CN101606647B - 使用脂质酰基转移酶产生乳化剂的方法 - Google Patents

使用脂质酰基转移酶产生乳化剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用脂质酰基转移酶产生乳化剂的方法。一种在原位产生乳化剂的方法，其中将脂质酰基转移酶添加到食品中。优选地乳化剂的产生不增加或基本不增加所述食品中游离脂肪酸含量。优选地，脂质酰基转移酶可将脂质上的酰基转移到一种或多种下列酰基受体：固醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质或蛋白质亚单位、甘油。优选地，除乳化剂以外，可能产生一种或多种甾烷醇酯，或蛋白质酯，或碳水化合物酯，或甘油二酯，或甘油单酯。它们中的一种或多种也可以作为附加乳化剂。

Description

使用脂质酰基转移酶产生乳化剂的方法
本申请是申请日为2004年1月15日、申请号为200480002380.7(国际申请号为PCT/IB2004/000655)、发明名称为“方法”的发明申请的分案申请。
参考的相关申请
本申请参考了如下相关申请：1999年7月20日提交的、系列申请号为09/750,990的美国申请和申请号为10/409,391的美国申请。每一篇申请和这些申请的每一篇中引用的每个文献(“申请引用的文献”)，每一篇本发明所参考和引用的每篇文献，无论在正文中或者在那些申请的审查过程中，以及在这些审查过程中提出的所有支持专利性的文献，都包含在本文中作为参考。本文正文也引用了各种文件(“在此引用文件”)。每一篇“本文引用文件”和每一篇在“本文所引用文件”中引用或者参考的文献都包含在本文中作为参考。
发明的技术领域
本发明涉及使用脂质酰基转移酶在食品中原位产生乳化剂的方法。
本发明还涉及使用脂质酰基转移酶在食品中原位产生乳化剂的方法，其中所述方法使得产生该乳化剂时不增加或基本不增加所述食品中的游离脂肪酸。
本发明还涉及使用脂质酰基转移酶在食品中原位产生至少两种乳化剂的方法。
本发明还涉及使用脂质酰基转移酶在食品中原位产生碳水化合物酯和/或甾醇酯和/或甾烷醇(stanol)酯和/或蛋白质酯和/或甘油酯和/或羟基酸酯的方法。
本发明涉及含有脂质酰基转移酶的食品酶组合物和/或饲料酶组合物，以及所述组合物在本发明方法中的用途。
本发明还涉及鉴定适宜本发明的脂质酰基转移酶的方法，及如前述所鉴定的脂质酰基转移酶。
本发明进一步还涉及固定化的脂质酰基转移酶。
技术背景
众所周知，多年来在食品或饲料工业中应用的磷脂酶以及脂酶(称为脂解酶(EC.3.1.1.x)的有利用途。
例如，在EP 0585988中声称在面团中添加脂酶具有促进抗腐败(antistaling)效应的作用。提示从少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)中得到的脂酶，在与起酥油/脂肪(shortening/fat)联用时，添加到面团中可提高所生产的面包的质量。W094/04035中教导在面团中添加脂酶可改善柔软性而不需另外添加脂类或油类。Castello，P.ESEGP 89-10Dec.1999赫尔辛基，表明外源性脂酶可以改变面包体积。
脂解酶(lipolytic enzyme)可将食品中的脂质水解出一种或多种脂肪酸，使食品中产生有效的(powerful)乳化剂分子，这提供了有商业价值的功用。提供最显著的乳化特性的分子是部分水解产物，诸如溶血磷脂(lyso-phospholipid)、溶血糖脂(lyso-glycolipid)和甘油单酯(mono-glyceride)分子。极性脂质水解产物，如溶血磷脂和溶血糖脂是具体优选的。在制作面包时，所述原位产生的乳化剂可起到与乳化剂(诸如DATEM)相当的作用。
但是，脂解酶的活性也导致游离脂肪酸的堆积，这可能对食品产生不良作用。脂解酶的固有活性限制了他们的功能。
本领域尝试了多种方法解决此技术问题。然而，这些方法可以导致食品中游离脂肪酸显著增加，特别是对于含水量高的食品，包括但不仅限于面包面团和蛋黄。
磷脂酶，特别是磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)，在蛋或基于蛋的食品处理中应用多年(例如参见US 4,034,124和Dutihl&Groger 1981 J.Sci.FoodAgric.32，451-458)，磷脂酶在蛋或基于蛋的食品处理中使具有乳化剂作用的极性溶血卵磷脂蓄积，磷脂酶处理蛋或基于蛋的产品可提高稳定性，如巴氏灭菌法等热处理时的热稳定性，并且具有明显的稠化作用。基于蛋的产品包括但不仅限于蛋糕、蛋黄酱、色拉调料、调味酱、冰淇淋等等。磷脂酶的应用使游离脂肪酸蓄积。游离脂肪酸的蓄积可能明显影响产品香味，另外，游离脂肪酸的蓄积使产品易于氧化，因此产品保质期短，易变色以及其它食品重要性质如口味和质地改变。近来，具有广泛底物特异性的脂解酶已经市场化用于处理蛋黄和相关食品。它们的优势在于不像多数的磷脂酶A2，它们不是源于哺乳动物。但是它们会导致游离脂肪酸显著蓄积， 不仅仅是导致磷脂的水解，还包括导致甘油三酯的水解。
如同前面提到的，脂酶广泛应用的另一领域是面包制造业。八十年代早期，磷脂酶就已应用于烘焙工艺。
小麦粉中脂酶作用的底物是1.5-3％内源性小麦脂质，所述内源性小麦脂质是极性与非极性脂质的混合物。极性脂质分为糖脂和磷脂。这些脂质与两个脂肪酸和一个极性基团所酯化的甘油构成。该极性基团对这些脂质的表面活性产生贡献。对这些脂质中的脂肪酸之一的酶解能使脂质具有更高的表面活性。公知的，诸如DATEM等具有高表面活性的乳化剂被添加到面团中可产生显著作用。
然而，脂酶(E.C.3.1.1.X)在生面类产品中使用会对酵母活性产生损害作用，和/或对面包体积产生负面影响，对面包体积的负面影响往往以剂量过大来解释。剂量过大可导致面筋弹力下降，这使面团过硬，使面包体积缩小。另外，或可选，这些脂酶会降解添加到面团中的起酥油、油脂和乳脂，导致面团和烘焙食品的味道变坏。剂量过大和味道变坏归因于面团中游离脂肪酸的蓄积。
据EP 1193314，EP 0977869和WO01/39602中记载，在制作面包的过程中应用作用于糖脂的脂解酶有很大的好处，其部分水解产物-溶血糖脂具有强的乳化作用，显然导致与游离脂肪酸的不良蓄积相比更高比例的积极乳化剂作用。但是，酶对甘油三酯具有显著的非选择性作用，从而产生不必要的大量游离脂肪酸。
WO 00/32758报导了同样发现，除对长链而非短链脂肪酸有选择性的变体外，还公开了对磷脂和/或糖脂有增强活性的脂解酶变体。WO 01/39602也公开了后一特性，认为对防止游离短链脂肪酸蓄积造成的味道变坏尤为重要。然而，会产生大量的游离脂肪酸。
在W002/094123提到高甘油三酯活性问题，使用脂解酶作用于面团中的极性脂质(如磷脂和糖脂)，而对于甘油三酯或1-甘油单酯基本没有活性。但会产生大量的游离脂肪酸。
有些脂解酶对极性脂质(如糖脂/磷脂)处于溶解状态时呈现低活性或者无活性。此类酶的应用被认为是优选的，因为这类酶可以使高极性可溶脂质(lyso-lipid)聚集从而产生最佳功效。但是游离脂肪酸也同时会蓄积。这种选择性功能是磷脂酶A2和公开在EP 0977869，EP 1193314，和 WO01/39602中的糖脂的特点。已制备了低选择性脂解酶的变异酶，与其母体酶相比对极性可溶脂质活性更低(WO03/060112)。但会有显著的游离脂肪酸生成。
WO00/05396中指出含有一种乳化剂食品的加工过程中，食品原料与酶接触，在酶的作用下，从脂肪酸酯中可就生成乳化剂，并且第二功能性成分从第二成分中产生。WO00/05396还教导了脂酶或脂酶的具体用途。但在WO00/05396中没有讲到脂质酰基转移酶的具体用法，另外，WO00/05396谈到，含水量高的食品中使用酯酶和脂酶会导致显著的游离脂肪酸蓄积。
使用脂酶包括磷脂酶和糖脂酶伴随产生的缺点可由脂质释放的游离脂肪酸累积导致的。在过去的二十年间，脂解酶在食品中的应用受限是由于游离脂肪酸有害的蓄积与有积极作用的可溶脂质的生成之间存在的一种平衡关系。虽然在本领域内进行了大量的尝试，其中一些明显改善了功能，但现有技术没有一个方法能完全说明并解决根本问题，即用脂解酶原位生产的食品中有游离脂肪酸大量蓄积。
未加工的原料或食品产品中存在高水平游离脂肪酸(FFA)普遍被认为是质量缺陷，食品生产商和消费者往往在食品规范中规定了FFA的最高水平。过量的FFA水平可能会导致器官感觉上和/或功能上的缺陷。
脂解作用可导致食品的水解酸败，形成特异的“肥皂”气味，这种“肥皂”气味对食品如乳制品或植物油中的重要成分中等链长度(C8-C12)的脂肪酸尤为显著，尽管这种脂肪酸不会高水平存在。一个更普遍的感觉器官不足是由于脂解酶和氧化过程的联合效用。当在酰基脂质中非酯化时不饱和脂肪酸对酶促氧化作用比其发生酯化时更为敏感。
已确认高水平FFA导致食品功能性缺陷，但仍不能很好的解释。不局限于理论，未发生改变的脂质水解成羧酸使[H+]增加，并产生与其它化合物或金属离子结合的羰基。游离脂肪酸还可以通过疏水性相互作用与蛋白质结合，在烹饪过程中与淀粉结合(complex)。FFA还可以干扰表面活化剂如极性脂质和乳化剂的作用(Lipid in Cereal Technology，P.J.Bames，AcademicPress 1983.)
W003/100044公开了一类已知为PDAT(或ATWAX)的酰基转移酶。这些酶利用甘油单酯或甘油二酯作为受体分子，以磷酸卵磷酯(PC)作为供体分子，产生如下产物：可溶的磷酸卵磷酯、三酰甘油和/或二酰甘油。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及将乳清蛋白掺入食品中的改进，提供了在不降低其质量例如食品组合物和产品本身质地的前提下提高产量的方法。
干酪组合物通常由液体奶制品通过包括用凝结剂或凝固剂处理所述液体的过程制备的。该凝结剂可以是凝乳酶(curding enzyme)，酸，或者合适的细菌培养物，或者它包括所述培养物。形成的乳凝块一般包括经转化的酪蛋白、脂肪包括天然的牛油脂肪、和当使用细菌培养物尤其需要的调味剂。乳凝块可以与液体状乳清分离，乳清中含有不受凝结反应影响的可溶性蛋白，因此没有掺入乳凝块中。
乳清因此是生产食品-例如干酪的商业方法生产的副产品。传统意义上，乳清被当作无用的废物或者被用作肥料或饲料或被加工成食品成分。
乳清蛋白不能充分的被保留在乳凝块中是导致奶制品诸如干酪乳凝块常规生产的效率低下以及与起始乳制液体中所有的蛋白质固体掺入所得干酪凝块中相关的总产量缩减的重要原因。
进行许多努力用以将乳清蛋白包含到干酪中，例如通过加热处理牛奶，加热处理乳清，或通过过滤例如超滤。
也有关于应用具体可蛋白酶诱导乳清蛋白聚集的数篇记述。源于地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)的丝氨酸蛋白酶显示出诱导乳清蛋白聚集的能力(US 5,523,237)。
然而，在生产过程诸如制造干酪中添加乳清蛋白还存在许多难点。例如，乳清蛋白掺入干酪中与产品口味和口感的下降有关，进一步还会干扰凝结和产品的后续加工。已有报道将蛋白酶加入干酪乳用于水解乳清蛋白导致酪蛋白的明显水解，如Madsen，J.S.&Qvist，K.B.(1997)在“Hydrolysisof milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic aminoacid residues”(.J Food Sci.62，579-582)中所述。
因此，在本领域需要这样的方法和组合物，其在保留器官感觉和其它所需特性的同时改善了将乳清蛋白向食品中的掺入。这种优化会导致效率的提高、食品产量的提高和总原料成本的降低。
脂酶：胆固醇酰基转移酶(cholesterol acyltransferase)已经是已知的(参见例如Buckley-Biochemistry伯克利生物化学1983，22，5490-5493)。具体地，已经发现甘油磷脂：胆固醇酰基转移酶(GCAT)，它很象植物和/或哺乳动物卵 磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)，可以催化脂肪酸在卵磷脂与胆固醇之间的转移。
厄普顿(Upton)和伯克利(Buckley)(TIBS 20，May 1995p 178-179)及布鲁米尔科(Brumlik)和伯克利(Buckley)(J.of Bacteriology Apr.1996p2060-2064)教导了源自嗜水气单胞菌(Aeromona hydrophila)的脂酶/酰基转移酶能够将酰基在水介质中转移到乙醇受体上。
发明概要
本发明第一方面提供了一种在食品中原位产生乳化剂的方法，此方法包括将在这里定义的脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种在食品中原位产生乳化剂的方法，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
另一方面，本发明提供了一种在食品中原位产生乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
另一方面，本发明提供了一种在食品中原位产生乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面，提供了一种在食品中原位产生至少两种乳化剂的方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面，提供了一种在食品中原位产生至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种在食品中原位产生至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种在食品中原位产生碳水化合物酯的方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种在食品中原位产生碳水化合物酯和乳化剂的方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种在食品中原位产生乳化剂，以及一种或多种碳水化合物酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白质酯、甘油单酯或甘油二酯的方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含一种乳化剂的食品的产生方法，所述方法包括将这里定义的一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含一种乳化剂的食品的产生方法，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的产生方法，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的产生方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含至少两种乳化剂的食品的产生方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的产生方法，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的产生方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含碳水化合物酯的食品的产生方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含碳水化合物酯和乳化剂的食品的产生方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了一种包含乳化剂以及一种或多种碳水化合物 酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白质酯、甘油单酯或甘油二酯的食品的产生方法，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明的另一方面提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含乳化剂的食品的用途，其中所述乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明的另一方面提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含乳化剂的食品的用途，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，其中所述乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
在另一方面，本发明提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，其中所述乳化剂和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生。
在另一方面，本发明提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述乳化剂和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
在另一方面，本发明提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有至少两种乳化剂的食品的用途，其中所述两种乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明另一方面提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述乳化剂的一种或两种和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明另一方面提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有至少两种乳化剂以及甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品的用途，所述乳化剂的一种或两种和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明另一方面提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有碳水化合物酯的食品的用途，其中所述碳水化合物酯是通过脂质酰基转移酶从 食品原料组分中产生的。
在另一方面，本发明提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有至少一种碳水化合物酯和其它乳化剂的食品的用途，其中所述碳水化合物酯和乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
在另一方面，本发明提供了脂质酰基转移酶用于从食品原料制备含有乳化剂和一种或多种碳水化合物酯、甾醇酯、甾烷醇酯、蛋白质酯、甘油单酯或甘油二酯的食品的用途，其中所述乳化剂和/或碳水化合物酯和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯是通过脂质酰基转移酶从食品原料组分中产生的。
本发明另一方面提供了一种在基于蛋类的食品中原位产生乳化剂(优选溶血卵磷脂)和甾醇酯的方法，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明另一方面提供了一种在基于蛋类的食品中原位产生乳化剂(优选溶血卵磷脂)和甾醇酯的方法，其中所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种基于蛋类的食品的产生方法，所述基于蛋类的食品中含有一种乳化剂(优选溶血卵磷脂)和甾醇酯，其中所述方法使得所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种基于蛋类的食品的产生方法，所述基于蛋类的食品中含有乳化剂(优选溶血卵磷脂)和甾醇酯，所述方法包括将一种脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
本发明另一方面还提供了按照本发明的方法可得到的、优选得到的食品。
在另一方面，本发明进一步涉及包含脂质酰基转移酶的食品酶组合物和/或饲料酶组合物及所述组合物在本方明的方法中的用途。
本发明另一方面进一步提供了一种适合于本发明应用的脂质酰基转移酶的鉴别方法，该方法包括以下步骤：应用“低水分环境中的转移酶测定法”(″Transferase Assay in a Low Water environment″)，“高水分蛋黄中的转移酶测定法”(″Transferase Assay in High Water Egg Yolk″)或“经缓冲的底 物中的转移酶测定法”(″Transferase Assay in Buffered Substrate″)中的一种或多种测定目标酶，并选择一种脂质酰基转移酶，该酶具有以下一种或多种性质：(a)应用“低水分环境中的转移酶测定法”进行检测时，在经过选自30、20或120分钟之一的时间后具有至少1％的相对转移酶活性；(b)在含54％水分的蛋黄中应用“高水分蛋黄中的转移酶测定法”进行检测时，具有高达100％的相对转移酶活性；或者(c)应用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”进行检测时，具有至少2％的酰基转移酶活性。
本发明还进一步提供了一种应用本发明的方法鉴定的脂质酰基转移酶。
在另一方面，本发明提供了一种这里定义的固定化脂质酰基转移酶。
本发明还涉及：
1)一种在食品中原位生产乳化剂的方法，该方法包括将脂质酰基转移酶添加到食品中的步骤。
2)项1所述的方法，其中有至少两种乳化剂生成。
3)项1或项2所述的方法，其中所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成。
4)项1-3任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是这样一种酶，其能够将酰基从脂质转移到下述酰基受体中的一种或多种：固醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质或其亚基、甘油。
5)项2所述的方法，其中至少一种乳化剂是碳水化合物酯。
6)项2所述的方法，其中至少一种乳化剂是蛋白质酯。
7)前述任意一项项所述的方法，其中甾醇酯或甾烷醇酯或蛋白质酯或碳水化合物酯或甘油二酯或甘油单酯中的一种或多种在食品中原位生成。
8)项7所述的方法，其中所述甾醇酯是一种或多种α-谷甾醇酯、β-谷甾醇酯、豆甾醇酯、麦角固醇酯、油菜甾醇酯或胆固醇酯。
9)项6所述的方法，其中所述甾烷醇酯是一种或多种β-谷甾醇或ss-谷甾醇。
10)前述项任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种残基：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T， N，M或S。
11)前述项任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含 H-309，或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。
12)前述项任意一项所述的方法，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生物体获得：气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
13)前述项任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ IDNo.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQ IDNo.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。
14)前述项任意一项所述的方法，其中所述乳化剂是下列物质中的一种或多种：甘油单酯、溶血磷脂酰胆碱、DGMG。
15)脂质酰基转移酶在从食物原料制备包含乳化剂的食品中的用途，其中所述乳化剂在食品中的游离脂肪酸不增加或基本不增加的情况下生成，所述乳化剂是通过脂质酰基转移酶从食物原料组分中产生的。
16)项15所述的用途，其中有至少两种乳化剂生成。
17)项16所述的用途，其中至少一种乳化剂是碳水化合物酯。
18)项16所述的用途，其中至少一种乳化剂是蛋白质酯。
19)项15-18中任意一项所述的用途，其中一种或多种甾醇酯或甾烷醇酯或蛋白质酯或碳水化合物酯或甘油二酯或甘油单酯也在食品中原位产生。
20)项19所述的用途，其中所述的甾醇酯是α-谷甾醇酯、β-谷甾醇酯、豆甾醇酯、麦角固醇酯、油菜甾醇酯或胆固醇酯中的一种或多种物质。
21)项20所述的用途，其中所述甾烷醇酯是一种或多种β-谷甾醇或ss-谷甾醇。
22)项15-21中任意一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种残基：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T， N，M或S。
23)项15-22中任意一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。
24)项15-23中任意一项所述的用途，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生物体获得：气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌属、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
25)项15-24中任意一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQID No.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。
26)项15-25中任意一项所述的用途，其中所述乳化剂是下列物质中的一种或多种：甘油单酯、溶血磷脂酰胆碱、DGMG。
27)一种食品酶组合物或饲料酶组合物，其含有脂质酰基转移酶。
28)项27所述的食品酶组合物或饲料酶组合物，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸 基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种残基：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S。
29)项27或28所述的食品酶组合物或饲料酶组合物，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。
30)项27-29中任意一项所述的食品酶组合物或饲料酶组合物，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生物体获得：气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌属、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
31)项27-30中任意一项所述的食品酶组合物或饲料酶组合物，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQ ID No.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。
32)项27-31中任意一项所述的食品酶组合物或饲料酶组合物依照项15-26中任意一项的用途，或在项1-14中任意一项的方法中的用途。
33)一种食品，其可用项1-14中任意一项所述的方法获得。
34)一种固定化的脂质酰基转移酶。
35)项34所述固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种残基：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T， N，M或S。
36)项34或项35所述固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ IDNo.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。
37)项34-36中任意一项所述固定化的脂质酰基转移酶，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生物体获得：气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌属、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
38)项34-37中任意一项所述固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ IDNo.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ IDNo.34所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQ ID No.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。
39)一种鉴定适合用于本发明的脂质酰基转移酶的方法，其中该方法包括下述步骤，即应用“低水分环境中的转移酶测定法”、“高水分蛋黄中的转移酶测定法”或“经缓冲的底物中的转移酶测定法”中的一种或多种方法检测目的酶，选择具有下述一种或多种性质的脂质酰基转移酶：(a)当应用“低水分环境中的转移酶测定法”、在30、20、或120分钟后进行检测时具有至少1％的相对的转移酶活性；(b)当应用“高水分蛋黄中的转移酶测定法”在含水54％的蛋黄中进行检测时，具有至多100％的相对转移酶活性；或者(c)当应用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”检测时具有至少2％的酰基转移酶活性。
40)项39所述的方法，其中选择这样的脂质酰基转移酶，该酶具有以下性质中两种以上的性质：(a)当应用“低水分环境中的转移酶测定法”、在30、20、或120分钟后进行检测时具有至少1％的相对的转移酶活性；(b)当应用“高水分蛋黄中的转移酶测定法”在含水54％的蛋黄中进行检测时，具有至多100％的相对转移酶活性；或者(c)当应用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”检测时具有至少2％的酰基转移酶活性。
41)项39所述的方法，其中选择这样的脂质酰基转移酶，该酶具有以下性质中三种以上的性质：(a)当应用“低水分环境转移酶测定法”时经过选自30、20、或120分钟的时间段后测量，得到至少1％的相对的转移酶活性；(b)当检测含水54％蛋黄时应用“高水分蛋黄中转移酶测定法”，得到至多100％的相对转移酶活性；或者(c)当应用“缓冲底物中转移酶测定法”，得到至少2％转移酶活性。
42)项39所述的方法，其中选择这样的脂质酰基转移酶，该酶具有以下性质中的所有性质：(a)当应用“低水分环境转移酶测定法”时经过选自30、20、或120分钟的时间段后测量，得到至少1％的相对的转移酶活性；(b)当检测含水54％蛋黄时应用“高水分蛋黄中转移酶测定法”，得到至多100％的相对转移酶活性；或者(c)当应用“缓冲底物中转移酶测定法”，得到至少2％转移酶活性。
43)脂质酰基转移酶，其利用根据项39-42中任意一项的方法而得以鉴定。
本发明的详细描述
本文应用的术语“脂质酰基转移酶”是指一种也具有脂酶活性的酶(根据国际生物化学分子生物学联合会命名委员会的酶命名法推荐(EnzymeNomenclature Recommendations)(1992)通常分类为E.C.3.1.1.x)，该酶也具有酰基转移酶活性(通常分类为E.C.2.3.1.x)，该酶能够将酰基从一种脂质转移到一种或多种受体底物，例如以下物质的一种或多种：固醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质或其亚单位或甘油。
优选的，在本发明的方法和/或本发明的用途中所用的脂质酰基转移酶能够将酰基从脂质(如这里定义的)转移到一种或多种下述酰基受体底物：固醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质或其亚单位或甘油。
在本发明的一些方面中的“酰基受体”可以是任何包含羟基的化合物， 例如多价醇类包括甘油、固醇、甾烷醇、碳水化合物；羟基酸包括果酸、枸橼酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白质或其亚单位如氨基酸、蛋白质水解物和肽类(部分水解的蛋白质)，及其混合物和衍生物。对于本发明而言优选的“酰基受体”不是水。
在一实施方案中，所述酰基受体优选不是甘油单酯和/或甘油二酯。
在一方面中，所述酶能优选将酰基从脂质转移到固醇和/或甾烷醇。
在一方面中，所述酶能优选将酰基从脂质转移到碳水化合物。
在一方面中，所述酶能优选将酰基从脂质转移到蛋白质或其亚单位。适宜的蛋白质亚单位可能是下列一种或多种物质：氨基酸、蛋白质水解物、缩氨酸，二肽，寡肽，多肽。
适宜地，在蛋白质或蛋白质亚单位中，酰基受体可以是蛋白质或蛋白质亚单位的一或多种以下组分：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸。
当蛋白质亚单位是氨基酸时，所述氨基酸宜为任何适合的氨基酸。适合的氨基酸宜为，举例来说，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸中的一种或多种。
在一方面，所述酶能优选将酰基从脂质转移到甘油。
在一方面，所述酶能优选将酰基从脂质转移到羟基酸。
在一方面，所述酶能优选将酰基从脂质转移到多价醇。
在一方面，脂质酰基转移酶还能将酰基从脂质转移到固醇和/或甾烷醇，还能将酰基从脂质转移到下列一种或多种物质：碳水化合物、蛋白质、蛋白质水解物、甘油。
优选地，本发明的一些方面，脂质酰基转移酶对其起作用的脂质底物是下列一种或多种脂质：磷脂，诸如卵磷脂例如磷脂酰胆碱、三酰甘油、心磷脂、甘油二酯，或糖酯诸如双半乳糖甘油二酯(DGDG)。此处所指的脂质底物可称为“脂质酰基供体”，这里应用的术语卵磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
在一些方面，优选地，脂质酰基转移酶对其起作用的脂质底物是磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。
在一些方面，优选地，所述脂质底物是糖脂，例如DGDG。
脂质底物优选是食品脂质，也就是说食品中的脂质成分。
在一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶不能或基本不能作用 于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯。
脂质底物或脂质酰基供体宜为一种或多种脂质，其存在于一种或多种下列底物中：脂肪，包括猪油(lard)、牛羊油(tallow)、乳脂(butter fat)；油，包括从棕榈油(palm oil)、葵花子油(sunflower oil)、大豆油(soya bean oil)、红花油(safflower oil)、棉籽油(cotton seed oil)、花生油(ground nut oil)、玉米油(corn oil)、橄榄油(olive oil)、花生油(peanut oil)、椰子油(coconut oil)和油菜籽油(rape seed oil)中提取或由它们衍生的油。来自大豆、油菜籽、或蛋黄的卵磷脂也是适宜的脂质底物。脂质底物也可以是燕麦脂质或其它包含半乳糖脂的基于植物的物质。
在一方面，脂质酰基供体优选蛋黄中的卵磷脂(如磷脂酰胆碱)。
在本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为8-22碳的脂质。
本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为16-22碳的脂质，更优选为16-20碳的脂质。
本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长不多于14碳的脂质，适宜地选自脂肪酸链长4-14碳的脂质，适宜为4-10碳的脂质，适宜为4-8碳的脂质。
适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶可显示出一种或多种下列脂酶的活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)，三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)，磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)，磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。这里应用的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。
适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶具有至少一种或多种下列活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)和/或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)。
对于本发明一些方面，脂质酰基转移酶至少具有糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。
适宜地，对于一些方面，本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂上转移到以下一种或多种受体底物：固醇，甾烷醇，碳水化合物，蛋白质，甘油。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂转移到固醇和/或甾烷醇，形成至少甾醇酯和/或甾烷醇酯。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂 转移到碳水化合物，形成至少碳水化合物酯。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂或磷脂转移到蛋白质，形成至少蛋白酯(或蛋白脂肪酸缩合物(condensate))。
一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂转移到甘油，至少形成甘油二酯和/或甘油单酯。
一些方面，优选本发明脂质酰基转移酶不表现三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)。
在一些方面，所述脂质酰基转移酶可将酰基从脂质转移到固醇和/或甾烷醇。因此，在一个实施方案中，本发明的“酰基受体”既可以是固醇又可以是甾烷醇，或二者的联用物。
在一个实施方案中，适宜的固醇和/或甾烷醇可以包括以下一种或多种结构特征：
i)3-β羟基或3-α羟基；和/或
ii)顺式位置的A:B环或反式位置的A:B环或者C5-C6是不饱和的。
适宜的固醇酰基受体包括胆固醇和植物甾醇(phytosterol)，例如α-谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇、豆甾醇(stigmasterol)、麦角固醇(ergosterol)、油菜甾醇(campesterol)、5，6-二氢固醇、菜子固醇(brassicasterol)、α-菠菜甾醇(spinasterol)、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、岩藻甾醇(fucosterol)、dimosterol、子囊甾醇(ascosterol)、serebisterol，、表甾醇(episterol)、anasterol、α-苯基丁酰胺(hyposterol)、chondrillasterol、链甾醇(desmosterol)、海绵甾醇(chalinosterol)、多孔甾醇(poriferasterol)、γ-谷甾醇(clionasterol)、固醇糖苷(sterol glycoside)和其它天然或合成的同分异构体和衍生物。
在本发明的一方面，适宜地，一种以上固醇和/或甾烷醇可以作为酰基受体，适宜地，两种以上固醇和/或甾烷醇可以作为酰基受体。换言之，在本发明一个方面，适宜地，可以产生一种以上甾醇酯和/或甾烷醇脂。适宜地，当胆固醇是酰基受体时，一种或多种其他固醇和一种或多种甾烷醇也可作为酰基受体。因此，在一个方面，本发明提供了胆固醇酯与至少一种甾醇酯或甾烷醇酯的原位联合产生方法。换言之，在本发明的一些方面，脂质酰基转移酶可以将酰基从脂质上转移到胆固醇与至少一种其它固醇和/或至少一种甾烷醇。
在一方面，优选的固醇酰基受体是下列一种或多种物质：α-谷甾醇、 β-谷甾醇、豆甾醇、麦角固醇、油菜甾醇。
在一方面，优选的所述固醇酰基受体是胆固醇。当胆固醇作为脂质酰基转移酶的酰基受体的情况下，食品中游离胆固醇的量与用脂质酰基转移酶处理前的食品中的游离胆固醇相比和/或与未经脂质酰基转移酶处理的等量食品中的游离胆固醇相比减少。
适合的甾烷醇酰基受体包括植物甾醇，例如β-谷甾醇或ss-谷甾醇。
在一方面，优选地，所述固醇和/或甾烷醇酰基受体是除胆固醇之外的固醇和/或甾烷醇。
在一些方面，按照本发明方法制备的食品可用于降低血清胆固醇和/或低密度脂蛋白。血清胆固醇和低密度脂蛋白与人类某些疾病有关，诸如动脉粥样硬化和/或心脏病。因此，可以设想，按照本发明方法制备的食品可用于降低患这些疾病的风险。
因此，在本发明的一方面，提供了本发明中的食品用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或心脏病的用途。
在又一方面，本发明提供了一种含有本发明食品的药剂。
在又一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防人类和动物患者疾病的方法，所述方法包括给予患者有效量的本发明中的食品。
适宜地，固醇和/或甾烷醇“酰基受体”可天然存在于所述食品中。所述固醇和/或甾烷醇可选择地添加到食品中。在将固醇和/或甾烷醇添加到所述食品中的情况下，可在添加本发明的脂质酰基转移酶之前，同时，和/或之后在食品中添加固醇和/或甾烷醇。适当地，本发明的方法可包括在添加本发明的酶之前或者同时将外源性固醇/甾烷醇(具体为植物固醇/phytostanol)添加到食品中。
在一些方面，在添加本发明的脂质酰基转移酶之前或同时，所述食品中的一种或多种的固醇可能被转化成一种或多种甾烷醇。任何将固醇转化成甾烷醇的适宜方法都可使用，例如，可以通过化学氢化作用实施所述转化。这种转化可在本发明的脂质酰基转移酶添加之前或本发明的脂质酰基转移酶添加的同时进行。将固醇转化成甾烷醇的适宜的酶在WO00/061771中有教导。
本发明可以适宜应用于在食品中原位产生phytostanol酯。phytostanol酯具有增加的透类脂膜溶解性，生物利用度，且更加有益于健康(参见例如 WO92/99640)。
在本发明的一些具体实施方案中，甾烷醇酯和/或甾醇酯可以是一种调味剂和/或组织形成剂。在这些实施例中本发明包括了原位产生的调味剂和/或组织处理剂(texturiser)。
在本发明的一些方面，本发明所述的脂质酰基转移酶可利用碳水化合物作为酰基受体。碳水化合物酰基受体可以为以下物质中的一种或多种：单糖、二糖、寡糖或多糖。优选的碳水化合物是以下物质中的一种或多种：葡萄糖、果糖、脱水果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖、木寡糖(xylooligosacharide)、阿拉伯糖、麦芽寡糖(maltooligosaccharide)、塔格糖(tagatose)、microthecin、ascopyrone P、ascopyrone T、cortalcerone。
适宜地，碳水化合物“酰基受体”可以天然存在于食品中。可选择地，碳水化合物可以被添加到食品中。当向食品中添加碳水化合物时，可在添加本发明中的脂质酰基转移酶之前、同时、和/或之后添加碳水化合物。
碳水化合物酯可以在食品中用作有价值的乳化剂。因此，当酶的作用为将酰基转移到糖上时，本发明包括了在食品中产生第二原位乳化剂。
在一些实施方案中，脂质酰基转移酶可以利用固醇和/或甾烷醇以及碳水化合物作为酰基受体。
对于包含蛋类的食品，利用可将酰基转移到碳水化合物及固醇和/或甾烷醇上的脂质酰基转移酶特别有益。具体地，蛋类和蛋类食品中糖特别是葡萄糖的存在，常被认为是没有益处的。蛋黄可以包含多至1％葡萄糖。通常，蛋类或基于蛋类的食品可以用葡萄糖氧化酶处理以去除部分或全部葡萄糖。然而，在本发明中，这种多余的糖可以很容易通过糖的酯化生成糖酯来去除。
在本发明的一些方面，本发明所述脂质酰基转移酶可以利用蛋白质作为酰基受体。适宜的蛋白质可以是食品中例如在乳制品和/或肉制品中的一种或多种蛋白质。仅作为实例，适宜的蛋白质可能是乳凝块或乳清中的蛋白质，如乳球蛋白。其它适宜的蛋白质包括来自蛋类的卵清蛋白、麸蛋白(gliadin)、麦谷蛋白(glutenin)、puroindoline、谷物中的脂质转移蛋白和肉类中的肌球蛋白。
因此在本发明中，可以实现一种或多种如下的有益性质：原位产生乳化剂而不增加游离脂肪酸含量；食品中游离脂肪酸蓄积量下降；食品中的 游离胆固醇水平下降；甾醇酯和/或甾烷醇酯增加；血清胆固醇和/或低密度脂蛋白下降；碳水化合物酯增加；多余的游离碳水化合物减少。
本发明的优势在于，在食品中原位产生乳化剂而不增加或基本不增加食品中游离脂肪酸的含量。游离脂肪酸的产生对食品是有害的。具体地，游离脂肪酸与食品中气味变坏(off-odour)和/或味道变坏(off-flavour)有关，另外还有其它有害影响，包括例如干酪中有肥皂味等等。优选地，本发明提供的方法使乳化剂在原位制备，减少和/或消除其中游离脂肪酸的蓄积。不局限于理论，根据本发明所述，用脂质酰基转移酶将脂质上的脂肪酸转移到酰基受体，例如固醇和/或甾烷醇上。因此，食品中的游离脂肪酸总体水平不会增加或仅增加到不显著的水平。这和利用脂酶(E.C.3.1.1.x)原位产生乳化剂的情况形成鲜明对比。具体地，脂酶的使用可使食品中游离脂肪酸大量增加，这一点是有害的。本发明中游离脂肪酸的蓄积量与使用脂酶(具体为磷脂酶A)代替本发明中的脂质酰基转移酶时游离脂肪酸的蓄积量相比，减少和/或消除。
利用脂质酰基转移酶将酰基转移到固醇和/或甾烷醇，对含蛋类的食品特别有益。具体地，发现利用这里定义的脂质酰基转移酶处理的基于蛋类的食品与用常规的磷脂酶例如(Novozymes A/S，Denmark)，Lecitase
Figure G2009101343050D00212
(Novozymes A/S，Denmark)或来自Biocatalysts的Lipomod 22L处理的基于蛋的食品相比，明显具有更好的特性。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征：
(i)该酶具有转移酰基的活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；和
(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S。
优选地，GDSX基序中的X是L，这样，本发明所述的酶优选包含氨基酸基序GSDL。
GDSX基序是由四种保守氨基酸构成。优选地，所述基序中的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，GDSX基序中的丝氨酸可以在与嗜水气单胞菌脂解酶中与Ser-16相应的位置，如Brumlik和Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996，Vol.1，No.7，p 2060-2064)的教导。
为确定一种蛋白质是否含有本发明所述GDSX基序，该序列优选与 Pfam数据库中的隐藏markov模型图谱(model profile)(HMM图谱)进行比较。
Pfam是蛋白质结构域家族的数据库。Pfam包括为每个家族的辅助(curated)多重序列比对以及用于鉴定新序列中的这些结构域的隐藏Markov模型图谱(HMM图谱)。对Pfam的介绍见于Bateman A等.(2002)NucleicAcids Res.30；276-280。隐藏Markov模型被应用于许多旨在对蛋白质进行分类的数据库中，综述见Bateman A和Haft DH(2002)Brief Bioinform3；236-245。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&list uids＝12230032&dopt＝Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&list uids＝11752314&dopt＝Abstract
对隐藏Markov模型的详细解释和这些模型如何在Pfam数据库中应用参见Durbin R，Eddy S，和Krogh A(1998)Biological sequence analysis；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4(Durbin R，Eddy S，和Krogh A(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4。Hammer程序包可以从华盛顿大学，St Louis，USA获得。
可选择地，GDSX基序可以通过应用Hammer软件包识别，说明由Durbin R，Eddy S，和Krogh A(1998)Biological sequence analysis；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4(Durbin R，Eddy S，和Krogh A(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4)及其中的参考文献提供，以及本说明书中关于HMMER2的资料。
PFAM数据库可以通过，例如，目前位于如下网址的几个服务器进行访问：
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
数据库提供了检索工具，在此可以输入蛋白质序列。应用数据库的默认参数，对蛋白质序列中Pfam结构域的存在进行分析。GDSX结构域是在 数据库中已建立的区域，因此任何查询序列中存在的该结构域可以得到识别。数据库将返回Pfam00657共有序列与查询序列的比对。
多重比对，包括杀鲑气单胞菌或嗜水气单胞菌可以通过下列方法获得。
a)手工方法
通过上述程序，可获得目的蛋白与Pfam00657共有序列的比对并获得P10480序列与Pfam00657共有序列的比对；或
b)通过数据库
在鉴定Pfam00657共有序列之后，数据库提供选项显示查询序列与Pfam00657共有序列的种子比对(seed alignment)，P10480是该种子比对的一部分，且表示为GCAT_AERHY。查询序列和P10480都将在同一窗口显示。
嗜水气单胞菌参比序列：
嗜水气单胞菌GDSX脂酶的残基在NCBI文件P10480中进行编号，所述文本中的编号是指由该文件给出的编号，在本发明中它用来确定具体的氨基酸残基，所述具体的氨基酸残基在优选具体实施方案中，存在于本发明的脂质酰基转移酶中。
实施Pfam比对(图33和34)
下列保守的残基可被识别，并且在优选的实施方案中存在于本发明的组合物和方法所应用的酶中。
1区-GDSX区
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28  29  30  31 32  33  34  35
2区-GANDY区
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
3区-HPT区
His
309
其中′hid′是指选自Met，Ile，Leu，Val，Ala，Gly，Cys，His，Lys，Trp，Tyr或Phe的一个疏水残基。
优选地，应用于本发明的组合物/方法中的脂质酰基转移酶可用Pfam00657共有序列进行比对。
优选地，与pfam00657结构域家族的隐藏markov模型图谱(HMM图谱)的阳性匹配表明本发明中的GDSL或GDSX结构域的存在。
优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中的脂质酰基转移酶含有至少一个，优选一个以上，优选两个以上下列区域，GDSx区、GANDY区、HPT区。适宜地，脂质酰基转移酶含有GDSx区和GANDY区。可选择地，所述酶含有GDSx区和HPT区。优选地，所述酶含有至少一个GDSx区。
优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中的酶与参比嗜水气单胞菌多肽序列即SEQ ID No.32比较时含有至少一个，优选一个以上，优选两个以上，优选三个以上，优选四个以上，优选五个以上，优选六个以上，优选七个以上，优选八个以上，优选九个以上，优选十个以上，优选十一个以上，优选十二以上，优选十三以上，优选十四个以上下列氨基酸残基：28hid，29hid，30hid，31hid，32gly，33Asp，34Ser，35hid，130hid，131Gly，132hid，133Asn，134Asp，135hid，309His。
pfam00657 GDSX结构域是将具有该区域蛋白与其它酶区分的独特标识。
Pfam00657共有序列，表示为图1的SEQ ID No.1。这是从第6版数据库Pfam00657家族的鉴定衍生出来的，本文也称其为pfam00657.6。
共有序列可通过新版Pfam数据库来更新。
例如，图33和34显示第11版数据库中00657家族的pfam比对，本文也称其为pfam00657.11。
发现两个版本(release)的数据库中Pfam00657家族中都存在GDSx区、GANDY区和HPT区。其它版本的pfam数据库可用来鉴定pfam00657家族。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征：
(i)该酶具有转移酰基的活性(可定义为酯基转移活性)，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；
(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S；
(iii)该酶包含His-309或包含对应于嗜水气单胞菌脂解酶的His-309位的组氨酸残基，所述嗜水气单胞菌脂解酶如图2所示(SEQ ID No.2或SEQID No.32)。优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。
在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)中的His-291。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体：Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分别对应于图2(SEQ ID No.2)或图28(SEQ ID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示序列中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34，Asp-134和His-309，等同于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16，Asp-116和His-291。在图1(SEQ IDNo.1)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser-7，Asp-157和His-348。
优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征：
(i)该酶具有转移酰基的活性(可定义为酯基转移活性)，由此将第一脂质酰基供体原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体形成新酯；并且
(ii)该酶包含至少Gly-32，Asp-33，Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分别对应于图2(SEQ ID No.2)或图28(SEQ ID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中Gly-32，Asp-33，Ser-34，Asp-134和His-309的甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以并优选从下列来自一个或多个属的生物体中获得：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李司忒氏菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄杆菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以并优选从下列一种或多种生物体中获得：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉 菌(Streptomyces rimosus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌(Vibrionaceae)、苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)、硫磺矿硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、无害李司忒氏菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、Mesorhizobium loti、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。
在一方面，优选地，本发明中的脂质酰基转移酶可以并优选从一种或多种嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中获得。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含一种或多种下列氨基酸序列。
(i)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列(见图2)
(ii)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列(见图3)
(iii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列(见图4)
(iv)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列(见图5)
(v)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列(见图6)
(vi)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列(见图14)
(vii)SEQ ID No.20所示的氨基酸序列(见图16)
(viii)SEQ ID No.22所示的氨基酸序列(见图18)
(ix)SEQ ID No.24所示的氨基酸序列(见图20)
(xi)SEQ ID No.26所示的氨基酸序列(见图22)
(xii)SEQ ID No.28所示的氨基酸序列(见图24)
(xiii)SEQ ID No.30所示的氨基酸序列(见图26)
(ixi)SEQ ID No.32所示的氨基酸序列(见图28)
(xiv)SEQ ID No.34所示的氨基酸序列(见图30)
或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQID No.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者更高同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶或者包含SEQ ID No.2或SEQID No.3或SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列有75％或75％以上，优选80％或80％以上，优选85％或85％以上，优选90％或90％以上，优选95％或95％以上同一性的氨基酸序列。
为了达到本发明的目的，同一性的程度取决于相同序列元素的数目。依照本发明，同一性程度可通过本领域已知电脑程序适宜地测定，所述程序诸如GCG程序包提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，US53711)(Needleman & Wunsch(1970)，J.of Molecular Biology48，443-45)，利用下列设置进行多肽序列比较：GAP生成罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含一段氨基酸序列，该序列与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQ IDNo.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的任何一段序列具有80％或80％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上的同一性。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一个或多个：
(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的1-100氨基酸残基所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的101-200氨基酸残基所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的201-300氨基酸残基所示的氨基酸序列；或
(d)与上述(a)-(c)定义的任意氨基酸序列有75％或75％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上同一性的 氨基酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一个或多个：
(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；
(d)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或
(f)与上述(a)-(e)定义的任意氨基酸序列有75％或75％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以包含下列核苷酸序列中的一个或多个序列表达而产生的氨基酸序列。
(a)如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列(见图9)；
(b)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列(见图10)；
(c)如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列(见图11)；
(d)如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列(见图12)；
(e)如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列(见图13)；
(f)如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列(见图15)；
(g)如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列(见图17)；
(h)如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列(见图19)；
(i)如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列(见图21)；
(j)如SEQ ID No.27所示的核苷酸序列(见图23)；
(k)如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列(见图25)；
(l)如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列(见图27)；
(m)如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列(见图29)；
(n)如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列(见图31)；
(o)或
与SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQID No.11，SEQ ID No.13，SEQ ID No.21，SEQ ID No.23，SEQ ID No.25，SEQ ID No.27，SEQ ID No.29，SEQ ID No.31，SEQ ID No.33或SEQ IDNo.35所示的任意一序列具有75％或75％以上同一性的核苷酸序列。
适宜地，核苷酸序列可以与SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.13，SEQ ID No.21，SEQID No.23，SEQ ID No.25，SEQ ID No.27，SEQ ID No.29，SEQ ID No.31，SEQ ID No.33或SEQ ID No.35所示的任意一序列具有80％或80％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上的同一性。
一方面，本发明所述的脂质酰基转移酶可以为卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(例如分子进化产生的变体)。
本领域所知的适宜的LCAT可从下列一种或多种生物体中得到，例如：哺乳动物、大鼠、小鼠、小鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物，包括拟南芥(Arabidopsis)和稻(Oryza sativa)、线虫、真菌和酵母。
在本发明所述的脂质酰基转移酶的一个具体实施方案中，所述的脂质酰基转移酶可以并优选从含有pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大肠杆菌菌株E.TOP 10(E.coli strains TOP 10)中获得，该菌株由丹麦哥本哈根K，DK-1001，Langebrogade 1的丹尼斯科公司(Danisco A/S of Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，Denmark)，根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏(the Budapest Treaty on the International Recognitionof the Deposit of Microorganisms for the purpose of Patent Procedure)在2003年12月22日保藏于英国苏格兰阿伯丁圣马恰尔街23号国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)(the National Collection ofIndustrial，Marine andFood Bacteria (NCIMB)23 St.Machar Street，Aberdeen Scotland，GB)，保藏号分别为NCIMB 41204和NCIMB 41205。
优选地，当实施本发明的方法时，在不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸的情况下产生产品。
这里使用的术语“转移酶”与术语“脂质酰基转移酶”可以互换。
适宜地，本发明定义的脂质酰基转移酶催化下列一种或多种反应：酯交换作用(interesterification)，酯基转移作用(transesterification)，醇解作用，水解作用。
术语“酯交换作用”指的是酰基在脂质供体与脂质受体之间的酶催化转移，其中的脂质供体不是游离的酰基。
本文术语“酯基转移作用”指的是酰基从脂质供体(除外游离脂肪酸)上经酶催化转移到酰基受体(除外水)。
本发明使用的术语“醇解作用”指的是通过与醇ROH的反应酸衍生物的共价键的酶裂解，使得一产物与醇的H结合而另一产物与醇的OR基团结合。
本发明使用的术语“醇”指的是包含羟基的烷基化合物。
本发明使用的术语“水解作用”指的是酰基从脂质到水分子OH基团的酶催化转移作用。由水解作用引起的酰基转移作用需要水分子的分离。
这里使用的术语“不增加或基本不增加游离脂肪酸”指的是本发明的脂质酰基转移酶优选具有100％转移酶活性(即将100％的酰基从酰基供体转移到酰基受体，无水解活性)；但是此酶可将不到100％的存在于脂质酰基供体中的酰基转移到酰基受体。在这种情况下，优选的酰基转移酶活性占总酶活性的至少5％，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，并且更优选至少98％。％转移酶活性(即转移酶活性占总酶活性的百分比)可通过下列方案测定：
测定转移酶活性百分率的实验设计：
酶促反应后，可用CHCl3：CH3OH 2∶1提取已添加本发明的脂质酰基转移酶的食品，分离包含脂质物质的有机相，并可根据在下文描述的详细步骤通过GLC和HPLC分析。通过GLC和HPLC的分析，确定游离脂肪酸和一种或多种固醇/甾烷醇酯类；碳水化合物酯；蛋白质酯；甘油二酯；或单甘油酯的量。不添加本发明的酶的对照食品用同种方法分析。
计算：
从GLC和HPLC分析的结果可以计算出游离脂肪酸和/或固醇/甾烷醇酯类和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油二酯和/或单甘油酯的增加量。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；Mv脂肪酸＝脂肪酸平均分子量
A＝Δ％甾醇酯/Mv甾醇酯(其中Δ％甾醇酯＝％固醇/甾烷醇酯(酶)-％固醇/甾烷醇酯(对照)，Mv甾醇酯＝固醇/甾烷醇酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是固醇和/或甾烷醇酯；
B＝Δ％碳水化合物酯/Mv碳水化合物酯(其中Δ％碳水化合物酯＝％碳水化合物酯(酶)-％碳水化合物酯(对照)，Mv碳水化合物酯＝碳水化合物酯平均分子量)，这适用于酰基受体是碳水化合物。
C＝Δ％蛋白质酯/Mv蛋白质酯(其中Δ％蛋白质酯＝％蛋白质酯(酶)-％蛋白质酯(对照)，Mv蛋白质酯＝蛋白质酯平均分子量)，这适用于酰基受体是蛋白；和
D＝甘油二酯和/或单甘油酯/Mv甘油二酯/单甘油酯的绝对值(其中Δ％甘油二酯和/或甘油单酯＝％甘油二酯和/或甘油单酯(酶)-％甘油二酯和/或甘油单酯(对照)，Mv甘油二酯/甘油单酯＝甘油二的酯和/或甘油单酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是甘油。
转移酶活性以占总酶活性的百分率计算：
Figure G2009101343050D00311
*指适当时删除。
如果食品中的游离脂肪酸增加，优选它们基本不增加，即不达到显著水平。我们的意思是游离脂肪酸的增加不会负面影响食品质量。
本发明的一些方面，使用的术语“基本不增加游离脂肪酸”意思是用本发明脂质酰基转移酶处理过的食品或组合物中的游离脂肪酸量少于在已使用除本发明脂质酰基转移酶以外的酶时食品或化合物中产生的游离脂肪酸量，例如与已使用常规的磷脂酶如
Figure G2009101343050D00312
(Novozymes A/S，丹麦)时产生的游离脂肪酸含量进行比较。
本文术语“原位”意思是乳化剂和/或固醇/甾烷醇酯类和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯或甘油二酯在食品或食品级分中产生。这与以下情形相反：乳化剂和/或固醇/甾烷醇酯类和/或碳水化合物酯和/或蛋 白质酯和/或甘油单酯或甘油二酯与食品分开制备，并作为形成的(formed)产物在等同制备过程中添加到食品中。换句话说，本发明使用的术语“原位”意思是通过将本发明的脂质酰基转移酶添加到食品中，或加到构成所述食品的食物成分/材料中，乳化剂和/或固醇/甾烷醇酯类和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯或甘油二酯可从食品成分产生。食品中的成分可适宜为酶的底物。如有必要，食品中的成分可通过添加一种或多种与所述食品中的成分相同或与已存在于所述食品中的成分不同的成分而得到补充。为避免产生疑问，在一个实施方案中，本发明方法可以是一种在食品中原位产生乳化剂和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油单酯或甘油二酯的方法，而不是制备用于随后加到食品中的乳化剂和/或甾醇酯和/或甾烷醇酯(例如是分离和/或纯化的形式)的方法。
在另一具体实施方案中，脂酶酰基转移酶可在食物加工中使用，但并不保留于食品中。例如，脂酶酰基转移酶可以是固定化的，能够被再使用。
优选地，本发明的脂质酰基转移酶能在极性环境，优选水性环境，优选含水食品中将酰基从脂质转移到固醇和/或甾烷醇和/或碳水化合物和/或蛋白和/或甘油。适宜的水性环境可以是水的缓冲液或可以是食品的含水相。本文的术语“水性环境”优选指这样的环境，其不存在有机溶剂，优选不存在极性有机溶剂，更为优选为不存在不可食用有机溶剂。术语“水性环境”具体指不添加外源性有机溶剂，优选不添加极性有机溶剂的环境。这里使用的术语有机溶剂不包括食物油，优选不包括含大量非极性脂质的食物油。在一个实施方案中术语有机溶剂应除外可食用有机溶剂，如乙醇、丙二醇和/或甘油。本发明适宜的水性环境可包含体积百分比小于80％的有机溶剂，体积百分比小于70％的有机溶剂，体积百分比小于50％的有机溶剂，体积百分比小于30％的有机溶剂，优选含体积百分比小于15％的有机溶剂，更优选含体积百分比小于5％的有机溶剂。适宜的食品应含1-5％的有机溶剂，如乙醇。但是，当食品中含有这样的有机溶剂时，优选在食品中内源生成它。这就是说，当食品中含有这样的有机溶剂时，优选的有机溶剂并非外源性有机溶剂。
此处应用的术语“食品”是指适于人类和/或动物食用的物质。
适宜地，此处应用的术语“食品”可以指某种形式便于食用的食品。然而，可选或者进一步，此处应用的术语“食品”也可以指代一种或多种 用于制备食品的食物材料。仅作为举例，术语食品包括由面团制作的烘焙食品，也包括制备上述烘焙食品所用的面团。
本发明优选的方面提供了一种在前面定义过的食品，该食品选自以下的一种或多种食品：蛋类、基于蛋的产品(包括但不仅限于蛋黄酱、色拉调料、沙司(sauce)、冰淇淋、蛋粉、改良蛋黄及由它们制备的产品)、烘焙食品(包括面包、蛋糕、甜面制品、层状面点、液体面糊(batter)、松饼、油炸圈饼、饼干(biscuit)、发面饼干(cracker)和曲奇饼干)、糖食(confectionary)(包括巧克力、糖果(candy)、焦糖(caramel)、halawa、口香糖，包括无糖口香糖和含糖甜口香糖、泡泡糖、软泡泡糖、口香糖和布丁)、冷冻食品(包括清凉果汁饮料(sorbet)、优选的冰冻乳制品(dairy)(包括冰淇淋、冰牛奶))、乳制品(包括干酪、黄油、牛奶、咖啡稀奶油(coffee cream)、搅打起泡的稀奶油(whipped cream)、蛋奶羹(custard cream)、奶饮品和酸奶)、木斯(mousse)、经搅打的蔬菜奶油泥(whipped vegetable cream)、肉制品(包括加工的肉制品(processed meat products))、食用油和脂肪、充气的和真空的经搅打食品、水包油乳剂、油包水乳剂、人造黄油、起酥油(shortening)和涂抹物(spread)包括低脂和极低脂涂抹物；调料(dressings)、蛋黄酱、调味液(dip)、奶油质酱(cream based sauce)、奶油质汤(cream based soup)、软饮料、调味乳和调味酱。
本发明合适的食品可以是一种“精制食品(fine foods)”，包括蛋糕、发面点心(pastry)、糖食、巧克力、法奇糖(fudge)等。
本发明的食品的一方面可以是面团制品(dough product)或烘烤产品(baked product)，例如面包，油炸制品(fried product)，小吃(snack)，蛋糕(cake)，馅饼(pie)，胡桃巧克力小方饼(brownie)，曲奇(cookie)，面条(noodle)，休闲零食品(snack items)诸如发面饼干(cracker)，全麦饼干(graham cracker)，椒盐卷饼(pretzel)，薯片(potato chips)等，面食制品(pasta)。
另一方面，本发明的食品可以是源自植物的食品制品，例如面粉、预混合物(pre-mix)、油、脂肪、可可脂、调咖啡用白油(coffee whitener)、色拉调料、人造黄油、涂抹物、花生酱、起酥油、冰激淋、烹饪用油。
另一方面，本发明所述食品可以是一种乳制品，包括黄油、奶、奶油、干酪-如天然的、经加工的和人工仿制的干酪，它可以呈现多种形式(包括碎片状(shredded)、块状(blocked)、薄片状(sliced)、或搓碎状(grated))、奶油 干酪、冰激淋、冷冻的甜点、酸奶、酸奶饮品、乳脂肪(butter fat)、脱水奶脂肪、其它乳制品。本发明所述的酶能够提高乳制品中脂肪的稳定性。
当干酪中的游离脂肪酸的生成与“肥皂”口味有关时，利用本发明制备干酪是特别有利的。因此，应用本发明的脂质酰基转移酶有利于制备出没有“肥皂”口味的干酪。
另一方面，本发明所述食品可以是一种含有动物来源的成分的食品，例如加工过的肉制品、烹饪用油、起酥油。
另一方面，本发明的食品可以是软饮料、水果、水果混合物、蔬菜或葡萄酒。在一些情况下，所述软饮料中可以含有最高达到20g/l的添加的植物甾醇。
另一方面，本发明的食品可以是一种动物饲料。该动物饲料可以富含植物甾醇类和/或phytostanols，优选β-谷甾醇/甾烷醇。适宜地，该动物饲料可以是一种家禽饲料。当所述食品是家禽饲料时，本发明就可以用于降低喂饲了本发明饲料的家禽所产的蛋中的胆固醇含量。
优选地，所述食品选自以下食品中的一种或多种：蛋类、基于蛋的产品-包括蛋黄酱、色拉调料、沙司、冰激淋、蛋粉、改良蛋黄及其制品。
优选，本发明的食品是含水食品。适宜的该食品可以含水10-98％、适宜地14-98％、适宜地18-98％、适宜地20-98％、适宜地40-98％、适宜地50-98％、适宜地70-98％、适宜地75-98％。
在一些方面，本发明优选的食品不是一种纯植物油，诸如橄榄油、葵花籽油、花生油、油菜籽油。为了避免产生疑问，在本发明一些方面中本发明食品可以含油，但是优选地，食品不主要地由油或油的混合物构成。对于本发明一些方面，优选该食品包含低于95％，优选低于90％、优选低于85％、优选低于80％的脂质。因此，对于本发明一些方面，油可以是食品的组成成分，但优选所述食品本身不是油。
本发明的权利要求应包括上面列出的每一类食品。
当根据本发明产生碳水化合物酯时，优选所述碳水化合物酯是寡糖酯、单糖酯或二糖酯。
适宜地，当根据本发明产生碳水化合物酯时，碳水化合物酯可以是以下的一种或多种：葡萄糖酯、果糖酯、脱水果糖酯、麦芽糖酯、乳糖酯、半乳糖酯、木糖酯、木寡糖酯(xylooligosaccharide ester)、阿拉伯糖酯 (arabinose ester)、麦寡糖酯(maltooligosaccharide ester)、塔格糖酯(tagatoseester)、蔗糖酯、microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、或cortalcerone酯。
根据本发明优选产生的碳水化合物酯是以下一种或者多种：碳水化合物单酯(carbohydrate mono-ester)、糖单酯(sugar mono-ester)、寡糖单酯、三糖单酯、二糖单酯、单糖单酯、葡萄糖单酯、果糖单酯、脱水果糖单酯、麦芽糖单酯、乳糖单酯、半乳糖单酯、木糖单酯、木寡糖单酯、阿拉伯糖单酯、麦寡糖单酯、塔格糖单酯、蔗糖单酯、microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、或cortalcerone酯。
在一个具体实施方案中，microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗微生物剂起作用。可选地或者进一步地，microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗氧化剂和/或乳化剂的一个或两个来起作用。
优选地，本发明碳水化合物酯的形成(如果有的话)不依赖于UDP-葡萄糖。
优选地，本发明的食品不包含UDP-葡萄糖或仅仅包含不显著量的UDP-葡萄糖。
适宜地，本发明乳化剂可以例如是以下一种或多种：甘油二酯、甘油单酯诸如1-甘油单酯或溶血卵磷脂如溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)，如二半乳糖基甘油单酯(DGMG)。所述乳化剂优选在从脂质酰基供体去除(remove)一或多个酰基后从所述脂质酰基供体产生。本文应用的术语溶血卵磷脂包含溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine)、溶血磷脂酰肌醇(lysophosphatidylinositol)、溶血磷脂酰丝氨酸(lysophosphatidylserine)和溶血磷脂酰甘油(lysophosphatidylglycerol)。
当乳化剂的一种是碳水化合物酯，那第二种乳化剂可以是以下举例的乳化剂中的一种或多种：甘油二酯、甘油单酯诸如1-甘油单酯、溶血磷脂酰胆碱、或二半乳糖基甘油单酯(DGMG)。第二乳化剂优选在从脂质酰基供体去除一或多个酰基后从所述脂质酰基供体产生。本文应用的术语溶血磷脂酰胆碱与术语溶血卵磷脂同义，而且在本申请中二者可以互相替代。
优选的第二乳化剂是DGMG。适宜地，DGMG是通过从DGDG去除 酰基而原位生成的，且该去除的酰基转移至碳水化合物上形成碳水化合物酯。
当乳化剂的一种是蛋白质酯和/或甘油二酯和/或甘油单酯，那第二种乳化剂可以是例如以下乳化剂中的一种或多种：甘油二酯、甘油单酯诸如1-甘油单酯、溶血磷脂酰胆碱或二半乳糖基甘油单酯(DGMG)。第二乳化剂优选在从脂质酰基供体去除一或多个酰基后从所述脂质酰基供体产生。本文应用的术语溶血磷脂酰胆碱与溶血卵磷脂同义，而且在本申请中二者可以互相替代。
在一个具体实施方案中，本发明所述的脂质酰基转移酶可以应用于食品诸如烹饪用油、人造黄油或涂抹物的制备方法中，所述食品天然包含或已经添加了甘油、至少一种磷脂(例如卵磷脂)和/或糖脂(例如双半乳糖甘油二酯)，以及可选的植物甾醇或phytostanol。
当用作烹饪用油或人造黄油时，该食品可以有增强的抗粘锅(antiplattering)性质。进一步或者可选择的，该食品可以有一种或多种有益的技术性质，例如增强的氧化安定性(oxidative stability)，改善的乳化性能，或健康益处。
在一个具体实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶可以用于制备低脂食品，例如低脂涂抹物、低脂色拉调料、低脂蛋黄酱、低脂人造黄油等。与脂肪较高的等价物相比，通过添加乳化剂和额外的水通常降低了这些低脂食品中的脂肪含量。
已发现本发明组合物和方法中应用的脂质酰基转移酶与脂解酶相比具有独特的性质，它们明显优先地将酰基从脂质转移到水以外的受体上，即使在有大量水存在的条件下也是如此。与现有技术中的酶相比发现，本发明中应用的脂质酰基转移酶在存在6％、54％、73％、89％和大约95％的水的条件下具有高的相对转移酶活性(relative transferase activity)。被试脂解酶在这些水浓度条件下事实上不具有明显的相对转移酶活性。
酶的脂酶活性和酰基转移酶活性可以使用以下测定方法来评估。通过此方法可以获得/鉴定具有本文定义的酶特性的脂质酰基转移酶。
经缓冲的底物中的转移酶测定法(参见实施例12)
起脂质酰基转移酶作用以用于本发明组合物和方法中的酶可以用实施例12中教导的测定法常规鉴定出来。此测定方法将在下文称为“经缓冲的 底物中的转移酶测定法”。在实施例12中对本发明源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶进行分析并与本发明未涉及的一定范围的脂解酶进行比较。可以看出脂解酶中只有
Figure G2009101343050D00371
F(Novozymes，丹麦)具有转移酶活性，因此仅具有较低的水平(1.3％)。
适于本发明的组合物和方法中应用的酶可以利用在经缓冲的底物中的转移酶测定法来常规确定。应用这种测定方法(其中含水量非常高-大约95％)，本发明应用的脂质酰基转移酶是至少有2％酰基转移酶活性(相对转移酶活性)，优选至少5％相对转移酶活性，优选至少10％相对转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％相对转移酶活性的酶。本发明适宜的脂质酰基转移酶可以具有小于28％、小于30％、优选小于40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的酰基转移酶活性。
高水分蛋黄中的转移酶测定法(参见实施例11)
作为“经缓冲底物中的转移酶测定法”(参见上面所述)的替换(或附加)，本发明所用脂质酰基转移酶可以用实施例11教导的“高水分蛋黄中的转移酶测定法”来鉴定。
在一个具体的实施方案中，本发明方法和/或组合物适用的脂质酰基转移酶是这样的一种酶，当使用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含水量54％的蛋黄中进行检测时，所述酶具有最高100％的相对转移酶活性。事实上，在高水分蛋黄中进行的实验显示，在实验的开始，初始的转移酶速率经计算为100％转移酶活性，即没有观察到水解活性。相反的，作为对照的脂解酶即
Figure G2009101343050D00372
F和磷脂酶A2在含水54％的蛋黄或富含水分的蛋黄(即含水73％或89％的蛋黄)中没有显示出可检测的转移酶活性。优选地，含水量的增加并没有显著降低本发明方法或组合物中所用脂质酰基转移酶的百分比酰基转移酶活性。
在一个优选的具体实施方案中，使用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含水量54％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明所用脂质酰基转移酶具有的初始百分比转移酶活性(初始相对转移酶活性)为至少0.1％相对转移酶活性，优选至少1％相对转移酶活性，优选至少5％相对转移酶活性，优选至少10％相对转移酶活性，优选至少20％相对转移酶活性，优选至少30％相对转移酶活性，优选至少40％相对转移酶 活性，优选至少50％相对转移酶活性，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选大约100％酰基转移酶活性。
在一个优选的实施方案中，使用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含水量54％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明组合物和方法中所用的脂质酰基转移酶具有可测的转移酶活性，即0.1到100％之间的相对转移酶活性，优选至少1％的相对转移酶活性，优选至少5％的相对转移酶活性，优选至少10％的相对转移酶活性，优选至少20％的相对转移酶活性，优选至少30％的相对转移酶活性，优选至少40％的相对转移酶活性，优选至少45％、50％、60％、70％、80％或90％的相对转移酶活性。适宜地，在使用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含水量54％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明脂质酰基转移酶可以具有少于45％、47％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比酰基转移酶活性(相对转移酶活性)。
在一个优选的实施方案中，使用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含水量73％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明组合物和方法中所用的脂质酰基转移酶具有可测的转移酶活性，即0.1到100％之间的相对转移酶活性，优选至少1％的相对转移酶活性，优选至少5％的相对转移酶活性，优选至少10％的相对转移酶活性，优选至少20％的相对转移酶活性，优选至少30％的相对转移酶活性，优选至少40％的相对转移酶活性，优选至少45％、50％、58％、60％、70％、80％或90％的相对转移酶活性。适宜地，在使用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含水量73％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明脂质酰基转移酶可以具有少于45％、47％、50％、58％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比酰基转移酶活性(相对转移酶活性)。
在优选的具体实施方案中，使用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含水量89％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明组合物和方法中所用的脂质酰基转移酶具有可测的转移酶活性，即在0.1与100％之间的相对转移酶活性，优选至少1％的相对转移酶活性，优选至少5％的相对转移酶活性，优选至少10％的相对转移酶活性，优选至少20％的相对转移酶活性，优选至少30％的相对转移酶活性，优选至少40％的相对 转移酶活性，优选至少45％、50％、60％、70％、80％或90％的相对转移酶活性。适宜地，在使用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含水量73％的蛋黄中进行检测时，在供体分子(即磷脂)消耗10％后，本发明脂质酰基转移酶可以具有少于45％、47％、50％、60％、70％、80％、90％或100％百分比酰基转移酶活性(相对转移酶活性)。
在优选的具体实施方案中，根据高水分蛋黄中的转移酶测定法，本发明组合物中和方法中应用的脂质酰基转移酶具有显著的相对转移酶活性(即在两种水含量都至少0.1％)，在含水量54％和含水量73％的蛋黄中具有相当的相对转移酶活性，测定是供体分子(即磷脂)消耗10％后进行。
在优选的具体实施方案中，根据高水分蛋黄中的转移酶测定法，本发明组合物中和方法中应用的脂质酰基转移酶具有显著的相对转移酶活性(即在两种水含量都至少0.1％)，在含水量54％和含水量89％的蛋黄中具有相当的相对转移酶活性，测定是供体分子(即磷脂)消耗10％后进行。
在优选的具体实施方案中，根据高水分蛋黄中的转移酶测定法，本发明组合物中和方法中应用的脂质酰基转移酶具有显著的相对转移酶活性(即在两种水含量都至少0.1％)，在含水量73％和含水量89％的蛋黄中具有相当的相对转移酶活性，测定是供体分子(即磷脂)消耗10％后进行。
本文应用的术语“相当的相对转移酶活性”表示酶具有的相对转移酶活性(％酰基转移酶活性)在水含量较高的蛋黄中比在水含量较低的蛋黄中，至少低2％，优选地至少低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
低水分环境中的转移酶测定法
作为“高水分蛋黄中的转移酶测定法”和/或“经缓冲的底物中的转移酶测定法”的替代或附加，本发明中使用的脂质酰基转移酶可以通过“低水分环境中的转移酶测定法”来鉴定。
为了判定一种酶是否是属于根据本发明的脂质酰基转移酶，可进行“低水分环境中的转移酶测定法”，即如实施例22教导在含水6％的油性环境中。这个例子说明在水含量6％的油性环境中本发明的脂质酰基转移酶具有高的相对转移酶活性，而现有技术的脂解酶具有水解活性。
在一具体实施方案中，本发明组合物和/或方法中应用的适宜脂质酰基转移酶是用“低水分环境中的转移酶测定法”试验的酶，在30、20或120 分钟后进行测定时，其相对转移酶活性至少1％，优选至少2％，优选至少5％，优选至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少75％。适宜地，用“低水分环境中的转移酶测定法”在10、20、30或120分钟后进行测定时，本发明脂质酰基转移酶，可有少于30％、40％、50％、60％、70％或80％的活性。
如上所述，本发明中的脂酶酰基转移酶可以用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”或“低水分环境中的转移酶测定法”以胆固醇为酰基受体进行鉴定。当然，本领域技术人员会容易意识到，通过对分析性方法进行显著修改，“经缓冲的底物中的转移酶测定法”或“低水分环境中的转移酶测定法”可用于确定脂质酰基转移酶对任何脂质酰基供体或任何酰基受体组合的活性。如有必要，技术人员可简单地用可选酰基供体底物(如糖脂，甘油三酯)替换酰基供体底物(如磷脂)和/或用可选酰基受体底物(如碳水化合物，蛋白质，其它固醇，甾烷醇或甘油)替换酰基受体底物(如胆固醇)。
本文使用的术语“高水分”意味着任何底物或食品，其水含量大于2％，优选大于3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
本文使用的术语“低水分”意味着任何底物或食品，其水含量小于6％，优选小于5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。
优选地，可以在以下温度在食品中实施本发明的方法和/或用途，例如，15-60℃，优选20-60℃，优选20-50℃，优选20-45℃，优选20-40℃。在一些方面，例如在面团中，优选发生酰基转移酶反应时食物的温度在20至40℃之间。对于其它方面，例如对于乳制品诸如干酪，食物的适宜温度可以为在30至60℃之间。在其它方面，例如对于蛋黄酱，食物的适宜温度可以为在20至40℃之间。更为优选的应在25至30℃之间。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的5wt％或5wt％以下。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到4wt％。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到2wt％。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到1wt％。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到0.5wt％。
优选地，依照本发明产生的乳化剂占食品重量的0.01到0.3wt％。
依照本发明适宜的方法包括使酶失活或变性，使得食品中包含失活或变性形式的酶。适宜地，所述酶可以用烘烤或用巴氏灭菌法而得以变性。
本发明可进一步包括本文定义的脂质酰基转移酶在食品和/或饲料酶组合物中的用途，而且可包括其中含有本文定义的脂质酰基转移酶的食品和/或饲料酶组合物。这样的组合物可以包含一种或多种另外的酶，例如本发明所列举的。或者，本发明的酶组合物可与本文所述其它食品成分/食品添加剂(包括其它酶组合物)联用。通过将本发明的脂质酰基转移酶配制在食品和/或饲料组合物中，所述酶可在用于食品和/或饲料生产之前得以稳定化，以便长期保存(在适宜条件下)。另外，本发明的酶组合物提供了适宜形式的酶，其可安全地在食品和/或饲料或者用于食品和/或饲料制品的组分的制备过程“原位”应用。这些组合物可以以流体，半流体或固体/颗粒形式存在。
在一具体实施方案中，适宜的食品酶组合物可为面团改良组合物(dough improving composition)。面团改良组合物可包括其它有益成分如乳化剂和/或本发明列举的其它酶。
食品酶以稳定液态浓缩剂或固体颗粒形式出售。制成食品酶组合物使得在运输、储藏、使用过程中的酶活性损失量降到最低。在食品和饮料生产过程中酶常常处于湿、热或氧化环境中。制剂通过对抗主要灭活作用力：变性、催化部位失活和蛋白质水解，来增强稳定性。当一种酶的蛋白质三级结构在热或化学应力作用下物理性去折叠，酶就发生了变性。酶一旦开始去折叠就极易失活并发生蛋白质水解。为了最小化去折叠，配制者可以改变蛋白的环境来诱导紧密的蛋白质结构；最有效的方法是通过添加缔合水的化合物如糖、多羟基醇和易溶性盐从蛋白表面“优先除去”水。防止活性位点失活的最佳方法是确保任何必需辅助因子的水平充足，添加可逆抑制剂，并且从制剂中除去氧化性或具有反应活性种类。
除了酶稳定性之外，制剂还要求满足几个关键的次要需求，包括防止微生物污染的保藏，避免物理性沉淀或云雾状混浊(haze)形成，使致敏尘埃或气溶胶的形成降到最低，和达到最佳的美感性标准如色泽和气味。这些问题许多通过尽可能关注“上游”而得以很好地解决，包括在发酵或酶回收过程中原材料的选择。下游操作如渗滤、吸附、层析、结晶和提取可以 用来除去与色泽、气味和沉淀有关的杂质。物理沉淀的风险可通过在接近酶等电点利用亲水的溶剂诸如甘油或丙二醇进行配制而降到最低。技术人员也可有效添加水平适中的助溶盐，来避免盐析或避免“反向盐助溶(reversesalting-in)”。为防止微生物污染，可联合使用过滤、酸化，以及使游离水减到最小限度；杀生物剂可有效，但用于控制或杀灭微生物的可接受化学物质的范围越来越受到健康与安全规范的限制。
迄今为止，两种产生耐磨性最强的颗粒的方法是高剪切力制粒法和流床喷雾包衣法，例如见T.Becker：″Separation and Purification Processes forRecovery of Industrial Enzymes″(“工业酶回收的分离纯化过程”)in R.K.Singh，S.S.H.Rizvi(eds.)：Bioseparation Processes in Foods(食品的生物分离过程)，Marcel Dekker，New York，pp.427-445。这些方法使用各种粘合剂，包衣剂，颗粒形态学来产生不易碎的颗粒，这种颗粒还在储藏过程中对酶起到保护作用，但允许它们在使用过程中容易地释放到溶液中。
可以用标准化的配制技术如喷雾干燥或液体配制来制备包含本发明所述脂质酰基转移酶的食物酶组合物。
本发明所述脂质酰基转移酶可在任何适宜的表达宿主表达。例如本发明所述脂质酰基转移酶可在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达，并且可以通过超滤法和/或乙醇沉淀法和/或离心法纯化，接着可以使用淀粉(麦芽糊精)作为酶的载体进行喷雾干燥。经喷雾干燥后的酶通过添加另外的粉末形式载体而标准化为规定的PLU活性。有关技术在本领域中是很明确且常规的。
或者，本发明使用的脂质酰基转移酶，例如，本发明外源性产生的脂质酰基转移酶，一旦经纯化，可稳定于适宜的液体制剂中，如基于甘油的那些。其它制备稳定化酶制剂的方法在EP 0770037和EP 0702712中有所描述。
粉末状的酰基转移酶也可以与本文列出的其它酶联用，来制备具有产品说明书所限定的活性的酶组合物。
通常食物酶制剂的剂量是每1000千克食品10克到1000克，优选每1000千克食品50克到200克，优选每1000千克食品75克到125克。
本发明优选的酶以失活或变性的形式存在于食品中。
在一具体实施方案中，本发明的酶优选非固定化的，具体为不固定于 固体载体上。
在一可选择的具体实施方案中，所述酶可以是固定化的。
固定化的脂质酰基转移酶可以使用本领域熟知的固定化技术制备。本领域有大量的对本领域技术人员而言清楚明白的制备固定化的酶的方法(例如以下文献中所述的技术：EP 0746608；或Balcao VM，Paiva AL，Malcata FX.，Enzyme MicrobTechnol.1996 May 1；18(6)：392-416；或ReetzMT，Jaeger KE.Chem Phys Lipids.1998Jun；93(1-2)：3-14；或BornscheuerUT，Bessler C，Srinivas R，Krishna SH.TrendsBiotechnol.2002 Oct；20(10)：433-7(将每篇都包含在本文中作为参照)。
在一具体实施方案中，本发明的食品可以包含使用固定化脂质酰基转移酶制备的食品成分，但不包含食品成分或食品中的脂质酰基转移酶。例如所述食品可包含一种或多种下列物质：乳化剂、一种以上的乳化剂、一种或多种调味剂、一种或多种结构强化剂和/或一种或多种甾醇酯，如植物甾醇酯或phytostanol酯。
本发明的酶可以与一种或多种常规乳化剂共同使用，所述乳化剂包括例如甘油单酯、二醋酸基酒石酸的脂肪酸单甘油酯和二甘油酯，和卵磷脂，例如其得自大豆。
本发明的酶可以和一种或多种其它适宜的食品级酶共同使用。这样，在本发明涉及范围内，除本发明的酶外，至少还有一种其它酶添加到食品中。这些其它酶包括淀粉降解酶如内淀粉酶(endoamylase)或外淀粉酶(exoamylase)、支链淀粉酶(pullulanase)、脱支酶(debranching enzyme)、半纤维素酶(hemicellulase)-包括木聚糖酶(xylanase)，纤维素酶(cellulose)，脂酶，磷脂酶和蛋白酶。
本发明的酶可以和一种或多种其它适宜的食品级酶共同使用。这样，在本发明涉及范围内，除本发明的酶外，至少还有一种其它酶添加到食品中。这些其它酶包括淀粉降解酶如内淀粉酶或外淀粉酶、支链淀粉酶、脱支酶、半纤维素酶-包括木聚糖酶、纤维素酶、氧化还原酶-如葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶(sulfyhydryl oxidase)或碳水化合物氧化酶-如氧化麦芽糖的氧化酶例如己糖氧化酶(HOX)、脂酶、磷脂酶和己糖氧化酶和蛋白酶。
在一优选的具体实施方案中，脂质酰基转移酶与具有下列一种或多种 脂酶活性的脂酶联合使用：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)、三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶Al活性(E.C.3.1.1.32)。适宜地，脂酶在本领域是公知的，并包括下列用举例方式说明的脂酶：
Figure G2009101343050D00441
F和/或ULTRA(Novozymes A/S，丹麦)、磷脂酶A2(例如磷酯酶A2来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L，来自Genecor的LIPOMAXTM)、
Figure G2009101343050D00443
(Novozymes A/S，丹麦)，在W003/97835、EP0977869或EP 1193314中教导的脂酶。本发明脂质酰基转移酶和脂酶的联用在面团制品或烘焙食品或在精细食品例如蛋糕和糖食的生产中是特别优选的。
脂酶与本发明的酶的联合使用在可能需要游离脂肪酸的一些蓄积的情况下尤其有优势，例如在游离脂肪酸可以产生所需香气的干酪中，或在精细食品的制备中。本领域的技术人员可以联用成比例的脂解酶，例如
Figure G2009101343050D00444
F和/或
Figure G2009101343050D00445
ULTRA(Novozymes A/S，丹麦)、磷脂酶A2(例如磷酯酶A2来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L，来自Genecor的LIPOMAXTM)，
Figure G2009101343050D00446
(Novozymes A/S，丹麦)，在W003/97835，EP0 977869或EP 1193,314中教导的脂酶，以提供理想的水解与转移酶活性比例，这能够带来食品中优选的技术效果或技术效果的组合(例如那些在本文中在“技术效果”中所列的内容)。
传统的蛋糕工业使用蛋糕改良剂以改善蛋糕产量并保证在口味、结构、食用质量和外观方面具有高质量的蛋糕。这些蛋糕改良剂一般是基于在如淀粉和麦芽糊精等的载体上经喷雾干燥的乳化剂。一些蛋糕改良剂还为基于乳化剂、糖和水的凝胶形式。这些蛋糕改良剂对于蛋糕生产企业生产出高质量蛋糕至关重要。但是蛋糕改良剂含有乳化剂和其它具有E编号的“非天然”成分。由于消费者要求减少E编号的数量，蛋糕生产企业就需要不使用乳化剂而采取其它替代的方法生产出高质量蛋糕。
一种替代方法是生产蛋糕时使用一种酶，即本文限定的脂质酰基转移酶或本发明的酶组合物。
本文限定的脂质酰基转移酶和/或本发明的食品酶组合物可在生产精细食品如蛋糕时使用。在这样的例子中，下列成分可在精细食品中形成。
i)食糖酯和溶血卵磷脂(源于蛋糕配方中的碳水化合物和形成蛋糕配方组成部分的蛋中的卵磷脂)；和/或
ii)酰化的肽和溶血卵磷脂(在蛋白脂肪酸缩聚物形成过程中，将脂肪酸从卵磷脂转移到蛋白或肽，这种蛋白脂肪酸缩聚物被认为是十分有效的乳化剂(Herstellung und Anvendungmoglichkeiten vonEiweiss-Fettsaurekondensaten.Andreas Sander，Eberhard Eilers，AndreaHeilemann，Edith von Kreis.Fett/lipid 99(1997)Nr.4，115-120))。
一般认为在制备一些精细食品时，具体是高脂肪精细食品，如蛋糕，需要一些脂肪酸蓄积。因此，联合应用脂解酶和本文所述的脂质酰基转移酶对于生产高脂肪精细食品尤其有益。或者，可选择另外的游离脂肪酸或脂肪酸皂化物(E470a)，并与所述脂质酰基转移酶联合应用。
本发明的食品适宜地包含一种或多种下列添加剂：
大豆蛋白材料；类胡萝卜素、黄酮素(flavenoid)、抗氧化剂和植物化学成分(具体是anthocyanonide、类胡萝卜素、生物黄酮素(bioflavinoid)、谷胱甘肽、儿茶素、异黄酮、番茄红素(lycopene)、人参皂苷(ginsenoside)、柏松素(pycnogenol)、生物碱(alkaloid)、臀果木(pygeum)植物甾醇、萝卜硫素(sulphoraphone)、芪三酚(resveretol)、葡萄籽提取物或含有甾烷醇酯类的食品)，维生素(具体是维生素C、维生素A、维生素B3、维生素D、维生素E、硫胺(thiamine)、核黄素、烟酸、吡哆醇(pyridoxine)、氰钴胺素(cyanocobalamin)、叶酸、生物素、泛酸或维生素K)，矿物质(具体是钙、碘、镁、锌、铁、硒、锰、铬、铜、钴、钼或磷)，脂肪酸(具体是γ-亚油酸(linoleic acid)、ucospentaenoic acid或二十二碳六烯酸)，油(特别是琉璃苣油(borage oil)、高类胡萝卜素canola油(high carotenoid canola oil)或亚麻仁油(flaX seed oil))，氨基酸(具体是色氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、牛磺酸或酪氨酸)，酶((具体是菠萝蛋白酶(bromelain)，木瓜蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶或辅酶Q)、木质素、甾烷醇酯或无害细菌(具体是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusbulgaricus)、双歧乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或屎肠球菌(Streptococcus faecium))，叶酸和可溶性纤维。
技术效果：
出乎意料地，脂质酰基转移酶在食品中具有显著的酰基转移酶活性。 这种活性在食品的制备方法中具有意想不到的有益应用。
本发明基于意想不到的发现，即本发明的脂质酰基转移酶可在含水量较高的食品中通过醇解作用(alcoholosis)进行碳水化合物酯化作用，即从脂质转移酰基。现有技术提示这种酶如果完全以这种方式发挥功能，那么只能在溶剂环境中发挥作用(即在含水量低或无水的环境中)。
本发明提供了一或多种以下在蛋制品具体是蛋黄酱中的意外的技术效果：在巴氏灭菌过程中改善的热稳定性；改善的感觉器官特性，改善的粘稠度(consistency)。
本发明提供了一或多种在面团和/或烘焙产品中的下列意外的技术效果：改善的面团或烘焙产品(例如面包和/或蛋糕)的体积度(specific volume)；改善的面团稳定性；改善的外皮评分(例如更薄和/或更脆的面包外皮)；改善的面团瓤评分(例如更为均匀的面团瓤分布和/或更精细的面团瓤结构和/或更为柔软的面团瓤)；改善的外观(例如表面光滑没有泡或者洞，或者基本上没有泡或者洞)；变味减少；改善的柔软度；改善的气味；改善的口味。
本发明可提供有益的效果，所述效果源于食品中高表面活性物质的形成而基本上不形成大量的游离脂肪酸，这样可降低食品在储藏时的氧化能力，这是因为游离脂肪酸比相应的脂肪酸酯更易于被氧化。
适宜地，本发明可提供在食品中的一种或多种以下意外的技术效果：改善的外观、改善的口感、提高的稳定性，具体是提高的热稳定性、改善的口味、提高的柔软度、改善的弹性、改善的乳化作用。
适宜地，本发明提供在乳制品例如冰激淋中的一种或多种以下意外的技术效果：改善的口感(更好的奶油性口感)、改善的口味、改善的熔化特性。
适宜地，本发明提供了在蛋或蛋类产品中的一种或多种以下意外的技术效果：乳化稳定性的提高，热稳定性的提高，改善的风味，降低的恶臭，改善的增稠特性，改善的粘稠度。
与本文定义的脂质酰基转移酶在食品制备中的应用相关的具体技术效果可列举在以下表格中：
适宜地，本发明可在干酪中提供以下一种或多种意外的技术效果：干酪中走油(oiling-off)效果的下降、干酪产率的增加、口味的改进、臭味减少、“肥皂”味减少。
在食品生产中，具体是干酪的生产中，应用本发明的脂质酰基转移酶在从乳制品回收可溶蛋白的能力方面具有显著的优点。例如，在干酪生产中接近全部牛奶蛋白的20％从乳清(即在乳凝块形成以后残留的牛奶的水样部分)去除。乳清中包含可溶性乳蛋白，疏水蛋白保留在乳凝块中。通过使用本发明的脂质酰基转移酶，可将酰基从脂质(优选从糖脂或磷脂)转移到蛋白质(具体是乳清蛋白，例如乳球蛋白(lactoglobulin))形成蛋白脂肪酸缩聚物。因此，产生一种产品，它更加疏水而且能够保留在乳凝块中而非在乳清中洗脱。用这种方式，更多乳蛋白被保留在最终的产品中，即最终的乳制品如干酪。
一方面，本发明部分基于可通过使用脂质酰基转移酶改善食品诸如干酪产量。另外地或可以替代地，食品风味、质地、抗氧化稳定性(oxidativestability)和/或食品保质期都可以改善。另外地或可以替代地，食品可以具有降低的胆固醇水平或提高的植物甾醇酯/甾烷醇酯含量。
不期望局限于某种具体的理论，认为食品产量的增加是由乳清蛋白和肽的酰基转移作用导致的，并且导致干酪凝乳中乳清蛋白疏水性以及酰化的乳清蛋白的沉淀量显著提高。
在生物系统中，例如，膜结合蛋白和酶的沉积可以通过两种不同机制获得。膜结合蛋白或具有一定数量的跨膜或疏水域，或可选具有与多肽链连接的脂肪酸。脂肪酸通常具有14或16碳原子的碳链。脂肪酸与多肽链在三处不同位置共价连接，氨基酸氨基末端作为酰胺键，半胱氨酸残基作为硫酯(thioester)连接，或丝氨酸或苏氨酸作为酯连接。每一多肽分子仅一个脂肪酸对于将蛋白质掺入细胞膜中是必需的。
当脂肪酸通过共价键结合到非膜蛋白时，其物理的和功能的特性将明显改变。WO97/14713描述了将大豆蛋白和谷蛋白通过用源自米黑毛霉(Mucor miehei)的脂酶(LipozymeTM，Novozymes)处理转化成酰基衍生物，和有机溶剂中的脂肪酸。本发明的脂质酰基转移酶可用于在低水分或高水分环境中产生酰化蛋白。
我们注意到酰化的蛋白形成两亲性复合物，可以用于多种化妆品。酰化的蛋白能形成凝胶(可结合水以保持湿度)具有乳化性质，在水和脂质之间的中间相中具有非常好的活性。
因此，本发明一方面可以提供包含本文定义的脂质酰基转移酶的化妆品组合物。
此外，本发明还提供了本文定义的脂质酰基转移酶在生产化妆品组合物中的用途。
另一方面，本发明还提供了在化妆品组合物中原位产生蛋白质酯的方法，该方法包括将本文定义的脂质酰基转移酶添加到化妆品组合物(或它的组分)中的步骤。
多种食物蛋白能溶于水，因此适于通过脂酶酰基转移酶(lipase acyltransferase)进行原位修饰。在干酪生产中，β-乳球蛋白进入乳清级分而被丢失。在应用脂酶酰基转移酶或其变体进行酰化之后，初始的结果表明在粗 质凝乳酶(rennet)凝固过程中，β-乳球蛋白被沉淀于酪蛋白微团表面中。β-乳球蛋白在三个表面环上有三个潜在的酰化作用位点(丝氨酸残基)。牛乳包含足量的卵磷脂，卵磷脂是脂质酰基转移酶对β-乳球蛋白进行酰化的适宜底物。形成的溶血卵磷脂可以具有附加的乳化作用。
与应用不具有酰基转移酶活性的脂解酶例如三酰甘油脂酶和磷脂酶相比，可以看到应用本发明的脂质酰基转移酶具有明显的改进。
优点
从至少一种食品原料成分原位产生的乳化剂和甾醇/甾烷醇酯的生成表示食品原料将至少包含一种更少量的附加原料。由于在生产的方便性方面的改进，这是有益的。例如，无需进行进一步的加工过程或额外添加附加的成分，或附加的乳化剂。进一步，食品中可以包含更少量的“添加剂”。添加剂的减少或者去除是消费者想要的，而且，添加剂的添加经常要求必须在产品成分表单中注明以便让消费者清楚知道。因此，本发明是更具优势的。
本发明的益处可以是食品中原位产生的乳化剂产品没有带来食品中自由脂肪酸含量的有害的增加。
从至少一种食品原料成分中原位产生的两种乳化剂和/或一种碳水化合物脂表明食品原料至少含有一种更少量的附加原料。
另外，当脂质酰基转移酶作用于糖脂时，能够有益地原位产生乳化剂DGMG而不带来食品中游离脂肪酸含量的有害的增加。因此，减少由于游离脂肪酸的增加而产生的有害效应，包括但不限于降低奶酪中的“肥皂”味道，防止在面团中和烘烤面食中的超量使用。
在一些方面，本发明的优点在于降低了食品中游离胆固醇的水平。
另一方面，本发明的优点在于增加了食品中甾烷醇酯/甾醇酯的含量。一些甾烷醇酯和/或甾醇酯可以是有效的调味剂和/或质地改良剂。本发明不但能够原位生成乳化剂，而且能够在食品中原位生成调味剂和/或质地改良剂。已知一些甾烷醇酯/甾醇酯若添加到食品中能够降低血清胆固醇和/或低密度脂蛋白。因此，本发明可以用于生产含有高水平甾醇酯和/或甾烷醇酯的食品。
在一些方面，具体地，优点在于本发明的酶应用于基于蛋类的产品时去除了多余的游离碳水化合物。
有益地，食品乳化剂性质也得到增强，带来了外观的改善和/或可控性的增强和/或结构的改善和/或一致性的增强和/或热稳定性的加强，而对口味没有负面影响。
另外，一些实施方案中，有利地，当自身应用脂酶时，通过添加本发明的酶可有效地克服观察到的“超剂量”效应。这至少部分归功于当应用本发明所述的酶时没有产生游离脂肪酸或仅有极低量的游离脂肪酸产生。
分离
在一方面，优选地，本发明应用的多肽或蛋白质是分离形式的。术语“分离的”意思是序列至少基本上不含有至少一种其它成分，该成分于此序列天然相结合，并在自然界发现。
纯化
在一方面，优选地，本发明应用的多肽或蛋白质是纯化型的。术语“纯化的”意思是序列处于相对纯化的状态-如至少大约51％纯度、或至少大约75％纯度、至少大约80％纯度、至少大约90％纯度、至少大约95％纯度、至少大约98％纯度。
克隆编码本发明所述多肽的核苷酸序列
编码具有本文定义的具体性质的多肽或适合被修饰的多肽的核苷酸序列，可以从产生上述多肽的细胞或生物体中分离。本领域有多种不同的已知的方法分离核苷酸序列。
例如，基因组DNA(genomic DNA)和/或cDNA库可以应用由源自产生多肽的生物体的染色体DNA或信使RNA构建。如果多肽氨基酸序列是已知的，可以合成标记的寡核苷酸探针，并用于识别从生物体制备的基因组文库的多肽编码型克隆。可替代的，包含与另一个已知的多肽基因同源的氨基酸序列的标记的寡核苷酸探针可以用于识别多肽编码克隆。在后面的例子中，应用低严谨性的杂交和洗涤条件。
可替代的，多肽编码克隆能够通过将基因组DNA片段插入表达载体如质粒中进行鉴别，使用得到的基因组DNA文库(genomic DNA library)转化不含酶的细菌，然后将转化后的细菌涂布于含有一种被多肽抑制的酶琼脂平皿，从而使表达多肽的克隆被鉴定。
作为另外的选择，编码多肽的核苷酸序列可以用确定的标准方法合成制备，该标准方法例如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869描述的亚膦酰胺(phosphoroamidite)方法，或Matthes等(1984)EMBO J.3，p 801-805描述的方法。在亚膦酰胺方法中，寡核苷酸被合成(例如在自动DNA合成器中)、纯化、退火、连接并克隆到适宜的载体中。
核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源，混合的合成与cDNA来源，或混合的基因组与cDNA来源，其可通过使用标准技术连接合成DNA、基因组DNA(genomic DNA)或cDNA来源(适当的)的片段来制备。每一个连接片段对应于整个核苷酸序列中不同的位置。DNA序列也可通过聚合酶链式反应(PCR)使用特异性的引物制备，例如US 4,683,202中所描述的或在Saiki R K等(Science(1988)239，pp 487-491)中所描述的。
核苷酸序列
本发明也包括具有本文定义的具体性质的核苷酸序列编码多肽。这里使用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，它的变体、同族体、片段和它的衍生物(例如它的部分)。该核苷酸序列可以是基因组的、合成的、或重组的来源，不论是代表同义链或反义链，它可以是双链的或是单链的。
本发明术语“核苷酸序列”包含基因组DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA，和RNA。本发明优选的是DNA，更优选为编码序列的cDNA。
一个优选的实施方案中，当结合到也存在它的自然环境中的、与其相结合的序列时，编码具有本文定义具体特性的多肽的核苷酸序列本身不涵盖自然条件下存在的天然核苷酸序列。为了便于参考，我们称这种优选的实施方案为“非自然核苷酸序列”。在这种条件下，术语“自然核苷酸序列”是指在其自身天然环境中的完整核苷酸序列，并且条件是与其天然所结合的完整启动子可操作地连接，所述启动子也存在于其自身天然环境中。因此，本发明的多肽可以通过存在于自然生物体中的核苷酸序列表达，但是其中的核苷酸序列不受该生物体中与其天然结合的启动子的控制。
优选的多肽不是一种天然多肽。这种条件下，术语“天然多肽”是指一种处于其自身的天然环境中的完整多肽，且条件是它被其天然核苷酸序列表达。
一般地，编码具有本发明定义的具体性质的多肽的核苷酸序列可以通过重组DNA技术(即重组DNA)制备。然而，在本发明一个可选择的实施方案中，所述核苷酸序列的全部或部分可以应用本领域已知的化学方法 合成(参考Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and HornT et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
一旦编码酶的核苷酸序列被分离，或者推定的编码酶的核苷酸序列被鉴定，修改选定的核苷酸序列是合乎需要的，例如为了制备本发明所述的酶而使核苷酸序列突变是合乎需要的。
突变可以由合成的寡核苷酸引入。这些寡核苷酸包含位于所需的突变位点侧翼的氨基酸序列。
适宜的方法被Morinaga等在(Biotechnology(1984)2，p646-649)中公开。另一种将突变引入编码酶的核苷酸序列的方法记述在Nelson和Long的(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。
作为定点突变的替代，例如上面所述，可以随机引入突变，例如使用商业试剂盒诸如Stratagene生产的GeneMorph PCR突变试剂盒，或Clontech生产的多样化(Diversify)PCR随机突变试剂盒。EP 0583265涉及对基于PCRd诱变的优化，它能与突变DNA类似物(例如EP 0866796中描述的那些物质)的应用相结合。易错聚合酶链式反应(Error prone PCR)技术适宜于生产具有优选特征的脂质酰基转移酶变体。WO0206457涉及脂酶分子进化。
获得新序列的第三种方法是非同一的氨基酸序列的片段化，或应用任何数量的限制性内切酶，或应用诸如DNase I的酶，并重新组装编码功能蛋白的全部氨基酸序列。或者，可以引入一种或多种不可识别的氨基酸序列，并在重新组装编码功能蛋白的全部氨基酸序列的过程中引入突变。DNA改组和DNA家族改组(DNA shuffling and family shuffling)技术适宜于生产具有优选特性的脂质酰基转移酶的突变体。适宜的实现“改组”的方法被EPO 752008、EP1138763、EP1103606公开。如US 6,180,406和WO01/34835所描述的，改组也可以与DNA突变的其它形式相结合。
因此，能在体内或在体外在核苷酸序列中产生大量的定点突变或随机突变，随后用不同的方法筛选功能改善的编码多肽。应用silico和exo介导的重组方法(见WO00/58517，US 6,344,328，US 6,361,974)，例如，分子进化能够在产生的突变体保持与已知的酶或蛋白十分低的同源性的情况下完成。这些获得的突变体与已知的转移酶具有显著的结构近似性，但是具 有十分低的氨基酸序列同源性。
作为一个非限制的例子，另外地，多肽序列的突变或天然突变体能够被整合到或野生型或其它突变或天然突变体中用于生产新的突变体。这种新的突变体也被筛选出来以改善编码多肽的功能。
通过上述提到的应用和类似的分子进化方法，可在没有任何关于蛋白质结构或功能的已知知识的情况下，鉴别和选择具有优选的性质本发明所述酶的突变体，同时可产生不可预测的但有益的突变或突变体。本领域有关分子进化的应用中有很多有关酶活力优化或改变的例子。这些例子包括，但不限于以下一种或多种，优化在宿主细胞内或体外优化的表达或活性，增加酶活性，改变酶作用底物和/或产品特异性，提高或降低酶或结构的稳定性，在优选的环境条件下(例如温度、pH、酶作用底物)酶活性/特异性的改变。
应用分子进化工具可使酶发生改变以改善酶的功能，这对于本领域的技术人员是显然的。
适宜地，本发明中使用的脂质酰基转移酶可以是一种突变体，即与其亲代酶比较，可以包含至少一个氨基酸置换、缺失或添加。突变酶保持与其亲代酶至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。适宜的亲代酶可包括任何具有酯酶或脂酶活性的酶。优选地，亲代酶与Pfam00657共有序列一致。
在一个优选的实施方案中，脂质酰基转移酶突变体在GDSx、GANDY和HPT区保留或掺入至少一个或多个Pfam00657保守序列氨基酸残基。
酶，例如在水环境中无或低脂质酰基转移酶活性的脂酶可应用分子进化工具进行突变，引入或增强转移酶活性，因此产生适用于本发明的组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。
适宜地，用于本发明的脂质酰基转移酶可以是一种突变体，这种突变体与其亲代酶相比，对于极性脂质，优选磷脂和/或糖脂具有增强的酶活性。优选地，这种突变体优选对于溶解性(lyso)极性脂质表现出低或无活性。对于极性脂质，磷脂和/或糖脂的增强的活性可能是水解作用和/或转移酶活性的结果。
与其亲代酶相比，用于本发明的脂质酰基转移酶突变体可能减弱了对 甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯的活性。
适宜地，酶突变体对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯无活性。
或者，本发明应用的酶突变体可具有增强的对甘油三酯的活性，和/或也增强对下列一种或多种物质的活性，极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。
已知的脂质酰基转移酶突变体，和一种或多种突变体可适用于本发明的方法和用途和/或用于本发明的酶组合物中。仅仅作为举例，在下列参考文献中描述的脂质酰基转移酶突变体可以适用于本发明：Hilton&Buckley JBiol.Chem.1991 Jan 15：266(2)：997-1000；Robertson等J.Biol.Chem.1994Jan 21；269(3)：2146-50；Brumlik等J.Bacteriol 1996 Apr；178(7)：2060-4；Peelman等Protein Sci.1998 Mar；7(3)：587-99。
氨基酸序列
本发明还包括具有本文定义的具体特性的多肽的氨基酸序列。
这里使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
氨基酸序列可从适宜的来源制备/分离，或者可以通过合成制备或可通过应用DNA重组技术制备。
适宜地，在此处提到的氨基酸序列可通过标准技术从分离出的本文教导的多肽中获得。
以下是测定分离的多肽中确定氨基酸序列的一种适宜方法：
纯化的多肽可为冰冻干燥的，100μg冰冻干燥的原材料溶于50μl由8M尿素和0.4M碳酸氢铵组成的混合溶液中，pH 8.4。溶解的蛋白质50℃变性还原15分钟，然后以氮气覆盖，添加5μl 45mM的二硫苏糖醇。经冷却至室温后，在室温，黑暗，氮气环境中加入5μl 100mM的碘乙酰胺，使半胱氨酸残基衍生15分钟。
将135μl的水与溶于5μl水的5μg赖氨酸-C内蛋白酶加入上述反应混合物，在氮气环境中37℃消化24小时。
得到的多肽通过反相HPLC在VYDAC碳-18柱(0.46×15cm；10μm；The Separation Group，California，USA)分离，使用水中的溶剂A：0.1％TFA和乙腈中的溶剂B：0.1％TFA。在氨基末端测序之前，可对选出的多肽利用相同溶液体系通过Develosil碳-18柱再进行色谱分析。可以根据生产厂 家的技术说明书(Applied Biosystems，California，USA)利用脉冲液态快速循环，使用Applied Biosystems 476A序列分析仪进行测序。
序列同一性或序列同源性
本发明还涉及与具有本文定义的具体性质多肽的氨基酸序列或任何编码这种多肽的核苷酸序列的氨基酸序列(后面称为“同源序列”)具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列的用途。这里，术语“同源体”指的是与受试氨基酸序列和受试核苷酸序列具有一定同源性的实体。这里，术语“同源性”可与“同一性”等同。
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保持功能活性和/或增强酶活性的多肽。
在本文中，指定同源序列包含与受试序列具有至少75、85或90％一致性，优选95或98％一致性的氨基酸序列。一般地，同源序列包括与受试氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可被认为是相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明的上下文中，优选以序列的同一性表述同源性。
在本发明的上下文中，指定同源序列包括与编码本发明多肽的核苷酸序列(主体序列)具有至少75，85或90％的同一性，优选95或98％的同一性的核苷酸序列。一般地，同源序列包括与受试序列相同的编码活性位点及其它的序列。虽然同源性也可被认为是相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明的上下文中，优选以序列的同一性表述同源性。
同源性比较可用肉眼进行，或更普遍的是，借助与容易获得的序列比对软件进行比较。这种市场上可买到的电脑软件可计算出两个或更多个序列之间的％同源性。
％同源性可在相邻的序列中计算，即一条序列与另一条对齐，一条序列的每一个氨基酸直接与另一条的氨基酸比较，每次一个残基。这被称为“无间隙”排列。一般地，这种无间隙排列只对相对较少数目的残基进行。
虽然这是一种非常简单和稳定的方法，但不能考虑到例如在否则同一的序列对中，插入和缺失将导致后面的氨基酸残基不能对齐，因此当总体比对已经完成时，很可能地导致同源性百分比大幅度下降。因此，为产生最佳排列而设计的许多序列比较方法考虑到可能存在的插入和缺失，而不 会过分降低整体同源性得分。这是通过在序列中插入“缺口”，最大化局部同源性来实现的。
但是，这些更为复杂的方法将“缺口罚分”(″gap penalties″)赋予每一个在排列上出现的缺口，使得对于相同数目的同一性氨基酸，具有尽可能少的缺口数的比对(反映两条被比较序列之间更高的相关性)比缺口数多的比对可得到更高的分数。一般应用的“亲和缺口成本”(″Affine gap costs″)缺口的存在的罚分较高，而对缺口后的每个后续的残基罚分较少。这是最通常应用的缺口评分系统。高缺口罚分当然产生具有较少缺口的优化排列。大多数排列程序允许对缺口罚分进行更改。然而，使用这些软件进行序列比较时优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin最佳拟合(Bestfit)程序包时，缺省的氨基酸序列缺口罚分为每个缺口-12和每个延伸-4。
计算最大同源性百分比首先需要考虑到缺口罚分，产生最佳排列，实现这样排列的适宜的计算机程序是GCG Wisconsin最佳拟合程序包(Devereux等1984 Nuc.Acids Research 12 p387)。其它可进行序列对比的软件实例，包括但不仅限于，BLAST程序包(参见Ausubelet al 1999 ShortProtocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter 18)，FASTA(Altschul etal 1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具组。BLAST和FASTA都可以脱机和在线检索(参考Ausubel等1999，pages 7-58 to 7-60)。然而，在一些应用中优选使用GCG最佳拟合程序。一个名为BLAST 2 Sequence的新工具也可以用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana&commat；ncbi.nlm.nih.gov)
尽管最终同源性百分比能够以同一性的方式测定，排列程序普遍不是基于全有或全无(all-or-nothing)的成对比较。作为替代，成比例的相似性分数矩阵是普遍应用的，该矩阵为基于化学相似性和进化距离对每个配对比较赋值。平常应用的这样一种矩阵的一个实例就是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组件的缺省矩阵。如果能提供的话(想得到进一步的详细信息，参见用户手册)，GCG Wisconsin程序通常应用或公开的缺省值或应用定制的标记比较表。在一些应用中，优选使用GCG程序包公开的缺省值，或者在应用其它软件的情况下，使用缺省的矩阵，如BLOSUM62。
可选择地，同源性百分比可以在DNASISTM(Hitachi Software)通过利用 多重对比特征来计算，这基于一种类似于CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法。
一旦软件产生了最佳的比对，就能够计算序列同源性百分比，优选序列同一性百分比。通常软件进行部分序列的比较，产生数值型结果。
序列也可以具有氨基酸残基的删除、插入或取代，这会产生一个沉默变化并导致生成一个功能上等同的物质。只要物质保持第二结合活性，目的氨基酸取代可以基于残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性方面的性质的近似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性并具有不带电荷的极性头基团的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。
可以进行保守取代，例如下面表中所述。第二栏中同一区，优选第三栏中同一行中的氨基酸可以互相取代。
Figure 2009101343050100002000571
本发明也包含同源取代的产生，(取代和置换都为此处应用的，即用另外的残基取代现有的氨基酸残基)即相似取代，例如碱性氨基酸取代碱性氨基酸，酸性氨基酸取代酸性氨基酸，极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基到另一类或可选择地涉及非天然氨基酸例如鸟氨酸(下文中记为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文中记为B)、原亮氨酸鸟氨酸(下文中记为O)、pyriylalanine、噻吩基丙氨酸(thienylalanine)、萘基丙氨酸(naphthylalanine)和苯基甘氨酸。
取代也可以通过非天然氨基酸产生。
氨基酸序列的突变体可以包含适宜的可插入任意两个氨基酸残基序列 间的间隔基团包括烷基基团诸如甲基、乙基、丙基，以及氨基酸间隔物，例如甘氨酸或丙氨酸残基。进一步的突变形式是本领域技术人员容易理解的，该突变形式包含类肽(peptoid)形式的一种或多种氨基酸残基。为了避免产生疑问，“类肽形式”用于指代变体氨基酸残基，其中α-碳取代基团在该残基的氮原子上而非α-碳上。制备类肽形式的肽是本领域已知的，例如Simon RJ等.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。
本发明中应用的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体性质的多肽的核苷酸序列可以包括合成的或修饰的核苷酸。寡核苷酸的许多不同种类的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和磷硫酰骨架和/或在分子的3′和/或5′端附加的吖啶或聚赖氨酸链。为了本发明所述的目的，本领域任何可得的方法均可以用于修饰本文描述的氨基酸序列，这是可以理解的。这些修饰可以用于提高核苷酸序列在体内的活性或延长氨基酸序列的寿命。
本发明也涉及氨基酸序列作为本文讨论的序列，或任何衍生物、片段及其衍生物的互补序列的用途。如果序列为它的片段的互补序列，那么该序列可以用作探针鉴定其它生物体中相似编码序列的存在等。
与本发明非100％同源但落入发明保护范围的多核苷酸序列，是可以通过多种途径获得的。此处描述的序列的其它突变体也可以获得，例如通过检测来自不同范围个体例如来自不同种群的个体的DNA文库。而且，其它病毒的/细菌的，或细胞的同源体特别是哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛或灵长类动物细胞)的细胞同源物可以获得，此同源体和它的片段一般而言能够选择性地与本文序列表所列的序列杂交。此序列可以通过检测其它动物物种的cDNA文库或基因组DNA文库来获得，并在中到高严谨条件下用探针探测这样的文库，所述探针包含序列表中所示任何序列的全部或部分。相似的考虑适用于获得本发明的多肽和核苷酸序列的种属同源物和等位基因突变体。
变体和菌株/种属同源体也可以应用简并PCR获得，其使用设计用来靶向变体和同源体中编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列的引物。保守序列可以例如通过比对来自数种变体/同源体的氨基酸序列来预知。序列比对可以通过本领域公知的计算机软件进行。例如广泛应用的GCGWisconsin PileUp程序。
用于简并PCR的引物可以包含一或多个简并位置，其可用于严格条件，该严格条件低于用针对已知序列的单个序列引物来克隆序列的那些严格条件。
或者，此多核苷酸能够通过特征序列的定点诱变获得。在需要例如沉默密码子序列变化来最优化密码子对其中表达多核苷酸的具体宿主细胞的偏好时，这是有用的。其它序列的变化是为了引入限制多肽识别位点，或改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可以的探针用于制备引物例如PCR引物、用于替换扩增反应的引物，探针例如通过常规方法用放射性或非放射性标记从而由暴露(revealing)标记物来标记，或者多核苷酸可以克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段可以为至少15，优选至少20，例如至少25、30或40个核苷酸的长度，也包含在本发明所用的术语多核苷酸中。
本发明所述的多核苷酸例如DNA多核苷酸和探针可以重组地制备、合成地制备或用本领域技术人员能够获得的任意有效的方法制备。它们也可以通过标准技术克隆。
一般而言，引物是用合成方法生产的，包括以一次一种核苷酸的方式所需核酸序列的分步制备方法。使用自动技术完成上述任务的技术是本领域容易获得的技术。
较长的多核苷酸通常可以用基因重组技术制备，例如应用PCR(多聚酶链式反应)克隆技术。这包含制备位于需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的引物对(例如大约15到30个氨基酸)，使该引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在使所需区域扩增的条件下进行多聚酶链式反应，分离被扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶中纯化反应混合物)并回收被扩增的DNA。引物可以被设计为包含适宜的酶识别位点限制性内切酶，以至于被扩增的DNA能够被克隆到适宜的克隆载体。
杂交
本发明也包含本发明序列的互补序列，或能够或杂交到本发明序列中或其互补序列中的序列。
本发明应用的术语“杂交”包括“通过碱基配对将核酸链连接到互补链的过程”，也就是使用多聚酶链式反应(PCR)技术的扩增过程。
本发明也涉及能够与本文讨论的受试序列的互补序列或它的任何衍生 物、它的片段或其衍生物杂交的核苷酸序列的用途。
本发明也涉及与能够与本文讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)中的教导，并显示如下定义的“严格性”。
最大严格性有代表性的发生在Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)条件下；高严格性发生在大约Tm下5℃-10℃；中等严格性发生在大约Tm下10℃-20℃；低严格性发生在大约Tm下20℃-25℃。正如本领域技术人员理解的，最大严格性杂交能够用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严格性杂交能够用于鉴定或检测类似或相关的多聚核苷酸序列。
优选地，本发明包含在高严格性或中等严格性条件下能够与编码具有本发明定义具体性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列之互补序列。
更加优选地，本发明涉及能够在高严格条件(例如65℃和O.IxSSC{lxSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0))下与编码具有本文定义的具体性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列之互补序列。
本发明也涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括那些本文讨论的序列的互补序列)杂交的序列。
本发明也涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括那些本文讨论的序列的互补序列)杂交的序列的互补序列。
本发明也包括在中等到最大严格性条件下，能够与本文讨论的核苷酸序列杂交的多聚核苷酸序列。
在优选的方面中，本发明覆盖了能够在严格条件下(例如50℃和0.2×SSC)与本文讨论的核苷酸序列，或它的互补序列杂交的核苷酸序列。
在更加优选的方面中，本发明覆盖了能够在高严格条件下(例如65℃和0.1×SSC)与本文讨论的核苷酸序列，或它的互补序列杂交的核苷酸序列。
多肽的表达
本发明使用的或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列能够被掺入到重组的可复制载体中。该载体可以在和/或从相容的宿主细胞中复制并表达核苷酸序列为多肽的形式。表达可以用控制序列，包括启动子/增强子和其它表达调节信号来控制。可使用原核生物的启动子和在真 核细胞中具有功能的启动子。可使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。也可使用嵌合的启动子，它包含的序列元件来自两种或多种上述不同启动子。
由宿主重组细胞产生的核苷酸序列表达的多肽可以依赖于使用的序列和/或载体被分泌或被包含在细胞内。编码序列可以设计成与信号序列一起，该信号序列可以引导所述物质的编码序列穿过具体的原核生物或真核生物细胞膜。
表达载体
术语“表达载体”意思是一种能够在体内或体外表达的构建体。
优选地，表达载体是掺入到生物体基因组中的。术语“掺入”优选包括稳定地掺入到基因中。
本发明的核苷酸序列或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列可以存在于载体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接到调节序列，以至于该调节序列能够通过适宜的宿主生物体表达核苷酸序列，即该载体是表达载体。
本发明的载体可以被转化到合适的下面描述的宿主细胞来表达具有本发明所限定的具体性质的多肽。
载体的选择，例如质粒、粘端质粒、病毒或噬菌体载体，常常依赖于它被引入的宿主细胞。
载体可以包含一种或多种可选标记基因-诸如提供抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，该选择可以通过共转化完成(如WO91/17243中描述的)。
载体可被用于体外，例如产生RNA或用于转染或转化宿主细胞。
因此，在一个进一步的具体实施方案中，本发明提供了一种制备本发明的核苷酸序列或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列的方法，所述方法是通过引入核苷酸序列到可复制载体中，引入该载体到适合的宿主细胞中，并在能够引起所述载体复制的条件下使所述宿主细胞生长。
载体可以进一步包含在正讨论的宿主细胞中促进载体复制的核苷酸序列。这些序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
调节序列
在一些应用中，本发明使用的核苷酸序列或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列可以可操作地连接到能(如通过被选宿主细胞)表达所述核苷酸序列的调节序列上。例如，本发明包括这样的载体，其包含可操作连接到这样的调节序列上的本发明核苷酸序列，即该载体是表达载体。
术语“可操作连接”(″operably linked″)指并列(juxtaposition)，其中描述的组分为使它们以意图方式作用的关系。“可操作连接”到编码序列的调节序列以通过在与控制序列相容的条件下完成表达编码序列的方式来连接。
术语“调节序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。
这里使用的术语“启动子”是本领域内可常规使用的，例如RNA聚合酶结合位点。
编码具有本发明限定的具体性质的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源的调节序列来完成，例如启动子、分泌前导序列(secretionleader)和终止区。
优选地，本发明的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作连接。
指导细菌、真菌或酵母宿主内核苷酸序列转录的适宜启动子的例子是本领域公知的。
构建体
术语“构建体”与术语如“偶联物(conjugate)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，它包括编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列，其用于根据本发明直接或间接与启动子连接。间接连接的例子是在启动子和本发明核苷酸序列中间提供适宜的间隔组(spacer group)，例如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。同样，本发明的术语“融合”包括直接或间接连接。在一些方面，这些术语不包括编码通常与野生型基因启动子连接的蛋白质的核苷酸序列的天然组合并且条件是所述它们都处于它们的自然环境中。
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择遗传构建体的标记物。
对于一些应用中，优选所述构建体包含至少本发明的核苷酸序列或编 码具有本发明限定的具体性质的多肽的核苷酸，其可操作连到启动子。
宿主细胞
本发明的术语“宿主细胞”包括任何具有以下性质的细胞：其包含编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列，或者上面描述的用于重组制备具有本发明所限定具体性质的多肽的表达载体。
因此，本发明进一步的具体实施方案提供了用本发明核苷酸序列或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。可选择与上述载体相容的所述细胞，可以例如是原核生物(如细菌)、真菌、酵母或植物的细胞。优选的宿主细胞不是人的细胞。
适合的细菌宿主生物体的例子是革兰阴性菌或革兰氏阳性菌。
依赖于编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列的性质，和/或进一步加工所表达蛋白质的需求，真核生物的宿主例如酵母或其它真菌是优选的。一般而言，酵母细胞是相对真菌细胞优选的，因为酵母细胞较容易操纵。然而，一些蛋白质或者从酵母细胞中分泌很少，或者有时没有被恰当加工(例如酵母中的高糖基化)。在这些例子中，应选择不同的真菌宿主生物体。
适宜宿主细胞，如酵母、真菌和植物宿主细胞的用途，可以提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、投石(lapidation)和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，因为可能需要使本发明的重组表达产物具有最佳生物活性。
所述宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶阴性的(minus)菌株。
生物体
本发明的术语“生物体”包括任何包含本发明所述的核苷酸序列，或包含用于编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列和/或由此获得的产物的生物体。
适宜的生物体可包括原核生物、真菌，酵母或植物。
本发明的术语“转基因生物体”包括任何生物体，所述生物体包含用于编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列和/或由此获得的产品的，和/或其中的启动子能够允许在生物体中表达用于编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列。优选的核苷酸序列被掺入在生物体基因组中。
术语“转基因生物体”不包括在天然环境中的天然核苷酸编码序列，此时所述序列受同样处于天然环境中的它们的天然启动子控制。
因此，本发明转基因生物体包括含有选自如下物质之一，或其组合的生物体：用于编码具有本发明所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列，本文定义的构建体，本文限定的载体，本文限定的质粒，本文限定的细胞，或它的产物。例如，转基因生物体也包含在异源的启动子控制下用于编码具有本发明所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/宿主生物体转化
正如先前指出的，宿主生物体可以是原核生物体或真核生物体。适合的原核生物宿主的例子包括大肠杆菌和枯草杆菌。
原核生物宿主转化是本领域公知的，例如参见Sambrook等(MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press)。如果应用原核生物宿主，那么核苷酸序列在转化之前需要被适当修饰-例如去除内含子。
另一个具体实施方案中，转基因生物体可以是酵母。
丝状真菌细胞可以使用本领域公知的各种方法转化，例如涉及原生质体形成和原生质体转化，之后用公知的方式再生细胞壁的方法。曲霉(Aspergillus)作为宿主微生物的用途已经被EP 0238023公开。
另一种宿主生物体可以是植物。用于转化植物的一般技术的综述公开在Potrykus的文章中(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou的文章中(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)。进一步有关于植物转化方面的教导见于EP-A-0449375。
对于真菌、酵母和植物转化的广泛教导见下述部分。
转化的真菌
宿主生物体可以是真菌-例如丝状真菌。此类适合的宿主的例子包括属于嗜热酶属、枝顶孢霉属(Acrenomium)、曲霉属、青霉属、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)等菌属中的任意一种。
转化丝状真菌的教导可以参见US-A-5741665，它综述了转化丝状真菌和培养真菌本领域公知的标准技术。一个适用于粗糙脉孢菌(N.crassa)的范围更广的综述，例如见于Davis和de Serres的MethodsEnzymes(1971)17A：79-143中。
进一步转化丝状真菌的教导被公开在US-A-5674707中。
一方面，宿主生物体可以是曲霉属，例如黑曲霉。
本发明的转基因曲霉也可用以下方法制得，例如Turner G.1994(Vectorsfor genetic manipulation.In：Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编者)Aspergillus：50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam1994.pp.641-666)教导的方法。
丝状真菌中的基因表达已经被公开在Punt等(2002)Trends Biotechnol2002 May；20(5)：200-6，Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306中。
转化的酵母
在另一个具体实施方案中，转基因生物体可以是酵母。
有关酵母中异源基因表达的原理的综述见于，例如Methods Mol Biol(1995)，49：341-54，和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60。
从这个角度，酵母-例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisi)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(200024(1)：45-66)可以被用作异源基因表达的载体。
有关酿酒酵母异源基因表达和基因产物的分泌原理的综述见EHinchcliffe E Kenny(1993，″Yeast as a vehicle for the expression of heterologousgenes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic Press Ltd.)。
对于酵母的转化，已开发了数个试验方案。例如，本发明的转基因酵母可以通过以下Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；and Ito，H et al(1983，J Bacteriology 153，163-168)教导的方法制备。
转化的酵母细胞可以通过使用不同的选择性标记例如营养缺陷型标记显性的抗菌素抗性标记来选择。
适宜的酵母宿主生物体可以选自生物工程相关酵母种类，例如，但不限于，选自毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、Yarrowiniaspp.、酵母属(Saccharomyces spp.)包括酿酒酵母、或裂殖酵母(Schizosaccharomyce spp.)包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce pombe)。
甲基营氧(methylotrophic)酵母种的菌株巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)可 以用作宿主生物体。
在一具体实施方案中，宿主生物体可以是汉逊酵母属，例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)(如在WO01/39544中公开的)。
转化的植物/植物细胞
本发明适宜的宿主生物体可以是植物。有关一般技术的综述见于Potrykus的文章(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou的文章(Agro-Food-IndustryHi-Tech March/April 1994 17-27)，或在WO01/16308中。例如，转基因植物可产生升高水平的植物甾醇酯以及phytostanol酯。
因此，本发明也涉及生产具有提高的植物甾醇酯和phytostanol酯水平的转基因植物的方法，包含用本发明定义的脂质酰基转移酶转化植物细胞(具体是用包含本文定义的脂质酰基转移酶的表达载体或结构体)和从转化的细胞培育植物的步骤。
分泌
通常，使多肽从表型宿主分泌到培养基中是希望得到的，而酶能够很容易从所述培养基中回收。分泌前导序列可基于所需的表达宿主进行选择。杂交信号序列也在本发明中得到应用。
异源分泌前导序列的常见例子是那些源于真菌淀粉葡苷酶(AG)基因(glaA-具有18和24氨基酸，例如来自曲霉)，a-因子基因(酵母例如酵母属、克鲁维酵母属和汉逊酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的序列。
检测
本领域有多种检测和测定氨基酸序列表达的公知方案。例如包括酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和荧光活化的细胞分选法(FACS)。
本领域技术人员掌握已知多种标记和连接技术，并可以被应用在核酸和氨基酸测定方面中。
许多公司，例如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)为这些方法提供商业试剂盒和实验方案。
适宜的报道分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光素、化学发光物(chemiluminescent)、显色剂，也包括底物、辅助因子、抑制因子、磁颗粒 等等类似的物质。专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241已经教导了这些标记的用途。
重组免疫球蛋白也可以如US-A-4,816,567中所述生产。
融合蛋白
具有本发明所述具体性质的多肽可以被当作融合蛋白生产，例如有助于它的提取和纯化。融合蛋白配偶体(partner)的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合区域和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以便允许去除融合蛋白序列的蛋白质序列也是方便的。优选的融合蛋白不妨碍所述蛋白质序列的活性。
大肠杆菌中的基因融合表达系统已经公开在Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)：501-6中。
本发明的另一个具体实施方案中，具有本发明所述具体性质的多肽的氨基酸序列可以连接到异源序列以便编码融合蛋白。例如，为了筛选多肽文库寻找能够影响物质活性的因子，编码表达可识别可购得的抗体的异源表位的嵌合物质是有用的。
本发明下面的部分将仅通过实施例并参照下图与实施例进行详细描述。
图1显示来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.1)；
图2显示从生物体嗜水气单胞菌中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.2)(P 10480；GI：121051)；
图3显示从生物体杀鲑气单胞菌中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(AAG098404；GI：9964017)；
图4显示从生物体天蓝色链霉菌A3(2)中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(Genebank登录号NP631558)；
图5显示从生物体天蓝色链霉菌A3(2)中得到的氨基酸序列(SEQ IDNo.5)(Genebank登录号CAC42140)；
图6显示从生物体酿酒酵母中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.6)(Genebank登录号P41734)；
图7显示所选序列与pfam00657共有序列的比对。
图8显示SEQ ID No.3与SEQ ID No.2的配对比对，其显示93％的氨基酸序列同一性。信号序列加下划线。+表示有差别。GDSX基序包括活性位点丝氨酸16，并且活性位点天冬氨酸116和组氨酸291突出显示(见于阴影区域)。氨基酸后的数字是负信号序列(minus the signal sequence)；
图9显示编码从生物体嗜水气单胞菌获得的、本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.7)；
图10显示编码从生物体杀鲑气单胞菌获得的、本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.8)；
图11显示编码从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的、本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.9)(Genebank登录号Nec003888.1：8327480..8328367)；
图12显示编码从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的、本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.10)(Genebank登录号AL939131.1：265480..266367)；
图13显示编码从生物体酿酒酵母获得的、本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.11)(Genebank登录号Z75034)；
图14显示从生物体雷尔氏菌(Ralstonia)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.12)(Genebank登录号AL646052)。
图15显示编码从生物体雷尔氏菌获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.13)；
图16显示SEQ ID No.20。所述序列编码Scoe1，其为NCBI蛋白质登录号CAB39707.1GI：4539178保守的公知(hypothetical)蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图17显示如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列，其编码NCBI蛋白质登录号CAB39707.1 GI：4539178保守的公知蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图18显示SEQ ID No.22所示氨基酸序列。所述序列编码Scoe2，其为NCBI蛋白质登录号CAC01477.1 GI：9716139的保守公知蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图19显示如SEQ ID No.23所示核苷酸序列，该核苷酸序列编码Scoe2，其为NCBI蛋白质登录号CAC01477.1 GI：9716139的保守公知蛋白质[天蓝 色链霉菌A3(2)]；
图20显示Scoe3的氨基酸序列(SEQ ID No.24)，所述Scoe3为NCBI蛋白质登录号CAB88833.1 GI：7635996的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图21显示如SEQ ID No.25所示核苷酸序列，该核苷酸序列编码Scoe3，其为NCBI蛋白登录号为CAB88833.1 GI：7635996的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图22显示Scoe4的氨基酸序列(SEQ ID No.26)，所述Scoe4是NCBI蛋白登录号为CAB89450.1 GI：7672261的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图23显示如SEQ ID No.27所示核苷酸序列，该核苷酸序列编码Scoe4，其为NCBI蛋白质登录号CAB89450.1 GI：7672261的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图24显示Scoe5的氨基酸序列(SEQ ID No.28)，Scoe5为NCBI蛋白质登录号CAB62724.1 GI：6562793的公知脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图25显示如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列，其编码Scoe5，Scoe5为NCBI蛋白质登录号CAB62724.1 GI：6562793的公知脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图26显示Srim1的氨基酸序列(SEQ ID No.30)，Srim1为NCBI蛋白质登录号为AAK84028.1 GI：15082088的GDSL-脂酶[龟裂链霉菌(streptomycesrimosus)]；
图27显示SEQ ID No.31所示的核苷酸序列，其编码Srim1，Srim1为NCBI蛋白登录号为AAK84028.1 GI：15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图28显示从嗜水气单胞菌(ATCC#7965)获得的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.32)；
图29显示编码从嗜水气单胞菌(ATCC#7965)获得的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.33)；
图30显示从杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeronionas salmonicidasubsp.Salmonicida)(ATCC#14174)获得的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.34)；
图31显示编码从杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC#14174)获得的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.35)；
图32显示气单胞菌属基因的同源物可使用国家生物技术信息中心(theNational Center for Biotechnology Information)，NIH，MD，USA的基础局部序列比对检索工具服务(basic local alignment search tool service)和完整基因组数据库得以鉴定。用GDSX基序作数据库搜索，而且鉴定了潜在编码具有脂解活性的酶的许多序列/基因。已从链霉菌属，黄单胞菌属和雷尔氏菌属(Ralstonia)中鉴定了基因。如下面的例子，青枯雷尔氏菌(Palstoniasolanacearum)与杀鲑气单胞菌(satA)基因作比对。成对比对表现出23％的同一性。活性位点丝氨酸出现在氨基端，且可以鉴定催化性残基组氨酸和天冬氨酸。
图33显示Pfam00657.11[家族00657，数据库版本11]共有序列(此后称作Pfam共有序列)以及不同序列与Pfam共有序列的比对。箭头表示活性位点残基，加下划线的框(boxes)表示三种已由[Upton C and Buckley JT(1995)Trends Biochem Sci 20；179-179]标明的同源框。Pfam共有序列中的大写字母表示在许多家族成员中保守的残基。“-”标记表示预期在Pfam共有序列的隐藏Markov模型中发现残基而没有发现残基，因而有缺口被插入的位点。“.”标记表示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。这些序列是在图16、18、20、22、24、26、28和30中列出的氨基酸序列。
图34显示Pfam00657.11[家族00657，数据库版本11]共有序列(此后称作Pfam序列)，以及不同序列与Pfam共有序列的比对。箭头表示活性位点残基，加下划线的框表示三种已由[Upton C and Buckley JT(1995)Trends Biochem Sci 20；179-179]标明的同源框。Pfam共有序列中的大写字母表示在许多家族成员中保守的残基。“-”标记表示预期在Pfam共有序列的隐藏Markov模型中发现残基而没有发现残基，因而有缺口被插入的位点。“.”标记表示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。这些序列是在图2、16、18、20、26、28和30中列出的氨基酸序列。这些蛋白质都对脂质底物具有活性。
图35显示包含羧基末端组氨酸标记的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶基因的表达载体pet12-AsalGCAT-pSM；
图36显示用NEFA试剂盒测定法检测细胞提取物的结果，结果描述了 重组杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶对卵磷脂的活性。从左至右的孔表示的是：阳性对照，阴性对照(即空质粒提取物)和IPTG诱导后保温0、1、2和3小时收集的样本。
图37显示含表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS的生长优化，其显示在30℃培养生成了对卵磷脂有高活性的酶。用NEFA试剂盒测定法来检测细胞提取物的磷脂酶活性。从左至右的孔表示的是：阳性对照；阴性对照；20℃；30℃；
图38显示与底物卵磷脂一同保温的、表达活性脂质酰基转移酶的BL21(DE3)pLysS的细胞粗提取物，反应混合物通过薄层色谱法分析，显示降解产物的存在。泳道：1.无酶；2.+A.sal-10μl 37℃；3.+A.sal-20μl 37℃；4.+A.sal-10μl  24℃；5.+A.sal-20μl 24℃；
图39所示为杀鲑气单胞菌酰基转移酶的部分纯化，其显示了与纯化的组氨酸标记蛋白相关的磷脂酶活性。SE＝超声提取物，His＝用Qiagen的Ni-NTA离心-试剂盒(spin-kit)纯化；
图40显示包含C-末端组氨酸标记的嗜水气单胞菌甘油脂质酰基转移酶(Glycerolipid Acyl Transferase)(GCAT)基因的表达载体pet12-A.h.GCAT＝pSMa，被用于转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS；
图41显示使用Non-Esterified Fatty Acid(NEFA)试剂盒(Roche，瑞士)，测定含有重组嗜水气单胞菌GCAT酶的粗提物(5&10μl)对卵磷脂的活性，显示存在对磷脂，卵磷脂有活性的酶；
图42显示含有表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS的生长优化，显示在30℃培养生成了对卵磷脂有高活性的酶。用NEFA试剂盒测定法来检测细胞提取物的磷脂酶活性。
图43显示嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的酰基转移酶的部分纯化，其显示了与纯化的组氨酸标记蛋白相关的磷脂酶活性。SE＝超声提取物，His＝用Qiagen的Ni-NTA自旋-试剂盒纯化；
图44显示了气单胞菌属基因在枯草芽孢杆菌163中的表达，其显示产生了对卵磷脂和DGDG均具有活性的分泌的酶。pUB-AH为包含嗜水气单胞菌基因的构建体，pUB-AS为带有杀鲑气单胞菌基因的构建体，培养物滤出液与底物保温60分钟。
图45与图46显示在展开剂IV中的薄层色谱板(氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶ 4))；泳道1：40mg谷甾醇30分钟；泳道2：转移酶+40mg谷甾醇30分钟；泳道3：转移酶+80mg谷甾醇30分钟；泳道4：转移酶+40mg谷甾醇120分钟；泳道5：转移酶+80mg谷甾醇120分钟；泳道6：转移酶+40mg谷甾醇300分钟；泳道7：40mg谷甾醇300分钟；泳道8：胆固醇；泳道9：谷甾醇；
图47描述了通过脂质酰基转移酶的催化作用，磷脂酰胆碱与胆固醇之间的反应；
图48显示对从酶处理或不经酶处理的蛋黄中提取的脂质进行薄层色谱分析，6)0.31PLU/g转移酶#179，7)1.25PLU/g转移酶#178-9，8)23.25PLU/g转移酶#3108，9)对照；
图49显示用酶处理或不经酶处理的蛋黄生产的蛋黄酱检测样本：5)转移酶#179，0.31 PLU/g，6)转移酶#178-9，1.25 PLU/g，7)磷脂酶#3108，23.3PLU/g，8)对照，水；
图50显示用从嗜水气单胞菌提取的脂质酰基转移酶处理的蛋黄脂质的薄层色谱(在溶剂I中)。
图51显示用从嗜水气单胞菌提取的脂质酰基转移酶处理的蛋黄脂质的薄层色谱(在溶剂IV中)。
图52显示在一时程的转移酶处理的蛋黄脂质的薄层色谱分析。
图53显示应用脂质酰基转移酶(Tranf#178-9)时脂肪酸和甾醇酯的产生量作为时间的函数，并与应用对照的脂解酶、细毛嗜热霉(Thermomyceslanuginosus)作比较。
图54显示了在高含水量的蛋黄中的酶促反应中表示为％转移酶活性和水解活性的相对转移酶活性，#1991(磷脂酶A2)和#2427(磷脂酶A1)是对照磷脂酶，#178是脂质酰基转移酶；
图55显示含水量对在高含水量的蛋黄中的转移酶反应中测定的转移酶#178的转移酶活性的影响。
图56显示在含水量高的蛋黄中的转移酶反应中脂质酰基转移酶(#178)的转移酶活性作为反应时间的函数。
图57和图58所示的图描述了脂肪酸和胆固醇酯作为时间的函数。这些图描述了测定中通过气液色谱分析法获得的结果，该测定用缓冲液中的卵磷脂和胆固醇作为底物测定了脂质酰基转移酶活性；
图59显示溶剂I中的薄层色谱。经来自于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶#138处理的蛋黄(泳道1和2)，或用磷脂酶#2938(
Figure G2009101343050D00731
F)处理的蛋黄(泳道3)，或未经过处理的蛋黄(泳道4)。
图60显示溶剂IV中的薄层色谱。经脂质酰基转移酶#138处理的蛋黄(泳道1和2)，或用磷脂酶#2938处理的蛋黄(泳道3)，或未经过处理的蛋黄(泳道4)。
图61显示经脂质酰基转移酶#138处理的蛋黄(样本1和2)，或用磷脂酶#2938处理的蛋黄(样本3)，或未经过处理的蛋黄(样本4)。
图62显示在100℃处理2小时后的食物乳剂。0)未处理的蛋黄，1)经脂质酰基转移酶#138处理210分钟的蛋黄，3)经对照磷脂酶#2938处理210分钟的蛋黄；
图63显示了薄层色谱板，它筛选了对植物甾醇和甘油的转移酶活性。PC＝磷脂酰胆碱，LPC＝溶血磷脂酰胆碱，PE＝磷脂酰乙醇胺；monogl＝甘油单酯；
图64所示溶剂I中的薄层色谱板，样本1到6是反应24小时后，样本1到4是反应4小时后。薄层色谱分析证实在样本1、2、5和6中形成了甾醇酯。
图65所示溶剂I中的薄层色谱板，来源于杀鲑气单胞菌的固定化的酰基转移酶的转移酶活性在与0.5、1、3、6和24小时取出的样本的油性混合物中检测到。
图66与图67所示溶剂I和IV中的薄层色谱板：泳道1＝卵磷脂；泳道2＝对照，10分钟；泳道3＝0.75 PLU，10分钟；泳道4＝0.75 PLU，60分钟；泳道5＝0.75 PLU，220分钟；泳道6＝对照，20小时；泳道7＝0.75 PLU，20小时；泳道8＝胆固醇酯；
图68与图69所示在溶液IV中的薄层色谱板：泳道1＝卵磷脂；泳道2＝对照，10分钟；泳道3＝1 PLU，10分钟；泳道4＝1 PLU，60分钟；泳道5＝1 PLU，180分钟；泳道6＝1 PLU，220分钟；泳道7＝1 PLU，1200分钟；泳道8＝对照，1200分钟；泳道9＝葡萄糖酯；泳道10＝胆固醇；泳道11＝葡萄糖；
图70显示在脂质酰基转移酶催化下DGDG与葡萄糖的反应。
图71显示在例17中用于诱变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融 合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.36)，加下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽；
图72显示编码来源于嗜水气单胞菌的含木聚糖酶信号肽的酶的核苷酸序列(SEQ ID No.45)；并且
图73所示薄层色谱板清晰地显示植物甾醇酯和甘油单酯的生成。泳道1是反应1小时后，泳道2是反应4小时后，泳道3是反应24小时后，并且泳道4是植物固醇。
实施例
除了所指出的，按照实施例6中的描述实施TLC分析，并在实施例11中的描述实施GLC分析。
实施例1：来源于杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.Salmonicida)的转移酶的克隆，序列测定和异源性表达。
所用的菌株：
杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC 14174)获自ATCC，在30℃、Luria-Bertani培养基(LB)中生长过夜。对所述细胞进行离心并用Qiagen Ltd.的基因组DNA分离方法分离基因组DNA。基因组DNA缓冲液组(cat.19060)，蛋白激酶K(cat.19131)和RNAse A(cat.19101)均获自于Qiagen.Ltd(Boundarycourt Gatwick Court，West Sussex，RH10 2AX)。
宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)用于产生重组气单胞菌属酶。BL21(DE3)pLysS的感受态细胞作为用表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM转化的宿主。包含适宜质粒的转化体在37℃、含有100-μg氨苄西林每毫升的LB琼脂培养基中生长。
表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的构建：
对于来自气单胞菌属的转移酶基因的所有DNA扩增，以基因组DNA(0.2-1μl)作为模板，pfu DNA聚合酶(2.5单位)与10μl 10x pfu缓冲液，均为1μl的每一种引物(50pmol/μl)，200μM dNTP在100μl的总反应容积中一起使用。PCR反应在可程控的热循环仪中利用如下条件进行：95℃维持30秒，以95℃30秒、60℃ 1分钟、68℃ 2分钟循环30次。72℃再延伸5 分钟。
来自杀鲑气单胞菌的转移酶基因的PCR扩增通过两个分离的PCR反应进行。PCR反应1使用以下引物对实施：as1 USNEW(5′AGCATATGAAAAAATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3′[SEQ ID No.36])和asls950new(5′GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3′[SEQ ID No.37])。实施第二次PCR反应以掺入C-末端组氨酸标记，所述反应使用第一次反应的PCR产物以及以下引物进行：as1USNEW(5′AGCATATGAAAA AATGGTTTGTTTGTTTATTG GGG 3′[SEQ ID No.38])和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3′[SEQ ID No.39])。纯化第二次反应的PCR产物并利用限制性内切酶Ndel和BamHI消化。2μgpET 12a载体DNA同样经限制性内切酶Ndel和BamHI消化并用磷酸酶处理。限制性内切酶处理的pET 12a与反应2的PCR产物经纯化，用快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)(Roche，Switzerland)连接。连接混合物用来转化大肠杆菌TOP10细胞。转化体铺在含有100μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基上。
T7启动子引物(5′TAATACGACTCACTATAG3′[SEQ ID No.40])和T7终止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG3′[SEQ ID No.41])用于验证pET12a载体中所克隆的转移酶基因的序列和方向。用ABI
Figure G2009101343050D00751
BigDyeTM终止子循环测序试剂盒(Terminators Cycle sequencing kit)，以500ng质粒DNA作为模板，以及3.2pmol T7启动子和终止子引物实施DNA序列测定。
图35所示构建体用于转化感受态细菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)并且可选出氨苄西林抗性转化体用于表达分析。
重组杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的表达
用非酯化的脂肪酸(Non-Esterified Fatty Acid)(NEFA)试剂盒(Roche，Switzerland)在细胞提取物中定量对于卵磷脂的酶活性。
在图36中，包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄西林中生长，37℃振荡保温，直到OD600＝0.6到1.0。用IPTG(0.4mM)诱导所述培养物，再保温3小时。IPTG诱导0、1、2和3小时后取样品。以卵磷脂作为底物用NEFA试剂盒检测酶活性。
用于制备活性更强的酶的生长优化
包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄西林中生长，在不同生长温度(37℃、30℃、20℃)、振荡条件下保温。产生活性脂质酰基转移酶的最适条件是当如图37所示培养物在30℃生长时。
重组杀鲑气单胞菌转移酶的部分纯化
包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生长，通过超声处理(sonification)制备细胞粗提物。重组体酶用Qiagen的Ni-NTA自旋(spin)试剂盒从经超声处理的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性。来自表达活性转移酶的BL21(DE3)pLysS的细胞粗提物与底物卵磷脂一同保温，用薄层色谱法分析反应混合物，显示降解产物的存在(参见图38)。
重组杀鲑气单胞菌转移酶的部分纯化
包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生长，通过超声处理制备细胞粗提物。重组酶用Qiagen的Ni-NTA自旋试剂盒从经超声处理后的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性(参见图39).
实施例2嗜水气单胞菌转移酶在大肠杆菌中的克隆与表达
从ATCC获得的嗜水气单胞菌(ATCC#7965)，30℃、Luria-Bertani培养基(LB)中保温过夜。离心细胞并用QiagenLtd.的基因组DNA分离方法分离基因组DNA(genomic DNA)。基因组DNA缓冲液组(cat.19060)，蛋白激酶K(cat.19131)和RNAse A(cat.19101)均来自于Qiagen Ltd.(Boundarycourt Gatwick Court，West Sussex，RH10 2AX)。
宿主细菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)用于制备重组气单胞菌属酶。BL21(DE3)pLysS的感受态细胞作为用表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa转化的宿主。包含适宜质粒的转化体在含有100-μg氨苄西林每毫升的LB琼脂培养基中、于37℃生长。
表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的构建：
对于来自气单胞菌属的转移酶基因的所有DNA扩增，以基因组DNA (0.2-1μl)作为模板，pfu DNA聚合酶(2.5单位)与10μl 10x pfu缓冲液，均为1μl的每一种引物(50pmol/μl)，200μM dNTP在100μl的总反应容积中一起使用。PCR反应在可程控的热循环仪中利用如下条件进行：95℃维持30秒，以95℃30秒、60℃1分钟、68℃2分钟循环30次。72℃再延伸5分钟。
来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的转移酶基因的PCR扩增通过两个分离的PCR反应进行。
PCR反应1使用以下引物对进行：AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3′，SEQID No.42)和ahls950(5′ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3′，SEQ ID No.43)。
实施第二次PCR反应以掺入C-末端组氨酸标记，所述反应使用第一次反应的PCR产物以及以下引物进行：AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3′SEQ ID No.44，)和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3′SEQ ID No.45)。
纯化第二次反应的PCR产物并利用限制性内切酶Ndel和BamHI消化。2μg pET 12a载体DNA同样经限制性内切酶Ndel和BamHI消化并用磷酸酶处理。限制性内切酶处理的pET 12a与反应2的PCR产物经纯化，用快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)(Roche，Switzerland)连接。连接混合物用来转化大肠杆菌TOP10细胞。将转化体铺在含有100μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基上。
T7启动子引物(5′TAATACGACTCACTATAG3′)和T7终止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG3′)用于验证pET12a载体中所克隆GCAT的序列和方向。用ABI
Figure G2009101343050D00771
BigDyeTM终止子循环测序试剂盒(TerminatorsCycle sequencing kit)，以500ng质粒DNA作为模板，以及3.2pmol T7启动子和终止子引物实施DNA序列测定。
图40所示构建体用于转化感受态细菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，并且可选出氨苄西林抗性转化体用于表达分析。
嗜水气单胞菌转移酶在BL21(DE3)pLysS中的表达
包含表达载体pet12a-A.h.GCAT＝pSMa的大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄西林中生长，37℃振荡保温，直到OD600＝0.6到1.0。用IPTG(0.4mM)诱导所述培养物，再保温3小时。IPTG诱导0、1、2和3小时后取样品。以卵磷脂作为底物用NEFA试剂盒检测酶活性(图41)。
用于制备活性更强的酶的生长优化
包含表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄西林中生长，在不同生长温度(37℃、30℃、20℃)、振荡条件下保温。产生活性脂质酰基转移酶的最适条件是当如图42所示培养物在30℃生长时。
重组嗜水气单胞菌转移酶(GCAT)的部分纯化
包含表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生长，通过超声处理制备细胞粗提物。重组体酶用Qiagen的Ni-NTA自旋(spin)试剂盒从经超声处理的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性(图43)。
实施例3：气单胞菌属转移酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)163中的表达
质粒构建
两种不同的枯草芽孢杆菌表达载体(pUB 110&pBE5)用于气单胞菌属基因在枯草芽孢杆菌的异源表达。pUB 110载体包含α淀粉酶启动子而pBE载体含有作为融合的气单胞菌属基因的表达调节区的P32启动子。在pUB110中，气单胞菌属成熟GCAT基因的第一个氨基酸与枯草芽孢杆菌的木聚糖酶信号肽的最后一个氨基酸通过在限制酶切位点Nhe1在框内融合，在成熟蛋白之前产生两个额外的氨基酸。pBE5含有在Nco 1位点融合的cgtase信号序列，使重组蛋白质分泌入培养过滤物。
实施PCR反应获得与pUB 110和pBE5载体的信号序列框内融合的气单胞菌属基因。用下列的配对引物对嗜水气单胞菌基因进行PCR。
PCR反应1：usAHncol(5′ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3′，SEQ ID No.46)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.47)
PCR反应2：US-AhnheI(5′TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3′，SEQ ID No.48.)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3，SEQID No.49)
用下列配对引物对杀鲑气单胞菌基因进行PCR。
PCR反应3：US-Asncol(5′TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQ ID No.50)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.51)
PCR反应4：US-ASnhe1(5′TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQ ID No.52)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.53)
全部PCR产物克隆到PCR blunt II(TOPO载体)中并用反向或正向测序引物测序。
来自PCR反应1和3的克隆用Ncol和Bam HI切割，作为插入物与Nco1/BamH1/磷酸酶切割的pBE5载体连接。来自PCR反应2和4的克隆用Nhe1和BamH1切割，作为插入物与Nhe1/BamH1/磷酸酶切割的pUB载体连接。
枯草芽孢杆菌中气单胞菌属转移酶基因的表达与所述酶的活性表征。
来自两种气单胞菌种的酰基转移酶已成功地在大肠杆菌中表达(结果如上)。芽孢杆菌pUB 110和pBE5基因融合构建体用来转化枯草芽孢杆菌，并通过铺在卡那霉素板上选择转化株。经分离并在2xYT中生长的卡那霉素抗性转化体能在枯草芽孢杆菌中异源表达气单胞菌基因。培养过滤物除具有酰基转移酶与磷脂酶活性外，还具有二半乳糖基二酰甘油(digalactosyldiacylglycerol)(DGDG)半乳糖脂酶活性。针对二半乳糖基二酰甘油(DGDG)的活性在将上清液与底物保温60分钟后测定，来自小麦粉的DGDG(来自Sigma)以及针对卵磷脂的活性在图44中显示。芽孢杆菌在培养基中培养过夜(20-24小时)至48小时以后作为分泌性蛋白产生。在一些情况中，气单胞菌基因的表达影响芽孢杆菌和大肠杆菌中的细胞活力和生长，因此有必要仔细选择表达菌株并优化生长条件以确保表达。例如，数种芽孢杆菌宿主菌株(B.s 163，DB104和OS 21)用表达载体转化用于生长比较。 B.s163可由两种气单胞菌基因转化并具有表达活性蛋白的能力。DB104可用所有构建体转化但只有表达杀鲑气单胞菌转移酶的能力。
实施例4：大肠杆菌中产生的气单胞菌脂质酰基转移酶的发酵和纯化
大肠杆菌发酵：
微生物
本研究中使用大肠杆菌的两个菌株，一个包括嗜水气单胞菌(实施2)脂质酰基转移酶而另外的包括杀鲑气单胞菌(实施例1)脂质酰基转移酶。
包含嗜水气单胞菌基因的大肠杆菌菌株命名为DIDK0124，包含杀鲑气单胞菌基因的大肠杆菌菌株命名为DIDK0125。DIDK0124的发酵物命名为HYDRO0303并且DIDK0125的发酵物命名为SAL0302。从HYDRO025纯化的蛋白质命名为REF#138。从HYDRO0303纯化的蛋白命名为REF#135。
生长培养基与培养条件
LB-琼脂
用于维持菌株的LB-琼脂板包括：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取液，5g/LNaCl，15g/L琼脂，100mg/L氨苄西林和35mg/L氯霉素。琼脂板在30℃保温。
LB摇瓶
用于产生生物反应物培养用接种物原料的LB培养基(50mL pr摇瓶)包括：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，100mg/L氨苄西林(ampicillin)和35mg/L氯霉素(chloramphenicol)。摇瓶用LB琼脂板培养物接种，30℃、200rpm保温。
生物反应物的培养
生物反应物培养在6L内部建造的(in-built)生物反应器中进行，所述生物反应器中充满含有以下物质的4L培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取液、5g/L NaCl、8g/L KH2PO4、0.9g/L MgSO4，7H2O、40g/L葡萄糖一水合物、0.4mL/ADD
Figure G2009101343050D00801
Foamstop Sin 260(ADD APT Chemicals AG，Helmond，The Netherlands)、10mg/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、0.7mg/LCuSO4·5H2O、3mg/L ZnSO4·7H2O、3mg/L MnSO4·H2O、10mg/L EDTA、0.1mg/L NiSO4·6H2O、0.1mg/L CoCl2、0.1mg/L H3BO4、0.1mg/L KI、0.1mg/L Na2MoO4·2H2O、1g/L氨苄西林和35mg/L氯霉素。
在生物反应器中接种一定量的LB培养基确保在大约20小时培养后的生长终点(通过以下参数计算：最大比生长速率0.6h-1，LB摇瓶的OD600和生物反应器终末OD600，其为大约20)。
SAL0302接种了10mL的LB培养基，而HYDR00303接种了4mL的LB培养基。
生物反应器在下列条件下操作：温度30℃，搅拌800-1000rpm(依照实验)，通气5L/min，pH 6.9，pH控制8.75％(w/v)NH3-水和2M H2SO4。添加异丙基β-D-硫半乳糖苷(thiogalactoside)至终末浓度0.6mM，诱导完成，分别产生0.4摩尔(HYDR00303)和0.7摩尔CO2。
收获
以下操作步骤用于生物质的收获与匀浆：
1)来自发酵的发酵肉汤在5000×g离心，4℃放置10分钟，弃去上清液。所述生物质用前-20℃放置保存。融化所述生物质并在500mL 20mMNaH2PO4，pH 7.4，500mM NaCl，10mM咪唑和完全(无EDTA)蛋白酶抑制剂(Roche，Germany)中重悬。
2)悬浮的生物质在2kbar，4℃，在来自Constant Systems公司(Warwick，UK)的细胞破裂仪(cell disrupter)中匀浆。
3)细胞碎片在10.000×g离心去除，4℃放置30分钟，收集上清液。
4)使上清液在13.700×g离心而澄清化，4℃放置60分钟，收集上清。
5)所述上清液通过0.2μm Vac Cap过滤器(Pall LifeSciences，UK)过滤，收集滤出液立即层析纯化。
转移酶的层析纯化
用50ml螯合型琼脂糖ff.凝胶填充柱(2.5×10cm)，并用镍-硫酸盐装料(charged with)(根据生产商Amersham Biosciences所述方法)。以200ml 20mM NaH2PO4，pH 7.4，500mM NaCl，10mM咪唑平衡柱，将400ml粗提物以5ml/min的流速加样于柱。用20mM NaH2PO4，pH 7.4，500mM NaCl，10mM咪唑洗柱直到UV280达到基线，然后用40ml 20mM NaH2PO4，pH 7.4，500mM NaCl，500mM咪唑洗脱GCAT。
实施例5：枯草芽孢杆菌中产生的气单胞菌脂质酰基转移酶的发酵与纯化
发酵
BAC031-19，BAC0323-24
微生物
本研究中所用的微生物来源于含有插入pUB110OIS载体中、编码杀鲑气单胞菌转移酶的基因的质粒对枯草芽孢杆菌宿主菌株#163的转化。该基因的表达受α淀粉酶启动子控制，转移酶的分泌由枯草芽孢杆菌木聚糖酶信号序列介导(实施例3)。菌株命名为DIDK0138(发酵BAC0318-19)和DIDK0153(发酵BAC0323-24)。
生长培养基及培养条件
预培养基
摇瓶(总容积500mL，有隔板)中加入100mL培养基，所述培养基包括：
NaCl                          5g/L
K2HPO4                        10g/L
大豆粉                        20g/L
酵母提取物，BioSpringer106    20g/L
消泡剂，SIN260                5mL/L
高压灭菌前pH调整到7.0
高压灭菌后向每个摇瓶中添加6mL 50％(w/w)Nutriose。并且在高压灭菌后添加浓度50mg/L的卡那霉素。
接种
预培养摇瓶用直接来自25％(w/v)甘油储存液的冰冻培养物接种。摇瓶在33℃、175rpm保温大约16小时，取50mL接种发酵罐。
发酵
发酵在6L内部建造的发酵罐中进行。
成批发酵培养基(batch medium)(3L)包括：
玉米浆(50％dw)                            40g/L
酵母提取物BioSpringer 153(50％dw)         10g/L
NaCl                                      5g/L
CaCl2，2H2O                               0.25g/L
Mn(NO3)2，H2O                             0.2g/L
消泡剂SIN260                              1mL/L
卡那霉素(经滤过灭菌处理后加入高压灭菌的发酵罐)50mg/L
进料(feed)包括：
葡萄糖一水合物                         540g/kg
MgSO4，7H2O                            4.8g/kg
消泡剂SIN260                           4mL/kg
酵母提取物，BioSpringer 153(50％dw)    150g/kg
(分别高压灭菌)
根据下列方程式，发酵BAC0318和BAC0323中的进料基于蓄积的CO2开始：
进料率-流率(flow)[g/h]＝0，AcCO2＜0.15
进料率-流率[g/h]＝2.85+t·1.54，Ac CO2≥0.15和t＜12
进料率-流率[g/h]＝21.3，t＞12
t：从蓄积的CO2(Ac CO2)达到0.15摩尔的点开始的时间(小时)。
根据下列方程式，发酵BAC0319和BAC0324中的进料基于蓄积的CO2开始：
进料率-流率[g/h]＝0，AcCO2＜0.15
进料率-流率[g/h]＝2.0+t·1.08，Ac CO2≥0.15和t＜12
进料率-流率[g/h]＝15，t＞12
t：从蓄积的CO2(Ac CO2)达到0.15摩尔的点开始的时间(小时)。
加入12.5％(w/v)氨水或2M磷酸使pH值控制在7.0。
通气量为3L/min对应1vvm。
温度33℃。
发酵罐配备有相距10cm的两个8cm
Figure G2009101343050D00831
Rushton推进器(impeller)。
收获
在室温16,000×g离心10分钟，去除生物质。上清液经过滤灭菌，滤 出液用于纯化和应用试验。
实施例6：蛋黄中的应用试验
在如下实验中，在大肠杆菌中表达的、分离自杀鲑气单胞菌的转移酶仅在蛋黄中以及添加了植物固醇的蛋黄中检出。
材料：
来自杀鲑气单胞菌REF#138的转移酶
蛋黄：来自新鲜卵(母鸡鸡蛋)
植物固醇：β-谷甾醇，Sigma S 5753
TLC板：二氧化硅板Merck nr.1.05715.0001
TLC分析
TLC-板在加热箱(110℃)中放置半小时，使之活化
将100ml展开剂倒入加盖的层析小室。小室的壁覆有滤纸(Whatman 2)使该小室被展开剂蒸汽饱和。
TLC板放于支架中，并将样品加到距底部2cm的TLC板上。将TLC板放入有展开剂的TLC小室中。当展开剂距离板底部14cm时，取出TLC板，置于蒸发板(fume board)上干燥，然后置于加热箱(heat board)(110℃)中10分钟。
接着使TLC板浸入展开试剂中，在加热箱(110℃)中干燥15分钟。
展开剂：
Nr.IV：氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4)
Nr.I：P-醚∶MTBE∶乙酸(60∶40∶1)
展开缓冲液(钒酸盐-缓冲液)：
32g Na2CO3 ad 300ml H2O(1M)
加入18.2g五氧化二钒(V2O5)微热溶解。
将溶液冷却至环境温度。
小心加入460ml 2.5M H2SO4.(460ml H2O+61ml H2SO4)
加水至1000ml。
磷脂酶活性
底物：
0.6％L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti#441601)+0.4％巛-X 100(SigmaX-100)+5mM CaCl2被溶于pH 7的0.05M HEPES缓冲液。
步骤
将400μl底物加到1.5ml Eppendorf管，置于Eppendorf热混合器(thermomixer)，30℃、5分钟。
时间T＝0时，加入50μl酶溶液。对含有水而不是酶的空白进行分析。
以1000rpm在Eppendorf热混合器上于30℃混合所述样品10分钟。时间T＝10分钟时，将Eppendorf管置于另一热混合器中，在99℃、10分钟以结束反应。
样品中游离脂肪酸使用WAKO GmbH的NEFA试剂盒分析。
测定条件下，酶活性PLU-7pH 7以每分钟产生的微摩尔脂肪酸来计算。
脂质提取
1g蛋黄和7.5ml氯仿∶甲醇2∶1在Whirley中混合，以750×g离心10分钟。
分离3ml氯仿相，用于进一步脂质分析。
结果：
以上述方法分析在大肠杆菌中表达的、来自杀鲑气单胞菌的转移酶(REF#138)的磷脂酶活性，并在有或没有β-谷甾醇的蛋黄中检测。反应过程中所述样品用磁力搅拌器搅拌。实验设计如表1。
表1
Figure 2009101343050100002000851
加入7.5ml氯仿∶甲醇(2∶1)并在Whirley混合器上混合30秒终止反应。离心分离氯仿相，将2μl的氯仿相转移到预先活化的二氧化硅TLC板，TLC板用展开剂nr.I洗脱，另一TLC板在展开剂IV中洗脱。
图45和46显示TLC分析结果。
利用来自杀鲑气单胞菌的转移酶、在添加植物固醇的蛋黄中的转移酶反应说明，该酶在胆固醇酯形成过程将脂肪酸从蛋黄的卵磷脂转移到胆固醇。TLC层析图也表明加到蛋黄中的部分固醇被转移到甾醇酯。
在反应过程中与所形成胆固醇酯的量有关的甾醇酯的量可用HPLC或GLC分析。
现已知植物甾醇酯可减少肠道对胆固醇的吸收。文献中也表明肠道对胆固醇酯的吸收少于对游离胆固醇的吸收。当将转移酶和植物固醇添加到蛋黄，可得到减少胆固醇吸收的产品，同时产生可改善蛋黄乳化性质的溶血卵磷脂。在蛋黄中添加转移酶和植物固醇的更进一步的优势在于植物甾醇酯与天然获得的胆固醇一同被摄入，预期这具有使胆固醇吸收减少最大效应。
实施例7：来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶对蛋黄的修饰
依照本发明，现已表明使用转移酶有可能从蛋黄中产生溶血卵磷脂而基本上不形成脂肪酸。
蛋黄中的卵磷脂含量是制备蛋黄酱的一种重要的乳化剂，但局限在于所得蛋黄酱对热不稳定。因此几年来人们已知可使用胰腺得来的磷脂酶将蛋黄的卵磷脂修饰为一种更强的乳化剂即溶血卵磷脂。在蛋黄酱生产过程中用酶修饰的蛋黄有助于改善在巴氏灭菌时蛋黄酱的热稳定性。在蛋黄中使用胰磷脂酶的局限性在于游离脂肪酸数量也增多，这导致抗氧化能力的下降，因为游离脂肪酸比其相应酯更易于被氧化。游离脂肪酸也可能导致肥皂味道(soapy-off taste)的出现。
如实施例5所述，来自杀鲑气单胞菌的转移酶在枯草芽孢杆菌中成功表达并在实验室范围内发酵，通过液相层析纯化，用来修饰蛋黄脂质。经酶修饰的蛋黄用于热稳定蛋黄酱的生产。
来自杀鲑气单胞菌的转移酶可在蛋黄中产生溶血卵磷脂和胆固醇酯而不产生大量游离脂肪酸。这就是说不增加或基本不增加食品中的游离脂肪酸。
经酶修饰的蛋黄显示改善的乳化剂特性并可用于热稳定的生产。
酶通过催化卵磷脂和胆固醇间的脂质转移反应(图47)表现出对蛋黄修 饰的高度功能性。
该研究进一步研究了转移酶在对蛋黄的修饰中的用途以及经修饰的蛋黄在热稳定生产中的用途。
本实施例描述了转移酶的发酵，分离和在蛋黄中的应用以及经酶修饰的蛋黄在热稳定生产中的应用。本实施例分成两部分：
A.转移酶在蛋黄中的应用
B.在蛋黄酱中检测经酶修饰的蛋黄
实验
A.应用
酶与底物
来自杀鲑气单胞菌的转移酶#178-9，纯化2554-100C73，15 PLU-7/ml
来自杀鲑气单胞菌的转移酶#179，18.5PLU-7/ml
磷脂酶A1LECITASETM Mltra(Novozymes A/S，Denamrk)
蛋黄：含8％盐的液态蛋黄，SANOVAFOODS，DK
TLC分析按前述方法实施(见于前面实施例6)
磷脂酶活性：见前述实施例。
脂质提取
1g蛋黄和7.5ml氯仿∶甲醇2∶1在Whirley中混合30秒，以750×g离心10分钟。
分离4ml氯仿相用于进一步脂质分析。
氧化稳定性检测
蛋黄酱的氧化稳定性在ML OXIPRESS仪器中测量，其中所述样品通过在氧气环境中、加压条件下的加热而经受氧化应激。
经过被称作诱导期(IP)的一段时间以后，样品的氧化导致一定的氧气消耗，通过压力传感器记录为压力改变。诱导期越高表明氧化稳定性越好。
操作步骤
5克蛋黄酱放于玻璃容器中且玻璃容器用压力传感器封闭。该容器充满5巴(bar)氧气。打开阀排空容器。本操作重复两次并将样品以及5巴氧气的环境置于80℃。氧压被测定为时间的函数且诱导期(IP)以小时计算。
结果
来自杀鲑气单胞菌的经纯化的转移酶样品#179和#178-9用于处理蛋黄，如表2所示。初次检测显示，加入的GCAT转移酶的磷脂酶(PLU)活性应当以比商品磷脂酶的活性低得多。原因在于GCAT是转移酶，因此具有比普通磷脂酶低的多的水解活性。
表2
Figure 2009101343050100002000881
按比例将蛋黄和酶放于烧杯中(scaling the egg yolk and the enzyme in abeaker)进行酶促反应。样品置于加热箱中，37℃、慢速搅拌。反应1，2和4小时后，取样品做TLC分析。反应4小时后，将所述产物保存在5℃以备蛋黄酱实验使用。
从经酶处理的蛋黄提取的脂质的TLC分析如图48所示。
图48所示的TLC分析显示磷脂酶#3108在形成游离脂肪酸过程中，对于甘油三酯还有一些甘油单酯和甘油二酯具有明显的水解作用。磷脂酶#3108对胆固醇似乎无影响。两转移酶样品都明显地促成胆固醇酯的形成并伴有胆固醇含量的下降。
D在蛋黄酱中的经酶修饰的蛋黄
为研究表2中提到的对蛋黄样品修饰作用的效应，以含50％脂肪的蛋黄酱进行应用实验。也产生含有未经处理的蛋黄的蛋黄酱。
研究目的是明确对经酶修饰的蛋黄的乳化特性与热稳定性的影响。全部蛋黄酱样品含有相同的油水平并只有蛋黄被乳化(emulsified with only eggyolk)。全部蛋黄酱样品用KoruMa调拌器(Disho V60/10)制备，制备过程中加热至95℃维持5分钟。
由经酶处理的蛋黄制备的蛋黄酱样品(图49)质地细密均匀无油分离。对照样品在油与水相中分离。
由经酶处理的蛋黄制备的蛋黄酱样品中的油滴颗粒大小用MalvernMastersizer测量。测量前样品与0.1％SDS在pH 7的0.1M磷酸盐缓冲液中混合。读数是表3所示的所有颗粒的大小均值。
表3
Figure 2009101343050100002000891
颗粒大小测量结果清楚地显示了来自杀鲑气单胞菌的转移酶剂量增加的效应。使用大剂量的转移酶，颗粒大小与用Lecitase Mltra制备的蛋黄酱的颗粒近似。但是，应谨记的是Lecitase Mltra产生大量脂肪酸，促成细小颗粒的分布。
利用酶所制备的蛋黄酱的油滴大小明显小于没有利用酶所制备的蛋黄酱(即对照蛋黄酱)的油滴大小。
氧化稳定性
蛋黄酱样品7和8的氧化稳定性用ML OXIPRES分析，分析结果如表4所示。
表4
Figure 2009101343050100002000892
氧化稳定性的测定说明抗氧化稳定性有显著性差异。转移酶179-8处理的蛋黄制成的蛋黄酱比Lecitase Mltra处理的蛋黄制成的蛋黄酱具有更好的抗氧化稳定性。这是由于Lecitase Mltra产生更多的游离脂肪酸，这些游离脂肪酸更易于被氧化成相应的脂肪酸酯。
用于蛋黄酱生产的蛋黄样品用氯仿提取，蛋黄中的脂质用GLC分析，结果见表5。
表5
Figure 2009101343050100002000893
Figure 2009101343050100002000901
表5中的GLC结果证实了TLC分析的结果，Lecitase Mltra可产生非常大量的游离脂肪酸并且大部分的甘油三酯被水解。另一方面，转移酶仅产生适量的游离脂肪酸且甘油三酯不被水解。同样清楚地显示转移酶从胆固醇产生胆固醇酯。
结果说明“经酶处理的”蛋黄酱中的PC量少于对照蛋黄酱，同时经酶处理的蛋黄酱的LPC量高于对照蛋黄酱。LPC量升高可以很好地解释经酶处理的蛋黄酱与对照蛋黄酱相比，前者乳化作用增强的原因。HPLC和GLC与也表明经酶处理的蛋黄酱的游离胆固醇水平比对照蛋黄酱的游离胆固醇水平低，可能是由于在转移酶反应中，胆固醇作为受体分子导致经酶处理的蛋黄酱与对照蛋黄酱相比，前者有更多的胆固醇酯产生。另外，结果表明当用转移酶处理蛋黄时游离脂肪酸不显著性增加。结果进一步表明经脂质酰基转移酶处理的食品中的游离脂肪酸含量显著低于用对照磷脂酶处理的食品中的游离脂肪酸含量，即使食品中溶血卵磷脂形成量一样也是如此。
实施例8：杀鲑气单胞菌转移酶在蛋糕中的效应
在一蛋糕配方中检测来自杀鲑气单胞菌的GCAT酰基转移酶的效应。酶被单独检测并与其它脂解酶混合检测。酶可加到一些蛋糕成分中或在混合蛋糕前与其它蛋糕成分一同加入。
初步实验说明，与对照相比，酰基转移酶与甘油三酯水解酶结合可改善蛋糕体积与面团瓤(crumb)结构。
在如下实验中，来自杀鲑气单胞菌及变体的转移酶可被单独检测或与甘油三酯水解酶联合检测。这些酶对鸡蛋以及起酥油中的脂质成分有活性，并对蛋糕配方组成部分即糖，蛋白质，甘油和胆固醇(蛋中)有活性。
材料与方法
酶
#179，来自杀鲑气单胞菌的酰基转移酶
Grindamyl EXEL 16，脂酶来自细毛嗜热霉
蛋糕配方：
Figure 2009101343050100002000911
设备：
混合器：带铲的Hobart N50
烤箱：Simon蛋糕烤箱
操作步骤：
所有成分控制在室温。
1.使糖和起酥油乳化(cream up)3分钟-以第二速度开始，30秒内调到第三速度
2.添加剩余成分-以第一速度开始30秒内调到第二速度-搅拌总共5分钟。
3.在1 dl量杯中测定糊(batter)的体积
4.用“Babette”油涂抹物(oil spread)喷洒(spray)磅蛋糕罐(pound caketin)，并用纸覆盖
5.称2×350g放入磅蛋糕罐
6.用铲均匀展开团块
7.放入烤箱之前-在蛋糕的顶部(蛋糕的中间沿纵长方向)加一行油-使蛋糕从中间断开
8.180℃烘烤50分钟
9.烘烤完后，将罐从烤箱取出，在蛋糕从罐取出之前把罐“掉落”到桌子上
10.除去蛋糕上的纸并将正面朝上
11.在称重和测量体积之前，将蛋糕放在格子上冷却60分钟
备注：
所用的酶在混合开始时加入，或在加入其它成分之前加到蛋糕的其它成分中。
酶仅在蛋糕成分混合或反应过程中有活性，在蛋糕烘烤过程中这些酶失活。
结果
以下实验按下表所示进行
Figure 2009101343050100002000921
根据上面提供配方，在鸡蛋用于制作蛋糕之后，很快使鸡蛋，葡萄糖浆和酶在37℃反应30分钟。
初步结果说明酰基转移酶与来自细毛嗜热霉的甘油三酯水解酶与水对照物相比改善蛋糕体积、以及面团瓤结构、口感和外观。初步结果说明在蛋糕中将脂质酰基转移酶和脂酶联合使用很好。
实施例9：这些实验的目的是检测在大肠杆菌中表达的来自嗜水气单胞菌的转移酶
在蛋黄中检测嗜水气单胞菌#135(0.5NEFA-PLU/ml)的转移酶反应。实验设计如表6所示。
表6
Figure 2009101343050100002000922
将蛋黄加热至37℃，加入酶。反应时间后加入7ml氯仿∶甲醇2∶1并在Whirley中混合30秒。
样品在800×g离心10分钟，分离出较低的溶剂相。取2μl样品加至TLC二氧化硅板上并用洗脱液IV洗脱。TLC分析结果如图50、51所示。
本实施例提及的材料与方法见于以上实施例详细描述的材料与方法。
本实验的样品作为TMS衍生物也经GLC分析。GLC结果如表7所示。
表7蛋黄脂质的GLC
Figure 2009101343050100002000931
从对游离脂肪酸，胆固醇和胆固醇酯的GLC分析，可以计算出每种成分摩尔浓度并计算出转移酶活性百分比，如表7所示。
转移酶活性百分比计算
依据结果，游离脂肪酸，甾醇酯的增加量如下计算
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)
Δ％甾醇酯＝％甾醇酯/甾烷醇酯(酶)-％甾醇酯/甾烷醇酯(对照)
转移酶活性百分比是占总酶活性的百分比：
Figure G2009101343050D00931
其中：
Mv甾醇酯＝甾醇酯平均分子量
Mv脂肪酸＝脂肪酸平均分子量
表8蛋黄中嗜水气单胞菌#135的转移酶活性
Figure 2009101343050100002000934
Figure 2009101343050100002000941
TLC和GLC分析都证实最初嗜水气单胞菌#135的转移酶反应是主要反应。反应150分钟后开始出现一些水解活性。1560分钟后，转移酶反应与水解反应水平基本相当。结果还证实了只要有受体分子胆固醇可用，转移酶反应就是主要反应。当胆固醇浓度下降，水解活性就越来越主要。
实施例10：以蛋黄作为底物的转移酶活性的测定实验-下文成为“蛋黄测定法”
脂质酰基转移酶从杀鲑气单胞菌分离并在枯草芽孢杆菌中表达。本次研究的目的是制定一种分析方法，这种方法可以测量酶的转移酶活性和水解活性，通过这些分析，用包含卵磷脂和胆固醇的底物，使酶的转移酶和水解活性的限定成为可能。
由于蛋黄包含卵磷脂和胆固醇且已知转移酶与磷脂酶对这种底物可充分地起作用，所以本研究将蛋黄作为酶测定的底物。
使用蛋黄的缺点是这种底物是水、脂质和蛋白质的复杂混合物。脂质成分包括甘油酯，66.2％；磷脂，29.6％；和胆固醇，4.2％。磷脂包括73％卵磷脂，15％脑磷脂，和12％其它磷脂。对于脂肪酸，33％是饱和脂肪酸和67％不饱和脂肪酸，包括42％油酸和7％亚油酸(ref.Kirk-OthmerEncyclopedia of Chemical Technology，John Wiley & Sons，Inc.)
预期蛋黄成分有所改变。但文献(Biochimica et Biophysica Acta，1124(1992)205-222)中提到“尽管饮食与环境条件有很大改变，家养母鸡的成熟蛋黄中的脂质及脂蛋白成分非常恒定”，并进一步引证“结果，蛋黄持续提供组成基本稳定的食品，这就可保持它的化学及物理化学特性从而可信地应用于烘烤，化妆品和制药工业中”。
这篇文献表明蛋黄组分非常稳定，因此决定在蛋黄测定中用鸡蛋黄作为底物。
量化对蛋黄的酶处理所得的脂质反应产物是通过从底物中提取脂质，接着做脂质成分的GLC分析得来的。
操作步骤
材料
蛋黄：巴氏灭菌的液态蛋黄，来自Danaeg Products A/S，DK-4000Roskilde。
HEPES缓冲液Sigma目录号.H 3375
氯仿，分析级
酶
纯化的、来自杀鲑气单胞菌#178-9的脂质酰基转移酶
细毛嗜热霉脂酶GRINDAMYL EXEL 16，产品号147060(对照)
以蛋黄为底物的酶测定。
在20ml Wheaton玻璃杯称量5克液态蛋黄，加热到35℃。
添加0.25ml酶溶液，计时开始。
以规律间隔将0.5g样品移到10ml Dram玻璃杯(glass)中。
添加20μl 4M HCl，以终止酶反应并酸化脂肪酸盐。
添加3ml氯仿。将样品在Whirley中混合30秒。
将样品在3000×g离心10分钟，并取0.8ml氯仿相移至涂焦油的(tarred)Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽条件下蒸发氯仿。再次称量dram玻璃杯。
提取的脂质通过GLC和TLC分析。
TLC分析-如本文所述。
GLC分析-如本文所述。
结果
对于用蛋黄作为底物的蛋黄测定法，如表9所示进行实验。
表9
Figure 2009101343050100002000951
分别在15，30，60，120和1080分钟后取出0.5g样品，通过溶剂提取分离脂质。分别用溶剂I和IV做脂质的TLC分析。TLC板的照片如图52所示。
TLC分析清楚的表明杀鲑气单胞菌的转移酶#178-9的活性(样品3)。这可以从磷脂PC和PE的下降看出。结果也表明溶血卵磷脂LPC的量不像期望值那样高。这说明也许该酶对溶血卵磷脂有水解活性或也可能是由于溶血卵磷脂极性强，可部分的分散在水相中，导致提取不充分所至。
为确定游离脂肪酸，胆固醇及胆固醇酯的量，也对溶剂提取所分离的脂质进行GLC分析。GLC结果如表10所示。
表10来自经酶处理的蛋黄的脂质的GLC分析。结果以基于脂质成分的％表示
Figure 2009101343050100002000961
从结果来看，观察到在60分钟后样品3中的胆固醇几乎全部被酯化。可以推论在前30分钟中有多余的反应底物。因此，来自15和30分钟后所取样品的结果被用于计算所述酶的活性。
基于表10的信息和蛋黄中含有27％脂质的事实，可计算出每毫升酶产 生的微摩尔脂肪酸与胆固醇酯的数量，结果见于表11。
表11的结果通过对样品3(杀鲑气单胞菌，15分钟)中脂肪酸的结果进行如下计算得来
5g蛋黄中的脂质＝5*0.27＝1.35克
1.35克脂质含1.007％脂肪酸＝1.35*1.007/100＝0.01359克
脂肪酸的平均分子量是272
0.01359克＝0.01359*1000000/272μmol＝49.9798μmol
添加0.25ml酶
μmol脂肪酸/ml酶＝49.9798/0.25＝199.9
表11
Figure 2009101343050100002000971
从表11的结果可以计算出，与对照相比，酶引起的脂肪酸和胆固醇酯的量的变化，见表12。
表12
Figure 2009101343050100002000972
产生的脂肪酸和胆固醇酯的量作为时间的函数，如图53所示。
作为时间的函数的水解活性(FFA形成)和脂质酰基转移酶活性(胆固醇酯形成)可从曲线的斜度计算出。接着可以算出相对转移酶活性(％酰基转移酶活性)和相对水解活性，如表13所示。相对转移酶活性可通过先前描述的酰基转移酶活性百分比测定方案来测定。例如，计算#178-9的相对活性：总活性是FFA活性+转移酶活性＝9,023+7,2884＝16,311μmol/min/ml，相对 转移酶活性＝7,2884*100/16,311＝44,7，相对水解活性＝9,023*100/16,311＝55,3
表13
表13中的结果证实来自杀鲑气单胞菌的转移酶具有显著的转移酶活性，而且所述结果也证实该酶具有显著的水解活性。
来源于细毛嗜热霉的脂酶主要有水解活性，相对转移酶活性1.6不能证明具有任何转移酶活性，只能用分析中的不确定因素来解释。
结论
利用蛋黄作为底物，来测定来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶和来自细毛嗜热霉的脂酶的转移酶和水解酶活性。测定条件下，在胆固醇酯与游离脂肪酸的形成与脂质酰基转移酶的时间之间最初存在线性关系。基于这种线性关系就可计算出水解活性(FFA形成)和转移酶活性(胆固醇酯形成)。相对水解活性和转移酶活性也可计算出来。来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(本例是GCAT)在这种测定条件下，表现出几乎等同的水解和转移酶活性。来自细毛嗜热霉的脂酶表现出很低的水解活性而且转移酶活性不显著。
实施例11：高水分的蛋黄中的转移酶测定
简介
依据本发明的脂质酰基转移酶从杀鲑气单胞菌分离并在枯草芽孢杆菌中表达。初步实验显示该酶对于利用蛋黄为底物将脂肪酸从脂质转移到胆固醇有效。
如下实验中，将更详细研究用蛋黄作为底物的转移酶反应，特别关注含所述底物中的水浓度。
操作步骤
材料
蛋黄：巴氏灭菌的液态蛋黄，来自Danaeg Products A/S，DK-4000Roskilde。
HEPES缓冲液Sigma产品号H 3375
氯仿，分析级
角鲨烷，分析级
酶：
依据本发明来自杀鲑气单胞菌的#178-9脂质酰基转移酶来自尖镰孢(fusarium oxysporum)的#2427磷脂酶
Figure G2009101343050D00991
Ffrom Novozymes，DK(相当于脂解酶)
来自胰腺的#1991磷脂酶A2，LIPOMOD 22L from Biocatalysts，UK(相当于脂解酶)
以蛋黄为底物的酶测定
用20ml Wheaton玻璃杯称量5克液态蛋黄，加热到35℃。
添加水和酶溶液，开始计时。
以规律间隔将0.5g样品移到10ml Dram玻璃杯中。
添加20μl 4M HCl以终止酶反应并酸化脂肪酸盐。
添加3ml氯仿。将样品在Whirley中混合30秒。
将样品在3000×g离心10分钟并取0.8ml氯仿相移至涂焦油的Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽下蒸发氯仿。再次称量dram玻璃杯。
分离的脂质通过GLC分析。
GLC分析
Perkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph，其配备有WCOT融合的硅柱12.5m×0.25mm ID×0.1μ薄膜厚度5％苯甲基硅酮(phenyl-methyl-silicone)(CP Sil 8 CB来自Chrompack)。
载气：氦
注射器.PSSI冷裂注射(最初温度50℃加热到385℃)体积1.0μl
检测器FID：395℃
烘箱程序：                          1        2        3
烘箱温度，℃.                       90       280      350
等温(isothermal)，时间，分钟.       1        0        10
变温速率(temperature rate)，℃/min. 15       4
样品制备：30mg样品溶于9ml庚烷：吡啶，2∶1含有内部标准十七烷，0.5mg/ml。将300μl的样品溶液移到曲管形瓶(crimp vial)，添加300μlMSTFA(N-甲基N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid))，60℃反应20分钟。
计算：甘油单-二-三酯(mono-di-triglycerides)和游离脂肪酸的反应因子(reaction factor)通过标准2(单-双-甘油三酯)确定，胆固醇，胆固醇棕榈酸酯(Cholesteryl palmitate)和胆固醇硬脂酸酯的反应因子通过纯化的参比物质(称重纯化物质10mg)来确定。
结果
含有2％角鲨烷(squalane)的蛋黄作为反应的底物。加入角鲨烷作为GLC分析的内部标准，以量化蛋黄中的脂质成分。
实验设计如表14所示。
表14
Figure 2009101343050100002001002
30，60和120分钟后取样品，用上述方法分析(取样品0.5ml(exp 1-4)0.86ml(exp.5-6)和2.2ml(exp.7-8))。
GLC结果如表15所示。GLC结果用底物(蛋黄)的百分比表示。本表还显示了反应时间与反应混合物中的总水含量。
表15
Figure 2009101343050100002001003
Figure 2009101343050100002001011
基于对脂肪酸，胆固醇和胆固醇酯的分析，可计算出产生的游离脂肪酸和胆固醇酯的含量作为反应时间和含水量的函数。在这些结果的基础上，就可以以脂肪酸形成和胆固醇酯形成的总和计算出总酶活性。通过表16所示结果可计算出相对水解活性和相对转移酶活性(即％酰基转移酶活性)。
表16所示结果也可用Statgraphic Multifactor ANOVA做统计分析。图54的统计结果证实在此种测定条件下，磷酸脂酶A1，#2427和磷酸脂酶A2，#1991没有转移酶活性而转移酶#178-9显示出50％的转移酶活性。
在该测定中含水量对于转移酶#178的转移酶活性的影响也经统计学分析，如图55所示。这些结果表明该测定中的含水量在54-89％范围之间的情况下，含水量对于相对转移酶活性无明显影响。
反应时间对于转移酶#178的转移酶活性的影响利用如表16与图56所示的结果评估。图56结果表明相对转移酶活性作为反应时间的函数下降。这可以用大多数受体分子胆固醇被消耗，因此相对水解活性提高这一事实来解释。#2427转移酶反应的负值仅表明对于这种分析方法，在变异内没有转移酶活性。
表16
Figure 2009101343050100002001012
Figure 2009101343050100002001021
结论
来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的检测在底物蛋黄中、并在不同含水量条件下进行。该酶与对照脂解酶即来自尖镰孢的磷脂酶A1和来自胰腺的磷脂酶A2对比。
结果证明在胆固醇酯形成过程中只有转移酶催化卵磷脂与胆固醇之间的转移酶反应。结果表明在底物含水量在54％到89％的范围内，对于来自杀鲑气单胞菌转移酶的相对转移酶活性几乎是相同的。
实施例12：“经缓冲的底物中的转移酶测定法”用于测定酰基转移酶活性(例如用于利用卵磷脂与胆固醇的食品)
脂质酰基转移酶从杀鲑气单胞菌分离出来并在枯草芽孢杆菌中表达。该酶在形成胆固醇酯过程中，对于将脂肪酸从脂质转移到胆固醇非常有效。通过观察游离脂肪酸的形成，显示该酶具有一定的水解活性。传统的磷脂酶(EC3.1.1.4和EC3.1.1.32)在游离脂肪酸和溶血卵磷脂的形成过程中具有水解卵磷脂的能力，并且未有报道这些酶有转移酶活性。
我们这里详细描述了酶的转移酶和水解活性的测定方法，因此可鉴别 与本发明一致的脂质酰基转移酶，测定方法所用底物包括卵磷脂和胆固醇。此次研究中所用的底物基于分散在缓冲液中的磷酸卵磷酯和胆固醇。从所述底物中提取脂质，然后用GLC分析脂质成分，从而定量反应产物。
操作步骤
材料
L-α-磷脂酰胆碱95％(植物)Avanti no.441601
胆固醇：Sigma目录.C 8503
胆固醇基棕榈酸酯，Sigma C 6072
胆固醇基硬脂酸酯，Sigma C 3549
HEPES缓冲液Sigma目录号.H 3375
氯仿，分析级
酶
来源杀鲑气单胞菌的#178-9的、纯化GCAT
TLC分析如实施例6描述进行。
GLC如实施例11描述进行。
结果：转移酶测定基于作为底物的磷酸卵磷酯和胆固醇。
根据下述操作，下列转移酶的转移酶活性在以磷酸卵磷酯和胆固醇基础的底物中测定。
450mg磷酸卵磷酯(＞95％PC Avanti产品号441601)和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥。300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到一Wheaton玻璃杯中并且添加15ml 50mM HEPES缓冲液pH 7。在搅拌过程中脂质分散到缓冲液中。
底物用磁力搅拌器混和同时加热至35℃，添加0.25ml酶溶液。这是含水量大约95％的高水分环境。
在反应0，5，10，15，25，40和60分钟后取出2ml样品。立即添加25μl 4M HCl以酸化游离脂肪酸，终止酶反应。添加3.00ml氯仿。将样品在Whirley中剧烈摇晃振摇30秒。将样品离心，分离2ml氯仿相并用0.45-μm的滤纸(filter)过滤，进入10ml涂焦油的Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽条件下蒸发氯仿。并再次称量样品。提取的脂质通过GLC分析。
GLC分析结果如图17所示。结果以所提取脂质的百分比计算。形成的 脂肪酸和胆固醇酯的量作为时间的函数，如图57所示。从图57推断酶反应作为时间的函数不是线性的，因为可观察到最初的水解和转移酶活性较高。在大约10分钟之后，大约60分钟之前，反应显示出脂肪酸和胆固醇酯的形成与时间的线性关系。因此决定以这种时间间隔观察酶反应。
表17
Figure 2009101343050100002001041
根据已知的反应混合物中的脂质含量与添加的酶量可计算脂肪酸和胆固醇酯的生成量，用μmol/ml酶表示(表18与图58)
表18
Figure 2009101343050100002001042
从表18的结果和图58的曲线斜率，可以计算出作为时间函数的脂肪酸和胆固醇酯的数量，用μmol/min每ml酶表示。
水解活性与转移酶活性的计算如表19所示。用在上文描述的％酰基转移酶活性的测定方案测定相对转移酶活性。
表19
Figure 2009101343050100002001043
其它酶的转移酶活性筛选
上面提到的方法用来筛选不同脂解酶的转移酶活性和水解活性。检测的酶如表20所示。
表20
包含300mg磷脂酰胆碱/胆固醇的底物分散到50mM pH 7.0的HEPES缓冲液中，搅拌下加热至35℃，添加酶溶液，搅拌样品维持在35℃。以规律的时间间隔取出样品并用氯仿提取。分离的脂质用GLC分析，结果如表21所示。
表21
Figure 2009101343050100002001052
Figure 2009101343050100002001061
从GLC分析可以观察到，只有脂质酰基转移酶(178-9)产生大量的胆固醇酯和脂肪酸。并观察到来自尖镰孢的磷脂酶使得游离脂肪酸量稳定增加，仅最初有少量的胆固醇酯形成，但是没有观察到胆固醇酯作为时间函数而增高。
根据脂质底物的量与GLC分析，可以基于得自10到60分钟反应时间的结果计算出相对转移酶活性和相对水解活性。转移酶178-9和尖镰孢脂酶的结果如表21所示。其它被检验的酶不表现活性。
表21
Figure 2009101343050100002001062
表21所示结果证实脂质酰基转移酶(样品178-9)具有显著的转移酶活性。同样也观察到相对转移酶活性与表19所示实验十分一致。
然而观察到来自尖镰孢的磷脂酶具有很低的转移酶活性。转移酶活性非常低以至于其落在分析的不确定性范围中。正如意料中一样，尖镰孢的磷脂酶具有显著的水解活性。
结论
基于纯化的磷脂酰胆碱和胆固醇的人造底物替代蛋黄(实施例11所示)作为测定杀鲑气单胞菌转移酶活性的底物。在反应时间10到60分钟之间，游离脂肪酸与胆固醇酯形成作为时间的函数呈现几乎线性。基于反应时间10到60分钟之间的活性，可计算出水解活性与转移酶活性。
本测定方法中的底物浓度相对低于蛋黄中的底物浓度而言较低，而含水量相对较高。
根据来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(这种情况中是GCAT)在缓 冲液中人造底物磷脂酰胆碱/胆固醇中的实验的结果，推论这种酶在含水量很高的体系中也具有很好的转移酶活性。
基于蛋黄(参见实施例11)和缓冲液中的磷脂酰胆碱/胆固醇(参见实施例12)的测定方法都可用于测定酶的转移酶活性和水解活性。根据以下角度优选蛋黄：水解活性和转移酶活性与时间呈线性关系，而缓冲液中的磷脂酰胆碱/胆固醇仅在某一时间范围内呈线性关系。
实施例13：食品乳剂(Food Emulsion)
在含60％油的标准食品乳剂配方(standard Food emulsion recipe)中测定经酶修饰的液态蛋黄的影响。
标准方法与材料如前例的逐条所述。
如表22所示，蛋黄用来自杀鲑气单胞菌(#138)的脂质酰基转移酶或磷脂酶，即商品酶(commercially available enzyme)
Figure G2009101343050D01071
(Novozymes A/S，Denmark)(#2938)处理。
表22蛋黄的酶处理
Figure 2009101343050100002001072
来自酶处理过的蛋黄的蛋黄脂质的TLC分析显示在图59和60。
在本实验中，#2939的剂量增大10倍，这对蛋黄产生十分明显的活性。游离脂肪酸量明显升高，卵磷脂(PC)水解为溶血卵磷脂(LPC)。由于游离胆固醇转化为胆固醇酯，部分卵磷脂转化为溶血卵磷脂，所以转移酶#138产生了明显的转移酶反应。
酶修饰作用的另一有趣方面是产物的稠度(consistency)。经磷脂酶#2938处理的样品变得十分坚硬，而用脂质酰基转移酶#138处理的样品与对照样品具有相同的液体稠度(参见图61)。
在食品乳剂配方中检测修饰后的蛋黄，如表23所示。
表23蛋黄酱与酶修饰蛋黄
Figure 2009101343050100002001081
经修饰的蛋黄1和2经脂质酰基转移酶处理；经修饰的蛋黄3经商品磷脂酶处理。
根据下列操作程序可生产水包油乳剂的食品乳剂：蛋黄与水在烧杯中称量，油单独称量。
Turrax混合器(20000rpm)浸于水相中。油以一恒定速度泵入水相，持续2分钟。混合过程再持续1分钟。然后加入醋并混合5秒。
在100℃加热箱中时检验乳化剂稳定度。100℃、2小时后评定所述乳剂(参见图62)。
本次实验中未经处理蛋黄的乳剂稳定度十分良好。但用脂质酰基转移酶#138处理蛋黄由于水分离(water separation)的量减少而具有提高的稳定度。经磷脂酶#2938处理的蛋黄产生非常不稳定的乳剂，在100℃时油与水相几乎完全分离。
认为，在一些申请中，使用本发明的组合物和方法可提高乳剂的热稳定性，如水包油色拉调料等。这一点对于食品乳化剂尤为重要，这些食品乳化剂为延长保质期要经巴氏灭菌处理和/或储存之前接受加热处理，如在食用之前要再加热处理的经预加工的肉类(如微波炉肉类)。虽然不期望受任何具体理论束缚，在一些申请中，游离脂肪酸的蓄积被认为可损害这些乳剂的热稳定性。应认识到使用本发明方法获得的热稳定性增强的食品乳剂，在所有食品申请中不能被发现或甚至不是所需的。这对于这样的领域中的技术人员而言显而易见，在该领域中的申请中这些特点在申请中是可取的，乳剂的稳定性可用等同于例如巴氏灭菌或微波炉再加热的简单加热实验容易地检测。发明人已发现在优选的具体实施方案中，用本发明的酶获得的 食品乳剂具有提高的热稳定性。
实施例14：富含植物固醇的蛋黄中的转移酶反应
源自杀鲑气单胞菌的转移酶可催化在富含植物固醇与甘油的蛋黄中形成溶血卵磷脂、甘油单酯和植物甾醇酯。所述酶也在包括棕榈油，卵磷脂，植物固醇与甘油的低含水量体系中检测。通过TLC和GLC分析显示，在这些反应条件下有甘油单酯和植物甾醇酯生成。
引言：
在卵磷脂、脂肪、植物固醇与甘油的几乎不含水的体系(almost water freesystem)中，测定来自杀鲑气单胞菌的转移酶的转移酶活性。
材料：
蛋黄：经巴氏灭菌的液态蛋黄来自Danaeg Products A/S，DK-4000Roskilde
GCAT转移酶纯化178-9，32 PLU-7/ml(Journal 2254-100)
大豆卵磷脂，Yolkin from Aarhus United，Denmark.
棕榈油43，来自Aarhus United，Denmark.
L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti#441601)
谷甾醇，Sigma noS5753
植物固醇：Generol N122来自Cognis，Germany
甘油产品号085915
结果
对植物固醇与甘油的转移酶活性初始筛选在蛋黄中如表24所述进行。
表24
Figure 2009101343050100002001091
*相对酶溶液中水量的水＝83μl
混合各成分并加热至37℃，在用磁力搅拌器搅拌的过程中保持在这个温度。
3和23小时后取出0.1克样品，用TLC分析。
TLC分析结果如图63所示。
图63中的结果表明，胆固醇与植物固醇可通过转移酶反应酯化，并伴随溶血卵磷脂的形成(样品3和4)，原因是在样品3中几乎所有的游离固醇和胆固醇都转化为相应的酯。
结果也说明只具有甘油和蛋黄的样品产生甘油单酯。甘油单酯的量需经过GLC分析确认。当固醇与甘油(样品3)同时添加时，甘油单酯的量非常低，以至于应用TLC检测不到。这说明只要固醇和胆固醇有剩余，使用甘油的转移酶反应就是适度的。
在另一实验中，将转移酶178-9添加到大豆卵磷脂、甘油和植物固醇的混合物中，目的是研究酶在该反应混合物中的催化活性。
在这些实验中反应混合物中的组成如表25所示。
表25
Figure 2009101343050100002001101
实验通过在46℃搅拌下混合所述脂质成分来进行。添加酶，4和24小时以后取出样品。
样品通过TLC分析，如图64所示。
在反应24小时后，取出实验2、4和5的样品，也进行GLC分析，结果如表26所示。
表26
Figure 2009101343050100002001102
结果证实了转移酶178-9在含有大豆卵磷脂，甘油和植物固醇的反应混合物中，可催化植物甾醇酯和甘油单酯的形成。在需要甘油单酯的乳化 性质以及植物固醇的降低胆固醇效应的情况下，这种反应混合物可用于人造黄油的生产。
结论
来源于杀鲑气单胞菌的CGAT转移酶可催化添加了植物固醇和甘油的蛋黄中植物甾醇酯和甘油单酯的形成。同样的酶还催化在棕榈油，卵磷脂，植物固醇和甘油的混合物中形成植物甾醇酯和甘油单酯。因此在需要甘油单酯和溶血卵磷脂以改善乳化作用并需要植物固醇的降低胆固醇效应的情况下，该酶可用于人造黄油和其它含油食品的生产。
实施例15：来源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的固定化和在甾醇酯合成中的用途
来源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(本例中为GCAT)通过丙酮的沉淀作用固定在Celite上。10ml酶溶液在20mM pH 7的TEA缓冲液中与0，1克Celite 535535(来自Fluka)在室温缓慢搅拌2小时。
在持续搅拌过程中加入50ml冷丙酮。
沉淀物通过在5000g离心1分钟分离。
沉淀物用20ml冷丙酮洗涤2次。
Celite在环境温度干燥1小时
固定化转移酶在含有13％磷脂酰胆碱酶和7％植物固醇的油混合物中检测。(表27)
表27
Figure 2009101343050100002001111
卵磷脂，植物固醇和大豆油加热至46℃，溶解植物固醇。添加固定化的转移酶。
在用磁力搅拌器温和搅拌的过程中，转移酶反应在46℃持续进行。在1/2、1、3、6和24小时后取出样品，并进行TLC分析。反应24小时后终止反应，滤出(filter off)固定化的酶。
TLC分析样品结果如图65所示。
TLC分析明确显示来自杀鲑气单胞菌的固定化的转移酶在将胆固醇转化为胆固醇酯中的效应。也可观察到少量甘油单酯形成。酶也显示在含水量高(6-89％)的环境中具有高的活性，转移酶和用于本发明的其它转移酶因此也可用于具有高含水量的固定化的酶的应用中。这就允许在利用转移酶的脂质的生物转化中替代目前的固定化的脂酶。
实施例16嗜水气单胞菌转移酶可从磷脂转移到固醇形成甾醇酯和/或转移到糖分子形成糖酯。
来自嗜水气单胞菌、在大肠杆菌(Hydro 0303 HVP)中表达的脂质酰基转移酶(标号#139)在螯合型琼脂糖凝胶FF，HR 2.5/10柱上纯化并分析磷脂酶活性。在蛋黄中评价转移酶活性来确定在蛋黄中的酶活性与功能性。所述酶也可在含有葡萄糖的蛋黄中检测。
磷脂酶活性
从螯合型琼脂糖凝胶FF，HR 2.5/10柱分离的转移酶#139用NEFA-PLU(pH7)测定，活性为1，15单位NEFA-PLU/ml。
蛋黄
在初始申请试验中，转移酶#139是根据下列操作步骤在蛋黄中检测的。
1克新鲜蛋黄在10ml有螺旋盖的烧瓶中称量。加入酶制剂并在旋涡混合器中混和。样品放置于37℃并用磁性搅拌器搅拌。
加入7.5ml氯仿∶甲醇(2∶1)终止反应并在Whirley中混和30秒。氯仿相通过离心分离，将2μl氯仿相转移至预活化的硅TLC板上并用流动的缓冲液nr.I洗脱，另一TLC板在流动的缓冲液IV中洗脱。
实验设计如表28所示
表28
Figure 2009101343050100002001121
TLC分析如图66和图67所示。TLC分析清楚显示了转移酶#139的转移酶反应。胆固醇转化为胆固醇酯，卵磷脂量减少。然而结果同样也说明由于转移酶#139也作用于溶血卵磷脂，所以溶血卵磷脂仅有少量的蓄积。游离脂肪酸(FFA)的形成支持本次观察结果。
蛋黄与葡萄糖
初期已显示来自杀鲑气单胞菌的转移酶(#138)可在转移酶反应中利用葡萄糖作为受体分子。也检测了转移酶(#139)是否可利用葡萄糖作为受体分子。实验设计见于表29。
表29
Figure 2009101343050100002001131
反应产物通过TLC分析(图68和图69)。
TLC分析表明在反应时间220分钟后形成葡萄糖酯(图69泳道6)但在反应1200分钟后观察不到葡萄糖酯。因此可以推论转移酶#139具有转移酶和水解活性。游离脂肪酸作为反应时间的函数稳定升高也证明了这一点。
概述(resume)：
来自嗜水气单胞菌的转移酶在蛋黄中检测。结果证实该酶催化胆固醇酯的形成并伴有溶血卵磷脂的形成。延长的反应时间之后，当大部分胆固醇消耗掉，游离脂肪酸也形成。因此可以推论该酶主要具有转移酶活性，当只有水作为供体分子时，也可观察到水解活性。
在利用蛋黄与葡萄糖的实验中，观察到来自嗜水气单胞菌的转移酶在含水量高的食物环境中可催化葡萄糖酯的原位形成(图70)。
实施例17：来自嗜水气单胞菌(Ahyd2)的脂质酰基转移酶的变体(SEQID No.36(参见图71))
用来自Stratagene，La Jolla，CA 92037，USA的
Figure G2009101343050D01131
Multi-Site Directed Mutagenesis试剂盒引入突变，按Stratagene提供的说明进行。
变异位于酪氨酸256的变体表现出对磷脂的活性增加。
变异位于酪氨酸256和酪氨酸260的变体显示对半乳糖脂的活性增加。
变异位于酪氨酸265的变体显示对作为酰基供体的半乳糖脂的转移酶活性增加。
编号指示在下列序列中的位置：来自嗜水气单胞菌的酶，其氨基酸序列如图71 SEQ ID No.36所示(加下划线的氨基酸表示木聚糖酶信号肽)。核苷酸序列如图72中SEQ ID No 54所示。
实施例18：酰基转移酶反应在产生用于制备人造黄油的植物甾醇酯和甘油单酯中的用途
在枯草芽孢杆菌中表达的、源自杀鲑气单胞菌的酰基转移酶在包含植物卵磷脂，植物固醇和甘油的棕榈油混合物中被检测。酰基转移酶在产生植物甾醇酯和甘油单酯的过程中，表现出利用植物固醇和甘油作为受体分子的能力。反应混合物用于基于反应混合物中的甘油单酯生产高品质的食用(table)人造黄油，与此同时，人造黄油中富含有降胆固醇作用的植物甾醇酯。
此次实验的目的是研究通过溶于植物脂肪中的卵磷脂、植物固醇和甘油的酶促反应生成甘油单酯和植物甾醇酯的可能性。
初始实验表明利用来自杀鲑气单胞菌的酰基转移酶从卵磷脂、甘油和植物固醇生成甘油单酯和植物甾醇酯是可能的。
此次实验中，这种反应混合物被用于生产食用人造黄油。
材料：
来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶，#196C101，18.6PLU/g(Journal2254-104)
棕榈油43，来自Aarhus United，DK
L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti#441601)
植物固醇：Generol N122来自Cognis，Germany
甘油产品号085915
蒸馏过的甘油单酯，Dimodan HP来自Danisco.
人造黄油的制备
1、混合水相成分。(如有需要，将水相加热至约80℃进行巴氏灭菌)。调节到pH 5.5。
2、熔化脂肪相，温度调节到大约40-45℃。
3、加热乳化剂，其中一些油为以下比例
1份乳化剂比5份的油脂到一定温度(75-80℃)，所述温度比乳化剂的熔点高5-10℃。当混合物完全熔化并充分搅拌后，将其加入持续加热的油中，持续搅拌。
4、添加调味料。
5、将水相添加到脂肪相中，持续搅拌。
6、在冷凝管(正常容量，正常冷却)中冷却至出口温度8-10℃。
结果
在棕榈油混合物中检测源自杀鲑气单胞菌的酰基转移酶，如表30所示。为使植物固醇和卵磷脂溶解，在搅拌过程中将卵磷脂、植物固醇、甘油和棕榈油加热至60℃。
表30
底物冷却至48℃，按表31所示量添加酰基转移酶#196。缓慢搅拌中保持反应混合物在48℃24小时。
表31
 
在反应1、4和24小时后从反应混合物中取出样品，并在溶剂I中做TLC分析(图73)。TLC结果清楚显示有植物甾醇酯和甘油单酯形成。在图73中，第一泳道是反应1小时后，泳道2是反应4小时后，泳道3是反应24小时后，泳道4是植物固醇。
反应24小时后终止反应，弃去不溶性植物固醇的残余物，澄清溶液用于生产人造黄油。
人造黄油
根据表32所示配方，含甘油单酯和植物甾醇酯的反应混合物用于生产食用人造黄油。
表32
Figure 2009101343050100002001161
从反应混合物中产生的人造黄油品质优良，具有良好的可涂抹性(spreadability)，良好的口感且没有任何风味丧失。人造黄油与用蒸馏过的甘油单酯Dimodan HP生产的参比人造黄油在质量水平上进行对比。
观察到人造黄油jour.3734 no 2与反应混合物的唯一不同就是稍稍硬一些，原因是配方中所含的棕榈油43比参比人造黄油中的含量大。
实施例19：脂质酰基转移酶在面包制作中的用途
在制作面包时，使用脂酶的局限性之一是脂酶反应过程中有游离脂肪酸形成。众所周知，过多的游离脂肪酸形成将对面粉的烘烤效果产生负面影响，原因是谷蛋白变得太硬和僵(bucky)(即弹性下降)的面团形成，其在发酵和烘烤过程中不能膨胀。
从抗氧化稳定性角度而言，也应避免形成游离脂肪酸，原因是游离脂肪酸比相应的甘油三酯更易于发生脂质氧化。
本发明中，在面团中添加脂解酶导致游离脂肪酸形成的问题可以用添 加脂质酰基转移酶的方法克服，脂质酰基转移酶不产生游离脂肪酸，而将一个或多个脂肪酸从脂质酰基供体转移到面团中的非水受体分子上，如碳水化合物、蛋白或肽链，或者如果用于含有乳脂肪面包中，固醇可选或与其它上面列出的受体联合添加到面团中，所述固醇如植物固醇或phytostanol。优选，面团中的受体分子可能是葡萄糖、蔗糖或麦芽糖和/或其它常用在面团中的碳水化合物中的一种或多种物质。
在下列实验中，在微型烘烤实验中检测脂质酰基转移酶。反应产物的形成，充分醒发成形的(fully proved)面团中的脂质成分由水饱和的丁醇提取，并通过HPLC和GLC分析。
材料与方法
酶：酰基转移酶，550PLU-7/ml
LipopanTM F BG，Novozymes.提供的商品脂酶.12000 LIPU/g或Grindamyl Exel 16.12000 LIPU/g
卵磷脂粉，95％磷脂(Danisco A/S Denmark提供)
双半乳糖甘油二酯，来自全麦(面)粉(来自SigmaD4651)
面粉：
Figure G2009101343050D01171
nr.2001084(丹麦小麦粉，来自Havnemollerne，Odense，Denmark)
微型烘烤实验
面粉50克，干酵母10克，葡萄糖0.8克，盐0.8克，70ppm抗坏血酸和400 Brabender单位的水在50克Brabender混合碗中、30℃揉捏5分钟。
34℃静置10分钟。将面团分成各15克的面团。然后在一特殊装置中成形，其中面团卷在木盘和树脂玻璃支架之间。所述面团在罐中34℃醒发45分钟，在Voss家用烤炉中225℃烘烤8分钟。
烘烤后，使面包冷却至室温。20分钟后称量面包并用油菜籽置换法(rapeseed displacement method)测量体积。面包还被切开，并评价面团瓤(crumb)和面包皮(crust)。
结果与结论：
初步结果表明脂质酰基转移酶对于面包的体积与外观都显示出明显的积极作用。具体地，初步结果表明与对照(无酶)及与使用商品脂解酶即Grindamyl Exel 16或LipopanFTM时相比，使用脂质酰基转移酶使比面包体 积(spcific bread volume)增大。
实施例20：利用乳脂的标准冰淇淋
用于冰淇淋的乳化剂可产生受控制的脂肪结晶化和轻微的去稳定化，这是由于在冰淇淋的陈化(aging)过程中蛋白质吸附作用导致。这种改变改善了冰淇淋品质。甘油单酯或甘油二酯通常用于冰淇淋生产，也已知在冰淇淋生产过程中联合使用极性乳化剂如聚山梨酯和糖酯以及甘油单-二酯(mono-diglyceride)，有助于控制脂肪去稳定化，生产的冰淇淋具有良好的奶油质感和幼滑的口感。
冰淇淋乳化剂通常以粉剂形式添加到冰淇淋混合物。但近来已表明使用脂酶对冰淇淋配方中的脂肪进行酶促反应，可产生甘油单-二酯。但是使用脂酶带来的问题是当反应混合物中存在有水时，脂酶也催化游离脂肪酸的形成。
但是，令人吃惊的是脂质酰基转移酶克服了脂酶的缺陷，因为脂质酰基转移酶可以将脂肪酸从卵磷脂和其它脂质上转移至受体分子如固醇，胆固醇，葡萄糖，甘油和蛋白/肽链，而不形成大量的游离脂肪酸。
冰淇淋中的主要成分之一是含有38％乳脂的乳制奶油(diary cream)。乳制奶油也包含少量的卵磷脂，卵磷脂是脂质酰基转移酶的供体分子。(“contains smaller amount of lecithin，which is a donor molecule foracyl-transferase.(“Complex milk lipids account for about 1 ％ of the total milkfat and are mainly composed of phospholipids”Ref.Mllmann′s Encyclopedia ofIndustrial ChemistryCopyright
Figure G2009101343050D01181
2003 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA.)。乳制奶油还含有少量作为脂质酰基转移酶的受体分子的胆固醇。
根据冰淇淋的组成成分，有可能产生甘油单酯和极性乳化剂，如溶血卵磷脂和糖酯，这些对于冰淇淋生产有益。
在乳制奶油中酰基转移酶反应的另一有益效果是形成胆固醇酯，这可以减慢胆固醇在肠道中的吸收。
冰淇淋配方
Figure 2009101343050100002001191
冰淇淋生产过程
1.将乳制奶油，葡萄糖糖浆和甘油加热至约40℃。添加脂质酰基转移酶，并让混合物反应30分钟。取出样品用于分析。
2.加热所有其它脂质成分至约40℃。
3.添加其它干燥成分。(添加之前，先混合稳定剂混合物(stabiliser blend)和糖)
4.当干燥成分溶解，加入乳制奶油-葡萄糖混合物。
5.80-85℃巴氏灭菌20-40秒。
6.80℃匀浆(配方1，190巴；配方2，175巴)
7.冷却至陈化温度，4℃
8.在持续冷冻箱中冷冻到所需超限(desired overrun)(建议100％)
9.在管道(tunnel)中-40℃硬化
10.-25℃以下保存
结果：
与使用商品乳化剂Cremodan SE 30制备的冰淇淋相比相比，在冰淇淋生产过程中使用酰基转移酶有助于生产味道极佳，奶油口感很好的冰淇淋。由脂质酰基转移酶生产的冰淇淋的熔化现象也有改善。
实施例21：乳酪中的酰基转移酶
乳酪是通过凝固牛奶，脱脂牛奶，部分脱脂牛奶，奶油，乳清奶油，或酪乳，或这些物质的任何组合，通过粗制凝乳酶(rennet)或其它适宜的促凝剂的作用，部分排出所述凝固所产生的乳清，制成的新鲜或成熟的固体或半固体产品。
乳酪产量主要依赖于牛奶中的脂肪与蛋白成分。盐(具体是钙盐)和蛋白浓缩物，还有酸度，对于凝固非常重要。(ref.Mllmann′s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry Copyright
Figure G2009101343050D01201
2003 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co)。
所述努力是为优化和增加乳酪产量，其可通过乳酪生产程序的最优化(USP 4,959,229)或通过使用改良凝固方法(USP 4,581,240)实现，后一种方法可以增加凝乳中乳清蛋白的含量。
在本发明中，使用脂质酰基转移酶制备乳酪过程中，通过对牛奶的处理，通过酶促修饰乳清蛋白使凝乳中乳清蛋白的含量增加。
当脂肪酸与非膜性蛋白如β-乳球蛋白共价结合时，它的物理的和功能的特性将显著改变。
为本发明的乳酪生产，在牛奶中添加粗制凝乳酶之前或同时将脂质酰基转移酶加到牛奶中。
酪蛋白沉淀的过程中，酰基转移酶可在形成酰化的蛋白或酰化的肽链过程中利用卵磷脂和牛奶中的其它脂质作为供体，肽或蛋白作为受体分子。
乳蛋白疏水性的改变有助于增加乳酪生产过程中凝乳中的蛋白沉淀。
由于本发明获得的乳酪产量增加源于提高常常丢失到乳清中的蛋白在乳酪凝块中的保留量增加，因此一种直接与本发明机制相关的适宜方法是建立在测定乳清中的最终蛋白含量的基础上。乳清中的蛋白越少必然意味着凝乳中的蛋白越多，乳酪产量也越高。
乳清中蛋白量的测定含可按以下方法进行。在100ml烧杯中，将脱脂或全脂牛奶加热至适宜粗制凝乳酶凝固的温度，通常是30-35℃。任选添加1％的批乳酸菌起子(bulk lactic acid bacteria starter)，并添加相应量(例如0.03-0.05％)的标准粗制凝乳酶。当牛奶转变成凝块，其硬度足够大从而允许被切成约边长0.5cm的小块，用锋利的刀进行所述切割。脱水收缩作用从而开始，保持30分钟后，使凝乳沉降，取出乳清样品，用实验室离心机离心10分钟。用例如Kjeldahl方法分析该样品的蛋白含量。做为选择，和/或作为补充，样品应通过能确定单独蛋白组分的类型和质量的方法分析。
实施例22“低水分环境中的测定法”
脂解酶在低含水量环境中的转移酶反应。
操作步骤
材料
胆固醇Sigma目录.C 8503
L-α-磷脂酰胆碱95％(植物)Avanti#441601
大豆油，Aarhus United，DK.
氯仿，分析级
酶
#179，GCAT来自杀鲑气单胞菌
#2427，磷脂酶A1来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)，
Figure G2009101343050D01211
F来自Novozymes，Denmark
#1991，来自胰腺的磷脂酶A2，LIPOMOD 22L来自Biocatalysts，UK
#2373，南极念珠菌(Candida antarctica)脂酶，Novozyme 525 L来自Novozymes Denmark.
酶测定
通过在搅拌过程中加热到60℃，使13.1％卵磷脂与6.6％胆固醇溶于大豆油
用20ml Wheaton玻璃杯称量底物并加热到46℃
添加水与酶溶液并开始计时
以规律间隔将50mg样品转移到10ml Dram玻璃杯中并冷冻
分离出的脂质通过GLC分析
GLC分析
GLC分析按实施例11所述实施
结果
实验设计如表33所示
将以含有13.1％卵磷脂与6.6％胆固醇的大豆油为基础的底物加热到46℃。添加酶溶液并开始计时。
反应30，60和120分钟后，取样品做GLC分析。
表33
Figure 2009101343050100002001221
GLC结果如表34所示。结果以基于总样品组分的百分比表示。以GLC结果为基础，可计算出相对不加酶的对照样品，通过酶反应产生的脂肪酸与胆固醇酯的量。在这样的实验条件下，总体酶活性可以以水解活性(通过游离脂肪酸形成测定)与转移酶活性(通过胆固醇酯形成估计)来评价。从这些结果以及脂肪酸与胆固醇酯的分子量信息可计算出相对摩尔水解活性与相对摩尔转移酶活性，如表35所示。
表34
Figure 2009101343050100002001222
表35
Figure 2009101343050100002001231
结论
在这些实验中可观察到所有被检测的酶都表现有水解活性，这是由于脂肪酸的量增加。但只有来自杀鲑气单胞菌的GCAT表现出转移酶活性。因此推论在具有卵磷脂与胆固醇的、含6％水的油性体系中，来自尖镰孢的磷脂酶A1，来自胰腺的磷脂酶A2和来自南极念珠菌的脂酶只有水解活性。
上面说明书中提及的所有公开的内容包含在本文中作为参考。本发明方法和体系的不同修饰和改变对于本领域普通技术人员来说是清楚的而不会偏离本发明的范围和精神。尽管本发明根据优选的具体实施方案进行了描述，但本发明权利要求保护的范围不应该不适当地限于这些特殊的具体实施方案是可以理解的。事实上，对用于实现发明的所述模式的各种修饰对于生物化学领域和生物工程学领域或相关领域的普通技术人员来说是清楚明白的，意图包含在下面的权利要求的保护范围内。
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
丹尼斯科公司(Danisco A/S)
Langebrogade 1
DK-1001 Copenhagen
丹麦
保藏人的姓名和地址
Figure 2009101343050100002001241
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
表格sp/4(只此一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
丹尼斯科公司(Danisco A/S)        存活证明
Langebrogade 1                   由下一页所指明的国际保
DK-1001 Copenhagen               藏单位根据细则10.2出具
丹麦
应接到此存活证明的
单位的名称和地址
Figure 2009101343050100002001251
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
Figure 2009101343050100002001252
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
丹尼斯科公司(Danisco A/S)
Langebrogade 1
DK-1001 Copenhagen
丹麦
保藏人的姓名和地址
当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
表格sp/4(只此一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
丹尼斯科公司(Danisco A/S)                存活证明
Langebrogade 1                           由下一页所指明的国际保
DK-1001Copenhagen                        藏单位根据细则10.2出具
丹麦
应接到此存活证明的
单位的名称和地址
Figure G2009101343050D01271
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
Figure G2009101343050D01272
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
Figure 2009101343050100002001291
Figure 2009101343050100002001301
Figure 2009101343050100002001311
Figure 2009101343050100002001321
Figure 2009101343050100002001331
Figure 2009101343050100002001361
Figure 2009101343050100002001381
Figure 2009101343050100002001391
Figure 2009101343050100002001401
Figure 2009101343050100002001411
Figure 2009101343050100002001421
Figure 2009101343050100002001431
Figure 2009101343050100002001441
Figure 2009101343050100002001451
Figure 2009101343050100002001461
Figure 2009101343050100002001471
Figure 2009101343050100002001501
Figure 2009101343050100002001511
Figure 2009101343050100002001531
Figure 2009101343050100002001541
Figure 2009101343050100002001551
Figure 2009101343050100002001561
Figure 2009101343050100002001571

Claims (5)

1.脂质酰基转移酶用于从包含10％-98％的含水食物原料制备食品的用途，所述食品选自包含乳化剂的蛋或基于蛋的产品或包含乳化剂的乳制品，其中所述乳化剂通过脂质酰基转移酶从食物原料的组分产生，其中所述脂质酰基转移酶分类为E.C.2.3.1.x，且其中所述脂质酰基转移酶是这样的酶：
(a)当利用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含有54％水分的蛋黄中进行测定时，所述的酶具有多至100％的相对转移酶活性，所述转移酶测定法包括如下步骤：
i)用20ml Wheaton玻璃杯称量5克液态蛋黄底物，加热到35℃；
ii)添加水和酶溶液，开始计时；
iii)以规律间隔将0.5g样品移到10ml Dram玻璃杯中；
iv)添加20μl 4M HCl以终止酶反应并酸化脂肪酸盐；
v)添加3ml氯仿，将样品在Whirley中混合30秒，并在3000×g离心10分钟；
vi)取0.8ml氯仿相移至涂焦油的Dram玻璃杯中，在60℃氮蒸汽下蒸发氯仿，称量Dram玻璃杯；
vii)通过GLC分析分离的脂质；
(b)当利用经缓冲的底物中的转移酶测定法进行测定时，所述的酶具有至少2％的酰基转移酶活性，其中所述脂质酰基转移酶是当利用经缓冲的底物中的转移酶测定法进行测定时具有至少2％酰基转移酶活性的脂质酰基转移酶，所述转移酶测定法包括如下步骤：
i)将450mg磷脂酰胆碱和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥；
ii)将300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到Wheaton玻璃杯中，添加15ml 50mM HEPES缓冲液pH 7，并在搅拌过程中将脂质分散到缓冲液中；
ii)将底物用磁力搅拌器混合同时加热至35℃，添加0.25ml酶溶液，这是在含水量95％的高水分环境下进行的；
iv)在反应0，5，10，15，25，40和60分钟后取出2ml样品，并通过立即添加25μl 4M HCl酸化游离脂肪酸来终止酶反应；
v)添加3ml氯仿，在Whirley中剧烈摇晃振摇30秒，离心，分离2ml氯仿相，用0.45μm的滤纸过滤，进入10ml涂焦油的Dram玻璃杯中；
vi)在60℃氮蒸汽条件下蒸发氯仿，并称量样品；
vii)通过GLC分析提取的脂质；或
(c)当利用低水分环境中的转移酶测定法进行测定时，在30、20或120分钟的时间后测量，所述的酶具有至少1％的相对转移酶活性，所述转移酶测定法包括如下步骤：
i)通过在搅拌过程中加热到60℃，使13.1％卵磷脂与6.6％胆固醇溶于大豆油；
ii)用20ml Wheaton玻璃杯称量底物并加热到46℃；
iii)添加水与酶溶液，开始计时；
iv)以规律间隔将50mg样品转移到10ml Dram玻璃杯中并冷冻；
v)通过GLC分析分离的脂质。
2.根据权利要求1的用途，其中所述基于蛋的产品是蛋黄酱、色拉调料、沙司、冰淇淋、蛋粉、改良蛋黄和由它们制备的产品；其中所述乳制品是黄油、乳、奶油、干酪、冷冻的甜点、酸奶、酸奶饮品、乳脂肪、脱水奶脂肪。
3.根据权利要求1的用途，其中所述乳制品是奶油干酪、冰淇淋。
4.制备包含乳化剂的蛋或基于蛋的产品或包含乳化剂的乳制品的方法，其中所述方法包括将脂质酰基转移酶添加于包含10％-98％水的蛋或基于蛋的产品或乳制品的步骤，其中所述脂质酰基转移酶分类为E.C.2.3.1.x，且其中所述脂质酰基转移酶是这样的酶：
(a)当利用高水分蛋黄中的转移酶测定法在含有54％水分的蛋黄中进行测定时，所述的酶具有多至100％的相对转移酶活性，所述转移酶测定法包括如下步骤：
i)用20ml Wheaton玻璃杯称量5克液态蛋黄底物，加热到35℃；
ii)添加水和酶溶液，开始计时；
iii)以规律间隔将0.5g样品移到10ml Dram玻璃杯中；
iv)添加20μl 4M HCl以终止酶反应并酸化脂肪酸盐；
v)添加3ml氯仿，将样品在Whirley中混合30秒，并在3000×g离心10分钟；
vi)取0.8ml氯仿相移至涂焦油的Dram玻璃杯中，在60℃氮蒸汽下蒸发氯仿，称量Dram玻璃杯；
vii)通过GLC分析分离的脂质；
(b)当利用经缓冲的底物中的转移酶测定法进行测定时，所述的酶具有至少2％的酰基转移酶活性，其中所述脂质酰基转移酶是当利用经缓冲的底物中的转移酶测定法进行测定时具有至少2％酰基转移酶活性的脂质酰基转移酶，所述转移酶测定法包括如下步骤：
i)将450mg磷脂酰胆碱和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥；
ii)将300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到Wheaton玻璃杯中，添加15ml 50mM HEPES缓冲液pH 7，并在搅拌过程中将脂质分散到缓冲液中；
iii)将底物用磁力搅拌器混合同时加热至35℃，添加0.25ml酶溶液，这是在含水量95％的高水分环境下进行的；
iv)在反应0，5，10，15，25，40和60分钟后取出2ml样品，并通过立即添加25μl 4M HCl酸化游离脂肪酸来终止酶反应；
v)添加3ml氯仿，在Whirley中剧烈摇晃振摇30秒，离心，分离2ml氯仿相，用0.45μm的滤纸过滤，进入10ml涂焦油的Dram玻璃杯中；
vi)在60℃氮蒸汽条件下蒸发氯仿，并称量样品；
vii)通过GLC分析提取的脂质；或
(c)当利用低水分环境中的转移酶测定法进行测定时，在30、20或120分钟的时间后测量，所述的酶具有至少1％的相对转移酶活性，所述转移酶测定法包括如下步骤：
i)通过在搅拌过程中加热到60℃，使13.1％卵磷脂与6.6％胆固醇溶于大豆油；
ii)用20ml Wheaton玻璃杯称量底物并加热到46℃；
iii)添加水与酶溶液，开始计时；
iv)以规律间隔将50mg样品转移到10ml Dram玻璃杯中并冷冻；
v)通过GLC分析分离的脂质。
5.通过根据权利要求4所述的方法可获得的包含10％-98％水的含水食品，其中所述食品包含权利要求4中所述的脂质酰基转移酶和乳化剂。
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