CN1802435A

CN1802435A - 方法

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Publication number: CN1802435A
Application number: CNA2004800063823A
Authority: CN
Inventors: 阿尔诺·D·克赖杰; 苏珊·M·马德里德; 乔恩·D·米克尔森; 乔恩·B·索伊
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2003-01-17
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2006-07-12
Also published as: CN101606647A; RU2009129174A; GB0301117D0; CN1989818A; CN101606646B; RU2518345C2; CN101606646A; CN1759183A; CN101606647B

Abstract

制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的方法，所述方法包括将酰基供体，酰基受体与水混合以产生包含5－98％水的高水分环境，其中所述酰基供体是选自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种的脂质底物，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组成的组中的一或多种物质；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种：醇解或酯基转移作用。

Description

方法

参考的相关申请

本申请参考了如下相关申请：1999年7月20日提交的、申请号为09/750,990的美国申请和申请号为10/409,391的美国申请。每一篇申请和这些申请的每一篇中引用的每篇文献(“申请引用的文献”)，每一篇本发明所参考和引用的每篇文献，无论在正文中或者在那些申请的审查过程中，以及在这些审查过程中提出的所有支持专利性的文献，都包含在本文中作为参考。本文正文也引用了各种文件(“本文引用的文件”)。每一篇“本文引用的文件”和每一篇在“本文引用的文件”中引用或者参考的文献都包含在本文中作为参考。

技术领域

本发明涉及通过利用脂质酰基转移酶对脂质进行生物转化以制备碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯(hydroxy acidester)的方法。

本发明还涉及脂质酰基转移酶在对脂质进行生物转化使其成为以下一或多种物质中的用途：碳水化合物酯和/或蛋白质和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯。

本发明还涉及本文固定化的脂质酰基转移酶的用途，该固定化的脂质酰基转移酶可用于在高水分环境中对脂质进行生物转化以制备一或多种碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯。

本发明还涉及固定化的脂质酰基转移酶.

背景技术

脂酶已经广泛用于脂质的生物转化以制备高价值产品，例如糖酯，以便用于广泛的工业中，包括食品和/或饲料工业，化妆品和/或皮肤护理工业，油化学(oleochemical)工业和制药工业。

当生物转化过程需要脂质底物水解时，脂解酶可用于高水分环境中。然而，当生物转化过程需要酯交换反应或酯基转移反应诸如通过醇解，由于不需要的水解反应利用酯酶高水分环境可以是有害的，所述不需要的水解反应可导致不需要的生物产物和/或使得生物转化产物的产量较低。

通常，需要酯交换作用和/或酯基转移作用的生物转化过程利用非-水环境中的酯酶，所述非-水环境诸如油系统和/或有机溶剂系统诸如丁醇，甲醇或己烷。这样的系统提供这样的环境，其中极性受体分子和脂质供体分子可以至少部分溶解，且所述酯酶具有足够的酶活性。尽管少量水是任何酶活性所需的，水的量严格保持在较低水平以避免该酶的水解活性。

通常，糖酯，蛋白质酯，羟基酸酯已经通过化学合成利用无机催化物产生。常规生物转化法制备糖酯或羟基酸酯利用有机溶剂环境或仅存在少量水的超临界液体中的酯酶。

Lecointe et al Biotechnology Letters，Vol 18.，No.8(August)，pp869-874公开了对多种脂酶的研究，以及它们在含水介质中的活性，所述研究根据分别来自甲醇和丁醇的甲基酯或丁基酯。Lecointe et al教导来自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的酯酶/酰基转移酶，其随甲醇或丁醇浓度增加显示降低的水解活性以及增强的产生甲基酯和丁基酯的能力。来自近平滑念珠菌的酯酶/酰基转移酶在制备脂肪羟氨基(hydroxamic)酸中的用途在Vaysseet al J.of Biotechnology 53(1997)41-46中教导。

脂酶：胆固醇酰基转移酶(cholesterol acyltransferase)已经是已知的(参见例如Buckley-Biochemistry伯克利生物化学1983，22，5490-5493)。具体地，已经发现甘油磷脂：胆固醇酰基转移酶(GCAT)，它很象植物和/或哺乳动物卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)，可以催化脂肪酸在卵磷脂与胆固醇之间的转移。

厄普顿(Upton)和伯克利(Buckley)(TIBS 20，May 1995 p178-179)及布鲁米尔科(Brumlik)和伯克利(Buckley)(J.of Bacteriology Apr.1996 p2060-2064)教导了源自嗜水气单胞菌(Aeromona hydrophila)的脂酶/酰基转移酶能够在水介质中将酰基转移到乙醇受体上。

发明内容

本发明第一方面提供了制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的方法，所述方法包括将酰基供体，酰基受体与水混合以产生包含5-98％水的高水分环境，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂(lysophospholipid)，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂(lysoglycolipid)组成的组中的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组成的组中的一或多种物质；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种：醇解或酯基转移作用。

本发明另一方面提供脂质酰基转移酶在制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯中的用途，其可通过在酰基供体，酰基受体与水的混合物中催化醇解和/或酯基转移作用进行，所述混合物包含5-98％水，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组成的组中的一或多种物质。

根据本发明另一方面，提供了通过本发明的方法制备的碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯。

根据本发明另一方面，提供了通过本发明的方法制备的药物，化妆品，食品，颜料(paint)，包含碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯。

根据本发明另一方面，提供了本发明所述的固定化的脂质酰基转移酶。

发明详述

本文应用的术语“脂质酰基转移酶”是指一种也具有脂酶活性的酶(根据国际生物化学分子生物学联合会命名委员会的酶命名法推荐(EnzymeNomenclature Recommendations)(1992)通常分类为E.C.3.1.1.x)，该酶也具有酰基转移酶活性(通常分类为E.C.2.3.1.x)，该酶能够将酰基从一种脂质转移到一种或多种受体底物，例如以下物质的一种或多种：碳水化合物、蛋白质或其亚单位或羟基酸。

优选，本发明的“酰基受体”不是水。

一方面，优选所述酶能够将酰基从脂质底物转移到碳水化合物。

碳水化合物酰基受体可以为以下物质中的一种或多种：单糖、二糖、寡糖或多糖。优选的碳水化合物是以下物质中的一种或多种：葡萄糖、果糖、脱水果糖(anhydrofructose)、麦芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖(xylose)、木寡糖(xylooligosacharide)、阿拉伯糖、麦芽寡糖(maltooligosaccharide)、塔格糖(tagatose)、microthecin、ascopyrone P、ascopyrone T或cortalcerone。

碳水化合物酯可作为有价值的乳化剂在例如食品中起作用。

一方面，优选所述酶能够将酰基从脂质底物转移到蛋白质和/或蛋白质亚基。

优选所述蛋白质亚基是以下物质中的一种或多种：氨基酸，蛋白质水解产物，肽，二肽，寡肽，多肽。

适宜的蛋白质可以是食品中例如在乳制品和/或肉制品中的一种或多种蛋白质。仅作为实例，适宜的蛋白质可能是乳凝块或乳清中的蛋白质，如乳球蛋白。其它适宜的蛋白质包括卵清蛋白(来自蛋类)、麸蛋白(gliadin)、麦谷蛋白(glutenin)、puroindoline、来自谷物的脂质转移蛋白和肉中的肌球蛋白，或以下乳蛋白：酪蛋白，乳白蛋白(lactalbulin)和乳铁传递蛋白(lactoferrin)。

适宜地，在所述蛋白质或蛋白质亚基中，所述酰基受体可以是以下蛋白质或蛋白质亚基组分中的一种或多种：丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，或半胱氨酸。

当所述蛋白质亚基是氨基酸时，适宜地所述氨基酸可以是任何氨基酸，优选所述氨基酸是例如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或半胱氨酸中的一或多种。

一方面，优选所述酶能将酰基从脂质底物转移到羟基酸。

适宜地，所述羟基酸是以下酸中的一种或多种：柠檬酸，酒石酸，乳酸，抗坏血酸，羟基乙酸，苹果酸，α-羟基醋酸(alpha-hydroxylethanoic acid)，α-羟基辛酸(alpha-hydroxyoctanoic acid)，α-羟基辛酸(alpha-hydroxycaprylicacid)，羟基辛酸(hydroxycaprylic acid)，葡糖酸，乳糖酸(lactobionic acid)或麦芽糖酸(maltobionic acid)。

适宜地，所述羟基酸可以是水果酸(fruit acid)，例如苹果酸，乳酸，酒石酸，柠檬酸或羟基乙酸中的一种或多种。

一个实施方案中，优选所述羟基酸是柠檬酸，乳酸，酒石酸或苹果酸中的一种或多种。

本文术语“羟基酸”指其中烷基的一或多个氢原子被羟基取代的羧酸。

一方面，所述脂质酰基转移酶可将酰基从脂质底物转移到碳水化合物，蛋白质亚基或羟基酸中的一种或多种，所述脂质酰基转移酶还可将酰基从脂质转移到固醇和/或stanol，具体是phytosterol和/或hytostanol中的一种或多种。

适宜地，当所述脂质底物是磷脂，其可为卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。本文术语卵磷脂包括磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。

适宜地，当脂质底物是溶血磷脂，其可为溶血卵磷脂，例如溶血磷脂酰胆碱。本文术语溶血磷脂酰胆碱与术语溶血卵磷脂同义，这些术语可互换使用。

适宜地，当脂质底物是糖脂，其可为例如双半乳糖甘油二酯(DGDG)。

所述脂质底物可称为“脂质酰基供体”或“酰基供体”。这些术语可互换使用。

一些方面，优选脂质酰基转移酶针对其起作用的脂质底物是磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。

一些方面，优选所述脂质底物是糖脂，诸如DGDG。

一些方面，所述脂质底物可以是食品脂质，即食品的脂质组分。

在一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯。

脂质底物或脂质酰基供体宜为一种或多种脂质，其存在于一种或多种下列底物中：脂肪，包括猪油(lard)、牛羊油(tallow)、乳脂(butter fat)；油，包括从棕榈油(palm oil)、葵花子油(sunflower oil)、大豆油(soya bean oil)、红花油(safflower oil)、棉籽油(cotton seed oil)、花生油(ground nut oil)、玉米油(corn oil)、橄榄油(olive oil)、花生油(peanut oil)、椰子油(coconut oil)和油菜籽油(rape seed oil)中提取或由它们衍生的油。来自大豆、油菜籽、或蛋黄的卵磷脂也是适宜的脂质底物。脂质底物也可以是燕麦脂质或其它包含半乳糖脂的基于植物的物质。

在本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为8-22碳的脂质。

本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为16-22碳的脂质，更优选为16-20碳的脂质。

本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长不多于14碳的脂质，适宜地选自脂肪酸链长4-14碳的脂质，适宜地为4-10碳的脂质，适宜地为4-8碳的脂质。

优选所述酰基供体不是游离脂肪酸。

优选，所述酰基供体不是碳水化合物(糖)酯。

适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶可显示出一种或多种下列脂酶的活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)，甘油三酯酶活性(E.C.3.1.1.3)，磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)，磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。这里应用的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。

适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶具有至少一种或多种下列活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)和/或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)。

对于本发明一些方面，脂质酰基转移酶至少具有糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。

适宜地，对于一些方面，本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂上转移到以下一种或多种受体底物：碳水化合物，蛋白质，甘油羟基酸。

一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂转移到碳水化合物，形成至少碳水化合物酯。

一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂或磷脂转移到蛋白质或蛋白质亚基，形成至少蛋白质酯(或蛋白质脂肪酸缩合物)或蛋白质亚基酯。

本文术语“蛋白质亚基酯”酯从任何蛋白质亚基形成的酯，诸如二肽酯，，寡肽酯，多肽酯或蛋白质水解产物酯。

一些方面，优选本发明脂质酰基转移酶不表现甘油三酯酶活性(E.C.3.1.1.3)。

优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征：

(i)该酶具有酰基转移活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到一或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸酰基受体形成新酯，即碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯；和

(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S中的一种或多种。

优选地，GDSX基序中的X是L，这样，本发明所述的酶优选包含氨基酸基序GSDL。

GDSX基序是由四种保守氨基酸构成。优选地，所述基序中的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，GDSX基序中的丝氨酸可以在与嗜水气单胞菌脂解酶中与Ser-16相应的位置，如Brumlik和Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996，Vol.1，No.7，p2060-2064)的教导。

为确定一种蛋白质是否含有本发明所述GDSX基序，优选将该序列与Pfam数据库中的隐藏markov模型图谱(model profile)(HMM图谱)进行比较。

Pfam是蛋白质结构域家族的数据库。Pfam包括用于每个家族的辅助(curated)多重序列比对以及用于鉴定新序列中的这些结构域的隐藏Markov模型图谱(HMM图谱)。对Pfam的介绍见于Bateman A等.(2002)NucleicAcids Res.30；276-280。隐藏Markov模型被应用于许多旨在对蛋白质进行分类的数据库中，综述见Bateman A和Haft DH(2002)Brief Bioinform3；236-245。

http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed &list uids＝12230032&dopt＝Abstract

http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/querv.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed &list uids＝11752314&dopt＝Abstract

对隐藏Markov模型的详细解释和这些模型如何在Pfam数据库中应用参见Durb中R，Eddy S，和Krogh A(1998)Biological sequence分析；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4(Durb中R，Eddy S，和Krogh A(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4。Hammer程序包可以从华盛顿大学，St Louis，USA获得。

可选择地，GDSX基序可以通过应用Hammer软件包识别，说明由Durb中R，Eddy S，和Krogh A(1998)Biological sequence分析；probabilisticmodels of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN0-521-62041-4(Durb中R，Eddy S，和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4)及其中的参考文献提供，以及本说明书中关于HMMER2的资料。

PFAM数据库可以通过，例如，目前位于如下网址的几个服务器进行访问：

http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml

http：//pfam.wustl.edu/

http：//pfam.jouy.inra.fr/

http：//pfam.cgb.ki.se/

数据库提供了检索工具，在此可以输入蛋白质序列。应用数据库的默认参数，对蛋白质序列中Pfam结构域的存在进行分析。GDSX结构域是在数据库中已建立的区域，因此任何查询序列中存在的该结构域可以得到识别。数据库将返回Pfam00657共有序列与查询序列的比对。

多重比对，包括杀鲑气单胞菌或嗜水气单胞菌可以通过下列方法获得：

a)手工方法

通过上述程序，可获得目的蛋白与Pfam00657保守序列的比对并获得P10480序列与Pfam00657保守序列的比对；或

b)通过数据库

在鉴定Pfam00657共有序列之后，数据库提供选项显示查询序列与Pfam00657保守序列的种子比对(seed alignment)，P10480是该种子比对的一部分，且表示为GCAT AERHY。查询序列和P10480都将在同一窗口显示。

嗜水气单胞菌参比序列：

嗜水气单胞菌GDSX脂酶的残基在NCBI文件P10480中进行编号，所述文本中的编号是指由该文件给出的编号，在本发明中它用来确定具体的氨基酸残基，所述具体的氨基酸残基在优选具体实施方案中，存在于本发明的脂质酰基转移酶中。

实施Pfam比对(图33和34)：

下列保守的残基可被识别，并且在优选的实施方案中存在于本发明的组合物和方法所应用的酶中。

1区-GDSX区

hid hid hid hid Gly Asp Ser hid

28 29 30 31 32 33 34 35

2区-GANDY区

hid Gly hid Asn Asp hid

130 131 132 133 134 135

3区-HPT区

His

309

其中′hid′是指选自Met，Ile，Leu，Val，Ala，Gly，Cys，His，Lys，Trp，Tyr或Phe的一个疏水残基。

优选地，应用于本发明的组合物/方法中的脂质酰基转移酶可用Pfam00657共有序列进行比对。

优选地，与pfam00657结构域家族的隐藏markov模型图谱(HMM图谱)的阳性匹配表明本发明中的GDSL或GDSX结构域的存在。

优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中的脂质酰基转移酶含有至少一个，优选一个以上，优选两个以上下列区域，GDSx区、GANDY区、HPT区。适宜地，脂质酰基转移酶含有GDSx区和GANDY区。可选择地，所述酶含有GDSx区和HPT区。优选地，所述酶含有至少一个GDSx区。

优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中的酶与参比嗜水气单胞菌多肽序列即SEQ ID No.32比较时含有至少一个，优选一个以上，优选两个以上，优选三个以上，优选四个以上，优选五个以上，优选六个以上，优选七个以上，优选八个以上，优选九个以上，优选十个以上，优选十一个以上，优选十二以上，优选十三以上，优选十四个以上下列氨基酸残基：28hid，29hid，30hid，31hid，32gly，33Asp，34Ser，35hid，130hid，131Gly，132hid，133Asn，134Asp，135hid，309His。

pfam00657 GDSX结构域是将具有该区域蛋白与其它酶区分的独特标识。

Pfam00657共有序列，表示为图1的SEQ ID No.1。这是从第6版数据库Pfam00657家族的鉴定衍生出来的，本文也称其为pfam00657.6。

保守序列可通过新版Pfam数据库来更新。

例如，图33和34显示第11版数据库中00657家族的pfam比对，本文也称其为pfam00657.11。

发现两个版本的数据库中Pfam00657家族中都存在GDSx区、GANDY区和HPT区。其它版本的(release)pfam数据库可用来鉴定pfam00657家族。

(i)该酶具有转移酰基的活性(可定义为酯基转移活性)，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；

(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S；

(iii)该酶包含His-309或包含对应于嗜水气单胞菌脂解酶的His-309位的组氨酸残基，所述嗜水气单胞菌脂解酶如图2所示(SEQ ID No.2或SEQID No.32)。优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。

在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)中的His-291。

优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体：Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分别对应于图2(SEQ ID No.2)或图28(SEQ ID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示序列中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34，Asp-134和His-309，等同于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16，Asp-116和His-291。在图1(SEQ IDNo.1)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser-7，Asp-157和His-348。

(i)该酶具有酰基转移活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到一或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸酰基受体形成新酯，即碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯；并且

(iii)该酶包含His-309或包含对应于嗜水气单胞菌脂解酶的His-309位的组氨酸残基，所述嗜水气单胞菌脂解酶如图2所示(SEQ ID No.2或SEQID No.32)。

优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。

(ii)该酶包含至少Gly-32，Asp-33，Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分别对应于图2(SEQ ID No.2)或图28(SEQ ID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中Gly-32，Asp-33，Ser-34，Asp-134和His-309的甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸。

适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以并优选从下列来自一个或多个属的生物体中获得：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李司忒氏菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、Mesorhizobium、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄杆菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。

适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以并优选从下列一种或多种生物体中获得：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(杀鲑气单胞菌)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacteriumdehalogenans)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌(Vibrionaceae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、硫磺矿硫叶菌(Sulfolobussolfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土曲霉(Aspergillusterreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、无害李司忒氏菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、Mesorhizobium loti、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母(近平滑念珠菌)。

在一方面，优选地，本发明中的脂质酰基转移酶可以并优选从一种或多种嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中获得。

适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含一种或多种下列氨基酸序列。

(i)SEQ ID No.2所示的的氨基酸序列(见图2)

(ii)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列(见图3)

(iii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列(见图4)

(iv)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列(见图5)

(v)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列(见图6)

(vi)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列(见图14)

(vii)SEQ ID No.20所示的氨基酸序列(见图16)

(viii)SEQ ID No.22所示的氨基酸序列(见图18)

(ix)SEQ ID No.24所示的氨基酸序列(见图20)

(xi)SEQ ID No.26所示的氨基酸序列(见图22)

(xii)SEQ ID No.28所示的氨基酸序列(见图24)

(xiii)SEQ ID No.30所示的氨基酸序列(见图26)

(ixi)SEQ ID No.32所示的氨基酸序列(见图28)

(xiv)SEQ ID No.34所示的氨基酸序列(见图30)

或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQID No.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者更高同一性的氨基酸序列。

适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶或者包含SEQ ID No.2或SEQID No.3或SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列有75％或75％以上，优选80％或80％以上，优选85％或85％以上，优选90％或90％以上，优选95％或95％以上同一性的氨基酸序列。

为了达到本发明的目的，同一性的程度取决于相同序列元素的数目。依照本发明，同一性程度可通过本领域已知电脑程序适宜地测定，所述程序诸如GCG程序包提供的GAP(Program Manual for the Wiscons中Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，US53711)(Needleman & Wunsch(1970)，J.of Molecular Biology48，443-45)，利用下列设置进行多肽序列比较：GAP生成罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。

适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含一段氨基酸序列，该序列与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQ IDNo.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的任何一段序列具有80％或80％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上的同一性。

适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一或多种：

(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的1-100氨基酸残基所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的101-200氨基酸残基所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的201-300氨基酸残基所示的氨基酸序列；或

(d)与上述(a)-(c)定义的任意氨基酸序列有75％或75％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上同一性的氨基酸序列。

(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；

(d)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；

(e)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或

(f)与上述(a)-(e)定义的任意氨基酸序列有75％或75％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上同一性的氨基酸序列。

适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以包含下列核苷酸序列中的一个或多个序列表达而产生的氨基酸序列。

(a)如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列(见图9)；

(b)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列(见图10)；

(c)如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列(见图11)；

(d)如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列(见图12)；

(e)如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列(见图13)；

(f)如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列(见图15)；

(g)如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列(见图17)；

(h)如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列(见图19)；

(i)如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列(见图21)；

(j)如SEQ ID No.27所示的核苷酸序列(见图23)；

(k)如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列(见图25)；

(l)如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列(见图27)；

(m)如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列(见图29)；

(n)如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列(见图31)；

(o)或

与SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQID No.11，SEQ ID No.13，SEQ ID No.21，SEQ ID No.23，SEQ ID No.25，SEQ ID No.27，SEQ ID No.29，SEQ ID No.31，SEQ ID No.33或SEQ IDNo.35所示的任意一序列具有75％或75％以上同一性的核苷酸序列。

适宜地，核苷酸序列可以与SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.13，SEQ ID No.21，SEQID No.23，SEQ ID No.25，SEQ ID No.27，SEQ ID No.29，SEQ ID No.31，SEQ ID No.33或SEQ ID No.35所示的任意一序列具有80％或80％以上，优选85％或85％以上，更优选90％或90％以上，还更优选95％或95％以上的同一性。

一方面，本发明所述的脂质酰基转移酶可以为卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(例如分子进化产生的变体)。

本领域所知的适宜的LCAT可从下列一种或多种生物体中得到，例如：哺乳动物、大鼠、小鼠、小鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物，包括拟南芥(Arabidopsis)和稻(Oryza sativa)、线虫(nematodes)、真菌和酵母。

在一个具体实施方案中，本发明所述的脂质酰基转移酶可以是可以并优选从含有pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大肠杆菌菌株E.TOP 10(E.coli strains TOP 10)中获得的脂质酰基转移酶，该菌株由丹麦哥本哈根K，DK-1001，Langebrogade 1的丹尼斯科公司(Danisco A/S of Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，Denmark)，根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏(the Budapest Treaty on the International Recognitionof the Deposit of Microorganisms for the purpose of Patent方法)在2003年12月22日保藏于英国苏格兰阿伯丁圣马恰尔街23号国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)(the National Collection of Industrial，Marine and FoodBacteria(NCIMB)23 St.Machar Street，Aberdeen Scotland，GB)，保藏号分别为NCIMB 41204和NCIMB 41205。

这里使用的术语“转移酶”与术语“脂质酰基转移酶”可以互换。

适宜地，本发明定义的脂质酰基转移酶催化下列一种或两种反应：酯基转移作用(transesterification)，醇解作用。

根据本发明，可获得一或多种以下的优越性质：从脂质到形成一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的生物转化可在高水分环境中发生，所述环境不包含有机溶剂或包含于常规生物转化法相比而言较少量的有机溶剂。

术语“生物转化”指修饰一种有机化合物以产生另一种有机化合物和/或通过酶催化从其它有机化合物合成有机化合物。

本文术语“酯基转移作用”指的是酰基从脂质供体(除外游离脂肪酸)上经酶催化转移到酰基受体(除外水)。为避免怀疑，本文所用术语“酯基转移作用”指的是酰基在脂质供体与酰基受体(不是水)之间的酶催化转移，其中所述酰基受体包含适宜地化学基团，其可以为例如-OH或-SH基团。

本发明使用的术语“醇解作用”指的是通过与醇基团ROH的反应对酸衍生物的共价键的酶裂解，使得一产物与醇基团的H结合而另一产物与醇基团的OR基团结合。

本发明使用的术语“水解作用”指的是酰基从脂质到水分子OH基团的酶催化转移作用。由水解作用引起的酰基转移作用需要水分子的分离。

术语“酯交换作用”指的是酰基在脂质供体与酰基受体之间的酶催化转移，其中的脂质供体不是游离的酰基。换言之“酯交换作用”指两个脂质分子之间的脂肪酸互换。

一方面，本发明定义的脂质酰基转移酶催化酯交换作用。

适宜地，本发明的方法或用途可进一步包含一或多种以下步骤：将酰基受体溶于水；将脂质酰基供体加入溶解的酰基受体，形成双相系统或乳液；对反应混合物进行搅拌或超声处理；加热反应混合物，例如，使得酶变性；通过标准分离技术将水相从脂肪/乳液相分离，所述标准分离技术诸如溶剂提取或水蒸发；通过疏水反应层析使得脂肪相分级，结晶或高真空蒸馏(high vacuum distillation)。适宜地，一或多种加热，分离或分级步骤可在所述反应达到平衡以后实施。

一个实施方案中，本发明方法所用的酯酶酰基转移酶是固定化的。当所述酶被固定的情况下，所述混合物包含酰基供体，酰基受体和流经柱子的水，所述水例如包含固定化的酶。通过将所述酶固定化，可能容易地再利用它。

适宜地，所述固定的酶可用于流动反应器(flow reactor)中或批量反应器(batch reactor)中，所述反应器含有反应混合物，该混合物包含溶于水的酰基受体以及脂质酰基供体作为双相系统或乳液。反应混合物可选被搅拌或经超声处理。一旦反应到达例如平衡，所述反应混合物和固定化的酶可被分离。适宜地，所述反应产物可以例如通过疏水反应层析，结晶或高真空蒸馏来分级。

固定化的脂质酰基转移酶可以使用本领域熟知的固定化技术制备。本领域有大量的对本领域技术人员而言清楚明白的制备固定化的酶的方法(例如以下文献中所述的技术：EP 0 746 608；或Balcao VM，Paiva AL，Malcata FX.，Enzyme Microb Technol.1996 May 1；18(6)：392-416；或ReetzMT，Jaeger KE.Chem Phys Lipids.1998 Jun；93(1-2)：3-14；或BornscheuerUT，Bessler C，Srinivas R，Krishna SH.TrendsBiotechnol.2002 Oct；20(10)：433-7；Plou et al，J.Biotechnology 92(2002)55-66；Warmuth et al.，1992.BioForum 9，282-283；Ferrer et al.，2000.J.Chem.Technol.Biotechnol.75，1-8；或Christensen et al.，1998.Nachwachsende Rohstoff 10，98-105；Petersen andChristenen，2000，Applied Biocatalysis.Harwood Academic Publishers，Amsterdam。(将每篇都包含在本文中作为参照)。本文所用技术包括例如与Eupergit C的共价偶联，吸附于聚丙烯和硅颗粒。

本文术语“高水分环境(high water environment)”优选指低或缺乏有机溶剂的环境，优选低或缺乏极性有机溶剂。本文术语有机溶剂作为脂质底物时优选不包括食品油，并有选不包括例如含高非极性脂质的食品油。适宜地，本发明高水分环境包含不超过50％体积的有机溶剂，不超过30％体积的有机溶剂，更优选不超过15％体积的有机溶剂，更优选不超5％，更优选不超过1％，更优选不超过0.5％体积的有机溶剂，更优选0％体积的有机溶剂。

当根据本发明产生碳水化合物酯时，优选所述碳水化合物酯是寡糖酯、单糖酯或二糖酯。

适宜地，当根据本发明产生碳水化合物酯时，碳水化合物酯可以是以下的一种或多种：葡萄糖酯、果糖酯、脱水果糖酯、麦芽糖酯、乳糖酯、半乳糖酯、木糖酯、木寡糖酯(xylooligosaccharide ester)、阿拉伯糖酯(arabinose ester)、麦寡糖酯(maltooligosaccharide ester)、塔格糖酯(tagatoseester)、蔗糖酯、microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、或cortalcerone酯。

根据本发明优选产生的碳水化合物酯是以下一种或者多种：碳水化合物单酯(碳水化合物mono-ester)、糖单酯(sugar mono-ester)、寡糖单酯、三糖单酯、二糖单酯、单糖单酯、葡萄糖单酯、果糖单酯、脱水果糖单酯、麦芽糖单酯、乳糖单酯、半乳糖单酯、木糖单酯、木寡糖单酯、阿拉伯糖单酯、麦寡糖单酯、塔格糖单酯、蔗糖单酯、microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、或cortalcerone酯。

在一个具体实施方案中，microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗微生物剂起作用。可选地或者进一步地，microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗氧化剂和/或乳化剂的一个或两个来起作用。

优选地，本发明碳水化合物酯的的形成(如果有的话)不依赖于UDP-葡萄糖。

优选地，本发明的食品不包含UDP-葡萄糖或仅仅包含不显著量的UDP-葡萄糖。

已发现本发明组合物和方法中应用的脂质酰基转移酶与脂解酶相比具有独特的性质，它们明显优先地将酰基从脂质转移到水以外的受体上，即使在有大量水存在的条件下也是如此。与现有技术中的酶相比发现，本发明中应用的脂质酰基转移酶在存在6％、54％、73％、89％和大约95％的水的条件下具有高的相对转移酶活性。被试脂解酶在这些水浓度条件下事实上不具有明显的相对转移酶活性。

％转移酶活性(即作为总酶活性百分比的转移酶活性)可通过以下方案测定：

测定转移酶活性百分率的实验设计：

酶促反应后，可用CHCl₃∶CH₃OH 2∶1提取已添加本发明的脂质酰基转移酶的食品，分离包含脂质物质的有机相，并可根据在下文描述的详细步骤通过GLC和HPLC分析。通过GLC和HPLC的分析，确定游离脂肪酸和一种或多种固醇/stanol酯类；碳水化合物酯；蛋白质酯；甘油二酯；或单甘油酯的量。不添加本发明的酶的对照食品用同种方法分析。

计算：

从GLC和HPLC分析的结果可以计算出游离脂肪酸和碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸的增加量：

Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；Mv脂肪酸＝脂肪酸平均分子量

A＝Δ％蛋白质酯/Mv蛋白质酯(其中Δ％蛋白质酯＝％蛋白质酯(酶)-％蛋白质酯(对照)，Mv蛋白质酯＝蛋白质酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是蛋白质；

B＝Δ％碳水化合物酯/Mv碳水化合物酯(其中Δ％碳水化合物酯＝％碳水化合物酯(酶)-％碳水化合物酯(对照)，Mv碳水化合物酯＝碳水化合物酯平均分子量)，这适用于酰基受体是碳水化合物。

C＝Δ％蛋白质亚基酯/Mv蛋白质亚基酯(其中Δ％蛋白质亚基酯＝％蛋白质亚基酯(酶)-％蛋白质亚基酯(对照)，Mv蛋白质亚基酯＝蛋白质亚基酯平均分子量)，这适用于酰基受体是蛋白质亚基；和

D＝羟基酸酯/Mv羟基酸酯(其中Δ％羟基酸酯＝％羟基酸酯(酶)-％羟基酸酯(对照)，Mv羟基酸酯＝羟基酸酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是羟基酸。

转移酶活性以占总酶活性的百分率计算：

^*指适当时删除。

酶的酯酶和酰基转移酶活性可利用以下实验评估。由此，具有本发明所述酶特征的脂质酰基转移酶可被获得/鉴定。

经缓冲的底物中的转移酶测定法(参见实施例6)

起脂质酰基转移酶作用以用于本发明组合物和方法中的酶可以用实施例12中教导的测定法常规鉴定出来。此测定方法将在下文称为“经缓冲的底物中的转移酶测定法”。在实施例6中对本发明源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶进行分析并与本发明未涉及的一定范围的脂解酶进行比较。可以看出脂解酶中只有LIPOPAN^F(Novozymes，丹麦)具有转移酶活性，且仅具有较低的水平(1.3％)。

适于本发明的组合物和方法中应用的酶可以利用在经缓冲的底物中的转移酶测定法来常规确定。应用这种测定方法(其中含水量非常高-大约95％)，本发明应用的脂质酰基转移酶是至少有2％酰基转移酶活性(相对转移酶活性)，优选至少5％相对转移酶活性，优选至少10％相对转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％相对转移酶活性的酶。本发明适宜的脂质酰基转移酶可以具有小于28％、小于30％、优选小于40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的酰基转移酶活性。

低水分蛋黄中的转移酶测定法(参见实施例11)

作为“经缓冲底物中的转移酶测定法”的替换(或附加)，本发明所用脂质酰基转移酶可以用“低水分蛋黄中的转移酶测定法”来鉴定。

为了判定一种酶是否是属于根据本发明的脂质酰基转移酶，可进行“低水分环境中的转移酶测定法”，即如实施例9教导在含水6％的油性环境中。这个例子说明在水含量6％的油性环境中本发明的脂质酰基转移酶具有高的相对转移酶活性，而现有技术的脂解酶具有水解活性。

在一具体实施方案中，本发明组合物和/或方法中应用的适宜脂质酰基转移酶是用“低水分环境中的转移酶测定法”检测的酶，在30、20或120分钟后进行测定时，其相对转移酶活性至少1％，优选至少2％，优选至少5％，优选至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少75％。适宜地，用“低水分环境中的转移酶测定法”在10、20、30或120分钟后进行测定时，本发明脂质酰基转移酶，可有少于30％、40％、50％、60％、70％或80％的活性。

如上所述，本发明中的脂酶酰基转移酶可以用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”或“低水分环境中的转移酶测定法”以胆固醇为酰基受体进行鉴定。当然，本领域技术人员会容易意识到，通过对分析方法进行明显的修改，“经缓冲的底物中的转移酶测定法”或“低水分环境中的转移酶测定法”可用于确定脂质酰基转移酶对任何脂质酰基供体或任何酰基受体组合的活性。如有必要，技术人员可简单地用可选酰基供体底物(如糖脂，甘油三酯)替换酰基供体底物(如磷脂)和/或用可选酰基受体底物(如碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸)替换酰基受体底物(如胆固醇)。(例如见实施例10-13)。

本发明术语“高水分环境”指任何包含5-98％水的环境。优选所述环境包含不超过6％水含量，优选不超过7％，8％，9％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％水含量。适宜地，所述高水分环境包含20-98％，适宜地包含50-98％水，适宜地包含70-98％水，适宜地包含75-98％水。

一个实施方案中，所述混合物中加入的脂质酰基转移酶的量与水的重量比至少1∶700，优选1∶10,000。

本文使用的术语“低水分”意味着任何底物或食品，其水含量小于6％，优选小于5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。

优选本发明的方法和/或用途可在15-60℃实施，优选在20-60℃，优选20-50℃，优选20-45℃，优选20-40℃。

适宜地，本发明的方法或用途包含另一步骤或纯化和/或分离所述反应产物，即一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯，或羟基酸酯。因此，优选所述反应产物是纯化的和/或分离的形式。

纯化酯的多种方法是本领域技术人员已知的。例如，只有通过本发明教导的方法/用途产生的酯可利用层析诸如疏水反应，过滤，离心，溶剂提取/蒸馏或结晶。适宜的方法见Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(2002)，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KgaA。

本发明所述脂质酰基转移酶可在任何适宜的表达宿主表达。例如本发明所述脂质酰基转移酶可在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达，并且可以通过超滤法和/或乙醇沉淀法和/或离心法纯化，接着可以使用淀粉(麦芽糊精)作为酶的载体进行喷雾干燥。经喷雾干燥后的酶通过添加另外的粉末形式载体而标准化为规定的PLU活性。有关技术在本领域中是很明确且常规的。

一个实施方案中，本发明的方法是体外方法。所述方法适宜地是连续或批量方法。

本发明的酶可以和一或多种其它酶联用。因此，除了本发明的酶以外，将所述混合物与至少一种其它的酶接触也包含在本发明的范围内。所述另外的酶包括淀粉降解酶，诸如内(endo)或外(exo)淀粉酶，支链淀粉酶(pullulanases)，去支化(debranching)酶，半纤维素酶(hemicellulases)包括木聚糖酶(xylanases)，纤维素酶(cellulase)，氧化还原酶(oxidoreductases)，例如葡萄糖氧化酶或碳水化合物氧化酶诸如麦芽糖的氧化酶，例如己糖氧化酶(HOX)，酯酶，磷脂酶和己糖氧化酶，以及蛋白酶。所述混合物可以和本发明的酶以及至少一种其它的酶同时或依次接触。

一个实施方案中例如所述脂质酰基转移酶可以和具有一或多种以下脂酶活性的脂酶联用：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26，三酰甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)，磷酯酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷酯酶A1活性(E.C.3.1.1.32).适宜的酯酶是本领域已知的，并作为实例包括以下酯酶：LIPOPAN^F和/或LECITASE^ULTRA(Novozymes A/S，Denmark)，磷酯酶A2(例如磷酯酶A2来自LIPOMOD^TM 22L来自Biocatalysts，LIPOMAX^TM来自Genecor)，LIPOLASE^(Novozymes A/S，Denmark)，酯酶的教导见WO03/97835，EP 0977 869或EP 1 193 314。

用途

因此，本发明的方法产生一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯，羟基酸酯。这些酯中的许多是有用的乳化剂。作为实例只有例如氨基酸酯，肽酯，蛋白质酯，碳水化合物酯和羟基酸酯(诸如酒石酸酯)是功能重要的乳化剂。乳化剂可用于多种工业中，诸如食品工业，饲料工业，化妆品工业(例如在化妆品基础中)，制药工业(例如在药物合成和配制中)以及例如颜料工业中。乳化剂可作为湿润剂，食品成分和活性成分起作用。

此外，蛋白质脂肪酸缩合物由于它们优越的生理性质适于作在例如化妆品和个人卫生产品中。例如，蛋白质酯可用于沐浴制品以及香波和身体清洁剂中。蛋白质脂肪酸缩合物也可用于药物组合物，例如作为基质。

已知蛋白质脂肪酸缩合物可用于化妆品工业中。通常，这些产品通过利用水作为溶剂，使蛋白质水解产物与脂肪酸氯化物在Schotten-Baumann条件下反应来制备。

( http：//www.scf-online.com/english/26_e/rawmaterial26_e_.htm#5).

在开发蛋白质-脂肪酸缩合物的过程中，可能将可再生来源脂肪酸(来自植物油)与蛋白质结合，其可获自动物废弃物(皮)以及来自许多植物，来构建具有疏水(脂肪酸)和亲水(蛋白质)部分的表面活性剂结构。在该过程中，脂肪酸氯化物(fatty acid chloride)与氨基酸的氨基反应，并形成蛋白质脂肪酸缩合物(见图49)。获得具有很好的皮肤相容性以及另外具有好的清洁效果的产品。

甚至加入较少的酰基化蛋白质水解产物对其它表面活性剂的皮肤相容性具有协同作用这一事实从技术配制角度来看是非常重要的。该保护作用可由该产物的两性特性来解释。蛋白质-脂肪酸缩合物与皮肤胶原之间存在相互作用。这导致保护性层的形成，其减少了表面活性剂对上皮层的过度攻击，它们强的去油效应以及阴离子表面活性剂与皮肤的直接相互作用。

在化妆品工业中，基于蛋白质的表面活性剂主要用于温和的沐浴产品(shower and bath product)，温和的香波，基于表面活性剂的洗面剂，冷-剃须制品和固定剂或婴儿用表面活性剂制品。

蛋白质水解产物脂肪酸缩合物也可用作药物制剂的基质，例如用作含有用于局部给药皮肤的活性成分的乳膏或油膏。

本发明提供无需利用脂肪酸氯化物制备蛋白质脂肪酸缩合物的新方法。本发明的反应的描述见图50。所述反应可在水或缓冲体系中在低温进行而不形成废物。

本文术语“蛋白质脂肪酸缩合物”包括所有以下物质：蛋白质酯，多肽酯，二肽酯，寡肽酯，肽酯，以及氨基酸酯。

本领域技术人员已知，碳水化合物酯(具体是糖酯)在食品工业中具有广泛的应用。其它应用领域包括化妆品，口腔护理产品，和医学用品。此外这些化合物可用作抗生素，抗肿瘤剂，杀真菌剂和杀虫剂。本发明的脂质酰基转移酶能催化在高水分环境中形成葡萄糖糖酯(图51)。

本发明制备的酯可用于以下领域：

化妆品：包括精华油乳液(essential oil emulsion)(o/w，HLB 16-18)石蜡油乳液，o/w，HLB 10-14；硬脂酸乳液；蜡乳液(wax emulsion)，o/w，HLB14-16；羊毛脂乳液，o/w，HLB 12-14；硅酮乳液；牙膏，o/w；泡沫沐浴品(foam bath)，o/w，HLB 14-18；洗发液。

药物制剂：包括药物乳剂；油膏基质；栓剂化合物，w/o；包囊化(encapsulation)；注射制剂。

农业：包括土壤改良；作为增肥添加剂(feritliser additive)；作为全能洗涤剂(all-purpose cleaner)；水果和蔬菜的洗涤物；搅乳器用清洁物。

农作物保护：包括天然存在的杀虫剂；氯化烃(chlorinated hydrocarbon)，和140；磷酸酯o/w，HLB 10-14；杀真菌剂，o/w；除莠剂，o/w。

食品工业：包括面包和蛋糕；人造黄油；巧克力；脂肪粉霜预防(fatbloom prevention)，w/o，HLB 5-10；糖霜化(sugar frosting)，o/w，HLB 14-16；焦糖(caramel)和口香糖的软化剂，w/o，HLB.2-4；粘连预防，w/o，HLB2-4；冰淇淋添加剂w/o，HLB 4-6；奶和烘焙粉的湿化，w/o，HLB 9-11；蛋奶(custard)粉，w/o，HLB 2-4；在饮料工业中；在水果和蔬菜中；在调味剂中，w/o和o/w，HLB 10-12；在肉，沙拉或其它调味酱中，o/w；在食品色素中，w/o，HLB 2-4；o/w，HLB 8-18；在泡沫抑制剂中。

利用本发明制备的蛋白质脂肪酸酯，羟基酸酯和碳水化合物酯作为食品应用中的乳化剂的益处是这些是无害的食品相容性成分，它们与其它常规使用的乳化剂例如乙氧基化的脂肪酸酯相比更容易发生生物降解。因此，这些乳化剂在食品工业和非食品工业应用中更为环保。

在一个具体实施方案中，microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗微生物剂起作用。可选地或者进一步地，microthecin酯、ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗氧化剂和/或乳化剂的来起作用。

一个实施方案中，本发明的方法和用途可用于利用脂质酰基-转移酶制备用于药物配制剂中的乳化剂，具体是用于活性成分的控制释放的产生中，其中所述活性成分是酰基化的。这种慢释放型制剂具体可用于口服给药的药物组合物，其中所述酯在消化道中的逐渐水解可逐渐释放活性成分。所述酰基化的组合物可进一步用于皮下或静脉内制剂。

另一实施方案中，本发明的方法或用途可用于制备相转移催化剂用于例如在有机反应中将盐转移到有机溶剂溶液中。例如，将酰基基团转移到适当的阳离子受体，诸如羟基酸(柠檬酸)，或可选具有阴离子受体基团，诸如羟基-胺可产生用于将盐转移到有机溶剂溶液中的相转移催化剂。

另一实施方案中，本发明的方法可用于制备具有低生物利用度和/或低溶解度的药物化合物的前药，例如抗病毒剂如阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(gangaciclovir)。所述方法可进一步用于其它具有游离羟基的药物化合物，例如伯，仲，叔羟基。

优选，本发明制备的酯可用于药物配制。

优选，本发明制备的酯可用于化妆品和/或个人卫生用品中。

优选，本发明制备的酯可用于食品和/或饲料中。

本发明的方法可以是在生产一或多种药物，化妆品，个人卫生用品，食品或饲料的方法中的一个步骤。

优点

本发明方法的一个优点是其导致一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的生产而无需利用有机溶剂。因此，本发明允许利用较少的有机溶剂或不利用有机溶剂。这具有许多优点，例如降低生产成本，降低人和/或环境的有机溶剂暴露，简化生产过程。

在用于食品应用的酯的生产中，具体优选利用脂质而不是脂肪酸，因为不必要去除过多的脂质，这是由于它们可来自利用反应产物的食品的一部分。另一方面，多余的游离脂肪酸必须被去除，这是由于它们对于大多数食品是有害的。

分离

在一方面，优选地，本发明应用的多肽或蛋白质是分离形式的。术语“分离的”意思是序列至少基本上不含有至少一种其它成分，该成分于此序列天然相结合，并在自然界发现。

一方面，优选本发明的生物转化产品例如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯分离自反应混合物。术语“分离的”指所述生物转化产物至少基本不含至少一种其它组分，所述生物转化产物在生物转化反应过程中与该其它组分结合。

纯化

在一方面，优选地，本发明应用的多肽或蛋白质是纯化的。术语“纯化的”意思是序列处于相对纯化的状态-如至少大约51％纯度、或至少大约75％纯度、至少大约80％纯度、至少大约90％纯度、至少大约95％纯度、至少大约98％纯度。

一方面，优选本发明制备的生物转化产物，例如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯自反应混合物纯化，并因此为纯化的形式。术语“纯化的”指所述生物转化产物是相对纯的状态-例如至少约51％纯，或至少约75％，或至少约80％，或至少约90％纯，或至少约95％纯或至少约98％纯。

药物组合物

本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的产物和可药用的载体，稀释剂或赋形剂(包括其组合)。

所述药物组合物可在人或兽医医学中用于人或动物并通常包含任何一或多种可药用稀释剂，载体或赋形剂。治疗用可接受的载体或稀释剂是制药领域已知的，并在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中描述。药物载体，赋形剂或稀释剂可根据目的给药途径和标准药物操作来选择。所述药物组合物可包含或另外包含，载体，赋形剂或稀释剂，任何适宜的粘合剂，润滑剂，助悬剂，包被剂，助溶剂。

防腐剂，稳定剂，染料甚至调味剂可在药物组合物中提供。防腐剂的实例包括苯甲酸钠，山梨酸，以及对羟基苯甲酸的酯。抗氧化剂和助悬剂也可使用。

根据不同的递送系统，有不同的组合物/配制要求。例如，本发明的药物组合物可配制成利用微型泵或通过粘膜突途径给药的形式，例如作为喷鼻剂或吸入气溶胶或可摄入溶液，或经胃肠外给药，其中所述组合物可配制成可注射形式用于例如经静脉内，肌内或皮下途径来递送。可选，所述配制剂可设计为通过多种途径给药。

当所述药剂经胃肠道粘膜给药时，其应当能够在通过胃肠道的过程中保持稳定；例如其应抵抗蛋白水解降解，在酸性pH稳定并抵抗胆汁的清洁作用。

适当的情况下，所述药物组合物可通过吸入给药，以栓剂或阴道栓的形式，以洗液，溶液，乳膏，油膏或粉尘的形式，通过利用皮肤贴片(pateh)，以含有赋形剂诸如淀粉或乳糖的口服片剂，或以单独或与赋形剂混合的胶囊或卵形胶囊(ovule)的形式，或以含有调味或着色剂的酏剂，溶液或悬液的形式，或它们可经胃肠外例如经静脉内，肌内或皮下注射。对于经胃肠外给药，所述组合物最好以含有其它物质的无菌含水溶液形式使用，所述其它物质例如足够的盐或单糖使得所述溶液与血液等张。对于经颊或经舌下给药，所述组合物可以以可通过传统方式配制的片剂或锭剂形式给药。

克隆编码本发明所述多肽的核苷酸序列

编码具有本文定义的具体性质的多肽或适合被修饰的多肽的核苷酸序列，可以从产生上述多肽的细胞或生物体中分离。本领域有多种不同的已知的方法分离核苷酸序列。

例如，基因组DNA和/或cDNA库可以应用由源自产生多肽的生物体的染色体DNA或信使RNA构建。如果多肽氨基酸序列是已知的，可以合成标记的寡核苷酸探针，并用于识别从生物体制备的基因组文库的多肽编码克隆。可替代的，包含与另一个已知的多肽基因同源的氨基酸序列的标记的寡核苷酸探针可以用于识别多肽编码型克隆。在后面的例子中，应用低严谨性的杂交和洗涤条件。

可替代的，多肽编码克隆能够通过将基因组DNA片段插入表达载体如质粒中进行鉴别，使用得到的基因组DNA文库转化不含酶的细菌，然后将转化后的细菌涂布于含有一种被多肽抑制的酶琼脂平皿，从而使表达多肽的克隆被鉴定。

作为另外的选择，编码多肽的核苷酸序列可以用确定的标准方法合成制备，该标准方法例如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，p1859-1869描述的亚膦酰胺(phosphoroamidite)方法，或Matthes等(1984)EMBO J.3，p 801-805描述的方法。在亚膦酰胺方法中，寡核苷酸被合成(例如在自动DNA合成器中)、纯化、退火、连接并克隆到适宜的载体中。

核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源，混合的合成与cDNA来源，或混合的基因组与eDNA来源，其可通过使用标准技术连接合成DNA、基因组DNA(genomic DNA)或cDNA来源(适当的)的片段来制备。每一个连接片段对应于整个核苷酸序列中不同的位置。DNA序列也可通过聚合酶链式反应(PCR)使用特异性的引物制备，例如US 4,683,202中所描述的或在Saiki R K等(Science(1988)239，pp 487-491)中所描述的。

核苷酸序列

本发明也包括具有这里定义的特殊性质的核苷酸序列编码多肽。这里使用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，它的变体、同族体、片段和它的衍生物(例如它的部分)。该核苷酸序列可以属于基因组的、合成的、或重组的来源，不论是代表同义链或反义链，它可以是双链的或是单链的。

关于本发明使用的术语“核苷酸序列”包含基因组DNA、cDNA、合成DNA，和RNA。优选的是DNA，更优选为编码序列的cDNA。

一个优选的实施方案中，当结合到也存在它的自然环境中的、与其相结合的序列时，编码具有本文定义具体特性的多肽的核苷酸序列本身不涵盖自然条件下存在的天然核苷酸序列。为了便于参考，我们称这种优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。在这种条件下，术语“天然核苷酸序列”是指在其自身天然环境中的完整核苷酸序列，并且条件是与其天然所结合的完整启动子可操作地连接，所述启动子也存在于其自身天然环境中。因此，本发明的多肽可以通过存在于自然生物体中的核苷酸序列表达，但是其中的核苷酸序列不受该生物体中与其天然结合的启动子的控制。

优选的多肽不是一种天然多肽。这种条件下，术语“天然多肽”是指一种处于其自身的天然环境中的完整多肽，且条件是它被其天然核苷酸序列表达。

一般地，编码具有本发明定义的具体性质的多肽的核苷酸序列可以通过重组DNA技术(即重组DNA)制备。然而，在本发明一个可选择的实施方案中，核苷酸序列的全部或部分可以应用本领域已知的化学方法合成(参考Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T etal(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。

分子进化

一旦编码酶的核苷酸序列被分离，或者推定的编码酶的核苷酸序列被鉴定，修改选定的核苷酸序列是合乎需要的，例如为了制备本发明所述的酶而使核苷酸序列突变是合乎需要的。

突变可以由合成的寡核苷酸引入。这些寡核苷酸包含位于所需的突变位点侧翼的氨基酸序列。

适宜的方法被Morinaga等在(Biotechnology(1984)2，p646-649)中公开。另一种将突变引入编码酶的核苷酸序列的方法记述在Nelson和Long的(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。

作为定点突变的替代，例如上面所述，可以随机引入突变，例如使用商业试剂盒诸如Stratagene生产的GeneMorph PCR突变试剂盒，或Clontech生产的多样化(Diversify)PCR随机突变试剂盒。EP 0 583 265涉及对基于PCRd诱变的优化，它能与突变DNA类似物(例如EP 0 866 796中描述的那些物质)的应用相结合。易错聚合酶链式反应(Error prone PCR)技术适宜于生产具有优选特征的脂质酰基转移酶变体。WO0206457涉及脂酶分子进化。

获得新序列的第三种方法是非同一的氨基酸序列的片段化，或应用任何数量的限制性内切酶，或诸如DNase I的酶，并重新组装编码功能蛋白的的全部氨基酸序列。或者，可以引入一种或多种不可识别的氨基酸序列，并在重新组装编码功能蛋白的的全部氨基酸序列的过程中引入突变。DNA改组和DNA家族改组(DNA shuffling and family shuffling)技术适宜于生产具有优选特性的脂质酰基转移酶的突变体。适宜的实现“改组”(′shuffling′)的方法被EPO 752 008、EP1 138 763、EP1 103 606公开。如US 6,180,406和WO01/34835所描述的，重排也可以与DNA突变的其它形式相结合。

因此，能在体内或在体外在核苷酸序列中产生大量的定点突变或随机突变，随后用不同的方法筛选功能改善的编码多肽。应用silico和exo介导的重组方法(见WO00/58517，US 6,344,328，US 6,361,974)，例如，分子进化能够在产生的突变体保持与已知的酶或蛋白十分低的同源性的情况下完成。这些获得的突变体与已知的转移酶具有显著的结构近似性，但是具有十分低的氨基酸序列同源性。

作为一个非限制的例子，另外地，多肽序列的突变或天然突变体能够被整合到或野生型或其它突变或天然突变体中用于生产新的突变体。这种新的突变体也被筛选出来以改善编码多肽的功能。

通过上述提到的应用和类似的分子进化方法，可在没有任何关于蛋白质结构或功能的已知知识的情况下，鉴别和选择具有优选的性质本发明所述酶的突变体，同时可产生不可预测的但有益的突变或突变体。本领域有关分子进化的应用中有很多有关酶活力优化或改变的例子。这些例子包括，但不限于以下一种或多种，优化在宿主细胞内或体外优化的表达或活性，增加酶活性，改变酶作用底物和/或产品特异性，提高或降低酶或结构的稳定性，在优选的环境条件下(例如温度、pH、酶作用底物)酶活性/特异性的改变。

应用分子进化工具可使酶发生改变以改善酶的功能，这对于本领域的技术人员是显然的。

适宜地，本发明中使用的脂质酰基转移酶可以是一种突变体，即与其亲代酶比较，可以包含至少一个氨基酸置换、缺失或添加。突变酶保持与其亲代酶至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。适宜的亲代酶可包括任何具有酯酶或脂酶活性的酶。优选地，亲代酶与Pfam00657共有序列一致。

在一个优选的实施方案中，脂质酰基转移酶突变体在GDSx、GANDY和HPT区保留或掺入至少一个或多个Pfam00657共有序列氨基酸残基。

酶，例如在水环境中无或低脂质酰基转移酶活性的脂酶可应用分子进化工具进行突变，引入或增强转移酶活性，因此产生适用于本发明的组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。

适宜地，用于本发明的脂质酰基转移酶可以是一种突变体，这种突变体与其亲代酶相比，对于极性脂质，优选磷脂和/或糖脂具有增强的酶活性。优选地，这种突变体优选对于溶解(lyso)极性脂质表现出低或无活性。对于极性脂质，磷脂和/或糖脂的增强的活性可能是水解作用和/或转移酶活性的结果。

与其亲代酶相比，用于本发明的脂质酰基转移酶突变体可能减弱了对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯的活性。

适宜地，酶突变体对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯无活性。

或者，本发明应用的酶突变体可具有增强的对甘油三酯的活性，和/或也增强对下列一种或多种物质的活性，极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。

已知的脂质酰基转移酶突变体，和一种或多种所述突变体可适用于本发明的方法和用途和/或用于本发明的酶组合物中。仅仅作为举例，在下列参考文献中描述的脂质酰基转移酶突变体可以适用于本发明：

Hilton S，Buckley JT.Studies on the reaction mechanism of a microbiallipase/acyltransferase using chemical modification and site-directedmutagenesis.J Biol Chem.1991 Jan 15；266(2)：997-1000。

Robertson DL，Hilton S，Wong KR，Koepke A，Buckley JT.Influence ofactive site and tyrosine modification on the secretion and activity of theAeromonas hydrophila lipase/acyltransferase.J Biol Chem.1994 Jan21；269(3)：2146-50。

Brumlik MJ，Buckley JT.Identification of the catalytic triad of thelipase/acyltransferase from Aeromonas hydrophila.J Bacteriol.1996Apr；178(7)：2060-4。

Peelman F，Vinaimont N，Verhee A，Vanloo B，Verschelde JL，Labeur C，Seguret-Mace S，Duverger N，Hutchinson G，Vandekerckhove J，Tavernier J，Rosseneu M.A proposed architecture for lecithin cholesterol acyl transferase(LCAT)：identification of the catalytic triad and molecular modeling.Protein Sci.1998 Mar；7(3)：587-99。

氨基酸序列

本发明还包括具有本文定义具体特性的多肽的氨基酸序列。

这里使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。

氨基酸序列可从适宜的来源制备/分离，或者可以通过合成制备或可通过应用DNA重组技术制备。

适宜地，在此处提到的氨基酸序列可通过标准技术从分离出的本文教导的多肽中获得。

以下是测定分离的多肽中确定氨基酸序列的一种适宜方法：

纯化的多肽可为冰冻干燥的，100μg冰冻干燥的原材料溶于50μl由8M尿素和0.4M碳酸氢铵组成的混合溶液中，pH8.4。溶解的蛋白质50℃变性还原15分钟，然后以氮气覆盖，添加5μl 45mM的二硫苏糖醇。经冷却至室温后，在室温，黑暗，氮气环境中加入5μl 100mM的碘乙酰胺，使半胱氨酸残基衍生15分钟。

将135μl的水与溶于5μl水的5μg赖氨酸-C内蛋白酶加入上述反应混合物，在氮气环境中37℃消化24小时。

得到的多肽通过反相HPLC在VYDAC碳-18柱(0.46×15cm；10μm；The Separation Group，California，USA)分离，使用水中的溶剂A：0.1％TFA和乙腈中的溶剂B：0.1％TFA。在氨基末端测序之前，可对选出的多肽利用相同溶液体系通过Develosil碳-18柱再进行色谱分析。可以根据生产厂家的技术说明书(Applied Biosystems，California，USA)利用脉冲液态快速循环，使用Applied Biosystems 476A序列分析仪进行测序。

序列同一性或序列同源性

本发明还涉及与具有本文定义的具体性质多肽的氨基酸序列或任何编码这种多肽的核苷酸序列的氨基酸序列(后面称为“同源序列”)具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列的用途。这里，术语“同源体”指的是与受试氨基酸序列和受试核苷酸序列具有一定同源性的实体。这里，术语“同源性”可与“同一性”等同。

同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保持功能活性和/或增强酶活性的多肽。

在本文中，指定同源序列包含与受试序列具有至少75、85或90％一致性，优选95或98％一致性的氨基酸序列。一般地，同源序列包括与受试氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可被认为是相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明的上下文中，优选以序列的同一性表述同源性。

在本发明的上下文中，指定同源序列包括与编码本发明多肽的核苷酸序列(主体序列)具有至少75，85或90％的同一性，优选95或98％的同一性的核苷酸序列。一般地，同源序列包括与受试序列相同的编码活性位点及其它的序列。虽然同源性也可被认为是相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明的上下文中，优选以序列的同一性表述同源性。

同源性比较可用肉眼进行，或更普遍的是，借助与容易获得的序列比对软件进行比较。这种市场上可买到的电脑软件可计算出两个或更多个序列之间的％同源性。

％同源性可在相邻的序列中计算，即一条序列与另一条对齐，一条序列的每一个氨基酸直接与另一条的氨基酸比较，每次一个残基。这被称为“无间隙”排列。一般地，这种无间隙排列只对相对较少数目的残基进行。

虽然这是一种非常简单和稳定的方法，但不能考虑到例如在否则同一的序列对中，插入和缺失将导致后面的氨基酸残基不能对齐，因此当总体比对已经完成时，很可能地导致同源性百分比大幅度下降。因此，为产生最佳排列而设计的许多序列比较方法考虑到可能存在的插入和缺失，而不会过分降低整体同源性得分。这是通过在序列中插入“缺口”，最大化局部同源性来实现的。

但是，这些更为复杂的方法将“缺口罚分”(″gap penalties″)赋予每一个在排列上出现的缺口，使得对于相同数目的同一性氨基酸，具有尽可能少的缺口数的比对(反映两条被比较序列之间更高的相关性)比缺口数多的比对可得到更高的分数。一般应用的“亲和缺口成本”(″Affine gap costs″)缺口的存在的罚分较高，而对缺口后的每个后续的残基罚分较少。这是最通常应用的缺口评分系统。高缺口罚分当然产生具有较少缺口的优化排列。大多数排列程序允许对缺口罚分进行更改。然而，使用这些软件进行序列比较时优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin最佳拟合(Bestfit)程序包时，缺省的氨基酸序列缺口罚分为每个缺口-12和每个延伸-4。

计算最大同源性百分比首先需要考虑到缺口罚分，产生最佳排列，实现这样排列的适宜的计算机程序是GCG Wiscons中最佳拟合程序包(Devereux等1984 Nuc.Acids Research 12 p387)。其它可进行序列对比的软件实例，包括但不仅限于，BLAST程序包(参见Ausubelet al 1999 ShortProtocols中Molecular Biology，4^th Ed-Chapter 18)，FASTA(Altschul etal 1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具组。BLAST和FASTA都可以脱机和在线检索(参考Ausubel等1999，pages 7-58 to 7-60)。然而，在一些应用中优选使用GCG最佳拟合程序。名为BLAST 2 Sequence的新工具也可以用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett1999 177(1)：187-8和tatiana & commat；ncbi.nlm.nih.gov)

尽管最终同源性百分比能够以同一性的方式测定，比对程序通常不是基于全有或全无(all-or-nothing)的成对比较。作为替代，成比例的相似性分数矩阵是普遍应用的，该矩阵为基于化学相似性和进化距离的每个配对比较分配分值。平常应用的这样一种矩阵的一个实例就是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组件的缺省矩阵。如果能提供的话(想得到进一步的纤细信息，参见用户手册)，GCG Wisconsin程序通常或应用公开的缺省值或应用定制的标记比较表。在一些应用中，优选使用GCG程序包公开的缺省值，或者在应用其它软件的情况下，使用缺省的矩阵，如BLOSUM62。

可选择地，同源性百分比可以在DNASIS^TM(日立公司软件)通过序列特征多重对比来计算，基于一种类似于CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法。

一旦软件产生了一个最佳的排列，就能够计算序列同源性百分比，优选序列同一性百分比。通常软件进行部分序列的比较，产生一个数值型结果。

序列也可以进行氨基酸残基的删除、插入或置换，这会产生一个沉默变化并导致生成一个功能上等同的物质。只要物质保持第二结合活性，考虑周全的氨基酸置换可以基于在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或亲水亲油性方面残基性质的近似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括门冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性并具有不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。

可以进行保守置换，例如下面表中所述。第二栏中同一区的氨基酸，优选第三栏中同一行的可以互相取代。

脂肪族的	非极性的	GAP
		GAP	ILV
		极性不带电核的	ILV	CSTM
	NQ			CSTM
	NQ		极性带电核的	DE
	KR			DE
	KR	芳香族的			HFWY

本发明也包含同源取代的产生，(取代和置换都为此处应用的，即用另外的残基取代现有的氨基酸残基)即相似取代，例如碱性氨基酸取代碱性氨基酸，酸性氨基酸取代酸性氨基酸，极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基到另一类或可选择地涉及非天然氨基酸例如鸟氨酸(下文中记为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文中记为B)、原亮氨酸鸟氨酸(下文中记为O)、pyriylalanine、噻吩基丙氨酸(thienylalanine)、萘基丙氨酸(naphthylalanine)和苯基甘氨酸。

取代也可以通过非天然氨基酸产生。

氨基酸序列的突变体可以包含适宜的可插入任意两个氨基酸残基序列间的间隔基团包括烷基基团诸如甲基、乙基、丙基，以及氨基酸间隔物，例如甘氨酸或丙氨酸残基。进一步的突变形式是本领域技术人员容易理解的，该突变形式包含类肽(peptoid)形式的一种或多种氨基酸残基。为了避免产生疑问，“类肽形式”用于指代变体氨基酸残基，其中α-碳取代基团在该残基的氮原子上而非α-碳上。制备类肽形式的肽是本领域已知的，例如Simon RJ等.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。

本发明中应用的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体性质的多肽的核苷酸序列可以包括合成的或修饰的核苷酸。寡核苷酸的许多不同种类的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和磷硫酰骨架和/或在分子的3′和/或5′端附加的吖啶或聚赖氨酸链。为了本发明所述的目的，本领域任何可得的方法均可以用于修饰本文描述的氨基酸序列，这是可以理解的。这些修饰可以用于提高核苷酸序列在体内的活性或延长氨基酸序列的寿命。

本发明也涉及氨基酸序列作为本文讨论的序列，或任何衍生物、片段及其衍生物的互补序列的用途。如果序列为它的片段的互补序列，那么该序列可以用作探针鉴定其它生物体中相似编码序列的存在等。

与本发明非100％同源但落入发明保护范围的多核苷酸序列，是可以通过多种途径获得的。此处描述的序列的其它突变体也可以获得，例如通过检测来自不同范围个体例如来自不同种群的个体的DNA文库。而且，其它病毒的/细菌的，或细胞的同源体特别是哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛或灵长类动物细胞)的细胞同源物可以获得，此同源体和它的片段一般而言能够选择性地与本文序列表所列的序列杂交。此序列可以通过检测其它动物物种的cDNA文库或基因组DNA文库来获得，并在中到高严谨条件下用探针探测这样的文库，所述探针包含序列表中所示任何序列的全部或部分。相似的考虑适用于获得本发明的多肽和核苷酸序列的种属同源物和等位基因突变体。

变体和菌株/种属同源体也可以应用简并PCR获得，其使用设计用来靶向变体和同源体中编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列的引物。保守序列可以例如通过比对来自数种变体/同源体的氨基酸序列来预知。序列比对可以通过本领域公知的计算机软件进行。例如广泛应用的GCGWisconsin PileUp程序。

用于简并PCR的引物可以包含一或多个简并位置，其可用于严格条件，该严格条件低于用针对已知序列的单个序列引物来克隆序列的那些严格条件。

或者，此多核苷酸能够通过特征序列的定点诱变获得。在需要例如沉默密码子序列变化来最优化密码子对其中表达多核苷酸的具体宿主细胞的偏好时，这是有用的。其它序列的变化是为了引入限制多肽识别位点，或改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。

本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可以的探针用于制备引物例如PCR引物、用于替换扩增反应的引物，探针例如通过常规方法用放射性或非放射性标记从而由暴露(revealing)标记物来标记，或者多核苷酸可以克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段可以为至少15，优选至少20，例如至少25、30或40个核苷酸的长度，也包含在本发明所用的术语多核苷酸中。

本发明所述的多核苷酸例如DNA多核苷酸和探针可以重组地制备、合成地制备或用本领域技术人员能够获得的任意有效的方法制备。它们也可以通过标准技术克隆。

一般而言，引物是用合成方法生产的，包括以一次一种核苷酸的方式所需核酸序列的分步制备方法。使用自动技术完成上述任务的技术是本领域容易获得的技术。

较长的多核苷酸通常可以用基因重组技术制备，例如应用PCR(多聚酶链式反应)克隆技术。这包含制备位于需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的引物对(例如大约15到30个氨基酸)，使该引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在使所需区域扩增的条件下进行多聚酶链式反应，分离被扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶中纯化反应混合物)并回收被扩增的DNA。引物可以被设计为包含适宜的酶识别位点限制性内切酶，以至于被扩增的DNA能够被克隆到适宜的克隆载体。

杂交

本发明也包含本发明序列的互补序列，或能够或杂交到本发明序列中或其互补序列中的序列。

本发明应用的术语“杂交”包括“通过碱基配对将核酸链连接到互补链的过程”，也就是使用多聚酶链式反应(PCR)技术的扩增过程。

本发明也涉及能够与本文讨论的受试序列的互补序列或它的任何衍生物、它的片段或其衍生物杂交的核苷酸序列的用途。

本发明也涉及与能够与本文讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。

杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)中的教导，并显示如下定义的“严格性”。

最大严格性有代表性的发生在Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)条件下；高严格性发生在大约Tm下5℃-10℃；中等严格性发生在大约Tm下10℃-20℃；低严格性发生在大约Tm下20℃-25℃。正如本领域技术人员理解的，最大严格性杂交能够用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严格性杂交能够用于鉴定或检测类似或相关的多聚核苷酸序列。

优选地，本发明包含在高严格性或中等严格性条件下能够与编码具有本发明定义具体性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列之互补序列。

更加优选地，本发明涉及能够在高严格条件(例如65℃和O.IxSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0))下与编码具有本文定义的具体性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列之互补序列。

本发明也涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括那些本文讨论的序列的互补序列)杂交的序列。

本发明也涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括那些本文讨论的序列的互补序列)杂交的序列的互补序列。

本发明也包括在中等到最大严格性条件下，能够与本文讨论的核苷酸序列杂交的多聚核苷酸序列。

在优选的方面中，本发明覆盖了能够在严格条件下(例如50℃和0.2×SSC)与本文讨论的核苷酸序列，或它的互补序列杂交的核苷酸序列。

在更加优选的方面中，本发明覆盖了能够在高严格条件下(例如65℃和0.1×SSC)与本文讨论的核苷酸序列，或它的互补序列杂交的核苷酸序列。

多肽的表达

本发明使用的或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列能够被掺入到重组的可复制载体中。该载体可以在和/或从相容的宿主细胞中复制并表达核苷酸序列为多肽的形式。表达可以用控制序列，包括启动子/增强子和其它表达调节信号来控制。可使用原核生物的启动子和在真核细胞中具有功能的启动子。可使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。也可使用嵌合的启动子，它包含的序列元件来自两种或多种上述不同启动子。

由宿主重组细胞产生的核苷酸序列表达的多肽可以依赖于使用的序列和/或载体被分泌或被包含在细胞内。编码序列可以设计成与信号序列一起，该信号序列可以引导所述物质的编码序列穿过具体的原核生物或真核生物细胞膜。

表达载体

术语“表达载体”意思是一种能够在体内或体外表达的构建体。

优选地，表达载体是掺入到生物体基因组中的。术语“掺入”优选包括稳定地掺入到基因中。

本发明的核苷酸序列或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列可以存在于载体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接到调节序列，以至于该调节序列能够通过适宜的宿主生物体表达核苷酸序列，即该载体是表达载体。

本发明的载体可以被转化到合适的下面描述的宿主细胞来表达具有本发明所限定的具体性质的多肽。

载体的选择，例如质粒、粘端质粒、病毒或噬菌体载体，常常依赖于它被引入的宿主细胞。

载体可以包含一种或多种可选标记基因-诸如提供抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，该选择可以通过共转化完成(如WO91/17243中描述的)。

载体可被用于体外，例如产生RNA或用于转染或转化宿主细胞。

因此，在一个进一步的具体实施方案中，本发明提供了一种制备本发明的核苷酸序列或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列的方法，所述方法是通过引入核苷酸序列到可复制载体中，引入该载体到适合的宿主细胞中，并在能够引起所述载体复制的条件下使所述宿主细胞生长。

载体可以进一步包含在正讨论的宿主细胞中促进载体复制的核苷酸序列。这些序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

调节序列

在一些应用中，本发明使用的的核苷酸序列或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列可以可操作地连接到能(如通过被选宿主细胞表达所述核苷酸序列的的调节序列上。例如，本发明包括这样的载体，其包含可操作连接到这样的调节序列上的本发明核苷酸序列，即该载体是表达载体。

术语“可操作连接”(″operably linked″)指并列(juxtaposition)，其中描述的组分为使它们以意图方式作用的关系。“可操作连接”到编码序列的调节序列以通过在与控制序列相容的条件下完成表达编码序列的方式来连接。

术语“调节序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。

这里使用的术语“启动子”是本领域内可常规使用的，例如RNA聚合酶结合位点。

编码具有本发明限定的具体性质的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源的调节序列来完成，例如启动子、分泌前导序列(secretionleader)和终止区。

优选地，本发明的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作连接。

指导细菌、真菌或酵母宿主内核苷酸序列转录的适宜启动子的例子是本领域公知的。

构建体

术语“构建体”与术语如“偶联物(conjugate)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，它包括编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列，其用于根据本发明直接或间接与启动子连接。间接连接的例子是在启动子和本发明核苷酸序列中间提供适宜的间隔组(spacer group)，例如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。同样，本发明的术语“融合”包括直接或间接连接。在一些方面，这些术语不包括编码通常与野生型基因启动子连接的蛋白质的核苷酸序列的天然组合并且条件是所述它们都处于它们的自然环境中。

所述构建体甚至可以包含或表达允许选择遗传构建体的标记物。

对于一些应用中，优选所述构建体包含至少本发明的核苷酸序列或编码具有本发明限定的具体性质的多肽的核苷酸，其可操作连到启动子。

宿主细胞

本发明的术语“宿主细胞”包括任何具有以下性质的细胞：其包含编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列，或者上面描述的用于重组制备具有本发明所限定具体性质的多肽的表达载体。

因此，本发明进一步的具体实施方案提供了用本发明核苷酸序列或编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。可选择与上述载体相容的所述细胞，可以例如是原核生物(如细菌)、真菌、酵母或植物的细胞。优选的宿主细胞不是人的细胞。

适合的细菌宿主生物体的例子是革兰阴性菌或革兰氏阳性菌。

依赖于编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列的性质，和/或进一步加工所表达蛋白质的需求，真核生物的宿主例如酵母或其它真菌是优选的。一般而言，酵母细胞是相对真菌细胞优选的，因为酵母细胞较容易操纵。然而，一些蛋白质或者从酵母细胞中分泌很少，或者有时没有被恰当加工(例如酵母中的高糖基化)。在这些例子中，应选择不同的真菌宿主生物体。

适宜宿主细胞，如酵母、真菌和植物宿主细胞的用途，可以提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、投石(lapidation)和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，因为可能需要使本发明的重组表达产物具有最佳生物活性。

所述宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶阴性的(minus)菌株。

生物体

本发明的术语“生物体”包括任何包含本发明所述的核苷酸序列，或包含用于编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列和/或由此获得的产物的生物体。

适宜的生物体可包括原核生物、真菌，酵母或植物。

本发明的术语“转基因生物体”包括任何生物体，所述生物体包含用于编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列和/或由此获得的产品的，和/或其中的启动子能够允许在生物体中表达用于编码具有本发明所限定具体性质的多肽的核苷酸序列。优选的核苷酸序列被掺入在生物体基因组中。

术语“转基因生物体”不包括在天然环境中的天然核苷酸编码序列，此时所述序列受同样处于天然环境中的它们的天然启动子控制。

因此，本发明转基因生物体包括含有选自如下物质之一，或其组合的生物体：用于编码具有本发明所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列，本文定义的构建体，本文限定的载体，本文限定的质粒，本文限定的细胞，或它的产物。例如，转基因生物体也包含在异源的启动子控制下用于编码具有本发明所限定的具体性质的多肽的核苷酸序列。

宿主细胞/宿主生物体转化

正如先前指出的，宿主生物体可以是原核生物体或真核生物体。适合的原核生物宿主的例子包括大肠杆菌和枯草杆菌。

原核生物宿主转化是本领域公知的，例如参见Sambrook等(MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press)。如果应用原核生物宿主，那么核苷酸序列在转化之前需要被适当修饰-例如去除内含子。

另一个具体实施方案中，转基因生物体可以是酵母。

丝状真菌细胞可以使用本领域公知的各种方法转化，例如涉及原生质体形成和原生质体转化，之后用公知的方式再生细胞壁的方法。曲霉作为宿主微生物的用途已经被EP 0 238 023公开。

另一种宿主生物体可以是植物。用于转化植物的一般技术的综述公开在Potrykus的文章中(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou的文章中(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)。进一步有关于植物转化方面的教导见于EP-A-0449375。

对于真菌、酵母和植物转化的广泛教导见下述部分。

转化的真菌

宿主生物体可以是真菌-例如丝状真菌。此类适合的宿主的例子包括属于嗜热酶属、枝顶孢霉属(Acrenomium)、曲霉属、青霉属、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)等菌属中的任意一种。

转化丝状真菌的教导可以参见US-A-5741665，它综述了转化丝状真菌和培养真菌本领域公知的标准技术。一个适用于粗糙脉孢菌(N.crassa)的范围更广的综述，例如见于Davis和de Serres的MethodsEnzymes(1971)17A：79-143中。

进一步转化丝状真菌的教导被公开在US-A-5674707中。

一方面，宿主生物体可以是曲霉属，例如黑曲霉。

本发明的转基因曲霉也可用以下方法制得，例如Turner G.1994(Vectorsfor genetic manipulation.In：Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编者)Aspergillus：50 years on.Progress中industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam1994.pp.641-666)教导的方法。

丝状真菌中的基因表达已经被公开在Punt等(2002)Trends Biotechnol2002 May；20(5)：200-6，Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306中。

转化的酵母

在另一个具体实施方案中，转基因生物体可以是酵母。

有关酵母中异源基因表达的原理的综述见于，例如Methods Mol Biol(1995)，49：341-54，和Curr Op中Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60。

从这个角度，酵母-例如酿酒酵母或毕赤酵母(Saccharomyces cerevisi orPichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(200024(1)：45-66)可以被用作异源基因表达的载体。

有关酿酒酵母异源基因表达和基因产物的分泌原理的综述见EHinchcliffe E Kenny(1993，″Yeast as a vehicle for the expression of heterologousgenes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic Press Ltd.)。

对于酵母的转化，已开发了几个试验方案。例如，本发明的转基因酵母可以通过以下Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；and Ito，H et al(1983，J Bacteriology 153，163-168)教导的方法制备。

适宜的酵母宿主生物体可以选自生物工程相关酵母种类，例如，但不限于，选自毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、Yarrowiniaspp.、酵母属(Saccharomyces spp.)包括酿酒酵母、或裂殖酵母(Schizosaccharomyce spp.)诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce pombe)。

甲基营氧(methylotrophic)酵母种的菌株巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)可以用作宿主生物体。

在一具体实施方案中，宿主生物体可以是汉逊酵母属，例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)(如在WO01/39544中公开的)。

转化的酵母细胞可以通过使用不同的选择性标记例如营养缺陷型标记显性的抗菌素抗性标记来选择。

转化的植物/植物细胞

本发明适宜的宿主生物体可以是植物。有关一般技术的综述见于Potrykus的文章(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou的文章(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)，或在WO01/16308中。例如，转基因植物可产生升高水平的植物固醇酯以及phytostanol酯。

因此，本发明也涉及生产具有提高的植物甾醇酯和phytostanol酯水平的转基因植物的方法，包含用本发明定义的脂质酰基转移酶转化植物细胞(具体是用包含本文定义的脂质酰基转移酶的表达载体或结构体)和从转化的细胞培育植物的步骤。

分泌

通常，使多肽从表型宿主分泌到培养基中是希望得到的，而酶能够很容易从所述培养基中回收。分泌前导序列可基于所需的表达宿主进行选择。杂交信号序列也在本发明中得到应用。

异源分泌前导序列的常见例子是那些源于真菌淀粉葡苷酶(AG)基因(glaA-具有18和24氨基酸，例如来自曲霉)，a-因子基因(酵母例如酵母属、克鲁维酵母属和汉逊酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的序列。

检测

本领域有多种检测和测定氨基酸序列表达的公知方案。例如包括酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和荧光活化的细胞分选法(FACS)。

本领域技术人员掌握已知多种标记和连接技术，并可以被应用在核酸和氨基酸测定方面中。

许多公司，例如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)为这些方法提供商业试剂盒和实验方案。

适宜的报道分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光素、化学发光物(chemiluminescent)、显色剂，也包括底物、辅助因子、抑制因子、磁颗粒等等类似的物质。专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850，752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241已经教导了这些标记的用途。

重组免疫球蛋白也可以如US-A-4,816,567中所述生产。

融合蛋白

具有本发明所述具体性质的多肽可以被当作融合蛋白生产，例如有助于它的提取和纯化。融合蛋白配偶体(partner)的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合区域和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以便允许去除融合蛋白序列的蛋白质序列也是方便的。优选的融合蛋白不妨碍所述蛋白质序列的活性。

大肠杆菌中的基因融合表达系统已经公开在Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)：501-6中。

本发明的另一个具体实施方案中，具有本发明所述具体性质的多肽的氨基酸序列可以连接到异源序列以便编码融合蛋白。例如，为了筛选多肽文库寻找能够影响物质活性的因子，编码表达可识别可购得的抗体的异源表位的嵌合物质是有用的。

本发明下面的部分将仅通过实施例并参照下图与实施例进行详细描述。

图1显示来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.1)；

图2显示从生物体嗜水气单胞菌中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.2)(P 10480；GI：121051)；

图3显示从生物体杀鲑气单胞菌中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(AAG098404；GI：9964017)；

图4显示从生物体天蓝色链霉菌A3(2)中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(Genebank登录号NP631558)；

图5显示从生物体天蓝色链霉菌A3(2)中得到的氨基酸序列(SEQ IDNo.5)(Genebank登录号CAC42140)；

图6显示从生物体酿酒酵母中得到的氨基酸序列(SEQ ID No.6)(Genebank登录号P41734)；

图7显示所选序列与pfam00657共有序列的比对。

图8显示SEQ ID No.3与SEQ ID No.2配对比对，其显示93％的氨基酸序列同一性。信号序列加下划线。+表示有差别。GDSX基序包括活性位点丝氨酸16，并且活性位点天冬氨酸116和组氨酸291突出显示(见于阴影区域)。氨基酸后的数字是负信号序列(minus the signal sequence)；

图9显示编码从生物体嗜水气单胞菌获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.7)；

图10显示编码从生物体杀鲑气单胞菌获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.8)；

图11显示编码从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.9)(Genebank登录号Nec003888.1：8327480..8328367)；

图12显示编码从生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.10)(Genebank登录号AL939131.1：265480..266367)；

图13显示编码从生物体酿酒酵母获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.11)(Genebank登录号Z75034)；

图14显示从生物体雷尔氏菌(Ralstonia)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.12)(Genebank登录号AL646052)。

图15显示编码从生物体雷尔氏菌获得的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.13)；

图16显示SEQ ID No.20。所述序列编码Scoel，其为NCBI蛋白质登录号CAB39707.1 GI：4539178保守的公知(hypothetical)蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图17显示如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列，其编码NCBI蛋白质登录号CAB39707.1 GI：4539178保守的公知蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图18显示SEQ ID No.22所示氨基酸序列。所述序列编码Scoe2，其为NCBI蛋白质登录号CAC01477.1 GI：9716139的保守公知蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图19显示如SEQ ID No.23所示核苷酸序列，该核苷酸序列编码Scoe2，其为NCBI蛋白质登录号CAC01477.1 GI：9716139的保守公知蛋白质[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图20显示Scoe3的氨基酸序列(SEQ ID No.24)，所述Scoe3为NCBI蛋白质登录号CAB88833.1 GI：7635996的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图21显示如SEQ ID No.25所示核苷酸序列，该核苷酸序列编码Scoe3，其为NCBI蛋白登录号为CAB88833.1 GI：7635996的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图22显示Scoe4的氨基酸序列(SEQ ID No.26)，所述Scoe4是NCBI蛋白登录号为CAB89450.1 GI：7672261的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图23显示如SEQ ID No.27所示核苷酸序列，该核苷酸序列编码Scoe4，其为NCBI蛋白质登录号CAB89450.1 GI：7672261的公知分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图24显示Scoe5的氨基酸序列(SEQ ID No.28)，Scoe5为NCBI蛋白质登录号CAB62724.1 GI：6562793的公知脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图25显示如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列，其编码Scoe5，Scoe5为NCBI蛋白质登录号CAB62724.1 GI：6562793的公知脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；

图26显示Srim1的氨基酸序列(SEQ ID No.30)，Srim1为NCBI蛋白质登录号为AAK84028.1 GI：15082088的GDSL-脂酶[龟裂链霉菌(streptomycesrimosus)]；

图27显示SEQ ID No.31所示的核苷酸序列，其编码Srim1，Srim1为NCBI蛋白登录号为AAK84028.1 GI：15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；

图28显示从嗜水气单胞菌(ATCC#7965)获得的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.32)；

图29显示编码从嗜水气单胞菌(ATCC#7965)获得的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.33)；

图30显示从杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeronionas salmonicidasubsp.Salmonicida)(ATCC#14174)获得的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.34)；

图31显示编码从杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC#14174)获得的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.35)；

图32显示气单胞菌属基因的同源物可使用国家生物技术信息中心(theNational Center for Biotechnology Information)，NIH，MD，USA的基础局部序列比对检索工具服务(basic local alignment search tool service)和完整基因组数据库鉴定。用GDSX基序作数据库搜索，而且鉴定了潜在编码具有脂解活性的酶的许多序列/基因。已从链霉菌属，黄单胞菌属和雷尔氏菌属(Ralstonia)中鉴定了基因。如下面的例子，青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)与杀鲑气单胞菌(satA)基因作比对。成对比对表现出23％的同一性。活性位点丝氨酸出现在氨基端，且可以鉴定催化性残基组氨酸和天冬氨酸。

图33显示Pfam00657.11[家族00657，数据库版本11]共有序列(此后称作Pfam共有序列)以及不同序列与Pfam共有序列的比对。箭头表示活性位点残基，加下划线的框(boxes)表示三种已由[Upton C and Buckley JT(1995)Trends Biochem Sci 20；179-179]标明的同源框。Pfam共有序列中的大写字母表示在许多家族成员中保守的残基。“-”标记表示预期在Pfam共有序列的隐藏Markov模型中发现残基而没有发现残基，因而有缺口被插入的位点。“.”标记表示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。这些序列是在图16、18、20、22、24、26、28和30中列出的氨基酸序列。

图34显示Pfam00657.11[家族00657，数据库版本11]共有序列(此后称作Pfam序列)，以及不同序列与Pfam共有序列的比对。箭头表示活性位点残基，加下划线的框表示三种已由[Upton C and Buckley JT(1995)Trends Biochem Sci 20；179-179]标明的同源框。Pfam共有序列中的大写字母表示在许多家族成员中保守的残基。“-”标记表示预期在Pfam共有序列的隐藏Markov模型中发现残基而没有发现残基，因而有缺口被插入的位点。“.”标记表示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。这些序列是在图2、16、18、20、26、28和30中列出的氨基酸序列。这些蛋白质都对脂质底物具有活性。

图35显示包含羧基末端组氨酸标记的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶基因的表达载体pet12-AsalGCAT-pSM；

图36显示用NEFA试剂盒测定法检测细胞提取物的结果，结果描述了重组杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶对卵磷脂的活性。从左至右的孔表示的是：阳性对照，阴性对照(即空质粒提取物)和IPTG诱导后保温0、1、2和3小时收集的样本。

图37显示合表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS的生长优化，其显示在30℃培养生成了对卵磷脂有高活性的酶。用NEFA试剂盒测定法来检测细胞提取物的磷脂酶活性。从左至右的孔表示的是：阳性对照；阴性对照；20℃；30℃；

图38显示与底物卵磷脂一同保温的、表达活性脂质酰基转移酶的BL21(DE3)pLysS的细胞粗提取物，反应混合物通过薄层色谱法分析，显示降解产物的存在。泳道：1.无酶；2.+A.sal-10μl 37℃；3.+A.sal-20μl 37℃；4.+A.sal-10μl 24℃；5.+A.sal-20μl 24℃；

图39所示为杀鲑气单胞菌酰基转移酶的部分纯化，其显示了与纯化的组氨酸标记蛋白相关的磷脂酶活性。SE＝超声提取物，His＝用Qiagen的Ni-NTA离心-试剂盒(spin-kit)纯化；

图40显示包含C-末端组氨酸标记的嗜水气单胞菌甘油脂质酰基转移酶(Glycerolipid Acyl Transferase)(GCAT)基因的表达载体pet12-A.h.GCAT＝pSMa，被用于转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS；

图41显示使用Non-Esterified Fatty Acid(NEFA)试剂盒(Roche，瑞士)，测定含有重组嗜水气单胞菌GCAT酶的粗提物(5 & 10μl)对卵磷脂的活性，显示存在对磷脂，卵磷脂有活性的酶；

图42显示含有表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS的生长优化，显示在30℃培养生成了对卵磷脂有高活性的酶。用NEFA试剂盒测定法来检测细胞提取物的磷脂酶活性。

图43显示嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的酰基转移酶的部分纯化，其显示了与纯化的组氨酸标记蛋白相关的磷脂酶活性。SE＝超声提取物，His＝用Qiagen的Ni-NTA自旋-试剂盒纯化；

图44显示了气单胞菌属基因在枯草芽孢杆菌163中的表达，其显示产生了对卵磷脂和DGDG均具有活性的分泌的酶。pUB-AH为包含嗜水气单胞菌基因的构建体，pUB-AS为带有杀鲑气单胞菌基因的构建体，培养物滤出液与底物保温60分钟。

图45与图46图示了脂肪酸和胆固醇酯作为时间的函数。所述图显示在利用卵磷脂和胆固醇缓冲液作为底物的条件下，食品中酰基转移酶活性测定实验的GLC分析所得结果；

图47显示在例17中用于诱变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.36)，加下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽；

图48描述了编码包含木聚糖酶信号肽的编码嗜水气单胞菌酶的核苷酸序列(SEQ ID No.54)；

图49显示氨基酸的蛋白质-脂肪酸缩合物(condensate)的结构；

图50图示了来自磷脂酰胆碱的脂肪酸在转移到具有可用于酯化的游离羟基的氨基酸例如酪氨酸或丝氨酸的游离羟基时所发生的反应；并且

图51显示DGDG与葡萄糖在脂质酰基转移酶的催化下的反应图示。

实施例

实施例1：来源于杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicida)的转移酶的克隆，序列测定和异源性表达。

所用的菌株：

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC 14174)获自ATCC，在30℃、Luria-Bertani培养基(LB)中保温过夜。对所述细胞进行离心并用Qiagen Ltd.的基因组DNA分离方法分离基因组DNA。基因组DNA缓冲液组(cat.19060)，蛋白激酶K(cat.19131)和RNAse A(cat.19101)均获自于Qiagen.Ltd(Boundarycourt Gatwick Court，West Sussex，RH10 2AX)。

宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)用于产生重组气单胞菌属酶。BL21(DE3)pLysS的感受态细胞作为用表达载体pet12-AsalGCAT-pSM转化的宿主。包含适宜质粒的转化体在37℃、含有100-μg氨苄西林每毫升的LB琼脂培养基中生长。

表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的构建：

对于来自气单胞菌属的转移酶基因的所有DNA扩增，以基因组DNA(0.2-1μl)作为模板，pfu DNA聚合酶(2.5单位)与10μl 10×pfu缓冲液，均为1μl的每一种引物(50pmol/μl)，200μM dNTP在100μl的总反应容积中一起使用。PCR反应在可程控的热循环仪中利用如下条件进行：95℃维持30秒，以95℃ 30秒、60℃ 1分钟、68℃ 2分钟循环30次。72℃再延伸5分钟。

来自杀鲑气单胞菌的转移酶基因的PCR扩增通过两个分离的PCR反应进行。PCR反应1使用以下引物对实施：as1USNEW(5′AGCATATGAAAAAATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3′[SEQ ID No.36])和asls950new(5′GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3′[SEQ ID No.37])。实施第二次PCR反应以掺入C-末端组氨酸标记，所述反应使用第一次反应的PCR产物以及以下引物进行：as1USNEW(5′AGCATATGAAAA AATGGTTTGTTTGTTTATTG GGG 3′[SEQ ID No.38])和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3′[SEQ ID No.39])。纯化第二次反应的PCR产物并利用限制性内切酶Ndel和BamHI消化。2μgpET12a载体DNA同样经限制性内切酶Ndel和BamHI消化并用磷酸酶处理。限制性内切酶处理的pET 12a与反应2的PCR产物经纯化，用快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)(Roche，Switzerland)连接。连接混合物用来转化大肠杆菌TOP10细胞。转化体铺在含有100μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基上。

T7启动子引物(5′TAATACGACTCACTATAG3′[SEQ ID No.40])和T7终止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG3′[SEQ ID No.41])用于验证pET12a载体中所克隆的转移酶基因的序列和方向。用ABI PrismBigDye^TM终止子循环测序试剂盒(Terminators Cycle sequencing kit)，以500ng质粒DNA作为模板，以及3.2pmol T7启动子和终止子引物实施DNA序列测定。

图35所示构建体用于转化感受态细菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，并且可选出氨苄西林抗性转化体用于表达分析。

重组杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的表达

用非酯化的脂肪酸(Non-Esterified Fatty Acid)(NEFA)试剂盒(Roche，Switzerland)在细胞提取物中定量对于卵磷脂的酶活性。

在图36中，包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄西林中生长，37℃振荡保温，直到OD₆₀₀＝0.6到1.0。用IPTG(0.4mM)诱导所述培养物，再保温3小时。IPTG诱导0、1、2和3小时后取样品。以卵磷脂作为底物用NEFA试剂盒检测酶活性。

用于制备活性更强的酶的生长优化

包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄西林中生长，在不同生长温度(37℃、30℃、20℃)、振荡条件下保温。产生活性脂质酰基转移酶的最适条件是当如图37所示培养物在30℃生长时。

重组杀鲑气单胞菌转移酶的部分纯化

包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生长，通过超声处理(sonification)制备细胞粗提物。重组体酶用Qiagen的Ni-NTA自旋(spin)试剂盒从经超声处理的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性。来自表达活性转移酶的BL21(DE3)pLysS的细胞粗提物与底物卵磷脂一同保温，用薄层色谱法分析反应混合物，显示降解产物的存在(参见图38)。

重组杀鲑气单胞菌转移酶的部分纯化

包含表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生长，通过超声处理制备细胞粗提物。重组酶用Qiagen的Ni-NTA自旋试剂盒从经超声处理后的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性(参见图39)。

实施例2嗜水气单胞菌转移酶在大肠杆菌中的克隆与表达

从ATCC获得的嗜水气单胞菌(ATCC#7965)，30℃、Luria-Bertani培养基(LB)中保温过夜。离心细胞并用QiagenLtd.的基因组DNA分离方法分离基因组DNA(genomic DNA)。基因组DNA缓冲液组(cat.19060)，蛋白激酶K(cat.19131)和RNAse A(cat.19101)均来自于Qiagen Ltd.(Boundary courtGatwick Court，West Sussex，RH10 2AX)。

宿主细菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)用于制备重组气单胞菌属酶。BL21(DE3)pLysS的感受态细胞作为用表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa转化的宿主。包含适宜质粒的转化体在含有100-μg氨苄西林每毫升的LB琼脂培养基中、于37℃生长。

表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的构建：

来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的转移酶基因的PCR扩增通过两个分离的PCR反应进行。

PCR反应1使用以下引物对进行：AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3′，SEQID No.42)和ahls950(5′ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3′，SEQ ID No.43)。

实施第二次PCR反应以掺入C-末端组氨酸标记，所述反应使用第一次反应的PCR产物以及以下引物进行：AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3′SEQ ID No.44，)和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3′SEQ ID No.45)。

纯化第二次反应的PCR产物并利用限制性内切酶Ndel和BamHI消化。2μg pET 12a载体DNA同样经限制性内切酶Ndel和BamHI消化并用磷酸酶处理。限制性内切酶处理的pET 12a与反应2的PCR产物经纯化，用快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)(Roche，Switzerland)连接。连接混合物用来转化大肠杆菌TOP10细胞。将转化体铺在含有100μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基上。

T7启动子引物(5′TAATACGACTCACTATAG3′)和T7终止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG3′)用于验证pET12a载体中所克隆GCAT的序列和方向。用ABI PrismBigDye^TM终止子循环测序试剂盒(TerminatorsCycle sequencing kit)，以500ng质粒DNA作为模板，以及3.2pmol T7启动子和终止子引物实施DNA序列测定。

图40所示构建体用于转化感受态细菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，并且可选出氨苄西林抗性转化体用于表达分析。

嗜水气单胞菌转移酶在BL21(DE3)pLysS中的表达

包含表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄西林中生长，37℃振荡保温，直到OD₆₀₀＝0.6到1.0。用IPTG(0.4mM)诱导所述培养物，再保温3小时。IPTG诱导0、1、2和3小时后取样品。以卵磷脂作为底物用NEFA试剂盒检测酶活性(图41)。

用于制备活性更强的酶的生长优化

包含表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄西林中生长，在不同生长温度(37℃、30℃、20℃)、振荡条件下保温。产生活性脂质酰基转移酶的最适条件是当如图42所示培养物在30℃生长时。

重组嗜水气单胞菌转移酶(GCAT)的部分纯化

包含表达载体pet12a-A.h.GCAT-pSMa的菌株BL21(DE3)pLysS在37℃生长，通过超声处理制备细胞粗提物。重组体酶用Qiagen的Ni-NTA自旋(spin)试剂盒从经超声处理的细胞粗提物进一步纯化。使用NEFA试剂盒且以卵磷脂作为底物测定磷脂酶活性(图43)。

实施例3：气单胞菌属转移酶在枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)163中的表达

质粒构建

两种不同的枯草芽孢杆菌表达载体(pUB 110&pBE5)用于气单胞菌属基因在枯草芽孢杆菌的异源表达。pUB 110载体包含α淀粉酶启动子而pBE载体含有作为融合的气单胞菌属基因的表达调节区的P32启动子。在pUB110中，气单胞菌属成熟GCAT基因的第一个氨基酸与枯草芽孢杆菌的木聚糖酶信号肽的最后一个氨基酸通过在限制酶切位点Nhe1在框内融合，在成熟蛋白之前产生两个额外的氨基酸。pBE5含有在Nco 1位点融合的cgtase信号序列，使重组蛋白质分泌入培养过滤物。

实施PCR反应获得与pUB 110和pBE5载体的信号序列框内融合的气单胞菌属基因。用下列的配对引物对嗜水气单胞菌基因进行PCR。

PCR反应1：usAHncol(5′ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3′，SEQ ID No.46)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.47)

PCR反应2：US-AhnheI(5′TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3′，SEQ ID No.48.)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3，SEQID No.49)

用下列配对引物对杀鲑气单胞菌基因进行PCR。

PCR反应3：US-Asncol(5′TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQ ID No.50)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.51)

PCR反应4：US-ASnhel(5′TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQ ID No.52)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.53)

全部PCR产物克隆到PCR blunt II(TOPO载体)中并用反向或正向测序引物测序。

来自PCR反应1和3的克隆用Nco1和Bam HI切割，作为插入物与Nco1/BamH1/磷酸酶切割的pBE5载体连接。来自PCR反应2和4的克隆用Nhe1和BamH1切割，作为插入物与Nhe1/BamH1/磷酸酶切割的pUB载体连接。

枯草芽孢杆菌中气单胞菌属转移酶基因的表达与所述酶的活性表征。

来自两种气单胞菌种的酰基转移酶已成功地在大肠杆菌中表达(结果如上)。芽孢杆菌pUB 110和pBE5基因融合构建体用来转化枯草芽孢杆菌，并通过铺在卡那霉素板上选择转化株。经分离并在2xYT中生长的卡那霉素抗性转化体能在枯草芽孢杆菌中异源表达气单胞菌基因。培养过滤物除具有酰基转移酶与磷脂酶活性外，还具有二半乳糖基二酰甘油(digalactosyldiacylglycerol)(DGDG)半乳糖脂酶活性。针对二半乳糖基二酰甘油(DGDG)的活性在将上清液与底物保温60分钟后测定，来自小麦粉的DGDG(来自Sigma)以及针对卵磷脂的活性在图44中显示。芽孢杆菌在培养基中培养过夜(20-24小时)至48小时以后作为分泌性蛋白产生。在一些情况中，气单胞菌基因的表达影响芽孢杆菌和大肠杆菌中的细胞活力和生长，因此有必要仔细选择表达菌株并优化生长条件以确保表达。例如，数种芽孢杆菌宿主菌株(B.s 163，DB104和OS 21)用表达载体转化用于生长比较。B.s163可由两种气单胞菌基因转化并具有表达活性蛋白的能力。DB104可用所有构建体转化但只有表达杀鲑气单胞菌转移酶的能力。

实施例4：大肠杆菌中产生的气单胞菌脂质酰基转移酶的发酵和纯化

大肠杆菌发酵：

微生物

本研究中使用大肠杆菌的两个菌株，一个包括嗜水气单胞菌(实施2)脂质酰基转移酶而另外的包括杀鲑气单胞菌(实施例1)脂质酰基转移酶。

包含嗜水气单胞菌基因的大肠杆菌菌株命名为DIDK0124，包含杀鲑气单胞菌基因的大肠杆菌菌株命名为DIDK0125。DIDK0124的发酵物命名为HYDRO0303并且DIDK0125的发酵物命名为SAL0302。从HYDRO025纯化的蛋白质命名为REF#138。从HYDRO0303纯化的蛋白命名为REF#135。

生长培养基与培养条件

LB-琼脂

用于维持菌株的LB-琼脂板包括：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取液，5g/LNaCl，15g/L琼脂，100mg/L氨苄西林和35mg/L氯霉素。琼脂板在30℃保温。

LB摇瓶

用于产生生物反应物培养用接种物原料的LB培养基(50mL pr摇瓶)包括：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，100mg/L氨苄西林(ampicillin)和35mg/L氯霉素(chloramphenicol)。摇瓶用LB琼脂板培养物接种，30℃、200rpm保温。

生物反应物的培养

生物反应物培养在6L内部建造的(in-built)生物反应器中进行，所述生物反应器中充满含有以下物质的4L培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取液、5g/LNaCl、8g/L KH₂PO₄、0.9g/LMgSO₄，7H₂O、40g/L葡萄糖一水合物、0.4mL/ADD APTFoamstop S中260(ADD APT Chemicals AG，Helmond，The Netherlands)、10mg/L(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O、0.7mg/LCuSO₄·5H₂O、3mg/L ZnSO₄·7H₂O、3mg/L MnSO₄·H₂O、10mg/L EDTA、0.1mg/L NiSO₄·6H₂O、0.1mg/L CoCl₂、0.1mg/L H₃BO₄、0.1mg/L KI、0.1mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、1g/L氨苄西林和35mg/L氯霉素。

在生物反应器中接种一定量的LB培养基确保在大约20小时培养后的生长终点(通过以下参数计算：最大比生长速率0.6h^-1，LB摇瓶的OD₆₀₀和生物反应器终末OD₆₀₀，其为大约20)。

SAL0302接种10mL的LB培养基，而HYDR00303接种4mL的LB培养基。

生物反应器在下列条件下操作：温度30℃，搅拌800-1000rpm(依照实验)，通气5L/min，pH 6.9，pH控制8.75％(w/v)NH₃-水和2M H₂SO₄。添加异丙基β-D-硫半乳糖苷(thiogalactoside)至终末浓度0.6mM，完成诱导，分别产生0.4摩尔(HYDR00303)和0.7摩尔CO₂。

收获

以下操作步骤用于生物质的收获与匀浆：

1)来自发酵的发酵肉汤在5000×g离心，4℃放置10分钟，弃去上清液。所述生物质用前-20℃放置保存。融化所述生物质并在500mL 20mMNaH₂PO₄，pH 7.4，500mM NaCl，10mM咪唑和完全(无EDTA)蛋白酶抑制剂(Roche，Germany)中重悬。

2)悬浮的生物质在2kbar，4℃，在来自Constant Systems公司(Warwick，UK)的细胞破裂仪(cell disrupter)中匀浆。

3)细胞碎片在10.000×g离心去除，4℃放置30分钟，收集上清液。

4)使上清液在13.700×g离心而澄清化，4℃放置60分钟，收集上清。

5)所述上清液通过0.2μm Vac Cap过滤器(Pall LifeSciences，UK)过滤，收集滤出液立即层析纯化。

转移酶的层析纯化

用50ml螯合型琼脂糖ff.凝胶填充柱(2.5×10cm)，并用镍-硫酸盐装料(charged with)(根据生产商Amersham Biosciences所述方法)。以200ml 20mM NaH₂PO₄，pH 7.4，500mM NaCl，10mM咪唑平衡柱，将400ml粗提物以5ml/min的流速加样于柱。用20mM NaH₂PO₄，pH 7.4，500mM NaCl，10mM咪唑洗柱直到UV₂₈₀达到基线，然后用40ml 20mM NaH₂PO₄，pH 7.4，500mM NaCl，500mM咪唑洗脱GCAT。

实施例5：枯草芽孢杆菌中产生的气单胞菌脂质酰基转移酶的发酵与纯化

发酵

BAC0318-19，BAC0323-24

微生物

本研究中所用的微生物来源于含有插入pUB110OIS载体中、编码杀鲑气单胞菌转移酶的基因的质粒对枯草芽孢杆菌宿主菌株#163的转化。该基因的表达受α淀粉酶启动子控制，转移酶的分泌由枯草芽孢杆菌木聚糖酶信号序列介导(实施例3)。菌株命名为DIDK0138(发酵BAC0318-19)和DIDK0153(发酵BAC0323-24)。

生长培养基及培养条件

预培养基

摇瓶(总容积500mL，有隔板)中加入100mL培养基，所述培养基包括：

NaCl 5g/L

K₂HPO₄ 10g/L

大豆粉 20g/L

酵母提取物，BioSpringer 106 20g/L

消泡剂，SIN260 5mL/L

高压灭菌前pH调整到7.0

高压灭菌后向每个摇瓶中添加6mL 50％(w/w)Nutriose。并且在高压灭菌后添加浓度50mg/L的卡那霉素。

接种

预培养摇瓶用直接来自25％(w/v)甘油储存液的冰冻培养物接种。摇瓶在33℃、175rpm保温大约16小时，取50mL接种发酵罐。

发酵

发酵在6L内部建造的发酵罐中进行。

成批发酵培养基(batch medium)(3L)包括：

玉米浆(50％dw) 40g/L

酵母提取物BioSpringer 153(50％dw) 10g/L

NaCl 5g/L

CaCl₂，2H₂O 0.25g/L

Mn(NO₃)₂，H₂O 0.2g/L

消泡剂SIN260 1mL/L

卡那霉素(经滤过灭菌处理后加入高压灭菌的发酵罐)50mg/L

进料(feed)包括：

葡萄糖一水合物 540g/kg

MgSO₄，7H₂O 4.8g/kg

消泡剂SIN260 4mL/kg

酵母提取物，BioSpringer 153(50％dw) 150g/kg

(分别高压灭菌)

根据下列方程式，发酵BAC0318和BAC0323中的进料基于蓄积的CO₂开始：

进料率-流率(flow)[g/h]＝0，AcCO₂＜0.15

进料率-流率[g/h]＝2.85+t·1.54，AcCO₂≥0.15和t＜12

进料率-流率[g/h]＝21.3，t＞12

t：从蓄积的CO₂(AcCO₂)达到0.15摩尔的点开始的时间(小时)。

根据下列方程式，发酵BAC0319和BAC0324中的进料基于蓄积的CO₂开始：

进料率-流率[g/h]＝0，AcCO₂＜0.15

进料率-流率[g/h]＝2.0+t·1.08，AcCO₂≥0.15和t＜12

进料率-流率[g/h]＝15，t＞12

t：从蓄积的CO₂(AcCO₂)达到0.15摩尔的点开始的时间(小时)。

加入12.5％(w/v)氨水或2M磷酸使pH值控制在7.0。

通气量为3L/min对应1vvm。

温度33℃。

发酵罐配备有相距10cm的两个8cmRushton推进器(impeller)。

收获

在室温16,000×g离心10分钟，去除生物质。上清液经过滤灭菌，滤出液用于纯化和应用试验。

实施例6：“经缓冲的底物中的转移酶实验”用于测定酶的酰基转移酶活性

从杀鲑气单胞菌分离脂质酰基转移酶，并在枯草芽孢杆菌中表达。该酶在形成胆固醇酯过程中将脂肪酸从卵磷脂转移到胆固醇非常有效。还显示，该酶具有一些水解活性，这通过游离脂肪酸的形成观察。常规磷酯酶(EC3.1.1.4和EC3.1.1.32)具有在形成游离脂肪酸和溶血卵磷脂过程中水解卵磷脂的能力，对于这些酶没有转移酶反应的报道。

我们详细描述了能够测定酶的转移酶和水解活性的实验，并由此鉴定本发明的脂质酰基转移酶，所述实验利用含有卵磷脂和胆固醇的底物。在该研究中，使用基于分散在缓冲液中的磷脂酰胆碱和胆固醇的底物。反应产物的定量通过从所述底物提取脂质并随后对该脂质组分进行GLC分析来进行。

步骤

材料

L-α-磷脂酰胆碱95％(植物)Avanti no.441601

胆固醇：Sigma cat.C 8503

胆固醇基棕榈酸酯(Cholesteryl Palmitate)，Sigma C 6072

胆固醇基硬脂酸酯(Cholesteryl Stearate)，Sigma C 3549

HEPES缓冲液Sigma cat.No.H 3375

氯仿，分析级.

酶

纯化的GCAT来自杀鲑气单胞菌#178-9

TLC分析。

TLC-板在加热箱中(110℃)活化h.

将100ml分离缓冲液(running buffer)倾倒入有盖层析小室。所述小室的壁覆盖有滤纸(Whatman 2)以用溶剂蒸气饱和所述小室。

将TLC-板置于框架中(in frame)并将样品加于TLC板2cm自底部。将该TLC板置于具有分离缓冲液的TLC小室中。当分离缓冲液的高度达到距离底部14cm时，将该TLC板取出并在烘板上干燥，然后置于加热箱中110℃、10分。

随后将该TLC-板浸于展开剂中，然后在加热箱中干燥110℃、15分。

分离-缓冲液：

Nr.IV：氯仿∶甲醇∶H₂O(65∶25∶4)

Nr.I：P-醚∶MTBE∶乙酸(60∶40∶1)

展开缓冲液(钒酸盐-缓冲液)：

32g Na₂CO₃ ad 300ml H₂O(1M)

将18.2g五氧化二钒(V₂O₅)加入，轻柔搅拌使其溶解。

将所述溶液冷却至室温。

小心加入460ml 2.5M H₂SO₄.(460ml H₂O+61ml H₂SO₄)

加入水至1000ml。

GLC分析

Perkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph，其配备有WCOT融合的硅柱12.5m×0.25mm ID×0.1μ薄膜厚度5％苯基甲基硅酮(phenyl-methyl-silicone)(CP Sil 8 CB来自Chrompack)。

载气：氦

注射器.PSSI冷裂注射(cold split injection)(最初温度50℃加热到385℃)，体积1.0μl

检测器FID：395℃

烘箱程序： 1 2 3

烘箱温度，℃. 90 280 350

等温，时间，分钟. 1 0 10

温度比，℃/min. 15 4

样品制备：30mg样品溶于9ml 2∶1庚烷：吡啶，其含有内部标准十七烷，0.5mg/ml。将300μl的样品溶液移到曲管形瓶(crimp vial)s，添加300μlMSTFA(N-甲基N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid))，60℃反应20分钟。

计算：甘油单-二-三酯(mono-di-triglycerides)和游离脂肪酸的反应因子(response factor)通过标准2(单-双-甘油三酯)确定，胆固醇，胆固醇基棕榈酸酯(Cholesteryl palmitate)和胆固醇基硬脂酸酯的反应因子通过纯化的参考物质(称重纯化物质10mg)来确定。

结果：基于磷脂酰胆碱和胆固醇作为底物的转移酶测定。

在下文中，转移酶的转移酶活性在基于磷脂酰胆碱和胆固醇的底物中根据以下方法测定。

450mg磷酸卵磷酯(＞95％PC Avanti产品号441601)和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥。300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到一Wheaton玻璃杯中并且添加15ml 50mM HEPES缓冲液pH 7。在搅拌过程中脂质分散到缓冲液中。

底物用磁力搅拌器混和同时加热至35℃，添加0.25ml酶溶液。这是含水量大约95％的高水分量环境。

在反应0，5，10，15，25，40和60分钟后取出2ml样品。立即添加25μl 4M HCl以酸化游离脂肪酸，终止酶反应。添加3.00ml氯仿。将样品在Whirley中剧烈摇晃振摇30秒。将样品离心，分离2ml氯仿相并用0.45-μm的滤纸过滤，进入10ml涂焦油的Dram玻璃杯中。在60℃氮蒸汽条件下蒸发氯仿。并再次称量样品。提取的脂质通过GLC分析。

GLC分析结果如图17所示。结果以所提取脂质的百分比计算。形成的脂肪酸和胆固醇酯的数量作为时间的函数，如图45所示。从图45推断酶反应作为时间的函数不是线性的，因为可观察到最初的水解和转移酶活性较高。在大约10分钟之后，大约60分钟之前，反应显示出脂肪酸和胆固醇酯的形成与时间的线性关系。因此决定以这种时间间隔观察酶反应。

表1

分钟	0	5	10	15	25	40	60
分钟	0	5	10	15	25	40	60
胆固醇，％	10.064	8.943	8.577	8.656	8.102	7.856	7.809
胆固醇，％	10.064	8.943	8.577	8.656	8.102	7.856	7.809	胆固醇酯，％	0.000	1.571	2.030	2.058	2.282	2.659	3.081
总FFA，％	0.260	1.197	1.239	1.466	2.445	2.943	3.940	胆固醇酯，％	0.000	1.571	2.030	2.058	2.282	2.659	3.081

根据已知的反应混合物中的脂质含量与添加的酶量可计算脂肪酸和胆固醇酯的生成量，用μmol/ml酶表示(表18与图58)

表2

分钟	10	15	25	40	60
分钟	10	15	25	40	60		μmol/ml	μmol/ml	μmol/ml	μmol/ml	μmol/ml
总FFA	58.1	68.7	114.6	138.0	184.7		μmol/ml	μmol/ml	μmol/ml	μmol/ml	μmol/ml
总FFA	58.1	68.7	114.6	138.0	184.7	胆固醇酯	88.8	90.0	99.3	115.6	133.8

从表2的结果和图46的曲线斜率，可以计算出作为时间函数的脂肪酸和胆固醇酯的数量，用μmol/min每ml酶表示。

水解活性与转移酶活性的计算如表3所示。用在上文描述的％酰基转移酶活性的测定方案测定相对转移酶活性。

表19

水解活性(脂肪酸)	2.52	μmol/min每ml酶
水解活性(脂肪酸)	2.52	μmol/min每ml酶	转移酶活性(胆固醇酯)	0.94	μmol/min每ml酶
总活性	3.45	μmol/min每ml酶	转移酶活性(胆固醇酯)	0.94	μmol/min每ml酶
总活性	3.45	μmol/min每ml酶

相对转移酶活性	27.1	％
相对转移酶活性	27.1	％	相对水解活性	72.9	％

其它酶的转移酶活性筛选

上面提到的方法用来筛选不同脂解酶的转移酶活性和水解活性。检测的酶如表4所示。

表4

		1	2	3	4	5
		1	2	3	4	5	底物	ml	15	15	15	15	15
#178-9的转移酶杀鲑气单胞菌PLU-7/ml	ml	0.25					底物	ml	15	15	15	15	15
#178-9的转移酶杀鲑气单胞菌PLU-7/ml	ml	0.25					5％#3016，LIPOPAN^F(尖镰孢)	ml		0.25
5％细毛嗜热霉	ml			0.25			5％#3016，LIPOPAN^F(尖镰孢)	ml		0.25
5％细毛嗜热霉	ml			0.25			5％皱落念珠菌(Candida rugosa)#2983	ml				0.25
5％柱状念珠菌(Candida cylindracea)#3076	ml					0.25	5％皱落念珠菌(Candida rugosa)#2983	ml				0.25

包含300mg磷脂酰胆碱/胆固醇的底物分散到50mM pH 7.0的HEPES缓冲液中，搅拌下加热至35℃，添加酶溶液，搅拌样品并将其维持在35℃。以规律的时间间隔取出样品并用氯仿提取。分离的脂质用GLC分析，结果如表21所示。

表5

样品
样品									1	转移酶178-9
	分钟	0	5	10	15	25	40	60	1	转移酶178-9
	分钟	0	5	10	15	25	40	60		FFA	1.216	2.516	2.983	2.62	2.894	3.448	3.911
	胆固醇	7.547	6.438	6.365	6.15	6.136	5.936	5.662		FFA	1.216	2.516	2.983	2.62	2.894	3.448	3.911
	胆固醇	7.547	6.438	6.365	6.15	6.136	5.936	5.662		胆固醇酯	0	1.835	2.177	2.44	2.58	2.851	3.331
										胆固醇酯	0	1.835	2.177	2.44	2.58	2.851	3.331
									2	尖镰孢(LIPOPAN^F)	0	5	10	15	25	40	60
	FFA	1.216	1.345	1.796	1.95	2.487	2.424	2.977	2	尖镰孢(LIPOPAN^F)	0	5	10	15	25	40	60
	FFA	1.216	1.345	1.796	1.95	2.487	2.424	2.977		胆固醇	7.547	7.309	7.366	7.33	7.429	7.341	7.326
	胆固醇酯	0	0.26	0.386	0.35	0.267	0.36	0.394		胆固醇	7.547	7.309	7.366	7.33	7.429	7.341	7.326
	胆固醇酯	0	0.26	0.386	0.35	0.267	0.36	0.394
3	细毛嗜热霉	0	5	10	15	25	40	60
3	细毛嗜热霉	0	5	10	15	25	40	60		FFA	1.216	0.853	0.875	1	0.896	1.105	1.009
	胆固醇	7.547	7.384	7.639	7.63	7.675	7.603	7.529		FFA	1.216	0.853	0.875	1	0.896	1.105	1.009

	胆固醇酯	0	0	0	0	0	0	0
	胆固醇酯	0	0	0	0	0	0	0
4	皱落念珠菌(#2938)	0	5	10	15	25	40	60
4	皱落念珠菌(#2938)	0	5	10	15	25	40	60		FFA	1.216	0.982	0.987	1.02	1.135	1.131	1.15
4	胆固醇	7.547	7.438	7.656	7.66	7.638	7.575	7.585		FFA	1.216	0.982	0.987	1.02	1.135	1.131	1.15
4	胆固醇	7.547	7.438	7.656	7.66	7.638	7.575	7.585		胆固醇酯	0	0	0	0	0	0	0
										胆固醇酯	0	0	0	0	0	0	0
									5	柱状念珠菌(#3076)	0	5	10	15	25	40	60
	FFA	1.216	1.032	1.097	1.07	1.203	1.131	1.43	5	柱状念珠菌(#3076)	0	5	10	15	25	40	60
	FFA	1.216	1.032	1.097	1.07	1.203	1.131	1.43		胆固醇	7.547	7.502	7.425	7.65	7.619	7.502	7.411
	胆固醇酯	0	0	0	0	0	0	0		胆固醇	7.547	7.502	7.425	7.65	7.619	7.502	7.411

从GLC分析可以观察到只有脂质酰基转移酶(178-9)产生大量的胆固醇酯和脂肪酸。并观察到来自尖镰孢的磷脂酶使得游离脂肪酸量稳定增加，仅最初有少量的胆固醇酯形成，但是并未观察到胆固醇酯作为时间函数的增高。

根据已知脂质底物的量与GLC分析，可以基于得自10到60分钟反应时间的结果计算出相对转移酶活性和相对水解活性。转移酶178-9和尖镰孢脂酶的结果如表6所示。其它被检验的酶不表现活性。

表6

	转移酶178-9	尖镰孢
	转移酶178-9	尖镰孢	水解活性，微摩尔/分钟每毫升酶	1.03	0.96
转移酶活性，微摩尔/分钟每毫升酶	0.40	0.01	水解活性，微摩尔/分钟每毫升酶	1.03	0.96
转移酶活性，微摩尔/分钟每毫升酶	0.40	0.01	总活性，微摩尔/分钟每毫升酶	1.43	0.98
			总活性，微摩尔/分钟每毫升酶	1.43	0.98
			相对水解活性	71.8	98.7
相对转移酶活性	28.2	1.3	相对水解活性	71.8	98.7

表6所示结果证实脂质酰基转移酶(样品178-9)具有显著的转移酶活性。同样也观察到相对转移酶活性与表3所示实验十分一致。

然而观察到来自尖镰孢的磷脂酶具有很低的转移酶活性。转移酶活性非常低以至于其落在分析的不确定性中。正如意料中一样，尖镰孢的磷脂酶具有显著的水解活性。

结论

基于纯化的磷脂酰胆碱和胆固醇的人造底物作为测定杀鲑气单胞菌转移酶活性的底物。在反应时间10到60分钟之间，游离脂肪酸与胆固醇酯形成作为时间的函数呈现几乎线性。基于反应时间10到60分钟之间的活性，可计算出水解活性与转移酶活性。

本测定方法中的底物浓度相对低于蛋黄中而言较低，而含水量相对较高。

根据来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(这种情况中是GCAT)在缓冲液中的人造底物磷脂酰胆碱/胆固醇中的实验的结果，推论这种酶在含水量很高的体系中也具有很好的转移酶活性。

可利用缓冲液中的磷脂酰胆碱/胆固醇实验来测定酶的转移酶活性和水解活性。缓冲液中的磷脂酰胆碱/胆固醇仅在某一时间范围内呈线性。

实施例7：来源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的固定化

来源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶(本例中为GCAT)通过丙酮的沉淀作用固定在Celite 535 535(来自Fluka)上。20mM pH7的TEA缓冲液中的10ml酶溶液与0，1克Celite 535 535(来自Fluka)在室温缓慢搅拌2小时。

在持续搅拌过程中加入50ml冷丙酮。

沉淀物通过在5000g离心1分钟分离。

沉淀物用20ml冷丙酮洗涤2次。

Celite在环境温度干燥1小时

所述酶在含水量高(6-89％)的环境中具有高的活性，所述转移酶和用于本发明的其它转移酶因此也可用于固定化的酶在含水量高的应用中。这就允许在利用转移酶的脂质生物转化中替代目前的固定化的脂酶。

实施例8：来自嗜水气单胞菌的脂质酰基转移酶变体(Ahyd2)(SEQ ID No.36(参见图47)

用来自Stratagene，La Jolla，CA 92037，USA的QuikChange^Multi-SiteDirected Mutagenesis试剂盒引入突变，按Stratagene提供说明进行。

变异位于酪氨酸256的变体表现出对磷脂的活性增加。

变异位于酪氨酸256和酪氨酸260的变体显示对半乳糖脂的活性增加。

变异位于酪氨酸265的变体显示对作为酰基供体的半乳糖脂的转移酶活性增加。

编号指示在下列序列中的位置：来自嗜水气单胞菌的酶，其氨基酸序列如图47 SEQ ID No.36所示(加下划线的氨基酸表示木聚糖酶信号肽)。核苷酸序列如图48中SEQ ID No 54所示。

实施例9“低水分环境中的测定法”

脂解酶在低含水量环境中的转移酶反应。

方法

材料

胆固醇Sigma cat.C 8503

L-α-磷脂酰胆碱95％(植物)Avanti#441601

大豆油，Aarhus United，DK.

氯仿，分析级

酶

#179，GCAT，来自杀鲑气单胞菌

#2427，磷脂酶A1，来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)。LIPOPANF来自Novozymes，Denmark

#1991，来自胰腺的磷脂酶A2，LIPOMOD 22L来自Biocatalysts，UK

#2373，南极念珠菌(Candida antarctica)脂酶，Novozyme 525 L来自Novozymes Denmark.

酶测定

通过在搅拌过程中加热到60℃，使13.1％卵磷脂与6.6％胆固醇溶于大豆油

用20ml Wheaton玻璃杯称量底物并加热到46℃

添加水与酶溶液并开始计时

以规律间隔将50mg样品转移到10ml Dram玻璃杯中并冷冻

分离出的脂质通过GLC分析

GLC分析

GLC分析方案-见实施例6

结果

实验设计如表8所示

将以含有13.1％卵磷脂与6.6％胆固醇的大豆油为基础的底物加热到46℃。添加酶溶液并开始计时。

反应30，60和120分钟后，取样品做GLC分析。

表33

		1	2	3	4	5
		1	2	3	4	5	底物转移酶#179-C72，56PLU-7/ml#2427，200PLU-7/ml胰腺PLA 2#1991 6300PLU/mlNovozyme 525L，#2373，200 LIPU/ml水％水	克mlmlmlmlml	50.36	50.36	50.36	50.36	50.36

GLC结果如表9所示。结果以基于总样品组分的百分比表示。以GLC结果为基础，可计算出相对不加酶的对照样品，通过酶反应产生的脂肪酸与胆固醇酯的量。在这样的实验条件下，总体酶活性可以作为水解活性(通过游离脂肪酸形成测定)与转移酶活性(通过胆固醇酯形成估计)来评价。从这些结果以及脂肪酸与胆固醇酯的分子量信息可计算出相对摩尔水解活性与相对摩尔转移酶活性，如表10所示。

表9

酶	反应时间分钟	脂肪酸％	胆固醇％	胆固醇酯％
酶	反应时间分钟	脂肪酸％	胆固醇％	胆固醇酯％	对照#179#179	1203060	0.5330.7700.852	7.0945.7615.369	0.0002.2292.883

#179#2427#2427#2427#1991#1991#1991

12030601203060120

0.8763.2693.4203.7102.8713.5783.928

4.9007.0947.0947.0947.0947.0947.094

3.6670.0000.0000.0000.0000.0000.000

表10

酶	反应时间分钟	产生的脂肪酸	消耗的胆固醇	产生的胆固醇酯	水解活性％	转移酶活性％
酶	反应时间分钟	产生的脂肪酸	消耗的胆固醇	产生的胆固醇酯	水解活性％	转移酶活性％	#179#179#179#2427#2427#2427#1991#1991#1991#2373#2373#2373	3060120306012030601203060120	0.2380.3190.3432.7372.8873.1772.3383.0463.3950.8850.8881.383	1.3341.7252.1950.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000	2.2292.8833.6670.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000	202118100100100100100100100100100	807982000000000

结论

在这些实验中可观察到所有检测酶都表现有水解活性，这是由于脂肪酸数量增加。但只有来自杀鲑气单胞菌的GCAT表现出转移酶活性。因此推论在具有含6％水的卵磷脂与胆固醇的油性体系中，来自尖镰孢的磷脂酶A1，来自胰腺的磷脂酶A2和来自南极念珠菌的脂酶只显示水解活性。

实施例10：利用本发明的脂质酰基转移酶制备蛋白质酯

脂肪酸诸如蔗糖酯和葡萄糖酯的碳水化合物酯通常通过使脂肪酸或脂肪酸皂以及碳水化合物在高温反应制备(Journal of the Americal Oil Chemists’Society(1978)55；4；398-401)。但该方法的缺点在于形成副反应和有色的副产物。

本发明中，脂肪酸的碳水化合物酯通过转移酶反应利用卵磷脂作为脂肪酸供体及碳水化合物如葡萄糖作为受体分子来制备。

该反应在流动反应器(flow reactor)中利用固定在固体支持物上的脂质酰基转移酶进行。

方法

在搅拌下将100g葡萄糖溶于1000ml水，然后将200g磷脂酰胆碱在搅拌下分散到该水相中并加热到40℃。

调节pH到pH6.5.

在流动反应器中充满100g固定在固体支持物上的、来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶。

将该流动反应器置于加热箱40℃。

将该反应混合物以2ml/min泵入该柱。

收集反应产物。

反应产物中的水通过薄膜真空蒸发(thin film vacuum evaporation)去除并分离脂质。

葡萄糖酯通过溶剂分级自脂质分离。

碳水化合物酯可用于多种用途中，诸如食品和非食品工业中的有效乳化剂。

实施例11-利用本发明的脂质酰基转移酶制备蛋白质酯

本发明中，氨基酸，肽或蛋白质的脂肪酸缩合物通过转移酶反应制备。在该反应中，磷脂酰胆碱用作供体将脂肪酸转移到氨基酸(诸如酪氨酸，丝氨酸或苏氨酸)的游离羟基，所述氨基酸具有可用于酯化的游离羟基。

方法1.

50g 1-酪氨酸(或丝氨酸或苏氨酸)在搅拌下溶于1000ml水，在搅拌中将200g磷脂酰胆碱分散于水相，并加热到40℃。

pH调节到pH7，并用NaOH或HCl维持该pH。

加入50ml来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶，并在搅拌下使该反应在40℃继续。

间隔规律的时间取样，并通过TLC以及HPLC分析。

20h反应时间后，该反应到达平衡并终止反应。

酪氨酸脂肪酸缩合物，卵磷脂及溶血卵磷脂通过离心自该反应介质分离，所述离心根据标准方法(见“Centrifiges，Filtering”中Ullmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry for example(2002)by Wiley-VCH VerlagGmbH & Co.KgaA)实施。

酪氨酸脂肪酸缩合物进一步通过疏水反应柱层析纯化并且分离含有酪氨酸脂肪酸缩合物的级分，通过蒸发去除溶剂。(见‘Basic Principles ofChromatography‘中Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry(2002)通过Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA.)

方法2

下文中，脂质酰基转移酶的转移酶活性在基于磷脂酰胆碱及1-酪氨酸的底物中根据以下方法测定。

在Wheaton玻璃杯中称量450mg磷脂酰胆碱(＞95％ PC Avanti产品号441601)及50mg 1-酪氨酸，并加入15ml 50mM HEPES缓冲液pH7。在搅拌下使脂质分散于缓冲液中。

磁力搅拌同时将该底物加热到35℃，并加入0.25ml 10 PLU/ml的转移酶。

0，5，10，15，25，40及60分钟的反应时间后取出2ml样品。

立即加入25μl 4M HCl以酸化该游离脂肪酸并终止酶反应。加入3.00ml氯仿，在Whirley上剧烈振摇所述样品30秒。对该样品进行离心，并分离2ml氯仿相，通过0.45-μm滤纸过滤到10ml tared Dram玻璃杯中。

在氮气流条件下、60℃蒸发氯仿，再次称量所述样品。提取的脂质通过TLC分析。

实施例12-利用本发明的脂质酰基转移酶制备羟基酸酯(具体是乳酸酯)

脂肪酸的羟基酯通常由反应脂肪酸和羟基酸之间的反应在高温利用无机盐或金属离子作为催化剂制备(见例如Bailey’s Industrial Oil及FatProducts，Fifth edition，Volume 3.Edible Oil及Fat Products：Products及Application Technology，page 502-511.)。但是该方法的缺点在于会形成副反应以及有色副产物。

本发明中，羟基酸酯脂肪酸利用卵磷脂作为脂肪酸供体及羟基酸(具体是乳酸酯)作为受体分子通过转移酶反应制备。

方法.

50g lactic在搅拌下溶于1000ml水，在搅拌中将200g磷脂酰胆碱分散于水相，并加热到40℃。

将pH调节到pH 7，并用NaOH或HCl维持该pH。

间隔规律的时间取样，并通过TLC以及HPLC分析。

20h反应时间后，该反应到达平衡并终止反应。

乳酸酯，卵磷脂及溶血卵磷脂通过离心自该反应介质分离，所述离心根据标准方法(见“Centrifiges，Filtering”中Ullmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry for example(2002)by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KgaA)实施。

乳酸酯进一步通过分子蒸馏来纯化，获得具有高纯度的乳酸酯脂肪酸。

实施例13-利用本发明的脂质酰基转移酶制备柠檬酸酯

基于底物磷脂酰胆碱柠檬酸的转移酶测定

下文中，来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的转移酶活性在基于磷脂酰胆碱及1-酪氨酸的底物中根据以下方法测定。

在Wheaton玻璃杯中称量450mg磷脂酰胆碱(＞95％PC Avanti产品号441601)及50mg柠檬酸，并加入15ml 50mM HEPES缓冲液pH 7。在搅拌下使脂质分散于缓冲液中。

磁力搅拌同时将该底物加热到35℃，并加入0.25ml 10 PLU/ml来自杀鲑气单胞菌的转移酶。

0，5，10，15，25，40及60分钟的反应时间后取出2ml样品。

上面说明书中提及的所有公开的内容包含在本文中作为参考。本发明方法和体系的不同修饰和改变对于本领域普通技术人员来说是清楚的而不会偏离本发明的范围和精神。尽管本发明根据优选的具体实施方案进行了描述，但本发明权利要求保护的范围不应该不适当地限于这些特殊的具体实施方案是可以理解的。事实上，对用于实现发明的所述模式的各种修饰对于生物化学领域和生物工程学领域或相关领域的普通技术人员来说是清楚明白的，意图包含在下面的权利要求的保护范围内。

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¹当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。

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1 指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。

2 对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。

3 用打叉表示选定。

IV.实施存活性检验的条件⁴
IV.实施存活性检验的条件⁴
V.国际保藏单位
V.国际保藏单位	名称：NCIMB Ltd.地址：23 St Machar DriveAberdeenAB24 3RYScotland	能代表国际保藏单位或被授权的官员的人的签名：日期：2004年1月9日

4 如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。

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丹尼斯科公司(Danisco A/S) 存活证明

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DK-1001 Copenhagen 藏单位根据细则10.2出具

丹麦

应接到此存活证明的

单位的名称和地址

3 用打叉表示选定。

IV.实施存活性检验的条件⁴
IV.实施存活性检验的条件⁴
V.国际保藏单位
V.国际保藏单位	姓名：NCIMB Ltd.地址：23 St Machar DriveAberdeenAB24 3RYScotland	能代表国际保藏单位或被授权的官员的人的签名：日期：2004年1月9日

4 如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。

Claims

1.制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的方法，所述方法包括将酰基供体，酰基受体与水混合以产生含5-98％水的高水分环境，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组成的组中的一或多种物质；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种：醇解或酯基转移作用。

2.权利要求1的方法，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。

3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括纯化所述碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯，羟基酸酯。

4.权利要求1-3之一的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征是，其为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S。

5.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。

6.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生物体获得：气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。

7.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQ ID No.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。

8.脂质酰基转移酶用于制备碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯中一或多种酯的用途，所述制备通过对酰基供体，酰基受体与水的混合物的醇解和/或酯基转移作用进行催化来实施，所述混合物包含5-98％水，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组成的组中的一或多种物质。

9.权利要求8的用途，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。

10.权利要求8的用途，其中所述碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯是经纯化的。

11.权利要求8-10之一的用途，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种残基：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S。

12.权利要求8-11之一的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。

13.权利要求8-12之一的用途，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生物体获得：气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。

14.权利要求8-13之一的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQ ID No.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。

15.碳水化合物酯，其通过权利要求1-7之一的方法产生。

16.蛋白质酯，其通过权利要求1-7之一的方法产生。

17.蛋白质亚基酯，其通过权利要求1-7之一的方法产生。

18.羟基酸酯，其通过权利要求1-7之一的方法产生。

19.固定化的脂质酰基转移酶。

20.权利要求19的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种残基：L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S。

21.权利要求19或20的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。

22.权利要求19-21之一的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生物体获得：气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。

23.权利要求19-22之一的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.12，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22，SEQ ID No.24，SEQ ID No.26，SEQ ID No.28，SEQ ID No.30，SEQ ID No.32，或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75％或者75％以上同一性的氨基酸序列。