son) generado(s) a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende un éster de carbohidrato, donde el éster de carbohidrato es generado a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende al menos un éster de carbohidrato y un emulsionante adicional, 5 donde el éster de carbohidrato y el emulsionante son generados a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende un emulsionante y uno o más de un éster de carbohidrato, un éster de esterol, un éster de proteína, un monoglicérido o un diglicérido, y donde el emulsionante y/o el éster de

10 carbohidrato y/o el éster de esterol y/o el éster de estanol y/o el éster de proteína y/o el monoglicérido y/o el diglicérido es(son) generado(s) a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

Según un aspecto adicional, se proporciona un método para la producción in situ de un emulsionante, preferiblemente una lisolecitina y un éster de esterol en un alimento basado en huevo, donde el método es tal que el

15 emulsionante es producido sin aumentar o sin el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

Según un aspecto adicional, se proporciona un método para la producción in situ de un emulsionante, preferiblemente una lisolecitina, y un éster de esterol en un alimento basado en huevo, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

20 En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción de un alimento basado en huevo que comprende un emulsionante, preferiblemente una lisolecitina, y un éster de esterol en un alimento basado en huevo, donde el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres del alimento, y donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método de producción de un alimento basado en huevo que

25 comprende un emulsionante, preferiblemente una lisolecitina, y un éster de esterol en un alimento basado en huevo, donde el método comprende una lípido aciltransferasa al alimento.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona además un alimento obtenible, preferiblemente, mediante un método según la presente descripción.

En otro aspecto, la presente invención se refiere además a una composición enzimática alimentaria y/o a una

30 composición enzimática para piensos, que contiene una lípido aciltransferasa, y al uso de dicha composición en los métodos de la presente descripción.

Según un aspecto adicional, se proporciona un método para identificar una lípido aciltransferasa adecuada para su uso según la presente descripción, que comprende las etapas de evaluar una enzima de interés usando uno o más de "Ensayo de Transferasa en un entorno Bajo en Agua", "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" 35 ó "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado", y seleccionar una lípido aciltransferasa si es una que tenga una

o más de las siguientes características: (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un entorno Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, presenta una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad

40 de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

La presente descripción proporciona además una lípido aciltransferasa identificada usando un método de acuerdo con la presente descripción.

Según un aspecto adicional, la presente invención proporciona una enzima lípido aciltransferasa inmovilizada tal 45 como se define en la presente memoria.

Aspectos detallados de la presente invención

El término "lípido aciltransferasa" tal como se usa en la presente memoria significa una enzima que además de tener actividad de lipasa (generalmente clasificada como E.C. 3.1.1.x según las Recomendaciones de Nomenclatura de Enzimas (1992) del Nomenclature Committee de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology)

50 también presenta actividad de aciltransferasa (generalmente clasificada como E.C. 2.3.1.x), por lo que la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta uno o más sustratos aceptores, tales como uno o más de los siguientes: un esterol; un estanol; un carbohidrato; una proteína; una subunidad de proteína; glicerol.

La lípido aciltransferasa para uso en los métodos y/o los usos de la presente descripción puede ser una descrita en las solicitudes de patente WO2004/064537 ó WO2004/064987, ó PCT/IB2004/004378 ó GB0513859.9, ó PCT/ GB05/002823.

La lípido aciltransferasa para uso en los métodos y/o usos de la presente descripción puede ser una lípido

5 aciltransferasa natural o puede ser un lípido aciltransferasa variante. Preferiblemente, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y/o usos de la presente invención es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido (tal como se define en la presente memoria) a uno o más de los siguientes sustratos aceptores: un esterol, un estanol, un carbohidrato, una proteína o sus subunidades, o un glicerol.

Para algunos aspectos, el "aceptor de acilo" puede ser cualquier compuesto que comprenda un grupo hidroxi (-OH),

10 tal como por ejemplo alcoholes polivalentes, que incluyen el glicerol; esterol; estanoles; carbohidratos; hidroxiácidos que incluyen ácidos de fruta, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico y ácido ascórbico; proteínas o una subunidad de las mismas, tal como aminoácidos, hidrolisatos proteicos y péptidos (proteína parcialmente hidrolizada) por ejemplo; y mezclas y derivados de los mismos. Preferiblemente, el "aceptor de acilo" no es agua.

En una realización, el aceptor de acilo preferiblemente no es un monoglicérido y/o un diglicérido.

15 En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un esterol y/o un estanol.

En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un carbohidrato.

En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta una proteína o

20 subunidad de la misma. De manera adecuada, la subunidad de proteína puede ser una o más de las siguientes: un aminoácido, un hidrolisato de proteína, un péptido, un dipéptido, un oligopéptido, un polipéptido.

De manera adecuada, en la proteína o subunidad de proteína el aceptor de acilo puede ser uno o más de los siguientes constituyentes de la proteína o subunidad de proteína: una serina, una treonina, una tirosina o una cisteína.

25 Cuando la subunidad de proteína es un aminoácido, de manera adecuada el aminoácido puede ser cualquier aminoácido adecuado. De manera adecuada, el aminoácido puede ser uno o más de una serina, una treonina, una tirosina o una cisteína, por ejemplo.

En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta glicerol.

En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un 30 hidroxiácido.

En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un alcohol polivalente.

En un aspecto, la lípido aciltransferasa puede ser, además de capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un esterol y/o un estanol, adicionalmente capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta uno o más

35 de los siguientes: un carbohidrato, una proteína, una subunidad de proteína, glicerol.

Preferiblemente, el sustrato de lípido sobre el que actúa la lípido aciltransferasa según la presente invención es uno

o más de los siguientes lípidos: un fosfolípido, tal como una lecitina, por ejemplo una fosfatidilcolina, un triacilglicérido, una caridolipina, un diglicérido o un glicolípido, tal como digalactosilglicérido (DGDG), por ejemplo. Dicho sustrato de lípido puede denominarse en la presente memoria "lípido dador de acilo". El término lecitina, tal

40 como se usa en la presente memoria, abarca fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina y fosfatidilglicerol.

Para algunos aspectos, preferiblemente el sustrato de lípido sobre el que actúa la lípido aciltransferasa es un fosfolípido, tal como lecitina, por ejemplo fosfatidilcolina.

Para algunos aspectos, el sustrato de lípido es preferiblemente un glicolípido, tal como DGDG, por ejemplo.

45 Preferiblemente el sustrato de lípido es un lípido alimentario, es decir, un componente lipídico de un alimento.

Para algunos aspectos, la lípido aciltransferasa según la presente invención preferiblemente es incapaz, o sustancialmente incapaz, de actuar sobre un triglicérido y/o un 1-monoglicérido y/o un 2-monoglicérido.

De forma adecuada, el sustrato de lípido o el lípido dador de acilo puede ser uno o más de los siguientes sustratos: grasas, que incluye sebo y grasa butírica; aceites que incluyen aceites extraídos o derivados de aceite de palma, 50 aceite de girasol, aceite de soja, aceite de alazor, aceite de algodón, aceite de cacahuete, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de coco, aceite de colza. También es adecuada como sustrato de lípido la lecitina

de soja, colza o yema de huevo. El sustrato de lípido puede ser un lípido de avena u otro material basado en plantas que contenga galactolípidos.

En un aspecto, el lípido dador de acilo preferiblemente es lecitina (tal como fosfatidilcolina) en yema de huevo.

Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido puede seleccionarse de lípidos que tengan una longitud de 5 cadena de ácido graso de entre 8 y 22 carbonos.

Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido se puede seleccionar de lípidos que tengan una longitud de cadena de ácido graso de entre 16 y 22 carbonos, más preferiblemente de entre 16 y 20 carbonos.

Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido se puede seleccionar de lípidos que tengan una longitud de cadena de ácido graso no superior a 14 carbonos, de forma adecuada de lípidos que tengan una longitud de

10 cadena de ácido graso de entre 4 y 14 carbonos, de forma adecuada entre 4 y 10 carbonos, de forma adecuada entre 4 y 8 carbonos.

De forma adecuada, la lípido aciltransferasa puede exhibir una o más de las siguientes actividades de lipasa: actividad de glicolipasa (E.C. 3.1.1.26), actividad de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3), actividad de fosfolipasa A2

(E.C. 3.1.1.4) o actividad de fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32). El término "actividad de glicolipasa", tal como se emplea 15 en la presente memoria, abarca "actividad de galactolipasa".

De forma adecuada, la lípido aciltransferasa puede presentar al menos una o más de las siguientes actividades: actividad de glicolipasa (E.C. 3.1.1.26) y/o actividad de fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32) y/o actividad de fosfolipasa A2

(E.C. 3.1.1.4).

Para algunos aspectos, la lípido transferasa puede tener al menos actividad de glicolipasa (E.C. 3.1.1.26).

20 De forma adecuada, para algunos aspectos, la lípido aciltransferasa puede ser capaz de transferir un grupo acilo desde un glicolípido y/o un fosfolípido hasta uno o más de los siguientes sustratos aceptores: un esterol, un estanol, un carbohidrato, una proteína, glicerol.

Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa es capaz de transferir un grupo acilo desde un glicolípido y/o un fosfolípido hasta un esterol y/o un estanol para formar al menos un éster de esterol y/o un éster de

25 estanol.

Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa es capaz de transferir un grupo acilo desde un glicolípido y/o un fosfolípido hasta un carbohidrato para formar al menos un éster de carbohidrato.

Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa es capaz de transferir un grupo acilo desde un glicolípido y/o un fosfolípido hasta una proteína para formar al menos un éster de proteína (o un condensado de

30 ácido graso proteico).

Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa es capaz de transferir un grupo acilo desde un glicolípido y/o un fosfolípido hasta glicerol para formar al menos un diglicérido y/o un monoglicérido.

En una realización el aceptor de acilo es glicerol. El glicerol puede formar parte de forma natural de un alimento y/o materia alimentaria que comprende el dador de acilo (es decir, el fosfolípido, por ejemplo) - tal como mantequilla,

35 leche o nata, por ejemplo. Alternativamente, se puede añadir el glicerol al alimento y/o materia alimentaria que comprende el dador de acilo (es decir, los fosfolípidos, por ejemplo) - tal como mantequilla, leche o nata - antes, durante o después de la adición de la enzima lípido aciltransferasa.

Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa no exhibe actividad de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3) o no exhibe una actividad de triacilglicerol lipasa significativa (E.C. 3.1.1.3).

40 En algunos aspectos, la lípido aciltransferasa puede ser capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido a un esterol y/o un estanol. Por tanto, en una realización el "aceptor de acilo" puede ser un esterol o un estanol o una combinación de un esterol y un estanol.

En una realización, de forma adecuada el esterol y/o el estanol puede comprender una o más de las siguientes características estructurales:

45 i) un grupo hidroxi 3-beta o un grupo hidroxi 3-alfa; y/o

ii) anillos A:B en posición cis o anillos A:B en posición trans o C5-C6 está insaturado.

Los aceptores de acilo de esterol adecuados incluyen colesterol y fitoesteroles, por ejemplo alfa-sitoesterol, betasitoesterol, estigmaesterol, ergoesterol, campesterol, 5,6-dihidroesterol, brassicaesterol, alfa-espinaesterol, betaespinaesterol; gamma-espinaesterol, deltaespinaesterol, fucoesterol, dimoesterol, ascoesterol, serebiesterol, epiesterol, anaesterol, hipoesterol, condrillaesterol, desmoesterol, calinoesterol, poriferaesterol, clionaesterol, glicósidos de esterol y otras formas isoméricas y derivados naturales o sintéticos.

En un aspecto de la presente descripción, de forma adecuada puede actuar como aceptor de acilo más de un esterol y/o estanol, de forma adecuada más de dos esteroles y/o estanoles pueden actuar como aceptor de acilo. En otras 5 palabras, en un aspecto de la presente descripción, de forma adecuada se puede producir más de un éster de esterol y/o éster de estanol. De forma adecuada, cuando el aceptor de acilo es colesterol uno o más esteroles adicionales o uno o más estanoles también pueden actuar como aceptor de acilo. Por lo tanto, en un aspecto, la presente descripción proporciona un método para la producción in situ de un éster de colesterol y al menos un éster de esterol o estanol en combinación. En otras palabras, la lípido aciltransferasa para algunos aspectos puede

10 transferir un grupo de acilo desde un lípido a colesterol y al menos un esterol adicional y/o al menos un estanol.

En un aspecto, preferiblemente el aceptor de acilo es uno o más de los siguientes: alfa-sitoesterol, beta-sitoesterol, estigmaesterol, ergoesterol y campesterol.

En un aspecto, el aceptor de acilo es preferiblemente colesterol. Cuando se da el caso de que el aceptor de acilo para la lípido aciltransferasa es colesterol, la cantidad de colesterol libre en el alimento se reduce en comparación

15 con el alimento antes de la exposición a la lípido aciltransferasa y/o en comparación con un alimento equivalente que no ha sido tratado con la lípido aciltransferasa.

De forma ventajosa, preferiblemente el nivel de colesterol en el alimento (por ejemplo un producto lácteo, tal como queso, leche, nata, mantequilla o helado, por ejemplo) se reduce en comparación con un alimento de control (por ejemplo un producto lácteo, tal como queso, leche, nata, mantequilla o helado, por ejemplo), por ejemplo que no ha

20 sido tratado con una lípido aciltransferasa).

En otra realización el aceptor de acilo es colesterol. El colesterol puede formar parte de forma natural de un alimento y/o materia alimentaria que comprende el dador de acilo (es decir, el fosfolípido, por ejemplo) - tal como mantequilla, leche o nata, por ejemplo. Alternativamente, se puede añadir el colesterol al alimento y/o materia alimentaria que comprende el dador de acilo (es decir, los fosfolípidos, por ejemplo) - tal como mantequilla, leche o nata -antes,

25 durante o después de la adición de la enzima lípido aciltransferasa.

Los aceptores de acilo de estanol adecuados incluyen fitoestanoles, por ejemplo beta-sitoestanol o ss-sitoestanol.

En un aspecto, preferiblemente el aceptor de acilo de esterol y/o estanol es un esterol y/o estanol diferente de colesterol.

En algunos aspectos, el alimento preparado se puede usar para reducir el colesterol en suero sanguíneo y/o para

30 reducir las lipoproteínas de baja densidad. El colesterol en suero sanguíneo y las lipoproteínas de baja densidad han sido asociados ambos a determinadas enfermedades en humanos, tal como aterosclerosis y/o enfermedad cardíaca, por ejemplo. Por tanto, se contempla que los alimentos preparados se pueden usar para reducir el riesgo de dichas enfermedades.

Por tanto, en un aspecto de la presente descripción proporciona el uso de un alimento según la presente descripción 35 para uso en el tratamiento y/o la prevención de aterosclerosis y/o enfermedad cardíaca.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un medicamento que comprende un alimento.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad en un paciente humano o animal, método que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un alimento.

De forma adecuada, el "aceptor de acilo" de esterol y/o estanol puede encontrarse de forma natural dentro del

40 alimento. Alternativamente, el esterol y/o estanol pueden añadirse al alimento. Cuando se da el caso en que se añade esterol y/o estanol al alimento, el esterol y/o estanol se pueden añadir antes, simultáneamente y/o después de la adición de la lípido transferasa. De forma adecuada, la presente invención puede abarcar la adición de esteroles/estanoles exógenos, particularmente fitoesteroles/fitoestanoles, al alimento antes o simultáneamente a la adición de la enzima.

45 Para algunos aspectos, uno o más esteroles presentes en el alimento se pueden convertir en uno o más estanoles antes o a la vez que se añade la lípido aciltransferasa. Se puede emplear cualquier método adecuado para convertir esteroles a estanoles. Por ejemplo, la conversión se puede llevar a cabo mediante hidrogenación química, por ejemplo. La conversión se puede llevar a cabo antes de la adición de la lípido aciltransferasa o simultáneamente a la adición de la lípido aciltransferasa. De forma adecuada, las enzimas para la conversión de esterol a estanoles se

50 muestran en el documento WO 00/061771.

De forma adecuada, la presente invención se puede emplear para producir ésteres de fitoestanol in situ en un alimento. Los ésteres de fitoestanol presentan una solubilidad incrementada a través de membranas lipídicas, biodisponibilidad y mayores beneficios para la salud (véase, por ejemplo, WO92/99640).

En algunas realizaciones de la presente descripción, el éster de estanol y/o el éster de esterol puede ser un aromatizante y/o agente modificador de la textura. En estos casos, la presente descripción abarca la producción in situ de aromatizantes y/o agentes modificadores de la textura.

Para algunos aspectos de la presente descripción, la lípido aciltransferasa puede utilizar un carbohidrato como

5 aceptor de acilo. El aceptor de acilo de carbohidrato puede ser uno o más de los siguientes: un monosacárido, un disacárido, un oligosacárido o un polisacárido. Preferiblemente, el carbohidrato es uno o más de los siguientes: glucosa, fructosa, fructosa anhidra, maltosa, lactosa, sacarosa, galactosa, xilosa, xilooligosacáridos, arabinosa, maltooligosacáridos, tagatosa, microtecina, ascopirona P, ascopirona T, cortalcerona.

De forma adecuada, el "aceptor de acilo" de carbohidrato puede encontrarse de forma natural dentro del alimento.

10 Alternativamente, el carbohidrato puede añadirse al alimento. Cuando se da el caso en que se añade el carbohidrato al alimento, el carbohidrato se pueden añadir antes, simultáneamente y/o después de la adición de la lípido transferasa.

Los ésteres de carbohidrato pueden actuar como emulsionantes valiosos en alimentos. Así, cuando se da el caso de que la enzima actúa para transferir el grupo acilo a un azúcar, la descripción abarca la producción de un segundo

15 emulsionante in situ en el alimento.

En algunas realizaciones, la lípido aciltransferasa puede utilizar tanto un esterol y/o un estanol como un carbohidrato como aceptor de acilo.

La utilización de lípido aciltransferasa que puede transferir el grupo acilo a un carbohidrato así como a un esterol y/o un estanol es particularmente ventajosa para alimentos que comprenden huevos. En particular, la presencia de

20 azúcares, en particular glucosa, en huevos y productos de huevo a menudo se ve como ventajosa. La yema de huevo puede comprender hasta un 1% de glucosa. Típicamente, el huevo o los productos basados en huevo pueden tratarse con glucosa oxidasa para eliminar parte o toda esta glucosa. Sin embargo, este azúcar no deseado puede eliminarse fácilmente "esterificando" el azúcar para formar un éster de azúcar.

Para algunos aspectos de la presente descripción, la lípido aciltransferasa puede utilizar una proteína como aceptor

25 de acilo. De forma adecuada, la proteína puede ser una o más de las proteínas presentes en un producto alimentario, por ejemplo un producto lácteo y/o un producto cárnico. Simplemente a modo de ejemplo, las proteínas adecuadas pueden ser las encontradas en el cuajo o suero, tal como la lactoglobulina. Otras proteínas adecuadas incluyen ovoalbúmina de huevo, gliadina, glutenina, puroindolina, proteínas de transferencia de lípidos de granos, y miosina de carne.

30 Por tanto, se puede lograr una o más de las siguientes propiedades ventajosas: producción in situ de un emulsionante sin aumentar el contenido de ácidos grasos libres; una reducción de la acumulación de ácidos grasos libres en el alimento; una reducción en los niveles de colesterol libre en el alimento; un aumento de los ésteres de esterol y/o de los ésteres de estanol; una reducción en el colesterol en suero sanguíneo y/o las lipoproteínas de baja densidad; un aumento en los ésteres de carbohidrato; una reducción de carbohidratos libres no deseados.

35 Una ventaja es que el(los) emulsionante(s) es(son) preparado(s) in situ en el alimento sin aumentar, o sin aumentar sustancialmente, el contenido de ácidos grasos libres del alimento. La producción de ácidos grasos libres puede ser perjudicial para los alimentos. En particular, los ácidos grasos libres se han relacionado con la aparición de olores modificados y/o sabores modificados en los alimentos, así como otros efectos negativos, incluyendo un sabor jabonoso en el queso, por ejemplo. Preferiblemente, el método da como resultado la preparación in situ de un

40 emulsionante(s) donde la acumulación de ácidos grasos libres se ve reducida y/o eliminada. Sin pretender establecer ninguna teoría, los ácidos grasos que son eliminados del lípido son transferidos por acción de la lípido aciltransferasa a un aceptor de acilo, por ejemplo un esterol y/o un estanol. Por tanto, el nivel global de ácidos grasos libres en el alimento no aumenta, o lo hace solo en un grado insignificante. Esto supone una importante diferencia con la situación en la que se usan lipasas (E.C. 3.1.1.x) para producir emulsionantes in situ. En particular,

45 el uso de lipasas puede dar como resultado un aumento de la cantidad de ácidos grasos libres en el alimento, lo que puede ser negativo. La acumulación de ácidos grasos libres se reduce y/o se elimina en comparación con la cantidad de ácidos grasos que se habrían acumulado si se hubiera usado una enzima lipasa, en particular una enzima fosfolipasa A, en lugar de la lípido aciltransferasa.

La utilización de una lípido aciltransferasa que puede transferir el grupo acilo a un esterol y/o estanol puede ser

50 particularmente ventajosa para alimentos que comprenden huevos. En particular, se ha descubierto que se puede obtener un producto basado en huevo con propiedades significativamente mejores siguiendo un tratamiento con una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria, en comparación con productos basados en huevo tratados con fosfolipasas convencionales, tales como Lipopan F® (Novozymes A/S, Dinamarca) ), Lecitase Ultra® (Novozymes A/S, Dinamarca) o Lipomod 22 L de Biocatalysts, por ejemplo.

55 En otro aspecto, el aceptor de acilo puede ser ácido ascórbico o comprender ácido ascórbico. Por lo tanto, se puede añadir ácido ascórbico al alimento y/o materia alimentaria, o emulsión acuosa, posiblemente en combinación con un nivel apropiado de glicerol y opcionalmente esterol/estanoles. El éster ascórbico es un antioxidante. El uso de ácido ascórbico puede ser especialmente preferido cuando se usa en un alimento, ya que las propiedades anti-oxidantes

pueden actuar como agente conservante, por ejemplo para prevenir o reducir la oxidación de lípidos. De este modo, el uso de ácido ascórbico en el alimento y/o materia alimentaria puede prevenir o reducir la rancidez del alimento y/o materia alimentaria modificados. Por lo tanto, el uso de ácido ascórbico puede ser particularmente útil para uso en productos lácteos donde la rancidez puede ser un problema, por ejemplo en el queso. La cantidad de ácido ascórbico añadida puede ser muy baja, por ejemplo al nivel de hasta 1/5, tal como hasta 1/10 o hasta 1/100 de las cantidades recomendadas para la adición de glicerol, tal como se define en la presente memoria. Preferiblemente, el rango de ácido ascórbico debería ser 0,02-0,5% p/p. En una realización preferible, el ácido ascórbico se añade en forma de un palmitato de ascorbilo, por ejemplo para uso como anti-oxidante en aceite, y la dosis preferiblemente se encuentra entre 0,1 y 0,2% p/p correspondiente a preferiblemente entre 0,04 y 0,08% p/p de ácido ascórbico.

En una realización preferida, el alimento y/o materia alimentaria modificados tratados comprende lisofosfolípido, preferiblemente lisolecitina, preferiblemente el alimento y/o materia alimentaria tratados según la presente invención comprenden al menos un 0,001% p/p, tal como 0,005% p/p, que incluye al menos 0,01% p/p, lisofosfolípido, preferiblemente lisolecitina, más preferiblemente al menos 0,05% p/p o al menos 0,1% p/p, lisofosfolípido, preferiblemente lisolecitina. También se contemplan mayores concentraciones de lisofosfolípidos, preferiblemente lisolecitina, tal como al menos 0,5% p/p, o al menos 1% p/p de lisofosfolípido, preferiblemente lisolecitina, que incluye al menos 2% p/p, o al menos 5% p/p de lisofosfolípido, preferiblemente lisolecitina.

En una realización preferida el alimento y/o materia alimentaria tratados comprenden uno o más de los siguiente: glicerofosfatilcolina/fosfatiletanolamina, fosfatilinositol y fosfatilserina, preferiblemente el alimento y/o la materia alimentaria tratados comprende al menos un 0,001% p/p de uno o más de los siguientes: glicerofosfatilcolina/fosfatiletanolamina, fosfatilinositol y fosfatilserina, tal como 0,005% p/p, incluyendo al menos 0,01% p/p, más preferiblemente al menos 0,05% p/p o al menos 0,1% p/p, uno o más de los siguientes: glicerofosfatilcolina/fosfatiletanolamina, fosfatilinositol y fosfatilserina. También se contemplan mayores concentraciones de uno o más de los siguientes: glicerofosfatilcolina/fosfatiletanolamina, fosfatilinositol y fosfatilserina, tal como al menos 0,5% p/p, o al menos 1% p/p, que incluye al menos 2% p/p, o al menos 5% p/p.

Es preferible que el alimento y/o materia alimentaria modificados descritos en el anterior párrafo comprendan glicerofosfatilcolina.

Cuando el alimento y/o materia alimentaria modificados comprenden glicerofosfatilcolina, el alimento y/o materia alimentaria modificados puede comprender menos de 0,001% p/p de lisofosfolípido, tal como lisolecitina. Pueden contener menos de 0,0005% p/p de lisofosfolípido, incluyendo la realización en la que el alimento y/o materia alimentaria modificados no comprenden lisofosfolípidos.

En una realización preferida, el alimento y/o composición alimentaria modificados comprenden al menos 0,001% p/p de monoglicéridos, tal como 0,005% p/p, incluyendo al menos 0,01% p/p de monoglicéridos, más preferiblemente al menos 0,05% p/p de monoglicéridos, o al menos 0,1% p/p de monoglicéridos. También se contemplan mayores concentraciones de monoglicéridos, tal como al menos 0,5% p/p de monoglicéridos, o al menos 1% p/p de monoglicéridos, incluyendo al menos 2% p/p de monoglicéridos, o al menos 5% p/p de monoglicéridos.

En una realización preferida, el alimento y/o composición alimentaria modificados comprenden al menos 0,001% p/p de éster de esterol, tal como 0,005% p/p, incluyendo al menos 0,01% p/p de éster de esterol, más preferiblemente al menos 0,05% p/p de éster de esterol, o al menos 0,1% p/p de éster de esterol. También se contemplan mayores concentraciones de éster de esterol, tal como al menos 0,5% p/p de éster de esterol.

En una realización, es decir, cuando el aceptor de acilo es glicerol por ejemplo, el ingrediente funcional se genera mediante una reacción seleccionada de alcoholisis, preferiblemente glicerolisis.

Una temperatura preferida para la modificación del alimento y/o materia alimentaria según los procesos puede depender de varios factores, que incluyen la temperatura óptima y la estabilidad de la enzima usada, el punto de fusión y la viscosidad del alimento y/o materia alimentaria, el volumen de alimento y/o materia alimentaria que se va a modificar, la estabilidad térmica del alimento y/o materia alimentaria.

Por ejemplo, en una realización, la modificación enzimática puede producirse a 10-70ºC, tal como entre 10 a 32ºC, o entre 10 a 34ºC, que incluye entre 10-20ºC, más preferiblemente entre 20-60ºC, tal como entre 30-60ºC, o entre 3660ºC, tal como entre 37-60ºC, que incluye entre 40-60ºC.

Para la modificación enzimática de leche y/o nata, por ejemplo, puede ser preferible usar una temperatura inferior a aproximadamente 50ºC, tal como entre aproximadamente 10 a 34ºC, por ejemplo, o entre aproximadamente 3649ºC, por ejemplo, o entre aproximadamente 40-49ºC, por ejemplo, o entre aproximadamente 40 a 45ºC, por ejemplo, o entre aproximadamente 45-49ºC, por ejemplo. Se pueden usar temperaturas adecuadas de entre 2050ºC, tal como entre 30-40ºC, por ejemplo.

En algunas realizaciones, una ventaja del uso de una lípido aciltransferasa descrita en la presente memoria puede ser que tenga una alta estabilidad térmica y, por tanto, pueda ser usada en el tratamiento de un alimento y/o materia alimentaria a una temperatura en la que la viscosidad de dicho alimento y/o materia alimentaria sea baja. Una elevada estabilidad térmica también puede permitir el uso de menores dosis de enzimas.

De forma adecuada, para algunas realizaciones la lípido aciltransferasa puede tener un óptimo de temperatura de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 70ºC, por ejemplo. De forma adecuada, para algunas realizaciones una lípido aciltransferasa puede tener una estabilidad térmica, medida usando el ensayo PLU, donde dicha aciltransferasa retiene al menos aproximadamente el 25%, tal como al menos aproximadamente el 50%, de su actividad después de 1 hora a 55ºC.

El proceso para el tratamiento del alimento y/o materia alimentaria puede producirse a lo largo de un periodo de tiempo adecuado. Éste puede depender, por ejemplo, de la temperatura usada y de la dosis de enzima. Simplemente a modo de ejemplo, el periodo de tiempo puede ser de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 4 horas, tal como entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 2 horas, o entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 1 hora, o entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 30 minutos, o entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 29 minutos, o entre aproximadamente 31 minutos y aproximadamente 60 minutos. De forma adecuada, el periodo de tiempo puede ser de entre aproximadamente 5 minutos y 1 hora.

La dosis de enzima puede ser cualquier dosis adecuada, por ejemplo la dosis de enzima, cuando se añade en términos de actividad PLU, puede estar entre aproximadamente 1 y 10.000 PLU/kg de alimento y/o materia alimentaria, tal como entre 5 y 5.000 PLU/kg de alimento y/o materia alimentaria, tal como entre 100 y 1.000 PLU/kg de alimento y/o materia alimentaria, ó de 1.000 a 3.000 PLU/kg de alimento y/o materia alimentaria. En algunas realizaciones para una lípido aciltransferasa puede ser preferible de 50 a 1.000 PLU/kg de alimento y/o materia alimentaria.

Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa puede caracterizarse usando los siguientes criterios:

(i): la enzima posee actividad de acil transferasa que puede definirse como actividad de transferencia de éster en la que la parte acilo de un enlace de éster original de un lípido dador de acilo es transferida a un aceptor de acilo para formar un nuevo éster; y

(ii): la enzima comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S.

Preferiblemente, X del motivo GDSX es L ó Y. Más preferiblemente, X del motivo GDSX es L. Por tanto, preferiblemente la enzima comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GSDL.

El motivo GDSX consta de cuatro aminoácidos conservados. Preferiblemente, la serina del motivo es una serina catalítica de la enzima lípido aciltransferasa. De forma adecuada, la serina del motivo GDSX puede estar en una posición que corresponde a la Ser-16 de la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada en Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Abril de 1996, Vol. 178, Nº 7, pág. 2060-2064).

Para determinar si una proteína tiene el motivo GDSX, la secuencia se compara preferiblemente con los perfiles del modelo de Markov ocultos (perfiles HMM) de la base de datos pfam.

Pfam es una base de datos de familias de dominios de proteínas. Pfam contiene alineamientos de secuencia múltiples curados para cada familia, así como perfiles de modelo de Markov oculto (perfiles HMM) para identificar dichos dominios en nuevas secuencias. Se puede encontrar una introducción a Pfam en Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280. Los modelos de Markov ocultos se usan en una serie de bases de datos dirigidas a clasificar proteínas, para una revisión véase Bateman A y Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.

http://www.ncbi.nlm.nlm.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids =12230032&dopt=Abstract

http://www.ncbi.nlm.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids =11752314&dopt-Abstract

Para una explicación detallada de los modelos de Markov ocultos y cómo se aplican en la base de datos Pfam véase Durbin R, Eddy S y Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. El paquete de software Hammer se puede obtener en Washington University, St Louis, EE.UU.

Alternativamente, el motivo GDSX se puede identificar usando el paquete de software Hammer, las instrucciones se proporcionan en Durbin R, Eddy S y Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 y en las referencias incluidas en la misma, y el perfil HMMER2 proporcionado en esta especificación.

Se puede acceder a la base de datos PFAM, por ejemplo, a través de varios servidores que actualmente están localizados en las siguientes páginas web.

http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml

http://pfam.wustl.edu/

http://pfam.jouy.inra.fr/

http://pfam.cgb.ki.se/

La base de datos ofrece un medio de búsqueda en el que se puede introducir una secuencia de proteína. Entonces se analizará la secuencia de proteínas, usando los parámetros por defecto de la base de datos, para determinar la 5 presencia de dominios Pfam. El dominio GDSX es un dominio establecido en la base de datos y como tal se reconocerá su presencia en cualquier secuencia de búsqueda.

Se puede obtener un alineamiento múltiple, que incluye Aeromonas salmonicida o Aeromonas hydrophila de forma:

a) manual.

Obtener un alineamiento de la proteína de interés con la secuencia de consenso Pfam00657 y obtener un 10 alineamiento de P10480 con la secuencia de consenso Pfam00657 siguiendo el procedimiento descrito antes;

o

b) a través de la base de datos. Tras identificar la secuencia de consenso Pfam00657, la base de datos ofrece la opción de mostrar un alineamiento de la secuencia de búsqueda al alineamiento de siembra de la secuencia de consenso Pfam00657. P10480 es parte de dicho alineamiento de siembra y se indica como GCAT_AERHY. Tanto la

15 secuencia de búsqueda como P10480 se mostrarán en la misma ventana.

La secuencia de referencia de Aeromonas hydrophila:

Los residuos de lipasa GDSX de Aeromonas hydrophila están numerados en el archivo NCBI P10480, los números en el texto se refieren a los números dados en el archivo que se usa para determinar residuos de aminoácido específicos que, en una realización preferida, están presentes en las enzimas lípido aciltransferasa.

20 Se llevó a cabo el alineamiento Pfam (Figura 33 y 34):

Se pueden reconocer los siguientes residuos conservados y en una realización preferida pueden estar presentes en las enzimas para uso en las composiciones y métodos;

Bloque 1 - bloque GDSX

25 Bloque 2 - bloque GANDY

Bloque 3 - bloque HPT

Donde 'hid' significa un residuo hidrofóbico seleccionado entre Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, 30 Phe.

Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa para uso en las composiciones/métodos de la descripción puede alinearse usando la secuencia de consenso Pfam00657.

Preferiblemente, una coincidencia positiva con el perfil de modelo Markov oculto (perfil HMM) de la familia de domino pfam00657 indica la presencia del dominio GDSL ó GDSX.

35 Preferiblemente, cuando se alinea con la secuencia de consenso Pfam00657 la lípido aciltransferasa para uso en las composiciones/métodos de la descripción tiene al menos uno, preferiblemente más de uno, preferiblemente más de dos, de los siguientes, un bloque GDSX, un bloque GANDY, un bloque HPT. De forma adecuada, la lípido aciltransferasa puede tener un bloque GDSX y un bloque GANDY. Alternativamente, la enzima puede tener un bloque GDSX y un bloque HPT. Preferiblemente, la enzima comprende al menos un bloque GDSX.

40 Preferiblemente, los residuos del motivo GANDY se seleccionan entre GANDY, GGNDA, GGNDL, más preferiblemente GANDY.

Preferiblemente, cuando se alinea con la secuencia de consenso Pfam00657, la enzima para uso en las composiciones/métodos de la descripción tiene al menos uno, preferiblemente más de uno, preferiblemente más de dos, preferiblemente más de tres, preferiblemente más de cuatro, preferiblemente más de cinco, preferiblemente más de seis, preferiblemente más de siete, preferiblemente más de ocho, preferiblemente más de nueve, preferiblemente más de diez, preferiblemente más de once, preferiblemente más de doce, preferiblemente más de trece, preferiblemente más de catorce de los siguientes residuos de aminoácido en comparación con la secuencia de polipéptidos de referencia de A. hydrophilia , es decir la SEQ ID No. 32: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His

El dominio GDSX de pfam00657 es un identificador único que distingue proteínas que poseen dicho dominio de otras enzimas.

La secuencia de consenso pfam00657 se presenta en la Figura 1 como SEQ ID No. 1. Ésta se deriva de la identificación de la familia pfam 00657, base de datos versión 6, que también puede referirse en la presente memoria como pfam00657.6.

La secuencia de consenso puede actualizarse usando nuevas versiones de la base de datos pfam.

Por ejemplo, las Figuras 33 y 34 muestran el alineamiento pfam de la familia 00657, de la base de datos versión 11, que también puede referirse en la presente memoria como pfam00657.11.

La presencia de los bloques GDSX, GANDY y HPT se da en la familia pfam 00657 en ambas versiones de la base de datos. Las versiones futuras de la base de datos pfam pueden usarse para identificar la familia pfam 00657.

(i): la enzima posee actividad de acil transferasa que puede definirse como actividad de transferencia de éster en la que la parte acilo de un enlace de éster original de un lípido dador de acilo es transferida a un aceptor de acilo para formar un nuevo éster,

(ii): la enzima comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S;

(iii) la enzima comprende His-309 o comprende un residuo de histidina en una posición que corresponde a His-309 en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada en la Figura 2 (SEQ ID No. 2 ó SEQ ID No. 32).

Preferiblemente, el residuo de aminoácido del motivo GDSX es L.

En la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32 los primeros 18 residuos de aminoácido forman una secuencia señal. La His309 de la secuencia de longitud completa, que es la proteína que incluye la secuencia señal, es igual a la His-291 de la parte madura de la proteína, es decir, la secuencia sin la secuencia señal.

Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa comprende la siguiente triada catalítica: Ser-34, Asp-306 e His-309,

: o comprende un residuo de serina, un residuo de ácido aspártico y un residuo de histidina, respectivamente, en las posiciones que corresponden a Ser-34, Asp-306 e His-309 de la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada en la Figura 2 (SEQ ID No. 2) o en la Figura 28 (SEQ ID No. 32). Como se ha indicado anteriormente, en la secuencia mostrada en la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32 los primeros 18 residuos de aminoácido forman una secuencia señal. Ser-34, Asp-306 e His 309 de la secuencia de longitud completa, que es la proteína que incluye la secuencia señal, son iguales a Ser-16, Asp-288 e His-291 de la parte madura de la proteína, es decir, la secuencia sin la secuencia señal. En la secuencia de consenso pfam00657, tal como se da en la Figura 1 (SEQ ID No. 1), los residuos del centro activo corresponden a Ser-7, Asp-345 e His-348.

(i): la enzima posee actividad de acil transferasa que puede definirse como actividad de transferencia de éster en la que la parte acilo de un enlace de éster original de un primer lípido dador de acilo es transferida a un aceptor de acilo para formar un nuevo éster; y

(ii): la enzima comprende al menos Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-306 e His-309, o comprende residuos de glicina, ácido aspártico, serina, ácido aspártico e histidina en las posiciones correspondientes a Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp306 e His-309, respectivamente, en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada en la Figura 2 (SEQ ID No. 2) o la Figura 28 (SEQ ID No. 32).

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa se puede obtener, obtenida preferiblemente a partir de microorganismos de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención se puede obtener, obtenida preferiblemente de uno o más de los siguientes organismos: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis y Candida parapsilosis.

En un aspecto, la enzima lípido aciltransferasa preferiblemente se puede obtener, obtenida preferiblemente a partir de uno o más de Aeromonas hydrophila o Aeromonas salmonicida.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa puede estar codificada por una cualquiera de las siguientes secuencias de nucleótidos:

(a) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 7 (véase la Figura 9);

(b) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 8 (véase la Figura 10);

(c) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 9 (véase la Figura 11);

(d) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 10 (véase la Figura 12);

(e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 11 (véase la Figura 13);

(f) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 13 (véase la Figura 15);

(g) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 (véase la Figura 17);

(h) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 (véase la Figura 19);

(i) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 (véase la Figura 21);

(j) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27 (véase la Figura 23);

(k) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29 (véase la Figura 25);

(l) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 (véase la Figura 27);

(m) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 33 (véase la Figura 29);

(n) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 35 (véase la Figura 31);

(o) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 46 (véase la Figura 95);

(p) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 75 (véase la Figura 87);

(q) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 77 (véase la Figura 89);

(r) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 78 (véase la Figura 90);

(s) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 81 (véase la Figura 93);

(t) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 83 (véase la Figura 37);

(u) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 87 (véase la Figura 99);

(v) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 88 (véase la Figura 100);

(w) o una secuencia de nucleótidos que tiene un 70% o más, preferiblemente un 75% o más, de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 87 ó SEQ ID No. 88.

De forma adecuada, la lípido aciltransferasa codificada por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 83, SEQ ID No.87 ó SEQ ID No. 88, o por una secuencia de nucleótidos que tiene un 70% o más, preferiblemente un 75% o más, de identidad con respecto a una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 83, SEQ ID No.87 ó SEQ ID No. 88, puede ser modificada post-transcripcionalmente y/o post-traduccionalmente.

5 De forma adecuada, la secuencia de nucleótidos puede tener un 80% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más, e incluso más preferiblemente un 95% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 81, SEQ. ID No. 83,

10 SEQ ID No.87 ó SEQ ID No. 88.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima lípido aciltransferasa para su uso en los métodos y usos de la presente descripción es una secuencia de nucleótidos que tiene un 70% o más, preferiblemente un 75% o más, de identidad con respecto a una cualquiera de las secuencias mostradas como: SEQ ID No. 88, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 34. De forma adecuada, la secuencia de

15 nucleótidos puede tener un 80% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más e incluso más preferiblemente un 95% o más, de identidad con respecto a una cualquiera de las secuencias mostradas como: SEQ ID No. 88, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 34.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos de la presente invención es una secuencia de nucleótidos que tiene un 70% o más, un 75% o más,

20 un 80% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más, e incluso más preferiblemente un 95% o más, de identidad con respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID No. 88.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa puede comprender una o más de las siguientes secuencias de aminoácido:

(i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2 (véase la Figura 2)

25 (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3 (véase la Figura 3)

(iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4 (véase la Figura 4)

(iv): la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 5 (véase la Figura 5)

(v): la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6 (véase la Figura 6)

(vi): la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12 (véase la Figura 14)

30 (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20 (Figura 16)

(viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22 (Figura 18)

(ix): la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24 (Figura 20)

(x): la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26 (Figura 22)

(xi): la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28 (Figura 24)

35 (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30 (Figura 26)

(xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32 (Figura 28)

(xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34 (Figura 30)

(xv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 62 (Figura 74)

(xvi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90 (Figura 102) o una secuencia de aminoácidos que

40 tiene un 75% o más de identidad con respecto a una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 62 ó SEQ ID No. 90.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa puede comprender la secuencia de aminoácidos mostrada

45 como SEQ ID No. 2 ó como SEQ ID No. 3 ó SEQ ID No. 32 ó SEQ ID No. 34 ó SEQ ID No. 62 ó SEQ ID No. 90 ó puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 75% o más, preferiblemente un 80% o más, preferiblemente un 85% o más, preferiblemente un 90% o más, preferiblemente un 95% o más, de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2 ó la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3 ó la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32 ó la secuencia de aminoácidos mostrada como

SEQ ID No. 34 ó la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.62 ó la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90.

Para los propósitos de la presente descripción el grado de identidad se basa en el número de elementos de secuencia que son iguales. El grado de identidad para las secuencias de aminoácidos puede determinarse de forma adecuada por medio de programas de ordenador conocidos en la técnica, tal como Vector NTI 10 (Invitrogen Corp.). Para el alineamiento por pares la puntuación usada preferiblemente es BLOSUM62 con una penalización de apertura de Gap de 10,0 y una penalización de extensión de Gap de 0,1.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más e incluso más preferiblemente un 95% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SED. ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 ó SEQ ID No. 34.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa puede comprender una o más de SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34 ó SEQ ID No. 62 antes de ser modificada post-traduccionalmente. La presente descripción también abarca el uso de una enzima lípido aciltransferasa que ha sido modificada post-traduccionalmente, donde la enzima traducida originalmente o pro-enzima comprende una o más de SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34 ó SEQ ID No. 62.

En una realización la enzima lípido aciltransferasa puede ser un fragmento de una o más de las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 62 ó SEQ ID No. 90. En una realización preferiblemente el fragmento de secuencia de aminoácidos tiene un 70% o más, preferiblemente un 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 62 ó SEQ ID No. 90 cuando se determina sobre la totalidad de la secuencia mostrada como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 62 ó SEQ ID No. 90, respectivamente.

En una realización, de forma adecuada la lípido aciltransferasa comprende (o consiste en) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No. 90 ó comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98%, de identidad con la SEQ ID No. 90.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácido:

(a): una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácido 1-100 de la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32;

(b): una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácido 101-200 de la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32;

(c): una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácido 201-300 de la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32; o

(d): una secuencia de aminoácidos que tiene un 75% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más, incluso más preferiblemente un 95% o más, de identidad con respecto a una cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas en los anteriores apartados (a)-(c).

(a): una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácido 28-39 de la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32;

(b): una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácido 77-88 de la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32;

(c): una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácido 126-136 de la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32;

(d): una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácido 163-175 de la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32;

(e): una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácido 304-311 de la SEQ ID No. 2 ó la SEQ ID No. 32; o

5 (f) una secuencia de aminoácidos que tiene un 75% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más, incluso más preferiblemente un 95% o más, de identidad con respecto a una cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas en los anteriores apartados (a)-(e).

En un aspecto, la lípido aciltransferasa para uso en el método y usos de la presente descripción puede ser la lípido aciltransferasa de Candida parapsilosis como se muestra en el documento EP 1 275 711. Por tanto, en un aspecto la

10 lípido aciltransferasa para uso en el método y usos de la presente descripción puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID No. 63 ó la SEQ ID No. 64.

A modo de referencia, la lípido aciltransferasa para uso en el método y usos de la presente descripción puede ser una lípido acil transferasa (lípido aciltransferasa) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 62, o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90 ó una secuencia de aminoácidos que tiene

15 un 75% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más, incluso más preferiblemente un 95% o más, incluso más preferiblemente un 99% o más, de identidad con la SEQ ID No. 62 ó la SEQ ID No. 90. Esta enzima puede considerarse una enzima variante.

En un aspecto, la lípido aciltransferasa puede ser una lecitina:colesterol aciltransferasa (LCAT) o sus variantes (por ejemplo una variante preparada mediante evolución molecular).

20 En la técnica se conocen LCAT adecuadas y se pueden obtener a partir de uno o más de los siguientes organismos, por ejemplo: mamíferos, rata, arroz, pollos, Drosophila melanogaster, plantas, que incluyen Arabidopsis y Oryza sativa, nemátodos, hongos y levadura.

En una realización, la enzima lípido transferasa puede ser la lípido aciltransferasa que puede obtenerse, obtenida preferiblemente, a partir de las cepas de E. coli TOP 10 que alberga pPet12aAhydro y pPet12aASalmo depositada

25 por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001 Copenague K, Dinamarca, bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos de Procedimientos de Patentes en la National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St Machar Street, Aberdeen, Escocia, GB el 22 de diciembre de 2003, con los números de acceso NICMB 41204 y NCIMB 41205, respectivamente.

Las lípido aciltransferasas altamente preferidas (en particular una fosfolípido glicerol acil transferasa) para uso en los

30 métodos de la descripción incluyen las aisladas de Aeromonas spp., preferiblemente Aeromonas hydrophila o A. salmonicida, lo más preferible A. salmonicida. Las lípido acil transferasas más preferidas para uso en la presente descripción son codificadas por una de las SEQ ID No. 2, 3, 32, 34, 62 ó 90. El especialista reconocerá que es preferible que los péptidos señal de la acil transferasa sean sometidos a ruptura durante la expresión de la transferasa. Los péptidos señal de SEQ ID No. 2, 3, 32, 34, 62 y 90 son los aminoácidos 1-18. Por tanto, las

35 regiones más preferidas son los aminoácidos 19-335 de SEQ ID No. 32 y SEQ ID No. 2 (A. hydrophilia) y los aminoácidos 19-336 de SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 62 y SEQ ID No. 90 (A. salmonicida). Cuando se usan para determinar la homología de identidad de las secuencias de aminoácidos, es preferible que los alineamientos tal como se describen en la presente memoria usen la secuencia madura. La secuencia madura puede ser a la que se ha quitado el péptido señal y/o puede ser una que ha sido modificada post-traduccionalmente.

40 Por lo tanto, las regiones más preferidas para determinar la homología (identidad) son los aminoácidos 19-335 de SEQ ID No. 32 y 2 (A. hydrophilia) y los aminoácidos 19-336 de SEQ ID No. 3, 34 y 62 (A. salmonicida). Las SEQ ID No. 73 y 74 son secuencias proteicas "maduras" (es decir, sin péptido señal) de las lípido acil transferasas altamente preferidas de A. hydrophilia y A. salmonicida respectivamente. Las SEQ ID No. 73 y 74 pueden sufrir una modificación post-traduccional adicional o no.

45 También se puede aislar una lípido acil transferasa para uso en la descripción a partir de Thermobifida, preferiblemente T. fusca, lo más preferiblemente la codificada por la SEQ ID No. 67.

También se puede aislar una lípido acil transferasa para uso en la descripción a partir de Streptomyces, preferiblemente S. avermitis, lo más preferiblemente la codificada por la SEQ ID No. 71. Otras posibles enzimas para uso en la presente descripción a partir Streptomyces incluyen las codificadas por las SEQ ID No. 4, 5, 20, 22, 24, 26,

50 28, 30, 70, 72.

También se puede aislar una enzima para uso en la descripción a partir de Corynebacterium, preferiblemente C efficiens, lo más preferiblemente aquella codificada por la SEQ ID No. 68.

De forma adecuada, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 76, 77, 79, 80, 82, 55 84 ó 86, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ó 98%

de identidad con las mismas, o que es codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEQ ID No. 75, 78, 81, 83, 85 ó 87, o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96% 97% ó 98% de identidad con las mismas.

En una realización, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos según la presente invención 5 preferiblemente es una lípido aciltransferasa codificada por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 75;

b) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 75 mediante degeneración del código genético; y

10 c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 75.

En una realización, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos preferiblemente es una lípido aciltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID No. 76 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad con la misma.

15 En una realización adicional, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 76, 77, 79, 80, 82, 84 ó 86, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ó 98% de identidad con las mismas, o codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEQ ID No. 78, 81, 83, 85 ó 87, o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, 75%,

20 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ó 98% de identidad con las mismas.

En una realización adicional, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 77, 79, 80, 84 ó 86, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ó 98% de identidad con las mismas, para los usos descritos en la presente memoria.

25 En una realización adicional, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 77, 79 ó 86, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ó 98% de identidad con las mismas, para los usos descritos en la presente memoria.

Más preferiblemente, en una realización la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos puede ser una

30 lípido aciltransferasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 86 ó una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ó 98% de identidad con la misma.

En otra realización, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos puede ser una lípido aciltransferasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 82 ó 83, o una secuencia de aminoácidos que

35 tiene al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ó 98% de identidad con las mismas.

En otra realización, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos puede ser una lípido aciltransferasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 80, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ó 98% de identidad con la misma.

En una realización, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos y usos puede ser una codificada por un ácido 40 nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la 45 secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 75.

En una realización, la lípido aciltransferasa puede ser una lípido aciltransferasa que puede obtenerse, obtenida preferiblemente a partir de las cepas L130 ó L131 de Streptomyces depositadas por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001 Copenague K, Dinamarca, bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos de Procedimiento de Patente en la National Collection of Industrial,

50 Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Escocia, GB el 25 de junio de 2004, con los números de acceso NCIMB 41226 y NCIMB 41227, respectivamente.

Las lípido aciltransferasas adecuadas para uso y/o en los métodos de la presente descripción pueden comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos y/o estar codificadas por una de las siguientes secuencias de nucleótidos:

un polinucleótido que codifica una lípido aciltransferasa (SEQ ID No. 62);

una secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa (SEQ ID No. 63);

un polinucleótido que codifica una lípido aciltransferasa (SEQ ID No. 90).

Una enzima lípido acil-transferasa adecuada para uso en los métodos de la descripción también puede identificarse mediante alineamiento con la secuencia L131 (SEQ ID No. 76) usando Align X, el algoritmo de alineamiento de pares Clustal W de VectorNTI usando los parámetros por defecto.

Un alineamiento de la L131 y homólogos de S. avermitilis y T. fusca ilustra que la conservación del motivo GDSx (GDSY en L131 y S.avermitilis y T. fusca), la caja GANDY, que es GGNDA o GGNDL, y el bloque HPT (considerado como la histadina catalítica conservada). Estos tres bloques conservados están resaltados en la Figura 103.

Cuando se alinea con la secuencia de consenso de pfam Pfam00657 y/o la secuencia L131 descrita en la presente memoria (SEQ ID No. 76), es posible identificar tres regiones conservadas, el bloque GDSx, el bloque GANDY y el bloque HTP.

Cuando se alinean con la secuencia de consenso pfam Pfam00657 y/o la secuencia L131 descrita en la presente memoria (SEQ ID No 76)

La enzima lípido acil-transferasa de la descripción, o para uso en los métodos de la descripción, preferiblemente tiene un motivo GDSx, más preferiblemente un motivo GDSx seleccionado entre GDSL o GDSY, y/o

ii) La enzima lípido acil-transferasa de la descripción, o para uso en los métodos de la descripción, preferiblemente tiene un bloque GANDY, más preferiblemente un bloque GANDY que comprende un amino GGNDx, más preferiblemente GGNDA o GGNDL, y/o

iii) La enzima de la descripción, o para uso en los métodos de la descripción, preferiblemente tiene un bloque HTP.

y preferiblemente

iv) La enzima lípido acil-transferasa de la descripción, o para uso en los métodos de la descripción, preferiblemente tiene un motivo GDSx o GDSY, y un bloque GANDY que comprende amino GGNDx, preferiblemente GGNDA o GGNDL, y un bloque HTP (histadina conservada).

Lípido acil transferasa variante

En una realización preferida, la lípido acil transferasa es una lípido acil transferasa variante. Los métodos adecuados para la producción de lípido acil transferasas para uso en la descripción se describen en el documento WO2005/066347. Las variantes que presentan una actividad incrementada sobre fosfolípidos, tal como una actividad hidrolítica incrementada y/o una actividad de transferasa incrementada, preferiblemente una actividad de transferasa incrementada con fosfolípidos.

Preferiblemente, la lípido aciltransferasa variante se prepara mediante una o más modificaciones de aminoácidos de las lípido acil transferasas definidas en la presente memoria.

De forma adecuada, la lípido aciltransferasa para uso en los métodos o usos de la presente descripción puede ser una lípido aciltransferasa variante, en cuyo caso la enzima puede caracterizarse porque la enzima comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S, y donde la enzima variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de partida en uno o más de los residuos de aminoácido definidos en el conjunto 2 ó el conjunto 4 ó el conjunto 6 ó el conjunto 7 (tal como se definen en la solicitud de patente WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria).

Por ejemplo, la enzima lípido aciltransferasa variante para uso en los métodos o usos de la presente descripción puede caracterizarse porque la enzima comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S, y donde la enzima variante comprende una o más modificaciones de aminoácido en comparación con una secuencia de partida en uno cualquiera, o más de uno, de los residuos de aminoácido detallados en el conjunto 2 o el conjunto 4 o el conjunto 6 o el conjunto 7 (como se define en el documento WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria) identificada porque dicha secuencia de partida está estructuralmente alineada con el modelo estructural de P10480 definido en la presente memoria, que se obtiene preferiblemente mediante alineamiento estructural de las coordinadas de estructura de cristal P10480 con 1IVN.PDB y/o 1DEO.PDB como se define en el documento WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria.

En una realización, la enzima lípido aciltransferasa variante para uso en los métodos o usos de la presente descripción puede caracterizarse porque la enzima comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S, y donde la enzima variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de partida en uno cualquiera de los residuos de aminoácido mostrados en el conjunto 2 identificado cuando dicha secuencia de partida se alinea con la secuencia de consenso pfam (SEQ ID No. 1 - Figura 2) y modificada según un modelo estructural de P10480 para asegurar el mejor ajuste de solapamiento, tal como se define en el documento WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa variante puede comprender una secuencia de aminoácidos, secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 71 ó SEQ ID No. 72, excepto por una o más modificaciones de aminoácidos en uno cualquiera, o más, de los residuos de aminoácido definidos en el conjunto 2 o en el conjunto 4 o en el conjunto 6 o en el conjunto 7 (tal como se define en el documento WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria) identificada mediante alineamiento de secuencia con la SEQ ID No. 73.

Alternativamente, la enzima lípido aciltransferasa variante puede ser una enzima variante que comprende una secuencia de aminoácidos, secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 71 ó SEQ ID No. 72, excepto por una o más modificaciones en uno cualquiera, o más, de los residuos de aminoácido definidos en el conjunto 2 o en el conjunto 4 o en el conjunto 6 o en el conjunto 7 tal como se define en el documento WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria, identificada porque dicha secuencia de partida es alineada estructuralmente con el modelo estructural de P10480 definido en la presente memoria, que se obtiene preferiblemente mediante alineamiento estructural de las coordenadas de estructura cristalina de P10480 con 1IVN.PDB y/o 1DEO.PDB, como se muestra en la solicitud de patente WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria.

De forma alternativa, la enzima lípido aciltransferasa variante puede ser una enzima variante que comprende una secuencia de aminoácidos, secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 71 ó SEQ ID No. 72, excepto por una o más modificaciones de aminoácidos en uno cualquiera, o más, de los residuos de aminoácido mostrados en el conjunto 2 identificado cuando dicha secuencia de partida es alineada con la secuencia de consenso pfam (SEQ ID No. 1) y modificada según un modelo estructural de P10480 para asegurar el mejor ajuste de solapamiento tal como se muestra en el documento WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria.

Preferiblemente, la enzima de partida es una enzima que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 73 y/o SEQ ID No. 34 y/o SEQ ID No. 74, o que es homóloga a ella.

Preferiblemente, la enzima variante es una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos, secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID No. 73 ó SEQ ID No. 74, excepto por una o más modificaciones de aminoácidos en uno cualquiera, o más, de los residuos de aminoácido definidos en el conjunto 2 o en el conjunto 4 o en el conjunto 6 o en el conjunto 7 tal como se define en el documento WO2005/066347 y a continuación en la presente memoria.

Definición de Conjuntos

Conjunto de aminoácidos 1:

Conjunto de aminoácidos 1 (nótese que éstos son los aminoácidos de 1IVN - Figura 53 y Figure 54) Gly8, Asp9, Ser10, Leu1 1, Ser12, Tyr15, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75, Leu76, Gln106, Ile107, Arg108, Leu109, Pro110, Tyr113, Phe121, Phe139, Phe140, Met141, Tyr145, Met151, Asp154, His157, Gly155, Ile156, Pro158

Los motivos altamente conservados, tales como GDSx y residuos catalíticos, fueron des-seleccionados del conjunto 1 (residuos subrayados). Para evitar dudas, el conjunto 1 define los residuos de aminoácido a menos de 10Å del átomo de carbono central de un glicerol en el centro activo del modelo 1IVN.

Conjunto de aminoácidos 2:

Conjunto de aminoácidos 2 (nótese que la numeración de los aminoácidos se refiere a los aminoácidos en la secuencia madura P 10480) Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val1 12, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289 y Val290.

Tabla de residuos seleccionados en el Conjunto 1 comparados con el Conjunto 2:

Modelo IVN: Número de Residuo de secuencia madura P10480

IVN: Homólogo A.hyd

PFAM: Estructura

Gly8: Gly32

Asp9: Asp33

Ser10: Ser34

Leu11: Leu35 Leu17

Ser12: Ser36 Ser18

Lys22

Met23

Tyr15: Gly58 Gly40

Gly44: Asn98 Asn80

Asp45: Pro99 Pro81

Thr46: Lys100 Lys82

Asn87

Asn88

Glu69: Trp129 Trp111

Leu70: Val130 Val112

Gly71: Gly131

Gly72: Ala132 Ala114

Asn73: Asn133

Asp74: Asp134

Gly75: Tyr135 Tyr117

Leu76: Leu136 Leu118

Gln106: Pro174 Pro156

Ile107: Gly177 Gly159

Arg108: Gln178 Gln160

Leu109: Asn179 Asn161

Pro110: 180 a 190 Pro162

Tyr113: Ser163

Ala164

Arg165

Ser166

Gln167

Lys168

Val169

Val170

Glu171

Ala172

Phe121: His198 Tyr197 Tyr179

His198: His180

Modelo IVN: Número de Residuo de secuencia madura P10480

IVN: Homólogo A.hyd

PFAM: Estructura

Asn199: Asn181

Phe139: Met227 Met209

Phe140: Leu228 Leu210

Met141: Arg229 Arg211

Tyr145: Asn233 Asn215

Lys284

Met151: Met303 Met285

Asp154: Asp306

Gly155: Gln307 Gln289

Ile156: Val308 Val290

His157: His309

Pro158: Pro310

Conjunto de aminoácidos 3:

El conjunto de aminoácidos 3 es idéntico al conjunto 2 pero se refiere a la secuencia codificadora de Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 3), es decir, los números de los residuos de aminoácido son 18 números mayores en el 5 conjunto 3, como refleja la diferencia entre la numeración de aminoácidos de la proteína madura (SEQ ID No. 73) y la proteína que incluye una secuencia señal (SEQ ID No. 36).

Las proteínas maduras de GDSX de Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 3) y Aeromonas hydrophila (SEQ ID No.73) difieren en cinco aminoácidos. Éstos son Thr3Ser, Gln182Lys, Glu309Ala, Ser310Asn, Gly318-, donde el residuo de salmonicida se enumera primero y el residuo de hydrophila se enumera último. Las proteínas de Thehydrophila

10 tienen sólo 317 aminoácidos de longitud y carecen de un residuo en la posición 318. El GDSX de Aeromonas salmonicidae tiene una actividad considerablemente mayor sobre lípidos polares tales como sustratos galactolipídicos que la proteína de Aeromonas hydrophila. Se llevó a cabo un escaneo de sitio para las cinco posiciones de aminoácido.

Conjunto de aminoácidos 4:

15 El conjunto de aminoácidos 4 es S3, Q 182, E309, S310 y -318.

Conjunto de aminoácidos 5:

F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157 N, Y226F, D228N, Y230F.

Conjunto de aminoácidos 6:

El conjunto de aminoácidos 6 es Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88, Trp111,

20 Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318.

La numeración de los aminoácidos del conjunto 6 se refiere a los residuos de aminoácido de P1 0480 (SEQ ID No. 36) - se pueden determinar los aminoácidos correspondientes en otras cadenas principales de secuencias mediante

25 alineamiento de homología y/o alineamiento estructural con P10480 y/o 1IVN.

Conjunto de aminoácidos 7:

El conjunto de aminoácidos 7 es Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, 30 Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318, Y30X (donde X se selecciona entre A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W), Y226X (donde X se selecciona entre A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W), Y230X (donde X se selecciona entre A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W), S18X (donde X

se selecciona entre A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W ó Y), D157X (donde X se selecciona entre A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y).

La numeración de los aminoácidos del conjunto 7 se refiere a los residuos de aminoácido de P10480 (SEQ ID No. 36) - se pueden determinar los aminoácidos correspondientes en otras cadenas principales de secuencias mediante alineamiento de homología y/o alineamiento estructural con P10480 y/o 1IVN.

De forma adecuada, la enzima variante comprende una o más de las siguientes modificaciones de aminoácidos con respecto a la enzima de partida:

S3E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T ó G

E309Q, R ó A, preferiblemente Q ó R

-: 318Y, H, S ó Y, preferiblemente Y.

Preferiblemente, X del motivo GDSX es L. Por tanto, preferiblemente la enzima de partida comprende el motivo de aminoácidos GDSL.

De forma adecuada, dicha primera lípido aciltransferasa de partida puede comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 71 ó SEQ ID No. 72.

De forma adecuada, dicha segunda lípido aciltransferasa relacionada puede comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 89, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 71 ó SEQ ID No. 72.

La enzima variante comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a la enzima de partida. En algunas realizaciones, la enzima variante puede comprender al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 4, preferiblemente al menos 5, preferiblemente al menos 6, preferiblemente al menos 7, preferiblemente al menos 8, preferiblemente al menos 9, preferiblemente al menos 10, modificaciones de aminoácido con respecto a la enzima de partida.

Cuando se refiere a residuos de aminoácido específicos en la presente memoria la numeración es la obtenida del alineamiento de la secuencia variante con la secuencia de referencia mostrada como SEQ ID No. 73 ó SEQ ID No.

74.

En un aspecto, preferiblemente la enzima variante comprende una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W ó Y; y/o L17A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o S18A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W ó Y; y/o K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S; T, V, W ó Y; y/o M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o Y30A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W; y/o G40A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o W111A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o

V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W ó Y; y/o A114C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o Y117A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W; y/o L118A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o

5 P 156A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o G159A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o Q160A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W ó Y; y/o N161A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o

10 P 1 62A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o S163A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W ó Y; y/o A164C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o R165A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W ó Y; y/o S166A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W ó Y; y/o

15 Q167A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W ó Y; y/o K168A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o V169A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W ó Y; y/o V170A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W ó Y; y/o E171A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o

20 A172C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W; y/o H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o N181A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W ó Y, preferiblemente K; y/o

25 M209A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o L210 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o R211A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o N215 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o Y226A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W; y/o

30 Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W; y/o K284A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o M285A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W ó Y; y/o V290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W ó Y; y/o

35 E309A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; y/o S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W ó Y.

Además de, o alternativamente, puede haber una o más extensiones C-terminales. Preferiblemente, la extensión Cterminal adicional está compuesta por uno o más aminoácidos alifáticos, preferiblemente un aminoácido no polar, más preferiblemente I, L, V ó G. Así, la presente descripción proporciona además una enzima variante que comprende una o más de las siguientes extensiones C-terminales: 318I, 318L, 318V, 318G.

5 Las enzimas variantes preferidas pueden presentar una actividad hidrolítica disminuida frente a fosfolípidos, tal como

fosfatidilcolina (PC), también pueden presentar una actividad de transferasa incrementada a partir de un fosfolípido. Las enzimas variantes preferidas pueden presentar una actividad de transferasa incrementada a partir de un fosfolípido, tal como fosfatidilcolina (PC), también pueden presentar una actividad hidrolítica incrementada frente a un fosfolípido.

10 La modificación de uno o más de los siguientes residuos puede dar como resultado una enzima variante que tiene una actividad de transferasa absoluta incrementada frente a fosfolípido:

S3, D157, S310, E309, Y179, N215, K22, Q289, M23, H180, M209, L210, R211, P81, V112, N80, L82, N88, N87 Las modificaciones específicas preferidas que pueden proporcionar una enzima variante que tiene una actividad de transferasa mejorada a partir de un fosfolípido pueden seleccionarse entre una o más de las siguientes:

15 S3A, C, D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T,V,W ó Y; preferiblemente N, E, K, R, A, P ó M, lomás preferiblemente S3A D57A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y ; preferiblemente D157S, R, E, N, G, T, V, Q, K ó C S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W ó Y; preferiblemente S310T -318 E E309A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W ó Y; preferiblemente E309 R, E, L, R ó A 20 Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V ó W; preferiblemente Y 179 D, T, E, R, N, V, K, Q ó S, más preferiblemente E, R, N, V, K ó Q N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente N215 S, L, R ó Y K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente K22 E, R, C ó A Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente Q289 R, E, G, P ó N

25 M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente M23 K, Q, L, G,T ó S H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente H180 Q, R ó K M209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente M209 Q, S, R, A, N, Y, E, V ó L

L210A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente L210 R, A, V, S, T, I, W ó M R211A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W ó Y; preferiblemente R211T

30 P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente P81G V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W ó Y; preferiblemente V112C N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente N80 R, G, N,

D, P, T, E, V, A ó G L82A, C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente L82N, S ó E

35 N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente N88C N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W ó Y; preferiblemente N87M ó G La modificación preferida de uno o más de los siguientes residuos da como resultado una enzima variante que tiene

una actividad de transferasa absoluta incrementada frente a fosfolípido: S3 N, R, A, G

40 M23 K, Q, L, G, T, S H180 R L82 G

Y179E, R, N, V, K ó Q

E309 R, S, L ó A

Una modificación preferida es N80D. Éste es el caso particular cuando se usa la secuencia de referencia SEQ ID No. 74. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente descripción, la lípido aciltransferasa según la presente descripción comprende la SEQ ID No. 74 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 75% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más, incluso más preferiblemente un 95% o más, incluso más preferiblemente un 98% o más, o incluso más preferiblemente un 99% o más, de identidad con respecto a la SEQ ID No. 74.

Como se ha indicado anteriormente, cuando se refiere a residuos de aminoácido específicos en la presente memoria la numeración es la obtenida del alineamiento de la secuencia variante con la secuencia de referencia mostrada como SEQ ID No. 73 ó SEQ ID No. 74.

A modo de preferencia, la lípido aciltransferasa para uso en el método y usos de la presente descripción puede ser una lípido aciltransferasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 62, o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene un 75% o más, preferiblemente un 85% o más, más preferiblemente un 90% o más, incluso más preferiblemente un 95% o más, incluso más preferiblemente un un 98% o más, incluso más preferiblemente un 99% o más, de identidad con la SEQ ID No. 62 y/o la SEQ ID No. 90. Esta enzima puede considerarse una enzima variante.

Para los propósitos de la presente descripción el grado de identidad se basa en el número de elementos de secuencia que son iguales. El grado de identidad puede determinarse de forma adecuada por medio de programas de ordenador conocidos en la técnica, tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45) usando los siguientes parámetros para la comparación de secuencias de péptidos: penalización de creación de GAP de 3,0 y penalización de extensión de GAP de 0,1. De forma adecuada, el grado de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos se determina sobre al menos 20 aminoácidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 30 aminoácidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 40 aminoácidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 50 aminoácidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 60 aminoácidos contiguos.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa / lípido acil transferasa puede obtenerse, se obtiene preferiblemente de organismos de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas, Candida, Thermobifida y Corynebacterium.

De forma adecuada, la enzima lípido aciltransferasa / lípido acil transferasa puede obtenerse, se obtiene preferiblemente de uno o más de los siguientes organismos: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptomyces thermosacchari, Streptomyces avermitilis Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sumolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Candida parapsilosis Thermobifida fusca y Corynebacterium efficient.

En un aspecto, preferiblemente la enzima lípido aciltransferasa se puede obtener, se obtiene o se deriva preferiblemente de uno o más de Aeromonas spp., Aeromonas hydrophila o Aeromonas salmonicida.

Preferiblemente, cuando se lleva a cabo un método el producto es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres del alimento.

El término "transferasa" tal como se usa en la presente memoria es intercambiable con el término "lípido aciltransferasa".

De forma adecuada, la lípido aciltransferasa tal cual se define en la presente memoria cataliza una o más de las siguientes reacciones: interesterificación, transesterificación, alcohólisis, hidrólisis.

El término "interesterificación" se refiere a la transferencia catalizada enzimáticamente de grupos acilo entre un lípido dador y un lípido aceptor, donde el lípido dador no es un grupo acilo libre.

El término "transesterificación" tal como se usa en la presente memoria significa la transferencia catalizada enzimáticamente de un grupo acilo desde un lípido dador (que no sea un ácido graso libre) hasta un aceptor de acilo (que no sea agua).

Tal como se usa en la presente memoria, el término "alcohólisis" se refiere a la ruptura enzimática de un enlace covalente de un derivado de ácido por reacción con un alcohol ROH, de tal modo que uno de los productos se combina con el H del alcohol y el otro producto se combina con el grupo OR del alcohol.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "alcohol" se refiere a un compuesto alquílico que contiene un 5 grupo hidroxilo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "hidrólisis" se refiere a la transferencia catalizada enzimáticamente de un grupo acilo desde un lípido al grupo OH de una molécula de agua. La transferencia de acilo resultante de hidrólisis requiere la separación de la molécula de agua.

La expresión "sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres", tal como se usa

10 en la presente memoria, significa que preferiblemente la lípido acil transferasa tiene un 100% de actividad de transferasa (es decir, transfiere el 100% de los grupos acilo desde un dador de acilos hasta un aceptor de acilos, sin actividad hidrolítica); sin embargo, la enzima puede transferir menos del 100% de los grupos acilo presentes en el lípido dador de acilo al aceptor de acilo. En dicho caso, la actividad de aciltransferasa preferiblemente contabiliza al menos el 5%, más preferiblemente al menos el 10%, más preferiblemente al menos el 20%, más preferiblemente al

15 menos el 30%, más preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90% y más preferiblemente al menos el 98% de la actividad enzimática total. El % de actividad de transferasa (es decir, la actividad de transferasa como porcentaje de la actividad enzimática total) puede determinarse mediante el siguiente protocolo:

20 Protocolo para la Determinación del % de actividad de aciltransferasa:

Un alimento al que se ha añadido una lípido aciltransferasa puede ser extraído después de la reacción enzimática con CHCl3:CH3OH 2:1 y la fase orgánica que contiene el material lipídico se aísla y analiza mediante GLC y HPLC, según el procedimiento detallado más adelante. A partir de los análisis de GLC y HPLC se determina la cantidad de ácidos grasos libres y uno o más ésteres de esterol/estanol; ésteres de carbohidrato; ésteres de proteína;

25 diglicéridos; o monoglicéridos. De igual modo se analiza un alimento de control al que no se ha añadido enzima.

Cálculo:

A partir de los resultados de los análisis de GLC y HPLC se puede calcular el incremento del contenido de ácidos grasos libres y ésteres de esterol/estanol y/o ésteres de carbohidrato y/o ésteres de proteína y/o diglicéridos y/o monoglicéridos:

La actividad de transferasa se calcula como un porcentaje de la actividad enzimática total:

* - eliminar según sea apropiado.

Si el contenido de ácidos grasos libres aumenta en el alimento, preferiblemente no aumentan sustancialmente, es 5 decir, en un grado significativo. Con esto queremos decir que el aumento del contenido de ácidos grasos libres no afecta negativamente a la calidad del alimento.

En algunos aspectos de la presente descripción, la expresión "sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres", tal como se usa en la presente memoria, significa que la cantidad de ácidos grasos libres en un alimento o composición tratado con una lípido aciltransferasa es inferior a la cantidad de ácidos grasos libres

10 producidos en el alimento o composición cuando se ha usado una enzima que no es lípido aciltransferasa, tal como por ejemplo en comparación con la cantidad de ácidos grasos libres producidos cuando se ha usado una enzima fosfolipasa convencional, por ejemplo Lipopan F® (Novozymes A/S, Dinamarca).

El término "in situ" tal como se usa en la presente memoria significa que el(los) emulsionante(s) y/o los ésteres de esterol/estanol y/o los ésteres de carbohidrato y/o los ésteres de proteína y/o los mono-o di-glicéridos son 15 producidos dentro del alimento o fracción del alimento. Esto contrasta con la situación en la que el(los) emulsionante(s) y/o los ésteres de esterol/estanol y/o los ésteres de carbohidrato y/o los ésteres de proteína y/o los mono- o di-glicéridos son producidos por separado del alimento y son añadidos al alimento como productos formados durante la preparación del mismo. En otras palabras, el término "in situ" tal como se usa en la presente memoria significa que mediante la adición de la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención a un 20 alimento, o a los ingredientes/materias que componen el alimento, se puede producir un emulsionante y/o un éster de esterol y/o un éster de estanol y/o un éster de carbohidrato y/o un éster de proteína y/o un mono- o di-glicérido a partir de los componentes del alimento. De forma adecuada, los componentes del alimento pueden ser el(los) sustrato(s) para la enzima. Si es necesario, los componentes del alimento pueden suplementarse mediante la adición de uno o más componentes adicionales, componentes adicionales que pueden ser iguales a los presentes

25 en el alimento o pueden ser componentes adicionales a los ya presentes en el alimento. Para evitar dudas, en una realización, el método puede ser un método para la producción de un emulsionante y/o un éster de esterol y/o un éster de estanol y/o un éster de carbohidrato y/o un éster de proteína y/o un mono-o di-glicérido in situ en un alimento y no es un método para preparar un emulsionante y/o un éster de esterol y/o un éster de estanol (por ejemplo, en una forma aislada y/o purificada) para la posterior adición al alimento.

30 En otra realización, se puede usar la lipasa acil-transferasa durante el procesado de alimentos, pero sin que permanezca en el alimento. Por ejemplo, la lipasa acil transferasa se puede inmovilizar, permitiendo su reutilización.

Preferiblemente, la lípido aciltransferasa es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido a un esterol y/o un estanol y/o un carbohidrato y/o una proteína y/o glicerol cuando está presente en un entorno polar, preferiblemente en un medio acuoso, preferiblemente un alimento que contiene agua. De forma adecuada, el medio acuoso puede 35 ser un tampón acuoso o puede ser la fase acuosa de un alimento. El término "medio acuoso" tal como se usa en la presente memoria preferiblemente significa un entorno que carece de disolvente orgánico, que preferiblemente carece de un disolvente orgánico polar, que más preferiblemente carece de un disolvente orgánico no comestible. En particular, el término "medio acuoso" puede referirse a un entorno al que no se han añadido disolventes orgánicos exógenos, preferiblemente disolventes orgánicos polares. El término disolvente orgánico tal como se usa 40 en la presente memoria no abarca aceites alimentarios, preferiblemente no abarca aceites alimentarios que tengan un alto contenido de lípidos polares. En una realización, el término disolvente orgánico puede excluir disolventes orgánicos comestibles, tales como etanol, propilen glicol y/o glicerol. De forma adecuada, el medio acuoso puede comprender menos de un 80% en volumen de disolvente orgánicos, menos de un 70% en volumen de disolventes orgánicos, menos de un 50% en volumen de disolventes orgánicos, menos de un 30% en volumen de disolventes

45 orgánicos, más preferiblemente menos de un 15% en volumen de disolventes orgánicos, más preferiblemente menos de un 5%. De forma adecuada, el alimento puede comprender entre un 1 y un 5% de disolvente orgánico, por ejemplo etanol. Sin embargo, cuando el alimento comprende dicho disolvente orgánico, preferiblemente es producido endógenamente dentro del alimento. Es decir, cuando el alimento comprende dicho disolvente orgánico, preferiblemente el disolvente orgánico no es un disolvente orgánico exógeno.

50 El término "alimento" tal como se usa en la presente memoria significa una sustancia que es adecuada para el consumo humano y/o animal.

De forma adecuada, el término "alimento" tal como se usa en la presente memoria puede significar un alimento en una forma que está preparada para el consumo. Alternativa o adicionalmente, sin embargo, el término alimento tal como se usa en la presente memoria puede significar una o más materias alimentarias que se usan en la preparación de un alimento. Simplemente a modo de ejemplo, el término alimento abarca tanto bienes cocinados producidos a partir de una masa como la masa usada en la preparación de dichos bienes cocinados. A modo de ejemplo adicional, el término alimento abarca tanto el producto final, es decir por ejemplo el producto lácteo final tal como queso, así como la leche (por ejemplo, leche de queso), la nata y/o la mantequilla, por ejemplo, usados en la

5 preparación de dicho producto lácteo (por ejemplo, el queso).

El término "materia alimentaria" tal como se usa en la presente memoria significa uno o más materiales usados en la preparación de un alimento. El término alimento puede usarse en la presente memoria para indicar una materia alimentaria y viceversa. En algunas realizaciones, por ejemplo, la materia alimentaria puede ser el alimento final. Simplemente a modo de ejemplo, el alimento final puede ser un aceite comestible (tal como un aceite de fritura); en

10 tales casos la materia alimentaria también puede ser el aceite comestible. En algunas realizaciones, por ejemplo, la materia alimentaria puede ser un constituyente del alimento final. Simplemente a modo de ejemplo, el alimento final puede ser producto lácteo, tal como queso por ejemplo; en tales casos la materia alimentaria puede ser leche (por ejemplo, leche de queso), nata y/o mantequilla, por ejemplo usadas en la preparación de dicho producto lácteo (por ejemplo, el queso).

15 Cuando la materia alimentaria es solo un constituyente del alimento final, por ejemplo en algunas realizaciones el alimento final puede estar compuesto por menos del 10% p/p de materia alimentaria, tal como menos del 5% p/p.

En algunas realizaciones, de forma adecuada el alimento final puede estar compuesto por de 0,01 a 4% p/p de materia alimentaria.

En algunas realizaciones, de forma adecuada el alimento final puede estar compuesto por de 0,01 a 2% p/p de 20 materia alimentaria.

En algunas realizaciones, de forma adecuada el alimento final puede estar compuesto por de 0,01 a 1% p/p de materia alimentaria.

En algunas realizaciones, de forma adecuada el alimento final puede estar compuesto por de 0,01 a 0.5% p/p de materia alimentaria.

25 En algunas realizaciones, de forma adecuada el alimento final puede estar compuesto por de 0,01 a 0.3% p/p de materia alimentaria.

En un aspecto preferido la presente descripción proporciona un alimento como el definido anteriormente donde el alimento se selecciona entre uno o más de los siguientes: huevos, productos basados en huevo, que incluyen aunque sin limitación mayonesa, aliños para ensalada, salsas, helados, polvo de huevo, yema de huevo modificada 30 y productos hechos de los mismos; bienes cocinados, que incluye panes, pasteles, productos de masa dulces, rebozados líquidos, magdalenas, donuts, galletas, galletas crujientes; confitería, que incluye chocolate, caramelos, gominolas, que incluyen gominolas sin azúcar y edulcoradas con azúcar, burbuja de gominola, chicle y puddings; productos congelados que incluyen sorbetes, preferiblemente productos lácteos congelados, que incluyen helados y leche helada; productos lácteos, que incluyen queso, mantequilla, leche, crema para café, nata, natillas, bebidas de

35 lácteos y yogures; musses, natas vegetales, productos cárnicos, que incluye productos cárnicos procesados; aceites y grasas comestibles, productos batidos aireados y no aireados, emulsiones de aceite-en-agua, emulsiones de agua-en-aceite, margarina, manteca y untables que incluyen untables bajos en grasa y muy bajos en grasa; aliños, mayonesa, salsas para mojar, salsas basadas en nata, sopas basadas en nata, brebajes, emulsiones y salsas picantes.

40 De forma adecuada, el alimento puede ser un "producto alimenticio fino", que incluye pasteles, pastas, confitería, chocolates, dulce de leche y similares.

En un aspecto, el alimento puede ser un producto de masa o un producto cocinado, tal como un pan, un producto frito, un snack, pasteles, tartas, brownies, galletas, fideos, aperitivos tales como galletas crujientes, galletas graham, pretzels y patatas fritas, y pasta.

45 En un aspecto adicional, el alimento puede ser un producto alimenticio derivado de plantas tal como harinas, premezclas, aceites, grasas, manteca de cacao, blanqueante de café, aliños de ensaladas, margarina, untables, mantequilla de cacahuete, mantecas, helados, aceites de fritura.

En otro aspecto, el alimento puede ser un producto lácteo, que incluye mantequilla, leche, nata, queso tal como quesos naturales, procesados y de imitación en una variedad de formas (que incluyen tiras, dados, lonchas o

50 rayado), crema de queso, helado, postres helados, yogur, bebidas de yogur, grasa butírica, grasa de leche anhidra, otros productos lácteos. La enzima según la presente invención puede mejorar la estabilidad de las grasas en productos lácteos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "leche" puede comprender leche de origen tanto animal como vegetal. Es posible usar leche de fuentes animales tales como búfalo, vaca (tradicional), oveja, cabra, etc., tanto 55 individualmente como combinada. También se pueden usar leches vegetales tales como la leche de soja. La leche

vegetal se puede usar en combinación con la leche animal, por ejemplo en un porcentaje bajo (de leche vegetal), digamos por debajo del 15% o debajo del 20%, o debajo del 25% v/v. El término leche también puede comprender leche de queso y nata. Una ventaja es que puede asistir a la incorporación de leche de soja para la producción de queso a una concentración mayor cuando se mezcla con leche procedente de una fuente animal. Sin pretender

5 establecer ninguna teoría, esto puede deberse a las propiedades emulsionantes de la leche de soja tratada.

En un aspecto, el alimento puede ser un helado.

En un aspecto, el alimento puede ser o puede comprender queso o un análogo del queso.

En una realización, la presente descripción se refiere a un método para la producción de queso usando una lípido aciltransferasa y/o el uso de una lípido aciltransferasa para la producción de queso. Preferiblemente, el uso conduce

10 a uno o más efectos técnicos en el queso mostrados en la presente memoria.

De forma adecuada, en algunas realizaciones el alimento puede ser un derivado del alimento. Simplemente a modo de ejemplo, el alimento puede ser una pizza que comprende queso producido.

En la presente solicitud, el término "queso" se refiere a cualquier tipo de queso, tal como queso natural, análogos de queso y queso procesado, por ejemplo. El queso se puede obtener mediante cualquier proceso adecuado conocido

15 en la técnica, tal como, por ejemplo, por coagulación enzimática de la leche de queso y/o nata con cuajo, o mediante coagulación ácida de la leche de queso y/o nata con comida de grado ácido o ácido producido mediante cultivo de bacterias de ácido láctico.

En una realización, el queso fabricado mediante el proceso de la invención es queso de cuajo. El cuajo se encuentra disponible comercialmente, por ejemplo como Naturene (cuajo de animal), Chymaxe (quimosina producida por

20 fermentación), Microlane (coagulante microbiano producido por fermentación), todos de Chr. Hansen A/S, Dinamarca. La leche de queso y/o o la nata pueden someterse a un proceso de fabricación de queso convencional.

Un coagulante preferible es Marzyme®, un coagulante microbiano puro, que proporciona los beneficios de la quimosina producida por fermentación (FPC, del inglés "fermentation-produced chymosin") sin afectar al rendimiento

o al sabor.

25 El queso procesado se fabrica preferiblemente a partir de queso natural o de análogos de queso mediante cocinado y emulsión de queso, tal como con sales emulsionantes (por ejemplo, fosfatos y citrato). El proceso puede incluir además la adición de especies/condimentos.

El término "análogos de queso" se refiere a productos de tipo queso que contienen grasa (tal como, por ejemplo, grasa de leche (por ejemplo, nata)) como parte de su composición, y que además contienen, como parte de su

30 composición, constituyentes no lácteos tales como, por ejemplo, un aceite vegetal. Un ejemplo de un análogo de queso es la base de queso. Los análogos de queso pueden comprender leche de soja o proteínas de soja.

Los quesos producidos mediante el proceso de la presente descripción comprenden todas las variedades de queso, tales como, por ejemplo, Campesino, Chester, Danbo, Drabant, Herregård, Manchego, Primativo, Provolone, Saint Paulin, Queso blando, Svecia, Taleggio, Queso blanco, que incluyen quesos de cuajo producidos mediante

35 coagulación de cuajo de queso; quesos madurados tales como Cheddar, Colby, Edam, Muenster, Gryere, Emmenthal, Camembert, Parmesano y Romano; quesos frescos tales como Mozzarella y Feta; quesos coagulados ácidos tales como crema de queso, Neufchatel, Quarg, Cottage Cheese y Queso Blanco; y queso pasta filata.

Una realización se refiere a la producción de queso de pizza mediante el proceso de la invención.

En la fabricación de queso, la coagulación de la caseína de la leche se lleva a cabo preferiblemente de dos formas:

40 el queso de cuajo y el queso de coagulación ácida. En la producción de queso estos dos tipos de cuajos constituyen los dos grupos principales de tipos de quesos. Los quesos frescos de coagulación ácida se refieren a las variedades de queso producidas por la coagulación de leche, nata o suero mediante acidificación o una combinación de ácido y calor, y que son aptos para el consumo una vez fabricados sin necesidad de completar una maduración. Los quesos frescos de coagulación ácida generalmente difieren de las variedades de queso de cuajo animal (por ejemplo,

45 Camembert, Cheddar, Emmenthal), en los que la coagulación se induce normalmente por la acción de un cuajo animal a valores de pH de 6,4-6,6, a los que la coagulación se produce normalmente cerca del punto isoeléctrico de la caseína, es decir, por ejemplo a pH 4,6 o a valores superiores cuando se emplean temperaturas elevadas, por ejemplo en el Ricotta, pH 6,0 y 80ºC.

En una realización de la invención, el queso pertenece a la clase de los quesos de cuajo de animal.

50 La Mozzarella es un miembro de los quesos denominados pasta filata, o de cuajo estirado, que normalmente se distinguen por un tratamiento de plasticidad y amasado del cuajo fresco en agua caliente, lo que imparte al queso finalizado su característica estructura fibrosa y propiedades de fusión y estiramiento, véase por ejemplo "Mozzarella and Pizza cheese" de Paul S. Kindstedt, Cheese: Chemistry, physics and microbiology, Volumen 2: Major Cheese groups, segunda edición, página 337-341, Chapman & Hall. El queso de pizza tal como se usa en la presente memoria incluye quesos adecuados para pizzas, y habitualmente son quesos de cuaje pasta filata/estirados. En una realización, el proceso de la descripción comprende además un tratamiento de calor/estiramiento como para los quesos pasta filata, tal como para la fabricación de Mozzarella.

En una realización preferiblemente el queso es Mozzarella.

5 En realizaciones adicionales de la descripción se prepara la leche de queso, totalmente o en parte, a partir de fracciones de leche deshidratada, tales como, por ejemplo, leche entera en polvo, leche desnatada en polvo, caseína, caseinato, proteína láctea total o polvo de mantequilla, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, preferiblemente el alimento y/o materia alimentaria es grasa butírica.

En una realización, particularmente cuando el alimento y/o materia alimentaria tratado con la lípido aciltransferasa es

10 grasa butírica, la grasa butírica tratada con enzima puede usarse a continuación para producir un producto lácteo adicional (particularmente queso) y/o margarina y untables (que incluyen untables bajos en grasa y muy bajos en grasa).

En una realización, la grasa butírica tratada con enzima puede añadirse a la leche (por ejemplo, leche de queso) y/o a la nata que posteriormente puede usarse para preparar un producto lácteo adicional, tal como queso, por ejemplo.

15 En otra realización, el alimento y/o la materia alimentaria puede ser leche y/o crema.

En una realización, particularmente cuando el alimento y/o la materia alimentaria tratada con la lípido aciltransferasa es leche (preferiblemente leche de queso) y/o nata, la leche y/o crema tratada con enzima puede usarse a continuación para producir un producto lácteo adicional (tal como uno o más de entre queso, helado, postres helados, yogur, bebidas de yogur por ejemplo, particularmente queso y/o helado).

20 En una realización, el alimento consiste en o consta de un alimento de queso que es calentado por encima de la temperatura de fusión del queso. El uso de queso preparado en alimentos que son calentados puede conducir a un menor efecto de generación de aceite desde el queso. También puede haber beneficios en la textura y el sabor al usar queso o productos de queso preparados.

La presente invención se refiere además al uso del queso producido mediante el proceso de la presente descripción

25 en pizza, platos de comida preparada, tal como lasaña o queso procesado, o como ingrediente en otros productos alimenticios. Por consiguiente, el queso producido puede usarse en productos de comida procesados adicionalmente como queso procesado, pizza, hamburguesa, salsas de tostadas, aliños, queso en polvo o aromas de queso.

En realizaciones adicionales, el proceso de la descripción comprende además la etapa de someter al queso, o

30 alimento que comprende el queso, preparado, a un tratamiento de calentamiento, tal como por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 150-350ºC, o en el intervalo de aproximadamente 155-345ºC, o en el intervalo de aproximadamente 160-340ºC o en el intervalo de aproximadamente 170-330ºC o en el intervalo de aproximadamente 180-320ºC o en el intervalo de aproximadamente 200-300ºC. De forma adecuada, el tratamiento de calentamiento puede durar al menos 2 minutos, tal como al menos 5 minutos, que incluye al menos 10 minutos.

35 En un aspecto de la presente descripción, el queso producido tiene una temperatura de fusión que no difiere significativamente de la del queso de control (es decir, uno que no ha sido producido usando una lípido aciltransferasa).

En otro aspecto de la presente descripción, el queso producido tiene una textura y una consistencia que es similar (si no mejor) a la de un queso de control (es decir, uno que no ha sido producido usando una lípido aciltransferasa).

40 Es particularmente ventajoso utilizar la presente descripción en queso, ya que la producción de ácidos grasos libres en el queso se asocia a un sabor "jabonoso". Por tanto, el uso de una lípido aciltransferasa produce de forma ventajosa un queso sin sabor "jabonoso".

La reducción de sabor "jabonoso" y/o de los defectos de sabor o sabor negativo asociada al uso de una lípido aciltransferasa proporciona una ventaja significativa en comparación con el uso de una lipasa y/o fosfolipasa

45 estándar (tal como Lecitase™ por ejemplo). La reducción de efectos negativos sobre el sabor puede ser de forma ventajosa resultado de una reducción de la producción de ácidos grasos libres durante las reacciones enzimáticas. Los ácidos grasos retirados enzimáticamente por la lípido aciltransferasa del dador de acilo son transferidos a una molécula aceptora de acilo, y por tanto no se acumulan en el queso.

En otro aspecto, el alimento puede ser un producto alimenticio que contiene ingredientes derivados de animales, tal 50 como productos cárnicos procesados, aceites de fritura, mantecas.

En un aspecto adicional, el alimento puede ser una bebida, una fruta, una fruta mixta, una verdura o vino. En algunos casos, la bebida puede contener hasta 20 g/L de fitoesteroles añadidos.

En otro aspecto, el alimento puede ser un pienso para animales. El pienso para animales puede estar enriquecido con fitoesterol y/o fitoestanoles, preferiblemente con beta-sitoesterol/estanol. De forma adecuada, el pienso para animales puede ser un pienso para aves. Cuando el alimento es pienso para aves, la presente descripción puede usarse para disminuir el contenido de colesterol de los huevos producidos por las aves alimentadas con el alimento.

5 En un aspecto, preferiblemente el alimento se selecciona entre uno o más de los siguientes: huevos, productos basados en huevo, que incluyen mayonesa, aliños para ensalada, salsas, helados, polvo de huevo, yema de huevo modificada y productos hechos de los mismos.

Preferiblemente, el alimento es un alimento que contiene agua. De forma adecuada el alimento puede estar compuestos en un 10-98% por agua, de forma adecuada en un 14-98%, de forma adecuada en un 18-98% por

10 agua, de forma adecuada en un 20-98%, de forma adecuada en un 40-98%, de forma adecuada en un 50-98%, de forma adecuada en un 70-98%, de forma adecuada en un 75-98%.

Para algunos aspectos, preferiblemente el alimento no es un aceite vegetal puro, tal como aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de colza, por ejemplo. Para evitar dudas, el alimento puede comprender un aceite, pero preferiblemente el alimento no está compuesto principalmente por aceites o mezclas de aceite. Para

15 algunos aspectos, el alimento preferiblemente comprende menos de un 95% de lípidos, preferiblemente menos de un 90% de lípidos, preferiblemente menos de un 85%, preferiblemente menos de un 80% de lípidos. Por tanto, el aceite puede ser un componente del alimento, pero preferiblemente el alimento no es un aceite per se.

Cuando se da el caso de que se produce un éster de carbohidrato, el éster de carbohidrato preferiblemente es un éster de oligosacárido, un éster de monosacárido o un éster de disacárido.

20 De forma adecuada, el éster de carbohidrato, cuando se produce, puede ser uno o más de los siguientes: éster de glucosa, éster de fructosa, éster de maltosa, éster de lactosa, éster de galactosa, éster de xilosa, éster de xilooligosacárido, éster de arabinosa, éster de maltooligosacárido, éster de tagatosa, éster de sacarosa, éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T ó éster de cortalcerona.

Preferiblemente, el éster de carbohidrato, cuando se produce, es uno o más de los siguientes: un monoéster de

25 carbohidrato, un monoéster de azúcar, un monoéster de oligosacárido, un monoéster de trisacárido, un monoéster de disacárido, un monoéster de monosacárido, un monoéster de glucosa, un monoéster de fructosa, un monoéster de fructosa anhidra, un monoéster de maltosa, un monoéster de lactosa, un monoéster de galactosa, un monoéster de xilosa, un monoéster de xilooligosacárido, un monoéster de arabinosa, un monoéster de maltooligosacárido, un monoéster de tagatosa, un monoéster de sacarosa, un éster de microtecina, un éster de ascopirona P, un éster de

30 ascopirona T o un éster de cortalcerona.

En una realización, el éster de microtecina, el éster de ascopirona P, el éster de ascopirona T y/o el éster de cortalcerona pueden actuar como agente antimicrobiano. Alternativa o adicionalmente, el éster de microtecina, el éster de ascopirona P, el éster de ascopirona T y/o el éster de cortalcerona pueden actuar como antioxidante y/o emulsionante.

35 Preferiblemente, la formación del éster de carbohidrato (si lo hay) es independiente de glucosa-UDP.

Preferiblemente, el alimento no comprende glucosa UDP, o solo comprende glucosa UDP en cantidades no significativas.

De forma adecuada, el emulsionante puede ser, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un diglicérido, un monoglicérido tal como 1-monoglicérido o una lisolecitina, tal como lisofosfatidilcolina, por ejemplo, un monoglicérido

40 de digalactosilo (DGMG). El emulsionante se produce preferiblemente a partir del lípido dador de acilo después de la retirada de uno o más grupos acilo de dicho lípido dador de acilo. El término lisolecitina tal como se usa en la presente memoria abarca lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilinositol, lisofosatidilserina y lisofosfatidilglicerol.

Cuando uno de los emulsionantes es un éster de carbohidrato, el segundo emulsionante puede ser, por ejemplo,

45 uno o más de los siguientes: un diglicérido, un monoglicérido, tal como 1-monoglicérido, lisofosfatidilcolina o monoglicérido de digalactosilo (DGMG). El segundo emulsionante se produce preferiblemente a partir del lípido dador de acilo después de la retirada de uno o más grupos acilo de dicho lípido dador de acilo. El término lisofosfatidilcolina tal como se usa en la presente memoria es sinónimo del término lisolecitina, y estos términos pueden usarse aquí de forma intercambiable.

50 Preferiblemente, el segundo emulsionante es DGMG. De forma adecuada, el DGMG se produce in situ mediante la eliminación de un grupo acilo del DGDG con la transferencia del grupo de acilo retirado a un carbohidrato para formar un éster de carbohidrato.

Cuando uno de los emulsionantes es un éster de proteína y/o un diglicérido y/o un monoglicérido, el segundo emulsionante puede ser, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un diglicérido, un monoglicérido, tal como 155 monoglicérido, lisofosfatidilcolina o monoglicérido de digalactosilo (DGMG). El segundo emulsionante se produce

preferiblemente a partir del lípido dador de acilo después de la retirada de uno o más grupos acilo de dicho lípido dador de acilo. El término lisofosfatidilcolina tal como se usa en la presente memoria es sinónimo del término lisolecitina, y estos términos pueden usarse aquí de forma intercambiable.

En una realización, la lípido aciltransferasa puede usarse en un proceso para la preparación de un alimento tal como un aceite de fritura (por ejemplo, comestible), margarina o untable, grasa butírica (por ejemplo, para uso en quesos y/o margarina y/o untables), donde el alimento contiene de forma natural glicerol, o ha sido suplementado con glicerol, y/o ha sido suplementado con al menos uno fosfolípido (por ejemplo, lecitina) y/o glicolípido (por ejemplo, digalactosil-diglicérido), y opcionalmente un fitoesterol o fitoestanol.

En una realización la lípido acil transferasa puede usarse en un proceso para la preparación de un alimento tal como margarina o untable, donde el alimento contiene de forma natural glicerol, o ha sido suplementado con glicerol, y/o al menos un fosfolípido (por ejemplo, lecitina y/o glicolípido (por ejemplo, digalactosil-diglicérido), y opcionalmente un fitoesterol o fitoestanol.

En una realización, la presente descripción proporciona un proceso para la producción de aceite o grasa comestible modificada (que incluye grasa butírica) que comprende i) lisofosfolípido y/o * uno o más de los siguientes, glicerofosfatilcolina, fosfatiletanolamina, fosfatilinositol y fosfatilserina, y ii) monoglicérido, comprendiendo dicho proceso:

a) seleccionar al menos una aceite o grasa comestible, o una combinación de los mismos, donde dicho aceite o grasa comestible comprende al menos un fosfolípido,

b) suplementar dicho aceite o grasa comestible seleccionado en la etapa a) con glicerol exógeno y opcionalmente b) fosfolípido exógeno; donde cuando el aceite o grasa comestible modificado seleccionado en la etapa a) consiste esencialmente en un aceite vegetal, se añade fosfolípido exógeno durante la etapa b),

c) poner en contacto el aceite o grasa suplementado de la etapa b) con al menos una lípido acil transferasa, y opcionalmente una enzima adicional,

para producir una mezcla de reacción aceite comestible/enzima, y

d) incubar dicha mezcla de reacción aceite comestible/enzima a una temperatura a la cual dicha al menos una lípido acil transferasa sea activa a fin de producir un aceite o grasa comestible modificado que comprenda i) lisofosfolípido y/o uno o más de los siguientes, glicerofosfatilcolina, fosfatiletanolamina, fosfatilinositol y fosfatilserina, e ii) monoglicérido, y

e) opcionalmente desactivar o eliminar dicha lípido acil transferasa y/o enzima adicional opcional.

Cuando se usa como aceite de fritura o margarina, el alimento puede presentar propiedades anti-adherentes potenciadas. Adicional o alternativamente, el alimento puede presentar una o más propiedades técnicas beneficiosas, por ejemplo estabilidad oxidativa mejorada, propiedades emulsionantes mejoradas, o beneficios para la salud.

En una realización, la lípido acil transferasa puede estar en la preparación de alimentos bajos en grasa, tal como untables bajos en grasa, aliños de ensalada bajos en grasa, mayonesa baja en grasa, margarinas bajas en grasa, etc. En dichos productos bajos en grasa, el contenido en grasa normalmente se ve reducido por la adición de emulsionantes y agua adicional, con respecto al equivalente con mayor cantidad de grasa.

Se ha observado que las lípido acil transferasas usadas en las composiciones y métodos de la descripción tienen propiedades únicas en comparación con las enzimas lipolíticas, ya que presentan una preferencia marcada por la transferencia de grupos acilo desde lípidos a aceptores diferentes del agua, incluso en presencia de una cantidad significativa de agua. En comparación con las enzimas de la técnica anterior, se observó que la lípido acil transferasa usada en la invención presenta una elevada actividad relativa de transferasa en presencia de un 6% de agua, 54% de agua, 73% de agua, 89% de agua y aproximadamente 95% de agua. Las enzimas lipolíticas evaluadas no presentaron virtualmente actividad relativa de transferasa significativa con dichas concentraciones de agua.

La actividad de fosfolipasa de una enzima puede evaluarse usando los siguientes ensayos. Así, se puede obtener/identificar una lípido aciltransferasa que tenga unas características de enzima definidas en la presente memoria.

Determinación de la actividad de fosfolipasa (ensayo TIPU-K de actividad de fosfolipasa):

Sustrato

1,75% de L- Fosfatidilcolina al 95% de Planta (Avanti nº441601), 6,3% de Triton-X 100 (libre de peróxidos) y CaCl2 5 mM se disuelven en tampón HEPES 0,05 M, pH 7.

Procedimiento de ensayo:

Se añaden 21 μL de sustrato a una cubeta (Kone-Lab. Robot) y se incuba a 30 °C durante 5 minutos. A tiempo t = 0 min, se añaden 4 μL de disolución de enzima. También se analizó un blanco con agua en lugar de enzima. A tiempo t = 10 min, se añaden 75 μL de NEFA A (Sustrato A del Kit NEFA de Wako Chemicals, Alemania), se mezcla y se incuba a 30 °C. A tiempo t = 15 min, se añaden 150 μL de NEFA B (Sustrato B del Kit NEFA de Wako Chemicals, Alemania) y se incuba a 30 °C. A tiempo t = 20 min se mide la absorbancia (DO a 520 nm).

Se prepara una curva de calibrado basada en ácido oleico y se usa para el cálculo del contenido de ácidos grasos libres en las muestras.

Se calcula la actividad enzimática TIPU-K como micromoles de ácidos grasos producidos por minuto en las condiciones de ensayo.

Determinación de la actividad de fosfolipasa (ensayo PLU-7 de actividad de fosfolipasa):

Sustrato

0,6% de L-α Fosfatidilcolina al 95% de Planta (Avanti nº441601), 0,4% de Triton-X 100 (Sigma X-100) y CaCl2 5 mM se dispersan en tampón HEPES 0,05 M, pH 7.

Procedimiento de ensayo:

Se añaden 400 μL de sustrato a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y se colocan en un Termomezclador Eppendorf a 37ºC durante 5 minutos. A tiempo t = 0 min, se añaden 50 μL de disolución de enzima. También se analiza un blanco con agua en lugar de enzima. La muestra se mezcla a 10x100 rpm en un Termomezclador Eppendorf a 37ºC durante 10 minutos. A tiempo t = 10 minutos, el tubo Eppendorf se coloca en otro termomezclador a 99ºC durante 10 minutos para detener la reacción.

El contenido en ácidos grasos libres de las muestras se analiza usando el kit NEFA C de WAKO GmbH.

Se calcula la actividad enzimática PLU-7 a pH 7 como micromoles de ácidos grasos producidos por minuto en las condiciones de ensayo.

La actividad de lipasa y aciltransferasa de una enzima puede evaluarse usando los siguientes ensayos. Así, se puede obtener/identificar una lípido aciltransferasa que tenga unas características de enzima definidas en la presente memoria.

Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado (véase el Ejemplo 12). Las enzimas que actúan como lípido aciltransferasas para uso en las composiciones y métodos de la invención se pueden identificar de forma rutinaria usando el ensayo presentado en la presente memoria en el Ejemplo 12. Este ensayo se denominará a partir de este punto "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado". En el Ejemplo 12, la enzima lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida se analizó y se comparó con un abanico de enzimas lipolíticas no abarcadas por la presente descripción. Como puede observarse, de las enzimas lipolíticas únicamente la LIPOPAN® F (Novozymes, Dinamarca) presentó algo de actividad de transferasa aunque solo a un nivel muy bajo (1,3%).

Las enzimas adecuadas para uso en las composiciones y métodos de la descripción pueden identificarse rutinariamente usando el Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado. Usando este ensayo, en el que hay un contenido de agua muy elevado - aproximadamente el 95% - las lípido aciltransferasas de la descripción son aquellas que presentan al menos un 2% de actividad de aciltransferasa (actividad de transferasa relativa), preferiblemente al menos un 5% de actividad de transferasa relativa, preferiblemente al menos un 10% de actividad de transferasa relativa, preferiblemente al menos un 15%, 20%, 25%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60% ó 75% de actividad de transferasa relativa. De forma adecuada, la lípido aciltransferasa puede tener menos del 28%, menos del 30%, preferiblemente menos del 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% de actividad de aciltransferasa.

Ensayo de Transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua (véase el Ejemplo 11)

Como alternativa (o adicionalmente) al uso del "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" (ver anteriormente), se puede identificar una lípido aciltransferasa para ser usada empleando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo con Alto Contenido en Agua" mostrado en el Ejemplo 11.

En una realización, la lípido aciltransferasa adecuada para uso en los métodos y/o composiciones es una que cuando se evalúa usando el Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo con Alto Contenido en Agua en una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa. De hecho, los experimentos con yema de huevo de alto contenido en agua han demostrado que al inicio del experimento la velocidad de transferasa inicial fue calculada en un 100% de la actividad de transferasa, es decir no se observó actividad hidrolítica. Por el contrario, las enzimas lipolíticas usadas como control, esto es, LIPOPAN® F y fosfolipasa A2, no mostraron actividad de transferasa detectable en yema de huevo un 54% de agua, o con yema de huevo con un contenido en agua enriquecido (a saber, yema de huevo con un 73% de agua o un 89% de agua).

Preferiblemente, el aumento del contenido de agua no disminuye significativamente el porcentaje de actividad de acil transferasa de una lípido aciltransferasa para uso en los métodos o composiciones.

En una realización preferible, en referencia al Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo con un Alto Contenido en Agua, con un contenido en agua del 54%, una lípido aciltransferasa presentará un porcentaje inicial de actividad de 5 aciltransferasa (actividad relativa de transferasa inicial) medida después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido) de al menos un 0,1% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos un 1% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos un 5% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos un 10% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos un 20% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos un 30% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al

10 menos un 40% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos un 50% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, preferiblemente al menos un 99%, preferiblemente aproximadamente un 100% de actividad de acil transferasa.

En una realización preferible, en referencia al Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo con Alto Contenido en

15 Agua, con un contenido en agua del 54%, y medido después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido), la lípido aciltransferasa para uso en las composiciones y métodos de la descripción presenta una actividad de transferasa detectable, es decir, una actividad relativa de transferasa de entre el 0,1 y el 100%, preferiblemente de al menos el 1% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 5% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 10% de la actividad relativa de transferasa,

20 preferiblemente de al menos el 20% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 30% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 40% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 45%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de la actividad relativa de transferasa. De forma adecuada, la lípido acil transferasa según la presente invención puede presentar, cuando se usa el Ensayo de Transferencia en Yema de Huevo con Alto Contenido en Agua con un contenido en agua del 54% y medido después

25 de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido), un porcentaje de actividad de acil transferasa (actividad relativa de transferasa) de menos del 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100%.

En una realización preferible, en referencia al Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo con Alto Contenido en Agua, con un contenido en agua del 73%, medido después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido), la lípido aciltransferasa para uso en las composiciones y métodos de la descripción presenta una 30 actividad de transferasa detectable, es decir, una actividad relativa de transferasa de entre el 0,1 y el 100%, preferiblemente de al menos el 1% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 5% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 10% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 20% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 30% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 40% de la actividad relativa de transferasa,

35 preferiblemente de al menos el 45%, 50%, 58%, 60%, 70%, 80% ó 90% de la actividad relativa de transferasa. De forma adecuada, la lípido acil transferasa puede presentar, cuando se usa el Ensayo de Transferencia en Yema de Huevo con Alto Contenido en Agua con un contenido en agua del 73% y medido después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido), un porcentaje de actividad de acil transferasa (actividad relativa de transferasa) de menos del 45%, 47%, 50%, 58%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100%.

40 En una realización preferible, en referencia al Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo con Alto Contenido en Agua, con un contenido en agua del 89%, y medido después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido), la lípido aciltransferasa para uso en las composiciones y métodos de la descripción presenta una actividad de transferasa detectable, es decir, una actividad relativa de transferasa de entre el 0,1 y el 100%, preferiblemente de al menos el 1% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 5% de la

45 actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 10% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 20% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 30% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 40% de la actividad relativa de transferasa, preferiblemente de al menos el 45%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de la actividad relativa de transferasa. De forma adecuada, la lípido acil transferasa puede presentar, cuando se usa el Ensayo de Transferencia en Yema de Huevo

50 con Alto Contenido en Agua con un contenido en agua del 89% y medido después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido), un porcentaje de actividad de acil transferasa (actividad relativa de transferasa) de menos del 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100%.

En una realización preferible, en referencia al Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo con Alto Contenido en Agua, una lípido aciltransferasa para uso en las composiciones y métodos de la invención presenta una actividad

55 relativa de transferasa significativa (es decir, al menos un 0,1% para ambos contenidos de agua), y presenta una actividad relativa de transferasa equivalente en yema de huevo con un contenido de agua del 54% y en yema de huevo con un contenido en agua del 73%, cuando se mide después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido).

60 Agua, una lípido aciltransferasa para uso en las composiciones y métodos de la descripción presenta una actividad relativa de transferasa significativa (es decir, al menos un 0,1% para ambos contenidos de agua), y presenta una actividad relativa de transferasa equivalente en yema de huevo con un contenido de agua del 54% y en yema de huevo con un contenido en agua del 89%, cuando se mide después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido).

5 Agua, una lípido aciltransferasa para uso en las composiciones y métodos de la invención presenta una actividad relativa de transferasa significativa (es decir, al menos un 0,1% para ambos contenidos de agua), y presenta una actividad relativa de transferasa equivalente en yema de huevo con un contenido de agua del 73% y en yema de huevo con un contenido en agua del 89%, cuando se mide después de un 10% de consumo de la molécula dadora (es decir, fosfolípido).

10 La expresión "actividad relativa de transferasa equivalente" tal como se emplea en la presente memoria, significa que la enzima tiene una actividad relativa de transferasa (% de actividad de aciltransferasa) que es al menos un 2% inferior, preferiblemente al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% inferior en la yema de huevo con un mayor contenido en agua en comparación con la de la yema de huevo con un menor contenido de agua.

15 Ensayo de Transferasa en un Entorno Bajo en Agua

Como alternativa (o adicionalmente) al uso del "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo con Alto Contenido en Agua" y/o el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado", las lípido aciltransferasas para uso según la presente invención pueden identificarse usando el "Ensayo de Transferasa en un Entorno Bajo en Agua".

A fin de determinar si una enzima es una lípido aciltransferasa, se puede llevar a cabo un "Ensayo de Transferasa 20 en un Entorno Bajo en Agua", a saber, en un entorno aceitoso con un 6% de agua, como se muestra en el Ejemplo

22. Este ejemplo ilustra que en un entorno aceitoso con un 6% de contenido de agua, la lípido aciltransferasa de la invención tiene una actividad relativa de transferasa, donde las enzimas lipolíticas de la técnica anterior presentan actividad hidrolítica.

En una realización, la lípido aciltransferasa adecuada para uso en los métodos y/o composiciones es aquella que

25 cuando es evaluada en el "Ensayo de Transferasa en un Entorno Bajo en Agua", medido tras un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, presenta una actividad relativa de transferasa de al menos un 1%, preferiblemente de al menos un 2%, preferiblemente de al menos un 5%, preferiblemente de al menos un 10%, preferiblemente de al menos un 20%, preferiblemente de al menos un 30%, preferiblemente de al menos un 40%, preferiblemente de al menos un 50%, preferiblemente de al menos un 60%, preferiblemente de al menos un 70%,

30 preferiblemente de al menos un 75%. De forma adecuada, la lípido aciltransferasa según la presente invención puede tener menos de un 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de actividad cuando se mide después de un periodo de tiempo de 10, 20, 30 ó 120 minutos usando el "Ensayo de Transferasa en un Entorno Bajo en Agua".

Tal como se ha descrito antes, la lípido aciltransferasa puede identificarse usando el "Ensayo de Transferasa en un Sustrato Tamponado" o el "Ensayo de Transferasa en un Entorno Bajo en Agua", usando colesterol como aceptor de 35 acilo. Por supuesto, el especialista es fácilmente consciente de que, con ajustes obvios en los métodos analíticos, el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" o el "Ensayo de Transferasa en un Entorno Bajo en Agua" pueden usarse para determinar la actividad de lípido aciltransferasa para cualquier combinación de lípido dador de acilo y aceptor de acilo. El especialista, en caso de ser necesario, simplemente reemplazaría el sustrato dador de acilo (por ejemplo, fosfolípido) por un sustrato dador de acilo alternativo (por ejemplo, glicolípido, triacilglicérido) y/o

40 reemplazaría el aceptor de acilo (por ejemplo, colesterol) por un sustrato aceptor de acilo alternativo (por ejemplo, un carbohidrato, una proteína, otro esterol, un estanol o glicerol).

El término "alto contenido en agua" tal como se usa en la presente memoria significa cualquier sustrato o alimento con más de un 2% de contenido en agua, preferiblemente más de un 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90%.

45 El término "bajo en agua" tal como se usa en la presente memoria significa cualquier sustrato o alimento con menos de un 6% de contenido en agua, preferiblemente menos de un 5%, 4%, 3%, 2%, 1 % ó 0,5%.

Ensayo Lus

La capacidad para hidrolizar triglicéridos (actividad E.C. 3.1.1.3) se puede determinar mediante la actividad de lipasa determinada según Food Chemical Codex (3ª Ed., 1981, pág. 492-493) modificado para aceite de girasol y pH 5,5 en

50 lugar de aceite de oliva y pH 6,5. La actividad de lipasa se mide como LUS (unidades de lipasa de girasol, del inglés "lipase units sunflower"), donde 1 LUS se define como la cantidad de enzima que puede liberar 1 [mu]mol de ácidos grasos por minuto a partir de aceite de girasol en las condiciones de ensayo anteriores.

Ensayo Lut

Alternativamente, se puede usar el ensayo LUT como se define en el documento WO9845453.

La lípido acil transferasa para uso en el método en el método y/o usos de la presente descripción, que es sustancialmente incapaz de actuar sobre un triglicérido, puede presentar un LUS/mg de menos de 1000, por ejemplo menos de 500, tal como menos de 300, preferiblemente menos de 200, más preferiblemente menos de 100, más preferiblemente menos de 50, más preferiblemente menos de 20, más preferiblemente menos de 10, tal como menos de 5, menos de 2, más preferiblemente menos de 1 LUS/mg. Alternativamente, la actividad de LUT/mg puede ser inferior a 500, tal como menos de 300, preferiblemente menos de 200, más preferiblemente menos de 100, más preferiblemente menos de 50, más preferiblemente menos de 20, más preferiblemente menos de 10, tal como menos de 2, más preferiblemente menos de 1 LUT/mg.

La lípido acil transferasa para uso en el método y/o usos de la presente descripción, que es sustancialmente incapaz de actuar sobre un monoglicérido, puede determinarse usando un monooleato (M7765, 1-Oleoil-rac-glicerol, 99%) en lugar del aceite de girasol en el ensayo LUS. Se define 1 MGHU como la cantidad de enzima que puede liberar 1 [mu]mol de ácidos grasos por minuto desde un monoglicérido en las condiciones de ensayo.

La lípido acil transferasa para uso en el método en el método y/o usos de la presente descripción, que es sustancialmente incapaz de actuar sobre un triglicérido, puede presentar un MGHU/mg de menos de 5000, por ejemplo menos de 1000, por ejemplo menos de 500, tal como menos de 300, preferiblemente menos de 200, más preferiblemente menos de 100, más preferiblemente menos de 50, más preferiblemente menos de 20, más preferiblemente menos de 10, tal como menos de 5, menos de 2, más preferiblemente menos de 1 MGHU/mg.

Preferiblemente, el método y/o uso puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un alimento a una temperatura de 1560°C, preferiblemente a una temperatura de 20-60°C, preferiblemente 20-50°C, preferiblemente 20-45°C, preferiblemente 20-40°C. Para algunos aspectos, por ejemplo en una masa, preferiblemente la temperatura del alimento a la cual tiene lugar la reacción de aciltransferasa está entre 20 y 40°C. Para algunos aspectos, por ejemplo con respecto a productos lácteos, tal como queso, la temperatura del alimento puede estar de forma adecuada entre 30ºC y 60°C. En otros aspectos adicionales, por ejemplo con respecto a la mayonesa, la temperatura del alimento puede estar de forma adecuada entre 20 y 40ºC, más preferiblemente entre 25 y 30°C.

Preferiblemente, el emulsionante producido constituye menos del 5% p/p del alimento.

Preferiblemente, el emulsionante producido constituye entre el 0,01 y el 4 % p/p del alimento.

Preferiblemente, el emulsionante producido constituye entre el 0,01 y el 2 % p/p del alimento.

Preferiblemente, el emulsionante producido constituye entre el 0,01 y el 1 % p/p del alimento.

Preferiblemente, el emulsionante producido constituye entre el 0,01 y el 0,5 % p/p del alimento.

Preferiblemente, el emulsionante producido constituye entre el 0,01 y el 0,3 % p/p del alimento.

De forma adecuada, el método de acuerdo con la presente descripción incluye la desactivación o desnaturalización de la enzima para proporcionar un alimento que comprende la enzima en una inactiva o desnaturalizada. De forma adecuada, la enzima puede desnaturalizarse mediante cocción o mediante pasteurización.

La presente descripción puede abarcar además el uso de una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria en composiciones enzimáticas para alimentos y/o piensos, y puede abarcar composiciones enzimáticas para alimentos y/o piensos que comprenden una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria. Dichas composiciones pueden contener una o más enzimas adicionales, tales como las enumeradas en la presente memoria. Alternativamente, la composición enzimática de la invención puede usarse en combinación con otros ingredientes/aditivos de alimentos, tal como los enumerados en la presente invención, que incluyen las otras composiciones enzimáticas. Mediante formulación de la lípido acil transferasa de la invención dentro de una composición de alimento y/o pienso, la enzima puede estabilizarse para permitir un almacenamiento prolongado (en condiciones adecuadas) antes de su uso en la producción de alimentos y/o piensos. Adicionalmente, la composición enzimática de la presente descripción proporciona la enzima en una forma adecuada para un uso seguro en la aplicación 'in situ' en la preparación de alimentos y/o piensos, o ingredientes para uso en la preparación de alimentos y/o piensos. Dichas composiciones puede estar en forma líquida, semi-líquida o sólida/granular.

En una realización, la composición enzimática de alimento puede ser de forma adecuada una composición mejoradora de masa. La composición mejoradora de masa puede comprender otros componentes beneficiosos tales como un emulsionante y/u otras enzimas como las enumeradas en la presente memoria.

Las enzimas para alimentos se venden como concentrados líquidos estabilizados o como sólidos particulados. La formulación en una composición enzimática alimentaria minimiza la pérdida de actividad enzimática durante el transporte, almacenamiento y uso. A menudo las enzimas son expuestas a humedad, calor o entornos oxidantes durante el procesado de alimentos y bebidas. Las formulaciones potencia la estabilidad actuando contra la causa principal de la desactivación: desnaturalización, desactivación del sitio catalítico y proteólisis. La desnaturalización se produce por desplegamiento físico de la estructura terciaria proteínica de una enzima sometida a estrés térmico o químico. Una vez que una enzima empieza a desplegarse se vuelve drásticamente más vulnerable a la desactivación y proteólisis. Para minimizar el desplegamiento, el formulador puede alterar el entorno de una proteína de tal modo que se induzca una estructura proteica compacta; esto se lleva a cabo de la forma más eficaz mediante "exclusión preferencial" del agua de la superficie de la proteína a través de la adición de compuestos de asociación con agua tales como azúcares, alcoholes polihídricos y sales liotrópicas. Los mejores modos de combatir la

5 desactivación del sitio activo son asegurar niveles suficientes de los cofactores requeridos, añadir inhibidores reversibles, y excluir especies oxidantes o reactivas de la formulación.

Además de la estabilidad enzimática, una formulación debería cumplir varios requisitos secundarios clave, que incluyen la preservación frente a contaminación microbiana, evitar la precipitación física o la formación de niebla, minimizar la formación de polvos o aerosoles sensibilizadores, y la optimización de criterios estéticos tales como el 10 color y el olor. El mejor modo de abordar muchos de estos problemas es en la etapa más temprana posible del proceso, incluyendo la selección de materias primas en la fermentación o el proceso de recuperación de la enzima. Las operaciones a posteriori del proceso, tal como operaciones de tipo diafiltración, adsorción, cromatografía, cristalización y extracción pueden usarse para eliminar las impurezas responsables de color, olor y precipitación. El riesgo de precipitación física se minimiza formulando cerca del punto isoeléctrico de la enzima con disolventes

15 hidrofílicos tales como glicerol o propilen glicol. También se pueden añadir de manera efectiva niveles moderados de sales de solvatación para evitar la precipitación de sales o la "redisolución de sales inversa". Para prevenir la contaminación microbiana, se puede usar una combinación de filtración, acidificación y la minimización de agua libre, los biocidas pueden ser efectivos, pero el rango de productos químicos aceptables para controlar o matar microbios es cada vez más reducido por temas de regulación de seguridad y salud.

20 Dos procesos que producen los gránulos más resistentes a la atrición son la granulación de alta cizalla y el recubrimiento por pulverización en lecho fluidizado, véase por ejemplo T. Becker: "Separation and Purification Processes for Recovery of Industrial Enzymes" en R. K. Singh, S. S. H. Rizvi (eds.): Bioseparation Processes in Foods, Marcel Dekker, Nuevo York, pág. 427 - 445. Estos procesos usan varios aglomerantes, recubrimientos y morfologías de partícula para producir partículas no desmenuzables que además de proteger a las enzimas durante

25 el almacenamiento, permiten su liberación fácil a la disolución durante el uso.

Las composiciones enzimáticas alimentarias que contienen la lípido acil transferasa pueden prepararse usando técnicas de formulación estándares, tal como secado por pulverización o formulación de líquidos.

La lípido acil transferasa puede expresarse en cualquier hospedante de expresión adecuado. Por ejemplo, la lípido aciltransferasa puede expresarse en Bacillus subtilis y puede purificarse mediante ultrafiltración y/o precipitación en

30 etanol y/o centrifugación, y puede ser secada a continuación mediante secado por pulverización usando almidón (maltodextrina) como vehículo para la enzima. La enzima secada por pulverización puede estandarizarse a una actividad PLU especificada añadiendo más vehículo en forma de polvo. Las técnicas implicadas están bien establecidas y son rutinarias en la técnica.

Alternativamente, la lípido aciltransferasa, por ejemplo la lípido aciltransferasa producida heterólogamente, una vez

35 purificada, puede ser estabilizada en una formulación líquida adecuada, tal como las basadas en glicerol. En los documentos EP 0 770 037 y EP 0 702 712 se describen otros métodos para preparar formulaciones enzimáticas estabilizadas.

La acil transferasa en polvo también puede usarse en combinación con otras enzimas enumeradas en la presente memoria, para la producción de composiciones enzimáticas con una actividad definida según la especificación del

40 producto.

Típicamente, la dosis de la formulación de enzima alimentaria se encuentra entre 10 g y 1000 g por cada 1000 kg de alimento, preferiblemente 50-200 g por cada 1000 kg de alimento, preferiblemente, 75-125 g por cada 1000 kg de alimento.

Preferiblemente, la enzima está presente en una forma inactiva o en una forma desnaturalizada en el alimento.

45 En una realización, la enzima preferiblemente no está inmovilizada, en particular no está inmovilizada sobre un soporte sólido.

En una realización alternativa, la enzima puede estar inmovilizada.

La lípido acil transferasa inmovilizada se puede preparar usando técnicas de inmovilización conocidas en la técnica. Existen numerosos métodos para preparar enzimas inmovilizadas, lo que será evidente para el especialista en la

50 técnica (por ejemplo, las técnicas referidas en la solicitud de patente EP 0 746 608; o en Balcao VM, Paiva AL, Malcata FX., Enzyme Microb Technol. 1 de mayo de 1996; 18(6): 392-416; o en Reetz MT, Jaeger KE.Chem Phys Lipids. junio de 1998; 93(1-2): 3-14; o en Bornscheuer UT, Bessler C, Srinivas R, Krishna SH.Trends Biotechnol. Octubre de 2002; 20(10): 433-7.

En una realización, el alimento puede contener ingredientes alimentarios, que han sido preparados usando lípido

55 aciltransferasa inmovilizada, pero no contienen la lípido aciltransferasa en el ingrediente alimentario o alimento. Por ejemplo, el alimento puede contener uno o más de los siguientes: un emulsionante, más de un emulsionante, uno o más agentes aromatizantes, uno o más potenciadores de la textura y/o uno o más ésteres de esterol, tal como ésteres de fitoesterol o ésteres de fitoestanol.

La enzima puede usarse con uno o más emulsionantes convencionales, que incluyen por ejemplo monoglicéridos, ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- y di-glicéridos de ácidos grasos, y lecitinas, por ejemplo obtenidas a 5 partir de soja.

La enzima puede usarse con una o más enzimas de grado alimentario adecuadas. Además de la enzima de la invención, se añade al menos una enzima adicional al alimento. Dichas enzimas adicionales incluyen enzimas degradadoras de almidón tales como endo- o exo-amilasas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas que incluyen xilanasas, celulasas, oxidorreductadas, por ejemplo peroxidasas, fenol oxidasas, glucosa oxidasa,

10 piranosa oxidasa, sulfhidril oxidasa, o una oxidasa de carbohidrato tal como una que oxida maltosa, por ejemplo hexosa oxidasa (HOX), lipasas, fosfolipasas, glicolipasas, galactolipasas y proteasas.

En una realización la enzima puede ser Dairy HOX™, que actúa como un secuestrador de oxígeno para prolongar la fecha de caducidad del queso, a la vez que proporciona un control de la aparición de color marronáceo en hornos de pizza. Por lo tanto, en un aspecto, la presente descripción se refiere al uso de una enzima capaz de reducir la

15 reacción de maillard en un alimento (véase el documento WO02/39828, incorporado aquí a modo de referencia), tal como un producto lácteo, por ejemplo queso, donde la enzima preferiblemente es una enzima que oxida maltosa tal como carbohidrato oxidasa, glucosa oxidasa y/o hexosa oxidasa, en el proceso de preparación de una materia alimentaria y/o alimento.

En una realización preferida, la lípido aciltransferasa se usa en combinación con una lipasa que tiene una o más de

20 las siguientes actividades: actividad de glicolipasa (E.C. 3.1.1.26), actividad de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3), actividad de fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) o actividad de fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32). De forma adecuada, las enzimas lipasa son bien conocidas en la técnica y a modo de ejemplo incluyen las siguientes lipasas: LIPOPAN® F y/o LECITASE®ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca), fosfolipasa A2 (por ejemplo, fosfolipasa A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts, LIPOMAX™ de Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Dinamarca), las lipasas mostradas en

25 WO03/97835, EP 0 977 869 o EP 1 193 314. Esta combinación de una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria y una lipasa puede ser particularmente preferida en productos de masa o cocinados, o en productos alimentarios finos tales como pasteles y confitería.

En algunas realizaciones, también puede ser beneficioso combinar el uso de lípido aciltransferasa con una lipasa como pasta de cuajo preparada a partir de ternero, cordero, estómago de crías, o Palatase A750L (Novo), Palatase 30 M200L (Novo), Palatase M1000 (Novo) o Piccantase A (DSM), también Piccantase de fuentes animales de DSM (K, KL, L & C) o Lipomod 187, Lipomod 338 (Biocatalysts). Estas lipasas se usan convencionalmente en la producción de queso para producir aromas de queso. Estas lipasas también pueden usarse para producir un alimento modificado enzimáticamente, por ejemplo un producto lácteo (por ejemplo, queso), particularmente donde dicho producto lácteo consiste en, es producido a partir de o consta de grasa butírica. Una combinación de la lípido

35 aciltransferasa con una o más de estas lipasas puede tener un efecto beneficioso sobre el sabor de un producto lácteo (por ejemplo, queso).

El uso de lipasas en combinación con la enzima puede ser particularmente ventajoso en los casos en los que puede ser deseable algo de acumulación de ácidos grasos libres, por ejemplo en el queso en el que los ácidos grasos libres pueden conferir un sabor deseable, o en la preparación de alimentos finos. El especialista en la técnica será 40 capaz de combinar proporciones de enzimas lipolíticas, por ejemplo LIPOPAN® F y/o LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca), fosfolipasa A2 (por ejemplo, fosfolipasa A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts, LIPOMAX™ de Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Dinamarca), las lipasas mostradas en WO03/97835, EP 0 977 869 o EP 1 193 314 y la lípido aciltransferasa para proporcionar la relación deseada de actividades hidrolítica y transferasa que dé como resultado un efecto técnico preferido o una combinación de efectos técnicos preferidos en

45 el alimento (tal como los enumerados en la presente memoria en el epígrafe "Efectos Técnicos").

También puede ser beneficioso combinar el uso de lípido aciltransferasa con una fosfolipasa, tal como fosfolipasa A1, fosfolipasa A2, fosfolipasa B, fosfolipasa C y/o fosfolipasa D.

El uso combinado puede llevarse a cabo secuencialmente o simultáneamente, por ejemplo el tratamiento con lípido aciltransferasa puede producirse antes o durante el tratamiento adicional con enzima. Alternativamente, el

50 tratamiento adicional con enzima puede producirse antes o durante el tratamiento con lípido acil transferasa.

En el caso de tratamientos enzimáticos secuenciales, en algunas realizaciones puede ser ventajoso eliminar la primera enzima usada, por ejemplo mediante desactivación térmica o mediante el uso de una enzima inmovilizada, antes del tratamiento con la segunda (y/o tercera, etc.) enzima.

Tradicionalmente, la industria de pasteles usa mejoradores de pasteles para la producción de pasteles y para

55 asegurar pasteles de elevada calidad en términos de sabor, estructura, calidad de comida y apariencia. Dichos mejoradores de pasteles normalmente se basan en emulsionantes secados por pulverización sobre un vehículo tipo almidón y malto dextrina. Algunos mejoradores de pasteles también se encuentran en forma de gel basada en emulsionantes, azúcares y agua. Estos mejoradores de pasteles son muy importantes para la industria pastelera a fin de producir pasteles de alta calidad. Los mejoradores de pasteles, sin embargo, contienen emulsionantes y otros ingredientes "no naturales" con un E-número. Debido a la demanda de los consumidores por reducir el número de Enúmeros, la industria pastelera ha solicitado alternativas para producir pasteles de alta calidad sin usar emulsionantes.

5 Un modo alternativo para producir pasteles es usar una enzima, es decir la lípido aciltransferasa definida en la presente memoria o una composición enzimática.

La lípido aciltransferasa definida en la presente memoria y/o la composición enzimática alimentaria puede usarse en las preparaciones de un alimento fino, tal como un pastel. En dichos casos, se pueden formar los siguientes constituyentes en el alimento fino:

10 i) ésteres de azúcar y lisolecitina (a partir del carbohidrato en la receta de pasteles y la lecitina en huevo que también forma parte de la receta de pasteles); y/o

ii) péptidos acilados y lisolecitina (mediante transferencia de un ácido graso desde lecitina hasta una proteína o péptido durante la formación de condensados de proteína-ácido graso, que son conocidos por ser emulsionantes altamente eficientes (Herstellung und Anvendungmöglichkeiten von Eiweiss-Fëttsäurekondensaten. Andreas Sander,

15 Eberhard Eilers, Andrea Heilemann, Edith von Kreis.Fett/lipid 99 (1997) Nr. 4, 115-120).

Se considera que en la producción de algunos alimentos finos, particularmente alimentos finos de alto contenido en grasa, tales como pasteles, puede ser deseable tener algo de acumulación de ácidos grasos. Por tanto, la combinación del uso de enzimas lipolíticas y lípido acil transferasa definida en la presente memoria puede ser particularmente beneficiosa para la producción de alimentos finos de alto contenido en grasa. Alternativamente, se

20 pueden seleccionar ácidos grasos libres adicionales o jabón de ácido graso (E470a) y usarse en combinación con la lípido acil transferasa.

El alimento puede comprender de manera adecuada uno o más de los siguientes aditivos: material de proteína de soja; carotenoides, flavenoides, antioxidantes y fitoquímicos (especialmente antocianonide, carotenoide, bioflavinoide, glutationa, catequina, isoflavona, licopeno, ginsenoside, picnogenol, alcaloide, pigeum fitoesterol, 25 sulforafona, resveretol, extracto de semilla de uva o comida que contiene ésteres de estanol), vitaminas (especialmente vitamina C, vitamina A, vitamina B3, vitamina D, vitamina E, tiamina, riboflavina, niacina, piridoxina, cianocobalamina, ácido fólico, biotina, ácido pantoténico o vitamina K), minerales (especialmente calcio, yodo, magnesio, zinc, hierro, selenio, manganeso, cromo, cobre, cobalto, molibdeno o fósforo), ácidos grasos (especialmente ácido gamma linoleico, ácido ucospentaenoico o ácido decosahexaenoico), aceites (especialmente 30 aceite de borraja, aceite de canola de alto contenido en carotenoides o aceite de semilla de lino), aminoácidos (especialmente triptófano, lisina, metionina, fenilalalina, treonina, valina, leucina, isoleucina, alanina, arginina, ácido aspártico, cistina, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, prolina, hidroxiprolina, serina, taurina o tirosina), enzimas (especialmente bromelaíona, papaína, amilasa, celulasa o coenzima Q), lignina, éster de estanol o bacterias amistosas (especialmente Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus bifidus,

35 Lactobacillus plantarum o Streptococcus faecium), ácido fólico y fibra soluble.

Efecto Técnico

Sorprendentemente, las lípido aciltransferasas presentan una actividad de aciltransferasa significativa en alimentos. Esta actividad tiene aplicaciones beneficiosas sorprendentes en la preparación de alimentos.

La presente descripción se predica sobre el sorprendente descubrimiento de que las lípido aciltransferasas pueden

40 llevar a cabo la esterificación de carbohidratos vía alcohólisis, es decir la transferencia de acilo desde un lípido, en un alimento con un contenido significativo de agua. La técnica anterior sugiere que dichas enzimas, si funcionan de esta manera, sólo funcionarían en un entorno con disolvente (es decir, en entornos con bajo o nulo contenido en agua).

La presente descripción puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos en productos de huevo,

45 particularmente en mayonesa: un estabilidad térmica mejorada durante la pasteurización; propiedades organolépticas mejoradas; una consistencia mejorada.

La presente descripción puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos no esperados en productos de masa y/o cocinados: un volumen específico mejorado tanto de la masa como de los productos cocinados (por ejemplo, de pan y/o pasteles); una estabilidad de la masa mejorada; una puntuación de corteza

50 mejorada (por ejemplo una corteza de pan más fina y/o más crujiente), una puntuación de miga mejorada (por ejemplo, una distribución de miga más homogénea y/o una estructura de miga más fina y/o una miga más fina); una apariencia mejorada (por ejemplo, una superficie suave sin ampollas o agujeros o sustancialmente sin ampollas o agujeros); una menor correosidad; una suavidad potenciada; un olor mejorado; un sabor mejorado.

La presente descripción puede proporcionar un efecto beneficioso de la formación de materiales con elevada 55 actividad superficial en un alimento sin la formación de una cantidad sustancial de ácidos grasos libres, lo que reduce la capacidad del alimento para oxidarse durante el almacenamiento, ya que los ácidos grasos libres son más propensos a la oxidación que los correspondientes ésteres de ácidos grasos.

De forma adecuada, la presente descripción puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos no esperados en un alimento: una apariencia mejorada, una sensación en la boca mejorada, una estabilidad mejorada, 5 en particular una estabilidad térmica mejorada, un sabor mejorado, una suavidad mejorada, una resiliencia mejorada, una emulsificación mejorada.

De forma adecuada, la presente descripción puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos no esperados en productos lácteos, tal como helado, por ejemplo: una sensación en la boca mejorada (preferiblemente una sensación más cremosa); un sabor mejorado; una fusión mejorada.

10 De forma adecuada, la presente descripción puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos en huevo o productos de huevo: estabilidad de la emulsión mejorada; estabilidad térmica de la emulsión; sabor mejorado, mal olor reducido, propiedades de espesamiento mejoradas, consistencia mejorada.

Los efectos técnicos específicos asociados al uso de una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria en la preparación de un alimento se enumeran en la tabla presentada a continuación:

Alimento: Efecto

1: Pan, Magdalenas y Donuts Fortalece la masa e incrementa la resistencia mecánica y aumenta la capacidad de absorción de agua. Incrementa el volumen de productos de panadería y mantiene la suavidad de la mida

2: Masa congelada Evita el deterioro durante la refrigeración

3: Pastel esponjoso Produce un buen volumen de pastel y una textura suave uniforme

4: Galletas, galletas crujientes Produce emulsiones estables de la grasa y evita que se pegue a la máquina. Evita la aparición de productos de alto contenido en grasa

5: Empanado Mejora la textura de los productos fritos.

6: Fideos Evita que la masa se pegue a la máquina. Aumenta el contenido de agua, y disminuye la pérdida por cocción

7: Fideos instantáneos Evita que los fideos se formen adheridos unos a otros

8: Pasta El acondicionador de la masa evita la adhesión durante la cocción

9: Crema pastelera Produce pasta de almidón con una textura suave y cremosa, y evita la deshidratación.

10: Blanqueante de café Evita aceite y agua

11: Nata montada Proporciona una emulsión estable

12: Chocolate Evita o reduce el afloramiento

13: Caramelo, golosinas y turrón Mejora la emulsificación de azúcar fundido y aceite. Evita la separación de aceite.

14: Carne procesada, salchichas Mejora la capacidad de retención de agua de las salchichas y el jamón comprimido, y evita la separación de la fase aceite de pastas y paté.

De forma adecuada, la presente descripción puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos no esperados en un queso: una disminución del efecto de pérdida de aceite del queso; un aumento del rendimiento de queso; una mejora en el sabor; un mal olor reducido, un sabor "jabonoso" reducido.

El sudado es la tendencia a formar aceite libre durante el almacenamiento y la fusión. Un sudado excesivo es un defecto que casi siempre se asocia a productos calentados en los que se usa queso, por ejemplo pizza y productos relacionados (véase, por ejemplo, Kindstedt J. S; Rippe J. K. 1990, J Dairy Sci. 73: 867-873). Cada vez es más importante controlar/eliminar este defecto, ya que está aumentando la preocupación del consumidor por los niveles

5 de grasa de la dieta. El aceite/grasa libre en un producto se percibe como un elevado contenido en grasa y, generalmente, no es deseable. El efecto de eliminación de aceite no solo puede afectar a la apariencia del queso, sino que en casos extremos el aceite liberado por el queso puede extenderse por el producto alimenticio y ser absorbido por el producto alimenticio. Esto es particularmente pernicioso para productos alimenticios que contengan componentes horneados, tal como una base de pizza, y el efecto no se aprecia solo en una apariencia no deseada, sino que también se puede producir una textura y un sabor perjudiciales.

En los alimentos la fase de grasa se estabiliza a menudo mediante emulsificación mecánica, por ejemplo, mediante homogeneización. Generalmente, esta tecnología no es aplicable a la producción de queso, ya que la homogeneización de la leche de queso tiene una influencia negativa sobre las propiedades de coagulación de la leche de queso, así como sobre el rendimiento y el sabor del queso producido a partir de la misma.

15 El uso del alimento y/o materia alimentaria modificado con la enzima (que incluye leche, nata y/o grasa butírica modificadas con enzima, por ejemplo) puede usarse para producir alimentos, tal como queso, con un efecto de sudado reducido, y/o para mejorar las propiedades de homogeneización de la leche de queso, y/o para reducir la influencia negativa de las propiedades de coagulación de la leche de queso homogeneizada cuando se transforma en queso, y/o para mejorar el sabor y/o la textura del queso.

El efecto de sudado de aceite y el rendimiento de queso y el rendimiento/contenido de grasa puede determinarse siguiendo los protocolos descritos en el documento WO00/54601.

En una realización, el alimento preparado (por ejemplo el producto lácteo, por ejemplo queso) puede tener un rendimiento más elevado.

Se pueden producir aumentos del rendimiento a queso cuando la leche y/o nata de queso son modificadas

25 directamente mediante tratamiento enzimático, y/o cuando la leche de queso es suplementada con el aceite o grasa modificados enzimáticamente, tal como grasa butírica modificada enzimáticamente.

Una ventaja adicional puede ser la reducción de los aromas y/o sabores negativos, preferiblemente reduciendo la cantidad de ácidos grasos libres en los alimentos tratados enzimáticamente (por ejemplo, en el queso).

Una ventaja es que la lípido aciltransferasa puede usarse en una dosis menor para producir el mismo efecto (o mejor) que una fosfolipasa A2 (PLA2). Por tanto, efectivamente puede necesitarse enzima para alcanzar los mismos resultados (o mejores).

Otra ventaja es que la lípido aciltransferasa para uso en la presente invención y particularmente en la fabricación de queso no requiere necesariamente un pretratamiento de la leche y/o nata. De hecho, la lípido aciltransferasa cuando se usa en la presente descripción puede añadirse directamente a la cuba de queso. Esto puede simplificar de forma

35 ventajosa el proceso de fabricación del queso para el usuario final.

Otra ventaja es que la lípido aciltransferasa puede aumentar el contenido de humedad del alimento, tal como por ejemplo un queso (por ejemplo, mozarella) y/o grasa butírica, en comparación con si se usa una fosfolipasa como Lecitase™, por ejemplo.

En una realización, el uso del alimento y/o materia alimentaria modificado con enzima puede emplearse para producir un alimento tal como un queso que tenga un contenido de humedad incrementado comparado con si se usa una fosfolipasa como Lecitase™, por ejemplo. Dicha realización puede ser particularmente ventajosa cuando el alimento y/o materia alimentaria es un producto lácteo, por ejemplo leche, nata, grasa butírica y/o queso.

Otra ventaja es que pueden producirse en el alimento ésteres de esterol y/o ésteres de estanol. Dicha realización puede ser particularmente ventajosa cuando el alimento y/o materia alimentaria es un producto lácteo, por ejemplo

45 leche, nata, grasa butírica y/o queso.

De forma ventajosa, la presente descripción puede usarse para reducir el nivel de colesterol de un alimento, particularmente un producto lácteo, por ejemplo queso.

En la producción de alimentos, en particular en la producción de queso, el uso de la lípido aciltransferasa proporciona una ventaja significativa en la capacidad para recuperar proteínas solubles de productos lácteos. Por ejemplo, en la producción de queso casi el 20% de todas las proteínas lácteas son retiradas en el suero (es decir, la parte acuosa de la leche que permanece tras la formación de la cuajada). El suero comprende las proteínas lácteas solubles, mientras que las proteínas hidrofóbicas se mantienen en la cuajada. Mediante el uso de la lípido aciltransferasa es posible transferir un grupo acilo desde un lípido (preferiblemente desde un glicolípido o un fosfolípido) hasta una proteína (en particular a una proteína de suero, tal como una lactoglobulina) para formar un 55 condensado de ácido graso proteico. Produciendo de este modo un producto que es más hidrofóbico y que

permanecerá en la cuajada en lugar de ser eluído al suero. Así, se puede retener una mayor proporción de la proteína láctea en el alimento final, es decir en el producto lácteo final, tal como en el queso.

En un aspecto, la presente descripción se basa en parte en el hecho de que los rendimientos a alimentos -tal como queso- pueden mejorarse mediante el uso de una lípido acil transferasa. Adicionalmente o alternativamente, se

5 puede mejorar el aroma, la textura, la estabilidad oxidativa y/o la fecha de caducidad del alimento. Adicionalmente o alternativamente, el alimento puede tener un menor nivel de colesterol o un mayor contenido de fitoesterol/ésteres de estanol.

Sin pretender establecer ninguna teoría particular, se considera que el aumento del rendimiento puede ser resultado de la transesterificación de las proteínas y péptidos del suero, que da como resultado un aumento de la

10 hidrofobicidad de las proteínas del suero y la precipitación de las proteínas de suero aciladas en la cuajada de queso.

En sistemas biológicos, por ejemplo, la deposición de proteínas ligadas a membrana y enzimas se consigue a través de dos mecanismos diferentes. Las proteínas ligadas a membrana o bien poseen un número de dominios hidrofóbicos o de membrana, o alternativamente pueden presentar un ácido graso unido a la cadena de polipéptido.

15 Los ácidos grasos normalmente pueden tener una longitud de cadena de 14 ó 16 átomos de carbono. Los ácidos grasos se unen covalentemente a una cadena de polipéptidos en 3 posiciones diferentes, el aminoácido N-terminal con un enlace amida, un residuo de cisteína con un enlace tioéster, o un aminoácido de serina o treonina con un enlace éster. Solo es necesario un ácido graso por molécula de polipéptido para incorporar la proteína a la membrana celular.

20 Cuando un ácido graso está ligado covalentemente a una proteína que no es de membrana, las propiedades físicas y funcionales cambian drásticamente. El documento WO 97/14713 describe proteínas de soja y gluten transformadas en derivadas de acilo mediante tratamiento con una lipasa de Mucor miehei (Lipozyme™, Novozymes), y un ácido graso en disolvente orgánico. La lípido acil transferasa puede usarse en la producción de proteínas aciladas en un medio con bajo o alto contenido en agua.

25 Cabe destacar que las proteínas aciladas forman complejos anfifílicos que pueden usarse para una serie de productos cosméticos. La proteína acilada puede formar geles, ligar agua por retención de humedad, presentar propiedades emulsionantes, y es muy activa en la interfase entre el agua y el lípido.

Por tanto, la presente descripción puede, en un aspecto, proporcionar una composición cosmética que comprende una lípido acil transferasa como la definida en la presente memoria.

30 Además, la presente descripción puede proporcionar el uso de una aciltransferasa como la definida en la presente memoria para producir una composición cosmética.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para la producción in situ de un éster de proteína en una composición cosmética, donde el método comprende la etapa de añadir a la composición cosmética (o a sus componentes) una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria.

35 Muchas proteínas alimentarias son solubles en disolución acuosa y por tanto son adecuadas para la modificación situ por acción de la lípido acil transferasa. En la producción de queso, la β-lactoglobulina se pierde en la fracción se suero. Sin embargo, tras acilación con una lipasa acil transferasa, o una variante de lipasa acil transferasa, los resultados iniciales indican que la β-lactoglobulina puede depositarse en la superficie micelar de caseína durante la coagulación de cuajo. La β-lactoglobulina tiene tres sitios de acilación potenciales (residuos de serina) en tres lazos

40 superficiales. La leche contiene una cantidad suficiente de lecitina, un sustrato adecuado para que una enzima lípido acil transferasa produzca la acilación de la β-lactoglobulina. La lisolecitina puede tener un efecto emulsionante adicional.

Las mejoras observadas con lípido aciltransferasa son comparables a cuando se usan enzimas lipolíticas sin actividad aciltransferasa, tal como triacilglicerol lipasas y fosfolipasas.

45 Ventajas

La generación de un emulsionante y un éster de esterol/estanol in situ a partir de al menos un constituyente de la materia alimentaria, significa que la materia alimentaria contendrá al menos un material aditivo menos. Esto es ventajoso debido a la mejora en la facilidad de producción. Por ejemplo, puede que no se requiera un procesamiento adicional o la adición de ingredientes o la adición de emulsionantes. Además, el alimento puede contener menos

50 "aditivos". La reducción o eliminación de "aditivos" es deseable para los consumidores y la inclusión de aditivos a menudo debe ser declarada al consumidor en la lista de ingredientes del alimento.

Una ventaja puede ser la producción in situ de un emulsionante en un alimento sin un aumento negativo del contenido de ácidos grasos libres del alimento.

La generación de dos emulsionantes y/o ésteres de carbohidrato in situ a partir de al menos un constituyente de la materia alimentaria, significa que la materia alimentaria contendrá al menos un material aditivo menos.

Además, cuando la lípido aciltransferasa actúa sobre un glicolípido es posible producir de forma ventajosa el emulsionante DGMG in situ sin un aumento perjudicial del contenido de ácidos grasos libres en el alimento. Se

5 reducen de este modo los efectos perjudiciales atribuidos a un aumento del contenido de ácidos grasos libres, que incluyen, aunque sin limitación, una reducción del sabor "jabonoso" en el queso, la prevención de la sobredosis en la masa y las propiedades de cocción de la masa.

Para algunos aspectos, una ventaja es la reducción en los niveles de colesterol libre en el alimento.

Para otro aspecto, una ventaja es el aumento del contenido de ésteres de estanol y/o de esterol en el alimento.

10 Algunos ésteres de esterol/estanol pueden ser aromatizantes y/o texturizantes efectivos. Por tanto, la presente descripción puede no resultar únicamente en la producción in situ de un emulsionante en un alimento, sino también en la producción in situ de un aromatizante y/o un texturizante. Se sabe que algunos ésteres de esterol/estanol reducen el colesterol en suero sanguíneo y/o las lipoproteínas de baja densidad cuando se consumen en un alimento. Por tanto, la presente descripción puede usarse para preparar un alimento con niveles incrementados de

15 ésteres de esterol y/o ésteres de estanol.

Para algunos aspectos, particularmente cuando la enzima según la presente invención se usa en productos basados en huevo, una ventaja es la eliminación de carbohidratos libres no deseados.

También de forma ventajosa las propiedades de emulsificación son potenciadas, conduciendo a una mejora de la apariencia y/o las propiedades de manejo y/o la estructura y/o la consistencia y/o la estabilidad térmica, sin un

20 impacto negativo en el sabor.

Adicionalmente, para algunas realizaciones, de forma ventajosa el efecto de "sobredosis" observado cuando se usan lipasas per se, se supera eficazmente mediante la adición de una enzima. Esto se debe, al menos en parte, al hecho de que no se producen ácidos grasos libres, o lo hacen solo en un grado no significativo, cuando se usa la enzima.

Otras ventajas adicionales y/o alternativas se presentan en la sección anterior titulada "Efectos Técnicos".

25 Aislada

En un aspecto, el polipéptido o proteína se encuentra preferiblemente en forma aislada. El término "aislada" significa que la secuencia está sustancialmente libre de al menos otro componente con el que la secuencia está asociada de forma natural en la naturaleza y tal como se encuentra en la naturaleza.

Purificada

30 En un aspecto, el polipéptido o proteína se encuentra preferiblemente en forma purificada. El término "purificada" significa que la secuencia se encuentra en un estado relativamente puro -por ejemplo, al menos aproximadamente pura en un 51%, o al menos aproximadamente un 75%, o al menos aproximadamente un 80%, o al menos pura en aproximadamente un 90%, o al menos pura en aproximadamente un 95% o al menos pura en aproximadamente un 98%.

35 Clonación de una Secuencia de Nucleótidos que Codifica un Polipéptido

Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, o un polipéptido que es adecuado para modificación, puede ser aislado a partir de cualquier célula u organismo que produzca dicho polipéptido. En la técnica se conocen varios métodos para el aislamiento de secuencias de nucleótidos.

40 Por ejemplo, se puede construir una biblioteca de ADN y/o de ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce el polipéptido. Si se conoce la secuencia de aminoácidos del polipéptido, se pueden sintetizar sondas de oligonucleótidos marcadas y usarse para identificar clones que codifican polipéptidos procedentes de la biblioteca genómica preparada a partir del organismo. De forma alternativa, se podría usar una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homólogas a otro polipéptido de gen conocido para

45 identificar clones que codifican polipéptidos. En el último caso, se usan condiciones de hibridación y lavado de baja severidad.

Alternativamente, se podrían identificar clones que codifican polipéptidos insertando fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformando bacterias negativas en enzimas con la biblioteca de ADN genómica resultante, y a continuación llevando a placa las bacterias transformadas sobre agar que contiene

50 una enzima inhibida por el polipéptido, permitiendo con ello que los clones expresen el polipéptido que va a ser identificado.

En otra alternativa adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido puede prepararse sintéticamente mediante métodos estándar, por ejemplo el método de fosforoamidita descrito por Beucage S.L. et al (1981)

Tetrahedron Letters 22, pág. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al (1984) EMBO J. 3, pág. 801-805. En el método de fosforoamidita, se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se maduran, se ligan y se clonan en vectores apropiados.

La secuencia de nucleótidos puede ser origen mixto genómico y sintético, de origen mixto sintético y de ADNc, o de origen mixto genómico y de ADNc, preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADN (según sea apropiado) de acuerdo con las técnicas estándar. Cada fragmento ligado corresponde a varias partes de la secuencia de nucleótidos completa. La secuencia de ADN también puede prepararse mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en el documento US 4.683.202 o en Saiki R. K. et al (Science (1988) 239, páginas 487-491).

Secuencias de Nucleótidos

La presente descripción también abarca secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria. El término "secuencia de nucleótidos" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una secuencia de oligonucleótido o a una secuencia de polinucleótido, y a sus derivados, fragmentos, variantes y homólogos (tales como sus porciones). La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico o sintético o recombinante, que puede ser de doble cadena o de cadena doble que representa tanto la cadena sentido como la antisentido.

El término "secuencia de nucleótidos" referido a la presente descripción incluyen ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferiblemente significa ADN, más preferiblemente ADNc para la secuencia codificadora.

En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos per se que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria no cubre la secuencia de nucleótidos nativa en su entorno natural cuando está ligada a su(s) secuencia(s) asociada(s) de forma natural que también está(n) en su entorno natural. A fin de facilitar la referencia, denominaremos a esta realización preferida "secuencia de nucleótidos no nativa". A este respecto, el término "secuencia de nucleótidos nativa" significa una secuencia de nucleótidos completa que se encuentra en su entorno natural y cuando está ligada operativamente a un promotor completo con el cual está asociada de forma natural, promotor que también se encuentra en su entorno natural. Por tanto, el polipéptido de la presente invención puede expresarse mediante una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo pero donde la secuencia de nucleótidos no está bajo el control del promotor con el cual está asociada de forma natural dentro de dicho organismo.

Preferiblemente el polipéptido no es un polipéptido nativo. A este respecto, el término "polipéptido nativo" significa un polipéptido completo que se encuentra en su entorno nativo y cuando ha sido expresado por su secuencia de nucleótidos nativa.

Habitualmente la secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria se prepara usando técnicas de ADN recombinante (es decir, ADN recombinante). Sin embargo, la secuencia de nucleótidos podría sintetizarse, totalmente o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

Evolución Molecular

Una vez aislada la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, o una vez identificada la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima putativa, puede ser deseable modificar la secuencia de nucleótidos seleccionada, por ejemplo puede ser deseable mutar la secuencia con el objetivo de preparar una enzima.

Se pueden introducir mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados.

Un método adecuado se describe en Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p. 646-649). Otro método para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican enzima se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p. 147-151).

En lugar de mutagénesis dirigida a sitio, tal como se ha descrito previamente, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente, por ejemplo usando un kit comercial como el kit de mutagénesis GeneMorph PCR de Stratagene, o el kit de mutagénesis aleatoria Diversify PCR de Clontech. La solicitud de patente EP 0 583 265 se refiere a métodos de optimización de mutagénesis basada en PCR, que también puede combinarse con el uso de análogos de ADN mutagénicos tales como los descritos en el documento EP 0 866 796. Las tecnologías PCR propensas a error son adecuadas para la producción de variantes de lípido acil transferasas con características preferidas. El documento WO 0206457 se refiere a la evolución molecular de lipasas.

Un tercer método para obtener nuevas secuencias es fragmentar secuencias de nucleótidos no idénticos, usando cualquier número de enzimas de restricción o una enzima tal como ADNasa I, y reconstruyendo secuencias de nucleótidos completas que codifican para proteínas funcionales. Alternativamente, se puede usar una o múltiples secuencias de nucleótidos no idénticos e introducir mutaciones durante la reconstrucción de la secuencia de nucleótidos completa. El barajado de ADN y las tecnologías de barajado de familia son adecuadas para la producción de variantes de lípido acil transferasas con características preferidas. Los métodos adecuados para llevar a cabo el "barajado" se pueden encontrar en los documentos EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606. El

5 barajado también puede combinarse con otras formas de mutagénesis de ADN, tal como se describe en la patente de EE.UU. nº 6.180.406 y la solicitud de patente internacional WO 01/34835.

Por tanto, es posible producir numerosas mutaciones, dirigidas a sitio o aleatorias, en una secuencia de nucleótidos, tanto in vivo como in vitro, y posteriormente realizar un escrutinio para determinar funcionalidades mejoradas del polipéptido codificado empleando diversos medios. Usando métodos de recombinación mediados in silico y exo

10 (véase los documentos WO 00/58517, US 6.344.328, US 6.361.974), por ejemplo, se puede llevar a cabo una evolución molecular en la que la variante producida mantiene una homología muy baja con respecto a enzimas o proteínas conocidas. Las variantes obtenidas de este modo pueden presentar una analogía estructural significativa con respecto a enzimas de transferasa conocidas, pero tienen una homología de secuencia de aminoácidos muy baja.

15 Como ejemplo no limitante, adicionalmente, las mutaciones o variantes naturales de una secuencia de polinucleótido pueden recombinarse con mutaciones naturales o de otro tipo o con variantes naturales para producir nuevas variantes. Dichas nuevas variantes también pueden ser escrutadas para determinar mejoras de la funcionalidad en el polipéptido codificado.

La aplicación de los métodos de evolución molecular mencionados anteriormente y otros similares permite la

20 identificación y la selección de variantes de las enzimas que presentan características preferidas sin ningún conocimiento previo de la estructura o la función de la proteína, y permite la producción de mutaciones o variantes no predecibles pero beneficiosas. Existen numerosos ejemplos de la aplicación de evolución molecular en la técnica para la optimización o la alteración de la actividad enzimática, ejemplos que incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: una expresión y/o actividad optimizadas en una célula hospedante o in vitro, una actividad

25 enzimática incrementada, una especificidad de sustrato y/o producto alterada, una estabilidad enzimática o estructural aumentada o disminuida, una actividad/especificidad enzimática alterada en condiciones ambientales preferidas, por ejemplo, temperatura, pH, sustrato.

Como resultará evidente para el especialista en la técnica, usando herramientas de evolución molecular se puede alterar una enzima para mejorar la funcionalidad de la enzima.

30 De forma adecuada, la lípido aciltransferasa puede ser una variante, es decir, puede contener al menos una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, en comparación con una enzima de partida. Las enzimas variantes retienen al menos el 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de homología con respecto a la enzima de partida. Las enzimas de partida adecuadas pueden incluir cualquier enzima con actividad de esterasa o lipasa. Preferiblemente, la enzima de partida se alinea con la secuencia de consenso

35 pfam00657.

En una realización preferida, una enzima lípido aciltransferasa variante retiene o incorpora al menos uno o más de los residuos de aminoácido de la secuencia de consenso pfam00657 encontrados en los bloques GDSx, GANDY y HPT.

Las enzimas, tal como las lipasas con poca o nula actividad de lípido aciltransferasa en un entorno acuoso pueden

40 ser mutadas usando herramientas de evolución molecular para introducir o potenciar la actividad de transferasa, produciendo de este modo una enzima lípido aciltransferasa con una actividad significativa de transferasa adecuada para uso en las composiciones y métodos de la presente descripción.

De forma adecuada, la lípido aciltransferasa puede ser una variante con actividad enzimática mejorada con lípidos polares, preferiblemente fosfolípidos y/o glicolípidos, en comparación con la enzima de partida. Preferiblemente,

45 dichas variantes también presentan baja o nula actividad con lípidos liso polares. La actividad mejorada con lípidos polares, fosfolípidos y/o glicolípidos, puede ser el resultado de hidrólisis y/o actividad de transferasa o de una combinación de ambos.

Las lípido aciltransferasas variantes pueden presentar una actividad disminuida con triglicéridos, y/o monoglicéridos y/o diglicéridos, en comparación con la enzima de partida.

50 De forma adecuada, la enzima variante puede tener actividad nula con triglicéridos y/o monoglicéridos y/o diglicéridos.

De forma alternativa, la enzima variante puede presentar una actividad incrementada con triglicéridos, y/o también puede presentar una actividad incrementada con uno o más de los siguientes, lípidos polares, fosfolípidos, lecitina, fosfatidilcolina, glicolípidos, monoglicérido de digalactosilo, monoglicérido de monogalactosilo.

55 Se conocen variantes de lípido aciltransferasa, y una o más de dichas variantes pueden ser adecuadas para uso en los métodos y usos según la presente invención y/o en las composiciones enzimáticas según la presente invención.

Simplemente a modo de ejemplo, de acuerdo con la presente invención se pueden usar las variantes de lípido aciltransferasas descritas en las siguientes referencias: Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 enero 15: 266 (2): 9971000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 enero 21; 269(3): 2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 abril, 178 (7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 marzo; 7(3): 587-99.

5 Secuencias de aminoácidos

La presente descripción también abarca secuencias de aminoácidos de polipéptidos que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del

10 término "péptido".

La secuencia de aminoácidos puede prepararse/aislarse a partir de una fuente adecuada, o puede fabricarse sintéticamente o puede prepararse mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.

De forma adecuada, las secuencias de aminoácidos pueden obtenerse a partir de los polipéptidos aislados mostrados en la presente memoria mediante técnicas estándar.

15 Un método adecuado para determinar secuencias de aminoácidos a partir de polipéptidos aislados es el siguiente:

El polipéptido purificado puede liofilizarse y se pueden disolver 100 μg del material liofilizado en 50 μL de una mezcla de urea 8 M e hidrogenocarbonato de amonio 0,4 M, pH 8,4. La proteína disuelta puede ser desnaturalizada y reducida durante 15 minutos a 50ºC después de ventilación con nitrógeno y adición de 5 μL de ditiotreitol 45 mM. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se pueden añadir 5 μL de iodoacetamida 100 mM para derivatizar los

20 residuos de cisteína durante 15 minutos a temperatura ambiente a oscuras y en atmósfera de nitrógeno.

Se pueden añadir 135 μL de agua y 5 μg de endoproteinasa Lys-C en 5 μL de agua a la anterior mezcla de reacción y la digestión se puede llevar a cabo a 37ºC en atmósfera de nitrógeno durante 24 horas.

Los péptidos resultantes pueden separarse mediante HPLC de fase inversa en una columna VYDAC C 18 (0,46 x 15 cm; 10 μm; The Separation Group, California, EE.UU.) usando un disolvente A: 0,1% de TFA en agua y un

25 disolvente B: 0,1 % de TFA en acetonitrilo. Los péptidos seleccionados se pueden volver a someter a cromatografía en una columna Develosil C18 usando el mismo sistema de disolventes, antes del secuenciamiento N-terminal. El secuenciamiento se puede realizar usando un secuenciador Applied Biosystems 476A empleando ciclos rápidos de líquido pulsado siguiendo las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, California, EE.UU.).

Identidad de Secuencia u Homología de Secuencia

30 La presente descripción también abarca el uso de secuencias que presentan un grado de identidad de secuencia o de homología de secuencia con la(s) secuencia(s) de aminoácido(s) de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido (denominada a partir de aquí "secuencia(s) homóloga(s)"). En la presente memoria, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una determinada homología con las secuencias de aminoácidos objeto de la invención y con

35 las secuencias de nucleótidos objeto de la invención. En la presente memoria, el término "homología" puede igualarse a "identidad".

La secuencia de aminoácidos homóloga y/o la secuencia de nucleótidos homóloga debería proporcionar y/o codificar un polipéptido que retiene la actividad funcional y/o potencia la actividad de la enzima.

En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que

40 puede ser idéntica a la secuencia objeto de la invención en al menos un 75, un 85 ó un 90%, preferiblemente idéntica a la secuencia objeto en al menos un 95 ó un 98%. Habitualmente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc. que la secuencia de aminoácidos objeto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácido que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente descripción se prefiere expresar la homología en términos de identidad de

45 secuencia.

En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser idéntica en al menos un 75, 85 ó 90%, preferiblemente idéntica en al menos un 95 ó un 98%, a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente descripción (la secuencia objeto). Habitualmente los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican para los sitios activos, etc., que la secuencia objeto.

50 Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácido que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente descripción se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Las comparaciones de homología se pueden llevar a cabo visualmente, o de forma más habitual con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de ordenador disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.

El % de homología se puede calcular para secuencias contiguas, es decir una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido de una secuencia es comparado directamente con el correspondiente aminoácido de la otra secuencia, residuo a residuo. Esto se denomina alineamiento "sin huecos". Habitualmente, dichos alineamientos sin huecos se llevan a cabo sólo con un número relativamente corto de residuos.

Aunque este es un método muy simple y consistente, no tiene en consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o eliminación provocará que los siguientes residuos de aminoácido queden fuera de alineamiento, dando potencialmente como resultado una gran reducción del % de homología cuando se realiza un alineamiento global. Consecuentemente, la mayoría de los métodos de comparación están diseñados para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta las posibles inserciones y eliminaciones sin penalizar de forma indebida la puntuación global de homología. Esto se logra mediante la inserción de "huecos" en el alineamiento de secuencia para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada hueco que se produce en el alineamiento de tal modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con el mínimo número posible de huecos - lo que refleja la relación entre las dos secuencias comparadas - conseguirá un puntuación mayor que uno con muchos huecos. Habitualmente se usan "costes de hueco afines" que aplican un coste relativamente alto para la existencia de un hueco, y una penalización menor para cada residuo subsiguiente en el hueco. Este el sistema de puntuación de huecos usado más habitualmente. Por supuesto, una elevada penalización de hueco producirá alineamiento optimizados con menores huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones de hueco. Sin embargo, es preferible usar los valores por defecto cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización de hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.

Por lo tanto, el cálculo del % máximo de homología en primer lugar requiere la producción de un alineamiento óptimo, considerando las penalizaciones de hueco. Un programa de ordenador adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p. 387) o el Vector NTI (Invitrogen Corp.). Los ejemplos de software que puede llevar a cabo comparaciones de secuencia incluyen, aunque sin limitación, el paquete BLAST (véase Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed -Capítulo 18), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y Align X, por ejemplo. Tanto el BLAST como el FASTA se encuentran disponibles para búsquedas on line y off line (véase Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a 7-60). También está disponible una nueva herramienta, denomina BLAST 2 Sequences, para comparar secuencias de proteína y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

Aunque el % de homología final se puede medir en términos de identidad, el propio proceso de alineamiento habitualmente no se basa en una comparación de pares todo-o-nada. En lugar de eso, generalmente se usa una matriz de puntuación de escala de similitud que asigna puntuaciones a cada comparación por pares en base a la similitud química o la distancia de evolución. Un ejemplo de dicha matriz usado habitualmente es la matriz BLOSUM62 - la matriz por defecto para el tipo de programas BLAST. Los programas Vector NTI y los programas GCG Wisconsin generalmente usan los valores públicos por defecto o una tabla de comparación de símbolos, si se suministra (véase el manual de usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, es preferible usar los valores públicos por defecto para el paquete GCG o Vector NTI, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Alternativamente, los porcentajes de homología se pueden calcular usando la característica de alineamiento múltiple de DNASIS™ (Hitachi Software), en base a un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).

En caso de que usen penalizaciones de hueco al determinar la identidad de secuencia, se usarán preferiblemente los siguientes parámetros para la alineación por pares:

PARA BLAST

APERTURA DE: 0

HUECO

EXTENSIÓN DE: 0

HUECO

PARA CLUSTAL: ADN PROTEÍNA

TAMAÑO DE PALABRA: 2 1 K triple

PENALIZACIÓN DE HUECO: 15 10

EXTENSIÓN DE HUECO: 6,66 0,1

En una realización, se puede usar CLUSTAL con la penalización de hueco y la extensión de hueco establecidas anteriormente.

De forma adecuada, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se determina sobre al

5 menos 20 nucleótidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 30 nucleótidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 40 nucleótidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 50 nucleótidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 60 nucleótidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 100 nucleótidos contiguos.

De forma adecuada, el grado de identidad con respecto a la secuencia de nucleótidos puede determinarse sobre la secuencia completa.

10 Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software habitualmente realiza esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Las secuencias también pueden tener eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden realizar 15 sustituciones de aminoácidos deliberadas en base a la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos, siempre que se mantenga la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina,

20 asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Se pueden realizar sustituciones conservativas, por ejemplo según la Tabla mostrada continuación. Los aminoácidos del mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente de la misma línea de la tercera columna pueden ser sustituidos entre sí:

ALIFÁTICO: No polar G A P

I L V

Polar - no cargado: C S T M

N Q

Polar -cargado: D E

K R

AROMÁTICO: H F W Y

25 La presente descripción también abarca la sustitución homóloga (sustitución y reemplazamiento se usan ambos en la presente memoria para indicar el intercambio de un residuo de aminoácido existente por un residuo alternativo) que puede producirse, es decir sustitución de tipo-por-tipo tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También se puede producir la sustitución no homóloga, es decir a partir de una clase de residuo por otra,

o alternativamente que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (denominada a partir de

30 aquí Z), ornitina de ácido diaminobutírico (denominada a partir de aquí B), ornitina de norleucina (denominada a partir de aquí O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalalina y fenilglicina.

También se pueden realizar reemplazamientos con aminoácidos no naturales.

Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores que pueden insertarse entre dos residuos de aminoácido cualesquiera de la secuencia, que incluyen grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo, además de espaciadores de aminoácidos tales como residuos de glicina o β-alanina. Otra forma adicional de variación, que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácido en forma peptoide, será bien entendida por los especialistas en la técnica. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se usa para referirse a residuos de aminoácido variantes en los que el grupo sustituyente de carbono α está sobre el átomo de nitrógeno del residuo, en lugar de sobre el carbono α. En la técnica se conocen los procesos para preparar péptidos en la forma peptoide, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.

Las secuencias de nucleótidos o que codifican un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria pueden incluir dentro de ellas nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conoce una serie de tipos diferentes de modificación de oligonucleótidos. Éstas incluyen cadenas de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los propósitos de la presente descripción, debe entenderse que las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria pueden modificarse empleando cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo con el objetivo de potenciar la actividad in vivo o la esperanza de vida de las secuencias de nucleótidos.

La presente descripción también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que sean complementarias a las secuencias discutidas en la presente memoria, o cualquier derivado o fragmento de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de la misma, entonces dicha secuencia puede usarse como sonda para identificar secuencias codificadoras similares en otros organismos, etc.

Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a las secuencias de la presente descripción, pero que entran dentro del alcance de la descripción, se pueden obtener en una variedad de modos. Otras variantes de las secuencias descritas en la presente memoria se pueden obtener, por ejemplo, empleando sondas en bibliotecas de ADN preparadas a partir de una serie de individuos, por ejemplo de individuos procedentes de diferentes poblaciones. Adicionalmente, se pueden obtener otros homólogos víricos/bacterianos, o celulares, particularmente homólogos celulares encontrados en células de mamífero (por ejemplo, células de rata, ratón, bovinas y de primate), y dichos homólogos y sus fragmentos en general serán capaces de hibridarse de forma selectiva con las secuencias mostradas en el listado de secuencias incluido en la presente memoria. Dichas secuencias pueden obtenerse mediante el empleo de sondas en bibliotecas de ADNc preparadas o de bibliotecas de ADN genómicas de otras especies animales, y sondeando dichas bibliotecas con sondas que comprenden la totalidad o una parte de una cualquiera de las secuencias del listado de secuencias anexo, en condiciones de media a alta severidad. Se aplican consideraciones similares a la obtención de homólogos de especie y variantes alélicas de las secuencias de polipéptido o nucleótidos de la descripción.

Las variantes y los homólogos de cepa/especie también pueden obtenerse usando PCR degenerativa, que usará cebadores diseñados para dirigirse a secuencias dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las secuencias de la presente descripción. Se pueden predecir las secuencias conservadas, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varios homólogos/variantes. Los alineamientos de secuencia se pueden llevar a cabo usando un software de ordenador conocido en la técnica. Por ejemplo, se usa ampliamente el programa GCG Wisconsin PileUp.

Los cebadores usados en la PCR degenerativa contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de severidad menores a los usados para clonar secuencias con cebadores de secuencia individuales contra secuencias conocidas.

Alternativamente, dichos polipéptidos pueden obtenerse mediante mutagénesis dirigida a sitio de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando se requieren cambios de secuencia de codón silenciosos para optimizar las preferencias de codón para una célula hospedante concreta en la que se van a expresar las secuencias de polinucleótidos. Pueden ser deseables otros cambios de secuencia con el objetivo de introducir sitios de reconocimiento de polipéptido de restricción, o para alterar la propiedad o la función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos) de la invención pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda por ejemplo marcada con una etiqueta reveladora por medios convencionales usando etiquetas radiactivas o no radiactivas, o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de al menos 15 nucleótidos, preferiblemente de al menos 20 nucleótidos, por ejemplo al menos 25, 30 ó 40 nucleótidos, y también quedan abarcados por el término "polinucleótidos" de la descripción tal como se usa en la presente memoria.

Los polinucleótidos tales como polinucleótidos y sondas de ADN pueden producirse recombinantemente, sintéticamente o por cualquier medio disponible al especialista en la técnica. También pueden clonarse mediante técnicas estándar.

En general, los cebadores se producirán por medios sintéticos, lo que implica la fabricación por etapas de la 5 secuencia de ácido nucleico deseada, nucleótido a nucleótido. Las técnicas para llevar a cabo esto empleando técnicas automatizadas se encuentran fácilmente disponibles en la técnica.

Los polinucleótidos de mayor tamaño generalmente se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo usando una técnica de clonación PCR (reacción en cadena de polimerasa). Esto implicará preparar un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que escolten una región de la secuencia dirigida 10 a lípido que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenido de una célula animal

o humana, llevando a cabo la reacción en cadena de polimerasa en condiciones que conlleven la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento aislado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción sobre gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para contener sitios de reconocimiento de enzima de restricción, de tal modo que el ADN amplificado puede ser clonado en un vector de clonación adecuado.

15 Hibridación

La presente descripción también contempla secuencias que son complementarias a las secuencias de la presente descripción o secuencias que son capaces de hibridarse con las secuencias de la presente invención o con secuencias que son complementarias a las mismas.

El término "hibridación" tal como se usa en la presente memoria incluirá "el proceso mediante el cual una cadena de

20 ácido nucleico se une a una cadena complementaria a través de emparejamiento de bases", así como el proceso de amplificación llevado a cabo en las tecnologías de reacción en cadena de polimerasa (PCR).

La presente descripción también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse con las secuencias que son complementarias a las secuencias objeto discutidas en la presente memoria, o cualquier derivado o fragmento de las mismas.

25 La presente descripción también abarca secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria.

Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) del complejo de unión al nucleótido, como se muestra en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), y confieren una "severidad" definida como se explica a continuación.

30 La máxima severidad se produce habitualmente a aproximadamente Tf -5ºC (5ºC por debajo de la Tf de la sonda); elevada severidad a aproximadamente entre 5°C y 10°C por debajo de la Tf; severidad intermedia a aproximadamente entre 10°C y 20°C por debajo de la Tf; y baja severidad a aproximadamente entre 20°C y 25°C por debajo de la Tf; Como entenderán los especialistas en la técnica, se puede usar una hibridación de severidad máxima para identificar o detectar secuencias de nucleótidos idénticas, y se puede usar una hibridación de

35 severidad intermedia (o baja) para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos similares o relacionadas.

Preferiblemente, la presente descripción abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridarse en condiciones de alta severidad o en condiciones de severidad intermedia con secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria.

Más preferiblemente, la presente descripción abarca secuencias que son secuencias complementarias que son

40 capaces de hibridarse en condiciones de alta severidad (por ejemplo, 65ºC y 0,1 x SSC {1 x SSC = NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M, pH 7,0}) a secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria.

La presente descripción también se refiere a secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse a las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria (que incluyen secuencias complementarias a las discutidas en la

45 presente memoria).

La presente descripción también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a secuencias que pueden hibridarse a las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria (que incluyen secuencias complementarias a las discutidas en la presente memoria).

También se incluyen dentro del alcance de la presente descripción las secuencias de polinucleótido que son

50 capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria en condiciones de severidad entre intermedia y máxima.

En un aspecto preferido, la presente descripción cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria, o su complemento, en condiciones de severidad (por ejemplo, 50ºC y 0,2 x SSC).

En un aspecto más preferido, la presente descripción cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria, o su complemento, en condiciones de alta severidad (por ejemplo, 65ºC y 0,1 x SSC).

Expresión de Polipéptidos

Una secuencia de nucleótidos para uso en la presente descripción o para codificar un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria se puede incorporar en un vector replicable recombinante. El vector puede usarse para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma de polipéptido, en y/o a partir de una célula hospedante compatible. La expresión se puede controlar usando secuencias de control que incluyen promotores/potenciadores y otras señales de regulación de la expresión. Se pueden usar promotores procarióticos y promotores funcionales en células eucarióticas. Se pueden usar promotores específicos de tejido o específicos de estímulo. También se pueden usar promotores quiméricos que comprenden elementos de secuencia de dos o más promotores diferentes descritos anteriormente.

El polipéptido producido por una célula recombinante hospedante mediante expresión de la secuencia de nucleótidos puede ser secretado o puede estar contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Pueden diseñarse secuencias codificadoras con secuencias señal que dirijan la secreción de las secuencias codificadoras de la sustancia a través de una membrana concreta de célula procariótica o eucariótica.

Vector de Expresión

El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de expresión in vivo o in vitro.

Preferiblemente, el vector de expresión se incorpora al genoma del organismo. El término "incorpora" preferiblemente cubre la incorporación estable en el genoma.

La secuencia de nucleótidos de la presente descripción o que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria puede estar presente en un vector, en el que la secuencia de nucleótidos está ligada operativamente a secuencias reguladoras de tal modo que las secuencias reguladoras son capaces de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos mediante un organismo hospedante adecuado, es decir, el vector es un vector de expresión.

Los vectores de la presente descripción pueden transformarse en una célula hospedante adecuada, como se describe más adelante, para proporcionar la expresión de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria.

La elección de vector, por ejemplo un vector plásmido, cósmido, vírico o fago, a menudo dependerá de la célula hospedante en la que se va a introducir.

Los vectores pueden contener uno o más marcadores seleccionables -tal como un gen que confiere resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Alternativamente, la selección puede lograrse mediante co-transformación (tal como se describe en el documento WO91/17243).

Se pueden usar los vectores in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o pueden usarse para transfectar o transformar una célula hospedante.

Por tanto, en una realización adicional, la descripción proporciona un método para preparar secuencias de nucleótidos de la presente descripción o secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen propiedades específicas como las definidas en la presente memoria introduciendo una secuencia de nucleótidos en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedante compatible, y cultivando la célula hospedante en condiciones que produzcan la replicación del vector.

El vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos que permita que el vector se replique en la célula hospedante en cuestión. Los ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB1 10, pE194, pAMB1 y pU702.

Secuencias Reguladoras

En algunas aplicaciones, una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria se puede ligar operativamente a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos, tal como mediante la célula hospedante elegida. A modo de ejemplo, la presente descripción cubre un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente descripción ligada operativamente a dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.

El término "ligada operativamente" se refiere a la yuxtaposición en la que los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su modo pretendido. Una secuencia reguladora "ligada operativamente" a una secuencia codificadora está ligada de tal modo que la expresión de la secuencia codificadora se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.

El término "secuencias reguladoras" incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión.

5 El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo un sitio de unión de polimerasa de ARN.

También se puede lograr una expresión potenciada de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones de promotor, de líder de secreción y de terminación.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar ligada operativamente al menos a 10 un promotor.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos en un hospedante bacteriano, fúngico o de levadura son bien conocidos en la técnica.

Construcciones

El término "construcción" - que es sinónimo del términos tales como "conjugado", "casete" e "híbrido" -incluye una

15 secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria directa o indirectamente unido a un promotor. Un ejemplo de unión indirecta es la provisión de un grupo espaciador adecuado tal como una secuencia de intrón, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, intermedio entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente descripción. Lo mismo es válido para el término "fusionado" en relación a la presente descripción, que incluye la unión directa o indirecta. En algunos casos, los términos no

20 cubren la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifican para la proteína asociada de forma ordinaria al promotor génico natural y cuando ambos están en su entorno natural.

La construcción incluso pueden contener o expresar un marcador que permite la selección de la construcción genética.

Para algunas aplicaciones, la construcción preferiblemente comprende al menos una secuencia de nucleótidos de la

25 presente descripción o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria ligada operativamente al promotor.

Células Hospedantes

El término "célula hospedante" -en relación a la presente descripción - incluye cualquier célula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente

30 memoria o un vector de expresión como el descrito anteriormente y que se usa en la producción recombinante de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria.

Por tanto, una realización adicional proporciona células hospedantes transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos de la presente descripción o una secuencia de nucleótidos que expresa un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria. Se elegirán las células compatibles con dicho

35 vector y por ejemplo pueden ser células procarióticas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, de levadura o vegetales. Preferiblemente, las células hospedantes no son células humanas.

Los ejemplos de organismos hospedantes bacterianos adecuados son bacterias gram negativas o bacterias gram positivas.

Dependiendo de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades

40 específicas definidas en la presente memoria, y/o de la necesidad de un procesamiento posterior de la proteína expresada, pueden ser preferibles hospedantes eucarióticos tales como levaduras u otros hongos.

En general, se prefieren células de levadura antes que células fúngicas debido a que son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son secretadas en bajos niveles a partir de células de levadura, o en algunos casos no se procesan adecuadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levadura). En estos casos, debería seleccionarse

45 un organismo hospedante fúngico diferente.

El uso de células hospedantes adecuadas, tales como células hospedantes de levadura, de hongo y de planta, puede facilitar modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, miristoilación, glicosilación, cortado, lapidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) según se necesiten para conferir una actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinantes de la presente descripción.

50 La célula hospedante puede ser de una cepa deficiente en proteasa o baja en proteasa.

Organismo

El término "organismo" en relación a la presente descripción incluye cualquier organismo que pudiera comprender una secuencia de nucleótidos según la presente descripción o una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria y/o productos obtenidos a partir

5 del mismo.

Los organismos adecuados pueden incluir un procarionte, un hongo, una levadura o una planta.

El término "organismo transgénico" en relación con la presente descripción incluye cualquier organismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria y/o los productos obtenidos a partir del mismo, y/o cuando un promotor puede

10 permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria en el organismo. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos se incorpora al genoma del organismo.

El término "organismo transgénico" no cubre secuencias codificadoras de nucleótidos nativos en su entorno natural cuando están bajo el control de su promotor nativo, que también está en su entorno natural.

15 Por lo tanto, el organismo transgénico de la presente descripción incluye un organismo que comprende una cualquiera, o combinaciones, de las secuencias de nucleótidos que codifican para un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, construcciones como las definidas en la presente memoria, vectores como los definidos en la presente memoria, plásmidos como los definidos en la presente memoria, células como las definidas en la presente memoria, o los productos de los mismos. Por ejemplo, el

20 organismo transgénico también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria bajo el control de un promotor heterólogo.

Transformación de Células/Organismos Hospedantes

Tal como se ha indicado anteriormente, el organismo hospedante puede ser un organismo procariótico o eucariótico. Los ejemplos de hospedantes procarióticos adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Los conocimientos sobre la

25 transformación de hospedantes procarióticos están bien documentados en la técnica, véase por ejemplo Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Si se usa un hospedante procariótico la secuencia de nucleótidos puede necesitar ser modificada de forma adecuada antes de la transformación - por ejemplo mediante la eliminación de intrones.

En otra realización el organismo transgénico puede ser una levadura.

30 Las células de hongos filamentosos pueden transformarse usando varios métodos conocidos en la técnica - tal como un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de la regeneración de la pared celular de un modo conocido. El uso de Aspergillus como microorganismo hospedante se describe en la Solicitud de Patente Europea EP 0 238 023.

Otro organismo hospedante puede ser una planta. Se pueden encontrar una revisión de las técnicas generales

35 usadas para transformar plantas en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Marzo/Abril 1994 17-27). En el documento EP-A-0449375 se puede encontrar más información sobre la transformación de plantas.

Los conocimientos generales sobre la transformación de hongos, levaduras y plantas se presentan en las siguientes secciones.

40 Hongos Transformados

Un organismo hospedante puede ser un hongo - tal como un hongo filamentoso. Los ejemplos de dichos hospedantes adecuados incluyen cualquier miembro que pertenezca a los géneros Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma y otros similares.

Los conocimientos sobre la transformación de hongos filamentosos se revisan en el documento US-A-5741665, que

45 establece las técnicas estándar para la transformación de hongos filamentosos, y el cultivo de hongos es bien conocido en la técnica. Una extensa revisión de técnicas aplicadas a N. crassa puede encontrarse, por ejemplo, en Davis y de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.

Otros conocimientos adicionales sobre la transformación de hongos filamentosos se revisan en el documento US-A5674707.

50 En un aspecto, el organismo hospedante puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.

También se puede preparar un Aspergillus transgénico según la presente descripción siguiendo, por ejemplo, el contenido de Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. En: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editores) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol. 29. Elsevier Amsterdam 1994. pág. 641-666).

La expresión de genes en hongos filamentosos ha sido revisada en Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 mayo; 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4): 273-306.

Levadura Transformada

En otra realización, el organismo transgénico puede ser una levadura.

Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en levadura se proporciona, por ejemplo, en Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54, y en Curr Opin Biotechnol (1997) octubre; 8(5): 554-60.

A este respecto, se pueden usar levaduras -tales como las especies Saccharomyces cerevisi o Pichia pastoris (véase FEMS Microbiol Rev (2000 24(1): 45-66), como vehículo para la expresión de genes heterólogos.

Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y de la secreción de productos génicos es proporcionada por E. Hinchcliffe y E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H. Rose y J. Stuart Harrison, eds., 2ª edición, Academic Press Ltd.).

Para la transformación de levaduras se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, se puede preparar una Saccharomyces transgénica de acuerdo con la presente descripción siguiendo las instrucciones de Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Nature, Londres, 275, 104); y Ito, H. et al (1983, J. Bacteriology 153, 163-168).

Las células de levadura transformadas pueden seleccionarse usando varios marcadores selectivos -tales como marcadores auxotróficos dominantes marcadores de resistencia a antibióticos.

Se puede seleccionar un organismo hospedante de levadura a partir de especies de levadura biotecnológicamente relevantes tales como, aunque sin limitación, las especies de levadura seleccionadas entre Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces, Yarrowinia spp., Saccharomyces spp., que incluye S. cerevisiae o Schizosaccharomyce spp., que incluye Schizosaccharomyce pombe.

Se puede usar una cepa de la especie de levadura metilotrófica Pichia pastoris como organismo hospedante.

En una realización, el organismo hospedante puede ser una especie Hansenula , tal como H. polymorpha (según se describe en el documento WO01/39544).

Plantas/Células Vegetales Transformadas

Un organismo hospedante adecuado para la presente descripción puede ser una planta. Una revisión de las técnicas generales se puede encontrar en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech marzo/abril 1994, 17-27), o en la solicitud de patente WO 01/16308. La planta transgénica puede producir niveles incrementados de ésteres de fitoesterol y de ésteres de fitoestanol, por ejemplo.

Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a un método para la producción de una planta transgénica con niveles mejorados de ésteres de fitoesterol y de ésteres de fitoestanol, que comprende las etapas de transformar una célula vegetal con una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria (en particular con un vector de expresión o construcción que comprende una lípido aciltransferasa como la definida en la presente memoria), y cultivar una planta a partir de una célula vegetal transformada.

Secreción

A menudo es deseable que el polipéptido sea secretado desde el hospedante de expresión al medio de cultivo, desde donde la enzima puede recuperarse más fácilmente. La secuencia líder de secreción puede seleccionarse en base al hospedante de expresión deseado. También se pueden usar secuencias señal híbridas con el contexto de la presente invención.

Los ejemplos típicos de secuencias líder de secreción heterólogas son aquellas que se originan a partir del gen de amiloglucosidasa (AG) fúngico (glaA - las versiones de los aminoácidos 18 y 24 de, por ejemplo, Aspergillus), el gen de factor-a (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de α-amilasa (Bacillus).

Detección

En la técnica se conoce una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la clasificación de células activadas fluorescente (FACS).

Los especialistas en la técnica conocen una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación y pueden usarse en diversos ensayos con ácido nucleico y aminoácidos.

Una serie de compañías tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) y US Biochemical Corp. (Cleveland, OH) suministran kits y protocolos comerciales para dichos procedimientos.

5 Las moléculas informadoras o etiquetas adecuadas incluyen radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares. Las patentes que describen el uso de dichas etiquetas incluyen US-A-3.817.837; US-A-3.850.752; US-A-3.939.350; US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; US-A-4.275.149 y US-A-4.366.241.

Asimismo, se pueden producir inmunoglobulinas como se indica en el documento US-A-4.816.567.

10 Proteínas de Fusión

Se puede producir un polipéptido que tenga las propiedades específicas definidas en la presente memoria en forma de proteína de fusión, por ejemplo para ayudar en la extracción y purificación del mismo. Los ejemplos de compañeros de proteína de fusión incluyen glutationa-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de unión de ADN y/o de activación transcripcional) y β-galactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de ruptura

15 proteolítica entre el compañero de la proteína de fusión y la secuencia proteica de interés para permitir la eliminación de secuencias de proteína de fusión. Preferiblemente, la proteína de fusión no dificultará la actividad de la secuencia de proteína.

Los sistemas de expresión de fusión de genes en E. coli han sido revisados en Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5): 501-6.

20 En otra realización, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria puede ligarse a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para el escrutinio de bibliotecas de péptidos para detectar agentes capaces de afectar a la actividad de sustancia, puede ser útil codificar una sustancia quimérica que expresa un epítopo heterólogo que sea reconocido por un anticuerpo disponible comercialmente.

25 La invención de describirá ahora, meramente a modo de ejemplo, en referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos.

Figura 1: muestra una secuencia de consenso pfam00657 de la base de datos versión 6 (SEQ ID No. 1);

Figura 2: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 2) obtenida del organismo Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051);

Figura 3: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 3) obtenida del organismo Aeromonas salmonicida 30 (AAG098404; GI:9964017);

Figura 4: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 4) obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acceso de Genbank NP_631558);

Figura 5: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 5) obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acceso de Genbank: CAC42140);

35 Figura 6: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 6) obtenida del organismo Saccharomyces cerevisiae (número de acceso de Genbank P41734)

Figura 7: muestra un alineamiento de secuencias seleccionadas con la secuencia de consenso pfam00657;

Figura 8: muestra un alineamiento por pares de la SEQ ID No. 3 con la SEQ ID No. 2 que demuestra una identidad de secuencia de aminoácidos del 93%. La secuencia señal está subrayada. + denota diferencias. Está resaltado el

40 motivo GDSX que contiene el sitio activo de serina 16, y los sitios activos de ácido aspártico 116 e histidina 291 (ver las regiones sombreadas). Los números detrás de cada aminoácido es menos la secuencia señal;

Figura 9: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 7) que codifica una lípido acil transferasa obtenida del organismo Aeromonas hydrophila;

Figura 10: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 8) que codifica una lípido acil transferasa obtenida del 45 organismo Aeromonas salmonicida;

Figura 11: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 9) que codifica una lípido acil transferasa obtenida a partir del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acceso de Genbank NC_003888.1:8327480..8328367);

Figura 12: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 10) que codifica una lípido acil transferasa obtenida a 50 partir del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acceso de Genbank AL939131.1:265480..266367);

Figura 13: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 11) que codifica una lípido acil transferasa obtenida a partir del organismo Saccharomyces cerevisiae (número de acceso de Genbank Z75034);

Figura 14: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 12) obtenida a partir del organismo Ralstonia (número de acceso de Genbank AL646052);

Figura 15: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 13) que codifica una lípido acil transferasa obtenida a partir del organismo Ralstonia;

Figura 16: muestra la SEQ ID No. 20. proteína hipotética conservada Scoe1 con código de acceso de proteína NCBI CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 17: muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 que codifica la proteína hipotética conservada con código de acceso de proteína NCBI CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 18: muestra un aminoácido mostrado como SEQ ID No.22. proteína hipotética conservada Scoe2 con código de acceso de proteína NCBI CAC01477.1 GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 19: muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 que codifica una proteína hipotética conservada Score2 con código de acceso de proteína NCBI CAC01477.1 GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 20: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.24) de proteína secretada putativa Scoe3 con código de acceso de proteína NCBI CAB88833.1 GI:7635996. [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 21: muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 que codifica una proteína secretada putativa Scoe3 con código de acceso de proteína NCBI CAB88833.1 GI:7635996. [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 22: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.26) de una proteína secretada putativa Scoe4 con código de acceso de proteína NCBI CAB89450.1 GI:7672261. [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 23: muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27, que codifica una proteína secretada putativa Scoe4 con código de acceso de proteína NCBI CAB89450.1 GI:7672261. [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 24: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.28) de lipoproteína putativa Scoe5 con código de acceso de proteína NCBI CAB62724.1 GI:6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 25: muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29, que codifica una lipoproteína putativa Scoe5 con código de acceso se proteína NCBI CAB62724.1 GI:6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 26: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.30) de GDSL-lipasa Srim1 con código de acceso de proteína NCBI AAK84028.1 GI:15082088 [Streptomyces rimosus];

Figura 27: muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 que codifica una GDSL-lipasa Srim1 con código de acceso de proteína NCBI AAK84028.1 GI:15082088 [Streptomyces rimosus];

Figura 28: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.32), una lípido acil transferasa de Aeromonas hydrophila (ATCC #7965);

Figura 29: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 33) que codifica una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (ATCC #7965);

Figura 30: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.34) de una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida subespecie Salmonicida (ATCC# 14174);

Figura 31: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No 35) que codifica una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida subespecie Salmonicida (ATCC# 14174); Figura 32: muestra que se pueden identificar homólogos de los genes de Aeromonas usando el servicio de herramientas de búsqueda de alineamiento local básico del "National Center for Biotechnology Information", NIH, MD, EE.UU., y las bases de datos del genoma completo. Se usó el motivo GDSX para la búsqueda en la base de datos y se identificó una serie de secuencias/genes que potencialmente codifican enzimas con actividad lipolítica. Se identificaron genes de los géneros Streptomyces, Xanthomonas y Ralstonia. Como ejemplo, se alineó la Ralstonia solanacearum con el gen de Aeromonas salmonicida (satA). El alineamiento por pares demostró una identidad del 23%. El sitio activo de serina está presente en el extremo amino y se pueden identificar los residuos catalíticos de histidina y ácido aspártico;

Figura 33: muestra la secuencia de consenso Pfam00657.11 [familia 00657, base de datos versión 11] (denominada a partir de este punto consenso Pfam) y el alineamiento de varias secuencias con la secuencia de consenso Pfam.

Las flechas indican los residuos de sitios activos, las cajas subrayadas indican tres de las cajas de homología indicadas por [Upton C. y Buckley J.T. (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Las letras mayúsculas del consenso Pfam indican residuos conservados en muchos miembros de la familia. El símbolo - indica una posición en la que se esperaba que el modelo de Markov oculto del consenso Pfam encontrara un residuo pero no lo hizo, de tal modo que se inserta un hueco. El símbolo indica un residuo sin un residuo correspondiente en el consenso Pfam. Las secuencias son las secuencias de aminoácidos enumeradas en las Figuras 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 y 30.

Figura 34: muestra la secuencia de consenso Pfam00657.11 [familia 00657, base de datos versión 11] (denominada a partir de este punto consenso Pfam) y el alineamiento de varias secuencias con la secuencia de consenso Pfam. Las flechas indican los residuos de sitios activos, las cajas subrayadas indican tres de las cajas de homología indicadas por [Upton C. y Buckley J.T. (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Las letras mayúsculas del consenso Pfam indican residuos conservados en muchos miembros de la familia. El símbolo - indica una posición en la que se esperaba que el modelo de Markov oculto del consenso Pfam encontrara un residuo pero no lo hizo, de tal modo que se inserta un hueco. El símbolo indica un residuo sin un residuo correspondiente en el consenso Pfam. Las secuencias son las secuencias de aminoácidos enumeradas en las Figuras 2, 16, 18, 20, 26, 28 y 30. Se observó que todas estas proteínas eran activas con sustratos lipídicos.

Figura 35: muestra un vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM que contiene el gen de lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida marcado con His en el extremo C;

Figura 36: muestra los resultados de evaluación de extractos celulares en un kit de ensayo NEFA, que representa la actividad de una lípido aciltransferasa recombinante de A. salmonicida hacia lecitina. Los pocillos de izquierda a derecha indican: un control positivo, un control negativo (es decir, extractos de plásmido vacío) y muestras tomadas después de 0, 1, 2 y 3 horas de cultivo tras la inducción con IPTG;

Figura 37: muestra la optimización del crecimiento de BL21(DE3)pLysS que aloja el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM que demuestra que el cultivo a 30 ºC dio como resultado la producción de enzima con una elevada actividad hacia lecitina. Se evaluaron los extractos celulares para determinar la actividad de fosfolipasa usando el kit de ensayo NEFA. Los pocillos de izquierda a derecha: control positivo; control negativo; 20°C; 30°C;

Figura 38: muestra los extractos celulares sin purificar procedentes de BL21(DE3)pLysS que expresa lípido aciltransferasa activa incubada con el sustrato lecitina, y se analizó la mezcla de reacción usando cromatografía de capa fina que muestra la presencia de productos de degradación. Bandas: 1. Sin enzima; 2. + A. sal -10 uL a 37°C;

3. + A. sal - 20 uL a 37°C; 4. + A. sal - 10 uL a 24°C; 5. + A. sal - 20 uL a 24°C;

Figura 39: muestra la purificación parcial de la Acil Transferasa de Aeromonas salmonicida que presenta la actividad de fosfolipasa asociada a proteína con etiqueta His purificada. SE = Extractos Sonicados, His = Purificada con el kit de giro Ni-NTA de Qiagen;

Figura 40: muestra el vector de expresión pet12-A.h. Se usó GCAT=pSMa que contiene el gen de Glicerolípido Acil Transferasa (GCAT) de Aeromonas hydrophila marcado con His en el extremo C para transformar la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS;

Figura 41: muestra la actividad de los extractos sin purificar (5 & 10 uL) que contienen la enzima GCAT recombinante de Aeromonas hydrophila que fue evaluada hacia lecitina usando el kit de Ácido Graso No Esterificado (NEFA, del inglés "Non-Esterified Fatty Acid") (Roche, Suiza), que demuestra la presencia de enzima activa hacia el fosfolípido, lecitina;

Figura 42: muestra la optimización del crecimiento de BL21(DE3)pLysS que aloja el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM que demuestra que el cultivo a 30 ºC dio como resultado la producción de enzima con una elevada actividad hacia lecitina. Se evaluaron los extractos celulares para determinar la actividad de fosfolipasa usando el kit de ensayo NEFA;

Figura 43: muestra la purificación parcial de las Acil Transferasas de Aeromonas hydrophila & A. salmonicida que presentan la actividad de fosfolipasa asociada a proteína marcada con His purificada. SE = Extractos Sonicados, His = Purificada con el kit de giro Ni-NTA de Qiagen;

Figura 44: muestra la expresión de los genes de Aeromonas en Bacillus subtilis 163 que muestra la producción de enzima secretada con actividad hacia lecitina y la construcción DGDG. pUB-AH= que contiene el gen de A. hydrophila y pUB-AS, la construcción con el gen de A. salmonicida, y el filtrado del cultivo se incubó con los sustratos durante 60 minutos.

Figura 45 y Figura 46: muestran una placa de TLC en disolvente de desarrollo IV (cloroformo:metanol:agua (65:25:4)); Banda 1: 40 mg desitoesterol 30 min: Banda 2: Transferasa + 40 mg de sitoesterol 30 min; Banda 3: Transferasa + 80 mg de sitoesterol 30 min; Banda 4: Transferasa + 40 mg de sitoesterol 120 min; Banda 5: Transferasa + 80 mg de sitoesterol 120 min; Banda 6: Transferasa + 40 mg de sitoesterol 300 min; Banda 7: 40 mg de sitoesterol 300 min; Banda 8: Colesterol; Banda 9: Sitoesterol;

Figura 47: muestra la reacción entre fosfatidilcolina y colesterol, que es catalizada por una lípido aciltransferasa;

Figura 48: muestra un análisis de TLC de lípidos extraídos de yema de huevo tratada con enzima y sin tratar con enzima., 6) 0,31 PLU/g de Transferasa nº179, 7) 1,25 PLU/g de Transferasa nº178-9, 8) 23,25 PLU/g de Fosfolipasa nº3108, 9) Control.

Figura 49: muestra muestras de ensayo de mayonesa producidas con yema de huevo tratada con enzima y no tratada con enzima: 5) Transferasa nº179, 0,31 PLU/g. 6) Transferasa nº178-9, 1,25 PLU/g, 7) Fosfolipasa nº3108, 23,3 PLU/g 8) Control, agua

Figura 50: muestra una TLC (en disolvente I) de lípido de yema de huevo tratado con una lípido acil transferasa de

A. hydrophila;

Figura 51: muestra una TLC (en disolvente IV) de lípido de yema de huevo tratado con una lípido acil transferasa de

A. hydrophila;

Figura 52: muestra un análisis de TLC de lípido de yema de huevo tratado con transferasa con el transcurso del tiempo;

Figura 53: muestra la cantidad de ésteres de ácidos grasos y colesterol producidos en función del tiempo cuando se usa una lípido aciltransferasa (Tranf nº178-9) en comparación con cuando se usa una enzima lipolítica de control, Thermomyces lanuginosus;

Figura 54: muestra la actividad relativa de transferasa como % de actividad de transferasa e hidrolítica en reacciones enzimáticas con yema de huevo con un alto contenido en agua, nº1991 (fosfolipasa A2) y nº2427 (fosfolipasa A1) son fosfolipasas de control, nº178 es una lípido aciltransferasa;

Figura 55: muestra el efecto del contenido de agua en el ensayo de la actividad de transferasa de la transferasa nº178 en reacciones de transferasa con yema de huevo con un alto contenido en agua;

Figura 56: muestra la actividad de transferasa correspondiente a una lípido aciltransferasa (nº178) en función del tiempo de reacción en reacciones de transferasa con yema de huevo con un alto contenido en agua;

Figura 57 y Figura 58: muestran gráficas que presentan los ésteres de ácidos grasos y de colesterol en función del tiempo. Las gráficas presentan resultados obtenidos para el análisis de GLC en el ensayo de medida de la actividad de aciltransferasa usando como sustrato lecitina y colesterol en tampón;

Figura 59: muestra una TLC en disolvente I. Yema de huevo tratada con lípido aciltransferasa nº138 de Aeromonas salmonidica (bandas nº 1 y 2) o con una fosfolipasa nº2938 (LIPOPAN® F) (banda nº 3) yema de huevo no tratada (banda nº 4);

Figura 60: muestra una TLC en disolvente IV. Yema de huevo tratada con lípido aciltransferasa nº138 (bandas nº 1 y 2) o con Fosfolipasa nº2938 (banda nº 3). Yema de huevo no tratada (banda nº 4);

Figura 61: muestra yema de huevo tratada con lípido aciltransferasa nº138 (muestra nº 1 y 2) y con fosfolipasa nº2938 (muestra nº 3). Yema de huevo no tratada (muestra nº 4);

Figura 62: muestra una emulsión de alimento tras 2 horas a 100 °C. 0) Yema de huevo no tratada. 1) Yema de huevo tratada con lípido acil transferasa nº 138 durante 210 minutos. 3) Yema de huevo tratada con la fosfolipasa de control nº 2938 durante 210 minutos;

Figura 63: muestra placas de TLC que presentan el escrutinio de actividad de transferasa sobre esterol vegetal y glicerol. PC = fosfatidilcolina, LPC = lisofosfatidilcolina; PE = fosfatidiletanolamina; monogl = monoglicérido;

Figura 64: muestra una placa de TLC en disolvente I, Muestras 1 a 6 tras 24 horas de tiempo de reacción y muestras 1 a 4 tras 4 horas de tiempo de reacción. El análisis de TLC confirma la formación de éster de esterol en las muestras 1, 2, 5 y 6;

Figura 65: muestra una placa de TLC en disolvente I en la que la actividad de transferasa de una aciltransferasa inmovilizada de Aeromonas salmonicida fue evaluada en una mezcla de aceite - tomando muestra a 0,5, 1, 3, 6 y 24 h;

Figuras 66 y 67: muestran placas de TLC en disolvente I y IV. Banda 1 = lecitina; Banda 2 = control - 10 minutos; Banda 3 = 0,75 PLU, 10 minutos; Banda 4 = 0,75 PLU, 60 minutos; Banda 5 = 0,75 PLU, 220 minutos; Banda 6 = control, 20 h; Banda 7 = 0,75 PLU, 20 h; y Banda 8 = éster de colesterol;

Figuras 68 y 69: muestran placas de TLC en disolvente IV. Banda 1 = lecitina; Banda 2 = control - 10 minutos; Banda 3 = 1 PLU, 10 minutos; Banda 4 = 1 PLU, 60 minutos; Banda 5 = 1 PLU, 180 minutos; Banda 6 = 1 PLU, 220

minutos; Banda 7 = 1 PLU, 1200 minutos; Banda 8 = control, 1200 minutos; Banda 9 = éster de glucosa; Banda 10 = colesterol; y Banda 11 = glucosa;

Figura 70: muestra la reacción entre DGDG y glucosa catalizada por una lípido aciltransferasa; Figura 71: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 36) de la construcción de fusión usada para la mutagénesis del gen de lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila del Ejemplo 17. Los aminoácidos subrayados son un péptido señal de xilanasa;

Figura 72: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 45) que codifica una enzima de Aeromonas

hydrophila que incluye un péptido señal de xilanasa; Figura 73: muestra una placa de TLC que presenta claramente la formación de éster de esterol vegetal y monoglicérido. La banda 1 corresponde a 1 hora de tiempo de reacción, la banda 2 corresponde a 4 horas de tiempo de reacción, la banda 3 corresponde a 24 horas de tiempo de reacción y la banda 4 corresponde a un esterol vegetal; y

Figura 74: muestra la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa madura mutante de Aeromonas salmonicida (GCAT con una mutación de Asn80Asp (a destacar, el aminoácido 80 está en la secuencia madura) (SEQ ID No. 62);

Figura 75: muestra la SEQ ID No. 63 que es la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa de Candida

parapsilosis; Figura 76: muestra la SEQ ID No. 64 que es la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa de Candida parapsilosis;

Figura 77: muestra la SEQ ID No. 65. proteína hipotética conservada Scoe1 con código de acceso de proteína NCBI

CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)]; Figura 78: muestra una secuencia de polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Thermobifida_(SEQ ID No. 66);

Figura 79: muestra una secuencia de polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Thermobifida_SEQ ID No.

67); Figura 80: muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Corynebacterium efficiens GDSx 300 aminoácido_(SEQ ID No. 68);

Figura 81: muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Novosphingobium aromaticivorans GDSx

284 aminoácido_(SEQ ID No. 69); Figura 82: muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Streptomyces coelicolor GDSx 269 aminoácido (SEQ ID No. 70);

Figura 83: muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Streptomyces avermitilis \ GDSx 269 aminoácido (SEQ ID No. 71);

Figura 84: muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Streptomyces (SEQ ID No. 72); Figura 85: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 73) obtenida del organismo Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051) (a destacar, esta es la secuencia madura);

Figura 86: muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 74) de una lípido aciltransferasa madura mutante de Aeromonas salmonicida (GCAT) (a destacar, esta es la secuencia madura); Figura 87: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 75) de Streptomyces thermosacchari; Figura 88: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 76) de Streptomyces thermosacchari; Figura 89: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 77) de Thermobifida fusca/GDSx 548 aminoácidos; Figura 90: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 78) de Thermobifida fusca;

Figura 91: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 79) de Thermobifida fusca/GDSx; Figura 92: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 80) de Corynebacterium efficiens/GDSx 300 aminoácido;

Figura 93: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 81) de Corynebacterium efficiens;

Figura 94: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 82) de S. coelicolor/ GDSx 268 aminoácido; Figura 95: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 83) de S. coelicolor; Figura 96: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 84) de S. avermitilis; Figura 97: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 85) de S. avermitilis; Figura 98: muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 86) de Thermobifida fusca/GDSx; Figura 99: muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 87) de Thermobifida fusca/GDSx; Figura 100: muestra una secuencia de nucleótidos de Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 88) que incluye la

secuencia señal (preLAT - posiciones 1 a 87);

Figura 101: muestra una secuencia de polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Streptomyces (SEQ ID No. 89); Figura 102: muestra la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa madura mutante de Aeromonas

salmonicida (GCAT) con una mutación de Asn80Asp (a destacar, el aminoácido 80 está en la secuencia madura) mostrada en la presente memoria como SEQ ID No. 62 - después de ser sometida a una modificación posttraduccional (SEQ ID No. 90);

Figura 103: muestra un alineamiento de la L131 y homólogos de S. avermitilis y T. fusca que ilustra que la conservación del motivo GDSx (GDSY en L131 y S.avermitilis y T. fusca), la caja GANDY, que es GGNDA ó GGNDL, y el bloque HPT (considerado como la histidina catalítica conservada). Estos tres bloques conservados están resaltados;

Figura 104: Análisis de TLC (tampón de elución 5) de 10 muestras de grasa butírica, mono y diglicéridos y St 17 que

contienen colesterol, ácido oleico y éster de colesterol; Figura 105: Análisis de TLC (tampón de elución 1) de 10 muestras de grasa butírica, mono y diglicéridos y St 8 que contienen colesterol;

Figura 106: Análisis TLC (tampón de elución 5) de muestras de grasa butírica 1 (ref.) y 2 (enzima). Referencia St. 17

que contiene colesterol, ácido oleico y éster de colesterol; Figura 107: Análisis de TLC (tampón de elución 1) de muestra de grasa butírica 1 (referencia), 2 (enzima), monodiglicérido y St 17 que contiene colesterol, ácido graso y éster de colesterol;

Figura 108: Análisis de TLC (tampón de elución 4) de muestra de grasa butírica 1 (referencia), 2 (enzima), mono

diglicérido y St. que contiene fosfatidilcolina (PC) y liso-fosfatidilcolina; Figura 109: Análisis de TLC (tampón de elución 5) de muestra de nata 3 (referencia), 4 (enzima) y referencia St. 17 que contiene colesterol, ácido oleico y éster de colesterol;

Figura 110: Análisis de TLC (tampón de elución 1) de muestra de nata 3 (referencia), 4 (enzima), mono-diglicérido y

St 17 que contiene colesterol, ácido graso y éster de colesterol; Figura 111: Análisis de TLC (tampón de elución 4) de muestra de nata 3 (referencia), 4 (enzima), mono-diglicérido y St. 4 que contiene fosfatidilcolina (PC) y liso-fosfatidilcolina;

Figura 112: muestra una representación de cinta de la estructura cristalina de 1IVN.PDB que tiene glicerol en el

centro activo. La Figura se realizó usando el visor Deep View Swiss-PDB; Figura 113: muestra la Estructura Cristalina de 1IVN.PDB -vista lateral usando el visor Deep View Swiss-PDB, con glicerol en el centro activo - los residuos a menos de 10Å del centro activo de glicerol están en color negro;

Figura 114: muestra la Estructura Cristalina de 1IVN.PDB - vista superior usando el visor Deep View Swiss-PDB, con glicerol en el centro activo - los residuos a menos de 10Å del centro activo de glicerol están en color negro; Figura 115: muestra el alineamiento 1;

Figura 116: muestra el alineamiento 2; Figuras 117 y 118: muestra un alineamiento de 1IVN a P10480 (P10480 es la secuencia de la base de datos correspondiente a la enzima de A. hydrophila), este alineamiento se ha obtenido a partir de la base de datos PFAM y se ha usado en el proceso de construcción del modelo;

Figura 119: muestra un alineamiento en el que P10480 es la secuencia de la base de datos correspondiente a Aeromonas hydrophile. Esta secuencia se usa para la construcción del modelo y para la selección de sitio. Nótese que se muestra la proteína completa (SEQ ID No. 36), la proteína madura (equivalente a SEQ ID No. 73) comienza en el residuo 19. A. sal es lipasa GDSX de Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 3), A. hyd es lipasa GDSX de Aeromonas hydrophila (SEQ ID No. 73). La secuencia de consenso contiene un * en la posición de una diferencia entre las secuencias presentadas;

Figura 120: muestra un diagrama que ilustra la adición de enzima a cada cuba, Han PL es lecitasa, Dan PL es KLM3, una lípido aciltransferasa;

Figura 121: muestra un análisis de TLC (disolvente 6) de lípido extraído de nata y una mezcla estándar (St16) de fosfolípidos; Fosfatidilcolina (PC); Liso-fosfatidilcolina (LPC); Fosfatidilinositol (PI); Fosfatidiletanolamina (PE); 5,13% de ácido fosfatídico (PA); y Espingolípido (SG);

Figura 122: muestra un análisis de TLC (disolvente 1) de lípido extraído de nata y una mezcla estándar de ácidos grasos libres (FFA), colesterol (CHL) y éster de colesterol (éster-CHL);

Figura 123: muestra la evaluación ANOVA de colesterol en nata (30%) tratada con enzima, analizada mediante TLC (Tabla 43), A = control, B = Lecitasa, y C = KLM3';

Figura 124: muestra la evaluación ANOVA de ácidos grasos en nata (30%) tratada con enzima, analizada mediante TLC (Tabla 43), A = control, B = Lecitasa, y C = KLM3';

Figura 125: muestra la evaluación ANOVA de colesterol analizado mediante GLC (Tabla 44), A = control, B = Lecitasa, y C = KLM3';

Figura 126: muestra la evaluación ANOVA de éster de colesterol analizado mediante GLC (Tabla 44), A = control, B = Lecitasa, y C = KLM3';

Figura 127: muestra la evaluación ANOVA de la suma de FFA (ácido palmítico, C:16:0 + ácido oleico, C18:1 + ácido linoleico, C18:2 + ácido esteárico, C18.0) analizado mediante GLC (Tabla 44), A = control, B = Lecitasa y C = KLM3';

Figura 128: muestra un análisis de TLC (disolvente 6) de lípido extraído de queso y una mezcla estándar de ácidos grasos libres (FFA), colesterol (CHL) y éster de colesterol (éster-CHL);

Figura 129: muestra un análisis de TLC (disolvente 6) de lípido extraído de queso y una mezcla estándar defosfolípidos: Fosfatidilcolina (PC), Liso-fosfatidilcolina (LPC), Fosfatidilinositol (PI), Fosfatidiletanolamina (PE) y Ácido fosfatídico (PA);

Figura 130: muestra la evaluación ANOVA de colesterol en queso analizado mediante GLC (Tabla 45), A = control, B = Lecitasa, y C = KLM3';

Figura 131: muestra la evaluación ANOVA de éster de colesterol en queso analizado mediante GLC (Tabla 45), A = control, B = Lecitasa, y C = KLM3';

Figura 132: muestra la evaluación ANOVA de ácido oleico (C18:1) + ácido linoleico (C18:2) en queso analizado mediante GLC (Tabla 45), A = control, B = Lecitasa, y C = KLM3';

Figura 133: muestra la evaluación ANOVA de ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1)

+ ácido linoleico (C18:2) en queso analizado mediante GLC (Tabla 45), A = control, B = Lecitasa, y C = KLM3';

Figura 134: muestra un diagrama que representa la fuerza como producto de la masa, la aceleración y las propiedades de desviación del material objetivo;

Figura 135: muestra fotografías de las muestras de control DAN011 (izquierda) y del queso producido con KLM3 DAN013 (derecha). 5 minutos de reposo tras la etapa de calentamiento;

Figura 136: muestra una pizza horneada con queso DAN011 (izquierda), DAN012 (centro) y DAN013 (derecha);

Figura 137: muestra una construcción génica usada en el Ejemplo 32;

Figura 138: muestra una construcción génica de codón optimizado (nº 052907) usada en el Ejemplo 32; y

Figura 139: muestra la secuencia del inserto XhoI que contiene el gen precursor LAT-KLM3', las cajas -35 y -10 están subrayadas; y

Figura 140: muestra BML780-KLM3'CAP50 (que comprende la SEQ ID No. 90 - colonia superior) y BML780 (la cepa de hospedante vacía - colonia inferior) tras 48 h de crecimiento a 37ºC en agar de tributirina al 1%.

Ejemplos

Excepto donde se indique lo contrario, el análisis de TLC se ha llevado a cabo como se describe en el Ejemplo 6, y el análisis de GLC se ha llevado a cabo como se describe en el Ejemplo 11.

EJEMPLO 1: Clonación, secuenciamiento y expresión heteróloga de una transferasa procedente de Aeromonas salmonicida subespecie Salmonicida

Cepas usadas:

La Aeromonas salmonicida subespecie Salmonicida (ATCC 14174) se obtuvo del ATCC y se cultivó durante una noche a 30ºC en medio Luria-Bertani (LB). Las células fueron centrifugadas y se aisló ADN genómico usando los procedimientos para el aislamiento de ADN genómico del set de tampón de ADN Genómico de Qiagen Ltd. (cat. 19060); la proteasa K (cat. 19131) y la ARNasa A (cat. 19101) fueron obtenidas de Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).

Se usó la cepa bacteriana hospedante BL21(DE3)pLysS (Novagen) para la producción de las enzimas recombinantes de Aeromonas. Se usaron células competentes de BL21(DE3)pLysS como hospedante para la transformación con el vector de expresión pet12-AsalGCAT=pSM. Se cultivaron los transformantes que contienen el plásmido apropiado a 37 ºC en medio agar LB que contiene 100 ug de ampicilina/mL.

Construcción del vector de expresión pet12-AsalGCAT-pSM:

Para todas las amplificaciones de ADN de los genes de transferasa de Aeromonas, se usó ADN genómico (0,2-1 uL) como plantilla y se usó ADN polimerasa pfu (2,5 unidades) con 10 uL de tampón pfu 10x, 1 uL de cada cebador (50 pmol/uL), 200 uM dNTP en un volumen de reacción total de 100 uL. Se llevaron a cabo reacciones de PCR en un termociclador programable usando las siguientes condiciones: 95 °C durante 30 segundos, 30 ciclos 95 °C durante 30 segundos, 60 ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos. Se aplicó una extensión adicional de 5 minutos a 72 ºC.

La amplificación PCR del gen de transferasa de A. salmonicida se llevó a cabo en 2 reacciones de PCR separadas. La reacción de PCR 1 se llevó a cabo usando pares de cebador, como 1USNEW (5' AGC ATA TGA AAA AAT GGT TTG TTT GTT TAT TGG GG 3' [SEQ ID No. 36]) y asls950new (5' GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG 3' [SEQ ID No. 37]). Se llevó a cabo una segunda reacción de PCR para incorporar una etiqueta de Histidina Cterminal usando el producto de PCR de la primera reacción y los cebadores: as1USNEW (5' AGC ATA TGA AAA AAT GGT TTG TTT GTT TAT TGG GG 3' [SEQ ID No. 38]) y AHLS1001 (5' TTG GAT CCG AAT TCA TCA ATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC 3' [SEQ ID No. 39]). El producto de PCR de la segunda reacción se purificó y se digirió con enzimas de restricción Nde1 y BamHI. También se digirieron 2 ug de ADN vector pET 12a con enzimas de restricción Nde1 y BamHI y se trataron con fosfatasa. El producto de PCR de la reacción 2 y el pet12a tratado con enzima de restricción fueron purificados y ligados usando el kit Rapid Ligation (Roche, Suiza). La mezcla de ligación se usó para transformar células TOP10 de E. coli. Los transformantes fueron llevados a placa sobre medio agar LB que contenía 100 ug/mL de ampicilina.

El cebador promotor T7 (5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG 3' [SEQ ID No. 40]) y el cebador terminador T7 (5' CTA GTT ATT GCT CAG CGG 3' [SEQ ID No. 41]) fueron usados para verificar las secuencias y la orientación de los genes de transferasa clonados en el vector pET12a. Se llevó a cabo el secuenciamiento de ADN usando el kit de secuenciamiento Terminators Cycle de ABI Prism® BigDye™ con 500 ng de ADN plásmido como plantilla y 3,2 pmol de cebadores promotor y terminador T7.

La construcción mostrada en la Figura 35 se usó para transformar la cepa hospedante bacteriana competente BL21(DE3)pLysS (Novagen) y se seleccionaron transformantes resistentes a ampicilina para ser usados en análisis de expresión.

Expresión de la lípido aciltransferasa recombinante de Aeromonas salmonicida.

La cuantificación de la actividad enzimática hacia lecitina se determinó sobre extractos celulares usando el kit Non-Esterified Fatty Acid (NEFA) (Roche, Suiza).

En la Figura 36, se cultivó BL21(DE3)pLysS que aloja el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM en medio LB + 100 ug/mL de ampicilina, y se incubó con agitación a 37ºC hasta obtener una DO600 = de 0,6 a 1,0. A continuación los cultivos fueron inducidos usando IPTG (0,4 mM) y se continuó con la incubación durante las 3 siguientes horas. Se tomaron muestras a las 0, 1, 2 y 3 horas después de la inducción con IPTG. Se evaluó la actividad enzimática usando el kit NEFA y lecitina como sustrato.

La Optimización del Crecimiento para la producción de enzimas más activas BL21(DE3)pLysS que alojan el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM se cultivó en medio LB + 100 ug/mL de ampicilina y se incubó con agitación a diferentes temperaturas de crecimiento (37°C, 30°C y 20 °C). Las condiciones óptimas para la producción de enzima lípido aciltransferasa activa son cuando los cultivos se cultivan a 30ºC, como se muestra en la Figura 37.

Purificación parcial de transferasa recombinante de Aeromonas salmonicida. La cepa BL21(DE3)pLysS que aloja el vector de expresión pet12-AsalGCAT=pSM se cultivó a 37°C y los extractos celulares sin purificar se prepararon mediante sonicación. La enzima recombinante fue purificada adicionalmente a partir de los extractos celulares sin purificar usando el kit Ni-NTA de Qiagen. Actividad de fosfolipasa usando el kit NEFA y lecitina como sustrato. Los extractos celulares sin purificar de BL21(DE3)pLysS que expresa transferasa activa se incubaron con el sustrato de lecitina, y la mezcla de reacción fue analizada usando cromatografía de capa fina que demuestra la presencia de productos de degradación (véase la Figura 38).

Purificación parcial de transferasa recombinante de Aeromonas salmonicidae. La cepa BL21(DE3)pLysS que aloja el vector de expresión pEt12-AsaIGCAT=pSM fue cultivada a 37ºC y los extractos celulares sin purificar fueron preparados mediante sonicación. La enzima recombinante fue purificada adicionalmente a partir de los extractos celulares sin purificar usando el kit Ni-NTA de Qiagen. Se evaluó la actividad de fosfolipasa usando el kit NEFA y lecitina como sustrato (véase la Figura 39).

EJEMPLO 2 Clonación y Expresión de transferasa de Aeromonas hydrophila en E. coli

La Aeromonas hydrophila (ATCC nº 7965) se obtuvo de la ATCC y se cultivó durante una noche a 30ºC en medio Luria-Bertani (LB). Las células fueron centrifugadas y se aisló el ADN genómico usando los procedimientos para el aislamiento de ADN genómico del set de tampón Genomic DNA de Qiagen Ltd. (cat. 19060); la proteasa K (cat: 19131) y la ARNasa A (cat. 19101) fueron obtenidas de Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).

Se usó la cepa bacteriana hospedante BL21(DE3)pLysS (Novagen) para la producción de las enzimas recombinantes de Aeromonas. Se usaron células competentes de BL21(DE3)pLysS como hospedante para la transformación con el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT=pSMa. Se cultivaron los transformantes que contienen el plásmido apropiado a 37 ºC en medio agar LB que contiene 100 ug de ampicilina/mL.

Construcción del vector de expresión pet12a-A.h.GCAT- pSMa:

Para todas las amplificaciones de ADN del gen de transferasa de Aeromonas, se usó ADN genómico (0,2-1 uL) como plantilla y se usó ADN polimerasa pfu (2,5 unidades) con 10 uL de tampón pfu 10x, 1 uL de cada cebador (50 pmol/uL), 200 uM dNTP en un volumen de reacción total de 100 uL. Se llevaron a cabo reacciones de PCR en un termociclador programable usando las siguientes condiciones: 95 °C durante 30 segundos, 30 ciclos 95 °C durante 30 segundos, 60 ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos. Se aplicó una extensión adicional de 5 minutos a 72 ºC.

La amplificación PCR del gen de transferasa de A. hydrophila (ATCC nº 7965) se llevó a cabo en 2 reacciones de PCR separadas.

La reacción de PCR 1 se llevó a cabo usando los pares de cebadores, AHUS1 (5' GTC ATA TGA AAA AAT GGT TTG TGT GTT TAT TGG GAT TGG TC 3', SEQ ID No. 42) y ahls950 (5' ATG GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG 3', SEQ ID No. 43).

Se llevó a cabo una segunda reacción de PCR para incorporar una etiqueta de Histidina C-terminal usando el producto de PCR de la primera reacción y los pares de cebadores:

AHUS1 (5' GTC ATA TGA AAA AAA TGG TTT GTG TGT TTA TTG GGA TTG GTC 3' SEQ ID No. 44) y AHLS1001 (5' TTG GAT CCG AAT TCA TCA ATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC 3' SEQ ID No. 45).

El producto de PCR de la segunda reacción se purificó y se digirió con enzimas de restricción Nde1 y BamHI. También se digirieron 2 ug de ADN vector pET 12a con enzimas de restricción Nde1 y BamHI y se trataron con fosfatasa. El producto de PCR de la reacción 2 y el pet12a tratado con enzima de restricción fueron purificados y ligados usando el kit Rapid Ligation (Roche, Suiza). La mezcla de ligación se usó para transformar células TOP10 de

E. coli. Los transformantes fueron llevados a placa sobre medio agar LB que contenía 100 ug/mL de ampicilina.

El cebador promotor T7 (5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG 3') y el cebador terminador T7 (5' CTA GTT ATT GCT CAG CGG 3') fueron usados para verificar las secuencias y la orientación de los genes de GCAT clonados en el vector pET12a. Se llevó a cabo el secuenciamiento de ADN usando el kit de secuenciamiento Terminators Cycle de ABI Prism® BigDye™ con 500 ng de ADN plásmido como plantilla y 3,2 pmol de cebadores promotor y terminador T7.

La construcción mostrada en la Figura 40 se usó para transformar la cepa hospedante bacteriana competente BL21(DE3)pLysS (Novagen) y se seleccionaron transformantes resistentes a ampicilina para ser usados en análisis de expresión.

Expresión de la transferasa de Aeromonas hydrophila en BL21(DE3)pLysS

Se cultivó la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS que aloja el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT= pSMa en medio LB + 100 ug/mL de ampicilina y se incubó con agitación a 37ºC hasta obtener una DO600 = de 0,6 a 1,0. A continuación los cultivos fueron inducidos usando IPTG (0,4 mM) y se continuó con la incubación durante las 3 siguientes horas. Se tomaron muestras a las 0, 1, 2 y 3 horas después de la inducción con IPTG. Se evaluó la actividad enzimática usando el kit NEFA y lecitina como sustrato (véase la Figura 41).

Optimización del Crecimiento para la producción de enzimas más activas

Se cultivó BLZ1(DE3)pLysS que aloja el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT= pSMa en medio LB + 100 ug/mL de ampicilina y se incubó con agitación a diferentes temperaturas de crecimiento (37 °C, 30 °C y 20 °C). Las condiciones óptimas para la producción de enzima GCAT activa son cuando los cultivos se cultivan a 30ºC, como se muestra en la Figura 42.

Purificación parcial de transferasa recombinante de A.hydrophila (GCAT)

La cepa BL21(DE3)pLysS que aloja el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT=pSMa fue cultivada a 37ºC y los extractos celulares sin purificar fueron preparados mediante sonicación. La enzima recombinante fue purificada adicionalmente a partir de los extractos celulares sin purificar usando el kit Ni-NTA de Qiagen. Ensayo de actividad de fosfolipasa usando el kit NEFA y lecitina como sustrato. (Figura 43).

EJEMPLO 3: Expresión de transferasas de Aeromonas en Bacillus subtilis 163

Construcción de Plásmido

Se usaron dos vectores de expresión de Bacillus subtilis (pUB 110 y pBE5) para la expresión heteróloga de los genes de Aeromonas en Bacillus subtilis. El vector pUB110 contiene el promotor de alfa amilasa, mientras que el vector pBE tiene el promotor P32 como región reguladora para la expresión de los genes fusionados de Aeromonas. En el pUB110, el primer aminoácido de los genes GCAT maduros de Aeromonas se fusionó en marco con el último aminoácido de la secuencia de péptido señal de xilanasa de Bacillus subtilis a través del sitio de restricción Nhe1, creando 2 aminoácidos adicionales delante de las proteínas maduras. El pBE5 contiene la fusión de secuencia señal cgtase en el sitio Nco1 para la secreción de las proteínas recombinantes en el filtrado del cultivo.

Se llevaron a cabo reacciones PCR para obtener los genes de Aeromonas fusionados en marco con las secuencias señal de los vectores pUB 110 y pBE5. Se realizaron PCRs usando los pares de cebadores para el gen de A. hydrophila:

Reacción de PCR 1: usAHncol (5' ATG CCA TGG CCG ACA GCC GTC CCG CC 3', SEQ ID No. 46) y 1sAH (5' TTG GAT CCG AAT TCA TCA ATG GTG ATG 3', SEQ ID No. 47)

Reacción de PCR 2: US-AhnheI (5' TTG CTA GCG CCG ACA GCC GTC CCG CC 3', SEQ ID No. 48) y 1sAH (5' TTG GAT CCG AAT TCA TCA ATG GTG ATG 3', SEQ ID No. 49)

Se realizaron PCRs usando los pares de cebadores para el gen de A. salmonicida:

Reacción de PCR 3: US-Asncol (STF GCC ATG GCC GAC ACT CGC CCC GCC 3', SEQ ID No. 50) y 1sAH (5' TTG GAT CCG AAT TCA TCA ATG GTG ATG 3'; SEQ ID No. 51)

Reacción de PCR 4: US-ASnhe1 (5' TTG CTA GCG CCG ACA CTC GCC CCG CC 3', SEQ ID No. 52) y 1sAH (5' TTG GAT CCG AAT TCA TCA ATG GTG ATG 3', SEQ ID No. 53)

Todos los productos de PCR fueron clonados en PCR blunt II (vector TOPO) y secuenciados con cebadores de secuenciamiento directos e inversos.

Los clones de las reacciones de PCR 1 y 3 fueron cortados con NcoI y BamHI, y se usaron como insertos para la ligación al vector pBE5 cortado con Nco1/BamH1/fosfatasa. Los clones de las reacciones de PCR 2 y 4 fueron cortados con Nhe1 y Bam H1, y se usaron como insertos para la ligación al vector pUB que fue cortado con Nhe1BamH1/fosfatasa.

Expresión de los genes de transferasa de Aeromonas en Bacillus subtilis y caracterización de la actividad enzimática.

Las acil transferasas de dos especies de Aeromonas han sido expresadas con éxito en E. coli (ver resultados anteriores). Se usaron las construcciones de fusión de genes de Bacillus pUB110 y pBE5 para transformar Bacillus subtilis y se seleccionaron los transformantes llevándolos a placas de canamicina. Los transformantes resistentes a canamicina aislados y cultivados en 2xYT son capaces de expresión heteróloga de los genes de Aeromonas en Bacillus. Los filtrados de cultivo presentan actividad de galactolipasa de digalactosildiacilglicerol (DGDG), además de presentar actividad de acil transferasa y de fosfolipasa. La actividad hacia digalactosildiacilglicerol (DGDG) se midió después de 60 minutos de incubación del sobrenadante de cultivo con el sustrato, el DGDG de harina de trigo (obtenido en Sigma), así como la actividad hacia lecitina, se muestra en la Figura 44. Los bacillus produjeron la enzima después de una noche (20-24 horas) hasta 48 horas de cultivo en el medio de cultivo en forma de proteína secretada. En algunos casos, se ha demostrado que la expresión de los genes de Aeromonas interfiere con la viabilidad celular y el crecimiento en Bacillus y E. coli, por lo tanto es necesario seleccionar cuidadosamente las cepas de expresión y optimizar las condiciones de crecimiento para asegurar la expresión. Por ejemplo, se transformaron varias cepas hospedantes de Bacillus (B.s 163, DB 104 y OS 21) con los vectores de expresión para comparación del crecimiento. La B.s163 es transformable con los 2 genes de Aeromonas y es capaz de expresar proteína activa. La DB 104 es transformable con todas las construcciones, pero solo es capaz de expresar transferasa de A. salmonicida.

EJEMPLO 4: Fermentación y Purificación de lípido aciltransferasas de Aeromonas producidas en E. coli

Fermentaciones de E. coli:

Microorganismos

En este estudio se usaron dos cepas de Eschericia coli, una que contiene una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (Ejemplo 2) y otra que contiene lípido aciltransferasas de Aeromonas salmonicida, (Ejemplo 1).

La cepa de E. coli que contiene el gen de A. hydrophila se denominó DIDK0124, y la cepa de E. coli que contiene el gen de A. salmonicida se denominó DIDK0125. La fermentación con DIDK0124 se denominó HYDR00303 y la fermentación con DIDK0125 se denominó SAL0302. La proteína purificada a partir de HYDRO025 se denominó REFnº138. La proteína purificada a partir de HYDRO0303 se denominó REFnº135.

Medio de crecimiento y condiciones de cultivo

Agar LB

Las placas de agar LB usadas para mantener las cepas contenían: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 15 g/L de agar, 100 mg/L de ampicilan y 35 mg/L de cloranfenicol. Las placas de agar fueron incubadas a 30°C.

Matraz de agitación LB

El medio LB (50 mL por matraz de agitación) usado para la producción de material inóculo para los cultivos en biorreactor contenía: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 100 mg/L de ampicilina y 35 mg/L de cloranfenicol. Los matraces de agitación fueron inoculados a partir de placas de agar LB, y se incubaron a 30ºC y 200 rpm.

Cultivo en biorreactor

Los cultivos de biorreactor fueron llevados a cabo en biorreactores de construcción doméstica de 6 L rellenos con 4 L de medio que contenía: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 8 g/L de KH2PO4, 0,9 g/L de MgSO4· 7H2O, 40 g/L de monohidrato de glucosa, 0,4 mL/ de ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, Holanda), 10 mg/L de (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O, 0,7 mg/L de CuSO4·5H2O, 3 mg/L de ZnSO47H2O, 3 mg/L de MnSO4H2O, 10 mg/L de EDTA, 0,1 mg/L de NiSO4·6H2O, 0,1 mg/L de CoCl2, 0,1 mg/L de H3BO4, 0,1 mg/L de KI, 0,1 mg/L de Na2MoO4·2H2O, 1 g/L de ampicilina y 35 mg/L de cloranfenicol.

Los biorreactores fueron inoculados con una cantidad de cultivo de LB que asegura la finalización del crecimiento después de aproximadamente 20 horas de cultivo (calculado a partir de la máxima velocidad de crecimiento específica de 0,6 h-1, la DO600 del matraz de agitación de LB y la DO600 final en el biorreactor de aproximadamente 20).

Se inoculó SAL0302 con 10 mL de cultivo LB, y se inoculó HYDRO0303 con 4 mL de cultivo LB.

Los biorreactores fueron operados en las siguientes condiciones: temperatura 30°C, agitación 800-1000 rpm (dependiendo del experimento), aeración 5 L/min, pH 6,9, control de pH con NH3-agua al 8,75% (p/v) y H2SO4 2 M. La inducción se logró mediante la adición de β-D-tiogalactosido de isopropilo hasta una concentración final de 0,6 mM, cuando se produjeron respectivamente 0,4 moles (HYDRO0303) y 0,7 moles de CO2.

Recolección

Se usó el siguiente procedimiento para la recolección y la homogeneización de la biomasa:

1) El caldo de fermentación de las fermentaciones se centrifugó a 5000 x g y 4ºC durante 10 minutos, y se descargó el sobrenadante. La biomasa se almacenó a -20°C hasta uso. La biomasa se descongeló y se volvió a suspender en 500 mL de NaH2PO4 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, inhibidor de proteasa de imidazol y completo (libre de EDTA) (Roche, Alemania).

2) La biomasa suspendida se homogeneizó a 2 kbar y 4ºC en un disruptor celular de Constant Systems Ltd (Warwick, R.U.).

3) Los restos celulares se retiraron mediante centrifugación a 10.000 x g y 4°C durante 30 minutos seguido de la recolección del sobrenadante.

4) Se clarificó el sobrenadante adicionalmente mediante centrifugación a 13.700 x g y 4°C durante 60 minutos, seguido de la recolección del sobrenadante.

5 5) Se filtró el sobrenadante a través de filtros Vacu Cap de 0,2 μm Vacu Cap (Pall Life Sciences, R.U.) y se recolectó el filtrado para ser purificado inmediatamente mediante cromatografía.

Purificación cromatográfica de las Transferasas

Se empaquetó una columna (2,5 x 10 cm) con 50 mL de gel quelante de Sepharose ff. y se cargó con sulfato de Ni (según el método descrito por el fabricante, Amersham Biosciences). La columna se equilibró con 200 mL de

10 NaH2PO4 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM. Se aplicaron 400 mL de material no purificado a la columna con un caudal de 5 mL/minuto. La columna se lavó a continuación con NaH2PO4 20 mM, pH 7.4, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM hasta que el UV280 alcanzó la línea base. A continuación se eluyó la GCAT con 40 mL de NaH2PO4 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM e imidazol 500 mM.

EJEMPLO 5: Fermentación y Purificación de lípido aciltransferasas de Aeromonas producidas en Bacillus 15 subtilis. Fermentaciones BAC0318-19, BAC0323-24 Microorganismo Los microorganismos usados en este estudio proceden de la transformación de una cepa de hospedante de Bacillus

20 subtilis, nº163 con un plásmido que contiene el gen que codifica la transferasa de Aeromonas salmonicida insertada en el vector pUB1100IS. La expresión del gen se controla mediante un promotor de alfa-amilasa, y la secreción de la transferasa está mediada por la secuencia señal de xilanasa de B. subtilis (Ejemplo 3). Las cepas se denominaron DIDK0138 (fermentación BAC0318-19) y DIDK0153 (fermentación BAC0323-24).

Medio de crecimiento y condiciones de cultivo 25 Medio de pre cultivo Un matraz de agitación (500 mL de volumen total, con deflectores) se añadieron 100 mL de un medio que contenía:

NaCl 5 g/L

K2HPO4 10 g/L

Harina de soja 20 g/L

Extracto de levadura, BioSpringer 106 20 g/L

Antiespumante, SIN260 5 mL/L

El pH se ajustó a 7,0 antes de llevar a autoclave Después del autoclave se añadieron 6 mL de Nutriosa al 50% (p/p) por matraz. Se añadió canamicina a una

30 concentración de 50 mg/L después del autoclave. Inoculación Se inoculó un matraz de agitación de pre cultivo con cultivo congelado directamente a partir de la reserva de glicerol

al 25% (p/v). Se incubó el matraz de agitación a 33ºC y 175 rpm durante aproximadamente 16 horas, cuando se usaron 50 mL para inocular el fermentador. 35 Fermentaciones Las fermentaciones se llevaron a cabo en fermentadores de construcción doméstica de 6 L.

El medio de reacción (3 L) contenía: Licor de maíz (50% dw) 40 g/L Extracto de levadura BioSpringer 153 (50% dw) 10 g/L NaCl 5 g/L CaCl2, 2H2O 0,25 g/L Mn(NO3)2, H2O 0,2 g/L Antiespumante SIN260 1 mL/L Canamicina (filtro esterilizado al fermentador tras 50 mg/L autoclavado)

El alimento contenía: Monohidrato de glucosa 540 g/kg MgSO4, 7H2O 4,8 g/kg Antiespumante SIN260 4 mL/kg Extracto de levadura, BioSpringer 153 (50% dw) (autoclavado por 150 g/kg separado)

5 El alimento en la fermentación BAC0318 y BAC0323 comenzó en base al CO2 acumulado, según las siguientes ecuaciones: Alimento - caudal [g/h] = 0,AcCO2 <0,15 Alimento - caudal [g/h] = 2,85 + t·1,54, AcCO2 ≥ 0,15 y t < 12 Alimento - caudal [g/h] = 21,3, t > 12

10 t: tiempo (horas) desde el momento en que el CO2 acumulado (AcCO2) alcanzó 0,15 moles. El alimento en las fermentaciones BAC0319 y BAC0324 comenzó en base al CO2 acumulado, según las siguientes ecuaciones:

Alimento - caudal [g/h] = 0,AcCO2 <0,15 Alimento - caudal [g/h] = 2,0 + t·1,08, AcCO2 ≥ 0,15 y t < 12 15 Alimento - caudal [g/h] = 15, t > 12

t: tiempo (horas) desde el momento en que el CO2 acumulado (AcCO2) alcanzó 0,15 moles. El pH se controló a 7,0 añadiendo NH3-agua al 12,5 % (p/v) o ácido fosfórico 2M. La aireación fue de 3 L/min correspondiente a 1 vvm. La temperatura fue de 33°C.

20 El fermentador se equipó con dos turbinas Rushton 0 de 8 cm colocadas a una distancia de 10 cm.

Recolección

La biomasa se retiró mediante centrifugación a 16.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se esterilizó por filtración el sobrenadante, y el filtrado se usó para purificación y ensayos de aplicación.

EJEMPLO 6. Ensayos de aplicación con yema de huevo.

En los siguientes experimentos se evaluó la transferasa aislada de Aeromonas salmonicida expresada en E. coli en yema de huevo sola o en yema de huevo a la que se había añadido un esterol vegetal. Material Transferasa de Aeromonas salmonicida REF nº138 Yema de huevo: de huevos frescos (huevos de gallina) Esterol vegetal: β-sitoesterol, Sigma S 5753 Placas de TLC: placas de sílice de Merck nº 1.05715.0001 Análisis de TLC.

La placa de TLC se activó en una estufa de calefacción (110ºC) durante ½ h. Se vertieron 100 mL de disolvente de desarrollo en una cámara de cromatografía con tapa. Se cubrieron las paredes de la cámara con papel de filtro (Whatman 2) con el objetivo de saturar la cámara con el vapor del disolvente.

La placa de TLC se colocó en un marco y se aplicó la muestra sobre la placa de TLC a 2 cm del fondo. A continuación se colocó la placa de TLC en la cámara de TLC con el disolvente de desarrollo. Cuando el disolvente alcanzó los 14 cm desde el fondo de la placa, la placa de TLC se extrajo y se secó en campana, y a continuación se colocó en la estufa de calefacción a 110ºC durante 10 minutos.

La placa de TLC se sumergió entonces en el reactivo de desarrollo, y se secó en la estufa de calefacción a 110ºC durante 15 minutos. Disolvente de desarrollo: Nº IV: Cloroformo : Metanol : H2O (65:25:4) Nº I: P-éter : MTBE : Ácido acético (60:40:1) Tampón de Desarrollo (tampón de vanadato): 32 g de Na2CO3 y 300 mL de H2O (1 M) se añaden 18,2 g de pentóxido de vanadato (V2O5) y se disuelven aplicando una calefacción moderada. La disolución se enfría hasta temperatura ambiente. Se añaden con cuidado 460 mL de H2SO4 2,5 M (460 mL de H2O + 61 mL H2SO4). Se añade agua hasta alcanzar 1000 mL. Actividad de fosfolipasa.

Sustrato: Se disuelve un 0,6 % de L-a Fosfatidilcolina vegetal al 95% (Avanti nº441601) + un 0,4 % de Triton-X 100 (Sigma X100) + CaCl2 5 mM en tampón HEPES 0,05 M, pH 7.

Procedimiento.

Se añadieron 400 μL de sustrato a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y se colocaron en un Termomezclador Eppendorf a 30ºC durante 5 minutos. En el momento T = 0 se añadieron 50 μL de disolución de enzima. También se analizó un blanco con agua en lugar

de enzima. La muestra se mezcló a 1000 rpm en un Termomezclador Eppendorf a 30ºC durante 10 minutos.

A tiempo T = 10 minutos, el tubo Eppendorf se colocó en otro termomezclador a 99ºC durante 10 minutos para detener la reacción. El contenido en ácidos grasos libres de las muestras se analizó usando el kit NEFA de WAKO GmbH. Se calculó la actividad enzimática PLU-7 a pH 7 como los micromoles de ácidos grasos producidos por minuto en las

5 condiciones de ensayo. Extracción de lípidos. Se mezcló 1 g de yema de huevo y 7,5 mL de Cloroformo:Metanol 2:1 en un Whirley y se centrifugó a 750 x g durante 10 minutos.

Se aislaron 3 mL de la fase de cloroformo y se usaron para continuar con el análisis de lípidos. Resultados: 10 La transferasa (REF nº138), procedente de Aeromonas salmonicida expresada en E-coli fue analizada para determinar la actividad de fosfolipasa como se ha descrito anteriormente, y también se evaluó en yema de huevo

con y sin β-sitoesterol. La muestra se agitó con un agitador magnético durante la reacción. El diseño de experimentos se muestra en la Tabla 1. Tabla 1

Ensayo: Tiempo de reacción a 37°C Yema huevo de Sitoesterol Transferasa nº138

Nº: Minutos gramos mg Unidades

1: 30 1 40

2: 30 1 40 0,75 PLU

3: 30 1 80 0,75 PLU

4: 120 1 40 0,75 PLU

5: 120 1 80 0,75 PLU

6: 300 1 40 0,75 PLU

8: 300 1 40

La reacción se detuvo añadiendo 7,5 mL de Cloroformo:Metanol (2:1) y se mezcló en un mezclador Whirley durante 30 segundos. La fase de cloroformo se aisló mediante centrifugación y se transfirieron 2 μL de la fase de cloroformo a una placa de TLC de sílice pre-activada y se eluyó con disolvente de desarrollo nº I, y otra placa de TLC en disolvente de desarrollo IV.

20 Los resultados del análisis de TLC se muestran en las Figuras 45 y 46.

La reacción de transferasa con una transferasa procedente de Aeromonas salmonicida en yema de huevo a la que se había añadido un esterol vegetal ha demostrado que la enzima transfiere ácidos grasos desde la lecitina de la yema de huevo hasta el colesterol durante la formación de éster de colesterol. El cromatograma de TLC también indicó que parte del esterol añadido a la yema de huevo fue transferido a éster de esterol.

25 La cantidad de éster de esterol relativa a la cantidad de éster de colesterol formado durante la reacción puede analizarse mediante HPLC o GLC.

Se sabe que los ésteres de esterol vegetales reducen la absorción de colesterol en el intestino. También se indica en la bibliografía que los ésteres de colesterol se absorben menos que el colesterol libre en el intestino. Cuando se añade una transferasa y un esterol vegetal a yema de huevo se obtiene un producto que produce una menor

30 absorción de colesterol, y al mismo tiempo se produce lisolecitina que mejora las propiedades de emulsión de la yema de huevo. Una ventaja adicional de añadir transferasa y esterol vegetal a la yema de huevo es que el éster de esterol vegetal se ingiere junto con el colesterol disponible de forma natural, lo que es de esperar que produzca el máximo efecto sobre la reducción de la absorción de colesterol.

EJEMPLO 7: Modificación de yema de huevo mediante acil transferasa de Aeromonas salmonicida.

Se ha demostrado ahora que es posible producir lisolecitina a partir de yema de huevo sin una formación sustancial de ácidos grasos libres mediante el uso de una transferasa.

El contenido de lecitina de yema de huevo es un emulsionante importante para la producción de mayonesa con la limitación de que la mayonesa no es estable térmicamente. Por lo tanto, durante varios años se ha conocido el uso de una fosfolipasa procedente del páncreas para modificar la lecitina de la yema de huevo y formar lisolecitina, que es un emulsionante más eficiente. El uso de una yema de huevo modificada enzimáticamente para la producción de mayonesa contribuye a una mejor estabilidad térmica de la mayonesa durante la pasteurización. Una limitación de usar fosfolipasa de páncreas en yema de huevo es que la cantidad de ácidos grasos libre también aumenta, lo que contribuye a una estabilidad oxidativa reducida debido a que los ácidos grasos libres son más propensos a la oxidación que el correspondiente éster. Los ácidos grasos libres también pueden contribuir a un sabor jabonoso.

La transferasa procedente de Aeromonas salmonicida se expresó con éxito en B. subtilis y se fermentó a escala de laboratorio como se describe en el Ejemplo 5, se purificó mediante cromatografía de líquidos y se usó para modificar lípidos de yema de huevo. La yema de huevo modificada enzimáticamente se usó para producir mayonesa térmicamente estable.

La transferasa procedente de A. salmonicida se puede usar para producir lisolecitina y éster de colesterol en yema de huevo sin purificación de cantidades significativas de ácidos grasos libres. Es decir, sin incrementar, o sin incrementar sustancialmente, el contenido de ácidos grasos libres del alimento.

La yema de huevo modificada enzimática producida mediante transferasa presentó propiedades de emulsión mejoradas y puede usarse para mayonesa térmicamente estable.

Esta enzima resultó altamente funcional en la modificación de yema de huevo a través de la catálisis de la reacción de transferencia de lípidos entre la lecitina y el colesterol de la Figura 47.

Este estudio investigó además el uso de transferasa para la modificación de yema de huevo, así como el uso de yema de huevo modificada para la producción de mayonesa térmicamente estable.

Este ejemplo describe la fermentación, aislamiento y aplicación de la transferasa en yemas de huevo, así como la aplicación de la yema de huevo modificada enzimáticamente a mayonesa. El ejemplo se divide en dos partes:

A. Aplicación de transferasa en yema de huevo

B. Evaluación de la yema de huevo modificada enzimáticamente en mayonesa

Procedimiento Experimental

A. Aplicación Enzima y sustrato Transferasa nº178-9 de A. salmonicida, purificación 2554-100 C73, 15 PLU-7/mL. Transferasa nº179 de A.

salmonicida, 18,5 PLU-7/mL. Fosfolipasa A1 LECITASE™ Ultra (Novozymes A/S, Dinamarca) Yema de huevo: yema de huevo líquida con un 8% de sal, SANOVA FOODS, Dinamarca. El análisis de TLC se llevó a cabo como se ha indicado previamente (véase el Ejemplo 6 anterior). Actividad de fosfolipasa: ver los ejemplos previos. Extracción de lípidos Se mezcló 1 g de yema de huevo y 7,5 mL de Cloroformo:Metanol 2:1 en un Whirley durante 30 segundos y se

centrifugó a 750 x g durante 10 minutos. Se aislaron 4 mL de la fase de cloroformo y se usaron para continuar con el análisis de lípidos. Ensayo de estabilidad frente a la oxidación La estabilidad frente a la oxidación de la mayonesa se midió en un equipo ML OXIPRESS, en el que la muestra es

sometida a estrés oxidativo por medio de aplicación de calor a presión en una atmósfera de oxígeno.

Después de un tiempo determinado, denominado periodo de inducción (IP), la oxidación de la muestra provoca un determinado consumo de oxígeno, que es registrado como un cambio de presión en el transductor de presión. Un periodo de inducción mayor indica una mejor estabilidad frente a la oxidación. Procedimiento.

Se colocan 5 gramos de mayonesa en un recipiente de vidrio y el recipiente de vidrio se cierra con el transductor de

5 presión. El contenedor se rellena con oxígeno a 5 bares. La válvula se abre para vaciar el contenedor. Este procedimiento se repite dos veces y la muestra con una atmósfera de 5 bar de oxígeno es llevada a 80 °C. Se mide la presión de oxígeno en función del tiempo y se calcula el periodo de inducción (IP) en horas.

Resultados

Las muestras nº 179 y 178-9 de transferasa purificada procedentes de Aeromonas salmonicida fueron usadas para

10 tratar yema de huevo como se describe en la Tabla 2. El ensayo inicial ha mostrado que la transferasa GCAT debería añadirse con una actividad de fosfolipasa (PLU) mucho más baja que una fosfolipasa comercial. Esto se explica por el hecho de que la GCAT es una transferasa y por lo tanto presenta una actividad hidrolítica mucho menor que una fosfolipasa normal.

Tabla 2

Yema de huevo con 8% de sal Sanofo: 2344-4.4 C89 18,5 PLU-7/mL Transferasa nº178-9 nº 3108, Lecitase Ultra Agua

Nº: Yema de huevo Transferasa nº179 18,5 PLU-7/mL 1500 PLU-7/mL

gramos
gramos
gramos: mL gramos PLU-7/mL

6: 120 2,00 8,00 0,31

7: 120 10 0 1,25

8: 120 1,86 8,14 23,25

9: 120 10 0

Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo escalando la yema de huevo y la enzima en un vaso de precipitados. Después de 1, 2 y 4 horas de tiempo de reacción se extrajo una muestra para análisis de TLC. Tras 4 horas de tiempo de reacción se almacenó el producto a 5 ºC y se usó para los experimentos de mayonesa.

Los análisis de TLC de lípidos extraídos de la yema de huevo tratada enzimáticamente se muestran en la Figura 48.

20 El análisis de TLC de la Figura 48 muestra un claro efecto hidrolítico de la Fosfolipasa nº3108 sobre los triglicéridos durante la formación de ácidos grasos libres, así como sobre algunos mono- y diglicéridos. La fosfolipasa nº3108 parece no tener efecto sobre el colesterol. Ambas muestras de transferasa contribuyen claramente a la formación de éster de colesterol simultánea a la reducción del contenido en colesterol.

D. Yema de huevo modificada con enzima en mayonesa

25 Con el objetivo de investigar el efecto de la modificación de las muestras de yema de huevo mencionadas en la Tabla 2, se realizaron ensayos de aplicación sobre mayonesa con un contenido en grasa del 50%. También se produjo una mayonesa que contiene yema de huevo no tratada.

El objetivo de la investigación fue determinar el impacto de las propiedades de emulsión de las yemas de huevo modificadas enzimáticamente, así como el impacto sobre la estabilidad térmica. Todas las muestras de mayonesa

30 contenían el mismo nivel de aceite y fueron emulsificadas solo con yema de huevo.

Las muestras de mayonesa fueron producidas usando un mezclador Koruma (Disho V60/10) y se calentaron en el procesado a 95°C durante 5 minutos.

Las muestras de mayonesa (Figura 49) producidas con yema de huevo tratada con enzima eran buenas y homogéneas, sin separación de aceite. La muestra de control se separó en una fase de aceite y otra acuosa.

El tamaño de partícula de la gota de aceite en las muestras de mayonesa con yema de huevo tratada enzimáticamente se midió en un Mastersizer Malvern. La muestra se mezcló con un 0,1% de SDS en tampón fosfato 0,1 M a pH 7 antes de la medida. La lectura fue el tamaño promedio de todas las partículas, según se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3.

Experimento: Enzima Tamaño de partícula medio, μm

6: Transferasa nº179, 0,31 PLU-7/g 12,9

7: Transferasa nº178-9, 1,25 PLU-7/g 7,2

8: nº3108, Lecitase Ultra, 23 PLU-7/g, 5,2

Los resultados de la medida de tamaño de partícula muestran claramente el efecto de una dosis incrementada de transferasa de A. salmonicida. Con la dosis alta de transferasa el tamaño de partícula es próximo al de la mayonesa producida con Lecitase Ultra. Sin embargo, debería tenerse en cuenta que la Lecitase Ultra produce muchos ácidos

10 grasos, lo que podría contribuir a una distribución de tamaños de partícula más estrecha.

El tamaño de la gota de aceite de la mayonesa preparada con la enzima es significativamente más pequeño que el tamaño de la gota de aceite de la mayonesa preparada sin la enzima (es decir, la mayonesa de control).

Estabilidad frente a la oxidación

La estabilidad a la oxidación de las muestras de mayonesa 7 y 8 se analizó en un ML OXIPRES, dando lugar a los 15 resultados mostrados en la Tabla 4.

Tabla 4

Muestra: Periodo de inducción Periodo de inducción

1. Determinación - horas: 2. Determinación - horas

7: 37,44 38,08

8: 35,68 35,52

La medida de la estabilidad frente a la oxidación proporcionó una clara diferencia significativa en la estabilidad frente a la oxidación. La mayonesa con yema de huevo tratada con transferasa 179-8 presentó una estabilidad frente a la

20 oxidación significativamente mejor que la mayonesa con yema de huevo tratada con Lecitase Ultra. Esto podría explicarse por el hecho de que la Lecitase Ultra produce más ácidos grasos libres que son más propensos a la oxidación que los correspondientes ésteres de ácido graso.

Se extrajo una muestra de las yemas de huevo usadas para la producción de mayonesa con cloroformo, y se analizaron los lípidos de la yema de huevo mediante GLC con los resultados mostrados en la Tabla 5.

25 Tabla 5 Los resultados de GLC de la Tabla 5 confirman los resultados del análisis de TLC de que la Lecitase Ultra produce una cantidad muy elevada de ácidos grasos libres, y una parte importante de los triglicéridos se hidrolizan. Por otro lado, la transferasa produce solamente una cantidad modesta de ácidos grasos libres y no se hidrolizan triglicéridos. También se muestra claramente que la transferasa produce éster de colesterol a partir de colesterol.

Experimento: Enzima Ácido graso Colesterol Éster de colesterol Triglicéridos

6: Transferasa nº179 0,96 0,94 0,49 23,95

7: Transferasa nº178-9 1,84 0,60 1,06 24,54

8: nº 3108, Lecitase Ultra 14,05 1,16 0,12 2,45

9: Control 0,48 1,16 0,13 22,87

5 Los resultados indican que la cantidad de PC en la mayonesa "tratada enzimáticamente" se reduce en comparación con la mayonesa de control, mientras que la cantidad de LPC aumenta en la mayonesa tratada enzimáticamente con respecto a la mayonesa de control. El aumento en la cantidad e LPC puede explicar bien las propiedades de emulsión mejoradas de la mayonesa tratada enzimáticamente en comparación con la mayonesa de control. Los análisis de HPLC y de GLC también indican un menor nivel de colesterol libre en la mayonesa tratada

10 enzimáticamente en comparación con la mayonesa de control, probablemente debido a que el colesterol está siendo usado como molécula aceptora en la reacción de transferasa, lo que da como resultado un aumento de la cantidad de ésteres de colesterol en la mayonesa tratada enzimáticamente en comparación con la mayonesa de control. Adicionalmente, los resultados indican que la cantidad de ácidos grasos libres no aumenta significativamente cuando la yema de huevo es tratada con la transferasa. Los resultados indican además que la cantidad de ácidos grasos

15 libres producidos en el alimento tratado con la lípido aciltransferasa es significativamente menor que en el alimento tratado con la fosfolipasa de control, siendo esto cierto incluso cuando la cantidad de lisolecitina formada en el alimento es la misma.

EJEMPLO 8: Efecto de la transferasa de Aeromonas salmonicida en pasteles.

El efecto de la acil transferasa GCAT procedente de Aeromonas salmonicida se evalúa en una receta de pastel. La

20 enzima es evaluada sola y en combinación con otras enzimas lipolíticas. Las enzimas se añaden a algunos ingredientes del pastel o se añaden junto con los otros ingredientes del pastel antes de mezclar el pastel.

Los resultados preliminares muestran que la acil transferasa combinada con una enzima que hidroliza triglicéridos mejora el volumen del pastel y la estructura de la miga en comparación con un control.

En los siguientes experimentos se evaluó una transferasa procedente de A. salmonicida , y sus variantes, sola y en

25 combinación con enzimas que hidrolizan triglicéridos. Estas enzimas son activas con los componentes lipídicos del huevo y de la manteca, así como con los carbohidratos, proteínas, glicerol y colesterol (del huevo), que forman parte de la receta del pastel.

Materiales y método

Enzima

30 Nº179, Acil-transferasa de Aeromonas salmonicida

Grindamyl EXEL 16, Lipasa de Thermomyces lanuginisus

Receta de pastel:

Ingredientes: % g

Azúcar 35/20: 20,37 204

Harina de pastel, Albatros: 18,11 181

Almidón de trigo: 5,21 52

Polvo de horneado: 0,36 4

Huevo líquido entero pasteurizado: 22,63 226

Manteca Vegao (Aarhus United): 18,11 181

Polvo de suero: 0,68 7

Jarabe de glucosa,75% 42 DE: 4,53 45

Glicerol: 1,36 14

Sal: 0,32 3

Ingredientes: % g

Aceite de colza: 6,34 63

Sorbato de potasio: 0,18 1,8

Equipamiento: Mezclador: Hobart N50 con una espátula Horno: horno pastelero Simon

5 Procedimiento: Todos los ingredientes deben templarse a temperatura ambiente.

1. Hacer crema de azúcar y manteca durante 3 minutos - comenzar en la 2ª velocidad y pasar a 3ª velocidad a los 30 segundos

2. Añadir el resto de ingredientes -comenzar a 1ª velocidad y pasar a 2ª velocidad a los 30 segundos -mezclar un 10 total de 5 minutos

3.: Medir el volumen de la mezcla en una copa de 1 dL

4.: Las bandejas de pastel son rociadas con aceite de untado "Babette", y se cubre con papel

5.: Escalar 2 x 350 g en las bandejas de pastel

6.: Extender la masa uniformemente con una espátula

15 7. Antes de llevar al horno - añadir una hilera de aceite en la parte superior del pastel (todo lo largo en el medio) para hacer que el pastel se abra por el medio

8.: Hornear durante 50 minutos a 180°C

9.: Tras el horneado sacar las bandejas del horno, y dejarlas "caer" sobre la mesa, antes de sacar los pasteles de las bandejas

20 10. Quitar el papel de los pasteles y voltear el lado derecho hacia arriba

11. Los pasteles son enfriados en una rejilla durante 60 minutos antes de ser pesados y de medir su volumen Observaciones: La(s) enzima(s) usada(s) es(son) añadida(s) al principio de la mezcla o es(son) añadidas a algunos ingredientes del

pastel antes que el resto de ingredientes del pastel. 25 Las enzimas son activas únicamente durante la mezcla o reacción de componentes del pastel, y las enzimas se desactivan durante el horneado del pastel.

Resultados. Los siguientes experimentos se han llevado a cabo como se muestra en la siguiente tabla:

1: 2 3 4

Huevo entero: G 250 250 250 250

Jarabe de glucosa, 75% DE 42: G 10 10 10 10

acil-transferasa nº179, 26 PLU/mL: Ml 25 25

Grindamyl EXEL 16,: Mg 37,5 37,5

Agua: 25

Se hace reaccionar huevo, jarabe de glucosa y enzima durante 30 minutos a 37 ºC y poco después los huevos se 5 usan para producir un pastel de acuerdo con la receta mencionada anteriormente.

Los resultados preliminares demuestran que una combinación de aciltransferasa y lipasa que hidroliza triglicéridos a partir de Thermomyces lanoginosus mejora el volumen del pastel y también la estructura de la miga, la calidad al comer y la apariencia se ven mejoradas en comparación con un control de agua. Los resultados preliminares indican que en un pastel puede ser preferible usar una combinación de lípido aciltransferasa y una lipasa.

10 EJEMPLO 9: El propósito de estos experimentos fue evaluar una transferasa procedente de A. hydrophila expresada en E. coli.

La reacción de transferasa de A. hydrophila nº135 (0,5 NEFA-PLU/mL) se evaluó con yema de huevo. El conjunto de experimentos se muestra en la Tabla 6.

Tabla 6

Tiempo de reacción: Yema de huevo nº135 conc.

Nº: Minutos gramos Unidades, PLU-NEFA

1: 30 1 0,000

2: 30 2 0,100

3: 60 2 0,100

4: 150 2 0,100

5: 240 2 0,100

6: 1560 2 0,100

7: 1560 1 0,000

La yema de huevo se calentó a 37ºC y se añadió la enzima. Tras el tiempo de reacción se añadieron 7 mL de CHCl3:Metanol 2:1 y se mezcló en un Whirley durante 30 segundos.

La muestra se centrifugó a 800 x g durante 10 minutos y se aisló la fase inferior de disolvente. Se aplicaron 2 μL de esta muestra a una placa de sílice de TLC y se eluyó en disolvente de elución IV. Los resultados del análisis de TLC 20 se muestran en las Figuras 50 y 51.

Los métodos y materiales mencionados en este Ejemplo son los detallados en los Ejemplos anteriores.

Las muestras de este experimento también se analizaron mediante GLC como derivados de TMS. Los resultados del análisis de GLC se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Análisis GLC de lípido de yema de huevo

Nº: Reacción Transferasa nº135 conc.

tiempo: Unidades/g de yema de huevo Ácidos grasos libres Colesterol Éster de colesterol

min: % % %

7: Control 0 0,25 2,88 0,34

3: 60 0,025 0,25 2,68 0,56

4: 150 0,025 0,29 1,85 1,72

5: 240 0,025 0,53 1,42 3,54

6: 1560 0,025 0,95 0,3 4,43

A partir del análisis de GLC de ácidos grasos libres, colesterol y ésteres de colesterol, es posible calcular la concentración molar de cada componente y calcular el % de actividad de transferasa mostrado en la Tabla 7.

Cálculo del % de actividad de transferasa

A partir de los resultados se calcula el aumento del contenido de ácidos grasos libres y ésteres de esterol

10 La actividad de transferasa se calcula como el % de la actividad enzimática total:

donde: Mv éster esterol = peso molecular medio de los ésteres de esterol Mv ácido graso = peso molecular medio de los ácidos grasos

Tabla 8. Actividad de transferasa en yema de huevo de A.hydrophila nº135

Nº: Reacción Transferasa nº135 conc.

tiempo: Unidades/g de yema de huevo Ácidos grasos libres Colesterol Éstercolesterol de Actividad de transferasa

min: mM mM mM %

7: Control 0 8,9 74,5 5,3 -

3: 60 0,05 8,9 69,3 8,7 100

4: 150 0,05 10,4 47,8 26,5 93

5: 240 0,05 18,9 36,7 54,6 77

6: 1560 0,05 33,9 7,8 68,4 48

Tanto el análisis de TLC como el de GLC confirman que inicialmente la reacción de transferasa de A. hydrophila nº135 es la reacción predominante. Después de 150 minutos de tiempo de reacción se produce algo de actividad

5 hidrolítica. Después de 1560 minutos la reacción de transferasa y la reacción hidrolítica habían alcanzado casi el mismo nivel. Los resultados también indican que mientras haya disponible colesterol como molécula aceptora la reacción de transferasa es la predominante. Cuando la concentración de colesterol disminuye, la actividad hidrolítica se vuelve más predominante.

EJEMPLO 10: Ensayo para la medida de actividad de transferasa usando yema de huevo como sustrato 10 denominado a partir de este punto "Ensayo de Yema de Huevo"

Se aisló una lípido aciltransferasa a partir de Aeromonas salmonicida y se expresó en Bacillus subtilis. El propósito de este trabajo es desarrollar un método analítico, que sea capaz de medir tanto la actividad de transferasa como la hidrolítica en enzimas, y a partir de dichos análisis es posible definir ambas actividades enzimáticas, de transferasa e hidrolítica, usando un sustrato que contenga lecitina y colesterol.

15 En este trabajo se usó yema de huevo como sustrato para el ensayo enzimático debido a que la yema de huevo contiene tanto lecitina como colesterol, y se sabe que las transferasas y las fosfolipasas funcionan muy bien con dicho sustrato.

La desventaja de usar yema de huevo es que el sustrato es una mezcla compleja de agua, lípidos y proteínas. Los componentes lipídicos incluyen glicéridos, un 66,2%; fosfolípidos, 29,6%; y colesterol, 4,2%. Los fosfolípidos

20 consisten en un 73% de lecitina, un 15% de cefalina y un 12% de otros fosfolípidos. De los ácidos grasos, el 33% son saturados y el 67% insaturados, que incluye un 42% de ácido oleico y un 7% de ácido linoleico (ref. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Inc.)

Se podrían esperar algunas variaciones de la composición de la yema de huevo. Sin embargo, en la bibliografía (Biochimica et Biophysica Acta, 1124 (1992) 205-222), se menciona que "La yema de huevo madura de gallinas

25 domésticas posee una composición en lípidos y lipoproteínas marcadamente constante a pesar de variaciones importantes en las condiciones ambientales y de dieta", y además se establece "Como resultado, la yema de huevo continúa proporcionando un producto alimentario de composición casi constante, lo que sirve para mantener sus propiedades químicas y físico-químicas para una utilización fiable en las industrias panadera, cosmética y farmacéutica".

30 Esta referencia indica que la composición de la yema de huevo es muy constante y por lo tanto se decidió usar yema de huevo de gallina como sustrato para el Ensayo de Yema de Huevo.

La cuantificación de los productos de reacción lipídicos del tratamiento enzimático de yema de huevo se realizó mediante extracción de los lípidos del sustrato seguida de análisis de GLC de los componentes de los lípidos.

Procedimiento Materiales. Yema de huevo: Yema de huevo líquida pasteurizada de Danæg Products A/S, Dinamarca- 4000 Roskilde. Tampón

HEPES de Sigma, nº de cat. H 3375

5 Cloroformo, grado analítico Enzimas. Lípido aciltransferasa purificada procedente de A. salmonicida nº178-9 Lipasa de Thermomyces lanuginosus. GRINDAMYL EXEL 16 , ítem nº 147060 (Control)

Ensayo de enzima con sustrato de yema de huevo.

10 Se escalaron 5 gramos de yema de huevo líquida en un vaso Wheaton de 20 mL y se calentó a 35 ºC. Se añadieron 0,25 mL de disolución enzimática y se puso en marcha un reloj de parada. A intervalos regulares se transfirieron muestras de 0,5 g a un vaso Dram de 10 mL. Se añadieron 20 μL de HCl 4M a fin de detener la reacción enzimática y acidificar los jabones de ácido graso. Se añadieron 3 mL de cloroformo. Y la muestra se mezcló en un mezclador Whirley durante 30 segundos. 15 La muestra se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos y se transfirieron 0,8 mL de la fase cloroformo a un vaso Dram tarado. Se evaporó el cloroformo a 60ºC con una corriente de nitrógeno. El vaso dram se escaló de nuevo. Los lípidos aislados fueron analizados mediante GLC y TLC. Análisis TLC - tal como se describe en la presente memoria. Análisis GLC - tal como se describe en la presente memoria.

20 Resultados Para el Ensayo de Yema de Huevo que usa como sustrato yema de huevo, se llevó a cabo el experimento mostrado en la Tabla 9.

Tabla 9

1: 2 3

Yema de huevo, líquida.: gramos 5 5 5

Transferasa nº 178-9, 32 PLU-7/mL*: mL 0,25

Lipasa de T. lanuginosus, 200 LIPU/mL: mL 0,25

Agua: mL 0,25

25 Se extrajeron muestras de 0,5 g tras 15, 30, 60 120 y 1080 minutos, y los lípidos fueron aislados mediante extracción con disolventes. Los lípidos fueron analizados mediante TLC usando el disolvente I y el disolvente IV, respectivamente. La Figura 52 muestra una fotografía de la placa de TLC.

El análisis de TLC demuestra claramente la actividad de la transferasa nº178-9 de A. salmonicida (muestra 3). Esto puede observarse a través del descenso de los fosfolípidos PC y PE. Los resultados también indican que la cantidad

30 de lisolecitina LPC no es tan alta como cabría esperar. Esto podría indicar una actividad hidrolítica sobre la lisolecitina, o también podría deberse a una extracción insuficiente ya que la lisolecitina es muy polar y por tanto se podría distribuir parcialmente en la fase acuosa.

Los lípidos aislados mediante extracción con disolvente también podrían analizarse mediante GLC con el objetivo de cuantificar la cantidad de ácidos grasos libres, colesterol y éster de colesterol. Los resultados de GLC se muestran

35 en la Tabla 10.

Tabla 10. Análisis de GLC de lípidos procedentes de yema de huevo tratada enzimáticamente. Los resultados se expresan en % referido al contenido de lípidos.

15: 30 60 120 1080

Minutos
Minutos
Minutos
Minutos
Minutos

Ácidos grasos libres: Control 1 0,328 0,304 0,332 0,333 0,369

T. lanuginosus: 2 0,391 0,376 0,459 0,627 22,909

A. salmonicida nº178-9: 3 1,007 1,668 4,013 6,761 15,098

Colesterol: Control 1 3,075 2,968 3,103 3,056 3,099

T. lanuginosus: 2 3,130 3,032 3,045 3,026 3,225

A. salmonicida nº178-9: 3 2,835 1,912 0,356 0,220 0,206

Éster de colesterol: Control 1 0,416 0,397 0,422 0,408 0,437

T. lanuginosus
T. lanuginosus: 2 0,436 0,400 0,425 0,419 0,416

A. salmonicida nº178-9
A. salmonicida nº178-9: 3 1,414 2,988 6,107 6,694 5,760

Triglicéridos: Control 1 76,153 73,505 75,565 79,344 77,382

T. lanuginosus: 2 74,099 74,413 77,079 74,284 21,781

A. salmonicida nº178-9: 3 73,781 73,342 77,857 82,040 72,117

A partir de los resultados, se observó que casi todo el colesterol se había esterificado después de 60 minutos en la

5 muestra 3. Se concluyó que en los primeros 30 minutos había un exceso de sustrato para la reacción. Por tanto, se usaron los resultados de las muestras tomadas después de 15 y 30 minutos para calcular las actividades de las enzimas.

En base a la información de la Tabla 10 y al hecho de que la yema de huevo contiene un 27% de lípidos, se calculó la cantidad de micromoles de ácidos grasos y ésteres de colesterol producidos por mL de enzima, dando lugar a los 10 resultados mostrados en la Tabla 11.

Los resultados de la Tabla 11 se obtuvieron mediante los siguientes cálculos a partir de los resultados de ácidos grasos de la muestra nº 3 (A. salmonicida, 15 min.)

Lípidos en 5 g de yema de huevo = 5*0,27 = 1,35 gramos

1,35 gramos de lípidos contienen 1,007% de ácidos grasos = 1,35*1,007/100 = 0,01359 gramos. El peso molecular 15 promedio de los ácidos grasos es de 272.

0,01359 gramos = 0,01359* 1000000/272 μmol = 49,9798 μmol

Se añaden 0,25 mL de enzima μmol de ácidos grasos/mL de enzima = 49,9798/0,25 = 199,9 Tabla 11

Micromoles/mL de enzima

0 min: 15 min 30 min

Ácidos grasos libres: Control 65,01 60,37

T. lanuginosa: 77,61 74,71

Transferasa nº178-9: 199,86 331,06

Éster de colesterol: Control 35,09 33,50

T. lanuginosa: 36,77 33,73

Transf. nº178-9: 119,29 252,15

A partir de los resultados de la Tabla 11 es posible calcular el cambio de la cantidad de ácidos grasos y ésteres de colesterol provocado por la enzima, con respecto al control, tal como se muestra en la Tabla 12.

Tabla 12.

Δ Micromoles/mL de enzima: min 15 min 30 min

Ácidos grasos libres: T. lanuginosus 0 12,593 14,340

Transf. nº178-9: 0 134,843 270,691

Éster de colesterol: T. lanuginosus 0 1,677 0,235

Transf. nº178-9: 0 84,196 218,652

La cantidad de ácidos grasos o ésteres de colesterol producidos en función del tiempo se muestra en la Figura 53.

A partir de la pendiente de la curva, se calculó la actividad hidrolítica (formación de FFA) y la actividad de lípido 10 aciltransferasa (formación de éster de colesterol) en función del tiempo. A continuación se calculó la actividad de transferasa relativa (% de actividad de aciltransferasa) y la actividad hidrolítica relativa como se muestra en la Tabla

13. La actividad de transferasa relativa se determinó usando el protocolo para la determinación del % de actividad de aciltransferasa, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Por ejemplo, el cálculo de la actividad relativa correspondiente a nº178-9: La actividad total es la actividad de FFA + la actividad de transferasa =

15 9,023+7,2884 = 16,311 μmol/min·mL, Actividad de transferasa relativa = 7,2884*100/16,311 = 44,7, Actividad hidrolítica relativa = 9,023*100/16,311 = 55,3

Tabla 13.

T. lanuginosus: Actividad de FFA 0,4780 μmol/min·mL

A. salmonicida nº178-9: Actividad de FFA 9,0230 μmol/min·mL

T. lanuginosus: Actividad de éster de colesterol 0,0078 μmol/min·mL

A. salmonicida nº178-9: Actividad de éster de colesterol 7,2884 μmol/min·mL

T. lanuginosus: Actividad de transferasa relativa 1,6

A. salmonicida nº178-9: 44,7

T. lanuginosus: Actividad hidrolítica relativa 98,4

A. salmonicida nº178-9: 55,3

Los resultados de la Tabla 13 confirmaron que la enzima transferasa procedente de A. salmonicida tiene una actividad de transferasa significativa, pero los resultados también confirmaron que dicha enzima presenta una 5 actividad hidrolítica significativa.

La lipasa de T. lanuginosus presenta fundamentalmente actividad hidrolítica, y la actividad de transferasa relativa de 1,6 no es una prueba de actividad de transferasa alguna, sino que se explica por la incertidumbre del análisis.

Conclusión.

Se usó yema de huevo como sustrato para la medida de la actividad de transferasa e hidrolítica de lípido

10 aciltransferasa de Aeromonas salmonicida y de una lipasa de Thermomyces lanuginosus. En las condiciones de ensayo inicialmente se observó una relación lineal entre el tiempo y la formación de éster de colesterol y ácidos grasos libres para la enzima lípido aciltransferasa. En base a dicha relación lineal fue posible calcular la actividad hidrolítica (formación de FFA) y la actividad de transferasa (formación de éster de colesterol). También se calcularon las actividades hidrolítica y de transferasa relativas. La lípido aciltransferasa (en este caso una GCAT) de

15 Aeromonas salmonicida demostró una actividad casi igual de transferasa e hidrolítica en las condiciones de ensayo. La lipasa procedente de Thermomyces lanuginosus mostró una actividad hidrolítica muy baja y la actividad de transferasa no fue significativa.

EJEMPLO 11: Ensayo de transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua

Introducción

20 Se aisló una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente descripción a partir de Aeromonas salmonicida y se expresó en Bacillus subtilis. Los experimentos iniciales han demostrado que esta enzima es muy eficiente para la transferencia de ácidos grasos desde lecitina a colesterol usando yema de huevo como sustrato.

En los siguientes experimentos se estudió la reacción de transferasa con más detalle usando yema de huevo como sustrato con especial atención a la concentración de agua en el sustrato.

25 Procedimiento

Materiales.

Yema de huevo: Yema de huevo líquida pasteurizada de Danæg Products A/S, Dinamarca- 4000 Roskilde.

Tampón HEPES de Sigma, nº de cat. H 3375

Cloroformo, grado analítico Escualano, grado analítico Enzimas. Nº 178-9 Lípido acil transferasa de acuerdo con la presente descripción procedente de A. salmonicida

5 Nº 2427 Fosfolipasa A1 de Fusarium oxysporum. LIPOPAN® F de Novozymes, Dinamarca (enzima lipolítica comparativa) Nº 1991 Fosfolipasa A2 de páncreas, LIPOMOD 22L de Biocatalysts, R.U. (enzima lipolítica comparativa)

Ensayo de enzima con sustrato de yema de huevo.

Se escalaron 5 gramos de sustrato de yema de huevo líquida en un vaso Wheaton de 20 mL y se calentó a 35 ºC.

10 Se añadió agua y disolución de enzima y se puso en marcha un reloj de parada. A intervalos regulares se transfirieron muestras de 0,5 g a un vaso Dram de 10 mL. Se añadieron 20 μL de HCl 4M a fin de detener la reacción enzimática y acidificar los jabones de ácido graso. Se añadieron 3 mL de cloroformo. Y la muestra se mezcló en un mezclador Whirley durante 30 segundos. La muestra se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos y se transfirieron 0,8 mL de la fase cloroformo a un vaso

15 Dram alquitranado. Se evaporó el cloroformo a 60ºC con una corriente de nitrógeno. El vaso dram se escala de nuevo. Los lípidos aislados son analizados mediante GLC.

Análisis de GLC

Cromatógrafo Capilar de Gases Perkin Elmer Autosystem 9000 equipado con una columna de sílice fusionada 20 WCOT de 12,5 m x 0,25 mm ID x 0,1 μm de espesor de película, 5% de fenil-metilsilicona (CP Sil 8 CB de Chrompack).

Gas portador: Helio.

Inyector. Inyección con split en frío PSSI (temperatura inicial 50°C, calentamiento hasta 385°C), volumen 1,0 μL, Detector FID: 395°C

Programa del horno:: 1 2 3

Temperatura del horno, °C.: 90 280 350

Isotérmico, tiempo, min.: 1 0 10

Rampa de temperatura, °C/min.: 15 4

Preparación de muestras: se disolvieron 30 mg de muestra en 9 mL de Heptano:Piridina, 2:1 que contenían el patrón interno, heptadecano, 0,5 mg/mL. Se transfirieron 300 μL de disolución de muestra a un vial de rosca, se añadieron 300 μL de MSTFA (N-Metil-N-trimetisilil-trifluoracetamida) y se dejó reaccionar 20 minutos a 60°C.

Cálculo: Se determinaron los factores de respuesta correspondientes a mono-di-triglicéridos y ácidos grasos libres

30 empleando el patrón 2 (mono-di-triglicéridos), para colesterol, palmitato de colesterilo y estearato de colesterilo los factores de respuesta se determinaron a partir de las materias de referencia puras (pesando 10 mg del material puro).

Resultados

Se usó yema de huevo que contenía un 2% de escualano como sustrato para las reacciones. El escualano se

35 añadió como patrón interno para el análisis de GLC, con el objetivo de cuantificar los componentes lipídicos de la yema de huevo.

El experimento se planificó como se muestra en la Tabla 14. Tabla 14.

1: 2 3 4 5 6 7 8

Sustrato, yema de huevo con un 2% de escualano: g 5 5 5 5 5 5 2,5 2,5

Transferasa nº 178-9, 14 PLU-7/mL: mL 0,25 0,25 0,13

Disolución de LIPOPAN® F, 200 PLU-7/mL: mL 0,25 0,13

Nº 1991 Fosfolipasa A2, 6300 PLU/mL: mL 0,25 0,25

Agua: mL 0,25 3,8 3,8 8,75 8,75

Se tomaron muestras a los 30, 60 y 120 minutos y se analizaron según el método descrito anteriormente (se tomaron muestras de 0,5 mL (exp. 1-4), 0,86 mL (exp. 5-6) y 2,2 mL (exp. 7-8)).

Los resultados del análisis de GLC se muestran en la Tabla 15. Los resultados de GLC se expresan en porcentaje del sustrato (yema de huevo). La tabla también indica el tiempo de reacción y la cantidad total de agua en la mezcla de reacción.

Tabla 15.

Enzima: Tiempo reacción de % de agua GLC GLC GLC

minutos: en reacción % degrasos ácidos % de colesterol % de éster de colesterol

Control: 120 54 0,247 0,863 0,083

Nº 178: 30 54 0,422 0,669 0,445

Nº 178: 60 54 0,515 0,549 0,672

Nº 178: 120 54 0,711 0,364 1,029

Nº 2427: 30 54 2,366 0,848 0,090

Nº 2427: 60 54 3,175 0,837 0,088

Nº 2427: 120 54 3,926 0,833 0,082

Nº 1991: 30 54 1,606 0,911 0,083

Nº 1991: 60 54 1,701 0,838 0,080

Nº 1991: 120 54 1,781 0,763 0,053

Nº 178: 30 73 0,377 0,764 0,495

Nº 178: 60 73 0,488 0,665 0,719

Enzima: Tiempo reacción de % de agua GLC GLC GLC

Nº 178: 120 73 0,626 0,426 0,931

Nº 2427: 30 73 2,471 0,853 0,092

Nº 2427: 60 73 3,284 0,858 0,087

Nº 2427: 120 73 4,176 0,837 0,081

Nº 178: 30 89 0,344 0,720 0,308

Nº 178: 60 89 0,443 0,725 0,446

Nº 178: 120 89 0,610 0,597 0,607

Nº 2427: 30 89 0,510 0,167 0,010

Nº 2427: 60 89 0,602 0,133 0,010

Nº 2427: 120 89 0,867 0,147 0,009

En base a los análisis de ácidos grasos, colesterol y éster de colesterol, fue posible calcular la cantidad de ácidos grasos libres y de ésteres de colesterol producidos en función del tiempo de reacción y del contenido en agua. En base a estos resultados a continuación fue posible calcular la actividad enzimática total como la suma de la

5 formación de ácidos grasos y la formación de éster de colesterol. A continuación se calculó la actividad hidrolítica relativa y la actividad de transferasa relativa (es decir, el % de actividad de aciltransferasa) dando lugar a los resultados mostrados en la Tabla 16.

Los resultados de la Tabla 16 también fueron analizados estadísticamente usando un software Statgraphics.

Multifactor ANOVA. Los resultados estadísticos de la Figura 54 confirman que la Fosfolipasa A1, nº 2427, y la

10 fosfolipasa A2, nº 1991, no presentan actividad de transferasa, mientras que la transferasa nº 178-9 mostró casi un 50% de actividad de transferasa en estas condiciones de ensayo.

El efecto del contenido de agua en el ensayo sobre la actividad de transferasa de la transferasa nº 178 también se analizó estadísticamente, como se muestra en la Figura 55. Estos resultados indican que en el intervalo entre 54% y 89% de agua en el ensayo no se produjo un efecto importante del contenido de agua sobre la actividad de

15 transferasa relativa.

Se evaluó el impacto del tiempo de reacción sobre la actividad de transferasa para la transferasa nº 178, dando lugar a los resultados mostrados en la Tabla 16 y la Figura 56. Los resultados de la Figura 56 indican que la actividad de transferasa relativa disminuye en función del tiempo de reacción. Esto podría explicarse por el hecho de que la mayor parte de las moléculas aceptoras de colesterol se han consumido y, por tanto, aumenta la actividad hidrolítica

20 relativa. Los valores negativos para la reacción de transferasa de nº 2427 indican solamente que no hay actividad de transferasa dentro del error del método analítico.

Tabla 16.

Enzima: Tiempo de reacción, minutos % de agua en la mezcla de reacción Ácidos grasos producidos Colesterol consumido Ésteres de colesterol producidos % de actividad hidrolítica % de actividad de transferasa

Nº 178: 30 54 0,175 0,194 0,362 53 47

Nº 178: 60 54 0,268 0,314 0,589 52 48

Nº 178: 120 54 0,464 0,499 0,946 53 47

Nº 2427: 30 54 2,119 0,015 0,007 100 0

Nº 2427: 120 54 2,928 0,026 0,005 100 0

Nº 2427: 60 54 3,679 0,030 -0,001 100 0

Nº 1991: 30 54 1,359 -0,048 0,000 100 0

Nº 1991: 60 54 1,454 0,025 -0,003 100 0

Nº 1991: 120 54 1,534 0,100 -0,030 101 -1

Nº 178: 30 73 0,130 0,099 0,412 42 58

Nº 178: 60 73 0,241 0,198 0,636 47 53

Nº 178: 120 73 0,379 0,437 0,848 51 49

Nº 2427: 30 73 2,224 0,010 0,009 100 0

Nº 2427: 60 73 3,037 0,005 0,004 100 0

Nº 2427: 120 73 3,929 0,026 -0,002 100 0

Nº 178: 30 89 0,097 0,143 0,225 50 50

Nº 178: 60 89 0,196 0,138 0,363 56 44

Nº 178: 120 89 0,363 0,266 0,524 62 38

Nº 2427: 30 89 0,263 0,696 -0,073 113 -13

Nº 2427: 60 89 0,355 0,730 -0,073 110 -10

Nº 2427: 120 89 0,620 0,716 -0,074 105 -5

Conclusión.

La lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida se evaluó en yema de huevo como sustrato y con diferentes 5 niveles de contenido de agua. Esta enzima se comparó con enzimas lipolíticas de control, a saber Fosfolipasa A1 procedente de Fusarium oxysporum y una Fosfolipasa A2 de páncreas.

Los resultados han demostrado que solo la transferasa cataliza la reacción de transferasa entre la lecitina y el colesterol durante la formación de éster de colesterol. Los resultados demostraron que en el intervalo entre 54% y 89% de agua en el sustrato la actividad de transferasa relativa fue casi la misma que la de la transferasa de

10 Aeromonas salmonicida.

EJEMPLO 12: El "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" para la mediad de la actividad de aciltransferasa (por ejemplo, para uso en un alimento que contiene lecitina y colesterol).

Se aisló lípido aciltransferasa a partir de Aeromonas salmonicida y se expresó en Bacillus subtilis. Esta enzima es muy eficiente en la transferencia de ácidos grasos de lecitina a colesterol durante la formación de ésteres de colesterol. También se ha demostrado que la enzima presenta algo de actividad hidrolítica, que se observa a través de la formación de ácidos grasos libres. Las fosfolipasas tradicionales (EC3.1.1.4 y EC3.1.1.32) tienen la capacidad de hidrolizar lecitina durante la formación de ácidos grasos libres y lisolecitina, no habiéndose publicado nada sobre reacciones de transferasa para estas enzimas.

En la presente memoria se detalla un ensayo que es capaz de medir la actividad enzimática, tanto de transferasa como hidrolítica, para así identificar lípido aciltransferasas de acuerdo con la presente descripción, el ensayo usa un sustrato que contiene lecitina y colesterol. En este trabajo se usó un sustrato basado en fosfatidilcolina y colesterol dispersados en un tampón. La cuantificación de los productos de reacción se realizó mediante extracción de lípidos del sustrato seguida de análisis de GLC de los componentes lipídicos.

Procedimiento

Materiales

L-alfa-Fosfatidilcolina al 95% (Plant) Avanti nº 441601

Colesterol: Sigma cat. C 8503

Palmitato de colesterilo, Sigma C 6072

Estearato de colesterilo, C 3549

Tampón HEPES de Sigma, nº de cat. H 3375

Cloroformo, grado analítico.

Enzimas

GCAT purificada procedente de A. salmonicida nº178-9

El análisis de TLC se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 6.

El análisis de GLC se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 11.

Resultados: Ensayo de transferasa basado en fosfatidilcolina y colesterol como sustrato.

A continuación se evaluó la actividad de transferasa de la transferasa en un sustrato basado en fosfatidilcolina y colesterol según el siguiente procedimiento.

Se disolvieron 450 mg de fosfatidilcolina (>95% PC Avanti ítem nº 441601) y 50 mg de colesterol en cloroformo y se evaporaron hasta sequedad a vacío. Se transfirieron 300 mg de mezcla de colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton y se añadieron 15 mL de tampón HEPES 50 mM, pH 7. El lípido se dispersó en el tampón durante la agitación.

El sustrato se calentó a 35 ºC durante el mezclamiento con un agitador magnético y se añadieron 0,25 mL de disolución de enzima. Se trata de un medio de muy alto contenido en agua, aproximadamente el 95% de agua.

Se tomaron muestras de 2 mL a los 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción. Inmediatamente, se añadieron 25 μL de HCl 4M para acidificar los ácidos grasos libres y detener la reacción enzimática. Se añadieron 3,00 mL de cloroformo, y la muestra se agitó vigorosamente en un Whirley durante 30 segundos. La muestra se centrifugó y se aislaron 2 mL de la fase cloroformo que se filtraron a través de filtros de 0,45 μm en un vaso Dram tarado de 10 mL. Se evaporó el cloroformo en una corriente de nitrógeno a 60ºC, y las muestras se volvieron a escalar. Los lípidos extraídos fueron analizados mediante GLC.

Los resultados del análisis de GLC se muestran en la Tabla 17. Los resultados se expresan en % calculado respecto a los lípidos extraídos. La cantidad de ácidos grasos y ésteres de colesterol formados en función del tiempo se muestra en la Figura 57. Se puede concluir que la reacción enzimática no es lineal con el tiempo, ya que se observa una fuerte actividad inicial, tanto hidrolítica como de transferasa. Después de aproximadamente 10 minutos y hasta aproximadamente 60 minutos, la reacción muestra una respuesta casi lineal para la formación de ácidos grasos y ésteres de colesterol en función del tiempo. Por lo tanto, se decidió mirar a la reacción enzimática en este intervalo de tiempo.

Tabla 17

Minutos: 0 5 10 15 25 40 60

Colesterol, %: 10,064 8,943 8,577 8,656 8,102 7,856 7,809

Éster de colesterol, %: 0,000 1,571 2,030 2,058 2,282 2,659 3,081

FFA totales, %: 0,260 1,197 1,239 1,466 2,445 2,943 3,940

Conociendo la cantidad de lípidos en la mezcla de reacción y la cantidad de enzima añadida, es posible calcular la formación de ácidos grasos y ésteres de colesterol expresados en μmol/mL de enzima (Tabla 18 y Figura 58)

Tabla 18

Minutos: 10 15 25 40 60

μmol/mL
μmol/mL
μmol/mL
μmol/mL
μmol/mL

FFA totales: 58,1 68,7 114,6 138,0 184,7

Ésteres de colesterol: 88,8 90,0 99,3 115,6 133,8

A partir de los resultados de la Tabla 18 y de la pendiente de las curvas de la Figura 58 fue posible calcular la cantidad de ácidos grasos y de ésteres de colesterol en función del tiempo, expresada como μmol/min por mL de enzima.

10 El cálculo de la actividad hidrolítica y de la actividad de transferasa se muestra en la Tabla 19. La actividad de transferasa relativa se determinó usando el protocolo para la determinación del % de actividad de aciltransferasa, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

Tabla 19

Actividad hidrolítica (ácidos grasos): 2,52 μmol/min por mL de enzima

Actividad de transferasa (éster colesterol): de 0,94 μmol/min por mL de enzima

Actividad total: 3,45 μmol/min por mL de enzima

Actividad de transferasa relativa: 27,1 %

Actividad hidrolítica relativa: 72,9 %

15 Escrutinio de otras enzimas para determinar actividad de transferasa.

Se usó el método mencionado anteriormente para escrutar diferentes enzimas lipolíticas para determinar la actividad hidrolítica y de transferasa. Las enzimas fueron evaluadas como se muestra en la Tabla 20.

Tabla 20

1: 2 3 4 5

Sustrato: mL 15 15 15 15 15

Nº 178-9 Transferasa de A. salmonicida 32 PLU-7/mL: mL 0,25

5% de Nº 3016, LIPOPAN® F (F. oxysporum): mL 0,25

5% de Thermomyces lanuginosus: mL 0,25

5% de Candida rugosa Nº 2983: mL 0,25

5% de Candida cylindracea Nº 3076: mL 0,25

Se calentó a 35 ºC con agitación un sustrato que contenía 300 mg de fosfatidilcolina/colesterol dispersada en tampón HEPES 50 mM, pH 7,0. Se añadió la disolución enzimática y la muestra se mantuvo a 35 ºC con agitación. Se tomaron muestras a intervalos regulares y se extrajeron con cloroformo. Los lípidos aislados fueron analizados mediante GLC, dando lugar a los resultados mostrados en la Tabla 21.

Tabla 21 A partir de los análisis de GLC se dedujo que sólo la lípido aciltransferasa (178-9) produjo una cantidad significativa

Muestra

1: Transferasa nº178-9

Minutos: 0 5 10 15 25 40 60

FFA: 1,216 2,516 2,983 2,62 2,894 3,448 3,911

Colesterol: 7,547 6,438 6,365 6,15 6,136 5,936 5,662

Éster de col.: 0 1,835 2,177 2,44 2,58 2,851 3,331

2: Fusarium oxysporum (LIPOPAN® F) 0 5 10 15 25 40 60

FFA: 1,216 1,345 1,796 1,95 2,487 2,424 2,977

Colesterol: 7,547 7,309 7,366 7,33 7,429 7,341 7,326

Éster de col.: 0 0,26 0,386 0,35 0,267 0,36 0,394

3: Thermomy ces lanuginosu s 0 5 10 15 25 40 60

FFA: 1,216 0,853 0,875 1 0,896 1,105 1,009

Colesterol: 7,547 7,384 7,639 7,63 7,675 7,675 7,603 7,529

3: Thermomy ces lanuginosu s 0 5 10 15 25 40 60

Éster de col.: 0 0 0 0 0 0 0

4: Candida rugosa (Nº2938) 0 5 10 15 25 40 60 6C

FFA: 1,216 0,982 0,987 1,02 1,135 1,131 1,15

Colesterol: 7,547 7,438 7,656 7,66 7,638 7,575 7,585

Éster de col.: 0 0 0 0 0 0 0

5: Candida cylandrace a (Nº3076) 0 5 10 15 25 40 60

FFA: 1,216 1,032 1,097 1,07 1,203 1,131 1,43

Colesterol: 7,547 7,502 7,425 7,65 7,619 7,502 7,411

Éster de col.: 0 0 0 0 0 0 0

5 de ésteres de colesterol y ácidos grasos. La fosfolipasa procedente de Fusarium oxysporum también proporcionó un aumento sostenido del contenido de ácidos grasos pero sólo se observó una pequeña cantidad de formación inicial de ésteres de colesterol, sin que se observara un aumento en la producción de los ésteres de colesterol con el tiempo.

En base al conocimiento sobre la cantidad de sustrato lipídico y a los análisis de GLC, fue posible calcular la

10 actividad de transferasa relativa y la actividad hidrolítica relativa en base a los resultados de los tiempos de reacción de 10 y 60 minutos. Los resultados de la Transferasa 178-9 y de la lipasa de Fusarium oxysporum se muestran en la Tabla 21. Las otras enzimas evaluadas no presentaron actividad.

Tabla 21

Transferasa nº178-9: Fusarium oxysporum

Actividad hidrolítica, micromol/min por mL de enzima: 1,03 0,96

Actividad de transferasa, micromol/min por mL de enzima: 0,40 0,01

Actividad total, micromol/min por mL de enzima: 1,43 0,98

Actividad hidrolítica relativa: 71,8 98,7

Actividad de transferasa relativa: 28,2 1,3

El resultado mostrado en la Tabla 21 confirma una actividad de transferasa significativa para la lípido aciltransferasa (muestra 178-9). También se observó que la actividad de transferasa relativa coincide adecuadamente con el 5 experimento mencionado en la Tabla 19

Sin embargo, se observó una muy baja actividad de transferasa para la fosfolipasa de Fusarium oxysporum. Dicho nivel de transferasa es tan bajo que entra dentro de la incertidumbre del análisis. Como era de esperar, la fosfolipasa de Fusarium oxysporum presentó una actividad hidrolítica significativa.

Conclusión.

10 En lugar de yema de huevo (mostrada en el Ejemplo 11), se usó un sustrato artificial basado en fosfatidilcolina y colesterol purificados como sustrato para la medida de la actividad de la transferasa de Aeromonas salmonicida. En el intervalo de tiempo de reacción entre los minutos 10 y 60 el ensayo presentó una formación casi lineal de ácidos grasos libres y ésteres de colesterol en función del tiempo. En base a la actividad entre los tiempos de reacción de 10 minutos y 60 minutos se calculó la actividad hidrolítica y la actividad de transferasa.

15 En este ensayo la concentración de sustratos fue relativamente menor que con la yema de huevo, y la cantidad de agua presente en el ensayo fue relativamente mayor.

En base a los resultados del ensayo de la lípido aciltransferasa (en este caso una GCAT) procedente de Aeromonas salmonicida en un sustrato artificial de fosfatidilcolina/colesterol en tampón, se concluye que dicha enzima presenta una actividad de transferasa muy buena también en un sistema con un contenido de agua muy alto.

20 Ambos ensayos, el basado en yema de huevo (véase el Ejemplo 11) y el de fosfatidilcolina/colesterol en tampón (Ejemplo 12), pueden usarse para medir la actividad hidrolítica y de transferasa de enzimas. Se prefiere la yema de huevo desde el punto de vista de que la actividad hidrolítica y de transferasa es lineal en función del tiempo, mientras que el de fosfatidilcolina/colesterol en tampón sólo es lineal en un intervalo de tiempo limitado.

EJEMPLO 13: Emulsiones alimentarias

25 Se evaluó el efecto de la yema de huevo líquida modificada enzimáticamente en una receta de emulsión alimentaria estándar con un 60 % de aceite.

Los métodos y materiales estándares son los mismos detallados en los Ejemplos anteriores.

La yema de huevo fue tratada con una lípido aciltransferasa procedente de Aeromonas salmonicida( Nº138) o con fosfolipasa, a saber, una enzima disponible comercialmente Lipopan F® (Novozymes A/S, Dinamarca) (Nº2938)

30 como se muestra en la Tabla 22.

Tabla 22. Tratamiento enzimático de yema de huevo.

1: 2 3 4

Yema de huevo, Sanofo producto nº 1123P2: Gramos 10 10 10 10

Nº138, 10 PLU/mL: M1 1 1

Nº2938, 200 PLU/mL: M1 1

Agua: M1 1

Tiempo de reacción: Minutos 210 360 210 210

El análisis de TLC de los lípidos de yema de huevo correspondiente a la yema de huevo tratada enzimáticamente (Tabla 9) se muestra en las Figuras 59 y 60.

5 En este experimento se incrementó la dosis de nº2938 en un factor de 10 y esto proporcionó una actividad muy clara sobre la yema de huevo. La cantidad de ácidos grasos libres aumentó significativamente y la lecitina (PC) se hidrolizó a lisolecitina (LPC). La transferasa nº138 produjo una evidente reacción de transferasa ya que el colesterol se convirtió en éster de colesterol y parte de la lecitina se convirtió en lisolecitina.

Otro aspecto interesante de la modificación enzimática fue la consistencia del producto. La muestra tratada con

10 Fosfolipasa nº2938 se volvió muy sólida, mientras que las muestras tratadas con la lípido aciltransferasa nº 138 mantuvo la misma consistencia que la muestra de control (véase la Figura 61).

Estas yemas de huevo modificadas fueron evaluada en una receta de Emulsión Alimentaria como la mostrada en la Tabla 23.

Tabla 23. Mayonesa con yema de huevo modificada con enzima.

0: 1a 2a 3a 4a

%
%
%
%
%

Aceite de colza: 60 60 60 60 60

Yema de huevo, Sanofo producto nº 1123P2: 2,8

Yema de huevo modificada enz. nº1: 2,8

Yema de huevo modificada enz. nº 2: 2,8

Yema de huevo modificada enz. nº 3: 2,8

Yema de huevo de control (no tratada) nº 4: 2,8

Agua: 39 36,2 36,2 36,2 36,2

Vinagre, 10% de ácido acético: 1 1 1 1 1

Las yemas de huevo modificadas 1 y 2 fueron tratadas con la lípido acil transferasa; y la yema de huevo modificada 3 fue tratada con la fosfolipasa disponible comercialmente.

La emulsión alimentaria se produjo como una emulsión de aceite en agua según el siguiente procedimiento: Se escaló yema de huevo en un vaso de precipitados. El aceite se escaló por separado.

Se sumergió una mezcladora Turrax (20000 rpm) en la fase acuosa. Se bombeó el aceite a la fase acuosa con una velocidad constante a lo largo de 2 minutos. Se continuó con la mezcla durante otro minuto adicional. A continuación se añadió el vinagre y se mezcló durante 5 segundos.

Se evaluó la estabilidad de la emulsión en una cabina de calefacción a 100 ºC. Después de 2 horas a 100 ºC se evaluó la emulsión (véase la Figura 62).

En este experimento la estabilidad de la emulsión de yema de huevo no tratada fue bastante buena. Sin embargo, el tratamiento de yema de huevo con la lípido aciltransferasa nº138 mejoró la estabilidad, ya que se redujo el nivel de separación de agua. La yema de huevo tratada con fosfolipasa nº2938 proporcionó una emulsión inestable con una separación casi completa de las fases de aceite y agua a 100 °C.

Se considera que en algunas aplicaciones el uso de las composiciones y métodos de la descripción puede proporcionar una estabilidad térmica mejorada en las emulsiones, tal como en aliños de ensalada de aceite en agua, y otros similares. Esto es particularmente importante en emulsiones alimentarias que son pasteurizadas para asegurar un mayor fecha de caducidad, y/o que son calentadas antes de servirse, por ejemplo en comidas prepreparadas para recalentar antes de servir (por ejemplo, alimentos para microondas). Aunque sin pretender establecer ninguna teoría particular, se considera que en algunas aplicaciones la acumulación de ácidos grasos libres puede ser negativa para la estabilidad térmica de dichas emulsiones. Cabe reconocer que puede que no se dé, o incluso que no sea deseable, una estabilidad térmica mejorada de las emulsiones alimentarias producidas usando los métodos de la descripción para todas las aplicaciones para alimentos. Será evidente para el especialista en la técnica en qué aplicaciones son deseables dichas características, y se puede determinar fácilmente la estabilidad de las emulsiones usando un ensayo de calefacción sencillo, por ejemplo, equivalente a la pasteurización y/o al calentamiento con microondas. Los inventores han descubierto que en una realización preferida las emulsiones alimentarias obtenidas mediante el uso de las enzimas de la descripción presentan una estabilidad térmica mejorada.

EJEMPLO 14: Reacción de transferasa en yema de huevo enriquecida con esteroles vegetales:

La transferasa procedente de Aeromonas salmonicida fue capaz de catalizar la formación de lisolecitina, monoglicéridos y ésteres de esterol vegetal en yema de huevo enriquecida con esteroles vegetales y glicerol. También se evaluó la misma enzima en un sistema de bajo contenido en agua que contiene aceite de palma, lecitina, esteroles vegetales y glicerol. Mediante el uso de análisis de TLC y GLC se demostró que se producen monoglicéridos y ésteres de esterol vegetal en las condiciones de reacción utilizadas.

Introducción:

La transferasa procedente de Aeromonas salmonicida se evaluó para determinar la actividad de transferasa en un sistema casi libre de agua basado en lecitina, grasa, esteroles vegetales y glicerol.

Materiales:

Yema de huevo: Yema de huevo líquida pasteurizada de Danæg Products A/S, Dinamarca -4000 Roskilde Purificación de transferasa GCAT 178-9, 32 PLU-7/mL (Journal 2254-100)

Lecitina de soja. Yolkin de Aarhus United, Dinamarca.

Aceite de palma 43, de Aarhus United, Dinamarca.

L-α fosfatidilcolina al 95% Vegetal (Avanti nº441601)

Sitoesterol, Sigma nº S5753

Esterol vegetal: Generol N122 de Cognis, Alemania

Glicerol nº de cat. 085915

Resultados

El escrutinio inicial de la actividad de transferasa sobre esteroles vegetales y glicerol se llevó a cabo con yema de huevo, como se muestra en la Tabla 24.

Tabla 24

1: 2 3 4

Yema de huevo: Gramos 1 1 1 1

Glicerol: Gramos 0,1 0, 1

Sitoesterol:aceite 3:7: Gramos 0,13 0,13

Transferasa nº178-9: Unidades 1

Agua: * *

*Agua correspondiente a la cantidad de agua en la disolución enzimática = 83 μLLos ingredientes se mezclaron y se calentaron a 37 ºC y se mantuvieron a esta temperatura durante la agitación con un agitador magnético.

Se tomaron muestras de 0,1 gramos después de 3 y 23 horas y se analizaron mediante TLC.

5 Los resultados del análisis de TLC se muestran en la Figura 63.

El resultado de la Figura 63 indicó que tanto el colesterol como los esteroles vegetales son esterificados por la reacción de transferasa, simultánea a la formación de lisolecitina (muestras 3 y 4), ya que casi todo el esterol y el colesterol libres fueron convertidos a los correspondientes ésteres en la muestra 3.

Los resultados también indicaron que la muestra solo de glicerol y yema de huevo produjo monoglicéridos. Es

10 necesario confirmar la cantidad de monoglicéridos mediante análisis de GLC. Cuando se añadió el esterol junto con el glicerol (muestra 3), la cantidad de monoglicéridos resultó muy baja y no detectable mediante TLC. Esto indicó que mientras haya un exceso de esterol o de colesterol la reacción de transferasa que usa glicerol es modesta.

En otro experimento se añadió la enzima de transferasa 178-9 a una mezcla de lecitina de soja, glicerol y esterol vegetal, con el objetivo de estudiar la actividad catalítica de la enzima en esta mezcla de reacción.

15 En la Tabla 25 se muestra la composición de las mezclas de reacción en estos experimentos.

Tabla 25

1: 2 3 4 5 6

Lecitina de soja: gramos 1,875 2,25 1,875 2,5 3,5 3,5

Esterol vegetal; Generol N 122: gramos 0,225 0,225 0 0 0,225 0,5

Aceite de palma 43: gramos 2,675 2,25 2,8 2,125 1,062 0,831

Glicerol: gramos 0,225 0,275 0,325 0,375 0,248 0,238

Transferasa nº178 -9, 32 PLU/mL: mL 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

El experimento se llevó a cabo mezclando los componentes lipídicos con agitación a 46 °C. Se añadió la enzima y se tomaron muestras después de 4 y 24 horas.

20 Las muestras fueron analizadas mediante TLC, tal como se muestra en la Figura 64.

La muestras de los experimentos 2, 4 y 5 después de un tiempo de reacción de 24 horas también fueron analizadas mediante GLC, dando lugar a los resultados mostrados en la Tabla 26.

Tabla 26.

2: 4 5

Glicerol: % 3,16 5,71 4,17

Ácidos grasos: % 4,23 5,36 6,67

Mono: % 2,24 3,87 3,92

Esterol: % 2,13 2,62

Éster de esterol: % 2,89 2,14

Los resultados confirmaron que la transferasa 178-9 es capaz de catalizar la formación de ésteres de esterol vegetal y monoglicéridos a partir de una mezcla de reacción que contiene lecitina de soja, glicerol y esteroles vegetales. 5 Dicha mezcla de reacción podría ser de interés para uso en la producción de margarinas, donde se requieren monoglicéridos para las propiedades de emulsión y ésteres de esterol por su efecto reductor de colesterol.

Conclusión

La transferasa CGAT de Aeromonas salmonicida fue capaz de catalizar la formación de ésteres de esterol vegetal y monoglicéridos en yema de huevo a la que se habían añadido esteroles vegetales y glicerol. La misma enzima

10 también catalizó la formación de ésteres de esterol vegetal y monoglicéridos en una mezcla de aceite de palma, lecitina, esterol vegetal y glicerol. Por lo tanto, esta enzima presenta interés para su utilización en margarinas y otros productos alimentarios que contengan aceite, en los que sean necesaria la presencia de monoglicéridos y lisolecitina, para mejorar las propiedades de emulsión, y de ésteres de esterol vegetal por sus efectos reductores de colesterol.

15 EJEMPLO 15: Inmovilización de una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida y el uso en la síntesis de Ésteres de esterol.

Se inmovilizó una lípido aciltransferasa (en este caso una GCAT) procedente de A. salmonicida sobre Celite mediante precipitación en acetona. Se agitaron lentamente 10 mL de disolución de la enzima en tampón TEA 20 mM, pH 7, con 0,1 gramos de Celite 535 535 (de Fluka) durante 2 horas a temperatura ambiente.

20 Se añadieron 50 mL de acetona fría con continua agitación.

Se aisló el precipitado mediante centrifugación a 5000 g durante 1 minuto.

Se lavó el precipitado 2 veces con 20 mL de acetona fría.

Se secó el Celite a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora.

La transferasa inmovilizada fue evaluada en una mezcla de aceite que contiene un 13 % de Fosfatidilcolina y un 7% 25 de esteroles vegetales (Tabla 27).

Tabla 27 La lecitina, el esterol vegetal y el aceite de soja se calentaron a 46 ºC y el esterol vegetal se disolvió. Se añadió la transferasa inmovilizada.

%

Lecitina Avanti: 12,0

Esterol vegetal, Generol 122N: 6,6

Palma 43: 71,4

Glicerol: 5,0

Transferasa nº178 inmovilizada, 45 U/g: 2,0

Agua: 3,0

La reacción de transferasa continuó a 46 ºC con una agitación suave mediante el uso de un agitador magnético. Se 5 tomaron muestras para análisis después de ½, 1, 3, 6 y 24 horas y se analizaron mediante TLC. La reacción se detuvo después de 24 horas de tiempo de reacción y la enzima inmovilizada se retiró mediante filtración.

Las muestras fueron analizadas mediante TLC, tal como se muestra en la Figura 65.

El análisis de TLC muestra claramente el efecto de la transferasa inmovilizada procedente de A. salmonicida en la transformación de colesterol en éster de colesterol. También se observó que se había formado una pequeña

10 cantidad de monoglicéridos. También se ha demostrado que la enzima presenta una alta actividad en medios con un elevado contenido en agua (6-89 %), por lo tanto, el uso de la transferasa, y otras transferasas para uso en la descripción, puede utilizarse en aplicaciones de enzimas inmovilizadas con un contenido en agua significativo. Esto permite la sustitución de los disolventes usados por las actuales lipasas inmovilizadas para la bioconversión de lípidos usando transferasas.

15 EJEMPLO 16: La transferasa de Aeromonas hydrophilia puede transferir desde un fosfolípido hasta un esterol para formar un éster de esterol, y/o una molécula de azúcar para formar un éster de azúcar.

Se purificó una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila expresada en E. coli (Hydro 0303 HVP), marcada como nº139, en una columna de Sepharose FF quelante HR 2,5/10, y se analizó para determinar la actividad de fosfolipasa. La actividad de transferasa se evaluó en yema de huevo para determinar la actividad enzimática y la

20 funcionalidad en yema de huevo. También se evaluó la enzima en yema de huevo que contiene glucosa.

Actividad de fosfolipasa.

Se evaluó la transferasa nº139 aislada en una columna de Sepharose FF quelante HR 2,5/10 mediante NEFA-PLU (pH7). La actividad fue de 1,15 unidades NEFA-PLU/mL.

Yema de huevo

25 En un ensayo de aplicación inicial se evaluó la transferasa nº 139 con yema de huevo de acuerdo con el siguiente procedimiento.

Se escaló 1 gramo de yema de huevo fresca en un matraz de 10 mL con tapón enroscado. Se añadió la preparación enzimática y se mezcló en un mezclador Vortex. La muestra se colocó a 37 ºC y se agitó con un agitador magnético.

La reacción se detuvo añadiendo 7,5 mL de Cloroformo:Metanol (2:1) y se mezcló en un mezclador Whirley durante

30 30 segundos. La fase de cloroformo se aisló mediante centrifugación y se transfirieron 2 μL de la fase de cloroformo a una placa de TLC de sílice pre-activada y se eluyó con disolvente de desarrollo nº I, y otra placa de TLC en disolvente de desarrollo IV.

El conjunto de experimentos se muestra en la Tabla 28.

Tabla 28 Los análisis de TLC en la Figura 66 y en la Figura 67. El ensayo de TLC demuestra claramente la reacción de transferasa de la transferasa nº139. El colesterol se convierte en ésteres de colesterol y la cantidad de lecitina se ve reducida. Sin embargo, los resultados también indican que la lisolecitina solo se acumula en una cantidad muy pequeña debido a que la transferasa nº139 también es activa sobre la lisolecitina. Esta observación se ve apoyada

Ensayo: Tiempo de reacción Yema de huevo Transferasa nº139

Nº: min. gramos unidades

1: 10
1

2: 10 1 0,75 de NEFA-PLU

3: 60 1 0,75 de NEFA-PLU

4: 300 1 0,75 de NEFA-PLU

5: 1200 1

1200: 1 0,75 de NEFA-PLU

5 por la formación de ácidos grasos libres (FFA).

Yema de huevo y glucosa

Anteriormente se ha demostrado que la transferasa procedente de Aeromonas salmonicida (nº138) es capaz de usar glucosa como molécula aceptora en una reacción de transferasa. También se ha evaluado si la transferasa nº139 puede usar glucosa como molécula aceptora. El conjunto de experimentos se muestra en la Tabla 29.

10 Tabla 29

Ensayo: Tiempo de reacción Yema de huevo Glucosa, 70% Transferasa nº139

Nº: Minutos gramos mg unidades

1: 10 1 500

2: 10 1 500 1 NEFA-PLU

3: 60 1 500 1 NEFA-PLU

4: 180 1 500 1 NEFA-PLU

5: 300 1 500 1 NEFA-PLU

6: 1200 1 500 1 NEFA-PLU

7: 1200 1 500

Los productos de reacción fueron analizados mediante TLC (Figura 68 y Figura 69).

El análisis de TLC indica la formación de éster de glucosa después de 220 minutos de tiempo de reacción (Figura 69, banda 6), pero después de 1200 minutos de tiempo de reacción no se observa éster de glucosa.

15 Por lo tanto, debe concluirse que la transferasa nº139 presenta tanto actividad de transferasa como actividad hidrolítica. Esto también se ve apoyado por el hecho de que la cantidad de ácidos grasos libres aumenta de forma sostenida con el tiempo de reacción.

Resumen:

Se evaluó la transferasa procedente de Aeromonas hydrophila en yema de huevo. Los resultados confirman que

20 esta enzima cataliza la formación de ésteres de colesterol simultánea a la formación de lisolecitina. Tras un tiempo de reacción extendido, cuando la mayoría del colesterol ya se ha consumido, también se forman ácidos grasos libres. Por lo tanto, se puede concluir que la enzima tiene principalmente actividad de transferasa pero también se observa actividad hidrolítica cuando sólo se dispone de agua como molécula dadora.

En un experimento con yema de huevo y glucosa se ha observado que la transferasa de Aeromonas hydrophila es

25 capaz de catalizar la formación de éster de glucosa in situ en un medio alimentario de alto contenido en agua (Figura 70).

EJEMPLO 17: Variantes de una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (Ahyd2) (SEQ ID No. 36 (véase la Figura 71))

Se introdujeron mutaciones usando el kit QuikChange® Multi-Site Directed Mutagenesis de Stratagene, La Jolla, CA 30 92037, EE.UU., siguiendo las instrucciones proporcionadas por Stratagene.

Las variantes de Tyr256 mostraron un aumento de actividad hacia fosfolípidos.

Las variantes de Tyr256 y Tyr260 mostraron un aumento de actividad hacia galactolípidos.

Las variantes de Tyr265 muestran un aumento de la actividad de transferasa con galactolípidos como dador de acilo.

Los números indican posiciones en la siguiente secuencia: Una enzima de Aeromonas hydrophila cuya secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID No. 36 en la Figura 71 (los aminoácidos subrayados muestran un péptido señal de xilanasa). La secuencia de nucleótidos también se muestra como SEQ ID No. 54 en la Figura 72.

EJEMPLO 18: Uso de reacción de acil-transferasa para la producción de ésteres de esterol vegetal y monoglicéridos para la producción de margarina.

Se evaluó una aciltransferasa de Aeromonas salmonicida expresada en Bacillus subtilis en una mezcla de aceite de palma que contiene lecitina vegetal, esterol vegetal y glicerol. La acil-transferasa demostró la capacidad para utilizar esterol vegetal y glicerol como moléculas aceptoras durante la producción de ésteres de esterol vegetal y monoglicéridos. La mezcla de reacción se usó para producir margarina de mesa de buena calidad en base a los monoglicéridos de la mezcla de reacción y al mismo tiempo se enriqueció la margarina con ésteres de esterol vegetal, que ha demostrado tener un efector reductor de colesterol.

El objetivo de este trabajo fue estudiar la posibilidad de producir monoglicéridos y ésteres de esterol vegetales

mediante reacción enzimática de lecitina, esterol vegetal y glicerol disueltos en grasa vegetal. Los experimentos iniciales han demostrado que fue posible usar acil-transferasa de Aeromonas salmonicida para producir monoglicéridos y ésteres de esterol vegetal a partir de lecitina, glicerol y esterol vegetal.

En este experimento, se usó dicha mezcla de reacción para producir margarina de mesa. Materiales: Lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida, nº 196 C101, 18,6 PLU/g (Journal 2254-104) Aceite de palma 43, de Aarhus United, Dinamarca. L-α fosfatidilcolina al 95% Vegetal (Avanti nº441601) Esterol vegetal: Generol N122 de Cognis, Alemania Glicerol nº de cat. 085915 Monoglicéridos destilados, Dimodan HP de Danisco. Producción de margarina.

1.: Mezclar los ingredientes de la fase acuosa. (Si se requiere, pasteurizar la fase acuosa mediante calefacción a aproximadamente 80°C). Ajustar el pH a 5,5.

2.: Fundir la fase grasa, y templar a aproximadamente 40-45°C.

3.: Calentar el emulsionante con algo del aceite en una relación de 1 parte de emulsionante por 5 partes de aceite a una temperatura (75-80°), que es 5-10°C superior al punto de

fusión del emulsionante. Cuando la mezcla esté completamente fundida y bien agitada, añadirla al resto del aceite calentado, agitando continuamente.

4.: Añadir el aromatizante.

5.: Añadir la fase acuosa a la fase grasa, agitando continuamente.

6.: Enfriar en un refrigerado tubular (capacidad normal, enfriamiento normal) hasta una temperatura de salida de 810°C.

Resultados

Se evaluó la aciltransferasa de A. salmonicida en una mezcla de aceite de palma como se muestra en la Tabla 30. Se calentó lecitina, esterol vegetal, glicerol y aceite de palma a 60°C durante la agitación con el objetivo de solubilizar el esterol vegetal y la lecitina.

Tabla 30

Sustrato:: %

Lecitina Avanti: 12

Esterol vegetal, Generol 122N: 6,6

Aceite de palma, punto de fusión 43: 76,4

Glicerol: 5

El sustrato se enfrió hasta 48 °C y se añadió acil-transferasa nº196 en las cantidades mostradas en la Tabla 31. La mezcla de reacción se mantuvo a 48 °C durante 24 horas con agitación lenta.

Tabla 31

gramos

Sustrato: 220

Transferasa nº 196 C101, 18,6 PLU/g: 15

Se tomaron muestras de la mezcla de reacción después de 1, 4 y 24 horas de tiempo de reacción, y se analizaron mediante TLC en disolvente (Figura 73). Los resultados de TLC muestran claramente la formación de ésteres de esterol y de monoglicéridos. En la Figura 73, la primera banda corresponde a 1 hora de tiempo de reacción, la banda 2 corresponde a 4 horas de reacción, la banda 3 corresponde a 24 horas de reacción y la banda 4 corresponde a un

10 esterol vegetal.

Se detuvo la reacción tras 24 horas de tiempo de reacción y se eliminaron los residuos de esterol vegetal no disuelto, y la disolución transparente se usó para producir margarina.

Margarina.

La mezcla de reacción que contiene monoglicéridos y ésteres de esterol vegetales se usó para producir margarina 15 de mesa según la receta mostrada en la Tabla 32.

Tabla 32 Se evaluó la calidad como comida y la facilidad para untar de la margarina producida a partir de la mezcla de reacción, y se obtuvo una buena sensación en la boca sin ningún sabor negativo. Se comparó la margarina con la margarina de referencia producida usando monoglicéridos destilados de Dimodan HP, dando un nivel de calidad

Jour. Nº 3734: 1 2

Fase de agua

Fase de agua: 16 16

Sal: 0,5 0,5

Polvo de leche desnatada: 1 1

Sorbato de potasio: 0,1 0, 1

EDTA: 0,015 0,015

pH: 5,5 5,5

Fase acuosa total: 16,6 16,6

Jour. Nº 3734: 1 2

Fase grasa

Palma 43: 25 25

Aceite de colza: 75 75

Fase grasa total: 83,2 78,4

Dimodan HP: 0,2

Mezcla de reacción: 5

5 similar.

La única diferencia observada fue que la margarina jour. 3734 nº 2 con respecto a la mezcla de reacción fue ligeramente más firme, lo que se explica por el hecho de que la receta contenía más Palma 43 que la margarina de referencia.

EJEMPLO 19: Uso de una lípido aciltransferasa durante la producción de pan.

10 Una de las limitaciones de usar lipasas en la fabricación de pan es que se forman ácidos grasos libres durante la reacción de lipasa. Es bien conocido que la formación de demasiados ácidos grasos libres tiene un impacto negativo sobre la cocción de la harina, ya que el gluten se vuelve demasiado rígido y se forma una masa dura (es decir, menos elástica) que no se puede expandir durante la fermentación y el horneado.

Debería evitarse la formación de ácidos grasos libres desde el punto de vista de la estabilidad frente a la oxidación,

15 debido a que los ácidos grasos libres son más propensos a la oxidación de lípidos que los correspondientes triglicéridos.

En la presente descripción, los problemas de formación de ácidos grasos libres al añadir una enzima lipolítica a una masa se han solucionado usando una lípido aciltransferasa que, en lugar de producir ácidos grasos libres, transfiere uno o más ácidos grasos desde el lípido dador de acilo a una molécula aceptora que no es agua presente en la

20 masa, tal como un carbohidrato, una proteína o un péptido, o si se usa en pan con grasa láctea, se puede añadir a la masa un esterol, alternativamente o en combinación con otros aceptores enumerados anteriormente, por ejemplo fitoesteroles o fitoestanoles. Preferiblemente, la molécula aceptora en una masa puede ser uno o más de glucosa, sacarosa o maltosa y/u otros carbohidratos disponibles normalmente en una masa.

En los siguientes experimentos se evaluó la acil transferasa en experimentos de horneado a mini escala. La

25 formación de productos de reacción, y los componentes lipídicos en una masa completamente probada, es extraída con butanol saturado en agua y se analiza mediante análisis de HPLC y GLC.

Materiales y métodos

Enzimas:

Acil Transferasa, 550 PLU-7/mL

30 Lipopan™ F BG, una lipasa comercial de Novozymes, 12000 LIPU/g o Grindamyl Exel 16, 12000 LIPU/g

Polvo de lecitina, 95% de fosfolípido (disponible en Danisco A/S Dinamarca). Digalactosildiglicérido de harina de trigo entera (de Sigma D4651)

Harina: Solvmel nº 2001084 (harina de trigo danesa, obtenida de Havnemøllerne, Odense, Dinamarca) Ensayo de mini horneado.

Se amasa harina, 50 gramos, levadura seca, 10 gramos, glucosa, 0,8 gramos, sal, 0,8 gramos, 70 ppm de ácido ascórbico y agua, 400 unidades Brabender, en un recipiente de mezcla Brabender de 50 g durante 5 minutos a 30ºC.

El tiempo de reposo fue de 10 minutos a 34 °C. La masa se escaló a 15 gramos por masa. A continuación se moldeó en un dispositivo especial en el que la masa es enrollada entre una placa de madera y un marco de plexiglás. Las masas fueron examinadas en bandejas durante 45 minutos a 34 °C, y se hornearon en un horno doméstico Voss durante 8 minutos a 225 ºC.

Tras el horneado, los panes se enfriaron hasta temperatura ambiente y después de 20 minutos los panes fueron escalados y se determina el volumen mediante el método de desplazamiento de semilla de colza. Los panes también son cortados y se evalúa la miga y la corteza.

Resultados y conclusión:

Los resultados preliminares indican que la lípido aciltransferasa claramente presenta un efecto positivo sobre el volumen del pan y sobre la apariencia del pan. En particular, los resultados preliminares indican que el uso de la lípido aciltransferasa da como resultado un aumento del volumen específico del pan en comparación con el obtenido con el control (sin enzima) y con el obtenido usando una enzima lipolítica disponible comercialmente, a saber Grindamyl Exel 16 ó Lipopan F™.

EJEMPLO 20: Helado estándar con grasa láctea

La función de los emulsionantes usados en el helado es la de producir una cristalización controlada y una desestabilización moderada de la grasa debido a la desorción de proteínas durante el envejecimiento del helado. Este cambio mejora la calidad del helado. Normalmente se usan mono-diglicéridos para la producción de helado, pero también es conocido el uso de emulsionantes polares como polisorbato y ésteres de azúcar en la producción de helado en combinación con mono-diglicéridos para facilitar una desestabilización controlada de la grasa y producir un helado con una muy buena textura cremosa y suave al comer.

Los emulsionantes usados para helados normalmente se añaden a la mezcla de helado en forma de polvo. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que los mono-diglicéridos se pueden producir mediante reacción enzimática de la grasa de la receta del helado usando lipasas. El problema de usar lipasas, sin embargo, es que las lipasas también catalizan la formación de ácidos grasos libres, cuando hay agua disponible en la mezcla de reacción.

Sin embargo, sorprendentemente se ha demostrado que las lípido acil-transferasas superan la limitación de las lipasas debido a que las acil-transferasas son capaces de transferir ácidos grasos desde la lecitina y otros lípidos a moléculas aceptoras como el esterol, el colesterol, la glucosa, el glicerol y proteínas/péptidos, sin la formación de cantidades significativas de ácidos grasos libres.

Uno de los principales ingredientes del helado es la nata láctea que contiene un 38 % de grasa láctea. La nata láctea contiene una menor cantidad de lecitina, que es una molécula dadora para la acil-transferasa. ("Complex milk lipids account for about 1 % of the total milk fat and are mainly composed of phospholipids". Ref. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright © 2003 por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.). La nata láctea también contiene una cantidad pequeña de colesterol, que es una molécula aceptora para la acil-transferasa.

A partir de los constituyentes del helado, por tanto, es posible producir tanto monoglicéridos como emulsionantes polares del tipo liso-lecitina y ésteres de azúcar, los cuales son conocidos por presentar efectos beneficiosos en la producción de helado.

Un efecto beneficioso adicional de la reacción de la acil-transferasa en nata láctea es la formación de ésteres de colesterol, que podrían frenar la absorción de colesterol en el intestino.

Receta de helado

Con emulsionante: Con enzima

Nata láctea, 38%: 23,65 23,65

Leche desnatada: 53,30 53,30

Polvo de leche desnatada: 4,90 11,30

Azúcar: 12,00 12,00

Jarabe de glucosa, DE 42, 75% TS: 4,25 4,25

Glicerol: 1,0 1,0

Mezcla estabilizadora: 0,2 0,2

Cremodan SE 30: 0,6

Lípido acil transferasa, 500 PLU/g: 0,1

Aromatizante Grindsted 2976: 0,1 0,1

Color: + +

Proceso de producción de helado

1. Calentar la nata láctea, el jarabe de glucosa y el glicerol hasta aproximadamente 40 ºC. Añadir la lípido 5 aciltransferasa y dejar que la mezcla reaccione durante 30 minutos. Se toma una muestra para análisis.

2.: Calentar todos los demás ingredientes a aproximadamente 40 ºC.

3.: Añadir los otros ingredientes secos. (la mezcla estabilizadora se mezcla con el azúcar antes de la adición)

4.: Cuando los ingredientes secos se hayan disuelto, añadir la mezcla de nata láctea-glucosa.

5.: Pasteurizar a 80 -85 ºC/20-40 segundos

10 6. Homogeneizar a 80°C (190 bar para la receta 1 y 175 bar para la receta 2)

7.: Enfriar hasta temperatura de envejecimiento, 4 °C

8.: Congelar en un congelador continuo hasta el exceso deseado (recomendado 100%)

9.: Endurecer en túnel a -40 °C

10.: Almacenar por debajo de -25 °C

15 Resultados:

Los usos de acil-transferasa en la producción de helado contribuyen a la producción de helado con muy buen sabor y una sensación en la boca excelentemente cremosa, comparable al helado producido usando un emulsionante comercial como el Cremodan SE 30. También se mejora la fusión del helado producido con la lípido acil transferasa.

EJEMPLO 21: Acil transferasa en el queso.

20 El queso es el producto sólido o semisólido fresco o madura obtenido coagulando leche, leche desnatada, leche semidesnatada, nata, nata de suero o grasa butírica, o cualquier combinación de dichas materias, a través de la acción de cuajo u otros agentes coagulantes adecuados, y drenando parcialmente el suero que se produce en dicha coagulación.

El rendimiento de queso depende principalmente del contenido de grasa y proteínas de la leche. La concentración 25 de sal (particularmente las sales de calcio) y proteínas, así como la acidez, son muy importantes para la coagulación. (ref. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright © 2003 de Wiley-VCH Verlag GmbH & Co).

Dicho esfuerzo se ha realizado con el objetivo de optimizar y aumentar el rendimiento a queso mediante optimización del procedimiento de fabricación de queso (Patente de EE.UU. nº 4.959.229) o usando un método de coagulación mejorado (Patente de EE.UU. nº 4.581.240), que aumenta la cantidad de proteína de suero en la cuajada.

En la presente descripción se incrementa la cantidad de proteína de suero en la cuajada a través de una modificación enzimática de la proteína de suero por tratamiento de la leche durante la fabricación del queso con una lípido acil transferasa.

Cuando un ácido graso está ligado covalentemente a una proteína que no es de membrana como la βlactoglobulina, las propiedades físicas y funcionales cambian drásticamente.

Para la producción de queso de la presente descripción se añade acil transferasa a la leche antes o al mismo tiempo que se añade el cuajo a la leche.

Durante la precipitación de la caseína, la acil transferasa es capaz de usar lecitina y otros lípidos de la leche como dadores y los péptidos o proteínas como moléculas aceptoras durante la formación de proteínas aciladas o péptidos acilados.

El cambio de las propiedades hidrofóbicas de las proteínas de la leche contribuye a aumentar la precipitación de proteínas y la cuajada durante la producción del queso.

Puesto que el incremento del rendimiento de queso de la presente descripción tiene su origen en un aumento de la retención de proteínas en el coágulo del queso, que normalmente se pierden con el suero, un método adecuado, relacionado directamente con el mecanismo de la descripción, se basa en la determinación de la cantidad de proteína que acaba en el suero. Menos proteína en el suero necesariamente significa más proteína en la cuajada, y un mayor rendimiento de queso.

El ensayo para determinar la cantidad de proteínas en el suero se puede llevar a cabo del siguiente modo. Se calienta leche desnatada o entera hasta una temperatura adecuada para la coagulación de cuajo, típicamente 30350 °C en un vaso de precipitados de 100 mL. Opcionalmente, se añade un 1% de iniciador de bacterias de ácido láctico en bruto, y se añade un cuajo estándar en una cantidad correspondiente a, por ejemplo, 0,03-0,05%. Cuando la leche se ha vuelto un coágulo suficientemente sólido para que pueda ser cortado en cubos con una longitud de lado de aproximadamente 0,5 cm, se lleva a cabo dicho corte con un cuchillo afilado. De este modo se inicia la sinéresis, y después de un periodo de espera de 30 minutos, que permite que la cuajada se asiente, se toma una muestra de suero y se centrifuga en una centrífuga de laboratorio durante 10 minutos. Dicha muestra se analiza para determinar el contenido de proteína, usando por ejemplo el método Kjeldahl. Alternativamente, y/o como un suplemento, la muestra se puede analizar con los métodos que permiten establecer el tipo y la cantidad de componentes proteicos individuales.

EJEMPLO 22: "Ensayo en Medio Bajo en Agua"

Reacciones de transferasa de enzimas lipolíticas en medio bajo en agua.

Procedimiento

Materiales.

Colesterol Sigma cat. C 8503

L-alfa-Fosfatidilcolina al 95% (Vegetal) Avanti nº441601

Aceite de soja, Aarhus United, Dinamarca.

Cloroformo, grado analítico

Enzimas.

Nº 179, GCAT de A. salmonicida

Nº 2427, Fosfolipasa A1 de Fusarium oxysporum. LIPOPAN® F de Novozymes, Dinamarca

Nº 1991, Fosfolipasa A2 de Páncreas, LIPOMOD 22L de Biocatalysts, R.U. nº 2373, lipasa de Candida Antarctica, Novozyme 525 L de Novozymes, Dinamarca.

Ensayo enzimático

Se disolvió un 13,1 % de lecitina y un 6,6 % de colesterol en aceite de soja calentando a 60 ºC durante agitación. El sustrato se escaló en un vaso Wheaton de 20 mL y se calentó a 46 ºC. Se añadió agua y disolución de enzima y se puso en marcha un reloj de parada. 5 A intervalos regulares se transfirieron muestras de 50 mg a un vaso Dram de 10 mL y se congelaron. Los lípidos aislados fueron analizados mediante GLC.

Análisis de GLC

El análisis de GLC se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 11. 10 Resultados El experimento se planificó como se muestra en la Tabla 33. El sustrato, basado en aceite de soja que contenía un 13,1 % de lecitina y un 6,6 % de colesterol, se calentó a 46°C. Se añadió la disolución de enzima y se puso en marcha un reloj de parada. Se tomaron muestras después de 30, 60 y 120 minutos de tiempo de reacción para análisis de GLC. 15 Tabla 33

1: 2 3 4 5

Sustrato: gramos 5 5 5 5 5

Transferasa nº179-C72, 56 PLU-7/mL: mL 0,3

Nº 2427, 200 PLU-7/mL: mL 0,3

PLA 2 de páncreas nº1991 6300 PLU/mL: mL 0,3

Novozyme 525 L, nº2373, 200 LIPU/mL: mL 0,3

Agua: mL 0,3

% de agua: 6 6 6 6 6

Los resultados del análisis de GLC se muestran en la Tabla 34. Los resultados se expresan como porcentaje en base al total de la muestra. En base a los resultados de GLC fue posible calcular la cantidad de ácidos grasos y ésteres de colesterol producidos por la reacción enzimática respecto a la muestra de control a la que no se había

20 añadido enzima. En las condiciones experimentales se estimó la actividad enzimática total como la actividad hidrolítica medida como la formación de ácidos grasos libres y la actividad de transferasa estimada como la formación de ésteres de colesterol. A partir de estos resultados y de la información relativa al peso molecular de los ácidos grasos y los ésteres de colesterol, fue posible calcular la actividad hidrolítica molar relativa y la actividad de transferasa molar relativa, tal como se muestra en la Tabla 35.

Tabla 34

Enzima: Tiempo de minutos reacción, % degrasos ácidos % de colesterol % de ésteres de colesterol

Control: 120 0,533 7,094 0,000

Nº 179: 30 0,770 5,761 2,229

Nº 179: 60 0,852 5,369 2,883

Nº 179: 120 0,876 4,900 3,667

Nº 2427: 30 3,269 7,094 0,000

Nº 2427: 60 3,420 7,094 0,000

Nº 2427: 120 3,710 7,094 0,000

Nº 1991: 30 2,871 7,094 0,000

Nº 1991: 60 3,578 7,094 0,000

Nº 1991: 120 3,928 7,094 0,000

Nº 2373: 30 1,418 7,094 0,000

Nº 2373: 60 1,421 7,094 0,000

Nº 2373: 120 1,915 7,094 0,000

Tabla 35 5

Enzima: Tiempo reacción, minutos de Ácidos grasos producidos Colesterol usado Ésteres de colesterol producidos %actividad hidrolítica de % de actividad de transferasa

Nº 179: 30 0,238 1,334 2,229 20 80

Nº 179: 60 0,319 1,725 2,883 21 79

Nº 179: 120 0,343 2,195 3,667 18 82

Nº 2427: 30 2,737 0,000 0,000 100 0

Nº 2427: 60 2,887 0,000 0,000 100 0

Nº 2427: 120 3,177 0,000 0,000 100 0

Nº 1991: 30 2,338 0,000 0,000 100 0

Nº 1991: 60 3,046 0,000 0,000 100 0

Nº 1991: 120 3,395 0,000 0,000 100 0

Nº 2373: 30 0,885 0,000 0,000 100 0

Enzima: Tiempo reacción, minutos de Ácidos grasos producidos Colesterol usado Ésteres de colesterol producidos % de actividad hidrolítica % de actividad de transferasa

Nº 2373: 60 0,888 0,000 0,000 100 0

Nº 2373: 120 1,383 0,000 0,000 100 0

Conclusión

En estos experimentos se observó que todas las enzimas evaluadas mostraron actividad hidrolítica ya que la cantidad de ácidos grasos aumentó. Sin embargo, la única enzima que mostró actividad de transferasa fue la GCAT de A. salmonicida. Por lo tanto, se concluye que un sistema oleaginoso con lecitina y colesterol que contiene un 6% de agua, la fosfolipasa A1 de Fusarium oxysporum , la fosfolipasa A2 de páncreas y la lipasa de Candida antarctica solo mostraron actividad hidrolítica.

Ejemplo 23 - Tratamiento de grasa butírica

Se expresó la lípido acil transferasa procedente de Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 90, variante N80D) en Bacillus licheniformis (denominado a partir de este punto KLM3 (ver más adelante).

Se evaluó la lípido acil transferasa en grasa butírica con el objetivo de investigar la reacción de transferencia cuando se añade un 0,5% de glicerol y un 1% de fosfolípido a la grasa butírica.

Los productos de reacción fueron analizados mediante TLC y los resultados mostraron claramente la formación de monoglicéridos que confirman que la lípido acil transferasa utiliza el glicerol como molécula aceptora.

Procedimiento experimental

Enzimas:

Lípido acil transferasa (LAT) expresada en B. licheniformis: 2005876 (5500 TIPU/mL) Lipomod 699L, fosfolipasa pancreática de Biocatalysts. 10000 U/mL Grasa butírica: Grasa butírica anhidra A0019659 lote 0130547 de Croman, Bélgica. Glicerol: Lecitina: Fosfatidilcolina al 95% Vegetal (Avanti nº 441601), HPTLC Aplicador: LINOMAT 5, aplicador CAMAG. Placa de HPTLC: 10 x10 cm (Merck nº 1.05633) La placa se activó antes de ser usada mediante secado en un horno a 160ºC durante 20-30 minutos. Aplicación: 1,0

μL de una disolución al 15,0% de materia butírica reaccionada disuelta en Cloroformo:Metanol (2:1) se aplicaron a la placa de HPTLC usando un aplicador LINOMAT 5. Tampón de elución: 1: P-éter:MTBE:Ácido acético (60:40:1) Tiempo de aplicación/elución: 14 minutos. Tampón de elución:5 P-éter:MTBE:Ácido acético (70:30:1) Tiempo de aplicación/elución: 12 minutos. Tampón de elución:4 Cloroformo:Metanol:Agua (75:25:4) Tiempo de aplicación/elución: 20 minutos.

Fluido de desarrollo: 6% de cupriacetato en H3PO4 al 16% Tras elución, la placa fue secada en un horno a 160ºC durante 5 minutos, se enfrió y se sumergió en el fluido de desarrollo, y a continuación se secó por otros 5 minutos más a 160°C. La placa fue evaluada visualmente y se escaneó (escáner de TLC Camag).

Resultados

Las muestras de grasa butírica, glicerol, lecitina y enzima fueron escaladas en un vaso Wheaton de 20 mL Como se describe en la Tabla 36 Tabla 36.

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Grasa butírica Croman: g 10 10 10 10 10 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9

lecitina,: g 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

LAT, 500: mg 20 100 20 100

Lipopmod 699L 1000: mg 20 100 20 100

Glicerol: mg 50 30 30 50 30 30

Unidades/g: 0 1 5 2 10 1 1 5 2 10

5 * LAT 2005876 (5000 TIPU/mL) disuelto en glicerol:enzima 9:1

** Lipomod 699L (nº 3332) disuelto en glicerol:enzima 9:1Las muestras se colocaron en un bloque de calefacción a 50 ºC durante 4 horas y a continuación se tomaron muestras para análisis y se disolvieron en cloroformo : metanol

2:1. Las muestras fueron analizadas mediante TLC en el tampón de elución 5, 1 y 4, como se muestra en la Figura 104. 10 La placa de TLC mostrada en la Figura 105 fue escaneada con un escáner densiométrico Camag, y en base a la

cantidad de monoglicéridos de la muestra de referencia de mono-glicérido se calcula la cantidad de monoglicéridos en la grasa butírica, tal como se muestra en la Tabla 37. Tabla 37. Monoglicéridos en las muestras de grasa butírica calculados mediante densiometría.

Muestra

Jour. 2390-67: % de monoglicéridos

1: 0,005

2: 0,005

3: 0,009

4: 0,005

5: 0,005

6: 0,004

7: 0,423

8: 0,449

9: 0,004

10: 0,004

medida de la placa de TLC.

Conclusión

Los resultados de TLC del tratamiento enzimático de aceite de mantequilla que contiene glicerol/fosfolípidos con lípido aciltransferasa confirman la capacidad de la enzima para convertir colesterol en ésteres de colesterol y glicerol en monoglicéridos usando fosfolípidos como dador de acilo.

En el experimento llevado a cabo se demostró que todos los fosfolípidos, fosfatidilcolina (PC) y liso-fosfatidilcolina (LPC), pueden ser convertidos completamente en glicerofosfocolina.

Los experimentos también indicaron que la fosfolipasa pancreática es menos activa en un medio bajo en agua y no presentó una actividad de aciltransferasa significativa.

La grasa butírica modificada enzimáticamente (muestras 7 y 8 de la Tabla 37) se añaden a leche desnatada a una concentración final de 3,6 % p/p de grasa para producir una leche para uso en la preparación de queso.

Ejemplo 24 - tratamiento de grasa butírica y helado

Se evaluó la lípido acil transferasa en grasa butírica y helado (38% de grasa) con el objetivo de investigar la reacción de transferencia cuando se añade un 0,5% de glicerol y un 1% de fosfolípidos a la grasa butírica.

Los productos de reacción se analizaron mediante TLC y los resultados de la grasa butírica mostraron claramente la formación de monoglicéridos y lisofosfolípidos. Los resultados del experimento con nata también confirmaron la formación de monoglicéridos, aunque a un menor nivel, posiblemente debido a la reacción hidrolítica competitiva que provoca la formación de ácidos grasos libres. En los experimentos con nata se observó un pequeño aumento del contenido de lisofosfolípidos, pero esto podría explicarse por una dosis de enzima demasiado elevada.

Procedimiento experimental

Enzimas: Lípido acil transferasa (como en el Ejemplo 23) Grasa butírica: Grasa butírica anhidra A0019659 lote 0130547 de Croman, Bélgica. Nata: 38% de grasa, de ARLA, Dinamarca Glicerol: Lecitina: Fosfatidilcolina al 95% Vegetal (Avanti nº 441601), HPTLC Aplicador: LINOMAT 5, aplicador CAMAG. Placa de HPTLC: 10 x10 cm (Merck nº 1.05633) La placa se activó antes de ser usada mediante secado en un horno a 160ºC durante minutos. Aplicación: 1,0 μL de

una disolución al 15,0% de materia butírica reaccionada disuelta en Cloroformo:Metanol (2:1) se aplicaron a la placa de HPTLC usando un aplicador LINOMAT 5. Tampón de elución:1 P-éter:MTBE:Ácido acético (60:40: 1) Tiempo de aplicación/elución: 14 minutos. Tampón de elución:5 P-éter:MTBE:Ácido acético (70:30:1) Tiempo de aplicación/elución: 12 minutos. Tampón de elución:4 Cloroformo:Metanol:Agua (75:25:4) Tiempo de aplicación/elución: 20 minutos.

Resultados

Las muestras de grasa butírica, glicerol, lecitina y enzima fueron escaladas en un vaso Wheaton de 20 mL Como se describe en la Tabla 38 Tabla 38.

1: 2

Croman, Grasa butírica anhidra A0019659 lote 0130547: g 10 10

Nata, 38%: g

Lecitina, Avanti: g 0,1 0,1

LAT, 500 TIPU/mL*: mg 50

Glicerol: mg 50

Unidades/g: 0 2,5

* LAT (5000 TIPU/mL) disuelto en glicerol:enzima 9:1

Las muestras se colocaron en un bloque de calefacción a 45ºC y se sacaron las muestras después de 10, 30, 60 y 5 120 minutos y se disolvieron en cloroformo : metanol 2:1.

Las muestras fueron analizadas mediante TLC en el tampón de elución 5, 1 y 4, como se muestra en las Figuras 106, 107 y 108.

Conclusión. Experimento de Grasa butírica

Los resultados de TLC del tratamiento enzimático de aceite de mantequilla que contiene glicerol/fosfolípidos con

10 lípido aciltransferasa confirman la capacidad de esta enzima para convertir colesterol en ésteres de colesterol y glicerol en monoglicéridos usando fosfolípidos como dador de acilo.

En el experimento llevado a cabo se demostró que los fosfolípidos (PC) se convierten en liso-fosfatidilcolina (LPC). Alargando el tiempo de reacción, los liso-fosfolípidos (LPC) se convierten en glicofosfocolina. Por lo tanto, es posible optimizar la dosis de enzima y el tiempo de reacción con el objetivo de identificar el nivel óptimo de producción de

15 monoglicéridos y lisofosfolípidos para una aplicación particular.

La grasa butírica modificada enzimáticamente se añade a leche desnatada a una concentración final de 3,6 % p/p de grasa para producir una leche para uso en la preparación de queso. Los experimentos iniciales indican que la grasa butírica modificada enzimáticamente puede incorporarse más fácilmente a la leche desnatada que una grasa butírica no modificada.

20 Resultados con nata

Se escalaron muestras de nata, glicerol y enzima en un vaso Wheaton de 20 mL como se describe en la Tabla 39.

Tabla 39.

3: 4

Croman, Grasa butírica anhidra A0019659 lote 0130547: g

Nata, 38%: g 10 10

Lecitina, Avanti: g 0,1 0,1

LAT, 500 TIPU/mL*: mg 50

Glicerol: mg 50

* LAT (5000 TIPU/mL) disuelto en glicerol:enzima 9:1

Las muestras se colocaron en un bloque de calefacción a 45ºC y se sacaron las muestras después de 10, 30, 60 y 120 minutos y se disolvieron en cloroformo : metanol 2:1. 5 Las muestras fueron analizadas mediante TLC en el tampón de elución 5, 1 y 4, como se muestra en las Figuras 109, 110 y 111.

Conclusión. Experimento con nata Los resultados de TLC del tratamiento de nata que contiene fosfolípidos y glicerol con una enzima lípido acil transferasa confirman claramente la reacción de transferencia de grupos acilo desde los fosfolípidos (PC) hasta

10 colesterol durante la formación de ésteres de colesterol. También se observó la reacción de transferasa de grupos acilo a glicerol. También se produjo una destacable

actividad hidrolítica. Por lo tanto, es posible una optimización adicional para producir un nivel óptimo de monoglicéridos a través de la modulación de la dosis de enzima, la dosis de glicerol y el tiempo de reacción. EJEMPLO 25 - Producción de Mozzarella

15 Enzimas

EDS 188: Lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención (referida a partir de este punto KLM33), expresada en B. licheniformis: 2005876 (1460 TIPU/mL) (SEQ ID No. 90, variante N80D). Lecitasa, fosfolipasa de páncreas, Sigma P0861, 10.000 unidades/mL. Día 1.

20 1. Se separó la leche a 55 °C en leche desnatada (~ 0,075% p/p de grasa) y nata (30% p/p de grasa). Se preparó una grasa "desnatada" (0,83%, p/p) mezclando la leche desnatada con nata (véase la Figura 120)

2. Se añadieron 0,4 g de CaCl2 (50%, p/v) por kg de nata (30% de nata) y la nata se dividió en 3 lotes iguales -a saber, para el control (Cuba 1), Lecitasa (Cuba 2) y KLM3' (Cuba 3).

3. Se añadió un 0,2% de lecitasa (p/p de contenido graso) a la Cuba 2 equivalente a un 0,06% (p/p de nata con un 25 30 % p/p de grasa) o equivalente a 0,6 g por kg de nata del 30% en grasa.

4.: Se añadió KLM3' 25 TIPU/kg de nata a la Cuba 3.

5.: En el control (Cuba 1), no se añadió ninguna disolución (o agua) de enzima.

6.: Todos los tratamientos de nata (incluido el control) fueron incubados a 50 °C durante 30 min.

7.: Inmediatamente después, se añadió el peso correcto de cada nata al peso correcto de grasa de leche "desnatada"

30 (0,83% p/p) fría (10ºC) para conseguir el contenido graso correcto (3,5%, p/p) en las mezclas, que son las leches estandarizadas.

8.: Éstas fueron pasteurizadas a 72 ºC durante 26 segundos.

9.: Se enfría a 5 ºC y se mantienen durante una noche.

Día 2.

10.: La leche se calentó a 41ºC y se mantuvo durante 30 minutos (esto se realizó para revertir los efectos sobre la leche del envejecimiento durante el almacenamiento en frío).

11.: La leche se enfrió a 34,4°C

12.: Se añadió un cultivo de inicio (Choozit Ta 61 100 DCU, Choozit LH100 50 DCU en DAN 011, Dan 012, DAN 013; y Choozit Ta 61 100 DCU, Choozit LH100 23,3 DCU en DAN 021, DAN 022, DAN 023). DAN 021, DAN 022 y DAN 023 fueron dosificados con una cantidad reducida de Choozit LH 100 para reflejar las tasas de adición de cultivo de Helveticus usadas normalmente en la producción industrial de mozzarella. Los cultivos se añadieron directamente a la leche de queso y se dejaron sin agitar durante 45 minutos.

13.: Se añadió el cuajo (145 mL de Marzyme 10 (140 imcu/mL) diluido a 1 litro con agua),

14.: El cuajo se mezcló durante 2 minutos.

Se tomó una muestra de la leche con cuajo y se colocó en un reómetro para medir el cambio en el módulo elástico, G', en función del tiempo.

15.: El gel (cuajada) de la cuba se cortó cuando la rigidez (G') alcanzó los 40 Pa, determinado en un reómetro de resistencia controlada.

16.: El gel se cortó usando una rejilla de alambre - (velocidad 2-15 segundos, reposo 1 minuto, velocidad de corte 1 15 segundos, reposo 1 minuto, velocidad de corte 1 - 10 segundos) - y la mezcla de cuajada y suero se dejó reposar quiescentemente (curar). Esta etapa de curado se incorpora a la fabricación industrial de queso para minimizar las pérdidas de grasa al suero.

17.: La mezcla de cuajada y suero se agitó (a los 10 minutos desde el inicio de periodo de corte) durante 5 minutos, de tal modo que se obtenga una mezcla cuajada/suero en movimiento.

18.: La mezcla cuajada/suero se calentó a 41,1°C en 30 min.

19.: Se continuó con la agitación hasta que el pH de la cuajada alcanzó 5,9 (medido en el suero escurrido de la cuajada).

20.: La mezcla de suero y cuajada se drenó en una cuba de finalización, y se retiró el suero por gravedad.

21.: La cuajada se cortó a los laterales de la cuba, conduciendo a 2 cortes de cuajada.

22.: Los cortes de cuajada se cortaron en bloques.

23.: Los bloques de cuajada se voltearon cada 15-20 minutos y se mantuvieron en la cuba de finalización hasta que el pH alcanzó 5,25 (medido insertando la sonda de pH en la muestra de cuajada).

24.: A continuación la cuajada se trituró en virutas (~ 0,75 cm x ~ 0,75 cm x ~ 7 cm de largo).

25.: Se cubrió con agua fría (17°C) durante 15 minutos.

26.: El agua se drenó durante 10 minutos.

27.: Se pesó la cuajada y se añadió sal a la cuajada hasta un nivel de 0,2% (p/p) del peso de leche de queso (0,9 kg de cuajada de queso a partir de 450 kg de leche). Se dejó que la cuajada absorbiera la sal aplicada durante 20 minutos.

28.: La cuajada se colocó en una unidad de amasado/estirado de plastifización (a través de la unidad de trituración construida en el equipo).

29.: La cuajada fue amasada/estirada a la vez que se calentó a 63ºC haciendo circular agua a 80ºC.

30.: La cuajada se colocó en agua a 7ºC durante 30 minutos.

31.: A continuación la cuajada se colocó en salmuera a 7ºC (23% de NaCl) durante 90 minutos.

32.: La cuajada se retiró de la salmuera y se dejó drenar durante 10 minutos.

33.: Se pesó la cuajada salmuerada.

34.: Se envasó al vacío y se colocó a 4ºC.

Resultados Tabla 40 - Rendimiento de queso y contenido de grasa del suero

Código: Peso leche Peso Cuajada en moldes Cuajada sin molde Cuajada de salmuera Peso total de queso salado Rendimiento de queso kg/100 kg Grasa en suero

kg
kg
kg
kg: kg de leche %, p/p

DAN011: 454,1 26,62 18,36 2678 45,25 9,96 0,48

DAN012: 454,6 26,62 21,66 26,69 48,41 10,65 0,41*

DAN013: 454,2 26,6 23,56 26,83 50,59 11,14* 0,34*

DAN021: 454,4 26,55 18,63 26,7 45,44 10,00 0,51

DAN022: 454,1 26,5 20,69 26,69 47,53 10,47 0,41*

DAN023: 454,3 26,4 21,61 26,52 48,23 10,62* 0,35*

DAN011 y DAN021 = control; DAN 012 y DAN022 = Lecitasa; DAN013 y DAN023 = KLM3 [* significa estadísticamente significativo en comparación con el control]

Ejemplo 26: Pizza preparada con queso modificado enzimáticamente

5 El queso preparado según el Ejemplo 25 se usa en la preparación de pizza. Base de pizza 500 g de harina blanca fuerte 12 g de levadura fresca disueltos en 200-250 mL de agua que contiene 1 cucharada pequeña de azúcar disuelta, y

se deja reposar a 20ºC durante 10 minutos.

10 1 huevo 1-2 cucharadas de aceite de oliva al gusto Sal al gusto Todo lo anterior se mezcla y se amasa posteriormente a mano durante 5 minutos para producir una masa. Se deja la

masa, cubierta con un paño húmedo, para que se eleve hasta al menos el doble de su volumen. A continuación la

15 masa es enrollada hasta aproximadamente 5 mm - 1 cm de espesor, al gusto. Se prepara una salsa de tomate friendo brevemente cebolla y ajo cortados finamente en una sartén con aceite de oliva y añadiendo tomates triturados. Se reduce la salsa hasta una consistencia deseable. Una vez fría, la salsa se añade a la masa de pizza enrollada.

Se añade el queso preparado en el Ejemplo 25, y también se pueden añadir ingredientes vegetales, de carne y de

20 marisco. La pizza se hornea a 200ºC en una base de piedra en un horno asistido por un ventilador. La pizza preparada con el queso que comprende el aceite/grasa comestible parece tener un aceite superficial destacadamente menor, y la base de pizza horneada está menos saturada con el aceite, especialmente en los bordes, y sobre la superficie de la salsa y los ingredientes (véase la Figura 136). Esto hace la pizza más apetitosa para comer y para manejarla.

25 La pizza presenta una apariencia mejorada con una menor pérdida de aceite visible.

Ejemplo 27 - Análisis de lípidos

La nata y el queso de la producción de mozzarella detallados en el Ejemplo 25 fueron analizados como se indica a continuación: Análisis de lípidos

La nata y el queso de la producción de queso Mozzarella detallados en el Ejemplo 25 fueron extraídos con disolventes orgánicos y los lípidos aislados fueron analizados mediante HPTLC y GLC. En el experimento de queso, la nata usada para producir el queso fue tratada con una fosfolipasa pancreática (Lecitasa) o con una lípido aciltransferasa según la presente invención (KLM3). También se llevó a cabo un experimento de control sin ningún tratamiento con enzima. Los tres experimentos se realizaron por duplicado a lo largo de dos días.

El análisis de lípidos de los lípidos aislados de la nata tratada enzimáticamente, así como del queso producido con las natas, demostró que tanto la Lecitasa como la KLM3 fueron activas sobre los fosfolípidos en los productos, y los principales fosfolípidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE) se degradaron casi completamente.

En la muestra tratada con lecitasa, la degradación de PC y PE vino seguida de la formación simultánea de ácidos grasos libres, principalmente ácido oleico y ácido linoleico. En el experimento con KLM3 la formación de ácidos grasos libres fue significativamente menor que la degradación de fosfolípidos debido a que esta enzima lleva a cabo la reacción de transferencia de ácidos grasos desde los fosfolípidos hasta el colesterol, lo que da como resultado la formación de ésteres de colesterol. En las muestras de queso tratadas con KLM3 sólo quedó el 40% del colesterol, en comparación con los quesos de control y los tratados con Lecitasa. En el queso tratado con KLM3 se formaron pequeñas cantidades de ácidos grasos libres saturados debido a la actividad no específica sobre los ácidos grasos saturados en la posición sn-1 de los fosfolípidos.

El tratamiento con enzimas se realizó en una nata del 30% que después del tratamiento enzimático se añadió a leche desnatada y se ajustó al 3,5% de grasa para la producción de queso.

En este informe se analizan los análisis de los componentes lipídicos de la nata usada para la producción de queso, así como del queso.

Materiales y métodos

Enzimas:

EDS 188: Lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención (referida a partir de este punto KLM33), expresada en B. licheniformis: 2005876 (1460 TIPU/mL), (SEQ ID No. 90, variante N80D).

Lecitasa, fosfolipasa de páncreas, Sigma P0861, 10.000 unidades/mL.

Patrones de TLC:

ST16: disolución al 0,5% de fosfolípidos que contiene un 14,76% de Fosfatidilcolina (PC), un 0,49% de Lisofosfatidilcolina (LPC), un 10,13% de Fosfatidilinositol (PI), un 12,74% de Fosfatidiletanolamina (PE) y un 5,13% deÁcido fosfatídico (PA).

ST17: disolución al 0,1% de colesterol, un 0,1% de estearato de colesterol y un 0,1% de ácido oleico.

Tratamiento enzimático de nata usada para la producción de queso Mozzarella

Se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 25.

HPTLC

Aplicador. aplicador CAMAG AST4. Placa de HPTLC: 20 x 10 cm (Merck nº 1.05641) La placa se activó antes de ser usada mediante secado en un horno a 160ºC durante 20-30 minutos. Aplicación: se aplicaron 3,0 μL de lípidos extraídos disueltos en Cloroformo:Metanol (2:1) a la placa de HPTLC

usando un aplicador AST4. También se aplicaron a la placa de HPTLC 0,1; 0,3; 0,5; 0,8 y 1,5 μL de una disolución patrón de componentes estándares de concentración conocida. Tampón de elución:1 P-éter:MTBE:Ácido acético (50:50:1) Tiempo de aplicación/elución: 12 minutos. Tampón de elución:6 Acetato de metilo:Cloroformo:Metanol:Isopropanol:0,25% de disolución de KCl en agua.

(25:25:25:10:9) Tiempo de aplicación/elución: 20 minutos. Fluido de desarrollo: 6% de cupriacetato en H3PO4 al 16%

Tras elución, la placa fue secada en un horno a 160ºC durante 10 minutos, se enfrió y se sumergió en el fluido de desarrollo, y a continuación se secó por otros 5 minutos más a 160°C. La placa fue evaluada visualmente y se escaneó (escáner de TLC Camag).

Tras secado, las manchas de TLC son cuantificadas escaneando la placa en un Escáner 3 de TLC de Camag. En 5 base a la densidad del componente patrón se construye una curva de calibrado, que se usa para la cuantificación de los componentes de la muestra.

Análisis de GLC

Cromatógrafo Capilar de Gases Perkin Elmer Autosystem 9000 equipado con una columna de sílice fusionada WCOT de 12,5 m x 0,25 mm ID x 0,1 μm de espesor de película, 5% de fenil-metilsilicona (CP Sil 8 CB de 10 Chrompack).

Gas portador: Helio.

Inyector. inyección con split frío PSSI (temperatura inicial 50°C, calentamiento hasta 385°C); volumen 1,0 μL, Detector FID: 395°C

Programa del horno (usado desde ):: 1 2 3

Temperatura del horno, °C.: 90 280 350

Isotérmico, tiempo, min.: 1 0 10

Rampa de temperatura, °C/min.: 15 4

15 Preparación de muestras: Los lípidos extraídos de las muestras de queso o nata se disolvieron en 0,5 mL de Heptano:Piridina, 2:1, que contiene el patrón interno heptadecano, 0,5 mg/mL. Se transfieren 300 μL de disolución de muestra a un vial de rosca, se añaden 300 μL de MSTFA (N-Metil-N-trimetisilil-trifluoracetamida) y se deja reaccionar 20 minutos a 60°C. Cálculo: Los factores de respuesta correspondientes a Ácidos grasos libres (FFA), Colesterol, Palmitato de colesterol y Estearato de colesterilo fueron determinados a partir de los materiales de

20 referencia puros.

Extracción de Nata.

Las muestras de nata en tubos Eppendorf se calentaron a 99ºC durante 10 minutos con el objetivo de desactivar la enzima, y se enfriaron a temperatura ambiente. Se transfirió 1 mL de nata a un vaso de vidrio dram de 10 mL con tapón roscado. Se añadieron 3 mL de Cloroformo:Metanol 2:1 y se mezcló con un aparato Whirley. La muestra fue

25 extraída durante 30 minutos en un Rotamix. La muestra se centrifugó durante 10 minutos a 1700 g. La fase orgánica inferior se aisló y se usó para análisis de TLC y GLC.

Extracción de queso

Se escalaron 0,5 g de queso en un tubo de centrífuga de 12 mL con tapa roscada. Se añadieron 2 mL de etanol al 99% y la muestra se homogeneizó con un mezclador Ultra Turrax durante 30 segundos a 20000 rpm. La mezcladora

30 se aclaró con 1,5 mL de etanol. Se añadieron 5 mL de cloroformo y se mezclaron en un aparato Whirley. La muestra fue extraída durante 30 minutos en un Rotamix a 25 rpm. La muestra se centrifugó durante 10 minutos a 1700 g.

La fase orgánica inferior se aisló y se usó para los análisis de TLC y GLC.

Muestras

Tabla 41 - Muestras de nata tomadas después de 30 minutos de tratamiento enzimático.

Ensayo Nº: Enzima Dosis, ppm Día

DAN011: Control 0 1

DAN012: Lecitasa 600 1

DAN013: KLM3 17,1 1

DAN021: Control 0 2

DAN022: Lecitasa 600 2

DAN023: KLM3 17,1 2

Tabla 42 - Marcado de las muestras de queso de Mozzarella

Ensayo Nº: Enzima Día

DAN011: Control 1

DAN012: Lecitasa 1

DAN013: XLM3 1

DAN021: Control 2

DAN022: Lecitasa 2

DAN023: KLM3 2

Resultados

Análisis de lípidos de nata.

Las muestras de nata usadas para la producción de queso fueron extraídas con cloroformo-metanol según el procedimiento mencionado anteriormente en el apartado de Materiales y Métodos y se analizaron mediante HPTLC.

10 Los resultados de los análisis de TLC de las muestras de nata se muestran en las Figuras 121 y 122.

La Figura 121 muestra el análisis de TLC (disolvente 6) de lípido extraído de nata y una mezcla estándar (ST16) de fosfolípidos; Fosfatidilcolina (PC); Liso-fosfatidilcolina (LPC); Fosfatidilinositol (PI); Fosfatidiletanolamina (PE); 5,13% de ácido fosfatídico (PA); y Espingolípido (SG);

La Figura 122 muestra un análisis de TLC (disolvente 1) de lípido extraído de nata y una mezcla estándar de ácidos 15 grasos libres (FFA), colesterol (CHL) y éster de colesterol (éster-CHL).

Se determinó la densidad de las bandas del cromatograma de TLC, y en base a la mezcla estándar de fosfolípidos se calculó la cantidad de PC y PE a partir del cromatograma de TLC de la Figura 121, y en base a la mezcla estándar de colesterol y ácidos grasos se calculó la cantidad de ácidos grasos libres y de colesterol en las muestras a partir del cromatograma de TLC. Los resultados de GLC se muestran en la Tabla 43.

20 Tabla 43. Análisis de Fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), colesterol (CHL) y ácidos grasos libres (FFA) en base a los cromatogramas de TLC de las Figuras 121 y 122.

Enzima: Día ppm de PC ppm de PE ppm de CHL ppm de FFA

Control: 1 149 278 713 201

Lecitasa: 1 23 17 638 396

KLM3: 1 11 24 328 274

Control: 2 117 214 638 166

Lecitasa: 2 39 29 629 345

KLM3: 2 15 28 311 201

Los resultados de la Tabla 43 fueron evaluados estadísticamente mediante un análisis ANOVA usando el software 5 Statgraphics Plus para Windows 3.1. La evaluación estadística para el colesterol y los ácidos grasos libres se ilustra gráficamente en las Figuras 123 y 124.

El análisis de TLC de nata tratada con Lecitasa y KLM3 ha demostrado un fuerte efecto de las fosfolipasas en la nata (Figura 121) y se observa que los dos componentes principales de fosfolípidos PC y PE están completamente hidrolizados (Tabla 43).

10 En la Figura 122 se muestra que la KLM3 presenta un fuerte impacto sobre el colesterol, en comparación con la Lecitasa. También se observa que la cantidad de ácidos grasos producida en la muestra tratada con Lecitasa es claramente mayor que en las muestras tratadas con KLM3 y el control.

Una evaluación estadística de la cantidad de ácidos grasos (Figura 124) demuestra que la KLM3 produce una cantidad pequeña, pero no significativa, de ácidos grasos libres en comparación con el control. Sin embargo, la 15 cantidad de ácidos grasos de la muestra tratada con Lecitasa es significativamente mayor. Esto se explica por el hecho de que la Lecitasa hidroliza fosfolípidos, lo que da como resultado la formación de ácidos grasos libres. La KLM3 también degrada los fosfolípidos (Tabla 43) pero da como resultado la transferencia de los ácidos grasos procedentes de los fosfolípidos hacia el colesterol, dando como resultado la formación de ésteres de colesterol. Esto también se confirma por el hecho de que la cantidad de colesterol es significativamente menor en la muestra tratada

20 con KLM3, mientras que las muestras de control y tratadas con Lecitasa tienen un nivel similar (véase la Figura 123).

En términos de relación molar se puede calcular que la cantidad de PC y PE degradados es de 0,6 mmol/kg tanto para la Lecitasa como para la KLM3, y la cantidad de ácidos grasos producidos es de 0,65 mmol/kg en la nata tratada con Lecitasa y de 0,2 mmol/kg en la nata tratada con KLM3, lo que confirma las observaciones de que la

25 Lecitasa hidroliza fosfolípidos, pero la KLM3 cataliza una reacción de transferencia.

Los lípidos extraídos de la nata después de 30 minutos de tratamiento enzimático también fueron analizados mediante GLC con el objetivo de cuantificar los ácidos grasos, el colesterol y los ésteres de colesterol específicos.

Los resultados del análisis de GLC se muestran en la Tabla 44.

Tabla 44. Análisis de GLC de ácido palmítico (FFA-16), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico (C18:2), ácido esteárico 30 (C:18:0), Suma de FFA (C16:0, C 18:0, C18:1 y C 18:2), colesterol y ésteres de colesterol.

Enzima: Día FFA-16 ppm FFA-18:1 y C:18:2 ppm FFA-C18:0 ppm Suma de FFA ppm Colesterol ppm Ésteres de colesterol ppm

Control: 1 119 154 54 327 551 0

Lecitasa: 1 133 316 60 508 546 0

KLM3: 1 125 177 51 353 216 286

Control: 2 111 152 54 317 520 0

Lecitasa: 2 130 314 62 507 547 0

KLM3: 2 130 195 63 388 238 335

Los resultados de la Tabla 44 fueron evaluados estadísticamente mediante un análisis ANOVA usando el software Statgraphics Plus para Windows 3.1. La evaluación estadística para el colesterol, los ésteres de colesterol y la suma de ácidos grasos libres (FFA) se ilustra gráficamente en las Figuras 125 a 127.

5 El análisis de GLC confirma lo que ya se había observado en el análisis de TLC, que la KLM3 reduce significativamente la cantidad de colesterol (véase la Figura 126) en comparación con la nata de control y la nata tratada con Lecitasa. El colesterol de la nata tratada con KLM3 se convierte en ésteres de colesterol (véase la Figura 121), mientras que la nata tratada con Lecitasa y el control no contienen ésteres de colesterol. La formación de ésteres de colesterol también tiene un impacto sobre el nivel de ácidos grasos libres (véase la Figura 127), donde la

10 Lecitasa produce una cantidad significativa de ácidos grasos libres por hidrólisis de fosfolípidos, y la KLM3 sólo produce una pequeña cantidad, no significativa, de ácidos grasos libres. También se observa que son principalmente los ácidos grasos insaturados los que aumentan durante el tratamiento enzimático, ya que la Lecitasa es una fosfolipasa específica sn-2 y la KLM3 es específica sn-2 con respecto a la reacción de transferasa. En los fosfolípidos naturales la posición sn-2 contiene principalmente ácidos grasos insaturados.

15 Análisis de lípidos de queso

Las muestras de queso producidas a partir de nata modificada enzimáticamente fueron extraídas con cloroformo y etanol según el procedimiento mencionado anteriormente y se analizaron mediante HPTLC y GLC.

Cada muestra se analizó por duplicado.

Los resultados del análisis de HPTLC se muestran en las Figuras 128 y 129.

20 El cromatograma de TLC mostrado en la Figura 129 indica que tanto la Lecitasa como la KLM3 han hidrolizado completamente los fosfolípidos fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. El cromatograma de la Figura 128 ilustra que el queso tratado con KLM3 presenta un contenido reducido de colesterol en comparación con el queso de control o con el tratado con Lecitasa. También se observa que la cantidad de ácidos grasos libres en el queso tratado con KLM3 es inferior a la del queso tratado con Lecitasa aunque ambas enzimas hidrolizan completamente los

25 fosfolípidos PC y PE.

Análisis de GLC de lípidos de queso de Mozzarella.

Los lípidos extraídos del queso también fueron analizados mediante GLC con el objetivo de cuantificar los ácidos grasos, el colesterol y los ésteres de colesterol específicos. Cada queso fue extraído y analizado por duplicado.

Los resultados del análisis de GLC se muestran en la Tabla 45. El análisis de ácidos grasos se divide en la cantidad 30 de ácido palmítico (C16:0), ácido oleico (C18:1) y ácido linoleico (C18:2) y ácido esteárico (C18:0).

Tabla 45: Análisis de GLC de lípidos de queso de Mozzarella.

Enzima: Día FFA-16 FFA-18:1 18:2 y FFA-18:0 FFA Colesterol Ésteres de colesterol

Control: 1 291 291 158 740 89 0

Control: 1 304 275 156 735 58 0

Lecitasa: 1 345 566 195 1105 688 0

Lecitasa: 1 336 546 180 1062 690 0

KLM3: 1 374 453 202 1030 296 440

KLM3: 1 399 481 228 1109 304 492

Control: 2 285 259 160 703 26 0

Control: 2 302 261 167 730 702 0

Lecitasa: 2 354 584 202 1140 728 0

Lecitasa: 2 357 591 202 1150 744 0

KLM3: 2 377 458 221 1056 302 419

KLM3: 2 388 485 227 1099 315 487

Los resultados de la Tabla 45 que muestran el análisis de GLC de lípidos de queso Mozzarella fueron evaluados estadísticamente mediante un análisis ANOVA usando el software Statgraphics Plus para Windows 3.1. La evaluación estadística para el colesterol, los ésteres de colesterol, ácido oleico + ácido linoleico y la suma de FFA se muestra en las Figuras 130 a 133.

El análisis de GLC de lípidos de Mozzarella ha confirmado el efecto de la KLM3 sobre el colesterol (véase la Figura 130) y la formación de ésteres de colesterol (véase la Figura 131). El queso producido con KLM3 contiene sólo el 40% de colesterol en comparación con el queso de control. La Lecitasa no mostró ningún efecto sobre el nivel de colesterol y no se formó ningún éster de colesterol en el queso de control ni en el queso tratado con Lecitasa.

Debido a la reacción de transferencia, también se observa que la cantidad de ácidos grasos libres en los quesos producidos con KLM3 es inferior a la del queso producido con Lecitasa. Esto se observa claramente para los ácidos grasos insaturados ácido oleico y ácido linoleico (véase la Figura 132), que son menores en los ensayos con KLM3 en comparación con los de Lecitasa. Sin embargo, las diferencias son menos pronunciadas para el ácido palmítico y el ácido esteárico (véase la Tabla 45). Se sabe que la fosfolipasa de páncreas - Lecitasa - es muy específica para la posición sn-2 de los fosfolípidos y por tanto produce principalmente ácidos grasos insaturados. También se sabe que la KLM3 tiene algo de actividad hidrolítica no específica, lo que puede explicar la formación de ácidos grasos saturados procedentes de la posición sn-1 de los fosfolípidos de la grasa láctea.

En este experimento se observa que casi todos los fosfolípidos son degradados después de 30 minutos de tratamiento enzimático de la nata. Sin embargo, la reacción enzimática continúa durante la estandarización de la leche de queso hasta que la leche de queso es pasteurizada. La reacción enzimática continuada después del tratamiento enzimático de la nata, hasta que la leche de queso es pasteurizada, explica la formación de ácidos grasos saturados C16:0 y C18:0 en el experimento con KLM3. Esto también se confirma por el hecho de que no se forman ácidos grasos saturados en la nata después de 30 minutos de tratamiento enzimático con KLM3, si no que se observan únicamente en el queso. La formación de ácidos grasos saturados en el experimento con KLM3 se puede reducir o evitar reduciendo el tiempo de incubación de la nata.

Conclusión

El tratamiento enzimático de la nata para uso en la producción de queso de Mozzarella ha demostrado que la KLM3 y la Lecitasa fueron muy activas con los fosfolípidos de la grasa láctea. Se observó una casi completa conversión de los fosfolípidos fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina.

La actividad de la Lecitasa sobre los fosfolípidos contribuyó a aumentar el contenido de ácidos grasos libres. Los ácidos grasos producidos fueron principalmente los ácidos grasos insaturados ácido oleico y ácido linoleico, ya que la Lecitasa es específica sn-2 y los ácidos grasos insaturados son los más abundantes en la posición sn-2 de los fosfolípidos.

Sin embargo, la KLM3 produjo menos ácidos grasos libres debido a que esta enzima transfiere los ácidos grasos desde los fosfolípidos hasta el colesterol durante la formación de ésteres de colesterol.

El análisis de lípidos de los lípidos extraídos del producto final de queso de Mozzarella mostró casi los mismos perfiles de lípidos observados para la nata usada para producir el queso de Mozzarella.

Ejemplo 28: Análisis de humedad

Se analizó el queso procedente de seis experimentos con el uso de enzima en la producción de queso Mozzarella a escala piloto (véase el Ejemplo 25) para determinar el contenido de humedad empleando el método normalizado IDF 4A, 1982, y se determinó el contenido en grasa mediante el método normalizado IDF 5B, 1986 de la International Dairy Federation.

Resultados:

Tabla 46 - Análisis de humedad y contenido de grasa

Queso: % de humedad % de grasa

DAN011: Control 48,75 23,26

DAN012: Lecitasa 50,95 23,02

DAN013: KLM3 52,03 22,70

DAN021: Control 48,67 24,69

DAN022: Lecitasa 49,60 24,25

DAN023: KLM3 51,66 23,67

El contenido de humedad del queso se vio influido por el tratamiento enzimático; la acil transferasa KLM3 aumentó

10 significativamente el contenido de humedad del queso, tanto comparado con el control como con la lecitasa. Esto explica parcialmente el aumento de rendimiento obtenido con el tratamiento enzimático. Por tanto, el porcentaje de grasa del queso disminuye ligeramente debido al aumento total del rendimiento.

Ejemplo 29: Análisis de la pérdida de aceite

El queso de los experimentos con uso de enzima para la producción de queso Mozzarella a escala piloto (véase el

15 Ejemplo 25) se analizó para determinar la pérdida de aceite empleando un ensayo de difusión. Tras la producción los quesos se maduraron durante 8 días a 6°C.

Ensayo del Diámetro de pérdida de aceite:

Se molieron muestras de queso (2 g) y se comprimieron en un anillo de 2 cm de ancho usando un peso de 16 g dejado caer desde una altura de 5 cm, se aplicó tres veces a fin de obtener una masa compacta. Esto es un punto

20 clave para medir la pérdida de aceite, a menos que se conozca la cantidad de fuerza usada para crear la muestra (junto con la resistencia del material que está siendo compactado), ya que la densidad de la masa final no será clara, lo que tiene un efecto directo sobre la pérdida de aceite durante el calentamiento (véase la Figura 134).

Las muestras se colocaron en papeles de filtro Whatman del número 4 y se calentaron juntas en un horno de secado a 90,0ºC durante 5 minutos.

25 Las medidas de la pérdida de aceite se determinaron a través del diámetro de las zonas translucidas observadas sobre los papeles de filtro medido después de 10 minutos.

Resultados:

Tabla 47 - pérdida de aceite

Queso: Media SD Área promedio/mm2 % de control área de

DAN011: 32,33 1,25 821,09

DAN013: 25,00 2,16 490,87 59,78

30 DAN011 fue un control sin enzima. DAN013 fue tratado con KLM3. 121

La Figura 135 muestra fotografías de las muestras de control DAN011 (izquierda) y del queso producido con KLM3 DAN013 (derecha). 5 minutos de reposo tras la etapa de calentamiento.

Conclusiones:

Como se puede observar a partir de los resultados, tras 10 minutos el queso con KLM3 registró una pérdida de 5 aceite significativamente menor que el control.

Ejemplo 30 - Ensayo de fusión:

Se analizó el queso procedente de los experimentos con uso de enzima para la producción de queso Mozzarella a escala piloto (véase el Ejemplo 25) para determinar la capacidad de fusión empleando el método del tubo descrito por Olsen (Olsen, NF. y WV. Price, Journal of Dairy Science 1958, Vol. 41: 999-1000). Se mide el flujo de queso

10 como el porcentaje de cambio desde el punto de inicio antes de calentar el tubo (Olsen, 1958).

Resultados:

Tabla 48 - resultados de flujo de queso.

Queso: Flujo de queso (%)

DAN011: Control 211

DAN012: Lecitasa 217

DAN013: KLM3 221

DAN021: Control 168

DAN022: Lecitasa 200

DAN023: KLM3 200

No se observó una diferencia estadísticamente significativa en el ensayo de fusión para el queso, por tanto ni la 15 Lecitasa ni la acil transferasa KLM3 cambiaron las propiedades de fusión del queso.

Las propiedades de fusión también fueron determinadas mediante el horneado de pizza, para determinar cambios visuales en el queso mozzarella en comparación con la muestra de control sin enzima. El queso mostró menos pérdida de aceite sobre la pizza y unas propiedades de fusión normales.

Ejemplo 31 - Expresión de una lípido aciltransferasa en Bacillus licheniformis

20 Se expresó una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 100) que codifica una lípido aciltransferasa (SEQ. ID No. 90, a partir de este punto KLM3) en Bacillus licheniformis como una proteína de fusión con el péptido señal de B. licheniformis [alfa]-amilasa (LAT) (véanse las Figuras 137 y 138). Para la expresión óptima en Bacillus, se encargó una construcción génica de codón optimizado (nº 052907) a Geneart (Geneart AG, Regensburg, Alemania).

La construcción nº 052907 contiene un promotor LAT incompleto (solo la secuencia -10) en frente del gen precursor

25 LAT-KLM3' y la transcripción LAT (Tlat) por debajo del gen precursor LAT-KLM3' (véanse las Figuras 137 y 139). Para crear un fragmento XhoI que contenga el gen precursor LAT-KLM3' flanqueado por el promotor LAT completo en el extremo 5' y el terminador LAT en el extremo 3', se llevó a cabo una amplificación de PCR (reacción en cadena de polimerasa) con los cebadores Plat5Xhol_FW y EBS2XhoI_RV y la construcción génica 052907 como plantilla.

Plat5XhoI_FW:

EBS2XhoI_RV: tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc

La PCR se llevó a cabo en un termociclador con polimerasa de ADN Phusion High Fidelity (Finnzymes OY, Espoo, Finlandia) según las instrucciones del fabricante (temperatura de maduración de 55ºC).

El fragmento de PCR resultante se digirió con enzima de restricción XhoI y se ligó con T4 ADN ligasa en plCatH digerido con XhoI según las instrucciones del suministrador (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.).

La mezcla de ligación se transformó en la cepa SC6.1 de B. subtilis tal como se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. US20020182734 (Publicación Internacional WO 02/14490). La secuencia del injerto de XhoI que contiene el gen precursor de LAT-KLM3' fue confirmada mediante secuenciamiento de ADN (BaseClear, Leiden, Holanda) y uno de los clones plásmidos correctos se designó pICatH-KLM3'(ori1) (Figura 137). Se transformó el plCatHKLM3'(oril) en la cepa BML780 de B. licheniformis (un derivado de BRA7 y BML612, véase el documento W02005111203) a la temperatura permisiva (37ºC).

Se seleccionó un transformante resistente a neomicina (neoR) y un transformante resistente a cloranfenicol (CmR) y se designó BML780(plCatH-KLM3'(oril)). El plásmido de BML780(plCatH-KLM3'(oril)) se integró en la región catH del genoma de B. licheniformis cultivando la cepa a una temperatura no permisiva (50ºC) en medio con 5 ug/mL de cloranfenicol. Se seleccionó un clon resistente a CmR y se designó BML780-plCatH-KLM3'(oril). Se cultivó de nuevo el BML780-plCatH-KLM3'(oril) a la temperatura permisiva durante varias generaciones sin antibióticos para abrir lazos de secuencias vector y a continuación se seleccionó un clon CmR sensible a neomicina (neoS). En este clon se escinden las secuencias vector de plCatH sobre el cromosoma (que incluyen el gen de resistencia a neomicina) y solo queda la casete catH-LATKLM3'. A continuación, se amplificó la casete catH - LATKLM3' sobre el cromosoma cultivando la cepa en/sobre un medio con concentraciones crecientes de cloranfenicol. Después de varias rondas de amplificación, se seleccionó un clon (resistente a 50 ug/mL de cloranfenicol) y se designó BML780-KLM3'CAP50. Para verificar la expresión de KLM3', se cultivó BML780-KLM3'CAP50 y BML780 (la cepa hospedante vacía) durante 48h a 37ºC en una placa de agar Heart Infusion (Bacto) con un 1% de tributirina. Una zona clara, indicativa de la actividad de lípido aciltransferasa, fue claramente visible alrededor de la colonia de BML780-KLM3'CAP50 pero no alrededor de la cepa hospedante BML780 (véase la Figura 140). Este resultado demuestra que se expresa una cantidad sustancial de KLM3' en la cepa BML780-KLM3'CAP50 de B. licheniformis y que dichas moléculas de KLM3' son funcionales.

PÁRRAFOS RESUMEN

La presente descripción se define en las reivindicaciones y en la descripción acompañante. Para mayor comodidad, éstos y otros aspectos de la presente invención se presentan en la presente memoria a través de unos párrafos numerados.

1.: Un método para la producción in situ de un emulsionante en un alimento, donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al alimento,

2.: Un método según el párrafo 1, en el que se producen al menos 2 emulsionantes.

3.: Un método según el párrafo 1 o el párrafo 2, en el que el emulsionante se produce sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos del alimento.

4.: Un método según uno cualquiera de los párrafos 1-3, en el que la lípido aciltransferasa es una capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido a uno o más de los siguientes aceptores de acilo: un esterol, un estanol, un carbohidrato, una proteína o una sub-unidad de la misma, glicerol.

5.: Un método según el párrafo 2, en el que al menos uno de los emulsionantes es un éster de carbohidrato.

6.: Un método según el párrafo 2, en el que al menos uno de los emulsionantes es un éster de proteína.

7.: Un método según uno cualquiera de los párrafos precedentes, en el que se produce uno o más de un éster de esterol o un éster de estanol o un éster de proteína o un éster de carbohidrato o un diglicérido o un monoglicérido in situ en el alimento.

8.: Un método según el párrafo 7, en el que el éster de esterol es uno o más de éster de alfa-sitoesterol, éster de beta-sitoesterol, éster de estigmaesterol, éster de ergoesterol, éster de campesterol o éster de colesterol.

9.: Un método según el párrafo 6, en el que el éster de estanol es uno o más de beta-sitoestanol o ss-sitoestanol.

10.: Un método según uno cualquiera de los párrafos precedentes, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de acil transferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX, en el que X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S.

11.: Un método según uno cualquiera de los párrafos precedentes, en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende H-309 o comprende un residuo de histidina en una posición que corresponde a His-309 en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID No. 2 ó SEQ ID No. 32.

12.: Un método según uno cualquiera de los párrafos precedentes, donde la lípido aciltransferasa se puede obtener a partir de un organismo de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter,

Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

13.: Un método según uno cualquiera de los párrafos precedentes, donde la lípido aciltransferasa comprende uno o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2;

(ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3; (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 5; (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6; (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, (xv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 62,

(xvi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene un 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 ó SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 62 ó SEQ ID No. 90.

14.: Un método según uno cualquiera de los párrafos precedentes, donde el emulsionante es uno o más de los siguientes: un monoglicérido, una lisofosfatidilcolina, DGMG.

15.: El uso de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de una materia alimentaria un alimento que comprende un emulsionante, donde el emulsionante es producido sin aumentar o sin aumentar sustancialmente el contenido de ácidos grasos libres del alimento, y donde el emulsionante es generado a partir de los constituyentes de la materia alimentaria por acción de la lípido aciltransferasa.

16.: El uso según el párrafo 15, en el que se producen al menos dos emulsionantes.

17.: El uso según el párrafo 16, en el que al menos uno de los emulsionantes es un éster de carbohidrato.

18.: El uso según el párrafo 16, en el que al menos uno de los emulsionantes es un éster de proteína.

19.: El uso según uno cualquiera de los párrafos 15-18, en el que también se produce in situ uno o más de un éster de esterol o un éster de estanol o un éster de proteína o un éster de carbohidrato o un diglicérido o un monoglicérido en el alimento.

20.: El uso según el párrafo 19, en el que el éster de esterol es uno o más de éster de alfa-sitoesterol, éster de betasitoesterol, éster de estigmaesterol, éster de ergoesterol, éster de campesterol o éster de colesterol.

21.: El uso según el párrafo 20, en el que el éster de estanol es uno o más de beta-sitoestanol o ss-sitoestanol.

22.: El uso según uno cualquiera de los párrafos 15 a 21, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de acil transferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX, en el que X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S.

23.: El uso según uno cualquiera de los párrafos 15-22, en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende H-309 o comprende un residuo de histidina en una posición que corresponde a His-309 en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID No. 2 ó SEQ ID No. 32.

24.: El uso según uno cualquiera de los párrafos 15-23, donde la lípido aciltransferasa se puede obtener a partir de un organismo de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

25.: El uso según uno cualquiera de los párrafos 15-24, donde la lípido aciltransferasa comprende uno o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2; (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3; (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 5; (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6; (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, (xv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 62,

26.: El uso según uno cualquiera de los párrafos 15-25, donde el emulsionante es uno o más de los siguientes: un monoglicérido, una lisofosfatidilcolina, DGMG.

27.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso que contiene una lípido aciltransferasa.

28.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso según el párrafo 27, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de acil transferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX, en el que X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó

S.

29.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso según el párrafo 27 o el párrafo 28, en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende H-309 o comprende un residuo de histidina en una posición que corresponde a His309 en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID No. 2 ó SEQ ID No. 32.

30.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso según uno cualquiera de los párrafos 27-29, donde la lípido aciltransferasa se puede obtener a partir de un organismo de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desumtobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

31.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso según uno cualquiera de los párrafos 27-30, donde la lípido aciltransferasa comprende uno o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2; (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3; (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 5; (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6; (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, (xv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 62, (xvi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene un 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 ó SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 62 ó SEQ ID No. 90.

32.: El uso de una composición enzimática alimentaria o para pienso según uno cualquiera de los párrafos 27-31 según uno cualquiera de los párrafos 15-26 o en el método según uno cualquiera de los párrafos 1-14.

33.: Un alimento que puede obtenerse mediante el método según uno cualquiera de los párrafos 1-14.

34.: Una enzima lípido acil transferasa inmovilizada.

35.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 34, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de acil transferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S.

36.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 34 o el párrafo 35, en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende H-309 o comprende un residuo de histidina en una posición que corresponde a His-309 en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID No. 2 ó SEQ ID No. 32.

37.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según uno cualquiera de los párrafos 34-36, donde la lípido aciltransferasa se puede obtener a partir de un organismo de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Sachharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

38.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según uno cualquiera de los párrafos 34-37, donde la lípido aciltransferasa comprende uno o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2; (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3; (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 5; (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6; (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20, (viii) la secuencia de aminoácidos

mostrada como SEQ ID No. 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, (xv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 62, (xvi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene un 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 ó SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 62 ó SEQ ID No. 90.

39.: Un método para identificar una lípido aciltransferasa adecuada para uso según la presente descripción, que comprende las etapas de evaluar una enzima de interés usando uno o más de "Ensayo de Transferasa en un entorno Bajo en Agua", "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" ó "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado", y seleccionar una lípido aciltransferasa si es una que tenga una o más de las siguientes características: (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un entorno Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, presenta una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o

(c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

40.: Un método según el párrafo 39, en el que la lípido aciltransferasa se selecciona si es una que presente más de dos de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

41.: Un método según el párrafo 39, en el que la lípido aciltransferasa se selecciona si es una que presente más de tres de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

42.: Un método según el párrafo 39, en el que la lípido aciltransferasa se selecciona si es una que presente todas las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

43.: Una lípido aciltransferasa identificada usando un método según uno cualquiera de los párrafos 39-42.

44.: Una lípido aciltransferasa donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 75% con respecto a la SEQ ID No. 90, preferiblemente al menos un 80% de identidad con la misma, preferiblemente al menos un 85% de identidad con la SEQ ID No. 90, preferiblemente al menos un 90% de identidad con la SEQ ID No. 90, preferiblemente al menos un 95% de identidad con la SEQ ID No. 90.

45.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 44, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de acil transferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S.

46.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 44 ó el párrafo 45, donde la lípido aciltransferasa se puede obtener (o se obtiene) del género Aeromonas.

47.: Una lípido aciltransferasa según uno cualquiera de los párrafos 44-46, donde la lípido aciltransferasa presenta una o más de las siguientes características: (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un entorno Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, presenta una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

48.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 47, donde la lípido aciltransferasa presenta más de dos de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

49.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 47, donde la lípido aciltransferasa presenta más de tres de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

50.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 47, donde la lípido aciltransferasa presenta todas las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o

51.: Una enzima lípido aciltransferasa inmovilizada donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 75% con respecto a la SEQ ID No. 90, preferiblemente al menos un 80% de identidad con la misma, preferiblemente al menos un 85% de identidad con la SEQ ID No. 90, preferiblemente al menos un 90% de identidad con la SEQ ID No. 90, preferiblemente al menos un 95% de identidad con la SEQ ID No. 90.

52.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 51, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de acil transferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S.

53.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 51 ó el párrafo 52, donde la lípido aciltransferasa se puede obtener a partir de un organismo del género Aeromonas.

54.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según uno cualquiera de los párrafos 51-53, donde la lípido aciltransferasa presenta una o más de las siguientes características: (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un entorno Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, presenta una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

55.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 54, donde la lípido aciltransferasa presenta más de dos de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

56.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 54, donde la lípido aciltransferasa presenta más de tres de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

57.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 54, donde la lípido aciltransferasa presenta todas las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de

transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

58.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso que contiene dicha lípido aciltransferasa según uno cualquiera de los párrafos precedentes.

59.: Una lípido aciltransferasa donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene un 95% o más de identidad con la SEQ ID No. 90.

60.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 59, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de acil transferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S.

61.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 59 ó el párrafo 60, donde la lípido aciltransferasa se puede obtener (o se obtiene) del género Aeromonas.

62.: Una lípido aciltransferasa según uno cualquiera de los párrafos 59-61, donde la lípido aciltransferasa presenta una o más de las siguientes características: (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un entorno Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, presenta una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

63.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 62, donde la lípido aciltransferasa presenta más de dos de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

64.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 62, donde la lípido aciltransferasa presenta más de tres de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

65.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 62, donde la lípido aciltransferasa presenta todas las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o

66.: Una enzima lípido aciltransferasa inmovilizada donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene un 95% o más de identidad con la SEQ ID No. 90.

67.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 66, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de acil transferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX, donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ó S.

68.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 66 ó el párrafo 67, donde la lípido aciltransferasa se puede obtener a partir de un organismo del género Aeromonas.

69.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según uno cualquiera de los párrafos 66-68, donde la lípido aciltransferasa presenta una o más de las siguientes características: (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un entorno Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, presenta una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

70.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 69, donde la lípido aciltransferasa presenta más de dos de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

71.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 69, donde la lípido aciltransferasa presenta más de tres de las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

72.: Una lípido aciltransferasa inmovilizada según el párrafo 69, donde la lípido aciltransferasa presenta todas las siguientes características (a) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en un Medio Bajo en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado entre 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad de transferasa relativa de al menos un 1%; (b) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Yema de Huevo Alta en Agua" con una yema de huevo con un 54% de agua, presenta hasta un 100% de actividad de transferasa relativa; o (c) cuando es evaluada usando el "Ensayo de Transferasa en Sustrato Tamponado" tiene una actividad de aciltransferasa de al menos el 2%.

73.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso que contiene dicha lípido aciltransferasa según uno cualquiera de los párrafos precedentes.

74.: Una lípido aciltransferasa donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene un 95% o más de identidad con la SEQ ID No. 90.

75.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 74, donde la lípido aciltransferasa tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90.

76.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 74 ó el párrafo 75, donde la lípido aciltransferasa está inmovilizada.

77.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso que contiene dicha lípido aciltransferasa según uno cualquiera de los párrafos precedentes.

78.: Una lípido aciltransferasa, donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90.

79.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 78, donde la lípido aciltransferasa tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90.

80.: Una lípido aciltransferasa según el párrafo 78 ó el párrafo 79, donde la lípido aciltransferasa está inmovilizada.

81.: Una composición enzimática alimentaria o para pienso que contiene dicha lípido aciltransferasa según uno cualquiera de los párrafos precedentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una lípido aciltransferasa, donde la lípido aciltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90.
2. Una lípido aciltransferasa según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la lípido 5 aciltransferasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 90.
3.

Una enzima lípido aciltransferasa según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la lípido aciltransferasa está inmovilizada.
4.

Una composición enzimática alimentaria o para pienso que contiene dicha lípido aciltransferasa según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.