CN1898391A - 油的酶促处理 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从食用油中减少和/或去除甘油二酯的方法，包括a)将食用油与酰基受体底物和不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶混合，其中该不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。优选地，甘油二酯：甘油酰基转移酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是如下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一种或多种。此外，本发明涉及不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在食用油加工中的用途，用于从所述食用油中减少和/或去除(优选选择性地减少和/或去除)甘油二酯，以及所述酶在包含食用油的食品加工中的用途，用于改进所述食品的结晶特性，该酶表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。
Description
相关申请的参照
本申请参考了如下相关申请：1999年7月20日提交的美国专利申请流水号09/750,990；美国专利申请流水号10/409,391；2003年7月23日提交的美国专利申请流水号60/489,441；2003年1月17日提交的英国专利申请号GB 0301117.8；2003年1月17日提交的英国专利申请号GB 0301118.6；2003年1月17日提交的英国专利申请号GB 0301119.4；2003年1月17日提交的英国专利申请号GB 0301120.2；2003年1月17日提交的英国专利申请号GB 0301121.0；2003年1月17日提交的英国专利申请号GB 0301122.8；2003年12月24日提交的英国专利申请号GB 0330016.7；和2004年1月15日提交的国际专利申请号PCT/IB2004/000655。这些专利申请的每一份以及每一份这些专利申请中引用的每一篇文献(“申请引用文献”)以及在申请引用文献中参考或引用的每一篇文献(无论在正文中或者在这些申请的审查过程中)，以及在这些审查过程中用于支持专利性的所有论据，均在此引入作为参考。本申请正文中也引用了多份文献(“本文引用文献”)。本文引用文献以及在本文引用文献中引用或参考的每一篇文献均在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及用于从食用油中酶促去除和/或减少甘油二酯(优选1，2-甘油二酯)的新方法。
技术背景
油和脂肪是三酰甘油(TAG)、二酰甘油(DAG)、游离脂肪酸和其他次要组分的复杂混合物。这些混合物的结晶取决于TAG的特性(结构、链长度、饱和与不饱和比率等等)以及这些TAG彼此之间的相互作用。至于DAG的存在，先前的研究表明它们对油和脂肪的物理特性具有重大影响。它们在结晶率、多晶形变化、熔点、晶体大小和特性上存在差异(Siew，2001)。
在大多数从含油种子提取的油中，由于仅存在少量的DAG，因此DAG的作用不是很明显。主要是在含有高天然含量DAG的棕榈油和橄榄油中，如果其中存在DAG，这些油的质量就会受到影响。
从油棕(Elaeis guineensis)中获得的棕榈油是一种具有重大商业价值的食用油。由于数项有利特性，如高产量、低廉、热稳定性和氧化稳定性高、以及室温的可塑性，使得棕榈油成为食品工业中重要的脂肪和油来源。此外，与其他植物油相比，棕榈油是抗氧化剂维生素E的丰富来源。
精制棕榈油的典型化学组成是约93％甘油三酯、6％甘油二酯和1％甘油一酯(MAG)(Okiy，1977)。
当棕榈油结晶时，形成原有成分的复杂三维网络结构。理论上，网络结构中的构件块(building block)(TAG、DAG和MAG)的多样性越大，该网络结构越复杂，发生结晶的速度越慢(Jacobsberg和Ho，1976)。该理论得到Drozdowski(1994)的证实。此外，他的研究表明，三酰甘油分子中的脂肪酸组成变化越大，不同结晶相之间的转换越困难。
如先前指出，棕榈油中的高含量甘油二酯会影响其结晶特性(Okiy等人，1978；Okiy，1978)。
这些油中存在甘油二酯是不利的。特别地，食用油(特别是棕榈油)中存在甘油二酯，会导致油的品质低下。
与棕榈油和其他食用油以及脂肪中的甘油二酯含量相关的问题已经成为许多研究的课题，在文献中可以找到试图解决甘油二酯过多的问题的不同解决方案。
日本的酶生产商Amano在其网站主页(Amano Enzyme Inc.，2004)上推荐了用于去除脂肪和油中的甘油二酯的酶促方法。该方法基于使用一种能够将甘油二酯降解成游离脂肪酸和甘油的酶LIPASE G“AMANO”50。这种酶是甘油二酯(DAG)和/或甘油一酯(MAG)水解酶。通过真空蒸馏或者分馏结晶来去除生成的游离脂肪酸。
EP 0 558 112描述了一种酶促水解甘油三酯制剂乳液中的残留甘油二酯的方法。该方法基于使用Amano(日本，同上文)的脂肪酶G水解甘油二酯。通过在乳液中进行将甘油二酯降解成脂肪酸和甘油的酶促反应来加强该方法。反应后分离水相，该酶可部分重复使用。
JP 62061590讲授了一种含有少量甘油二酯的硬质黄油，通过在存在催化量的水时用甘油酯部分特异的酶(例如脂肪酶)处理油或脂肪，以及在存在脂肪酸、脂肪酸酯或者其他甘油酯油或脂肪时用1，3-特异的脂肪酶处理油或脂肪，由此进行加工。该产品是特别适合用作可可脂替代品的硬质黄油。因此，将脂肪酶G和德列马根霉(Rhizopus delemar，Rhizopus deremer)脂肪酶(1，3-特异酶)与硅藻土混合并制成颗粒。将该颗粒与棕榈液的熔点馏分(5.7％甘油二酯，酸值0.25)以及水(相对于甘油酯部分特异的酶为10％)混合。将该混合物于室温搅拌1小时，除去酶和水，生成含有1.2％甘油二酯的硬质黄油(酸值10.5)。
因此，现有技术讲授了通过酶促反应来减少或去除棕榈油和其他食用油中的甘油二酯含量的方法。这些方法依赖于在游离脂肪酸和甘油形成过程中，用特定的甘油二酯水解脂肪酶水解甘油二酯。然后，通过不同方法如真空蒸馏或分馏，除去游离脂肪酸。
使用特定的甘油二酯水解酶的不利之处在于不利地形成了游离脂肪酸。必须从棕榈油中去除这些游离脂肪酸。因此，游离脂肪酸的形成常常被认为是产品损失。
为了克服与去除游离脂肪酸以及因游离脂肪酸形成而造成的产品损失相关的问题，我们发现了一种新方法，用于解决棕榈油和其他植物油中的高甘油二酯含量的问题。
已经讲授了使用脂肪酶来酶促去除棕榈油中的甘油二酯，代表性的酶为1，3-特异性三酰甘油水解酶(E.C.3.1.1.3)(如参见JP 62061590或EP 0 652289)。WO00/05396特别讲授了用脂肪酶处理可能包含甘油的食物，从而在低水含量的环境中进行甘油醇解(glycerolysis)。
然而，1，3-特异性三酰甘油水解酶(脂肪酶)和DAG/MAG水解酶都会造成油中的游离脂肪酸显著增加，并且还会引起甘油一酯发生水解。
但是，在某些用于特定应用的植物油中，例如可能期望提高油中的甘油一酯的含量，因为它提供乳化剂的功能性。因此，一个方面，优选减少甘油二酯的含量，而不降低甘油一酯的含量。另一个方面，可能优选降低甘油二酯和甘油一酯二者的含量。
由于食用油中存在的大量脂质即三酰甘油(TAG)的水解，脂肪酶还会造成DAG有害地增加。
在WO2000/36114、US2003/0028923和US2003/0074695中，讲授了用具有编码二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的序列或其反义序列的核酸转化植物。这些文献中讲授的DGAT酶催化“Kennedy路径”中的最后步骤，在该步骤中，二酰甘油(DAG)与乙酰CoA的酰基基团结合形成甘油三酯(TAG)。因此，这些文献讲授了具有改进的TAG组成和/或含量的转基因植物的生成。这些文献中讲授的DGAT酶不是本发明的脂质酰基转移酶和/或甘油二酯：甘油酰基转移酶。
特别地，DGAT需要存在乙酰CoA或脂肪酸CoA来发挥作用。乙酰CoA相当昂贵，不适合商业应用来处理食用油。但是，缺乏乙酰CoA时，这些酶不起作用。此外，依赖脂肪酸-CoA的酶促反应难以进行工业控制。
此外，所有这些文献讲授了通常期望减少在植物中表达DGAT酶，从而降低植物中的TAG的量。这与本发明构成鲜明对比，本发明在减少食用油中的甘油二酯(DAG)的同时，基本上需要保留和/或生成TAG。
WO03/100044讲授了一种磷脂：二酰甘油酰基转移酶(PDAT)，它通过将酰基从磷脂(卵磷脂)转移到二酰甘油(DAG)上，催化生成甘油三酯(TAG)。PDAT需要磷脂作为酰基供体。这与本发明构成鲜明的对比，在本发明中酰基供体是DAG。该文献没有讲授用本发明的脂质酰基转移酶从食用油中去除DAG。
发明概述
已经发现，使用本文定义的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶，特别是不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶，可以从食用油中选择性地减少和/或去除甘油二酯(优选1，2-甘油二酯)。
本文所用的术语“选择性的”是指在食用油环境中，相对于三酰甘油(TAG)或甘油一酯(MAG)，该酶优先利用甘油二酯(DAG)作为底物，优选1，2-甘油二酯。因此，可以从食用油中去除和/或减少甘油二酯，同时使得油中的甘油三酯的含量未改变(或基本上未改变)。油中的甘油一酯的含量仍然未改变(或基本上未改变)或者可能增加。在某些应用中，油中的甘油一酯的含量可能减少。
在本发明的一个方面，提供了从食品中减少和/或去除甘油二酯的方法，包括a)将食品或其部分与酰基受体底物以及不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶混合，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基从甘油二酯转移到甘油上的酶。
在本发明的另一个方面，提供了从食用油中减少和/或去除甘油二酯的方法，包括a)将食用油与酰基受体底物以及不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶混合，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基从甘油二酯转移到甘油上的酶。
合适地，按照本发明的方法可能还包括将所处理的食用油或其部分添加到一种或多种食物组分中来配制食品，例如人造奶油或者涂抹食品(spread)。
本发明还提供了不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在食品加工中的用途，用于从所述食品中减少和/或去除(优选选择性地减少和/或去除)甘油二酯，该不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。
在另一个方面，本发明还进一步提供了不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在食品加工中的用途，用于改进食品的结晶特性，该不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶被表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。
在另一个方面，本发明提供了不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在食用油加工中的用途，用于从所述食用油中减少和/或去除(优选选择性地减少和/或去除)甘油二酯，该不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。
在另一个方面，本发明提供了不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在食用油加工中的用途，用于改进食用油的结晶特性，该不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。
发明详述
本文所用的术语“不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶”和“不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶”是指具有酰基转移酶活性因而能够将酰基基团从甘油二酯转移到一种或多种受体底物上的酶(按照国际生化和分子生物学协会命名委员会的酶命名建议(1992)(Enzyme NomenclatureRecommendations(1992)of the Nomenclature Committee of the InternationalUnion of Biochemistry and Molecular Biology)，通常归入E.C.2.3.1.x)。
因此，本发明的“不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶”或“不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶”是具有酰基转移酶活性但不是二酰甘油酰基转移酶(DGAT)或磷脂：二酰甘油酰基转移酶(PDAT)的酶(通常归入E.C.2.3.1.x)。DGAT通常归入E.C.2.3.1.20。PDAT通常归入E.C.2.3.1.158。因此，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶或者不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶是具有酰基转移酶活性但不是任何归入E.C.2.3.1.20或E.C.2.3.1.158的酶的酶。
本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶或者不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在食用油中能够将酰基基团从DAG转移到甘油上。因此，由本发明的酶催化的反应为：
这与称为二酰甘油酰基转移酶(或者二酰甘油O-酰基转移酶)(DGAT)的酶(这些酶归入E.C.2.3.1.20)构成鲜明的对比，这些酶催化Kennedy过程的最后步骤，即：
为了避免产生疑问，DGAT不是本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶或者不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶。
由本发明的酶催化的反应还与由称为磷脂：二酰甘油酰基转移酶(PDAT)的酶催化的反应形成鲜明的对比，即：
为了避免产生疑问，PDAT不是本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶或者不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶。
优选地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶或者不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶是归入E.C.2.3.1.73的酶。
适合地，不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶可以是不依赖膜的，即可以是在其天然环境中不会通过存在的膜锚着点或者跨膜结构域而与膜结合的蛋白质。
为了避免产生疑问，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶不是WO03/100044、WO2000/36114、US2003/0028923或US2003/0074695中的任何一篇讲授的酶。
除了酰基转移酶活性以外，该酶还可以具有脂肪酶活性，例如磷脂酶活性(通常归入E.C.3.1.1.x)。
本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶是不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶。这些术语在此互换使用。
优选地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶是包含氨基酸序列基序GDSX的酰基转移酶，其中X是如下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一种或多种。
本文所用的术语“甘油二酯：甘油酰基转移酶”与术语“不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶”的意思相同。
为了避免产生疑问，术语“脂肪酸CoA”与术语“酰基CoA”、“脂肪酸酶CoA”和“酰基辅酶A”相同。这些术语在此互换使用。
用于本发明的方法和用途中的食用油可以是粗制油的形式或者是精制的油。
在一个优选实施方案中，优选地甘油二酯的含量减少了，而不是完全去除。
在此所用的术语“减少了”是指用本发明的酶处理的食用油中的甘油二酯的含量低于用酶处理前的食用油中的甘油二酯的含量。
优选地，甘油二酯未完全地从食用油中去除。
在某些应用中，诸如所处理的油在人造奶油和/或起酥油中的用途，甘油二酯，特别是1，2-甘油二酯的含量应当减少到脂肪混合物的结晶速度产生小β-晶体的点。棕榈油中的1，2-甘油二酯的含量与总甘油二酯含量的比率取决于该油的贮藏时间和条件。对于商品油来说，1，3-甘油二酯：1，2-甘油二酯的比率为1.8∶3.3。去除1，2-甘油二酯将会对结晶特性产生最大影响。
甘油二酯含量的减少可以通过反应时间和反应温度来控制，这对于本领域技术人员来说是十分显然的。在一个具有固定酶的流动反应器中，可以通过流速来控制反应。
优选地，用于本发明的方法和/或用途中的脂质酰基转移酶能够将酰基基团从甘油二酯转移到酰基受体上，其中酰基受体是包含羟基基团(-OH)的任何化合物。
适宜地，本文所用的术语“甘油二酯”是指1，2-甘油二酯或1，3-甘油二酯的一种或多种。优选地，甘油二酯是1，2-甘油二酯。
术语“甘油二酯”和“二酰甘油”在本文中互换使用。
术语“甘油二酯”不包括双半乳糖基甘油二酯(DGDG)和/或卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。
优选地，酰基受体能够溶解于食用油中。
适宜地，酰基受体可以是醇，诸如例如乙醇或多元醇，包括甘油及其混合物和衍生物。合适地，酰基受体可以是甾醇、甾烷醇(stanol)、羟酸、山梨糖醇、山梨聚糖或其他糖的一种或多种。
在一个优选实施方案中，酰基受体是甘油。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了从食用油中减少和/或去除甘油二酯的方法，包括a)将食用油与甘油和不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶二者混合，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶是具有酰基转移酶活性且包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是如下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一种或多种。
优选地，本发明的酰基受体不是水。
优选地，酰基受体不是甘油一酯和/或甘油二酯。
优选地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶能够切割脂质底物的脂肪酸残基和甘油主链之间的酰基键，其中优选地脂质底物是甘油二酯，优选1，2-甘油二酯。
优选地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶不作用于甘油三酯和/或甘油一酯。换句话说，优选地，不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶选择甘油二酯，优选选择1，2-甘油二酯。脂质底物在本文中称为“脂质酰基供体”。
因此，按照本发明，可以达到一种或多种如下益处：食用油中的甘油二酯含量降低；食用油中的甘油二酯含量降低而食用油中的甘油三酯含量不降低；食用油中的甘油二酯含量降低而食用油中的甘油一酯含量不增加；食用油中的甘油二酯含量降低而食用油中的甘油一酯含量增加；食用油中的甘油二酯减少且甘油一酯含量减少；食用油的甘油二酯含量降低而食用油中的脂肪酸含量没有显著增加。
优选地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶通过将脂肪酸酰基基团从甘油二酯(优选1，2-DAG)转移到醇(优选甘油)上，进行醇解反应，从而生成两个甘油一酯分子，即一个来自甘油二酯，而一个由甘油与所接受的酰基基团生成。
优选地，基序GDSX中的X为L。因此，优选地，本发明的酶包含氨基酸序列基序GSDL。
GDSX基序由四个保守氨基酸组成。优选地，基序中的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，GDSX基序中的丝氨酸可以处于对应于Brumlik和Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996，第178卷，第7期，第2060-2064页)中讲授的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂肪分解酶中的Ser-16的位置。
为了确定蛋白质是否具有依照本发明的GDSX基序，优选将序列与pfam数据库的隐藏Markov模型序型(profile)(HMM序型)进行比较。
pfam是蛋白质结构域家族的数据库。pfam包含排列好的每个家族的多重序列对比，以及用于在新序列中鉴定这些结构域的序型隐藏Markov模型(序型HMM)。关于pfam的介绍见Bateman A等，2002，Nucleic Acids Res.30：276-280。隐藏Markov模型在致力于蛋白质分类的许多数据库中得到采用，综述见Bateman A和Haft DH，2002，Brief Bioinform 3：236-245。
http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed
&list_uids＝12230032&dopt＝Abstract
http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed
&list_uids＝11752314&dopt＝Abstract
关于隐藏Markov模型的详细解释和它们在pfam数据库中是如何应用的见Durbin R、Eddy S、和Krogh A，1998，Biological sequence analysis；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4。Hammer软件包可以由华盛顿大学(St Louis，USA)获得。
或者，可以使用Hammer软件包来鉴定GDSX基序，其说明书见Durbin R、Eddy S、和Krogh A，1998，Biological sequence analysis；probabilistic modelsof proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4及其参考文献，以及该说明书中提供的HMMER2序型。
可以通过例如目前位于下列网站的几个服务器访问PFAM数据库。
http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http：//pfam.wustl.edu/
http：//pfam.jouy.inra.fr/
http：//pfam.cgb.ki.se/
数据库提供了能够输入蛋白质序列的搜索工具。使用数据库的默认参数，就将对蛋白质序列分析是否存在Pfam结构域。GDSX结构域是数据库中已经确定的结构域，因此它在任何检索序列中的存在都将受到识别。数据库将对检索序列报告其与Pfam00657共有序列的对比。
可以通过下列方式获得包括杀鲑气单胞菌或嗜水气单胞菌在内的多重对比：
1)手工
遵循上文所述流程，获得目的蛋白与Pfam00657共有序列的对比，并获得P10480与Pfam00657共有序列的对比；
或
2)通过数据库
在鉴定了Pfam00657共有序列之后，数据库提供选项以显示检索序列与Pfam00657共有序列种子对比(seed alignment)的对比。P10480是该种子对比的一部分，以GCAT_AERHY表示。检索序列和P10480二者都将在同一个窗口中得到显示。
嗜水气单胞菌参考序列：
嗜水气单胞菌GDSX脂肪酶的残基在NCBI文件P10480中进行了编号，本文中的编号就是该文件中给出的编号，在本发明中用于在优选实施方案中确定本发明脂酰基转移酶中存在的具体氨基酸。
进行了Pfam对比(图33和图34)：
可以识别下列保守残基，而且在优选实施方案中它们可以存在于本发明组合物和方法所使用的酶变体中；
模块1-GDSX模块
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28 29 30 31 32 33 34 35
模块2-GANDY模块
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
模块3-HPT模块
His
309
其中“hid”指选自下组的疏水残基：Met、Ile、Leu、Val、Ala、Gly、Cys、His、Lys、Trp、Tyr、Phe。
优选的是，可以将本发明组合物/方法所使用的脂质酰基转移酶与Pfam00657共有序列进行对比。
优选的是，与pfam00657结构域家族的隐藏Markov模型序型(HMM序型)的正匹配指示存在依照本发明的GDSL或GDSX结构域。
优选的是，在与Pfam00657共有序列对比时，本发明组合物/方法所使用的脂质酰基转移酶具有GDSX模块、GANDY模块和HPT模块中的至少一个、优选超过一个、优选超过两个。合适的是，脂质酰基转移酶可以具有GDSX模块和GANDY模块。或者，该酶可以具有GDSX模块和HPT模块。优选的是，该酶包含至少GDSX模块。
优选的是，在与Pfam00657共有序列对比时，与嗜水气单胞菌多肽参考序列即SEQ ID No.32相比，本发明组合物/方法所使用的酶具有下列氨基酸残基中的至少一个、优选超过一个、优选超过两个、优选超过三个、优选超过四个、优选超过五个、优选超过六个、优选超过七个、优选超过八个、优选超过九个、优选超过十个、优选超过十一个、优选超过十二个、优选超过十三个、优选超过十四个：28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34Ser、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。
pfam00657是区分具有此结构域的蛋白质与其它酶的独特鉴别物。
pfam00657共有序列在图1中显示为SEQ ID No.1。它衍生自对第6版数据库pfam家族00657的鉴定，在本文中也可称为pfam00657.6。
可以使用pfam数据库的较新版本更新共有序列。
例如，图33和图34显示了第11版数据库的00657家族的pfam对比，在本文中也可称为pfam00657.11。
在来自数据库两个版本的pfam家族00657中都发现存在GDSX、GANDY和HPT模块。可以使用更新版本的pfam数据库来鉴定pfam家族00657。
优选的是，可以使用下列标准来鉴定依照本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶：
(1)酶具有可以定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的最初酯键的酰基部分转移给酰基受体，从而形成新的酯；
(2)酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S；和
(3)酶包含His-309或者在与图2(SEQ ID No.2或SEQ ID No.32)所示嗜水气单胞菌脂肪分解酶中His-309对应的位置包含组氨酸残基。
优选的是，GDSX基序中的氨基酸残基X是L。
在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32中，前18个氨基酸残基构成信号序列。
全长序列即包含信号序列的蛋白质中的His-309等同于蛋白质成熟部分即不含信号序列的序列中的His-291。
优选的是，依照本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶包含下列催化性三联体：Ser-34、Asp-134、和His-309，或者在与图2(SEQ ID No.2)或图28(SEQ ID No.32)所示嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Ser-34、Asp-134和His-309对应的位置分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示序列中，前18个氨基酸残基构成信号序列。全长序列即包含信号序列的蛋白质中的Ser-34、Asp-134和His-309等同于蛋白质成熟部分即不含信号序列的序列中的Ser-16、Asp-116和His-291。在pfam00657共有序列中，如图1(SEQ ID No.1)所示，活性位点的残基对应于Ser-7、Asp-157和His-348。
优选的是，可以使用下列标准鉴定依照本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶：
(1)酶具有可以定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将第一种脂质酰基供体的最初酯键的酰基部分转移给酰基受体，从而形成新的酯；和
(2)酶至少包含Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134和His-309或者在与图2(SEQ ID No.2)或图28(SEQ ID No.32)所示嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134和His-309对应的位置分别包含甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸残基。
合适的是，依照本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可以由一种或多种下列属的生物体获得，优选就是这样获得的：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、糖酵母属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分支杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌科(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、利斯特氏菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。
合适的是，依照本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可以由一种或多种下列生物体获得，优选就是这样获得的：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、天蓝色链霉菌(Streptomyees coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分支杆菌属(Mycobacterium)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌科(Vibrionaceae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、无害利斯特氏菌(Listeriainnocua)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)、茄青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。
在一个方面，优选的是，依照本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可以从嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌的一种或多种获得，优选就是这样获得的。
适宜地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶包含如下氨基酸序列的一种或多种：
(i)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列(参见图2)
(ii)如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列(参见图3)
(iii)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列(参见图4)
(iv)如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列(参见图5)
(v)如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列(参见图6)
(vi)如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列(参见图14)
(vii)如SEQ ID No.20所示的氨基酸序列(参见图16)
(viii)如SEQ ID No.22所示的氨基酸序列(参见图18)
(ix)如SEQ ID No.24所示的氨基酸序列(参见图20)
(x)如SEQ ID No.26所示的氨基酸序列(参见图22)
(xi)如SEQ ID No.28所示的氨基酸序列(参见图24)
(xii)如SEQ ID No.30所示的氨基酸序列(参见图26)
(xiii)如SEQ ID No.32所示的氨基酸序列(参见图28)
(xiv)如SEQ ID No.34所示的氨基酸序列(参见图30)
(xv)如SEQ ID No.55所示的氨基酸序列(参见图52)
(xvi)如SEQ ID No.58所示的氨基酸序列
(xvii)如SEQ ID No.60所示的氨基酸序列
(xviii)如SEQ ID No.61所示的氨基酸序列
(xix)如SEQ ID No.63所示的氨基酸序列
(xx)如SEQ ID No.65所示的氨基酸序列
(xxi)如SEQ ID No.67所示的氨基酸序列
(xxii)如SEQ ID No.70所示的氨基酸序列或者
(xxiii)与如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.55、SEQ ID No.58、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.63、SEQ ID No.65、SEQ ID No.67或SEQ ID No.70所示的序列的任何之一具有75％或更高的同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶包含如SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列或者包含与如SEQ ID No.2所示氨基酸序列或如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或如SEQ ID No.32所示的氨基酸或如SEQ ID No.34所示的氨基酸序列具有75％或更高、优选80％或更高、优选85％或更高、优选90％或更高、优选95％或更高的同一性的氨基酸序列。
为了本发明的目的，同一性程度是基于相同的序列元件的数量。本发明的同一性程度可以适宜的通过本领域知晓的计算机程序确定，诸如GCG程序包中提供的GAP(Wisconsin软件包的程序手册，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，US53711)(Needleman和Wunsch，1970，J.of Molecular Biology 48，443-45)，采用如下设定来进行多肽序列比较：GAP产生罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。
适宜地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶包含与如SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.55、SEQ ID No.58、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.67或SEQ ID No.70所示序列的任何一种具有80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高以及甚至更优选95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶包含如下序列的一种或多种：
(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基1-100所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基101-200所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基201-300所示的氨基酸序列；
(d)与上述(a)-(c)定义的氨基酸序列的任何一种具有75％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶包含如下氨基酸序列的一种或多种：
(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；
(d)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或
(f)与上述(a)-(e)定义的氨基酸序列的任何一种具有75％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适宜地，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可能包含通过表达如下核苷酸序列的一种或多种生成的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列(参见附图9)；
(b)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列(参见图10)；
(c)如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列(参见图11)；
(d)如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列(参见图12)；
(e)如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列(参见图13)；
(f)如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列(参见图15)；
(g)如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列(参见图17)；
(h)如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列(参见图19)；
(i)如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列(参见图21)；
(j)如SEQ ID No.27所示的核苷酸序列(参见图23)；
(k)如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列(参见图25)；
(l)如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列(参见图27)；
(l)如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列(参见图29)；
(m)如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列(参见图31)；
(n)如SEQ ID No.54所示的核苷酸序列(附图51)；
(o)如SEQ ID No.59所示的核苷酸序列；
(p)如SEQ ID No.62所示的核苷酸序列；
(q)如SEQ ID No.64所示的核苷酸序列；
(r)如SEQ ID No.66所示的核苷酸序列；
(s)如SEQ ID No.68所示的核苷酸序列
(t)如SEQ ID No.69所示的核苷酸序列；或
(v)与如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、SEQID No.35、SEQ ID No.54、SEQ ID No.59、SEQ ID No.62、SEQ ID No.64、SEQ ID No.66，SEQ ID No.68或SEQ ID No.69所示的序列的任何一种具有75％或更高的同一性的核苷酸序列。
适宜地，该核苷酸可以与如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.54、SEQ ID No.59、SEQ ID No.62、SEQ ID No.64、SEQ ID No.66、SEQ ID No.68或SEQ ID No.69所示的序列的任何一种具有80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高和甚至更优选95％或更高的同一性。
一个方面，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可以是卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(例如通过分子进化制备的变体)。
适宜的LCAT是本领域已知的，可以从如下生物体的一种或多种中获得：哺乳动物、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物(包括拟南芥和稻)、线虫、真菌和酵母。
在一个实施方案中，本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可以是可以、优选就是从携带pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大肠杆菌菌株TOP 10中获得的脂质酰基转移酶，根据用于专利程序的微生物保藏的国际公认的布达佩斯条约，这些菌株由Danisco A/S(Langebrogade 1，DK-1001Copenhagen K，丹麦)于2003年12月22日保藏在国立工业、食品和海洋细菌保藏中心(NCIMB，Machar街23号，阿伯丁，苏格兰，大不列颠)，保藏号分别为NICMB 41204和NCIMB 41205。
优选地，在实施本发明的方法时，生产产品而不在食品中增加或者大量增加游离脂肪酸。
在此所用的术语“转移酶”与术语“脂质酰基转移酶”互换使用。
适宜地，本文定义的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶催化如下反应的一种或多种：酯交换(interesterification)、酯转移(transesterification)、醇解、水解。
术语“酯交换”是指酶催化脂质供体和脂质受体之间的酰基基团的转移，其中脂质供体不是游离的酰基基团。
本文所用的术语“酯转移”是指酶催化酰基基团从脂质供体(除了游离脂肪酸)到酰基受体(除了水)的转移
如本文所用的术语“醇解”是指通过与醇ROH的反应酶促切割酸衍生物的共价键，使得一种产物与醇的H结合，而另一种产物与醇的OR基团结合。
如本文所用的术语“醇”是指含有羟基基团的烷基化合物。
如本文所用的术语“水解”是指酶促催化酰基基团从脂质到水分子OH基团的转移。由水解引起的酰基转移需要分解水分子。
如本文所用的术语“不增加或不显著增加游离脂肪酸”是指优选地，本发明的脂质酰基转移酶在食用油环境中具有100％的转移酶活性(即100％地将酰基基团从酰基供体转移给酰基受体，无水解活性)；然而，酶可能将少于100％的脂质酰基供体上的酰基基团转移给酰基受体。在这种情况中，优选地，酰基转移酶活性占到全部酶活性的至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％和更优选至少98％。％转移酶活性(即转移酶活性作为总酶促活性的百分比)可以通过如下方法确定：
用于确定％转移酶活性的方法：
可以在与CHCl3∶CH3OH为2∶1的酶促反应后，对添加了本发明的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶的食用油进行萃取，分离含有脂质物质的有机相，按照下文详细描述的操作进行GLC分析。根据GLC分析，确定游离脂肪酸和甘油二酯的含量。用相同方式对未添加本发明的酶的对照食用油进行分析。
计算：
从GLC分析的结果，可以计算出游离脂肪酸的增加和甘油二酯的减少：
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；
Mv Fa＝脂肪酸的平均分子量；
Δ％甘油二酯＝％甘油二酯(对照)-％甘油二酯(酶)；
Mv Di＝甘油二酯的平均分子量；
转移酶活性计算为总酶促活性的百分比：
如果食用油中的游离脂肪酸增加，优选不是显著增加，即不是显著程度。这是指游离脂肪酸的增加不会对食用油的品质产生有害作用。
在本发明的某些方面，本文所用的术语“不会显著地增加游离脂肪酸”是指用本发明的脂质酰基转移酶处理的食用油中的游离脂肪酸的含量低于使用除了本发明的脂质酰基转移酶之外的酶的食用油或组合物中产生的游离脂肪酸的含量，诸如例如在与使用常规脂肪酶例如洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(Lipase PS，Amano日本)或米根霉(Rhizopusoryzae)脂肪酶(LipaseF，Amano日本)时生成的游离脂肪酸的含量比较时。
适宜地，可以去除发生反应后仍然存在于食用油中的任何甘油，例如通过离心或真空蒸馏。
任选地，在发生酶促反应后，可以从食用油中去除该酶。可替代地，可以仅仅将该酶灭活并保留在食用油中。适宜地，例如可以通过加热来灭活酶。
在一个实施方案中，用于本发明的方法中的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可以固定。在固定化酶的情况中，可以使包含酰基受体和食用油的混合物通过柱子，例如包含固定化酶的柱子。通过固定化酶，有可能容易地重复使用该酶。
适宜地，固定化酶可用于含有反应混合物的流动反应器或间歇反应器中，该混合物包含酰基受体和食用油作为两相系统。可选择地搅拌或超声波处理反应混合物。例如一旦反应达到平衡，可以分离反应混合物和固定化酶。适宜地，反应后去除过量的酰基受体(诸如过量的甘油)，例如通过离心或真空蒸馏。
可以用本领域知晓的固定技术来制备固定化脂质酰基转移酶。有大量制备固定化酶的方法，对于本领域技术人员来说是显然的(例如在EP 0 746608；或Balcao V.M.，Paiva A.L.，Malcata F.X.，Enzyme Microb Technol.1996年5月1日，18(6)：392-416；或Retz M.T.，Jaeger K.E.，Chem Phys Lipids 1998年6月，93(1-2)：3-14；Bornscheuer U.T.，Bessler C，Srinivas R，Krishna S.H.，Trends Biotechnol.2002年10月，20(10)：433-7；Plou等人，J.Biotechnology2002，92：55-66；Warmuth等人，1992，Bio Forum 9：282-283；Ferrer等人，2000，J.Chem.Technol.Biotechnol.75：1-8；或Christensen等人，1998，Nachwachsende Rohstoff 10：98-105；Petersen和Christenen，2000，AppliedBiocatalysis，Harwood Academic Publishers，Amsterdam中提及的方法，它们中的每一篇在此引入作为参考)。可用于本文中的技术包括例如共价偶联到Eupergit C上、吸附到聚丙烯上和硅的粒化。
优选地，食用油是含有甘油二酯，优选显著含量的甘油二酯的任何食用油。
优选地，食用油是如下油的一种或多种：提取或来源于棕榈油、棕榈油精、棕榈硬脂精、棕榈中间馏分或者任何棕榈油馏分或橄榄油的油。
更加优选地，食用油是棕榈油和/或棕榈油精和/或棕榈硬脂精。
至于食用油、酰基受体底物和脂质酰基转移酶的混合，本领域技术人员显然知晓，这可以以任何组合和/或次序来进行。例如，可以将酰基受体底物与食用油混合，接着加入脂质酰基转移酶。可替代地，可以将食用油与脂质酰基转移酶混合，接着加入酰基受体底物。可替代地，可以将脂质酰基转移酶和酰基受体底物混合，然后将酶/底物混合物与食用油混合。可替代地，当然可以同时混合全部三种底物(即食用油、酰基受体底物和脂质酰基转移酶)。
优选地，该方法在高于食用油熔点的温度进行。
适宜地，可以在30-50℃之间的温度实施该方法，优选在35-45℃之间，优选在40-45℃之间。
优选地，将酶添加到粗制或精制的食用油中。优选地，在与含水组分混合时，本发明不包括用酶处理食用油。因此，本发明包括处理食用油本身，即在低水含量的环境中。
虽然可以在本发明的方法之前或之中，将水添加到油脂中，在最优选的实施方案中，不添加水。如果食用油中存在水，优选存在的水少于10％，更优选少于7.5％、少于5％、少于1％、少于0.5％、少于0.4％、少于0.3％、少于0.2％或少于0.1％。适宜地在食用油中存在0.1-1％的水。
在一个实施方案中，用于本发明的方法中的食用油中可以添加一种或多种酰基供体和/或可以添加一种或多种酰基受体和/或可以添加一种或多种酰基受体及一种或多种酰基供体。“添加”是指酰基供体和/或酰基受体在自然条件下不存在于食用油中，并且在按照本发明将食用油与脂质酰基转移酶接触的同时、之后和/或之前立即加入。
适宜地，所添加的酰基供体可以不是DAG。适宜地，所添加的酰基供体可以是例如磷脂(例如卵磷脂)。
适宜地，所添加的酰基受体可以是甘油。适宜地，可以是甘油外的酰基受体，例如植物甾醇和/或植物甾烷醇。适宜地，所添加的酰基受体是甘油与一种或多种其他酰基受体的组合。
使用添加了磷脂的油容许在油中生成其他乳化剂(溶血磷脂)。使用添加了植物甾醇和/或植物甾烷醇的油容许在食用油中生成植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯二者。已经报道，在将植物甾醇酯和植物甾烷醇酯添加到食物中时，具有降低血清胆固醇的作用。
使用固定化脂肪酶诸如1，3-特异脂肪酶LipozymeTL IM(Novozymes，丹麦)的酶促酯交换反应可用于减少油中的反式脂肪酸含量，用于饮食用途和/或用于改变食用油和脂肪的熔化特性。
在酯交换过程中，食物油的甘油三酯中的一个或两个多不饱和脂肪酸可以用来自反式脂肪酸少的另一种油(诸如棕榈油)的脂肪酸替换。从棕榈油中转移脂肪酸使得可以改变食物油的熔点，而不引入反式脂肪酸。脂肪酶的固定描述在US5776741、US4798793和US5156963中。US6284501描述了磷脂的酯交换。
固定化转移酶可以用与用于脂肪酶的相同技术来制备。
在一个实施方案中，本文描述的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可以与酯交换脂肪酶结合使用。脂肪酶酯交换和酰基转移酶步骤优选分别进行。
在还有一个方面，本文描述的不依赖脂肪酸CoA的脂质酰基转移酶可以与常规的结晶抑制剂结合使用。
在另一个方面，本发明提供了改进包含食用油的食品的结晶特性的方法，包括将食用油与酰基受体底物以及本文描述的不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶混合，可选择地还有结晶抑制剂。
在一个实施方案中，本发明提供了不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在制备包含食用油的食品中的用途，用于改进食品的结晶特性。
适宜地，可选择地添加一种或多种其他结晶抑制剂。
本发明还提供了本文描述的不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在加工包含食用油的食品中的用途，用于改进所述食品的结晶特性。
在另一个方面，本发明提供了本文描述的不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶结合其他结晶抑制剂在加工包含食用油的食品中的用途，用于改进所述食品的结晶特性。
其他结晶抑制剂可以是任何常规的结晶抑制剂，诸如例如一种或多种山梨聚糖三硬酯酸酯、卵磷脂、PGE或聚山梨酸酯。
优点
在本发明中，通过使用本文讲授的方法，特别是通过选择本文讲授的酶用于所要求保护的方法中，用于去除或减少食用油中的甘油二酯，可以达到相对于甘油一酯和甘油三酯选择性地降低甘油二酯，而不减少甘油三酯和/或显著增加游离脂肪酸(FFA)。
可以实施本发明的方法而不显著增加食用油中的游离脂肪酸含量的事实克服了产品损失的问题。
如果用常规的脂肪酶处理粗制的棕榈油，必需在油的精制过程中去除游离脂肪酸，但是如果用本发明的脂质酰基转移酶处理精制的棕榈油(从而不必用常规的脂肪酶处理粗制的棕榈油)，不必去除脂肪酸，因为游离脂肪酸的含量未显著增加。
此外或可选择地，本发明使得可以从食用油中去除和/或减少甘油二酯，而不显著地降低甘油一酯的水平。
此外或可选择地，本发明使得可以从食用油中去除和/或减少甘油二酯，同时提高食用油中的甘油一酯水平。这与利用甘油一酯作为底物从而减少食用油中的甘油一酯含量的现有的酶形成对比。
本发明不需要添加脂肪酸CoA，这是有益的。这与依赖酰基CoA的DGAT形成鲜明的对比。本发明的酶依赖甘油的存在(和添加，如果需要的话)，而甘油是廉价的日用品。
A去除/减少棕榈油中的甘油二酯的商业实用性
甘油二酯阻碍基于棕榈油的人造奶油和起酥油的结晶。
多年来，我们看到棕榈油的消费稳定增加，部分是由于局部可用性、部分由于经济、和部分由于性能。发现人造奶油/起酥油型产品中存在棕榈油能够增强油混合物的β’质量。然而，棕榈油的使用先前局限于棕榈硬酯精和棕榈油精的使用，以及棕榈仁及其部分的一些用途。现今，由于糖果和食品加工商想得到非常特别的熔化特性，情况已经发生改变。
随着消费者试图增加棕榈油在配方中的使用，工业中出现比先前更多的结晶问题。有必要加入“晶原”促进剂在低反式或无反式配方中起始结晶，从而防止或延缓使用前的后晶体形成(post crystal formation)。人们对减缓、延迟后晶体生长的抗结晶剂的兴趣也在增加，诸如山梨聚糖三硬酯酸酯、卵磷脂、PGE、聚山梨酸酯。这是高甘油二酯存在的表现。
本发明的商业利益可以是如下的一种或多种：
a)减少在生产过程中和/或随后在使用过程中往食用油中添加额外的甘油一酯的需要。甘油一酯是食品系统中广泛使用的乳化剂。
b)将甘油二酯从约6-8％降低到约4-5％，甚至更低。
c)提高车间(工厂)生产量的弹性-从而降低生产开销。
d)能够大量减少后结晶问题。
e)在某些配方中，由于我们减少了对促进结晶的需求，因此有可能去除某些完全饱和的油甘油三酯。从这一点来看，制造商通常往配方中添加完全饱和的甘油三酯来“促进”晶体形成，并解决在售后产品中产生不期望的延迟晶体形成。这种晶体形成是在该配方中具有显著含量棕榈油或其组分的表现，其含有的甘油二酯的浓度足以在加工过程中延迟晶体生长成为期望的晶体类型(即在人造奶油和起酥油的情况中优选β-促进物(beta-prime))。然而，通过使用按照本发明处理的棕榈油，在特定的混合物或配方中的甘油二酯含量得到显著降低，使得对于加入完全饱和的甘油三酯来辅助晶体发生的需要变得不太重要。
f)使得基于棕榈油的混合物更加多样化，增加液体油的价格，而不改变主要的加工方法。
g)使得可以替代抗结晶剂和/或部分替代抗结晶剂。
B反式脂肪酸
现今，我们看到了法律和公众都反对在食品中使用反式酸(Fdevareministeriet，丹麦2003)。因此，这已导致执行问题。制造商在可能的情况中可能希望改用基于棕榈油的溶液，因为这种类型的油中存在高水平的C:16:0和C:18:0异构体。结果是我们开始看到在先前不使用棕榈的经济领域中对棕榈的消耗在增加。
C糖果产品中的甘油二酯的结晶抑制
可可脂等价物(CBE)由特定脂肪配制而成，诸如分馏的棕榈油、尤其是棕榈的中间馏分(PMF)、分馏的牛油树脂肪以及许多其他外来脂肪。由于成本原因，在CBE中包括尽可能多的PMF是有利的。事实上，许多CBE可能仅含有棕榈馏分。巧克力加工中最为棘手的方面是脂肪结晶。甘油二酯对结晶产生负面影响，例如脱膜就是一个严重问题(Siew，2001)。
D晶体质量
甘油三酯的质量极大地影响性能，这从标准82％脂肪餐桌人造奶油的含有反式酸的典型油配方与含有典型酯交换棕榈硬脂精部分和棕榈仁作为硬浆的不含反式酸的配方的比较例子中可以看出，二者具有相似的SFC模式。结晶速度和质量降低会引起称为“流油(oiling out)”的情况。这继而需要使用结晶促进剂，诸如硬MAG。此外，延迟晶体稳定的晶体形成会产生称为“沙质(sandiness)”的现象，使得期望的晶体类型的转化最终回复到更加稳定的β形式，从而产生沙质的质地。这种现象是工业类型产品的特定问题。
某些用途
脂肪改良
在高脂肪固体食品(诸如人造奶油、涂抹产品、糖果/巧克力)中所用脂肪的化学生产过程中，反式脂肪酸在加氢(硬化)过程中加入到食物用油中。这使得可以改变食物用油的熔化温度，以确保最终的食品具有适当的稠度，例如对于餐桌人造奶油，虽是固体，但是在室温可以涂抹，或者对于巧克力，在存储条件下是固体，但是在口中会熔化。
然而，化学生产使用大量溶剂，诸如正己烷，这被认为对环境和健康是有害的，应当在使用改良的油/脂肪作为食品成分之前完全去除溶剂。
在许多国家，通过法律法规控制限制对食品生产进行部分加氢，许多主要的食品生产商现在已经转向使用替代的低反式替代物。
通过本发明的方法制备的油可以用作人造奶油和/或涂抹产品的成分。
可可脂替代物/等价物
可可脂含有独特组分，它提供了在口中能够熔化的固体糖果。为了用更为廉价的替代物替换可可脂，对植物油加氢来生产反式脂肪酸，从而提高食品用油的熔点，产生在体温熔化的类似固体糖果。这些改良的植物油称为可可脂等价物(CBE)，或者在改良的脂肪增强巧克力产品的特性的情形中称为可可脂替代物(CBR)。CBE和CBR的一个主要问题是植物油加氢产生被认为对健康和温度有害的反式脂肪。这导致了具有较高熔化温度的低反式植物油或其馏分的使用。在这方面，棕榈油和棕榈油馏分作为反式CBR/CBE低的主要成分(a major component low in trans CBR/CBE)被认为是有利的。
可可脂替代物(CBR)脂肪用于为巧克力产品提供更优越的特性，例如无需回火、减少后硬化、稳定、抗起霜。特别期望使用非月桂酸/非反式脂肪，例如棕榈油。用于CBR中的脂肪的结晶特性在确保产品在口中熔化同时保留上述优越特性之间的适当平衡中起重要作用。出于健康原因，在CBR混合物中使用低反式脂肪，例如棕榈油是特别期望的。EP0293194中描述了棕榈油在CBR中的应用。
按照本发明的方法制备的油可以用作巧克力的成分，例如在脂肪混合物中作为可可脂的替代物和/或等价物。
某些用于本发明中的甘油二酯：甘油酰基转移酶的序列
用于本发明和/或本发明的方法中的合适甘油二酯：甘油酰基转移酶可能包含如下氨基酸序列的任何之一和/或可以由如下核苷酸序列编码：
Termobifida\fusca GDSx 548 aa
SEQ ID No.58
ZP 00058717
1 mlphpagerg evgaffallv gtpqdrrlrl echetrplrg rcgcgerrvp pltlpgdgvl
61 cttsstrdae tvwrkhlqpr pdggfrphlg vgcllagqgs pgvlwcgreg crfevcrrdt
121 pglsrtrngd ssppfragws lppkcgeisq sarktpavpr ysllrtdrpd gprgrfvgsg
181 praatrrrlf lgipalvlvt altlvlavpt gretlwrmwc eatqdwclgv pvdsrgqpae
241 dgeflllspv qaatwgnyya lgdsyssgdg ardyypgtav kggcwrsana ypelvaeayd
301 faghlsflac sgqrgyamld aidevgsqld wnsphtslvt igiggndlgf stvlktcmvr
361 vplldskact dqedairkrm akfettfeel isevrtrapd arilvvgypr ifpeeptgay
421 ytltasnqrw lnetiqefnq qlaeavavhd eeiaasggvg svefvdvyha ldgheigsde
481 pwvngvqlrd latgvtvdrs tfhpnaaghr avgervieqi etgpgrplya tfavvagatv
541 dtlagevg
SEQ ID No.59
nt
1 ggtggtgaac cagaacaccc ggtcgtcggc gtgggcgtcc aggtgcaggt gcaggttctt
61 caactgctcc agcaggatgc cgccgtggcc gtgcacgatg gccttgggca ggcctgtggt
121 ccccgacgag tacagcaccc atagcggatg gtcgaacggc agcggggtga actccagttc
181 cgcgccttcg cccgcggctt cgaactccgc ccaggacagg gtgtcggcga cagggccgca
241 gcccaggtac ggcaggacga cggtgtgctg caggctgggc atgccgtcgc gcagggcttt
301 gagcacgtca cggcggtcga agtccttacc gccgtagcgg tagccgtcca cggccagcag
361 cactttcggt tcgatctgcg cgaaccggtc gaggacgctg cgcaccccga agtcggggga
421 acaggacgac caggtcgcac cgatcgcggc gcaggcgagg aatgcggccg tcgcctcggc
481 gatgttcggc aggtaggcca cgacccggtc gccggggccc accccgaggc tgcggagggc
541 cgcagcgatc gcggcggtgc gggtccgcag ttctccccag gtccactcgg tcaacggccg
601 gagttcggac gcgtgccgga tcgccacggc tgatgggtca cggtcgcgga agatgtgctc
661 ggcgtagttg agggtggcgc cggggaacca gacggcgccg ggcatggcgt cggaggcgag
721 cactgtggtg tacggggtgg cggcgcgcac ccggtagtac tcccagatcg cggaccagaa
781 tccttcgagg tcggttaccg accagcgcca cagtgcctcg tagtccggtg cgtccacacc
841 gcggtgctcc cgcacccagc gggtgaacgc ggtgaggttg gcgcgttctt tgcgctcctc
901 gtcgggactc cacaggatcg gcggctgcgg cttgagtgtc atgaaacgcg accccttcgt
961 ggacggtgcg gatgcggtga gcgtcgggtg cctcccctaa cgctccccgg tgacggagtg
1021 ttgtgcacca catctagcac gcgggacgcg gaaaccgtat ggagaaaaca cctacaaccc
1081 cggccggacg gtgggtttcg gccacactta ggggtcgggt gcctgcttgc cgggcagggc
1141 agtcccgggg tgctgtggtg cgggcgggag ggctgtcgct tcgaggtgtg ccggcgggac
1201 actccgggcc tcagccgtac ccgcaacggg gacagttctc ctcccttccg ggctggatgg
1261 tcccttcccc cgaaatgcgg cgagatctcc cagtcagccc ggaaaacacc cgctgtgccc
1321 aggtactctt tgcttcgaac agacaggccg gacggtccac gggggaggtt tgtgggcagc
1381 ggaccacgtg cggcgaccag acgacggttg ttcctcggta tccccgctct tgtacttgtg
1441 acagcgctca cgctggtctt ggctgtcccg acggggcgcg agacgctgtg gcgcatgtgg
1501 tgtgaggcca cccaggactg gtgcctgggg gtgccggtcg actcccgcgg acagcctgcg
1561 gaggacggcg agtttctgct gctttctccg gtccaggcag cgacctgggg gaactattac
1621 gcgctcgggg attcgtactc ttcgggggac ggggcccgcg actactatcc cggcaccgcg
1681 gtgaagggcg gttgctggcg gtccgctaac gcctatccgg agctggtcgc cgaagcctac
1741 gacttcgccg gacacttgtc gttcctggcc tgcagcggcc agcgcggcta cgccatgctt
1801 gacgctatcg acgaggtcgg ctcgcagctg gactggaact cccctcacac gtcgctggtg
1861 acgatcggga tcggcggcaa cgatctgggg ttctccacgg ttttgaagac ctgcatggtg
1921 cgggtgccgc tgctggacag caaggcgtgc acggaccagg aggacgctat ccgcaagcgg
1981 atggcgaaat tcgagacgac gtttgaagag ctcatcagcg aagtgcgcac ccgcgcgccg
2041 gacgcccgga tccttgtcgt gggctacccc cggatttttc cggaggaacc gaccggcgcc
2101 tactacacgc tgaccgcgag caaccagcgg tggctcaacg aaaccattca ggagttcaac
2161 cagcagctcg ccgaggctgt cgcggtccac gacgaggaga ttgccgcgtc gggcggggtg
2221 ggcagcgtgg agttcgtgga cgtctaccac gcgttggacg gccacgagat cggctcggac
2281 gagccgtggg tgaacggggt gcagttgcgg gacctcgcca ccggggtgac tgtggaccgc
2341 agtaccttcc accccaacgc cgctgggcac cgggcggtcg gtgagcgggt catcgagcag
2401 atcgaaaccg gcccgggccg tccgctctat gccactttcg cggtggtggc gggggcgacc
2461 gtggacactc tcgcgggcga ggtggggtga cccggcttac cgtccggccc gcaggtctgc
2521 gagcactgcg gcgatctggt ccactgccca gtgcagttcg tcttcggtga tgaccagcgg
2581 cggggagagc cggatcgttg agccgtgcgt gtctttgacg agcacacccc gctgcaggag
2641 ccgttcgcac agttctcttc cggtggccag agtcgggtcg acgtcgatcc cagcccacag
2701 gccgatgctg cgggccgcga ccacgccgtt gccgaccagt tggtcgaggc gggcgcgcag
2761 cacgggggcg agggcgcgga catggtccag gtaagggccg tcgcggacga ggctcaccac
2821 ggcagtgccg accgcgcagg cgagggcgtt gccgccgaag gtgctgccgt gctggccggg
2881 gcggatcacg tcgaagactt ccgcgtcgcc taccgccgcc gccacgggca ggatgccgcc
2941 gcccagcgct ttgccgaaca ggtagatatc ggcgtcgact ccgctgtggt cgcaggcccg
//
Termobifida\fusca\-GDSx
SEQ ID No.60
1 vgsgpraatr rrlflgipal vlvtaltlvl avptgretlw rmwceatqdw clgvpvdsrg
61 qpaedgefll lspvqaatwg nyyalgdsys sgdgardyyp gtavkggcwr sanaypelva
121 eaydfaghls flacsgqrgy amldaidevg sqldwnspht slvtigiggn dlgfstvlkt
181 cmvrvpllds kactdqedai rkrmakfett feelisevrt rapdarilvv gyprifpeep
241 tgayytltas nqrwlnetiq efnqqlaeav avhdeeiaas ggvgsvefvd vyhaldghei
301 gsdepwvngv qlrdlatgvt vdrstfhpna aghravgerv ieqietgpgr plyatfavva
361 gatvdtlage vg
Corynebacterium\effciens\GDSx 300aa
SEQ ID No.61
1 mrttviaasa llllagcadg areetagapp gessggiree gaeastsitd vyialgdsya
61 amggrdqplr gepfclrssg nypellhaev tdltcqgavt gdlleprtlg ertlpaqvda
121 ltedttlvtl siggndlgfg evagcireri agenaddcvd llgetigeql dqlppqldrv
181 heairdragd aqvvvtgylp lvsagdcpel gdvseadrrw aveltgqine tvreaaerhd
241 alfvlpddad ehtscappqq rwadiqgqqt dayplhptsa gheamaaavr dalglepvqp
//
SEQ ID No.62
nt
1 ttctggggtg ttatggggtt gttatcggct cgtcctgggt ggatcccgcc aggtggggta
61 ttcacggggg acttttgtgt ccaacagccg agaatgagtg ccctgagcgg tgggaatgag
121 gtgggcgggg ctgtgtcgcc atgagggggc ggcgggctct gtggtgcccc gcgacccccg
181 gccccggtga gcggtgaatg aaatccggct gtaatcagca tcccgtgccc accccgtcgg
241 ggaggtcagc gcccggagtg tctacgcagt cggatcctct cggactcggc catgctgtcg
301 gcagcatcgc gctcccgggt cttggcgtcc ctcggctgtt ctgcctgctg tccctggaag
361 gcgaaatgat caccggggag tgatacaccg gtggtctcat cccggatgcc cacttcggcg
421 ccatccggca attcgggcag ctccgggtgg aagtaggtgg catccgatgc gtcggtgacg
481 ccatagtggg cgaagatctc atcctgctcg agggtgctca ggccactctc cggatcgata
541 tcgggggcgt ccttgatggc gtccttgctg aaaccgaggt gcagcttgtg ggcttccaat
601 ttcgcaccac ggagcgggac gaggctggaa tgacggccga agagcccgtg gtggacctca
661 acgaaggtgg gtagtcccgt gtcatcattg aggaacacgc cctccaccgc acccagcttg
721 tggccggagt tgtcgtaggc gctggcatcc agaagggaaa cgatctcata tttgtcggtg
781 tgctcagaca tgatcttcct ttgctgtcgg tgtctggtac taccacggta gggctgaatg
841 caactgttat ttttctgtta ttttaggaat tggtccatat cccacaggct ggctgtggtc
901 aaatcgtcat caagtaatcc ctgtcacaca aaatgggtgg tgggagccct ggtcgcggtt
961 ccgtgggagg cgccgtgccc cgcaggatcg tcggcatcgg cggatctggc cggtaccccg
1021 cggtgaataa aatcattctg taaccttcat cacggttggt tttaggtatc cgcccctttc
1081 gtcctgaccc cgtccccggc gcgcgggagc ccgcgggttg cggtagacag gggagacgtg
1141 gacaccatga ggacaacggt catcgcagca agcgcattac tccttctcgc cggatgcgcg
1201 gatggggccc gggaggagac cgccggtgca ccgccgggtg agtcctccgg gggcatccgg
1261 gaggaggggg cggaggcgtc gacaagcatc accgacgtct acatcgccct cggggattcc
1321 tatgcggcga tgggcgggcg ggatcagccg ttacggggtg agccgttctg cctgcgctcg
1381 tccggtaatt acccggaact cctccacgca gaggtcaccg atctcacctg ccagggggcg
1441 gtgaccgggg atctgctcga acccaggacg ctgggggagc gcacgctgcc ggcgcaggtg
1501 gatgcgctga cggaggacac caccctggtc accctctcca tcgggggcaa tgacctcgga
1561 ttcggggagg tggcgggatg catccgggaa cggatcgccg gggagaacgc tgatgattgc
1621 gtggacctgc tgggggaaac catcggggag cagctcgatc agcttccccc gcagctggac
1681 cgcgtgcacg aggctatccg ggaccgcgcc ggggacgcgc aggttgtggt caccggttac
1741 ctgccgctcg tgtctgccgg ggactgcccc gaactggggg atgtctccga ggcggatcgt
1801 cgttgggcgg ttgagctgac cgggcagatc aacgagaccg tgcgcgaggc ggccgaacga
1861 cacgatgccc tctttgtcct gcccgacgat gccgatgagc acaccagttg tgcaccccca
1921 cagcagcgct gggcggatat ccagggccaa cagaccgatg cctatccgct gcacccgacc
1981 tccgccggcc atgaggcgat ggccgccgcc gtccgggacg cgctgggcct ggaaccggtc
2041 cagccgtagc gccgggcgcg cgcttgtcga cgaccaaccc atgccaggct gcagtcacat
2101 ccgcacatag cgcgcgcggg cgatggagta cgcaccatag aggatgagcc cgatgccgac
2161 gatgatgagc agcacactgc cgaagggttg ttccccgagg gtgcgcagag ccgagtccag
2221 acctgcggcc tgctccggat catgggccca accggcgatg acgatcaaca cccccaggat
2281 cccgaaggcg ataccacggg cgacataacc ggctgttccg gtgatgatga tcgcggtccc
2341 gacctgccct gaccccgcac ccgcctccag atcctcccgg aaatcccggg tggccccctt
2401 ccagaggttg tagacacccg cccccagtac caccagcccg gcgaccacaa ccagcaccac
2461 accccagggt tgggatagga cggtggcggt gacatcggtg gcggtctccc catcggaggt
2521 gctgccgccc cgggcgaagg tggaggtggt caccgccagg gagaagtaga ccatggccat
2581 gaccgccccc ttggcccttt ccttgaggtc ctcgcccgcc agcagctggc tcaattgcca
2641 gagtcccagg gccgccaggg cgatgacggc aacccacagg aggaactgcc cacccggagc
2701 ctccgcgatg gtggccaggg cacctgaatt cgaggcctca tcacccgaac cgccggatcc
2761 agtggcgatg cgcaccgcga tccacccgat gaggatgtgc agtatgccca ggacaatgaa
2821 accacctctg gccagggtgg tcagcgcggg gtggtcctcg gcctggtcgg cagcccgttc
2881 gatcgtccgt ttcgcggatc tggtgtcgcc cttatccata gctcccattg aaccgccttg
2941 aggggtgggc ggccactgtc agggcggatt gtgatctgaa ctgtgatgtt ccatcaaccc
//
Novosphingobium\aromaticivorans\GDSx 284aa
SEQ ID No.63
ZP 00094165
1 mgqvklfarr capvllalag lapaatvare aplaegaryv algssfaagp gvgpnapgsp
61 ercgrgtlny phllaealkl dlvdatcsga tthhvlgpwn evppqidsvn gdtrlvtlti
121 ggndvsfvgn ifaaacekma spdprcgkwr eiteeewqad eermrsivrq iharaplarv
181 vvvdyitvlp psgtcaamai spdrlaqsrs aakrlarita rvareegasl lkfshisrrh
241 hpcsakpwsn glsapaddgi pvhpnrlgha eaaaalvklv klmk
//
SEQ ID No.64
1 tgccggaact caagcggcgt ctagccgaac tcatgcccga aagcgcgtgg cactatcccg
61 aagaccaggt ctcggacgcc agcgagcgcc tgatggccgc cgaaatcacg cgcgaacagc
121 tctaccgcca gctccacgac gagctgccct atgacagtac cgtacgtccc gagaagtacc
181 tccatcgcaa ggacggttcg atcgagatcc accagcagat cgtgattgcc cgcgagacac
241 agcgtccgat cgtgctgggc aagggtggcg cgaagatcaa ggcgatcgga gaggccgcac
301 gcaaggaact ttcgcaattg ctcgacacca aggtgcacct gttcctgcat gtgaaggtcg
361 acgagcgctg ggccgacgcc aaggaaatct acgaggaaat cggcctcgaa tgggtcaagt
421 gaagctcttc gcgcgccgct gcgccccagt acttctcgcc cttgccgggc tggctccggc
481 ggctacggtc gcgcgggaag caccgctggc cgaaggcgcg cgttacgttg cgctgggaag
541 ctccttcgcc gcaggtccgg gcgtggggcc caacgcgccc ggatcgcccg aacgctgcgg
601 ccggggcacg ctcaactacc cgcacctgct cgccgaggcg ctcaagctcg atctcgtcga
661 tgcgacctgc agcggcgcga cgacccacca cgtgctgggc ccctggaacg aggttccccc
721 tcagatcgac agcgtgaatg gcgacacccg cctcgtcacc ctgaccatcg gcggaaacga
781 tgtgtcgttc gtcggcaaca tcttcgccgc cgcttgcgag aagatggcgt cgcccgatcc
841 gcgctgcggc aagtggcggg agatcaccga ggaagagtgg caggccgacg aggagcggat
901 gcgctccatc gtacgccaga tccacgcccg cgcgcctctc gcccgggtgg tggtggtcga
961 ttacatcacg gtcctgccgc catcaggcac ttgcgctgcc atggcgattt cgccggaccg
1021 gctggcccag agccgcagcg ccgcgaaacg gcttgcccgg attaccgcac gggtcgcgcg
1081 agaagagggt gcatcgctgc tcaagttctc gcatatctcg cgccggcacc atccatgctc
1141 tgccaagccc tggagcaacg gcctttccgc cccggccgac gacggcatcc cggtccatcc
1201 gaaccggctc ggacatgctg aagcggcagc ggcgctggtc aagcttgtga aattgatgaa
1261 gtagctactg cactgatttc aaatagtatt gcctgtcagc tttccagccc ggattgttgc
1321 agcgcaacag aaacttgtcc gtaatggatt gatggtttat gtcgctcgca aattgccgtc
1381 gaagggaacg ggcgcgtcgc tcgttaacgt cctgggtgca gcagtgacgg agcgcgtgga
1441 tgagtgatac tggcggtgtc atcggtgtac gcgccgccat tcccatgcct gtacgcgccg
//
S.coelicolor\GDSx 268aa
SEQ ID No.65
NP 625998.
1 mrrfrlvgfl sslvlaagaa ltgaataqaa qpaaadgyva lgdsyssgvg agsyisssgd
61 ckrstkahpy lwaaahspst fdftacsgar tgdvlsgqlg plssgtglvs isiggndagf
121 adtmttcvla sessclsria taeayvdstl pgkldgvysa isdkapnahv vvigyprfyk
181 lgttciglse tkrtainkas dhlntvlaqr aaahgftfgd vrttftghel csgspwlhsv
241 nwlnigesyh ptaagqsggy lpvlngaa
//
SEQ ID No.66
1 cccggcggcc cgtgcaggag cagcagccgg cccgcgatgt cctcgggcgt cgtcttcatc
61 aggccgtcca tcgcgtcggc gaccggcgcc gtgtagttgg cccggacctc gtcccaggtg
121 cccgcggcga tctggcgggt ggtgcggtgc gggccgcgcc gaggggagac gtaccagaag
181 cccatcgtca cgttctccgg ctgcggttcg ggctcgtccg ccgctccgtc cgtcgcctcg
241 ccgagcacct tctcggcgag gtcggcgctg gtcgccgtca ccgtgacgtc ggcgccccgg
301 ctccagcgcg agatcagcag cgtccagccg tcgccctccg ccagcgtcgc gctgcggtcg
361 tcgtcgcggg cgatccgcag cacgcgcgcg ccgggcggca gcagcgtggc gccggaccgt
421 acgcggtcga tgttcgccgc gtgcgagtac ggctgctcac ccgtggcgaa acggccgagg
481 aacagcgcgt cgacgacgtc ggacggggag tcgctgtcgt ccacgttgag ccggatcggc
541 agggcttcgt gcgggttcac ggacatgtcg ccatgatcgg gcacccggcc gccgcgtgca
601 cccgctttcc cgggcacgca cgacaggggc tttctcgccg tcttccgtcc gaacttgaac
661 gagtgtcagc catttcttgg catggacact tccagtcaac gcgcgtagct gctaccacgg
721 ttgtggcagc aatcctgcta agggaggttc catgagacgt ttccgacttg tcggcttcct
781 gagttcgctc gtcctcgccg ccggcgccgc cctcaccggg gcagcgaccg cccaggcggc
841 ccaacccgcc gccgccgacg gctatgtggc cctcggcgac tcctactcct ccggggtcgg
901 agcgggcagc tacatcagct cgagcggcga ctgcaagcgc agcacgaagg cccatcccta
961 cctgtgggcg gccgcccact cgccctccac gttcgacttc accgcctgtt ccggcgcccg
1021 tacgggtgat gttctctccg gacagctcgg cccgctcagc tccggcaccg gcctcgtctc
1081 gatcagcatc ggcggcaacg acgccggttt cgccgacacc atgacgacct gtgtgctcca
1141 gtccgagagc tcctgcctgt cgcggatcgc caccgccgag gcgtacgtcg actcgacgct
1201 gcccggcaag ctcgacggcg tctactcggc aatcagcgac aaggcgccga acgcccacgt
1261 cgtcgtcatc ggctacccgc gcttctacaa gctcggcacc acctgcatcg gcctgtccga
1321 gaccaagcgg acggcgatca acaaggcctc cgaccacctc aacaccgtcc tcgcccagcg
1381 cgccgccgcc cacggcttca ccttcggcga cgtacgcacc accttcaccg gccacgagct
1441 gtgctccggc agcccctggc tgcacagcgt caactggctg aacatcggcg agtcgtacca
1501 ccccaccgcg gccggccagt ccggtggcta cctgccggtc ctcaacggcg ccgcctgacc
1561 tcaggcggaa ggagaagaag aaggagcgga gggagacgag gagtgggagg ccccgcccga
1621 cggggtcccc gtccccgtct ccgtctccgt cccggtcccg caagtcaccg agaacgccac
1681 cgcgtcggac gtggcccgca ccggactccg cacctccacg cgcacggcac tctcgaacgc
1741 gccggtgtcg tcgtgcgtcg tcaccaccac gccgtcctgg cgcgagcgct cgccgcccga
1801 cgggaaggac agcgtccgcc accccggatc ggagaccgac ccgtccgcgg tcacccaccg
1861 gtagccgacc tccgcgggca gccgcccgac cgtgaacgtc gccgtgaacg cgggtgcccg
1921 gtcgtgcggc ggcggacagg cccccgagta gtgggtgcgc gagcccacca cggtcacctc
1981 caccgactgc gctgcggggc
//
S.avermitilis\GDSx 269aa
SEQ ID No.67
NP 827753.
1 mrrsritayv tslllavgca ltgaataqas paaaatgyva lgdsyssgvg agsylsssgd
61 ckrsskaypy lwqaahspss fsfmacsgar tgdvlanqlg tlnsstglvs ltiggndagf
121 sdvmttcvla sdsaclsrin takayvdstl pgqldsvyta istkapsahv avlgyprfyk
181 lggsclagls etkrsainda adylnsaiak raadhgftfg dvkstftghe icssstwlhs
241 ldllnigqsy hptaagqsgg ylpvmnsva
//
SEQ ID No.68
1 ccaccgccgg gtcggcggcg agtctcctgg cctcggtcgc ggagaggttg gccgtgtagc
61 cgttcagcgc ggcgccgaac gtcttcttca ccgtgccgcc gtactcgttg atcaggccct
121 tgcccttgct cgacgcggcc ttgaagccgg tgcccttctt gagcgtgacg atgtagctgc
181 ccttgatcgc ggtgggggag ccggcggcga gcaccgtgcc ctcggccggg gtggcctggg
241 cgggcagtgc ggtgaatccg cccacgaggg cgccggtcgc cacggcggtt atcgcggcga
301 tccggatctt cttgctacgc agctgtgcca tacgagggag tcctcctctg ggcagcggcg
361 cgcctgggtg gggcgcacgg ctgtgggggg tgcgcgcgtc atcacgcaca cggccctgga
421 gcgtcgtgtt ccgccctggg ttgagtaaag cctcggccat ctacgggggt ggctcaaggg
481 agttgagacc ctgtcatgag tctgacatga gcacgcaatc aacggggccg tgagcacccc
541 ggggcgaccc cggaaagtgc cgagaagtct tggcatggac acttcctgtc aacacgcgta
601 gctggtacga cggttacggc agagatcctg ctaaagggag gttccatgag acgttcccga
661 attacggcat acgtgacctc actcctcctc gccgtcggct gcgccctcac cggggcagcg
721 acggcgcagg cgtccccagc cgccgcggcc acgggctatg tggccctcgg cgactcgtac
781 tcgtccggtg tcggcgccgg cagctacctc agctccagcg gcgactgcaa gcgcagttcg
841 aaggcctatc cgtacctctg gcaggccgcg cattcaccct cgtcgttcag tttcatggct
901 tgctcgggcg ctcgtacggg tgatgtcctg gccaatcagc tcggcaccct gaactcgtcc
961 accggcctgg tctccctcac catcggaggc aacgacgcgg gcttctccga cgtcatgacg
1021 acctgtgtgc tccagtccga cagcgcctgc ctctcccgca tcaacacggc gaaggcgtac
1081 gtcgactcca ccctgcccgg ccaactcgac agcgtgtaca cggcgatcag cacgaaggcc
1141 ccgtcggccc atgtggccgt gctgggctac ccccgcttct acaaactggg cggctcctgc
1201 ctcgcgggcc tctcggagac caagcggtcc gccatcaacg acgcggccga ctatctgaac
1261 agcgccatcg ccaagcgcgc cgccgaccac ggcttcacct tcggcgacgt caagagcacc
1321 ttcaccggcc atgagatctg ctccagcagc acctggctgc acagtctcga cctgctgaac
1381 atcggccagt cctaccaccc gaccgcggcc ggccagtccg gcggctatct gccggtcatg
1441 aacagcgtgg cctgagctcc cacggcctga atttttaagg cctgaatttt taaggcgaag
1501 gtgaaccgga agcggaggcc ccgtccgtcg gggtctccgt cgcacaggtc accgagaacg
1561 gcacggagtt ggacgtcgtg cgcaccgggt cgcgcacctc gacggcgatc tcgttcgaga
1621 tcgttccgct cgtgtcgtac gtggtgacga acacctgctt ctgctgggtc tttccgccgc
1681 tcgccgggaa ggacagcgtc ttccagcccg gatccgggac ctcgcccttc ttggtcaccc
1741 agcggtactc cacctcgacc ggcacccggc ccaccgtgaa ggtcgccgtg aacgtgggcg
1801 cctgggcggt gggcggcggg caggcaccgg agtagtcggt gtgcacgccg gtgaccgtca
1861 ccttcacgga ctgggccggc ggggtcgtcg taccgccgcc gccaccgccg cctcccggag
1921 tggagcccga gctgtggtcg cccccgccgt cggcgttgtc gtcctcgggg gttttcgaac
//
链霉菌甘油二酯：甘油酰基转移酶
SEQ ID No.69
ACAGGCCGATGCACGGAACCGTACCTTTCCGCAGTGAAGCGCTCTCCCCCCATCGTTCGC
CGGGACTTCATCCGCGATTTTGGCATGAACACTTCCTTCAACGCGCGTAGCTTGCTACAA
GTGCGGCAGCAGACCCGCTCGTTGGAGGCTCAGTGAGATTGACCCGATCCCTGTCGGCCG
CATCCGTCATCGTCTTCGCCCTGCTGCTCGCGCTGCTGGGCATCAGCCCGGCCCAGGCAG
CCGGCCCGGCCTATGTGGCCCTGGGGGATTCCTATTCCTCGGGCAACGGCGCCGGAAGTT
ACATCGATTCGAGCGGTGACTGTCACCGCAGCAACAACGCGTACCCCGCCCGCTGGGCGG
CGGCCAACGCACCGTCCTCCTTCACCTTCGCGGCCTGCTCGGGAGCGGTGACCACGGATG
TGATCAACAATCAGCTGGGCGCCCTCAACGCGTCCACCGGCCTGGTGAGCATCACCATCG
GCGGCAATGACGCGGGCTTCGCGGACGCGATGACCACCTGCGTCACCAGCTCGGACAGCA
CCTGCCTCAACCGGCTGGCCACCGCCACCAACTACATCAACACCACCCTGCTCGCCCGGC
TCGACGCGGTCTACAGCCAGATCAAGGCCCGTGCCCCCAACGCCCGCGTGGTCGTCCTCG
GCTACCCGCGCATGTACCTGGCCTCGAACCCCTGGTACTGCCTGGGCCTGAGCAACACCA
AGCGCGCGGCCATCAACACCACCGCCGACACCCTCAACTCGGTGATCTCCTCCCGGGCCA
CCGCCCACGGATTCCGATTCGGCGATGTCCGCCCGACCTTCAACAACCACGAACTGTTCT
TCGGCAACGACTGGCTGCACTCACTCACCCTGCCGGTGTGGGAGTCGTACCACCCCACCA
GCACGGGCCATCAGAGCGGCTATCTGCCGGTCCTCAACGCCAACAGCTCGACCTGATCAA
CGCACGGCCGTGCCCGCCCCGCGCGTCACGCTCGGCGCGGGCGCCGCAGCGCGTTGATCA
GCCCACAGTGCCGGTGACGGTCCCACCGTCACGGTCGAGGGTGTACGTCACGGTGGCGCC
GCTCCAGAAGTGGAACGTCAGCAGGACCGTGGAGCCGTCCCTGACCTCGTCGAAGAACTC
CGGGGTCAGCGTGATCACCCCTCCCCCGTAGCCGGGGGCGAAGGCGGCGCCGAACTCCTT
GTAGGACGTCCAGTCGTGCGGCCCGGCGTTGCCACCGTCCGCGTAGACCGCTTCCATGGT
CGCCAGCCGGTCCCCGCGGAACTCGGTGGGGATGTCCGTGCCCAAGGTGGTCCCGGTGGT
GTCCGAGAGCACCGGGGGCTCGTACCGGATGATGTGCAGATCCAAAGAATT
链霉菌甘油二酯：甘油酰基转移酶
SEQ ID No.70
MRLTRSLSAASVIVFALLLALLGISPAQAAGPAYVALGDSYSSGNGAGSYIDSSGDCHRSN
NAYPARWAAANAPSSFTFAACSGAVTTDVINNQLGALNASTGLVSITIGGNDAGFADAMTT
CVTSSDSTCLNRLATATNYINTTLLARLDAVYSQIKARAPNARVVVLGYPRMYLASNPWYC
LGLSNTKRAAINTTADTLNSVISSRATAHGFRFGDVRPTFNNHELFFGNDWLHSLTLPVWE
SYHPTSTGHQSGYLPVLNANSST
本发明的甘油二酯：甘油酰基转移酶的鉴定
酶促减少棕榈油中的甘油二酯的测定法
将1克含有7％甘油二酯的棕榈油称量到有盖子的玻璃器皿中。加入50mg甘油和10μl酶溶液。在40℃的加热室中用磁力搅拌器将反应混合物搅拌20小时。通过加热到100℃达10分钟来终止酶反应。用相同的方式处理添加了10μl水来替代酶溶液的参比样本。按照标准的程序(参见下文)，通过GLC来分析样本，并计算脂肪酸、甘油一酯和甘油二酯的含量。
计算：
从GLC分析的结果，可以计算游离脂肪酸的增加量和甘油二酯的减少量：
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；
Mv Fa＝脂肪酸的平均分子量
Δ％甘油二酯＝％甘油二酯(对照)-％甘油二酯(酶)；
Mv Di＝甘油二酯的平均分子量；
转移酶活性计算为总酶促活性的百分比：
GLC分析
配备了WCOT熔融石英柱12.5m×0.25mm ID×0.1μ膜厚度5％苯基-甲基-硅树脂(购自Chrompack的CP Sil 8 CB)的Perkin Elmer Autosystem9000 Capillary Gas Chromatograph即毛细管气相层析自动系统
运载气体：氦
注射器：PSSI冷分流注射(初始温度50℃，加热至385℃)，体积1.0μl
检测仪FID：395℃
烤箱程序： 1 2 3
烤箱温度，℃ 90 280 350
等温，时间，分 1 0 10
升温速率，℃/分 15 4
样本制备：将30mg样品溶于9ml含有内部标准物十七烷(0.5mg/ml)的庚烷∶Pyridin(2∶1)。将300μl样本溶液转移到曲颈瓶(crimp vial)中，添加300μl MSTFA(N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid)，并于60℃反应20分钟。
分离的
一方面，优选的是，本发明所使用的多肽或蛋白质是分离形式的。术语“分离的”指序列至少基本上不含至少一种序列在自然界中天然与之相连且在自然界中发现天然与之相连的其它成分。
纯化的
一方面，优选的是，本发明所使用的多肽或蛋白质是纯化形式的。术语“纯化的”指序列处于相对较纯的状态-例如至少约51％纯、或至少约75％纯、或至少约80％纯、或至少约90％纯、或至少约95％纯、或至少约98％纯。
克隆编码依照本发明的多肽的核苷酸序列
可以由生成具有本文定义的具体特性之多肽或适于更改之多肽的任何细胞或生物体分离编码所述多肽的核苷酸序列。本领域众所周知用于分离核苷酸序列的多种方法。
例如，可以使用来自生成多肽的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果多肽的氨基酸序列是已知的，那么可以合成经标记寡核苷酸探针并用于由自生物体制备的基因组文库鉴定编码多肽的克隆。或者，可以将含有与另一种已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针用于鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况中，使用较低严谨度的杂交和清洗条件。
或者，可以如下鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA片段插入表达载体(诸如质粒)，用由此得到的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将经转化细菌涂布在含有受多肽抑制的酶的琼脂上，从而容许表达多肽的克隆得到鉴定。
又或者，可以通过已经建立的标准方法通过人工合成来制备编码多肽的核苷酸序列，例如Beucage S.L.等人，1981，Tetrahedron Letters 22：1859-1869描述的磷脒(phosphoroamidite)法或Matthes等人，1984，EMBO J.3：801-805描述的方法。在磷脒法中，对寡核苷酸进行合成(例如在自动化DNA合成仪中)、纯化、退火、连接、并克隆到合适的载体中。
核苷酸序列可以是混合的基因组与合成来源、混合的合成与cDNA来源、或混合的基因组与cDNA来源，它们是依照标准技术通过连接合成的、基因组的、或cDNA来源(根据需要)的片段而得到的。每一个连接片段对应于完整核苷酸序列的各个部分。还可以使用特异引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备DNA序列，例如US 4,683,202或Saiki P K等人，Science 1988，239：487-491所述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列。术语“核苷酸序列”在用于本文时指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同系物、片段、和衍生物(诸如它的一部分)。核苷酸序列可以是基因组、合成、或重组来源的，可以是双链，或是代表有义链或反义链的单链。
术语“核苷酸序列”在涉及本发明时包括基因组DNA、cDNA、合成DNA、和RNA。优选的是，它指DNA，更优选编码序列的cDNA。
在一个优选的实施方案中，当本身编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列在其天然环境中与其同样处于天然环境的天然相关序列相连时，本发明不覆盖这样的天然核苷酸序列。为了便于提及，我们将此优选实施方案称为“非天然核苷酸序列”。在这个方面，术语“天然核苷酸序列”指处于其天然环境且与其同样处于天然环境的天然相关完整启动子可操作连接时的完整核苷酸序列。由此，可以通过核苷酸序列在其天然生物体中表达本发明的多肽，但是其中核苷酸序列没有处在生物体内其天然相关启动子的控制之下。
优选的是，多肽不是天然多肽。在这个方面，术语“天然多肽”指处于其天然环境且通过其天然核苷酸序列表达时的完整多肽。
通常，使用重组DNA技术来制备编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列(即重组DNA)。然而，在本发明的一个备选实施方案中，可以使用本领域众所周知的化学法合成整个或部分核苷酸序列(见CaruthersMH等人，1980，Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等人，1980，NucAcids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
一旦分离得到编码酶的核苷酸序列，或者鉴定得出编码酶的推定核苷酸序列，可能希望更改选择的核苷酸序列，例如可能希望对序列进行突变，从而制备依照本发明的酶。
可以使用合成寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有期望突变位点侧翼的核苷酸序列。
Morinaga等人，Biotechnology，1984，2：646-649公开了一种合适的方法。Nelson和Long，Analytical Biochemistry，1989，180：147-151描述了将突变导入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。
除了定点诱变(诸如上文所述)以外，可以随机导入突变，例如使用商品化试剂盒，诸如购自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或购自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒。EP 0 583 265涉及优化基于PCR的诱变的方法，它也可以联合使用诱变性DNA类似物，诸如EP 0 866 796所述。错误倾向PCR技术适于生成具有优选特征的脂酰基转移酶变体。WO02/06457涉及脂肪酶的分子进化。
获取新序列的第三种方法是使用任何数目的限制酶或诸如DNA酶I等酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新装配成编码功能性蛋白质的全长核苷酸序列。或者，可以使用一种或多种不同的核苷酸序列，并在重新装配全长核苷酸序列的过程中导入突变。DNA改组和家族改组技术适于生成具有优选特征的脂酰基转移酶变体。适于进行“改组”的方法见EP 0 752 008、EP 1 138 763、EP 1 103 606。改组还可以联合其它DNA诱变形式，正如US6,180,406和WO 01/34835中所述。
由此，有可能在体内或在体外在核苷酸序列中生成大量的定点或随机诱变，并随后通过多种手段对编码的多肽筛选改进的功能。可以使用例如insilico和exo介导的重组方法(见WO 00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)来进行分子进化，其中所生成的变体保留与已知酶或蛋白质的很低同源性。由此获得的这些变体可能具有与已知转移酶的显著结构类似性，但是它们具有很低的氨基酸序列同源性。
作为一个非限制性实例，还可以将多核苷酸序列的突变或天然变体与野生型或其它突变或天然变体重组，从而生成新的变体。也可以对这些新的变体筛选所编码多肽的改进的功能性。
上述和类似分子进化方法的应用容许在没有关于蛋白质结构或功能的任何现有知识的条件下鉴定和选择具有优选特征的本发明酶变体，且容许生成不可预测的但有利的突变或变体。分子进化在本领域中用于优化或改变酶活性的应用有许多例子，包括但不限于下列中的一项或多项：优化在宿主细胞或在体外的表达和/或活性、提高酶活性、改变底物和/或产物特异性、提高或降低酶或结构稳定性、改变在优选环境条件(例如温度、pH、底物)中的酶活性/特异性。
正如本领域技术人员清楚知道的，使用分子进化工具，可以改变酶，从而改进酶的功能。
合适的是，本发明所使用的脂酰基转移酶可以是变体，即与亲本酶相比可以包含至少一处氨基酸替代、删除或添加。酶变体保留与亲本酶的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％同源性。合适的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选的是，亲本酶对应于pfam00657共有序列。
在一个优选的实施方案中，脂酰基转移酶变体保留或掺入了至少一个或多个在GDSX、GANDY、和HPT模块中发现的pfam00657共有序列氨基酸残基。
可以使用分子进化工具对酶诸如在水性环境中具有或没有脂酰基转移酶活性的脂肪酶进行突变以导入或增强转移酶活性，由此生成适用于本发明组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂酰基转移酶。
合适的是，本发明所使用的脂酰基转移酶可以是对极性脂质(优选磷脂和/或糖脂)的酶活性比亲本酶升高的变体。优选的是，这些变体没有或还具有对溶血极性脂质的低活性。对极性脂质、磷脂、和/或糖脂的活性升高可以是水解活性和/或转移酶活性或二者组合的结果。
本发明所使用的脂酰基转移酶变体对甘油三脂、和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性可比亲本酶降低。
合适的是，酶变体可没有对甘油三脂和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性。
或者，本发明所使用的酶变体对甘油三脂的活性可升高，和/或对下列中的一种或多种的活性也升高：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油一酯、单半乳糖基甘油一酯。
脂酰基转移酶变体是已知的，而且这些变体中的一种或多种可适用于依照本发明的方法和用途和/或依照本发明的酶组合物。仅作为范例，下列参考文献中描述的脂酰基转移酶变体可以依照本发明使用：Hilton和Buckley，J Biol.Chem.1991年1月15日，266(2)：997-1000；Robertson等人，J.Biol.Chem.1994年1月21日，269(3)：2146-50；Brumlik等人，J.Bacteriol1996年4月，178(7)：2060-4；Peelman等人，Protein Sci.1998年3月，7(3)：587-99。
氨基酸序列
本发明还涵盖具有本文定义的具体特性之多肽的氨基酸序列。
在用于本文时，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
可以由合适的来源制备/分离氨基酸序列，或者可以人工合成，或是可以使用重组DNA技术来制备。
合适的是，可以通过标准技术由本文讲授的分离多肽获得氨基酸序列。
用于由分离多肽测定氨基酸序列的一种合适方法如下：
可以将纯化的多肽冷冻-干燥，并且可以将100μg冷冻-干燥的材料溶于50μl 8M尿素与0.4M碳酸氢铵的混合液pH8.4。可以使溶解的蛋白质于50℃变性并还原15分钟，随后覆盖氮并添加5μl 45mM二硫苏糖醇。冷却至室温后，可以添加5μl 100mM碘乙酰胺，使得半胱氨酸残基于室温在黑暗中在氮中衍生15分钟。
可以向上述反应混合液中添加135μl水和溶于5μl水的5μg内切蛋白酶Lys-C，并于37℃在氮中消化24小时。
可以通过反相HPLC在VYDAC C18柱(0.46×14cm；10μl；The SeparationGroup，California，USA)上分离由此产生的肽，使用溶剂A：0.1％溶于水的TFA和溶剂B：0.1％溶于乙腈的TFA。在N端测序前，可以将选择的肽在Develosil C18柱上使用相同的溶剂系统再次进行层析。可以使用AppliedBiosystems 476A测序仪依照制造商的指示(Applied Biosystems，California，USA)使用脉冲液相快速循环进行测序。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文定义的具体特性之多肽的氨基酸序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列具有一定程度序列同一性或序列同源性的序列(下文称为“同源序列”)的用途。在本文中，术语“同源”指某一实体与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性。在本文中，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应当提供和/或编码保留酶的功能活性和/或提高酶活性的多肽。
在本文中，认为同源序列包括与主题序列可以是至少75、85、或90％相同、优选至少95或98％相同的氨基酸序列。通常，同系物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可以看成是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，在本发明的内容中优选将同源性表述成序列同一性。
在本文中，认为同源序列包括与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)可以是至少75、85、或90％相同、优选至少95或98％相同的核苷酸序列。通常，同系物将包含与主题序列相同的编码活性位点的序列等。尽管同源性也可以看成是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，在本发明的内容中优选将同源性表述成序列同一性。
可以目测进行同源性比较，或者更常用的是借助易于获得的序列比较程序。这些商业性计算机程序能够计算两种或多种序列之间的％同源性。
可以对毗邻序列计算％同源性，即将一种序列与其它序列进行对比，并将一种序列中的每一个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接进行比较，每次一个残基。这称为“无缺口”对比。通常，只对较短数目的残基进行这种无缺口对比。
尽管这是一种非常简单且可靠的方法，然而它未能考虑例如在其它方面相同的成对序列中一个插入或删除将引起后面的氨基酸残基无法进行对比，由此可能导致在进行整体对比时％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法设计成在考虑到可能的插入和删除的情况下生成最佳对比，不过度处罚整体同源性得分。这是通过在序列对比中插入“缺口”以设法使局部同源性最大化而实现的。
然而，这些更加复杂的方法给对比中发生的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的缺口的序列对比(反应了两种比较序列之间的较高相关性)将获得比具有更多缺口的其它序列对比更高的得分。通常使用“仿射缺口代价(Affine gap costs)”，即对缺口的存在处以较高代价，而对缺口中的每一个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然将以较少缺口生成优化对比。大多数对比程序容许更改缺口罚分。然而，在使用这种软件进行序列比较时，优选使用缺省值(default value)。例如在使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的缺省缺口罚分(default gappenalty)是缺口-12且每个延伸为-4。
因此，最大％同源性的计算首先需要生成最佳对比，其中要考虑缺口罚分。适用于进行这种对比的一种计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等人，1984，Nuc.Acids Research，12：387)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第4版，第18章)、FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.403-410)、和GENEWORKS比较工具套。BLAST和FASTA都能进行离线和在线搜索(见Ausubel等人，1999，7.58-7.60)。然而，对于有些应用，优选使用GCG Bestfit程序。还可以使用称为BLAST 2Sequences的一种新工具来比较蛋白质和核苷酸序列(见FEMS Microbiol Lett1999，174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999，177(1)：187-8，
及tatiana @ncbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终的％同源性可以根据同一性进行测量，然而对比过程自身通常不是基于“全是或全非”成对比较。而是，通常使用尺度相似性评分矩阵根据化学相似性或进化距离给每对比较赋予得分。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公开的缺省值或定制的符号比较表(如果提供的话)(进一步的细节见用户手册)。对于有些应用，优选使用GCG软件包的公开缺省值，或者在其它软件的情况中，使用缺省矩阵，诸如BLOSUM62。
或者，可以使用以与CLUSTAL(Higgins DG和Sharp PM，1988，Gene73(1)：237-244)类似的算法为基础的DNASISTM(Hitachi Software)中的多重对比特征来计算％同源性。
一旦软件生成了最佳对比，就有可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常作为序列比较的一部分来执行它，并生成一个数值结果。
序列还可以具有生成沉默改变并导致功能等同物的氨基酸残基删除、插入、或替代。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性本质进行审慎的氨基酸替代，只要保留物质的次要结合活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性头基团(具有相似亲水值)的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。
可以进行保守替代，例如依照下表。第二列同一块中、优选第三列同一行中的氨基酸可以互相替代。
| 脂肪族 | 非极性 | G、A、P |
| I、L、V | ||
| 极性-不带电荷 | C、S、T、M | |
| N、Q | ||
| 极性-带电荷 | D、E | |
| K、R | ||
| 芳香族 | H、F、W、Y |
本发明还涵盖可以发生的同源替代(替代和替换在本文中都用于指用备选氨基酸交换现有氨基酸)，即相似替代，诸如碱性替代碱性、酸性替代酸性、极性替代极性等。也可以发生非同源替代，即由一类残基变成另一类，或者牵涉非天然氨基酸，诸如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸、和苯甘氨酸。
还可以用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸序列变体可以包含合适的间隔基团，它可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间，除了氨基酸间隔物诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基以外，还包括烷基，诸如甲基、乙基、或丙基。变异的另一种形式牵涉类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基的存在，这是本领域技术人员充分理解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指氨基酸残基变体，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而非α-碳原子。用于制备类肽形式的肽的方法在本领域是已知的，例如Simon RJ等人，PNAS，1992，89(20)：9367-9371；以及Horwell DC，Trends Biotechnol.1995，13(4)：132-134。
本发明所使用的或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列可以在其中包含合成的或修饰的核苷酸。本领域知道许多对寡核苷酸的不同类型修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯(methylphosphonate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解可以通过本领域可利用的任何方法修饰本文所述核苷酸序列。可以为了增强核苷酸序列的体内活性或寿命而进行这些修饰。
本发明还涵盖与本文所述序列或其任何衍生物、片段、或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，那么该序列可用作探针，用于在其它生物体中鉴定相似编码序列等。
可以以多种方式获得与本发明序列不是100％同源但属于本发明范围的多核苷酸。可以通过例如探查由一群个体例如来自不同人群的个体制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。另外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同系物，特别是在哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛、和灵长类细胞)中发现的细胞同系物，而且这些同系物及其片段一般能够与本文序列表中所示序列发生选择性杂交。可以通过由其它动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库并在中等至高严谨度条件下用包含所附序列表中任一种序列的完整或部分序列的探针探查这些文库来获得这些序列。类似考虑应用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同系物和等位基因变体。
还可以使用简并PCR获得变体和株系/物种同系物，其中所用引物的序列设计成靶向变体和同系物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。可以通过例如对比来自几个变体/同系物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件来进行序列对比。例如广泛使用GCGWisconsin PileUp程序。
简并PCR所使用的引物将包含一个或多个简并位置，而且将用于比用针对已知序列的单一序列引物克隆序列时更低的严谨条件。
或者，可以通过已鉴定序列的定点诱变来获得这些多核苷酸。这在例如为了多核苷酸序列将要在其中表达的特定宿主细胞而需要沉默密码子序列改变来优化密码子偏爱性时可能是有用的。为了导入限制性多肽识别位点或改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能，可能还需要其它序列改变。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于生成引物，例如PCR引物，用于进行备选扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显现标记物标记的探针，或者可以将多核苷酸克隆到载体中。这些引物、探针、和其它片段的长度将是至少15个、优选至少20个、例如至少25个、30个、或40个核苷酸，而且同样由本文所使用的本发明术语多核苷酸所涵盖。
可以重组、合成、或通过本领域技术人员可利用的任何手段来生成依照本发明的多核苷酸，诸如DNA多核苷酸和探针。还可以通过标准技术对它们进行克隆。
一般而言，将通过合成手段来生成引物，牵涉逐步制造期望的核酸序列，每次一个核苷酸。使用自动化技术实现这一目的的技术在本领域是易于获得的。
通常使用重组方法例如PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来生成较长的多核苷酸。这将牵涉制造期望克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与由动物或人类细胞获得的mRNA或cDNA接触，在扩增期望区域的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合液)，并回收扩增的DNA。引物可以设计成包含合适的限制酶识别位点，从而能够将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列或是能够与本发明的序列或其互补序列发生杂交的序列。
术语“杂交”在用于本文时应当包括“一条核酸链与一条互补链通过碱基配对而结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明还涵盖能够与本文讨论的主题序列或其任何衍生物、片段、或衍生物的互补序列发生杂交的核苷酸序列的用途。
本发明还涵盖能够与本文讨论的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。
杂交条件是以核苷酸结合复合物的溶化温度(Tm)为基础的，正如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego，CA)中讲授的，而且赋予限定的“严谨度”，正如下文所解释的。
最高严谨度通常发生于约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨度发生于比Tm低约5℃至10℃；中等严谨度发生于比Tm低约10℃至20℃；而低严谨度发生于比Tm低约20℃至25℃。正如本领域技术人员将理解的，最高严谨度的杂交可用于鉴定或检测相同核苷酸序列，而中等(或低)严谨度的杂交可用于鉴定或检测相似或相关多核苷酸序列。
优选的是，本发明涵盖能够在高严谨度条件或中等严谨度条件下与编码多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列，所述多肽具有本文定义的具体特性。
更优选的是，本发明涵盖能够在高严谨度条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠pH7.0})下与编码多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列，所述多肽具有本文定义的具体特性。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)发生杂交的核苷酸序列。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)发生杂交的序列的互补核苷酸序列。
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨度条件下与本文讨论的核苷酸序列发生杂交的多核苷酸序列。
在一个优选的方面，本发明覆盖能够在严谨条件(例如50℃和0.2xSSC)下与本文讨论的核苷酸序列或其互补序列发生杂交的核苷酸序列。
在一个更优选的方面，本发明覆盖能够在高严谨条件(例如65℃和0.1xSSC)下与本文讨论的核苷酸序列或其互补序列发生杂交的核苷酸序列。
多肽的表达
可以将本发明所使用的或用于编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列掺入重组复制载体。载体可用于在相容宿主细胞中和/或由相容宿主细胞复制和表达所述核苷酸序列(以多肽的形式)。可以使用控制序列来控制表达，包括启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核启动子和在真核细胞中发挥功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异的启动子。还可以使用嵌合启动子，它包括来自两种或更多上文所述不同启动子的序列元件。
根据使用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列而生成的多肽可以是分泌的，或者是包含在细胞内的。编码序列可以设计成含有信号序列，它指导实质编码序列分泌穿过特定原核或真核细胞膜。
表达载体
术语“表达载体”指能够在体内或在体外进行表达的构建物。
优选的是，将表达载体掺入生物体的基因组。术语“掺入”优选覆盖稳定的掺入基因组。
本发明的或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接调控序列，使得调控序列能够通过合适的宿主生物体提供核苷酸序列的表达，即载体是表达载体。
可以如下文所述将本发明的载体转化到合适的宿主细胞中，从而提供具有本文定义的具体特性之多肽的表达。
载体的选择常常取决于它将要导入的宿主细胞，例如质粒、粘粒、病毒、或噬菌体载体。
载体可以含有一种或多种选择标记基因，诸如赋予抗生素抗性的基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、或四环素抗性。或者，可以通过共转化来进行选择(如WO 91/17243中所述)。
可以在体外使用载体，例如用于生成RNA或用于转染或转化宿主细胞。
由此，在另一个实施方案中，通过将核苷酸序列导入复制载体，将载体导入相容宿主细胞，并在促使载体复制的条件下培养宿主细胞，本发明提供了制备本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列的方法。
载体还可以包含使得载体能够在所讨论宿主细胞中进行复制的核苷酸序列。这些序列的实例有质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、和pIJ702的复制起点。
调控序列
在有些应用中，本发明所使用的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列可以可操作连接调控序列，它能够通过诸如选择的宿主细胞提供核苷酸序列的表达。例如，本发明覆盖包含本发明核苷酸序列且其与这种调控序列可操作连接的载体，即载体是表达载体。
术语“可操作连接”指位置毗邻，其中所述组件的相互关系容许它们以其计划方式发挥功能。与编码序列可操作连接的调控序列的连接方式使得能够在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子和其它表达调控信号。
术语“启动子”采用本领域常用含义，例如RNA聚合酶结合位点。
还可以选择异源调控区，例如启动子、分泌前导序列、和终止子区，从而实现编码具有本文定义的具体特性之酶的核苷酸序列的表达提高。
优选的是，本发明的核苷酸序列可以可操作连接至少一个启动子。
适于指导核苷酸序列在细菌、真菌、或酵母宿主中转录的启动子的实例在本领域是众所周知的。
构建物
术语“构建物”(与诸如“偶联物”、“盒”、和“杂合物”等术语同义)包含依照本发明使用的编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列且其直接或间接与启动子相连。间接相连的实例在本发明的启动子和核苷酸序列之间提供合适的间隔区，诸如内含子序列，诸如Sh1内含子或ADH内含子。术语“融合”在本发明中也是如此，包括直接或间接相连。在有些情况中，该术语不覆盖编码通常与野生型基因启动子相连的蛋白质之核苷酸序列的天然组合，以及当它们都处于其天然环境中时。
构建物甚至可以包含或表达容许选择基因构建物的标记。
对于有些应用，优选的是，构建物包含至少一种本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列且其可操作连接启动子。
宿主细胞
术语“宿主细胞”在涉及本发明时包括包含编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列或上文所述表达载体且用于重组生产具有本文定义的具体特性之多肽的任何细胞。
由此，本发明的另一个实施方案提供了经本发明的核苷酸序列或表达具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。将要选择与所述载体相容的细胞，可以是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母、或植物细胞。优选的是，宿主细胞不是人类细胞。
合适的细菌宿主生物体的实例有革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
根据编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列的本质和/或进一步加工所表达蛋白质的愿望，真核宿主可能是优选的，诸如酵母或其它真菌。一般而言，酵母细胞比真菌细胞更加优选，因为它们易于操作。然而，有些蛋白质或是难以由酵母细胞分泌，或是在有些情况中难以正确加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况中，应当选择不同的真菌宿主生物体。
使用合适的宿主细胞，诸如酵母、真菌、和植物宿主细胞，可以提供翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、lapidation、以及酪氨酸、丝氨酸、或苏氨酸磷酸化)，这可能是赋予本发明重组表达产物以最佳生物学活性所需要的。
宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶减除的菌株。
生物体
术语“生物体”在涉及本发明时包括能够包含依照本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何生物体。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母、或植物。
术语“转基因生物体”在涉及本发明时包括包含编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物和/或其中启动子能够容许编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列在生物体内表达的任何生物体。优选的是，将核苷酸序列掺入生物体的基因组。
术语“转基因生物体”不覆盖处于其天然环境中的天然核苷酸编码序列，此时它们处于其天然启动子的控制之下，而后者同样处于其天然环境中。
因此，本发明的转基因生物体包括包含编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列、本文定义的构建物、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定义的细胞、或其产物中的任何一种或组合的生物体。例如，转基因生物体还可以包含编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列且其处于异源启动子的控制之下。
宿主细胞/生物体的转化
如上所述，宿主生物体可以是原核或真核生物体。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
关于原核宿主转化的讲授在本领域有很好的记录，例如见Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press)。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前进行合适的修改，诸如清除内含子。
在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。
可以使用本领域知道的多种方法转化丝状真菌细胞，诸如包括以已知方式形成原生质体，转化原生质体，随后再生细胞壁的过程。EP 0 238 023描述了使用曲霉作为宿主微生物体。
另一种宿主生物体可以是植物。关于转化植物的一般技术的综述见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1991，42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech，1994年3月/4月，17-27)的论文。关于植物转化的其它讲授见EP-A-0449375。
下面的部分介绍了关于转化真菌、酵母、和植物的一般教导。
经转化的真菌
宿主生物体可以是真菌，诸如丝状真菌。合适的这种宿主的实例包括属于Thermomyces属、支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)、诸如此类的任何成员。
讲授丝状真菌转化的综述见US-A-5741665，它声明用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术在本领域是众所周知的。关于应用于粗糙链孢霉(N.crassa)的技术的综述见例如Davis和de Serres，Methods Enzymol 1971，17A：79-143。
关于转化丝状真菌的其它技术的综述见US-A-5674707。
在一个方面，宿主生物体可以是曲霉属的，诸如黑曲霉(Aspergillusniger)。
还可以通过遵循例如Martinelli S.D.、Kinghorn J.R.编的《Aspergillus：50years on.Progress in industrial microbiology》(vol29，Elsevier Amsterdam1944，p641-666)中Turner G(1944)著的“Vectors for genetic manipulation”的讲授来制备依照本发明的转基因曲霉。
关于丝状真菌中的基因表达的综述见Punt等人，2002，Trends Biotechnol2002年5月，20(5)：200-6；Archer和Peberdy，Crit Rev Biotechnol 1997，17(4)：273-306。
经转化的酵母
在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。
关于异源基因在酵母中表达的原理的综述见例如Methods Mol Biol1995，49：341-54和Curr Opin Biotechnol 1997年10月，8(5)：554-60。
在这个方面，可以使用酵母作为异源基因表达的载体，诸如啤酒糖酵母或巴斯德毕赤酵母氏酵母(见FEMS Microbiol Rev 2000，24(1)：45-66)。
关于在啤酒糖酵母中表达异源基因和分泌基因产物的原理的综述见EHinchcliffe和E Kenny，1993，“Yease as a vehicle for the expression ofheterologous genes”，Yeast，Vol.5，Anthony H Rose和J Stuart Harrison编，第2版，Academic Press有限公司。
关于酵母的转化，已经开发了数种转化方案。例如，可以通过遵循Hinnen等人，1978，Proceedings of the National Academy of Science of the USA，75：1929；Beggs，JD，1978，Nature，London，275：104；和Ito，I等人，1983，JBacteriology，153：163-168的讲授来制备依照本发明的转基因糖酵母。
可以使用多种选择标记来选择经过转化的酵母细胞，诸如营养缺陷标记和显性抗生素抗性标记。
可以由生物技术相关酵母物种选择合适的酵母宿主生物体，诸如但不限于选自毕赤氏酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、Yarrowinia、糖酵母属(Saccharomyces)(包括啤酒糖酵母S.cerevisiae)、或裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyce)(包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycepombe))的酵母物种。
可以使用甲基营养酵母物种巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)作为宿主生物体。
在一个实施方案中，宿主生物体可以是汉逊氏酵母属的物种，诸如多形汉逊氏酵母(H.polymorpha)(如WO 01/39544中所述)。
经转化的植物/植物细胞
适于本发明的宿主生物体可以是植物。关于一般技术的综述可以见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1991，42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech，1994年3月/4月，17-27)的论文或WO01/16308。例如，转基因植物可能以升高的水平生成植物甾醇酯和植物甾烷醇酯。
因此，本发明还涉及用于生成植物甾醇酯和植物甾烷醇酯水平升高的转基因植物的方法，包括用本文定义的脂酰基转移酶(特别是包含本文定义的脂酰基转移酶的表达载体或构建物)转化植物细胞并由经转化植物细胞培育植株的步骤。
分泌
通常希望表达宿主将多肽分泌到培养基中，由此可以更加容易地回收酶。依照本发明，可以根据期望的表达宿主来选择分泌前导序列。杂合信号序列也可用于本发明的内容。
异源分泌前导序列的典型实例有来自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸的两种形式，例如来自曲霉属)、α-因子基因(酵母，例如糖酵母属、克鲁维氏酵母属、和汉逊氏酵母)、或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的分泌前导序列。
检测
本领域已知用于检测和测量氨基酸序列表达的多个方案。实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、和荧光激活细胞分拣术(FACS)。
本领域技术人员知道多种标记物和偶联技术，它们可用于多种核酸和氨基酸测定法。
许多公司，诸如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)，供应这些流程的商品化试剂盒和方案。
合适的报道分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光、或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子、诸如此类。讲授这些标记物的用途的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149、和US-A-4,366,241。
同样，可以如US-A-4,816,567中所述生成重组免疫球蛋白。
融合蛋白
可以以融合蛋白的形式生成具有本文定义的具体特性的多肽，例如以便于它的提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)、和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体与目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点从而能够切除融合蛋白序列也是方便的。优选的是，融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。
关于大肠杆菌中的基因融合表达系统的综述见Curr.Opin.Biotechnol.1995，6(5)：501-6。
在本发明的另一个实施方案中，可以将具有本文定义的具体特性的多肽的氨基酸序列与异源序列相连，从而编码融合蛋白。例如，为了对肽库筛选能够影响实质活性的试剂，编码这样的嵌合物可能是有用的，即它表达受到商品化抗体识别的异源表位。
下面将参考附图和实施例描述本发明，仅作为范例。
附图描述
图1显示了来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.1)。
图2显示了由生物体嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.2)(P10480；GI：121051)。
图3显示了由生物体杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(AAG098404；GI：9964017)。
图4显示了由生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(基因库编号：NP_631558)。
图5显示了由生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.5)(基因库编号：CAC42140)。
图6显示了由生物体啤酒糖酵母获得的氨基酸序列(SEQ ID No.6)(基因库编号：P41734)。
图7显示了选定序列与pfam00657共有序列的对比。
图8显示了SEQ ID No.3与SEQ ID No.2的成对对比，显示93％的氨基酸序列同一性。信号序列标以下划线。+指示差异。标出了含有活性位点丝氨酸16的GDSX基序以及活性位点天冬氨酸116和组氨酸291(见阴影区)。氨基酸后的编号已减去信号序列。
图9显示了编码由生物体嗜水气单胞菌获得的依照本发明的脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.7)。
图10显示了编码由生物体杀鲑气单胞菌获得的依照本发明的脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.8)。
图11显示了编码由生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的依照本发明的脂酰基转移酶(基因库编号NC_003888.1：8327480..8328367)的核苷酸序列(SEQID No.9)。
图12显示了编码由生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的依照本发明的脂酰基转移酶(基因库编号AL939131.1：265480..266367)的核苷酸序列(SEQ IDNo.10)。
图13显示了编码由生物体啤酒糖酵母获得的依照本发明的脂酰基转移酶(基因库编号Z75034)的核苷酸序列(SEQ ID No.11)。
图14显示了由生物体雷尔氏菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.12)(基因库编号：AL646052)。
图15显示了编码由生物体雷尔氏菌获得的依照本发明的脂酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.13)。
图16显示了氨基酸序列SEQ ID No.20。Scoel NCBI蛋白质编号CAB39707.1 GI：4539178保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。
图17显示了编码Scoel NCBI蛋白质编号CAB39707.1 GI：4539178保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.21。
图18显示了氨基酸序列SEQ ID No.22。Scoe2 NCBI蛋白质编号CAC01477.1 GI：9716139保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。
图19显示了编码Scoe2 NCBI蛋白质编号CAC01477.1 GI：9716139保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.23。
图20显示了氨基酸序列SEQ ID No.24。Scoe3 NCBI蛋白质编号CAB88833.1 GI：7635996推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。
图21显示了编码Scoe3 NCBI蛋白质编号CAB88833.1 GI：7635996推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.25。
图22显示了氨基酸序列SEQ ID No.26。Scoe4 NCBI蛋白质编号CAB89450.1 GI：7672261推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。
图23显示了编码Scoe4 NCBI蛋白质编号CAB89450.1 GI：7672261推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.27。
图24显示了氨基酸序列SEQ ID No.28。Scoe5 NCBI蛋白质编号CAB62724.1 GI：6562793推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。
图25显示了编码Scoe5 NCBI蛋白质编号CAB62724.1 GI：6562793推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.29。
图26显示了氨基酸序列SEQ ID No.30。Sriml NCBI蛋白质编号AAK84028.1 GI：15082088 GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]。
图27显示了编码Sriml NCBI蛋白质编号AAK84028.1 GI：15082088GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]的核苷酸序列SEQ ID No.31。
图28显示了氨基酸序列SEQ ID No.32-来自嗜水气单胞菌的脂酰基转移酶(ATCC#7965)。
图29显示了编码来自嗜水气单胞菌的脂酰基转移酶(ATCC#7965)的核苷酸序列SEQ ID No.33。
图30显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicida)的脂酰基转移酶的氨基酸序列SEQ ID No.34(ATCC#14174)。
图31显示了编码来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的脂酰基转移酶(ATCC#14174)的核苷酸序列SEQ ID No.35。
图32显示了可以利用(美国)国家生物技术信息中心(NIH，MD，USA)的基本局部对比搜索工具服务和完整的基因组数据库来鉴定气单胞菌基因的同系物。在数据库搜索中使用GDSX基序，鉴定了可能编码具有脂肪分解活性的酶的许多序列/基因。鉴定了来自链霉菌属、黄单胞菌属、和雷尔氏菌属的基因。例如，将茄青枯雷尔氏菌与杀鲑气单胞菌(satA)基因进行对比。成对对比显示23％同一性。活性位点丝氨酸位于氨基末端，而催化残基组氨酸和天冬氨酸能够鉴定。
图33显示了Pfam00657.11[00657家族，第11版数据库]共有序列(下文称为Pfam共有序列)及多种序列与Pfam共有序列的对比。箭头指示活性位点残基，下划线指示[Upton C和Buckley JT(1995)Trends Biochem Sci 20：179-179]指出的三个同源盒。Pfam共有序列中的大写字母指示许多家族成员中的保守残基。-符号指示Pfam共有序列的隐藏Markov模型预计会发现插入残基但是并非如此，而是缺口的位置。.符号指示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。所示序列是图16、18、20、22、24、26、28、和30所示氨基酸序列。
图34显示了Pfam00657.11[00657家族，第11版数据库]共有序列(下文称为Pfam共有序列)及多种序列与Pfam共有序列的对比。箭头指示活性位点残基，下划线指示[Upton C和Buckley JT(1995)Trends Biochem Sci 20：179-179]指出的三个同源盒。Pfam共有序列中的大写字母指示许多家族成员中的保守残基。-符号指示Pfam共有序列的隐藏Markov模型预计会发现插入残基但是并非如此，而是缺口的位置。.符号指示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。所示序列是图2、16、18、20、26、28、和30所示氨基酸序列。发现所有这些蛋白质对脂质底物都有活性。
图35显示了含有C-末端His标记的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶基因的表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM。
图36显示了在NEFA试剂盒测定法中检测细胞提取物的结果，它描述了重组杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶对卵磷脂的活性。从左到右的孔表示：阳性对照、阴性对照(即来自空质粒的提取物)和IPTG诱导后培养0、1、2和3小时后收集的样本。
图37显示了含有表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS的生长优化，显示了30℃的培养导致生成对卵磷脂具有高度活性的酶。用NEFA试剂盒测定法来检测细胞提取物的磷脂酶活性。从左到右的孔：阳性对照；阴性对照；20℃；30℃。
图38显示了来自表达活性脂质酰基转移酶的BL21(DE3)pLysS的细胞粗提物在与底物卵磷脂和反应混合物一起保温后用薄层层析进行的分析，表明存在降解产物。泳道：1.无酶；2.加A.sal-10μl 37℃；3.加A.sal-20μl 37℃；4.加A.sal-10μl 24℃；5.加A.sal-20μl 24℃。
图39显示了杀鲑气单胞菌酰基转移酶的部分纯化，显示与纯化的His标记蛋白质相关的磷脂酶活性。SE＝超声波处理的提取物，His＝用购自Qiagen的Ni-NTA旋转试剂盒纯化。
图40显示了用于转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS的含有C-末端His标记的嗜水气单胞菌甘油脂质酰基转移酶(GCAT)基因的表达载体pet12-A.h.GCAT＝pSMa。
图41显示了用非酯化脂肪酸(NEFA)试剂盒(Roche，瑞士)测试含有重组嗜水气单胞菌GCAT酶的粗提物(5和10μl)对卵磷脂的活性，显示存在对磷脂、卵磷脂有活性的酶。
图42了显示含有表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS的生长优化，显示了30℃的培养导致生成对卵磷脂具有高度活性的酶。用NEFA试剂盒测定法来检测细胞提取物的磷脂酶活性。
图43显示了嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌酰基转移酶的部分纯化，显示与纯化的His标记蛋白质相关的磷脂酶活性。SE＝超声波处理的提取物，His＝用购自Qiagen的Ni-NTA旋转试剂盒纯化。
图44显示了气单胞菌基因在枯草芽孢杆菌163中的表达，显示产生对卵磷脂和DGDG二者具有活性的分泌酶。pUB-AH＝含有嗜水气单胞菌基因的构建体，pUB-AS＝含有杀鲑气单胞菌基因的构建体。将培养物滤出液与底物一起保温60分钟。
图45显示了在实施例17中用于诱变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.36)。标有下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽。
图46显示了编码来自嗜水气单胞菌的一种酶的核苷酸序列(SEQ ID No.45)，包括木聚糖酶信号肽。
图47显示了试验I中的HPTLC分析的结果。
图48显示了试验II中的HPTLC分析的结果。
图49显示了甘油一酯标准溶液的标准曲线。
图50显示了甘油二酯标准溶液的标准曲线。
图51显示了编码来自链霉菌的本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.54)。
图52显示了来自链霉菌的本发明脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ IDNo.55)。
实施例
为了避免产生疑问，本文中可使用如下缩写：
MONO＝甘油一酯
MAG＝一酰甘油＝甘油一酯
MAG和MONO在此是可互换的
DAG＝二酰甘油
FFA＝游离脂肪酸
实施例1：来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的转移酶的克隆、测序和异源表达
所用菌株：
杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC 14174)从ATCC获得，于30℃在Luria-Bertani培养基(LB)中培养过夜。将细胞离心并用购自Qiagen Ltd的用于基因组DNA分离的程序来分离基因组DNA。基因组DNA缓冲液组(产品目录号19060)、蛋白酶K(产品目录号19131)和RNA酶A(产品目录号19101)都购自Qiagen Ltd(Boundary court Gatwick Court，WestSussex，RH10 2AX)。
用宿主细菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)生产重组气单胞菌酶。将BL21(DE3)pLysS的感受态细胞作为宿主用于表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的转化。将含有适当质粒的转化子于37℃在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中进行培养。
表达载体pet12-AsalGCAT-pSM的构建：
对于来自气单胞菌的转移酶基因的所有DNA扩增，用基因组DNA(0.2-1μl)作为模板，在100μl的总反应体积中使用2.5个单位pfu DNA聚合酶及10μl 10x pfu缓冲液、1μl每种引物(50pmol/μl)和200μMdNTP。在可编程的热循环仪中进行PCR反应，采用如下条件：95℃30秒，30个循环的95℃30秒、60℃1分钟和68℃2分钟。于72℃再延伸5分钟。
在两个分开的PCR反应中PCR扩增来自杀鲑气单胞菌的转移酶基因。采用引物对aslUSNEW(5′AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTGGGG 3′[SEQ ID No.56])和asls950new(5′GTG ATG GTG GGC GAG GAACTC GTA CTG3′[SEQ ID No.37])进行PCR反应1。使用来自第一个反应的PCR产物和引物对：aslUSNEW(5′AGCATATGAAAA AATGGTTTGTTTGTTTATTG GGG 3′[SEQ ID No.38])和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3′[SEQ ID No.39])进行第二个PCR反应，掺入C-末端的组氨酸标记。纯化来自第二个反应的PCR产物，并用限制酶NdeI和BamHI消化。2μg pET12a载体DNA也用限制酶NdeI和BamHI消化，并用磷酸酶处理。纯化用限制酶处理过的pet12a和来自反应2的PCR产物，并用Rapid Ligation试剂盒(Roche，瑞士)进行连接。用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞。将转化子铺展在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。
用T7启动子引物(5′TAATACGACTCACTATAG 3′[SEQ ID No.40])和T7终止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG 3′[SEQ ID No.41])来验证pET12a载体中克隆的转移酶基因的序列和方向。采用ABI PrismBigDyeTM终止物循环测序试剂盒进行DNA测序，用500ng质粒DNA作为模板，以及3.2pmol T7启动子和终止子引物。
用图35中所示的构建体转化感受态细菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑选出氨苄青霉素抗性的转化子，用于表达分析。
重组杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的表达
使用非酯化脂肪酸(NEFA)试剂盒(Roche，瑞士)，量化细胞提取物对卵磷脂的酶活性。
在图36中，将含有表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中于37℃摇动培养至达到OD600＝0.6-1.0。然后用IPTG(0.4mM)诱导培养物，再培养3小时。在IPTG诱导后0、1、2和3小时时取样。用NEFA试剂盒测试酶活性，以卵磷脂作为底物。
为了生产更多有活性的酶而优化生长
将含有表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中于不同的生长温度(37℃、30℃和20℃)摇动培养。如图37中所示，培养物于30℃生长是生产活性脂质酰基转移酶的最佳条件。
重组杀鲑气单胞菌转移酶的部分纯化
将含有表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的菌株BL21(DE3)pLysS于37C进行培养，并通过超声波处理制备细胞粗提物。使用购自Qiagen的Ni-NTA旋转试剂盒，从超声波处理的细胞粗提物中进一步纯化重组酶。用NEFA试剂盒和卵磷脂作为底物来测定磷脂酶活性。将表达活性转移酶的BL21(DE3)pLysS的细胞粗提物与底物卵磷脂和反应混合物一起保温后采用薄层层析进行分析，表明存在降解产物(参见图38)。
重组杀鲑气单胞菌转移酶的部分纯化
将含有表达载体pet12-AsalGCAT＝pSM的菌株BL21(DE3)pLysS于37℃培养，并通过超声波处理制备细胞粗提物。使用购自Qiagen的Ni-NTA旋转试剂盒，从超声波处理的细胞粗提物中进一步纯化重组酶。用NEFA试剂盒和卵磷脂作为底物来测量磷脂酶活性(参见图39)。
实施例2：嗜水气单胞菌转移酶在大肠杆菌中的克隆和表达
嗜水气单胞菌(ATCC#7965)从ATCC获得，于30C在Luria-Bertani培养基(LB)中培养过夜。将细胞离心并用购自Qiagen Ltd的用于基因组DNA分离的程序来分离基因组DNA。基因组DNA缓冲液组(产品目录号19060)、蛋白酶K(产品目录号19131)和RNA酶A(产品目录号19101)都购自Qiagen Ltd(Boundary court Gatwick Court，West Sussex，RH10 2AX)。
用宿主细菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)生产重组气单胞菌酶。将BL21(DE3)pLysS的感受态细胞作为宿主用于表达载体pet12a-A.h.GCAT＝pSMa的转化。将含有适当质粒的转化子于37℃在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中进行培养。
表达载体pet12a-A.h.GCAT＝pSMa的构建：
对于来自气单胞菌的转移酶基因的所有DNA扩增，用基因组DNA(0.2-1μl)作为模板，在100μl的总反应体积中使用2.5个单位pfu DNA聚合酶及10μl 10x pfu缓冲液、1μl每种引物(50pmol/μl)和200μMdNTP。在可编程的热循环仪中进行PCR反应，采用如下条件：95℃30秒，30个循环的95℃30秒、60℃1分钟和68℃2分钟。于72℃再延伸5分钟。
在两个分开的PCR反应中PCR扩增来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的转移酶基因。
采用引物对AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC 3′，SEQ IDNo.42)和ahls950(5′ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG 3′，SEQ ID No.43)进行PCR反应1。
使用来自第一个反应的PCR产物和引物对：AHUS1(5′GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC 3′SEQ ID No.44)和AHLS1001(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC 3′SEQ ID No.57)进行第二个PCR反应，掺入C-末端的组氨酸标记。
纯化来自第二个反应的PCR产物，并用限制酶NdeI和BamHI消化。2μg的pET12a载体DNA也用限制酶NdeI和BamHI消化，并用磷酸酶处理。纯化用限制酶处理过的pet12a和来自反应2的PCR产物，并用Rapid Ligation试剂盒(Roche，瑞士)进行连接。用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞。将转化子铺展在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。
用T7启动子引物(5′TAATACGACTCACTATAG 3′)和T7终止子引物(5′CTAGTTATTGCTCAGCGG 3′)来验证pET12a载体中克隆的转移酶基因的序列和方向。采用ABI PrismBigDyeTM终止物循环测序试剂盒进行DNA测序，用500ng质粒DNA作为模板，以及3.2pmol T7启动子和终止子引物。
用图40中所示的构建体转化感受态细菌宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑选出氨苄青霉素抗性的转化子，用于表达分析。
嗜水气单胞菌转移酶在BL21(DE3)pLysS中的表达
将含有表达载体pet12a-A.h.GCAT＝pSMa的大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中于37℃摇动培养至达到OD600＝0.6-1.0。然后用IPTG(0.4mM)诱导培养物，再培养3小时。在IPTG诱导后0、1、2和3小时时取样。用NEFA试剂盒测试酶活性，以卵磷脂作为底物(图41)。
为了生产更多有活性的酶而优化生长
将含有表达载体pet12a-A.h.GCAT＝pSM的BL21(DE3)pLysS在LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素中于不同的生长温度(37℃、30℃和20℃)摇动培养。如图42中所示，培养物于30℃生长是生产活性GCAT酶的最佳条件。
重组嗜水气单胞菌转移酶(GCAT)的部分纯化
将含有表达载体pet12a-A.h.GCAT＝pSMa的菌株BL21(DE3)pLysS于37℃进行培养，并通过超声波处理制备细胞粗提物。使用购自Qiagen的Ni-NTA旋转试剂盒，从超声波处理的细胞粗提物中进一步纯化重组酶。用NEFA试剂盒和卵磷脂作为底物来测定磷脂酶活性(图43)。
实施例3：气单胞菌转移酶在枯草芽孢杆菌163中的表达
质粒构建
用两种不同的枯草芽孢杆菌载体(pUB110和pBE5)在枯草芽孢杆菌中异源表达气单胞菌基因。pUB110载体含有α-淀粉酶启动子，而pBE载体具有P32启动子作为调控区，用于表达融合的气单胞菌基因。在pUB110中，通过限制性位点NheI，将气单胞菌成熟GCAT基因的第一个氨基酸与来自枯草芽孢杆菌的木聚糖酶信号肽序列的最后一个氨基酸在读框内融合，在成熟蛋白的前面产生2个额外的氨基酸。pBE5在NcoI位点处含有cgtase信号序列融合体，用于将重组蛋白分泌到培养物滤出液中。
进行PCR反应来获得气单胞菌基因在读框内与pUB110和pBE5载体的信号序列融合。采用如下引物对对嗜水气单胞菌基因进行PCR：
PCR反应1：usAHncol(5′ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC 3′，SEQ ID No.46)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG 3′，SEQID No.47)
PCR反应2：US-AhnheI(5′TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC 3′，SEQ ID No.48)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG 3′，SEQID No.49)。
采用如下引物对对杀鲑气单胞菌基因进行PCR：
PCR反应3：US-Asncol(5′TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC 3′，SEQ ID No.50)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG 3′，SEQID No.51)
PCR反应4：US-ASnhel(5′TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3′，SEQ ID No.52)和lsAH(5′TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3′，SEQID No.53)。
将所有PCR产物克隆到PCR blunt II(TOPO载体)中并用反向和正向测序引物进行测序。
用NcoI和BamHI剪切来自PCR反应1和3的克隆，用作插入片段连接到用NcoI/BamHI/磷酸酶剪切过的pBE5载体中。用NcoI和BamHI剪切来自PCR反应2和4的克隆，用作插入片段连接到用NcoI/BamHI/磷酸酶剪切过的pUB载体中。
气单胞菌转移酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达以及酶活性的鉴定
已经在大肠杆菌中成功地表达来自两个气单胞菌物种的酰基转移酶(上面的结果)。用芽孢杆菌pUB110和pBE5基因融合构建体来转化枯草芽孢杆菌，并通过铺展在卡那霉素平板上来选择转化子。在2xYT中分离并培养的卡那霉素抗性转化子能够在芽孢杆菌中异源表达气单胞菌基因。除了具有酰基转移酶和磷脂酶这两种活性外，培养物滤出液还具有二半乳糖基二酰甘油(DGDG)半乳糖基脂肪酶活性。将培养物上清液与底物来自小麦面粉的DGDG(可从Sigma获得)一起保温60分钟后，测量对二半乳糖基二酰甘油(DGDG)的活性，以及对卵磷脂的活性，正如图44所示。在培养基中培养过夜(20-24小时)至48小时后，芽孢杆菌以分泌蛋白的形式生产酶。在某些情况中，已经证明气单胞菌基因的表达会在芽孢杆菌和大肠杆菌中干扰细胞的活力和生长，因而有必要仔细选择表达菌株并优化生长条件来确保表达。例如，用表达载体转化多种芽孢杆菌宿主菌株(B.s163、DB104和OS21)来进行生长比较。B.s163可用两种气单胞菌基因转化，并且能够表达活性蛋白。DB104可用所有构建体转化，但是仅能够表达杀鲑气单胞菌转移酶。
实施例4：大肠杆菌中生产的气单胞菌脂质酰基转移酶的发酵和纯化大肠杆菌发酵：
微生物
在此项研究中使用了两种大肠杆菌菌株，一种含有嗜水气单胞菌(实施例2)脂质酰基转移酶，另一种含有杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶(实施例1)。
含有嗜水气单胞菌基因的大肠杆菌菌株命名为DIDK0124，含有杀鲑气单胞菌基因的大肠杆菌菌株命名为DIDK0125。DIDK0124的发酵命名为HYDRO0303，而DIDK0125的发酵命名为SAL0302。来自HYDRO025的纯化蛋白质命名为REF#138。来自HYDRO0303的纯化蛋白质命名为REF#135。
生长培养基和培养条件
LB-琼脂
用于维持菌株的LB琼脂平板含有：10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、15g/L琼脂、100mg/L氨苄青霉素和35mg/L氯霉素。将琼脂平板于30℃进行温育。
LB摇瓶
用于生产进行生物反应器培养的接种物材料的LB培养基(每个摇瓶50ml)含有：10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、100mg/L氨苄青霉素和35mg/L氯霉素。以LB琼脂平板接种摇瓶，于30℃以200rpm温育。
生物反应器培养
在装有4L培养基的6L室内生物反应器中进行生物反应器培养，该培养基含有：10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、8g/L KH2PO4、0.9g/L MgSO4·7H2O、40g/L葡萄糖一水化物、0.4ml/L ADDAPTFoamstopSin 260(ADD APT Chemicals AG，Helmond，荷兰)、10mg/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、0.7mg/L CuSO4·5H2O、3mg/L ZnSO4·7H2O、3mg/L MnSO4·H2O、10mg/L EDTA、0.1mg/L NiSO4·6H2O、0.1mg/L CoCl2、0.1mg/L H3BO4、0.1mg/L KI、0.1mg/L Na2MoO4·2H2O、1g/L氨苄青霉素和35mg/L氯霉素。
用一定量的LB培养液接种生物反应器，以确保在约20小时培养后结束生长(是根据0.6h-1的最大比生长速率、LB摇瓶的OD600和约20小时后的生物反应器中的最终OD600计算得出的)。
用10ml LB培养物接种SAL0302，用4ml LB培养物接种HYDRO0303。
在如下条件下操作生物反应器：温度30℃、搅拌800-1000rpm(取决于试验)、通气5L/分钟、pH 6.9、pH控制8.75％(w/v)氨水和2M H2SO4。加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷至0.6mM的终浓度来进行诱导，分别产生0.4摩尔(HYDRO0303)和0.7摩尔CO2。
收获
用如下程序来收获和匀化生物量：
1)以5000×g和于4℃，将来自发酵的发酵液离心10分钟，倒出上清液。将生物量存储于-20℃直到使用。将生物量解冻，重悬在500ml 20mMNaH2PO4 pH7.4、500mM NaCl、10mM咪唑和完全(不含EDTA)蛋白酶抑制剂(Roche，德国)中。
2)于4℃以2kbar在购自Constant Systems Ltd(Warwick，UK)的细胞破碎器中将悬浮的生物量匀浆。
3)通过于4℃以10,000×g离心30分钟去除细胞碎片，接着收集上清液。
4)通过于4℃以13,700×g离心60分钟进一步澄清上清液，接着收集上清液。
5)用0.2μm Vacu Cap滤膜(Pall Life Sciences，UK)过滤上清液，收集滤出液立即用于层析纯化。
转移酶的层析纯化
用50ml螯合Sepharose琼脂糖ff凝胶装柱(2.5×10cm)，并用Ni-硫酸盐充电(按照生产商描述的方法，Amersham Biosciences)。该柱用200ml20mM NaH2PO4 pH7.4、500mM NaCl、10mM咪唑平衡。将400ml粗提物以5ml/分钟的流速添加到该柱中。然后用20mM NaH2PO4 pH7.4、500mMNaCl、10mM咪唑洗涤该柱，直到UV280达到基线。然后用40ml 20mMNaH2PO4 pH7.4、500mM NaCl和500mM咪唑洗脱GCAT。
实施例5：枯草芽孢杆菌中生产的气单胞菌脂质酰基转移酶的发酵与纯化
发酵
BAC0318-19、BAC0323-24
微生物
用于此项研究的微生物来源于枯草芽孢杆菌宿主菌株的转化，即#163携带插入在载体pUB110OIS中的编码杀鲑气单胞菌转移酶的基因的质粒。通过α-淀粉酶启动子控制基因的表达，并通过枯草芽孢杆菌木聚糖酶信号序列介导转移酶的分泌(实施例3)。所述菌株命名为DIDK0138(发酵BAC0318-19)和DIDK0153(发酵BAC0323-24)。
生长培养基和培养条件
预培养基
向摇瓶(500ml总体积，带挡板)中加入100ml培养基，该培养基含有：
NaCl 5g/L
K2HPO4 10g/L
大豆粉 20g/L
酵母提取物，BioSpringer 106 20g/L
防沫剂，SIN260 5ml/L
高压灭菌前将pH调整为7.0
高压灭菌后，向每个烧瓶中加入6ml 50％(w/w)Nutriose。高压灭菌后加入浓度为50mg/L的卡那霉素
接种
每个烧瓶中接种直接来自25％(w/v)甘油母液的冷冻培养物。于33℃以175rpm将摇瓶温育约16小时，然后用50ml接种发酵罐。
发酵
在容量为6L的室内发酵罐中进行发酵。
分批培养基(3L)含有：
玉米浆(50％dw) 40g/L
酵母提取物BioSpringer 153(50％dw) 10g/L
NaCl 5g/L
CaCl2·2H2O 0.25g/L
Mn(NO3)2·H2O 0.2g/L
防沫剂SIN260 1ml/L
卡那霉素(过滤灭菌后加到高压灭菌后的发酵罐中) 50mg/L
补料中含有：
葡萄糖一水化物 540g/kg
MgSO4·7H2O 4.8g/kg
防沫剂SIN260 4ml/kg
酵母提取物，BioSpringer 153(50％dw) 150g/kg
(分别高压灭菌)
按照如下的方程，根据积累的CO2，开始对发酵BAC0318和BAC0323补料：
补料流速[g/h]＝0，AcCO2＜0.15
补料流速[g/h]＝2.85+t·1.54，AcCO2≥0.15且t＜12
补料流速[g/h]＝21.3，t＞12
t：从积累的CO2(AcCO2)达到0.15摩尔的时间点开始的时间(小时)。
按照如下的方程，根据积累的CO2，开始对发酵BAC0319和BAC0324补料：
补料流速[g/h]＝0，AcCO2＜0.15
补料流速[g/h]＝2.0+t·1.08，AcCO2≥0.15且t＜12
补料流速[g/h]＝15，t＞12
t：从积累的CO2(AcCO2)达到0.15摩尔的时间点开始的时间(小时)。
通过加入12.5％(w/v)氨水或2M磷酸，将pH控制在7.0。
通气为3L/min，相当于1wm。
温度为33℃。
发酵罐装备了两个8cm直径的Rushton叶轮，相距10cm放置。
收获
通过于室温以16,000×g离心10分钟来去除生物量。将上清液过滤灭菌，滤出液用于纯化和应用检测。
实施例6：用来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶催化的棕榈油中DAG的酶促去除
概述
通过将甘油/转移酶溶液加入装有各种浓度的棕榈油和甘油/水的反应器中来起始酶促甘油水解试验。所有反应于43℃进行，采用磁力搅拌24小时。反应后，用HPTLC分析样本，而且在某些试验中，通过GC分析来证实结果。所进行的试验表明，水浓度与DAG和MAG水平之间分别存在好的相关性：所检测的最低水浓度产生最高MAG水平和最低DAG水平。
根据所述试验，可以得出如下结论，通过转移酶催化的反应可能降低棕榈油中的DAG含量，其中在合成甘油一酯的该甘油水解反应中，该酶用DAG作为供体分子和甘油作为受体分子。这与使用常规甘油三酯水解脂肪酶的甘油水解反应相反，该反应增加DAG含量。
此外，可以得出如下结论，水浓度对甘油一酯的合成量和DAG含量具有显著影响。发现如下关系：低水浓度(＜1％)和5％甘油获得较高的MAG产量和较低浓度的DAG。所获得的结果还表明主要是甘油二酯的1，2-异构体倾向于下降。
已知甘油二酯特别是1，2-异构体会延迟脂肪的结晶。该结果引起如人造奶油和起酥油的脂肪产品的后结晶化，这有利于形成大晶体(沙质)。在某些脂肪混合物中，观察到甘油二酯改善β’晶体的稳定性。因而，减少而不是完全去除棕榈油中的甘油二酯是优选的。因此，可以得出如下结论，甘油二酯降低将会产生更好和更一致的油质量；这是不应低估的事实。
引言
与甘油二酯相关的问题在某种程度上取决于产物的类型，例如其是否存在于人造奶油和起酥油中。因此，根据产品，甘油二酯的存在具有负面和正面两种作用。对于人造奶油生产来说，只有具有所需晶体结构的脂肪产品能够使用，以获得适当的稠度和可塑性。β’-晶体形式是最需要的结构，具有小晶体和维持液体馏分的高性能。最稳定的晶体形式(β-形式)是不合适的，因为具有大晶体会使人造奶油产生粒状结构。依照Hernquist和Anjou(1993)及Wahnelt等人(1991)，脂肪中存在甘油二酯会阻碍β’转变为β-晶体。但是因为甘油二酯阻碍β’转变为β，所以它们还阻碍α形式转变为β’形式(Walnet等人，1991)。由此，可以确定甘油二酯的存在阻碍整个结晶过程。缓慢的结晶对人造奶油应用具有重要作用。阻碍含有大量棕榈油的人造奶油混合物中的结晶的作用是在常规加工后，该产品可能有些柔软，引起包装困难，并且后来的结晶会产生较期望更为坚硬的质地(Berger，1990)。无论有利或不利，在减少和完全去除甘油二酯之间寻找适当的平衡可能是重要的。
令人惊奇地发现，可能通过采用脂质酰基转移酶的酶促甘油水解来减少棕榈油中的甘油二酯含量，该酶例如来自杀鲑气单胞菌的GDSx脂质酰基转移酶。不希望受理论约束，在该方法中，将酶以及少量甘油加入棕榈油中，且该酶催化如下反应：
反应后，如果有必要，通过离心或其他方法，可以容易地从反应混合物中分离剩余的甘油。
该方法的优点是通过由对甘油二酯特异而不使用甘油三酯作为转移酶反应供体的酶催化的甘油水解反应来减少甘油二酯(优选1，2-甘油二酯)的含量。
反应产物甘油一酯不必从反应混合物中去除，但是可有利地用作食品(如人造奶油和起酥油)生产的有效乳化剂。因此，该方法解决两个问题。首先，减少甘油二酯的含量，并优选地去除对甘油三酯的结晶特性具有负面影响的1，2-甘油二酯。其次，反应产物甘油一酯可用作如人造奶油和起酥油的食品生产的有效乳化剂。
在一个实施方案中，优选去除由转移酶反应产生的甘油一酯(如果有)。
适宜地，如果在粗制的棕榈油中进行转移酶反应，可以在食用油精制过程中通过除臭加工去除甘油一酯和/或甘油和/或水残留(如果有)。
使用脂质酰基转移酶的另一种非常感兴趣的优点为，该酶较少依赖反应混合物中的水含量，且由于该酶是一种转移酶，产生较少的或不产生水解活性，这意味着游离脂肪酸的含量不会显著增加。
众所周知，当脂肪分解酶如脂肪酶用于甘油水解反应时，该过程中的含水量是非常重要的(Kristensen，2004)。即使是对大多数脂肪分解反应来说是必需的少量水，也会导致显著含量游离脂肪酸的形成。该问题可以通过在甘油水解反应中使用脂质酰基转移酶来解决。
另一个方面是，本领域知晓的用于催化甘油水解反应的脂肪酶在甘油二酯形成过程中主要采用甘油三酯作为供体，而不减少甘油二酯的含量。
材料：
棕榈油：Palmotex，Aarhus United，丹麦
甘油：J.T.Baker(7044)
DIMODANP：Danisco A/S，丹麦
酶：来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶GCAT，在枯草芽孢杆菌中表达且以实验室规模发酵(转移酶#196)。
方法
酶的冻干
冻干前将酶脱盐(PD-10脱盐柱，Amersham Biosciences)。将脱盐的酶与甘油混合(酶∶甘油比率是3.5∶1)。冻干样本并加入10％水。每克样本含有约20U(磷脂酶单位)。
磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性测定法)：
底物
将0.6％L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2溶解在0.05M HEPES缓冲液pH 7中。
测定流程：
将400μl底物加入到1.5ml Eppendorf管中，并于37℃在Eppendorf热混合器(Thermomixer)中放置5分钟。在时间t＝0分钟时，加入50μl酶溶液。还分析用水替代酶的空白。于37℃在Eppendorf热混合器中以10*100rpm将样本混合10分钟。在时间t＝10分钟时，于99℃将Eppendorf管在Eppendorf热混合器中放置10分钟来终止反应。
用购自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样本中的游离脂肪酸。
pH 7下的酶活性PLU-7计算为测定条件下每分钟产生的微摩尔游离脂肪酸。
酶反应
按照表1和表2中的如下配方，使棕榈油与甘油-酶溶液反应。
表1：试验I
| 酶编号 | 转移酶#196 | |||
| 样本编号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| Gl(％) | 5 | 5 | 5 | 10 |
| 水(％) | 0 | 1 | 5 | 1 |
| 油相(％) | 95 | 94 | 90 | 89 |
| 反应混合物中的水 | 0.5 | 1.5 | 5.5 | 1.5 |
表2：试验II
| 酶编号 | 转移酶#196 | |||||
| 样本编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Gl(％) | 5 | 5 | 5 | 10 | 10 | 10 |
| 水(％) | 1 | 5 | 7.5 | 1 | 5 | 7.5 |
| 油相(％) | 94 | 90 | 87.5 | 89 | 85 | 82.5 |
| 反应混合物中的水 | 1 | 5 | 7.5 | 1 | 5 | 7.5 |
将棕榈油称量到20ml Wheaton玻璃器皿中，并加入甘油/酶和可选择的水。将样本放置在加热块上(由VARIOMAG-Thermomodul 40 ST恒温器控制的加热且示差搅拌(differential stirring)的Multitherm HP 15 St加热块(15孔))并在如下条件下反应：
反应温度：43℃
磁力搅拌：650rpm
反应时间：20小时
于97.5℃将反应混合物中的酶灭活10分钟。反应后，将样本匀浆20秒(Ultra Turrax)，取出匀浆样本用于进一步分析。
HPTLC
加料器(Applicator)：LINOMAT 5，CAMAG加料器。
HPTLC平板：10×10cm(Merck no.1.05633)
使用前，通过在180℃的烘箱中干燥20-30分钟来灭活平板。
应用：使用LINOMAT 5加料器将2.0μl溶解在氯仿∶甲醇(2∶1)中的2.0％反应后棕榈油溶液应用于HPTLC平板。
运行缓冲液：P-ether∶MTBE；乙酸(50∶50∶1)
应用/洗脱时间：8分钟
显影液：6％溶解在16％H3PO4中的Cupriacetate
洗脱后，将平板在180℃的烘箱中干燥10分钟，冷却并浸没在显影液中，然后于180℃再干燥20分钟。目测评价平板并直接扫描(ScanWizard 5)。
在试验II中，通过Adobe photoshop 6.0来量化成分，根据DAG和MAG标准溶液的标准曲线计算MAG和DAG的含量(参见图49和50)。
气相层析
装备了WCOT融合石英柱12.5m×0.25mm ID×0.1μm 5％苯基-甲基-硅树脂(购自Crompack的CP Sil 8 CB)的Perkin Elmer 8420毛细管气相层析。
载体：氦
注射：1.5μl，分流(with split)
检测仪：FID.385℃
烘箱程序 ： 1 2 3 4
烘箱温度，℃ ： 80 200 240 360
等温线，时间，分 2 0 0 10
升温速率，℃/分： 20 10 12
样本制备：将50mg脂质溶解在12ml庚烷∶吡啶(2∶1)中，其中含有内部标准正十七烷，2mg/ml。将500μl样本转移到曲颈瓶中。加入100μl MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)，并于60℃反应15分钟。
计算：根据这些成分的参照混合物测定游离脂肪酸、一酰-二酰-三酰甘油的响应因子。根据这些响应因子，计算样本中的脂质。
结果
试验I：本试验的目的在于检验来自杀鲑气单胞菌的甘油二酯：甘油酰基转移酶通过甘油水解反应对棕榈油中的DAG的影响。已知在胆固醇和溶血卵磷脂形成过程中，GCAT能够将游离脂肪酸从卵磷脂转移到胆固醇上。在此项研究中，我们调查了酶用DAG作为供体和甘油作为受体的可能性，以减少棕榈油中的DAG含量并生成甘油一酯。
在文献中，已知用如脂肪酶的酶来催化甘油水解反应。在这些反应中，甘油三酯是主要底物，而甘油一酯和二酯是反应产物。在这些过程中，甘油二酯的含量显著增加，而所产生的甘油二酯的含量达到所生成甘油一酯含量的水平或者更高(Kristensen，2004)。
测试了四种不同的样本组合物并与棕榈油对照比较，该对照与5％甘油混合而无酶，并用与样本相同的方式处理。图47显示来自表1的样本的HPTLC分析的结果。
从HPTLC分析获得的结果表明，DAG的含量随反应条件(指GL∶H2O之间的比例)而改变。与所有反应相同的是甘油二酯的1，3-异构体的含量高于甘油二酯的1，2-(2，3-)异构体。该观察结果能够得到如下理论的证实，即粗制棕榈油中的1，3-异构体与1，2-(2，3-)异构体的比例为7∶3(Siew和Ng，1999；Timms，2004)。此外，分析该结果得出，HPTLC平板表明转移酶成功地减少DAG的含量。所述减少在某种程度上可能与合成的MONO的含量相关。
如果我们比较图1中的1，2-异构体与1，3-异构体DAG，表明1，2-DAG主要是由酶催化的反应降低。这与转移酶对sn2-位置上的脂肪酸具有优选特异性是一致的。
在所进行的试验中，使用范围为0.5-5.5％的不同水浓度。结果表明，水浓度对MONO的合成量以及DAG的减少量具有显著影响。在这种情况中，转移酶#196表明，如果该系统中含有较低的水浓度，则产生MONO的浓度升高而观察到DAG的含量相应地下降。该试验还调查了甘油含量对系统平衡是否产生影响(泳道5：10％GL∶1％H2O)。转移酶#196表明，较高浓度甘油-也表示酶活性的剂量加倍-并不产生较高的MONO浓度。
优选地，本发明在低水环境中进行，即少于1％。
转移酶替代脂肪酶产生的优点之一是MONO的合成与FFA浓度过度增加无关。这在本试验中得到证实。图1表明，无一反应表现出清晰的FFA条带(FFA条带预期可见于1，3DAG和TAG之间)。
从本试验可以得出如下总结，对于转移酶#196来说，最佳的甘油与水的浓度如下：
转移酶#196：5％GL∶0.5％H2O
由于不可能计算反应混合物中的不同成分的浓度，HPTLC分析中的采样流程不包括具体的称重(specific weighing)。因此，该观察结果仅基于目测评价。
GC结果
基于HPTLC结果，选择2号样本用于GC分析。为了查明HPTLC平板的目测评价是否得到DAG定量分析的证实。在分析之前，通过离心从样本中去除甘油，仅脂质相用于GC分析。下面的表3给出了GC结果。
表3：试验I中选择的反应的GC结果
| 参照 | #196 | |
| 样本编号 | 1 | 2 |
| Gl(％)* | 5 | 5 |
| 水(％) | 0 | 0 |
| 油相(％) | 95 | 95 |
| GC结果 | ||
| MONO | ＜0.01 | 0.34 |
| DAG | 6.21 | 5.77 |
*甘油含有10％水
分析GC研究的结果发现，所选择的样本具有较高的MONO浓度和较低的DAG产量，与参照不同。该观察结果支持在HPTLC分析中获得的结果。
结论：试验I
考虑甘油水解产物中的甘油一酯和甘油二酯的含量，HPTLC分析的结果表明水浓度与MONO和DAG含量之间分别相关：水浓度越低，DAG越低而MONO越高。
GC分析证实了DAG的减少程度。在本试验中，DAG的减少量占棕榈油中甘油二酯总量的7.1％(表4)。
表4：DAG的减少程度
| 酶编号 | #196 |
| 样本编号 | 2 |
| DAGs的减少量(％) | 7.1 |
试验II：
这部分的目的在于继续优化减少棕榈油中的DAG，并分析用转移酶#196的转移酶催化的甘油水解。主要目的是达到一个充分平衡的反应，其中DAG含量随着MONO浓度的增加而减少。
在这部分试验工作中，对6个不同样本组合物进行测试并与棕榈油参照比较，所述参照与5％甘油混合(表2)。将参照暴露于与酶反应相同的加热模式，这使得可能观察和测定降低过程中的热降解程度。图48显示了HPTLC分析的结果。
从图48中的结果可以看出，MAG的含量特别地是变化的。HPTLC分析表明，在含有5％甘油的样本中(泳道：1-3)，在水浓度和MAG产量之间存在连续关系：反应混合物中的水含量减少，接着MAG产量增加。在含有10％甘油的反应中观察到相同趋势(泳道：5-7)。
按照甘油二酯的含量，仅根据HPTLC平板的目测评价不可能区分样本。因此，为了能够在样本之间进行区分，通过分析具有已知组成的MAG和DAG的标准材料，量化成分。用Adobe Photoshop 6.0扫描并处理HPTLC平板，借助已经构建的计算宏进行进一步计算(Microsoft Excel 2000)。下文表5中给出了对HPTLC分析的成分进行的定量分析。
表5：
| 酶编号 | 转移酶#196 | ||||||
| 运行顺序：HPTLC | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| MONO(％) | 0.38 | 0.01 | Nm*. | 0.01 | 0.15 | 0.07 | 0.03 |
| DAG(％) | 7.24 | 8.13 | Nm*. | 8.35 | 8.26 | 7.88 | 7.62 |
| DAG的减少量(％) | 13.29 | 2.63 | - | - | 1.08 | 5.36 | 8.74 |
Nm*未测量到
-未计算到
此项调查支持目测评价，并给出了不同水平甘油二酯的精细照片。从该结果中可以看出，在1号样本中，DAG含量减少的程度最大(5％GL∶1.5％H2O)。此外，观察到该样本还含有最高的MAG含量。
结论：试验II
试验II证实了如下观察结果，即来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶GCAT能够减少棕榈油中的甘油二酯含量。对于用5％甘油进行的试验来说，在反应混合物中的水浓度与MAG和DAG含量之间分别发现了关联：水浓度越低，DAG越低而MAG越高。
HPTLC量化了降低程度(参见表5)。从结果中可以看出，DAG的减少量占棕榈油中甘油二酯总量的13.29％，而合成的MONO的含量从0.01％(参照)升高到0.38％(1号样本)。
从该试验可以总结出，对于转移酶#196来说，甘油和水的最佳浓度如下：
转移酶#196：5％GL∶1.5％H2O
将这些观察结果与试验I中获得的结果比较，证实了在结果中获得了好的一致性。水的最佳浓度大概在0-1％水之间，取决于酶活性和甘油含量。
根据两个所进行的试验，可以得出如下结论，有可能通过转移酶催化的反应来减少棕榈油中的DAG含量，其中该酶在合成甘油一酯的甘油水解反应中用DAG作为供体分子和甘油作为受体分子。这与使用常规甘油三酯水解脂肪酶的甘油水解反应构成鲜明的对比，在该反应中DAG含量由于甘油三酯水解脂肪酶的部分水解活性而增加。
基于甘油二酯结构是1，2-和1，3-异构体的混合物以及转移酶对sn2-位置特异的事实，即使甘油二酯含量的少量减少也将对基于棕榈的产品具有巨大的物理影响。
实施例7：来自杀鲑气单胞菌的二酰甘油：甘油转移酶(本发明的脂质酰基转移酶)的固定
通过丙酮沉淀将甘油二酯：甘油转移酶固定在硅藻土(Celite)上。于室温将10ml溶解在20mM TEA缓冲液pH 7中的酶溶液与0.1克Celite 535(购自Fluka)缓慢搅拌2小时。
在持续搅拌过程中，加入50ml冷的丙酮。
通过5000g离心1分钟分离沉淀物。
用20ml冷的丙酮将沉淀物洗涤2次。
于环境温度将Celite试验约1小时。
在棕榈油中测试固定化转移酶(参见下表)
表
| ％ | |
| 棕榈油 | 92.5 |
| 甘油 | 5 |
| 固定在Celite上的二酰甘油：甘油转移酶，#178，45U/g | 2.0 |
| 水 | 0.5 |
将棕榈油和甘油加热到42℃。加入固定化转移酶。
在用磁力搅拌器缓和搅拌过程中，于42℃持续转移酶反应。在0.5、1、3、6和24小时后取样用于分析，并通过HPTLC进行分析。在24小时的反应时间后终止反应，过滤除去固定化酶。
HPTLC分析清楚显示了固定化的来自杀鲑气单胞菌的甘油二酯：甘油转移酶通过在棕榈油中形成甘油一酯并减少甘油二酯的作用。
在上述说明书中提及的所有出版物在此引入作为参考。所描述的本发明的方法和系统的不同修改和变化对于本领域技术人员来说是显然的，而不背离本发明的范围和精神。虽然已经连同具体的优选实施方案描述了本发明，应当理解，要求保护的发明不应不当地限于这种具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或者相关领域的技术人员来说是显然的用于实施本发明的所述模式的不同修改包括在权利要求书的范围内。
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布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
保藏证明由本页底部所指明的国际保藏单位根据细则7.1对初始保藏物出具
| 保藏人的名称和地址：Danisco A/SLangebrogade 1DK-1001 Copenhagen丹麦 |
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
BP/4表(只此一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
国际局表格
存活证明由下页所指明的国际保藏单位根据细则10.2出具
| 为其出具存活证明的组织的名称和地址：Danisco A/SLangebrogade 1DK-1001 Copenhagen丹麦 |
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
BP/9表(第1页)
| IV.存活性检验的操作条件4 | |
| V.国际保藏单位 | |
| 名称：NCIMB Ltd.地址：23St Machar DriveAberdeenAB24 3RYScotland，UK | 能代表国际保藏单位或被授权的官员的人的签名：日期：2004年1月9日 |
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
BP/9表(第2页且最后一页)
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1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
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| IV.存活性检验的操作条件4 | |
| V.国际保藏单位 | |
| 名称：NCIMB Ltd.地址：23 St Machar DriveAberdeenAB24 3RYScotland，UK | 能代表国际保藏单位或被授权的官员的人的签名：日期：2004年1月9日 |
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
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Claims (31)
1.从食用油中减少和/或去除甘油二酯的方法，包括a)将食用油与酰基受体底物和不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶混合，其中该不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。
2.按照权利要求1的方法，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是如下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一种或多种。
3.按照权利要求1的方法，其中食用油中的甘油二酯的含量减少了。
4.按照权利要求1或2的方法，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶将酰基基团从甘油二酯转移到酰基受体上，其中酰基受体是任何包含羟基基团(-OH)的化合物。
5.按照权利要求1-4的任何一项的方法，其中甘油二酯是1，2-甘油二酯。
6.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中酰基受体可溶于食用油中。
7.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中酰基受体是醇。
8.按照权利要求7的方法，其中酰基受体是醇。
9.按照权利要求8的方法，其中酰基受体是甘油。
10.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶包含H-309或者在对应于如SEQ ID No.2或SEQID No.32所示的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂肪分解酶的氨基酸序列中的His-309的位置上包含组氨酸残基。
11.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶可以从如下一种或多种属的生物体中获得：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、糖酵母属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌科(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特氏菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthonzonas)和假丝酵母属(Candida)。
12.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶包含如下氨基酸序列的一种或多种：(i)如SEQID No.2所示的氨基酸序列；(ii)如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；(iii)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；(iv)如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；(v)如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；(vi)如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；(vii)如SEQ ID No.20所示的氨基酸序列；(viii)如SEQ IDNo.22所示的氨基酸序列；(ix)如SEQ ID No.24所示的氨基酸序列；(x)如SEQ ID No.26所示的氨基酸序列；(xi)如SEQ ID No.28所示的氨基酸序列；(xii)如SEQ ID No.30所示的氨基酸序列；(xiii)如SEQ ID No.32所示的氨基酸序列；(xiv)如SEQ ID No.34所示的氨基酸序列；(xv)如SEQ ID No.55所示的氨基酸序列；(xvi)如SEQ ID No.58所示的氨基酸序列；(xvii)如SEQ ID No.60所示的氨基酸序列；(xviii)如SEQ ID No.61所示的氨基酸序列；(xix)如SEQ ID No.63所示的氨基酸序列；(xx)如SEQ ID No.65所示的氨基酸序列；(xxi)如SEQ ID No.67所示的氨基酸序列；(xxii)如SEQ ID No.70所示的氨基酸序列；或者(xxiii)与如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.55、SEQ ID No.58、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.63、SEQ ID No.65、SEQ ID No.67或SEQ ID No.70所示的序列的任何之一具有75％或更高的同一性的氨基酸序列。
13.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶包含由如下核苷酸序列的一种或多种编码的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；
(b)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
(c)如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
(d)如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；
(e)如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；
(f)如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；
(g)如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；
(h)如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列；
(i)如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列；
(j)如SEQ ID No.27所示的核苷酸序列；
(k)如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列；
(l)如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列；
(m)如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列；
(n)如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列；
(o)如SEQ ID No.54所示的核苷酸序列；
(p)如SEQ ID No.59所示的核苷酸序列；
(q)如SEQ ID No.62所示的核苷酸序列；
(r)如SEQ ID No.64所示的核苷酸序列；
(s)如SEQ ID No.66所示的核苷酸序列；
(t)如SEQ ID No.68所示的核苷酸序列；
(u)如SEQ ID No.69所示的核苷酸序列；或
(v)与如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ 1D No.33、SEQID No.35、SEQ ID No.54、SEQ ID No.59、SEQ ID No.62、SEQ ID No.64、SEQ ID No.66，SEQ ID No.68或SEQ ID No.69所示的序列的任何一种具有75％或更高的同一性的核苷酸序列。
14.按照前述权利要求的任何一项的方法，包括将所处理的食用油与一种或多种食物成分混合来配制食品。
15.不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在食用油加工中的用途，用于从所述食用油中减少和/或去除(优选选择性地减少和/或去除)甘油二酯，该不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。
16.不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶在包含食用油的食品加工中的用途，用于改进所述食品的结晶特性，该不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶表征为在食用油中能够将酰基基团从甘油二酯转移到甘油上的酶。
17.按照权利要求15或16的用途，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是如下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一种或多种。
18.按照权利要求15、16或17的任何一项的用途，其中食用油中的甘油二酯的含量减少了。
19.按照权利要求15-18的任何一项的用途，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶将酰基基团从甘油二酯转移到酰基受体上，其中酰基受体是任何包含羟基基团(-OH)的化合物。
20.按照权利要求15-19的任何一项的用途，其中甘油二酯是1，2-甘油二酯。
21.按照权利要求15-20的任何一项的用途，其中酰基受体可溶于食用油中。
22.按照权利要求14-19的任何一项的用途，其中酰基受体是醇。
23.按照权利要求22的用途，其中酰基受体是醇。
24.按照权利要求23的用途，其中酰基受体是甘油。
25.按照权利要求15-24的任何一项的用途，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶包含H-309或者在对应于如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示的嗜水气单胞菌脂肪分解酶的氨基酸序列中的His-309的位置上包含组氨酸残基。
26.按照权利要求15-25的任何一项的用途，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶可以从如下一种或多种属的生物体中获得：气单胞菌属、链霉菌属、糖酵母属、乳球菌属、分枝杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌属、弯曲杆菌属、弧菌科、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖糖酵母属、李斯特氏菌属、奈瑟氏球菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和假丝酵母属。
27.按照权利要求15-26的任何一项的用途，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶包含如下氨基酸序列的一种或多种：(i)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；(ii)如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；(iii)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；(iv)如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；(v)如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；(vi)如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；(vii)如SEQ ID No.20所示的氨基酸序列；(viii)如SEQID No.22所示的氨基酸序列；(ix)如SEQ ID No.24所示的氨基酸序列；(x)如SEQ ID No.26所示的氨基酸序列；(xi)如SEQ ID No.28所示的氨基酸序列；(xii)如SEQ ID No.30所示的氨基酸序列；(xiii)如SEQID No.32所示的氨基酸序列；(xiv)如SEQ ID No.34所示的氨基酸序列；(xv)如SEQ ID No.55所示的氨基酸序列；(xvi)如SEQ ID No.58所示的氨基酸序列；(xvii)如SEQ ID No.60所示的氨基酸序列；(xviii)如SEQ ID No.61所示的氨基酸序列；(xix)如SEQ ID No.63所示的氨基酸序列；(xx)如SEQ ID No.65所示的氨基酸序列；(xxi)如SEQ ID No.67所示的氨基酸序列；(xxii)如SEQ ID No.70所示的氨基酸序列；或者(xxiii)与如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.55、SEQ ID No.58、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.63、SEQ ID No.65、SEQ ID No.67或SEQ ID No.70所示的序列的任何之一具有75％或更高的同一性的氨基酸序列。
28.按照权利要求15-27的任何一项的用途，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶包含由如下核苷酸序列的一种或多种编码的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；
(b)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
(c)如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
(d)如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；
(e)如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；
(f)如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；
(g)如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；
(h)如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列；
(i)如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列；
(j)如SEQ ID No.27所示的核苷酸序列；
(k)如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列；
(l)如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列；
(m)如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列；
(n)如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列；
(o)如SEQ ID No.54所示的核苷酸序列；
(p)如SEQ ID No.59所示的核苷酸序列；
(q)如SEQ ID No.62所示的核苷酸序列；
(r)如SEQ ID No.64所示的核苷酸序列；
(s)如SEQ ID No.66所示的核苷酸序列；
(t)如SEQ ID No.68所示的核苷酸序列
(u)如SEQ ID No.69所示的核苷酸序列；或
(v)与如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ 1D No.33、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.54、SEQ ID No.59、SEQ ID No.62、SEQID No.64、SEQID No.66，SEQ ID No.68或SEQ ID No.69所示的序列的任何一种具有75％或更高的同一性的核苷酸序列。
29.按照权利要求15-28的任何一项的用途，其中不依赖脂肪酸CoA的甘油二酯：甘油酰基转移酶与结晶抑制剂联合使用。
30.实质如本文所述的方法，参考附随的说明书和附图。
31.实质如本文所述的用途，参考附随的说明书和附图。
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