EA018153B1

EA018153B1 - Липидацилтрансфераза и содержащая ее пищевая или кормовая композиция

Info

Publication number: EA018153B1
Application number: EA201000327A
Authority: EA
Inventors: Арно Де Край; Сусан Мампусти Мадрид; Йёрн Дальгорд Миккельсен; Йёрн Борк Сёе; Марк Тёрнер; Джонатан Гудвинс
Original assignee: Даниско А/С
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2013-05-30
Also published as: ES2415873T3; EA201000323A1; WO2009024862A3; PL2190864T3; DK2190296T3; CN101917862A; WO2009024862A2; DK2190864T3; AU2008290273B2; US8652809B2; CA2695562A1; EP2190296A2; NZ583006A; BRPI0816413A2; CL2008002415A1; CA2695562C; SA08290513B1; CA2693361A1; EP2190864B1; BRPI0814971A2

Abstract

Описана липидацилтрансфераза, включающая аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID No. 90, или аминокислотную последовательность, которая имеет 95% или большую идентичность с SEQ ID No. 90.

Description

Настоящее изобретение относится к липидацилтрансферазе.

Настоящее изобретение относится к пищевой ферментной композиции и/или кормовой ферментной композиции, которая содержит липидацилтрансферазу.

Настоящее изобретение также дополнительно относится к иммобилизованной липидацилтрансферазе.

Предпосылки создания настоящего изобретения

Полезное применение фосфолипаз и липаз (на которые ссылаются как на липолитические ферменты (ЕС. 3.1.1.x)), используемых в применениях в пищевой и/или кормовой промышленности, известно в течение многих лет.

Например, в ЕР 0585988 заявляется, что добавление липазы к тесту приводило к улучшению в противочерствительном эффекте. Предполагают, что липаза, полученная из Βΐιίζοριίδ аггЫхщ. при добавлении к тесту может улучшить качество получаемого хлеба при использовании в комбинации с шортенингом/жиром. \νϋ 94/04035 описывает, что улучшенная мягкость может быть получена путём добавления липазы к тесту без добавления к тесту какого-либо дополнительного жира/масла. Са§1е11о, Р. Е8ЕСР 8910 Оес. 1999 НеЫпкЦ показывает, что экзогенные липазы могут влиять на объём хлеба.

Липолитические ферменты гидролизуют одну или большее количество жирных кислот из липидов, присутствующих в продукте, что может приводить к образованию эффективных молекул эмульгатора в продукте питания, что обеспечивает коммерчески ценные функциональные возможности. Молекулы, которые вносят наиболее значительные характеристики эмульгатора, представляют собой продукты частичного гидролиза, такие как молекулы лизофосфолипида, лизогликолипида и моноглицерида. Полярные продукты гидролиза липидов, такие как лизофосфолипиды и лизогликолипиды, являются в особенности предпочтительными. В производстве хлеба такие ίη δίΐιι полученные эмульгаторы могут давать эквивалентные функциональные возможности в качестве эмульгаторов, таких как ΌΑΤΕΜ.

Однако активность липолитических ферментов также приводит к накоплению свободных жирных кислот, которые могут приводить к негативным свойствам в продукте питания. Эта неотъемлемая активность липолитических ферментов ограничивает их функциональные возможности.

В данной области техники были сделаны многочисленные попытки решения этой проблемы. Однако, они приводят к значительному увеличению в количестве свободных жирных кислот в продукте питания, в особенности продуктах питания с высоким содержанием воды, включая, не ограничиваясь приведенными, тесто для хлеба и яичный желток.

Фосфолипазы, в особенности фосфолипаза А2 (Е.С. 3.1.1.4), использовались в течение многих лет для обработки яиц или продуктов на основе яиц (см., к примеру, И8 4034124 и Όιιΐίΐιΐ & Сгодег 1981 1. 8с1. Еооб Адлс. 32, 451-458). Фосфолипазная активность при обработке яиц или продуктов на основе яиц приводит к накоплению полярного лизолецитина, который может действовать как эмульгатор. Фосфолипазная обработка яиц или продуктов на основе яиц может улучшить стабильность, термическую стабильность при тепловой обработке, такой как пастеризация, и приводит к существенному сгущению. Продукты на основе яиц могут включать, не ограничиваясь приведенными, торт, майонез, заправки для салата, соусы, мороженое и подобные. Применение фосфолипаз приводит к накоплению свободных жирных кислот. Накопление свободных жирных кислот может приводить к значительному постороннему неприятному запаху. Кроме того, накопление свободных жирных кислот может приводить к увеличенной восприимчивости к окислению и, следовательно, приводит к недостаточному сроку годности, потере цвета продуктом и изменению других критических характеристик пищи, таких как запах и текстура. В последнее время липолитические ферменты с более широкой специфичностью субстрата были предложены для обработки яичного желтка и родственных пищевых продуктов. Они имеют то преимущество, что в отличие от большинства фосфолипаз А2 они имеют происхождение не от млекопитающих. Однако они приводят к значительному накоплению свободных жирных кислот из-за гидролиза не только фосфолипидов, но также триглицеридов.

Как описано выше, другой областью, в которой липазы применяются в значительной степени, является хлебобулочная промышленность. Применение фосфолипаз в хлебобулочной промышленности датируется началом 1980-х.

Субстрат для липаз в пшеничной муке составляет 1,5-3% эндогенных пшеничных липидов, которые представляют собой комплексную смесь полярных и неполярных липидов. Полярные липиды могут подразделяться на гликолипиды и фосфолипиды. Эти липиды построены из глицерина, эстерифицированного двумя жирными кислотами, и полярной группы. Полярная группа вносит свой вклад в поверхностную активность этих липидов. Ферментативное отщепление одной из жирных кислот в этих липидах приводит к получению липидов с более высокой поверхностной активностью. Хорошо известно, что эмульгаторы, такие как ΌΑΤΕΜ, с высокой поверхностной активностью являются очень функциональными при

- 1 018153 добавлении к тесту.

Однако применение липаз (Е.С. 3.1.1.Х) в продуктах из теста может иметь вредное влияние на активность дрожжей, и/или негативный эффект на объём хлеба. Негативный эффект на объём хлеба часто объясняется передозировкой. Передозировка может приводить к уменьшению в глютеновой эластичности, что приводит к получению теста, которое слишком твёрдое, и, таким образом, приводит к уменьшенным объёмам хлеба. Дополнительно или альтернативно, такие липазы могут разлагать шортенинг, масло или молочный жир, добавленные к тесту, что приводит к неприятному запаху в тесте и печеных продуктах. Передозировка и неприятный запах могут быть отнесены к накоплению свободных жирных кислот в тесте.

В ЕР 1193314, ЕР 0977869 и также в \УО 01/39602 применение липолитических ферментов, активных по отношению к гликолипидам, как описано, является в особенности полезным в применении в производстве хлеба, так как продукты частичного гидролиза - лизогликолипиды, как было найдено, имеют очень высокие эмульгирующие возможности, что, очевидно, приводит к более высокой доле позитивной эмульгирующей функциональной возможности в сравнении с вредным накоплением свободных жирных кислот. Однако также было найдено, что ферменты имеют значительную неселективную активность по отношению к триглицериду, что приводит к излишне высоким количествам свободной жирной кислоты.

Такие же сведения описаны в \УО 00/32758, который раскрывает варианты липолитических ферментов с увеличенной активностью по отношению к фосфолипидам и/или гликолипидам, кроме того, к вариантам, которые отдавали предпочтение длинноцепочечным жирным кислотам, чем короткоцепочечным. Эта последняя особенность, также раскрытая в \УО 01/39602, является особенно важной для предотвращения неприятных запахов, связанных с накоплением свободных короткоцепочечных жирных кислот. Однако получаются значительные количества свободных жирных кислот.

Проблемы высокой триглицеридной активности касаются в \УО 02/094123, в котором описывают применение липолитических ферментов, активных по отношению к полярным липидам (т.е. гликолипидам и фосфолипидам) в тесте, но по сути неактивных по отношению к триглицеридам или 1-моноглицеридам. Однако получаются значительные количества свободных жирных кислот.

Некоторые липолитические ферменты имеют низкую активность или не имеют активности по отношению к лизоформе полярных липидов (например, гликолипидов/фосфолипидов). Применение таких ферментов считается предпочтительным, так как они обеспечивают накопление высокополярных лизолипидов, что приводит к оптимальным функциональным возможностям. Однако свободные жирные кислоты действительно накапливаются. Эта селективная функциональность является характеристичной особенностью фосфолипазных А2 ферментов и гликолипазы, раскрытых в ЕР 0977869, ЕР 1193314 и \УО 01/39602. Получают варианты ферментов менее селективных липолитических ферментов, которые имеют более низкую активность по отношению к лизополярным липидам в сравнении с исходным ферментом (\УО 03/060112). Однако получаются значительные количества свободных жирных кислот.

\УО 00/05396 описывает способ получения пищевого продукта, который содержит эмульгатор, где пищевой материал взаимодействует с ферментом таким образом, что эмульгатор производится с помощью фермента из сложного эфира жирной кислоты и второй функциональный ингредиент производится из второй составляющей. \УО 00/05396 описывает применение, в частности, липазного или эстеразного фермента. Нигде в \УО 00/05396 не описано специфическое применение липидацилтрансферазы. Кроме того, в пищевых продуктах с высоким содержанием воды применение эстераз и липаз, как описано в \УО 00/05396, приводит к значительному накоплению свободных жирных кислот.

Недостаток, связанный с применением липаз, включая фосфолипазы и гликолипазы, может быть вызван накоплением свободных жирных кислот, высвободившихся из липидов. За последние несколько декад применение липолитических ферментов в пищевых продуктах ограничивалось из-за баланса между вредным накоплением свободных жирных кислот и получением лизолипидов, которые обеспечивают положительные функциональные возможности. Хотя в данной области техники были предприняты многочисленные попытки, некоторые из которых обеспечивали значительные улучшения в функциональных возможностях, ни одна из них в полной мере не касалась и не решала фундаментальную проблему в данной области техники, т.е. значительное накопление свободных жирных кислот в пищевых продуктах, полученных, применяя липолитические ферменты ίη δίΐιι.

Присутствие высоких уровней свободных жирных кислот (ЕЕА) в сырых материалах или пищевых продуктах в основном считается недостатком качества, и производители пищи и потребители, как правило, будут включать максимальный ЕЕЛ уровень в технические условия на пищевые продукты. Полученные эффекты избыточных ЕЕА уровней могут заключаться в органолептических и/или функциональных дефектах.

Результатом липолиза является гидролитическая прогорклость, с образованием характеристичного мыльного привкуса. Этот мыльный привкус является в особенности острым с жирными кислотами со средней длиной цепи (С8-С12), которые, хотя и не присутствуют в высокой концентрации, могут быть важными составляющими, например, молочных продуктов или растительных масел. Более распространённый органолептический дефект возникает из-за объединённых эффектов липолитических ферментов и процессов окисления. Ненасыщенные жирные кислоты являются более восприимчивыми к фермента

- 2 018153 тивному окислению, когда они не эстерифицированны, чем когда они эстерифицированны в ациллипиды.

Функциональные дефекты в пище из-за высоких РРА уровней общепризнанны, но менее понятно объяснены. Не желая связываться теорией, гидролиз неизменённых липидов до карбоновых кислот будет повышать количество [Н+] и производить карбонильные группы, которые могут быть объединены с другими соединениями или ионами металлов. Свободные жирные кислоты также соединяют белки путём гидрофобных взаимодействий и могут образовывать комплекс с крахмалом в процессе приготовления. РРА также могут мешать действию поверхностно-активных агентов, таких как полярные липиды и эмульгаторы (Ыр1б ίη Сегеа1 ТесЬпо1оду, Р.1. Батек, Асабетю Ргекк 1983).

МО 03/100044 раскрывает класс ацилтрансфераз, известных как РЭАТ (или АТМАХ). Эти ферменты используют моноглицерид или диглицерид как акцепторную молекулу и фосфатидилхолин (РС) как донорную молекулу для получения следующих продуктов: лизофосфатидилхолин и триацилглицерин и/или диацилглицерин.

В одном варианте воплощения настоящее изобретение относится к улучшениям во внедрении сывороточных белков в пищевые продукты, обеспечивая улучшенные выходы без снижения качеств, таких как текстура, пищевых композиций и продуктов.

Сырные композиции, как правило, получают из молочных жидкостей с помощью способов, которые включают обработку этой жидкости с помощью коагулирующих или сгущающих агентов. Коагулирующий агент может представлять собой створаживающий фермент, кислоту или подходящую бактериальную культуру или он может включать такую культуру. Получаемый творог в основном объединяет трансформированный казеин, жиры, включая натуральный молочный жир, и отдушки, которые возникают, в особенности, когда используют бактериальную культуру. Этот творог может быть отделён от жидкой сыворотки, которая содержит растворимые белки, на которые не влияет коагулирование, и которые поэтому не включаются в творог.

Таким образом, сыворотка представляет собой побочный продукт производства в коммерческих процессах, которые приводят к получению пищевых продуктов, таких как сыры. Традиционно, сыворотка рассматривается как неиспользуемые отходы или используется как удобрение или пища для животных или перерабатывается в пищевой ингредиент.

Невозможность в значительной степени удерживать сывороточные белки в твороге является важным фактором, способствующим недостаточной эффективности в традиционном получении молочных продуктов, таких как сырная масса, и снижению в общем выходе, который относится к включению всех белковых веществ, которые находятся в исходных молочных жидкостях, в полученную сырную массу.

Были предприняты многочисленные попытки включить сывороточные белки в сыр, например, с помощью тепловой обработки молока, с помощью тепловой обработки сыворотки или путём фильтрации, такой как ультрафильтрация.

Существует также несколько описаний применения специфических протеаз для инициирования агрегации сывороточных белков. Серинпротеаза, полученная из ВасШик йсйепйогтй, как показано, имеет способность вызывать агрегацию сывороточных белков (И8 5523237).

Однако остаётся много сложностей, связанных с добавлением сывороточных белков в процессы, такие как производство сыров. Например, включение сывороточных белков в сыры связано с ухудшением привкуса и вкусовых ощущений продукта и, кроме того, склонно мешать створаживанию и последующей обработке продукта. Протеазы, о которых сообщалось ранее, которые могут быть добавлены к молоку для сыроделия для гидролиза сывороточных белков, приводят к значительному гидролизу казеинов, как описано Мабкеп, 1.8. & ΟνίκΙ, К.В. (1997) Нубго1укк оГ шбк рго1еш Ьу а ВасШик НсЬепШотик рго1еаке кресШс Гог аабю атшо ас1б гек1биек. 1. Рооб 8ск 62, 579-582.

Таким образом, в данной области техники существует необходимость в способах и композициях, которые обеспечивают улучшенное включение сывороточного белка в пищевые продукты, при этом сохраняя органолептические и другие желательные свойства. Такая оптимизация приводила бы к повышенной эффективности, более высоким выходам пищевых продуктов и сниженной общей стоимости материала.

Липаза:холестерин ацилтрансферазы известны уже в течение некоторого времени (см., например, ВисИеу - ВюсЬепийгу 1983, 22, 5490-5493). В частности, были найдены глицерофосфолипид:холестерин ацилтрансферазы (ОСАТк), которые как и растительные лецитин:холестерин ацилтрансферазы и/или лецитин:холестерин ацилтрансферазы млекопитающих (ЬСАТк) будут катализировать перенос жирной кислоты между фосфатидилхолином и холестерином.

Ир1оп и Виск1еу (Т1В8 20, Мау 1995, стр. 178-179) и ВгитПк и ВисИеу (1. оГ Вас1епо1оду Арг. 1996, стр. 2060-2064) описывают липазу/ацилтрансферазу из Аеготопак ЬубгорЫ1а, которая имеет способность выполнять перенос ацильной группы на спиртовые акцепторы в водной среде.

Краткие аспекты настоящего изобретения

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ ίη кйи получения эмульгатора в продукте питания, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липидацилтрансферазы, как определено в данном описании.

- 3 018153

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ίη ίάιι получения эмульгатора в продукте питания, где указанный способ представляет собой такой, в котором эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ίη 8Йи получения эмульгатора и другого сложного эфира стерола и/или сложного эфира станола в продукте питания, где указанный способ представляет собой такой, в котором эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ίη δίΐιι получения эмульгатора и другого сложного эфира стерола и/или сложного эфира станола в продукте питания, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ ίη δίΐιι получения по крайней мере двух эмульгаторов в продукте питания, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липидацилтрансферазы.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ ίη δίΐιι получения по крайней мере двух эмульгаторов и любого сложного эфира стерола и/или сложного эфира станола в продукте питания, где указанный способ представляет собой такой, в котором эмульгаторы производят без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ ίη δίΐιι получения по крайней мере двух эмульгаторов и любого сложного эфира стерола и/или сложного эфира станола в продукте питания, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ίη ίάιι получения сложного эфира углевода в продукте питания, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ίη δίΐιι получения сложного эфира углевода вместе с эмульгатором в продукте питания, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ίη ίάιι получения эмульгатора и одного или большего количества сложных эфиров углевода; сложного эфира стерола; сложного эфира станола; сложного эфира белка; моноглицерида или диглицерида в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ получения пищевого продукта, который включает эмульгатор, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липидацилтрансферазы, как определено в данном описании.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения пищевого продукта, который включает эмульгатор, где указанный способ представляет собой такой, в котором эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения пищевого продукта, который включает эмульгатор и другой сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола, где указанный способ представляет собой такой, в котором эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения пищевого продукта, который включает эмульгатор и любой сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ получения пищевого продукта, который включает по крайней мере два эмульгатора, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липидацилтрансферазы.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ получения пищевого продукта, который включает по крайней мере два эмульгатора и любой сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола, где указанный способ представляет собой такой, в котором эмульгаторы производят без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ полу

- 4 018153 чения пищевого продукта, который включает по крайней мере два эмульгатора и любой сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения пищевого продукта, который включает сложный эфир углевода, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения пищевого продукта, который включает сложный эфир углевода и эмульгатор, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения пищевого продукта, который включает эмульгатор и один или большее количество сложных эфиров углевода; сложный эфир стерола; сложный эфир станола; сложный эфир белка; моноглицерид или диглицерид, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который содержит эмульгатор, где указанный эмульгатор производят из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который содержит эмульгатор, где указанный эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный эмульгатор производят из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который включает эмульгатор и любой сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола, где указанный эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где эмульгатор, и/или сложный эфир стерола, и/или сложный эфир станола получают из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который включает эмульгатор и любой сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола, где указанный эмульгатор и/или сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола производят из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который включает по крайней мере два эмульгатора, где указанные два эмульгатора получают из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения обеспечивается применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который включает по крайней мере два эмульгатора и любой сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола, где указанные эмульгаторы получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где один или оба эмульгатора, и/или сложный эфир стерола, и/или сложный эфир станола производят из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения обеспечивается применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который включает по крайней мере два эмульгатора и любой сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола, и где один или оба эмульгатора и/или сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола получают из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который включает сложный эфир углевода, где указанный сложный эфир углевода получают из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который включает по крайней мере сложный эфир углевода и дополнительный эмульгатор, где указанный сложный эфир углевода и эмульгатор производят из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, который содержит эмульгатор и один или большее количество сложных эфиров углевода; сложный эфир стерола; сложный эфир станола; сложный эфир белка; моноглицерид или диглицерид, и где указанный эмульгатор, и/или сложный эфир углевода, и/или сложный эфир стерола, и/или сложный эфир станола, и/или сложный эфир белка, и/или моноглицерид, и/или диглицерид получают из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

- 5 018153

В соответствии с последующим аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ ίη δίΐιι получения эмульгатора, предпочтительно лизолецитина и сложного эфира стерола в продукте питания на яичной основе, где указанный способ представляет собой такой, в котором эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В соответствии с последующим аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ ίη 8Йи получения эмульгатора, предпочтительно лизолецитина, и сложного эфира стерола в продукте питания на яичной основе, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения пищевого продукта на яичной основе, который включает эмульгатор, предпочтительно лизолецитин, и сложный эфир стерола в продукте питания на яичной основе, где указанный эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания, и где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения пищевого продукта на яичной основе, который включает эмульгатор, предпочтительно лизолецитин, и сложный эфир стерола в продукте питания на яичной основе, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение дополнительно обеспечивает пищевой продукт, который может быть получен, предпочтительно может быть получен, с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно относится к пищевой ферментной композиции и/или пищевой ферментной композиции, которая содержит липидацилтрансферазу, и к применению такой композиции в способах настоящего изобретения.

В соответствии с последующим аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ определения подходящей липидацилтрансферазы для применения в соответствии с настоящим изобретением, который включает стадии тестирования фермента, который представляет интерес, используя один или больше из таких как Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды или Исследование трансферазы в забуференном субстрате, и выбирая липидацилтрансферазу, если она является той, которая имеет одну или более из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, измеряемом после периода времени, выбранного из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

Настоящее изобретение также дополнительно обеспечивает липидацилтрансферазу, которую определяют, используя способ в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с последующим аспектом настоящее изобретение обеспечивает иммобилизованный липидацилтрансферазный фермент, как определено в данном описании.

Детальные аспекты настоящего изобретения

Термин липидацилтрансфераза, как используется в данном изобретении, означает фермент, который, также обладая липазной активностью (в основном классифицируемой как Е.С. 3.1.1.x в соответствии с Номенклатурными рекомендациями относительно ферментов (Епхушс Иотепс1а1иге Кесоттепбаΐίοηδ) (1992) Международного союза биохимии и молекулярной биологии (Иотепс1а1иге СоттШее οί 111е 1п1егпа1юпа1 Ишоп οί Вюсйетщбу апб Мо1еси1аг Вю1оду)), имеет также ацилтрансферазную активность (которая обычно классифицируется как Е.С. 2.3.1.x), где фермент является способным к переносу ацильной группы из липида на один или более акцепторных субстратов, таких как один или более из приведенных далее: стерол, станол; углевод; белок; белковая субъединица; глицерин.

Липидацилтрансфераза для использования в способах и/или применениях настоящего изобретения может представлять собой такую, которая описана в \УО 2004/064537, или \УО 2004/064987, или РСТ/1В 2004/004378, или СВ 0513859.9, или РСТ/СВ 05/002823. Указанные документы включены в данную заявку путём ссылки.

Липидацилтрансфераза для использования в способах и/или применениях настоящего изобретения может быть природной липидацилтрансферазой или может быть вариантом липидацилтрансферазы. Предпочтительно липидацилтрансфераза для использования в способах и/или применениях настоящего изобретения способна к переносу ацильной группы от липида (как определено в данной заявке) на один или более ацилакцепторных субстратов, таких как стерол, станол, углевод, белок или его субъединицы или глицерин.

В некоторых аспектах акцептор ацила в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой соединение, включающее гидроксигруппу (-ОН), такое как, например, поливалентные

- 6 018153 спирты, включая глицерин; стеролы; станолы; углеводы; гидроксикислоты, включая фруктовые кислоты, лимонную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту и аскорбиновую кислоту; белки или их субъединицы, такие как аминокислоты, белковые гидролизаты и пептиды (частично гидролизованный белок), например; и их смеси, а также их производные. Предпочтительно, когда акцептор ацила в соответствии с настоящим изобретением не является водой.

В одном варианте воплощения акцептор ацила предпочтительно не представляет собой моноглицерид и/или диглицерид.

В одном аспекте предпочтительно фермент способен переносить ацильную группу от липида на стерол и/или станол.

В одном аспекте предпочтительно фермент способен переносить ацильную группу от липида на углевод.

В одном аспекте предпочтительно фермент способен переносить ацильную группу от липида на белок или его субъединицу. Соответственно, белковая субъединица может представлять собой одну или более из следующих: аминокислота, гидролизат белка, пептид, дипептид, олигопептид, полипептид.

Соответственно, в белке или белковой субъединице акцептор ацила может представлять собой один или более из следующих компонентов белка или белковой субъединицы: серин, треонин, тирозин или цистеин.

Когда белковая субъединица представляет собой аминокислоту, соответственно аминокислота может представлять собой любую подходящую аминокислоту. Соответственно, аминокислота может представлять собой, например, один или более из серина, треонина, тирозина или цистеина.

В одном аспекте предпочтительно фермент способен переносить ацильную группу от липида на глицерин.

В одном аспекте предпочтительно фермент способен переносить ацильную группу от липида на гидроксикислоту.

В одном аспекте предпочтительно фермент способен переносить ацильную группу от липида на поливалентный спирт.

В одном аспекте липидацилтрансфераза, будучи также способной переносить ацильную группу от липида на стерол и/или станол, дополнительно может быть способной переносить ацильную группу от липида на один или более из следующих: углевод, белок, белковая субъединица, глицерин.

Предпочтительно, когда липидный субстрат, на основе которого действует липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой один или более из следующих липидов: фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин, триацилглицерид, кардиолипин, диглицерид или гликолипид, такой как, например, дигалактозилдиглицерид (ΌΟΌΟ). Этот липидный субстрат может называться в данной заявке донором липидного ацила. Термин лецитин, как используется в данной заявке, охватывает фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин.

Для некоторых аспектов предпочтительно липидный субстрат, на который действует липидацилтрансфераза, представляет собой фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин.

Для некоторых аспектов предпочтительно липидный субстрат представляет собой гликолипид, такой как, например, ΌΟΌΟ.

Предпочтительно липидный субстрат представляет собой пищевой липид, который представляет собой липидный компонент пищевого продукта.

Для некоторых аспектов предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением не способна или по сути не способна действовать на триглицерид, и/или 1-моноглицерид, и/или 2-моноглицерид.

Соответственно, липидный субстрат или донор липидного ацила может представлять собой один или более липидов, присутствующих в одном или более из следующих субстратов: жиры, включая свиной жир, твёрдый животный жир и молочный жир; масла, включая масла, экстрагированные из или полученные из пальмового масла, подсолнечного масла, соевого масла, сафлорового масла, хлопкового масла, арахисового масла, кукурузного масла, оливкового масла, орехового масла, кокосового масла и рапсового масла. Лецитин из сои, семян рапса или яичного желтка также представляет собой подходящий липидный субстрат. Липидный субстрат может представлять собой овсяный липид или другой материал растительного происхождения, содержащий галактолипиды.

В одном аспекте донор липидного ацила представляет собой предпочтительно лецитин (такой как фосфатидилхолин) в яичном желтке.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, которые имеют длину цепи жирной кислоты от 8 до 22 атомов углерода.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, которые имеют длину цепи жирной кислоты от 16 до 22 атомов углерода, более предпочтительно от 16 до 20 атомов углерода.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, которые имеют длину цепи жирной кислоты не больше чем 14 атомов углерода, предпочтительно из липидов,

- 7 018153 которые имеют длину цепи жирной кислоты от 4 до 14 атомов углерода, более подходяще от 4 до 10 атомов углерода, более подходяще от 4 до 8 атомов углерода.

Соответственно, липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может проявлять одну или большее количество из следующих активностей липазы: гликолипазная активность (Е.С. 3.1.1.26), триацилглицеринлипазная активность (Е.С. 3.1.1.3), фосфолипазная А2 активность (Е.С. 3.1.1.4) или фосфолипазная А1 активность (Е.С. 3.1.1.32). Термин гликолипазная активность, как использовано в данном описании, охватывает галактолипазную активность.

Соответственно, липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может проявлять по крайней мере одну или большее количество из следующих активностей: гликолипазная активность (Е.С. 3.1.1.26), и/или фосфолипазная А1 активность (Е.С. 3.1.1.32), и/или фосфолипазная А2 активность (Е.С. 3.1.1.4).

Для некоторых аспектов липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может проявлять, по крайней мере, гликолипазную активность (Е.С. 3.1.1.26).

Соответственно, для некоторых аспектов липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может быть способна переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к одному или большему количеству следующих акцепторных субстратов: стерол, станол, углевод, белок, глицерин.

Для некоторых аспектов предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением способна переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к стеролу и/или станолу с образованием, по крайней мере, сложного эфира стерола и/или сложного эфира станола.

Для некоторых аспектов предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением способна переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к углеводу с образованием, по крайней мере, сложного эфира углевода.

Для некоторых аспектов предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением способна переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к белку с образованием, по крайней мере, сложного эфира белка (или продукта реакции конденсации белка и жирной кислоты).

Для некоторых аспектов предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением способна переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к глицерину с образованием, по крайней мере, диглицерида и/или моноглицерида.

В одном варианте воплощения акцептор ацила представляет собой глицерин. Г лицерин естественно может содержаться в продукте питания и/или пищевом материале, который включает донор ацила (т.е. например, фосфолипид) - таком как молочный жир, молоко или, например, сливки. Альтернативно, глицерин может быть добавлен к пищевому продукту и/или пищевому материалу, который включает донор ацила (т.е., например, фосфолипид) - такому как молочный жир, молоко или, например, сливки - или перед, в течение или после добавления фермента липидацилтрансферазы.

Для некоторых аспектов предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением не проявляет триацилглицеринлипазной активности (Е.С. 3.1.1.3) или значительной триацилглицеринлипазной активности (Е.С. 3.1.1.3).

В некоторых аспектах липидацилтрансфераза может быть способна переносить ацильную группу от липида к стеролу и/или станолу. Таким образом, в одном варианте воплощения акцептор ацила в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой или стерол, или станол, или комбинацию обоих стерола и станола.

В одном варианте воплощения соответственно стерол и/или станол может содержать одну или большее количество из следующих структурных особенностей:

ί) 3-β гидроксигруппа или 3а-гидроксигруппа; и/или

и) А:В кольца в цис-положении или А:В кольца в транс-положении или С₅-С₆ является ненасыщенным.

Подходящие стерольные акцепторы ацила включают холестерин и фитостеролы, например αситостерол, β-ситостерол, стигмастерол, эргостерол, кампестерол, 5,6-дигидростерол, брассикастерол, αспинастерол, β-спинастерол, γ-спинастерол, δ-спинастерол, фукостерол, димостерол, аскостерол, серебистерол, эпистерол, анастерол, гипостерол, хондрилластерол, десмостерол, чалиностерол, пориферастерол, клионастерол, стеролгликозиды, и другие природные или синтетические изомерные формы и производные.

В одном аспекте настоящего изобретения, соответственно, более чем один стерол и/или станол может действовать как акцептор ацила, соответственно, более чем два стерола и/или станола могут действовать как акцептор ацила. Другими словами, в одном аспекте настоящего изобретения, соответственно, может быть произведён более чем один сложный эфир стерола и/или сложный эфир станола. Соответственно, когда холестерин представляет собой акцептор ацила, один или больше дополнительных стеролов или один или больше станолов могут также действовать как акцептор ацила. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ίη Чш получения обоих сложного эфира холестери

- 8 018153 на и по крайней мере одного сложного эфира стерола или станола в комбинации. Другими словами, липидацилтрансфераза для некоторых аспектов настоящего изобретения может переносить ацильную группу от липида к обоим холестерину и по крайней мере одному дополнительному стеролу и/или по крайней мере одному станолу.

В одном аспекте предпочтительно стерольный акцептор ацила представляет собой один или больше из следующих: α-ситостерол, β-ситостерол, стигмастерол, эргостирол и кампестерол.

В одном аспекте предпочтительно стерольный акцептор ацила представляет собой холестерин. В случае, когда холестерин представляет собой акцептор ацила для липидацилтрансферазы, количество свободного холестерина в продукте питания снижается в сравнении с пищевым продуктом до подвергания действию липидацилтрансферазы и/или в сравнении с эквивалентным пищевым продуктом, который не был обработан с помощью липидацилтрансферазы.

Преимущественно предпочтительно уровень холестерина в продукте питания (например, молочном продукте, таком как, например, сыр, молоко, сливки, масло или мороженое) снижается в сравнении с контрольным пищевым продуктом (например, молочным продуктом, таким как, например, сыр, молоко, сливки, масло или мороженое), например, таким, который не был обработан с помощью липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением).

В другом варианте воплощения акцептор ацила представляет собой холестерин. Холестерин естественно может содержаться в продукте питания и/или пищевом материале, который включает донор ацила (т.е. например, фосфолипид), таком как, например, молочный жир, молоко или сливки. Альтернативно, холестерин может быть добавлен к пищевому продукту и/или пищевому материалу, который включает донор ацила (т.е. например, фосфолипид), такому как, например, молочный жир, молоко или сливки, или перед, в течение или после добавления фермента липидацилтрансферазы.

Подходящие станольные акцепторы ацила включают фитостанолы, например β-ситостанол или 55ситостанол.

В одном аспекте предпочтительно стерольный и/или станольный акцептор ацила представляет собой другой стерол и/или станол, чем холестерин.

В некоторых аспектах пищевой продукт, приготовленный в соответствии с настоящим изобретением, может быть использован для снижения уровня холестерина в сыворотке крови и/или для снижения уровня липобелка низкой плотности. Уровень холестерина в сыворотке крови и уровень липобелков низкой плотности оба связаны с определёнными болезнями у людей, такими как, например, атеросклероз и/или заболевание сердца. Таким образом, предполагают, что пищевые продукты, приготовленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для снижения риска таких заболеваний.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает использование пищевого продукта в соответствии с настоящим изобретением для применения в лечении и/или профилактике атеросклероза и/или заболевания сердца.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает лекарственное средство, содержащее пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения и/или профилактики заболевания у человека или пациента - животного, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества пищевого продукта в соответствии с настоящим изобретением.

Соответственно, стерольный и/или станольный акцептор ацила может быть естественно найден в продукте питания. Альтернативно, стерол и/или станол может быть добавлен к пищевому продукту. В случае, когда стерол и/или станол добавляют к пищевому продукту, стерол и/или станол может быть добавлен перед, одновременно с и/или после добавления липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением. Соответственно, настоящее изобретение может охватывать добавление экзогенных стеролов/станолов, в особенности фитостеролов/фитостанолов, к пищевому продукту перед или одновременно с добавлением фермента в соответствии с настоящим изобретением.

Для некоторых аспектов один или больше стеролов, присутствующих в продукте питания, может быть превращено один или больше станолов перед или одновременно с добавлением липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением.

Может быть использован любой подходящий способ для превращения стеролов в станолы. Например, указанное превращение может быть проведено с помощью, к примеру, химического гидрогенирования. Указанное превращение может быть проведено перед добавлением липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением или одновременно с добавлением липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением. Соответственно, ферменты для превращения стерола в станолы описаны в АО 00/061771.

Соответственно, настоящее изобретение может быть использовано для получения сложных эфиров фитостанола ίη 5йи в продукте питания. Сложные эфиры фитостанола имеют повышенную растворимость для прохождения через липидные мембраны, биодоступность и повышенную полезность для здоровья (см., например, АО 92/99640).

- 9 018153

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения сложный эфир станола и/или сложный эфир стерола может представлять собой ароматизатор и/или текстуризатор. В таких случаях настоящее изобретение охватывает ίη 8Йи получение ароматизаторов и/или текстуризаторов.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может использовать углевод в качестве акцептора ацила. Углеводный акцептор ацила может представлять собой один или больше из следующих: моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид. Предпочтительно указанный углевод представляет собой один или больше из следующих: глюкоза, фруктоза, ангидрофруктоза, мальтоза, лактоза, сахароза, галактоза, ксилоза, ксилоолигосахариды, арабиноза, мальтоолигосахариды, тагатоза, микротецин, аскопирон Р, аскопирон Т, кортальцерон.

Соответственно, углеводный акцептор ацила может быть найден естественно в продукте питания. Альтернативно, указанный углевод может быть добавлен к пищевому продукту. В случае, когда указанный углевод добавляют к пищевому продукту, этот углевод может быть добавлен перед, одновременно с и/или после добавления липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением.

Сложные эфиры углевода могут функционировать как ценные эмульгаторы в пищевых продуктах. Таким образом, в случае, когда фермент работает для переноса ацильной группы к сахару, данное изобретение охватывает получение второго ίη δίΐιι эмульгатора в продукте питания.

В некоторых вариантах воплощения липидацилтрансфераза может использовать как стерол и/или станол, так и углевод в качестве акцептора ацила.

Применение липидацилтрансферазы, которая может переносить ацильную группу к углеводу, а также к стеролу и/или станолу, является в особенности предпочтительным для пищевых продуктов, содержащих яйца. В частности, присутствие сахаров, в частности глюкозы, в яйцах и яичных продуктах часто считается неблагоприятным. Яичный желток может включать до 1% глюкозы. Как правило, яйца или продукты на основе яиц могут быть обработаны с помощью оксидазы глюкозы для удаления некоторого количества или всей этой глюкозы. Однако в соответствии с настоящим изобретением этот нежелательный сахар может быть легко удалён путём эстерифицирования сахара с образованием сложного эфира сахара.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может использовать белок в качестве акцептора ацила. Соответственно, этот белок может представлять собой один или больше из белков, найденных в пищевом продукте, например в молочном продукте и/или мясном продукте. Только для примера, подходящие белки могут представлять собой те, что найдены в твороге или сыворотке, такие как лактоглобулин. Другие подходящие белки включают овальбумин из яиц, глиадин, глютенин, пуроиндолин, переносящие липиды белки из зерновых и миозин из мяса.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением могут быть достигнуты одно или больше из следующих предпочтительных свойств: ίη δίΐιι получение эмульгатора без повышения в количестве свободных жирных кислот; уменьшение в накоплении свободных жирных кислот в продукте питания; уменьшение в уровнях свободного холестерина в продукте питания; повышение в количестве сложных эфиров стерола и/или сложных эфиров станола; уменьшение в количестве холестерина в сыворотке крови и/или липобелков низкой плотности; повышение в количестве сложных эфиров углевода; уменьшение в количестве нежелательных свободных углеводов.

Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что эмульгатор(ы) получают ίη δίΐιι в продукте питания без повышения, или существенного повышения, содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте. Получение свободных жирных кислот может быть вредным для пищевых продуктов. В частности, свободные жирные кислоты могут быть связаны с неприятным запахом и/или вкусом в пищевых продуктах, а также другими вредными эффектами, включая, например, мыльный привкус в сыре. Предпочтительно способ в соответствии с настоящим изобретением приводит к ίη δίΐιι получению эмульгатора(ов), в котором(ых) накопление свободных жирных кислот снижается и/или устраняется. Не желая связываться теорией, в соответствии с настоящим изобретением жирную кислоту, которую удаляют из липида, переносят с помощью липидацилтрансферазы к акцептору ацила, например стеролу и/или станолу. Таким образом, общий уровень свободных жирных кислот в продукте питания не повышается или повышается только до незначительной степени. В этом и состоит чёткое противопоставление ситуации, когда липазы (Е.С. 3.1.1.x) используют для получения эмульгаторов ίη δίΐιι. В частности, применение липаз может приводить к повышенному количеству свободной жирной кислоты в продукте питания, которое может быть вредным. В соответствии с настоящим изобретением накопление свободных жирных кислот снижают и/или устраняют в сравнении с количеством свободных жирных кислот, которое накопилось бы при использовании липазного фермента, в частности фосфолипазного А фермента вместо липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением.

Применение липидацилтрансферазы, которая может переносить ацильную группу к стеролу и/или станолу, может быть в особенности предпочтительным для пищевых продуктов, содержащих яйца. В частности, было найдено, что продукт на основе яиц со значительно улучшенными свойствами может быть получен после обработки с помощью липидацилтрансферазы, как определено в данном описании, по сравнению с продуктами на основе яиц, обработанными с помощью традиционных фосфолипаз, таких

- 10 018153 как, для примера, Ырорап Р® (Νονοζνιηοδ А/8, Эсптагк)). Ьесйаке ИНга® (Nονοζуте8 А/8, Эсптагк) или Ыротоб 22 Ь от Вюса1а1у818.

В другом аспекте акцептор ацила может представлять собой аскорбиновую кислоту или включает аскорбиновую кислоту. Поэтому аскорбиновая кислота может быть добавлена к пищевому продукту и/или пищевому материалу или водной эмульсии возможно в комбинации с подходящим уровнем глицерина и необязательно стерола/станолов. Сложный эфир аскорбиновой кислоты представляет собой антиоксидант. Применение аскорбиновой кислоты может быть особенно предпочтительным при использовании в продукте питания, так как антиоксидантные свойства могут действовать как консервант, например, для предотвращения или снижения окисления липидов. Таким образом, применение аскорбиновой кислоты в продукте питания и/или пищевом материале настоящего изобретения может предотвращать или снижать прогоркание в модифицированном пищевом продукте и/или пищевом материале. Поэтому применение аскорбиновой кислоты может быть в особенности полезным для использования в молочных продуктах, в которых прогоркание может быть проблемой, например в сыре. Количество добавляемой аскорбиновой кислоты может быть очень низким, например на уровне до 1/5, так, например, до 1/10 или до 1/100 количеств, рекомендованных для добавления глицерина, как определено в данном описании. Предпочтительно интервал аскорбиновой кислоты должен был бы составлять 0,02-0,5 мас.%. В предпочтительном варианте воплощения аскорбиновую кислоту добавляют в форме аскорбилпальмитата, например, для применения в качестве антиоксиданта в масле, и дозировка составляет предпочтительно от 0,1 до 0,2 мас.%, что соответствует предпочтительно от 0,04 до 0,08 мас.% аскорбиновой кислоты.

В предпочтительном варианте воплощения модифицированный пищевой продукт и/или пищевой материал, обработанный в соответствии с настоящим изобретением, включает лизофосфолипид, предпочтительно лизолецитин, предпочтительно пищевой продукт и/или пищевой материал, обработанный в соответствии с настоящим изобретением, включает по крайней мере 0,001 мас.%, например 0,005 мас.%, включая по крайней мере 0,01 мас.% лизофосфолипида, предпочтительно лизолецитина, более предпочтительно по крайней мере 0,05 мас.% или по крайней мере 0,1 мас.%), лизофосфолипида, предпочтительно лизолецитина. Также представляются возможными более высокие концентрации лизофосфолипида, предпочтительно лизолецитина, например по крайней мере 0,5 мас.% или по крайней мере 1 мас.% лизофосфолипида, предпочтительно лизолецитина, включая по крайней мере 2 мас.% или по крайней мере 5% лизофосфолипида, предпочтительно лизолецитина.

В предпочтительном варианте воплощения пищевой продукт и/или пищевой материал, обработанный в соответствии с настоящим изобретением, включает один или больше из следующих составляющих: глицерофосфатилхолин/фосфатилэтаноламин фосфатилинозитол и фосфатилсерин, предпочтительно пищевой продукт и/или пищевой материал, обработанный в соответствии с настоящим изобретением, включает по крайней мере 0,001 мас.% одной или больше из следующих составляющих: глицерофосфатилхолин/фосфатилэтаноламин фосфатилинозитол и фосфатилсерин, например 0,005 мас.%, включая по крайней мере 0,01 мас.%, более предпочтительно по крайней мере 0,05 мас.% или по крайней мере 0,1 мас.%, одной или больше из следующих составляющих: глицерофосфатилхолин/фосфатилэтаноламин фосфатилинозитол и фосфатилсерин. Также допускаются более высокие концентрации одной или больше из следующих составляющих: глицерофосфатил-холин/фосфатилэтаноламин фосфатилинозитол и фосфатилсерин, например по крайней мере 0,5 мас.% или по крайней мере 1 мас.%, включая по крайней мере 2 мас.% или по крайней мере 5%.

Считается предпочтительным, когда модифицированный пищевой продукт и/или пищевой материал, описанный в абзаце выше, включает глицерофосфатилхолин.

Когда модифицированный пищевой продукт и/или пищевой материал включает глицерофосфатилхолин, модифицированный пищевой продукт и/или пищевой материал может включать меньше чем 0,001 мас.% лизофосфолипида, например лизолецитина. Он может включать меньше чем 0,0005 мас.% лизофосфолипида, включая вариант воплощения, в котором модифицированный пищевой продукт и/или пищевой материал не включает никакого лизофосфолипида.

В предпочтительном варианте воплощения модифицированный пищевой продукт и/или пищевой материал включает по крайней мере 0,001 мас.% моноглицерида, например 0,005 мас.%, включая по крайней мере 0,01 мас.% моноглицерида, более предпочтительно по крайней мере 0,05 мас.% моноглицерида или по крайней мере 0,1 мас.% моноглицерида. Также допускаются более высокие концентрации моноглицерида, например по крайней мере 0,5 мас.% моноглицерида или по крайней мере 1 мас.% моноглицерида, включая по крайней мере 2 мас.% моноглицерида или по крайней мере 5% моноглицерида.

В предпочтительном варианте воплощения модифицированный пищевой продукт и/или пищевой материал включает по крайней мере 0,001 мас.% сложного эфира стерола, например 0,005 мас.%, включая по крайней мере 0,01 мас.% сложного эфира стерола, более предпочтительно по крайней мере 0,05 мас.% сложного эфира стерола или по крайней мере 0,1 мас.% сложного эфира стерола. Также предусматриваются более высокие концентрации сложного эфира стерола, например по крайней мере 0,5 мас.% сложного эфира стерола.

В одном варианте воплощения, т.е. в случае, когда акцептор ацила представляет собой, например, глицерин, функциональный ингредиент настоящего изобретения получают с помощью реакции, которую

- 11 018153 выбирают из спиртового гидролиза, предпочтительно глицеринолиза.

Предпочтительная температура для модификации пищевого продукта и/или пищевого материала в соответствии со способами настоящего изобретения может зависеть от нескольких факторов, включая оптимальную температуру и стабильность используемого фермента, точку плавления и вязкость пищевого продукта и/или пищевого материала, объём пищевого продукта и/или пищевого материала, который необходимо модифицировать, термостойкость пищевого продукта и/или пищевого материала.

Например, в одном варианте воплощения ферментная модификация может происходить в температурном интервале 10-70°С, например от 10 до 32°С или от 10 до 34°С, включая температурный интервал 10-20°С, более предпочтительно интервал 20-60°С, например интервал 30-60°С или 36-60°С, например 37-60°С, включая интервал 40-60°С.

Для ферментной модификации фермента молока и/или сливок, например, можно предпочтительно использовать температуру меньше чем, к примеру, приблизительно 50°С, например от приблизительно 10 до 34°С, или, к примеру, в температурном интервале приблизительно 36-49°С, или, например, в температурном интервале приблизительно 40-49°С, или, например, в интервале приблизительно от 40 до 45°С, или, например, в интервале приблизительно 45-49°С. Могут быть использованы подходящие температуры, например, в интервале 20-50°С, к примеру, в температурном интервале 30-40°С.

В некоторых вариантах воплощения преимущество применения липидацилтрансферазы, раскрытой в настоящем изобретении, может заключаться в том, что она имеет высокую температурную стабильность и поэтому может быть использована в обработке пищевого продукта и/или пищевого материала при температуре, когда вязкость указанного пищевого продукта и/или пищевого материала низкая. Высокая температурная стабильность также может позволить использовать более низкие дозировки фермента, которые необходимо использовать.

Соответственно, для некоторых вариантов воплощения липидацилтрансфераза может иметь оптимальную температуру в интервале, к примеру, от приблизительно 50 до приблизительно 70°С. Соответственно, для некоторых вариантов воплощения липидацилтрансфераза может иметь температурную стабильность, которую измеряют, используя РЬИ анализ, где указанная ацилтрансфераза сохраняет по крайней мере приблизительно 25%, например по крайней мере приблизительно 50% своей активности через 1 ч при 55°С.

Способ для обработки пищевого продукта и/или пищевого материала в соответствии с данным изобретением можно проводить в течение любого подходящего периода времени. Это может зависеть, например, от используемой температуры и дозировки фермента. Только в качестве примера период времени может составлять от приблизительно 1 мин до приблизительно 4 ч, например от приблизительно 5 мин до приблизительно 2 ч, или от приблизительно 10 мин до приблизительно 1 ч, или от приблизительно 5 до приблизительно 30 мин, или от приблизительно 1 до приблизительно 29 мин, или от приблизительно 31 до приблизительно 60 мин. Соответственно, период времени может составлять от приблизительно 5 мин до 1 ч.

Дозировка фермента может составлять любую подходящую дозировку, например дозировка фермента при добавлении в показателях РЬИ активности может находиться в интервале приблизительно 110000 РЬИ/кг пищевого продукта и/или пищевого материала, например в интервале 5-5000 РЬИ/кг пищевого продукта и/или пищевого материала, например в интервале 100-1000 РЬИ/кг пищевого продукта и/или пищевого материала или от 1000 до 3000 РЬИ/кг пищевого продукта и/или пищевого материала. В некоторых вариантах воплощения для липидацилтрансферазы может быть предпочтительно от 50 до 1000 РЬИ/кг пищевого продукта и/или пищевого материала.

Предпочтительно, когда фермент липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может быть охарактеризован при использовании следующих критериев: (ί) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса сложного эфира, посредством чего ацильная часть исходной связи сложного эфира донора липидного ацила переносится на акцептор ацила, с образованием нового сложного эфира; и (и) фермент включает аминокислотный мотив СЭ8Х, где X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Η, О, Т, Ν, М или 8.

Предпочтительно, когда X мотива СЭ8Х представляет собой Ь или Υ. Более предпочтительно, когда X мотива СЭ8Х представляет собой Ь. Таким образом, предпочтительно фермент в соответствии с настоящим изобретением включает аминокислотный мотив СЭ8Ь.

СЭ8Х мотив состоит из четырех консервативных аминокислот. Предпочтительно, когда серин в мотиве представляет собой серин фермента липидацилтрансферазы. Предпочтительно, когда серин мотива СЭ8Х может находиться в положении, соответствующем 8ег-16 в ферменте липидацилтрансферазы Аетошоиак йубторШа, как описывается у ВтишИк & Виск1еу (1оигиа1 οί Вас1етю1оду Арг. 1996, т. 178, № 7, стр. 2060-2064).

Для определения того, что белок имеет мотив СЭ8Х в соответствии с настоящим изобретением, последовательность предпочтительно сравнивают с профилями скрытой модели Маркова (НММ профили) базы данных рίат.

Рίат представляет собой базу данных семейств белковых доменов. Рίат содержит организованные

- 12 018153 выравнивания множества последовательностей для каждого семейства, также как профили скрытых моделей Маркова (НММ профили) для идентификации этих доменов в новых последовательностях. Введение в РГат может быть найдено в Ба!ешап А. е! а1. (2002) ^иеЫе АсИз Кез. 30; 276-280. Скрытые модели Маркова используют в целом ряде баз данных, которые направлены на классификацию белков, см. обзор Ба!ешап А. и Най И.Н. (2002) ВпеГ ВютГогш 3; 236-245.

11йц://удууу.псЫ.п1т.пЙ!.еоу/еп1ге2/диегу.£сд1?стй=Ке1пеуе&с1Ь=РиЬМей&1181и1Й8^:= 12230

032&άορΐ=АЬз!гас1

Ьйр://лууууу.псЫ.п1т.тЬ.доу/еп1тег/диегу.1сд1?ст0=Ке1пеуе&(1Ь^:=РиЬМе(1&1151 иИз= 11752

314&άορΐ=АЬзйас!

За детальными объяснениями скрытых моделей Маркова и того, как они применяются в РГат базе данных, обращайтесь к ИигЫп К., Еййу 8. и КгодН А. (1998) В1о1од1са1 зедиепсе апа1уз1з; ргоЬаЬШзйс тойе1з оГ рго!етз апй писЫс асИз. СатЬпйде Ишуегзйу Ргезз, Ι8ΒΝ 0-521-62041-4. Программное обеспечение Наттег может быть получено в \Уаз1гпд1оп Ишуегзйу, 8ΐ Бошз, И8А.

Альтернативно, мотив ΟΌ8Χ может быть идентифицирован, используя программное обеспечение Наттег, инструкции представлены в ИигЬт К., Еййу 8. и КгодН А. (1998) Вю1од1са1 зедиепсе апа1уз1з; ргоЬаЬШзйс тойе1з оГ рго!етз апй писЫс асИз. СатЬгИде Ишуегзйу Ргезз, I8ΒN 0-521-62041-4 и в ссылках в нём, и НММЕК2 профиле, представленном в этом описании.

Доступ к РГАМ базе данных можно получить, например, через несколько серверов, которые в настоящее время находятся на следующих веб-сайтах.

йЦр ://уууау. запеег.ас.ик/8оЙууаге/РГат/1пйех, зЫт!

ййр://рГат.\¥из11.ейи/ ййр://р£ат.1Оиу.тга.Гг/

Ьйр://рГат.сдЬ.к1.зе/

Указанная база данных предлагает возможность поиска, где каждый может ввести белковую последовательность. Используя параметры базы данных по умолчанию, белковая последовательность далее будет проанализирована на присутствие РГат доменов. ΟΌ8Χ домен представляет собой установленный домен в базе данных и как такой его присутствие в любой последовательности запроса будет распознано. База данных будет выдавать выравнивание РГат00657 консенсусной последовательности с последовательностью запроса.

Множественное выравнивание, включая Аеготопаз за1тошсИа или Аеготопаз НуйгорИ1а, может быть получено следующим способом:

a) вручную получают выравнивание белка, который представляет интерес, с РГат00657 консенсусной последовательностью и получают выравнивание Р10480 с РГат00657 консенсусной последовательностью, следуя процедуре, описанной выше;

или

b) с помощью базы данных.

После идентификации РГат00657 консенсусной последовательности, база данных предлагает опцию - показать выравнивание последовательности запроса к начальному выравниванию РГат00657 консенсусной последовательности. Р10480 представляет собой часть этого начального выравнивания и показано с помощью ОСАТ_АЕКНУ. Как последовательность запроса, так и Р10480 будут показаны в одном окне.

Аеготопаз НуйгорЫ1а стандартная последовательность.

Остатки Аеготопаз НуйгорШа ΟΌ8Χ липазы нумеруют в NСΒI файле Р10480, номера в этом тексте относятся к номерам, представленным в этом файле, который в настоящем изобретении используют для определения специфических остатков аминокислот, которые в предпочтительном варианте воплощения присутствуют в липидацилтрансферазных ферментах данного изобретения.

Представлено РГат выравнивание (фиг. 33 и 34).

Следующие консервативные остатки могут быть распознаны и в предпочтительном варианте воплощения могут присутствовать в ферментах для применения в композициях и способах настоящего изобретения;

- 13 018153

Блок 1 - ΟϋδΧ блок

Ыб Ыб Ыб Ыб СНу Азр 8ег Ыб

29 30 31 32 33 34 35

Блок 2 - ΟΑΝϋΥ блок

Ыб О1у Ыб Азп Азр Ыб

130 131 132 133 134 135

Блок 3 - НРТ блок

ΗΪ8

309 где Ыб означает гидрофобный остаток, выбранный из Ме1, 11е, Ьеи, Уа1, А1а, О1у, Суз, ΗΪ8, Ьуз, Тгр, Туг, Рйе.

Предпочтительно липидацилтрансферазный фермент для использования в композициях/способах данного изобретения может быть выровнен, используя Р1ат00657 консенсусную последовательность.

Предпочтительно, когда позитивное соответствие профилю скрытой модели Маркова (НММ профиль) семейства домена р!ат00657 свидетельствует о присутствии ΘΏ8Τ или ΘΏ8Χ домена в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно, когда выровненная с Р1ат00657 консенсусной последовательностью липидацилтрансфераза для использования в композициях/способах в соответствии с изобретением будет иметь по крайней мере один, предпочтительно более чем один, предпочтительно более двух из следующих: ΘΏδχ блок, ΘΑΝΏΥ блок, НРТ блок.

Предпочтительно липидацилтрансфераза может иметь ΘΏδχ блок и ΘΑΝΏΥ блок. Альтернативно, фермент может иметь ΘΏδχ блок и НРТ блок. Предпочтительно, когда фермент включает по крайней мере ΘΏδχ блок.

Предпочтительно, когда остатки ΘΑΝΏΥ мотива выбирают из ΘΑΝΏΥ, ΘΘΝΏΑ, (.ι(.ι\Ι)Ι,, более предпочтительно ΘΑΝΏΥ.

Предпочтительно, когда выровненный с Р1ат00657 консенсусной последовательностью фермент для использования в композициях/способах в соответствии с настоящим изобретением имеет по крайней мере одну, предпочтительно более одной, предпочтительно более двух, предпочтительно более трех, предпочтительно более четырех, предпочтительно более пяти, предпочтительно более шести, предпочтительно более семи, предпочтительно более восьми, предпочтительно более девяти, предпочтительно более десяти, предпочтительно более одиннадцати, предпочтительно более двенадцати, предпочтительно более тринадцати, предпочтительно более четырнадцати следующих аминокислотных остатков при сравнении со стандартной полипептидной последовательностью Α. йубгорЫНа, в частности, 8ЕС) II) Νο. 32: 28Ыб, 29Ыб, 30Ыб, 31Ыб, 32§1у, 33Α3ρ, 348ег, 35Ыб, 130Ыб, 131О1у, 132Ыб, 133Α3η, 134Α3ρ, 135Ыб, 309Η13.

Домен р!ат00657 ΘΏ8Χ представляет собой уникальный идентификатор, который отличает белки, обладающие этим доменом, от других ферментов.

р!ат00657 консенсусная последовательность представлена на фиг. 1 как 8ЕР ΙΌ Νο. 1. Она получена путем идентификации р!ат семейства 00657, версии базы данных 6, которая также называется как р!ат00657.6 в данной заявке.

Консенсусная последовательность может быть обновлена при использовании последующих выпусков р!ат базы данных.

Например, на фиг. 33 и 34 показано р!ат выравнивание семейства 00657 из версии базы данных 11, которое также может называться как р!ат00657.11 в данной заявке.

Присутствие ΘΏδχ, ΘΑΝΏΥ и НРТ блоков найдено в р!ат семействе 00657 из обоих выпусков базы данных. Будущие выпуски базы данных могут использоваться для идентификации р!ат семейства 00657.

Предпочтительно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением может быть охарактеризован, используя следующие критерии:

(ΐ) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса сложного эфира, посредством чего ацильная часть связи исходного сложного эфира донора липидного ацила переносится на акцептор ацила, с образованием нового сложного эфира;

(ΐΐ) фермент включает аминокислотный мотив ΘΏ8Χ, где X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков Е, А, V, I, Р, Υ, Η, ЕЕ Т, Ν, М или 8;

(ΐΐΐ) фермент включает ΗΪ3-309 или включает остаток гистидина в положении, соответствующем

- 14 018153

Ηίκ-309 в липолитическом ферменте Аеготопак НубгорНПа, показанном на фиг. 2 (8ЕО ГО Νο. 2 или 8Е0 ГО Νο. 32).

Предпочтительно аминокислотный остаток ΟΌ8Χ мотива представляет собой Ь.

В 8Е0 ГО Νο. 2 или 8Е0 ГО Νο. 32 первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. Ηίκ-309 последовательности полной длины, т.е. белка, включающего сигнальную последовательность, приравнивается к Ηίκ-291 зрелой части белка, т.е. последовательности, не содержащей сигнальной последовательности.

Предпочтительно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением включает следующую каталитическую триаду: 8ег-34, Акр-306 и Ηίκ-309 или включает остаток серина, остаток аспарагиновой кислоты и остаток гистидина, соответственно, в положениях, соответствующих 8ег-34, Акр-306 и Ηίκ-309 в липолитическом ферменте Аеготопак НубгорНПа, показанном на фиг. 2 (8Е0 ГО №. 2) или фиг. 28 (8Е0 ГО №. 32). Как указано выше, в последовательности, показанной в 8Е0 ГО №. 2 или 8Е0 ГО №. 32, первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. 8ег-34, Акр-306 и Ηίκ-309 последовательности полной длины, т.е. белка, включающего сигнальную последовательность, приравнивается к 8ег-16, Акр-288 и И|к-291 зрелой части белка, то есть последовательности, не содержащей сигнальной последовательности. В р£ат00657 консенсусной последовательности, как представлено на фиг. 1 (8Е0 ГО №. 1), остатки активного сайта соответствуют 8ег-7, Акр345 и Шк-348.

Предпочтительно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением может быть охарактеризован при использовании следующих критериев: (ί) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса сложного эфира, посредством чего ацильная часть исходной связи сложного эфира первого донора липидного ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового сложного эфира; и (ίί) фермент включает, по крайней мере, С1у-32, Акр-33, 8ег-34, Акр-306 и И1к-309 или включает остатки глицина, аспарагиновой кислоты, серина, аспарагиновой кислоты и гистидина в положениях, соответствующих С1у-32, Акр-33, 8ег-34, Акр-306 и Шк-309, соответственно, в липолитическом ферменте Аеготопак НубгорНПа, представленном на фиг. 2 (№6) ГО №. 2) или фиг. 28 (№6) ГО №. 32).

Соответственно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно получается из организмов из одного или больше следующих семейств: Аеготопак, 81гер1отусек, 8ассНаготусек, Ьас1ососсик, МусоЬас1егшт, 81гер1ососсик, Ьас1оЬасШик, ОекиИПоЬасЮпит, ВасШик, Сатру1оЬас1ег, У1Ьгюпасеае, Ху1е11а, 8и1£о1оЬик, АкрегдШик, 8с1и/окассНаготусек, Ык1еПа, №1ккепа, МекогН|/оЫит, К,а1к1оша, ХапШотопак и Сапб1ба.

Соответственно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно получается из одного или больше из следующих организмов: Аеготопак НубгорНПа, Аеготопак ка1тошс1ба, 81гер1отусек сое1юо1ог, 81гер1отусек птокпк, МусоЬас1егшт, 81гер1ососсик руодепек, Ьас1ососсик 1асПк, 81гер1ососсик руодепек, 81гер1ососсик (НегторНПпк, Ьас1оЬасй1ик НекеОспк, Эекп1£ПоЬас1егшт беНа1одепапк, ВасШик кр, Сатру1оЬас1ег )е)иш, УШпопасеае, Ху1е11а ГакОбюка, 8и1£о1оЬик ко1£а1апсик, 8ассНаготусек сегеу1к1ае, АкрегдШик 1еггеик, БсЫхокассНаготусек ротЬе, Б1к1епа 1пиосиа, Ык1епа топосуЮдепек, №1ккепа тептдШШк, МекогН|/оЫпт 1оН, Ва1кЮша ко1апасеагит, Хапбютопак сатрекНгк, ХапШотопак ахопороб1к и Сапб1ба рагаркПоык.

В одном аспекте предпочтительно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно получается из одного или больше Аеготопак НубгорНПа или Аеготопак ка1тошс1ба.

Соответственно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением может кодироваться с помощью любой из следующих нуклеотидных последовательностей:

(a) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8Е0 ГО №. 7 (см. фиг. 9);

(b) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8Е0 ГО №. 8 (см. фиг. 10);

(c) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 9 (см. фиг. 11);

(б) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 10 (см. фиг. 12);

(е) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 11 (см. фиг. 13); (ί) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 13 (см. фиг. 15); (д) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 21 (см. фиг. 17);

(H) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 23 (см. фиг. 19); (ί) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 25 (см. фиг. 21); (ί) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 27 (см. фиг. 23);

(к) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 29 (см. фиг. 25);

(I) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 31 (см. фиг. 27);

(т) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 33 (см. фиг. 29);

(п) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 35 (см. фиг. 31. 95);

(о) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 46 (см.фиг. 95);

(р) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 75 (см. фиг. 87);

(с.|) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 77 (см. фиг. 89);

- 15 018153 (г) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8Ε0 ΙΌ Νο. 78 (см. фиг. 90);

(в) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 81 (см. фиг. 93); (ΐ) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 83 (см. фиг. 37);

(и) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 87 (см. фиг. 99); (ν) нуклеотидная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 88 (см. фиг. 100);

(к) или нуклеотидная последовательность, которая имеет 70% или большую, предпочтительно 75% или большую, идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 7, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 8, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 9, 8Ер ΙΌ Νο. 10, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 11, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 13, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 21, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 23, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 25, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 27, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 29, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 31, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 33, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 35, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 46, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 75, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 77, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 78, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 81, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 83, 5ΕΟ ΙΌ Νο.87, или 5ΕΟ ΙΌ Νο. 88.

Соответственно липидацилтрансфераза, кодируемая с помощью нуклеотидной последовательности любой из последовательностей, которые показаны как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 7, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 8, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 9, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 10, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 11, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 13, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 21, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 23, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 25, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 27, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 29, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 31, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 33, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 35, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 46, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 75, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 77, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 78, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 81, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 83, 8ΕΟ ΙΌ Νο.87, или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 88 или с помощью нуклеотидной последовательности, которая имеет 70% или большую, предпочтительно 75% или большую идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 7, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 8, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 9, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 10, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 11, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 13, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 21, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 23, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 25, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 27, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 29, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 31, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 33, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 35, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 46, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 75, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 77, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 78, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 81, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 83, 5ΕΟ ΙΌ Νο.87, или 5ΕΟ ΙΌ Νο. 88, может быть послетранскрипционно и/или послетрансляционно модифицирована.

Соответственно нуклеотидная последовательность может иметь 80% или большую, предпочтительно 85% или большую, более предпочтительно 90% или большую и даже более предпочтительно 95% или большую идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 7, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 8, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 9, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 10, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 11, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 13, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 21, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 23, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 25, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 27, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 29, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 31, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 33, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 35, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 46, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 75, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 77, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 78, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 81, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 83, 5ΕΟ ΙΌ Νο.87 или 5ΕΟ ΙΌ Νο. 88.

В одном варианте воплощения нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазный фермент для использования в способах и применениях настоящего изобретения, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая имеет 70% или большую, предпочтительно 75% или большую, идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 88, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 7, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 8, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 33 и 8ΕΟ ΙΌ Νο. 34. Соответственно нуклеотидная последовательность может иметь 80% или большую, предпочтительно 85% или большую, более предпочтительно 90% или большую и даже более предпочтительно 95% или большую идентичность с любой из последовательностей, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 88, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 7, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 8, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 33 и 8ΕΟ ΙΌ Νο. 34.

В одном варианте воплощения нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазный фермент для использования в способах и применениях настоящего изобретения, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая имеет 70%) или большую, 75%) или большую, 80% или большую, предпочтительно 85% или большую, более предпочтительно 90% или большую и даже более предпочтительно 95% или большую идентичность с последовательностью, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 88.

Соответственно, липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением может включать одну или больше из следующих аминокислотных последовательностей:

(ΐ) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 2 (см. фиг. 2); (ίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 3 (см. фиг. 3); (ΐΐΐ) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 4 (см. фиг. 4); (ίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 5 (см. фиг. 5); (ν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 6 (см. фиг. 6); (νί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 12 (см. фиг. 14); (νίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 20 (см. фиг. 16); (νίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 22 (фиг. 18); (ίχ) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 24 (фиг. 20);

(х) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 26 (фиг. 22); (χί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 28 (фиг. 24); (χίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 30 (фиг. 26); (χίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 32 (фиг. 28); (χίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 34 (фиг. 30); (χν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 62 (фиг. 74); (χνί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 90 (фиг. 102); или аминокислотная последовательность, которая имеет 75% или большую идентичность с любой из

- 16 018153 последовательностей, которые показаны как 8Εφ ΙΌ Νο. 2, 8Εφ ΙΌ Νο. 3, 8Εφ ΙΌ Νο. 4, 8Εφ ΙΌ Νο. 5, 8Εφ ΙΌ Νο. 6, 8Εφ ΙΌ Νο. 12, 8Εφ ΙΌ Νο. 20, 8Εφ ΙΌ Νο. 22, 8Εφ ΙΌ Νο. 24, 8Εφ ΙΌ Νο. 26, 8Εφ ΙΌ Νο. 28, 8Εφ ΙΌ Νο. 30, 8Εφ ΙΌ Νο. 32, 8Εφ ΙΌ Νο. 34, 8Εφ ΙΌ Νο. 62 или 8Εφ ΙΌ Νο. 90.

Соответственно, липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением может включать или аминокислотную последовательность, которая показана как 8Εφ ΙΌ Νο. 2, или как 8Εφ ΙΌ Νο. 3, или 8Εφ ΙΌ Νο. 32, или 8Εφ ΙΌ Νο. 34, или 8Εφ ΙΌ Νο. 62, или 8Εφ ΙΌ Νο. 90, или может включать аминокислотную последовательность, которая имеет 75% или большую, предпочтительно 80% или большую, предпочтительно 85% или большую, предпочтительно 90% или большую, предпочтительно 95% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, которая показана как 8Εφ ΙΌ Νο. 2, или аминокислотной последовательностью, которая показана как 8Εφ ΙΌ Νο. 3, или аминокислотной последовательностью, которая показана как 8Εφ ΙΌ Νο. 32, или аминокислотной последовательностью, которая показана как 8Εφ ΙΌ Νο. 34, или аминокислотной последовательностью, которая показана как 8Εφ ΙΌ Νο.62, или аминокислотной последовательностью, которая показана как 8Εφ ΙΌ Νο.90.

Для целей настоящего изобретения степень идентичности основывается на количестве элементов последовательности, которые являются одинаковыми. Степень идентичности в соответствии с настоящим изобретением для аминокислотных последовательностей может быть предпочтительно определена с помощью компьютерных программ, которые являются известными в области техники, например, таких как УссЮг ΝΤΙ 10 (ΙηνίΐΓο^βη Согр.). Для попарного выравнивания используемая оценка предпочтительно представляет собой ВЬО8ИМ62 со штрафом за внесение делеции в выравнивание 10,0 и со штрафом за продолжение делеции 0,1.

Соответственно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением включает аминокислотную последовательность, которая имеет 80% или большую, предпочтительно 85% или большую, более предпочтительно 90% или большую и даже более предпочтительно 95% или большую идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8Εφ ΙΌ Νο. 2, 8Εφ ΙΌ Νο. 3, 8Εφ ΙΌ Νο. 4, 8Εφ ΙΌ Νο. 5, 8Εφ ΙΌ Νο. 6, 8Εφ ΙΌ Νο. 12, 8Εφ ΙΌ Νο. 20, 8Εφ ΙΌ Νο. 22, 8Εφ ΙΌ Νο. 24, 8Εφ ΙΌ Νο. 26, 8Εφ ΙΌ Νο. 28, 8Εφ ΙΌ Νο. 30, 8Εφ ΙΌ Νο. 32, или 8Εφ ΙΌ Νο. 34.

Соответственно, липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением может включать одну или большее количество из 8Εφ ΙΌ Νο. 2, 8Εφ ΙΌ Νο. 3, 8Εφ ΙΌ Νο. 4, 8Εφ ΙΌ Νο. 5, 8Εφ ΙΌ Νο. 6, 8Εφ ΙΌ Νο. 12, 8Εφ ΙΌ Νο. 20, 8Εφ ΙΌ Νο. 22, 8Εφ ΙΌ Νο. 24, 8Εφ ΙΌ Νο. 26, 8Εφ ΙΌ Νο. 28, 8Εφ ΙΌ Νο. 30, 8Εφ ΙΌ Νο. 32, 8Εφ ΙΌ Νο. 34 или 8Εφ ΙΌ Νο. 62 перед проведением послетрансляционного модифицирования. Настоящее изобретение также охватывает применение липидацилтрансферазного фермента, который был послетрансляционно модифицирован, где исходно транслированный фермент или профермент включает одну или большее количество из 8Εφ ΙΌ Νο. 2, 8Εφ ΙΌ Νο. 3, 8Εφ ΙΌ Νο. 4, 8Εφ ΙΌ Νο. 5, 8Εφ ΙΌ Νο. 6, 8Εφ ΙΌ Νο. 12, 8Εφ ΙΌ Νο. 20, 8Εφ ΙΌ Νο. 22, 8Εφ ΙΌ Νο. 24, 8Εφ ΙΌ Νο. 26, 8Εφ ΙΌ Νο. 28, 8Εφ ΙΌ Νο. 30, 8Εφ ΙΌ Νο. 32, 8Εφ ΙΌ Νο. 34 или 8Εφ ΙΌ Νο. 62.

В одном варианте воплощения липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой фрагмент одной или большего количества из аминокислотных последовательностей 8Εφ ΙΌ Νο. 2, 8Εφ ΙΌ Νο. 3, 8Εφ ΙΌ Νο. 4, 8Εφ ΙΌ Νο. 5, 8Εφ ΙΌ Νο. 6, 8Εφ ΙΌ Νο. 12, 8Εφ ΙΌ Νο. 20, 8Εφ ΙΌ Νο. 22, 8Εφ ΙΌ Νο. 24, 8Εφ ΙΌ Νο. 26, 8Εφ ΙΌ Νο. 28, 8Εφ ΙΌ Νο. 30, 8Εφ ΙΌ Νο. 32, 8Εφ ΙΌ Νο. 34, 8Εφ ΙΌ Νο. 62 или 8Εφ ΙΌ Νο. 90. В одном варианте воплощения предпочтительно фрагмент аминокислотной последовательности имеет 70% или большую, предпочтительно 75% или большую идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8Εφ ΙΌ Νο. 2, 8Εφ ΙΌ Νο. 3, 8Εφ ΙΌ Νο. 4, 8Εφ ΙΌ Νο. 5, 8Εφ ΙΌ Νο. 6, 8Εφ ΙΌ Νο. 12, 8Εφ ΙΌ Νο. 20, 8Εφ ΙΌ Νο. 22, 8Εφ ΙΌ Νο. 24, 8Εφ ΙΌ Νο. 26, 8Εφ ΙΌ Νο. 28, 8Εφ ΙΌ Νο. 30, 8Εφ ΙΌ Νο. 32, 8Εφ ΙΌ Νο. 34, 8Εφ ΙΌ Νο. 62 или 8Εφ ΙΌ Νο. 90, при определении по всей последовательности, которая показана как 8Εφ ΙΌ Νο. 2, 8Εφ ΙΌ Νο. 3, 8Εφ ΙΌ Νο. 4, 8Εφ ΙΌ Νο. 5, 8Εφ ΙΌ Νο. 6, 8Εφ ΙΌ Νο. 12, 8Εφ ΙΌ Νο. 20, 8Εφ ΙΌ Νο. 22, 8Εφ ΙΌ Νο. 24, 8Εφ ΙΌ Νο. 26, 8Εφ ΙΌ Νο. 28, 8Εφ ΙΌ Νο. 30, 8Εφ ΙΌ Νο. 32, 8Εφ ΙΌ Νο. 34, 8Εφ ΙΌ Νο. 62 или 8Εφ ΙΌ Νο. 90 соответственно.

В одном варианте воплощения соответственно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением включает (или состоит из) аминокислотную последовательность, показанную в 8Εφ ΙΌ Νο. 90, или включает (или состоит из) аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 70%, по крайней мере 75%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%, по крайней мере 98% идентичность с 8Εφ ΙΌ Νο. 90.

Соответственно, липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением включает одну или больше из следующих аминокислотных последовательностей:

(a) аминокислотная последовательность, которая показана как аминокислотные остатки 1-100 8Εφ ΙΌ Νο. 2 или 8Εφ ΙΌ Νο. 32;

(b) аминокислотная последовательность, которая показана как аминокислотные остатки 101-200 5ΕΟ ΙΌ Νο. 2 или 8Εφ ΙΌ Νο. 32;

(c) аминокислотная последовательность, которая показана как аминокислотные остатки 201-300 8Εφ ΙΌ Νο. 2 или 8Εφ ΙΌ Νο. 32; или (ά) аминокислотная последовательность, которая имеет 75% или большую, предпочтительно 85%

- 17 018153 которая которая которая показана показана показана как как как аминокислотные аминокислотные аминокислотные остатки остатки остатки

126-136

163-175

304-311 или большую, более предпочтительно 90% или большую, даже более предпочтительно 95% или большую идентичность с любой из аминокислотных последовательностей, определённых в (а)-(с) выше.

(a) аминокислотная последовательность, которая показана как аминокислотные остатки 28-39 8ЕЦ ГО Ыо. 2 или БЕС) ГО Ыо. 32;

(b) аминокислотная последовательность, которая показана как аминокислотные остатки 77-88 8ЕЦ ГО Ыо. 2 или БЕС) ГО Ыо. 32;

(c) аминокислотная последовательность,

БЕС) ГО Ыо. 2 или БЕС) ГО Ыо. 32;

(ά) аминокислотная последовательность,

БЕС) ГО Ыо. 2 или БЕС) ГО Ыо. 32;

(е) аминокислотная последовательность, БЕЦ ГО Ыо. 2 или БЕЦ ГО Ыо. 32; или (ί) аминокислотная последовательность, которая имеет 75% или большую, предпочтительно 85% или большую, более предпочтительно 90% или большую, даже более предпочтительно 95% или большую идентичность с любой из аминокислотных последовательностей, определённых в (а)-(е) выше.

В одном аспекте липидацилтрансфераза для использования в способе и применениях настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу из СапйИа рагарШоык, как описано в ЕР 1275711. Таким образом, в одном аспекте липидацилтрансфераза для использования в способе и применениях настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую одну из аминокислотных последовательностей, описанных в БЕЦ ГО Ыо. 63 или БЕЦ ГО Ыо. 64.

Еще более предпочтительно, когда фермент липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, включающую аминокислотную последовательность, которая представлена как БЕЦ ГО Ыо. 62, или аминокислотную последовательность, которая показана как БЕЦ ГО Ыо. 90, или аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или большей, предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей, даже более предпочтительно 95% или большей, даже более предпочтительно 98% или большей, или даже более предпочтительно 99% или большей идентичностью с БЕЦ ГО Ыо. 62 или БЕЦ ГО Ыо. 90. Такой фермент может рассматриваться в качестве варианта фермента.

В одном аспекте липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением представляет собой лецитин:холестерин ацилтрансферазы (ЬСАТ) или их вариант (например, вариант, полученный с помощью молекулярной эволюции).

Приемлемые ЬСАТ являются известными в области техники и могут быть получены из одного или более следующих организмов, например млекопитающих, крыс, мышей, курей, ЭгокорНПа те1аподак!ег, растений, включая АаЫборык и Οπ'ζη кайуа, нематод, грибов и дрожжей.

В одном варианте воплощения фермент липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может являться липидацилтрансферазой, получаемой, предпочтительно полученной, из штаммов Е. сой ТОР 10, которые несут рРе112аАНуйго и рРе!12аА8а1то, депонированных ЭапЬсо А/8 ЬапдеЬгодайе 1, ΌΚ-1001 СорепНадеп К, Эептагк в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры при Национальной коллекции промышленных, морских и пищевых бактерий (ЫС1МВ) 23 8ΐ. МасЬаг Б1гееС АЬегйееп БсоБапТ СВ 22 декабря 2003 г. под депозитными номерами ЫС1МВ 41204 и ЫС1МВ 41205 соответственно.

Наиболее предпочтительно липидацилтрансферазы (в частности, фосфолипид-глицерин-ацилтрансфераза) для использования в способах настоящего изобретения включают те, которые выделяют из Аеготопак крр., предпочтительно Аеготопак НуйгорНПа или А. 8а1тошс1йа, наиболее предпочтительно А. 8а1тошс1йа. Наиболее предпочтительно липидацилтрансферазы для использования в настоящем изобретении кодируются с помощью одной из БЕЦ ГО Ыо. 2, 3, 32, 34, 62 или 90. При этом специалисту в данной области техники будет понятно, что является предпочтительным, когда сигнальные пептиды ацилтрансферазы были вырезаны во время экспрессии трансферазы. Сигнальный пептид последовательностей БЕЦ ГО Ыо. 2, 3, 32, 34, 62 и 90 представляет собой аминокислоты 1-18. Таким образом, наиболее предпочтительные участки представляют собой аминокислоты 19-335 для БЕЦ ГО Ыо. 32 и БЕЦ ГО Ыо. 2 (А. БуйгорЬШа) и аминокислоты 19-336 для БЕЦ ГО Ыо. 3, БЕЦ ГО Ыо. 34 и БЕЦ ГО Ыо. 62 и БЕЦ ГО Ыо. 90 (А. 8а1тошсИа). При использовании для определения гомологии или идентичности аминокислотных последовательностей является предпочтительным, чтобы при выравниваниях, как описано в данной заявке, использовалась зрелая последовательность. Зрелая последовательность может представлять собой такую, у которой сигнальный пептид удалён, и/или может представлять собой такую, которая была послетрансляционно модифицирована.

Поэтому наиболее предпочтительные области для определения гомологии (идентичности) представляют собой аминокислоты 19-335 для БЕЦ ГО Ыо.Ыо.32 и 2 (А. НуйгорНШа) и аминокислоты 19-336 для БЕЦ ГО Ыо.Ыо. 3, 34 и 62. (А. 8а1тошсИа). БЕЦ ГО Ыо.Ыо. 73 и 74 являются зрелыми (т.е. без сигнального пептида) белковыми последовательностями очень предпочтительных липидацилтрансфераз из

- 18 018153

А. кубгоркШа и Α. 8а1тошс1ба соответственно. 8ЕС ΙΌ Νο.Νο. 73 и 74 могут подвергаться или не подвергаться дополнительной послетрансляционной модификации.

Липидацилтрансфераза для использования в данном изобретении также может быть выделена из ТксгтоЫПба. предпочтительно Т. Гикса, наиболее предпочтительно той, что кодируется с помощью 8ЕС ГО Νο. 67.

Липидацилтрансфераза для использования в данном изобретении также может быть выделена из 81гер1отусе5, предпочтительно 8. ауеппШч наиболее предпочтительно той, что кодируется с помощью 8ЕО ГО Νο. 71. Другие возможные ферменты для использования в настоящем изобретении из 81гер1отусе§ включают те, которые кодируются с помощью 8ЕС ГО Νο.Νο. 4, 5, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 70, 72.

Фермент для использования в данном изобретении также может быть выделен из Со^^ка^етют, предпочтительно С. еГйаещ, наиболее предпочтительно той, что кодируется с помощью 8ЕС ГО Νο. 68.

Соответственно, липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, содержащую любую из аминокислотных последовательностей, которые показаны как 8ЕС ГО Νο.Νο. 76, 77, 79, 80, 82, 84 или 86, или аминокислотных последовательностей, которые имеют по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней, или которые кодируют с помощью любой из нуклеотидных последовательностей, которые показаны как 8ЕС ГО Νο.Νο. 75, 78, 81, 83, 85 или 87, или нуклеотидных последовательностей, которые имеют по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением представляет собой предпочтительно липидацилтрансферазу, кодируемую нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, которая включает, такие как

а) нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕС ГО Νο. 75;

к) нуклеиновая кислота, которая связана с нуклеотидной последовательностью 8ЕС ГО Νο. 75 вырождением генетического кода; и

с) нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность, которая имеет по крайней мере 70% идентичность с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕС ГО Νο. 75.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением представляет собой предпочтительно липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, как показано в 8ЕС ГО Νο. 76, или аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 60% идентичность с ней.

В дополнительном варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает любую из аминокислотных последовательностей, которые показаны как 8ЕС ГО Νο. 76, 77, 79, 80, 82, 84 или 86, или аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней, или кодируется с помощью любой из нуклеотидных последовательностей, которые показаны как 8ЕС ГО Νο. 78, 81, 83, 85 или 87, или нуклеотидной последовательностью, которая имеет по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней.

В дополнительном варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает любую из аминокислотных, которые показаны как 8ЕС ГО Νο. 77, 79, 80, 84 или 86, или аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней для применений, раскрытых в данном описании.

В дополнительном варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает любую из аминокислотных, которые показаны как 8ЕС ГО Νο. 77, 79 или 86, или аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней для применений, раскрытых в данном описании.

Более предпочтительно в одном варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8ЕС ГО Νο. 86, или аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней.

В другом варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8ЕС ГО Νο. 82 или 83, или аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней.

В другом варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8ЕС ГО Νο. 80, или аминокислот

- 19 018153 ную последовательность, которая имеет по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичность с ней.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением может кодироваться нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, которая включает, такие как:

a) нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕС ГО Νο. 75;

b) нуклеиновая кислота, которая связана с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО Νο. 75 вырождением генетического кода; и

c) нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность, которая имеет по крайней мере 70% идентичность с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕС ГО Νο. 75.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, получаемую, предпочтительно полученную из штаммов 81гсрЮтусс5 Ь130 или Ь131, депонированных Эап15со А/8 οί ЬапдеЬгодабе 1, ΌΚ-1001 СорепЕадеп Κ, Эентагк в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры при Национальной коллекции промышленных, морских и пищевых бактерий (ΝΟΙΜΒ) 23 81. Масйаг 81гее1. АЬегбееп 8^11;·ιηά. СВ 25 июня 2004 г., под депозитными номерами ΝΟΙΜΒ 41226 и ΝΟΙΜΒ 41227 соответственно.

Подходящие липидацилтрансферазы для использования в соответствии с настоящим изобретением и/или в способах настоящего изобретения могут включать любую из следующих аминокислотных последовательностей и/или кодироваться следующими нуклеотидными последовательностями:

полинуклеотид, кодирующий липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением (81)0) ГО Νο. 62);

аминокислотная последовательность липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением (8ЕС ГО Νο. 63);

полинуклеотид, кодирующий липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением (81)0) ΙΌ Νο. 90).

Приемлемый фермент липидацилтрансферазы для использования в одном из способов настоящего изобретения также может быть идентифицирован путем выравнивания с Ь131 (8ЕС ГО Νο. 76) последовательностью при использовании Α1ί§η X, С1и51а1 А алгоритма попарного выравнивания УесЮг ΝΤΙ при использовании параметров по умолчанию.

Выравнивание Ь131 и гомологов из 8. ауегтйй15 и Т. Ги5са иллюстрирует, что сохранение СЭ8х мотива (СЭ8У в Ь131 и 8. ауегтй1115 и Т. Ги5са), САХЭУ блока, который представляет собой либо СС№А, либо ССХЭЬ, и НРТ блока (считается консервативным каталитическим гистидином). Эти три консервативных блока являются выделенными на фиг. 103.

При выравнивании либо с рГат РГат00657 консенсусной последовательностью и/либо с Ь131 последовательностью, раскрытой в данной заявке (8ЕС ГО Νο. 76), является возможным идентифицировать три консервативных участка, СЭ8х блок, САХЭУ блок и НТР блок.

При выравнивании либо с рГат РГат00657 консенсусной последовательностью, и/либо с Ь131 последовательностью, раскрытой в данной заявке (8ЕС ГО Νο 76)

ί) липидацилтрансферазный фермент данного изобретения, или для использования в способах данного изобретения, имеет предпочтительно СЭ8х мотив, более предпочтительно СЭ8х мотив, выбранный из СО8Ь или СО8У мотива;

и/или ίί) липидацилтрансферазный фермент данного изобретения, или для использования в способах данного изобретения, имеет предпочтительно САХЭУ блок, более предпочтительно САХЭУ блок, содержащий аминоССХЭх, более предпочтительно ССКЭА или ССХЭЬ;

и/или ϊϊΐ) фермент данного изобретения, или для использования в способах данного изобретения, имеет предпочтительно НТР блок;

и предпочтительно ίν) липидацилтрансферазный фермент данного изобретения, или для использования в способах данного изобретения, имеет предпочтительно СЭ8х или СО8У мотив, и САХЭУ блок, содержащий аминоССХЭх, предпочтительно ССХЭА или ССХЭЬ, и НТР блок (консервативный гистидин).

Вариант липидацнлтрансферазы.

В предпочтительном варианте воплощения липидацилтрансфераза представляет собой вариант липидацилтрансферазы. Подходящие способы для получения липидацилтрансфераз для использования в данном изобретении описаны в АО 2005/066347. Могут использоваться варианты, которые обладают повышенной активностью по отношению к фосфолипидам, такой как повышенная гидролитическая активность и/или повышенная трансферазная активность, предпочтительно повышенная трансферазная активность по отношению к фосфолипидам.

Предпочтительно вариант липидацилтрансферазы получают с помощью одной или более модифи- 20 018153 каций аминокислот липидацилтрансфераз, как определено в данной заявке выше.

Предпочтительно липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой вариант липидацилтрансферазы, в случае чего фермент может быть охарактеризован тем, что фермент включает мотив ΟΌ8Χ аминокислотной последовательности, в данной заявке X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков Ь, А, V, I, Ε, Υ, Η, ρ, Τ, Ν, М или 8, и в данной заявке вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в каком-либо одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (как определено в \УО 2005/066347 и в данной заявке ниже).

Например, вариант липидацилтрансферазного фермента для использования в способах или применениях настоящего изобретения может быть охарактеризован тем, что фермент включает мотив ΟΌ8Χ аминокислотной последовательности, в данной заявке X, который представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Ε, Υ, Η, ρ, Τ, Ν, М или 8, и в данной заявке вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в каком-либо одном или более аминокислотных остатках, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (как определено в \УО 2005/066347 и в данной заявке ниже), идентифицированном с помощью указанной исходной аминокислотной последовательности, являющейся структурно выровненной со структурной моделью Р10480, определенной в данной заявке, которая является предпочтительно полученной с помощью структурного выравнивания Р10480 координат кристаллической структуры с 1ΙνΝ.ΡΌΒ и/или 1ΌΕΟ.ΡΌΒ, как определено в \УО 2005/066347 и в данной заявке ниже.

В дополнительном варианте воплощения вариант липидацилтрансферазного фермента для использования в способах или применениях настоящего изобретения может быть охарактеризован тем, что фермент включает мотив ΟΌ8Χ аминокислотной последовательности, в данной заявке X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Ε, Υ, Η, ρ, Τ, Ν, М или 8, и в данной заявке вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в каком-либо одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, идентифицированном тогда, когда указанная исходная последовательность является выровненной с рГат консенсусной последовательностью (8Ερ ΙΌ Νο. 1 - фиг. 2) и модифицированной в соответствии со структурной моделью Р10480 для обеспечения наибольшего соответствия перекрывания, как определено в \УО 2005/066347 и в данной заявке ниже.

Предпочтительно вариант липидацилтрансферазного фермента может включать аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность представляет собой такую, которая представлена как 8Ερ ΙΌ Νο. 73, 8Ερ ΙΌ Νο. 2, 8Ερ ΙΌ Νο. 3, 8Ερ ΙΌ Νο. 4, 8Ερ ΙΌ Νο. 5, 8Ερ ΙΌ Νο. 6, 8Ερ ΙΌ Νο. 12, 8ΕΡ ΙΌ Νο. 65, 8Ερ ΙΌ Νο. 22, 8Ερ ΙΌ Νο. 24, 8Ερ ΙΌ Νο. 26, 8Ερ ΙΌ Νο. 28, 8Ερ ΙΌ Νο. 30, 8ΕΡ ΙΌ Νο. 32, 8Ερ ΙΌ Νο. 34, 8Ερ ΙΌ Νο. 36, 8Ερ ΙΌ Νο. 89, 8Ερ ΙΌ Νο. 66, 8Ερ ΙΌ Νο. 67, 8Ερ ΙΌ Νο. 68, 8Ερ ΙΌ Νο. 69, 8Ερ ΙΌ Νο. 71 или 8Ερ ΙΌ Νο. 72, за исключением одной или более модификаций аминокислот в одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (как определено в \УО 2005/066347 и в данной заявке ниже), идентифицированном с помощью выравнивания последовательности с 8Ερ ΙΌ Νο. 73.

Альтернативно, вариант липидацилтрансферазного фермента может представлять собой вариант фермента, включающий аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность представляет собой такую, которая представлена как 8Ερ ΙΌ Νο. 73, 8Ερ ΙΌ Νο. 2, 8Ερ ΙΌ Νο. 3, 8Ερ ΙΌ Νο. 4, 8ΕΡ ΙΌ Νο. 5, 8Ερ ΙΌ Νο. 6, 8Ερ ΙΌ Νο. 12, 8Ερ ΙΌ Νο. 65, 8Ερ ΙΌ Νο. 22, 8Ερ ΙΌ Νο. 24, 8Ερ ΙΌ Νο. 26, 8ΕΡ ΙΌ Νο. 28, 8Ερ ΙΌ Νο. 30, 8Ερ ΙΌ Νο. 32, 8Ερ ΙΌ Νο. 34, 8Ερ ΙΌ Νο. 36, 8Ερ ΙΌ Νο. 89, 8Ερ ΙΌ Νο. 66, 8ΕΡ ΙΌ Νο. 67, 8Ερ ΙΌ Νο. 68, 8Ερ ΙΌ Νο. 69, 8Ερ ΙΌ Νο. 71 или 8Ερ ΙΌ Νο. 72, за исключением одной или более модификаций аминокислот в одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7, как определено в \УО 2005/066347 и в данной заявке ниже, идентифицированном с помощью структурного выравнивания указанной исходной последовательности со структурной моделью Р10480, определенной в данной заявке, которая является предпочтительно полученной с помощью структурного выравнивания координат кристаллической структуры Р10480 с 1ΙνΝ.ΡΌΒ и/или ГОНО.РОВ, как описывается в \УО 2005/066347 и в данной заявке ниже.

Альтернативно, вариант липидацилтрансферазного фермента может представлять собой вариант фермента, включающий аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность представляет собой такую, которая представлена как 8Ερ ΙΌ Νο. 73, 8Ερ ΙΌ Νο. 2, 8Ερ ΙΌ Νο. 3, 8Ερ ΙΌ Νο. 4, 8ΕΡ ΙΌ Νο. 5, 8Ερ ΙΌ Νο. 6, 8Ερ ΙΌ Νο. 12, 8Ερ ΙΌ Νο. 89, 8Ερ ΙΌ Νο. 22, 8Ερ ΙΌ Νο. 24, 8Ερ ΙΌ Νο. 26, 8ΕΡ ΙΌ Νο. 28, 8Ερ ΙΌ Νο. 30, 8Ερ ΙΌ Νο. 32, 8Ερ ΙΌ Νο. 34, 8Ερ ΙΌ Νο. 36, 8Ερ ΙΌ Νο. 89, 8Ερ ΙΌ Νο. 66, 8ΕΡ ΙΌ Νο. 67, 8Ερ ΙΌ Νο. 68, 8Ερ ΙΌ Νο. 69, 8Ερ ΙΌ Νο. 71 или 8Ερ ΙΌ Νο. 72, за исключением одной или более модификаций аминокислот в одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, идентифицированном тогда, когда указанная исходная последовательность выравнивается с рГат консенсусной последовательностью (8Ερ ΙΌ Νο. 1) и модифицируется в соответствии со структурной моделью Р10480 для обеспечения наибольшего соответствия перекрывания, как определено

- 21 018153 в Ж.) 2005/066347 и в данной заявке ниже.

Предпочтительно исходный фермент представляет собой фермент, который включает или является гомологичным, аминокислотную последовательность, которая представлена как 8Ер II) Ко. 73 и/или 8Г'.О ГО Ко, 34, и/или 8Ер ГО Ко. 74.

Предпочтительно вариант фермента представляет собой фермент, который включает аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность представляет собой такую, которая представлена как 8Ер ГО Ко. 73 или 8Ер ГО Ко. 74, за исключением одной или более модификаций аминокислот в любом одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7, как определено в Ж.) 2005/066347 и в данной заявке ниже.

Определение наборов

Аминокислотный набор 1.

Аминокислотный набор 1 (примечание: эти аминокислоты представляют собой таковые в 11УК фиг. 53 и 54)

О1у8, А8р9, 8ег10, Ьеи11, 8ег12, Туг15, 61у44, Азр45, Ткг46, 61и69, Ьеи70, 61у71, О1у72,

А§п73, А8р74, О1у75, Ьеи76, 61п106, 11е107, Аг§108, Ьеи109, Рго110, Туг113, Рке121,

Рке139, РЫ140, Ме1141, Туг145, Ме1151, Аар!54, Н18157, О1у 155,11е156, Рго158

Высококонсервативные мотивы, такие как ΟΏ8χ и каталитические остатки, отсеивали из набора 1 (остатки подчеркнуты). Во избежание сомнений набор 1 определяет аминокислотные остатки в пределах 10А центрального атома углерода глицерина в активном сайте 11УК модели.

Аминокислотный набор 2.

Аминокислотный набор 2 (примечание: нумерация аминокислот относится к аминокислотам в зрелой последовательности Р10480)

Ьеи17, Ьуз22, Ме123, О1у40, Аап80, Рго81, Еуз82, Азп87, Азп88, Тгр111, Уа1112, А1а114,

Туг117, Ьеи118, Рго156, О1у 159, О1п160, Аап161, Рго162, 8ег163, А1а164, Агд165, 8ег166,

О1П167, Ьуа168, Уа1169, Уа1170, С31и171, А1а172, Туг179, Н18180, Азп181, Ме1209, Ьеи210, Аг_ё211, А8п215, Еуз284, Ме1285, 61п289 и Уа1290.

Таблица выбранных из набора 1 остатков по сравнению с набором 2

ΙΥΝ модель	Номер остатка зрелой последовательности Р10480
ΐνΝ	А.йуб гомолог
	РРАМ	Структура
О1у8	С1у32

Азр9	АзрЗЗ
8ег10 Ьеи11	8ег34 Ьеи35		Ьеи17
8ег12	8ег36		8ег18
Туг15	С1у58		Ьуз22 Ме123 С1у40
О1у44	Азп98		Азп80
Азр45	Рго99		Рго81
ТЬг46	Ьуз 100		Ьуз 8 2
61и69	Тгр129		Азп87 Азп88 Тгр111
Ьеи70	Уа1130		Уа1112
О1у71 С1у72	О1у131 А1а132		А1а114
Азп73 Азр74 О1у75	Азп133 Азр 134 Туг135		Туг117
Ьеи76	Ьеи136		Ьеи118
О1пЮ6		Рго174	Рго156
11е107		О1у177	О1у159
Аге108		С1П178	О1п160
Ьеи109		Азп179	Азп161
Рго110		180- 190	Рго162
Туг113 РЬе121	ΗΪ3198	Туг 197	8ег163 А1а164 Аг§165 8ег166 С1п167 Ьуз168 Уа1169 Уа1170 О1и171 А1а172 Туг179
РЬе139	Ме1227	ΗΪ3198 Азп199	ΗΪ3180 Азп181 Ме1209
РЬе140	Ьеи228		Ьеи210
Ме1141	Аг§229		Аг§211
Туг145	Азп233		Азп215
Ме1151	Ме1303		Ьуз284 Ме1285
Азр154 О1у155	АзрЗОб СНпЗО7		О1п289
11е156	Уа1308		Уа1290
ΗΪ8157 Рго158	ΗΪ3309 РгоЗЮ

- 22 018153

Аминокислотный набор 3.

Аминокислотный набор 3 является идентичным набору 2, но относится к кодирующей последовательности Аеготопак ка1тошс1ба (8ЕЦ ΙΌ Νο. 3), т.е. номера аминокислотных остатков являются на 18 выше в наборе 3, поскольку это отражает отличие между нумерацией аминокислот в зрелом белке (8ЕЦ ГО Νο. 73) по сравнению с белком, включающим сигнальную последовательность (8ЕЦ ГО Νο. 36).

Зрелые белки Аеготопак ка1топ1с1ба 6Ό8Χ (8ЕЦ ГО Νο. 3) и Аеготопак йубгорШа 6Ό8Χ (8ЕЦ ГО Νο. 73) отличаются пятью аминокислотами. Таковые представляют собой Т11г38ег, 61п182Ьук, С1и309А1а, 8ег310Акп и С1у318-, где ка1топ1с1ба остаток указывается первым, а йубторййа остаток указывается последним. Белок йубторШа имеет длину только 317 аминокислот и не содержит остатка в положении 318. Аеготопак ка1тошс1ба 6Ό8Χ имеет в значительной степени более высокую активность на полярных липидах, таких как субстраты на основе галактолипида, чем белок Аеготопак йубторШа. Сканирование сайтов осуществляли во всех пяти аминокислотных положениях.

Аминокислотный набор 4.

Аминокислотный набор 4 представляет собой 83, 6182, Е309, 8310 и -318.

Аминокислотный набор 5.

Е138, Ό15Ν, 8186, 8184, Υ30Ε, Ό116Ν, П116Е, Ό157Ν, Υ226Ε, Ό228Ν Υ230Ε.

Аминокислотный набор 6.

Аминокислотный набор 6 представляет собой 8ег3, Ьеи17, Ьик22, Ме123, 61у40, Акп80, Рго81, Ьик82, Акп87, Акп88, Тгр111, Уа1112, А1а114, Туг117, Ьеи118, Рго156, 61у159, 61п160, Акп161, Рго162, 8ег163, А1а164, Ат§165, 8ег166, 61п167, Ьук168, Уа1169, Уа1170, 61и171, А1а172, Туг179, Ηίκ180, Акп181, 61п182, Ме1209, Ьеи210, Ат§211, Акп215, Ьук284, Хе128Х 61п289, Уа1290, 61и309, 8ег310, -318.

Нумерация аминокислот в наборе 6 относится к аминокислотным остаткам в Р10480 (8ЕЦ ГО Νο. 36) - соответствующие аминокислоты в других каркасных последовательностях могут быть определены с помощью гомологичного выравнивания и/или структурного выравнивания до Р10480 и/или 1Ι4Ν.

Аминокислотный набор 7.

Аминокислотный набор 7 представляет собой 8ег3, Ьеи17, Ьук22, Ме123, 61у40, Акп80, Рго81, Ьук82, Акп 87, Акп88, Тгр111, Уа1112, А1а114, Туг117, Ьеи118, Рго156, 61у159, 61п160, Акп161, Рго162, 8ег163, А1а164, Ат§165, 8ег166, 61п167, Ьук168, Уа1169, Уа1170, 61и171, А1а172, Туг179, Ηίκ180, Акп181, 61п182, Ме1209, Ьеи210, Ат§211, Акп215, Ьук284, Ме1285, 61п289, Уа1290, 61и309, 8ег310, -318, Υ30Χ (где Х является выбранным из А, С, Ό, Е, 6, Н, I, К, Ь, М, Ν, Р, О, В, 8, Т, V или V), Υ226Χ (где X является выбранным из А, С, Ό, Е, 6, Н, I, К, Ь, М, Ν, Р, О, В, 8, Т, V или V), Υ230Χ (где Χ является выбранным из А, С, Ό, Е, 6, Н, I, К, Ь, М, Ν, Р, О, В, 8, Т, V или V), 818Χ (где Χ является выбранным из А, С, Ό, Е, Е, Н, I, К, Ь, М, Ν, Р, О, В, Т, V или Υ), Ό157Χ (где Χ является выбранным из А, С, Е, Е, 6, Н, I, К, Ь, М, Р, О, В, 8, Т, V, V или Υ).

Нумерация аминокислот в наборе 7 относится к аминокислотным остаткам в Р10480 (8ЕЦ ГО Νο. 36) - соответствующие аминокислоты в других каркасных последовательностях могут быть определены с помощью гомологичного выравнивания и/или структурного выравнивания до Р10480 и/или ΗΥΝ.

Предпочтительно вариант фермента включает одну или более из следующих модификаций аминокислот по сравнению с исходным ферментом: 83Е, А, 6, К, М, Υ, В, Р, Ν, Т или 6 Е309Ц, В или А, предпочтительно О или В -318Υ, Η, 8 или Υ, предпочтительно Υ.

Предпочтительно Χ 6Ό8Χ мотива представляет собой Ь. Таким образом, предпочтительно исходный фермент включает аминокислотный мотив 6Ό8Ε.

Предпочтительно указанная первая исходная липидацилтрансфераза может включать любую из следующих аминокислотных последовательностей: 8ЕЦ ГО Νο. 73, 8ЕЦ ГО Νο. 2, 8ЕЦ ГО Νο. 3, 8ЕЦ ГО Νο. 4, 81X) ГО Νο. 5, 81X) ГО Νο. 6, 81X) ГО Νο. 12, 81X) ГО Νο. 65, 81X) ГО Νο. 22, 81X) ГО Νο. 24, 81X) ГО Νο. 26, 81X) ГО Νο. 28, 81X) ГО Νο. 30, 81X) ГО Νο. 32, 81X) ГО Νο. 34, 81X) ГО Νο. 36, 81X) ГО Νο. 89, 81X) ГО Νο. 66, 81X) ГО Νο. 67, 81X) ГО Νο. 68, 81X) ГО Νο. 69, 81X) ГО Νο. 71 или 81X) ГО Νο. 72.

Предпочтительно указанная вторая родственная липидацилтрансфераза может включать любую из следующих аминокислотных последовательностей: 8ЕЦ ГО Νο. 2, 8ЕЦ ГО Νο. 73, 8ЕЦ ГО Νο. 3, 8ЕЦ ГО Νο. 4, 81X) ГО Νο. 5, 81X) ГО Νο. 6, 81X) ГО Νο. 12, 81X) ГО Νο. 65, 81X) ГО Νο. 22, 81X) ГО Νο. 24, 81X) ГО Νο. 26, 81X) ГО Νο. 28, 81X) ГО Νο. 30, 81X) ГО Νο. 32, 81X) ГО Νο. 34, 81X) ГО Νο. 36, 81X) ГО Νο. 89, 81X) ГО Νο. 66, 81X) ГО Νο. 67, 81X) ГО Νο. 68, 81X) ГО Νο. 69, 81X) ГО Νο. 71 или 81X) ГО Νο. 72.

Вариант фермента должен включать по крайней мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с исходным ферментом. В некоторых воплощениях вариант фермента может включать по крайней мере 2, предпочтительно по крайней мере 3, предпочтительно по крайней мере 4, предпочтительно по крайней мере 5, предпочтительно по крайней мере 6, предпочтительно по крайней мере 7, предпочтительно по крайней мере 8, предпочтительно по крайней мере 9, предпочтительно по крайней мере 10 модификаций аминокислот по сравнению с исходным ферментом.

При ссылке на специфические аминокислотные остатки в данной заявке представляет собой такую, которую получают из выравнивания вариантной последовательности со стандартной последовательностью, которая представлена как 8ЕЦ ГО Νο. 73 или 8ЕЦ ГО Νο. 74.

В одном аспекте вариант фермента предпочтительно включает одну или более из следующих замен

- 23 018153 аминокислот:

А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, ζ), К, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Ь17А, С, ϋ, Е, Ρ, Ο, Η, I, К, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, или Υ; и/или

818А, С, ϋ, Е, Ρ, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, Р, К, Т, АУ, или Υ; и/или

К22А, С, ϋ, Е, Г, О, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, <3, К, 8, Т, V, или Υ; и/или

М23А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Ν, Р, 9, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Υ30Α, С, ϋ, Е, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, К, 8, Т, V, или АУ; и/или

О40А, С, ϋ, Е, Ρ, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Ν80Α, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Р81А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, р, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

К82А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Ν87Α, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, (}, К, 8, Т, V, XV, или Υ; и/или

Ν88Α, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, 9, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

АУ111 А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ или Υ; и/или

VI12А, С, ϋ, Е, Ρ, С, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, АУ, или Υ; и/или

А114С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Υ117А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, или АУ; и/или

Ы18А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Р156А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Э157А, С, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, 9, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или (3159А, С, ϋ, Е, Ρ, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

0160А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

N161 А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Р162А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, 9, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

8163А, С, ϋ, Е, Ρ, С, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, Т, V, АУ, или Υ; и/или

А164С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

К.165А, С, ϋ, Е, Ρ, σ, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

8166А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, Т, V, АУ, или Υ; и/или (2167 А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

К168А, С, ϋ, Е, Ρ, С, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, 9, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

У169А, С, О, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, АУ, или Υ; и/или

У170А, С, ϋ, Е, Ρ, С, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, АУ, или Υ; и/или

Е171А, С, ϋ, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

А172С, ϋ, Е, Ρ, С, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Υ179Α, С, ϋ, Е, Р, С, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, или АУ; и/или

Н180А, С, ϋ, Е, Ρ, О, I, К, Ь, Μ, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или

Ν181Α, С, ϋ, Е, Ρ, С, Η, I, К, Ь, Μ, Р, (}, К, 8, Т, V, АУ, или Υ; и/или <3182А, С, ϋ, Е, Ρ, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, К, 8, Т, V, АУ, или Υ, предпочтительно К; и/или

- 24 018153

М209А, С, ϋ, Ε, Ε, Ο, Η, I, К, к, Ν, Ρ, ζ), Κ, 8, Τ, V, XV, или Υ; и/или

Ь210 А, С, ϋ, Ε, Ε, Ο, Η, I, Κ, Μ, Ν, Ρ, ρ, Κ, 8, Τ, V, XV, или Υ; и/или

Κ211 А, С, ϋ, Ε, Γ, Ο, Η, I, К, к, Μ, Ν, Ρ, ρ, Κ, 8, Τ, V, XV, или Υ; и/или

N215 А, С, ϋ, Ε, Γ, 6, Η, I, К, Ε, Μ, Ν, Ρ, р, Κ, 8, Τ, V, XV, или Υ; и/или

Υ226Α, С, ϋ, Ε, Ο, Η, I, К, к, Μ, Ν, Ρ, ρ, Κ, 8, Τ, V, или XV; и/или

Υ230Α, С, ϋ, Ε, 6, Η, I, К, к, Μ, Ν, Ρ, р, Κ, 8, Τ, V или XV; и/или

Κ284Α, С, ϋ, Ε, Γ, Ο, Η, I, Ε, Μ, Ν, Ρ, р, Κ, 8, Τ, V, XV, или Υ; и/или

Μ285Α, С, ϋ, Ε, Ρ, Ο, Η, I, К, к, Ν, Ρ, ρ, Κ, 8, Τ, V, XV, или Υ; и/или

Ρ289Α, С, ϋ, Ε, Γ, Ο, Η, I, К, к, Μ, Ν, Ρ, Κ., 8, Τ, V, XV, или Υ; и/или

У290А, С, ϋ, Ε, Γ, Ο, Η, I, К, к, Μ, Ν, Ρ, ρ, Κ, 8, Τ, XV, или Υ; и/или

Ε309Α, С, ϋ, Γ, Ο, Η, I, К, к, Μ, Ν, Ρ, Ρ, Κ, 8, Τ, V, XV, или Υ; и/или

8310Α, С, ϋ, Ε, Γ, Ο, Η, I, К, к, Μ, Ν, Ρ, р, К, Τ, V, XV, или Υ.

В дополнение к этому или альтернативно к этому может существовать одно или более Стерминальных удлинений. Предпочтительно, когда дополнительное С-терминальное удлинение состоит из одной или более алифатических аминокислот, предпочтительно неполярной аминокислоты, более предпочтительно I, Ь, V или О. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно обеспечивает вариант фермента, включающий одно или более из следующих С-терминальных удлинений: 3181, 318Ь, 318ν, 318О.

Предпочтительные варианты ферментов могут обладать сниженной гидролитической активностью в отношении фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (РС), они могут также обладать повышенной трансферазной активностью из фосфолипида.

Предпочтительные варианты ферментов могут обладать трансферазной активностью из фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (РС), таковые могут также обладать повышенной гидролитической активностью в отношении фосфолипида.

Модификация одного или более из следующих остатков может приводить к получению варианта фермента, обладающего повышенной абсолютной трансферазной активностью против фосфолипида: 83, Ό157, 8310, Е309, Υ179, N215, К22, ^289, М23, Н180, М209, Е210, К211, Р81, ν112, N80, Ь82, N88, N87.

Специфические предпочтительные модификации, которые могут обеспечивать вариант фермента, обладающего улучшенной трансферазной активностью из фосфолипида, могут быть выбраны из одного или более из следующих:

- 25 018153

83А, С, ϋ, Е, Е, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, к, Т, V, V/ или Υ; предпочтительно Ν, Е, К, к,

А, Р или М, наиболее предпочтительно 83 А

Э157А, С, Е, Г, 6, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V, \У или Υ ; предпочтительно ϋ1578, к, Е, Ν, О, Т, V, 9, К или С

8310А, С, ϋ, Е, Г, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, К, Т, V, Ψ или Υ; предпочтительно 83 ЮТ

-318 Е

Е309А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, К, Т, V, Ψ или Υ; предпочтительно Е309 К,

Е, Ь, К. или А

Υ179Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V или Ψ; предпочтительно Υ179 ϋ,

Т, Е, К., Ν, V, К, 9 или 8, более предпочтительно Е, К, Ν, V, К или 9

N215А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, 9, к, 8, Т, V, \У или Υ; предпочтительно N215 8,

Ь, К или Υ

К22А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V, Ψ или Υ; предпочтительно К22 Е, к,

С или А

9289А, С, О, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, к, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно 9289 к,

Е, О, Р или N

М23А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь Ν, Р, 9, к, 8, Т, V, АУ или Υ; предпочтительно М23 К, 9,

Ь, О, Т или 8

Н180А, С, Ώ, Е, Р, О, I, К, Ь, Μ, Р, 9, К, 8, Т, V, ДУ или Υ; предпочтительно Н180 9, к или К

М209 А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V, \У или Υ; предпочтительно М209 9,

8, к, Α, Ν, Υ, Е, V или Ь

Ь210А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Μ, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V, \У или Υ; предпочтительно Е210 к,

А, V, 8, Т, I, АУ или М к211 А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, 8, Т, V, V/ или Υ; предпочтительно к211Т

Р81 А, С, ϋ, Е, Р, С, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, 9, к, 8, Т, V, \У или Υ; предпочтительно Р81О

VI12А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V/ или Υ; предпочтительно VI12С

Ν80Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, 9, к, 8, Т, V, АУ или Υ; предпочтительно N80 к, О,

Ν, ϋ, Р, Т, Е, V, А или С

Ь82А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, Μ, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V, Ψ или Υ; предпочтительно Ь82Ц 8 или

Е

Ν88Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, 9, к, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно N880

Ν87Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, 9, К 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно Ν87Μ или

О

Предпочтительные модификации одного или более из следующих остатков приводят к получению варианта фермента, обладающего повышенной абсолютной трансферазной активностью против фосфолипида:

Ν, К, А, 6

М23 К, 0, Ь , О, Т, 8

Н180К

Ь82 О

Υ179 Е, К, Ν, V, К или 9

Е309 К, 8, Ь или А

Одна предпочтительная модификация представляет собой Ν80Ό. Это, в частности, является случаем, когда используется стандартная последовательность 8РО ΙΌ ^. 74. Поэтому в предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением включает 8РО ΙΌ ^. 74 или аминокислотную последовательность, которая имеет 75% или большую, предпочтительно 85% или большую, более предпочтительно 90% или большую, даже более предпочтительно 95% или большую, даже более предпочтительно 98% или большую или даже более

- 26 018153 предпочтительно 99% или большую идентичность с 8ЕС ΙΌ №. 74.

Как отмечалось выше, при ссылке на специфические аминокислотные остатки в соответствии с данной заявкой нумерация представляет собой такую, которая получена из выравнивания вариантной последовательности со стандартной последовательностью, которая представлена как 8ЕС ΙΌ №. 73 или 8ЕС ΙΌ №. 74.

Еще более предпочтительно липидацилтрансфераза для использования в способе и применениях настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8ЕС ΙΌ №. 62, или аминокислотную последовательность, которая показана как 8ЕС ΙΌ №. 90, или аминокислотную последовательность, которая имеет 75% или большую, предпочтительно 85% или большую, более предпочтительно 90% или большую, даже более предпочтительно 95% или большую, даже более предпочтительно 98% или большую или даже более предпочтительно 99% или большую идентичность с 8ЕС ΙΌ №. 62 и/или 8ЕС ΙΌ №. 90. Этот фермент может рассматриваться как вариант фермента.

Для целей настоящего изобретения степень идентичности основывается на количестве элементов последовательности, которые являются одинаковыми. Степень идентичности в соответствии с настоящим изобретением может быть предпочтительно определена с помощью компьютерных программ, которые являются известными в области техники, например, такой как САР, обеспеченная в ССС программном обеспечении (Ргодгат Мапиа1 Гог 1йе АЬсопмп Раскаде, версия 8, август 1994 г., Сепебск СотрШет Сгоир, 575 8с1еисе Элме, Майкоп, АЬсопмп, И853711) (№еб1етап & АипксН (1970), 1. оГ Мо1еси1аг Βίо1оду 48, 443-45), используя следующие установки для сравнения полипептидной последовательности: штраф за внесение делеции 3,0 и штраф за продолжение делеции 0,1. Соответственно, степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности определяется на протяжении по крайней мере 20 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 30 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 40 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 50 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 60 смежных аминокислот.

Предпочтительно липидацилтрансфераза/липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены, предпочтительно получаются из организмов из одного или больше следующих семейств: Аеготопак, 81гер1отусек, 8ассйаготусек, Ьас1ососсик, МусоЬас1егшт, 81гер1ососсик, ЬаСоЬасШик, Пеки1ГйоЬас1егшт, ВасШик, Сатру1оЬас1ег, ^Ьпопасеае, Ху1е11а, 8и1Го1оЬик, АкретдШик, 8сЫ7окассйатотусек, Ык1ет1а, №|ккела, МекогС/оШит, Ка1к1ота, ХапШотопак, Сапб1ба, ТНегтоЫПба и СогупеЬас1ег1ит.

Предпочтительно липидацилтрансфераза/липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены, предпочтительно получаются из одного или больше из следующих организмов: Аеготопак йубгорШа, Аеготопак ка1тошс1ба, 81гер1отусек сое11со1ог, 81гер1отусек птокик, МусоЬас1егшт, 81герЮсоссик руодепек, ЬасЮсоссик 1асбк, 81гер1ососсик руодепек, 81герЮсоссик ШегторЫ1ик, 81гер1отусек Шегтокассйап, 81гер1отусек ауегтйШк, ЬасЮЬасШик йекебсик, Эеки1ПюЬас1ег1ит бекйодепапк, ВасШик кр, Сатру1оЬас1ег _)е.)иш, ^Ьбопасеае, Ху1е11а Гакббтка, 8и1Го1оЬик ко1Га1абсик, 8ассйатотусек сетеуЫае, АкретдШик 1еггеик, 8с1и/окасс11аготусек ротЬе, Ык1епа тпосиа, Ык1епа топосуЮдепек, №1ккеба тептдШбк, Мекоби/оЬтт 1об, Ка1к!оша ко1апасеагит, ХапШотопак сатрекбгк, ХапШотопак ахопороб1к, Сапб1ба рагаркйобк, ТНегтоЫПба Гикса и СотупеЬаСебит еГПСепк.

В одном аспекте предпочтительно липидацилтрансферазный фермент в соответствии с настоящим изобретением может быть получен, предпочтительно получается или происходит из одного или больше Аеготопак крр., Аеготопак бубгорШа или Аеготопак ка1тошс1ба.

Предпочтительно при проведении способа в соответствии с настоящим изобретением продукт получают без повышения или существенного повышения содержания свободных жирных кислот в продукте питания.

Термин трансфераза, как используется в данной заявке, употребляется попеременно с термином липидацилтрансфераза.

Предпочтительно липидацилтрансфераза, как определено в данной заявке, катализирует одну или более из следующих реакций: интерэстерификацию, трансэстерификацию, алкоголиз, гидролиз.

Термин интерэстерификация относится к катализируемому ферментом переносу ацильных групп между липидным донором и липидным акцептором, в данной заявке липидный донор не представляет собой свободную группу ацила.

Термин трансэстерификация, как используется в данной заявке, означает катализируемый ферментом перенос ацильной группы из липидного донора (отличного от свободной жирной кислоты) на акцептор ацила (отличный от воды).

Как используется в данной заявке, термин алкоголиз относится к ферментативному расщеплению ковалентной связи кислотной производной с помощью реакции с участием ΚΌΗ спирта так, что один из продуктов объединяется с Н спирта, а другой продукт соединяется с ΘΚ-группой спирта.

Как используется в данной заявке, термин спирт относится к алкильному соединению, содержащему гидроксильную группу.

- 27 018153

Как используется в данной заявке, термин гидролиз относится к ферментативному катализируемому переносу ацильной группы из липида на ОН-группу молекулы воды. Перенос ацильной группы, который происходит из-за гидролиза, требует отделения молекулы воды.

Термин без повышения или без существенного повышения уровня свободных жирных кислот, как используется в данной заявке, означает, что предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением обладает 100% трансферазной активностью (т.е. переносит 100% ацильных групп из донора ацила на акцептор ацила при отсутствии гидролитической активности); однако фермент может переносить менее чем 100% ацильных групп, присутствующих в доноре липидного ацила, на акцептор ацила. В этом случае ацилтрансферазная активность предпочтительно составляет по крайней мере 5%, более предпочтительно по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 20%, более предпочтительно по крайней мере 30%, более предпочтительно по крайней мере 40%, более предпочтительно 50%, более предпочтительно по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 70%, более предпочтительно по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 90% и более предпочтительно по крайней мере 98% общей активности фермента. % трансферазной активности (т.е. трансфертная активность как процент общей ферментативной активности) может быть определен с помощью следующего протокола.

Протокол для определения % ацилтрансферазной активности.

Пищевой продукт, к которому добавляют липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, может быть экстрагирован, следуя ферментативной реакции с СΗС1з:СНзОН 2:1, и органическую фазу, содержащую липидный материал, выделяют и анализируют с помощью ГЖХ и ВЭЖХ в соответствии с процедурой, детально описанной в данной заявке ниже. В ГЖХ и ВЭЖХ анализах определяют количество свободных жирных кислот и одного или больше сложных эфиров стерола/станола; сложных эфиров углевода, сложных эфиров белка; диглицеридов или моноглицеридов.

Контрольный пищевой продукт, к которому не добавляют фермент в соответствии с настоящим изобретением, анализируют тем же способом.

Расчёт.

Из результатов ГЖХ и ВЭЖХ анализов может быть рассчитано увеличение в количестве свободных жирных кислот и сложных эфиров стерола/станола, и/или сложных эфиров углевода, и/или сложных эфиров белка, и/или диглицеридов, и/или моноглицеридов:

Δ % жирной кислоты = % жирной кислоты (фермент) - % жирной кислоты (контроль);

Μν жирной кислоты = средняя молекулярная масса жирных кислот;

А = Δ % сложного эфира стерола/Μν сложного эфира стерола (где Δ % сложного эфира стерола = % сложного эфира стерола/станола (фермент) - % сложного эфира стерола/станола (контроль) и Μν сложного эфира стерола = средняя молекулярная масса сложных эфиров стерола/станола) - применимо, когда акцептор ацила представляет собой стерол и/или станол;

В = Δ % сложного эфира углевода/Μν сложного эфира углевода (где Δ % сложного эфира углевода = % сложного эфира углевода (фермент) - % сложного эфира углевода (контроль) и Μν сложного эфира углевода = средняя молекулярная масса сложного эфира углевода) - применимо, когда акцептор ацила представляет собой углевод;

С = Δ % сложного эфира белка/Μν сложного эфира белка (где Δ % сложного эфира белка = % сложного эфира белка (фермент) - % сложного эфира белка (контроль) и Μν сложный эфир белка = средняя молекулярная масса сложного эфира белка) - применимо, когда акцептор ацила представляет собой белок; и

Э = абсолютное значение диглицерида и/или моноглицерида/Μν ди/моноглицерида (где Δ % диглицерида и/или моноглицерида = % диглицерида и/или моноглицерида (фермент) - % диглицерида и/или моноглицерида (контроль) и Μν ди/моноглицерида = средняя молекулярная масса диглицерида и/или моноглицерида) - применимо, когда акцептор ацила представляет собой глицерин.

Трансферазную активность рассчитывают как процент от общей ферментативной активности % трансферазной активности = А* + В* + С* + Р*______________________________________

А* + В* + С* + Ρ*+Δ % жирной кислоты /(Μν жирной кислоты) х 100 * - удаляется при необходимости.

Если количество свободных жирных кислот возрастает в продукте питания, оно предпочтительно не возрастает существенно, т.е. в значительной степени. Под этим мы подразумеваем, что повышение количества свободной жирной кислоты не влияет негативно на качество пищевого продукта.

В некоторых аспектах настоящего изобретения термин без существенного повышения уровня свободных жирных кислот, как используется в данной заявке, означает, что количество свободной жирной кислоты в продукте питания или композиции, обработанной с помощью липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, является меньшим, чем количество свободной жирной кислоты, образовавшейся в продукте питания или композиции тогда, когда использовался фермент, отличный от

- 28 018153 липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, так как, например, по сравнению с количеством свободной жирной кислоты, образовавшейся тогда, когда использовался традиционный фермент фосфолипаза, например Ыроран Р® (№уохутс5 А/8, Эситагк).

Термин ίη δίΐιι. как используется в данной заявке, означает, что эмульгатор(ы) и/или сложные эфиры стерола/станола, и/или сложные эфиры углевода, и/или сложные эфиры белка, и/или моно- или диглицериды образуются в продукте питания или фракции пищевого продукта. Это контрастирует с ситуацией, когда эмульгатор(ы) и/или сложные эфиры стерола/станола, и/или сложные эфиры углевода, и/или сложные эфиры белка, и/или моно- или диглицериды образуются отдельно от пищевого продукта и добавляются как образованные продукты к пищевому продукту в течение его получения. Другими словами, термин ίη δίΐιι, как используется в данной заявке, означает, что путём добавления липидацилтрансферазного фермента в соответствии с настоящим изобретением к пищевому продукту, или к пищевым ингредиентам/материалам, составляющим пищевой продукт, эмульгатор и/или сложный эфир стерола, и/или сложный эфир станола, и/или сложный эфир углевода, и/или сложный эфир белка, и/или моно- или диглицерид может быть образован из компонентов пищевого продукта. Соответственно, эти компоненты пищевого продукта могут представлять собой субстрат(ы) для фермента. Если необходимо, эти компоненты пищевого продукта могут быть дополнены путём добавления одного или большего количества дополнительных компонентов, где дополнительные компоненты могут представлять собой те же самые, что присутствуют в продукте питания, или могут быть дополнительными к тем компонентам, которые уже присутствуют в продукте питания. Во избежание неопределённости, в одном варианте воплощения способ в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой способ получения эмульгатора, и/или сложного эфира стерола, и/или сложного эфира станола, и/или сложного эфира углевода, и/или сложного эфира белка, и/или моно- или диглицерида ίη δίΐιι в продукте питания и не представляет собой способ получения эмульгатора, и/или сложного эфира стерола, и/или сложного эфира станола (например, в выделенной и/или очищенной форме) для последующего добавления в пищевой продукт.

В другом варианте воплощения липазаацилтрансфераза может быть использована в течение обработки продукта, но не остаётся в продукте питания. Например, липазаацилтрансфераза может быть иммобилизирована, обеспечивая этим её повторное применение.

Предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением способна переносить ацильную группу от липида к стеролу, и/или станолу, и/или углеводу, и/или белку, и/или глицерину, когда присутствует в полярной среде, предпочтительно в водной среде, предпочтительно в воде, содержащей пищевой продукт. Соответственно, водная среда может представлять собой водный буфер или может представлять собой водную фазу в продукте питания. Термин водная среда, как используется в данной заявке, предпочтительно означает среду, которая не содержит органического растворителя, предпочтительно не содержит полярного органического растворителя, более предпочтительно не содержит не съедобного органического растворителя. В частности, термин водная среда может относиться к среде, к которой не добавляют никаких экзогенных органических растворителей, предпочтительно никаких полярных органических растворителей. Термин органический растворитель, как используется в данной заявке, не охватывает пищевых масел, предпочтительно не охватывает пищевых масел, которые находятся в высокой концентрации в неполярных липидах. В одном варианте воплощения термин органический растворитель может исключать съедобные органические растворители, такие как этанол, пропиленгликоль и/или глицерин. Соответственно, водная среда в соответствии с настоящим изобретением может включать меньше чем 80 об.% органических растворителей, меньше чем 70 об.% органических растворителей, меньше чем 50 об.% органических растворителей, меньше чем 30 об.% органических растворителей, более предпочтительно меньше чем 15 об.% органических растворителей, более предпочтительно меньше чем 5%. Соответственно пищевой продукт может включать от 1 до 5% органического растворителя, например этанола. Однако, когда пищевой продукт включает такой органический растворитель, предпочтительно его получают эндогенно в продукте питания. Другими словами, когда пищевой продукт включает такой органический растворитель, тогда предпочтительно этот органический растворитель не представляет собой экзогенный органический растворитель.

Термин пищевой продукт, как используется в данной заявке, означает вещество, которое подходит для потребления человеком и/или животным.

Соответственно, термин пищевой продукт, как используется в данной заявке, может означать пищевой продукт в форме, которая готова к употреблению. Однако альтернативно или дополнительно, термин пищевой продукт, как используется в данной заявке, может означать один или большее количество пищевых материалов, которые используют в получении пищевого продукта. Только в качестве примера термин пищевой продукт охватывает как хлебобулочные изделия, полученные из теста, так и тесто, используемое для получения указанных хлебобулочных изделий. В качестве дополнительного примера, термин пищевой продукт охватывает как конечный продукт, т.е., например, конечный молочный продукт, такой как сыр, так и молоко (например, молоко для сыроделия), сливки и/или жир сливочного масла, например, используемый в получении указанного молочного продукта (например, сыра).

Термин пищевой материал, как используется в данной заявке, означает один или большее количе

- 29 018153 ство материалов, используемых в получении пищевого продукта. Термин пищевой продукт может быть использован в данной заявке в значении пищевого материала и наоборот. В некоторых вариантах воплощения, например, пищевой материал может представлять собой конечный пищевой продукт. Только в качестве примера конечный пищевой продукт может представлять собой съедобное масло (такое как кулинарный жир); в таких случаях пищевой материал также может представлять собой съедобное масло. В некоторых вариантах воплощения, например, пищевой материал может представлять собой одну составляющую конечного пищевого продукта. Только в качестве примера конечный пищевой продукт может представлять собой молочный продукт, такой как, например, сыр; в таких случаях пищевой материал также может представлять собой молоко (например, молоко для сыроделия), сливки и/или жир сливочного масла, например, используемый в получении указанного молочного продукта (например, сыра).

Когда пищевой материал образует только составляющую конечного пищевого продукта, в качестве примера, в некоторых вариантах воплощения конечный пищевой продукт может содержать меньше чем 10 мас.% пищевого материала, т.е. меньше чем 5 мас.%.

В некоторых вариантах воплощения, соответственно, конечный пищевой продукт может содержать от 0,01 до 4 мас.% пищевого материала.

В некоторых вариантах воплощения, соответственно, конечный пищевой продукт может содержать от 0,01 до 2 мас. % пищевого материала.

В некоторых вариантах воплощения, соответственно, конечный пищевой продукт может содержать от 0,01 до 1 мас.% пищевого материала.

В некоторых вариантах воплощения, соответственно, конечный пищевой продукт может содержать от 0,01 до 0,5 мас.% пищевого материала.

В некоторых вариантах воплощения, соответственно, конечный пищевой продукт может содержать от 0,01 до 0,3 мас.% пищевого материала.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает пищевой продукт, как определено выше, в котором продукт питания выбирают из одного или большего количества следующих: яйца, продукты на основе яиц, включая, но не ограничиваясь приведенными, майонез, соусы к салату, соусы, мороженное, яичный порошок, модифицированный яичный желток и продукты, полученные из него; хлебобулочные изделия, включая хлеб, торты, продукты из сладкого теста, слоёное тесто, жидкое тесто, кексы, пончики, бисквиты, крекеры и печенье; кондитерские изделия, включая шоколад, конфеты, карамель, халву, камеди, включая камеди, подслащенные сахаром и без сахара, жевательную резинку, мягкую жевательную резинку, жвачки и пудинги; замороженные продукты, включая щербеты, предпочтительно замороженные молочные продукты, включая мороженое и молочное мороженое; молочные продукты, включая сыр, сливочное масло, молоко, сливки для кофе, взбитые сливки, яичный крем, молочные напитки и йогурты; муссы, взбитые сливки растительного происхождения, мясные продукты, включая обработанные мясные продукты; съедобные масла и жиры, газированные и негазированные взбитые продукты, эмульсии типа масло-в-воде, эмульсии типа вода-в-масле, маргарин, шортенинг и пасты, включая низкожирные и очень низкожирные пасты; начинки, майонез, подливы, соусы на основе сливок, супы на основе сливок, напитки, пряные эмульсии и соусы.

Соответственно, пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой деликатесы, включая торты, мучные кондитерские изделия, кондитерские изделия, шоколадки, помадки и подобные.

В одном аспекте пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой продукт из теста или печёный продукт, такой как хлеб, жареный продукт, закуску, торты, пирожки, шоколадные кексы, печенье, макаронные изделия, лёгкие закуски, такие как крекеры, крекеры из муки грубого помола, солёные крендельки и картофельные чипсы, и блюда из макарон.

В дополнительном аспекте пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой пищевой продукт, полученный из растений, такой как мука, смеси, масла, жиры, масло какао, забеливатель для кофе (заменитель молока), соусы для салатов, маргарин, пасты, арахисовое масло, шортенинги, мороженое, кулинарные жиры.

В другом аспекте пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой молочный продукт, включая сливочное масло, молоко, сливки, сыр, такой как натуральный, плавленый и искусственный сыры в многообразии форм (включая измельчённый, брикетированный, кусочками или тёртый), творожно-сырная паста, мороженое, замороженные десерты, йогурт, питьевые йогурты, молочный жир, безводный молочный жир, другие молочные продукты. Фермент в соответствии с настоящим изобретением может улучшить стабильность жиров в молочных продуктах.

Как используется в данной заявке, термин молоко может включать молоко от любого животного или растительного происхождения. Можно использовать молоко из животных источников, таких как буйвол, (традиционная) корова, овца, коза и т.д., или отдельно, или смешанно. Также может быть использовано растительное молоко, такое как соевое молоко. Растительное молоко может быть использовано в комбинации с животным молоком, например, при низком процентном содержании (растительного молока), к примеру меньше 15%, или меньше 20%, или меньше 25% об./об. Термин молоко может также включать молоко для сыроделия и сливки. Одно преимущество настоящего изобретения заключается

- 30 018153 в том, что оно может содействовать введению соевого молока в сырную продукцию при более высокой концентрации при смешивании с молоком из животного источника. Не желая связываться теорией, это может происходить благодаря эмульгирующим свойствам соевого молока, обработанного в соответствии с настоящим изобретением.

В одном аспекте пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой мороженое.

В одном аспекте пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой или может включать сыр или аналоги сыра.

В одном варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу получения сыра, используя липидацилтрансферазу, и/или к применению липидацилтрансферазы для производства сыра. Предпочтительно указанное применение приводит к одному или большему количеству технических эффектов в сыре, раскрытых в данной заявке.

Соответственно, в некоторых вариантах воплощения пищевой продукт может представлять собой производную пищевого продукта в соответствии с настоящим изобретением. Только в качестве примера пищевой продукт может представлять собой пиццу, содержащую сыр, полученный в соответствии с настоящим изобретением.

В данной заявке термин сыр относится к любому виду сыра, такому как, например, натуральный сыр, аналоги сыра и плавленый сыр. Этот сыр может быть получен с помощью любого подходящего процесса, известного в данной области техники, такого как, например, ферментативная коагуляция молока для сыроделия и/или сливок с помощью сычуга, или кислотная коагуляция молока для сыроделия и/или сливок с помощью пищевой кислоты или кислоты, полученной путём роста молочнокислых бактерий.

В одном варианте воплощения сыр, произведённый с помощью способа данного изобретения, представляет собой сычужно-творожный сыр. Сычуг является коммерчески доступным, например, как №-11игепе (животный сычуг), СНу-тахе (химозин, полученный ферментацией), М1сго1аие (микробный коагулянт, полученный путём ферментации), все из СНг. Напзеп А/8, Эептагк). Молоко для сыроделия и/или сливки могут быть подвергнуты обычному процессу сыроделия.

Предпочтительный коагулянт представляет собой Магхуте®. чистый, микробный коагулянт, обеспечивает преимущества полученного ферментацией химозина (ТРС), не влияя на выход или вкус.

Плавленый сыр предпочтительно производят из натурального сыра или аналогов сыра путём приготовления и эмульгирования сыра, к примеру, с помощью солей-эмульгаторов (например, фосфатов и цитрата). Указанный способ может дополнительно включать добавление специй/приправ.

Термин аналоги сыра относится к сыроподобным продуктам, которые содержат жир (такой как, например, молочный жир (например, сливки)) как часть композиции и которые дополнительно содержат как часть композиции немолочные составляющие, такие как, например, растительное масло. Пример аналогов сыра представляет собой сырную основу. Аналоги сыра могут включать соевое молоко или соевый белок.

Сыры, произведённые с помощью способа настоящего изобретения, включают все разновидности сыра, такие как, например, Сатрезто, СНез1ег, ЭанЬо, ЭгаЪап!, Неггедагй, МапсНедо, РптаЦуо, Ргоуо1опе, 8ат1 РаиНп, 8ой сНеезе, 8уес1а, Та1еддю, \УННе сНеезе, включая сычужный сыр, произведённый с помощью сычужной коагуляции сырной творожной массы; созревшие сыры, такие как СНеййаг, Со1Ьу, Ейат, Миепз!ег, Сгуеге, ЕттеШНак СатетЬег!, Рагтезап и Котапо; свежие сыры, такие как Моцарелла (Моххаге11а) и Фета (Те1а); коагулированные с помощью кислоты сыры, такие как сливочный сыр, №иГсНа!е1, Оиагд, Сойаде СНеезе и ОнезоВ1апсо; и сыр паста филата.

Один вариант воплощения относится к производству сыра для пиццы с помощью способа данного изобретения.

В производстве сыра коагуляция казеина в молоке предпочтительно проводится двумя путями: так называемый сычужный и творожный сыр. В производстве сыра эти два типа творога обеспечивают получение двух основных групп типов сыра. Свежие творожные сыры относятся к тем разновидностям сыра, которые получают путём коагуляции молока, сливок или сыворотки с помощью подкисления или комбинации кислоты и тепла и которые готовы к употреблению, как только производство без вызревания заканчивается. Свежие творожные сыры в основном отличаются от разновидностей сычужных сыров (например, СатетЬей, СНеййаг, Еттеп1йа1), где коагуляцию в основном вызывают действием сычуга при значениях рН 6,4-6,6, так как коагуляция в основном происходит близко к изоэлектрической точке казеина, т.е., например, при рН 4,6 или при более высоких значениях, когда используют повышенные температуры, например, в Ккойа рН 6,0 и 80°С.

В одном варианте воплощения данного изобретения сыр принадлежит к классу сычужных сыров.

Моцарелла представляет собой члена так называемого паста филата, или тянущегося творога, сыров, которые, как правило, отличаются уникальной пластифицирующей и месильной обработкой свежего творога в горячей воде, которая придаёт конечному сыру его характерную волокнистую структуру и свойства для плавления и растягивания, ср., например, Моххаге11а апй Р(хха сНеезе Раи1 8. Кшйз!ей!,

- 31 018153

СНее5е: Сйет151гу, р11У51с5 апб ткгоЬю^ду, т. 2: Μ;·ι]ογ СНее5е βΓουρ5, второе издание, стр. 337-341, Сйартап & На11. Сыр для пиццы, как используется в данной заявке, включает сыры, подходящие для пицц, и они, как правило, представляют собой сыры паста филата/тянущийся творог. В одном варианте воплощения способ данного изобретения дополнительно включает температурную/растягивающую обработку как для сыров паста филата, например для производства Моцарелла.

В одном варианте воплощения предпочтительно сыр в соответствии с настоящим изобретением представляет собой Моцарелла.

В дополнительных вариантах воплощения данного изобретения молоко для сыроделия получают, полностью или частично, из фракций сухого молока, таких как, например, порошок цельного молока, порошок обезжиренного молока, казеин, казеинат, общий молочный белок или сухая пахта или любая их комбинация.

В одном варианте воплощения предпочтительно пищевой продукт и/или пищевой материал в соответствии с настоящим изобретением представляет собой молочный жир.

В одном варианте воплощения, в особенности, когда пищевой продукт и/или пищевой материал, обработанный с помощью липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой молочный жир, этот обработанный ферментом молочный жир затем может быть использован для производства последующего молочного продукта (в особенности сыра) и/или маргарина или паст (включая пасты с низким содержанием жира и очень низким содержанием жира).

В одном варианте воплощения обработанный ферментом молочный жир в соответствии с настоящим изобретением может быть добавлен к молоку (например, молоку для сыроделия) и/или сливкам, которые дальше могут быть использованы для получения последующего молочного продукта, такого как, например, сыр.

В другом варианте воплощения пищевой продукт и/или пищевой материал в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой молоко и/или сливки.

В одном варианте воплощения, в особенности, когда пищевой продукт и/или пищевой материал, обработанный с помощью липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой молоко (предпочтительно молоко для сыроделия) и/или сливки, обработанное ферментом молоко и/или сливки дальше могут быть использованы для получения последующего молочного продукта (такого как один или больше из таких, как сыр, мороженое, замороженные десерты, йогурт, питьевые йогурты, к примеру, в особенности сыр и/или мороженое).

В одном варианте воплощения пищевой продукт состоит из или включает сырный пищевой продукт, который нагревают до температуры выше температуры плавления сыра. Применение сыра, полученного в соответствии с данным изобретением, в пищевых продуктах, которые нагревают, может привести к сниженному эффекту выделения масла из сыра. При использовании сыра или сырных продуктов, полученных в соответствии с настоящим изобретением, также могут получаться преимущества в текстуре и приятный вкус.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению сыра, полученного с помощью способа настоящего изобретения, в пицце, готовых к употреблению блюд, таких как лазанья или плавленый сыр, или в качестве ингредиента в других пищевых продуктах. Соответственно, сыр, полученный в соответствии со способом данного изобретения, может быть использован в последующих обработанных пищевых продуктах, таких как плавленый сыр, пицца, гамбургеры, тост, соусы, начинки, сырный порошок или сырные отдушки.

В дополнительных вариантах воплощения способ данного изобретения дополнительно включает стадию подвергания сыра или пищевого продукта, содержащего сыр, полученного в соответствии с настоящим изобретением, термической обработке, такой как, например, в интервале приблизительно 150350°С, или в интервале приблизительно 155-345°С, или в интервале приблизительно 160-340°С, или в интервале приблизительно 170-330°С, или в интервале приблизительно 180-320°С, или в интервале приблизительно 200-300°С. Соответственно, термическая обработка может продолжаться в течение по крайней мере 2 мин, например в течение по крайней мере 5 мин, включая по крайней мере 10 мин.

В одном аспекте настоящего изобретения сыр, полученный в соответствии с настоящим изобретением, имеет температуру плавления, которая в существенной степени не отличается от температуры контрольного сыра (т.е. сыра, который не был получен, используя липидацилтрансферазу).

В другом аспекте настоящего изобретения сыр, полученный в соответствии с настоящим изобретением, имеет текстуру и консистенцию, которая подобна (если не лучше, чем) текстуре и консистенции контрольного сыра (т.е. сыра, который не был получен, используя липидацилтрансферазу).

В особенности предпочтительно использовать настоящее изобретение в сыре, так как производство свободных жирных кислот в сыре связано с мыльным привкусом. Таким образом, применение липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением преимущественно приводит к получению сыра без мыльного привкуса.

Уменьшенный мыльный привкус и/или уменьшенные посторонние ароматы и посторонний вкус, связанный с применением липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает значительное преимущество в сравнении с применением стандартной липазы и/или фосфолипазы

- 32 018153 (такой как, например, Ьесйазе™). Уменьшенные посторонние ароматы и посторонний вкус преимущественно могут быть результатом снижения при производстве свободных жирных кислот в течение ферментативных реакций. Жирные кислоты, ферментативно удалённые с помощью липидацилтрансферазы от донора ацила, переносятся к молекуле акцептора ацила и, таким образом, не накапливаются в сыре.

В другом аспекте пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой пищевой продукт, содержащий ингредиенты животного происхождения, такие как обработанные мясные продукты, кулинарные жиры, шортенинги.

В дополнительном аспекте пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой напиток, фрукт, смесь фруктов, овощ или вино. В некоторых случаях напиток может содержать до 20 г/л добавленных фитостеролов.

В другом аспекте пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой корм для животных. Этот корм для животных может быть обогащен фитостеролом и/или фитостанолами, предпочтительно β-ситостеролом/станолом. Соответственно, корм для животных может представлять собой корм для птиц. Когда пищевой продукт представляет собой корм для птиц, настоящее изобретение может быть использовано для снижения содержания холестерина в яйцах, полученных от птицы, которую кормят пищевым продуктом в соответствии с настоящим изобретением.

В одном аспекте предпочтительно пищевой продукт выбирают из одного или больше из следующих: яйца, продукты на основе яиц, включая майонез, заправки к салатам, соусы, мороженое, яичный порошок, модифицированный яичный желток и продукты, полученные из него.

Предпочтительно пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением представляет собой воду, содержащую пищевой продукт. Соответственно, пищевой продукт может содержать 10-98% воды, предпочтительно 14-98% воды, предпочтительно 18-98% воды, предпочтительно 20-98% воды, предпочтительно 40-98% воды, предпочтительно 50-98% воды, предпочтительно 70-98% воды, предпочтительно 75-98% воды.

Для некоторых аспектов предпочтительно пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением не представляет собой чистое растительное масло, такое как, например, оливковое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло, рапсовое масло. Во избежание возникновения сомнений в некоторых аспектах настоящего изобретения пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением может включать масло, но предпочтительно пищевой продукт не состоит в основном из масла или смесей масла. Для некоторых аспектов предпочтительно пищевой продукт включает меньше чем 95% липидов, предпочтительно меньше чем 90% липидов, предпочтительно меньше чем 85% липидов, предпочтительно меньше чем 80% липидов. Таким образом, для некоторых аспектов настоящего изобретения масло может представлять собой компонент пищевого продукта, но предпочтительно пищевой продукт не представляет собой масло рег 8е.

Формула настоящего изобретения должна быть построена так, чтобы включать каждый из пищевых продуктов, описанных выше.

В случае, когда сложный эфир углевода получают в соответствии с настоящим изобретением, сложный эфир углевода предпочтительно представляет собой сложный эфир олигосахарида, сложный эфир моносахарида или сложный эфир дисахарида.

Соответственно, сложный эфир углевода при производстве в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой один или больше из следующих: сложный эфир глюкозы, сложный эфир фруктозы, сложный эфир ангидрофруктозы, сложный эфир мальтозы, сложный эфир лактозы, сложный эфир галактозы, сложный эфир ксилозы, сложный эфир ксилоолигосахарида, сложный эфир арабинозы, сложный эфир мальтоолигосахарида, сложный эфир тагатозы, сложный эфир сахарозы, сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т или сложный эфир кортальцерона.

Предпочтительно сложный эфир углевода при производстве в соответствии с настоящим изобретением представляет собой один или больше из следующих: моносложный эфир углевода, моносложный эфир сахара, моносложный эфир олигосахарида, моносложный эфир трисахарида, моносложный эфир дисахарида, моносложный эфир моносахарида, моносложный эфир глюкозы, моносложный эфир фруктозы, моносложный эфир ангидрофруктозы, моносложный эфир мальтозы, моносложный эфир лактозы, моносложный эфир галактозы, моносложный эфир ксилозы, моносложный эфир ксилоолигосахарида, моносложный эфир арабинозы, моносложный эфир мальтоолигосахарида, моносложный эфир тагатозы, моносложный эфир сахарозы, сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т или сложный эфир кортальцерона.

В одном варианте воплощения сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т и/или сложный эфир кортальцерона может функционировать как противомикробный агент. Альтернативно или дополнительно к этому, сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т и/или сложный эфир кортальцерона может функционировать в качестве одного или обоих антиоксиданта и/или эмульгатора.

Предпочтительно образование сложного эфира углевода (если это имеет место) в соответствии с

- 33 018153 настоящим изобретением не зависит от ИОР-глюкозы.

Предпочтительно пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением не содержит ЬЭРглюкозы или включает ИОР-глюкозу только в незначительных количествах.

Соответственно, эмульгатор в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой, например, один или больше из следующих: диглицерид, моноглицерид, такой как 1-моноглицерид, или лизолецитин, такой как лизофосфатидилхолин, например дигалактозил моноглицерид (ЭСМС). Указанный эмульгатор предпочтительно получают из донора липидного ацила после удаления одной или больше ацильных групп с указанного донора липидного ацила. Термин лизолецитин, как используется в данной заявке, охватывает лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилинозитол, лизофосфатидилсерин и лизофосфатидилглицерин.

Когда один из эмульгаторов представляет собой сложный эфир углевода, второй эмульгатор может представлять собой, например, один или больше из следующих: диглицерид, моноглицерид, такой как 1моноглицерид, лизофосфатидилхолин, или дигалактозил моноглицерид (ЭСМС). Второй эмульгатор предпочтительно получают из донора липидного ацила после удаления одной или больше ацильных групп с указанного донора липидного ацила. Термин лизофосфатидилхолин, как используется в данной заявке, является синонимичным с термином лизолецитин и эти термины могут быть использованы в данной заявке взаимозаменимо.

Предпочтительно второй эмульгатор представляет собой ЭСМС. Соответственно, ЭСМС получают ш κϊΐπ путём удаления ацильной группы от ΌΟΌΟ с переносом удалённой ацильной группы на углевод с образованием сложного эфира углевода.

Когда один из эмульгаторов представляет собой сложный эфир белка, и/или диглицерид, и/или моноглицерид, тогда второй эмульгатор может представлять собой, например, один или больше из следующих: диглицерид, моноглицерид, такой как 1-моноглицерид, лизофосфатидилхолин, или дигалактозил моноглицерид (ООМС). Второй эмульгатор предпочтительно получают из донора липидного ацила после удаления одной или больше ацильных групп с указанного донора липидного ацила. Термин лизофосфатидилхолин, как используется в данной заявке, является синонимичным с термином лизолецитин и эти термины могут быть использованы в данной заявке взаимозаменимо.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза данного изобретения может быть использована в способе для получения пищевого продукта, такого как кулинарное (например, съедобное) масло, маргарин или паста, молочный жир (например, для последующего использования в сыре и/или маргарине и/или пастах), в соответствии с чем пищевой продукт, как правило, содержит, или дополняется с помощью, глицерин и/или дополняется с помощью по крайней мере одного фосфолипида (например, лецитина) и/или гликолипида (например, дигалактозилдиглицерида) и необязательно фитостерола или фитостанола.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза данного изобретения может быть использована в способе для получения пищевого продукта, такого как маргарин или паста, в соответствии с чем этот пищевой продукт, как правило, содержит или дополняется с помощью глицерина по крайней мере один фосфолипид (например, лецитин) и/или гликолипид (например, дигалактозил-диглицерид) и необязательно фитостерол или фитостанол.

В одном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ производства модифицированного съедобного масла или жира (включая молочный жир), который включает г) лизофосфолипид и/или один или больше из следующих: глицерофосфатилхолин, фосфатилэтаноламин, фосфатилинозитол и фосфатилсерин, и и) моноглицерид, где указанный способ включает:

a) выбор по крайней мере одного съедобного масла или жира или их комбинации, где указанные съедобное масло или жир включает, по крайней мере, фосфолипид,

b) дополнение указанного съедобного масла или жира, выбранное в стадии а), экзогенным глицерином, и необязательно Ь) экзогенным фосфолипидом; в котором когда модифицированное съедобное масло или жир, выбранное в стадии а), по сути состоит из растительного масла, экзогенный фосфолипид добавляют в течение стадии Ь),

c) контактирование дополненного съедобного масла или жира стадии Ь) по крайней мере с одной липидацилтрансферазой и необязательно дополнительным ферментом, с получением реакционной смеси съедобное масло/фермент, и

ά) инкубирование указанной реакционной смеси съедобное масло/фермент при температуре, при которой указанная по крайней мере одна липидацилтрансфераза является активной для того, чтобы получить модифицированное съедобное масло или жир, включающее г) лизофосфолипид и/или один или больше из следующих: глицерофосфатилхолин, фосфатилэтаноламин, фосфатилинозитол и фосфатилсерин, и и) моноглицерид, и

е) необязательно деактивирование или удаление указанной липидацилтрансферазы и/или необязательно дополнительного фермента.

При использовании в качестве кулинарного масла или маргарина пищевой продукт может иметь улучшенные противооседающие свойства. Дополнительно или альтернативно пищевой продукт может иметь одно или больше полезных технических свойств, например улучшенную устойчивость к окисле

- 34 018153 нию, улучшенные свойства эмульгирования или полезность для здоровья.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза данного изобретения может использоваться в получении пищевых продуктов с низким содержанием жира, таких как пасты с низким содержанием жира, заправки для салатов с низким содержанием жира, майонез с низким содержанием жира, маргарины с низким содержанием жира и т.д. В таких пищевых продуктах с низким содержанием жира содержание жира, как правило, снижают путём добавления эмульгаторов и дополнительной воды в сравнении с эквивалентом с более высоким содержанием жира.

Было найдено, что липидацилтрансферазы, которые используют в композициях и способах данного изобретения, имеют уникальные свойства в сравнении с липолитическими ферментами, так как они имеют заметное предпочтение для переноса ацильной группы от липидов к акцепторам, другим чем вода, даже в присутствии значительного количества воды. В сравнении с ферментами предыдущего уровня техники найдено, что используемая в данном изобретении липидацилтрансфераза имеет высокую относительную трансферазную активность в присутствии 6% воды, 54% воды, 73% воды, 89% воды и приблизительно 95% воды. Тестируемые липолитические ферменты не имели, по существу, никакой значительной относительной трансферазной активности при этих концентрациях воды.

Фосфолипазная активность фермента может быть оценена, используя следующие исследования. Таким образом, может быть получена/идентифицирована липидацилтрансфераза, обладающая характеристиками фермента, определёнными в данной заявке.

Определение фосфолипазной активности (исследование фосфолипазной активности Т1РИ-К). Субстрат.

1,75% Ь-α фосфатидилхолин 95% растительный (ΑνΗηίί #441601), 6,3% Тритон-Х 100 (без пероксида) и 5 мМ СаС1₂ растворяют в 0,05М ΗΕΓΕ8 буфере рН 7.

Процедура исследования.

мкл субстрата добавляют в кювету (Копе-ЬаЬ. КоЬо1) и инкубируют при 30°С в течение 5 мин. В момент времени ΐ = 0 мин добавляют 4 мкл раствора фермента. Также анализируют холостой образец с водой вместо фермента. В момент времени ΐ = 10 мин добавляют 75 мкл ΝΕΡΑ А (субстрат Α ΝΕΡΑ набора от \Уако Сйет1са18, Сегтапу), смешивают и инкубируют при 30°С. В момент времени ΐ = 15 мин добавляют 150 мкл ΝΕΡΑ В (субстрат В ΝΕΡΑ набора от \Уако Сйеткак, Сегтапу) и инкубируют при 30°С. В момент времени ΐ = 20 мин измеряют абсорбцию (оптическая плотность 520 нм).

Калибровочную кривую на основе олеиновой кислоты строят и используют для калибрования свободной жирной кислоты в образцах.

Ферментную активность Т1РИ-К рассчитывают как микромоли жирной кислоты, полученные в минуту при условиях исследования.

Определение фосфолипазной активности (исследование фосфолипазной активности РЬИ-7). Субстрат.

0,6% Ь-α фосфатидилхолин 95% растительный (ΑνηηΙί #441601), 0,4% Тритон-Х 100 (§1дта Χ-100) и 5 мМ СаС1₂ диспергируют в 0,05М ΗΕΓΕ8 буфере рН 7.

Процедура исследования.

400 мкл субстрата добавляют к 1,5 мл пробирке Эппендорфа и помещают в термомиксер Эппендорфа при 37°С в течение 5 мин. В момент времени ΐ = 0 мин добавляют 50 мкл раствора фермента. Также анализируют холостой образец с водой вместо фермента. Указанный образец смешивают при 10x100 об./мин в термомиксере Эппендорфа при 37°С в течение 10 мин. В момент времени ΐ = 10 мин пробирку Эппендорфа помещают в другой термомиксер при 99°С в течение 10 мин для остановки реакции.

Свободную жирную кислоту в образцах анализируют, используя ΝΕΡΑ С набор от νΑΚΟ СтЬИ

Фермент активности РЬИ-7 при рН 7 рассчитывают как микромоли жирной кислоты, полученные в минуту при условиях исследования.

Липазная и ацилтрансферазная активность фермента может быть оценена, используя следующие исследования. Таким образом, может быть получена/идентифицирована липидацилтрансфераза, обладающая ферментными характеристиками, определёнными в данной заявке.

Исследование трансферазы в забуференном субстрате (см. пример 12).

Ферменты, которые функционируют как липидацилтрансферазы для использования в композициях и способах данного изобретения, могут быть в плановом порядке идентифицированы, используя исследование, описанное в данной заявке в примере 12. Это исследование в этой заявке дальше будет называться как Исследование трансферазы в забуференном субстрате. В примере 12 липидацилтрансферазный фермент из Αе^οтοηа8 8а1тошс1йа в соответствии с настоящим изобретением анализируют и сравнивают с рядом липолитических ферментов, которые не охватываются настоящим изобретением. Как может быть видно, найдено, что из липолитических ферментов только ΕΙΓΟΓΑΝ® Р (Nονοζуте8, Иептагк) имеет какую-либо трансферазную активность и то только очень низкий уровень (1,3%).

Ферменты, подходящие для использования в композициях и способах данного изобретения, могут быть в плановом порядке идентифицированы, используя исследование трансферазы в забуференном субстрате. Используя это исследование, в котором есть очень высокое содержание воды - приблизительно

- 35 018153

95%, липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением представляют собой те, которые имеют по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность (относительную трансферазную активность), предпочтительно по крайней мере 5% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 10% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 15, 20, 25 26, 28, 30, 40 50, 60 или 75% относительную трансферазную активность. Соответственно, липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь меньше чем 28%, меньше чем 30%, предпочтительно меньше чем 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% ацилтрансферазную активность.

Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды (см. пример 11).

Альтернативно (или дополнительно) использованию Исследования трансферазы в забуференном субстрате (смю выше), липидацилтрансфераза для использования в соответствии с настоящим изобретением может быть идентифицирована, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды, описанное в примере 11.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза, подходящая для использования в способах и/или композициях в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой такую, которая при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности. Действительно, эксперименты на яичном желтке с высоким содержанием воды показали, что в начале эксперимента начальная скорость трансферазы рассчитывается как 100% трансферазная активность, т.е. никакой гидролитической активности не наблюдается. Наоборот, липолитические ферменты, используемые как контроль, т.е. ЫРОРАЫ Р и фосфолипаза А2, не показали никакой определяемой трансферазной активности в яичном желтке с 54% воды, или яичном желтке с обогащенным содержанием воды (а именно яичный желток с 73% вода или 89% воды). Предпочтительно повышение в содержании воды в значительной степени не снижает процент ацилтрансферазной активности липидацилтрансферазы для использования в способах или композициях в соответствии с настоящим изобретением.

В предпочтительном варианте воплощения со ссылкой на Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды, с содержанием воды 54%, липидацилтрансфераза для использования в настоящем изобретении будет иметь исходный процент ацилтрансферазной активности (исходная относительная трансферазная активность), измеряемый после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида) по крайней мере 0,1% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 1% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 5% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 10% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 20% относительную трансфертную активность, предпочтительно по крайней мере 30% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 40% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 50% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 60%, предпочтительно по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 90%, предпочтительно по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, предпочтительно приблизительно 100% ацилтрансферазную активность.

В предпочтительном варианте воплощения со ссылкой на Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды, с содержанием воды 54%, и измеряемым после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида), липидацилтрансфераза для использования в композициях и способах данного изобретения имеет определяемую трансферазную активность, т.е. относительную трансферазную активность от 0,1 и 100%, предпочтительно по крайней мере 1% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 5% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 10% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 20% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 30% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 40% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 45, 50, 60, 70, 80 или 90% относительную трансферазную активность. Соответственно, липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь при использовании Исследования трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды, с содержанием воды 54%, и измеряемым после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида) процент ацилтрансферазной активности (относительной трансферазной активности) меньше чем 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%.

В предпочтительном варианте воплощения со ссылкой на Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды, с содержанием воды 73%, измеряемым после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида), липидацилтрансфераза для использования в композициях и способах данного изобретения имеет определяемую трансферазную активность, т.е. относительную трансферазную активность от 0,1 до 100%, предпочтительно по крайней мере 1% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 5% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 10% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 20% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 30% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 40% относительную трансфераз

- 36 018153 ную активность, предпочтительно по крайней мере 45, 50, 58, 60, 70, 80 или 90% относительную трансферазную активность. Соответственно, липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь при использовании Исследования трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды, с содержанием воды 73%, измеряемым после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида), процент ацилтрансферазной активности (относительной трансферазной активности) меньше чем 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%.

В предпочтительном варианте воплощения со ссылкой на Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды, с содержанием воды 89%, и измеряемым после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида), липидацилтрансфераза для использования в композициях и способах данного изобретения имеет определяемую трансферазную активность, т.е. относительную трансферазную активность от 0,1 и 100%, предпочтительно по крайней мере 1% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 5% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 10% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 20% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 30% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 40% относительную трансферазную активность, предпочтительно по крайней мере 45, 50, 60, 70, 80 или 90% относительную трансферазную активность. Соответственно, липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь при использовании Исследования трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды, с содержанием воды 89%, и измеряемым после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида) процент ацилтрансферазной активности (относительной трансферазной активности) меньше чем 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%.

В предпочтительном варианте воплощения со ссылкой на Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды липидацилтрансфераза для использования в композициях и способах данного изобретения имеет значительную относительную трансферазную активность (т.е. по крайней мере 0,1% при обоих содержаниях воды) и имеет эквивалентную относительную трансферазную активность в яичном желтке с содержанием воды 54% как в яичном желтке с содержанием воды 73%, при измерении после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида).

В предпочтительном варианте воплощения со ссылкой на Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды липидацилтрансфераза для использования в композициях и способах данного изобретения имеет значительную относительную трансферазную активность (т.е. по крайней мере 0,1% при обоих содержаниях воды) и имеет эквивалентную относительную трансферазную активность в яичном желтке с содержанием воды 54% как в яичном желтке с содержанием воды 89%, при измерении после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида).

В предпочтительном варианте воплощения со ссылкой на Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды липидацилтрансфераза для использования в композициях и способах данного изобретения имеет значительную относительную трансферазную активность (т.е. по крайней мере 0,1% при обоих содержаниях воды) и имеет эквивалентную относительную трансферазную активность в яичном желтке с содержанием воды 73% как в яичном желтке с содержанием воды 89%, при измерении после 10% расхода донорской молекулы (т.е. фосфолипида).

Термин эквивалентная относительная трансферазная активность, как описано в данной заявке, означает, что фермент имеет относительную трансферазную активность (% ацилтрансферазную активность), которая является по крайней мере на 2% ниже, предпочтительно по крайней мере на 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% ниже, в яичном желтке с более высоким содержанием воды в сравнении ней же в яичном желтке с более низким содержанием воды.

Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды.

Альтернативно (или дополнительно) использованию Исследования трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды и/или Исследования трансферазы в забуференном субстрате липидацилтрансферазы для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть идентифицированы, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды.

Для того чтобы определить, является ли фермент липидацилтрансферазой в соответствии с настоящим изобретением, специалист может провести Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, а именно в масляной среде с 6% воды, как описано в примере 22. Этот пример иллюстрирует, что в масляной среде с 6% содержанием воды липидацилтрансфераза данного изобретения имеет высокую относительную трансферазную активность, где липолитические ферменты предыдущего уровня техники имеют гидролитическую активность.

В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза, подходящая для использования в способах и/или композициях в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой такую, которая при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%, предпочтительно по крайней мере 2%, предпочтительно по крайней мере 5%, предпочтительно по крайней мере 10%, предпочтительно по крайней мере 20%, предпочтительно по крайней мере 30%, предпочтительно по крайней мере 40%, предпочтительно по крайней мере 50%,

- 37 018153 предпочтительно по крайней мере 60%, предпочтительно по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%. Соответственно, липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь меньше чем 30, 40, 50, 60, 70 или 80% активность при измерении через период времени 10, 20, 30 или 120 мин, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды.

Как описано выше, липазаацилтрансфераза данного изобретения может быть идентифицирована, используя или Исследование трансферазы в забуференном субстрате, или Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, используя холестерин как акцептор ацила. Конечно, квалифицированный специалист должен быть ясно осведомлён, что с очевидными дополнениями к аналитическим способам Исследование трансферазы в забуференном субстрате или Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды могут быть использованы для определения липидацилтрансферазной активности для комбинации любого донора липидного ацила или любого акцептора ацила. Квалифицированный специалист, если необходимо, легко заменил бы субстрат донора ацила (например, фосфолипид) на альтернативный субстрат донора ацила (например, гликолипид, триацилглицерид) и/или заменил бы акцептор ацила (например, холестерин) на альтернативный субстрат акцептора ацила (например, углевод, белок, другой стерол, станол или глицерин).

Термин высокое содержание воды, как используется в данной заявке, означает любой субстрат или пищевой продукт с более чем 2% содержанием воды, предпочтительно более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90%.

Термин низкое содержание воды, как используется в данной заявке, означает любой субстрат или пищевой продукт с меньше чем 6% содержанием воды, предпочтительно меньше чем 5, 4, 3, 2, 1 или 0,5%.

ЬИ8 исследование.

Способность гидролизовать триглицерид (Е.С. 3.1.1.3 активность) может быть определена с помощью липазной активности, которую определяют в соответствии с Кодексом пищевых химикатов (3-е изд., 1981, стр. 492-493), модифицированным для подсолнечного масла и рН 5,5 вместо оливкового масла и рН 6,5. Липазную активность измеряют как ЬИ8 (липазные единицы подсолнечника), где 1 ЬИ8 определяется как количество фермента, который может высвободить 1 мкмоль жирных кислот в минуту из подсолнечного масла при условиях описанного выше исследования.

ЬИТ исследование.

Альтернативно, может быть использовано ЬИТ исследование, как определено в \УО 9845453. Эта ссылка включена в данную заявку с помощью ссылки.

Липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением или для использования в способе и/или применениях настоящего изобретения, которая является по сути неспособной воздействовать на триглицерид, может иметь значение ЬИ8/мг менее чем 1000, например менее чем 500, такое как менее чем 300, предпочтительно менее чем 200, более предпочтительно менее чем 100, более предпочтительно менее чем 50, более предпочтительно менее чем 20, более предпочтительно менее чем 10, такое как менее чем 5, менее чем 2, более предпочтительно менее чем 1 ЬИ8/мг. Альтернативно, активность ЬИТ/мг является меньшей чем 500, такой как менее чем 300, предпочтительно менее чем 200, более предпочтительно менее чем 100, более предпочтительно менее чем 50, более предпочтительно менее чем 20, более предпочтительно менее чем 10, такой как менее чем 5, менее чем 2, более предпочтительно менее чем 1 ЬИТ/мг.

Липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением или для использования в способе и/или применениях настоящего изобретения, которая является по сути неспособной воздействовать на моноглицерид, может быть определена при использовании моноолеата (М7765 1-олеил-рац-глицерина 99%) вместо подсолнечного масла в ЬИ8 анализе. 1 МОНИ определяется как количество фермента, которое может высвобождать 1 мкмоль жирной кислот в минуту из моноглицерида при указанных выше условиях анализа.

Липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением или для использования в способе и/или применениях настоящего изобретения, которая является по сути неспособной воздействовать на триглицерид и может иметь значение МСНИ/мг менее чем 5000, например менее чем 1000, например менее чем 500, такое как менее чем 300, предпочтительно менее чем 200, более предпочтительно менее чем 100, более предпочтительно менее чем 50, более предпочтительно менее чем 20, более предпочтительно менее чем 10, такое как менее чем 5, менее чем 2, более предпочтительно менее чем 1 МСНИ/мг.

Предпочтительно способ и/или применение в соответствии с настоящим изобретением может быть проведён, например, в пищевом продукте при температуре 15-60°С, предпочтительно при температуре 20-60°С, предпочтительно 20-50°С, предпочтительно 20-45°С, предпочтительно 20-40°С. Для некоторых аспектов, например, в тесте, предпочтительно температура пищи, при которой происходит ацилтрансферазная реакция, составляет от 20 до 40°С. Для других аспектов, например, в отношении молочных продуктов, таких как сыр, температура пищи, соответственно, может составлять от 30 до 60°С. В следующих других аспектах, например, в отношении майонеза, температура пищи, соответственно, может составлять от 20 до 40°С, более предпочтительно от 25 до 30°С.

Предпочтительно эмульгатор, полученный в соответствии с настоящим изобретением, включает

- 38 018153 меньше чем 5 мас.% пищевого продукта.

Предпочтительно эмульгатор, полученный в соответствии с настоящим изобретением, включает от 0,01 до 4 мас.% пищевого продукта.

Предпочтительно эмульгатор, полученный в соответствии с настоящим изобретением, включает от 0,01 до 2 мас.% пищевого продукта.

Предпочтительно эмульгатор, полученный в соответствии с настоящим изобретением, включает от 0,01 до 1 мас.% пищевого продукта.

Предпочтительно эмульгатор, полученный в соответствии с настоящим изобретением, включает от 0,01 до 0,5 мас.% пищевого продукта.

Предпочтительно эмульгатор, полученный в соответствии с настоящим изобретением, включает от 0,01 до 0,3 мас.% пищевого продукта.

Соответственно, способ в соответствии с настоящим изобретением включает дезактивирование или денатурирование фермента для обеспечения получения пищевого продукта, содержащего фермент в дезактивированной или денатурированной форме. Предпочтительно этот фермент может быть денатурирован или с помощью выпекания, или с помощью пастеризации.

Настоящее изобретение может дополнительно охватывать применение липидацилтрансферазы, как определено в данном описании, в пищевых и/или кормовых ферментных композициях и может охватывать пищевые и/или кормовые ферментные композиции, содержащие липидацилтрансферазу, как определено в данном описании. Такие композиции могут содержать один или больше дополнительных ферментов, таких как те, что описаны в данной заявке. Альтернативно, ферментная композиция данного изобретения может быть использована в комбинации с другими пищевыми ингредиентами/добавками, такими как те, что описаны в данной заявке, включая другие ферментные композиции. Путём формулирования липидацилтрансферазы данного изобретения в пищевой и/или кормовой композиции фермент может быть стабилизирован для того, чтобы обеспечить пролонгированное хранение (при подходящих условиях) перед применением в получении пищи и/или корма. Дополнительно ферментная композиция настоящего изобретения обеспечивает фермент в подходящей форме для безопасного использования для 'ш кПи применения в получении пищевых продуктах и/или кормах или ингредиентов для использования в получении пищи и/или корма. Такие композиции могут быть или в жидкой, полужидкой или твёрдой/гранулированной форме.

В одном варианте воплощения пищевая ферментная композиция может представлять собой композицию, улучшающую тесто. Композиция, улучшающая тесто, может включать другие полезные компоненты, такие как эмульгатор и/или другие ферменты, как раскрыто в данной заявке.

Пищевые ферменты продаются в виде стабилизированных жидких концентратов или в виде измельчённых твердых частичек. Формулирование в пищевую ферментную композицию минимизирует потери в ферментативной активности при транспортировании, хранении и применении. Ферменты часто подвергаются действию влаги, высокой температуры или окислительных сред при обработке пищи и напитков. Формулирования повышают стабильность путём противодействия первичным силам дезактивации: денатурация, дезактивация каталитического сайта и протеолиз. Денатурация происходит путём физического развёртывания третичной белковой структуры фермента при термическом или химическом стрессе. Когда фермент начинает развёртываться, он становится значительно более уязвимым к дезактивации и протеолизу. Для минимизирования развёртывания разработчик рецептуры может изменять окружение белка для того, чтобы обеспечить компактную белковую структуру; это делается наиболее эффективно с помощью избирательного исключения воды с белковой поверхности путём добавления связывающих воду соединений, таких как сахара, многоатомные спирты и лиотропные соли. Наилучшими путями борьбы с дезактивацией каталитического сайта является обеспечение достаточных уровней любых необходимых кофакторов, добавление обратимо действующих ингибиторов и исключение окисляющих или реакционноспособных частиц из композиции.

Кроме ферментативной стабильности, композиция должна отвечать нескольким ключевым вторичным требованиям, включая предохранение от микробного заражения, избегание физического осаждения или образования мути, минимизирование образования сенсибимизирующей пудры или аэрозолей и оптимизацию эстетических критериев, таких как цвет и аромат. Многие из этих проблем решаются наилучшим образом путём фокусирования внимания на наиболее ранних операциях процесса, так это возможно, включая выбор сырых материалов в процессе ферментации или восстановления фермента. Последующие операции, такие как диафильтрование, адсорбция, хроматография, кристаллизация и экстракция, могут быть использованы для удаления примесей, которые отвечают за цвет, запах и осаждение. Риск физического осаждения минимизируется путём рецептирования около изоэлектрической точки фермента с гидрофильными растворителями, такими как глицерин или пропиленгликоль. Специалист может эффективно также добавлять умеренные уровни сольватирующих солей для избегания или высаливания или обратного всаливания. Для предупреждения микробного заражения специалист может использовать комбинацию фильтрования, подкисления и минимизации количества свободной воды; биоциды могут быть эффективными, но ряд приемлемых химических веществ для контролирования или уничтожения микробов всё больше и больше ограничивается санитарными нормами.

- 39 018153

Два способа производства наиболее износостойких гранул на сегодняшний день представляют собой грануляцию с большим усилием сдвига и нанесением покрытия разбрызгиванием псевдосжиженого слоя, см., например, Т. Вескег: 'ЪсрагаНон апб ΡπΓίΓίοαΙίοη Ргосс55С5 Гог Рсеоусгу оГ Ιη6ιΐ8ΐπ;·ι1 Енхутсх в В. К. 8ίη§1ι, 8. 8. Н. Κίζνί (ред.): В^ο8сра^аί^οη Ргоссббсз ίη Рообз, Магсс1 Искксг, №\ν Υο^к. стр. 427-445. В этих способах применяют различные связывающие агенты, покрытия и закономерности строения частиц для получения нехрупких частиц, которые всё же защищают ферменты в процессе хранения, но обеспечивают их лёгкое высвобождение в раствор в процессе применения.

Пищевые ферментные композиции, содержащие липидацилтрансферазу данного изобретения, могут быть получены, используя стандартные технологии формулирования, такие как распылительная сушка или жидкостное рецептирование.

Липидацилтрансфераза данного изобретения может экспрессироваться в любом подходящем экспрессирующем организме. Например, липидацилтрансфераза данного изобретения может экспрессироваться в Вас111и8 биЬййб и может быть очищена с помощью ультрафильтрования и/или с помощью осаждения в этаноле и/или центрифугирования и дальше может быть высушена распылением, используя крахмал (мальтодекстрин) как носитель для фермента. Высушенный распылением фермент может быть стандартизирован к определённой РЬИ активности путём добавления дополнительного носителя в порошкообразной форме. Применяемые технологии являются широкоизвестными и общепринятыми в данной области техники.

Альтернативно, липидацилтрансфераза для использования в соответствии с настоящим изобретением, например гетерологично полученная липидацилтрансфераза данного изобретения, после очистки, может быть стабилизирована в подходящей жидкой композиции, такой как композиция на основе глицерина. Другие способы получения стабилизированных ферментных композиций описаны в ЕР 0770037 и ЕР 0702712.

Ацилтрансфераза в порошкообразной форме также может быть использована в комбинации с другими ферментами, представленными в данном описании, для получения ферментных композиций с определённой активностью в соответствии с техническими условиями к продуктам.

Как правило, доза композиции пищевого фермента находится в интервале от 10 до 1000 г на 1000 кг пищевого продукта, предпочтительно 50-200 г на 1000 кг пищевого продукта, предпочтительно 75-125 г на 1000 кг пищевого продукта.

Предпочтительно фермент в соответствии с настоящим изобретением присутствует в неактивной форме или в денатурированной форме в продукте питания.

В одном варианте воплощения фермент в соответствии с настоящим изобретением является предпочтительно не иммобилизированным, в частности не иммобилизированным на твёрдой подложке.

В альтернативном варианте воплощения фермент может быть иммобилизированным.

Иммобилизованная липидацилтрансфераза может быть получена, используя технологии иммобилизации, известные в данной области техники. Существует много способов получения иммобилизованных ферментов, которые будут очевидны специалисту, квалифицированному в данной области техники (например, технологии, на которые ссылаются в ЕР 0746608; или Ва1сао ν.Μ., Райа А.Ь., Ма1са1а Р.Х., Εηζутс МюгоЬ Тссйио1. 1996 Мау 1; 18 (6): 392-416; или ВссМ М.Т., басдсг К.Е. Сйст Рйуз Ыр1бб. 1998 ίιιη; 93 (1-2): 3-14; или Вотксйсисг и.Т., Вс881сг С., 8итуа8 В., КгЫта 8.Н. Тгсп6з ВюГссйиок 2002 ОсГ; 20(10): 433-7 (каждый из которых включен в данную заявку с помощью ссылки).

В одном варианте воплощения пищевой продукт данного изобретения может содержать пищевые ингредиенты, которые получены, используя иммобилизованную липидацилтрансферазу, но не содержат липидацилтрансферазы в пищевом ингредиенте или пищевом продукте. Например, пищевой продукт может содержать один или больше из следующих: эмульгатор, больше чем один эмульгатор, один или больше ароматизаторов, один или больше агентов, улучшающих текстуру, и/или один или больше сложных эфиров стерола, таких как фитосложные эфиры стерола или фитосложные эфиры станола.

Фермент в соответствии с настоящим изобретением может быть использован с одним или большим количеством используемых обычно эмульгаторов, включая, например, моноглицериды, сложные эфиры диацетилвинной кислоты и моно- и диглицеридов жирных кислот, и лецитины, например, полученные из сои.

Фермент в соответствии с настоящим изобретением может быть использован с одним или большим количеством других подходящих пищевых ферментов. Таким образом, в объём настоящего изобретения попадает то, что к пищевому продукту кроме фермента данного изобретения добавляют по крайней мере один дополнительный фермент. Такие дополнительные ферменты включают разлагающие крахмал ферменты, такие как эндо- или экзоамилазы, пуллуланазы, деветвящие ферменты, хемицеллюлазы, включая ксиланазы, целлюлазы, оксидоредуктазы, например пероксидазы, фенол оксидазы, оксидаза глюкозы, оксидаза пиранозы, сульфгидрил оксидаза или оксидаза углевода, такая как та, которая окисляет мальтозу, например оксидаза гексозы (НОХ), липазы, фосфолипазы, гликолипазы, галактолипазы и протеазы.

В одном варианте воплощения фермент может представлять собой Иа1гу НОХ™, который действует как поглотитель кислорода, для продления срока хранения сыра, при этом обеспечивая контроль поджаривания в духовках для пиццы. Поэтому в одном аспекте настоящее изобретение относится к примене

- 40 018153 нию фермента, способного уменьшать реакцию Майяра в продукте питания (см. \УО 02/39828, включенный в данную заявку путём ссылки), таком как молочный продукт, например сыр, где фермент предпочтительно представляет собой оксиляющий мальтозу фермент, такой как оксидаза углевода, оксидаза глюкозы и/или оксидаза гексозы, в процессе или получении пищевого материала и/или пищевого продукта в соответствии с настоящим изобретением.

В одном предпочтительном варианте воплощения липидацилтрансферазу используют в комбинации с липазой, имеющей одну или больше из следующих липазных активностей: гликолипазная активность (Е.С. 3.1.1.26, триацилглицеринлипазная активность (Е.С. 3.1.1.3), фосфолипазная А2 активность (Е.С. 3.1.1.4) или фосфолипазная А1 активность (Е.С. 3.1.1.32). Соответственно, липазные ферменты хорошо известны в данной области техники и включают в качестве примера следующие липазы: ЕРОРАШ® Е и/или ΕΕΟΤΑδΕ® ИБТКА (Νονοζ\τικ5 А/8, Бептагк), фосфолипаза А2 (например, фосфолипаза А2 от ЕРОМОБ™ 22Ь от Вюса1а1у515, ЕРОМАХ™ от Οοη^οΓ), ^IРО^Α8Ε® (Νονοζνιηοδ А/8, Бептагк), липазы, описанные в \УО 03/97835, ЕР 0977869 или ЕР 1193314. Эта комбинация липидацилтрансферазы, как определено в данном описании, и липазы может быть в особенности предпочтительной в тесте или печеных продуктах или в деликатесных продуктах, таких как пирожные и кондитерские продукты.

В некоторых вариантах воплощения может быть предпочтительным объединять применение липидацилтрансферазы с липазой, такой как сычужная паста, полученная из желудков телят, ягнят, козлят, или Ра1а1а5С А750Ь (Νονο), Ра1а1а5С М200Б (Νονο), Ра1а1а5С М1000 (Νονο) или Рюсап1а5С А (Б8М), а также Рюсап1а5с из животных источников от Б8М (К, КБ, Б & С) или Εροιηοά 187, Εροιηοά 338 (Вюса1а1у515). Эти липазы традиционно используются при производстве сыра для получения веществ, придающих сыру определенный вкус. Эти липазы могут также использоваться для получения ферментативно модифицированных пищевых продуктов, например молочного продукта (например, сыра), в частности, где указанный молочный продукт состоит из, получен из или включает молочный жир. Комбинация липидацилтрансферазы с одной или более из этих липаз может оказывать благоприятный эффект на вкус молочного продукта (например, сыра).

Применение липаз в комбинации с ферментом в соответствии с изобретением может быть, в частности, предпочтительным в случаях, когда некоторое накопление свободных жирных кислот может быть желательным, например, в сыре, где свободные жирные кислоты могут придавать желаемый вкус, или при получении деликатесов. Специалист в данной области техники будет в состоянии смешать пропорции липолитических ферментов, например ЕРОРАБ® Е и/или ^ΕСIΤΑ8Ε® иЬТРА (Νονοζ\τηο5 А/8, Бептагк), фосфолипазы А2 (например, фосфолипазы А2 из ЕРОМОБ™ 22Ь от Вюса1а1у515, БЛОМАХ™ из бепе^!^-), ^IРО^Α8Ε® (Νονοζ\Ίηο5 А/8, Бептагк), липаз, описанных в \УО 03/97835, ЕР 0977869 или ЕР 1193314, и липидацилтрансферазы настоящего изобретения для обеспечения желаемого соотношения гидролитической и трансферазной активности, что приводит к предпочтительному техническому эффекту или комбинации технических эффектов в пищевых продуктах (такому как те, что приведены в данной заявке под названием Технические эффекты).

Также может быть предпочтительным объединять применение липидацилтрансферазы с фосфолипазой, такой как фосфолипаза А1, фосфолипаза А2, фосфолипаза В, фосфолипаза С и/или фосфолипаза Б.

Сочетанное применение может осуществляться последовательно или одновременно, например обработка с помощью липидацилтрансферазы может осуществлять до или во время дополнительной ферментной обработки. Альтернативно, дополнительная ферментная обработка может осуществлять до или во время обработки с помощью липидацилтрансферазы.

В случае последовательных ферментных обработок в некоторых воплощениях может быть желательным удалять первый используемый фермент, например, с помощью тепловой дезактивации или при использовании иммобилизованного фермента, перед обработкой с помощью второго (и/или третьего и т.д.) фермента.

Традиционно промышленность по производству тортов применяет добавки, улучшающие свойства тортов, для получения тортов и для гарантирования высокого качества тортов, что касается вкуса, структуры, пищевой ценности и внешнего вида. Эти добавки, улучшающие свойства тортов, как правило, основываются на эмульгаторах, высушенных распылением на носитель, такой как крахмал и мальтодекстрин. Некоторые добавки, улучшающие свойства тортов, находятся также в гелевой форме на основе эмульгаторов, сахаров и воды. Эти добавки, улучшающие свойства тортов, являются очень важными для промышленности по производству тортов для получения тортов высокого качества. Однако, добавки, улучшающие свойства тортов, содержат эмульгаторы и другие ненатуральные ингредиенты с Еномером. Из-за требования для потребителей снизить количество Е-номеров, промышленность по производству тортов ищет альтернативные пути получения тортов высокого качества без применения эмульгаторов.

Альтернативный способ получения торта заключается в использовании фермента, т.е. липидацилтрансферазы, определённой в данной заявке, или ферментной композиции в соответствии с настоя

- 41 018153 щим изобретением.

Липидацилтрансфераза, как определено в данном описании, и/или пищевая ферментная композиция настоящего изобретения может быть использована в получениях деликатесных продуктов, таких как пирожные. В таких случаях следующие составляющие могут быть образованы в деликатесном продукте:

ί) сложные эфиры сахара и лизолецитин (из углевода в рецепте пирожных и лецитин в яйце, который также составляет часть рецепта пирожных); и/или ίί) ацилированные пептиды и лизолецитин (путём переноса жирной кислоты от лецитина к белку или пептиду в процессе образования конденсатов белок-жирная кислота, которые, как известно, являются высоко эффективными эмульгаторами (Нег51е11ипд ипб Апуепбипдтодйсйкейеп νοη Еше155Εеΐΐ5аи^екοηάеη5аΐеη. Апбгеа5 8апбег, ЕЬегйагб ЕПег5, Апбгеа НеПетапп, Ебйй νοη Кге15. Еей/11р1б 99 (1997) №. 4, 115-120).

Считается, что в производстве некоторых деликатесных продуктов, в особенности деликатесных продуктов с высоким содержанием жира, таких как пирожные, может быть желательно иметь некоторое накопление жирных кислот. Поэтому комбинация применения липолитических ферментов и липидацилтрансферазы, как определено в данном описании, может быть в особенности предпочтительной для производства деликатесных продуктов с высоким содержанием жира. Альтернативно, дополнительные свободные жирные кислоты или мыло жирной кислоты (Е470а) могут быть выбраны и использованы в комбинации с липидацилтрансферазой.

Пищевой продукт в соответствии с настоящим изобретением, соответственно, может включать одну или больше из следующих добавок:

соевый белковый материал; каротиноиды, флавеноиды, антиоксидант и фитохимическое вещество (в особенности антоцианонид, каротиноид, биофлавиноид, глутатион, катехин, изофлавон, ликопин, гинсенозид, пикногенол, алкалоид, пигеум фитостерол, сульфорафон, ресверетол, экстракт виноградных косточек или пища, содержащая сложные эфиры станола), витамин (в особенности витамин С, витамин А, витамин В3, витамин Ό, витамин Е, тиамин, рибофлавин, ниацин, пиридоксин, цианокобаламин, фолиевая кислота, биотин, пантотеновая кислота или витамин Κ), минералы (в особенности кальций, йод, магний, цинк, железо, селен, марганец, хром, медь, кобальт, молибден или фосфор), жирная кислота (в особенности γ-линолеиновоя кислота, укоспентаеноевая кислота или декозагексаеноевая кислота), масло (в особенности масло бурачника, масло канолы с высоким содержанием каротиноидов или льняное масло), аминокислота (в особенности триптофан, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, валин, лейцин, изолейцин, аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, цистин, цистеин, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, пролин, гидроксипролин, серии, таурин или тирозин), фермент (в особенности бромелин, папаин, амилаза, целлюлаза или кофермент О), лигнин, сложный эфир станола или безвредные бактерии (в особенности ЬасФЬасШш ас^άοрЫ1и5, ЬасФЬасШш Ьи1дапси5, ЬасФЬасШш Ь1йби5, ЬасйЬасШш р1ап1агиш или Гаесшт), фолиевая кислота, и растворимые волокна.

Технические эффекты.

Неожиданно, липидацилтрансферазы имеют значительную ацилтрансферазную активность в пищевых продуктах. Эта активность имеет неожиданные полезные применения в способах получения пищевых продуктов.

Настоящее изобретение основывается на неожиданном открытии, что липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением могут проводить углевод-эстерификацию через алкоголиз, т.е. перенос ацила от липида, в продукте питания со значительным содержанием воды. Предыдущий уровень техники предполагает, что такие ферменты, если бы они функционировали полностью этим путём, должны были бы функционировать только в среде растворителей (т.е. в средах с низким содержанием воды или без воды).

Настоящее изобретение может обеспечивать один или больше из следующих неожиданных технических эффектов в яичных продуктах, в особенности в майонезе: улучшенная устойчивость к теплу в течение пастеризации; улучшенные органолептические свойства, улучшенная консистенция.

Настоящее изобретение может обеспечивать один или больше из следующих неожиданных технических эффектов в тесте и/или печеных продуктах: улучшенный специфический объём или теста, или печеных продуктов (например, хлеба и/или пирожных); улучшенная устойчивость теста; улучшенный показатель корки (например, более тонкая и/или более хрустящая корка хлеба), улучшенный показатель панировки (например, более однородное распределение панировки и/или более тонкая структура панировки и/или более мягкая панировка); улучшенный внешний вид (например, гладкая поверхность без пузырей или ямок или в основном без пузырей или ямок); уменьшенное очерствение; увеличенная мягкость; улучшенный запах; улучшенный вкус.

Настоящее изобретение может обеспечивать полезный эффект из образования очень поверхностноактивных материалов в продукте питания без образования существенного количества свободных жирных кислот, которые снижают способность пищевого продукта окисляться при хранении, потому что свободные жирные кислоты более склонны к окислению, чем соответствующие сложные эфиры жирных кислот.

- 42 018153

Соответственно, настоящее изобретение может обеспечивать один или больше из следующих неожиданных технических эффектов в продукте питания: улучшенный внешний вид, улучшенный привкус, улучшенная устойчивость, в частности улучшенная термическая устойчивость, улучшенный вкус, улучшенная мягкость, улучшенная эластичность, улучшенная эмульсификация.

Соответственно, настоящее изобретение может обеспечивать один или больше из следующих неожиданных технических эффектов в молочных продуктах, таких как, например, мороженое: улучшенный привкус (предпочтительно более сливочный привкус); улучшенный вкус; улучшенное расплавление.

Соответственно, настоящее изобретение может обеспечивать один или больше из следующих неожиданных технических эффектов в яйце или в яичных продуктах: улучшенная устойчивость эмульсии; термическая устойчивость эмульсии; улучшенный аромат; уменьшенный неприятный запах; уменьшенные свойства загущения, улучшенная консистенция.

Специфические технические эффекты, связанные с применением липидацилтрансферазы, как определено в данном описании, в получении пищевого продукта, представлены в таблице ниже.

	Пищевой продукт	Эффект
1	Хлеб, кексы и пончики	Укрепляет тесто и повышает механическую устойчивость и повышает способность абсорбировать воду. Повышает объём булочных продуктов и поддерживает мягкость корки
2	Замороженное тесто	Предотвращает порчу в процессе заморозки
3	Бисквитное пирожное	Создаёт хороший объём пирожных и однородную мягкую текстуру
4 5 6 7 8 9 10	Пищевой продукт Бисквит, крекер и печенье Жидкое тесто и панировка Лапша Лапша быстрого приготовления Паста Заварные сливки Забеливатель для кофе	Эффект Создаёт стабильную эмульсию жира и предотвращает прилипание к оборудованию. Предотвращает миграцию жира в продуктах с высоким содержанием жира Улучшает текстуру жареных продуктов Предохраняет тесто от прилипания к оборудованию. Повышает содержание воды, и уменьшает потери при приготовлении Предохраняет лапшу от слипания между собой Кондиционер для теста предотвращает слипание при приготовлении Создаёт крахмальную пасту с однородной и сливковой текстурой, и предотвращает дегидратацию Предотвращает разделение масла и воды
11	Сливки для взбивания	Обеспечивает стабильную эмульсию
12	Шоколад	Предотвращает или уменьшает образование налёта
13	Карамель, леденец и нуга	Улучшает эмульгирование плавленого сахара и масла. Предотвращает отделение масла
14	Г отовое мясное блюдо, сосиски	Улучшает способность сосисок и ветчины удерживать воду и предотвращает отделение масляной фазы от пищевой пасты и паштета

Соответственно, настоящее изобретение может обеспечивать один или больше из следующих неожиданных технических эффектов в сыре: уменьшение обезжиривающего эффекта в сыре; увеличение выхода сыра; улучшение запаха; уменьшение неприятного запаха; уменьшение мыльного привкуса.

Обезжиривание (выделение свободного масла) представляет собой тенденцию к образованию свободного масла при хранении и плавлении. Чрезмерное обезжиривание представляет собой недостаток, который наиболее часто связан с нагретыми продуктами, в которых используют сыр, таких как пицца и подобные пища (ср., например, К1пЙ81ей1 1.8; К1рре ГК. 1990, I. Папу 8с1. 73: 867873). Становится всё важнее и важнее контролировать/устранять это недостаток, так как возрастает озабоченность потребителя по поводу уровней жиров в рационе питания. Свободное масло/жир в продукте воспринимается как высокое содержание жира и считается в основном нежелательным. Обезжиривающий эффект может влиять не только на внешний вид сыра, но в серьёзных случаях масло, высвобожденное сыром, может распространиться по пищевому продукту и абсорбироваться пищевым продуктом. Это в особенности вредно для пищевых продуктов, которые содержат печеные компоненты, такие как основа для пиццы, и этот эффект заключается не только в нежелательном внешнем виде, но также может приводить к получению неприемлемой текстуры и запаху.

В пищевых продуктах жировую фазу часто стабилизируют с помощью механического эмульгирования, например гомогенизации. Эта технология в основном не применима в получении сыра, так как

- 43 018153 гомогенизация молока для сыроделия имеет негативное влияние на коагуляционные свойства молока для сыроделия и на выход, так же как и вкус сыра, полученного из него.

Применение модифицированного ферментом пищевого продукта и/или пищевого материала настоящего изобретения (включая, например, модифицированное ферментом молоко, сливки и/или молочный жир) может быть использовано для получения пищевых продуктов, таких как сыр, которые имеют уменьшенный обезжиривающий эффект, и/или для улучшения гомогенизационных свойств молока для сыроделия, и/или уменьшения негативного влияния коагуляционных свойств гомогенизированного молока для сыроделия при переработке в сыр, и/или улучшения запаха и/или текстуры сыра.

Обезжиривающий эффект и выход сыра и жировой выход/содержание могут быть измерены в соответствии с протоколами, раскрытыми в \УО 00/54601.

В одном варианте воплощения пищевой продукт (например, молочный продукт, такой как сыр), полученный в соответствии с настоящим изобретением, может иметь более высокий выход.

Увеличения выхода сыра могут происходить или когда молоко для сыроделия и/или сливки модифицируют непосредственно путём ферментативной обработки, и/или когда молоко для сыроделия дополняют модифицированным ферментом маслом или жиром, таким как модифицированный ферментом молочный жир.

Дополнительное преимущество настоящего изобретения может заключаться в уменьшении посторонних запахов и/или посторонних вкусов предпочтительно путём уменьшения количества свободных жирных кислот в ферментативно обработанных пищевых продуктах (например, в сыре).

Одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что липидацилтрансфераза может быть использована в более низкой дозе для получения тех же самых (или лучших) эффектов в сравнении с фосфолипазой А2 (РЬА2). Таким образом, эффективно фермент может быть необходим для достижения тех же самых (или лучших) результатов.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что липидацилтрансфераза для использования в настоящем изобретении и, в особенности, в производстве сыра не требует обязательной предварительной обработки молока и/или сливок. Фактически, липидацилтрансфераза при использовании в настоящем изобретении может быть добавлена непосредственно к сырной ванне. Это может преимущественно упрощать процесс производства сыра для конечного пользователя.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что липидацилтрансфераза может увеличивать содержание влаги в пищевом продукте, таком как, например, сыр (например, моцарелла) и/или молочный жир в сравнении с использованием, например, фосфолипазы, такой как Ьесйаке™.

В одном варианте воплощения применение модифицированного ферментом пищевого продукта и/или пищевого материала настоящего изобретения может быть использовано для получения пищевого продукта, такого как сыр, который имеет увеличенное содержание влаги в пищевом продукте в сравнении с использованием, например, фосфолипазы, такой как Ьесйаке™. Этот один вариант воплощения может быть в особенности предпочтительным, когда пищевой продукт и/или пищевой материал представляет собой молочный продукт, например молоко, сливки, молочный жир и/или сыр.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что сложные эфиры стерола и/или сложные эфиры станола могут быть получены в пищевом продукте. Этот один вариант воплощения может быть в особенности предпочтительным, когда пищевой продукт и/или пищевой материал представляет собой молочный продукт, например молоко, сливки, молочный жир и/или сыр.

Преимущественно настоящее изобретение может быть использовано для уменьшения уровня холестерина пищевого продукта, в особенности молочного продукта, такого как сыр.

В получении продуктов, в частности в получении сыра, применение липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает значительное преимущество в способности извлекать растворимые белки из молочных продуктов. Например, в получении сыра приблизительно 20% всех молочных белков удаляют в сыворотке (т.е. водной части молока, которая остаётся после образования творога). Сыворотка содержит растворимые молочные белки, в то время как гидрофобные белки остаются в твороге. Путём применения липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением можно переносить ацильную группу от липида (предпочтительно от гликолипида или фосфолипида) к белку (в частности, к белку сыворотки, такому как лактоглобулин) с образованием конденсата белковой жирной кислоты, таким образом, производя продукт, который является более гидрофобным и который скорее будет оставаться в твороге, чем будет извлечен в сыворотку. Таким путём больше молочного белка может быть получено в конечном пищевом продукте, т.е. конечном молочном продукте, таком как сыр.

В одном аспекте настоящее изобретение частично основывается на понимании того, что выходы продуктов, таких как сыр, могут быть улучшены путём применения липидацилтрансферазы. Дополнительно или альтернативно, могут быть улучшены запах, текстура, устойчивость к окислению и/или срок хранения продукта. Дополнительно или альтернативно, пища может иметь сниженный уровень холестерина или увеличенное содержание сложных эфиров фитостерола/станола.

Не желая связываться определённой теорией, принимают, что повышение выхода может быть результатом трансэстерификации сывороточных белков и пептидов, что приводит к значительному повышению

- 44 018153 гидрофобности сывороточных белков и осаждению ацилированных сывороточных белков в творог.

В биологических системах, например, осаждение связанных с мембраной белков и ферментов достигается двумя различными механизмами. Связанные с мембраной белки или обладают некоторым количеством связанных с мембраной или гидрофобных доменов, или, альтернативно, они имеют жирную кислоту, связанную с полипептидной цепью. Как правило, жирные кислоты имеют длину цепи 14 или 16 атомов углерода. Жирные кислоты ковалентно связаны с полипептидной цепью в 3 различных положениях: Ы-концевая аминокислота в виде амидной связи, цистеиновый остаток в виде тиосложноэфирной связи или аминокислота серин или треонин в виде сложноэфирной связи. Только одна жирная кислота на полипептидную молекулу необходима для прикрепления белка к клеточной мембране.

Когда жирная кислота ковалентно связана с немембранным белком, физические и функциональные свойства будут радикально изменяться. νθ 97/14713 описывает трансформированные соевые и глютеновые белки в ацильные производные путём обработки с помощью липазы из Мисог инеНе! (^^роζуте™, Ыоνоζуте8) и жирной кислоты в органическом растворителе. Липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в получении ацилированных белков в среде с низким или высоким содержанием воды.

Авторы отмечают, что ацилированные белки образуют амфифильные комплексы, которые могут быть использованы для некоторых косметических продуктов. Ацилированный белок может образовывать гели, связывать воду путём удержания влаги, иметь эмульгирующие свойства и являться очень активным на границе раздела водной и липидной фаз.

Таким образом, настоящее изобретение в одном аспекте может обеспечивать косметическую композицию, которая содержит липидацилтрансферазу, как определено в данном описании.

Кроме того, настоящее изобретение может обеспечивать применение ацилтрансферазы, как определено в данном описании, для получения косметической композиции.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ш κίΐιι получения сложного эфира белка в косметической композиция, где способ включает стадию добавления к косметической композиции (или её компонентов) липидацилтрансферазы, как определено в данном описании.

Многие пищевые белки являются растворимыми в водных растворах и поэтому подходят для ш κίΐιι модификации с помощью липазаацилтрансферазы. В производстве сыра β-лактоглобулин теряется в сывороточной фракции. После ацилирования с помощью липазаацилтрансферазы или варианта липазаацилтрансферазы исходные результаты показывают, что β-лактоглобулин может быть, однако, отложен в казеиновой мицелярной поверхности в процессе сычужной коагуляции, β-лактоглобулин имеет три потенциальных сайта ацилирования (сериновые остатки) на трёх поверхностных петлях. Молоко содержит достаточные количества лецитина, подходящий субстрат для липидацилтрансферазного фермента для ацилирования β-лактоглобулина. Образованный лизолецитин может иметь дополнительный эмульгирующий эффект.

При применении липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением наблюдаются улучшения в сравнении с применением липолитических ферментов без ацилтрансферазной активности, таких как триацилглицерин липазы и фосфолипазы.

Преимущества.

Получение эмульгатора и сложного эфира стерола/станола ш кйи по крайней мере из одного составляющего пищевого материала означает, что пищевой материал будет содержать по крайней мере на одну добавку меньше. Это является преимуществом из-за улучшения в лёгкости производства. Например, не требуется никакой дополнительной обработки или добавления ингредиентов или добавления эмульгаторов. Более того, пищевой продукт может содержать меньше добавок. Уменьшение количества или исключение добавок является желательным для потребителей и включение добавок часто должно быть заявлено потребителю в перечне ингредиентов на пищевом продукте. Таким образом, настоящее изобретение является дополнительно предпочтительным.

Преимущество настоящего изобретения может заключаться в получении ш κίΐιι эмульгатора в продукте питания без вредного увеличения содержания свободной жирной кислоты в пищевом продукте.

Получение двух эмульгаторов и/или сложного эфира углевода ш κίΐιι по крайней мере из одного составляющего пищевого материала означает, что пищевой материал будет содержать по крайней мере на одну добавку меньше.

Кроме того, когда липидацилтрансфераза действует на гликолипид, то можно преимущественно производить эмульгатор ЭСМС ш κίΐιι без вредного увеличения содержания свободной жирной кислоты в пищевом продукте. Таким образом, уменьшение вредных эффектов, которое относится к увеличению количества свободных жирных кислот, включает, не ограничиваясь приведенными, уменьшение мыльного привкуса в сыре, предотвращение передозировки в свойствах теста и выпеченного теста.

Для некоторых аспектов преимущество настоящего изобретения заключается в снижении уровней свободного холестерина в продукте питания.

Для других аспектов преимущество настоящего изобретения заключается в увеличении количества сложных эфиров станола и/или стерола в продукте питания. Некоторые сложные эфиры стерола/станола

- 45 018153 могут быть эффективными ароматизаторами и/или текстуризаторами. Таким образом, настоящее изобретение может приводить не только к ш з11и производству эмульгатора в продукте питания, но также к ш зйи производству ароматизатора и/или текстуризатора. Некоторые сложные эфиры стерола/станола, как известно, снижают уровни холестерина и/или липобелков низкой плотности в сыворотке крови, когда их употребляют в продукте питания. Таким образом, настоящее изобретение может быть использовано для получения пищевого продукта с увеличенными уровнями сложных эфиров стерола и/или сложных эфиров станола.

Для некоторых аспектов, в особенности, когда фермент в соответствии с настоящим изобретением используют в продуктах на основе яиц, преимущество заключается в устранении нежелательных свободных углеводов.

Также преимущественно эмульгирующие свойства пищевого продукта усиливаются, приводя к улучшенному внешнему виду, и/или пригодности для обработки, и/или структуре, и/или консистенции, и/или устойчивости к теплу без негативного влияния на вкус.

Кроме того, для некоторых вариантов воплощения преимущественно эффект передозировки, наблюдаемый при использовании липаз рег зе, эффективно преодолевается добавлением фермента в соответствии с настоящим изобретением. Это происходит, по крайней мере, частично благодаря тому факту, что свободные жирные кислоты не получаются или получаются только в незначительной степени при использовании фермента в соответствии с настоящим изобретением.

Дополнительные и/или альтернативные преимущества описаны в разделе, озаглавленном Технические эффекты, представленном выше.

Изолированная.

В одном аспекте предпочтительно полипептид или белок для использования в настоящем изобретении находится в изолированной форме. Термин изолированный означает, что последовательность является, по крайней мере, по сути свободной по крайней мере от одного другого компонента, с которым последовательность обычно ассоциируется в природе или как он обнаружен в природе.

Очищенная.

В одном аспекте предпочтительно полипептид или белок для использования в настоящем изобретении находится в очищенной форме. Термин очищенная означает, что последовательность находится в относительно чистом состоянии, например, является по крайней мере приблизительно на 51% чистой, или по крайней мере приблизительно на 75%, или по крайней мере приблизительно на 80%, или по крайней мере приблизительно на 90% чистой, или по крайней мере приблизительно на 95% чистой, или по крайней мере приблизительно на 98% чистой.

Клонирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид в соответствии с настоящим изобретением

Нуклеотидная последовательность, которая кодирует либо полипептид, который обладает специфическими свойствами, как определено в данной заявке, либо полипептид, который является приемлемым для модификации, может быть изолирована из любой клетки или организма, продуцирующего указанный полипептид. В области техники являются хорошо известными различные способы для изоляции нуклеотидных последовательностей.

Например, может быть сконструирована геномная ДНК и/или кДНК библиотека при использовании хромосомной ДНК или информационной РНК из организма, продуцирующего этот полипептид. Если аминокислотная последовательность полипептида является известной, то могут быть синтезированы и использованы меченные олигонуклеотидные зонды для идентификации клонов, кодирующих полипептид из геномной библиотеки, полученной из организмов. Альтернативно, меченные олигонуклеотидные зонды, содержащие последовательности, гомологичные гену другого известного полипептида, могут использоваться для идентификации клонов, кодирующих полипептид. В последнем случае используются условия гибридизации и промывания более низкой жесткости.

Альтернативно, клоны, кодирующие полипептид, могут быть идентифицированы путем встраивания фрагментов геномной ДНК в экспрессионный вектор, такой как плазмида, трансформации негативной по ферменту бактерии с помощью полученной геномной ДНК библиотеки и последующего высаживания трансформированных бактерий на агар, содержащий фермент, который ингибируется полипептидом, с помощью чего могут быть идентифицированы клоны, экспрессирующие полипептид.

Еще в одном альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, может быть получена синтетически с помощью установленных стандартных способов, например с помощью фосфорамидатного способа, описанного Веисаде 8.Ь. и др. (1981) Тейайейгоп Ьейегз 22, стр. 1859-1869, или способа, описанного МаИНез и др. (1984) ЕМВО 1. 3, стр. 801-805. При фосфорамидатном способе олигонуклеотиды синтезируются, например, в автоматическом ДНК синтезаторе, очищаются, отжигаются, лигируются и клонируются в приемлемые векторы.

Нуклеотидная последовательность может иметь смешанное геномное и синтетическое происхождение, смешанное синтетическое и кДНК происхождение или смешанное геномное и кДНК происхождение, полученное с помощью лигирования фрагментов синтетического, геномного или кДНК происхождения (если это является приемлемым) в соответствии со стандартными методиками. Каждый лигиро

- 46 018153 ванный фрагмент соответствует различным частям цельной нуклеотидной последовательности. ДНК последовательность может также быть полученной с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) при использовании специфических праймеров, например, как описано в И8 4683202 или у 8а1к1 В.К. и др. (8с1епсе (1988) 239, стр. 487-491).

Нуклеотидные последовательности

Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данной заявке. Термин нуклеотидная последовательность, как используется в данной заявке, относится к олигонуклеотидной последовательности или полинуклеотидной последовательности, а также к варианту, гомологам, фрагментам и их производным (таким как их части). Нуклеотидная последовательность может иметь геномное, или синтетическое, или рекомбинантное происхождение, при этом она может быть двухцепочечной или одноцепочечной, представляя собой либо смысловую, либо антисмысловую цепочку.

Термин нуклеотидная последовательность в отношении настоящего изобретения включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК. Предпочтительно это означает ДНК, более предпочтительно кДНК для кодирующей последовательности.

В предпочтительном воплощении нуклеотидная последовательность рег ке, кодирующая полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, не охватывает нативную нуклеотидную последовательность в ее природном окружении, когда она является связанной с природной(ыми), ассоциированной(ыми) с ней последовательностью(ями), которая(ые) также пребывает(ют) в своем природном окружении. Для облегчения ссылки мы будем называть это предпочтительное воплощение ненативной нуклеотидной последовательностью. В этой связи, термин нативная нуклеотидная последовательность означает цельную нуклеотидную последовательность, которая находится в своем нативном окружении и когда является оперативно связанной с цельным промотором, с которым она обычно ассоциируется, при этом промотор также находится в своем нативном окружении. Таким образом, полипептид в соответствии с настоящим изобретением может экспрессироваться нуклеотидной последовательностью в ее нативном организме, но где нуклеотидная последовательность не находится под контролем промотора, с которым она обычно ассоциируется в таком организме.

Предпочтительно полипептид не является нативным полипептидом. В этой связи, термин нативный полипептид означает цельный полипептид, который находится в своем нативном окружении и тогда, когда он экспрессирован его нативной нуклеотидной последовательностью.

Типично нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данной заявке, получают при использовании методик рекомбинантной ДНК (т.е. при использовании рекомбинантной ДНК). Однако в альтерантивном воплощении данного изобретения нуклеотидная последовательность может быть синтезирована, полностью или частично, при использовании химических способов, хорошо известных в уровне техники (см. СатиШетк М.Н. и др. (1980) кис. Лаб. Век. 8утр. 8ег. 215-23 и Нот Т. и др. (1980) Шс. Ас1б. Век. 8утр. 8ег. 225-232).

Молекулярная эволюция

Когда нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, была изолирована, или путативная нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, была идентифицирована, то может быть желательным модифицировать выбранную нуклеотидную последовательность, например может быть желательным мутировать последовательность для того, чтобы получить фермент в соответствии с настоящим изобретением.

Мутации могут быть введены при использовании синтетических олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, фланкирующие желаемые сайты мутаций.

Приемлемый способ является раскрытым у Моппада и др. (Вю1есйпо1оду (1984) 2, стр. 646-649). Другой способ введения мутаций в нуклеотидные последовательности, кодирующие фермент, описаны у №1коп и Ьопд (Апа1уйса1 ВюсйетШту (1989), 180, стр. 147-151).

Вместо сайт-направленного мутагенеза так, как описано выше, можно вводить мутации случайным образом, например при использовании коммерческого набора, такого как набор для ПЦР мутагенеза 6епеМотрй РСВ от 81га1адепе, или диверсифицированного набора для ПЦР случайного мутагенеза от С1оп1ес11. ЕР 0583265 относится к способам оптимизации мутагенеза на основе ПЦР, которые могут также сочетаться с применением мутагенных ДНК аналогов, таких как те, что описаны в ЕР 0866796. Методики подверженной ошибкам ПЦР являются приемлемыми для получения вариантов липидацилтрансфераз с желательными характеристиками. νθ 0206457 относится к молекулярной эволюции липаз.

Третий способ для получения новых последовательностей представляет собой фрагментацию неидентичных нуклеотидных последовательностей, либо при использовании любого числа рестрикционных ферментов, либо фермента, такого как ДНКаза I, и повторную сборку полных нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные белки. Альтернативно, можно использовать одну или множественные неидентичные нуклеотидные последовательности и вводить мутации во время повторной сборки цельной нуклеотидной последовательности. Методики перестановки в ДНК и перестановки в семействах являются приемлемыми для получения вариантов липидацилтрансфераз с желательными характеристиками. Приемлемые способы для осуществления перестановки могут быть найдены в ЕР

- 47 018153

0752008, ЕР 1138763, ЕР 1103606. Перестановка может также сочетаться с другими формами ДНК мутагенеза, как описано в И8 6180406 и \УО 01/34835.

Таким образом, является возможным получать многочисленные сайт-направленные или случайные мутации в нуклеотидной последовательности, либо ίη у1уо, либо ίη νίΐΐΌ, и осуществлять последующий скрининг на улучшенную функциональность кодируемого полипептида различными способами. При использовании компьютерного моделирования биологического эксперимента и экзо-опосредованных способов рекомбинации (см. \УО 00/58517, И8 6344328, И8 6361974), например, молекулярную эволюцию можно осуществлять тогда, когда полученный вариант сохраняет очень низкую гомологию с известными ферментами или белками. Такие варианты, полученные таким образом, могут обладать значительной структурной аналогией с известными трансферазными ферментами, но имеют очень низкую гомологию аминокислотной последовательности.

В качестве нелимитирующего примера, в дополнение мутации или природные варианты полинуклеотидной последовательности могут подвергаться рекомбинации либо с мутациями дикого типа, либо с другими мутациями или природными вариантами с получением новых вариантов. Такие новые варианты могут также подвергаться скринингу на улучшенную функциональность кодируемого полипептида.

Применение упомянутых выше и подобных способов молекулярной эволюции позволяет идентифицировать и отобрать варианты ферментов настоящего изобретения, которые обладают желательными характеристиками без каких-либо предварительных знаний о структуре или функции белка, а также позволяет получить неспрогнозированные, но благоприятные мутации или варианты. Существуют многочисленные примеры применения молекулярной эволюции в области техники для оптимизации или изменения ферментативной активности, такие примеры включают, но без ограничения, один или более из перечисленных выше: оптимизированная экспрессия и/или активность в хозяйской клетке или ίη νίίΐΌ, повышенная ферментативная активность, измененная специфичность в отношении субстрата и/или продукта, повышенная или сниженная ферментативная или структурная стабильности, измененная ферментативная активность/специфичность в предпочтительных условиях окружающей среды, например температура, рН, субстрат.

Как будет очевидным для специалиста в данной области техники, при использовании методик молекулярной эволюции фермент может подвергаться изменению для улучшения функциональности фермента.

Предпочтительно липидацилтрансфераза, используемая в данном изобретении, может представлять собой вариант липидацилтрансферазы, т.е. липидацилтрансфераза может содержать по крайней мере одну аминокислотную замену, делецию или присоединение по сравнению с исходным ферментом. Вариантные ферменты сохраняют по крайней мере 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 99% гомологии с исходным ферментом. Приемлемые исходные ферменты могут включать любой фермент с эстеразной или липазной активностью. Предпочтительно исходный фермент выравнивают до р£ат00657 консенсусной последовательности.

В предпочтительном воплощении вариантный фермент липидацилтрансферазы сохраняет или включает по крайней мере один или более аминокислотных остатков р£ат00657 консенсусных последовательностей, обнаруженных в ΟΌδχ, ΟΑΝΏΥ и НРТ блоках.

Ферменты, такие как липазы с отсутствующей или низкой липидацилтрансферазной активностью, в водном окружении могут подвергаться мутации при использовании методик молекулярной эволюции для введения или совершенствования трансферазной активности, полученный таким образом фермент липидацилтрансферазы со значительной трансферазной активностью является приемлемым для использования в композициях и способах настоящего изобретения.

Предпочтительно липидацилтрансфераза для использования в настоящем изобретении может представлять собой вариант с улучшенной ферментативной активностью на полярных липидах, предпочтительно фосфолипидах и/или гликолипидах, по сравнению с исходным ферментом. Предпочтительно такие варианты также обладают низкой или не обладают активностью на лизополярных липидах. Улучшенная активность на полярных липидах, фосфолипидах и/или гликолипидах может быть результатом гидролиза и/или трансферазной активности или их комбинацией.

Вариант липидацилтрансферазы для использования в настоящем изобретении может иметь сниженное влияние на триглицериды, и/или моноглицериды, и/или диглицериды по сравнению с исходным ферментом.

Предпочтительно вариант фермента может не обладать влиянием на триглицериды, и/или моноглицериды, и/или диглицериды.

Альтернативно, вариант фермента для использования в настоящем изобретении может обладать повышенным влиянием на триглицериды и/или может также иметь повышенную активность в отношении одного или более из следующих: полярные липиды, фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин, гликолипиды, дигалактозил моноглицерид, моногалактозил моноглицерид.

Варианты липидацилтрансферазы являются известными, и один или более таких вариантов могут быть приемлемыми для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением и/или в ферментных композициях в соответствии с настоящим изобретением. Только в качестве

- 48 018153 примера варианты липидацилтрансферазы описываются в следующих ссылках, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением: Н111оп & Виск1еу 1. Вю1. С1ет. 1991 1ап 15: 266 (2): 997-1000; ВоЬейкоп и др. 1. Вю1. С1ет. 1994 1ап 21; 269(3): 2146-50; Вгитйк и др. 1. Вас1епо1 1996 Арг; 178 (7): 2060-4; Рее1тап и др. Белок 8сг 1998 Маг; 7(3): 587-99.

Аминокислотные последовательности

Настоящее изобретение также охватывает аминокислотные последовательности полипептидов, которые обладают специфическими свойствами, как раскрыто в данном описании.

Как используется в данной заявке, термин аминокислотная последовательность является синонимом с термином полипептид и/или термином белок. В некоторых случаях термин аминокислотная последовательность является синонимичным с термином пептид.

Аминокислотная последовательность может быть получена/изолирована из приемлемого источника, или она может быть получена синтетически, или она может быть получена при использовании методик рекомбинантной ДНК.

Предпочтительно аминокислотные последовательности могут быть получены из изолированных полипептидов, описанных в данной заявке, с помощью стандартных методик.

Один приемлемый способ для определения аминокислотных последовательностей из изолированных полипептидов представляет собой следующий.

Очищенный полипептид может быть лиофилизирован, и 100 мкг лиофилизированого материала может быть растворено в 50 мкл смеси 8М мочевины и 0,4М гидрокарбоната аммония, рН 8,4. Растворенный белок может быть денатурирован и восстановлен в течение 15 мин при 50°С после покрытия азотом и прибавления 5 мкл 45 мМ дитиотреитола. После охлаждения до комнатной температуры 5 мкл 100 мМ йодацетамида может быть прибавлено для дериватизации остатков цистеина в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте в атмосфере азота.

135 мкл воды и 5 мкг эндопротеиназы Ьук-С в 5 мкл воды может быть прибавлено к упомянутой выше реакционной смеси и переваривание может осуществляться при 37°С в атмосфере азота в течение 24 ч.

Полученные пептиды могут быть разделены с помощью ВЭЖХ с обратной фазой на УУЭАС С18 колонке (0,46x15 см; 10 мкм; Т1е 8ератайоп Огоир, СаШотша, И8А) при использовании растворителя А: 0,1% ТФУ в воде и растворителя В: 0,1% ТФУ в ацетонитриле. Выбранные пептиды могут повторно подвергаться хроматографии на Оеуе1окП С18 колонке при использовании той же системы растворителей, перед Ν-терминальным секвенированием. Секвенирование может быть осуществлено при использовании секвенатора 476А от АррИеб Вюкуйетк с помощью импульсных жидкостных быстрых циклов в соответствии с инструкциями производителя (АррНеб Вюкуйетк, СаПГотша, И8А).

Идентичность последовательностей или гомология последовательностей

Настоящее изобретение также охватывает применение последовательностей, которые обладают степенью идентичности последовательности или гомологии последовательности с аминокислотной(ыми) последовательностью(ями) полипептида, который обладает специфическими свойствами, определёнными в данном описании, или любой нуклеотидной последовательности, кодирующей такой полипептид (на которую ссылаются в данном описании как гомологичная(ые) последовательность(и)). В данной заявке термин гомолог означает сущность, обладающую определенной гомологией с аминокислотными последовательностями, представляющими предмет данной заявки, и нуклеотидными последовательностями, представляющими предмет данной заявки. В данной заявке термин гомология может быть эквивалентным с идентичностью.

Гомологичная аминокислотная последовательность и/или нуклеотидная последовательность будут обеспечивать и/или кодировать полипептид, который сохраняет функциональную активность и/или улучшает эту активность фермента.

В контексте данного изобретения гомологичная последовательность взята для включения аминокислотной последовательности, которая может быть по крайней мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно по крайней мере на 95 или 98% идентичной последовательности, которая составляет предмет данной заявки. Типично гомологи будут включать те же активные сайты и т.п., что и аминокислотная последовательность, представляющая предмет изобретения. Несмотря на то, что гомология также может рассматриваться с точки зрения подобия (т.е. аминокислотные остатки, обладающие подобными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения является предпочтительным выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательности.

В контексте данного изобретения гомологичная последовательность взята для включения нуклеотидной последовательности, которая может быть по крайней мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно по крайней мере на 95 или 98% идентичной последовательности, кодирующей полипептид настоящего изобретения (последовательность, которая представляет собой предмет данного изобретения). Как правило, гомологи будут включать одинаковые последовательности с теми, которые кодируют активные сайты и т.п., что и последовательность, представляющая предмет изобретения. Несмотря на то, что гомология также может рассматриваться с точки зрения подобия (т.е. аминокислотные остатки, обладающие подобными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения явля

- 49 018153 ется предпочтительным выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательности.

Сравнение на гомологию может осуществляться визуально, или чаще, с использованием легко доступных программ сравнения последовательностей. Такие коммерчески доступные компьютерные программы могут подсчитывать % гомологии между двумя или более последовательностями.

% Гомологии может подсчитываться на протяжении смежных последовательностей, т.е. одна последовательность представляет собой выровненную с другой последовательностью, и каждая аминокислота в одной последовательности непосредственно сравнивается с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, один остаток одновременно. Это называется выравнивание без пробелов. Типично, такие выравнивания без пробелов осуществляют только на протяжении относительно небольшого количества остатков.

Несмотря на то, что это очень простой и унифицированный способ, он не принимает во внимание, что, например, может существовать иным образом идентичные пары последовательностей, одна вставка или делеция будут причиной того, что последующие аминокислотные остатки не будут подвергаться выравниванию, потенциально приводя, таким образом, к большому снижению % гомологии, когда осуществляется общее выравнивание. Следовательно, наилучшие способы сравнения последовательностей предназначены для получения оптимальных выравниваний, которые принимают во внимание возможные инсерции и делеции при отсутствии неправильного наложения штрафных санкций на общий балл гомологии. Этого достигают путем встраивания пробелов в выравнивание последовательностей для того, чтобы постараться максимизировать локальную гомологию.

Однако эти более сложные способы назначают штраф за пробел в последовательности на каждый пробел, который появляется в выравнивании, так, что для одинаковых номеров идентичных аминокислот выравнивание последовательностей с настолько малым количеством пробелов, насколько это является возможным - отражение более высокого родства между двумя сравниваемыми последовательностями будет достигаться более высокий балл, чем для таковой с большим количеством пробелов. Цена подобных пробелов типично используется, чтобы назначить относительно высокую цену за существование пробела для каждого последующего остатка в пробеле. Это представляет собой наиболее часто используемую систему балльного оценивания пробела. Высокие штрафы за пробел будут, безусловно, получать оптимизированные выравнивания с меньшим количеством пробелов. Наиболее оптимизированные программы выравнивания позволяют модифицировать штрафы за пробелы в последовательности. Однако является желательным применять значения по умолчанию при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей. Например, при использовании ССС ν^οηδίη Вез(П( программного обеспечения штраф за пробел в последовательности для аминокислотных последовательностей составляет -12 для пробела и -4 для другого удлинения.

Подсчет максимального % гомологии, таким образом, прежде всего требует получения оптимального выравнивания, принимая во внимание штрафы за пробелы в последовательности. Приемлемая компьютерная программа для осуществления такого выравнивания представляет собой ССС ν^οηδίη Ве51ίΐΐ программное обеспечение (Эеуегеих еΐ а1 1984 Шс. Ααάδ ВезеагсЬ 12 р387) или Vесΐο^ ΝΓΙ (ΙηνίΐΓΟ^η Согр.). Примеры других программ, которые могут осуществлять сравнение последовательностей, включают, но без ограничения, ΒΓ-Α^Π программное обеспечение (см. Αι.ΐ5ΐ.^1 и др. 1999 81юй РгоЮсоЕ в Μο1еси1аг Вю1оду, 4-ое изд., глава 18) и ΡΑ^Α (АНзсНЫ и др. 1990 1. Μο1. Βίο1. 403-410) и, например, Α1ί§η X. Как ΒΡΑ8Έ так и ΡΑί^Α являются доступными для автономного поиска и поиска в режиме οη-Ипе (см. Αι.ΐ5ΐ.^1 и др. 1999, стр. 7-58 - 7-60). Новое средство, называемое ΒΡ-Α^Π 2 ^диемек, также является доступным для сравнения белковой и нуклеотидной последовательностей (см. ΡΕΜ8 ΜίαοΜο1 ИеН 1999 174(2): 247-50; ΡΕΜ8 ΜίαοΜο1 Ьей 1999 177(1): 187-8 и ΐаΐ^аηа@ηсЬ^.η1т.шй.дον).

Несмотря на то, что заключительный % гомологии может измеряться с точки зрения идентичности, процесс выравнивания сам по себе типично не основывается на попарном сравнении все-или-ничего. В качестве альтернативы обычно используется пересчитанный балл подобия матрицы для каждого попарного сравнения на основе химического подобия или эволюционной отдаленности. Пример такой обычно используемой матрицы представляет собой ΒΕΟ8ΠΜ62 матрицу - матрицу по умолчанию для ΒΡ-Α^Π пакета программ. Программы Vесΐο^ ΝΓΙ и программы ССС ν^οηδίη в общем случае используют либо общедоступные параметры по умолчанию, либо обыкновенную таблицу сравнения символов, если такая обеспечивается (см. руководство для пользователей для дополнительных деталей). Для некоторых применений является предпочтительным использовать параметры по умолчанию для ССС пакета или Vесΐο^ ΝΓΙ программного обеспечения или в случае другого программного обеспечения матрицу параметров по умолчанию, такую как ΒΕΟ8ΠΜ62.

Альтернативно, процент гомологии может быть подсчитан при использовании множественного элемента выравнивания в ΌΝΑ8Ι8™ (ΗίΡκΙιί 8ой^аге) на основе алгоритма, аналогичного С^υ8ТΑ^ (Ηιμμιηκ ПС & 8Ьагр 1А1 (1988), Сепе 73(1), 237-244).

В случае, если будут использоваться штрафы за пробелы при определении идентичности последовательности, то предпочтительно используются следующие параметры для попарного выравнивания:

- 50 018153

Для ВЬА8Т
Открытие пробела	0
Удлинение пробела	0

Для СЬи8ТАЬ	ДНК	БЕЛОК
Длина слова	2	1	К тройка
Штраф за пробел в последовательности	15	10
Удлинение пробела	6,66	ОД

В одном варианте воплощения СЬИЗТЛЬ может быть использован с набором штрафов за пробел в последовательности и удлинениями пробела, как раскрыто выше.

Предпочтительно степень идентичности в отношении нуклеотидной последовательности определяется на протяжении по крайней мере 20 смежных нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 30 смежных нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 40 смежных нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 50 смежных нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 60 смежных нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 100 смежных нуклеотидов.

Предпочтительно степень идентичности в отношении нуклеотидной последовательности может быть определена на протяжении всей последовательности.

Так как программное обеспечение производит оптимальное выравнивание, то возможно рассчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательности. Программное обеспечение, как правило, делает это как часть сравнения последовательностей и выдаёт численный результат.

Последовательности могут также содержать делеции, инсерции или замены аминокислотных остатков, которые обеспечивают молчащие изменения и приводят к получению функционально эквивалентного вещества. Преднамеренная замена аминокислот может быть осуществлена на основе их подобия в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков при условии, что сохраняется вторичная связывающая активность вещества. Например, негативно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; позитивно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; а аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, обладающие подобными значениями гидрофильности, включают лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.

Консервативные замены могут быть осуществлены, например, в соответствии с таблицей, приведенной ниже. Аминокислоты в том же блоке во второй колонке и предпочтительно в той же строке третьей колонки могут быть замещены друг другом.

Алифатические	Неполярные	САР 1Ь V
	Полярные - незаряженные	С8ТМ Νρ
	Полярные - заряженные	ϋΕ кк
Ароматические		НЕ\УУ

Настоящее изобретение также охватывает гомологичные замещения (термины замещения и замены оба используются в данной заявке для понимания замены существующего аминокислотного остатка альтернативным остатком), которые могут осуществляться, т.е. замещения подобного на подобный, такие как основный на основный, кислый на кислый, полярный на полярный и т.п. Могут также осуществляться негомологичные замещения, т.е. замены остатков одного класса на остаток другого класса, или альтернативно, при вовлечении неприродных аминокислот, таких как орнитин (в данной заявке далее обозначается как Ζ), орнитин диаминомасляная кислота (в данной заявке далее обозначается как В), норлейцин орнитин (в данной заявке далее обозначается как О), пириилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.

Замены могут также осуществляться с помощью неприродных аминокислот.

Варианты аминокислотных последовательностей могут включать приемлемые спейсерные группы, которые могут быть встроены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, включая алкильные группы, такие как группы метила, этила или пропила в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Дополнительная форма вариации вовлекает присутствие одного или более аминокислотных остатков в форме пептоида, что является хорошо понятным квалифицированныму специалисту в данной области техники. Во избежание сомнений форма пептоида используется для обозначения варианта аминокислотных остатков, в котором группа заместителя α-углерода на остатке атома азота является более предпочтительной, чем α-углерод. Способы получения пептидов в форме пептоида являются хорошо известными в области техники, например, Βίιηοιι Κ.Ι. и др., ΡΝΑ8 (1992) 89 (20), 9367-9371 и ΗογμόΙΙ ΌΌ., Тгепбз Β^οΗηοΙ. (1995) 13 (4), 132-134.

- 51 018153

Нуклеотидные последовательности для использования в настоящем изобретении или кодирующие полипептид, обладающий специфическими свойствами, определенными в данной заявке, могут включать в себя синтетические или модифицированные нуклеотиды. Ряд различных типов модификаций олигонуклеотидов является известным в области техники. Такие включают метилфосфонатные и фосфортиоатные скелеты и/или добавления цепей акридина или полилизина на 3'- и/или 5'-концах молекулы. Для целей настоящего изобретения является понятным, что нуклеотидные последовательности, описанные в данной заявке, могут быть модифицированы с помощью любого из способов, известных в области техники. Такие модификации могут осуществляться для того, чтобы улучшить ίη νίνο активность или длительность существования нуклеотидных последовательностей.

Настоящее изобретение также охватывает применение нуклеотидных последовательностей, которые являются комплементарными последовательностями, которые обсуждаются в данной заявке, или любой производной, фрагмента или их производной. Если последовательность является комплементарной их фрагменту, то такая последовательность может использоваться в качестве зонда для идентификации подобных кодирующих последовательностей в других организмах и т.п.

Полинуклеотиды, которые не являются на 100% гомологичными последовательностям настоящего изобретения, но подпадают под объем изобретения, могут быть получены разными путями. Другие варианты последовательностей, описанных в данной заявке, могут быть получены, например, путем зондирования ДНК библиотек, полученных из спектра индивидуумов, например индивидуумов из различных популяций. Кроме того, могут быть получены другие вирусные/бактериальные или клеточные гомологи, в частности клеточные гомологи, обнаруженные в клетках млекопитающих (например, в клетках крыс, мышей, коров и приматов), и такие гомологи и их фрагменты в общем случае будут способными селективно гибридизоваться с последовательностями, показанными в списке последовательностей в данной заявке. Такие последовательности могут быть получены путем зондирования кДНК библиотек или геномных ДНК библиотек, полученных из других видов животных, и зондирования таких библиотек с помощью зондов, включающих всю или часть любой из последовательностей, приведенных в приложенном списке последовательностей, при условиях от средней до высокой степени жесткости. Подобные рассуждения применяются для получения видовых гомологов и аллельных вариантов полипептидных или нуклеотидных последовательностей в соответствии с изобретением.

Варианты и штаммо/видоспецифичные гомологи могут также быть получены при использовании вырожденной ПЦР, которая будет использовать праймеры, которые предназначены для нацеливания последовательностей в вариантах и гомологах, кодирующих консервативные аминокислотные последовательности в рамках последовательностей настоящего изобретения. Консервативные последовательности могут быть предсказаны, например, путем прибавления аминокислотных последовательностей из нескольких вариантов/гомологов. Выравнивание последовательностей будет осуществляться при использовании компьютерной программы, известной в области техники. Например, широко используется программа ОСО ХУЬсопмп РйеИр.

Праймеры, которые используются в вырожденной ПЦР, будут содержать одно или более вырожденное положение и будут использоваться при условиях жесткости, более низких, чем те, которые используются для клонирования последовательностей с праймерами единичной последовательности против известных последовательностей.

Альтернативно, такие полинуклеотиды могут быть получены с помощью сайт-направленного мутагенеза охарактеризованных последовательностей. Это может быть полезным, например, тогда, когда изменения последовательности молчащего кодона требуются для оптимизации предпочтительности кодонов для частной хозяйской клетки, в которой экспрессируются полинуклеотидные последовательности. Другие изменения последовательности могут быть желательными для того, чтобы ввести сайты узнавания рестрикции полипептида или для того, чтобы изменить свойство или функцию полипептидов, кодируемых полинуклеотидами.

Полинуклеотиды (нуклеотидные последовательности) в соответствии с данным изобретением могут использоваться для получения праймера, например ПЦР праймера, праймера для альтерантивной реакции амплификации, зонда, например, меченных с помощью метки, способной к выявлению, с помощью традиционных средств при использовании радиоактивных или нерадиоактивных меток, или полинуклеотиды могут быть клонированы в векторы. Такие праймеры, зонды и другие фрагменты будут иметь длину по крайней мере 15, предпочтительно по крайней мере 20, например по крайней мере 25, 30 или 40 нуклеотидов, а также охватываются термином полинуклеотид в соответствии с изобретением, как используется в данной заявке.

Полинуклеотиды, такие как ДНК полинуклеотиды, и зонды в соответствии с данным изобретением могут быть получены рекомбинантным путем, синтетически или с помощью любого способа, доступного специалисту в данной области техники. Они могут быть также клонированы с помощью стандартных методик.

В общем случае праймеры будут получать путем синтетических способов, вовлекающих пошаговое получение желаемой последовательности нуклеиновой кислоты по одному нуклеотиду за один прием. Методики для осуществления этого с использованием автоматических способов являются доступными в

- 52 018153 области техники.

Более длинные полинуклеотиды в общем случае будут получать при использовании рекомбинантных способов, например при использовании методик клонирования на основе ПЦР (полимеразная цепная реакция). Это будет вовлекать создание пары праймеров (например, содержащих приблизительно 15-30 нуклеотидов), фланкирующих участок липид-нацеливающей последовательности, который является желательным для клонирования, приведение праймеров в контакт с иРНК или кДНК, полученной из клеток животных или человека, осуществление полимеразной цепной реакции в условиях, которые приводят к амплификации желаемого участка, изолирование амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси на агарозном геле) и получение амплифицированной ДНК. Праймеры могут быть сконструированы таким образом, чтобы содержать приемлемые сайты распознавания рестрикционных ферментов, таким образом, чтобы амплифицированная ДНК могла быть клонирована в приемлемый клонирующий вектор.

Г ибридизация

Настоящее изобретение также охватывает применение последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям настоящего изобретения или последовательностям, которые являются способными к гибридизации либо с последовательностями настоящего изобретения, либо с последовательностями, которые являются комлементарными к ним.

Термин гибридизация, как используется в данной заявке, будет включать процесс, с помощью которого цепочка нуклеиновой кислоты объединяется с комплементарной цепью путем спаривания пар основ, а также процесс амплификации, как осуществляется с помощью методик на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Настоящее изобретение также охватывает применение нуклеотидных последовательностей, которые являются способными гибридизоваться с последовательностями, которые являются комплементарными последовательностям, которые составляют предмет изобретения и обсуждаются в данной заявке, или любой производной, фрагменту или их производным.

Настоящее изобретение также охватывает последовательности, которые являются комплементарными последовательностям, которые способны гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данной заявке.

Условия гибридизации основываются на температуре плавления (Тт) нуклеотидсвязывающего комплекса, как описывается Вегдег и К1тте1 (1987, Сшбе 1о Мо1еси1аг С1ошпд ТесНп1циек, Мебюбк т Епхуто1оду, т. 152, Асабетю Ргекк, 8ап Э1едо СА), и на обеспечении определенной жесткости, как объясняется ниже.

Максимальная жесткость, как правило, возникает при температурах приблизительно Тт 5°С (на 5°С ниже Тт зонда); высокая жесткость - при температурах приблизительно на 5-10°С ниже Тт; средняя жесткость - при температурах приблизительно на 10-20°С ниже Тт и низкая жесткость - при температурах приблизительно на 20-25°С ниже Тт. Как будет понятно квалифицированному специалисту в данной области техники, гибридизация при максимальной жесткости может использоваться для идентификации или определения идентичных нуклеотидных последовательностей, в то время как гибридизация при средней (или низкой) жесткости может использоваться для идентификации или определения подобных или родственных нуклеотидных последовательностей.

Предпочтительно настоящее изобретение охватывает применение последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизоваться при условиях высокой жесткости или средней жесткости с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данной заявке.

Более предпочтительно настоящее изобретение охватывает применение последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизоваться при условиях высокой жесткости (например, 65°С и 0,1х88С {1х88С = 0,15М №С1, 0,015М №1-цитрат рН 7,0}) с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данной заявке.

Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данной заявке (включая последовательности, комплементарные тем, что обсуждаются в данной заявке).

Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидных последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, которые обсуждаются в данной заявке (включая последовательности, комплементарные тем, что обсуждаются в данной заявке).

Также в объем настоящего изобретения включаются применения полинуклеотидных последовательностей, которые способны гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данной заявке, при условиях от средней до максимальной жесткости.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение охватывает нуклеотидные последовательности, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данной

- 53 018153 заявке, или их комплементом, при жестких условиях (например, при 50°С и 0,2х 88С).

В более предпочтительном аспекте настоящее изобретение охватывает нуклеотидные последовательности, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данной заявке, или их комплементом, при условиях высокой жесткости (например, при 65°С и 0,1х88С).

Экспрессия полипептидов

Нуклеотидная последовательность для использования в настоящем изобретении или кодирующая полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, могут быть введены в рекомбинантный вектор, способный к репликации. Вектор может использоваться для репликации и экспрессии нуклеотидной последовательности в форме полипептида в и/или из совместимой хозяйской клетки. Экспрессия может контролироваться при использовании контрольных последовательностей, которые включают промоторы/энхансеры и другие сигналы для регуляции экспрессии. Могут использоваться прокариотические промоторы и промоторы, функциональные в эукариотических клетках. Могут использоваться тканеспецифические и стимулоспецифические промоторы. Также могут использоваться химерные промоторы, включающие элементы последовательности из двух или более различных промоторов, описанных выше.

Полипептид, который продуцируется рекомбинантной клеткой путем экспрессии нуклеотидной последовательности, может секретироваться или может содержаться внутриклеточно в зависимости от используемой последовательности и/или вектора. Кодирующие последовательности могут быть сконструированы с сигнальными последовательностями, которые направляют секрецию вещества, кодирующего последовательности через мембрану определенной прокариотической или эукариотической клетки.

Экспрессионный вектор

Термин экспрессионный вектор означает конструкцию, способную к ίπ у1уо или ш уйто экспрессии.

Предпочтительно, когда экспрессионный вектор встраивается в геном организма. Термин встроенный предпочтительно охватывает стабильное встраивание в геном.

Нуклеотидная последовательность настоящего изобретения или кодирующая полипептид, имеющий специфические свойства, как определено в данной заявке, может быть представлена в векторе, в котором нуклеотидная последовательность является оперативно связанной с регуляторными последовательностями, таким образом, что регуляторные последовательности являются способными обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности приемлемым хозяйским организмом, т.е. вектор представляет собой экспрессионный вектор.

Векторы в соответствии с настоящим изобретением могут быть трансформированы в хозяйскую клетку так, как описано выше, для обеспечения экспрессии полипептида, обладающего специфическими свойствами, как определено в данной заявке.

Выбор вектора, например плазмиды, космиды, вирусного или фагового вектора, часто зависит от хозяйской клетки, в которую он встраивается.

Векторы могут содержать один или более генов селектируемых маркеров, таких как ген, который придает устойчивость к антибиотикам, например устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорафениколу или тетрациклину. Альтернативно, селекция может осуществляться путем совместной трансформации (как описано в \УО 91/17243).

Векторы могут использоваться ш уйго, например, для получения РНК или использоваться для трансфекции или трансформации хозяйской клетки.

Таким образом, в дополнительном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ получения нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения или нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данном описании, путём введения нуклеотидной последовательности в вектор, способный реплицироваться, вводя указанный вектор в совместимую хозяйскую клетку и выращивая хозяйскую клетку в условиях, которые вызывают репликацию указанного вектора.

Вектор может дополнительно включать нуклеотидную последовательность, позволяющую вектору реплицироваться в рассматриваемой хозяйской клетке. Примеры таких последовательностей представляют собой точки начала репликации плазмид рИС19, рАСУС177, рИВ110, рЕ194, рАМВ1 и рН702.

Регуляторные последовательности

В некоторых применениях нуклеотидная последовательность для использования в настоящем изобретении или нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, может быть получена путем оперативного связывания с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечить экспрессию нуклеотидной последовательности, например, с помощью выбранной хозяйской клетки. В качестве примера, настоящее изобретение охватывает вектор, включающий нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, оперативно связанную с такой регуляторной последовательностью, т.е. вектор представляет собой экспрессионный вектор.

Термин оперативно связанный относится к размещенным рядом компонентам, где описанные

- 54 018153 компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать в соответствии с предназначенным способом. Регуляторная последовательность, оперативно связанная с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с контрольными последовательностями.

Термин регуляторные последовательности включает промоторы и энхансеры, а также другие сигналы регуляции экспрессии.

Термин промотор используется в обычном смысле, как принято в данной области техники, например, сайт связывания РНК-полимеразы.

Улучшенная экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, может также быть достигнута с помощью селекции гетерологичных регуляторных участков, например промотора, лидерных и терминаторных участков секреции.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность настоящего изобретения может быть оперативно связана, по крайней мере, с промотором.

Примеры подходящих промоторов для направления транскрипции нуклеотидной последовательности в бактериального, грибкового или дрожжевого хозяина хорошо известны в данной области техники.

Конструкции

Термин конструкция, который является синонимичными с такими терминами, как конъюгат, кассета и гибрид, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, для использования в соответствии с настоящим изобретением, непосредственно или опосредованно связанную с промотором. Пример непосредственного присоединения представляет собой обеспечение приемлемой спейсерной группы, такой как последовательность интрона, такого как 8Ы-интрон или ΛΌΗ интрон, между промотором и нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения. То же самое касается термина слитый в отношении настоящего изобретения, который включает непосредственное или опосредованное присоединение. В некоторых случаях термины не охватывают природную комбинацию нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обычно ассоциированный с промотором гена дикого типа и когда они оба находятся в своем природном окружении.

Конструкция может даже содержать или экспрессировать маркер, который позволяет осуществлять селекцию генетической конструкции.

Для некоторых применений является предпочтительным, когда конструкция включает, по крайней мере, нуклеотидную последовательность настоящего изобретения или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, оперативно связанную с промотором.

Хозяйские клетки

Термин хозяйская клетка в отношении настоящего изобретения включает любую клетку, которая включает или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает специфическими свойствами, как определено в данном описании, или экспрессионный вектор, как описано выше, и который используют в рекомбинантном получении полипептида, который обладает специфическими свойствами, как определено в данном описании.

Таким образом, дополнительный вариант воплощения настоящего изобретения обеспечивает хозяйские клетки, трансформированные или трансфектированные с помощью нуклеотидной последовательности настоящего изобретения или нуклеотидной последовательности, которая экспрессирует полипептид, который обладает специфическими свойствами, как определено в данном описании. Указанные клетки выбираются совместимыми с указанным вектором и могут, например, представлять собой прокариотические (например, бактериальные), грибковые, дрожжевые клетки или клетки растений. Предпочтительно хозяйские клетки не являются клетками человека.

Примеры подходящих бактериальных хозяйских организмов включают грамотрицательные бактерии или грамположительные бактерии.

В зависимости от природы нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который обладает специфическими свойствами, как определено в данном описании, и/или желания дальнейшего процессинга экспрессированого белка, эукариотические хозяева, такие как дрожжи или другие грибы, могут быть предпочтительными. В основном, дрожжевые клетки предпочтительнее, чем грибковые клетки, так как с ними легче работать. Однако некоторые белки или плохо секретируются из дрожжевой клетки, или в некоторых случаях не обрабатываются достаточно хорошо (например, гипергликозилирование в дрожжах). В этих случаях следует выбирать другого грибкового организма-хозяина.

Применение подходящих хозяйских клеток, таких как дрожжевые, грибковые и растительные хозяйские клетки, может обеспечивать послетрансляционные модификации (например, миристоилирование, гликозилирование, усечение, липидизация и фосфорилирование тирозина, серина или треонина), что может быть необходимо для придания оптимальной биологической активности рекомбинантным экспрессионным продуктам настоящего изобретения.

Хозяйская клетка может быть дефектной по протеазе или представлять собой штамм протеаза минус.

- 55 018153

Организм

Термин организм в отношении настоящего изобретения включает любой организм, который может включать нуклеотидную последовательность в соответствии с настоящим изобретением или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, и/или продукты, полученные из него.

Подходящие организмы могут включать прокариот, грибы, дрожжи или растение.

Термин трансгенный организм в отношении настоящего изобретения включает любой организм, который включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, и/или продукты, полученные из него, и/или в данной заявке промотор может позволять осуществлять экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, в организме. Предпочтительно нуклеотидная последовательность встраивается в геном организма.

Термин трансгенный организм не охватывает нативных нуклеотидных кодирующих последовательностей в их природном окружении, когда они находятся под контролем их нативного промотора, который также находится в своем природном окружении.

Таким образом, трансгенный организм настоящего изобретения включает организм, включающий какую-либо одну или комбинацию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, конструкции, как определено в данной заявке, векторы, как определено в данной заявке, плазмиды, как определено в данной заявке, клетки, как определено в данной заявке, или их продукты. Например, трансгенный организм может также включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данной заявке, под контролем гетерологичного промотора.

Трансформация хозяйских клеток/организма

Как описано ранее, хозяйский организм может представлять собой прокариотический или эукариотический организм. Примеры приемлемых прокариотических хозяев включают Е. отк и ВасШиз 8иЬШ18.

Руководства по трансформации прокариотических хозяев являются хорошо описанными в уровне техники, например, см. 8ηπ±ιόο1< и др. (Μο^ώατ ΟΊοπιπβ: А ^аЬο^аΐο^у Мапиа1, 2-ое изд., 1989, Сц1й 8ргтд ΗηΛογ ^аЬο^аΐο^у Ргезз). Если используется прокариотический хозяин, то нуклеотидная последовательность предпочтительно может требовать модификации перед осуществлением трансформации, такой как удаление интронов.

В другом воплощении трансгенный организм может представлять собой дрожжи.

Клетки мицелиальных грибов могут трансформироваться при использовании различных способов, известных в уровне техники, таких как процесс, вовлекающий получение протопласта и трансформацию протопластов, после чего осуществляют регенерацию клеточной стенки известным способом. Применение АзрегдШиз в качестве хозяйского микроорганизма описывается в ЕР 0238023.

Другой хозяйский организм может представлять собой растение. Обзор общих методик, используемых для трансформации растений, может быть найден в статьях ΡοϊΓνΙιιΐδ (Аппи Кеу Р1ап1 ΡΗνδίοΙ Р1ап1 Μο1 Βίοί [1991] 42: 205-225) и Ск^^8ΐοи (Ад^ο-Εοοй-Iηйи8ΐ^у Ηί-Теск Магск/Аргй 1994 17-27). Дополнительные методики по трансформации растений могут быть найдены в ЕР-А-0449375.

Общие методики по трансформации грибов, дрожжей и растений представлены в следующих разделах.

Трансформированные грибы

Хозяйский организм может представлять собой грибы, такие как мицелиальные грибы. Примеры таких приемлемых хозяев включают любого члена, принадлежащего к семействам ТНет-мтусе!! Асгеιηοηίιιιη, АзрегдШиз, РешсШшт, Μικογ, ^ιποφοη, Тпс1юйегта и т.п.

Обзор способов трансформации мицелиальных грибов приведен в И8-А-5741665, который показывает, что стандартные методики для трансформации мицелиальных грибов и культивирования грибов являются хорошо известными в области техники. Обширный обзор методик применительно к Ν. сгазза может быть найден, например, у Όηνίδ и йе 8еггез, Ме11юй8 Εηζутο1 (1971) 17А: 79-143.

Дополнительные методики по трансформации мицелиальных грибов рассматриваются в И8-А5674707.

В одном аспекте хозяйский организм может представлять собой род АзрегдШиз, такой как Азрегдй1ик шдег.

Трансгенный АзрегдШиз в соответствии с настоящим изобретением может также быть получен, например, в соответствии с методиками Тигпег 6. 1994 ЮесЮгк Γογ депейс ташри1а!юп, в: МагйпеШ 8.Ό., 1<тд1югп 1.К.( ред.) АзрегдШиз: 50 уеагз οπ. Ргодгезз т тйи81па1 тюгоЬю^ду т. 29. Н18е\тег Атз!егйат 1994, стр. 641-666).

Обзор генной экспрессии в мицелиальных грибах приведен у Рип! и др. (2002) Тгепйз Β^οΐескηο1 2002 Мау; 20 (5): 200-6, Агскег & РеЬегйу Си1 Кеу ВюйсЬпЫ (1997) 17(4): 273-306.

Трансформированные дрожжи

Обзор принципов гетерологичной генной экспрессии в дрожжах обеспечивается, например, в Ме1к

- 56 018153 οά5 Μο1 Вю1 (1995), 49: 341-54, и Сигг Орт ВЫес^ (1997) Ос1; 8(5): 554-60.

В этой связи дрожжи, такие как виды 8асс11аготусе5 сетеу151 или Р1сЫа ра5ΐο^^5 (см. ЕЕМ8 МюгоЬю1 Неу (2000 24 (1): 45-66), могут использоваться в качестве вектора для гетерологичной генной экспрессии.

Обзор принципов гетерологичной генной экспрессии в 8ассйаготусе5 сегеу151ае и секреции генных продуктов приведен Е. Н1псПс11ГГе Е. Кеппу (1993, Уеа51 а5 а хе1пс1е Гэг (Не ехрге55юп οί 1^ΟΐΌ^οιΐ5 депе5, Уеа515, т. 5, Апбюпу Н. Κο5е и 1. 81иаг( Нагибюп, ред., 2-ое изд., Асабепнс Рге55 Ь!б.).

Для трансформации дрожжей было разработано несколько прописей трансформации. Например, трансгенный 8асс11аготусе5 в соответствии с настоящим изобретением может быть получен в соответствии с методиками Нтпеп и др., (1978, Ргосеебшд5 οί Ле Nаΐ^οиа1 Асабету οί 8с1епсе5 οί Ле И8А 75, 1929); Ведд5, ΤΌ. (1978, №1й.1ге, Εοι^οι·!, 275, 104); и Ιΐο, Н. и др. (1983, 1. ВасЮгюОду 153, 163-168).

Трансформированные дрожжевые клетки могут быть отобраны при использовании различных селективных маркеров, таких как ауксотрофные маркеры доминантной устойчивости к антибиотикам.

Приемлемый дрожжевой хозяйский организм может быть отобран из биотехнологически релевантных видов дрожжей, таких как, но без ограничения, видов дрожжей, выбранных из РюЫа 5рр., Нап5епи1а 5рр., К1иууеготусе5, Уаггст'йиа 5рр., 8асс11аготусе5 5рр., включая 8. сегеу151ае, или 8сЬ^ζο5ассЬа^οтусе5 5рр., включая 8с11^ζο5асс11а^οтусе5 рοтЬе.

Штамм метилотрофных дрожжей вида РюЫа ра5ΐο^^5 может использоваться в качестве хозяйского организма.

В одном варианте воплощения хозяйский организм может представлять собой виды Нап5епи1а, такие как Н. рο1утο^рЬа (как описано в АО 01/39544).

Трансформированные растения/растительные клетки

Хозяйский организм, приемлемый для настоящего изобретения, может представлять собой растение. Обзор общих методик может быть найден в статьях Рοΐ^уки5 (Аппи Кеу Р1ап( РНу5^ο1 Р1ап( Μο1 Вю1 [1991] 42: 205-225) и СЬп5Ли ^ο-Εοο6-Λ6π5ϊ^ НКТесй МатсЬ/Артб 1994 17-27), или в АО 01/16308. Трансгенное растение может продуцировать, например, повышенные уровни эстеров фитостерола и эстеров фитостанола.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения трансгенного растения с повышенными уровнями эстеров фитостерола и эстеров фитостанола, включающий этапы трансформации растительной клетки с помощью липидацилтрансферазы, как определено в данной заявке (в частности, с помощью экспрессионного вектора или конструкции, включающей липидацилтрансферазу, как определено в данной заявке), и выращивание растения из трансформированной растительной клетки.

Секреция

Часто является желательным, чтобы полипептид секретировался из хозяина экспрессии в культуральную среду, из которой фермент может быть более легко получен. В соответствии с настоящим изобретением лидерная последовательность для секреции может быть отобрана на основе желательного экспрессионного хозяина. Гибридные сигнальные последовательности могут также использоваться в контексте настоящего изобретения.

Типичные примеры гетерологичных лидерных последовательностей секреции являются такими, которые имеют происхождение из гена грибковой амилогликозидазы (АС) (д1аА - аминокислотные версии 18 и 24, например из А5ретдШи5), гена α-фактора (дрожжи, например 8ассЬаготусе5, К1иууеготусе5 и Нап5епи1б) или гена α-амилазы (ВасШи5).

Определение

В области техники являются известными разнообразные протоколы для определения и измерения экспрессии аминокислотной последовательности. Примеры включают твердофазный иммуносорбентный анализ (ЕЫ8А), радиоиммуноанализ (Н1А) и сортировку флюоресцентно-активированных клеток (ЕАС8).

Квалифицированному специалисту в данной области техники известно широкое разнообразие меток и методик конъюгации, которые могут использоваться в различных анализах нуклеиновой кислоты и аминокислотных анализах.

Ряд компаний, таких как РНагшааа Вю1ес11 (Р|5са1а\\'ау, ΝΓ), Рготеда (Μаб^5οη, А1) и И8 ВюсНеписа1 Οοηι. (С1еуе1апб, ОН), обеспечивают коммерческие наборы и протоколы для осуществления этих процедур.

Приемлемые репортерные молекулы или метки включают такие на основе радионуклидов, ферментов, флуоресцентных веществ, хемилюминисцентных веществ или хромогенных агентов, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Патенты, описывающие применение таких меток, включают И8-А-3817837; И8-А-3850752; И8-А-3939350; И8-А-3996345; И8-А-4277437; И8-А4275149 и И8-А-4366241.

Кроме того, рекомбинантные иммуноглобулины могут быть получены так, как описано в И8-А4816567.

Слитые белки

Полипептид, который обладает специфическими свойствами, как определено в данном описании,

- 57 018153 может быть получен в виде слитого белка, например, с целью его экстракции и очистки. Примеры партнеров слияния белка включают глутатион-Б-трансферазу (СБТ), 6хН1к, САЬ4 (ДНК-связывающие домены и/или домены активации транскрипции) и β-галактозидазу. Также может быть приемлемым включать сайт для расщепления протеолитических ферментов между партнером слияния белка и белковой последовательностью, которая представляет интерес, для того, чтобы вычленить последовательности слитого белка. Предпочтительно слитый белок не будет препятствовать активности белковой последовательности.

Системы для экспрессии слитых генов в Е. сой были рассмотрены в Сигг. Орт. Вю1есНпо1. (1995) 6(5): 501-6.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения аминокислотная последовательность полипептида, обладающего специфическими свойствами, как определено в данной заявке, может быть лигирована с гетерологичной последовательностью для кодирования слитого белка. Например, для скрининга пептидных библиотек на агенты, способные влиять на активность вещества, может быть полезным кодировать химерное вещество, экспрессирующее гетерологичный эпитоп, который узнается коммерчески доступным антителом.

Изобретение будет далее описываться только в качестве примера со ссылкой на следующие чертежи и примеры.

На фиг. 1 показана р£ат00657 консенсусная последовательность из базы данных версии 6 (БЕЦ ΙΌ Ыо. 1);

на фиг. 2 показана аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 2), полученная из организма Аеготопак НуйгорНПа (Р10480; С1:121051);

на фиг. 3 показана аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 3), полученная из организма Аеготопак ка1тошсИа (ААС098404; С1:9964017);

на фиг. 4 показана аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 4), полученная из организма Б1гер1отусек сое1юо1ог А3(2) (депозитный номер СепЬапк ЫР631558);

на фиг. 5 показана аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 5), полученная из организма Б1герЮтусек сое1юо1ог А3(2) (депозитный номер СепЬапк: САС42140);

на фиг. 6 показана аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 6), полученная из организма БассНаготусек сегеуШае (депозитный номер СепЬапк Р41734);

на фиг. 7 показано выравнивание выбранных последовательностей к р£ат00657 консенсусной последовательности;

на фиг. 8 показано попарное выравнивание БЕЦ ΙΌ Ыо. 3 с БЕЦ ΙΌ Ыо. 2, показывая 93% идентичность аминокислотных последовательностей. Сигнальная последовательность подчёркнута. + обозначает различия. СЭБХ фрагмент, содержащий активный сайт серина 16, и активные сайты аспарагиновой кислоты 116 и гистидина 291, выделен (см. заштрихованные области). Номера после аминокислоты представляют собой минус сигнальную последовательность;

на фиг. 9 показана нуклеотидная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 7), кодирующая липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученная из организма Аеготопак НуйгорНПа;

на фиг. 10 показана нуклеотидная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 8), кодирующая липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученная из организма Аеготопак ка1тошс1йа;

на фиг. 11 показана нуклеотидная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 9), кодирующая липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученная из организма Б1гер1отусек соейсо1ог А3(2) (депозитный номер СепЬапк ЫС003888.1:8327480..8328367);

на фиг. 12 показана нуклеотидная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 10), кодирующая липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученная из организма Б1гер1отусек соейсо1ог А3(2) (депозитный номер СепЬапк АЬ939131.1:265480..266367);

на фиг. 13 показана нуклеотидная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 11), кодирующая липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученная из организма БассНаготусек сегеуШае (депозитный номер СепЬапк Ζ75034);

на фиг. 14 показана аминокислотная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 12), полученная из организма Ва1к1оша (депозитный номер СепЬапк: АИ646052);

на фиг. 15 показана нуклеотидная последовательность (БЕЦ ΙΌ Ыо. 13), кодирующая липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученная из организма Ва1к1оша;

на фиг. 16 показана БЕЦ ΙΌ Ыо. 20. Код доступа САВ39707.1 Бсое1 ЫСВI белка. СТ4539178 консервативный гипотетический белок |Б1гер1отусек соейсо1ог А3(2)];

на фиг. 17 показана нуклеотидная последовательность, которая показана как БЕЦ ΙΌ Ыо. 21, кодирующая ЫСВI белок с кодом доступа САВ39707.1 СГ4539178 консервативный гипотетический белок |Б1гер1отусек соейсо1ог А3(2)];

на фиг. 18 показана аминокислота, которая показана как БЕЦ ΙΌ Ыо. 22. Бсое2 ЫСВI белок с кодом доступа САС01477.1 СТ9716139 консервативный гипотетический белок |Б1гер1отусек соейсо1ог А3(2)];

на фиг. 19 показана нуклеотидная последовательность, которая показана как БЕЦ ΙΌ Ыо. 23, кодирующая Бсое2 ЫСВI белок с кодом доступа САС01477.1 С!:9716139 консервативный гипотетический

- 58 018153 белок |81гср1отусс5 сос11со1ог А3(2)];

на фиг. 20 показана аминокислотная последовательность (8ЕО ΙΌ №. 24) 8сос3 NСВI белок с кодом доступа САВ88833.1 01:7635996 путативный секретируемый белок |81гср1отусс5 сос11со1ог А3(2)];

на фиг. 21 показана нуклеотидная последовательность, которая показана как 8Е0 ΙΌ №. 25, кодирующая 8сос3 NСВI белок с кодом доступа САВ88833.1 01:7635996 путативный секретируемый белок |81гср1отусс5 сос11со1ог А3(2)];

на фиг. 22 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ №. 26) 8сос4 NСВI белок с кодом доступа САВ89450.1 01:7672261 путативный секретируемый белок |81гср1отусс5 сос11со1ог А3(2)];

на фиг. 23 показана нуклеотидная последовательность, которая показана как 8Е0 ΙΌ №. 27, кодирующая 8сос4 NСВI белок с кодом доступа САВ89450.1 ОБ7672261 путативный секретируемый белок |81гср1отусс5 сос11со1ог А3(2)];

на фиг. 24 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ №. 28) 8сос5 NСВI белок с кодом доступа САВ62724.1 01:6562793 потенциальный липобелок |81гср1отусс5 сос11со1ог А3(2)];

на фиг. 25 показана нуклеотидная последовательность, которая показана как 8Е0 ΙΌ №. 29, кодирующая 8сос5 NСВI белок с кодом доступа САВ62724.1 0Ι:6562793 потенциальный липобелок |8(гср1отуссз сос11со1ог А3 (2)];

на фиг. 26 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ №. 30) 8пт1 NСВI белок с кодом доступа ААК84028.1 0Ι:15082088 ОИ8Ь-липаза |81гср1отусс5 птозиз];

на фиг. 27 показана нуклеотидная последовательность, которая показана как 8Е0 ΙΌ №. 31, кодирующая 8пт1 NСВI белок с кодом доступа ААК 84028.1 0Ι: 15082088 ОИ8Ь-липаза |81гср1отусс5 пто8И8];

на фиг. 28 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ №. 32) липидацилтрансферазы из Лсгатона”, йубгорййа (АТСС #7965);

на фиг. 29 показана нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ №. 33), кодирующая липидацилтрансферазу из Лс^οтοηа5 йубгорййа (АТСС #7965);

на фиг. 30 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ №. 34) липидацилтрансферазы из Асгатом^ 8а1тошс1ба подвида 8а1тошс1ба (АТСС#14174);

на фиг. 31 показана нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ № 35), кодирующая липидацилтрансферазу из Лс^οтοηа5 5а1тошаба подвида 8а1тошс1ба (АТСС#14174);

на фиг. 32 показано, что гомологи Лс^οтοηа5 генов могут быть идентифицированы, используя прибор средства поиска основного локального выравнивания в Национальном центре биотехнологической информации, МН, МО, И8А и законченную геномную базу данных. ОИ8Х фрагмент используют в поиске по базе данных и определяют количество последовательностей/генов, потенциально кодирующих ферменты с липолитической активностью. Гены определяют из семейства 81гср1отусс5, Xаηΐйοтοηа8 и ВаЫоша. Как пример ниже, ВаЫоша зоктассагит выравнивают с Лс^οтοηа5 8а1тошс1ба (заГА) геном. Попарное выравнивание показывает 23% идентичность. Активный сайт серина присутствует на аминоконце и каталитические остатки гистидина и аспарагиновой кислоты могут быть определены;

на фиг. 33 показана РГат00657.11 |семейство 00657, версии базы данных 11] консенсусная последовательность (далее называемая РГат консенсус) и выравнивание различных последовательностей с РГат консенсусной последовательностью. Стрелки показывают остатки активных сайтов, подчеркнутые боксы показывают три из гомологичных боксов, показанных с помощью [υрΐοη С и ВисИсу 1Т (1995) Тгсмбз Вюсйст 8с1 20; 179-179]. Заглавные буквы в РГат консенсусе показывают консервативные остатки у многих членов семейства. символ показывает положение, в котором скрытая модель Маркова РГат консенсуса, как ожидается, определит остаток, но не определяет, таким образом вставляется пробел. . символ показывает остаток без соответствующего остатка в РГат консенсусе. Указанные последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, перечисленные на фиг. 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30;

на фиг. 34 показана РГат00657.11 |семейство 00657, версии базы данных 11] консенсусная последовательность (далее называемая РГат консенсус) и выравнивание различных последовательностей с РГат консенсусной последовательностью. Стрелки показывают остатки активных сайтов, подчеркнутые боксы показывают три из гомологичных боксов, показанных с помощью [υрΐοη С и ВисИсу 1Т (1995) Тгсп6з Вюсйст 8с1 20; 179-179]. Заглавные буквы в РГат консенсусе показывают консервативные остатки у многих членов семейства. - символ показывает положение, в котором скрытая модель Маркова РГат консенсуса, как ожидается, определит остаток, но не определяет, таким образом вставляется пробел. . символ показывает остаток без соответствующего остатка в РГат консенсусе. Указанные последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, перечисленные на фиг. 2, 16, 18, 20, 26, 28 и 30. Все эти белки, как найдено, являются активными против липидных субстратов;

на фиг. 35 показан экспрессионный вектор рс112-А8а1ОСАТ=р8М, содержащий С-концевой Намеченный ген липидацилтрансферазы Асгатом^ 8а1тошс1ба;

на фиг. 36 показаны результаты тестирования экстрактов клеток в исследовании с помощью NΕРА набора, которое показывает активность рекомбинантной А. 8а1тошс1ба липидацилтрансферазы по отношению к лецитину. Лунки слева направо показывают позитивный контроль, негативный контроль (т.е.

- 59 018153 экстракты из пустого плазмида) и образцы, собранные через 0, 1, 2 и 3 ч культивирования после 1РТС индукции;

на фиг. 37 показана оптимизация роста ВЬ21(ПЕ3)рЬуз8, содержащего экспрессионный вектор ре!12-Аза1ССАТ=р8М, показывая культивацию при 30°С, что получают в производстве фермента с высокой активностью по отношению к лецитину. Клеточные экстракты исследуют на фосфолипазную активность, используя исследование с помощью набора NЕРА. Лунки слева направо: позитивный контроль; негативный контроль; 20°С; 30°С;

на фиг. 38 показаны сырые клеточные экстракты из ВЬ21(ОЕ3)рЬуз8, экспрессирующего активную липидацилтрансферазу, которые инкубируют с субстратом лецитина, и реакционную смесь анализируют, используя тонкослойную хроматографию, показывая присутствие продуктов распада. Полоски: 1) никакого фермента; 2) +А.за1-10 и1 37°С; 3) +А. за1-20 и1 37°С; 4) +А.за1-10 и1 24°С; 5) +А. за1-20 и 24°С;

на фиг. 39 показана частичная очистка Аеготопаз за1тошс1йа ацилтрансферазы, показывая фосфолипазную активность, связанную с очищенным Н1з-меченным белком. 8Е - обработанные ультразвуком экстракты, Н1з - очищенный с помощью №-№ТА зрт-кй от О|адеп;

на фиг. 40 показан экспрессионный вектор ре!12-А.Н. ССАТ=р8Ма, содержащий С-концевой Н1змеченный ген Аеготопаз НуйгорНйа глицеролипида-ацилтрансферазы (ССАТ), используют для трансформации Е.соН штамма ВЬ21(ИЕ3)рЕуз8;

на фиг. 41 показана активность сырых экстрактов (5 и 10 мкл), содержащих рекомбинантный Аеготопаз НуйгорНйа ССАТ фермент, тестируемый по отношению к лецитину, используя набор неэстерифицированных жирных кислот (ИБРА) (КосНе, 8М!7ег1апй), показывая присутствие активного фермента по отношению к фосфолипиду, лецитину;

на фиг. 42 показана оптимизация роста ВЬ21(ПЕ3)рЬуз8, содержащего экспрессионный вектор ре!12-Аза1ССАТ=р8М, показывая культивацию при 30°С, что получают в производстве фермента с высокой активностью по отношению к лецитину. Клеточные экстракты исследуют на фосфолипазную активность, используя исследование с помощью набора ИЕРА;

на фиг. 43 показана частичная очистка Аеготопаз НуйгорНйа и А. за1топ1с1йа ацилтрансферазы, показывая фосфолипазную активность, связанную с очищенным Н1з-меченным белком. 8Е - обработанные ультразвуком экстракты, Н1з - очищенный с помощью Νΐ-ΝΤΆ зр1п-к11 от О|адеп;

на фиг. 44 показана экспрессия Аеготопаз генов в ВасШиз зиЪййз 163, показывая выработку секретированного фермента с активностью по отношению как к лецитину, так и к ЭСЭС. рИВ-АН= конструкция, содержащая А. НуйгорНйа ген и рИВ-А8, конструкция с А. за1тошс1йа геном, культуральный фильтрат инкубируют с субстратами в течение 60 мин;

на фиг. 45 и 46 показана ТСХ пластина в проявляющем растворителе IV (хлороформ:метанол:вода (65:25:4)); полоска 1: 40 мг ситостерола 30 мин; полоска 2: трансфераза + 40 мг ситостерола 30 мин; полоска 3: трансфераза + 80 мг ситостерола 30 мин; полоска 4: трансфераза + 40 мг ситостерола 120 мин; полоска 5: трансфераза + 80 мг ситостерола 120 мин; полоска 6: трансфераза + 40 мг ситостерола 300 мин; полоска 7: 40 мг ситостерола 300 мин; полоска 8: холестерин; полоска 9: ситостерол;

на фиг. 47 показана реакция между фосфатидилхолином и холестерином, которая катализируется липидацилтрансферазой;

на фиг. 48 показан ТСХ анализ липидов, экстрагированных из яичного желтка, обработанного или необработанного ферментом, 6) 0,31 РЬИ/г трансферазы #179, 7) 1,25 РЬИ/г трансферазы #178-9, 8) 23,25 РЬИ/г фосфолипазы #3108, 9) контроль;

на фиг. 49 показана тестовые образцы майонеза, полученного с помощью обработанного или необработанного ферментом яичного желтка: 5) трансфераза #179, 0,31 РЬИ/г, 6) трансфераза #178-9, 1,25 РЬИ/г, 7) фосфолипаза #3108, 23,3 РЬИ/г 8) контроль, вода;

на фиг. 50 показана ТСХ (в растворителе I) липида яичного желтка, обработанного с помощью липидацилтрансферазы из А. НуйгорНйа;

на фиг. 51 показана ТСХ (в растворителе IV) липида яичного желтка, обработанного с помощью липидацилтрансферазы из А. НуйгорНйа;

на фиг. 52 показан ТСХ анализ обработанного трансферазой липида из яичного желтка в течение промежутка времени;

на фиг. 53 показано количество продуцированной жирной кислоты и сложного эфира холестерина как функция времени, при использовании липидацилтрансферазы (ТгапР #178-9) в сравнении с использованием контрольного липолитического фермента ТНегтотусез 1апидтозиз;

на фиг. 54 показана относительная трансферазная активность как % трансферазной и гидролитической активности в ферментативных реакциях в яичном желтке с высоким содержанием воды, #1991 (фосфолипаза А2) и #2427 (фосфолипаза А1) представляют собой контрольные фосфолипазы, #178 представляет собой липидацилтрансферазу;

на фиг. 55 показан эффект содержания воды в исследовании на трансферазную активность трансферазы #178 в трансферазных реакциях в яичном желтке с высоким содержанием воды;

на фиг. 56 показана трансферазная активность для липидацилтрансферазы (#178) как функция времени реакции в трансферазных реакциях в яичном желтке с высоким содержанием воды;

- 60 018153 на фиг. 57 и 58 показаны графики, отображающие жирную кислоту и сложный эфир холестерина как функция времени. Указанные графики показывают результаты, полученные для ГЖХ анализа в исследовании для измерения ацилтрансферазной активности, используя лецитин и холестерин в масле в качестве субстрата;

на фиг. 59 показана ТСХ в растворителе Ι. Яичный желток, обработанный с помощью липидацилтрансферазы #138 из Αе^οтοηа8 5а1нюшЙ1са (полоски №№ 1 и 2) или с помощью фосфолипазы #2938 (ЫРОРАЫ® Е) (полоска № 3), или необработанный яичный желток (полоска № 4);

на фиг. 60 показана ТСХ в растворителе ГУ. Яичный желток, обработанный с помощью липидацилтрансферазы #138 (полоски №№ 1 и 2) или с помощью фосфолипазы #2938 (полоска № 3). Необработанный яичный желток (полоска № 4);

на фиг. 61 показан яичный желток, обработанный с помощью липидацилтрансферазы #138 (образец №№ 1 и 2) и с помощью фосфолипазы #2938 (образец № 3). Необработанный яичный желток (образец № 4);

на фиг. 62 показана пищевая эмульсия через 2 ч при 100°С

0) необработанный яичный желток;

1) яичный желток, обработанный с помощью липидацилтрансферазы #138 в течение 210 мин; 3) яичный желток, обработанный с помощью контрольной фосфолипазы #2938 в течение 210 мин;

на фиг. 63 показаны ТСХ пластины, представляющие скрининг трансферазной активности на пластине стерола и глицерина. РС = фосфатидилхолин, ЬРС = лизофосфатидилхолин; РЕ = фосфатидилэтаноламин; моногл. = моноглицерид;

на фиг. 64 показана ТСХ пластина в растворителе Ι, образцы 1-6 через 24 ч и образцы 1-4 после 4часового времени реакции. ТСХ анализ подтверждает образование сложного эфира стерола в образцах 1, 2, 5 и 6;

на фиг. 65 показана ТСХ пластина в растворителе Ι, где трансферазную активность иммобилизованной ацилтрансферазы из Аегонюпах 5а1нюшс1Йа тестируют в масляной смеси с образцами, взятыми через 0,5, 1, 3, 6 и 24 ч;

на фиг. 66 и 67 показаны ТСХ пластины в растворителе Ι и РУ. Полоска 1 = лецитин; полоска 2 = контроль - 10 мин; полоска 3 = 0,75 РЬИ, 10 мин; полоска 4 = 0,75 РЬИ, 60 мин; полоска 5 = 0,75 РЬИ, 220 мин; полоска 6 = контроль, 20 ч; полоска 7 = 0,75 РЬИ, 20 ч и полоска 8 = сложный эфир холестерина;

на фиг. 68 и 69 показаны ТСХ пластины в растворителе Ιν. Полоска 1 = лецитин; полоска 2 = контроль - 10 мин; полоска 3 = 1 РЬИ, 10 мин; полоска 4 = 1 РЬИ, 60 мин; полоска 5 = 1 РЬИ, 180 мин; полоска 6 = 1 РЬИ, 220 мин; полоска 7 = 1 РЬИ, 1200 мин; полоска 8 = контроль, 1200 мин; полоска 9 = сложный эфир глюкозы; полоска 10 = холестерин и полоска 11 = глюкоза;

на фиг. 70 показана реакция между БСБС и глюкозой при катализировании с помощью липидацилтрансферазы;

на фиг. 71 показана аминокислотная последовательность (8Εφ ΙΌ Νο. 36) слитой конструкции, использованной для мутагенеза гена Аегонюпах 11уйгор1п1а липидацилтрансферазы в примере 17. Подчёркнутые аминокислоты представляют собой ксиланазный сигнальный пептид;

на фиг. 72 показана нуклеотидная последовательность (8Εφ ΙΌ Νο. 45), кодирующая фермент из Αе^οтοηа8 йуйгорййа, включающий ксиланазный сигнальный пептид;

на фиг. 73 показана ТСХ пластина, точно показывающая образование растительного сложного эфира стерола и моноглицерида. Полоска 1 представляет собой результат после времени реакции - 1 ч, полоска 2 представляет собой результат после времени реакции - 4 ч, полоска 3 представляет собой результат после времени реакции - 24 ч и полоска 4 представляет собой растительный стерол;

на фиг. 74 показана аминокислотная последовательность мутантной Аегонюпах 5а1нюшс1Йа зрелой липидацилтрансферазы (ССАТ) с мутацией А8п80А§р (в особенности, аминокислота 80 находится в зрелой последовательности) (8Εφ ΙΌ Νο. 62);

на фиг. 75 показана 8Εφ ΙΌ Νο. 63, которая представляет собой аминокислотную последовательность липидацилтрансферазы из СапйИа ρηπιρ5ί1ο5ί5;

на фиг. 76 показана 8Εφ ΙΌ Νο. 64, которая представляет собой аминокислотную последовательность липидацилтрансферазы из СапйИа ρηπιρ5ί1ο5ί5;

на фиг. 77 показана 8Εφ ΙΌ Νο. 65. 8тое1 NСВI белок с кодом доступа САВ39707.1 6Ι:4539178 консервативный гипотетический белок |81герЮтусе5 сοе1^сο1ο^ А3(2)];

на фиг. 78 показана полипептидная последовательность липидацилтрансферазного фермента из Τйе^тοЬ^йάа_(8Ε^ ΙΌ Νο. 66);

на фиг. 79 показана полипептидная последовательность липидацилтрансферазного фермента из Τйе^тοЬ^йάа_(8Ε^ ΙΌ Νο. 67);

на фиг. 80 показан полипептид липидацилтрансферазного фермента из Сο^уηеЬасΐе^^ит еГПаепх СБ8х 300 аминокислот_8Ε^ ΙΌ Νο. 68);

на фиг. 81 показан полипептид липидацилтрансферазного фермента из ΝονοκρΗΦ^οΜπΗ аготайανοπιπδ СБ8х 284 аминокислоты_8Ε^ ΙΌ Νο. 69);

- 61 018153 на фиг. 82 показан полипептид липидацилтрансферазного фермента из 8!гер1отусе8 соейсо1ог ΟΌδχ 269 аминокислот (δΕΟ ΙΌ №. 70);

на фиг. 83 показан полипептид липидацилтрансферазного фермента из δΐ^ерΐοтусек а\'егтЦ|Нк ΟΌδχ 269 аминокислот (δΕΟ ΙΌ №. 71);

на фиг. 84 показан полипептид липидацилтрансферазного фермента из δΐ^ерΐοтусек (δΕΟ ΙΌ №. 72):

на фиг. 85 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 73), полученная из организма Аеготопак НуйгорНПа (ΡΙ0480; ΟΙ: 121051) (в особенности, она представляет собой зрелую последовательность);

на фиг. 86 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 74) мутантной Аеготопак ка1тошс14а зрелой липидацилтрансферазы (ССАТ) (в особенности, она представляет собой зрелую последовательность);

на фиг. 87 показана нуклеотидная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 75) из δΐ^ерΐοтусек [Негтокассйап;

на фиг. 88 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 76) из δΐ^ерΐοтусек (Негтокассйап;

на фиг. 89 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 77) из ТНегтоЫПйа Γιι^η^Όδχ 548 аминокислот;

на фиг. 90 показана нуклеотидная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 78) из ТНегтоЫйба Гикса;

на фиг. 91 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 79) из ТНегтоЫПйа Γикса/С^δx;

на фиг. 92 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 80) из СогупеЬас1епит еГйсгёпз/СОЗх 300 аминокислот;

на фиг. 93 показана нуклеотидная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 81) из СогупеЬас1епит еГПаепк;

на фиг. 94 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 82) из δ. соейсо1ог1 С^δx 268 аминокислот;

на фиг. 95 показана нуклеотидная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 83) из δ. соейсо1от;

на фиг. 96 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 84) из δ. аνе^т^ΐ^1^к;

на фиг. 97 показана нуклеотидная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 85) из δ. а\^гегтЦШк;

на фиг. 98 показана аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 86) из ТНегтоЫПйа Γιι^η^Όδχ;

на фиг. 99 показана нуклеотидная последовательность (δΕΟ ΙΌ №. 87) из ТНегтоЫйба Γιι^η^Όδχ;

на фиг. 100 показана нуклеотидная последовательность из Аеготопак ка1тошсИа (δΕΟ ΙΌ №. 88), включающая сигнальную последовательность (ргеЬАТ - положения 1-87);

на фиг. 101 показана полипептидная последовательность липидацилтрансферазного фермента из δΐ^ерΐοтусек (δΕΟ ΙΌ №. 89);

на фиг. 102 показана аминокислотная последовательность мутантной Аеготопак ка1тошс14а зрелой липидацилтрансферазы (ССАТ) с мутацией Акп80Акр (в особенности, аминокислота 80 находится в зрелой последовательности) - показано в данной заявке как δΕΟ ΙΌ №. 62 - после подвергания послетрансляционной модификации (δΕΟ ΙΌ №. 90);

на фиг. 103 показано выравнивание Ь131 и гомологов из δ. аνе^т^ΐ^1^к и Т. Гикса, иллюстрирует сохранение С^δx мотива ^ΌδΥ в Ь131 и δ. аνе^т^ΐ^1^к и Т. Гикса), САN^Υ блока, который представляет собой либо ССN^А, либо ССN^^, и НРТ блока (считается консервативным каталитическим гистидином). Эти три консервативных блока выделены;

на фиг. 104 показана ТСХ (подвижный буфер 5) 10 образцов молочного жира, монодиглицерида и δΐ 17, содержащего холестерин, олеиновую кислоту и сложный эфир холестерина;

на фиг. 105 показана ТСХ (подвижный буфер 1) 10 образцов молочного жира, монодиглицерида и δΐ 8, содержащего холестерин;

на фиг. 106 показана ТСХ (подвижный буфер 5) образцов молочного жира 1 (стандарт) и 2 (фермент). Стандартный δΐ. 17 содержит холестерин, олеиновую кислоту и сложный эфир холестерина;

на фиг. 107 показана ТСХ (подвижный буфер 1) образца молочного жира 1 (стандарт), 2 (фермент), монодиглицерида и δΐ 17, содержащего холестерин, жирную кислоту и сложный эфир холестерина;

на фиг. 108 показана ТСХ (подвижный буфер 4) образца молочного жира 1 (стандарт), 2 (фермент) и δΐ. 4, содержащего фосфатидилхолин (РС) и лизофосфатидилхолин;

на фиг. 109 показана ТСХ (подвижный буфер 5) образца сливок 3 (стандарт), 4 (фермент) и стандарта δΐ. 17, содержащего холестерин, олеиновую кислоту и сложный эфир холестерина;

на фиг. 110 показана ТСХ (подвижный буфер 1) образца сливок 3 (стандарт), 4 (фермент), монодиглицерида и δΐ 17, содержащего холестерин, жирную кислоту и сложный эфир холестерина;

на фиг. 111 показана ТСХ (подвижный буфер 4) образца сливок 3 (стандарт), 4 (фермент) и δΐ. 4, содержащего фосфатидилхолин (РС) и лизофосфатидилхолин;

на фиг. 112 показано представление кристаллической структуры 1ΙΥΝ.ΡΌΒ в виде полоски, которая имеет глицерин в активном сайте. Фигуру получают при использовании устройства для визуального про

- 62 018153 смотра Эеер У1е\\' δ^ίββ-ΡΌΒ;

на фиг. 113 показан боковой вид кристаллической структуры 1ΙΥΝ.ΡΌΒ при использовании устройства для визуального просмотра Пеер У1е\у δ^ίβδ-ΡΌΒ, с глицерином в активном сайте - остатки в пределах 10 А активного сайта глицерина закрашены черным;

на фиг. 114 показан вид сверху кристаллической структуры ΠνΝ.ΡΌΒ при использовании устройства для визуального просмотра Пеер У1е\у δ^ίβδ-ΡΌΒ, с глицерином в активном сайте - остатки в пределах 10 А активного сайта глицерина закрашены черным;

на фиг. 115 показано выравнивание 1;

на фиг. 116 показано выравнивание 2;

на фиг. 117 и 118 показано выравнивание 1ΙνΝ к Р10480 (Р10480 представляет собой последовательность базы данных для фермента Α. НубгорНПа), это выравнивание получали из ΡΕΑΜ базы данных и использовали в процессе построения модели;

на фиг. 119 показано выравнивание, где Р10480 представляет собой последовательность базы данных для Αе^οтοηа5 НубгорНПа. Эта последовательность используется для конструирования модели и селекции сайта. Следует отметить, что показан полный белок (8ΕΟ ГО Νο. 36), зрелый белок (эквивалент 8ΕΟ ΙΌ Νο. 73) начинается на остатке 19. Α. ва1 представляет собой 6Ό8Χ липазу Легоп-юнав δαίιηοηίοίάα (8ΕΟ ΙΌ Νο. 3), Α. Нуб представляет собой 6Ό8Χ липазу Ле^οтοηа5 НубгорНПа (8ΕΟ ГО Νο. 73). Консенсусная последовательность содержит * в положении отличия между приведенными последовательностями;

на фиг. 120 показана диаграмма, которая иллюстрирует добавление фермента к каждой ванне, Нап ΡΌ представляет собой лецитазу, Пап ΡΕ представляет собой КЬМ3 липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением;

на фиг. 121 показана ТСХ (растворитель 6) липида, экстрагированного из сливок, и стандартной смеси (8Т16) фосфолипидов; фосфатидилхолина (ГС); лизофосфатидилхолина (ЬЕС); фосфатидилинизитола (ΡΙ); фосфатидилэтаноламина (РЕ); 5,13% фосфатидной кислоты (РА) и спрингхолипида (86);

на фиг. 122 показана ТСХ (растворитель 1) липида, экстрагированного из сливок, и стандартной смеси свободных жирных кислот (ΕΕΑ), холестерина (СНЬ) и сложного эфира холестерина (СНЬсложный эфир);

на фиг. 123 показана ΑΝΟνΑ оценка холестерина в обработанных ферментом сливках (30%, проанализированной с помощью ТСХ (табл. 43), А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 124 показана ΑΝΟνΑ оценка жирных кислот в обработанных ферментом сливках (30%, проанализированной с помощью ТСХ (табл. 43), А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 125 показана ΑΝΟνΑ оценка холестерина, проанализированного с помощью ГЖХ (табл. 44) А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 126 показана ΑΝΟνΑ оценка сложного эфира холестерина, проанализированного с помощью ГЖХ (табл. 44) А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 127 показана ΑΝΟνΑ оценка 8ит ΕΕΑ (пальмитиновая кислота, С: 16:0 + олеиновая кислота, С 18:1 + линолеиновая кислота, С 18:2 + стеариновая кислота, С 18.0), проанализированного с помощью ГЖХ (табл. 44) А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 128 показана ТСХ (растворитель 6) липида, экстрагированного из сыра, и стандартной смеси свободных жирных кислот (ΕΕΑ), холестерина (СНЬ) и сложного эфира холестерина (СНЬ-сложный эфир);

на фиг. 129 показана ТСХ (растворитель 6) липида, экстрагированного из сыра, и стандартной смеси фосфолипидов: фосфатидилхолин (Ρ6), лизофосфатидилхолин (ΕΡ6), фосфатидилинизитол (ΡΙ), фосфатидилэтаноламин (РЕ) и фосфатидная кислота (РА);

на фиг. 130 показана ΑΝΟνΑ оценка холестерина в сыре, проанализированном с помощью ГЖХ (табл. 45) А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 131 показана ΑΝΟνΑ оценка сложного эфира холестерина в сыре, проанализированном с помощью ГЖХ (табл. 45) А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 132 показана ΑΝΟνΑ оценка олеиновой кислоты (С 18:1) + линолеиновая кислота (С 18:2) в сыре, проанализированном с помощью ГЖХ (табл. 45) А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 133 показана ΑΝΟνΑ оценка пальмитиновой кислоты (С 16:0), стеариновой кислоты (С 18:0), олеиновой кислоты (С18:1) + линолеиновая кислота (С 18:2) в сыре, проанализированном с помощью ГЖХ (табл. 45) А = контроль, В = лецитаза и С = КЬМ3';

на фиг. 134 показана диаграмма, представляющая силу как выход массы, свойств ускорения и отражения целевого материала;

на фиг. 135 показаны фотографии контрольных образцов ΠΑΝ011 (левая) и сыра, полученного с КЬМ3 ΠΑΝ013 (правая). Стояние 5 мин после стадии нагревания;

на фиг. 136 показана пицца, спеченная с сыром ΌΑΝ011 (левая), ΌΑΝ012 (центральная) и ΌΑΝ013 (правая);

на фиг. 137 показана генная структура, использованная в примере 32;

на фиг. 138 показана оптимизированная кодоном генная структура (№ 052907), использованная в

- 63 018153 примере 32;

на фиг. 139 показана последовательность вставки Χ1ιο1, содержащей ЬАТ-КЬМ3' предшественник гена, -35 и -10 блоки являются подчеркнутыми;

на фиг. 140 показана ВМЬ780-КЬМ3'САР50 (включающая 8ЕЦ ГО Νο. 16 - верхняя колонка) и ВМЬ780 (хозяйский штамм без структуры - нижняя колонка) через 48 ч роста при 37°С на 1% трибутириновом агаре.

Примеры

Если не указано иное, ТСХ анализ проводили, как описано в примере 6, и ГЖХ анализ проводили, как описано в примере 11.

Пример 1. Клонирование, секвенирование и гетерологичная экспрессия трансферазы из Аеготопак ка1тошс1ба подвида 8а1тошс1ба.

Применяемые штаммы.

Аеготопак ка1тошс1ба подвида 8а1тошс1ба (АТСС 14174) получают из АТСС и выращивают в течение ночи при 30°С в среде Лурии-Бертани (ЬВ). Указанные клетки центрифугируют и геномную ДНК выделяют, используя процедуры для выделения геномной ДНК из 01адеп Ыб. Буферный набор геномной ДНК (кат. 19060), протеазу К (кат. 19131) и РНКазу А (кат. 19101) получают от 01адеп Ыб. (Воипбагу соий Са1\\лск Соий, Vекΐ 8иккех, ВН10 2ΆΧ).

Бактериальный штамм-хозяин ВЬ21 (ПЕ3)рЬук8 (Ноуадеп) используют для получения рекомбинантных Аеготопак ферментов. Компетентные клетки ВЬ21 (ПЕ3)рЬук8 используют в качестве хозяина для трансформации с экспрессионным вектором реН2-АкаЮСАТ=р8М. Трансформированные клетки, содержащие соответствующий плазмид, выращивают при 37°С в ЬВ агарозной среде, содержащей 100мкг ампициллина/мл.

Строение экспрессионного вектора реП2-Ака16САТ-р8М.

Для всех ДНК амплификации трансферазных генов из Аеготопак геномную ДНК (0,2-1 мкл) используют как матрицу и р£ц ДНК полимеразу (2,5 единицы) используют с 10 мкл 10х р£ц буфера, 1 мкл каждого праймера (50 пмоль/мкл), 200 мкМ б№ТР в общем объёме реакции 100 мкл. ПЦР реакции проводят в программируемой термоячейке, используя следующие условия: 95°С в течение 30 с, 30 циклов 95°С в течение 30 с, 60°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин. Применяют дополнительное 5минутное продление при 72°С.

ПЦР амплификацию трансферазного гена из А. ка1топ1с1ба выполняют в 2 отдельных ПЦР реакциях. ПЦР реакцию 1 проводят, используя пары праймеров, ак1υ8NЕV(5' А6САТАТ6АААА ААТ66ТТТ6Т ТТ6ТТТАТТ6 666 3' |8Ы) II) Νο. 38]) и ак1к950пете (5' 6Т6 АТ6 6Т6 66С 6А6 6АА СТС 6ТА СТ6 3' [8ЕЦ ГО Νο. 37]). Вторую ПЦР реакцию проводят для внедрения С-концевой гистидиновой метки, используя ПЦР продукт из первой реакции и праймеры ак1υ8NЕV(5Ά6САТАТ6АААА ААТ66ТТТ6Т ТТ6ТТТАТТ6 666 3' |8Ы) II) Νο. 38]) и АНЬ81001 (5ТТ66АТСС 6ААТТСАТ СААТ6 6Т6 АТ6 6Т6 АТ6 6Т6 66С 3' [8ЕЦ ГО Νο. 39]). ПЦР продукт из второй реакции очищают и расщепляют с помощью рестрикционных ферментов Ме1 и ВатНк 2 мкг рЕТ 12а вектора ДНК также расщепляют с помощью рестрикционных ферментов Кбе1 и ВатН и обрабатывают с помощью фосфатазы. Обработанный с помощью рестрикционных ферментов реП2а и ПЦР продукт из реакции 2 очищают и лигируют, используя набор для лигирования Вар1б Ыдайоп Кй (Воске, 8\\'Цхег1апб). Смесь для лигирования используют для трансформирования Е. сой ТОР10 клеток. Трансформированные клетки распределяют в ЬВ агарозной среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.

Т7 промоторный праймер (5' ТААТАС6АСТСАСТАТА6 3' [8ЕЦ ГО Νο. 40]) и Т7 терминаторный праймер (5' СТА6ТТАТТ6СТСА6С66 3' [8ЕЦ ГО Νο. 41]) используют для проверки последовательностей и ориентации клонированных трансферазных генов в рЕТ12а векторе. ЭКА секвенирование проводят, используя набор для циклического секвенирования терминаторов АЫ Рйкт® В|дЭуе™ с 500 нг плазмидной ДНК в качестве матрицы и 3,2 пмоль Т7 промоторных и терминаторных праймеров.

Строение, показанное на фиг. 35, используют для трансформирования штамма компетентного бактериального хозяина ВЬ21 (ПЕ3)рЬук8 (Nονадеη), и устойчивые к ампициллину трансформированные клетки собирают и используют для экспрессионного анализа.

Экспрессия рекомбинантной Аеготопак ка1тошс1ба липидацилтрансферазы.

Количественный анализ активности фермента по отношению к лецитину определяют на клеточных экстрактах, используя набор неэстерифицированных жирных кислот (МЕРА) (Воске, 8\\йхег1апб).

На фиг. 36 ВЬ21 (ПЕ3)рЬук8, включающий экспрессионный вектор реП2-Ака16САТ= р8М, выращивают в ЬВ среде + 100 мкг/мл ампициллина и инкубируют при встряхивании при 37°С до достижения ΟΌ₆₀₀=0,6-1,0 (где ΟΌ - оптическая плотность). Далее эти культуры индуцируют, используя ГРТ6 (0,4 мМ), и инкубирование продолжают в течение последующих 3 ч. Образцы отбирают в момент времени 0, 1, 2 и 3 ч после ГРТ6 индукции. Активность фермента тестируют, используя NЕРА набор и лецитин в качестве субстрата. Оптимизация роста для получения более активных ферментов ВЬ21 (ПЕ3)рЬук8, включающий экспрессионный вектор реН2-Ака16САТ=р8М, выращивают в ЬВ среде +100 мкг/мл ампициллина и инкубируют при встряхивании при различных температурах для роста (37°С, 30°С и 20°С).

- 64 018153

Оптимальное условие для получения активного липидацилтрансферазного фермента представляет собой такое, когда культуры выращивают при 30°С, как показано на фиг. 37.

Частичная очистка рекомбинантной Аеготопаз за1тошс1ба трансферазы.

Штамм ВЬ21 (ПЕ3)рЬуз8, включающий экспрессионный вектор ре112-Л5а1ССЛТ=р8М. выращивают при 37°С и сырые клеточные экстракты получают путём обработки ультразвуком. Рекомбинантный фермент дальше очищают от обработанных ультразвуком сырых клеточных экстрактов, используя набор для центрифугирования К1-КТА от О1адеп. Тестируют фосфолипазную активность, используя КЕРА набор и лецитин в качестве субстрата. Сырые клеточные экстракты из ВЬ21 (ПЕ3)рЬуз8, экспрессирующего активную трансферазу, инкубируют с субстратом - лецитином и реакционную смесь анализируют, используя тонкослойную хроматографию, которая показывает присутствие продуктов разложения (см. фиг. 38).

Частичная очистка рекомбинантной Аеготопаз за1тошс1ба трансферазы. Штамм ВЬ21 (ПЕ3)рЬуз8, включающий экспрессионный вектор реИ2-Аза1ССАТ=р8М, выращивают при 37°С и сырые клеточные экстракты получают путём обработки ультразвуком. Рекомбинантный фермент дальше очищают от обработанных ультразвуком сырых клеточных экстрактов, используя набор для центрифугирования К1КТА от О1адеп. Тестируют фосфолипазную активность, используя КЕРА набор и лецитин в качестве субстрата (см. фиг. 39).

Пример 2. Клонирование и экспрессия Аеготопаз НубгорНПа трансферазы в Е. сой.

Аеготопаз НубгорНПа (АТСС # 7965) получают из АТСС и выращивают в течение ночи при 30°С в среде Лурии-Бертани (ЬВ). Эти клетки центрифугируют и геномную ДНК выделяют, используя процедуры для выделения геномной ДНК от О1адеп Ыб. Буферный набор геномной ДНК (кат. 19060), протеазу К (кат. 19131) и РНКазу А (кат. 19101) получают от О1адеп Иб. (Воипбагу соий СаРтюк Соий, \Уез1 8иззех, КН10 2АХ).

Бактериальный штамм-хозяин ВЬ21 (ЭЕ3)рЬуз8 (Коуадеп) используют для получения рекомбинантных Аеготопаз ферментов. Компетентные клетки ВЬ21 (ЭЕ3)рЬуз8 используют в качестве хозяина для трансформации с экспрессионным вектором реИ2а-А.й.ССАТ=р8Ма. Трансформированные клетки, содержащие соответствующий плазмид, выращивают при 37°С в ЬВ агарозной среде, содержащей 100 мкг ампициллина/мл.

Строение экспрессионного вектора реИ2а-А.й.ССАТ-р8Ма.

Для всех ДНК амплификации трансферазных генов из Аеготопаз геномную ДНК (0,2-1 мкл) используют как матрицу и р£и ДНК полимеразу (2,5 единицы) используют с 10 мкл 10х р£и буфера, 1 мкл каждого праймера (50 пмоль/мкл), 200 мкМ бКТР в общем объёме реакции 100 мкл. ПЦР реакции проводят в программируемой термоячейке, используя следующие условия: 95°С в течение 30 с, 30 циклов 95°С в течение 30 с, 60°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин. Применяют дополнительное 5минутное продление при 72°С.

ПЦР амплификацию трансферазного гена из А. НубгорНПа (АТСС # 7965) выполняют в 2 отдельных ПЦР реакциях.

ПЦР реакцию 1 проводят, используя пары праймеров, АНи81 (5' СТСАТАТСААААААТССТТТСТСТСТТТАТТСССАТТССТС 3', 8Ш ΙΌ Ко. 42) и аН1з950 (5' АТССТСАТССТСССССАССААСТССТАСТС 3', 8Ш ΙΌ Ко. 43). Вторую ПЦР реакцию проводят для внедрения С-концевой гистидиновой метки, используя ПЦР продукт из первой реакции и праймеры АНИ81 (5' СТСАТАТСААААААТССТТТСТСТСТТТАТТСССАТТССТС 3' 81Т) ΙΌ Ко. 44) и АНЕ81001 (5' ТТССАТСССААТТСАТСААТССТСАТССТСАТССТСССС 3' 8РС ΙΌ Ко. 45).

ПЦР продукт из второй реакции очищают и расщепляют с помощью рестрикционных ферментов Кбе1 и ВатН1. 2 мкг рЕТ 12а вектора ДНК также расщепляют с помощью рестрикционных ферментов Кбе1 и ВатН1 и обрабатывают с помощью фосфатазы. Обработанный с помощью рестрикционных ферментов реИ2а и ПЦР продукт из реакции 2 очищают и лигируют, используя набор для лигирования Кар1б ЫдаПоп Кй (КосНе, 8\\'Пхег1апб). Смесь для лигирования используют для трансформирования Е. сой ТОР10 клеток. Трансформированные клетки распределяют в ЬВ агарозной среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.

Т7 промоторный праймер (5' ТААТАССАСТСАСТАТАС 3') и Т7 терминаторный праймер (5' СТАСТТАТТССТСАСССС 3') используют для проверки последовательностей и ориентации клонированных трансферазных генов в рЕТ12а векторе. ЭКА секвенирование проводят, используя набор для циклического секвенирования терминаторов АВ1 Рпзт® В1дЭуе™ с 500 нг плазмидной ДНК в качестве матрицы и 3,2 пмоль Т7 промоторных и терминаторных праймеров.

Строение, показанное на фиг. 35, используют для трансформирования штамма компетентного бактериального хозяина ВЬ21 (ЭЕ3)рЬуз8 (Коуадеп) и устойчивые к ампициллину трансформированные клетки собирают и используют для экспрессионного анализа.

Экспрессия Аеготопаз НубгорНПа трансферазы в ВЬ21 (ЭЕ3)рЬуз8.

Е. сой штамм ВЬ21 (ПЕ3)рЬуз8, включающий экспрессионный вектор реИ2а-А.й.ССАТ=р8Ма, выращивают в ЬВ среде + 100 мкг/мл ампициллина и инкубируют при встряхивании при 37°С до достиже

- 65 018153 ния ΘΌ₆₀₀ = 0,6-1,0. Далее эти культуры индуцируют, используя ГРТС (0,4 мМ), и инкубирование продолжают в течение последующих 3 ч. Образцы отбирают в момент времени 0, 1, 2 и 3 ч после ГРТС индукции. Активность фермента тестируют, используя NЕРА набор и лецитин в качестве субстрата (фиг. 41).

Оптимизация роста для получения более активных ферментов.

ВЬ21 (ЭЕ3)рЬук8, включающий экспрессионный вектор ре!12а-А.й.ССАТ=р8Ма, выращивают в ЬВ среде +100 мкг/мл ампициллина и инкубируют при встряхивании при различных температурах для роста (37°С, 30°С и 20°С). Оптимальное условие для получения активного ССАТ фермента представляет собой такое, когда культуры выращивают при 30°С, как показано на фиг. 42.

Частичная очистка рекомбинантной А.йубторййа трансферазы (ССАТ).

Штамм ВЬ21 (ЭЕ3)рЬук8, включающий экспрессионный вектор ре!12а-А.й.ССАТ=р8Ма, выращивают при 37°С и сырые клеточные экстракты получают путём обработки ультразвуком. Рекомбинантный фермент дальше очищают от обработанных ультразвуком сырых клеточных экстрактов, используя набор для центрифугирования Νΐ-ΝΊΆ от 01адеп. Тестируют фосфолипазную активность, используя NЕРА набор и лецитин в качестве субстрата (см. фиг. 43).

Пример 3. Экспрессия Аеготопак трансфераз в ВасШик киЫШк 163.

Строение плазмида.

Два различных ВасШик киЫШк экспрессионных вектора (рИВ 110 & рВЕ5) используют для гетерологичной экспрессии Аеготопак генов в ВасШик киЫШк. рИВ110 вектор содержит α-амилазный промотор, в то время как рВЕ вектор имеет Р32 промотор в качестве регуляторной области для экспрессии слитых Аеготопак генов. В рИВ110, первую аминокислоту зрелых ССАТ генов Аеготопак сливают в структуру с последней аминокислотой ксиланазной сигнальной пептидной последовательности от ВасШик киЬГШк через сайт рестрикции Ш1е1, создавая дополнительные 2 аминокислоты перед зрелыми белками. рВЕ5 содержит слитие ССТ-азной сигнальной последовательности на №о1 сайте для секреции рекомбинантных белков в культуральный фильтрат.

ПЦР реакции проводят для получения слития Аеготопак генов в структуру с сигнальной последовательностью рИВ 110 и рВЕ5 векторов. ПЦР реакции проводят, используя следующие пары праймеров для А. йубторййа гена:

ПЦР реакция 1: икАНпсо1 (5'АТСССАТСССССАСАССССТСССССС3', 8ЕО ΙΌ №. 46) и 1кАН (5'ТТССАТСССААТТСАТСААТССТСАТС3', 8ЕО ΙΌ №. 47),

ПЦР реакция 2: и8-/\11п11е1 (5'ТТССТАССССССАСАССССТСССССС3', 8ЕО ΙΌ №. 48.) и 1кАН (5'ТТССАТСССААТТСАТСААТССТСАТС3, 8ЕО ΙΌ №. 49).

ПЦР реакции проводят, используя следующие пары праймеров для А. ка1топ1с1ба гена:

ПЦР реакция 3: и8-Акпсо1 (5'ТТСССАТСССССАСАСТССССССССС3', 8ЕО ΙΌ №. 50) и 1кАН (5'ТТССАТСССААТТСАТСААТССТСАТС3', 8ЕО ΙΌ №. 51),

ПЦР реакция 4: И8-А8пйе1 (5'ТТССТАССССССАСАСТССССССССС3', 8ЕО ΙΌ №. 52) и 1кАН (5'ТТССАТСССААТТСАТСААТССТСАТС3', 8ЕО ΙΌ №. 53).

Все ПЦР продукты клонируют в ПЦР Ь1иШ ΙΙ (ТОРО вектор) и устанавливают последовательность с обратным и прямым праймерами секвенирования.

Клоны из ПЦР реакций 1 и 3 вырезают с помощью №о1 и ВатШ и используют как вставки для лигирования с рВЕ5 вектором, который обрезают с помощью №о1/ВатШ/фосфатазы. Клоны из ПЦР реакций 2 и 4 вырезают с помощью Ν1ιο1 и ВатШ и используют как вставки для лигирования с рИВ вектором, который обрезают с помощью №е1/ВатШ/фосфатазы.

Экспрессия Аеготопак трансферазных генов в ВасШик киЫШк и характеризация ферментной активности.

Ацилтрансферазы из двух Аеготопак видов успешно экспрессируются в Е. сой (результаты выше). Структуры слития генов ВасШик рИВ110 & рВЕ5 используют для трансформирования ВасШик киЫШк и трансформированные клетки выбирают путём раскладывания на канамициновых планшетах. Канамицин устойчивые трансформированные клетки, выделенные и выращенные в ΣχΥΈ способны гетерологично экспрессировать Аеготопак гены в ВасШик. Культуральные фильтраты имеют дигалактозилдиацилглицерин (ЭСЭС) галактолипазную активность, кроме наличия как ацилтрансферазной и фосфолипазной активностей. Активность в отношении дигалактозилдиацилглицерина (ЭСЭС) измеряют через 60 мин инкубирования культуральной надосадочной жидкости с субстратом, ЭСЭС из пшеничной муки (может быть получен от 81дта), а также активность в отношении лецитина, как показано на фиг. 44. ВасШик производит фермент в течение промежутка времени от суток (20-24 ч) до 48 ч культивирования в культуральной среде как секретируемый белок. В некоторых случаях экспрессия Аеготопак генов, как показано, мешает клеточной жизнеспособности и росту в ВасШик и Е. сой, поэтому необходимо тщательно подбирать экспрессионные штаммы и оптимизировать условия роста для обеспечения экспрессии. Например, несколько ВасШик хозяйских штаммов (В.к 163, ЭВ104 и 08 21) трансформируют с экспрессионными векторами для сравнения роста. В.к 163 может быть трансформирован с 2 Аеготопак генами и способен экспрессировать активный белок. ЭВ104 может быть трансформирован со всеми структурами,

- 66 018153 но способен экспрессировать только А. ха1тошс1ба трансферазу.

Пример 4. Ферментация и очистка Аегоппмых липидацилтрансфераз, полученных в Е.со11.

Е.сой ферментации.

Микроорганизмы.

Два штамма Ехскепаа сой, один, содержащий Аегототх кубгоркйа (пример 2) липидацилтрансферазу, и второй, содержащий Аегототх ха1тошс1ба липидацилтрансферазы (пример 1), используют в данном исследовании.

Е. со11 штамм, содержащий А. кубгоркйа ген, называют ΌΙΌΚ0124, и Е. со11 штамм, содержащий А. ха1тошс1ба ген, называют ΌΙΌΚ0125. Ферментацию с помощью ΌΙΌΚ0124 называют ΗΥΏΚ00303 и ферментацию с помощью ΌΙΌΚ0125 называют 8АЬ0302. Очищенный белок после ΗΎΏΚΟ025 называют ВЕР#138. Очищенный белок после ΗΎΌΚ00303 называют КЕЕ#135.

Среды для выращивания и условия культивирования ЬВ-агар.

ЬВ агарозные планшеты, используемые для поддержания штаммов, содержащих: 10 г/л тритона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л №С1, 15 г/л агара, 100 мг/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола. Указанные агарозные планшеты инкубируют при 30°С.

ЬВ встряхиваемая колба.

ЬВ среда (50 мл на встряхиваемую колбу), используемая для получения посевного материала для культивирования в биореакторе, содержащая 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л №С1, 100 мг/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола. Эти встряхиваемые колбы инокулируют из ЬВ агарозных планшетов и инкубируют при 30°С и 200 об/мин.

Культивирование в биореакторе.

Культивирования в биореакторе проводят в 6-литровых биореакторах собственной разработки, наполненных 4 л среды, содержащей 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л №С1, 8 г/л ΚΗ₂ΡΟ₄, 0,9 г/л Мд8О₄-7Н₂О, 40 г/л моногидрата глюкозы, 0,4 мл/АЭБ АРТ® Роатх1ор 8ίη 260 (АЭБ АРТ Скетъ са1х АО, Не^о^, Тке Nеΐке^1аηбх), 10 мг/л (ИН₄)₂Ре(8О₄)₂ 6Н₂О, 0,7 мг/л Си8О₄-5Н₂О, 3 мг/л 2п8О₄-7Н₂О, 3 мг/л Мп8О₄Н₂О, 10 мг/л ЕБТА, 0,1 мг/л №8О₄-6Н₂О, 0,1 мг/л СоС1₂, 0,1 мг/л Н₃ВО₄, 0,1 мг/л ΚΙ, 0,1 мг/л №₂МоО₄-2Н₂О, 1 г/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола.

Биореакторы инокулируют с помощью количества ЬВ культуры, обеспечивающего конец роста, через приблизительно 20 ч культивирования (рассчитано из максимальной специфической скорости роста 0,6 ч^-1, (ОБ₆₀₀ ЬВ встряхиваемой колбы и конечной ОБ₆₀₀ в биореакторе приблизительно 20).

8АЬ0302 инокулируют с помощью 10 мл ЬВ культуры, и НУБВО0303 инокулируют с помощью 4 мл ЬВ культуры.

Биореакторы запускают при следующих условиях: температура 30°С, перемешивание 800-1000 об/мин (в зависимости от эксперимента), аэрация 5 л/мин, рН 6,9, рН контроль 8,75% (мас./об.) ИН₃-вода и 2М Н₂8О₄. Индукции достигают путём добавления изопропил Ρ-Ό-тиогалактозида до конечной концентрации 0,6 мМ, при этом получают 0,4 моль (НУВКО0303) и 0,7 моль СО₂ соответственно.

Сбор клеток, выросших в культуре.

Следующую процедуру используют для сбора клеток, выросших в культуре, и гомогенизации биомассы:

1) ферментационный бульон из ферментации центрифугируют при 5000/д и 4°С в течение 10 мин и надосадочную жидкость сливают. Эту биомассу хранят при -20°С до применения. Эту биомассу оттаивают и снова суспендируют в 500 мл 20 мМ NаΗ₂ΡΟ₄, рН 7,4, 500 мМ №С1, 10 мМ имидазола и полного (не содержащего ЕБТА) ингибитора протеазы (Воске, 6еппапу);

2) эту суспендированную биомассу гомогенизируют при 2 кбар и 4°С в клеточном дезинтеграторе от С'опхЫгИ 8ух1етх Ыб. (ХУапуюк, υΚ);

3) остатки клеток удаляют путём центрифугирования при 10.000/д и 4°С в течение 30 мин, что сопровождают собиранием надосадочной жидкости;

4) надосадочную жидкость дополнительно очищают путём центрифугирования при 13.700/д и 4°С в течение 60 мин, что сопровождают собиранием надосадочной жидкости;

5) надосадочную жидкость фильтруют через 0,2 мкм Уаси Сар фильтры (Ра11 Ь1Ге 8^ι^χ, υΚ) и фильтрат собирают для последующей хроматографической очистки.

Хроматографическая очистка трансфераз.

Колонку (2,5/10 см) наполняют с помощью 50 мл С’ке1а1кщ 8еркагохе ГГ. геля и загружают с помощью Νί-сульфата (в соответствии со способом, описанным производителем, Атегхкат Вюхс1ег1сех). Указанную колонку приводят в равновесие с помощью 200 мл 20 мМ NаΗ₂ΡΟ₄, рН 7,4, 500 мМ №С1, 10 мМ имидазола. 400 мл сырого материала вносят в колонку при скорости потока 5 мл/мин. Далее указанную колонку промывают с помощью 20 мМ NаΗ₂ΡΟ₄, рН 7,4, 500 мМ №С1, 10 мМ имидазола до достижения УФ₂₈₀ базовой линии. Затем ОСАТ элюируют с помощью 40 мл 20 мМ NаΗ₂ΡΟ₄, рН 7,4, 500 мМ №1С1 и 500 мМ имидазола.

Пример 5. Ферментация и очистка Аегоп-юнах липидацилтрансфераз, полученных в ВасШих хиЫ1115.

Ферментации.

- 67 018153

ВАС0318-19, ВАС0323-24.

Микроорганизм.

Микроорганизмы, применяемые в данном исследовании, происходят от трансформации ВасШик киЫШк штамма-хозяина, #163 с плазмидом, содержащим ген, кодирующий Аеготопак ка1тотс1ба трансферазу, вставленную в вектор рЦВ110О18. Экспрессию этого гена контролируют с помощью αамилазного промотора и секрецию трансферазы опосредуют с помощью В. киЫШк ксиланазной сигнальной последовательности (пример 3). Эти штаммы называют ΏΙΏΚ0138 (ферментация ВАС0318-19) и ΏΙΏΚ0153 (ферментация ВАС0323-24).

Среда для выращивания и условия культивирования.

Прекультуральная среда.

В колбу для встряхивания (500 мл общий объём, с перегородками) добавляют 100 мл среды, содержащей такие компоненты

ИаС1	5 г/л
К₂НРО₄	10 г/л
Соевая мука	20 г/л
Экстракт дрожжей, Вю8рпп§ег 106	20 г/л
Антивспениватель, 8ΙΝ260	5 мл/л

рН доводят до 7,0 перед автоклавированием.

После автоклавирования 6 мл 50% (мас./мас.) нутриозы (А'Шпоке) добавляют в колбу. Канамицин добавляют при концентрации 50 мг/л после автоклавирования.

Инокуляция.

Колбу для встряхивания прекультуры инокулируют замороженной культурой прямо из 25% (мас./об.) глицеринового исходного раствора. Колбу для встряхивания инкубируют при 33°С и 175 об./мин. В течение приблизительно 16 ч, после чего 50 мл используют для инокулирования ферментёра.

Ферментации.

Ферментации проводят в 6-л встроенных ферментёрах собственной разработки.

Среда загрузки (3 л) содержит

Жидкий кукурузный экстракт (50% д.в.) 40 г/л

Экстракт дрожжей Вю8рпп§ег 153 (50% д.в.) 10 г/л

ИаС1 5 г/л

СаС1₂, 2Н₂О	0,25 г/л
Μπ(ΝΟ₃)₂, Н₂О Антивспениватель 8ΙΝ260	0,2 г/л 1 мл/л

Канамицин (стерилизованный фильтрацией

до ферментёра после автоклавирования)

50 мг/л

Подаваемый материал содержит:

Глюкозы моногидрат М_ё8О₄, 7Н₂О Антивспениватель 8ΙΝ260	540 г/кг 4,8 г/кг 4 мл/кг
Экстракт дрожжей, Вю8рпп§ег 153 (50% д.в.) (автоклавированный отдельно)	150 г/кг

Подачу в ферментации ВАС0318 и ВАС0323 начинают, основываясь на накопившемся СО₂, в соответствии с уравнениями ниже

Подача - поток [г/ч.] = 0, АсСО₂ < 0,15

Подача - поток [г/ч.] = 2,85 + ί · 1,54, АсСО₂ > 0,15 и ΐ < 12

Подача - поток [г/ч.] = 21,3, ί > 12 ΐ - время (ч) от момента, когда накопившийся СО₂ (АсСО₂) достигнет 0,15 моль.

Подачу в ферментации ВАС0319 и ВАС0324 начинают, основываясь на накопившемся СО₂, в соответствии с уравнениями ниже

- 68 018153

Подача - поток [г/ч.] = 0, АсСО₂ <0,15

Подача - поток [г/ч.] = 2,0 +1 · 1,08, АсСО₂> 0,15 и 1 < 12

Подача - поток [г/ч.] = 15,1 > 12 ΐ - время (ч) от момента, когда накопившийся СО₂ (АсСО₂) достигнет 0,15 моль.

рН удерживают при 7,0 путём добавления 12,5% (мас./об.) ΝΗ/з-воды или 2М фосфорной кислоты. Аэрация составляет 3 л/мин, что соответствует 1 уут.

Температура составляет 33°С.

Ферментёр оснащают двумя 8 см 0 КикЫоп импеллерами, помещаемыми на расстоянии 10 см.

Сбор клеток, выросших в культуре.

Биомассу удаляют с помощью центрифугирования при 16,000хд в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость стерилизуют фильтрацией и фильтрат используют для очистки и тестов приложения.

Пример 6. Тесты приложения в яичном желтке.

В следующих экспериментах выделенную трансферазу из Аеготопак ка1тотс1ба, экспрессированную в Е-со11, тестируют в яичном желтке отдельно и в яичном желтке, в который добавлен растительный стерол.

Материал.

Трансфераза из Аеготопак ка1тотс1ба КЕР#138.

Яичный желток из свежих яиц (куриные яйца).

Растительный стерол β-ситостерол, 81дта 8 5753.

ТСХ пластины: кремнеземный планшет Мегск № 1.05715.0001.

ТСХ анализ.

ТСХ пластину активируют в нагревательном шкафу (110°С) в течение 1/2 ч.

100 мл проявляющего растворителя выливают в хроматографическую камеру с крышкой. Стенки камеры покрывают фильтровальной бумагой (УНа(тап 2) для того, чтобы наполнить указанную камеру парами растворителя.

ТСХ пластину помещают в рамку и образец наносят на ТСХ пластину на 2 см выше нижней части. ТСХ пластину затем помещают в ТСХ камеру с проявляющим растворителем. Когда проявляющий растворитель достигнет 14 см от низа пластины, ТСХ пластину вынимают и сушат в испаряющей панели и затем помещают в нагревательный шкаф при 110°С на 10 мин.

ТСХ пластину затем погружают в проявляющий реагент и сушат в нагревательном шкафу при 110°С в течение 15 мин.

Проявляющий растворитель:

№ ГУ: хлороформ:метанолЛ₂О (65:25:4) № Г: п-эфир:МТВЕ:уксусная кислота (60:40:1).

Проявляющий буфер (Ванадат-буфер):

г Ха₂СО₃ и 300 мл Η₂Ο (1М)

18,2 г пентоксида ванадата (У₂О₅) добавляют и растворяют при осторожном нагревании.

Этот раствор охлаждают до комнатной температуры.

Осторожно добавляют 460 мл 2,5М ^8О₄ (460 мл Η^+61 мл Η₂8Ο4).

Воду добавляют до 1000 мл.

Фосфолипазная активность.

Субстрат:

0,6% Ь-α фосфатидилхолина 95% растительного (Ауапй #441601) + 0,4% Тритон-Х

100 (81дта Х-100) + 5 мМ СаС1₂ растворяют в 0,05М ΗΕΡΕ8 буфера рН 7.

Процедура.

400 мкл субстрата добавляют к 1,5 мл пробирке Эппендорфа и помешают в термомиксер Эппендорфа при 30°С на 5 мин.

К моменту времени Т=0 добавляют 50 мкл ферментного раствора. Также анализируют контрольную пробу с водой вместо фермента.

Эти образцы смешивают при 1000 об./мин на термомиксере Эппендорфа при 30°С в течение 10 мин.

К моменту времени Т=10 мин пробирку Эппендорфа помещают в другой термомиксер при 99°С на 10 мин для прекращения реакции.

Свободную жирную кислоту в образцах анализируют, используя ХЕРА набор от ХУАКО ΟтЬΗ.

Ферментную активность РШ-7 рН 7 рассчитывают как микромоли жирной кислоты, произведённые в минуту при условиях исследования.

Липидная экстракция.

г яичного желтка и 7,5 мл смеси хлороформ:метанол 2:1 смешивают на миксере УН1г1еу и центрифугируют при 750хд в течение 10 мин.

- 69 018153 мл фазы хлороформа выделяют и используют для дальнейшего липидного анализа.

Результаты.

Трансферазу (ΚΕΡ#138) из Αе^οтοηа8 за1тошс1ба, экспрессированную в Ε. сой, анализируют на фосфолипазную активность, как описано выше, и также тестируют в яичном желтке в присутствии и без β-ситостерола. Образцы перемешивают с помощью магнитной мешалки в процессе реакции. Модель эксперимента показана в табл. 1.

Таблица 1

Тест	Время реакции при 37°С	Яичный желток	Ситостерол	Трансфераза #138
№	Минуты	грамм	мг	единицы
1	30	1	40
2	30	1	40	0,75 рьи
3	30	1	80	0,75 рьи
4	120	1	40	0,75 рьи
5	120	1	80	0,75 рьи
6	300	1	40	0,75 рьи
8	300	1	40

Реакцию останавливают добавлением 7,5 мл смеси хлороформ:метанол (2:1) и смешивают на миксере Шй1г1еу в течение 30 с. Фазу хлороформа выделяют с помощью центрифугирования и 2 мкл фазы хлороформа переносят на предварительно активированную кремнеземную ТСХ пластину и элюируют с проявляющим растворителем № I, и другую ТСХ пластину в проявляющем растворителе IV.

Результаты ТСХ анализа показаны на фиг. 45 и 46.

Трансферазная реакция с трансферазой из Αе^οтοηа8 за1тошс1ба в яичном желтке, когда добавляют растительный стерол, показала, что фермент переносит жирную кислоту от лецитина в яичном желтке к холестерину в процессе образования сложного эфира холестерина. ТСХ хроматограмма также показывает, что часть стерола, добавленного к яичному желтку, переносится на сложный эфир стерола.

Количество сложного эфира стерола по отношению к количеству сложного эфира холестерина, образованному в процессе реакции, может быть проанализировано с помощью ВЭЖХ или ГЖХ.

Известно, что растительные сложные эфиры стерола уменьшают абсорбцию холестерина в кишечнике. В литературе также показано, что сложные эфиры холестерина абсорбируются меньше, чем свободный холестерин в кишечнике. Когда трансферазу и растительный стерол добавляют к яичному желтку, получают продукт, который вызывает уменьшенную абсорбцию холестерина, и в то же самое время производится лизолецитин, который улучшает свойства эмульгирования яичного желтка. Дальнейшее преимущество добавления трансферазы и растительного стерола к яичному желтку заключается в том, что растительный сложный эфир стерола принимают внутрь вместе с природным доступным холестерином, который, как ожидают, будет иметь самое высокое влияние на снижение абсорбции холестерина.

Пример 7. Модификация яичного желтка с помощью липидацилтрансферазы из Αе^οтοηа8 за1тотс1ба.

В соответствии с настоящим изобретением в настоящее время показано, что можно произвести лизолецитин из яичного желтка без образования существенных количеств свободной жирной кислоты путём применения трансферазы.

Содержание лецитина в яичном желтке является важным эмульгатором для производства майонеза с ограничением, что майонез не устойчив к высокой температуре. Поэтому в течение нескольких лет известно использование фосфолипазы из поджелудочной железы для модифицирования лецитина в яичном желтке в лизолецитин, который является более эффективным эмульгатором. Использование модифицированного ферментом яичного желтка в производстве майонеза способствует лучшей термостойкости майонеза во время пастеризации. Ограничение использования фосфолипазы поджелудочной железы в яичном желтке заключается в том, что количество свободной жирной кислоты также увеличивается, что способствует получению сниженной окислительной стабильности, потому что свободные жирные кислоты являются более склонными к окислению, чем соответствующий сложный эфир. Свободная жирная кислота может также поспособствовать получению постороннего мыльного привкуса.

Трансферазу из Αе^οтοηа8 за1тошс1ба успешно экспрессируют в В. зиЫШз и ферментируют в лабораторном масштабе, как описано в примере 5, очищают жидкостной хроматографией и используют для модифицирования липидов яичного желтка. Этот модифицированный ферментом яичный желток используют для получения майонеза, устойчивого к нагреванию.

Трансферазу из Α. за1тошс1ба можно использовать для получения лизолецитина и сложного эфира холестерина в яичном желтке без получения значительных количеств свободных жирных кислот, т.е. без повышения или существенного повышения содержания свободных жирных кислот в продукте питания.

Модифицированный ферментом яичный желток, полученный с помощью трансферазы, показал улучшенные эмульгирующие свойства и может быть использован для получения майонеза, устойчивого к нагреванию.

Этот фермент оказывается очень функциональным в модификации яичного желтка путём катализи

- 70 018153 рования липидтрансферазной реакции между лецитином и холестерином, как показано на фиг. 47.

Это исследование дополнительно изучило применение трансферазы для модификации яичного желтка и применение модифицированного яичного желтка в получении майонеза, устойчивого к нагреванию.

Этот пример описывает ферментацию, выделение и применение трансферазы в яичных желтках, а также применение модифицированного ферментом яичного желтка в получении майонеза. Этот пример подразделён на две части.

A. Применение трансферазы в яичном желтке.

B. Тестирование модифицированного ферментом яичного желтка в майонезе.

Экспериментальная часть

А. Применение.

Фермент и субстрат.

Трансфераза #178-9 из А. ка1шошс1ба, очистка 2554-100 С73, 15 РЬи-7/мл.

Трансфераза #179 из А. ка1тотск.1а, 18,5 РЬи-7/мл.

Фосфолипаза А1 ЬЕС1ТА8Е™ и11га (Л'охо/утек А/8, Оепатгк).

Яичный желток: жидкий яичный желток с 8% соли, 8ΑNОVΑ РООО8, ОК.

ТСХ анализ проводят, как описано выше (см. пример 6 выше).

Фосфолипазная активность: см. предыдущие примеры.

Липидная экстракция.

г яичного желтка и 7,5 мл смеси хлороформ:метанол 2:1 смешивают на миксере МЫг1еу и центрифугируют при 750хд в течение 10 мин.

мл фазы хлороформа выделяют и используют для последующего липидного анализа.

Тест на устойчивость к окислению.

Устойчивость к окислению майонеза измеряют на МЬ ОХ1РКЕ88 оборудовании, где образец подвергают окислению с помощью нагревания при давлении в атмосфере кислорода.

Через некоторое время, названное индукционным периодом (1Р), окисление образца вызывает потребление некоторого количества кислорода, которое регистрируют как изменение давления с датчиком давления. Более высокий индукционный период показывает лучшую устойчивость к окислению.

Процедура.

г майонеза помещают в стеклянный контейнер и этот стеклянный контейнер закрывают датчиком давления. Этот контейнер заполняют кислородом до 5 бар. Клапан открывают для опустошения контейнера. Эту процедуру повторяют дважды и образец с 5 бар атмосферами кислорода доводят до 80°С. Давление кислорода как функцию времени измеряют и индукционный период (1Р) рассчитывают в часах.

Результаты.

Очищенную трансферазу из Аеготопак ка1тотск.1е образца № #179 и #178-9 используют для обработки яичного желтка, как показано в табл. 2. Исходный тест показал, что следует добавлять ОСАТ трансферазу с значительно более низкой фосфолипазной (РЮ) активностью, чем коммерческую фосфолипазу. Это объясняется тем фактом, что ОСАТ представляет собой трансферазу и поэтому имеет значительно более низкую гидролитическую активность, чем нормальная фосфолипаза.

Таблица 2

	8апо1о яичный желток 8% соли	2344-44 С89 18,5 РЬи-7/мл	Трансфераза #178- 9	#3108, Ьесйазе 1Л1га	Вода
№	Яичный желток	Трансфераза #179	18,5 РЬи-7/мл	1500 рьи- 7/мл 7/мл
	г	г	г	мл	г	рьи- 7/мл
6	120	2,00			8,00	0,31
7	120		10		0	1,25
8	120			1,86	8,14	23,25
9	120				10	0

Ферментативные реакции проводят путём измерения яичного желтка и фермента в мензурке. Образцы помещают в термошкаф при 37°С при медленном перемешивании. Через 1, 2 и 4 ч времени реакции образец вынимают для ТСХ анализа. Через 4 ч времени реакции этот продукт хранят при 5°С и используют для экспериментов с майонезом.

ТСХ анализы липидов, экстрагированных из обработанного ферментом яичного желтка, показаны на фиг. 48.

ТСХ анализы на фиг. 48 показывают ясный гидролитический эффект фосфолипазы #3108 на триглицерид в процессе образования свободных жирных кислот, а также некоторого моно- и диглицерида. Кажется, что фосфолипаза #3108 не имеет эффекта на холестерин. Оба трансферазных образца явно спо

- 71 018153 собствуют формированию сложного эфира холестерина одновременно с уменьшением содержания холестерина.

I). Модифицированный ферментом яичный желток в майонезе.

Для того чтобы исследовать эффект модификации образцов яичного желтка, упомянутой в табл. 2, испытания применения проводят на майонезе с жирностью 50%. Также получают майонез, содержащий необработанный яичный желток.

Цель исследования состояла в том, чтобы определить воздействие свойства эмульгирования ферментативно модифицированного яичного желтка и воздействие на термостойкость. Все образцы майонеза содержат тот же самый уровень масла и эмульгируются только яичным желтком.

Образцы майонеза производят, используя миксер Κοτιιιηπ (Οίκΐιο ν60/10), и нагревают во время обработки до 95°С в течение 5 мин.

Образцы майонезов (фиг. 49), полученные с помощью обработанного ферментом яичного желтка, являются хорошими и гомогенными без отделения масла. Контрольный образец разделяют на масляную и водную фазу.

Размер частиц масляной капли в образцах майонеза с обработанным ферментом яичным желтком измеряют на Ма1уегп Ма81ег817ег. Образец смешивают с 0,1% 8Ώ8 в 0,1М фосфатном буфере рН 7 для измерения. Считывание показало средний размер всех частиц, как представлено в табл. 3.

___ Таблица 3

Эксперимент	Фермент	Средний размер частиц, мкм
6	Трансфераза #179, 0,31 РБи-7/г	12,9
7	Трансфераза #178-9, 1,25 РБИ-7/г	7,2
8	#3108, Бесказе Икга, 23 РБИ-7/г	5,2

Результаты измерения размера частиц ясно показывают эффект увеличенной дозировки трансферазы из А. 8а1тοη^с^йа. При высокой дозировке трансферазы размер частиц близок к майонезу, полученному с помощью Ьес11а8е И11га. Однако следует отметить, что Бесказе И11га обеспечивает получение множества жирных кислот, что могло бы поспособствовать более тонкому распределению частиц.

Размер масляной капли майонеза, полученного с этим ферментом, является значительно меньше, чем размер масляной капли майонеза, полученного без фермента (т.е. контрольного майонеза).

Устойчивость к окислению.

Устойчивость к окислению образцов майонеза 7 и 8 анализируют на МБ ΟXIΡКΕ8, при этом результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Образец	Индукционный период	Индукционный период
	1. определение часы	2. определение часы
7	37,44	38,08
8	35,68	35,52

Измерение устойчивости к окислению показывает ясную значительную разницу в устойчивости к окислению. Майонез с обработанным трансферазой 179-8 яичным желтком имеет значительно более лучшую устойчивость к окислению, чем майонез с обработанным Бесказе Б11та яичным желтком. Это может быть объяснено тем фактом, что Бесказе Шка приводит к получению большего количества свободных жирных кислот, которые более склонны к окислению, чем соответствующие сложные эфиры жирных кислот.

Образец яичных желтков, используемых для получения майонеза, экстрагируют хлороформом и липиды из яичного желтка анализируют с помощью ГЖХ, при этом результаты показаны в табл. 5.

Таблица 5

Эксперимент	Фермент	Жирная кислота	Холестерин	Сложный эфир холестерина	Триглицерид
6	Трансфераза #179	0,96	0,94	0,49	23,95
7	Трансфераза #178-9	1,84	0,60	1,06	24,54
8	#3108, Бесказе ИЙта	14,05	1,16	0,12	2,45
9	Контроль	0,48	1,16	0,13	22,87

ГЖХ результаты в табл. 5 подтверждают результаты из ТСХ анализа, что Бесказе Шка приводит к получению очень большого количества свободных жирных кислот и большая часть триглицеридов гидролизуется. С другой стороны, трансфераза приводит к получению только умеренных количеств свободных жирных кислот и никакие триглицериды не гидролизуется. Также ясно показано, что трансфераза приводит к получению сложного эфира холестерина из холестерина.

Результаты показывают, что количество РС в обработанном ферментом майонезе уменьшено по сравнению с контрольным майонезом, в то время как количество БРС увеличивается в обработанном ферментом майонезе по сравнению с контрольньм майонезом. Увеличение количества БРС может хорошо объяснить улучшенные свойства эмульгирования обработанного ферментом майонеза по сравнению

- 72 018153 с контрольным майонезом. ВЭЖХ и ГЖХ исследования также показывают, что более низкий уровень свободного холестерина в обработанном ферментом майонезе по сравнению с контрольным майонезом вероятно связан с тем, что используемый холестерин как акцепторная молекула в трансферазной реакции приводит к увеличению количества сложных эфиров холестерина в обработанном ферментом майонезе по сравнению с контрольным майонезом. Кроме того, результаты показывают, что количество свободных жирных кислот не возрастает значительно, когда яичный желток обрабатывают трансферазой. Результаты далее указывают, что количество свободных жирных кислот, полученных в продукте питания, обработанном с помощью липидацилтрансферазы, значительно ниже, чем в продукте питания, обработанном контрольной фосфолипазой, это верно, даже если количество лизолецитина, сформированного в продуктах питания, является тем же самым.

Пример 8. Эффект Аеготопак ка1тотс1ба трансферазы в тортах.

Эффект ОСАТ ацилтрансферазы из Аеготопак ка1тотс1ба тестируют в рецепте тортов. Фермент тестируют отдельно и в комбинации с другими липолитическими ферментами. Ферменты добавляют к некоторым из ингредиентов тортов или добавляют вместе с другими ингредиентами тортов перед перемешиванием тортов.

Предварительные результаты показывают, что ацилтрансфераза, объединённая с гидролизирующим триглицерид ферментом, улучшает объём и структуру мякиша в сравнении с контролем.

В следующих экспериментах трансферазу из А. ка1тошс1ба и варианты тестируют отдельно и в комбинации с гидролизирующими триглицерид ферментами. Эти ферменты являются активными по отношению к липидным компонентам в яйце и шортенинту, а также по отношению к углеводам, белкам, глицерину и холестерину (в яйце), которые образуют часть рецепта торта.

Материалы и способ.

Фермент. #179, ацилтрансфераза из Аеготопак ка^отсМа Огтбату1 ΕΧΕΙ, 16, липаза из ТНегтотусек 1апидт1кик.

Рецепт торта________________________________________________________________

Ингредиенты	%	г
Сахар 35/20	20,37	204
Мука для тортов, А1Ьа1гоз	18,11	181
Пшеничный крахмал	5,21	52
Разрыхлитель	0,36	4
Пастеризованные жидкие цельные яйца	22,63	226
Шортенинг Уедао (АагЬиз υηίΐεά)	18,11	181
Сухая молочная сыворотка	0,68	7
Глюкозный сироп,75% 42 ИЕ	4,53	45
Глицерин	1,36	14
Соль	0,32	3
Рапсовое масло	6,34	63
Сорбат калия	0,18	1,8

Оборудование.

Миксер: ИоЬаг! N50 с кулинарной лопаткой.

Духовка: духовой шкаф для выпекания тортов 81топ.

Процедура.

Все ингредиенты должны быть доведены до комнатной температуры.

1. Взбейте сахар и шортенинг в течение 3 мин - начинайте на 2-й скорости и переходите к 3-й скорости в течение 30 с.

2. Добавьте оставшиеся ингредиенты - начинайте на 1-й скорости и переходите к 2-й скорости в течение 30 с - перемешивайте всего 5 мин.

3. Измерьте объём взбитого жидкого теста в 1 дл чашке.

4. Обрызгайте формы для выпечки бисквитного теста пастой из растительных жиров ВаЬейе и покройте бумагой.

5. Отмерьте 2х350 г в формы для выпечки теста.

6. Распределите массу равномерно с помощью лопатки.

7. Перед тем как поставить в духовку, добавьте струйку масла на верх тортов (продольно по середине, чтобы сделать разлом торта посредине).

8. Выпекайте в течение 50 мин при 180°С.

9. После выпекания выньте эти формы из духовки и бросьте их на стол перед выниманием тортов из форм.

10. Уберите бумагу с тортов и переверните лицевой стороной вверх.

11. Охладите торты на решётке в течение 60 мин перед взвешиванием и определением объёма. Примечания.

Используемый(ые) фермент(ы) добавляют в начале перемешивания или добавляют к некоторым из

- 73 018153 ингредиентов тортов перед добавлением других ингредиентов торта.

Ферменты являются активными только в процессе перемешивания или реакции компонентов торта, и эти ферменты дезактивируются в процессе выпекания торта.

Результаты.

Следующие эксперименты проводят, как показано в следующей таблице_____________

		1	2	3	4
Цельное яйцо	г	250	250	250	250
Глюкозный сироп, 75% ϋΕ 42	г	10	10	10	10
#179 ацил-трансфераза, 26 РЬи/мл	мл	25		25
Оппйату1 ЕХЕЬ 16,	мг		37,5	37,5
Вода					25

Яйцо, глюкозный сироп и фермент реагируют в течение 30 мин при 37°С и вскоре после этого яйца используют для получения торта в соответствии с рецептом, описанным выше.

Предварительные результаты показывают, что комбинация ацилтрансферазы и гидролизирующей триглицерид липазы из ТНегтотусез 1аподтозиз улучшает объём торта, а также структура мякиша, пищевая ценность и внешний вид улучшаются в сравнении с водным контролем. Предварительные результаты показывают, что в торте может быть предпочтительно использована комбинация липидацилтрансферазы и липазы.

Пример 9. Цель этих экспериментов заключается в тестировании трансферазы из А. НуйгорНйа, экспрессированной в Е. сой.

Трансферазную реакцию А. НуйгорНйа #135 (0,5 \ЕЕА-РГЕ-мл) тестируют на яичном желтке. План эксперимента показан в табл. 6.

Таблица 6

	Время реакции	Яичный желток	#135 конц.
№	мин.	г	единицы, ΡΕΙΙ-ΝΕΡΑ
1	30	1	0,000
2	30	2	0,100
3	60	2	0,100
4	150	2	0,100
5	240	2	0,100
6	1560	2	0,100
7	1560	1	0,000

Яичный желток нагревают до 37°С и добавляют фермент. После прохождения времени реакции добавляют 7 мл смеси СНС1₃:метанол 2:1 и перемешивают на миксере ШН1г1еу в течение 30 с.

Образец центрифугируют 800хд в течение 10 мин и нижнюю фазу растворителя отделяют. 2 мкл этого образца наносят на ТСХ кремнеземную пластину и элюируют в элюирующем буфере IV. Результаты ТСХ анализа показаны на фиг. 50 и 51.

Способы и материалы, указанные в этом примере, представляют собой описанные в примерах выше.

Образцы из этого эксперимента также анализируют с помощью ГЖХ в виде ТМ8 производных. Результаты ГЖХ анализа показаны в табл. 7.

Таблица 7

ГЖХ анализ липида из яичного желтка

№	Время реакции	Трансфераза #135 конц.	Свободная жирная кислота	Холестерин	Сложный эфир холестерина

	мин.	единиц/г яичного желтка	%	%	%
7	контроль	0	0,25	2,88	0,34
3	60	0,025	0,25	2,68	0,56
4	150	0,025	0,29	1,85	1,72
5	240	0,025	0,53	1,42	3,54
6	1560	0,025	0,95	0,3	4,43

Из ГЖХ анализа свободной жирной кислоты, холестерина и сложного эфира холестерина можно рассчитать молярную концентрацию каждого компонента и рассчитать % трансферазной активности, как показано в табл. 7.

Расчёт % трансферазной активности.

Из результатов рассчитывают увеличение количества жирной кислоты, сложных эфиров стерола

Δ % сложного эфира стерола = % сложного эфира стерола/станола (фермент) - % сложного эфира стерола/станола (контроль).

- 74 018153

Трансферазную активность рассчитывают как % общей ферментативной активности % трансферазная активность^ (Δ % сложного эфира стерола/(Му сложного эфира стерола) х 100____________,

Δ % сложи, эфира стерола/(Му сложи, эфира стерола) + Δ % жирной кислоты/(Му жирной кислоты) где Μν сложного эфира стерола - средняя молекулярная масса сложных эфиров стерола, Μν жирной кислоты - средняя молекулярная масса жирных кислот.

Таблица 8

Трансферазная активность в яичном желтке А.ЬубгорЫ1а #135

№	Время реакции	Трансфераза #135 конц.	Свободная жирная кислота	Холестерин	Сложный эфир холестерина	Трансферазная активность
	мин.	Единиц/г яичного желтка	мМ	мМ	мМ	%
7	Контроль	0	8,9	74,5	5,3	-
3	60	0,05	8,9	69,3	8,7	100
4	150	0,05	10,4	47,8	26,5	93
5	240	0,05	18,9	36,7	54,6	77
6	1560	0,05	33,9	7,8	68,4	48

Как ТСХ, так и ГЖХ анализ подтверждают, что сначала трансферазная реакция А. ЬубгорЫ1а #135 является доминирующей реакцией. Через 150 мин времени реакции выявляется некоторая гидролитическая активность. Через 1560 мин трансферазная реакция и гидролитическая реакция достигают почти одинакового уровня. Результаты также показывают, что если акцепторная молекула холестерина доступна, трансферазная реакция является доминирующей реакцией. Когда концентрация холестерина снижается, гидролитическая активность становится более доминирующей.

Пример 10. Исследование для измерения трансферазной активности, используя яичный желток в качестве субстрата, ниже называется как Исследование яичного желтка.

Липидацилтрансферазу выделяют из Αе^οшοηа5 5а1тοп^с^ба и экспрессируют в ВасШи5 5иЬ1Ш5. Цель этой работы заключается в разработке аналитического способа, в котором можно измерять как трансферазную, так и гидролитическую активность ферментов, и из этих анализов можно определить как трансферазную, так и гидролитическую активность ферментов, используя субстрат, который содержит лецитин и холестерин.

В этой работе яичный желток используют в качестве субстрата для исследования фермента, потому что яичный желток содержит как лецитин, так и холестерин, и известно, что трансферазы и фосфолипазы работают очень хорошо в этом субстрате.

Недостаток использования яичного желтка заключается в том, что этот субстрат представляет собой комплексную смесь воды, липидов и белков. Липидные компоненты включают глицериды, 66,2%; фосфолипиды, 29,6% и холестерин, 4,2%. Фосфолипиды включают 73% лецитина, 15% кефалина и 12% других фосфолипидов. Из жирных кислот 33% являются насыщенными и 67% ненасыщенными, включая 42% олеиновой кислоты и 7% линолеиновой кислоты (ссылк. К1гк-О1Ьтег ЕпсусЬребха οί СЬетюа1 ΤесНиο1οду, .Ιο1ιιι АПеу & 8οιΐ5, 1пс.).

Можно ожидать некоторого отклонения в композиции яичного желтка. Однако в литературе (ВюсЫшюа е1 ВюрЬу51са Ас1а, 1124 (1992) 205-222) указано, что зрелый яичный желток домашней курицы обладает удивительно постоянной композицией липидов и липопротеинов, несмотря на значительные отклонения в диете и условиях окружающей среды, и далее заявляется: Как результат яичный желток продолжает обеспечивать пищевой продукт почти постоянной композиции, что служит для поддержания его химических и физико-химических свойств для надёжного использования в хлебопекарной, косметической и фармацевтической промышленности.

Эта ссылка показывает, что композиция яичного желтка является весьма постоянной, и поэтому было решено использовать яичный желток куриных яиц в качестве субстрата для исследования яичного желтка.

Количественный анализ продуктов липидной реакции после ферментативной обработки яичного желтка проводят экстракцией липидов из субстрата, что сопровождают ГЖХ анализом липидных компонентов.

Процедура.

Материалы.

Яичный желток: пастеризованный жидкий яичный желток из Иапаед Ргобис15 А/8, 1Ж-4000 Κο5к^1бе.

- 75 018153

ΗΕΡΕ8 буфер 81дта кат. № Н 3375.

Хлороформ, аналитическая чистота.

Ферменты.

Очищенная липидацилтрансфераза из Α. 8а1тοη^с^άа #178-9 Тйе^тοтусе8 ^^1^8^ липаза. ΘΚΙΝΏ ΑΜ УЬ ΕΧΕΕ 16, позиция № 147060 (контроль).

Ферментный анализ с яичным желтком в качестве субстрата.

г жидкого яичного желтка отмеряют в 20 мл стакане Уитона и нагревают до 35°С, 0,25 мл ферментного раствора добавляют и запускают секундомер. В равные интервалы 0,5 г образцы переносят в 10 мл стакан Дрэма. 20 мкл 4М НС1 добавляют для того, чтобы остановить ферментную реакцию и подкислить мыло жирной кислоты. 3 мл хлороформа добавляют и образец перемешивают на миксере ^Ыг1еу в течение 30 с. Образец центрифугируют при 3000х§ в течение 10 мин и 0,8 мл хлороформной фазы переносят в прокалённый стакан Дрэма. Хлороформ выпаривают при 60°С в потоке азота. Стакан Дрэма снова взвешивают. Выделенные жидкости анализируют с помощью ГЖХ и ТСХ.

ТСХ анализ - как описано в этой заявке.

ГЖХ анализ - как описано в этой заявке.

Результаты.

Для исследования яичного желтка, используя яичный желток в качестве субстрата, проводят эксперимент, показанный в табл. 9.

Таблица 9

		1	2	3
Яичный желток, жидкость.	г	5	5	5
Трансфераза# 178-9, 32 РШ1-7/мл*	мл			0,25
Т. 1апи%то:ш8 липаза, 200 ЫРи/мл	мл		0,25
Вода	мл	0,25

0,5 г образцы отбирают через 15, 30, 60 120 и 1080 мин и липиды выделяют экстракцией растворителя. Эти липиды анализируют с помощью ТСХ, используя растворитель Ι и Ιν соответственно. Изображение ТСХ пластины показано на фиг. 52.

ТСХ анализ ясно показывает активность трансферазы #178-9 из Α. 8а1тοшс^άа (образец 3). Это может быть видно из уменьшения в количестве фосфолипидов ΡС и РЕ.

Результаты также показывают, что количество лизолецитина ЕЕС не такое высокое, как ожидалось. Это могло бы показать гидролитическую активность в отношении лизолецитина или это могло бы также быть вызвано недостаточной экстракцией, потому что лизолецитин является очень полярным и поэтому мог бы быть частично распределён в водной фазе.

Липиды, выделенные экстракцией растворителя, также анализируют с помощью ГЖХ для того, чтобы определить количество свободной жирной кислоты, холестерина и сложного эфира холестерина. ГЖХ результаты показаны в табл. 10.

Таблица 10

ГЖХ анализ липида из обработанного ферментом яичного желтка Результаты представлены в % в пересчёте на содержание липидов

			15	30	60	120	1080
			Минуты	Минуты	Минуты	Минуты	Минуты
Свободные жирные кислоты	Контроль	1	0,328	0,304	0,332	0,333	0,369
	Т. 1апи%то8и8	2	0,391	0,376	0,459	0,627	22,909
	А. 8а1тотс1с1а #118-9	3	1,007	1,668	4,013	6,761	15,098

Холестерин	Контроль	1	3,075	2,968	3,103	3,056	3,099
	Т. 1апи§1пози8	2	3,130	3,032	3,045	3,026	3,225
	Α. ζαΐηιοηίοίίΐα #178-9	3	2,835	1,912	0,356	0,220	0,206

Сложный эфир холестерина	Контроль	1	0,416	0,397	0,422	0,408	0,437
	Т. 1апи&то$их	2	0,436	0,400	0,425	0,419	0,416
	А. ваЪпотсМа #178-9	3	1,414	2,988	6,107	6,694	5,760

Триглицерид	Контроль	1	76,153	73,505	75,565	79,344	77,382
	Т. 1апи£1по8и8	2	74,099	74,413	77,079	74,284	21,781
	А. 8а1тотс1с1а #178-9	3	73,781	73,342	77,857	82,040	72,117

Из результатов было замечено, что почти весь холестерин был эстерифицированным через 60 мин в образце 3. Можно заключить, что в течение первых 30 мин был излишек субстрата для реакции. Результаты образцов, взятых через 15 и 30 мин, поэтому используют для расчета активности ферментов.

Основываясь на информации в табл. 10 и том факте, что яичный желток содержит 27% липида, рас

- 76 018153 считывают количество микромоль жирной кислоты и сложного эфира холестерина, полученное на мл фермента, при этом результаты показаны в табл. 11. Результаты в табл. 11 получены с помощью следующих расчётов результатов из жирных кислот в образце № 3 (А. 8а1тοη^с^άа, 15 мин).

Липид в 5 г яичного желтка = 5-0,27=1,35 г.

1,35 г липида содержит 1,007% жирных кислот = 1,35-1,007/100=0,01359 г. Средняя молекулярная масса жирных кислот составляет 272.

0,01359 г = 0,01359-1000000/272 мкмоль = 49,9798 мкмоль.

0,25 мл фермента добавляют мкмоль жирной кислоты/мл фермента = 49,9798/0,25 = 199,9.

Таблица 11

Микромоль/мл фермента		0 мин.	15 мин.	30 мин.
Свободная жирная кислота	Контроль		65,01	60,37
	Т. Ιαηιΐβϊηοχα		77,61	74,71
	Трансфераза #178-9		199,86	331,06

Сложный эфир холестерина	Контроль		35,09	33,50
	Т. Ιαηιΐξίηοχα		36,77	33,73
	Трансфераза #178-9		119,29	252,15

Из результатов в табл. 11 можно рассчитать изменение в количестве жирной кислоты и сложного эфира холестерина, вызванное ферментом, по отношению к контролю, как показано в табл. 12.

Таблица 12

Δ Микромоль/мл фермента		0 мин.	15 мин.	30 мин.
Свободная жирная кислота	Т. 1апи§то5их	0	12,593	14,340
	Трансф. #178-9	0	134,843	270,691

Сложный эфир холестерина	Т. 1αηιΐ£ΐηοϊΐια	0	1,677	0,235
	Трансф. #178-9	0	84,196	218,652

Количество жирной кислоты или сложного эфира холестерина, получаемое как функция времени, показано на фиг. 53.

Из наклона кривой рассчитывают гидролитическую активность (образование ЕЕА) и липидацилтрансферазную активность (образование сложного эфира холестерина) как функцию времени. Относительную трансферазную активность (% ацилтрансферазной активности) и относительную гидролитическую активность затем рассчитывают, как показано в табл. 13. Относительную трансферазную активность определяют, используя протокол для определения % ацилтрансферазной активности, как описано в этой заявке выше. Например, расчёт относительной активности для #178-9: общая активность представляет собой ЕЕА активность + трансферазную активность = 9,023 + 7,2884 = 16,311 мкмоль/мин/мл. Отно сительная трансферазная активность = 7,2884-100/16,311=44,7. Относительная гидролитическая активность = 9,023 -100/16,311 =55,3.

- 77 018153

Таблица 13

Т. 1апи§този8	РРА активность	0,4780	мкмоль/мин./мл
А. 8а1тотси1а #178-9	РРА активность	9,0230	мкмоль/мин./мл

Т. 1апи§то8и8	Сложный эфир холестерина. Активность	0,0078	мкмоль/мин./мл
А. ςαΙηιοηΐΰάα #178-9	Сложный эфир холестерина. Активность	7,2884	мкмоль/мин./мл

Т. 1апи§този8	Относительная трансферазная активность	1,6
А. 8а1тотс1<ка #178-9		44,7

Т. 1апи§то$и$	Относительная гидролитическая активность	98,4
А. ха/тошсй/а #178-9		55,3

Результаты в табл. 13 подтверждают, что трансферазный фермент из Α. 8а1шошс1ба имеет значительную трансферазную активность, но эти результаты также подтверждают, что этот фермент имеет значительную гидролитическую активность.

Липаза из Т. ^идтозиз в основном имеет гидролитическую активность, и относительная трансферазная активность 1,6 не является доказательством какой-либо трансферазной активности, а объясняется неопределённостью анализа.

Заключение.

Яичный желток используют в качестве субстрата для измерения трансферазной и гидролазной активности липидацилтрансферазы из Αе^οшοηа8 8а1то1нск.1а и липазы из Тйегтотусек ктидтокик. В условиях исследования в начальной стадии существовала линейная зависимость между образованием сложного эфира холестерина и свободной жирной кислоты и временем для липидацилтрансферазного фермента. Основываясь на этом линейном отношении, можно было рассчитать гидролитическую активность (образование ΡΡΑ) и трансферазную активность (образование сложного эфира холестерина). Также рассчитывают относительную гидролитическую и трансферазную активность. Липидацилтрансфераза (в этом случае ССΑТ) из Αе^οшοηа8 8а1тотск.1а показала почти равную гидролитическую и трансферазную активность в этих условиях исследования.

Липаза из Тйегтотусек 1а1и1дп1о8И8 показала очень низкую гидролитическую активность и трансферазная активность была не значительной.

Пример 11. Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды.

Введение.

Липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением выделяют из Αе^οшοηа8 за1тошсМа и экспрессируют в БасШиз киЬййк. Начальные эксперименты показали, что этот фермент является очень эффективным в переносе жирной кислоты от лецитина к холестерину, используя яичный желток в качестве субстрата. В следующих экспериментах трансферазную реакцию изучают более детально, используя яичный желток в качестве субстрата, с особым вниманием к концентрации воды в субстрате.

Процедура.

Материалы.

Яичный желток: пастеризованный жидкий яичный желток из Баиаед Ргобис1з Α/8, БК-4000 Козкйбе.

ΗΕРΕ8 буфер 81дта кат. № Η 3375.

Хлороформ, аналитическая чистота.

Скволан, аналитическая чистота.

Ферменты:

#178-9 липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением из А. за^ошсМа, #2427 фосфолипаза А1 из Ρи8а^^иш охузрогит. ^IРΟРΑN® Ρ из Nονοζуше8, БК (сравнительный липолитический фермент), #1991 фосфолипаза А2 из поджелудочной железы, β^ΟΜΟΟ 221. из Б^οсаΐа1у8ΐ8, БК (сравнительный липолитический фермент).

Ферментное исследование с яичным желтком в качестве субстрата.

г жидкого яичного желтка отмеряют в 20 мл стакане Уитона и нагревают до 35°С. Добавляют воду и ферментный раствор и запускают секундомер. В равные интервалы 0,5 г образцы переносят в 10 мл стакан Дрэма. 20 мкл 4М 11С1 добавляют для того, чтобы остановить ферментную реакцию и подкислить мыло жирной кислоты. 3 мл хлороформа добавляют и образец перемешивают на миксере \\-'1нг1еу в тече

- 78 018153 ние 30 с. Образец центрифугируют при 3000хд в течение 10 мин и 0,8 мл хлороформной фазы переносят в прокалённый стакан Дрэма. Хлороформ выпаривают при 60°С в потоке азота. Стакан Дрэма снова взвешивают. Выделенные жидкости анализируют с помощью ГЖХ.

ГЖХ анализ.

Регкт Е1тег АнЮкукЮт 9000, капиллярный газовый хроматограф, оснащенный ν€ΟΤ кварцевой капиллярной колонкой 12,5 м х 0,25 мм ΙΌ х 0,1 мк толщина плёнки 5% фенилметилсиликона (СР Б11 8 СВ от СНготраск).

Газ-носитель: гелий.

Инжектор. РББХ холодный ввод пробы с делением потока (начальную температуру 50°С нагревают до 385°С), объём 1,0 мкл.

Детектор ΡΙΌ: 395°С.

Программа термостата: 123

Температура термостата, °С. 90 280350

Изотермическое время, мин. 1 010

Скорость изменения температуры, °С/мин. 154

Подготовка образца: 30 мг образца растворяют в 9 мл смеси гептан:пиридин, 2:1, содержащей внутренний стандарт - гептадекан, 0,5 мг/мл. 300 мкл раствора образца переносят в виалу с горлом под кримп, 300 мкл МБТРА (Ы-метил-Ы-триметилсилилтрифторацетамид) добавляют и оставляют реагировать в течение 20 мин при 60°С.

Расчёт: коэффициенты отклика для моно-ди-триглицеридов и свободной жирной кислоты определяют из стандарта 2 (моно-ди-триглицерид), для холестерина, холестерил пальмитата и холестерил стеарата коэффициенты отклика определяют из чистого стандартного материала (навеска для чистого материала 10 мг).

Результаты.

Яичный желток, содержащий 2% скволана, используют в качестве субстрата для реакции. Скволан добавляют в качестве внутреннего стандарта для ГЖХ анализа, для того чтобы количественно определить липидные компоненты в яичном желтке. Это эксперимент проводят, как показано в табл. 14.

___Таблица 14

		1	2	3	4	5	6	7	8
Субстрат, яичный желток с 2% скволана	г	5	5	5	5	5	5	2,5	2,5
Трансфераза # 178-9,14 ΡΠΙ-7/мл	мл		0,25			0,25		0,13
ίΤΡΟΡΑΝ® Р раствор, 200 РЬи-7/мл	мл			0,25					0,13
#1991 Фосфолипаза А2, 6300 РЬи/мл	мл				0,25		0,25

Вода	мл	0,25				3,8	3,8	8,75	8,75

Образцы отбирают через 30, 60 и 120 мин и анализируют в соответствии со способом, описанным выше (отбирают 0,5 мл (эксп. 1-4) 0,86 мл (эксп. 5-6) и 2,2 мл (эксп. 7-8) образцы).

Результаты ГЖХ анализа показаны в табл. 15. ГЖХ результаты выражают в процентах субстрата (яичный желток). Эта таблица также показывает время реакции и общее количество воды в реакционной смеси.

- 79 018153

Фермент	Время реакции	Вода %	ГЖХ	ГЖХ	ГЖХ
	минуты	в реакции	% жирной кислоты	% холестерина	% сложного эфира холестерина
Контроль	120	54	0,247	0,863	0,083
#178	30	54	0,422	0,669	0,445
# 178	60	54	0,515	0,549	0,672
# 178	120	54	0,711	0,364	1,029
#2427	30	54	2,366	0,848	0,090
#2427	60	54	3,175	0,837	0,088
#2427	120	54	3,926	0,833	0,082
#1991	30	54	1,606	0,911	0,083
#1991	60	54	1,701	0,838	0,080
#1991	120	54	1,781	0,763	0,053
# 178	30	73	0,377	0,764	0,495
# 178	60	73	0,488	0,665	0,719
# 178	120	73	0,626	0,426	0,931
#2427	30	73	2,471	0,853	0,092
#2427	60	73	3,284	0,858	0,087
#2427	120	73	4,176	0,837	0,081
# 178	30	89	0,344	0,720	0,308
#178	60	89	0,443	0,725	0,446
# 178	120	89	0,610	0,597	0,607
#2427	30	89	0,510	0,167	0,010
#2427	60	89	0,602	0,133	0,010
#2427	120	89	0,867	0,147	0,009

Таблица 15

Основываясь на анализах жирной кислоты, холестерина и сложного эфира холестерина, можно рассчитать количество свободной жирной кислоты и сложного эфира холестерина, полученное как функция времени реакции и содержания воды. Основываясь на этих результатах, дальше можно рассчитать общую ферментативную активность как сумму образования жирной кислоты и образования сложного эфира холестерина. Затем относительную гидролитическую активность и относительную трансферазную активность (т.е. % ацилтрансферазной активности) рассчитывают с результатами, показанными в табл. 16.

Результаты в табл. 16 также анализируют статистически, используя δΐаΐд^арЫс Ми111'1ас!ог АNОVА. Статистические результаты на фиг. 54 подтверждают, что фосфолипаза А1, #2427 и фосфолипаза А2, #1991 не имеет никакой трансферазной активности, в то время как трансфераза #178-9 показала почти 50% трансферазную активность при этих условиях исследования.

Влияние содержания воды в исследовании на трансферазную активность трансферазы #178 также анализируют статистически, как показано на фиг. 55. Эти результаты показывают, что в интервале от 54 до 89% воды в этом исследовании не было сильного влияния содержания воды на относительную трансферазную активность.

Оценивают влияние времени реакции на трансферазную активность для трансферазы #178, при этом результаты показаны в табл. 16 и на фиг. 56. Результаты на фиг. 56 показывают, что относительная трансферазная активность снижается как функция времени реакции. Это может быть объяснено тем фактом, что большинство акцепторных молекул холестерина исчерпывается и поэтому относительная гидролитическая активность возрастает. Отрицательные значения для трансферазной реакции для # 2427 не показывает никакой трансферазной активности в границах отклонения для аналитического метода.

Таблица 16

Фермент	Время реакции минуты	% Воды в реакционной смеси	Полученная Жирная кислота	Израсходованный Холестерин	Полученный сложный эфир холестерина	Г идролитическая активность %	Трансферазная активность %
# 178	30	54	0,175	0,194	0,362	53	47
# 178	60	54	0,268	0,314	0,589	52	48
# 178	120	54	0,464	0,499	0,946	53	47
#2427	30	54	2,119	0,015	0,007	100	0
#2427	120	54	2,928	0,026	0,005	100	0
#2427	60	54	3,679	0,030	-0,001	100	0
# 1991	30	54	1,359	-0,048	0,000	100	0
# 1991	60	54	1,454	0,025	-0,003	100	0
# 1991	120	54	1,534	0,100	-0,030	101	-1

- 80 018153

# 178	30	73	0,130	0,099	0,412	42	58
# 178	60	73	0,241	0,198	0,636	47	53
# 178	120	73	0,379	0,437	0,848	51	49
#2427	30	73	2,224	0,010	0,009	100	0
#2427	60	73	3,037	0,005	0,004	100	0
#2427	120	73	3,929	0,026	-0,002	100	0
# 178	30	89	0,097	0,143	0,225	50	50
# 178	60	89	0,196	0,138	0,363	56	44
# 178	120	89	0,363	0,266	0,524	62	38
#2427	30	89	0,263	0,696	-0,073	113	-13
#2427	60	89	0,355	0,730	-0,073	110	-10
#2427	120	89	0,620	0,716	-0,074	105	-5

Заключение.

Липидацилтрансферазу из Аеготопак ка1тотс1ба тестируют в яичном желтке в качестве субстрата и с различными уровнями содержания воды. Этот фермент сравнивают с контрольными липолитическими ферментами, а именно фосфолипазой А1 из Еикапиш охукрогит и фосфолипазой А2 из поджелудочной железы.

Результаты доказывают, что только трансфераза катализирует трансферазную реакцию между лецитином и холестерином в процессе образования сложного эфира холестерина. Результаты показали, что в интервале от 54 до 89% воды в субстрате относительная трансферазная активность является почти такой же для трансферазы из Аеготопак ка^ошаба.

Пример 12. Исследование трансферазы в забуференном субстрате для измерения ацилтрансферазной активности (например, для применения в продукте питания, используя лецитин и холестерин).

Липидацилтрансферазу выделяют из Аеготопак ка^ошаба и экспрессируют в ВасШик киЬ1111к. Этот фермент является очень эффективным в переносе жирной кислоты от лецитина к холестерину в процессе образования сложных эфиров холестерина. Также было показано, что фермент имеет некоторую гидролитическую активность, которая наблюдается как образование свободной жирной кислоты. Традиционные фосфолипазы (ЕС3.1.1.4 и ЕС3.1.1.32) обладают способностью гидролизовать лецитин в процессе образования свободных жирных кислот и лизолецитина, и для этих ферментов не было описано никаких трансферазных реакций.

В данной заявке авторы детально описывают исследование, в котором можно измерять как трансферазную, так и гидролитическую активность ферментов и, таким образом, идентифицировать липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, в данном исследовании используют субстрат, который содержит лецитин и холестерин. В этой работе используют субстрат на основе фосфатидилхолина и холестерина, диспергированный в буфере. Количественное оценивание продуктов реакции проводят путём экстракции липидов из субстрата, что сопровождают ГЖХ анализом липидных компонентов.

Процедура.

Материалы.

Ь-а-фосфатидилхолин 95% (растительный) АчапД по. 441601, холестерин: 81дта кат. С 8503, холестерил пальмитат, 81дта С 6072, холестерил стеарат, 81дта С 3549, НЕРЕ8 буфер 81дта кат. № Н 3375, хлороформ, аналитическая чистота.

Ферменты.

Очищенные 6САТ из А. ка1тошс1ба #178-9.

ТСХ анализ проводят, как описано в примере 6.

ГЖХ анализ проводят, как описано в примере 11.

Результаты.

Исследование трансферазы основывается на фосфатидилхолине и холестерине в качестве субстрата.

Далее трансферазную активность трансферазы тестируют в субстрате на основе фосфатидилхолина и холестерина в соответствии со следующей процедурой.

450 мг фосфатидилхолина (>95% РС АчапД позиция № 441601) и 50 мг холестерина растворяют в хлороформе и выпаривают досуха в вакууме. 300 мг смеси холестерина/фосфатидилхолина переносят в стакан Уитона и добавляют 15 мл 50 мМ НЕРЕ8 буфера рН 7. Липид диспергируют в буфере при интенсивном перемешивании. Этот субстрат нагревают до 35°С при перемешивании с помощью магнитной мешалки и добавляют 0,25 мл ферментного раствора. Он представляет собой среды с очень высоким содержанием воды, приблизительно 95% воды.

Образцы по 2 мл отбирают через 0, 5, 10, 15, 25, 40 и 60 мин времени реакции. Сразу добавляют 25 мкл 4М НС1 для подкисления свободной жирной кислоты и остановки ферментной реакции. Добавляют 3,00 мл хлороформа и образцы интенсивно встряхивают на аппарате νΊιίι%ν в течение 30 с. Образец центрифугируют и выделяют 2 мл хлороформной фазы и фильтруют через 0,45-мкм фильтры в 10 мл

- 81 018153 прокаленный стакан Дрэма. Хлороформ выпаривают в потоке азота при 60°С, и эти образцы снова измеряют. Экстрагированный липид анализируют с помощью ГЖХ.

Результаты из ГЖХ анализа показаны в табл. 17. Результаты выражают в % в пересчёте на экстрагированный липид. Количество образованной жирной кислоты и сложного эфира холестерина как функция времени проиллюстрировано на фиг. 57. Из фиг. 57 можно сделать заключение, что ферментная реакция как функция времени не является линейной, потому что сначала наблюдается сильная как гидролитическая, так и трансферазная активность. Через приблизительно 10 мин и до приблизительно 60 мин реакция показывает почти линейный отклик образования жирной кислоты и сложного эфира холестерина как функцию времени. Поэтому было решено посмотреть на ферментативную реакцию в этом временном интервале.

_____________________________________________Таблица 17

Минуты	0	5	10	15	25	40	60

Холестерин, %	10,064	8,943	8,577	8,656	8,102	7,856	7,809
Сложный эфир холестерина, %	0,000	1,571	2,030	2,058	2,282	2,659	3,081
РРА общий, %	0,260	1,197	1,239	1,466	2,445	2,943	3,940

Из знаний о количестве липида в реакционной смеси и количестве добавленного фермента можно рассчитать образование жирной кислоты и сложного эфира холестерина, которое выражают в мкмоль/мл фермента (табл. 18 и фиг. 58).

_____________________________ _____ _____ ___ Таблица 18

Минуты	10	15	25	40	60
	мкмоль/мл	мкмоль/мл	мкмоль/мл	мкмоль/мл	мкмоль/мл
РРА общий	58,1	68,7	114,6	138,0	184,7
Сложный эфир холестерина	88,8	90,0	99,3	115,6	133,8

Из результатов в табл. 18 и наклона кривых на фиг. 58 можно рассчитать количество жирной кислоты и сложного эфира холестерина как функцию времени, которое выражают в мкмоль/мин на 1 мл фермента.

Расчёт гидролитической активности и трансфертной активности показан в табл. 19. Относительную трансферазную активность определяют, используя протокол для определения % ацилтрансферазной активности, как описано в данной заявке выше.

Таблица19

Гидролитическая активность (жирная кислота)	2,52	мкмоль/мин. на мл фермента
Трансферазная активность (сложный эфир холестерина)	0,94	мкмоль/мин. на мл фермента
Общая активность	3,45	мкмоль/мин. на мл фермента

Относительная трансферазная активность	27,1	%
Относительная гидролитическая активность	72,9	%

Скрининг других ферментов на трансферазную активность.

Способ, описанный выше, используют для скрининга других липолитических ферментов на трансферазную и гидролитическую активность. Эти ферменты тестируют, как показано в табл. 20.

Таблица 20

Субстрат	мл	1 15	2 15	3 15	4 15	5 15
#178-9 Трансфераза Α. ζαΐιηοηίΰάα 32 РШ-7/мл	мл	0,25
5% # 3016, ΠΡΟΡΑΝ® Р (Е охузрогит)	мл		0,25
5%, Ткегтотусез 1апи^тозиз	мл			0,25
5% СапсНАа гиуоза # 2983	мл				0,25
5% СапсИАа суИпАгасеа # 3076	мл					0,25

Субстрат, содержащий 300 мг фосфатадилхолина/холестерина, диспергированный в 50 мМ НЕРЕ8 буфера рН 7,0, нагревают до 35°С при интенсивном перемешивании. Добавляют ферментный раствор и образец удерживают при 35°С при интенсивном перемешивании. Образцы отбирают с постоянным интервалом и экстрагируют хлороформом. Выделенные липиды анализируют с помощью ГЖХ, при этом результаты показаны в табл. 21.

- 82 018153

Ραηάιάα ги§оха (#2938)

Сложный холестерина

Тпегтотусеч шпи^тохих

Трансфераза 178-9

Минуты гичапит

Холестерин

Сложный холестерина

Холестерин

Сложный холестерина

Холестерин

Сложный холестерина (ΙΛΡΟΡΑΝ® Е)

Сапата

Таблица 21

Из ГЖХ анализа видно, что только липидацилтрансфераза (178-9) образует значительное количество сложного эфира холестерина и жирных кислот. Фосфолипаза из Ризапит охузрогит также обеспечивает устойчивое повышение в количестве свободной жирной кислоты, но получается только начальное малое количество образования сложного эфира холестерина, но не наблюдается никакого повышения в количестве сложного эфира холестерина как функции времени.

Основываясь на знании о количестве липидного субстрата и ГЖХ анализов, можно рассчитать относительную трансферазную активность и относительную гидролитическую активность, основываясь на результатах из 10-60-минутного времени реакции. Результаты из трансферазы 178-9 и Ризапит охузрогит липазы показаны в табл. 21. Другие тестируемые ферменты не показали никакой активности.

______ ______ Таблица 21

	Трансфераза 178-9	Еичагшт охучрогит
Гидролитическая активность, мкмоль/мин. на мл фермента	1,03	0,96
Трансферазная активность, мкмоль/мин. на мл фермента	0,40	0,01
Общая активность, мкмоль/мин. на мл фермента	1,43	0,98

Относительная гидролитическая активность	71,8	98,7
Относительная трансферазная активность	28,2	1,3

Результат, показанный в табл. 21, подтверждает значительную трансферазную активность от липидацилтрансферазы (образец 178-9). Также видно, что относительная трансферазная активность находится в согласии с экспериментом, описанным в табл. 19.

Однако наблюдается очень низкая трансферазная активность от Еизапиш охузрогит фосфолипазы. Этот трансферазный уровень является таким низким, что он попадает в область неопределённости анализа. Как ожидается, РизаВши охузрогит фосфолипаза имеет значительную гидролитическую активность.

Заключение.

Вместо яичного желтка (показанного в примере 11) используют искусственный субстрат на основе очищенного фосфатидилхолина и холестерина в качестве субстрата для измерения активности трансфе

- 83 018153 разы из Аеготонах ха1тотс1ба. Между 10 и 60 мин времени реакции это исследование обеспечивает почти линейное образование свободных жирных кислот и сложного эфира холестерина как функции времени. Основываясь на активности между 10 и 60 мин времени реакции, рассчитывают гидролитическую активность и трансфертную активность.

Концентрация субстратов в этом исследовании является относительно более низкой, чем в яичном желтке, и количество воды в этом исследовании является относительно более высоким.

Основываясь на результатах этого исследования липидацилтрансферазы (в этом случае ОСАТ) из Аеготонах ха1тотс1ба в искусственном субстрате фосфатидилхолина/холестерина в буфере, можно заключить, что этот фермент имеет очень хорошую трансферазную активность также в системе с очень высоким содержанием воды.

Исследования как на основе яичного желтка (см. пример 11), так и на основе фосфатидилхолина/холестерина в буфере (пример 12) могут быть использованы для измерения трансфертной и гидролитической активности ферментов. Яичный желток является предпочтительным с той точки зрения, что гидролитическая и трансферазная активность является линейной как функция времени, но фосфатидилхолин/холестерин в буфере показывает линейные данные только в определённых пределах времени.

Пример 13. Пищевые эмульсии.

Эффект модифицированного ферментом жидкого яичного желтка тестируют в рецепте стандартной пищевой эмульсии с 60% масла.

Стандартные методы и материалы являются такими, которые детально описаны в примерах выше.

Яичный желток обрабатывают с помощью липидацилтрансферазы из .Аеготонах ха1тотс1ба (# 138) или фосфолипазы, а именно коммерчески доступного фермента I проран Г® (Nονοζутех А/8, ^еηта^к) (#2938), как показано в табл. 22.

Таблица 22

Ферментная обработка яичного желтка

		1	2	3	4
Яичный желток, ЗапоГо продукт № 1123Р2	г	10	10	10	10
#138, ЮРШ/мл	мл	1	1
#2938, 200 РЬи/мл	мл			1
Вода	мл				1
Время реакции	Минуты	210	360	210	210

ТСХ анализ липидов яичного желтка из обработанного ферментом яичного желтка (табл. 9) показан на фиг. 59 и 60.

В этом эксперименте дозировку #2938 повышают на коэффициент 10, и это обеспечивает очень ясную активность на яичный желток. Количество свободной жирной кислоты возрастает значительно, и лецитин (РС) гидролизуют до лизолецитина (ЬРС). Трансфераза #138 обеспечивает явную трансферазную реакцию, потому что свободный холестерин превращают в сложный эфир холестерина и часть лецитина превращают в лизолецитин.

Другим интересным аспектом ферментной модификации является консистенция продукта. Образец, обработанный с помощью фосфолипазы # 2938, становится очень твёрдым, в то время как образцы, обработанные с помощью липидацилтрансферазы #138, сохраняют ту же самую жидкую консистенцию, что и контрольный образец (см. фиг. 61).

Эти модифицированные яичные желтки тестируют в рецепте пищевой эмульсии, показанном в табл. 23.

Таблица 23

Майонез с модифицированным ферментом яичным желтком

	0	1а	2а	За	4а
	%	%	%	%	%
Рапсовое масло	60	60	60	60	60
Яичный желток, ЗапоГо продукт №1123Р2	2,8
Модифицированный ферментом яичный желток № 1		2,8
Модифицированный ферментом яичный желток № 2			2,8
Модифицированный ферментом яичный желток № 3				2,8
Контрольный (необработанный) яичный желток № 4					2,8
Вода	39	36,2	36,2	36,2	36,2
Уксус, 10% уксусная кислота	1	1	1	1	1

Модифицированные яичные желтки 1 и 2 обрабатывают с помощью липидацилтрансферазы и модифицированный яичный желток 3 обрабатывают с помощью коммерчески доступной фосфолипазы.

- 84 018153

Пищевую эмульсию получают в виде эмульсии масла-в-воде в соответствии со следующей процедурой.

Яичный желток и воду измеряют в мензурке. Масло измеряют отдельно. Миксер Тиггах (20000 об./мин) погружают в водную фазу. Масло вливают в водную фазу при постоянной скорости в течение 2 мин. Перемешивание продолжают в течение ещё 1 мин. Затем добавляют уксус и перемешивают в течение 5 с.

Стабильность эмульсии тестируют в нагревательном шкафу при 100°С. Через 2 ч при 100°С эту эмульсию оценивают (см. фиг. 62).

Стабильность эмульсии необработанного яичного желтка является вполне хорошей в этом эксперименте. Однако обработка яичного желтка с помощью липидацилтрансферазы #138 улучшает стабильность, потому что количество отделившейся воды уменьшается. Яичный желток, обработанный с помощью фосфолипазы #2938, приводит к получению очень не стабильной эмульсии с почти полным разделением масляной и водной фазы при 100°С.

Считается, что в некоторых применениях использование композиции и способов данного изобретения может обеспечить увеличенную термическую стабильность эмульсий, таких как заправки к салату типа масло-в-воде и подобные. Это в особенности важно в пищевых эмульсиях, которые пастеризуют для обеспечения долгого срока хранения и/или нагревают перед подачей на стол, например, в ранее приготовленных блюдах для разогрева перед подачей на стол (например, еда для приготовления в микроволновой печи). Не желая связываться какой-либо определённой теорией, считают, что в некоторых применениях накопление свободной жирной кислоты может быть вредным для термической стабильности таких эмульсий. Следует признать, что увеличенная термическая стабильность пищевых эмульсий, полученных, используя способы данного изобретения, не может быть найдена, или даже желательна, во всех пищевых применениях. Квалифицированному в данной области специалисту будет ясно, в каких применениях такие характеристики являются желательными, и стабильность эмульсий может быть легко определена, используя простые тесты с нагреванием, эквивалентные, например, пастеризации и/или разогреву в микроволновой печи. Изобретатели выявили, что в предпочтительном варианте воплощения пищевые эмульсии, полученные, используя способы данного изобретения, имеют повышенную термическую стабильность.

Пример 14. Трансферазная реакция в обогащенном растительным стеролом яичном желтке.

Трансфераза из Аеготопак ка1тотс1ба способна катализировать образование лизолецитина, моноглицерида и растительных сложных эфиров стерола в яичном желтке, обогащенном растительным стеролом и глицерином. Тот же фермент также тестируют в системе с низким содержанием воды, которая содержит пальмовое масло, лецитин, растительный стерол и глицерин. С помощью ТСХ и ГЖХ анализов было найдено, что моноглицерид и растительные сложные эфиры стерола получают при этих условиях реакции.

Введение.

Трансферазу из Аеготопак ка1тотс1ба тестируют на трансферазную активность в почти безводной системе лецитина, жира, растительного стерола и глицерина.

Материалы.

Яичный желток: пастеризованный жидкий яичный желток от Оапаед Ргобис1к А/8, 1Ж-4000 Коккйбе.

ССАТ трансферазная очистка 178-9, 32 РЬи-7/мл (1оита1 2254-100).

Соевый лецитин. Уо1кт от Аагйик ипйеб, Оептагк.

Пальмовое масло 43 от Аагйик ипйеб, Оептагк.

Ь-α фосфатидилхолин 95% растительный (Ауап11 #441601).

Ситостерол, 81дта № 85753.

Растительный стерол: Оепега1 N122 от Содшк, Оегшапу.

Глицерин (позиция №085915).

Результаты.

Начальный скрининг трансферазной активности на растительном стероле и глицерине проводят в яичном желтке, как показано в табл. 24.

Таблица 24

		1	2	3	4
Яичный желток	г	1	1	1	1
Глицерин	г	0,1	о,1
Ситостерол: масла 3:7	г			0,13	0,13
Трансфераза #178-9	единицы	1		1
Вода			*		*

*Вода, соответствующая количеству воды в ферментном растворе = 83 мкл

Ингредиенты смешивают и нагревают до 37°С и поддерживают при этой температуре при перемешивании с помощью магнитной мешалки.

- 85 018153

0,1-граммовые образцы отбирают через 3 и 23 ч и анализируют с помощью ТСХ. Результаты ТСХ анализа показаны на фиг. 63.

Результат на фиг. 63 показал, что как холестерин, так и растительные стеролы эстерифицируются с помощью трансферазной реакции, параллельно с образованием лизолецитина (образец 3 и 4), потому что почти весь свободный стерол и холестерин превращаются в соответствующий сложный эфир в образце 3.

Результаты также показывают, что образец только с глицерином и яичным желтком приводит к получению моноглицерида. Количество моноглицерида необходимо подтверждать с помощью ГЖХ анализа. Когда стерол добавляют вместе с глицерином (образец 3), количество моноглицерида является очень низким и не определяется с помощью ТСХ. Это показывает, что поскольку существует избыток стерола или холестерина, трансфертная реакция, используя глицерин, является ограниченной.

В другом эксперименте трансферазный фермент 178-9 добавляют к смеси соевого лецитина, глицерина и растительного стерола для того, чтобы изучить каталитическую активность этого фермента в этой реакционной смеси.

Композиция реакционных смесей в этих экспериментах показана в табл. 25.

Таблица 25

		1	2	3	4	5	6
Соевый лецитин	г	1,875	2,25	1,875	2,5	3,5	3,5
Растительный стерол; Сгепего1 N 122	г	0,225	0,225	0	0	0,225	0,5
Пальмовое масло 43	г	2,675	2,25	2,8	2,125	1,062	0,831
Глицерин	г	0,225	0,275	0,325	0,375	0,248	0,238

Трансфераза #178 -9, 32 РЬи/мл	мл	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2

Этот эксперимент проводят путём смешивания липидных компонентов при перемешивании при 46°С. Добавляют фермент и образцы отбирают через 4 и 24 ч.

Эти образцы анализируют с помощью ТСХ, как показано на фиг. 64.

Образец из эксперимента 2, 4 и 5 через 24 ч времени реакции также анализируют с помощью ГЖХ, при этом результаты показаны в табл. 26.

Таблица 26

Глицерин

Жирные кислоты

Моно

Стерол

Сложный эфир стерола

	2	4	5
%	3,16	5,71	4,17
%	4,23	5,36	6,67
%	2,24	3,87	3,92
%	2,13		2,62
%	2,89		2,14

Результаты подтверждают, что трансфераза 178-9 способна катализировать образование сложных эфиров растительного стерола и моноглицерида из реакционной смеси, содержащей соевый лецитин, глицерин и растительный стерол. Такая реакционная смесь может быть интересна для использования в получении маргарина, где моноглицерид необходим из-за его эмульгирующих свойств и сложные эфиры растительного стерола из-за их уменьшающего количество холестерина эффекта.

Заключение.

ССАТ трансфераза из Аеготопаз 8а1тотс1йа способна катализировать образование сложных эфиров растительного стерола и моноглицерида в яичном желтке, в который добавляют растительный стерол и глицерин. Тот же самый фермент также катализирует образование сложных эфиров растительного стерола и моноглицерида в смеси пальмового масла, лецитина, растительного стерола и глицерина. Поэтому этот фермент представляет интерес для использования в маргарине и других содержащих масло пищевых продуктах, в которых моноглицерид и лизолецитин необходимы для улучшенного эмульгирования и сложный эфир растительного стерола из-за их уменьшающих количество холестерина эффектов.

Пример 15. Иммобилизация липидацилтрансферазы из Аеготопаз 8а1тотс1йа и применение в синтезе сложных эфиров стерола.

Липидацилтрансферазу (в этом случае ССАТ) из А. 8а1тошс1йа иммобилизируют на Целите с помощью ацетонного осаждения. 10 мл ферментного раствора в 20 мМ ТЕА буфере рН 7 взбалтывают медленно с 0,1 г Целита 535 535 (от Г1ика) в течение 2 ч при комнатной температуре.

мл холодного ацетона добавляют при постоянном взбалтывании. Осадок выделяют с помощью центрифугирования 5000 д в течение 1 мин. Осадок промывают 2 раза с 20 мл холодного ацетона. Целит испытывают при комнатной температуре в течение приблизительно 1 ч.

Иммобилизованную трансферазу тестируют в масляной смеси, содержащей 13% фосфатидилхолина и 7% растительного стерола (табл. 27).

- 86 018153

	%
АуапП лецитин	12,0
Растительный стерол, Сепего1122Ν	6,6
Пальмовое масло 43	71,4
Глицерин	5,0
Иммобилизованная Трансфераза #178, 45 ед./г	2,0
Вода	3,0

Таблица 27

Лецитин, растительный стерол и соевое масло нагревают до 46°С и растительный стерол растворяют. Добавляют иммобилизованную трансферазу. Трансферазная реакция продолжается при 46°С при осторожном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Образцы отбирают для анализов через 1/2, 1, 3, 6 и 24 ч и анализируют с помощью ТСХ. Реакцию останавливают через 24 ч времени реакции и иммобилизованный фермент отфильтровывают.

Эти образцы анализируют с помощью ТСХ, как показано на фиг. 65.

ТСХ анализ ясно показывает эффект иммобилизованной трансферазы из А. ка1шошс1ба в трансформировании холестерина в сложный эфир холестерина. Также видно, что образуется небольшое количество моноглицерида. Также было показано, что фермент имеет высокую активность в средах с высоким содержанием воды (6-89% водных средах), поэтому применение трансферазы и других трансфераз для использования в данном изобретении также может быть использовано в применениях иммобилизованного фермента со значительным содержанием воды. Это позволяет замещать используемые растворители на современные иммобилизованные липазы в биопревращении липидов, используя трансферазы.

Пример 16. Аеготопак ПубгорНШа трансфераза может переносить от фосфолипида к стеролу с образованием сложного эфира стерола и/или молекулы сахара с образованием сложного эфира сахара.

Липидацилтрансферазу из Аеготопак НубгорНПа экспрессируют в Е. сой (11ус1го 0303 КУР), помеченную #139, очищают на хелатирующей сефарозе ТТ, ΗΚ 2,5/10 колонка и анализируют на фосфолипазную активность. Эту трансферазную активность оценивают в яичном желтке на ферментную активность и функциональность в яичном желтке. Этот фермент также тестируют в яичном желтке, содержащем глюкозу.

Фосфолипазная активность.

Трансферазу #139, выделенную из хелатирующей сефарозы РР, ΗΚ 2,5/10 колонка, анализируют с помощью \ЕРА-Р1Т) (рН 7). Активность составляет 1,15 единиц ХЕРА-РЬи/мл.

Яичный желток.

В начальном тесте применения трансферазу #139 тестируют в яичном желтке в соответствии со следующей процедурой.

г свежего яичного желтка отмеряют в 10 мл колбе с навинчивающейся крышкой. Добавляют ферментный препарат и перемешивают на миксере Уог1ех. Этот образец доводят до 37°С и перемешивают с помощью магнитной мешалки. Реакцию останавливают добавлением 7,5 мл смеси хлороформ:метанол (2:1) и перемешивают на миксере УЫг1еу в течение 30 с. Хлороформную фазу отделяют с помощью центрифугирования и 2 мкл хлороформной фазы наносят на предварительно активированную кремнеземную ТСХ пластину и элюируют с помощью подвижного буфера № Г и другую ТСХ пластину с помощью подвижного буфера № ГУ.

Параметры эксперимента показаны в табл. 28.

Таблица 28

Тест	Время реакции	Яичный желток	Трансфераза #139
№	мин.	г	единицы
1	10	1
2	10	1	0,75 ΝΕΡΑ-ΡΕΕΓ
3	60	1	0,75 ΝΕΡΑ-РЬи
4	300	1	0,75 ΝΕΡΑ-РЬи
5	1200	1
6	1200	1	0,75 ΝΕΡΑ-РЬи

ТСХ анализ показан на фиг. 66 и 67. ТСХ анализ ясно демонстрирует трансфертную реакцию трансферазы #139. Холестерин превращают в сложный эфир холестерина и количество лецитина снижается. Однако результаты также показывают, что лизолецитин накапливается только в очень маленьком количестве, потому что трансфераза #139 также является активной по отношению к лизоле цитину. Это наблюдение подтверждается образованием свободных жирных кислот (РРА).

Яичный желток и глюкоза.

Ранее было показано, что трансфераза из Аеготопак ка^отсхба (#138) может использовать глюкозу в качестве акцепторной молекулы в трансферазной реакции. Также было протестировано, может ли трансфераза #139 использовать глюкозу в качестве акцепторной молекулы. Параметры эксперимента показаны в табл. 29.

- 87 018153

Таблица 29

Тест	Время реакции	Яичный желток	Блюкоза, 70%	Трансфераза #139
№	Минут	г	мг	единицы
1	10	1	500
2	10	1	500	1 ΝΕΡΑ-ΡΕυ
3	60	1	500	1 ΝΕΡΑ-ΡΕυ
4	180	1	500	1 ΝΕΡΑ-ΡΕυ
5	300	1	500	1 ΝΕΡΑ-ΡΕυ
6	1200	1	500	1 ΝΕΡΑ-ΡΕυ
7	1200	1	500

Продукты реакции анализируют с помощью ТСХ (фиг. 68 и 69).

ТСХ анализ показывает образование сложного эфира глюкозы через 220 мин времени реакции (фиг. 69 полоска 6), но через 1200 мин времени реакции не наблюдается сложного эфира глюкозы.

Поэтому необходимо заключить, что трансфераза #139 имеет как трансферазную, так и гидролитическую активность. Это также подтверждается тем фактом, что количество свободных жирных кислот постоянно возрастает как функция времени реакции.

Итоги.

Трансферазу из Ае^οтοηаз ЬуйгорЫ1а тестируют в яичном желтке. Результаты подтверждают, что этот фермент катализирует образование сложного эфира холестерина параллельно с образованием лизолецитина. После продлённого времени реакции, когда большинство холестерина исчерпалось, свободная жирная кислота также образуется. Поэтому можно заключить, что фермент имеет первичную трансфертную активность, но также гидролитическая активность наблюдается, когда только вода доступна как донорная молекула.

В эксперименте с яичным желтком и глюкозой видно, что трансфераза из Ае^οтοηаз йуй^οрЬ^1а способна катализировать образование сложного эфира глюкозы т зйи в пищевой среде с высоким содержанием воды (фиг. 70).

Пример 17. Варианты липидацилтрансферазы из Ае^οтοηаз 1уйгорЫ1а (А1уй2) (8ΕΡ ΙΟ Νο. 36 (см. фиг. 71)).

Мутации вводят, используя ОшкСНапде® набор мультисайтного направленного мутагенеза из 81га1адепе, Ба 3ο11η, СА 92037, и8А, следуя инструкциям, обеспеченным 81га1адепе.

Варианты при Туг256 показывают повышенную активность по отношению к фосфолипидам.

Варианты при Туг256 и Туг260 показывают повышенную активность по отношению к галактолипидам.

Варианты при Туг265 показывают повышенную трансферазную активность с галактолипидами в качестве донора ацила.

Номера показывают положения на следующей последовательности: фермент из .ΛΌΐΌΐιιοιίίΐκ йуйгорЫ1а, аминокислотная последовательность которого показана как 8ΕΟ ΙΟ Νο. 36 на фиг. 71 (подчёркнуты аминокислоты показывают ксиланазный сигнальный пептид). Нуклеотидная последовательность представляет собой ту, которая показана как 8Ε() ΙΌ Νο. 54 на фиг. 72.

Пример 18. Применение ацилтрансферазной реакции для получения растительного сложного эфира стерола и моноглицерида для производства маргарина.

Ацилтрансферазу из Ае^οтοηаз за1тοη^с^йа, экспрессированную в ВасШиз зиЫШз, тестируют в смеси пальмового масла, содержащей растительный лецитин, растительный стерол и глицерин. Ацилтрансфераза показала способность использовать как растительный стерол, так и глицерин в качестве акцепторных молекул при получении растительного сложного эфира стерола и моноглицерида. Реакционную смесь используют для производства столового маргарина хорошего качества на основе моноглицерида в реакционной смеси и в то же самое время маргарин обогащают растительным сложным эфиром стерола, который, как показано, обладает снижающим уровень холестерина эффектом.

Цель этой работы заключается в изучении возможности производить моноглицерид и растительный сложный эфир стерола с помощью ферментативной реакции лецитина, растительного стерола и глицерина, растворённого в растительном жире.

Начальные эксперименты показали, что можно использовать ацилтрансферазу из Ае^οтοηаз за1тοη^с^йа для получения моноглицерида и растительного сложного эфира стерола из лецитина, глицерина и растительного стерола.

В этом эксперименте такую реакционную смесь используют для получения столового маргарина. Материалы.

Липидацилтрансфераза из Ае^οтοηаз за1тοη^с^йа, # 196 С101, 18.6 РБи/г (Гейта! 2254-104).

Пальмовое масло 43 из Аагйиз ипйей, ОК.

Б-α фосфатидилхолин 95% растительный (Ауапй #441601).

Растительный стерол: Оепего1 Ν122 из (Мутз, Оегтапу.

Глицерин, позиция № 085915.

- 88 018153

Дистиллированный моноглицерид, В1тобап НР из Оатксо.

Производство маргарина.

1. Смешайте ингредиенты водной фазы (если необходимо, пастеризуйте водную фазу нагреванием до приблизит. 80°С). Доведите до рН 5,5.

2. Растопите жировую фазу и поддерживайте при приблизительно 40-45°С.

3. Нагрейте эмульгатор с некоторым количеством масла в соотношении 1 часть эмульгатора к 5 частям масла до температуры (75-80°С), которая на 5-10°С выше, чем температура плавления эмульгатора. Когда эта смесь полностью расплавится и хорошо перемешается, добавьте её к оставшемуся нагретому маслу, непрерывно перемешивая.

4. Добавьте ароматизатор.

5. Добавьте водную фазу к жировой фазе, непрерывно перемешивая.

6. Охладите в цилиндровом холодильнике (нормальная мощность, нормальное охлаждение) до температуры на выходе 8-10°С.

Результаты.

Ацилтрансферазу из А. ка1тошс1ба тестируют в смеси пальмового масла, как показано в табл. 30. Лецитин, растительный стерол, глицерин и пальмовое масло нагревают до 60°С при перемешивании для того, чтобы солюбилизировать растительный стерол и лецитин.

Таблица 30

Субстрат: %

Αναηΰ лецитин12

Растительный стерол, Оепего1 122Ν6,6

Пальмовое масло, температура плавления 4376,4

Глицерин5

Этот субстрат охлаждают до 48°С и ацилтрансферазу #196 добавляют в количестве, показанном в табл. 31. Реакционную смесь поддерживают при 48°С в течение 24 ч при медленном перемешивании.

Таблица 31 г

Субстрат 220

Трансфераза # 196 С101, 18,6 РШ/г 15

Образцы из реакционной смеси отбирают через 1, 4 и 24 ч времени реакции и анализируют с помощью ТСХ в растворителе I (фиг. 73). ТСХ результаты ясно показывают образование растительного сложного эфира стерола и моноглицерида. На фиг. 73 первая полоска - через 1 ч времени реакции, полоска 2 - через 4 ч времени реакции, полоска 3 - через 24 ч времени реакции и полоска 4 представляет собой растительный стерол.

Реакцию останавливают через 24 ч времени реакции и остатки нерастворённого растительного стерола удаляют и чистый раствор используют для получения маргарина.

Маргарин.

Реакционную смесь, содержащую моноглицерид и растительный сложный эфир стерола, используют для получения столового маргарина в соответствии с рецептом, показанным в табл. 32.

Таблица 32

1оиг. Νο 3734	1	2
Водная фаза
Водная фаза	16	16
Соль	0,5	0,5
Порошок снятого молока	1	1
Сорбат калия	0,1	0,1
ΕΌΤΑ	0,015	0,015
рН	5,5	5,5

Общая водная фаза	16,6	16,6

Жировая фаза
Пальмовое масло 43	25	25
Рапсовое масло	75	75

Общая жировая фаза	83,2	78,4

Эгтобап НР	0,2
Реакционная смесь		5

- 89 018153

Маргарин, полученный из этой реакционной смеси, считается хорошего качества с неплохой способностью к растеканию и хорошими вкусовыми ощущениями и без какого-либо постороннего запаха. Этот маргарин сравним на качественном уровне со стандартным маргарином, полученным путём использования дистиллированного моноглицерида Эттойап НР.

Наблюдаемая одна-единственная разница заключается в том, что маргарин ίοιίΓ. 3734 № 2 с этой реакционной смесью является слегка более твёрдым, что объясняется тем фактом, что этот рецепт содержит больше пальмового масла 43, чем стандартный маргарин.

Пример 19. Применение липидацилтрансферазы при производстве хлеба.

Одно из ограничений использования липаз в производстве хлеба заключается в том, что свободная жирная кислота образуется в процессе липазной реакции. Хорошо известно, что образование слишком большого количества свободной жирной кислоты будет иметь негативный эффект на хлебопекарные качества муки, так как глютен становится слишком жёстким и образуется обладающее повышенной упругостью (т.е. менее эластичное) тесто, которое не может увеличиваться в объёме в процессе ферментации и выпекания.

Образования свободной жирной кислоты также следует избегать с точки зрения устойчивости к окислению, потому что свободные жирные кислоты являются более подверженными липидному окислению, чем соответствующий триглицерид.

В настоящем изобретении проблемы с образованием свободной жирной кислоты при добавлении липолитического фермента к тесту преодолеваются использованием липидацилтрансферазы, которая вместо производства свободных жирных кислот переносит одну или больше жирных кислот от липидного ацильного донора к неводной акцепторной молекуле, присутствующей в тесте, такой как углевод, белок или пептид, или если используется в хлебе с молочным жиром, стерол, альтернативно или в комбинации с другими акцепторами, представленными выше, может быть добавлен к тесту, например фитостеролы или фитостанолы. Предпочтительно акцепторная молекула в тесте может представлять собой одну или больше из таких, как глюкоза, сахароза или мальтоза и/или другие углеводы, как правило, доступные в тесте.

В следующих экспериментах ацилтрансферазу тестируют в хлебопекарных экспериментах в минимальном масштабе. Образованные продукты реакции и липидные компоненты в полностью испытанном тесте экстрагируют с помощью насыщенного водой бутанола и анализируют с помощью ВЭЖХ и ГЖХ анализа.

Материалы и способы.

Ферменты:

ацилтрансфераза, 550 РЬИ-7/мл,

Β^ορη!·!'™ Е ВС, коммерческая липаза от Νονοζνιικδ. 12000 ЫРЬ/г или Сгшйату1 Εxе1 16. 12000 ЫРИ/г, лецитиновый порошок, 95% фосфолипид (доступный из □πιτί^ο А/8 Оепшагк), дигалактозилдиглицерид из цельной пшеничной муки (от 81дта Ό4651), мука: 8ο1νте1 № 2001084 (датская пшеничная мука, полученная из НаупенюНете, Ойепхе, Эептагк).

Пробная минивыпечка.

г муки, 10 г сухих дрожжей, 0,8 г глюкозы, 0,8 г соли, 70 ррт аскорбиновой кислоты (где ррт частей на миллион) и воду до 400 единиц Брабендера замешивают в 50 г чашке для перемешивания Брабендера в течение 5 мин при 30°С. Время выстаивания составляет 10 мин при 34°С. Тесто разделяют по 15 г на куски теста. Затем формуют на специальном приборе, где тесто прокручивают между деревянной тарелкой и рамкой из оргстекла. Куски теста накрывают в формах для выпечки на 45 мин при 34°С и выпекают в домашнем духовом шкафу νοδδ 8 мин при 225°С. После выпекания хлебцы охлаждают до комнатной температуры и через 20 мин хлебцы измеряют и объём определяют рапсовым методом замещения. Эти хлебцы также режут и оценивают мякиш и корочку.

Результаты и заключение.

Предварительные результаты показывают, что липидацилтрансфераза явно демонстрирует позитивный эффект как на объём хлеба, так и на внешний вид хлеба. В частности, предварительные результаты показывают, что применение липидацилтрансферазы приводит к повышенному специфическому объёму хлеба в сравнении с объёмом, который получают с контролем (без фермента) и который получают с применением коммерчески доступного липолитического фермента, а именно Сгшйату1 Εxе1 16 или ^^ρορаη Е™.

Пример 20. Стандартное мороженое с молочным жиром.

Функция эмульгаторов, используемых в мороженом, заключается в осуществлении контролируемой жировой кристаллизации и мягкой дестабилизации из-за десорбции белка в процессе созревания мороженого. Это изменение улучшает качество мороженого. Монодиглицериды, как правило, используют для производства мороженого, но также, как известно, используют полярные эмульгаторы, такие как сложные эфиры полисорбата и сахара в производстве мороженого в комбинации с монодиглицеридом для

- 90 018153 улучшения контролируемой жировой дестабилизации и производства мороженого с очень хорошей сливочной и мягкой для принятия в пищу текстурой.

Эмульгаторы, используемые для мороженого, как правило, добавляют к смеси мороженого в виде порошка. Однако недавно было показано, что монодиглицерид может быть получен с помощью ферментативной реакции жира в рецепте мороженого, используя липазы. Однако проблема использования липаз заключается также в том, что липазы также катализируют образование свободных жирных кислот, когда вода доступна в реакционной смеси.

Однако неожиданно было показано, что липидацилтрансфераза преодолевает ограничения с помощью липазы, потому что ацилтрансфераза способна переносить жирную кислоту от лецитина и других липидов к акцепторным молекулам, таким как стерол, холестерин, глюкоза, глицерин и белки/пептиды, без образования значительного количества свободных жирных кислот.

Одним из основных ингредиентов в мороженом являются молочные сливки, содержащие 38% молочного жира. Молочные сливки также содержат небольшое количество лецитина, который представляет собой донорную молекулу для ацилтрансферазы (''Сотр1ех тйк 11р1йк ассоип! £ог аЬои! 1% о£ 1Ье 1о1а1 тйк £а! апй аге тат1у сотрокей о£ рйокрйоНрЫк. Ке£ и11тапп'к Епсус1орей1а о£ !пйик1г1а1 Сйет1к1гу СорупдЫ© 2003 Ьу Шйеу-УСН Уег1а§ СтЬН & Со. КСаА). Молочные сливки также содержат небольшое количество холестерина, который представляет собой акцепторную молекулу для ацилтрансферазы.

Таким образом, из составляющих мороженого можно получить как моноглицерид, так и полярные эмульгаторы, такие как сложный эфир сахара и лизолецитина, которые известны благоприятными эффектами в производстве мороженого.

Дополнительным благоприятным эффектом от реакции ацилтрансферазы в молочных сливках является образование сложного эфира холестерина, который может замедлять абсорбцию холестерина в кишечнике.

Рецепт мороженого.	с эмульгатором	с ферментом
Молочные сливки, 38%	23,65	23,65
Снятое молоко	53,30	53,30
Порошок снятого молока	4,90	11,30
Сахар	12,00	12,00
Глюкозный сироп, ϋΕ 42, 75% Т8	4,25	4,25
Глицерин	1,0	1,0
Смесь стабилизаторов	0,2	0,2
Кремодан 8Е 30	0,6
Липид-ацил-трансфераза, 500 РЬи/г		0,1
Ароматизатор Гринстед 2976	0,1	0,1
Краситель	+	+

Процесс получения мороженого.

1. Нагрейте молочные сливки, глюкозный сироп и глицерин приблизительно до 40°С. Добавьте липидацилтрансферазу и оставьте эту смесь реагировать в течение 30 мин. Отберите образец для анализа.

2. Нагрейте все другие жидкие ингредиенты приблизительно до 40°С.

3. Добавьте другие сухие ингредиенты (смесь стабилизаторов смешивают с сахаром перед добавлением).

4. Когда сухие ингредиенты растворятся, добавьте смесь молочные сливки - глюкоза.

5. Пастеризуйте при 80-85°С/20-40 с.

6. Гомогенизируйте при 80°С (190 бар для рецепта 1 и 175 бар для рецепта 2).

7. Охладите до температуры созревания, 4°С.

8. Заморозьте в морозильном аппарате непрерывного действия до желаемой степени (100% рекомендовано).

9. Доведите до затвердения в туннельном аппарате при -40°С.

10. Храните при температуре ниже -25°С.

Результаты.

Использование ацилтрансферазы в производстве мороженого вносит свой вклад в получение мороженого с очень хорошим вкусом и прекрасными сливочными вкусовыми ощущениями, сравнимыми с мороженым, полученным, используя коммерческий эмульгатор Кремодан БЕ 30. Способ таяния мороженого, полученного с липидацилтрансферазой, является также улучшенным.

Пример 21. Ацилтрансфераза в сыре.

Сыр представляет собой свежий или созревший твёрдый или полутвёрдый продукт, полученный

- 91 018153 путём коагуляции молока, снятого молока, частично снятого молока, сливок, подсырных сливок, или пахты, или любой комбинации этих материалов с помощью действия сычуга или других подходящих коагулирующих агентов и, частично, стекания сыворотки, которая получается после такого коагулирования.

Выход сыра зависит в первую очередь от содержания жира и белка в молоке. Концентрации соли (в особенности солей кальция) и белка, а также кислотность являются очень важными для коагуляции (см. Штопкв Епсускребха οί 1пби51па1 СЕет15!гу СорулдЫ© 2003 Ьу А11еу-УСН Уег1ад СшЬН & Οο).

Такое усилие может быть сделано для того, чтобы оптимизировать и повысить выход сыра путём оптимизации процедуры получения сыра (И8Р 4959229) или путём использования улучшенного способа створаживания (И8Р 4581240), который повышает количество сывороточного белка в твороге.

В настоящем изобретении количество сывороточного белка в твороге повышают путём ферментативной модификации сывороточного белка с помощью обработки молока в процессе получения сыра с помощью липидацилтрансферазы.

Когда жирную кислоту ковалентно связывают с немембранным белком, таким как β-лактоглобулин, физические и функциональные свойства будут изменяться радикально.

Для производства сыра настоящего изобретения ацилтрансферазу добавляют к молоку предварительно или одновременно с добавлением к молоку сычуга.

В процессе осаждения казеина ацилтрансфераза может использовать лецитин и другие липиды в молоке в качестве донора и пептиды или белок в качестве акцепторной молекулы в процессе образования ацилированного белка или ацилированных пептидов.

Изменение в гидрофобных свойствах молочного белка вносит свой вклад в повышенное осаждение белка в твороге в процессе производства сыра.

Так как повышение в выходе сыра, полученного с помощью настоящего изобретения, происходит из-за повышенного удерживания в сырном коагуляте белков, которые, как правило, терялись в сыворотке, подходящий способ, непосредственно связанный с механизмом данного изобретения, основывается на определении количества белка, который оказывается в сыворотке. Меньшее количество белка в сыворотке непременно означает большее количество белка в твороге и более высокий выход сыра.

Тест на количество белка в сыворотке может быть проведён следующим способом. Снятое или цельное молоко нагревают до температуры, подходящей для коагуляции с сычугом, как правило, 30-35°С в 100-мл мерном стакане. Необязательно добавляют 1% объёмной закваски молочно-кислых бактерий и стандартный сычуг добавляют в количестве, которое соответствует, например, 0,03-0,05%. Когда молоко превращается в коагулят, достаточно твёрдый для того, чтобы его можно было разрезать на куски с длиной стороны приблизительно 0,5 см, такое разрезание проводят с помощью острого ножа. Таким образом, инициируют синерезис и через 30 мин периода удерживания, который позволяет творогу осесть, отбирают образец сыворотки и центрифугируют в лабораторной центрифуге в течение 10 мин. Этот образец анализируют на содержание белка, используя, например, метод Кьельдаля. Альтернативно и/или как добавление, образец может быть проанализирован с помощью способов, которые позволяют установить тип и количество отдельных компонентов белка.

Пример 22. Исследование в среде с низким содержанием воды.

Трансферазные реакции липолитических ферментов в среде с низким содержанием воды. Процедура.

Материалы.

Холестерин 81дта кат. С 8503,

Ь-а-фосфатидилхолин 95% (растительный) Ανаηί^ #441601, соевое масло, Ааг1ш5 иш!еб, ОК, хлороформ, аналитическая чистота.

Ферменты:

# 179, ССАТ из А. 8а1шοп^с^ба.

#2427, фосфолипаза А1 из Еи5апит οxу5рο^иш. ЫРОРАН® Е из Nονοζуше5, Оептагк, #1991, фосфолипаза А2 из поджелудочной железы, ЫРОМОЭ 22Ь из Вюса1а1у515, ИК, #2373, Сапб1ба Ап1агсйса липаза, Nονοζуше 525 Ь из Nονοζуше5 Оептагк.

Ферментное исследование.

13,1% лецитина и 6,6% холестерина растворяют в соевом масле путём нагревания до 60°С при перемешивании.

Субстрат отмеряют в 20 мл стакане Уитона и нагревают до 46°С.

Добавляют воду и ферментный раствор и запускают секундомер.

В равные интервалы 50 мг образцы переносят в 10 мл стакан Дрэма и замораживают.

Выделенные липиды анализируют с помощью ГЖХ.

ГЖХ анализ.

ГЖХ анализ проводят, как описано в примере 11

Результаты.

- 92 018153

Этот эксперимент проводят, как показано в табл. 33.

Субстрат на основе соевого масла, содержащего 13,1% лецитина и 6,6% холестерина, нагревают до 46°С. Ферментный раствор добавляют и запускают секундомер. Через 30, 60 и 120 мин времени реакции образцы отбирают для ГЖХ анализа.

Таблица 33

	1	2	3	4	5
Субстрат	г	5	5	5	5	5
Трансфераза# 179-С72, 56 РЬи-7/мл	мл		0,3
#2427, 200 РЬи-7/мл	мл			о,з
Поджелудочная железа РЬА 2 #1991
6300 рьи/мл	мл				0,3
Νονοζγηιε 525 Ь, #2373, 200 ЫРи/мл	мл					0,3
Вода	мл	0,3
% вода		6	6	6	6	6

Результаты ГЖХ анализа показаны в табл. 34. Результаты выражают в процентах по отношению к общей композиции образца. Основываясь на ГЖХ результатах, можно рассчитать количество жирной кислоты и сложного эфира холестерина, полученного с помощью ферментативной реакции, по отношению к контрольному образцу без добавления фермента. В этих экспериментальных условиях общая ферментативная активность оценивается как гидролитическая активность, измеренная как образование свободной жирной кислоты, и трансферазная активность, измеренная как образование сложного эфира холестерина. Из этих результатов и информации о молекулярной массе жирной кислоты и сложного эфира холестерина можно рассчитать относительную молярную гидролитическую активность и относительную молярную трансферазную активность, как показано в табл. 35.

Таблица 34

Фермент	Время реакции минуты	Жирная кислота %	Холестерин %	Сложный эфир холестерина %
Контроль	120	0,533	7,094	0,000
#179	30	0,770	5,761	2,229
#179	60	0,852	5,369	2,883
#179	120	0,876	4,900	3,667
#2427	30	3,269	7,094	0,000
#2427	60	3,420	7,094	0,000
#2427	120	3,710	7,094	0,000
#1991	30	2,871	7,094	0,000
#1991	60	3,578	7,094	0,000
#1991	120	3,928	7,094	0,000
#2373	30	1,418	7,094	0,000
#2373	60	1,421	7,094	0,000
#2373	120	1,915	7,094	0,000

- 93 018153

Таблица 35

Время Фермент реакции минут	Жирная кислота полученная	Холестерин используемый	Сложный эфир Гидролити-
холестерина полученный	ческая активность %	Трансферазная активность %
#179	30	0,238	1,334	2,229	20	80
#179	60	0,319	1,725	2,883	21	79
#179	120	0,343	2,195	3,667	18	82
#2427	30	2,737	0,000	0,000	100	0
#2427	60	2,887	0,000	0,000	100	0
#2427	120	3,177	0,000	0,000	100	0
#1991	30	2,338	0,000	0,000	100	0
#1991	60	3,046	0,000	0,000	100	0
#1991	120	3,395	0,000	0,000	100	0
#2373	30	0,885	0,000	0,000	100	0
#2373	60	0,888	0,000	0,000	100	0
#2373	120	1,383	0,000	0,000	100	0

Заключение.

В этих экспериментах видно, что все протестированные ферменты показали гидролитическую активность, потому что количество жирной кислоты возрастает. Однако ферментом, который показал трансферазную активность, является только ССАТ из А. за1тошс1йа. Поэтому можно сделать вывод, что в масляной системе с лецитином и холестерином, содержащей 6% воды, только фосфолипаза А1 из РизаГ1ит охузрогит, фосфолипаза А2 из поджелудочной железы и липаза из Сапй1йа ап!агсйса показала гидролитическую активность.

Пример 23. Обработка молочного жира.

Липидацилтрансферазу, полученную из Аеготопаз за1тотс1йа (8ЕР ГО Ко. 90, Ν80Ό уапап!), экспрессируют в ВасШиз НсНетГогт1з (в этой заявке ниже называется как КЬМ3) (см. ниже).

Липидацилтрансферазу тестируют в молочном жире с целью исследовать реакцию переноса, когда к молочному жиру добавляют 0,5% глицерина и 1% фосфолипида.

Продукты реакции анализируют с помощью ТСХ, и результаты ясно показывают образование моноглицерида, которые подтверждают, что липидацилтрансфераза использует глицерин в качестве акцепторной молекулы.

Экспериментальная часть

Ферменты.

Липидацилтрансферазу (ГАТ) экспрессируют в В. НсНетГогт1з: 2005876 (5500 ТРи/мл).

Ыротой 699Ь, фосфолипаза поджелудочной железы от Вюса!а1уз!з. 10000 ед./мл.

Молочный жир: безводный молочный жир А0019659 серия 0130547 от Сготап Ве1дшт.

Глицерин:

Лецитин: фосфатидилхолин 95% растительный (Ауапй #441601).

ВЭТСХ.

Аппликатор: ЬШОМАТ 5, САМАС аппликатор.

ВЭТСХ пластина: 10х 10 см (Мегск № 1.05633).

Пластину активируют перед применением путём высушивания в сушильном шкафу при 160°С в течение 20-30 мин.

Применение: 1,0 мкл 15,0% раствора прореагировавшего молочного жира, растворённого в смеси хлороформ:метанол (2:1), наносят на ВЭТСХ пластину, используя БШОМАТ 5 аппликатор.

Подвижный буфер 1: п-эфир:МТВЕ:уксусная кислота (60:40:1). Применение/время элюирования: 14 мин.

Подвижный буфер 5: п-эфир:МТВЕ:уксусная кислота (70:30:1). Применение/время элюирования: 12 мин.

Подвижный буфер 4: хлороформ:метанол:вода (75:25:4). Применение/время элюирования: 20 мин.

Проявляющая жидкость: 6% ацетат меди в 16% Н₃РО₄.

После элюирования пластину сушат в сушильном шкафу при 160°С в течение 5 мин, охлаждают и

- 94 018153 погружают в проявляющую жидкость и затем сушат ещё 5 мин при 160°С. Пластину оценивают визуально и сканируют (Сатад ТСХ сканер).

Результаты.

Образцы молочного жира, глицерина, лецитина и фермента отмеряют в 20-мл стакане Уитона, как показано в табл. 36.

Таблица 36

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Сгошап безводн. молочный жир,	10	10	10	10	10	9,9	9,9	9,9	9,9	9,9
Г Лецитин, г						0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
ЬАТ, 500 мг		20	100				20	100
Ырорто<1699Ь 1000 мг				20	100				20	100
Глицерин мг	50	30		30		50	30		30
Единиц/г	0	1	5	2	10	1	1	5	2	10

* ЬАТ 2005876 (5000 ТСРЦ/мл), растворенный в смеси глицерин:фермент 9:1 ** Ыротоб 699Ь (#3332), растворенный в смеси глицерин:фермент 9:1

Эти образцы помещают в нагревающий блок при 50°С в течение 4 ч и затем образец отбирают для анализа и растворяют в смеси хлороформ:метанол 2:1.

Эти образцы анализируют с помощью ТСХ в подвижном буфере 5, 1 и 4, как показано на фиг. 104.

ТСХ пластину, показанную на фиг. 105, сканируют с помощью Сатад денситометрического сканера, и основываясь на количестве моноглицерида в стандартном образце монодиглицерида, рассчитывают количество моноглицерида в молочном жире, как показано в табл. 37.

Таблица 37 Моноглицерид в образцах молочного жира, рассчитанный с помощью денситометрического измерения ТСХ пластины

Заключение.

ТСХ результаты после ферментативной обработки молочного жира, содержащего глицерин/фосфолипиды, с помощью липидацилтрансферазы подтверждают способность этого фермента превращать холестерин в сложный эфир холестерина и глицерин в моноглицерид, используя фосфолипид в качестве ацильного донора.

В проведённом эксперименте показано, что все фосфолипиды, как фосфатидилхолин (РС), так и лизофосфатидилхолин (ЬРС), могут быть полностью превращены в глицерофосфохолин.

Эти эксперименты также показывают, что фосфолипаза поджелудочной железы является менее активной в среде с низким содержанием воды и не имеет значительной ацилтрансферазной активности.

Модифицированный ферментом молочный жир (образцы 7 и 8 в табл. 37) добавляют к снятому молоку до конечной концентрации 3,6 мас.% жира с получением молока для использования в производстве сыра.

Пример 24. Обработка молочного жира и сливок.

Липидацилтрансферазу тестируют в молочном жире и сливках (38% жира) с целью исследовать реакцию переноса, когда к молочному жиру добавляют 0,5% глицерина и 1% фосфолипида.

Продукты реакции анализируют с помощью ТСХ и результаты, полученные из эксперимента с молочным жиром, ясно показывают образование моноглицерида и лизофосфосфолипида. Результаты, полученные из эксперимента со сливками, также подтверждают образование моноглицерида, хоть и на низком уровне, возможно из-за конкурентной гидролитической реакции, вызывающей образование сво

- 95 018153 бодных жирных кислот. В экспериментах со сливками наблюдается небольшое увеличение в количестве лизофосфолипидов, но это может быть объяснено слишком высокой дозировкой фермента.

Экспериментальная часть

Ферменты: липидацилтрансфераза (как в примере 23), молочный жир: безводный молочный жир А0019659 серия 0130547 от Сготап Ве1§шт, сливки: 38% жир от АКТА, ОК, глицерин, лецитин: фосфатидилхолин 95% растительный (Ауапй #441601),

ВЭТСХ, аппликатор: ЬШОМАТ 5, САМАО аппликатор, ВЭТСХ пластина: 10x10 см (Мегск № 1.05633).

Указанную пластину активируют перед применением с помощью сушки в сушильном шкафу при 160°С в течение 20-30 мин.

Применение. 1,0 мкл 15,0% раствора прореагировавшего молочного жира, растворённого в смеси хлороформ:метанол (2:1), наносят на ВЭТСХ пластину, используя ЬШОМАТ 5 аппликатор.

Подвижный буфер 4: хлороформ:метанол:вода (75:25:4). Применение/время элюирования: 20 мин. Проявляющая жидкость: 6% ацетат меди в 16% Н₃РО₄.

После элюирования пластину сушат в сушильном шкафу при 160°С в течение 5 мин, охлаждают и погружают в проявляющую жидкость и затем сушат ещё 5 мин при 160°С. Пластину оценивают визуально и сканируют (Сатад ТСХ сканер).

Результаты.

Образцы молочного жира, глицерина, лецитина и фермента отмеряют в 20 мл стакане Уитона, как показано в табл. 38.

Таблица 38

	1	2
Сготап, Безводный молочный жир А0019659 серия 0130547	г	10	10
Сливки, 38%	г
Лецитин, Ауапй	г	0,1	0,1
ЬАТ, 500 Т1Ри/мл*	мг		50
Глицерин	мг	50
Единиц/г	0	2,5

*1,АТ (5000 Т1Ри/мл), растворённый в смеси глицерин:фермент 9:1

Эти образцы помещают в нагревающий блок при 45°С и образец отбирают для анализа через 10, 30, 60 и 120 мин и растворяют в смеси хлороформ:метанол 2:1.

Эти образцы анализируют с помощью ТСХ в подвижном буфере 5, 1 и 4, как показано на фиг. 106, 107 и 108.

Заключение. Эксперимент с молочным жиром.

ТСХ результаты после ферментативной обработки молочного жира, содержащего глицерин/фосфолипиды, с помощью липидацилтрансферазы подтверждают способность этого фермента превращать холестерин в сложный эфир холестерина и глицерин в моноглицерид, используя фосфолипид в качестве донора ацила.

В проведённом эксперименте было показано, что фосфолипид (РС) превращают в лизофосфатидилхолин (ЬРС). При продолженном времени реакции лизофосфолипид (ЬРС) далее превращают в гликофосфохолин. Поэтому можно оптимизировать дозировку фермента и время реакции для того, чтобы определить оптимальный уровень получения моноглицерида и лизофосфолипида для любого определённого применения.

Модифицированный ферментом молочный жир добавляют к снятому молоку до конечной концентрации 3,6 мас.% жира для того, чтобы получить молоко для использования в производстве сыра. Начальные эксперименты показывают, что модифицированный ферментом молочный жир может быть более легко введён в снятое молоко по сравнению с не модифицированным молочным жиром.

Результаты, полученные со сливками.

- 96 018153

Образцы сливок, глицерина, лецитина и фермента отмеряют в 20 мл стакане Уитона, как показано в табл. 39.

Таблица 39

		3	4
Сготап, Безводный молочный жир А0019659 серия 0130547	г
Сливки, 38%	г	10	10
лецитин, Ауапй	г	0,1	0,1
ЬАТ, 500 Т1Ри/мл*	мг		50
Глицерин	мг	50

*ЬАТ (5000 ΤΙΡυ/мл), растворённый в смеси глицерин : фермент 9:1

Эти образцы анализируют с помощью ТСХ в подвижном буфере 5, 1 и 4, как показано на фиг. 109, 110 и 111.

Заключение. Эксперимент со сливками.

ТСХ результаты после обработки сливок, содержащих фосфолипид и глицерин, с помощью фермента липидацилтрансфераза ясно подтверждают реакцию переноса ацильных групп от фосфолипида (РС) к холестерину в процессе образования сложного эфира холестерина.

Также наблюдается трансферазная реакция ацильных груп к глицерину. Также существует заметная гидролитическая активность. Поэтому возможна дополнительная оптимизация для получения оптимального уровня моноглицерида с помощью модуляции дозировки фермента, дозировки глицерина и времени реакции.

Пример 25. Производство моцареллы.

Ферменты.

ЕЭ8 188: липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением (в данной заявке называется как КЬМ3), экспрессированная в В. ПсН1ш£огш1з: 2005876 (1460 ТГРИ/мл) (8ЕР Ш Ко. 90, К80Э вариант).

Лецитаза, фосфолипаза поджелудочной железы, 81дта Р0861, 10,000 единиц/мл.

День 1.

1. Молоко разделяют при 55°С на снятое молоко - плёнка (~ 0,075% мас./мас. жирности) и сливки (30% мас./мас. жирности). Плёнку (0,83% мас./мас. жирности) получают путём смешивания снятого молока - плёнки и сливок (см. фиг. 120).

2. 0,4 г СаС1₂ (50% мас./об.) на 1 кг сливок (30% жирность) добавляют и сливки разделяют на 3 равные части, а именно для контроля (ванна 1), лецитазы (ванна 2) и КЬМ3' (ванна 3).

3. К лецитазной ванне 2 добавляют 0,2% (мас./мас. жирности), эквивалентно 0,06% (мас./мас. 30% жирности сливок) или эквивалентно 0,6 г на 1 кг 30% жирности сливок.

4. КЬМ3' 25 ТГРИ/кг сливок добавляют в ванне 3.

5. В контрольную (ванну 1) не добавляют никакого ферментного раствора (или воды).

6. Сливки всех обработок (включ. контроль) инкубируют при 50°С в течение 30 мин.

7. Сразу после этого точную массу каждых сливок добавляют к точной массе холодного (10°С) снятого молока - плёнки (0,83% мас./мас.) для того, чтобы получить точную жирность (3,5% мас./мас.) в этих смесях, которые являются стандартизированным молоком.

8. Их пастеризуют при 72°С в течение 26 с.

9. Охлаждают до 5°С и удерживают в течение ночи.

День 2.

10. Молоко нагревают до 41°С и удерживают в течение 30 мин (это делают для того, чтобы обратить эффекты созревания при холодном хранении молока).

11. Это молоко охлаждают до 34,4°С.

12. Заквасочную культуру добавляют (СНоо/й Та 61 100ПСИ, СНоо/й БН100 50 1)СГ в □АК 011, [УАК 012, □АК 013; и СЬоогй Та 61 100 ОСГ, СЬоогй БН100 23.3 ОСГ в □АК 021, □АК 022, □АК 023). [УАК 021, 1У\\ 022 и 1У\\ 023 дозируют со сниженным количеством СНоо/й 1.11100 для отражения скоростей добавления Нейейсиз культуры, как правило, используемой в промышленном производстве моцареллы. Эти культуры добавляют непосредственно к молоку для сыроделия и оставляют на 45 мин при перемешивании.

13. Сычуг добавляют ((145 мл Мамуте 10 (140 1шси/мл), разбавленные до 1 л водой).

14. Сычуг перемешивают в течение 2 мин. Образец сычужного молока отбирают и помещают в

- 97 018153 реометр для измерения изменения в модуле упругости О' как функции времени.

15. Гель (творог) в этой ванне режут, когда твёрдость (С) достигнет 40 Па, что определяют на реометре с регулируемым напряжением сдвига.

16. Гель режут, используя натяжной зажим (скорость 2-15 с, выдержка 1 мин, скорость нарезания 115 с, выдержка 1 мин, скорость нарезания 1-10 с), и творожно-сывороточную смесь оставляют осаждаться неподвижно (отверждение). Эту стадию отверждения включают в промышленное производство сыра для минимизирования потерь жира в сыворотке.

17. Творожно-сывороточную смесь перемешивают (через 10 мин после начала периода нарезания) в течение 5 мин для того, чтобы получить творожно-сывороточную смесь в движении.

18. Эту творожно-сывороточную смесь нагревают до 41,1°С через 30 мин.

19. Перемешивание продолжают, пока рН творога (что измеряют в сыворотке, отжатой из творога) достигнет 5,9.

20. Эту творожно-сывороточную смесь фильтруют в финишную ванну и сыворотку удаляют самотёком.

21. В твороге прорезают желобки к стенкам ванны, что приводит к получению 2 творожных желобков.

22. Эти творожные желобки разрезают на плиты.

23. Творожные плиты переворачивают каждые 15-20 мин и держат в финишной ванне, пока рН (что измеряют введением зонда рН метра в образец творога) не достигнет 5,25.

24. Затем творог дробят на куски (~ 0,75 см / ~ 0,75 см / ~ 7 см длины).

25. Заливают холодной водой (17°С) на 15 мин.

26. Воду отфильтровывают в течение 10 мин.

27. Творог взвешивают и к нему добавляют соль на уровне 0,2% (мас./мас.) массы молока для сыроделия (0,9 кг к творогу из 450 кг молока). Творог оставляют абсорбировать введённую соль в течение 20 мин.

28. Творог помещают в месящий/вытягивающий блок для пластификации (с помощью измельчающего блока, встроенного в аппарат).

29. Творог месят/вытягивают, при этом нагревают до 63°С с помощью циркуляционной воды при 80°С.

30. Творог помещают в 7°С воду на 30 мин.

31. Затем творог помещают в 7°С солевой раствор (23% ХаС1) на 90 мин.

32. Творог вынимают из солевого раствора и оставляют стекать на 10 мин.

33. Солёный творог взвешивают.

34. Упаковывают в вакууме и оставляют при 4°С.

Результаты.

Таблица 40

Выход сыра и жирность сыворотки

Код	Масса молока кг	Масса творога в формах кг	Неформованный творог кг	Творог без солевого раствора кг	Общая масса солёного сыра кг	Выход сыра кг/100 кг молока	Жира в сыворотке %, масс./масс.
ϋΑΝΟΙΙ	454,1	26,62	18,36	26,78	45,25	9,96	0,48
ϋΑΝ012	454,6	26,62	21,66	26,69	48Л1	10,65	0,41*
ΏΑΝ013	454,2	26,6	23,56	26,83	50,59	11,14*	0,34*
ϋΑΝ021	454,4	26,55	18,63	26,7	45,44	10,00	0,51
ϋΑΝ022	454,1	26,5	20,69	26,69	47,53	10,47	0,41*
ϋΑΝ023	454,3	26,4	21,61	26,52	48,23	10,62*	0,35*

1).А\011 и 1).А\021 = контроль, □АХ 012 и 1ААХ022 = лецитаза, 1).АХ013 и 1).АХ023 = ЫЬМЭ [* означает статистически значимый в сравнении с контролем]

Пример 26. Пицца, полученная с модифицированным ферментом сыром.

Сыр, полученный в соответствии с примером 25, используют в приготовлении пиццы. Основа для пиццы.

500 мг сильной муки высшего сорта, мг свежих дрожжей, растворённых в 200-250 мл воды, содержащих 1 чайную ложку растворённого сахара, оставляют стоять при 20°С в течение 10 мин, яйцо,

1-2 столовые ложки оливкового масла для вкуса, соль по вкусу.

Описанные выше ингредиенты смешивают и далее замешивают вручную в течение 5 мин для полу

- 98 018153 чения теста. Это тесто оставляют, накрывают влажной тканью, чтобы оно подошло, по крайней мере, вдвое в объёме. Затем тесто раскатывают до приблизительно 5 мм - 1 см толщины в зависимости от желания.

Томатный соус готовят быстрым обжариванием мелко нарезанного лука и чеснока в сковороде с оливковым маслом, добавляя тёртые помидоры. Объём соуса уменьшают до желательной консистенции. После охлаждения этот соус добавляют к раскатанному тесту для пиццы.

Добавляют сыр, полученный в примере 25, также может быть добавлен верхний слой ингредиентов: овощи, мясо и морские продукты. Эту пиццу выпекают при 200°С на каменной подложке в духовке, оснащённой вентилятором.

Пицца, приготовленная с сыром, содержащим съедобное масло/жир данного изобретения, как видно, имеет заметно меньше поверхностного масла, и выпеченная основа для пиццы, кажется, является менее насыщенной маслом, в особенности по краям, и на поверхности соуса и верхнего слоя (см. фиг. 136). Это делает пиццу более удобной для обращения и аппетитной для еды.

Эта пицца имеет улучшенный внешний вид с менее заметным выделением масла.

Пример 27. Липидный анализ.

Сливки и сыр из производства моцареллы, как детально описано в примере 25, анализируют следующим образом.

Липидный анализ.

Сливки и сыр из производства сыра Моцарелла, как детально описано в примере 25, экстрагируют с помощью органических растворителей и выделенные липиды анализируют с помощью ВЭТСХ и ГЖХ. В эксперименте с сыром сливки, используемые для получения сыра, обрабатывают с помощью фосфолипазы поджелудочной железы (лецитазы) или липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением (КЬМ3). Также проводят контрольный эксперимент без какой-либо обработки ферментом. Все три эксперимента выполняют в двух повторах в течение двух дней.

Липидный анализ выделенных липидов из обработанных ферментом сливок, а также сыра, полученного из сливок, показал, что как лецитаза, так и КЬМ3 являются активными по отношению к фосфолипидам в этих продуктах, и основные фосфолипиды, фосфатидилхолин (РС) и фосфадидилэтаноламин (РЕ) почти полностью раскладываются.

В обработанном лецитазой образце разложение РС и РЕ сопровождается сопутствующим образованием свободных жирных кислот, в основном олеиновой кислоты и линолеиновой кислоты. В эксперименте с КЬМ3 образование свободных жирных кислот значительно ниже, чем разложение фосфолипидов, потому что этот фермент выполняет реакцию переноса жирных кислот от фосфолипидов к холестерину, что приводит к образованию сложных эфиров холестерина. В образцах сыра, обработанных с помощью КЬМ3, остаётся только 40% холестерина в сравнении с контролем и сырами, обработанными лецитазой. В сыре, обработанном с помощью КЬМ3, образуются небольшие количества насыщенных свободных жирных кислот из-за неспецифической активности по отношению к насыщенным жирным кислотам в кп-1 положении фосфолипидов.

Ферментную обработку проводят в 30% сливках, которые после ферментации добавляют к снятому молоку и доводят до 3,5% жирности для производства сыра.

В этом отчёте проводят анализы липидных компонентов в сливках, используемых для производства сыра, а также сыра.

Материалы и способы.

Ферменты:

ЕЭ8 188: липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением (в данной заявке ниже называется КЬМ3), экспрессированная в В. 11сЫш£огш1к: 2005876 (1460 ТРи/мл), (8ЕЦ ГО Νο. 90, Ν80Ό вариант).

ТСХ стандарты:

8Т16: 0,5% раствор фосфолипидов, содержащий 14,76% фосфатидилхолина (РС), 0,49% лизофосфатидилхолина (ЬРС), 10,13% фосфатидилинизитола (РЦ 12,74% фосфатидилэтаноламина (РЕ) и 5,13% фосфатидной кислоты (РА).

8Т17: 0,1% раствор холестерина, 0,1% стеарата холестерина и 0,1% олеиновой кислоты.

Ферментация сливок, используемых для производства сыра Моцарелла.

Проводят, как описано в примере 25.

ВЭТСХ.

Аппликатор: САМА6 аппликатор А8Т4.

ВЭТСХ пластина: 20х 10 см (Мегск № 1.05641).

Применение: 3,0 мкл экстрагированных липидов, растворённых в смеси хлороформ:метанол (2:1), наносят на ВЭТСХ пластину, используя А8Т4 аппликатор.

0,1, 0,3, 0,5, 0,8, 1,5 мкл стандартного раствора стандартных компонентов с известной концентраци

- 99 018153 ей также наносят на ВЭТСХ пластину.

Подвижный буфер 1: п-эфир:МТВЕ:уксусная кислота (50:50:1). Применение/время элюирования: 12 мин.

Подвижный буфер 6: метилацетат:хлороформ:метанол:изопропанол:0,25% КС1 раствор в воде. (25:25:25:10:9). Применение/время элюирования: 20 мин.

После элюирования пластину сушат в сушильном шкафу при 160°С в течение 10 мин, охлаждают и погружают в проявляющую жидкость и затем сушат ещё 5 мин при 160°С. Пластину оценивают визуально и сканируют (Сатад ТСХ сканер).

После высушивания ТСХ пятна оценивают количественно путём сканирования пластины в ТСХ Сканере 3 от Сатад. Исходя из плотности стандартного компонента, строят калибровочную кривую и используют для количественной оценки этих компонентов в образце.

ГЖХ анализ.

Регкт Е1тег АтПокуЛет 9000 капиллярный газовый хроматограф, оснащенный \\'С0Т кварцевой капиллярной колонкой 12,5 м х 0,25 мм 10 х 0,1 мк толщина плёнки 5%.

фенилметилсиликона (СР 811 8 СВ от Сйготраск).

Газ-носитель: гелий.

Инжектор. Р88I холодный ввод пробы с делением потока (начальную температуру 50°С нагревают до 385°С), объём 1,0 мкл.

Детектор РГО: 395°С.

Программа термостата (используемая с 30.10.2003):	1	2	3
Температура термостата, °С.	90	280	350
Изотермическое время, мин.	1	0	10
Скорость изменения температуры, °С/мин.	15	4

Подготовка образца: липиды, экстрагированные из образцов сыра или сливок, растворяют в 0,5 мл смеси гептан:пиридин, 2:1, содержащей внутренний стандарт - гептадекан, 0,5 мг/мл 300 мкл раствора образца переносят в виалу с горлом под кримп, 300 мкл М8ТРА (\-метил-\-триметилсилилтрифторацетамид) добавляют и оставляют реагировать в течение 20 мин при 60°С.

Расчёт: коэффициенты отклика для свободной жирной кислоты (РРА), холестерина, холестерил пальмитата и холестерил стеарата определяют из чистого стандартного материала.

Экстракция сливок.

Образцы сливок в пробирках Эппендорфа нагревают при 99°С в течение 10 мин для того, чтобы дезактивировать фермент, и охлаждают до комнатной температуры. 1 мл сливок переносят в 10 мл стакан Дрэма с закручивающейся крышкой. Добавляют 3 мл смеси хлороформ:метанол 2:1 и перемешивают на миксере \\'1нг1еу. Образец экстрагируют в течение 30 мин на Ко1ат1х. Образец центрифугируют в течение 10 мин при 1700 д. Нижнюю органическую фазу отделяют и используют для ТСХ и ГЖХ анализа.

Экстракция сыра.

0,5 г сыра отмеряют в 12-мл пробирку для центрифуги с закручивающейся крышкой. Добавляют 2 мл 99% этанола и образец гомогенизируют с помощью миксера Ш1га Тиггах М1хег в течение 30 с при 20000 об./мин. Этот миксер промывают с помощью 1,5 мл этанола. Добавляют 5 мл хлороформа и перемешивают на миксере \Ыг1еу. Этот образец экстрагируют в течение 30 мин на Ко1ат1х 25 об./мин. Образец центрифугируют в течение 10 мин при 1700 д. Нижнюю органическую фазу отделяют и используют для ТСХ и ГЖХ анализа.

Образцы.

Таблица 41 Образцы сливок, отобранные через 30 мин ферментации

Тест №	Фермент	Дозировка, рргп	День
ϋΑΝΟΙΙ	Контроль	0	1
ϋΑΝ012	Лецитаза	600	1
ϋΑΝ013	КЬМЗ	17,1	1
ϋΑΝ021	Контроль	0	2
ϋΑΝ022	Лецитаза	600	2
ϋΑΝ023	КЬМЗ	17,1	2

- 100 018153

Таблица 42 Маркировка образцов сыра Моцарелла

Тест №	Фермент	День
ϋΑΝΟΙΙ	Контроль	1
ΏΑΝ012	Лецитаза	1
ϋΑΝ013	КЬМЗ	1
ΏΑΝ021	Контроль	2
ΏΑΝ022	Лецитаза	2
ΟΑΝ023	КЬМЗ	2

Результаты.

Липидный анализ сливок.

Образцы сливок, используемых для производства сыра, экстрагируют с помощью смеси хлороформ:метанол в соответствии с процедурой, описанной в разделе Материалы и способы, и анализируют с помощью ВЭТСХ.

Результаты ТСХ анализа образцов сливок показаны на фиг. 121 и 122.

На фиг. 121 показана ТСХ (растворитель 6) липида, экстрагированного из сливок, и стандартной смеси (8Т16) фосфолипидов; фосфатидилхолина (РС); лизофосфатидилхолина (ЬРС); фосфатидилинизитола (РГ); фосфатидилэтаноламина (РЕ); 5,13% фосфатидной кислоты (РА) и спринголипида (8ртдйо11р1б) (8О).

На фиг. 122 показана ТСХ (растворитель 1) липида, экстрагированного из сливок, и стандартной смеси свободных жирных кислот (РРА), холестерина (С11Е) и сложного эфира холестерина (С11Есложный эфир).

Определяют плотность из ТСХ хроматограммы и, исходя из стандартной смеси фосфолипидов, рассчитывают количество РС и РЕ из ТСХ хроматограммы на фиг. 121, и исходя из стандартной смеси холестерина и жирных кислот, из ТСХ хроматограммы рассчитывают количество свободных жирных кислот и холестерина в образце. Результаты показаны в табл. 43.

Таблица 43 Анализ фосфатидилхолина (РС), фосфатидилэтаноламина (РЕ), холестерина (СМЕ) и свободных жирных кислот (РРА), исходя из ТСХ хроматограмм на фиг. 121 и 122

Фермент	День	ррт РС	ррт РЕ	ррт СНЬ	ррт РГА
Контроль	1	149	278	713	201
Лецитаза	1	23	17	638	396
КЬМЗ	1	11	24	328	274
Контроль	2	117	214	638	166
Лецитаза	2	39	29	629	345
КЬМЗ	2	15	28	311	201

Результаты в табл. 43 оценивают статистически с помощью АХОТА, используя программу 8(а(дгарЫс Р1ик для \\'пк1о\ук 3.1. Статистическая оценка для холестерина и свободной жирной кислоты проиллюстрирована графически на фиг. 123 и 124.

ТСХ анализ сливок, обработанных с помощью лецитазы и КЕХЕ3, показал сильный эффект фосфолипаз в сливках (фиг. 121) и видно, что два основных фосфолипидных компонента РС и РЕ являются почти полностью гидролизованными (табл. 43).

На фиг. 122 показано, что КЕХЕ3 обладает сильным действием на холестерин в сравнении с лецитазой. Также видно, что количество жирных кислот, полученных в примере, обработанном лецитазой, явно выше, чем у образцов, обработанных с помощью КЕХЕ3, и контроля.

Статистическая оценка количества жирных кислот (фиг. 124) показывает, что КЕХЕ3 приводит к получению небольшого, но не значительного количества свободных жирных кислот в сравнении с контролем. Однако количество жирных кислот в образце, обработанном лецитазой, значительно выше. Это объясняется тем фактом, что лецитаза гидролизует фосфолипиды, что приводит к образованию свободных жирных кислот. КЕМЕ3 также раскладывает фосфолипиды (табл. 43), но приводит к получению жирных кислот из фосфолипидов, которые должны переноситься к холестерину, таким образом приводя к образованию сложного эфира холестерина. Это также подтверждается тем фактом, что количество холестерина значительно ниже в образце, обработанном с помощью КЕХЕ3, в то время как контрольный образец и образец, обработанный лецитазой, находятся на одном и том же уровне (см. фиг. 123).

По молярному соотношению может быть рассчитано, что количество разложенного РС и РЕ составляет 0,6 ммоль/кг как для лецитазы, так и для КЕХЕ3, и количество полученных жирных кислот составляет 0,65 ммоль/кг в сливках, обработанных лецитазой, и 0,2 ммоль/кг для сливок, обработанных

- 101 018153

КЬМ3, что подтверждает наблюдения, что лецитаза гидролизует фосфолипиды, но КЬМ3 катализирует реакцию переноса.

Липиды, экстрагированные из сливок через 30 мин ферментации, также анализируют с помощью ГЖХ для того, чтобы количественно оценить специфические жирные кислоты, холестерин и сложный эфир холестерина.

Результаты ГЖХ анализа показаны в табл. 44.

Таблица 44 ГЖХ анализ пальмитиновой кислоты (ΕΕΑ-16), олеиновой кислоты (С18:1), линолеиновой кислоты (С18:2), стеариновой кислоты (С:18:0), суммы ΕΕΑ (С16:0, С18:0, С18:1 и С18:2), холестерина и сложного эфира холестерина

Фермент	День	РРА-16 ррт	РРА-18:1 и С:18:2 ррт	РРА-С18:0 ррт	Сумма РРА ррт	Холестерин ррт	Сложный эфир холестерина ррт
Контроль	1	119	154	54	327	551	0
Лецитаза	1	133	316	60	508	546	0
КЬМЗ	1	125	177	51	353	216	286
Контроль	2	111	152	54	317	520	0
Лецитаза	2	130	314	62	507	547	0
КЬМЗ	2	130	195	63	388	238	335

Результаты в табл. 44 оценивают статистически с помощью ΑΝΟνΑ, используя программу 81а1дгарЫс Ρ1υ8 для \·\Ίηι1ο\νβ 3.1. Статистическая оценка для холестерина, сложного эфира холестерина и суммы свободных жирных кислот (ΕΕΑ) проиллюстрирована графически на фиг. 125-127.

ГЖХ анализ подтверждает то, что уже наблюдали с помощью ТСХ анализа, что КЬМ3 значительно снижает количество холестерина (см. фиг. 126) в сравнении с контролем и сливками, обработанными лецитазой. Холестерин в сливках, обработанных с помощью КЬМ3, превращают в сложный эфир холестерина (см. фиг. 121), в то время как сливки, обработанные лецитазой, и контроль не содержат сложного эфира холестерина. Образование сложного эфира холестерина также имеет влияние на уровень свободной жирной кислоты (смотри Фигуру 127), где Лецитаза приводит к получению значительного количества свободных жирных кислот путём гидролиза фосфолипидов, а КЬМ3 приводит к получению только небольшого и не значительного количества свободных жирных кислот. Также видно, что это в основном ненасыщенная жирная кислота, количество которой возрастает в процессе ферментации, потому что лецитаза представляет собой вп-2 специфическую фосфолипазу и КЬМ3 представляет собой вп-2 специфическую в отношении трансферазной реакции. В фосфолипидах природного происхождения вп-2 положение содержит в основном ненасыщенные жирные кислоты.

Анализ липидов сыра.

Образцы сыра, полученные из модифицированных ферментом сливок, экстрагируют со смесью хлороформ:этанол в соответствии с процедурой, указанной выше, и анализируют с помощью ВЭТСХ и ГЖХ.

Каждый образец анализируют в двух повторах.

Результаты ВЭТСХ анализа показаны на фиг. 128 и 129.

ТСХ хроматограмма, представленная на фиг. 129, показывает, что как лецитаза, так и КЬМ3 полностью гидролизуют фосфолипиды - фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. Хроматограмма на фиг. 128 иллюстрирует, что сыр, обработанный с помощью КЬМ3, имеет сниженное содержание холестерина в сравнении с контрольным и обработанным лецитазой сыром. Также видно, что количество свободных жирных кислот в сыре, обработанном с помощью КЬМ3, ниже, чем в сыре, обработанном с помощью лецитазы, хотя оба ферменты полностью гидролизуют фосфолипиды ₽С и РЕ.

ГЖХ анализ липидов из сыра Моцарелла.

Липиды, экстрагированные из сыра, также анализируют с помощью ГЖХ для того, чтобы количественно определить специфические жирные кислоты, холестерин и сложный эфир холестерина. Каждый сыр экстрагируют и анализируют в двух повторах.

Результаты ГЖХ анализа показаны в табл. 45. Анализ жирных кислот разделяют на количество пальмитиновой кислоты (С16:0), олеиновой кислоты (С18:1) и линолеиновой кислоты (С18.2) и стеариновой кислоты (С18:0).

Таблица 45

ГЖХ анализ липидов из сыра Моцарелла

Фермент	День	РРА-16	РР А-18:1 и 18:2	РРА-18:0	Сумма РРА	Холестерин	Сложный эфир холестерина
Контроль	1	291	291	158	740	689	0
Контроль	1	304	275	156	735	758	0

- 102 018153

Фермент	День	РРА-16	РРА-18Д и 18:2	РРА-18:0	Сумма РРА	Холестерин	Сложный эфир холестерина
Лецитаза	1	345	566	195	1105	688	0
Лецитаза	1	336	546	180	1062	690	0
КЬМЗ	1	374	453	202	1030	296	440
КЬМЗ	1	399	481	228	1109	304	492
Контроль	2	285	259	160	703	726	0
Контроль	2	302	261	167	730	702	0
Лецитаза	2	354	584	202	1140	728	0
Лецитаза	2	357	591	202	1150	744	0
КЬМЗ	2	377	458	221	1056	302	419
КЬМЗ	2	388	485	227	1099	315	487

Результаты в табл. 45, показывающие ГЖХ анализ липидов из сыра Моцарелла, оценивают статистически с помощью АNОVА, используя δίπΙμπ-ψΙιίΕ Р1ик для \\'1пс1о\\к 3.1. Статистическое оценивание холестерина, сложного эфира холестерина, олеиновой кислоты + линолеиновой кислоты и суммы ЕРА проиллюстрировано на фиг. 130-133.

ГЖХ анализ липидов из сыра Моцарелла подтвердил эффект КЬМ3 на холестерин (см. фиг. 130) и образование сложного эфира холестерина (см. фиг. 131). Сыр, полученный с помощью КЬМ3, содержит только 40% холестерина в сравнении с контрольным сыром. Лецитаза не показывает какого-либо эффекта на уровень холестерина и никакого сложного эфира холестерина не образуется в контрольном и обработанном лецитазой сыре.

Исходя из реакции переноса также видно, что количество свободных жирных кислот в сырах, полученных с помощью КЬМ3, ниже, чем в сыре, полученном с помощью лецитазы. Это явно видно для ненасыщенных жирных кислот - олеиновой кислоты и линолеиновой кислоты (см. фиг. 132), уровень которых ниже в испытаниях с КЬМ3 в сравнении с лецитазой. Однако разницы являются менее выраженными для пальмитиновой кислоты и стеариновой кислоты (см. табл. 45). Известно, что фосфолипаза поджелудочной железы - лецитаза является очень специфической для кп-2 положения фосфолипида и, таким образом, сначала приводит к получению ненасыщенных жирных кислот. Известна некоторая неспецифическая гидролитическая активность КЬМ3, которая может быть объяснена образованием ненасыщенных жирных кислот из кп-1 положения фосфолипидов в молочном жире.

В этом эксперименте видно, что почти все фосфолипиды раскладываются через 30 мин ферментации сливок. Однако ферментная реакция продолжается в процессе стандартизации молока для сыроделия, пока молоко для сыроделия пастеризуют. Продолжающаяся ферментная реакция после ферментации сливок, пока молоко для сыроделия пастеризуют, объясняет образование насыщенных жирных кислот С16:0 и С18:0 в эксперименте с КЬМ3. Это также объясняется тем фактом, что ненасыщенные жирные кислоты образуются в сливках через 30 мин ферментации с помощью КЬМ3, но видно это только в сыре. Образование насыщенных жирных кислот в этом эксперименте с КЬМ3 может быть уменьшено или предупреждено путём снижения времени инкубирования сливок.

Заключение.

Ферментация сливок для использования в производстве сыра Моцарелла показала, что КЬМ3 и лецитаза являются очень активными по отношению к фосфолипидам в молочном жире. Наблюдается почти полное превращение фосфолипидов - фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина.

Активность лецитазы по отношению к фосфолипидам вносит свой вклад в увеличение количества свободных жирных кислот. Полученные жирные кислоты являются в основном ненасыщенными жирными кислотами - олеиновой кислотой и линолеиновой кислотой, потому что лецитаза является кп-2 специфической и ненасыщенные жирные кислоты являются наиболее избыточными в кп-2 положении фосфолипидов.

Однако КЬМ3 приводит к получению меньшего количества свободных жирных кислот, потому что этот фермент переносит жирные кислоты от фосфолипидов к холестерину в процессе образования сложного эфира холестерина.

Липидный анализ липидов, экстрагированных из конечного продукта сыра Моцарелла, показал почти те же самые липидные профили, что и те, которые наблюдаются для сливок, используемых для получения сыра Моцарелла.

Пример 28. Анализ влаги.

Сыр из шести экспериментов с использованием фермента в опытном масштабе производства сыра Моцарелла (см. пример 25) анализируют на содержание влаги с помощью стандартного способа ГОЕ 4А, 1982 и жирность определяют с помощью стандартного способа ГОЕ 5В, 1986 Международной федерации предприятий молочной промышленности.

Результаты.

- 103 018153

Таблица 46

Анализ содержания влаги и жирности

Сыр		% влаги	% жира
ϋΑΝΟΙΙ	Контроль	48,75	23,26
ϋΑΝ012	Лецитаза	50,95	23,02
ϋΑΝ013	КЬМЗ	52,03	22,70
ϋΑΝ021	Контроль	48,67	24,69
ϋΑΝ022	Лецитаза	49,60	24,25
ΏΑΝ023	КЬМЗ	51,66	23,67

На содержание влаги в сыре влияет обработка ферментом; КЬМ3 ацилтрансфераза значительно увеличивает содержание влаги в сыре как в сравнении с лецитазой, так и в сравнении с контролем. Это частично объясняет увеличенный выход, полученный с помощью ферментной обработки. Процент жира в сыре, таким образом, слегка снижается из-за общего увеличения выхода.

Пример 29. Анализ выделения масла.

Сыр из экспериментов с применением фермента в опытном масштабе производства сыра Моцарелла (см. пример 25) анализируют на выделение масла с помощью диффузного теста. После производства сыры выдерживают для созревания в течение 8 дней при 6°С.

Тест на диаметр выделенного масла.

Образцы сыра (2 г) измельчают и прессуют в 2 см ширины кольцо, используя 16 г гирю, бросаемую с 5 см высоты, применяемую три раза для того, чтобы получить компактную массу. Это является ключевой точкой для измерения выделения масла, когда количество силы, использованной для получения образца, известно (вместе с устойчивостью материала к сжатию), будет неясно в отношении плотности конечной массы, которая имеет прямой эффект на выделение масла в процессе нагревания (см. фиг. 134).

Образцы помещают на фильтровальные бумаги Шйа1тап номер 4 и нагревают вместе в сушильном шкафу при 90°С в течение 5 мин.

Измерения выделенного масла, которое определяют по диаметру просвечивающихся зон, видных на фильтровальных бумагах, проводят через 10 мин.

Результаты.

Таблица 47

Выделение масла

Сыр	Среднее	8ϋ	ср. площадь /мм²	% контрольной площади
ϋΑΝΟΙΙ	32,33	1,25	821,09
ϋΑΝ013	25,00	2,16	490,87	59,78

ЭА^И представляет собой контроль без фермента. БАМ013 является обработанным с помощью КЬМ3.

На фиг. 135 показаны фотографии контрольных образцов ЭА^И (слева) и сыра, полученного с помощью КЬМ3 ^ΑN013 (справа). 5-Минутное выдерживание после стадии нагревания.

Заключение.

Как может быть видно из результатов, через 10 мин КЬМ3 сыр в самом деле показывает значительно меньшее выделение масла, чем контроль.

Пример 30. Тест на плавление.

Сыр из экспериментов с применением фермента в опытном масштабе производства сыра Моцарелла (см. пример 25) анализируют на способность плавиться с помощью трубочного метода, описанного О1зеп (О1зеп, ΝΡ. & ШУ. Рисе, ^οи^ηа1 οΓ Ошгу 8с1епсе 1958, том 41: 999-1000). Растекание сыра измеряют как процент изменения от исходной точки перед нагреванием трубки (О1зеп 1958).

Результаты.

Таблица 48

Результаты растекания сыра

Сыр		Растекание сыра (%)
ϋΑΝΟΙΙ	Контроль	211
ϋΑΝ012	Лецитаза	217
ϋΑΝ013	КЬМЗ	221
ϋΑΝ021	Контроль	168
ϋΑΝ022	Лецитаза	200
ϋΑΝ023	КЬМЗ	200

Никакой статистически значимой разницы не наблюдалось в тесте плавления сыра, таким образом, ни лецитаза, ни ацилтрансфераза КЬМ3 не изменяют свойств плавления сыра.

Свойства плавления также определяют путём выпекания пиццы для определения визуальных изме

- 104 018153 нений сыра Моцарелла в сравнении контролем без фермента. Этот сыр показал меньшее выделение масла на пицце и нормальные свойства плавления.

Пример 31. Экспрессия липидацилтрансферазы в ВасШик ПсЬепИ'огппк.

Нуклеотидную последовательность (БЕР ГО Ыо. 100), кодирующую липидацилтрансферазу (БЕО. ГО Ыо. 90, в данном описании ниже КЬМ3) экспрессируют в ВасШик 11сРеш£огт1к как слитый белок с сигнальным пептидом В. 11сРеш£огт1к [а]-амилазой (ЬАТ) (см. фиг. 137 и 138). Для оптимальной экспрессии в ВасШик оптимизированную кодом генную структуру (№ 052907) упорядочивают на Сепеаг! (СепеаП АС, КедепкЬигд, Сегтапу).

Структура № 052907 содержит неполный ЬАТ промотор (только -10 последовательность) перед ЬАТ-КЬМ3' геном-предшественником и ЬАТ транскрипцию (Т1а1) ниже ЬАТ-КЬМ3' генапредшественника (см. фиг. 137 и 139). Для создания ХНо1 фрагмента, который содержит ЬАТ-КЬМ3' генпредшественник, фланкированный полным ЬАТ промотором на 5'-конце, и ЬАТ терминатор на 3'-конце, ПЦР (полимеразная цепная реакция) амплификацию проводят с праймерами Р1аΐ5XНоI_РV и ЕВБ2ХЬо!_КУ и генной структурой 052907 в качестве матрицы.

Р1а15ХЬо1_РА¥:

ссссйс1сцайцсШ1сШШеаайаааа1а1айййаааа1цШас1ЩиаааааЦс

2§аа1аШа1асаа1а1.са1а1§Шсасай§ааа§§дд

ЕВ82ХЬо1_КУ: Шцаа1с1сеаццШ1а1ссШассиЩс1сс

ПЦР проводят на термоциклере с РРикюп ИщН Р1йе111у ДНК полимеразой (Р^ηηζутек ΟΥ, Екроо, Рш1апй) в соответствии с инструкциями производителя (температура отжига 55°С).

Полученный ПЦР фрагмент обрабатывают с помощью рестрикционного фермента ХНо! и лигируют с помощью Т4 ДНК лигазы в Χ^Ι обработанный рГОаРН в соответствии с инструкциями поставщика (ШуШодеп, Саг1кЬай, Са11£. ИБА).

Смесь для лигирования трансформируют в В. киЬ1Шк штамм БС6.1, как описано в патентной заявке США иБ 20020182734 (международная публикация νΟ 02/14490). Последовательность Χ^Ι вставки, содержащей ЬАТ-КЬМ3' ген-предшественник, подтверждается ДНК секвенированием (ВакеС1еаг, Ье1йеп, ТНе ЫеШег1апйк) и один из корректных плазмидных клонов обозначается р1Са1Н-КЬМ3'(оп1) (фиг. 137). р1Са1Н-КЬМ3'(оп1) трансформируют в В. 11сРеш£огт1к штамм ВМЬ780 (производная ВКА7 и ВМЬ612, см. νΟ 2005111203) при пермиссивной температуре (37°С).

Один устойчивый к неомицину (пеоК) и устойчивый к хлорамфениколу (СшК) трансформант выбирают и обозначают ВМЬ780 (р1Са1Н-КЬМ3'(оп1)). Плазмид в ВМЬ780 (р1Са1Н-КЬМ3'(оп1)) интегрируют в са1Н область на В. ИсРеш£огт1к геноме путём выращивания штамма при непермиссивной температуре (50°С) в среде с 5 мкг/мл хлорамфеникола. Один СшК устойчивый клон выбирают и обозначают ВМЬ780-р1Са1Н-КЬМ3'(оп1). ВМЬ780-р1Са1Н-КЬМ3'(оп1) выращивают снова при пермиссивной температуре в течение нескольких генераций без антибиотиков до 1оор-ои1 векторных последовательностей и затем выбирают один чувствительный к неомицину (пеоБ), СтК клон. В этом клоне векторные последовательности р1Са1Н на хромосоме вырезают (включая устойчивый к неомицину ген) и только са1НЬАТКЬМ3' кассету оставляют. Дальше, са1Н-ЬАТКЬМ3' кассету на хромосоме амплифицируют путём выращивания штамма в/на среде с возрастающими концентрациями хлорамфеникола. После различных циклов амплификации один клон (устойчивый против 50 мкг/мл хлорамфеникола) выбирают и обозначают ВМЬ780-КЬМ3'САР50. Для контроля КЬМ3' экспрессии ВМЬ780-КЬМ3'САР50 и ВМЬ780 (пустой штамм-хозяин) выращивают в течение 48 ч при 37°С на агарозном планшете с сердечным настоем (Васю) с 1% трибутирином. Освобождающая зона, индикативная для липидацилтрансферазной активности, явно видна в колонии ВМЬ780-КЬМ3'САР50, но не в штамме-хозяине ВМЬ780 (см. фиг. 140). Этот результат показывает, что существенное количество КЬМ3' экспрессируют в В. 11сРеш£огт1к штамме ВМЬ780-КЬМ3'САР50 и что эти КЬМ3' молекулы являются функциональными.

Сводные параграфы

Настоящее изобретение определяется в пунктах формулы изобретения и сопроводительным описанием. Для удобства эти и другие аспекты настоящего изобретения представлены в данном описании с помощью пронумерованных параграфов.

1. Способ 1п кйи получения эмульгатора в продукте питания, где указанный способ включает стадию добавления липидацилтрансферазы к пищевому продукту.

2. Способ по параграфу 1, в котором получают по крайней мере 2 эмульгатора.

3. Способ по параграфу 1 или 2, в котором эмульгатор получают без повышения или существенного повышения содержания свободных жирных кислот в продукте питания.

4. Способ по любому из параграфов 1-3, в котором липидацилтрансфераза представляет собой такую, которая способна переносить ацильную группу от липида к одному или большему количеству из

- 105 018153 следующих акцепторов ацила: стерол, станол, углевод, белок или его субъединица, глицерин.

5. Способ по параграфу 2, в котором по крайней мере один из эмульгаторов представляет собой сложный эфир углевода.

6. Способ по параграфу 2, в котором по крайней мере один из эмульгаторов представляет собой сложный эфир белка.

7. Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором один или больше из таких как сложный эфир стерола, или сложный эфир станола, или сложный эфир белка, или сложный эфир углевода, или диглицерид, или моноглицерид получают ίη зйи в продукте питания.

8. Способ по параграфу 7, в котором сложный эфир стерола представляет собой один или больше из сложного эфира α-ситостерола, сложного эфира β-ситостерола, сложного эфира стигмастерола, сложного эфира эргостерола, сложного эфира кампестерола или сложного эфира холестерина.

9. Способ по параграфу 6, в котором сложный эфир станола представляет собой один или больше из β-ситостанола или зз-ситостанола.

10. Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности СЭ8Х, в которой X представляет собой один или больше из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Ρ, Υ, Η, О, Т, Ν, М или 8.

11. Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором фермент липидацилтрансфераза включает Н-309 или включает гистидиновый остаток в положении, соответствующем Шз-309 в аминокислотной последовательности Αе^οшοηаз йубгорйПа липолитического фермента, который показан как 8ΕΟ ГО Цо. 2 или 8ΕΟ ГО Цо. 32.

12. Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором липидацилтрансфераза может быть получена из организма из одного или больше следующих семейств: Αе^οшοηаз, 8ί^еρΐοшусез, 8ассйаготусез, Ьасйсоссиз, ΜусοЬасΐе^^иш, 81гер1ососснз, ЬасЮЬасШиз, □езиК'ЦоЬааепшп, Бас^11из, Сатру1оЬас1ег, V^Ь^^οηасеае. Ху1е11а, 8и1£о1оЬиз, Αзρе^д^11из, 8сй17озассйаготусез, Ь1з(ег1а, №1ззепа, Μезο^й^ζοЬ^иш, Ка1зФша, ХаЛ^то^з и СамбНа.

13. Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором липидацилтрансфераза включает одну или больше из следующих аминокислотных последовательностей: (ί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ГО №. 2; (ίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ГО №. 3; (ίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ГО №. 4; (ίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΌ ГО №. 5; (ν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ГО №. 6; (νί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ГО №. 12, (νίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ГО №. 20, (νίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 22, (ίχ) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 24, (х) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 26, (χί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 28, (χίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 30, (χίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 32, (χίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 34, (χν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 62, (χνί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО №. 90, или аминокислотная последовательность, которая имеет 75% или большую идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8ΕΟ ГО №. 2, 8ΕΟ ГО №. 3, 8ΕΟ ГО №. 4, 8ΕΟ ГО №. 5, 8ΕΟ ГО №. 6, 8ΕΕ) ГО Цо. 12, 8ΕΕ) ГО Цо. 20, 8ΕΕ) ГО Цо. 22, 8ΕΕ) ГО Цо. 24, 8ΕΕ) ГО Цо. 26, 8ΕΕ) ГО Цо. 28, 8ΕΕ) ГО Цо. 30, 8ΕΕ) ГО Цо. 32 или 8ΕΕ) ГО Цо. 34, 8ΕΕ) ГО Цо. 62 или 8ΕΕ) ГО Цо. 90.

14. Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором эмульгатор представляет собой один или больше из следующих: моноглицерид, лизофосфатидилхолин, ^СΜС.

15. Применение липидацилтрансферазы для получения из пищевого материала продукта питания, который включает эмульгатор, где указанный эмульгатор получают без повышения или без существенного повышения количества свободных жирных кислот в продукте питания и где указанный эмульгатор производят из компонентов пищевого материала с помощью липидацилтрансферазы.

16. Применение по параграфу 15, в котором получают по крайней мере два эмульгатора.

17. Применение по параграфу 16, в котором по крайней мере один из эмульгаторов представляет собой сложный эфир углевода.

18. Применение по параграфу 16, в котором по крайней мере один из эмульгаторов представляет собой сложный эфир белка.

19. Применение по любому из параграфов 15-18, в котором один или больше из таких как сложный эфир стерола, или сложный эфир станола, или сложный эфир белка, или сложный эфир углевода, или диглицерид, или моноглицерид также получают ίη зйи в продукте питания.

20. Применение по параграфу 19, в котором сложный эфир стерола представляет собой один или больше из таких как сложный эфир α-ситостерола, сложный эфир β-ситостерола, сложный эфир стигмастерола, сложный эфир эргостерола, сложный эфир кампестерола или сложный эфир холестерина.

- 106 018153

21. Применение по параграфу 20, в котором сложный эфир станола представляет собой один или больше из β-ситостанола или зз-ситостанола.

22. Применение по любому из параграфов 15-21, в котором липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности ΟΌ8Χ, в которой X представляет собой один или больше из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, Ι, Ε, Υ, Η, О, Т, Ν, М или 8.

23. Применение по любому из параграфов 15-22, в котором фермент липидацилтрансфераза включает Н-309 или включает гистидиновый остаток в положении, соответствующем И1з-309 в аминокислотной последовательности Ае^οтοηаз НуйгорНПа липолитического фермента, который показан как 8Ε0 ΙΌ Νο. 2 или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 32.

24. Применение по любому из параграфов 15-23, в котором липидацилтрансфераза может быть получена из организма из одного или больше следующих семейств: Ле^οтοηаз. 81герЮтусез, 8асс11аготусез, ΕλΛο^^ι.^, Му^а^ейит, 8ΐ^ерΐοсοссиз, БасЮЬасШиз, ОезиШшЬаЛейит, ВасШиз, СатруШЬаЛег, V^Ь^^οηасеае, Xу1е11а, ЗииЫсЬиБ, АзрегдШиз, 8сΗ^ζοзассΗа^οтусез. Ь1з1ейа, №1ззейа, Μезο^й^ζοЬ^ит, Ка1зЮша, Xаηι11οтοηаз и С’апйШа.

25. Применение по любому из параграфов 15-24, в котором липидацилтрансфераза включает одну или больше из следующих аминокислотных последовательностей: (ί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ΙΌ Νο. 2; (ίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ΙΌ Νο. 3; (ш) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ΙΌ Νο. 4; (ίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΌ ΙΌ Νο. 5; (ν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ΙΌ Νο. 6; (νί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ΙΌ Νο. 12, (νίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Ε0 ΙΌ Νο. 20, (νίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 22, (ίχ) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 24, (х) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 26, (χί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 28, (χίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 30, (χίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 32, (χίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 34, (χν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 62, (χνί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ГО Νο. 90, или аминокислотная последовательность, которая имеет 75% или большую идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8ΕΟ ГО Νο. 2, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 3, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 4, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 5, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 6, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 12, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 20, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 22, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 24, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 26, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 28, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 30, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 32, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 34, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 62 или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 90.

26. Применение по любому из параграфов 15-25, в котором эмульгатор представляет собой один или больше из следующих: моноглицерид, лизофосфатидилхолин, ООМС.

27. Пищевая или кормовая ферментная композиция, которая содержит липидацилтрансферазу.

28. Пищевая или кормовая ферментная композиция по параграфу 27, в которой липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности С^8X. в которой X представляет собой один или больше из следующих аминокислотных остатков Ь, А, V, Ι, Ε, Υ, Η, О, Т, Ν, М или 8.

29. Пищевая или кормовая ферментная композиция по параграфу 27 или 28, в которой фермент липидацилтрансфераза включает Н-309 или включает гистидиновый остаток в положении, соответствующем Шз-309 в аминокислотной последовательности Ле^οтοηаз НуйгорНПа липолитического фермента, который показан как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 2 или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 32.

30. Пищевая или кормовая ферментная композиция по любому из параграфов 27-29, в которой липидацилтрансфераза может быть получена из организма из одного или больше следующих семейств: Ле^οтοηаз. 81герЮтусез, 8ассНаготусез, Ει-κΙο^^ιη, Му^а^ейит, 8ΐ^ерΐοсοссиз, БасЮЬасШиз, Оези1йюЬайейит, ВасШиз, СатруШЬайег, МЬ^шсе-е, Xу1е11а, 8и1Гο1οЬиз, АзрегдШиз, 8сΗ^ζοзассΗа^οтусез. Ыз1ейа, №ззепа, Μезο^ЫζοЬ^ит, КПзЮша, XаηШοтοηаз и С’апШйа.

31. Пищевая или кормовая ферментная композиция по любому из параграфов 27-30, в которой липидацилтрансфераза включает одну или больше из следующих аминокислотных последовательностей: (ί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 2; (ίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 3; (ш) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 4; (ίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΌ ΙΌ Νο. 5; (ν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 6; (νί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 12, (νίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 20, (νίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 22, (ίχ) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 24, (х) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 26, (χί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 28, (χίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 30, (χίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 32, (χίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 34, (χν) аминокислотная последова- 107 018153 тельность, которая показана как 8Е0 ГО №. 62, (χνί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8Е0 ГО №. 90, или аминокислотная последовательность, которая имеет 75% или большую идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8ЕО ГО №. 2, 8ЕО ГО №. 3, 8ЕО ГО №. 4, 8ЕО ГО №. 5, 8ЕО ГО №. 6, 8ЕЕ) ГО №. 12, 8ЕЕ) ГО №. 20, 8ЕЕ) ГО №. 22, 8ЕЕ) ГО №. 24, 8ЕЕ) ГО №. 26, 8ЕЕ) ГО №. 28, 8ЕЕ) ГО №. 30, 8ЕЕ) ГО №. 32 или 8ЕЕ) ГО №. 34, 8ЕЕ) ГО №. 62 или 8ЕЕ) ГО №. 90.

32. Применение пищевой или кормовой ферментной композиции по любому из параграфов 27-31, по любому из параграфов 15-26 или в способе по любому из параграфов 1-14.

33. Продукт питания, который может быть получен по способу по любому из параграфов 1-14.

34. Иммобилизованный липидацилтрансферазный фермент.

35. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 34, где липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности 0Ό8Χ, в которой X представляет собой один или больше из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, Ι, Р, Υ, Н, О, Т, N М или 8.

36. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 34 или 35, где липидацилтрансферазный фермент включает Н-309 или включает гистидиновый остаток в положении, соответствующем Н1з309 в аминокислотной последовательности Асгошопиз ЬубгорЫ1а липолитического фермента, который показан как 8ЕО ΙΌ №. 2 или 8ЕО ΙΌ №. 32.

37. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по любому из параграфов 34-36, где липидацилтрансфераза может быть получена из организма из одного или больше следующих семейств: Асгошопиз, 81гср1ошуссз, 8ассйа^οшуссз, ЬасГососсиз, МусоЬасЮпит, 81гср1ососсиз, ЬасГоЬасШиз, ^сзи1Γ^ΐοЬасΐс^^иш, ВасШиз, Сатру1оЬас1сг, ^Ьг^-ссас, Ху1с11а, 8и1Го1оЬиз, АзрсгдШиз, 8с11^ζοзасс11а^οтуссз. ЫзГспа, Еиззспа, Μсзο^ЫζοЬ^иш, Ва1з1оша, Xаηι11οтοηаз и Ο’αη6ί6α.

38. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по любому из параграфов 34-37, где липидацилтрансфераза включает одну или больше из следующих аминокислотных последовательностей: (ί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 2; (и) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 3; (ίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 4; (ίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕЭ ГО №. 5; (ν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 6; (νί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 12, (νίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 20, (νίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 22, (ίχ) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 24, (х) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 26, (χί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 28, (χίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 30, (χίίί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 32, (χίν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 34, (χν) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 62, (χνί) аминокислотная последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 90, или аминокислотная последовательность, которая имеет 75% или большую идентичность с любой из последовательностей, которые показаны как 8ЕО ГО №. 2, 8ЕО ГО №. 3, 8ЕО ГО №. 4, 8ЕО ГО №. 5, 8ЕЕ) ГО №. 6, 8ЕЕ) ГО №. 12, 8ЕЕ) ГО №. 20, 8ЕЕ) ГО №. 22, 8ЕЕ) ГО №. 24, 8ЕЕ) ГО №. 26, 8ЕЕ) ГО №. 28, 8ЕЕ) ГО №. 30, 8ЕЕ) ГО №. 32 или 8ЕЕ) ГО №. 34, 8ЕЕ) ГО №. 62 или 8ЕЕ) ГО №. 90.

39. Способ выявления подходящей липидацилтрансферазы для применения в соответствии с настоящим изобретением, который включает стадии тестирования фермента, который представляет интерес, используя одно или больше из таких как Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды или Исследование трансферазы в забуференном субстрате, и выбирая липидацилтрансферазу, если она является такой, которая имеет одну или больше из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

40. Способ по параграфу 39, в котором липидацилтрансферазу выбирают, если она является такой, которая имеет больше чем две из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

41. Способ по параграфу 39, в котором липидацилтрансферазу выбирают, если она является такой,

- 108 018153 которая имеет больше чем три из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

42. Способ по параграфу 39, в котором липидацилтрансферазу выбирают, если она является такой, которая имеет все из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

43. Липидацилтрансфераза, выявленная, используя способ по любому из параграфов 39-42.

44. Липидацилтрансфераза, где липидацилтрансфераза включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8Е© ΙΌ Νο. 90, или аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 75% идентичность с 8Е© ΙΌ Νο. 90, предпочтительно по крайней мере 80% идентичность с ней, предпочтительно по крайней мере 85% идентичность с 8Е© ΙΌ Νο. 90, предпочтительно по крайней мере 90% идентичность с 8Е© ΙΌ Νο. 90, предпочтительно по крайней мере 95% идентичность с 8Е© ΙΌ Νο. 90.

45. Липидацилтрансфераза по параграфу 44, где липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности СЭ8Х, в которой X представляет собой один или больше из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, Ι, Е, Υ, Н, О, Τ, Ν, М или 8.

46. Липидацилтрансфераза по параграфу 44 или параграфу 45, где липидацилтрансфераза может быть получена (или получается) из семейства Аегопющ^.

47. Липидацилтрансфераза по любому из параграфов 44-46, где липидацилтрансфераза имеет одну или больше из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

48. Липидацилтрансфераза по параграфу 47, где липидацилтрансфераза имеет больше чем две из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансфертной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

49. Липидацилтрансфераза по параграфу 47, где липидацилтрансфераза имеет больше чем три из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

50. Липидацилтрансфераза по параграфу 47, где липидацилтрансфераза имеет все из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

51. Иммобилизованный липидацилтрансферазный фермент, где липидацилтрансфераза включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8Е© ΙΌ Νο. 90, или аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 75% идентичность с 8Е© ΙΌ Νο. 90, предпочтительно по

- 109 018153 крайней мере 80% идентичность с ней, предпочтительно по крайней мере 85% идентичность с 8ЕО ГО №. 90, предпочтительно по крайней мере 90% идентичность с 8ЕО ГО №. 90, предпочтительно по крайней мере 95% идентичность с 8ЕО ГО №. 90.

52. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 51, где липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности СЭ8Х, в которой X представляет собой один или больше из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8.

53. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 51 или параграфу 52, где липидацилтрансфераза может быть получена из организма из семейства Аеготопаз.

54. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по любому из параграфов 51-53, где липидацилтрансфераза имеет одну или больше из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

55. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 54, где липидацилтрансфераза имеет больше чем две из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

56. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 54, где липидацилтрансфераза имеет больше чем три из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

57. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 54, где липидацилтрансфераза имеет все из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

58. Пищевая или кормовая ферментная композиция, которая содержит указанную липидацилтрансферазу по любому из предыдущих параграфов.

59. Липидацилтрансфераза, где липидацилтрансфераза включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8ЕО ГО №. 90, или аминокислотную последовательность, которая имеет 95% или большую идентичность с 8ЕО ГО №. 90.

60. Липидацилтрансфераза по параграфу 59, где липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности СЭ8Х, в которой X представляет собой один или больше из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8.

61. Липидацилтрансфераза по параграфу 59 или параграфу 60, где липидацилтрансфераза может быть получена (или получается) из семейства Аеготопаз.

62. Липидацилтрансфераза по любому из параграфов 59-61, где липидацилтрансфераза имеет одну или больше из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

63. Липидацилтрансфераза по параграфу 62, где липидацилтрансфераза имеет больше чем две из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низ

- 110 018153 ким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

64. Липидацилтрансфераза по параграфу 62, где липидацилтрансфераза имеет больше чем три из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

65. Липидацилтрансфераза по параграфу 62, где липидацилтрансфераза имеет все из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

66. Иммобилизованный липидацилтрансферазный фермент, где липидацилтрансфераза включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8ЕО ΙΌ №. 90, или аминокислотную последовательность, которая имеет 95% или большую идентичность с 8ЕО ΙΌ №. 90.

67. Иммобилизованная липид-ацилтрансфераза по параграфу 66, в которой липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности СЭ8Х, в которой X представляет собой один или больше из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8.

68. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 66 или 67, где липидацилтрансфераза может быть получена из организма из семейства Аеготопак.

69. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по любому из параграфов 66-68, где липидацилтрансфераза имеет одну или больше из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

70. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 69, где липидацилтрансфераза имеет больше чем две из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

71. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 69, где липидацилтрансфераза имеет больше чем три из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансфертную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

72. Иммобилизованная липидацилтрансфераза по параграфу 69, где липидацилтрансфераза имеет все из следующих характеристик: (а) при тестировании, используя Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании, используя Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды, имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании, используя Исследование трансферазы в забуференном субстрате, имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазную активность.

- 111 018153

73. Пищевая или кормовая ферментная композиция, которая содержит указанную липидацилтрансферазу по любому из предыдущих параграфов.

74. Липидацилтрансфераза, где липидацилтрансфераза включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8Ер ΙΙ) Νο. 90, или аминокислотную последовательность, которая имеет 95% или большую идентичность с 8Ер ΙΌ Νο. 90.

75. Липидацилтрансфераза по параграфу 74, где липидацилтрансфераза имеет аминокислотную последовательность, которая показана как 8Ер ΙΌ Νο. 90.

76. Липидацилтрансфераза по параграфу 74 или 75, где липидацилтрансфераза является иммобилизованной.

77. Пищевая или кормовая ферментная композиция, которая содержит указанную липидацилтрансферазу по любому из предыдущих параграфов.

78. Липидацилтрансфераза, где липидацилтрансфераза включает аминокислотную последовательность, которая показана как 8Ер ΙΌ Νο. 90.

79. Липидацилтрансфераза по параграфу 78, где липидацилтрансфераза имеет аминокислотную последовательность, которая показана как 8Ер ΙΙ) Νο. 90.

80. Липидацилтрансфераза по параграфу 78 или 79, где липидацилтрансфераза является иммобилизованной.

81. Пищевая или кормовая ферментная композиция, которая содержит указанную липидацилтрансферазу по любому из предыдущих параграфов.

Все публикации, упомянутые в данном описании, введены в данную заявку как ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и систем настоящего изобретения будут понятными квалифицированному специалисту в данной области техники без отступления от сути и объёма настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи со специфическими предпочтительными воплощениями, следует понимать, что изобретение, как оно заявлено, не является ограниченным такими специфическими воплощениями. На самом деле, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые являются очевидными квалифицированному специалисту в области биохимии и биотехнологии или родственных областей, предназначены для включения в объем приведенных ниже пунктов формулы изобретения.

шЗ>дх£ЗТ ΤΧΣΑΤΐ ΟΧ Т22 ΕΏΧΗΧΑΏαΧΑΤ КЕСОСЯтОК ОК ТНЕ ОКРОЯТОТ МЗСКООКСАЮ5М5 ГОК ТЕЕ ПЖУО5Е5 ОТ РАТИТТ РКОСЕЫЖЕ

ВтЖКАТЮКАЬ юям

РЕСИГПКТИЕ ст ОТ АХ оюстмабъеронгг РгГЕККАТЮКАЬ ПЕРОЯТАКУ ΑϋΤΗΟΕΠΎ

Л (Ье Ъпйот егГ (Ыг ра^е



(ЛевйЯсяЙМ! гсЬгеасг ρ5να> Ьу (Ье	Аздзяга пшиЬег ρνεη Ъу СЬе
ΟΕΡΟΣΠΤΟΚί '	1К7ЕКЧА.^СШЕ1>ЕРСеГГАН.У ΚϋΤΗΟΜΊΎ:· ‘
ЕкЛеНсЫл ызй ТСЙЧОрРеШаАЬуаго	ЭСМВ 412М
п. эсга-гп пс Есасиртюк аэлжж. ркороьел	ТАХО140М1С ЕЕЯОМАПОН

- 112 018153

ГОПАПЗТ ТКЬАТУ

КЕОО6КП7ОК ОК ГНЕ РЕРО5СТ ОТ ШСКООКОАК15М5 КайТНЕГОКРОВЕЗ ОГГАТЕЛТУВОаЕРиТЕ

БшагеоА/З Ь*»»ЕЬго=абе 1 1Ж‘1001 Соря5®г=

ТУтптгагЬ отшоатзсйш-ижм

НАЕШЕТ!’ гаТЕМЕКТ

Ьааш5 раткш! I» Лик ЗвЛ Ъу йе

ППТЕЖКкТТОМАЪЫЗ’ОЗаАЕ.'У АТЛВСйиТГ ίάεοϋ&ελ ок Йэе ГиПогитл} раде . ХАМЕ ΑΜβ АЫЖЕ55 ОЕТНЕУ АКТУ ТО М>ЭОЫ ΪΗΒ ПАВЮТУ 5ТАТЕМЕХТ ΚΙΕΒΙΕΣ)

1 ЛЕРОЕГГСЙ.	П- ЮьНППСАТЮМ ОЕ ТНЕ КОСЕ-ОЭКОАУЛЕМ
Катке Α5Α3ΟΥΣ Аййплс .	Асссаяип пшЫйг руса Ьу 1Ьа ПчТГЕР6МЛОИАЬЛНРО£ЗТАЕУ АВТНОРЭТУ: ΝΟΜΒ412Μ Е>Ме оГ Й» берой иг оГ й» иалзГи¹:
	32&е№ь2>ег2ШЗ
Ш. ΛΤΑΕΠ1ΤΥ СТАТЕМхНТ

Лк тЫмТйу ЬГύιε пастогрткп Испйкй пайг Π Λονε то 1иййй оп 22 ЛазспЛст 2003 λ О» ЬЫ йайе, Йк спай пёсгоягвзтэд н-ве ‘

νίΛΙε ъь 1го5« г®Ые

Ьаоск 1Ьг йд!с оГ &е опрпа! Йсрэя1 от, РЪсте с ос* берпл! от а гхгеГа 1«в1жсэ пайе, йс шел ι=εαϋ ισ1η·3ηί * йзи (йнйс οί ώ₽ пгт ώφοϊΐΐ от йгк οί 1Ь: Ьапкйсг).

Ъ> й>е сак» тсйятсй 1о ш ОДе 1 С2(а)(л) апй (ΐίϊ), теГст 1о йе τοοεί геад1 -паЬййу ίεΛ.

Мяк итй а ста 8« здэНгзЫс Ьж.

Рогтп ВР/Р (алЛ рче)

Копп ЕР.9 (игзпй ζηί 1аи ра^с)

- 113 018153

ип’е; РЛп-лйгуЖЦ <ше (йа1е от 11а пгт оезол! от ώϋ от те ЬййтсЛ

Ιη ’Ъе сига теГсгпЭ 1о Ь Кл1е 10.2хаХ»Г) аиЗ (НГк >сГсГ Ιό йл π,πϊί гееед! г-гУН^*-³^δίΕπΛιίπφ οί уязопф Ьктга£ 1Ьс ρυ^ΐτ ίο тсрткггЛ 11л Ыагпзбпдй 1>ёроЕ1йту Дцйппту пт οί зиЛопгаб

- 114 018153

- 115 018153

ВХФДУЕ5Т ТИКАТУ ΟΝ ТЭГ ΙΚΤΕΚΧαΤΪΟΝΑΙ КГССХАТПО5 ОУ ΤΗΣ ΟΣ2Ό5ΓΓ ОГ УОСКООКОАГОЕМЗ РОХ ТНЕ КЖРО5Е5 ОУ ГЛТьЭТ гХиСЕВОкХ

Патясп ЫйЦескиа] Аззс15

Сатзсо А/3

ЬапгеЪгоеаде 1 ПХ-1СЮ1 СортсЬазса Пяпупятк гтЖКАЛОНАЬ РОКИ

УТЛБШТУ 5ТАГЕМЕЭТ тстЫ рпгдал! и Кик 10Л Ьу (Ье ШХКХАПОКЛЬ ПЕРОЯГ.АКУ АПТНОИТГ ИеийОей оо (ке ГаПотйП£ рг^е

КАМЕ ЛГФЛХФКЕЗЗ ОГ ΐΞΕ ΡΛΧΊΎ ТО тгаом ТЕЕ У1АЗЛДТУ 3ΤΑ.ΤΕΜΕΚΤ 15155Ц=&

Ь. ОЁГОЗГГОК	П. ЮЕНЛЯСАТЮК С₽ ТНЗ
Мат= АЗАВОУь АпЗгах	Агсгааи) шпбЬя (ко Ъу йе ЩТЕРОШХЛгаОЭОЗГГАКУ АШНОКПУ: ггамв 44225 - Ода п£1Ьс дсраа! от оГ 0зс РттдагЕ
	23Лда20М
Ш. УгАЕЗЛГУ ΪΤΑχΞΜΞΝΤ

Ьмсза (Ьа йле оГ йа οηςΐζΐϊ] Зсрий от, тсЬсге а огч· дерзай от а (гааЯЬс Ь» Ъсги да-к, |Ьс поя ггота» ττίηταΐ Айс [&га οί йп. иг* « дда οί Й» 1тхалсгУ

Ь £Ь« ааяз лЛктИ (э да Хи?е ЗО-Э^Хи) ίο! (ЙП, гейт (о <Ье а»л псеаС гиЬЯгу (ел

Ма± τνΐώ а пои 1Ъе аррНсэЬк Ъох.

Гост ВР.9 (ЗтЯ ре£е)

ΕακηδΚ? (зиадм! зпЗ Ья рзре)

- 116 018153

- 117 018153

Перечень последовательности

<Н0>	ДАНИСКО А/С
<120>	БЕЛОК
<130 =	Р032677ИО
<140> <141>	РСТ/СВ2008/000676 2008-02-27
<150> <151>	СВ0716126.8 2007-08-17
<160=·	114
<170>	РабепбЬп уегвхоп 3.5

<210> 1 <211> 361 <212> РКТ <213> АгбЬ£ЬсЬаЬ Зедиепсе <220>

<223> ЗупбкебЬс

р£ат00657 сопзепзиз

зедиепсе

<400

1> 1

Не

УаЬ

А1а

Рке

СЬу

Азр

Зег

Ьеи

Ткг

Азр

СЬу

СЬи

АЬа

Туг

СЬу

1

5

10

15

Азр

Зег

Азр

СЬу

Тгр

СЬу

АЬа

СЬу

Ьеи

АЬа

Азр

Агд

Ьеи

Ткг

20

25

30

АЬа

Ьеи

Агд

Ьеи

Агд

АЬа

Агд

Рго

Агд

СЬу

УаЬ

Азр

УаЬ

Рке

Азп

35

40

45

Агд

СЬу

ЬЬе

Зег

СЬу Агд

Ткг

Зег

Азр

СЬу

Агд

Ьеи

ЬЬе

УаЬ

Азр

АЬа

50

55

60

Ьеи

УаЬ

АЬа

Ьеи

Рке

Ьеи

АЬа

СЬп

Зег

Ьеи

СЬу

Ьеи

Рго

Азп

Ьеи

65

70

75

80

Рго

Туг

Ьеи

Зег

СЬу

Азр

Рке

Ьеи

Агд

СЬу

АЬа

Азп

Рке

АЬа

Зег

85

90

95

А1а

С1у

А1а

Ткг

Не

Ьеи

Рго

Ткг

Зег

СЬу

Рго

Рке

Ьеи

ЬЬе

СЬп

УаЬ

100

105

110

СЬп

Рке

ьуз

Азр

Рке

Ьуз

Зег

СЬп

УаЬ

Ьеи

СЬи

Ьеи

Агд

СЬп

АЬа

Ьеи

115

120

125

СЬу

Ьеи

СЬп

СЬи

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

АЬа

Ьуз

130

135

140

Зег

Рго

Азр

Ьеи

УаЬ

Ткг

ЬЬе

Меб

ЬЬе

СЬу

Ткг

Азп

Азр

Ьеи

ЬЬе

Ткг

145

150

155

160

Зег

А1а

Рке

СЬу

Рго

Ьуз

Зег

Ткг

СЬи

Зег

Азр

Агд

Азп

УаЬ

Зег

165

170

175

УаЬ

Рго

СЬи

Рке

Ьуз

Азр

Азп

Ьеи

Агд

СЬп

Ьеи

Не

ьуз

Агд

Ьеи

Агд

180

185

190

Зег

Азп

СЬу

АЬа

Агд

ЬЬе

УаЬ

Ьеи

Не

Ткг

Ьеи

УаЬ

ЬЬе

Ьеи

195

200

205

Азп

Ьеи

СЬу

Рго

Ьеи

СЬу

Суз

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьуз

Ьеи

АЬа

Ьеи

АЬа

Ьеи

210 215 220

118

А1а 225

Зег

Зег Ьуз Азп

Уа1 Азр А1а Зег (31у Суз Ьеи С1и Агд Ьеи Азп

230

235

240

С1и

А1а

Уа1

А1а

Азр

РЬе

Азп

С1и

А1а

Ьеи

Агд

О1и

Ьеи

А1а

11е

Зег

245

250

255

Ьуз

Ьеи

С1и

Азр

С1П

Ьеи

Агд

Ьуз

Азр

С1у

Ьеи

Рго

Азр

Уа1

Ьуз

(31у

260

265

270

А1а

Азр

Уа1

Рго

Туг

Уа1

Азр

Ьеи

Туг

Зег

Не

РЬе

С1п

Азр

Ьеи

Азр

275

280

285

<31у

Не

(31п

Азп

Рго

Зег

А1а

Туг

Уа1

Туг

<31у

РЬе

С1и

ТЬг

Ьуз

290

295

300

А1а

Суз

С1у

Туг

(31у

О1у

Агд

Туг

Азп

Туг

Азп

Агд

Уа1

Суз

С1у

305

310

315

320

Азп

А1а

С1у

Ьеи

Суз

Азп

Уа1

ТЬг

А1а

Ьуз

А1а

Суз

АЗП

Рго

Зег

325

330

335

Туг

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

РЬе

Тгр

Азр

С1у

РЬе

Η18

Рго

Зег

С1и

Ьуз

340

345

350

С1у

Туг

Ьуз

А1а

Уа1

А1а

О1и

А1а

Ьеи

355

360

<210> 2 <211> 335 <212> РНТ <213> Аеготопаз ЪуйгорИНа

<40С

)> 2

Мек

Ьуз

Тгр

РЬе

Уа1

Суз

Ьеи

С1у

Ьеи

Уа1

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

1

5

10

15

О1п

А1а

Азр

Зег

Агд

Рго

А1а

РЬе

Зег

Агд

Не

Уа1

Мек

РЬе

С1у

20

25

30

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

ТЬг

С1у

Ьуз

Мек

Туг

Зег

Ьуз

Мек

Агд

С1у

Туг

35

40

45

Ьеи

Рго

Зег

Рго

Туг

С1и

С1у

Агд

РЬе

Зег

Азп

С1у

Рго

50

55

60

Уа1

Тгр

Ьеи

61и

<31п

Ьеи

ТЬг

Азп

С1и

РЬе

Рго

С1у

Ьеи

ТЬг

Не

А1а

65

70

75

80

Азп С1и А1а О1и <31у О1у Рго ТЬг А1а Уа1 А1а Туг Азп Ьуз 11е Зег 85 90 95

Тгр Азп Рго Ьуз Туг О1п Уа1 Не Азп Азп Ьеи Азр Туг С1и Уа1 ТЬг 100 105 110

С1п

РЬе

Ьеи 115

С1п

Ьуз

Азр

Зег

РЬе 120

Ьуз

Рго

Азр

Ьеи 125

Уа1

Не

Ьеи

Тгр

Уа1 130

<31у

А1а

Азп

Азр

Туг 135

Ьеи

А1а

Туг

С1у

Тгр 140

Азп

ТЬг

С1и

С1п

Азр 145

А1а

Ьуз

Агд

Уа1

Агд 150

Азр

А1а

Не

Зег

Азр 155

А1а

Азп

Агд

Мек 160

Уа1

Ьеи

Азп

е1у

А1а

ьуз

<31и

Не

Ьеи

РЬе

Азп

Ьеи

РГО

Азр

Ьеи

1

65

170

175

С1у

О1п

Азп

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

<31п

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

Зег

180

185

190

Ηίδ

Уа1

Зег

А1а

Туг

Н13

Азп

<31п

Ьеи

Азп

Ьеи

А1а

Агд

С1п

195

200

205

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

<31у

Мек

Уа1

Ьуз

Ьеи

РЬе

С1и

11е

Азр

Ьуз

С1п

РЬе

210

215

220

А1а

С1и

Мек

Ьеи

Агд

Азр

Рго

СЯп

Азп

РЬе

С1у

Ьеи

Зег

Азр

С1п

Агд

225

230

235

240

Азп

А1а

Суз

Туг

СЯу

Зег

Туг

Уа1

Тгр

Ьуз

Рго

РЬе

А1а

Зег

Агд

245

250

255

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Азр

Зег

СЯп

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

Азп

Рго

С1п

С1и

Агд

260

265

270

Ьеи

А1а

Не

А1а

СЯу

Азп

Рго

Ьеи

А1а

<31п

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

275

280

285

Мек

А1а

Агд

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьеи

Азп

Суз

С1и

СЯу

Ьуз

Мек

РЬе

290

295

300

Тгр

Азр

СЯп

Уа1

Ηίβ

Рго

ТЬг

Уа1

Н18

А1а

Ьеи

Зег

О1и

305

310

315

320

Рго

А1а

ТЬг

РЬе

11е

С1и

Зег

С1п

Туг

СЯи

РЬе

Ьеи

А1а

Н13

325 330 335 <210> 3 <211> 336 <212> РКТ <213> Аеготопаз за1топ1С1да <400> 3

Мек Ьуз Ьуз Тгр РЬе Уа1 Суз Ьеи Ьеи С1у Ьеи 11е А1а Ьеи ТЬг Уа1 15 1015

С1п А1а А1а Азр ТЬг Агд Рго А1а РЬе Зег Агд 11е Уа1 Мек РЬе С1у 20 2530

Азр Зег Ьеи Зег Азр ТЬг С1у Ьуз Мек Туг Зег Ьуз Мек Агд <31у Туг 35 4045

Ьеи Рго Зег Зег Рго Рго Туг Туг С1и <31у Агд РЬе Зег Азп С1у Рго 50 5560

Уа1 Тгр Ьеи С1и <31п Ьеи ТЬг Ьуз С1п РЬе Рго С1у Ьеи ТЬг 11е А1а 65 70 7580

Азп <31и А1а <31и С1у О1у А1а ТЬг А1а Уа1 А1а Туг Азп Ьуз 11е Зег 85 9095

Тгр Азп Рго Ьуз Туг СЯп Уа1 Туг Азп Азп Ьеи Азр Туг С1и Уа1 ТЬг 100 105110

С1п РЬе Ьеи (31п Ьуз Азр Зег РЬе Ьуз Рго Азр Азр Ьеи νβΐ 11е Ьеи 115 120125

Тгр Уа1 <31у А1а Азп Азр Туг Ьеи А1а Туг О1у Тгр Азп ТЬг С1и С1п 130 135140

Азр А1а Ьуз Агд Уа1 Агд Азр А1а 11е Зег Азр А1а А1а Азп АгдМек

145 150 155160

Уа1 Ьеи Азп О1у А1а Ьуз <31п 11е Ьеи Ьеи РЬе Азп Ьеи Рго Азр ьеи

119

165

170

175

С1у

С1п

Азп

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

С1п

Ьуз

УаХ

Уа1

С1и

А1а

Уа1

Зег

180

185

190

Н13

Уа1

Зег

А1а

Туг

Н13

Азп

Ьуз

Ьеи

ьеи

Ьеи

Азп

Ьеи

АХа

Агд

С1п

195

200

205

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

С1у

Мек

УаХ

Ьуз

Ьеи

РЬе

СХи

11е

Азр

Ьуз

СХп

РЬе

210

215

220

А1а

С1и

Мек

Ьеи

Агд

Азр

Рго

СХп

Азп

РЬе

СХу

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

СХи

225

230

235

240

Азп

Рго

Суз

Туг

Азр

СХу

С1у

Туг

УаХ

Тгр

Ьуз

Рго

РЬе

АХа

ТЬг

Агд

245

250

255

Зег

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Агд

С1п

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

Зег

Рго

С1п

С1и

Агд

260

265

270

Ьеи

А1а

Не

А1а

СХу

Азп

Рго

Ьеи

А1а

СХп

АХа

Уа1

А1а

Зег

Рго

275

280

285

Мек

А1а

Агд

Зег

А1а

Зег

Рго

Ьеи

Азп

Суз

С1и

С1у

Ьуз

Мек

РЬе

290

295

300

Тгр

Азр

С1п

УаХ

Ηίε

Рго

ТЬг

УаХ

ΗΪ3

АХа

А1а

Ьеи

Зег

<31и

305

310

315

320

Агд

А1а

АХа

ТЬг

РЬе

11е

С1и

ТЬг

СХп

Туг

СХи

РЬе

Ьеи

АХа

ΗΪ3

СХу

325

330

335

<210

> 4

<211

> 295

<212

:> РКТ

<213

> Зкгеркошусез сое11со1ог

<400

|> 4

Мек

Рго

Ьуз

Рго

АХа

Ьеи

Агд

Уа1

Мек

ТЬг

А1а

ТЬг

Уа1

АХа

А1а

1

5

10

15

Уа1

С1у

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи

ТЬг

Азр

А1а

ТЬг

А1а

Н13

А1а

20

25

30

Рго

АХа

СХп

А1а

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьеи

Азр

Туг

УаХ

А1а

Ьеи

СХу

Азр

Зег

35

40

45

Туг

Зег

А1а

СХу

Зег

С1у

УаХ

Ьеи

Рго

Уа1

Азр

Рго

А1а

Азп

Ьеи

50

55

60

Суз

Ьеи

Агд

Зег

ТЬг

А1а

Азп

Туг

Рго

ΗΪ3

УаХ

Не

АХа

Азр

ТЬг

65

70

75

80

СХу

А1а

Агд

ьеи

ТЬг

Азр

УаХ

ТЬг

Суз

СХу

АХа

СХп

ТЬг

А1а

Азр

85

90

95

РЬе

ТЬг

Агд

А1а

СХп

Туг

Рго

СХу

УаХ

АХа

Рго

СХп

Ьеи

Азр

АХа

Ьеи

100

105

но

С1у

ТЬг

С1у

ТЬг

Азр

ьеи

УаХ

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

СХу

Азп

Азр

Азп

115

120

125

Зег

ТЬг

РЬе

Не

Азп

А1а

Не

ТЬг

А1а

Суз

СХу

ТЬг

А1а

СХу

УаХ

Ьеи

130

135

140

Зег

С1у

Ьуз

С1у

Зег

Рго

Суз

Ьуз

Азр

Агд

Н13

С1у

ТЬг

Зег

РЬе

145

150

155

160

Азр

СХи

11е

С1и

АХа

Азп

ТЬг

Туг

Рго

АХа

Ьеи

Ьуз

СХи

А1а

Ьеи

165

170

175

Ьеи

С1у

УаХ

Агд

АХа

Агд

АХа

Рго

ΗΪ8

А1а

Агд

УаХ

А1а

АХа

Ьеи

С1у

180

185

190

Туг

Рго

Тгр

11е

ТЬг

Рго

А1а

ТЬг

АХа

Азр

Рго

Зег

Суз

РЬе

Ьеи

Ьуз

195

200

205

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

АХа

СХу

Азр

Уа1

Рго

Туг

Ьеи

Агд

А1а

11е

С1п

А1а

210

215

220

Н18

Ьеи

Азп

Азр

А1а

Уа1

Агд

А1а

АХа

С1и

ТЬг

СХу

А1а

ТЬг

225

230

235

240

Туг

УаХ

Азр

РЬе

Зег

С1у

УаХ

Зег

Азр

С1у

Н1з

Азр

А1а

Суз

С1и

АХа

245

250

255

Рго

С1у

ТЬг

Агд

Тгр

11е

СХи

Рго

Ьеи

РЬе

С1у

Н18

Зег

Ьеи

Уа1

260

265

270

Рго

Уа1

Н13

Рго

Азп

А1а

Ьеи

С1у

С1и

Агд

Мек

А1а

С1и

Ηίβ

ТЬг

275

280

285

Мек

Азр

УаХ

Ьеи

С1у

Ьеи

Азр

290 295 <210> 5 <211> 295 <212> РКТ

<213

ι> Зкгеркотусез сое!з

-союг

<40С

1> 5

Мек

Рго

Ьуз

Рго

А1а

Ьеи

Агд

УаХ

Мек

ТЬг

АХа

ТЬг Уа1 А1а

А1а

1

5

10

15

УаХ

СХу

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи

ТЬг

Азр

А1а

ТЬг

А1а Ηίβ А1а

А1а

20

25

30

Рго

А1а

<31п

А1а

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьеи

Азр

Туг

νβΐ

А1а

Ьеи С1у Азр

Зег

35

40

45

Туг

Зег

А1а

СХу

Зег

С1у

УаХ

Ьеи

Рго

Уа1

Азр

Рго

А1а Азп Ьеи

Ьеи

50

55

60

Суз

Ьеи

Агд

Зег

ТЬг

А1а

Азп

Туг

Рго

ΗΪ8

Уа1

11е

А1а Азр ТЬг

ТЬг

65

70

75

80

С1у

А1а

Агд

Ьеи

ТЬг

Азр

Уа1

ТЬг

Суз

СХу

А1а

АХа

С1п ТЬг А1а

Азр

85

90

95

РЬе

ТЬг

Агд

А1а

С1п

Туг

Рго

СХу

УаХ

А1а

Рго

С1п

Ьеи Азр А1а

Ьеи

100

105

110

С1у

ТЬг

С1у

ТЬг

Азр

Ьеи

УаХ

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

СХу

С1у Азп Азр

Азп

115

120

125

Зег

ТЬг

РЬе

11е

Азп

А1а

Не

ТЬг

АХа

Суз

СХу

ТЬг

АХа СХу УаХ

Ьеи

130

135

140

Зег

С1у

СХу

Ьуз

СХу

Зег

Рго

Суз

Ьуз

Азр

Агд

Ηίδ

С1у ТЬг Зег

РЬе

145

150

155

160

120

- 121 018153 аЬдссдаадс сЬдсссЬЬсд ссдбдЬсаЬд ассдсдасад ЬсдссдссдЬ сддсасдсбс60 дсссЬсддсс Ьсассдасдс сассдсссас дссдсдсссд сссаддссас ЬссдасссЬд120 дасЬасдЬсд сссбсддсда садсбасадс дссддсЬссд дсдЬссЬдсс сдЬсдасссс180 дссаассЬдс ЬсЬдЬсЬдсд сбсдасддсс аасЬассссс асдбсаЬсдс ддасасдасд240 ддсдсссдсс ЪсасддасдП сассЬдсддс дссдсдсада ссдссдасЪЪ сасдсдддсс300 садЬасссдд дсдЬсдсасс ссадЬЬддас дсдсЪсддса ссддсасдда ссЬддбсасд360 сЬсассабсд дсддсаасда саасадсасс ЬЬсаЬсаасд ссаЬсасддс сбдсддсасд420 дсдддбдЬсс Ъсадсддсдд саадддсадс сссЪдсаадд асаддсасдд сассСссЪЬс480 дасдасдада Ъсдаддссаа сасдЪасссс дсдсЬсаадд аддсдсЬдсЬ сддсдбссдс540 дссадддсЬс сссасдссад ддЬддсддсЬ сЬсддсбасс сдЪддабсас сссддссасс600 дссдасссдЬ ссЬдсЬЬссЬ даадсЬсссс сЪсдссдссд дЪдасдбдсс сбассЪдсдд660 дссаЬссадд сасассЬсаа сдасдсддЬс сддсдддссд ссдаддадас сддадссасс720

ЬасдЬддасЬ ЪсЬссддддЬ дЪссдасддс сасдасдссЬ дсдаддсссс сддсасссдс780

ЬддаЬсдаас сдсЬдсЬсЬЬ сдддсасадс сЪсдЪЪсссд Ьссассссаа сдсссЬдддс840 дадсддсдса Ьддссдадса сасдаЪддас дЪссЬсддсс ЬддасЬда888 <210> 10 <211> 888 <212> ΟΝΑ <213> ЗЬгерЬотусез соеИсо1ог <400> 10

ЪсадЬссадд ссдаддасдЪ ссаЬсдЬдЬд сбсддссаЪд сдссдсСсдс ссадддсдЬЪ60 ддддСддасд ддаасдаддс Ъдбдсссдаа дадсадсддЬ ЬсдаЬссадс дддЬдссддд120 ддссЪсдсад дсдСсдЪддс сдбсддасас сссддадаад ЬссасдЬадд еддсбссддЬ180 сСссСсддсд дсссдссдда ссдсдЬсдЬЬ даддЬдЬдсс ЬддаЬддссс дсаддЪаддд240 сасдЬсассд дсддсдаддд ддадсЬЬсад даадсаддас дддЬсддсдд ЬддссддддЪ300 даЬссасддд Ьадссдадад ссдссасссЪ здсдбдддда дсссбддсдс ддасдссдад360 садсдссЬсс ЬЬдадсдсдд ддЬасдЬдЬЬ ддссЬсдаЬс ЬсдЬсдЬсда аддаддЬдсс420 дЬдссЬдбсс ЬЬдсаддддс ЪдсссЬЪдсс дссдсЬдадд асасссдссд Ьдссдсаддс480 сдбдаЬддсд ЬЬдаЬдаадд СдсЪдЬЪдЪс дЪЪдссдссд аЬддЬдадсд Ьдассаддбс540 сдЬдссддЬд ссдадсдсдЬ ссаасЬдддд Ъдсдасдссс дддЪасЪддд сссдсдЬдаа600 дбсддсддЬс Ьдсдсддсдс сдсаддЬдас дЬссдЪдадд сдддсдсссд ЬсдЬдЬссдс660 даЬдасдрдд дддЬадЬЬдд ссдЪсдадсд садасададс аддЬЬддсдд ддЬсдасддд720 саддасдссд дадссддсдс ЬдЬадсЬдЬс дссдадддсд асдЬадЪсса дддЬсддадЬ780 ддссбдддсд ддсдсддсдЬ дддсддЬддс дЬсддЬдадд ссдадддсда дсдЬдссдас840 ддсддсдасЬ дбсдсддЬса Ьдасасддсд аадддсаддс ЬЬсддса!:888 <210> 11 <211> 717 <212> ϋΝΑ <213> ЗассЬаготусез οβΓβνίβίΒβ <400> 11 аЬддаЬЪасд адаадЬЬЬсЬ дЬЬаЬЬЬддд даЬЬссаЬЬа сбдааЬЬЬдс ЬЬЬЬааЬасЬ60 аддсссаПСд аадаЬддсаа адаЬсадЬаЬ дсЬсЬЬддад ссдсаЬЬадЬ саасдаабаЬ120 асдадааааа ЬддаЬаЬЬс!: Ьсааададдд ЬЬсааадддЬ асасЬЪсЬад абдддсдЬЬд180 ааааЬасЫзс сСдадаСЫЬ ааадсаЪдаа ЪссааЪаЬСд ЬсаЬддссас ааЬаЬЬЬЬЬд240 ддЬдссаасд аЬдсаЬдсЬс адсаддЬссс сааадЬдЬсс сссЬссссда аЬЬЬаЬсдаЬ300 ааЬаЬЬсдЬс аааЬддбаЬс ЬЬЬдаЬдаад ЬсЬЬассаЬа ЬссдЬссЬаЬ ЬаЬааЬадда360 ссддддсЬад ЬадаЬадада даадбдддаа ааадаааааЬ сЬдаадаааЬ адсЬсЬсдда420

ЬасЬЬссдЬа ссаасдадаа сЬЬЬдссаЫ: ЬаЬЬссдаЬд ссЬЬадсааа асЪадссааб480 даддааааад ЬЬсссЬЬсдЬ ддсЪЫздааЬ ааддсдЬЬЬс аасаддаадд ЬддЬдаЬдсЬ540

Ьддсаасаас ЪдсЬаасада ЪддасЬдсас ЬЬЬЬссддаа аадддЬасаа ааЬЬЬЬЬсаб600 дасдааЪЪаЪ ЬдааддЬсаЪ ЪдадасаЪЬс ЪасссссааЬ абсаЬсссаа ааасабдсад660

ЬасааасЬда аадаЬЬддад адаЬдЬдсЬа даЬдаЬддаЬ сЬаасаЬааЬ дЬсЬЬда717 <210> 12 <211> 347 <212> РЕТ <213> Ка1з£оп1а зо1апасеагит <400> 12

Мер Азп Ьеи Агд (31п Тгр Ме£ С1у А1а А1а ТЬг А1а А1а Ьеи А1а Ьеи

1

5

10

15

С1у

Ьеи

А1а

Суз

С1у

ТЬг

Азр

С1п

Зег

<31у

Азп

Рго

20

25

30

АЗП

Уа1

А1а

Ьуз

Ча1

С1п

Агд

МеЬ

Ча1

РЬе

С1у

Азр

Зег

Ьеи

Зег

35

40

45

Азр

11е

С1у

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Ча1

А1а

С1п

А1а

Ча1

О1у

С1у

О1у

Ьуз

50

55

60

РЬе

ТЬг

Азп

Рго

С1у

Рго

11е

Тгр

А1а

С1и

ТЬг

Уа1

А1а

С1п

65

70

75

80

Ьеи

01у

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Рго

А1а

Уа1

МеЬ

С1у

Туг

А1а

ТЬг

Зег

Уа1

85

90

95

51 п

Азп

Суз

Рго

Ьуз

А1а

С1у

Суз

РЬе

Азр

Туг

А1а

С1п

О1у

<31у

Зег

100

105

110

Агд

Уа1

ТЬг

Азр

Рго

Азп

С1у

11е

С1у

ΗΪ3

Азп

51у

А1а

<31у

А1а

115

120

125

Ьеи

ТЬг

Туг

Рго

Уа1

С1п

Ьеи

А1а

Азп

РЬе

Туг

А1а

Зег

130

135

140

Азп

ТЬг

РЬе

Азп

С1у

Азп

Азр

Уа1

РЬе

Ча1

Ьеи

А1а

С1у

145

150

155

160

Зег

Азп

Азр

Не

РЬе

Тгр

ТЬг

А1а

ТЬг

Зег

С1у

Зег

165

170

175

С1у

Уа1

ТЬг

Рго

А1а

11е

А1а

ТЬг

А1а

С1п

Уа1

<31п

А1а

ТЬг

180

185

190

Азр

Ьеи

Уа1

С1у

Туг

Уа1

Ьуз

Азр

Меб

11е

А1а

Ьуз

С1у

А1а

ТЬг

С1п

195 200 205

Уа1 Туг Уа1 РЬе Азп Ьеи Рго Азр Зег Зег Ьеи ТЬг Рго Азр С1у Уа1 210 215220

А1а Зег С1у ТЬг ТЬг С1у (31п А1а Ьеи Ьеи Ηίβ А1а Ьеи Ча1 С1уТЬг

225 230 235240

РЬе Азп ТЬг ТЬг Ьеи (Э1п Зег <31у Ьеи А1а О1у ТЬг Зег А1а АгдНе

245 250255

11е Азр РЬе Азп А1а С1п Ьеи ТЬг А1а А1а 11е С1п Азп С1у А1а Зег 260 265270

РЬе О1у РЬе А1а Азп ТЬг Зег А1а Агд А1а Суз Азр А1а ТЬг Ьуз 11е 275 280285

Азп А1а Ьеи Уа1 Рго Зег А1а С1у О1у Зег Зег Ьеи РЬе Суз Зег А1а 290 295300

Азп ТЬг Ьеи Уа1 А1а Зег С1у А1а Азр С1п Зег Туг Ьеи РЬе А1а Азр

305				310					315 320
С1у	νδΐ Н15	Рго	ТЬг	ТЬг	А1а	е1у	Ηί3	Агд	Ьеи 11е А1а Зег Азп Ча1
			325					330	335
Ьеи	А1а Агд	Ьеи	Ьеи	А1а	Азр	Азп	\7а1	А1а	ΗΪ8
		340					345

<210> 13 <211> 1044 <212> ΌΝΑ

- 122 018153 <213? Ка1з£оп1а зо1апасеагиш <400? 13 аЬдаассЬдс дЬсааЬддаЬ дддсдссдсс асддсЬдссс ЬЬдссЬЬддд сЬЪддссдсд60

Ьдсдддддсд дЬдддассда ссададсддс ааЪсссааЬд ЬсдссааддЬ дсадсдсаЬд120 дЬддЬдЬЬсд дсдасадссЬ дадсдаЬаЬс ддсассЬаса сссссдЬсдс дсаддсддЬд180 ддсддсддса адЬЬсассас саасссдддс ссдаЬсЬддд ссдадассдЬ ддссдсдсаа240 сЬдддсдЬда сдсЬсасдсс ддсддЬдаЬд ддсЬасдсса ссЬссдЬдса дааПдсссс300 ааддссддср дсЫсдасСа Ьдсдсадддс ддсЬсдсдсд ЬдассдаЪсс даасддсаЬс360 ддссасаасд дсддсдсддд ддсдсЬдасс ЬасссддЬЬс адсадсадсЬ сдссаасЬЪс420

Ьасдсддсса дсаасаасас аЬЬсаасддс ааЬаасдаЬд ЬсдЬсЬЬсдЬ дсЬддссддс480 адсаасдаса ШДсШЬд дассасСдсд дсддссасса дсддсЬссдд сдкдасдссс540 дссаЬЬдсса сддсссаддЬ дсадсаддсс дсдасддасс ЪддЬсддсЬа ЬдЬсааддас600 аЬдаЬсдсса адддрдсдас дсадд£с£ас дЬдЪЬсаасс Ьдсссдасад садссЬдасд660 ссддасддсд Ьддсаадсдд сасдассддс саддсдсЬдс ЬдсасдсдсЬ ддрдддсасд720

ЪЬсаасасда сдсЪдсааад сдддсЬддсс ддсассЬсдд сдсдсаЬсаЬ сдасЫсаас780 дсасаасЬда ссдсддсдаЬ ссадааСддс дссЬсдЬЬсд дсЬЬсдссаа сассадсдсс840 сдддссЬдсд асдссассаа даЬсааЬдсс сЬддЬдссда дсдссддсдд садсЬсдсЬд900

ЫсЪдсЬсдд ссаасасдск ддЪддсЬЬсс ддЪдсддасс ададсЪасск дЬЬсдссдас960 ддсдЬдсасс сдассасддс сддссаЬсдс сЬдаЪсдсса дсаасдЬдсЬ ддсдсдссЪд1020 сЬддсддаЬа асдЬсдсдса с£да1044 <210? 14 <211> 4 <212? РКТ <213? АгЫ£з.с1а1 Зедиепсе <220?

<223? ЗупЬЬеЫс рерЫбе <400? 14 <31у Азр Зег Ьеи <210? 15 <211> 5 <212? РКТ <213? АгЫ£1С1а1 Зедиепсе <220?

<223? ЗупЬЬеЫс рерЫбе <400? 15

С1у А1а Азп Азр Туг

5 <210> 16 <211> 5 <212? РКТ <213? АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220?

<223> ЗупЬЬеЬьс ρβρίίάβ <400> 16 <31у С1у Азп Азр А1а

5 <210? 17 <211> 4 <212? РКТ <213? АгЫ£1С1а1 Зедиепсе <220?

<223? ЗупЬЬеЫс рерЫбе <400? 17

С1у Азр Зег Туг <210? 18 <211? 5 <212? РКТ <213? АгЫ£1С1а1 Зедиепсе <220?

<223? ЗупЬЬеЫс рерЫбе <400? 18

С1у <31у Азп Азр Ьеи

5 <210? 19 <211? 5 <212? РКТ <213? АгЫ££с1а1 Зедиепсе <220?

<223? ЗупЬЬеЫс рерЫбе <220?

<221? νΑΚΙΑΝΤ <222? (5)..(5) <223? Хаа 15 а ЬубгорЬоЫс гезьбие зе1ес£еб £гот Ме£, Не, Ьеи, Уа1, А1а, С1у, Суз, ΗΪ3, Ьуз, Тгр, Туг ог РЬе <400? 19

С1у С1у Азп Азр Хаа

5 <210? 20 <211? 261 <212? РКТ <213? ЗЬгерЬотусез сое11со1ог

<400? 20

Туг 5

Уа1 А1а

Уа1 С1у Азр Зег РЬе ТЬг С1и (31у Уа1

Ме£ 1

11е <31у Зег

10

15

01у

Азр

Рго

С1у

Рго

Азр

(31у

А1а

РЬе

Уа1

С1у

Тгр

А1а

Азр

Агд

Ьеи

20

25

30

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

Азр

Агд

Рго

О1и

<31у

Азр

РЬе

ТЬг

Туг

ТЬг

35

40

45

Азп

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

О1у

Агд

Ьеи

Азр

<31п

11е

Уа1

А1а

С1и

С1п

50

55

60

Уа1

Рго

Агд

Уа1

<31у

Ьеи

А1а

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

РЬе

А1а

65

70

75

80

С1у

АЗП

Азр

11е

Агд

Рго

О1у

ТЬг

Азр

Рго

Азр

С1и

Уа1

А1а

85

90

95

С1и

Агд

РНе

(31и

Ьеи

А1а

Уа1

А1а

Ьеи

ТЬГ

А1а

С1у

ТЬг

100

105

110

Уа1

Ьеи

Уа1

ТЬг

С1у

РЬе

Азр

ТЬг

Агд

О1у

Уа1

Рго

Уа1

Ьеи

Ьуз

115

120

125

123

- 124 018153

<400> 24

СЯу Агд Азр СЯу 5

(Яу А1а

(Яу А1а Рго Рго ТЬг Ьуз Нхз

МеЬ 1

ТЬг

Агд

10

15

Агд

А1а

Ьеи

А1а

Не

Уа1

ТЬг

Ьеи

Не

Уа1

А1а

Не

Зег

А1а

20

25

30

А1а

Не

Туг

А1а

СЯу

А1а

Зег

А1а

Азр

СЯу

Зег

Агд

Азр

ΗΪ8

А1а

35

40

45

Ьеи

С1п

А1а

(Яу

СЯу

Агд

Ьеи

Рго

Агд

(Яу

Азр

А1а

Рго

А1а

Зег

50

55

60

ТЬг

СЯу

А1а

Тгр

Уа1

(Яу

А1а

Тгр

А1а

ТЬг

А1а

Рго

А1а

(Яи

65

70

75

80

Рго

СЯу

ТЬг

(Яи

ТЬг

(Яу

Ьеи

А1а

С1у

Агд

Зег

Уа1

Агд

Азп

Уа1

85

90

95

Уа1

ΗΪ3

ТЬг

Зег

Уа1

<31у

(Яу

ТЬг

(Яу

А1а

Агд

Не

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

100

105

110

Ьеи

Туг

СЯу

СЯп

Зег

Рго

Ьеи

ТЬг

Уа1

ТЬг

ΗΪ8

А1а

Зег

Не

А1а

Ьеи

115

120

125

А1а

СЯу

Рго

Азр

ТЬг

А1а

Не

А1а

Азр

ТЬг

МеЬ

Агд

130

135

140

Ьеи

ТЬг

РЬе

(Яу

Зег

А1а

Агд

Уа1

Не

Рго

А1а

СЯу

(Яу

(Яп

145

150

155

160

Уа1

МеЬ

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Агд

Ьеи

А1а

Не

Рго

Туг

(Яу

А1а

Азп

Уа1

165

170

175

Ьеи

Уа1

ТЬг

Туг

Зег

Рго

Не

Рго

Зег

(Яу

Рго

Уа1

ТЬг

Туг

Н13

180

185

190

Рго

Θΐη

А1а

Агд

СЯп

ТЬг

Зег

Туг

Ьеи

А1а

Азр

(Яу

Азр

Агд

ТЬг

А1а

195

200

205

Азр

Уа1

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

Туг

ТЬг

Рго

ТЬг

Рго

Туг

Тгр

Агд

Туг

210

215

220

Ьеи

ТЬг

А1а

Ьеи

Азр

Уа1

Ьеи

Зег

Н13

СЯи

А1а

Азр

СЯу

ТЬг

Уа1

225

230

235

240

А1а

РЬе

О1у

Азр

Зег

Не

ТЬг

Азр

(Яу

А1а

Агд

Зег

СЯп

Зег

Азр

А1а

245

250

255

Азп

Н13

Агд

Тгр

ТЬг

Азр

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

ΗΪ8

СЯи

А1а

260

265

270

О1у

Азр

СЯу

Агд

Азр

ТЬг

Рго

Агд

Туг

Зег

Уа1

Азп

(Яи

СЯу

Не

275

280

285

5ег

О1у

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

Зег

Агд

Рго

(Яу

Агд

Рго

А1а

Азр

Азп

290

295

300

Рго

Зег

61у

Ьеи

Зег

Агд

РЬе

(Яп

Агд

Азр

Уа1

Ьеи

СЯи

Агд

ТЬг

Азп

305

310

315

320

Уа1

Ьуз

А1а

Уа1

Ьеи

(Яу

Уа1

Азп

Азр

Уа1

Ьеи

Азп

Зег

325

330

335

Рго

С1и

Ьеи

А1а

Азр

Агд

Азр

А1а

Не

Ьеи

ТЬг

С1у

Ьеи

Агд

ТЬг

Ьеи

340

345

350

Уа1

Азр

Агд

А1а

Н13

А1а

Агд

(Яу

Ьеи

Агд

Уа1

(Яу

А1а

ТЬг

Не

355

360

365

ТИг

Рго

РИе

СЯу

Туг

СЯу

Туг

ТИг

СЯи

А1а

Агд

СЯи

ТНг

Меб

370

375

380

Агд

е1п

<31и

Уа1

Азп

О1и

СЯи

11е

Агд

Зег

СЯу

Агд

Уа1

РНе

Азр

ТНг

385

390

395

400

Уа1

Азр

РНе

Азр

Ьуз

А1а

Ьеи

Агд

Азр

Рго

Туг

Азр

Рго

Агд

405

410

415

Мее

Агд

Зег

Азр

Туг

Азр

Зег

СЯу

Азр

ΗΪ3

Ьеи

Нхз

Рго

СЯу

Азр

Ьуз

420

425

430

О1у

Туг

А1а

Агд

Мее

СЯу

А1а

Уа1

11е

Азр

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьуз

СЯу

435

440

445

А1а

Рго

Уа1

Ьуз

А1а

450 <210> 25 <211> 1365 <212> ΟΝΑ <213 > зегерНотусез соеИсо1ог <400> 25 аНдасссддд дНсдедасдд дддедсдддд дсдсссссса ссаадсассд едсссНдсес60 дсддсдаЬсд НсасссНдае адеддсдаЬс Нссдсддсса еабасдссдд адсдессдсд120 дасдасддса дсадддасса сдсдсЬдсад дссддаддсс дСсНсссасд аддадасдсс180 дсссссдсде ссассддедс сНдддЬдддс дсседддсса ссдсассддс сдсддссдад240 ссдддсассд адасдассдд ссНддсдддс сдсессдбдс дсаасдНсде дсасассНсд300 дбсддсддса ссддсдсдсд дабсасссНс есдаассбде асдддсадбс дссдсбдасс360 десасасасд ссесдаНсдс сседдссдсс дддсссдаса ссдссдссдс даесдссдас420 ассаНдсдсс ддсСсассее сддсддсадс дсссдддбда Ъсаесссддс дддсддссад480 дЬдаЬдадсд асассдсссд ссесдссаНс сссСасдддд сдаасдессе ддрсассасд540 еасессссса ЬсссдНссдд дссддбдасс НассаНссдс аддсссддса дассадсеас600 сНддссдасд дсдассдсас ддсддасдСс ассдссдЬсд сдбасассас ссссасдссс660 еасНддсдсе ассбдассдс ссбсдасдед седадссасд аддссдасдд сасддНсдед720 дсдеесддсд асбссаЬсас сдасддсдсс сдсЬсдсада дсдасдссаа ссассдсбдд780 ассдасдесс есдссдсасд сседсасдад дсддсдддсд асддссддда сасдссссдс840 еасадсдесд есаасдаддд саесадсддс аассддсбсс едассадсад дссддддсдд900 ссддссдаса асссдадсдд асбдадссдд еессадсддд асдНдседда асдсассаас960 дЬсааддссд ЬсдЬсдЬсдЬ ссНсддсдНс аасдасдНсс Ьдаасадссс ддаасесдсс1020 дассдсдасд ссаЬссЬдас сддссбдсдс асссесдбсд ассдддсдса сдсссдддда1080 седсдддНсд есддсдссас даесасдссд еесддсддсе асддсддсЬа сассдаддсс1140 сдсдадасда едсддсадда ддесаасдад дадаессдсе ссддссддде сеесдасасд1200 дНсдЬсдасе Нсдасааддс ссНдсдсдас ссдеасдасс сдсдссддае дсдсНссдас1260 еасдасадсд дсдассассе дсассссддс дасаадддде асдсдсдсае дддсдсддес1320 аНсдассЬдд ссдсдсНдаа дддсдсддсд ссддНсаадд сдбад1365 <210> 26 <211> 340 <212> РЕТ <213> Зегереотусез сое11со1ог <400> 26

МеЬ ТЬг Зег МеЬ Зег Агд А1а Агд Уа1 А1а Агд Агд 1510

А1а А1а Туг С1у С1у С1у С1у Не СЯу Ьеи А1а С1у 2025

СЯу Ьеи Уа1 Уа1 А1а С1и Уа1 СЯп Ьеи А1а Агд Агд 3540

С1у ТЬг Рго ТЬг Агд Уа1 Рго Азп А1а С1п С1у Ьеи

11е А1а А1а СЯу

А1а А1а А1а Уа1

Агд Уа1 СЯу Уа1 45

Туг С1у СЯу ТЬг

125

50

55

60

Ьеи

Рго

ТЬг

А1а

С1у

Азр

Рго

Ьеи

Агд

Ьеи

МеЬ

Ьеи

СЛу

Азр

65

70

75

80

Зег

ТЬг

А1а

СИу

<31п

СЛу

Уа1

ΗΪ3

Агд

А1а

<31у

<31п

ТЬГ

Рго

СЛу

85

90

95

А1а

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Ьеи

А1а

Уа1

А1а

С1и

Агд

Рго

Уа1

Агд

100

105

но

Ьеи

С1у

Зег

Уа1

А1а

СИп

Рго

С1у

А1а

Суз

Зег

Азр

Ьеи

Азр

Агд

115

120

125

С1п

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

С1и

Рго

Азр

Агд

Уа1

РГО

Азр

11е

Суз

130

135

140

Уа1

11е

МеЬ

Уа1

С1у

А1а

Азп

Азр

Уа1

ТЬг

Н13

Агд

меЬ

Рго

А1а

ТЬг

145

150

155

160

Агд

Зег

Уа1

Агд

ΗΪ8

Ьеи

Зег

А1а

Уа1

Агд

Ьеи

Агд

ТЬг

А1а

165

170

175

С1у

А1а

<31и

Уа1

СЛу

ТЬг

Суз

Рго

Азр

Ьеи

С1у

ТЬг

11е

С1и

180

185

190

Агд

Уа1

Агд

<31п

Рго

Ьеи

Агд

Тгр

Ьеи

А1а

Агд

А1а

Зег

Агд

С1п

195

200

205

Ьеи

А1а

С1п

ТЬг

11е

С1у

А1а

Уа1

СЛи

С1п

С1у

О1у

Агд

ТЬг

210

215

220

Уа1

Зег

Ьеи

<31у

Азр

Ьеи

С1у

РГО

С1и

РЬе

А1а

<31п

АЗП

Рго

Агд

225

230

235

240

С1и

Ьеи

РЬе

С1у

Рго

Азр

Азп

Туг

ΗΪ8

Рго

Зег

А1а

С1и

С1у

Туг

А1а

245

250

255

ТЬг

А1а

МеЬ

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

Зег

Уа1

Суз

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи

260

265

270

Тгр

Рго

А1а

Азр

01и

<31и

ΗΪ3

Рго

Азр

А1а

Ьеи

Агд

О1и

СЛу

РЬе

275

280

285

Ьеи

Рго

Уа1

А1а

Агд

А1а

С1и

А1а

Зег

<31и

А1а

С1у

ТЬг

290

295

300

С1и

Уа1

А1а

МеЬ

Рго

ТЬг

С1у

Рго

Агд

СЛу

Рго

Тгр

А1а

Ьеи

305

310

315

320

Ьеи

Ьуз

Агд

Уа1

Зег

<31и

А1а

С1и

Рго

Зег

325

330

335

Рго Зег СИу Уа1

340 <210> 27 <211> 1023 <212> ϋΝΑ <213> ЗЬгерЬотусез сое11со1ог <400> 27 аЬдасдадса ддсддсддса сЬддссадас Ьасддсддса Ьссасддссд

ЬдЬсдадддс ЬсддссЬддс дсадддЬддд сссЬдсссас ссдддсаддд дадддЬддсд дддадсддсд ддЬдддсасд ддссддсдас сдЬдсассдд сддсддаЬсд дсддЬсддЬс ссдасссддд ссдссдсЬдс дссдддсада сддссддсдс ЬддЬддЬддс Ьдссдаасдс ддсЬдаЬдаЬ сдссдддсдс ддсдЬасддс 60 сдаддЬдсад 120 дсадддасЬд 180 дсЬдддсдас 240 дсЬдсЬддсд 300

ЬссдддсЬсд сддсддЬддс ддадсддссд дЬдсддсЬдд дсдЬдсЬсдд асдассЬдда ссддсаддЬд дсдсЬддЬдс сссдасаЬсЬ дсдЬдаЬсаЬ ддЬсддсдсс аасдасдЬса сдсЬсддЬдс ддсассЬдЬс сЬсддсддЬа сддсддсЬдс дЬддЬсддса ссЬдЬссдда ссЬдддсасд аЬсдадсддд сЬддсссддс дддссЬсасд дсадсЬсдсд дсддсасада ддсдддсдса сддЬдЬсдсЬ дддсдассЬд сЬдддЬссдд дадсЬсЬЬсд дссссдасаа сЬассасссс Ьссдссдадд дсддЬасЬдс ссЬсддЬдЬд сдссдсдсЬс ддссЬдЬддс дасдсдсЬдс дссдсдаддд сЬЬссЬдссд дЬддсдсдсд даддсдддЬа сддаддЬсдс сдссдссаЬд ссЬасддддс сЬдаадсдсс ддадасддсд ЬсдддЬдЬсд даддсддаас ддЬсддЬсдс Ьсдссдадсс сссассддаЬ дсасддссдд Ьдсддсадсс ссаЬсддсдс адЬЬсдсдса ддЬасдссас сддссдасда сддсддсдда сЬсдддддсс сдЬссадссс ссадссдддд ддассдддЬд дссддсдасс ЬдсддаддЬд дсЬдсдсЬдд сдЬсдадсад даасссдсдд ддссдсдаЬд ддадсасссд ддсддсдЬсс сЬдддсдсЬд дЬссддсдЬЬ

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1023 <210> 28 <211> 305 <212> РКТ <213> ЗЬгерЬотусез соеИсо1ог <400> 28

МеЬ

С1у

Агд

СЛу

ТЬг

Азр

С1п

Агд

ТЬг

Агд

Туг

С1у

Агд

А1а

¹

5

10

15

Агд

Уа1

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

ТЬг

А1а

Уа1

Ьеи

С1у

Уа1

<31у

Уа1

20

25

30

А1а

С1у

Суз

Азр

Зег

Уа1

б1у

С1у

Азр

Зег

Рго

А1а

Рго

Зег

С1у

Зег

35

40

45

Рго

Зег

Ьуз

Агд

ТЬг

Агд

ТЬг

А1а

Рго

А1а

Тгр

Азр

ТЬг

Зег

Рго

А1а

50

55

60

Зег

Уа1

А1а

Уа1

С1у

Азр

Зег

11е

ТЬг

Агд

О1у

РЬе

Азр

А1а

Суз

65

70

75

80

А1а Уа1 Ьеи Зег Азр Суз Рго С1и Уа1 Зег Тгр А1а ТЬг <31у Зег Зег 85 9095

А1а Ьуз Уа1 Азр Зег Ьеи А1а Уа1 Агд Ьеи Ьеи С1у Ьуз А1а Азр А1а 100 105110

А1а С1и ΗΪ8 Зег Тгр Азп Туг А1а Уа1 ТЬг С1у А1а Агд МеЬ А1а Азр 115 120125

Ьеи ТЬг А1а С1п Уа1 ТЬг Агд А1а А1а С1п Агд С1и Рго С1и Ьеи Уа1 130 135140

А1а Уа1 Мер А1а С1у А1а Азп Азр А1а Суз Агд Зег ТЬг ТЬг ЗегА1а

145 150 155160

МеС ТЬг Рго Уа1 А1а Азр РЬе Агд А1а С1п РЬе С1и С1и А1а МеЬА1а

165 170175

ТЬг Ьеи Агд Ьуз Ьуз Ьеи Рго Ьуз А1а С1п Уа1 Туг Уа1 Зег Зег Не 180 185190

Рго Азр Ьеи Ьуз Агд Ьеи Тгр Зег С1п С1у Агд ТЬг Азп Рго Ьеи <31у 195 200205

Ьуз С1п Уа1 Тгр Ьуз Ьеи С1у Ьеи Суз Рго Зег МеЬ Ьеи С1у Азр А1а 210 215220

Азр Зег Ьеи Азр Зег А1а А1а ТЬг Ьеи Агд Агд Азп ТЬг Уа1 АгдАзр

225 230 235240

Агд Уа1 А1а Азр Туг Азп С1и Уа1 Ьеи Агд О1и Уа1 Суз А1а ЬузАзр

245 250255

- 126 018153

- 127 018153

Ьеи Рго Зег Зег Рго Рго Туг Туг С1и <31у Агд РЬе Зег Азп С31у Рго 50 5560

Уа1 Тгр Ьеи С1и <31п Ьеи ТЪг Ьуз С1п РЬе Рго С1у Ьеи ТЬг Не А1а

70 7580

Азп <31и А1а <31и С1у С1у А1а ТЪг А1а Уа1 А1а Туг Азп Ьуз 11е Зег 85 9095

Тгр Азп Рго Ьуз Туг С1п Уа1 11е Азп Азп Ьеи Азр Туг <31и Уа1 ТЬг 100 105110

С1п РЬе Ьеи С1п Ьуз Азр Зег РЬе Ьуз Рго Азр Азр Ьеи Уа1 11е Ьеи 115 120125

Тгр Уа1 С1у А1а Азп Азр Туг Ьеи А1а Туг СЯу Тгр Азп ТЬг С1и С1п 130 135140

Азр А1а Ьуз Агд Уа1 Агд Азр А1а 11е Зег Азр А1а А1а Азп АгдМеЬ

145 150 155160

Уа1 Ьеи Азп С1у А1а Ьуз С1п 11е Ьеи Ьеи РЬе Азп Ьеи Рго АзрЬеи

165 170175

С1у С1п Азп Рго Зег А1а Агд Зег С1п Ьуз Уа1 Уа1 С1и А1а Уа1 Зег 180 185190

Н1з Уа1 Зег А1а Туг Н1з Азп С1п Ьеи Ьеи Ьеи Азп Ьеи А1а Агд С1п 195 200205

Ьеи А1а Рго ТЬг С1у МеЬ Уа1 Ьуз Ьеи РЬе <31и 11е Азр Ьуз С1п РЬе 210 215220

А1а С1и МеЬ Ьеи Агд Азр Рго С1п Азп РЬе <31у Ьеи Зег Азр Уа1<31и

225 230 235240

Азп Рго Суз Туг Азр С1у СЯу Туг Уа1 Тгр Ьуз Рго РЬе А1а ТЬгАгд

245 250255

Зег Уа1 Зег ТЬг Азр Агд С1п Ьеи Зег А1а РЬе Зег Рго С1п С1и Агд 260 265270

Ьеи А1а 11е А1а С1у Азп Рго Ьеи Ьеи А1а СЯп А1а Уа1 А1а Зег Рго 275 280285

МеЬ А1а Агд Агд Зег А1а Зег Рго Ьеи Азп Суз <31и С1у Ьуз МеЬ РЬе 290 295300

Тгр Азр С1п Уа1 Н1з Рго ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Шз А1а А1а Ьеи Зег СЯи 305 310 315320

Агд А1а А1а ТЬг РЬе 11е А1а Азп С1п Туг С1и РЬе Ьеи А1а Шз

325 330335 <210> 33 <211> 1008 <212> ΏΝΑ <213> Аеготопаз ЬуЯгорЬНа <400> 33 аЬдааааааЬ ддЬЬЬдЬдЬд ЬЬЬаЬЬддда ЬЬддЬсдсдс ЬдасадЬЬса ддсадссдас60 адЬсдссссд ссЬЬЬЬсссд даЬсдЬдаЬд ЬЬсддсдаса дссЬсЬссда Ьассддсааа120 аЬдЬасадса адаЬдсдсдд ЬЬассЬсссс Ьссадсссдс ссЬасЬаЬда дддссдЬЬЬс180

Ьссаасддас ссдЬсЬддсЬ ддадсадсЬд ассааасадЬ ЬсссдддЬсЬ дассаЬсдсс240 аасдаадсдд ааддсддЬдс сасЬдссдЬд дсЬЬасааса адаЬсЬссЬд дааЬсссаад300

ЬаЬсаддЬса ЬсаасаассЬ ддасЬасдад дЬсасссадЬ ЬсЬЬдсадаа адасадсЬЬс360 аадссддасд аЬсЬддЬдаЬ ссЬсЬдддЬс ддЬдссааЬд асЬаЬсЬддс сЬаЬддсЬдд420 аасасддадс аддаЬдссаа дсдддЬЬсдс даЬдссаЬса дсдаЬдсддс саассдсаЬд480 дЬасЬдаасд дЬдссаадса даЬасЬдсЬд ЬЬсаассЬдс сддаЬсЬддд ссадаасссд540

ЬсадсЬсдса дЬсадааддЬ ддЬсдаддсд дЬсадссаЬд ЬсЬссдссЬа Ьсасаассад600 сЬдсЬдсЬда ассЬддсасд ссадсЬддсс сссассддса ЬддЬааадсЬ дЬЬсдадаЬс660 дасаадсааЬ ЬЬдссдадаЬ дсЬдсдЬдаЬ ссдсадаасЬ ЬсддссЬдад сдасдЬсдад720 аассссЬдсЬ асдасддсдд сЬаЬдЬдЬдд аадссдЬЬЬд ссасссдсад сдЬсадсасс780 дассдссадс ЬсЬссдссЬЬ садЬссдсад даасдссЬсд ссаЬсдссдд саасссдсЬд840 сЬддсасадд ссдЬЬдссад ЬссЬаЬддсс сдссдсадсд ссадсссссЬ саасЬдЬдад900 ддсаадаЬдЬ ЬсЬдддаЬса ддЬасасссд ассасЬдЬсд Ьдсасдсадс ссЬдадсдад960 сдсдссдсса ссЬЬсаЬсдс даассадЬас дадЬЬссЬсд сссасЬда1008 <210> 34 <211> 336 <212> РКТ

<213

> Ае

^;Готс

за1гг

юп1с

ЛЯа

<400

> 34

МеЬ

Ьуз

Тгр

РЬе

Уа1

Суз

Ьеи

С1у

Ьеи

Не

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

5

10

15

СЯп

А1а

Азр

ТЬг

Агд

Рго

А1а

РЬе

Зег

Агд

Не

Уа1

МеЬ

РЬе

С1у

20

25

30

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

ТЬг

СЯу

Ьуз

МеЬ

Туг

Зег

Ьуз

МеЬ

Агд

СЯу

Туг

35

40

45

Ьеи

Рго

Зег

Рго

Туг

С1и

СЯу

Агд

РЬе

Зег

Азп

О1у

Рго

50

55

60

Уа1

Тгр

Ьеи

О1и

СЯп

Ьеи

ТЬг

Ьуз

СЯп

РЬе

Рго

СЯу

Ьеи

ТЬг

Не

А1а

65

70

75

80

Азп

С1и

А1а

С1и

СЯу

С1у

А1а

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

Туг

Азп

Ьуз

Не

Зег

85

90

95

Тгр

Азп

Рго

Ьуз

Туг

С1п

Уа1

Не

Азп

Ьеи

Азр

Туг

С1и

Уа1

ТЬг

100

105

110

С1п

РЬе

Ьеи

С1п

Ьуз

Азр

Зег

РЬе

Ьуз

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

Не

Ьеи

115

120

125

Тгр

Уа1

СЯу

А1а

Азп

Азр

Туг

Ьеи

А1а

Туг

СЯу

Тгр

Азп

ТЬг

О1и

С1п

130

135

140

Азр

А1а

Ьуз

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

Не

Зег

Азр

А1а

Азп

Агд

МеЬ

145

150

155

160

Уа1

Ьеи

Азп

СЯу

А1а

Ьуз

СЯп

Не

Ьеи

РЬе

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

165

170

175

СЯу

СЯп

Азп

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

СЯп

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

Уа1

Зег

180

185

190

Ηίβ

Уа1

Зег

А1а

Туг

ΗΪ3

Азп

Ьуз

Ьеи

АЗП

Ьеи

А1а

Агд

СЯп

195

200

205

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

СЯу

МеЬ

Уа1

Ьуз

Ьеи

РЬе

С1и

Не

Азр

Ьуз

СЯп

РЬе

210

215

220

А1а

О1и

МеЬ

Ьеи

Агд

Азр

Рго

СЯп

Азп

РЬе

С1у

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

С1и

225

230

235

240

Азп

РГО

Суз

Туг

Азр

С1у

СЯу

Туг

Уа1

Тгр

Ьуз

Рго

РЬе

А1а

ТЬг

Агд

245

250

255

Зег

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Агд

СЯп

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

Зег

Рго

СЯп

СЯи

Агд

128

- 129 018153 <400> 38 адсаЪаСдаа ааааЪддЕРР дСССдЬСЪаЕ Едддд :210:

:211:

:212:

:213:

ΏΝΑ

Аг£1£1С1а1 Зедиепсе :220:

:223:

ОИдопис1еоЫде ргттег <400:

РЬддаЪссда аЪЪсаРсааЕ ддРдаЪддЕд аЪддЬдддс :210:

:211:

:212:

:213:

:220:

:223:

ОИдопис1еоЫ0е рггте] :210:

:211:

:212:

:213:

ϋΝΑ

АгЫ£1с1а1 Зедиепсе :220:

:223:

0Идопис1еоЫ(1е ргттег <400:

сЬадРРаРЪд сЪсадсдд :210:

:211:

:212:

:213:

ΟΝΑ

Аг£1£1С1а1 Зедиепсе :220>

:223> ОИдописГеоЫйе ргттег <400> 42 дРсаРаРдаа ааааРддРРЕ дРдРдРЕРаР РдддаСРддР с :210:

:211:

:212:

:213:

ΏΝΑ

АгЫ£1с1а1 Зедиепсе :220:

:223:

ОИдопис1еоЫде ргхте!

<400:

аЬддРдардд Ъдддсдадда асЬсдрасЪд :220>

:223> 0Идопис1еоЫ0е ргитег <400> 44 д£са£а£даа ааааСддСЬС дРдЪдЕЪЪаР ЪдддаРРддР с :210:

:211:

:212:

:213:

ΟΝΑ

Аг£1£1с1а1 Зедиепсе :220:

:223:

011допис1еоР1с1е ргттег <400:

РРддаРссда аРРсаРсааР ддРдаЪддРд аРддРдддс :210:

:211:

:212:

:213:

ϋΝΑ

Аг£1£1с1а1 Зедиепсе :220:

:223:

011допис1еоР10е ргътег <400:

аЬдссаСддс сдасадссдр сссдсс :210:

:211:

:212:

:213:

ϋΝΑ

Аг£1£1С1а1 Зедиепсе :220:

:223:

ОИдописХеоСШе рггтег ;7

РЬддаРссда аРРсаРсааР ддЬдаРд <400:

:210:

:211:

:212:

:213:

ΏΝΑ

ΑΓΡίΕίσίβΙ Зедиепсе :220:

:223:

011допис1еоЬ1с1е рггтег <400:

ЫдсРадсдс сдасадссдр сссдсс :210:

:211:

:212:

:213:

ϋΝΑ

Аг1::1£1с1а1 Зедиепсе :220:

:223:

ОИдопис1ео(:1с1е ргттег :400:

ЕЕддаЬссда аРРсаРсааР ддЕдаРд

130 018153 <210> 50 <211> 26 <212> ϋΝΑ <213> АгЫНЫа! Зедиепсе <220>

<223> ОИдопиЫеокЫе рЫтег <400> 50 ккдссакддс сдасасксдс сссдсс <210> 51 <211> 27 <212> ϋΝΑ <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ОЫдопис1еоЫс1е ргхтег <400> 51 ккддакссда акксаксаак ддкдакд <210> 52 <211> 26 <212> ΏΝΑ <213> АгЫНЫа! Зедиепсе <220>

<223> ОИдопис1еоЫ(1е рптег <400> 52 ккдскадсдс сдасасксдс сссдсс <210> 53 <211> 27 <212> ϋΝΑ <213> Агк1£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> О11допис1еок1с1е рЫтег <400> 53 ккддакссда акксаксаак ддкдакд <210> 54 <211> 1047 <212> ϋΝΑ <213> Аеготопаз ЬубгорЫ1а <400> 54

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840 акдЬккаадк ккааааадаа ккксккадкк ддаккаксдд садскккаак дадкаккадс ккдкккксдд саассдсскс кдсадскадс дссдасадсс дксссдсскк кксссддакс дкдакдкксд дсдасадсск скссдакасс ддсаааакдк асадсаадак дсдсддккас скссссксса дсссдссска скакдадддс сдккксксса асддасссдк скддскддад садскдасса аасадккссс дддкскдасс аксдссаасд аадсддаадд сддкдссаск дссдкддскк асаасаадак сксскддаак сссаадкакс аддксаксаа саасскддас касдаддкса сссадккскк дсадааадас адскксаадс сддасдакск ддкдаксскс кдддксддкд ссаакдаска кскддсскак ддскддааса сддадсадда кдссаадсдд дкксдсдакд ссаксадсда кдсддссаас сдсакддкас кдаасддкдс саадсадака скдскдккса асскдссдда кскдддссад аасссдксад сксдсадкса дааддкддкс даддсддкса дссакдкскс сдсскаксас аассадскдс кдскдаасск ддсасдссад скддссссса ссддсакддк ааадс£д££с дадаксдаса адсаакккдс сдадакдскд сдкдакссдс адааскксдд сскдадсдас дксдадаасс сскдскасда сддсддскак дкдкддаадс сдкккдссас ссдсадсдкс адсассдасс дссадскскс сдсскксадк

ссдсаддаас дссксдссак сдссддсаас ссдскдскдд сасаддссдк кдссадксск 900 акддсссдсс дсадсдссад сссссксаас кдкдадддса адакдккскд ддаксаддка 960 сасссдасса скдксдкдса сдсадссскд адсдадсдсд ссдссасскк саксдсдаас 1020
садкасдадк кссксдссса скдакда	1047
<210> <211>	55 8
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1С1а1 Зедиепсе
<220> <223>	В1оск 1 СОЗХ Ыоск
<220> <221>	νΑΚΙΑΝΤ
<222>	(1)..(4)
<223>	Хаа 1з а ЬубгорЬоЫс гезббие зе!ескеб £гот Мек,	Не, Ьеи,	Уа1, А1а,
	<31у, Суз, ΗΪ8, Ьуз, Тгр, Туг ог РЬе
<220> <221>	νΑΚΙΑΝΤ
<222>	(8) . . (8)
<223>	Хаа ιέ а ЬубгорЬоЫс гезШие веТескеб £гот Мек,	Не, Ьеи,	Υ31, А1а,

С1у, Суз, Ηί3, Ьуз, Тгр, Туг ог РЬе <400>55

Хаа Хаа Хаа Хаа <31у Азр Зег Хаа <210>56 <211> 6 <212> РКТ <213> Агк1£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> В1оск 2 ΟΑΝϋΥ Ыоск <220>

<221> νΑΚΙΑΝΤ <222> (1)..(1) <223 > Хаа 18 а ЬубгорЬоЫс гезЫие зе1ескеб £гот Мек, Не, Ьеи, Vа1, А1а, С1у, Суз, Н1з, Ьуз, Тгр, Туг ог РЬе <220>

<221> νΑΚΙΑΝΤ <222> (3)..(3) <223> Хаа 13 а ЬубгорЬоЫс гезЫие зе1ескеб £гот Мек, Не, Ьеи, Уа1, А1а, С1у, Суз, Н15, Ьуз, Тгр, Туг ог РЬе <220>

<221> νΑΚΙΑΝΤ <222> (6)..(6) <223> Хаа 1з а ЬубгорЬоЫс гевхбие ве1ескеб. £гот Мек, 11е, Ьеи, νβΐ, А1а, С1у, Суз, ΗΪ3, Ьуз, Тгр, Туг ог РЬе <400> 56

Хаа С1у Хаа Азп Азр Хаа

5 <210> 57 <211> 18

- 131 018153

АгЪ111С1а1 Зестиепсе

011допис1еоЪ1ае рпшег

А.г£1£1С1а.1 Зестиепсе

Э11допис1ео£1ае рпшег

132 018153

100 105 110

С1у

А1а

Азп 115

Азр Туг Ьеи А1а Туг СХу Тгр Азп ТНг СХи СХп Азр А1а

120

125

Ьуз

Агд

УаХ

Агд

Азр

А1а

11е

Зег

Азр

АХа

Азп

Агд

МеС

Уа1

Ьеи

130

135

140

Азп

СХу

АХа

Ьуз

СХп

11е

Ьеи

РНе

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

СХу

С1п

145

150

155

160

АЗП

Рго

Зег

АХа

Агд

Зег

СХп

Ьуз

УаХ

СХи

А1а

УаХ

Зег

ΗΪ3

УаХ

165

170

175

5ег

А1а

Туг

Ηίβ

Азп

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьеи

АХа

Агд

СХп

Ьеи

АХа

180

185

190

Рго

ТИг

СХу

Мер

УаХ

Ьуз

Ьеи

РНе

СХи

1Хе

Азр

Ьуз

СХп

РНе

А1а

СХи

195

200

205

МеС

Ьеи

Агд

Азр

РГО

СХп

Азп

РНе

СХу

Ьеи

Зег

Азр

УаХ

СХи

Азп

Рго

210

215

220

Суз

Туг

Азр

СХу

СЗХу

Туг

УаХ

Тгр

Ьуз

Рго

РНе

А1а

ТИг

Агд

Зег

УаХ

225

230

235

240

Зег

ТИг

Азр

Агд

(31п

Ьеи

Зег

А1а

РНе

Зег

Рго

С1п

СХи

Агд

Ьеи

АХа

245

250

255

Не

А1а

СХу

Азп

Рго

Ьеи

А1а

С1п

А1а

УаХ

А1а

Зег

Рго

МеС

АХа

260

265

270

Агд

Зег

А1а

Зег

Рго

Ьеи

Азп

Суз

СХи

СХу

Ьуз

МеС

РНе

Тгр

Азр

275

280

285

СХп

УаХ

Н18

Рго

ТИг

ТНг

УаХ

ΗΪ8

АХа

Ьеи

Зег

СХи

Агд

АХа

290

295

300

АХа

ТИг

РНе

1Хе

СХи

ТНг

СХп

Туг

СХи

РНе

Ьеи

АХа

ΗΪ8

<31у

305 310 315 <210> 63 <211> 465 <212> РКТ <213> СапсННа рагарзНозхз <400> 63

МеС

Агд

Туг

РНе

АХа

1Хе

АХа

РНе

Ьеи

11е

Азп

ТИг

11е

Зег

А1а

1

5

10

15

РНе

УаХ

Ьеи

АХа

РГО

Ьуз

Рго

Зег

СХп

Азр

РНе

Туг

ТНг

Рго

20

25

30

Рго

СХп

СХу

Туг

СХи

АХа

СХп

Рго

Ьеи

С1у

Зег

11е

Ьеи

Ьуз

ТНг

Агд

35

40

45

Азп

УаХ

Рго

Азп

Рго

Ьеи

ТНг

АЗП

УаХ

РНе

ТНг

Рго

УаХ

Ьуз

УаХ

С1п

50

55

60

Азп

АХа

Тгр

СХп

Ьеи

УаХ

Агд

Зег

С1и

Азр

ТИг

РНе

СХу

Азп

Рго

65

70

75

80

Азп

А1а

1Хе

УаХ

ТНг

1Хе

СХп

Рго

РНе

АЗП

А1а

Ьуз

Азр

85

90

95

Ьуз

Ьеи

УаХ

Зег

Туг

СХп

ТНг

РНе

СХи

Азр

Зег

СХу

Ьуз

Ьеи

Азр

Суз

100

105

110

А1а

Рго

Зег

Туг

А1а

Не

СХп

Туг

СХу

Зег

Азр

Не

Зег

ТНг

Ьеи

ТНг

115

120

125

ТНг

СЯп

СХу

С1и

МеС

Туг

Не

Зег

АХа

Ьеи

Азр

С1п

СХу

Туг

130

135

140

Туг

Уа1

ТНг

Рго

Азр

Туг

С1и

С1у

Рго

Ьуз

Зег

ТНг

РНе

ТНг

Уа1

145

150

155

160

СХу

Ьеи

С1п

Зег

СХу

Агд

АХа

ТИг

Ьеи

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

ТНг

Ьеи

165

170

175

Ьуз

Зег

СХу

Азп

Ьеи

ТНг

СХу

УаХ

Зег

Азр

А1а

СХи

ТНг

Ьеи

180

185

190

Тгр

С1у

Туг

Зег

С1у

СХу

Зег

Ьеи

АХа

Зег

СХу

Тгр

А1а

АХа

А1а

Не

195

200

205

СЯп

Ьуз

С1и

Туг

АХа

Рго

С1и

Ьеи

Зег

Ьуз

Азп

Ьеи

С1у

А1а

АХа

210

215

220

Ьеи

СХу

С1у

РНе

Уа1

ТИг

Азп

Не

ТНг

А1а

ТНг

А1а

СХи

А1а

Уа1

Азр

225

230

235

240

Зег

СЯу

Рго

РНе

А1а

С1у

11е

Зег

Азп

А1а

Ьеи

АХа

С1у

Не

С1у

245

250

255

Азп

СЯи

Туг

Рго

Азр

РНе

Ьуз

Азп

Туг

Ьеи

Ьуз

Уа1

Зег

Рго

260

265

270

Ьеи

Зег

Не

ТНг

Туг

Агд

Ьеи

СХу

Азп

ТНг

ΗΪ3

Суз

Ьеи

Азр

275

280

285

СЯу

С1у

11е

А1а

Туг

РНе

СХу

Ьуз

Зег

РНе

Зег

Агд

Не

Агд

290

295

300

Туг

РНе

Рго

Азр

СХу

Тгр

Азр

Ьеи

Уа1

Азп

СХп

СХи

Рго

11е

Ьуз

ТНг

305

310

315

320

Не

Ьеи

С1п

Азр

Азп

СХу

Ьеи

Уа1

Туг

СХп

Рго

Ьуз

Азр

Ьеи

ТНг

Рго

325

330

335

СЯп

Не

РГО

Ьеи

РНе

Не

Туг

Н13

С1у

ТИг

Ьеи

Азр

А1а

Не

Уа1

Рго

340

345

350

Пе

УаХ

Азп

Зег

Агд

Ьуз

ТНг

РНе

СХп

СЯп

Тгр

Суз

Азр

Тгр

С1у

Ьеи

355

360

365

Ьуз

Зег

С1у

С1и

Туг

Азп

СХи

Азр

Ьеи

ТНг

Азп

С1у

ΗΪ8

Не

ТНг

СХи

370

375

380

Зег

Пе

Уа1

С1у

АХа

Рго

А1а

Ьеи

ТНг

Тгр

Не

11е

Азп

Агд

РИе

385

390

395

400

Азп

СЯу

С1п

Рго

Уа1

Азр

СЯу

Суз

С1п

ΗΪ8

Азп

Уа1

Агд

А1а

Зег

405

410

415

Азп

Ьеи

С1и

Туг

Рго

СХу

ТНг

Рго

СХп

Зег

Не

Ьуз

Азп

Туг

РИе

С1и

420

425

430

АХа

Ьеи

ΗΪ3

А1а

11е

Ьеи

СХу

РНе

Азр

Ьеи

СХу

Рго

Азр

Уа1

Ьуз

435

440

445

Агд

Азр

Ьуз

Уа1

ТНг

Ьеи

С1у

СХу

Ьеи

Ьуз

Ьеи

С1и

Агд

РНе

АХа

450

455

460

РНе

133

РИе

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

Ьуз

Рго

Зег

С1п

Азр

РНе

Туг

ТНг

Рго

20

25

30

Рго

С1п

О1у

Туг

С1и

А1а

С1п

Рго

Ьеи

С1у

Зег

11е

ьеи

Ьуз

ТНг

Агд

35

40

45

Азп

Уа1

РГО

Азп

Рго

Ьеи

ТНг

Азп

Уа1

РНе

ТНг

Рго

Уа1

Ьуз

Уа1

С1п

50

55

60

Азп

А1а

Тгр

С1п

Ьеи

Уа1

Агд

Зег

<31и

Азр

ТНг

РНе

б1у

Азп

Рго

65

70

75

80

Азп

А1а

Не

Уа1

ТНг

11е

<31п

Рго

РНе

АЗП

А1а

Ьуз

Азр

85

90

95

Ьуз

Ьеи

Уа1

Зег

Туг

О1п

ТНг

РНе

С1и

Азр

Зег

О1у

Ьуз

Ьеи

Азр

Суз

134 018153

УаЬ

СЬп

Азр

Агд

АЬа

Тгр

Азр

АЬа

Азр

Агд

Ьеи

НЬз

Ьеи

Зег

Рго

165

170

175

СЬи

СЬу

НЬз

ТЬг

Агд

УаЬ

АЬа

Ьеи

Агд

А1а

С1у

СЬп

АЬа

Ьеи

С1у

Ьеи

180

185

190

Агд

УаЬ

Рго

А1а

Азр

Рго

Азр

С1п

Рго

Тгр

Рго

Ьеи

Рго

Агд

195

200

205

СЬу

ТЬг

Ьеи

Азр

УаЬ

Агд

Азр

УаЬ

НЬз

Тгр

АЬа

Агд

С1и

Туг

210

215

220

Ьеи

УаЬ

Рго

Тгр

Не

СЬу

Агд

Ьеи

Агд

С1у

СЬи

Зег

СЬу

Азр

225

230

235

240

Н13

УаЬ

ТЬг

АЬа

Ьуз

СЬу

ТЬг

Ьеи

Зег

Рго

Азр

АЬа

11е

Ьуз

ТЬг

Агд

245

250

255

ЬЬе

АЬа

УаЬ

А1а

260 <210> 66 <211> 548 <212> РКТ <213> ТЬегтоЬЬ£Ька £изса <400> 66

Меб

Ьеи

Рго

НЬз

Рго

АЬа

СЬу

СЬи

Агд

СЬу

С1и

УаЬ

СЬу

АЬа

Рке

РЬе

1

5

10

15

АЬа

Ьеи

УаЬ

СЬу

Ткг

Рго

СЬп

Азр

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

СЬи

Суз

20

25

30

НЬз

СЬи

ТЬг

Агд

Рго

Ьеи

Агд

СЬу

Агд

Суз

С1у

Суз

СЬу

СЬи

Агд

35

40

45

УаЬ

Рго

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Рго

СЬу

Азр

СЬу

Уа1

Ьеи

Суз

Ткг

Зег

50

55

60

Зег

ТЬг

Агд

Азр

А1а

СЬи

ТЬг

УаЬ

Тгр

Агд

Ьуз

НЬз

Ьеи

СЬп

Рго

Агд

65

70

75

80

Рго

Азр

СЬу

РЬе

Агд

Рго

НЬз

Ьеи

С1у

Уа1

СЬу

Суз

Ьеи

А1а

85

90

95

СЬу

СЬп

СЬу

Зег

Рго

СЬу

УаЬ

Ьеи

Тгр

Суз

С1у

Агд

СЬи

СЬу

Суз

Агд

100

105

110

РЬе

СЬи

УаЬ

Суз

Агд

Азр

ТЬг

Рго

СЬу

Ьеи

Зег

Агд

ТЬг

Агд

Азп

115

120

125

СЬу

Азр

Зег

Рго

РЬе

Агд

А1а

СЬу

тгр

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

130

135

140

Суз

СЬу

СЬи

11е

Зег

СЬп

Зег

А1а

Агд

Ьуз

ТЬг

Рго

АЬа

Уа1

Рго

Агд

145

150

155

160

Туг

Зег

Ьеи

Агд

Ткг

Азр

Агд

Рго

Азр

СЬу

Рго

Агд

СЬу

Агд

РЬе

165

170

175

УаЬ

СЬу

Зег

СЬу

Рго

Агд

АЬа

ТЬг

Агд

Ьеи

РЬе

Ьеи

СЬу

180

185

190

11е

Рго

АЬа

Ьеи

Уа1

Ьеи

УаЬ

ТЬг

АЬа

Ьеи

ТЬг

Ьеи

УаЬ

Ьеи

А1а

УаЬ

195

200

205

Рго

ТЬг

СЬу

Агд

СЬи

ТЬг

Ьеи

тгр

Агд

Меб

тгр

Суз

С1и

А1а

ТЬг

СЬп

210

215

220

Азр

Тгр

Суз

Ьеи

СЬу

УаЬ

Рго

УаЬ

Азр

Зег

Агд

СЬу

СЬп

Рго

АЬа

СЬи

225

230

235

240

Азр

СЬу

СЬи

РЬе

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

СЬп

АЬа

ТЬг

Тгр

СЬу

245

250

255

Азп

Туг

А1а

Ьеи

СЬу

Азр

Зег

Туг

Зег

СЬу

Азр

С1у

А1а

Агд

260

265

270

Азр

Туг

Рго

СЬу

ТЬг

АЬа

УаЬ

Ьуз

СЬу

Суз

Тгр

Агд

Зег

АЬа

275

280

285

АЗП

АЬа

Туг

Рго

СЬи

Ьеи

УаЬ

АЬа

СЬи

АЬа

Туг

Азр

Рке

АЬа

СЬу

НЬз

290

295

300

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

АЬа

Суз

Зег

СЬу

СЬп

Агд

СЬу

Туг

АЬа

Меб

ьеи

Азр

305

310

315

320

АЬа

1Ье

Азр

С1и

УаЬ

СЬу

Зег

СЬп

Ьеи

Азр

Тгр

АЗП

Зег

Рго

ΗΪ3

ТЬг

325

330

335

Зег

Ьеи

УаЬ

ТЬг

1Ье

СЬу

Не

СЬу

Азп

Азр

Ьеи

СЬу

Рке

Зег

Ткг

340

345

350

УаЬ

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Суз

Меб

УаЬ

Агд

УаЬ

Рго

Ьеи

Азр

Зег

Ьуз

АЬа

355

360

365

Суз

ТЬг

Азр

С1п

СЬи

Азр

АЬа

11е

Агд

Ьуз

Агд

Меб

АЬа

Ьуз

Рке

СЬи

370

375

380

ТЬг

РЬе

СЬи

Ьеи

11е

Зег

СЬи

УаЬ

Агд

ТЬг

Агд

АЬа

Рго

Азр

385

390

395

400

АЬа

Агд

11е

Ьеи

УаЬ

С1у

Туг

Рго

Агд

11е

РЬе

Рго

СЬи

С1и

Рго

405

410

415

ТЬг СЬу АЬа Туг Туг ТЬг Ьеи ТЬг АЬа Зег Азп СЬп Агд Тгр Ьеи Азп 420 425430

СЬи ТЬг Не СЬп СЬи РЬе Азп СЬп СЬп Ьеи АЬа СЬи АЬа УаЬ А1а УаЬ 435 440445

НЬз Азр СЬи СЬи ЬЬе АЬа АЬа Зег СЬу СЬу УаЬ СЬу Зег УаЬ СЬи РЬе 450 455460

УаЬ Азр УаЬ Туг НЬз АЬа Ьеи Азр СЬу НЬз СЬи 1Ье СЬу Зег Азр С1и

465

470

475

480

РГО

Тгр

УаЬ

АЗП

СЬу

УаЬ

СЬп

Ьеи

Агд

Азр

Ьеи

АЬа

ТЬг

СЬу

Уа1

ТЬг

485

490

495

УаЬ

Азр

Агд

Зег

Ткг

Рке

НЬз

Рго

Азп

АЬа

СЬу

НЬз

Агд

АЬа

УаЬ

500

505

510

СЬу

СЬи

Агд

УаЬ

1Ье

СЬи

СЬп

1Ье

СЬи

Ткг

СЬу

Рго

СЬу

Агд

РГО

Ьеи

515

520

525

Туг

АЬа

ТЬг

РЬе

АЬа

УаЬ

АЬа

СЬу

АЬа

Ткг

УаЬ

Азр

ТЬг

Ьеи

АЬа

530

535

540

СЬу СЬи УаЬ СЬу

545 <210> 67 <211> 372

135 <212> РКТ <213> ТЬегтоЫТьЛа £изса <400> 67

МеЬ С1у Зег С1у Рго Агд А1а А1а ТЬг Агд Агд Агд Ьеи РЬе Ьеи С1у

10 15

11е Рго А1а Ьеи Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг А1а Ьеи ТЬг Ьеи Уа1 Ьеи А1а Уа1

20

25

30

Рго

ТЬг

(Лу

Агд

С1и

ТЬг

Ьеи

Тгр

Агд

МеЬ

Тгр

Суз

(Ли

А1а

ТЬг

С1п

35

40

45

Азр

Тгр

Суз

Ьеи

01у

Уа1

Рго

Уа1

Азр

Зег

Агд

(Лу

σΐη

Рго

А1а

С1и

50

55

60

Азр

С1у

(Ли

РЬе

Ьеи

ьеи

Зег

Рго

Уа1

С1п

А1а

ТЬг

Тгр

(Лу

65

70

75

80

Азп

Туг

А1а

Ьеи

СЛу

Азр

Зег

Туг

Зег

С1у

Азр

С1у

А1а

Агд

85

90

95

Азр

Туг

Рго

(Лу

ТЬг

А1а

Уа1

Ьуз

(Лу

Суз

Тгр

Агд

Зег

А1а

100

105

110

Азп

А1а

Туг

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

А1а

С1и

А1а

Туг

Азр

РЬе

А1а

(Лу

Н13

115

120

125

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Суз

Зег

С1у

С1п

Агд

(Лу

Туг

А1а

МеЬ

Ьеи

Азр

130

135

140

А1а

11е

Азр

(Ли

Уа1

С1у

Зег

С1п

Ьеи

Азр

Тгр

Азп

Зег

Рго

Н13

ТЬг

145

150

155

160

Зег

Ьеи

Уа1

ТЬг

Не

С1у

11е

СЛу

С1у

Азп

Азр

Ьеи

(Лу

РЬе

Зег

ТЬг

165

170

175

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Суз

меь

Уа1

Агд

Уа1

Рго

Ьеи

Азр

Зег

Ьуз

А1а

180

185

190

Суз

ТЬг

Азр

С1п

С1и

Азр

А1а

11е

Агд

Ьуз

Агд

МеЬ

А1а

Ьуз

РЬе

С1и

195

200

205

ТЬг

РЬе

(Ли

СЛи

Ьеи

11е

Зег

(Ли

Уа1

Агд

ТЬг

Агд

А1а

Рго

Азр

210

215

220

А1а

Агд

11е

Ьеи

Уа1

С1у

Туг

Рго

Агд

11е

РЬе

Рго

(Ли

Рго

225

230

235

240

ТЬг

О1у

А1а

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

А1а

Зег

Азп

ΘΙη

Агд

Тгр

Ьеи

Азп

245

250

255

(Ли

ТЬг

11е

С1п

(Ли

РЬе

Азп

С1п

Ьеи

А1а

С1и

А1а

Уа1

А1а

Уа1

260

265

270

ΗΪ3

Азр

С1и

11е

А1а

Зег

С1у

Уа1

СЛу

Зег

Уа1

(Ли

РЬе

275

280

285

Уа1

Азр

Уа1

Туг

Н13

А1а

Ьеи

Азр

С1у

ΗΪ8

(Ли

Не

С1у

Зег

Азр

(Ли

290

295

300

Рго

Тгр

Уа1

Азп

С1у

Уа1

С1п

Ьеи

Агд

Азр

Ьеи

А1а

ТЬг

(Лу

Уа1

ТЬг

305

310

315

320

Уа1

Азр

Агд

Зег

ТЬг

РЬе

Н13

Рго

Азп

А1а

(Лу

ΗΪ3

Агд

А1а

Уа1

325

330

335

С1у

С1и

Агд

Уа1

Не

С1и

ΘΙη

11е

С1и

ТЬг

(Лу

Рго

СЛу

Агд

Рго

Ьеи

340

345

350

Туг

А1а

ТЬг

РЬе

А1а

Уа1

А1а

(Лу

А1а

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Ьеи .

А1а

355

360

365

(Лу

С1и

Уа1

О1у

370 <210> 68 <211> 300 <212> РКТ <213> СогупеЬасЬегГит е££1с1епз <400> 68

МеЬ

Агд

ТЬг

Уа1

Не

А1а

Зег

А1а

Ьеи

А1а

(Лу

1

5

10

15

Суз

А1а

Азр

С1у

А1а

Агд

(Ли

ТЬг

А1а

(Лу

А1а

Рго

СЛу

(Ли

20

25

30

Зег

61у

СЛу

Не

Агд

С1и

(Ли

<31у

А1а

(Ли

А1а

Зег

ТЬг

Зег

11е

35

40

45

ТЬг

Азр

Уа1

Туг

Не

А1а

Ьеи

(Лу

АЗр

Зег

Туг

А1а

МеЬ

СЛу

(Лу

50

55

60

Агд

Азр

ΘΙη

Рго

Ьеи

Агд

(Лу

СЛи

Рго

РЬе

Суз

Ьеи

Агд

Зег

(Лу

65

70

75

80

Азп

Туг

Рго

С1и

Ьеи

ΗΪ3

А1а

С1и

Уа1

ТЬг

Азр

Ьеи

ТЬг

Суз

ΘΙη

85

90

95

(31у

А1а

Уа1

ТЬг

С1у

Азр

Ьеи

С1и

Рго

Агд

ТЬг

Ьеи

СЛу

СЛи

Агд

100

105

но

ТЬг

Ьеи

Рго

А1а

СЛп

Уа1

Азр

А1а

Ьеи

ТЬг

СЛи

Азр

ТЬг

Ьеи

Уа1

115

120

125

ТЬг

Ьеи

Зег

11е

С1у

Азп

Азр

Ьеи

С1у

РЬе

(Лу

СЛи

Уа1

А1а

(Лу

130

135

140

Суз

11е

Агд

С1и

Агд

Не

А1а

(Лу

С1и

Азп

А1а

Азр

Суз

Уа1

Азр

145

150

155

160

Ьеи

(Лу

(Ли

ТЬг

Не

Θίγ

СЛи

ΘΙη

Ьеи

Азр

С1п

Ьеи

Рго

(Лп

165

170

175

Ьеи

Азр

Агд

Уа1

Н13

(Ли

А1а

Не

Агд

Азр

Агд

А1а

СЛу

Азр

А1а

СЛп

180 185 190

Уа1 Уа1 Уа1 ТЬг С1у Туг Ьеи Рго Ьеи Уа1 Зег А1а С1у Азр Суз Рго 195 200 205

С1и Ьеи С1у Азр Уа1 Зег С1и А1а Азр Агд Агд Тгр А1а Уа1 С1и Ьеи 210 215 220

ТЬг С1у С1п 11е Азп <31и ТЬг Уа1 Агд <31и А1а А1а С1и Агд Ηίβ Азр

225

230

235

240

А1а

Ьеи

РЬе

Уа1

Ьеи

Рго

Азр

А1а

Азр

(Ли

Ηίβ

ТЬг

Зег

Суз

А1а

245

250

255

Рго

ΘΙη

СЛп

Агд

тгр

А1а

Азр

Не

С1П

(Лу

ΘΙη

ТЬг

Азр

А1а

260

265

270

Туг

Рго

Ьеи

ΗΪ3

Рго

ТЬг

Зег

А1а

С1у

ΗΪ5

(Ли

А1а

МеЬ

А1а

275

280

285

136

Уа1 Агд Азр А1а Ьеи С1у Ьеи С1и Рго Уа1 51п Рго

290 295 300 <210> 69 <211> 284 <212> РКТ <213> ЫоуозрЫпдоЫит аготаЫсхуогапз <400> 69

Мер

СЛу

С1п

Уа1

Ьуз

Ьеи

РЬе

А1а

Агд

Суз

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

1

5

10

15

А1а

Ьеи

А1а

СЛу

Ьеи

А1а

Рго

А1а

ТЬг

Уа1

А1а

Агд

(Ли

А1а

Рго

20

25

30

Ьеи

А1а

СЛи

(Лу

А1а

Агд

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

СЛу

Зег

РЬе

А1а

35

40

45

СЛу

Рго

(Лу

Уа1

СЛу

Рго

Азп

А1а

Рго

СЛу

Зег

Рго

СЛи

Агд

Суз

СЛу

50

55

60

Агд

(Лу

ТЬг

Ьеи

Азп

Туг

Рго

ΗΪ8

Ьеи

А1а

СЛи

А1а

Ьеи

Ьуз

Ьеи

65

70

75

80

Азр

Ьеи

Уа1

Азр

А1а

ТЬг

Суз

Зег

СЛу

А1а

ТЬг

ΗΪ8

Уа1

Ьеи

85

90

95

СЛу

Рго

Тгр

Азп

(Ли

Уа1

Рго

СЛп

11е

Азр

Зег

Уа1

АЗП

СЛу

Азр

100

105

110

ТЬг

Агд

Ьеи

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

СЛу

Азп

Азр

Уа1

Зег

РЬе

Уа1

115

120

125

(Лу

Азп

Не

РЬе

А1а

Суз

СЛи

Ьуз

МеЬ

А1а

Зег

Рго

Азр

Рго

130

135

140

Агд

Суз

СЛу

Ьуз

Тгр

Агд

(Ли

11е

ТЬг

(Ли

Тгр

СЛп

А1а

Азр

145

150

155

160

(Ли

СЛи

Агд

Мер

Агд

Зег

11е

Уа1

Агд

СЛп

11е

Н18

А1а

Агд

А1а

Рго

165

170

175

Ьеи

А1а

Агд

Уа1

Азр

Туг

11е

ТЬг

Уа1

Ьеи

Рго

Зег

180

185

190

(Лу

ТЬг

Суз

А1а

МеС

А1а

11е

Зег

Рго

Азр

Агд

Ьеи

А1а

С1п

Зег

195

200

205

Агд

Зег

А1а

Ьуз

Агд

Ьеи

А1а

Агд

Не

ТЬг

А1а

Агд

Уа1

А1а

Агд

210

215

220

С1и

СЛи

СЛу

А1а

Зег

Ьеи

Ьуз

РЬе

Зег

ΗΪ8

11е

Зег

Агд

Н13

225

230

235

240

ΗΪ8

Рго

Суз

Зег

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Зег

Азп

(Лу

Ьеи

Зег

А1а

Рго

А1а

245

250

255

Азр

СЛу

11е

Рго

Уа1

ΗΪ8

Рго

Азп

Агд

Ьеи

СЛу

Н13

А1а

С1и

А1а

260

265

270

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Ьеи

Мер

Ьуз

275

280

<210> 70 <211> 268 <212> РКТ <213 > ЗЬгер(:отусез соеИсо1ог <400> 70

Мее

Агд

РЬе

Агд

Ьеи

Уа1

СЛу

РЬе

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

1

5

10

15

А1а

(Лу

А1а

Ьеи

ТЬг

СЛу

А1а

ТЬг

А1а

СЛп

А1а

С1п

Рго

20

25

30

А1а

Азр

СЛу

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

(Лу

Азр

Зег

Туг

Зег

(Лу

35

40

45

Уа1

(Лу

А1а

СЛу

Зег

Туг

11е

Зег

(Лу

Азр

Суз

Ьуз

Агд

Зег

50

55

60

ТЬг

Ьуз

А1а

ΗΪ3

Рго

Туг

Ьеи

Тгр

А1а

Н13

Зег

Рго

Зег

ТЬг

65

70

75

80

РЬе

Азр

РЬе

ТЬг

А1а

Суз

Зег

(Лу

А1а

Агд

ТЬг

(Лу

Азр

Уа1

Ьеи

Зег

85

90

95

СЛу

СЛп

Ьеи

СЛу

Рго

Ьеи

Зег

СЛу

ТЬг

(Лу

Ьеи

Уа1

Зег

11е

Зег

100

105

110

11е

(Лу

Азп

Азр

А1а

(Лу

РЬе

А1а

Азр

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Суз

Уа1

115

120

125

Ьеи

СЛп

Зег

СЛи

Зег

Суз

Ьеи

Зег

Агд

11е

А1а

ТЬг

А1а

СЛи

А1а

130

135

140

Туг

Уа1

Азр

Зег

ТЬг

Ьеи

Рго

(Лу

Ьуз

Ьеи

Азр

(Лу

Уа1

Туг

Зег

А1а

145

150

155

160

11е

Зег

Азр

Ьуз

А1а

Рго

Азп

А1а

ΗΪ8

Уа1

11е

(Лу

Туг

Рго

165

170

175

Агд

РЬе

Туг

Ьуз

Ьеи

СЛу

ТЬг

Суз

11е

(Лу

Ьеи

Зег

(Ли

ТЬг

Ьуз

180

185

190

Агд

ТЬг

А1а

11е

Азп

Ьуз

А1а

Зег

Азр

ΗΪ8

Ьеи

Азп

ТЬг

Уа1

Ьеи

А1а

195

200

205

СЛп

Агд

А1а

Н13

(Лу

РЬе

ТЬг

РЬе

СЛу

Азр

Уа1

Агд

ТЬг

210

215

220

РЬе

ТЬг

СЛу

ΗΪ8

СЛи

Ьеи

Суз

Зег

СЛу

Зег

Рго

Тгр

Ьеи

Н18

Зег

Уа1

225

230

235

240

Азп

Тгр

Ьеи

Азп

11е

(Лу

(Ли

Зег

Туг

Н13

Рго

ТЬг

А1а

СЛу

СЛп

245

250

255

Зег

СЛу

Туг

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

Азп

(Лу

А1а

260

265

<211

Э> 7

1

<21:

1> Ъ

69

<21:

2> Р]

КТ

<21:

3> 3

Ьгер^!

еоту

сез ;

&νβη

ιιίΡί

Из

<401

0> 7

1

Мее

Агд

Зег

Агд

11е

ТЬг

А1а

Туг

Уа1

ТЬг

Зег

Ьеи

А1а

1

5

10

15

Уа1

СЛу

Суз

А1а

Ьеи

ТЬг

СЛу

А1а

ТЬг

А1а

С1п

А1а

Зег

Рго

А1а

25 30

137

А1а А1а

А1а ТЬг С1у Туг Уа1 А1а Ьеи С1у Азр Бег

Туг 45

Бег Зег С1у

35

40

Уа1

О1у

А1а

С1у

Бег

Туг

Ьеи

Бег

С1у

Азр

Суз

Ьуз

Агд

Зег

50

55

60

Бег

Ьуз

АХа

Туг

Рго

Туг

Ьеи

Тгр

СХп

АХа

А1а

Н13

Бег

Рго

Бег

Зег

65

70

75

80

РЬе

Бег

РЬе

Мек

А1а

Суз

Бег

СХу

А1а

Агд

ТЬг

С1у

Азр

Уа1

Ьеи

АХа

85

90

95

Азп

О1п

Ьеи

СХу

ТЬг

Ьеи

Азп

Бег

ТЬг

СХу

Ьеи

УаХ

Бег

Ьеи

ТЬг

100

105

110

Не

СХу

Азп

Азр

А1а

С1у

РЬе

Бег

Азр

Уа1

Мек

ТЬг

Суз

Уа1

115

120

125

Ьеи

СХп

Бег

Азр

Бег

А1а

Суз

Ьеи

Бег

Агд

1Хе

Азп

ТЬг

А1а

Ьуз

АХа

130

135

140

Туг

УаХ

Азр

Бег

ТЬг

Ьеи

Рго

СХу

С1п

Ьеи

Азр

Бег

УаХ

Туг

ТЬг

А1а

145

150

155

160

Не

Бег

ТЬг

Ьуз

АХа

Рго

Бег

А1а

Н18

УаХ

АХа

УаХ

Ьеи

СХу

Туг

Рго

165

170

175

Агд

РЬе

Туг

Ьуз

Ьеи

СХу

Бег

Суз

Ьеи

А1а

СХу

Ьеи

Бег

СХи

ТЬг

180

185

190

Ьуз

Агд

Бег

АХа

11е

Азп

Азр

АХа

Азр

Туг

Ьеи

Азп

Бег

АХа

11е

195

200

205

А1а

Ьуз

Агд

А1а

Азр

ΗΪ3

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

СХу

Азр

Уа1

ьуз

Бег

210

215

220

ТЬг

РЬе

ТЬг

С1у

ΗΪ8

С1и

Не

Суз

Бег

ТЬг

Тгр

Ьеи

Н1з

Бег

225

230

235

240

Ьеи

Азр

Ьеи

Азп

11е

СХу

С1п

Бег

Туг

Ηίδ

Рго

ТЬг

АХа

А1а

С1у

245

250

255

С1п

Бег

СХу

С1у

Туг

Ьеи

Рго

УаХ

Мек

Азп

Бег

Уа1

АХа

260 265 <210> 72 <211> 267 <212> РКТ

<212

1> 31

:геркотусез зр.

<400> 72

Мек

Агд

Ьеи

ТЬг

Агд

Бег

Ьеи

Зег

АХа

А1а

Зег

УаХ

Не

УаХ

РЬе

АХа

1

5

10

15

Ьеи

А1а

Ьеи

С1у

1Хе

Зег

Рго

АХа

СХп

А1а

АХа

СХу

Рго

20

25

30

А1а

Туг

Уа1

АХа

Ьеи

СХу

Азр

Зег

Туг

Бег

Зег

СХу

Азп

С1у

АХа

СХу

35

40

45

Бег

Туг

1Хе

Азр

Бег

СХу

Азр

Суз

Ηίδ

Агд

Зег

Азп

АХа

Туг

50

55

60

РГО

АХа

Агд

Тгр

А1а

АХа

А1а

Азп

АХа

Рго

Зег

РЬе

ТЬг

РЬе

А1а

65

70

75

80

А1а

Суз

Бег

СХу

А1а

УаХ

ТЬг

Азр

УаХ

1Хе

Азп

СХп

Ьеи

СХу

90 95

А1а

Ьеи

Азп

А1а

Бег

ТЬг

С1у

Ьеи

УаХ

Зег

Не

ТЬг

Не

СХу

С1у

Азп

100

105

но

Азр

А1а

С1у

РЬе

АХа

Азр

АХа

Мек

ТЬг

Суз

УаХ

ТЬг

Зег

Азр

115

120

125

Бег

ТЬг

Суз

Ьеи

Азп

Агд

Ьеи

АХа

ТЬг

А1а

ТЬг

Азп

Туг

11е

Азп

ТЬг

130

135

140

ТНг

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

Азр

А1а

Уа1

Туг

Зег

С1п

11е

Ьуз

А1а

Агд

145

150

155

160

АХа

Рго

Азп

АХа

Агд

Уа1

УаХ

Ьеи

СХу

Туг

Рго

Агд

Мек

Туг

Ьеи

165

170

175

А1а

Зег

Азп

Рго

Тгр

Туг

Суз

Ьеи

С1у

Ьеи

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Агд

АХа

180

185

190

А1а

11е

Азп

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

Ьеи

Азп

Зег

УаХ

11е

Зег

Бег

Агд

195

200

205

А1а

ТЬг

А1а

Н13

СХу

РЬе

Агд

РЬе

С1у

Азр

Уа1

Агд

Рго

ТЬг

РЬе

Азп

210

215

220

Азп

ΗΪ8

С1и

Ьеи

РЬе

СХу

Азп

Азр

Тгр

Ьеи

Н13

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьеи

225

230

235

240

Рго

УаХ

Тгр

С1и

Зег

Туг

Ηί3

Рго

ТЬг

Бег

ТЬг

С1у

Η18

СХп

Зег

С1у

245

250

255

Туг

Ьеи

Рго

УаХ

Ьеи

Азп

АХа

Азп

Зег

Бег

ТЬг

260 265 <210> 73 :211> 317 :212> РКТ

<213

;> Ае

‘готопаз

ЬуЬгорЫ

,1а

<40С

1> 73

А1а

Азр

Зег

Агд

Рго

А1а

РЬе

Бег

Агд

11е

Уа1

Мек

РЬе

С1у

Азр

Зег

1

5

10

15

Ьеи

Зег

Азр

ТЬг

С1у

Ьуз

Мек

Туг

Зег

Ьуз

Мек

Агд

СХу

Туг

Ьеи

Рго

20

25

30

Зег

Бег

Рго

Туг

СХи

С1у

Агд

РЬе

Зег

Азп

СХу

Рго

УаХ

Тгр

35

40

45

Ьеи

С1и

С1п

Ьеи

ТЬг

Азп

С1и

РЬе

Рго

С1у

Ьеи

ТЬг

11е

А1а

Азп

С1и

50

55

60

А1а

СХи

С1у

Рго

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

Туг

Азп

Ьуз

11е

Бег

Тгр

Азп

65

70

75

80

Рго

Ьуз

Туг

С1п

Уа1

Не

Азп

Ьеи

Азр

Туг

СХи

УаХ

ТЬг

С1п

РЬе

85

90

95

Ьеи

С1п

Ьуз

Азр

Зег

РЬе

Ьуз

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

11е

Ьеи

Тгр

Уа1

100

105

110

СХу

А1а

Азп

Азр

Туг

Ьеи

А1а

Туг

С1у

Тгр

Азп

ТЬг

СХи

СХп

Азр

А1а

115

120

125

Ьуз

Агд

УаХ

Агд

Азр

А1а

11е

Зег

Азр

А1а

Азп

Агд

Мек

Уа1

Ьеи

130

135

140

138

- 139 018153 <213> Збгерботусез бкегтозасскагЬ <400> 76

Меб Агд Ьеи 1

Ткг Агд Зег Ьеи Зег АЬа АЬа Зег УаЬ 1Ье УаЬ Рке

АЬа

5

10

15

ьеи

Ьеи

АЬа

Ьеи

СЬу

Не

Зег

Рго

АЬа

СЬп

АЬа

СЬу

Рго

20

25

30

АЬа

Туг

УаЬ

АЬа

Ьеи

СЬу

Азр

Зег

Туг

Зег

СЬу

Азп

СЬу

АЬа

СЬу

35

40

45

Зег

Туг

1Ье

Азр

Зег

СЬу

Азр

Суз

НЬз

Агд

Зег

Азп

АЗП

АЬа

Туг

50

55

60

Рго

АЬа

Агд

Тгр

АЬа

Азп

АЬа

Рго

Зег

Рке

Ткг

Рке

АЬа

65

70

75

80

АЬа

Суз

Зег

СЬу

АЬа

УаЬ

Ткг

Азр

УаЬ

Не

Азп

СЬп

Ьеи

СЬу

85

90

95

АЬа

Ьеи

Азп

АЬа

Зег

ТЬг

СЬу

Ьеи

УаЬ

Зег

1Ье

Ткг

1Ье

СЬу

Азп

100

105

110

Азр

АЬа

СЬу

Рке

АЬа

Азр

АЬа

Меб

Ткг

Суз

УаЬ

Ткг

Зег

Азр

115

120

125

Зег

Ткг

Суз

Ьеи

Азп

Агд

Ьеи

АЬа

Ткг

АЬа

Ткг

Азп

Туг

11е

Азп

Ткг

130

135

140

Ткг

Ьеи

АЬа

Агд

Ьеи

Азр

АЬа

УаЬ

Туг

Зег

СЬп

11е

Ьуз

АЬа

Агд

145

150

155

160

АЬа

Рго

Азп

АЬа

Агд

УаЬ

Ьеи

СЬу

Туг

Рго

Агд

Меб

Туг

Ьеи

165

170

175

АЬа

Зег

Азп

Рго

Тгр

Туг

Суз

Ьеи

СЬу

Ьеи

Зег

Азп

Ткг

Ьуз

Агд

АЬа

180

185

190

АЬа

11е

Азп

Ткг

АЬа

Азр

Ткг

Ьеи

Азп

Зег

УаЬ

Не

Зег

Агд

195

200

205

АЬа

Ткг

АЬа

НЬз

СЬу

Рке

Агд

Рке

СЬу

Азр

УаЬ

Агд

Рго

Ткг

Рке

Азп

210

215

220

Азп

НЬз

СЬи

Ьеи

Рке

СЬу

Азп

Азр

Тгр

Ьеи

Н13

Зег

Ьеи

Ткг

Ьеи

225

230

235

240

Рго

УаЬ

Тгр

СЬи

Зег

Туг

НЬз

Рго

Ткг

Зег

Ткг

СЬу

НЬз

СЬп

Зег

СЬу

245

250

255

Туг

Ьеи

Рго

УаЬ

Ьеи

Азп

АЬа

Азп

Зег

ТНг

260 265 <210> 77 <211> 548 <212> РКТ <213> ТкегтоЬЬ£Ька £изса <400> 77

Меб

Ьеи

Рго

ΗΪ8

Рго

АЬа

СЬу

СЬи

Агд

СЬу

СЬи

УаЬ

СЬу

АЬа

Рке

1

5

10

15

АЬа

Ьеи

УаЬ

СЬу

Ткг

Рго

СЬп

Азр

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

СЬи

Суз

20

25

30

НЬз

СЬи

Ткг

Агд

Рго

Ьеи

Агд

СЬу

Агд

Суз

СЬу

Суз

СЬу

СЬи

Агд

35

40

45

УаЬ

Рго

Ьеи

Ткг

Ьеи

Рго

СЬу

Азр

СЬу

УаЬ

Ьеи

Суз

Ткг

Зег

50

55

60

Зег

Ткг

Агд

Азр

АЬа

СЬи

Ткг

УаЬ

Тгр

Агд

Ьуз

НЬз

Ьеи

СЬп

Рго

Агд

65

70

75

80

Рго

Азр

СЬу

Рке

Агд

Рго

НЬз

Ьеи

СЬу

УаЬ

СЬу

Суз

Ьеи

АЬа

85

90

95

СЬу

СЬп

СЬу

Зег

Рго

СЬу

УаЬ

Ьеи

Тгр

Суз

СЬу

Агд

СЬи

СЬу

Суз

Агд

100

105

110

Рке

СЬи

УаЬ

Суз

Агд

Азр

Ткг

Рго

СЬу

Ьеи

Зег

Агд

Ткг

Агд

Азп

115

120

125

СЬу

Азр

Зег

Рго

Рке

Агд

АЬа

СЬу

Тгр

Зег

Ьеи

Рго

Ьуз

130

135

140

Суз

СЬу

СЬи

Не

Зег

СЬп

Зег

АЬа

Агд

Ьуз

Ткг

РГО

АЬа

УаЬ

Рго

Агд

145

150

155

160

Туг

Зег

Ьеи

Агд

Ткг

Азр

Агд

Рго

Азр

СЬу

Рго

Агд

СЬу

Агд

Рке

165

170

175

УаЬ

СЬу

Зег

СЬу

Рго

Агд

АЬа

Ткг

Агд

Ьеи

Рке

Ьеи

СЬу

180

185

190

Не

Рго

АЬа

Ьеи

УаЬ

Ьеи

УаЬ

Ткг

АЬа

Ьеи

Ткг

Ьеи

УаЬ

Ьеи

АЬа

УаЬ

195

200

205

Рго

Ткг

СЬу

Агд

СЬи

Ткг

Ьеи

Тгр

Агд

Меб

Тгр

Суз

СЬи

АЬа

ТЫ

СЬп

210

215

220

Азр

Тгр

Суз

Ьеи

СЬу

УаЬ

Рго

УаЬ

Азр

Зег

Агд

СЬу

СЬп

Рго

АЬа

СЬи

225

230

235

240

Авр

СЬу

СЬи

Рке

Ьеи

Зег

Рго

УаЬ

СЬп

АЬа

Ткг

Тгр

СЬу

245

250

255

АЗП

Туг

АЬа

Ьеи

СЬу

Азр

Зег

Туг

Зег

СЬу

Азр

СЬу

АЬа

Агд

260

265

270

Азр

Туг

Рго

СЬу

Ткг

АЬа

УаЬ

Ьуз

СЬу

Суз

Тгр

Агд

Зег

АЬа

275

280

285

Азп

АЬа

Туг

Рго

СЬи

Ьеи

УаЬ

АЬа

СЬи

АЬа

Туг

Азр

Рке

АЬа

СЬу

НЬз

290

295

300

Ьеи

Зег

Рке

Ьеи

АЬа

Суз

Зег

СЬу

С1п

Агд

СЬу

Туг

АЬа

Меб

Ьеи

Азр

305

310

315

320

АЬа

1Ье

Азр

СЬи

УаЬ

СЬу

Зег

СЬп

Ьеи

Азр

Тгр

Азп

Зег

Рго

Η18

ТНг

325

330

335

Зег

Ьеи

УаЬ

Ткг

ЬЬе

СЬу

ЬЬе

СЬу

Азп

Азр

Ьеи

СЬу

Рке

Зег

Ткг

340

345

350

УаЬ

Ьеи

Ьуз

Ткг

Суз

Меб

УаЬ

Агд

УаЬ

Рго

Ьеи

Азр

Зег

Ьуз

АЬа

355

360

365

Суз

Ткг

Азр

СЬп

СЬи

Азр

АЬа

1Ье

Агд

Ьуз

Агд

Меб

АЬа

Ьуз

Рке

СЬи

370

375

380

Ткг

Рке

СЬи

Ьеи

Не

Зег

СЬи

УаЬ

Агд

Ткг

Агд

АЬа

Рго

Азр

385 390 395 400

- 140 018153

А1а

Агд

Не

Ьеи

Уа1

С1у

Туг

Рго

Агд

11е

РЬе

Рго

С1и

Рго

405

410

415

ТЬг

С1у

А1а

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

А1а

Зег

Азп

С1п

Агд

Тгр

Ьеи

Азп

420

425

430

С1и

ТЬг

Не

<31п

С1и

РЬе

Азп

С1п

<31п

Ьеи

А1а

С1и

А1а

Уа1

А1а

Уа1

435

440

445

Ηίδ

Азр

С1и

О1и

Не

А1а

Зег

С1у

Уа1

С1у

Зег

Уа1

С1и

РЬе

450

455

460

Уа1

Азр

Уа1

Туг

ΗΪ5

А1а

Ьеи

Азр

<31у

ΗΪ8

01и

11е

С1у

Зег

Азр

01и

465

470

475

480

Рго

Тгр

Уа1

Азп

С1у

Уа1

С1п

Ьеи

Агд

Азр

Ьеи

А1а

ТЬг

С1у

Уа1

ТЬг

485

490

495

Уа1

Азр

Агд

Зег

ТЬг

РЬе

Η13

Рго

Азп

А1а

С1у

ΗΪ8

Агд

А1а

Уа1

500

505

510

<31у

С1и

Агд

Уа1

Не

С1и

С1п

11е

01и

ТЬг

01у

Рго

С1у

Агд

Рго

Ьеи

515

520

525

Туг

А1а

ТЬг

РЬе

А1а

Уа1

А1а

С1у

А1а

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Ьеи

А1а

530

535

540

С1у С1и Уа1 С1у

545 <210> 78 <211> 3000 <212> ΏΝΑ <213> ТНегтоЫНба £изса <400> 78 ддрддрдаас саасЬдсЬсс ссссдасдад сдсдссЬЬсд дсссаддЪас дадсасдЬса сасЬЫсддЬ асаддасдас даЬдЬЬсддс сдсадсдаЬс дадЪЬсддас ддсдЬадЫд сасЬдЬддЬд ЪссЪЪсдадд дсддЪдсЪсс дЬсдддасЬс ддасддЬдсд ЬЬдЪдсасса сддссддасд адЬсссдддд асЬссдддсс ИсссЬИсссс аддЬасИсЬИ ддассасдЪд асадсдсьса ЬдЬдаддсса даддасддсд дсдсЬсдддд дЪдаадддсд дасЬЬсдссд дасдсЪаЪсд садаасассс адсаддаЬдс Ьасадсассс сссдсддсЫ ддсаддасда сддсддЬсда ЬсдаЬсЬдсд саддЪсдсас аддЬаддсса дсддсддЪдс дсдИдссдда адддЬддсдс ЬасддддЬдд ИсддИЬассд сдсасссадс сасаддаЬсд даЬдсддЬда саЬсЬадсас дЬдддЬЬРсд ЪдсЬдЬддЬд

ЪсадссдЬас сдаааИдсдд ИдсЬИсдаас сддсдассад сдсьддьсьь сссаддасЬд адШсЬдсЬ аЬЬсдЬасЬс дЪЬдсЪддсд дасасЫдЬс асдаддЬсдд ддЬсдЪсддс сдссдЬддсс аЬадсддаЬд сдаасЬссдс сддЬдЪдсЬд адЬссЫасс сдаассддЬс сдаЬсдсддс сдасссддЬс дддИссдсад Ьсдссасддс сддддаасса сддсдсдсас ассадсдсса дддрдаасдс дсддсЬдсдд дсдЬсдддЬд дсдддасдсд дссасасЬЬа сдддсдддад ссдсаасддд сдадаЪсЪсс адасаддссд асдасддЬЪд ддсьдьсссд дЬдссЬдддд дсееЬсЪссд ЬЬсдддддас дЬссдсЪаас дИЬссИддсс сЬсдсадсЬд дЬдддсдЬсс дЬдсасдаЬд дЬсдаасддс ссаддасадд саддсЬдддс дссдЬадсдд даддасдсЬд дсаддсдадд дссддддссс ЬЪсЬссссад ЬдаЬдддЬса дасддсдссд ссддЪадЪас садЪдссЬсд ддЬдаддИЬд сЬЬдадЬдЬс ссЬссссЪаа дааассдЬаЬ ддддЬсдддЬ ддсЬдЬсдсЬ дасадЬЬсЬс садЪсадссс дасддИссас ЪЬссЪсддЬа асддддсдсд дЬдссддЪсд дЪссаддсад ддддсссдсд дссЪаЬссдд Ьдсадсддсс дасЬддаасЬ аддЪдсаддЬ дсаддЫсЫ 60 дссЬЬдддса ддссЬдЬддЬ 120 адсддддЬда асЬссадЬЬс 180 дЬдЬсддсда садддссдса 240 аЬдссдЪсдс дсадддсЬЪЬ 300 ЬадссдЪсса сддссадсад 360 сдсассссда адЬсддддда 420 ааЬдсддссд ЬсдссЬсддс 480 ассссдаддс Ьдсддадддс 540 дИссасЬсдд Исаасддссд 600 сддЬсдсдда адаЬдЬдсЬс 660 ддсаЪддсд! сддаддсдад 720 ЬсссадаИсд сддассадаа 780 ЬадЪссддЬд сдЬссасасс 840 дсдсдЬЪсЬЪ ЪдсдсИссИс 900 аЬдааасдсд ассссЪЬсдЬ 960 сдсЬссссдд ЬдасддадЬд 1020 ддадааааса ссЬасаассс 1080 дссйдсЫдс сдддсадддс 1140 ЬсдаддЬдЬд ссддсдддас 1200 сйсссЬСссд ддсЬддаЬдд 1260 ддаааасасс сдсЬдИдссс 1320 дддддаддЫ СдЪдддсадс 13 8 0 ЬссссдсЬсЬ ЬдЬасЬЬдЬд 1440 адасдсЬдЬд дсдсаЬдЬдд 1500 асЬсссдсдд асадссЪдсд 1560 сдассСдддд даасЬаЬЬас 1620 асЬасЬаЬсс сддсассдсд 1680 адсЪддЬсдс сдаадссЪас 1740 адсдсддсЬа сдссаЬдсЫ 1800 ссссЬсасас дЬсдсЬддЬд 1860 асдаЬсддда Ьсддсддсаа сдаЬсЬдддд ЬЬсИссасдд сдддЬдссдс ИдсЬддасад сааддсдЬдс асддассадд аЬддсдаааИ Ьсдадасдас дЬЬЬдаадад сЬсаЬсадсд дасдсссдда ЬссЬИдЬсдЬ дддсЬасссс сддаЬШЬс ЬасЬасасдс Ьдассдсдад саассадсдд ЬддсЬсаасд садсадсЬсд ссдаддсЬдЬ сдсддИссас дасдаддада ддсадсдЬдд адЬЬсдЬдда сдСсЪассас дсдЬЬддасд дадссдСддд СдаасддддЬ дсадИЬдсдд дассЬсдсса адЬассЬЬсс ассссаасдс сдсИдддсас сдддсддЬсд аЬсдааассд дсссдддссд ИссдсЬсИаЬ дссасЬЬИсд дЬддасасЬс Ьсдсдддсда ддНддддЬда сссддсИИас дадсасЬдсд дсдаЬсЬддЬ ссасЬдссса дЬдсадЬЬсд сддддададс сддаИсдИед адссдЬдсдЬ дЬсИЬИдасд ссдЬЬсдсас адЬЬсЬсЬЬс сддЬддссад адЬсдддЬсд дссдаИдсИд сдддссдсда ссасдссдИЬ дссдассадЬ сасдддддсд адддсдсдда саЬддЬссад дЬаадддссд ддсадЬдссд ассдсдсадд сдадддсдЬЬ дссдссдаад дсддаСсасд ЬсдаадасЬЬ ссдсдЬсдсс Ъассдссдсс дсссадсдсЬ ЬЬдссдааса ддЬадаЬаЬс ддсдЬсдасЬ

ЬИЬИдаадас аддасдсЬаЬ аадИдсдсас сддаддаасс ааассаЪЬса ЬЬдссдсдИс дссасдадаЪ ссддддИдас дЬдадсдддИ сддЬддЬддс сдЬссддссс ЬсЬЬсддЬда адсасасссс асдЬсдаЬсс ЬддИсдаддс Ьсдсддасда дЬдсЬдссдИ дссасдддса ссдсЬдЬддЬ сИдсаЬддЬд ссдсаадсдд ссдсдсдссд дассддсдсс ддадЪЕсаас дддсддддЬд сддсЬсддас ИдИддассдс саЬсдадсад дддддсдасс дсаддЬсЬдс Ьдассадсдд дсЬдсаддад садсссасад дддсдсдсад ддсЬсассас дсЬддссддд ддаИдссдсс сдсаддсссд

1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 <210> 79 <211> 372 <212? РКТ <213? тНегтоЫЕьба £изса <400? 79

Уа1

С1у

Зег

01у

Рго

Агд

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

РЬе

Ьеи

С1у

1

5

10

15

11е

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

ТИг

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Уа1

20

25

30

Рго

ТЬг

С1у

Агд

<31и

ТЬг

Ьеи

Тгр

Агд

МеС

Тгр

Суз

С1и

А1а

ТИг

<31п

35

40

45

Азр

Тгр

Суз

Ьеи

С1у

Уа1

Рго

Уа1

Азр

Зег

Агд

С1у

С1п

Рго

А1а

О1и

50

55

60

Азр

С1у

С1и

РЬе

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

С1п

А1а

ТИг

Тгр

С1у

65

70

75

80

Азп

Туг

А1а

Ьеи

С1у

Азр

Зег

Туг

Зег

С1у

Азр

О1у

А1а

Агд

85

90

95

Азр

Туг

Рго

61у

ТНг

А1а

Уа1

Ьуз

С1у

Суз

Тгр

Агд

Зег

А1а

100

105

110

Азп

А1а

Туг

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

А1а

01и

А1а

Туг

Азр

РЬе

А1а

<31у

ΗΪ3

115

120

125

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Суз

Зег

С1у

С1п

Агд

С1у

Туг

А1а

МеЬ

Ьеи

Азр

130

135

140

А1а

11е

Азр

01и

Уа1

С1у

Зег

01п

Ьеи

Азр

Тгр

Азп

Зег

Рго

ΗΪ8

ТИг

145

150

155

160

Зег

Ьеи

Уа1

ТЬг

11е

С1у

11е

С1у

Азп

Азр

Ьеи

<31у

РИе

Зег

ТНг

165

170

175

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Суз

МеЬ

Уа1

Агд

Уа1

Рго

Ьеи

Азр

Зег

Ьуз

А1а

180

185

190

Суз

ТЬг

Азр

С1п

С1и

Азр

А1а

11е

Агд

Ьуз

Агд

МеЬ

А1а

Ьуз

РНе

С1и

195

200

205

ТЬг

РЬе

<31и

Ьеи

11е

Зег

О1и

Уа1

Агд

ТИг

Агд

А1а

Рго

Азр

210

215

220

- 141 018153

А1а Агд 11е Ьеи 225

νβΐ

Уа1 СЯу Туг Рго Агд 11е РЬе Рго С1и СЯи Рго

230

235

240

ТЬг

С1у

А1а

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

А1а

Зег

Азп

С1п

Агд

Тгр

Ьеи

Азп

245

250

255

СЯи

ТЬг

11е

СЯп

СЯи

РЬе

Азп

61п

СЯп

Ьеи

А1а

С1и

А1а

Уа1

А1а

Уа1

260

265

270

Н1з

Азр

(Ни

С1и

11е

А1а

Зег

СЯу

(31у

Уа1

61у

Зег

Уа1

СЯи

РЬе

275

280

285

Уа1

Азр

Уа1

Туг

Н1з

А1а

Ьеи

Азр

(31у

Ηίδ

СЯи

Не

С1у

Зег

Азр

СЯи

290

295

300

Рго

Тгр

Уа1

Азп

(Яу

Уа1

<31п

Ьеи

Агд

Азр

Ьеи

А1а

ТЬг

(Яу

Уа1

ТЬг

305

310

315

320

Уа1

Азр

Агд

Зег

ТЬг

РЬе

Ηίδ

Рго

Азп

А1а

С1у

Η18

Агд

А1а

Уа1

325

330

335

СЯу

(Ни

Агд

Уа1

11е

(Яи

СЯп

11е

(31и

ТЬг

С1у

Рго

(Яу Агд

Рго

Ьеи

340

345

350

Туг

А1а

ТЬг

РЬе

А1а

Уа1

ν_&1

А1а

<31у

А1а

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Ьеи

А1а

355

360

365

СЯу

С1и

Уа1

СЯу

370 <210> 80 <211> 300 <212> РКТ <213> СогупеЬасЬегхит είίίοίθηβ <400> 80

МеЬ

Агд

ТЬг

Уа1

11е

А1а

Зег

А1а

Ьеи

А1а

С1у

1

5

10

15

Суз

А1а

Азр

(Яу

А1а

Агд

(Яи

61и

ТЬг

А1а

О1у

А1а

Рго

С1у

С1и

20

25

30

Зег

(Яу

11е

Агд

О1и

С1и

СЯу

А1а

С1и

А1а

Зег

ТЬг

Зег

11е

35

40

45

ТЬг

Азр

Уа1

Туг

11е

А1а

Ьеи

<Э1у

Азр

Зег

Туг

А1а

мее

СЯу

50

55

60

Агд

Азр

С1п

Рго

Ьеи

Агд

<31у

С1и

Рго

РЬе

Суз

Ьеи

Агд

Зег

СЯу

65

70

75

80

Азп

Туг

Рго

(Яи

Ьеи

ΗΪ3

А1а

С1и

Уа1

ТЬг

Азр

Ьеи

ТЬг

Суз

С1п

85

90

95

(31у

А1а

νεί

ТЬг

СЯу

Азр

Ьеи

С1и

Рго

Агд

ТЬг

Ьеи

СЯу

С1и

Агд

100

105

но

ТЬг

Ьеи

Рго

А1а

О1п

Уа1

Азр

А1а

Ьеи

ТЬг

О1и

Азр

ТЬг

Ьеи

Уа1

115

120

125

ТЬг

Ьеи

Зег

11е

СЯу

С1у

Азп

Азр

Ьеи

(31у

РЬе

С1у

С1и

Уа1

А1а

<Э1у

130

135

140

Суз

11е

Агд

(Яи

Агд

11е

А1а

СЯу

С1и

Азп

А1а

Азр

Суз

Уа1

Азр

145 150 155 160

Ьеи

(Яу

(Яи

ТЬг

11е

(Яу

(Яи

(Яп

Ьеи

Азр

(Яп

Ьеи

Рго

(Яп

165

170

175

Ьеи

Азр

Агд

Уа1

Н13

СЯи

А1а

Не

Агд

Азр

Агд

А1а

(Яу

Азр

А1а

(Яп

180

185

190

Уа1

ТЬг

(Яу

Туг

Ьеи

Рго

Ьеи

νβΐ

5ег

А1а

С1у

Азр

Суз

Рго

195

200

205

С1и

Ьеи

(Яу

Азр

Уа1

Зег

(Яи

А1а

Азр

Агд

Тгр

А1а

Уа1

(Яи

Ьеи

210

215

220

ТЪг

(Яу

(Яп

11е

Азп

СЯи

ТЬг

Уа1

Агд

(Яи

А1а

(Яи

Агд

Н18

Азр

225

230

235

240

А1а

Ьеи

РЬе

Уа1

Ьеи

Рго

Азр

А1а

Азр

(Яи

ΗΪ8

ТЬг

Зег

Суз

А1а

245

250

255

Рго

(Яп

Агд

Тгр

А1а

Азр

11е

(Яп

(Яу

(Яп

ТЬг

Азр

А1а

260

265

270

Туг

Рго

Ьеи

Η13

Рго

ТЬг

Зег

А1а

(Яу

ΗΪ8

(Яи

А1а

МеЬ

А1а

275

280

285

Уа1

Агд

Азр

А1а

Ьеи

(Яу

Ьеи

(Яи

Рго

Уа1

(Яп

Рго

290

295

300

<210> 81 <211> 3000 <212> ΟΝΑ <213> СогупеЬасЬегхит е££1с1епз <400> 81 ееседдддед ьеаеддддее дсеаесддсС сдСсседдде ддаесссдсс аддрддддра60 еесасддддд асЫЯЬдЬдЬ ссаасадссд адааЬдадЬд сссЬдадсдд едддааедад120 дедддсдддд седедесдсс аСдадддддс ддсдддсесе дрддрдсссс дсдасссссд180 дссссддЬда дсддрдаард аааЬссддсЬ дЪааЬсадса Ьсссдедссс ассссдЬсдд240 ддаддьсадс дсссддадед есЬасдсаде сддаессесе сддасЬсддс саЬдсЬдЬсд300 дсадсаЬсдс дсесссддде сСЪддсдЬсс сЬсддседре сЬдссЬдсЬд ессседдаад360 дсдаааедае сассддддад едаеасассд деддесесае сссддаедсс сасеесддсд420 ссаЬссддса аеесдддсад сессдддедд аадеаддрдд саессдардс десддедасд480 ссаеадеддд сдаадаесЬс аЬссЬдсЬсд адддедсРса ддссасесес сддаЬсдаЬа540 есдддддсдЬ ссЬЬдаЬддс дЬссЬЬдсЬд ааассдаддЬ дсадсЬЬдЬд ддсЬЬссааЬ600 еесдсассас ддадсдддас даддсЬддаа Ьдасддссда ададсссдед дЬддассЬса660 асдааддЬдд дЬадСсссдЬ десаесаеед аддаасасдс ссЬссассдс асссадсеед720

ЬддссддадЬ ЬдЬсдЬаддс дсЬддсаЬсс адаадддааа сдаСсЬсаЬа ЬЬедЬсддЬд780

ЬдсЬсадаса ЬдаЬсЬЬссЪ ЬЬдсЬдЬсдд ЬдЬсЬддЬас ЬассасддЬа дддсРдааРд840 саасСдъеае ьееъседееа ееееаддаае Сддессаеае сссасаддсЬ ддседеддес900 аааЬсдЬсаЬ саадЬааЬсс сЬдЬсасаса аааЬдддЬдд ЬдддадсссС ддЬсдсддЬЬ960 ссдЬдддадд сдссдЬдссс сдсаддаЬсд ЬсддсаЬсдд сддаеседдс сддеассссд1020 сддЬдааЬаа ааЬсаЬЬсЬд еаассеесае сасддеедде ЬЬСаддЬаЬс сдссссееес1080 десседассс сдЬссссддс дсдсдддадс ссдсдддеед сддеадасад дддадасдЬд1140 дасассаЬда ддасаасдде саЬсдсадса адсдсаееас ессеесРсдс сддаРдсдсд1200 даЬддддссс дддаддадас сдссддЬдса ссдссдддед адессессдд дддсаессдд1260 даддаддддд сддаддсдСс дасаадсаЬс ассдасдесе асаСсдсссе сддддаСРсс1320 еаедсддсда едддсдддсд ддаесадссд ееасддддрд адссдеесед ссЬдсдсЬсд1380 ессддеааее асссддаасе ссЬссасдса даддЬсассд аесесассед ссадддддсд1440 дедассдддд аЬсЪдсЬсда асссаддасд сЬдддддадс дсасдсЪдсс ддсдсаддЪд1500 даедсдседа сддаддасас сасссЬддСс асссЬсЬсса есдддддсаа едассесдда1560

ЬЬсддддадд еддсдддаед саЬссдддаа сддаесдссд дддадаасдс едаедаррдс1620 деддассрдс Ьдддддааас саРсддддад садсесдаес адсЬЬссссс дсадсрддас1680 сдсдЬдсасд аддсЬаРссд ддассдсдсс ддддасдсдс аддРСдеддР сассддееас1740 сЬдссдсЬсд Ьдеседссдд ддасЬдсссс даасЬддддд аРдЬсЬссда ддсддаРсдР1800 сдеедддсдд ЬЬдадседас сдддсадаЪс аасдадассд едсдсдаддс ддссдаасда1860 сасдаЬдссс есееедессе дсссдасдае дссдаЬдадс асассадеед едсассссса1920 садсадсдсе дддсддаЬае ссадддссаа садассдаЬд ссЬаЬссдсЬ дсасссдасс1980 ессдссддсс аРдаддсдае ддссдссдсс дессдддасд сдседддссе ддаассддес2040

- 142 018153

143 018153

Зег

Ьуз

А1а

Туг

Рго

Туг

Ьеи

Тгр

О1п

А1а

ΗΪ8

Зег

Рго

Зег

65

70

75

80

Рке

Зег

РЬе

Мек

А1а

Суз

5ег

СЯу

А1а

Агд

ТЬг

С1у

Азр

Уа1

Ьеи

А1а

85

90

95

Азп

С1п

Ьеи

С1у

ТЬг

Ьеи

Азп

Зег

ТЬг

С1у

Ьеи

Уа1

5ег

Ьеи

ТЬг

100

105

110

11е

С1у

Азп

Азр

А1а

(Яу

РЬе

Зег

Азр

Уа1

Мек

ТЬг

Суз

Уа1

115

120

125

Ьеи

<31п

Зег

Азр

Зег

А1а

Суз

Ьеи

Зег

Агд

11е

Азп

ТЬг

А1а

Ьуз

А1а

130

135

140

Туг

Уа1

Азр

Зег

ТЬг

Ьеи

Рго

СЯу

С1п

Ьеи

Азр

Зег

Уа1

Туг

ТЬг

А1а

145

150

155

160

11е

Зег

ТЬг

Ьуз

А1а

Рго

Зег

А1а

Ηίβ

Уа1

А1а

Уа1

Ьеи

С1у

Туг

Рго

165

170

175

Агд

РЬе

Туг

Ьуз

Ьеи

СЯу

О1у

Зег

Суз

Ьеи

А1а

С1у

Ьеи

Зег

С1и

ТЬг

180

185

190

Ьуз

Агд

Зег

А1а

11е

Азп

Азр

А1а

Азр

Туг

Ьеи

Азп

Зег

А1а

11е

195

200

205

А1а

Ьуз

Агд

А1а

Азр

ΗΪ8

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

СЯу

Азр

Уа1

Ьуз

Зег

210

215

220

ТЬг

РЬе

ТЬг

С1у

ΗΪ8

(Яи

11е

Суз

Зег

ТЬг

Тгр

Ьеи

ΗΪ8

Зег

225

230

235

240

Ьеи

Азр

Ьеи

Азп

11е

(Яу

С1п

Зег

Туг

ΗΪ8

Рго

ТЬг

А1а

СЯу

245

250

255

О1п

Зег

С1у

Туг

Ьеи

Рго

Уа1

Мек

Азп

Зег

Уа1

А1а

260 265 <210> 85 <211> 1980 <212> ΏΝΑ <213> Зкгеркотусез а'/епигСШз <400> 85 ссассдссдд дксддсддсд адксксскдд ссксддксдс ддададдккд дссдкдкадс60 сдкксадсдс ддсдссдаас дкскксккса ссдкдссдсс дкасксдккд аксаддссск120 кдсссккдск сдасдсддсс ккдаадссдд кдсссккскк дадсдкдасд акдкадскдс180 ссккдаксдс ддкдддддад ссддсддсда дсассдкдсс сксддссддд дкддсскддд240 сдддсадкдс ддкдаакссд сссасдаддд сдссддксдс сасддсддкк аксдсддсда300 кссддакскк сккдскасдс адскдкдсса касдадддад кссксскскд ддсадсддсд360 сдсскдддкд дддсдсасдд скдкдддддд кдсдсдсдкс аксасдсаса сддссскдда420 дсдксдкдкк ссдссскддд ккдадкааад ссксддссак скасдддддк ддсксааддд480 адккдадасс скдксакдад кскдасакда дсасдсаакс аасддддссд кдадсасссс540 ддддсдассс сддааадкдс сдадаадкск кддсакддас аскксскдкс аасасдсдка600 дскддкасда сддккасддс ададаксскд скааадддад дккссакдад асдкксссда660 аккасддсак асдкдасскс аскссксскс дссдксддск дсдсссксас сддддсадсд720 асддсдсадд сдкссссадс сдссдсддсс асдддскакд кддсссксдд сдасксдкас780 ксдкссддкд ксддсдссдд садскасскс адскссадсд дсдаскдсаа дсдсадкксд840 ааддсскакс сдкасскскд дсаддссдсд сакксассск сдксдкксад ккксакддск900 кдсксдддсд сксдкасддд кдакдксскд дссааксадс ксддсассск даасксдксс960 ассддсскдд ксксссксас саксддаддс аасдасдсдд дсккскссда сдксакдасд1020 асскдкдкдс кссадкссда садсдсскдс сксксссдса ксаасасддс дааддсдкас1080 дксдасксса ссскдсссдд ссаасксдас адсдкдкаса сддсдаксад сасдааддсс1140 ссдксддссс акдкддссдк дскдддскас ссссдсккск асаааскддд сддсксскдс1200 сксдсдддсс ксксддадас саадсддксс дссаксаасд асдсддссда скакскдаас1260 адсдссаксд ссаадсдсдс сдссдассас ддскксасск ксддсдасдк саададсасс1320 кксассддсс акдадакскд скссадсадс асскддскдс асадксксда сскдскдаас1380 аксддссадк сскассассс дассдсддсс ддссадкссд дсддскакск дссддксакд1440 аасадсдкдд сскдадсксс сасддсскда акккккаадд сскдаакккк кааддсдаад1500 дкдаассдда адсддаддсс ссдкссдксд дддкскссдк сдсасаддкс ассдадаасд1560 дсасддадкк ддасдксдкд сдсассдддк сдсдсасскс дасддсдакс ксдкксдада1620 ксдккссдск сдкдксдкас дкддкдасда асасскдскк скдскдддкс кккссдссдс1680 ксдссдддаа ддасадсдкс ккссадсссд дакссдддас сксдсссккс ккддксассс1740 адсддкаскс сассксдасс ддсасссддс ссассдкдаа ддксдссдкд аасдкдддсд1800 сскдддсддк дддсддсддд саддсассдд адкадксддк дкдсасдссд дкдассдкса1860 сскксасдда скдддссддс ддддксдксд кассдссдсс дссассдссд ссксссддад1920 кддадсссда дскдкддксд сссссдссдк сддсдккдкс дкссксдддд дкккксдаас1980 <210> 86 <211> 372 <212> РНТ <213> ТЬегтоЫкхйа кизса <400> 86

Мек (Яу Зег С1у Рго Агд А1а А1а ТЬг Агд Агд Агд Ьеи РЬе Ьеи С1у

1

5

10

15

11е

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

ТЬг

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Уа1

20

25

30

Рго

ТЬг

СЯу

Агд

(Яи

ТЬг

Ьеи

Тгр

Агд

Мек

Тгр

Суз

(Яи

А1а

ТЬг

(Яп

35

40

45

Азр

Тгр

Суз

Ьеи

(Яу

Уа1

Рго

^7а1

Азр

Зег

Агд

(Яу

(Яп

Рго

А1а

(Яи

50

55

60

Азр

СЯу

(Яи

РЬе

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

СЯп

А1а

ТЬг

Тгр

СЯу

65

70

75

80

Азп

Туг

А1а

Ьеи

(Яу

Азр

Зег

Туг

Зег

СЯу

Азр

(Яу

А1а

Агд

85

90

95

Азр

Туг

Рго

(Яу

ТЬг

А1а

Уа1

Ьуз

(Яу

Суз

Тгр

Агд

Зег

А1а

100

105

110

Азп

А1а

Туг

Рго

(Яи

Ьеи

Уа1

А1а

(Яи

А1а

Туг

Азр

РЬе

А1а

(Яу

ΗΪ3

115

120

125

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Суз

Зег

СЯу

СЯп

Агд

(Яу

Туг

А1а

Мек

Ьеи

Азр

130

135

140

А1а

11е

Азр

(Яи

Уа1

(Яу

Зег

С1П

Ьеи

Аер

Тгр

Азп

Зег

Рго

Н13

ТЬг

145

150

155

160

Зег

Ьеи

Уа1

ТЬг

11е

(Яу

Не

<31у

СЯу

Азп

Азр

Ьеи

(Яу

РЬе

Зег

ТЬг

165

170

175

Уа1

Ьеи

ьуз

ТЬг

Суз

Мек

Уа1

Агд

Уа1

Рго

Ьеи

Азр

Зег

Ьуз

А1а

180

185

190

Суз

ТЬг

Азр

СЯп

(Яи

Азр

А1а

11е

Агд

Ьуз

Агд

Мек

А1а

Ьуз

РЬе

(Яи

195

200

205

ТЬг

РЬе

СЯи

(Яи

Ьеи

11е

Зег

(Яи

Уа1

Агд

ТЬг

Агд

А1а

Рго

Азр

210

215

220

А1а

Агд

11е

Ьеи

Уа1

СЯу

Туг

Рго

Агд

11е

РЬе

Рго

(Яи

СЯи

Рго

225

230

235

240

ТЬг

СЯу

А1а

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

А1а

Зег

АЗП

(Яп

Агд

Тгр

Ьеи

Азп

245

250

255

(Яи

ТЬг

11е

(Яп

О1и

РЬе

Азп

СЯп

Ьеи

А1а

(Яи

А1а

Уа1

А1а

(7а 1

144

- 145 018153 < 212 > РКТ <213> Аеготопаз заТтопгсгба <400> 90

А1а

Азр

ТЬг

Агд

Рго

А1а

РЬе

Зег

Агд

Не

Уа1

Мек

РЬе

<31у

Азр

Зег

1

5

10

15

Ьеи

Зег

Азр

ТЬг

(31у

Ьуз

Мек

Туг

Зег

Ьуз

Мек

Агд

О1у

Туг

Ьеи

Рго

20

25

30

Зег

Рго

Туг

С1и

С1у

Агд

РЬе

Зег

Азп

С1у

Рго

Уа1

Тгр

35

40

45

Ьеи

(31и

С1п

Ьеи

ТЬг

Ьуз

<31п

РЬе

Рго

О1у

Ьеи

ТЬг

Не

А1а

Азп

(31и

50

55

60

А1а

С1и

О1у

С1у

А1а

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

Туг

АЗП

Ьуз

Не

Зег

Тгр

Азр

65

70

75

80

Рго

Ьуз

Туг

С31п

Уа1

Не

АЗП

Азп

Ьеи

Азр

Туг

С1и

Уа1

ТЬг

С1п

РЬе

85

90

95

Ьеи

61п

Ьуз

Азр

Зег

РЬе

Ьуз

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

Не

Ьеи

Тгр

Уа1

100

105

110

С1у

А1а

Азп

Азр

Туг

Ьеи

А1а

Туг

С1у

Тгр

АЗП

ТЬг

С1и

С1п

Азр

А1а

115

120

125

Ьуз

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

11е

Зег

Азр

А1а

Азп

Агд

Мек

Уа1

Ьеи

130

135

140

Азп

<31у

А1а

Ьуз

С1п

Не

Ьеи

РЬе

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

<31у

С1п

145

150

155

160

АЗП

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

<31 п

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

Уа1

Зег

Ηίβ

Уа1

165

170

175

Зег

А1а

Туг

Ηίβ

Азп

Ьуз

Ьеи

АЗП

Ьеи

А1а

Агд

σΐη

Ьеи

А1а

180

185

190

Рго

ТЬг

С1у

Мек

Уа1

Ьуз

Ьеи

РЬе

<31и

11е

Азр

Ьуз

<31п

РЬе

А1а

О1и

195

200

205

Мек

Ьеи

Агд

Азр

Рго

С1п

Азп

РЬе

С1у

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

С1и

АЗП

Рго

210

215

220

Суз

Туг

Азр

С1у

Туг

νβΐ

Тгр

Ьуз

Рго

РЬе

Агд

Зег

А1а

Зег

Рго

225

230

235

240

Ьеи

Азп

Суз

С1и

С1у

Ьуз

Мек

РЬе

Тгр

Азр

С1п

Уа1

Н13

Рго

ТЬг

245 250 255

Уа1 Уа1

Нхз А1а А1а Ьеи Зег С1и Агд А1а А1а ТЬг РЬе 11е С1и ТЬг

260 С1и РЬе Ьеи А1а Ηίβ <31у

265

270

С1п

Туг

275

280

<210

>> 91

<211

> 295

<212

:> РЕТ

<213

> Аеготопаз

за!топхсхЬа

<400

1> 91

Не

Уа1

Мек

РЬе

С1у

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

ТЬг

б1у

Ьуз

Мек

Туг

Зег

¹

5

10

15

Ьуз

Мек

Агд

С1у

Туг

Ьеи

Рго

Зег

Рго

Туг

С1и

<31у

Агд

20

25

30

РЬе

Зег

Азп

С1у

Рго

Уа1

Тгр

Ьеи

С1и

С1п

Ьеи

ТЬг

Ьуз

<31п

РЬе

Рго

35

40

45

С1у

Ьеи

ТЬг

11е

А1а

Азп

<31и

А1а

С1и

С1у

<31у

А1а

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

50

55

60

Туг

Азп

Ьуз

Не

Зег

Тгр

Азп

Рго

Ьуз

Туг

О1п

Уа1

Туг

Азп

Ьеи

65

70

75

80

Азр

Туг

<31и

Уа1

ТЬг

<31п

РЬе

Ьеи

С1п

Ьуз

Азр

Зег

РЬе

Ьуз

Рго

Азр

85

90

95

Азр

Ьеи

Уа1

11е

Ьеи

Тгр

Уа1

<31у

А1а

Азп

Азр

Туг

Ьеи

А1а

Туг

С1у

100

105

110

Тгр

Азп

ТЬг

<31и

С1п

Азр

А1а

Ьуз

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

Не

Зег

Азр

115

120

125

А1а

Азп

Агд

Мек

Уа1

Ьеи

Азп

<31у

А1а

Ьуз

С1п

11е

Ьеи

РЬе

130

135

140

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

С1у

<31п

Азп

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

С1п

Ьуз

Уа1

145

150

155

160

Уа1

<31и

А1а

Уа1

Зег

Нхз

Уа1

Зег

А1а

Туг

Нхз

Азп

Ьуз

Ьеи

165

170

175

Азп

Ьеи

А1а

Агд

<31п

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

С1у

Мек

Уа1

Ьуз

Ьеи

РЬе

<31и

180

185

190

11е

Азр

Ьуз

С1п

РЬе

А1а

С1и

Мек

Ьеи

Агд

Азр

Рго

С1п

Азп

РЬе

О1у

195

200

205

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

<31и

Азп

Рго

Суз

Туг

Азр

С1у

Туг

Уа1

Тгр

Ьуз

210

215

220

Рго

РЬе

А1а

ТЬг

Агд

Зег

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Агд

С1п

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

225

230

235

240

Зег

Рго

С1п

С1и

Агд

Ьеи

А1а

11е

А1а

С1у

Азп

Рго

Ьеи

А1а

С1п

245

250

255

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

Мек

А1а

Агд

Зег

А1а

Зег

Рго

Ьеи

Азп

Суз

260

265

270

<31и

С1у

Ьуз

Мек

РЬе

Тгр

Азр

С1п

Уа1

Нхз

Рго

ТЬг

Уа1

Нхз

146

280

285

275

<210> 92 <211> 247 <212> РКТ <213> ЗЬгерЬотусез соеИсо!ог

<400> 92

Туг 1

Уа1

А1а

Ьеи

СЯу Азр Зег Туг Зег А1а

СЯу Зег (Яу νβΐ

Ьеи 15

Рго

5

10

Уа1

Азр

РГО

А1а

Азп

Ьеи

Суз

Ьеи

Агд

Зег

ТЬг

А1а

Азп

Туг

Рго

20

25

30

Н13

Уа1

11е

А1а

Азр

ТЬг

СЯу

А1а

Агд

Ьеи

ТЬг

Азр

Уа1

ТЬг

Суз

35

40

45

СЯу

А1а

Θΐη

ТЬг

А1а

Азр

РЬе

ТЬг

Агд

А1а

(Яп

Туг

Рго

СЯу

Уа1

50

55

60

А1а

Рго

СЯп

Ьеи

Азр

А1а

Ьеи

СЯу

ТЬг

(Яу

ТЬг

Азр

Ьеи

Уа1

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

ТЬг

Не

(Яу

СЯу

АЗП

Азр

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

11е

Азп

А1а

Не

ТЬг

А1а

85

90

95

Суз

СЯу

ТЬг

А1а

СЯу

Уа1

Ьеи

Зег

СЯу

Ьуз

(Яу

Зег

Рго

Суз

Ьуз

100

105

но

Азр

Агд

Н18

СЯу

ТЬг

Зег

РЬе

Азр

(Яи

11е

СЯи

А1а

Азп

ТЬг

Туг

115

120

125

Рго

А1а

Ьеи

Ьуз

СЯи

А1а

Ьеи

СЯу

Уа1

Агд

А1а

Агд

А1а

Рго

Н13

130

135

140

А1а

Агд

Уа1

А1а

Ьеи

СЯу

Туг

Рго

Тгр

Не

ТЬг

Рго

А1а

ТЬг

А1а

145

150

155

160

Азр

Рго

Зег

Суз

РЬе

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

С1у

Азр

νβΐ

Рго

165

170

175

Туг

Ьеи

Агд

А1а

11е

СЯп

А1а

ΗΪ3

Ьеи

Азп

Азр

А1а

Уа1

Агд

А1а

180

185

190

А1а

СЯи

ТЬг

СЯу

А1а

ТЬг

Туг

Уа1

Азр

РЬе

Зег

СЯу

νβΐ

Зег

Азр

195

200

205

СЯу

Н1з

Азр

А1а

Суз

СЯи

А1а

Рго

<31у

ТЬг

Агд

Тгр

Не

СЯи

Рго

Ьеи

210

215

220

Ьеи

РЬе

СЯу

Ηίβ

Зег

Ьеи

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

Рго

Азп

А1а

Ьеи

СЯу

СЯи

225

230

235

240

Агд

МеЬ

А1а

СЯи

Ηίθ

ТЬг

245

<210> 93 <211> 247 <212> РКТ

<213> ЗЬгерЬотусез

сое1

1со1ог

<400> 93

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

(Яу

Азр

Зег

Туг

Зег

А1а

(Яу

Зег

СЯу

Уа1

Ьеи

Рго

10 15

Уа1

Азр

Рго

А1а

Азп

Ьеи

Суз

Ьеи

Агд

Зег

ТЬг

А1а

Азп

Туг

Рго

20

25

30

Ηίβ

Уа1

11е

А1а

Азр

ТЬг

СЯу

А1а

Агд

Ьеи

ТЬг

Азр

Уа1

ТЬг

Суз

35

40

45

СЯу

А1а

СЯп

ТЬг

А1а

Азр

РЬе

ТЬг

Агд

А1а

(Яп

Туг

Рго

СЯу

Уа1

50

55

60

А1а

Рго

сЯп

Ьеи

Азр

А1а

Ьеи

(Яу

ТЬг

СЯу

ТЬг

Азр

Ьеи

Уа1

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

ТЬг

Не

СЯу

Азп

Азр

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Не

Азп

А1а

Не

ТЬг

А1а

85

90

95

Суз

СЯу

ТЬг

А1а

(Яу

Уа1

Ьеи

Зег

СЯу

Ьуз

(Яу

Зег

Рго

Суз

Ьуз

100

105

110

Азр

Агд

Ηίβ

(Яу

ТЬг

Зег

РЬе

Азр

(Яи

Не

(Яи

А1а

Азп

ТЬг

Туг

115

120

125

Рго

А1а

Ьеи

Ьуз

(Яи

А1а

Ьеи

(Яу

νβΐ

Агд

А1а

Агд

А1а

Рго

Ηίβ

130

135

140

А1а

Агд

νβΐ

А1а

Ьеи

СЯу

Туг

Рго

Тгр

Не

ТЬг

Рго

А1а

ТЬг

А1а

145

150

155

160

Азр

Рго

Зег

Суз

РЬе

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

СЯу

Азр

Уа1

Рго

165

170

175

Туг

Ьеи

Агд

А1а

11е

(Яп

А1а

ΗΪ8

Ьеи

Азп

Азр

А1а

Уа1

Агд

А1а

180

185

190

А1а

СЯи

ТЬг

СЯу

А1а

ТЬг

Туг

Уа1

Азр

РЬе

Зег

СЯу

\7а1

Зег

Азр

195

200

205

СЯу

Н13

Азр

А1а

Суз

(Яи

А1а

Рго

(Яу

ТЬг

Агд

Тгр

Не

СЯи

Рго

Ьеи

210

215

220

Ьеи

РЬе

СЯу

Нгз

Зег

Ьеи

Уа1

Рго

Уа1

Ηίβ

Рго

Азп

А1а

Ьеи

(Яу

(Яи

225

230

235

240

Агд

Мер

А1а

СЯи

Н13

ТЬг

245 <210> 94 <211> 198 <212> РКТ

<213

> ЗассЬаготусез

0ΘΓθνί5ί3θ

<400

> 94

РЬе

Ьеи

РЬе

(Яу

Азр

Зег

11е

ТЬг

(Яи

РЬе

А1а

РЬе

Азп

ТЬг

Агд

1

5

10

15

Рго

Не

(Яи

Азр

СЯу

Ьуз

Азр

СЯп

туг

А1а

Ьеи

СЯу

А1а

Ьеи

Уа1

20

25

30

Азп

СЯи

Туг

ТЬг

Агд

Ьуз

МеС

Азр

Не

Ьеи

СЯп

Агд

(Яу

РЬе

Ьуз

(Яу

35

40

45

Туг

ТЬг

Зег

Агд

Тгр

А1а

Ьеи

Ьуз

Не

Ьеи

Рго

СЯи

Не

Ьеи

Ьуз

ΗΪ3

50

55

60

(Яи

Зег

Азп

Не

Уа1

МеЬ

А1а

ТЬг

Не

РЬе

Ьеи

СЯу

А1а

Азп

Азр

А1а

70 75 80

147

Суз

Зег

А1а

С1у

Рго

С1п

Зег

Уа1

Рго

Ьеи

Рго

С1и

РИе

Не

Азр

Азп

85

90

95

11е

Агд

С1п

Мее

Уа1

Зег

Ьеи

Мее

Ьуз

Зег

Туг

ΗΪ8

11е

Агд

РГО

11е

100

105

но

11е

61у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Азр

Агд

С1и

Ьуз

Тгр

С1и

Ьуз

С1и

Ьуз

115

120

125

Зег

С1и

Не

А1а

Ьеи

С1у

Туг

РНе

Агд

ТНг

Азп

С1и

Азп

РНе

А1а

130

135

140

Х1е

Туг

Зег

Азр

А1а

Ьеи

А1а

Ьуз

Ьеи

А1а

Азп

С1и

<31и

Ьуз

Уа1

Рго

145

150

155

160

РИе

Уа1

А1а

Ьеи

Азп

Ьуз

А1а

РНе

С1п

С1и

СЯу

Азр

А1а

Тгр

165

170

175

С1п

С1П

Ьеи

ТНг

Азр

С1у

Ьеи

ΗΪ8

РНе

Зег

СЯу

Ьуз

С1у

Туг

Ьуз

180

185

190

11е

РНе

ΗΪ8

Азр

С1и

Ьеи

195 <210> 95 <211> 318 <212> РКТ

<213

> Аеготопаз

заТтопгс

Яда

<40С

ι> 95

А1а

Азр

ТНг

Агд

Рго

А1а

РНе

Зег

Агд

11е

Уа1

мее

РНе

С1у

Азр

Зег

1

5

10

15

Ьеи

Зег

Азр

ТНг

<31у

Ьуз

Мее

Туг

Зег

Ьуз

мее

Агд

СЯу

Туг

Ьеи

Рго

20

25

30

Зег

Рго

Туг

(Э1и

<31у

Агд

РНе

Зег

Азп

С1у

Рго

Уа1

Тгр

35

40

45

Ьеи

С1и

СЯп

Ьеи

ТНг

Ьуз

<31п

РНе

Рго

С1у

Ьеи

ТНг

Не

А1а

АЗП

<31и

50

55

60

А1а

О1и

СЯу

б1у

А1а

ТНг

А1а

Уа1

А1а

Туг

Азп

Ьуз

Не

Зег

Тгр

Азп

65

70

75

80

Рго

Ьуз

Туг

(31п

Уа1

11е

Азп

Ьеи

Азр

Туг

<31и

Уа1

ТНг

С1п

РНе

85

90

95

Ьеи

<31п

Ьуз

Азр

Зег

РИе

Ьуз

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

Не

Ьеи

Тгр

Уа1

100

105

110

С1у

А1а

Азп

Азр

Туг

Ьеи

А1а

Туг

С1у

Тгр

Азп

ТНг

С1и

С1п

Азр

А1а

115

120

125

Ьуз

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

11е

Зег

Азр

А1а

АЗП

Агд

Мее

Уа1

Ьеи

130

135

140

Азп

С1у

А1а

Ьуз

С1п

11е

Ьеи

РНе

Азп

Ьеи

РГО

Азр

Ьеи

С1у

С1п

145

150

155

160

Азп

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

С1п

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

νβΐ

Зег

Н1з

Уа1

165

170

175

Зег

А1а

Туг

ΗΪ3

Азп

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьеи

А1а

Агд

С1п

Ьеи

А1а

180

185

190

Рго

ТИг

СЯу

Мее

Уа1

Ьуз

Ьеи

РНе

С1и

Не

Азр

Ьуз

С1п

РНе

А1а

С1и

195

200

205

Мее

Ьеи

Агд

Азр

Рго

С1п

Азп

РНе

С1у

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

С1и

Азп

Рго

210

215

220

Суз

Туг

Азр

С1у

<31у

Туг

Уа1

Тгр

Ьуз

Рго

РНе

А1а

ТНг

Агд

Зег

Уа1

225

230

235

240

Зег

ТИг

Азр

Агд

С1п

Ьеи

Зег

А1а

РНе

Зег

Рго

СЬп

С1и

Агд

Ьеи

А1а

245

250

255

Не

А1а

<31у

Азп

Рго

Ьеи

А1а

С1п

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

Мее

А1а

260

265

270

Агд

Зег

А1а

Зег

Рго

Ьеи

Азп

Суз

С1и

СЯу

Ьуз

Мее

РНе

Тгр

Азр

275

280

285

С1п

Уа1

ΗΪ8

Рго

ТНг

Уа1

ΗΪ3

А1а

АЬа

Ьеи

Зег

С1и

Агд

А1а

290

295

300

А1а

ТНг

РНе

Не

<31и

ТНг

Θΐη

Туг

61и

РНе

Ьеи

А1а

Н13

С1у

305 310 315 <210> 96 :211> 320 :212> РКТ

<213

ДзеопЬа

зо1а

тасе

<40С

1> 96

С1п

Зег

СЬу

Азп

Рго

Азп

УаЬ

АЬа

Ьуз

УаЬ

СЬп

Агд

мее

УаЬ

РНе

1

5

10

15

СЬу

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

Не

СЬу

ТНг

Туг

ТНг

Рго

УаЬ

АЬа

СЬп

АЬа

20

25

30

Уа1

СЬу

Ьуз

РНе

ТНг

АЗП

Рго

СЬу

Рго

11е

Тгр

А1а

СЬи

35

40

45

ТИг

Уа1

АЬа

А1а

СЬп

Ьеи

СЬу

УаЬ

ТНг

Ьеи

ТНг

Рго

А1а

УаЬ

Мее

СЬу

50

55

60

Туг

А1а

ТНг

Зег

УаЬ

СЬп

Азп

Суз

Рго

Ьуз

АЬа

СЬу

Суз

РНе

Азр

Туг

65

70

75

80

А1а

С1п

СЬу

Зег

Агд

УаЬ

ТНг

Азр

Рго

Азп

СЬу

11е

СЬу

НЬз

Азп

85

90

95

СЬу

С1у

АЬа

СЬу

АЬа

Ьеи

ТНг

Туг

Рго

УаЬ

СЬп

Ьеи

А1а

Азп

100

105

110

РНе

Туг

АЬа

Зег

Азп

ТНг

РНе

Азп

СЬу

Азп

Азр

УаЬ

115

120

125

РНе

УаЬ

Ьеи

АЬа

СЬу

Зег

Азп

Азр

11е

РНе

Тгр

ТНг

ТИг

АЬа

130

135

140

А1а

ТНг

Зег

СЬу

Зег

СЬу

Уа1

ТНг

Рго

АЬа

11е

А1а

ТНг

А1а

СЬп

Уа1

145

150

155

160

СЬп

С1п

АЬа

ТНг

Азр

Ьеи

УаЬ

СЬу

Туг

УаЬ

Ьуз

Азр

мее

11е

АЬа

165

170

175

Ьуз

С1у

АЬа

ТНг

СЬп

УаЬ

Туг

УаЬ

РНе

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Зег

Ьеи

180

185

190

ТНг

Рго

Азр

СЬу

УаЬ

АЬа

Зег

СЬу

ТНг

СЬу

СЬп

А1а

Ьеи

ΗΪ3

- 148 018153

195

200

205

А1а

Ьеи

Уа1

С1у

ТИг

РНе

Азп

ТНГ

ТИг

Ьеи

С1п

Бег

С1у

Ьеи

А1а

С1у

210

215

220

ТЬг

Зег

А1а

Агд

11е

Азр

РИе

Азп

А1а

С1п

Ьеи

ТИг

А1а

11е

225

230

235

240

С1П

Азп

С1у

А1а

Зег

РИе

С1у

РЬе

А1а

Азп

ТИг

Бег

А1а

Агд

А1а

Суз

245

250

255

Азр

А1а

ТЬг

Ьуз

11е

Азп

А1а

Ьеи

Уа1

Рго

Зег

А1а

С1у

61у

Бег

260

265

270

Ьеи

РНе

Суз

Зег

А1а

Азп

ТЬг

Ьеи

Уа1

А1а

Зег

С1у

А1а

Азр

Θΐη

Бег

275

280

285

Туг

Ьеи

РИе

А1а

Азр

<31у

Уа1

Н15

Рго

ТИг

ТНг

А1а

С1у

ΗΪ3

Агд

Ьеи

290

295

300

11е

А1а

Зег

Азп

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

А1а

Азр

Азп

Уа1

А1а

ΗΪ5

305

310

315

320

<210> 97

<211> 367

<212> РКТ

<213> АгШ1С1а1 Бедиепсе

<220>

<223

> БупЬИеЫс

Р£ат00657.11 сопзепзиз зедиепсе

<400

|> 97

11е

Уа1

А1а

РИе

С1у

Азр

Бег

Ьеи

ТНг

Азр

С1у

<31у

А1а

Туг

1

5

10

15

<31у

Азр

Зег

Азр

С1у

(31у

<31у

Тгр

С1у

А1а

С1у

Ьеи

А1а

Азр

Агд

Ьеи

20

25

30

ТИг

Бег

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

Агд

А1а

Агд

<31у

Агд

<31у

Уа1

Азр

Уа1

РНе

35

40

45

Азп

Агд

<31у

Не

Зег

С1у

Агд

ТНг

Зег

Азр

<31у

Агд

Ьеи

Уа1

Азр

50

55

60

А1а

Агд

Ьеи

νβΐ

А1а

ТИг

Ьеи

РИе

Ьеи

А1а

С1п

РИе

ьеи

61у

Ьеи

65

70

75

80

Азп

Ьеи

Рго

Туг

Ьеи

Бег

&1у

Азр

РИе

Ьеи

Агд

С1у

А1а

Азп

РИе

85

90

95

А1а

Бег

А1а

С1у

А1а

ТИг

Не

Ьеи

<31у

ТИг

Бег

Ьеи

Не

РГО

РИе

Ьеи

100

105

НО

Азп

Не

С1п

Уа1

С1п

РЬе

Ьуз

Азр

РИе

Ьуз

Бег

Ьуз

Уа1

ьеи

С1и

Ьеи

115

120

125

Агд

С1п

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи

<31п

С1и

Ьеи

Агд

Ьеи

Уа1

Рго

Уа1

130

135

140

Ьеи

Азр

А1а

Ьуз

Бег

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

ТЬг

Не

МеИ

Не

<31у

ТИг

Азп

145

150

155

160

Азр

Ьеи

Не

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз

РЬе

С1у

Рго

Ьуз

Бег

ТИг

Ьуз

Бег

Азр

165 170 175

Агд

Азп

Уа1

Зег

Уа1

Рго

С1и

РНе

Агд

Азр

Азп

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьеи

Не

180

185

190

Ьуз

Агд

Ьеи

Агд

Зег

А1а

Азп

С1у

А1а

Агд

Не

Ьеи

Не

ТИг

195

200

205

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азп

Ьеи

Рго

Ьеи

Рго

Ьеи

С1у

Суз

Ьеи

Рго

С1п

Ьуз

210

215

220

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Зег

Ьуз

Азп

Уа1

Азр

А1а

ТЬг

О1у

Суз

225

230

235

240

Ьеи

<31и

Агд

Ьеи

Азп

<31и

А1а

Уа1

А1а

Азр

Туг

Азп

<31и

А1а

Ьеи

Агд

245

250

255

С1и

Ьеи

А1а

С1и

Не

<31и

Ьуз

Ьеи

С1п

А1а

С1п

Ьеи

Агд

Ьуз

Азр

<31у

260

265

270

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

Ьуз

О1и

А1а

Азп

Уа1

Рго

Туг

Уа1

Азр

Ьеи

Туг

Зег

275

280

285

Не

РЬе

<31п

Азр

Ьеи

Азр

О1у

Не

С1п

Азп

Рго

Зег

А1а

Туг

Уа1

Туг

290

295

300

С1у

РЬе

<31и

С1и

ТИг

Ьуз

А1а

Суз

О1у

Туг

С1у

<31у

Агд

Туг

Азп

305

310

315

320

Туг

Азп

Агд

Уа1

Суз

О1у

Азп

А1а

С1у

Ьеи

Суз

Ьуз

Уа1

ТЬг

А1а

Ьуз

325

330

335

А1а

Суз

Азр

А1а

Зег

Туг

Ьеи

А1а

ТЬг

Ьеи

РИе

Тгр

Азр

О1у

340

345

350

РЬе

Ηί3

Рго

Зег

О1и

Ьуз

С1у

Туг

Ьуз

А1а

Уа1

А1а

<31и

А1а

Ьеи

355

360

365

:210> 98 :211> 367 :212> РКТ :213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе :220>

:223> ЗупЬИеЫс Р£ат00657.11 сопзепзиз зедиепсе

<400> 9?

Не

Уа1

А1а

РЬе

С1у

Азр

Зег

Ьеи

ТЬг

Азр

<31у

С1у

А1а

Туг

1

5

10

15

С1у

Азр

Зег

Азр

О1у

С1у

СЯу

Тгр

С1у

А1а

С1у

Ьеи

А1а

Азр

Агд

Ьеи

20

25

30

ТИг

Зег

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

Агд

А1а

Агд

С1у

Агд

С1у

Ча1

Азр

Уа1

РЬе

35

40

45

Азп

Агд

С1у

Не

Зег

С1у

Агд

ТНг

Зег

Азр

С1у

Агд

Ьеи

Уа1

Азр

50

55

60

А1а

Агд

Ьеи

Уа1

А1а

ТЬг

Ьеи

РЬе

Ьеи

А1а

<31п

РИе

Ьеи

С1у

Ьеи

65

70

75

80

Азп

Ьеи

Рго

Туг

Ьеи

Зег

С1у

Азр

РЬе

Ьеи

Агд

С1у

А1а

АЗП

РИе

85

90

95

А1а

Зег

А1а

С1у

А1а

ТЬг

Не

Ьеи

С1у

ТЬг

Зег

Ьеи

Не

Рго

РИе

Ьеи

100

105

но

149

Азп

Не

С1п

Уа1

СЯп

РЬе

Ьуз

Азр

РЬе

Ьуз

Зег

Ьуз

Уа1

Ьеи

СЯи

Ьеи

115

120

125

Агд

Θ1Π

А1а

Ьеи

СЯу

Ьеи

СЯп

СЯи

Ьеи

Агд

Ьеи

Уа1

Рго

Уа1

130

135

140

Ьеи

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

ТЬг

11е

МеЬ

Не

СЯу

ТИг

Азп

145

150

155

160

Азр

Ьеи

Не

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз

РИе

СЯу

Рго

Ьуз

Зег

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

165

170

175

Агд

Азп

Уа1

Зег

Уа1

Рго

СЯи

РНе

Агд

Азр

Азп

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьеи

11е

180

185

190

Ьуз

Агд

Ьеи

Агд

Зег

А1а

Азп

СЯу

А1а

Агд

Не

11е

Не

Ьеи

Не

ТИг

195

200

205

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азп

Ьеи

Рго

Ьеи

Рго

Ьеи

СЯу

Суз

Ьеи

Рго

СЯп

Ьуз

210

215

220

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Зег

Ьуз

Азп

Уа1

Азр

А1а

ТЬг

СЯу

Суз

225

230

235

240

Ьеи

СЯи

Агд

Ьеи

Азп

С1и

А1а

Уа1

А1а

Азр

Туг

Азп

(Яи

А1а

Ьеи

Агд

245

250

255

СЯи

Ьеи

А1а

СЯи

Не

СЯи

Ьуз

Ьеи

СЯп

А1а

(Яп

ьеи

Агд

Ьуз

Азр

<31у

260

265

270

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

Ьуз

(Ли

А1а

Азп

Уа1

Рго

Туг

Уа1

Азр

Ьеи

Туг

Зег

275

280

285

Не

РЬе

СЯп

Азр

Ьеи

Азр

С1у

Не

СЯп

Азп

Рго

Зег

А1а

Туг

Уа1

Туг

290

295

300

СЯу

РЬе

СЯи

ТЬг

Ьуз

А1а

Суз

СЯу

Туг

(Яу

С1у

Агд

Туг

Азп

305

310

315

320

Туг

Азп

Агд

Уа1

Суз

СЯу

Азп

А1а

СЯу

Ьеи

Суз

Ьуз

Уа1

ТИг

А1а

Ьуз

325

330

335

А1а

Суз

Азр

А1а

Зег

Туг

Ьеи

А1а

ТЬг

Ьеи

РЬе

Тгр

Азр

СЯу

340

345

350

РЬе

Ηίβ

Рго

Зег

СЯи

Ьуз

СЯу

Туг

Ьуз

А1а

Уа1

А1а

СЯи

А1а

Ьеи

355 360 365 <210> 99 <211> 267 <212> РКТ

<213

;> ЗЬгерЬотусез ЬНегтозассИагх

<400> 99

МеЬ

Агд

Ьеи

ТЬг

Агд

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

Не

Уа1

РИе

А1а

1

5

10

15

Ьеи

А1а

Ьеи

СЯу

Не

Зег

Рго

А1а

СЯп

А1а

СЯу

Рго

20

25

30

А1а

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

Азр

Зег

Туг

Зег

СЯу

Азп

СЯу

А1а

СЯу

35

40

45

Зег

Туг

Не

Азр

Зег

СЯу

Азр

Суз

ΗΪ3

Агд

Зег

Азп

А1а

Туг

50

55

60

Рго

А1а

Агд

Тгр

А1а

Азп

А1а

Рго

Зег

РЬе

ТИг

РИе

А1а

70 75 80

А1а

Суз

Зег СЯу

А1а Уа1 ТЬг ТЬг Азр Уа1 11е Азп Азп С1п Ьеи С1у

85

90

95

А1а

Ьеи

Азп

А1а

Зег

ТИг

СЯу

Ьеи

Уа1

Зег

11е

ТЬг

Не

СЯу

АЗП

100

105

но

Азр

А1а

СЯу

РЬе

А1а

Азр

А1а

МеЬ

ТИг

ТЬг

Суз

Уа1

ТЬг

Зег

Азр

115

120

125

Зег

ТЬг

Суз

Ьеи

Азп

Агд

Ьеи

А1а

ТЬг

А1а

ТИг

Азп

Туг

11е

Азп

ТЬг

130

135

140

ТИг

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

Азр

А1а

Уа1

Туг

Зег

(Яп

Не

Ьуз

А1а

Агд

145

150

155

160

А1а

Рго

Азп

А1а

Агд

Уа1

Ьеи

СЯу

Туг

РГО

Агд

МеЬ

Туг

Ьеи

165

170

175

А1а

Зег

Азп

РГО

Тгр

Туг

Суз

ьеи

СЯу

Ьеи

Зег

АЗП

ТЬг

Ьуз

Агд

А1а

180

185

190

А1а

Не

Азп

ТЬг

ТИг

А1а

Азр

ТНг

Ьеи

Азп

Зег

Уа1

Не

Зег

Агд

195

200

205

А1а

ТИг

А1а

ΗΪ8

СЯу

РЬе

Агд

РИе

С1у

Азр

Уа1

Агд

Рго

ТЬг

РЬе

Азп

210

215

220

Азп

ΗΪ3

СЯи

Ьеи

РИе

СЯу

Азп

Азр

Тгр

Ьеи

ΗΪ8

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьеи

225

230

235

240

Рго

Уа1

Тгр

СЯи

Зег

Туг

ΗΪ8

Рго

ТЬг

Зег

ТИг

СЯу

ΗΪ3

СЯп

Зег

(Яу

245

250

255

Т.уг

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

Азп

А1а

Азп

Зег

ТНг

260 265 <210> 100 <211> 269 <212> РКТ <213> ЗЬгерЬотусез ахегтШИз <400> 100

МеЬ Агд Агд Зег Агд 11е ТЬг

А1а

Туг Уа1 ТЬг Зег Ьеи Ьеи Ьеи А1а

1

5

10

15

Уа1

СЯу

Суз

А1а

Ьеи

ТЬг

СЯу

А1а

ТЬг

А1а

СЯп

А1а

Зег

Рго

А1а

20

25

30

А1а

ТЬг

СЯу

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

СЯу

Азр

Зег

Туг

Зег

СЯу

35

40

45

Уа1

СЯу

А1а

СЯу

Зег

Туг

Ьеи

Зег

СЯу

Азр

Суз

Ьуз

Агд

Зег

50

55

60

Зег

Ьуз

А1а

Туг

Рго

Туг

Ьеи

Тгр

СЯп

А1а

ΗΪΒ

Зег

Рго

Зег

65

70

75

80

РЬе

Зег

РЬе

МеЬ

А1а

Суз

Зег

СЯу

А1а

Агд

ТЬг

СЯу

Азр

Уа1

Ьеи

А1а

85

90

95

Азп

СЯп.

Ьеи

СЯу

ТЬг

Ьеи

Азп

Зег

ТЬг

СЯу

Ьеи

Уа1

Зег

Ьеи

ТНг

100

105

110

Не

СЯу

Азп

Азр

А1а

СЯу

РЬе

Зег

Азр

Уа1

МеЬ

ТЬг

Суз

Уа1

115 120 125

150

Ъеи

<31п Зег 130

Азр

Зег

А1а Суз Ьеи Зег Агд 11е Азп ТЬг А1а Ьуз А1а

135

140

Туг

νβΐ

Азр

Зег

ТЬг

Ьеи

Рго

С1у

С1п

Ьеи

Азр

Зег

Уа1

Туг

ТЬг

А1а

145

150

155

160

11е

Зег

ТЬг

Ьуз

А1а

Рго

Зег

А1а

ΗΪ8

νβΐ

А1а

Уа1

Ьеи

С1у

Туг

Рго

165

170

175

Агд

РЬе

Туг

Ьуз

Ьеи

(31у

С1у

Зег

Суз

Ьеи

А1а

С1у

Ьеи

Зег

С1и

ТЬг

180

185

190

Ьуз

Агд

Зег

А1а

Не

АЗП

Азр

А1а

Азр

Туг

Ьеи

Азп

Зег

А1а

Не

195

200

205

А1а

Ьуз

Агд

А1а

Азр

Н15

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

Азр

Уа1

Ьуз

Зег

210

215

220

ТЬг

РЬе

ТЬг

(31у

ΗΪ8

С1и

11е

Суз

Зег

ТЬг

Тгр

Ьеи

Н13

Зег

225

230

235

240

Ьеи

Азр

Ьеи

Азп

Не

С1у

СЛп

Зег

Туг

ΗΪ8

Рго

ТЬг

А1а

<31у

245

250

255

<31п

Зег

СЛу

С1у

Туг

Ьеи

Рго

Уа1

МеЬ

Азп

Зег

Уа1

А1а

260 265 <210> 101 <211> 372 <212> РКТ <213> ТЬегтоЫ£1с1а Еизса <400> 101

Уа1

СЛу

Зег

С1у

Рго

Агд

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

РЬе

Ьеи

С1у

1

5

10

15

11е

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

ТЬг

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Уа1

20

25

30

РГО

ТЬг

С1у

Агд

С1и

ТЬг

Ьеи

Тгр

Агд

МеЬ

Тгр

Суз

СЛи

А1а

ТЬг

<31п

35

40

45

Азр

Тгр

Суз

Ьеи

С1у

Уа1

Рго

Уа1

Азр

Зег

Агд

С1у

СЛп

Рго

А1а

С1и

50

55

60

Азр

СЛу

61и

РЬе

Ьеи

Зег

Рго

\7а1

С1п

А1а

ТЬг

Тгр

С1у

65

70

75

80

АЗП

Туг

А1а

Ьеи

СЛу

Азр

Зег

Туг

Зег

СЛу

Азр

СЛу

А1а

Агд

85

90

95

Азр

Туг

Рго

СЛу

ТЬг

А1а

νβΐ

Ьуз

С1у

Суз

Тгр

Агд

Зег

А1а

100

105

110

Азп

А1а

Туг

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

А1а

С1и

А1а

Туг

Азр

РЬе

А1а

СЛу

ΗΪ8

115

120

125

Ъеи

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Суз

Зег

СЛу

Θ1Π

Агд

СЛу

Туг

А1а

МеЬ

Ьеи

Азр

130

135

140

А1а

Не

Азр

СЛи

Уа1

С1у

Зег

СЛп

Ьеи

Азр

Тгр

Азп

Зег

Рго

ΗΪ3

ТЬг

145

150

155

160

Зег

Ьеи

Уа1

ТЬг

11е

С1у

11е

СЛу

С1у

Азп

Азр

Ьеи

СЛу

РЬе

Зег

ТЬг

165 170 175

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Суз

МеЬ

Уа1

Агд

Уа1

Рго

Ьеи

Азр

Зег

Ьуз

А1а

180

185

190

Суз

ТЬг

Азр

(Лп

(Ли

Азр

А1а

Не

Агд

Ьуз

Агд

МеЬ

А1а

Ьуз

РЬе

(Ли

195

200

205

ТЬг

РЬе

(Ли

Ьеи

Не

Зег

(Ли

Уа1

Агд

ТЬг

Агд

А1а

Рго

Азр

210

215

220

А1а

Агд

Не

Ьеи

Уа1

(Лу

Туг

Рго

Агд

Не

РЬе

Рго

СЛи

С1и

Рго

225

230

235

240

ТЬг

СЛу

А1а

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

А1а

Зег

Азп

(Лп

Агд

Тгр

Ьеи

Азп

245

250

255

<31и

ТЬг

Не

(Лп

(Ли

РЬе

Азп

С1п

Ьеи

А1а

(Ли

А1а

Уа1

А1а

Уа1

260

265

270

ΗΪ3

Азр

(Ли

Не

А1а

Зег

(Лу

Уа1

(Лу

Зег

Уа1

(Ли

РЬе

275

280

285

Уа1

Азр

Уа1

Туг

ΗΪ3

А1а

Ьеи

Азр

(Лу

Ηίβ

(Ли

Не

<31у

Зег

Азр

(Ли

290

295

300

Рго

Тгр

Уа1

Азп

(Лу

Уа1

(Лп

Ьеи

Агд

Азр

Ьеи

А1а

ТЬг

СЛу

Уа1

ТЬг

305

310

315

320

Уа1

Азр

Агд

Зег

ТЬг

РЬе

Н18

РГО

Азп

А1а

(Лу

ΗΪ8

Агд

А1а

Уа1

325

330

335

СЛу

(Ли

Агд

Уа1

Не

(Ли

(Лп

Не

(Ли

ТЬг

(Лу

Рго

СЛу

Агд

Рго

Ьеи

340

345

350

Туг

А1а

ТЬг

РЬе

А1а

Уа1

А1а

СЛу

А1а

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Ьеи

А1а

355

360

365

СЛу

(Ли

Уа1

(Лу

370 <210> 102 <211> 230 <212> РКТ <213> АзрегдШиз аси1еаЬиз <400> 102

ТЬг

Уа1

Туг

Ьеи

А1а

С1у

Азр

Зег

ТЬг

МеЬ

А1а

Ьуз

Азп

(Лу

СЛу

1

5

10

15

(Лу

Зег

(Лу

ТЬг

Азп

СЛу

Тгр

(Лу

СЛи

Туг

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Ьеи

Зег

20

25

30

А1а

ТЬг

Уа1

Азп

Азр

А1а

Уа1

А1а

СЛу

Агд

Зег

А1а

Агд

Зег

Туг

35

40

45

ТЬг

Агд

СЛи

СЛу

Агд

РЬе

(Ли

АЗП

Не

А1а

Азр

Уа1

ТЬг

А1а

СЛу

50

55

60

Азр

Туг

Уа1

Не

Уа1

СЛи

РЬе

СЛу

Н1з

Азп

Азр

(Лу

СЛу

Зег

Ьеи

Зег

65

70

75

80

ТЬг

Азр

АЗП

СЛу

Агд

ТЬг

Азр

Суз

Зег

(Лу

ТЬг

СЛу

А1а

(Ли

Уа1

Суз

85

90

95

Туг

Зег

Уа1

Туг

Азр

СЛу

Уа1

Азп

(Ли

ТЬг

Не

Ьеи

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

100

105

110

Туг

Ьеи

СЛи

Азп

А1а

Ьуз

Ьеи

РЬе

ТЬг

А1а

Ьуз

СЛу

А1а

Ьуз

Уа1

151

115

120

125

Ые

Ьеи

Зег

СЬп

Ткг

Рго

Азп

Рго

Тгр

СЬи

Ткг

СЬу

Ткг

Рке

130

135

140

УаЬ

Азп

Зег

Рго

ткг

Агд

Рке

УаЬ

СЬи

Туг

АЬа

СЬи

Ьеи

АЬа

СЬи

145

150

155

160

УаЬ

АЬа

СЬу

УаЬ

СЬи

Туг

УаЬ

Азр

НЬз

Тгр

Зег

Туг

УаЬ

Азр

Зег

ЬЬе

165

170

175

Туг

СЬи

Ткг

Ьеи

СЬу

Азп

АЬа

Ткг

УаЬ

Азп

Зег

Туг

Рке

Рго

1Ье

Азр

180

185

190

НЬз

Ткг

ΗΪ3

Ткг

Зег

Рго

АЬа

СЬу

АЬа

СЬи

УаЬ

АЬа

СЬи

АЬа

Рке

195

200

205

Ьеи

Ьуз

АЬа

УаЬ

Суз

ткг

СЬу

Ткг

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

УаЬ

Ьеи

Ткг

210

215

220

Ткг

Зег

Рке

СЬи

СЬу

225 230 <210> 103 <211> 184 <212> РКТ <213> ЕзскегЬскЬа соЬЬ <400> 103

АЬа

Азр

Ткг

Ьеи

ЬЬе

Ьеи

СЬу

Азр

Зег

Ьеи

Зег

АЬа

СЬу

Туг

Агд

1

5

10

15

Меб

Зег

АЬа

Зег

АЬа

Тгр

Рго

АЬа

Ьеи

Азп

Азр

Ьуз

Тгр

СЬп

20

25

30

Зег

Ьуз

Ткг

Зег

УаЬ

Азп

АЬа

Зег

1Ье

Зег

СЬу

Азр

ткг

Зег

СЬп

35

40

45

СЬп

СЬу

ьеи

АЬа

Агд

Ьеи

РГО

АЬа

Ьеи

Ьуз

СЬп

НЬз

СЬп

Рго

Агд

50

55

60

Тгр

УаЬ

Ьеи

УаЬ

СЬи

Ьеи

СЬу

Азп

Азр

СЬу

Ьеи

Агд

СЬу

Рке

СЬп

65

70

75

80

Рго

СЬп

Ткг

СЬи

СЬп

Ткг

Ьеи

Агд

СЬп

1Ье

Ьеи

СЬп

Азр

УаЬ

Ьуз

85

90

95

АЬа

Азп

АЬа

СЬи

Рго

Ьеи

Меб

СЬп

ЬЬе

Агд

Ьеи

РГО

АЬа

Азп

100

105

110

Туг

СЬу

Агд

Туг

Азп

СЬи

АЬа

Рке

Зег

АЬа

ЬЬе

Туг

Рго

Ьуз

Ьеи

115

120

125

АЬа

Ьуз

СЬи

Рке

Азр

УаЬ

РГО

Ьеи

РГО

Рке

меб

СЬи

УаЬ

130

135

140

Туг

Ьеи

Ьуз

Рго

СЬп

Тгр

Меб

СЬп

Азр

СЬу

ЬЬе

ΗΪ3

Рго

Азп

Агд

145

150

155

160

Азр

АЬа

СЬп

Рго

Рке

1Ье

АЬа

Азр

Тгр

Меб

АЬа

Ьуз

СЬп

ьеи

СЬп

Рго

165

170

175

Ьеи УаЬ Азп НЬз Азр Зег Ьеи СЬи

180 <210> 104 <211> 308 <212> РКТ <213> Аеготопаз кукгоркЬЬа <400> 104

11е УаЬ Меб Рке СЬу Азр Зег Ьеи Зег Азр Ткг СЬу Ьуз Меб Туг Зег 15 1015

Ьуз Меб Агд СЬу Туг Ьеи Рго Зег Зег Рго Рго Туг Туг СЬи СЬу Агд 20 2530

Рке Зег Азп СЬу Рго УаЬ Тгр Ьеи СЬи СЬп Ьеи Ткг Азп СЬи Рке Рго 35 4045

СЬу Ьеи Ткг ЬЬе АЬа Азп СЬи АЬа СЬи СЬу СЬу Рго Ткг АЬа УаЬ АЬа 50 5560

Туг Азп Ьуз ЬЬе Зег Тгр Азп Рго Ьуз Туг СЬп УаЬ ЬЬе Азп Азп Ьеи

65

70

75

80

Авр

Туг

СЬи

УаЬ

Ткг

СЬп

Рке

Ьеи

СЬп

Ьуз

Азр

Зег

Рке

Ьуз

Рго

Азр

85

90

95

Азр

Ьеи

УаЬ

1Ье

Ьеи

Тгр

УаЬ

СЬу

АЬа

Азп

Азр

Туг

Ьеи

АЬа

Туг

СЬу

100

105

110

Тгр

Азп

Ткг

СЬи

СЬп

Азр

АЬа

Ьуз

Агд

УаЬ

Агд

Азр

АЬа

11е

Зег

Азр

115

120

125

АЬа

Азп

Агд

Меб

УаЬ

Ьеи

Азп

СЬу

АЬа

Ьуз

СЬи

Не

Ьеи

Рке

130

135

140

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

СЬу

СЬп

Азп

Рго

Зег

АЬа

Агд

Зег

СЬп

Ьуз

УаЬ

145

150

155

160

УаЬ

СЬи

АЬа

Зег

ΗΪ8

УаЬ

Зег

АЬа

Туг

НЬз

Азп

СЬп

Ьеи

165

170

175

Азп

ьеи

АЬа

Агд

СЬп

Ьеи

АЬа

Рго

Ткг

СЬу

Меб

УаЬ

Ьуз

Ьеи

Рке

СЬи

180

185

190

1Ье

Азр

Ьуз

СЬп

Рке

АЬа

СЬи

Меб

Ьеи

Агд

Азр

Рго

СЬп

Азп

Рке

СЬу

195

200

205

Ьеи

Зег

Азр

СЬп

Агд

Азп

АЬа

Суз

Туг

СЬу

Зег

Туг

УаЬ

Тгр

Ьуз

210

215

220

Рго

Рке

АЬа

Зег

Агд

Зег

АЬа

Зег

Ткг

Азр

Зег

СЬп

Ьеи

Зег

АЬа

Рке

225

230

235

240

Азп

Рго

СЬп

СЬи

Агд

Ьеи

АЬа

Не

АЬа

СЬу

Азп

Рго

Ьеи

АЬа

СЬп

245

250

255

АЬа

УаЬ

АЬа

Зег

Рго

Меб

АЬа

Агд

Зег

АЬа

Зег

Ткг

Ьеи

Азп

Суз

260

265

270

СЬи

СЬу

ьуз

Мер

Рке

Тгр

Азр

СЬп

УаЬ

НЬз

РГО

Ткг

ткг

Уа1

УаЬ

НЬз

275

280

285

АЬа

Ьеи

Зег

СЬи

Рго

АЬа

Ткг

Рке

1Ье

СЬи

Зег

СЬп

Туг

СЬи

290

295

300

Рке

Ьеи

АЬа

НЬз

305 <210> 105 <211> 232

152 <212> РКТ <213 > АзрегдШиз аси1еаСиз <400> 105

ТЬг

Уа1

Туг

Ьеи

А1а

(Яу

Азр

Зег

ТЬг

МеС

А1а

Ьуз

Азп

(Яу

1

5

10

15

(Яу

Зег

(Яу

ТЬг

Азп

(Яу

Тгр

СЯу

(Яи

Туг

Ьеи

А1а

Зег

Туг

Ьеи

Зег

20

25

30

А1а

ТЬг

Уа1

Ча1

Азп

Азр

А1а

Уа1

А1а

(Яу

Агд

Зег

А1а

Агд

Зег

Туг

35

40

45

ТЬг

Агд

С1и

С1у

Агд

РЬе

(Яи

Азп

11е

А1а

Азр

Уа1

ТЬг

А1а

(Яу

50

55

60

Азр

туг

Уа1

Не

Уа1

СЯи

РЬе

СЯу

ΗΪ8

Азп

Азр

(Яу

С1у

Зег

Ьеи

Зег

65

70

75

80

ТЬг Азр Азп СЯу Агд ТЬг Азр Суз Зег 61у ТЬг (Яу А1а С1и Ча1 Суз

90 95

Туг

Зег

Уа1

Туг

Азр

(Яу

Уа1

Азп

(Яи

ТЬг

11е

Ьеи

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

100

105

110

Туг

Ьеи

(Яи

Азп

А1а

Ьуз

Ьеи

РЬе

ТЬг

А1а

Ьуз

(Яу

А1а

Ьуз

Уа1

115

120

125

11е

Ьеи

Зег

(Яп

ТЬг

Рго

Азп

Рго

Тгр

(Яи

ТЬг

С1у

ТЬг

РЬе

130

135

140

Уа1

Азп

Зег

Рго

ТЬг

Агд

РЬе

Ча1

(Яи

Туг

А1а

(Яи

Ьеи

А1а

СЯи

145

150

155

160

Уа1

А1а

(Яу

Ча1

(Яи

Туг

Уа1

Азр

ΗΪ8

Тгр

Зег

Туг

Уа1

Азр

Зег

11е

165

170

175

Туг

(Яи

ТЬг

Ьеи

(Яу

Азп

А1а

ТЬг

Уа!

Азп

Зег

Туг

РЬе

Рго

11е

Азр

180

185

190

Н13

ТЬг

ΗΪ8

ТЬг

Зег

Рго

А1а

(Яу

А1а

(Яи

Уа1

А1а

(Яи

А1а

РЬе

195

200

205

Ьеи

Ьуз

А1а

Уа1

Суз

ТЬг

(Яу

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

210

215

220

ТЬг

Зег

РЬе

(Яи

(Яу

ТЬг

Суз

225 230 <210> 106 <211> 184 <212> РКТ <213> ЕзсЬегхсЫа соИ <400> 106

А1а Азр ТЬг

Ьеи

Ьеи 5

11е

Ьеи (Яу Азр

Зег Ьеи Зег А1а (Яу Туг Агд

10

15

МеС

: Зег

А1а

Зег

А1а

Тгр

Рго

А1а

Ьеи

Азп

Азр

Ьуз

Тгр

(Яп

20

25

30

Зег Ьуз

ТЬг

Зег

Уа1

АЗП

А1а

Зег

11е

Зег

СЯу

Азр

ТЬг

Зег

(Яп

35

40

45

С1п С1у

Ьеи

₁ А1а

Агд

Ьеи

Рго

А1а

Ьеи

Ьуз

СЯп

Н18

(Яп

Рго

Агд

50

55

60

Тгр

Уа1

Ьеи

Уа1

(Яи

Ьеи

(Яу

Азп

Азр

СЯу

Ьеи

Агд

(Яу

РЬе

(Яп

65

70

75

80

Рго

СЯп

(Яп

ТЬг

(Яи

(Яп

ТЬг

Ьеи

Агд

СЯп

11е

Ьеи

(Яп

Азр

Уа1

Ьуз

85

90

95

А1а

Азп

А1а

(Яи

Рго

Ьеи

МеС

СЯп

11е

Агд

Ьеи

Рго

А1а

Азп

100

105

110

Туг

СЯу

Агд

Туг

Азп

(Яи

А1а

РЬе

Зег

А1а

11е

Туг

Рго

Ьуз

Ьеи

115

120

125

А1а

Ьуз

(Яи

РЬе

Азр

Уа1

Рго

Ьеи

Рго

РЬе

МеС

(Яи

Ча1

130

135

140

Туг

Ьеи

Ьуз

Рго

(Яп

Тгр

МеС

(Яп

Азр

СЯу

11е

Н15

Рго

Азп

Агд

145

150

155

160

Азр

А1а

СЯп

Рго

РЬе

Не

А1а

Азр

Тгр

МеС

А1а

Ьуз

(Яп

Ьеи

(Яп

Рго

165

170

175

Ьеи

Уа1

Азп

ΗΪ3

Азр

Зег

Ьеи

(Яи

180 <210> 107 <211> 308 <212> РКТ <213 > Аеготопаз Ьус1горЫ1а <400> 107

11е

Уа1

МеС

РЬе

СЯу

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

ТЬг

(Яу

Ьуз

МеС

Туг

Зег

1

5

10

15

Ьуз

МеС

Агд

(Яу

Туг

Ьеи

Рго

Зег

Рго

Туг

(Яи

(Яу

Агд

20

25

30

РЬе

Зег

Азп

СЯу

Рго

Ча1

Тгр

Ьеи

(Яи

(Яп

Ьеи

ТЬГ

Азп

СЯи

РЬе

Рго

35

40

45

СЯу

Ьеи

ТЬг

Не

А1а

Азп

СЯи

А1а

(Яи

(Яу

СЯу

Рго

ТЬг

А1а

Ча1

А1а

50

55

60

Туг

Азп

Ьуз

Не

Зег

Тгр

Азп

Рго

Ьуз

Туг

(Яп

Уа1

Не

Азп

Ьеи

65

70

75

80

Азр

Туг

С1и

Ча1

ТЬг

СЯп

РЬе

Ьеи

СЯп

Ьуз

Азр

Зег

РЬе

Ьуз

РГО

Азр

85

90

95

Азр

Ьеи

Ча1

Не

Ьеи

Тгр

Уа1

(Яу

А1а

Азп

Азр

Туг

Ьеи

А1а

Туг

СЯу

100

105

но

Тгр

Азп

ТЬг

(Яи

СЯп

Азр

А1а

Ьуз

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

Не

Зег

Азр

115

120

125

А1а

Азп

Агд

МеС

Ча1

Ьеи

Азп

(Яу

А1а

Ьуз

СЯи

11е

Ьеи

РЬе

130

135

140

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

(Яу

СЯп

Азп

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

СЯп

Ьуз

Ча1

145

150

155

160

Уа1

(Яи

А1а

Зег

ΗΪ3

Ча1

Зег

А1а

Туг

ΗΪ8

АЗП

СЯп

Ьеи

165

170

175

АЗП

Ьеи

А1а

Агд

СЯп

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

СЯу

Мес

Ча1

Ьуз

Ьеи

РЬе

(Яи

180

185

190

11е

Азр

Ьуз

СЯп

РЬе

А1а

(Яи

МеС

Ьеи

Агд

Азр

Рго

(Яп

Азп

РЬе

(Яу

153

195

200

205

Ьеи

Зег

Азр

С1п

Агд

Азп

А1а

Суз

Туг

С1у

Зег

Туг

Уа1

Тгр

Ьуз

210

215

220

Рго

РЬе

А1а

Зег

Агд

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Азр

Зег

С1п

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

225

230

235

240

Азп

Рго

ΘΙη

С1и

Агд

Ьеи

А1а

Не

А1а

С1у

Азп

Рго

Ьеи

А1а

ΘΙη

245

250

255

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

Мек

А1а

Агд

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьеи

Азп

Суз

260

265

270

С1и

С1у

Ьуз

Мек

РЬе

Тгр

Азр

С1п

Уа1

Ηϊβ

Рго

ТЬг

Уа1

ΗΪ3

275

280

285

А1а

Ьеи

Зег

О1и

Рго

А1а

ТЬг

РЬе

11е

С1и

Зег

С1п

Туг

С1и

290

295

300

РЬе

Ьеи

А1а

ΗΪ3

305 <210> 108 <211> 167 <212> РКТ <213> ЕзсЬеггсЫа со11 <400> 108

Ьеи

11е

Ьеи

61у

Азр

Зег

Ьеи

Зег

А1а

С1у

Туг

Агд

Мек

Зег

А1а

1

5

10

15

Зег

А1а

Тгр

Рго

А1а

Ьеи

Азп

Азр

Ьуз

Тгр

С1П

Зег

Ьуз

ТЬг

20

25

30

Зег

Уа1

Азп

А1а

Зег

11е

Зег

С1у

Азр

ТЬг

Зег

ΘΙη

С1у

Ьеи

35

40

45

А1а

Агд

Ьеи

Рго

А1а

Ьеи

Ьуз

С1п

ΗΪ5

ΘΙη

Рго

Агд

Тгр

Уа1

Ьеи

50

55

60

Уа1

С1и

Ьеи

С1у

Азп

Азр

С1у

Ьеи

Агд

С1у

РЬе

ΘΙη

Рго

С1п

ΘΙη

65

70

75

80

ТЬг

С1и

С1п

ТЬг

Ьеи

Агд

С1п

11е

Ьеи

ΘΙη

Азр

Уа1

Ьуз

А1а

Азп

85

90

95

А1а

С1и

Рго

Ьеи

Мек

С1п

11е

Агд

Ьеи

Рго

А1а

Азп

Туг

С1у

Агд

100

105

но

Агд

Туг

Азп

<31и

А1а

РЬе

Зег

А1а

11е

Туг

Рго

Ьуз

Ьеи

А1а

Ьуз

С1и

115

120

125

РЬе

Азр

Уа1

Рго

Ьеи

Рго

РЬе

Мек

С1и

Уа1

Туг

Ьеи

Ьуз

130

135

140

Рго

αΐη

Тгр

Мек

ΘΙη

Азр

С1у

11е

ΗΪ8

Рго

АЗП

Агд

Авр

А1а

ΘΙη

145

150

155

160

Рго РЬе 11е А1а Азр Тгр Мек

165 <210> 109 <211> 295 <212> РКТ <213> Аеготопаз ЬуйгорЬНа :400> 109

11е

Уа1

Мек

РЬе

С1у

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

ТЬг

С1у

Ьуз

Мек

Туг

Зег

1

5

10

15

Ьуз

Мек

Агд

С1у

Туг

Ьеи

Рго

Зег

Рго

Туг

С1и

С1у

Агд

20

25

30

РЬе

Зег

Азп

С1у

Рго

Уа1

Тгр

Ьеи

С1и

С1п

Ьеи

ТЬг

Азп

<31и

РЬе

Рго

35

40

45

С1у

Ьеи

ТЬг

Не

А1а

Азп

С1и

А1а

С1и

<31у

РГО

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

50

55

60

Туг

Азп

Ьуз

11е

Зег

Тгр

Азп

Рго

Ьуз

Туг

С1п

Уа1

Не

Азп

Ьеи

65

70

75

80

Азр

Туг

01и

Уа1

ТЬг

<31п

РЬе

Ьеи

О1п

Ьуз

Азр

Зег

РЬе

Ьуз

Рго

Азр

85

90

95

Азр

Ьеи

Уа1

11е

Ьеи

Тгр

Уа1

С1у

А1а

Азп

Азр

Туг

Ьеи

А1а

Туг

О1у

100

105

110

Тгр

Азп

ТЬг

О1и

(31п

Азр

А1а

Ьуз

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

Не

Зег

Азр

115

120

125

А1а

АЗП

Агд

Мек

Уа1

Ьеи

АЗП

С1у

А1а

Ьуз

С1и

Не

Ьеи

РЬе

130

135

140

АЗП

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

<31у

<31п

АЗП

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

С1п

Ьуз

Уа1

145

150

155

160

Уа1

С1и

А1а

Зег

Н13

Уа1

Зег

А1а

Туг

ΗΪ3

Азп

О1п

Ьеи

ьеи

165

170

175

Азп

Ьеи

А1а

Агд

<31п

Ьеи

А1а

Рго

ТЬг

С1у

Мек

Уа1

Ьуз

Ьеи

РЬе

<31и

180

185

190

11е

Азр

Ьуз

С1п

РЬе

А1а

С1и

Мек

Ьеи

Агд

Азр

Рго

О1п

Азп

РЬе

С1у

195

200

205

Ьеи

Зег

Азр

С1п

Агд

Азп

А1а

Суз

Туг

О1у

С1у

Зег

Туг

Уа1

Тгр

Ьуз

210

215

220

Рго

РЬе

А1а

Зег

Агд

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Азр

Зег

С1п

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

225

230

235

240

Азп

РГО

С1п

О1и

Агд

Ьеи

А1а

11е

А1а

О1у

Азп

Рго

Ьеи

А1а

С1п

245

250

255

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

Мек

А1а

Агд

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьеи

Азп

Суз

260

265

270

С1и

<31у

Ьуз

Мек

РЬе

Тгр

Азр

С1п

Уа1

ΗΪ3

Рго

ТЬг

Уа1

ΗΪ3

275

280

285

А1а

Ьеи

Зег

С1и

Рго

А1а

290 295 <210> 110 <211> 1225 <212> ϋΝΑ <213> Аг£1£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> ЗупкЬеЫс сопзкгиск

154 :220:

:221:

:222:

СОЗ (101) . . (1141) <400> 110 дскккксккк кддаадаааа какадддааа акддкаеккд ккаааааккс ддаакаккка касаакакса какдккксас аккдаааддд даддадаакс

115 едд Агд

Скк

Ьеи еда ккд скд

Агд Ьеи Ьеи дед скс акс ккс ккд асд скд кка ккк _ _

ТЬг Ьеи Ьеи РЬе А1а Ьеи 11е РЬе Ьеи

20

163 скд

Ьеи сек

Рго сак кек дса дек кеа

ΗΪ3 Зег А1а А1а Зег

211 едд Агд акс

11е дке акд ккк дда дак

Уа1 Мек РЬе С1у Азр 40

259 ааа аде Зег Ьуз ссд кеа аде ссд ссд как как даа ддс

Агд ккк РЬе акд ада ддс как скк _ _ _ _ _ __

Мек Агд С1у Туг Ьеи Рго Зег Зег Рго Рго Туг Туг С1и С1у 60 65

307

355 сед дда

Рго С1у скд асд акс дек аак даа дса даа дда дда дса аса дед дке

Ьеи ТЬг 11е А1а Азп С1и А1а С1и С1у С1у А1а ТЬг А1а Уа1

95 100

403 дсс как

А1а Туг Азп Ьуз 11(

105 аас ааа акс аде кдд дас ссд ааа как сад дке акс аас аас ~ Зег Тгр Азр Рго Ьуз Туг <31п Уа1 11е Азп Азп 110 115

451

199

547

595

643

691 дке дке даа дса дке аде сак дке аде дсс как сак аас ааа скд скд

Уа1 Уа1 С1и А1а Уа1 Зег Ηίβ Уа1 Зег А1а Туг Ηίβ Азп Ьуз Ьеи Ьеи 200 205 210

739

787 даа акк дас ааа сад ккк дсс даа акд скд ада дак ссд

835

С1и

11е

Азр

Ьуз

С1п

РЬе

А1а

С1и

Мек

Ьеи

Агд

Азр

Рго

СХп

Азп

РЬе

230

235

240

245

ддс

скд

аде

дак

дке

даа

аас

ссд

кде

как

дак

ддс

дда

как

дке

кдд

883

(ЗХу

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

СХи

Азп

Рго

Суз

Туг

Азр

С1у

СХу

Туг

УаХ

Тгр

250

255

260

ааа

ссд

ккк

дсс

аса

ада

аде

дке

аде

асд

дак

ада

саа

скд

кеа

дед

931

Ьуз

Рго

РЬе

АХа

ТЬг

Агд

Зег

Уа1

Зег

ТЬг

Азр

Агд

СХп

Ьеи

Зег

А1а

265

270

275

ккк

аде

ссд

саа

даа

ада

скд

дса

акс

дсс

дда

аак

ссд

скк

ккд

дса

979

РЬе

Зег

Рго

С1п

СХи

Агд

Ьеи

АХа

11е

А1а

С1у

Азп

Рго

Ьеи

АХа

280

285

290

саа

дса

дке

дсе

кеа

ссд

акд

дса

ада

кеа

дса

аде

сед

скд

аак

1027

С1п

А1а

Уа1

А1а

Зег

Рго

Мек

А1а

Агд

Зег

А1а

Зег

Рго

Ьеи

Азп

295

300

305

кде

даа

ддс

ааа

акд

ккк

кдд

дак

сад

дке

сак

ссд

аса

дкк

дке

1075

Суз

С1и

<31у

Ьуз

Мек

РЬе

Тгр

Азр

С1п

Уа1

Н18

Рго

ТЬг

Уа1

УаХ

310

315

320

325

сак

дек

дсс

скк

кеа

даа

ада

дед

асд

ккк

акс

даа

аса

сад

как

1123

ΗΪ8

А1а

Ьеи

Зег

СХи

Агд

А1а

ТЬг

РИе

11е

СХи

ТЬг

С1п

Туг

330

335

340

даа

ккк

скд

дсс

сак

ддс

кдадккааса <

}аддасддак к1

гсскдаадд

1171

61и

РЬе

Ьеи

А1а

ΗΪ8

(31у

345

ааакссдккк ккккакккка адеккддада сааддкааад дакаааасск сдад 1225 <2Ю> 111 <211> 347 <212> РКТ <213> АгН£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ЗупкЬекге сопзкгиск

<400> 111

Мек 1

Ьуз <31п С1п Ьуз Агд 5

ьеи

Туг А1а Агд 10

Ьеи

Ьеи ТЬг

Ьеи

15

РЬе

АХа

Ьеи

11е

РЬе

Ьеи

Рго

ΗΪ3

Зег

А1а

Зег

АХа

А1а

Азр

ТЬг

20

25

30

Агд

Рго

А1а

РЬе

Зег

Агд

1Хе

Уа1

Мек

РЬе

СХу

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

35

40

45

ТЬг

С1у

Ьуз

Мек

Туг

Зег

ьуз

Мек

Агд

СХу

Туг

Ьеи

Рго

Зег

Рго

50

55

60

Рго

Туг

С1и

СХу

Агд

РЬе

Зег

Азп

С1у

Рго

УаХ

Тгр

Ьеи

СХи

СХп

65

70

75

80

Ьеи

ТЬг

Ьуз

С1п

РЬе

Рго

СХу

Ьеи

ТЬг

11е

АХа

Азп

СХи

АХа

СХи

СХу

85

90

95

С1у

А1а

ТЬг

А1а

УаХ

А1а

Туг

Азп

Ьуз

11е

Зег

Тгр

Азр

Рго

Ьуз

Туг

100

105

110

С1п

УаХ

11е

Азп

Ьеи

Азр

Туг

СХи

УаХ

ТЬг

О1п

РЬе

Ьеи

С1п

Ьуз

115

120

125

Азр

Зег

РЬе

Ьуз

Рго

Азр

Ьеи

УаХ

11е

Ьеи

Тгр

Уа1

СХу

А1а

Азп

- 155 018153

130 135 140

Авр 145

Туг Ьеи

АЬа Туг

СЬу Тгр Азп Ткг СЬи СЬп Азр АЬа Ьуз Агд УаЬ

150

155

160

Агд

Азр

АЬа

ЬЬе

Зег

Азр

АЬа

Азп

Агд

Меб

УаЬ

Ьеи

Азп

СЬу

АЬа

165

170

175

Ьуз

СЬп

ЬЬе

Ьеи

Рке

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

СЬу

СЬп

Азп

Рго

Зег

180

185

190

А1а

Агд

Зег

СЬп

Ьуз

УаЬ

СЬи

АЬа

УаЬ

Зег

нЬз

УаЬ

Зег

АЬа

Туг

195

200

205

ΗΪ8

Азп

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьеи

АЬа

Агд

СЬп

Ьеи

АЬа

Рго

Ткг

СЬу

210

215

220

Меб

УаЬ

Ьуз

Ьеи

Рке

СЬи

Не

Азр

Ьуз

СЬп

Рке

АЬа

СЬи

Меб

Ьеи

Агд

225

230

235

240

Азр

Рго

СЬп

Азп

Рке

СЬу

Ьеи

Зег

Азр

УаЬ

СЬи

Азп

Рго

Суз

Туг

Азр

245

250

255

СЬу

Туг

УаЬ

Тгр

Ьуз

Рго

Рке

АЬа

Ткг

Агд

Зег

УаЬ

Зег

Ткг

Азр

260

265

270

Агд

СЬп

Ьеи

Зег

АЬа

Рке

Зег

Рго

СЬп

СЬи

Агд

Ьеи

АЬа

Не

АЬа

СЬу

275

280

285

Азп

Рго

Ьеи

АЬа

СЬп

АЬа

УаЬ

АЬа

Зег

Рго

Меб

АЬа

Агд

Зег

290

295

300

АЬа

Зег

Рго

Ьеи

Азп

Суз

СЬи

СЬу

Ьуз

Меб

Рке

Тгр

Азр

СЬп

УаЬ

НЬз

305

310

315

320

Рго

Ткг

УаЬ

ΗΪ8

АЬа

Ьеи

Зег

СЬи

Агд

АЬа

Ткг

Рке

325

330

335

ЬЬе

СЬи

Ткг

СЬп

Туг

СЬи

Рке

ьеи

АЬа

НЬз

СЬу

340

345

<210> 112 <211> 4 <212> РКТ <213> АгбЬбЬсЬаЬ Зециепсе <220>

<223> Зедиепсе тобЬ£ <220>

<221> νΑΚΙΑΝΤ <222> (4)..(4) <223> Хаа тау Ье опе ог тоге о£ бке ЕоЬЬомЬпд атЬпо асЬб гезЬбиез Ьеи, А1а, УаЬ, 11е, Рке, Туг, НЬз, СЬп, Ткг, Азп, Меб ог Зег.

<400> 112

СЬу Азр Зег Хаа <210> 113 <211> 335 <212> РКТ <213> Аеготопаз заЬтопЬсЬба

:400>

113

Меб

Ьуз

Тгр

Рке

УаЬ

Суз

Ьеи

СЬу

Ьеи

ЬЬе

АЬа

Ьеи

Ткг

УаЬ

1

5

10

15

СЬп

АЬа

Азр

Ткг

Агд

Рго

АЬа

Рке

Зег

Агд

ЬЬе

УаЬ

меб

Рке

СЬу

20

25

30

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Азр

Ткг

СЬу

Ьуз

меб

Туг

Зег

Ьуз

Меб

Агд

СЬу

Туг

35

40

45

Ьеи

Рго

Зег

Рго

Туг

СЬи

СЬу

Агд

Рке

Зег

Азп

СЬу

Рго

50

55

60

УаЬ

Тгр

Ьеи

СЬи

СЬп

Ьеи

Ткг

Ьуз

СЬп

Рке

Рго

СЬу

Ьеи

Ткг

ЬЬе

АЬа

65

70

75

80

Азп

СЬи

АЬа

СЬи

СЬу

АЬа

Ткг

АЬа

УаЬ

АЬа

Туг

Азп

Ьуз

ЬЬе

Зег

85

90

95

Тгр

Азп

Рго

Ьуз

Туг

СЬп

УаЬ

ЬЬе

АЗП

Азп

Ьеи

Азр

Туг

СЬи

УаЬ

Ткг

100

105

110

СЬп

Рке

Ьеи

СЬп

Ьуз

Азр

Зег

Рке

Ьуз

Рго

Азр

Ьеи

УаЬ

ЬЬе

Ьеи

115

120

125

Тгр

УаЬ

СЬу

АЬа

Азп

Азр

Туг

Ьеи

АЬа

Туг

СЬу

Тгр

Азп

Ткг

СЬи

СЬп

130

135

140

Азр

АЬа

Ьуз

Агд

УаЬ

Агд

Азр

АЬа

ЬЬе

Зег

Азр

АЬа

Азп

Агд

Меб

145

150

155

160

УаЬ

Ьеи

Азп

СЬу

АЬа

Ьуз

СЬп

ЬЬе

Ьеи

Рке

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

165

170

175

СЬу

СЬп

Азп

Рго

Зег

АЬа

Агд

Зег

СЬп

Ьуз

УаЬ

СЬи

АЬа

УаЬ

Зег

180

185

190

НЬз

УаЬ

Зег

АЬа

Туг

НЬз

Азп

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьеи

АЬа

Агд

СЬп

195

200

205

Ьеи

АЬа

Рго

Ткг

СЬу

Меб

УаЬ

Ьуз

Ьеи

Рке

СЬи

ЬЬе

Азр

Ьуз

СЬп

Рке

210

215

220

АЬа

СЬи

Меб

Ьеи

Агд

Азр

Рго

СЬп

Азп

Рке

СЬу

Ьеи

Зег

Азр

УаЬ

СЬи

225

230

235

240

Азп

Рго

Суз

Туг

Азр

СЬу

Туг

УаЬ

Тгр

Ьуз

РГО

Рке

АЬа

Ткг

Агд

245

250

255

Зег

УаЬ

Зег

Ткг

Азр

Агд

СЬп

Ьеи

Зег

АЬа

Рке

Зег

Рго

СЬп

СЬи

Агд

260

265

270

Ьеи

АЬа

Не

АЬа

СЬу

Азп

Рго

Ьеи

АЬа

СЬп

АЬа

УаЬ

АЬа

Зег

Рго

275

280

285

Меб

АЬа

Агд

Зег

АЬа

Зег

Рго

Ьеи

Азп

Суз

СЬи

СЬу

Ьуз

Меб

Рке

290

295

300

Тгр

Азр

СЬп

УаЬ

НЬз

Рго

Ткг

УаЬ

ΗΪ8

АЬа

Ьеи

Зег

СЬи

305

310

315

320

Агд

АЬа

Ткг

Рке

Не

СЬи

Ткг

СЬп

Туг

СЬи

Рке

Ьеи

АЬа

НЬз

325 330 335 <210> 114 <211> 317 <212> РКТ

156 <213> Аегошопаз за1топ1С1йа <400> 114

А1а

Азр

ТЬг

Агд

Рго

А1а

РЬе

Зег

Агд

11е

Уа1

МеЬ

РЬе

(Лу

Азр

Зег

1

5

10

15

Ьеи

Зег

Азр

ТЬг

(Лу

Ьуз

МеЬ

Туг

Зег

Ьуз

МеЬ

Агд

(Лу

Туг

Ьеи

Рго

20

25

30

5ег

Зег

Рго

Туг

(Ли

(Лу

Агд

РЬе

Зег

Азп

(Лу

Рго

Уа1

Тгр

35

40

45

Ьеи

(Ли

(Лп

Ьеи

ТЬг

Ьуз

(Лп

РЬе

Рго

(Лу

Ьеи

ТЬг

11е

А1а

Азп

(Ли

50

55

60

А1а

(Ли

(Лу

А1а

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

Туг

АЗП

Ьуз

Не

зег

Тгр

Азп

65

70

75

80

РГО

Ьуз

Туг

(Лп

Уа1

Не

Азп

Ьеи

Азр

Туг

(Ли

Уа1

ТЬг

(Лп

РЬе

85

90

95

Ьеи

(Лп

Ьуз

Азр

Зег

РЬе

Ьуз

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

Не

Ьеи

Тгр

Уа1

100

105

110

(Лу

А1а

Азп

Азр

Туг

Ьеи

А1а

Туг

(Лу

Тгр

Азп

ТЬг

(Ли

С1п

Азр

А1а

115

120

125

Ьуз

Агд

Уа1

Агд

Азр

А1а

11е

Зег

Азр

А1а

Азп

Агд

МеЬ

Уа1

Ьеи

130

135

140

Азп

(Лу

А1а

Ьуз

(Лп

11е

Ьеи

РЬе

Азп

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

(Лу

(Лп

145

150

155

160

Азп

Рго

Зег

А1а

Агд

Зег

С1п

Ьуз

νβΐ

Уа1

(Ли

А1а

Уа1

Зег

ΗΪ3

Уа1

165

170

175

Зег

А1а

Туг

Н18

Азп

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьеи

А1а

Агд

(Лп

Ьеи

А1а

180

185

190

Рго

ТЬг

(Лу

МеЬ

Уа1

Ьуз

Ьеи

РЬе

(Ли

11е

Азр

Ьуз

С1п

РЬе

А1а

С1и

195

200

205

МеЬ

Ьеи

Агд

Азр

Рго

(Лп

Азп

РЬе

(Лу

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

(Ли

Азп

Рго

210

215

220

Суз

Туг

Азр

(Лу

Туг

Уа1

Тгр

Ьуз

Рго

РЬе

А1а

ТЬг

Агд

Зег

Уа1

225

230

235

240

Зег

ТЬг

Азр

Агд

(Лп

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

Зег

Рго

(Лп

(Ли

Агд

Ьеи

А1а

245 250 255

11е А1а (Лу Азп Рго Ъеи Ъеи А1а (Лп А1а ν&1 А1а 8ег Рго МеЬ А1а

260 265 270

Агд Агд 8ег А1а 8ег Рго Ъеи Азп Суз СЛи СЛу Ьуз МеЬ РНе Тгр Азр

275 280285 (Лп Уа1 ΗΪ3 Рго ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Ηίβ А1а А1а Ьеи Зег СЛи Агд А1а

290 295300

А1а ТЬг РЬе 11е (Ли ТИг (Лп Туг (Ли РЬе Ьеи А1а Нхз

305 310315

Claims

1. Липидацилтрансфераза, включающая аминокислотную последовательность 8ΕΡ ΙΌ Νο. 90 или аминокислотную последовательность, которая имеет 95%-ную или большую идентичность с 8ΕΡ ГО Νο. 90.

2. Липидацилтрансфераза по п.1, которая включает мотив аминокислотной последовательности θ^8X, в котором X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, Ι, Ε, Υ, Η, р, Т, Ν, М или 8.

3. Липидацилтрансфераза по п.1 или 2, которая может быть получена (или получена) из семейства бактерий Ае^οтοηаз.

4. Липидацилтрансфераза по любому из пп.1-3, которая имеет одну или более из следующих характеристик: (а) при тестировании методом Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании методом Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании методом Исследование трансферазы в забуференном субстрате имеет по крайней мере 2% ацилтрансферазной активности.

5. Липидацилтрансфераза по п.4, которая имеет все следующие характеристики: (а) при тестировании методом Исследование трансферазы в среде с низким содержанием воды, которое проводят через период времени, выбранный из 30, 20 или 120 мин, имеет относительную трансферазную активность по крайней мере 1%; (Ь) при тестировании методом Исследование трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием воды в яичном желтке с 54% воды имеет до 100% относительной трансферазной активности; или (с) при тестировании методом Исследование трансферазы в забуференном субстрате имеет по

- 157 018153 крайней мере 2% ацилтрансферазной активности.

6. Липидацилтрансфераза по любому из предыдущих пунктов, включающая аминокислотную последовательность, которая имеет 98%-ную или большую идентичность с БЕр ГО Ыо. 90.

7. Липидацилтрансфераза по любому из предыдущих пунктов, включающая аминокислотную последовательность БЕР ΙΩ Ыо. 90.

8. Липидацилтрансфераза по любому из предыдущих пунктов, имеющая аминокислотную последовательность БЕР ГО Ыо. 90.

9. Липидацилтрансфераза по любому из предыдущих пунктов, которая является иммобилизированной.

10. Пищевая или кормовая ферментная композиция, которая содержит липидацилтрансферазу по любому из предыдущих пунктов.