JP2007521804A - 食用油の酵素処理 - Google Patents
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Abstract
Description
DAG(diglyceride)+グリセリン → 2MAG(monoglyceride)
である。
1,2−DAG+アシルCoA → CoA+TAG(triacylglycerol)
を触媒するDGAT(diacylglycerol acyltransferase)(又はジアシルグリセロールO−アシル基転移酵素)として知られる酵素とは極めて対照的である(かかる酵素は、E.C.2.3.1.20に分類される)。
(レシチンなどの)リン脂質+1,2−DAG → TAG(triacylglycerol)+リゾリン脂質
とも極めて対照的である。
"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract
"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract
"http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml" http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
"http://pfam.wustl.edu/" http://pfam.wustl.edu/
"http://pfam.jouy.inra.fr/" http://pfam.jouy.inra.fr/
"http://pfam.cgb.ki.se/" http://pfam.cgb.ki.se/
a)手引書
上記手順に従って、目的タンパク質とPfam00657コンセンサス配列とのアラインメント及びP10480とPfam00657コンセンサス配列とのアラインメントを得る、
又は
b)データベース
によって複数のアラインメントを得ることができる。
データベースは、Pfam00657コンセンサス配列の特定後に、検索配列のアラインメントをPfam00657コンセンサス配列のシードアラインメントに示す選択肢を提供する。P10480はこのシードアラインメントの一部であり、GCAT_AERHYで示される。検索配列とP10480の両方は同じ枠内に示される。
アエロモナス・ヒドロフィラGDSXリパーゼの残基は、NCBIファイルP10480中で番号付与されている。本文中の番号は、好ましい実施形態において本発明の脂質アシル基転移酵素中に存在する特定のアミノ酸残基を求めるために本発明において使用されるファイル中の番号である。
以下の保存残基は認識することができ、好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される酵素中に存在することができる。
ブロック1 − GDSXブロック
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28 29 30 31 32 33 34 35
ブロック2 − GANDYブロック
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
ブロック3 − HPTブロック
His
309
(i)本酵素は、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
(ii)本酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、Sから選択される1つ又は複数のアミノ酸残基)を含む。
(iii)本酵素は、His−309を含む、又は図2(配列番号2又は配列番号32)に示
されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含む。
(i)本酵素は、第1の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
(ii)本酵素は、少なくともGly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−134及びHis−309を含む、或いは図2(配列番号2)又は図28(配列番号32)に示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のそれぞれGly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−134及びHis−309に対応する位置のグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジン残基を含む。
(i)配列番号2で示されるアミノ酸配列(図2参照)
(ii)配列番号3で示されるアミノ酸配列(図3参照)
(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列(図4参照)
(iv)配列番号5で示されるアミノ酸配列(図5参照)
(v)配列番号6で示されるアミノ酸配列(図6参照)
(vi)配列番号12で示されるアミノ酸配列(図14参照)
(vii)配列番号20で示されるアミノ酸配列(図16)
(viii)配列番号22で示されるアミノ酸配列(図18)
(ix)配列番号24で示されるアミノ酸配列(図20参照)
(x)配列番号26で示されるアミノ酸配列(図22)
(xi)配列番号28で示されるアミノ酸配列(図24)
(xii)配列番号30で示されるアミノ酸配列(図26)
(xiii)配列番号32で示されるアミノ酸配列(図28)
(xiv)配列番号34で示されるアミノ酸配列(図30)
(xv)配列番号55で示されるアミノ酸配列(図52)
(xvi)配列番号58で示されるアミノ酸配列
(xvii)配列番号60で示されるアミノ酸配列
(xviii)配列番号61で示されるアミノ酸配列
(xix)配列番号63で示されるアミノ酸配列
(xx)配列番号65で示されるアミノ酸配列
(xxi)配列番号67で示されるアミノ酸配列
(xxii)配列番号70で示されるアミノ酸配列、
(xxiii)配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号12、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号55、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67又は配列番号70で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するアミノ酸配列。
(a)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基1〜100で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基101〜200で示されるアミノ酸配列、
(c)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基201〜300で示されるアミノ酸配列、或いは
(d)上記(a)〜(c)に定義されたアミノ酸配列のいずれか1つと75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列。
(a)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基28〜39で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基77〜88で示されるアミノ酸配列、
(c)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基126〜136で示されるアミノ酸配列、
(d)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基163〜175で示されるアミノ酸配列、
(e)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基304〜311で示されるアミノ酸配列、或いは
(f)上記(a)〜(e)に定義されたアミノ酸配列のいずれか1つと75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列。
(a)配列番号7で示されるヌクレオチド配列(図9参照)、
(b)配列番号8で示されるヌクレオチド配列(図10参照)、
(c)配列番号9で示されるヌクレオチド配列(図11参照)、
(d)配列番号10で示されるヌクレオチド配列(図12参照)、
(e)配列番号11で示されるヌクレオチド配列(図13参照)、
(f)配列番号13で示されるヌクレオチド配列(図15参照)、
(g)配列番号21で示されるヌクレオチド配列(図17参照)、
(h)配列番号23で示されるヌクレオチド配列(図19参照)、
(i)配列番号25で示されるヌクレオチド配列(図21参照)、
(j)配列番号27で示されるヌクレオチド配列(図23参照)、
(k)配列番号29で示されるヌクレオチド配列(図25参照)、
(l)配列番号31で示されるヌクレオチド配列(図27参照)、
(m)配列番号33で示されるヌクレオチド配列(図29参照)、
(n)配列番号35で示されるヌクレオチド配列(図31参照)、
(o)配列番号54で示されるヌクレオチド配列(図51)、
(p)配列番号59で示されるヌクレオチド配列、
(q)配列番号62で示されるヌクレオチド配列、
(r)配列番号64で示されるヌクレオチド配列、
(s)配列番号66で示されるヌクレオチド配列、
(t)配列番号68で示されるヌクレオチド配列、
(u)配列番号69で示されるヌクレオチド配列、
(v)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号54、配列番号59、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68又は配列番号69で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するヌクレオチド配列
の発現によって産生されるアミノ酸配列、或いはこれらのヌクレオチド配列の1個又は複数を含むことができる。
本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素が添加された食用油は、以下の詳細な手順に従って、酵素反応後にCHCl3:CH3OH 2:1で抽出し、脂質材料を含む有機相を単離し、GLCによって分析することができる。GLC分析から遊離脂肪酸及びジグリセリドの量が求められる。本発明による酵素が添加されていない対照食用油も同様に分析される。
GLC分析の結果から、遊離脂肪酸の増加及びジグリセリドの減少を計算することができる。
Δ%脂肪酸=%脂肪酸(酵素)−%脂肪酸(対照)、
Mv Fa=脂肪酸の平均分子量、
Δ%ジグリセリド=%ジグリセリド(対照)−%ジグリセリド(酵素)、
Mv Di=ジグリセリドの平均分子量、
転移酵素活性は、全酵素活性の百分率として計算される。
食用油からジグリセリドを除去するため又は食用油中のジグリセリドを低減するための、本明細書に教示される方法の使用による本発明において、特に特許請求の範囲の方法において使用される本明細書に教示される酵素の選択による本発明において、トリグリセリドを減少させず、且つ/又はFFA(free fatty acid)をさほど増加させずに、モノ及びジグリセリドを上回るジグリセリドの選択的な低減を実施することができる。
ジグリセリドは、パームを主成分とするマーガリン及びショートニングにおける結晶化を遅延させる。
a)加工中及び/又はその後の使用中に追加のモノグリセリドを食用油に添加する必要性を低下させる。モノグリセリドは、食品システムにおいて広く用いられている乳化剤である。
b)ジグリセリドを約6〜8%から約4〜5%に、さらにそれ以上減少させる。
c)プラント(工場)能力の適応性を増大させ、したがって製造間接費を低減する。
d)後結晶化問題を大きく減少させる。
e)一部の配合物においては、一部の完全飽和油脂トリグリセリドを除去することができる。というのは、本発明者らは結晶促進の必要性を低下させるからである。この点で、製造者は、従来、結晶形成を「促進」し販売後の製品における望ましくない結晶形成遅延を克服するために、完全飽和トリグリセリドを配合物に添加している。かかる結晶形成は、製造中に結晶成長を遅延させて所望の結晶タイプ(すなわち、マーガリン及びショートニングの場合には好ましくはベータ−プライム)にするのに十分な濃度のジグリセリドを含む配合物中にかなりの量のパーム油又はその成分が含まれるしるしである。しかし、本発明によって処理したパーム油を使用することによって、ジグリセリド含量は所与の混合物又は配合物内で十分に低減され、結晶成長を助けるために追加の完全飽和トリグリセリドを添加する必要性がより重要でなくなる。
f)大きなプロセス変更なしで、パームを主体とする混合物がより多様化し、液体油のコストが上昇する。
g)結晶化防止剤を置換することができ、且つ/又は結晶化防止剤を一部置換することができる。
現在、食品におけるトランス酸の使用に反対する立法及び世論がある(Fodevareministeriet, Denmark 2003)。そして、これは性能問題をもたらした。製造者は、可能であれば、パームを主成分とする溶液に切り替えたいと考えるかもしれない。というのは、この油タイプはC:16:0及びC:18:0異性体の量が多いからである。その結果、パームを以前は使用しなかった経済組織においてパームの消費が増加し始めている。
CBE(Cocoa Butter Equivalent)は、分留されたパーム油、特にPMF(palm mid fraction)、分留されたシアバター脂肪、多数の他の新奇な脂肪などの特殊な脂肪から処方される。コスト的な理由のため、CBE中にできるだけ多量のPMFを含めることが有利である。実際、多数のCBEはパーム留分のみを含むことができる。チョコレート製造の最も繊細な局面は、脂肪の結晶化である。ジグリセリドは結晶化に対して負の影響を及ぼし、例えば、成形品の取り出しは極めて重大な問題となり得る(Siew, 2001)。
トリグリセリド品質は性能に大きく影響する。これは、標準82%脂肪テーブルマーガリン用の典型的なトランス酸含有油配合物の例から、ともに類似したSFCプロファイルを有する典型的なエステル交換パームステアリン留分とパーム核を硬質原料(hard stock)として含むトランス非含有品に対して明らかである。結晶化の速度及び品質の低下は、「オイリングアウト(oiling out)」として知られる徴候をもたらし得る。そのため、硬質MAGなどの結晶プロモーターが必要になる。また、結晶安定化結晶形成(crystal stabilized crystal formation)の遅延は、「ざらつき(sandiness)」として知られる徴候をもたらし、それによって所望の結晶タイプの転換は、最終的により安定なベータ型に戻り、砂のようにざらざらした食感を与える。この徴候は、工業製品の特定の問題である。
脂肪改変
マーガリン、スプレッド、菓子/チョコレートなどの高脂肪固形食品に使用される脂肪の化学的製造中に、トランス脂肪酸は水素化プロセス(硬化)中に食用油に導入される。これによって、食用油の融解温度が変更されて、最終食品、例えば、室温で固形であるが塗り広げられるテーブルマーガリン又は保存中は固形であるが口の中で溶融するチョコレートの適切な粘ちゅう性が確保される。
カカオ脂は、口の中で溶融する固形菓子を与える独特の組成物を含む。より安価な代替品でカカオ脂を置換するために、植物油を水素化してトランス脂肪酸を生成させ、それによって食用油の融点を上昇させて、体温で溶融する類似の固形菓子が得られる。かかる変性植物油はCBE(cocoa butter equivalent)として知られ、或いは改変脂肪がチョコレート製品の諸特性を向上させる場合にはCBR(cocoa butter replacement)として知られる。CBE及びCBRに付随する1つの大きな問題は、植物油の水素化によって健康及び温度に有害と考えられるトランス脂肪が生成することである。このため、融解温度がそれよりも高い低トランス植物油又はその画分が使用される。パーム油及びパーム油留分は、トランスCBR/CBEが少ない主成分としてこの点で有利であると考えられる。
本発明に従って及び/又は本発明の方法において使用するのに適切なジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列のいずれか1つを含むことができ、且つ/又は以下のヌクレオチド配列によってコードすることができる。
配列番号58
ZP00058717
1 mlphpagerg evgaffallv gtpqdrrlrl echetrplrg rcgcgerrvp pltlpgdgvl
61 cttsstrdae tvwrkhlqpr pdggfrphlg vgcllagqgs pgvlwcgreg crfevcrrdt
121 pglsrtrngd ssppfragws lppkcgeisq sarktpavpr ysllrtdrpd gprgrfvgsg
181 praatrrrlf lgipalvlvt altlvlavpt gretlwrmwc eatqdwclgv pvdsrgqpae
241 dgeflllspv qaatwgnyya lgdsyssgdg ardyypgtav kggcwrsana ypelvaeayd
301 faghlsflac sgqrgyamld aidevgsqld wnsphtslvt igiggndlgf stvlktcmvr
361 vplldskact dqedairkrm akfettfeel isevrtrapd arilvvgypr ifpeeptgay
421 ytltasnqrw lnetiqefnq qlaeavavhd eeiaasggvg svefvdvyha ldgheigsde
481 pwvngvqlrd latgvtvdrs tfhpnaaghr avgervieqi etgpgrplya tfavvagatv
541 dtlagevg
配列番号59
nt
1 ggtggtgaac cagaacaccc ggtcgtcggc gtgggcgtcc aggtgcaggt gcaggttctt
61 caactgctcc agcaggatgc cgccgtggcc gtgcacgatg gccttgggca ggcctgtggt
121 ccccgacgag tacagcaccc atagcggatg gtcgaacggc agcggggtga actccagttc
181 cgcgccttcg cccgcggctt cgaactccgc ccaggacagg gtgtcggcga cagggccgca
241 gcccaggtac ggcaggacga cggtgtgctg caggctgggc atgccgtcgc gcagggcttt
301 gagcacgtca cggcggtcga agtccttacc gccgtagcgg tagccgtcca cggccagcag
361 cactttcggt tcgatctgcg cgaaccggtc gaggacgctg cgcaccccga agtcggggga
421 acaggacgac caggtcgcac cgatcgcggc gcaggcgagg aatgcggccg tcgcctcggc
481 gatgttcggc aggtaggcca cgacccggtc gccggggccc accccgaggc tgcggagggc
541 cgcagcgatc gcggcggtgc gggtccgcag ttctccccag gtccactcgg tcaacggccg
601 gagttcggac gcgtgccgga tcgccacggc tgatgggtca cggtcgcgga agatgtgctc
661 ggcgtagttg agggtggcgc cggggaacca gacggcgccg ggcatggcgt cggaggcgag
721 cactgtggtg tacggggtgg cggcgcgcac ccggtagtac tcccagatcg cggaccagaa
781 tccttcgagg tcggttaccg accagcgcca cagtgcctcg tagtccggtg cgtccacacc
841 gcggtgctcc cgcacccagc gggtgaacgc ggtgaggttg gcgcgttctt tgcgctcctc
901 gtcgggactc cacaggatcg gcggctgcgg cttgagtgtc atgaaacgcg accccttcgt
961 ggacggtgcg gatgcggtga gcgtcgggtg cctcccctaa cgctccccgg tgacggagtg
1021 ttgtgcacca catctagcac gcgggacgcg gaaaccgtat ggagaaaaca cctacaaccc
1081 cggccggacg gtgggtttcg gccacactta ggggtcgggt gcctgcttgc cgggcagggc
1141 agtcccgggg tgctgtggtg cgggcgggag ggctgtcgct tcgaggtgtg ccggcgggac
1201 actccgggcc tcagccgtac ccgcaacggg gacagttctc ctcccttccg ggctggatgg
1261 tcccttcccc cgaaatgcgg cgagatctcc cagtcagccc ggaaaacacc cgctgtgccc
1321 aggtactctt tgcttcgaac agacaggccg gacggtccac gggggaggtt tgtgggcagc
1381 ggaccacgtg cggcgaccag acgacggttg ttcctcggta tccccgctct tgtacttgtg
1441 acagcgctca cgctggtctt ggctgtcccg acggggcgcg agacgctgtg gcgcatgtgg
1501 tgtgaggcca cccaggactg gtgcctgggg gtgccggtcg actcccgcgg acagcctgcg
1561 gaggacggcg agtttctgct gctttctccg gtccaggcag cgacctgggg gaactattac
1621 gcgctcgggg attcgtactc ttcgggggac ggggcccgcg actactatcc cggcaccgcg
1681 gtgaagggcg gttgctggcg gtccgctaac gcctatccgg agctggtcgc cgaagcctac
1741 gacttcgccg gacacttgtc gttcctggcc tgcagcggcc agcgcggcta cgccatgctt
1801 gacgctatcg acgaggtcgg ctcgcagctg gactggaact cccctcacac gtcgctggtg
1861 acgatcggga tcggcggcaa cgatctgggg ttctccacgg ttttgaagac ctgcatggtg
1921 cgggtgccgc tgctggacag caaggcgtgc acggaccagg aggacgctat ccgcaagcgg
1981 atggcgaaat tcgagacgac gtttgaagag ctcatcagcg aagtgcgcac ccgcgcgccg
2041 gacgcccgga tccttgtcgt gggctacccc cggatttttc cggaggaacc gaccggcgcc
2101 tactacacgc tgaccgcgag caaccagcgg tggctcaacg aaaccattca ggagttcaac
2161 cagcagctcg ccgaggctgt cgcggtccac gacgaggaga ttgccgcgtc gggcggggtg
2221 ggcagcgtgg agttcgtgga cgtctaccac gcgttggacg gccacgagat cggctcggac
2281 gagccgtggg tgaacggggt gcagttgcgg gacctcgcca ccggggtgac tgtggaccgc
2341 agtaccttcc accccaacgc cgctgggcac cgggcggtcg gtgagcgggt catcgagcag
2401 atcgaaaccg gcccgggccg tccgctctat gccactttcg cggtggtggc gggggcgacc
2461 gtggacactc tcgcgggcga ggtggggtga cccggcttac cgtccggccc gcaggtctgc
2521 gagcactgcg gcgatctggt ccactgccca gtgcagttcg tcttcggtga tgaccagcgg
2581 cggggagagc cggatcgttg agccgtgcgt gtctttgacg agcacacccc gctgcaggag
2641 ccgttcgcac agttctcttc cggtggccag agtcgggtcg acgtcgatcc cagcccacag
2701 gccgatgctg cgggccgcga ccacgccgtt gccgaccagt tggtcgaggc gggcgcgcag
2761 cacgggggcg agggcgcgga catggtccag gtaagggccg tcgcggacga ggctcaccac
2821 ggcagtgccg accgcgcagg cgagggcgtt gccgccgaag gtgctgccgt gctggccggg
2881 gcggatcacg tcgaagactt ccgcgtcgcc taccgccgcc gccacgggca ggatgccgcc
2941 gcccagcgct ttgccgaaca ggtagatatc ggcgtcgact ccgctgtggt cgcaggcccg
//
テルモビフィダ\フスカ\−GDSx
配列番号60
1 vgsgpraatr rrlflgipal vlvtaltlvl avptgretlw rmwceatqdw clgvpvdsrg
61 qpaedgefll lspvqaatwg nyyalgdsys sgdgardyyp gtavkggcwr sanaypelva
121 eaydfaghls flacsgqrgy amldaidevg sqldwnspht slvtigiggn dlgfstvlkt
181 cmvrvpllds kactdqedai rkrmakfett feelisevrt rapdarilvv gyprifpeep
241 tgayytltas nqrwlnetiq efnqqlaeav avhdeeiaas ggvgsvefvd vyhaldghei
301 gsdepwvngv qlrdlatgvt vdrstfhpna aghravgerv ieqietgpgr plyatfavva
361 gatvdtlage vg
コリネバクテリウム\エフィシエンス(effciens)\GDSx 300 aa
配列番号61
1 mrttviaasa llllagcadg areetagapp gessggiree gaeastsitd vyialgdsya
61 amggrdqplr gepfclrssg nypellhaev tdltcqgavt gdlleprtlg ertlpaqvda
121 ltedttlvtl siggndlgfg evagcireri agenaddcvd llgetigeql dqlppqldrv
181 heairdragd aqvvvtgylp lvsagdcpel gdvseadrrw aveltgqine tvreaaerhd
241 alfvlpddad ehtscappqq rwadiqgqqt dayplhptsa gheamaaavr dalglepvqp
//
配列番号62
nt
1 ttctggggtg ttatggggtt gttatcggct cgtcctgggt ggatcccgcc aggtggggta
61 ttcacggggg acttttgtgt ccaacagccg agaatgagtg ccctgagcgg tgggaatgag
121 gtgggcgggg ctgtgtcgcc atgagggggc ggcgggctct gtggtgcccc gcgacccccg
181 gccccggtga gcggtgaatg aaatccggct gtaatcagca tcccgtgccc accccgtcgg
241 ggaggtcagc gcccggagtg tctacgcagt cggatcctct cggactcggc catgctgtcg
301 gcagcatcgc gctcccgggt cttggcgtcc ctcggctgtt ctgcctgctg tccctggaag
361 gcgaaatgat caccggggag tgatacaccg gtggtctcat cccggatgcc cacttcggcg
421 ccatccggca attcgggcag ctccgggtgg aagtaggtgg catccgatgc gtcggtgacg
481 ccatagtggg cgaagatctc atcctgctcg agggtgctca ggccactctc cggatcgata
541 tcgggggcgt ccttgatggc gtccttgctg aaaccgaggt gcagcttgtg ggcttccaat
601 ttcgcaccac ggagcgggac gaggctggaa tgacggccga agagcccgtg gtggacctca
661 acgaaggtgg gtagtcccgt gtcatcattg aggaacacgc cctccaccgc acccagcttg
721 tggccggagt tgtcgtaggc gctggcatcc agaagggaaa cgatctcata tttgtcggtg
781 tgctcagaca tgatcttcct ttgctgtcgg tgtctggtac taccacggta gggctgaatg
841 caactgttat ttttctgtta ttttaggaat tggtccatat cccacaggct ggctgtggtc
901 aaatcgtcat caagtaatcc ctgtcacaca aaatgggtgg tgggagccct ggtcgcggtt
961 ccgtgggagg cgccgtgccc cgcaggatcg tcggcatcgg cggatctggc cggtaccccg
1021 cggtgaataa aatcattctg taaccttcat cacggttggt tttaggtatc cgcccctttc
1081 gtcctgaccc cgtccccggc gcgcgggagc ccgcgggttg cggtagacag gggagacgtg
1141 gacaccatga ggacaacggt catcgcagca agcgcattac tccttctcgc cggatgcgcg
1201 gatggggccc gggaggagac cgccggtgca ccgccgggtg agtcctccgg gggcatccgg
1261 gaggaggggg cggaggcgtc gacaagcatc accgacgtct acatcgccct cggggattcc
1321 tatgcggcga tgggcgggcg ggatcagccg ttacggggtg agccgttctg cctgcgctcg
1381 tccggtaatt acccggaact cctccacgca gaggtcaccg atctcacctg ccagggggcg
1441 gtgaccgggg atctgctcga acccaggacg ctgggggagc gcacgctgcc ggcgcaggtg
1501 gatgcgctga cggaggacac caccctggtc accctctcca tcgggggcaa tgacctcgga
1561 ttcggggagg tggcgggatg catccgggaa cggatcgccg gggagaacgc tgatgattgc
1621 gtggacctgc tgggggaaac catcggggag cagctcgatc agcttccccc gcagctggac
1681 cgcgtgcacg aggctatccg ggaccgcgcc ggggacgcgc aggttgtggt caccggttac
1741 ctgccgctcg tgtctgccgg ggactgcccc gaactggggg atgtctccga ggcggatcgt
1801 cgttgggcgg ttgagctgac cgggcagatc aacgagaccg tgcgcgaggc ggccgaacga
1861 cacgatgccc tctttgtcct gcccgacgat gccgatgagc acaccagttg tgcaccccca
1921 cagcagcgct gggcggatat ccagggccaa cagaccgatg cctatccgct gcacccgacc
1981 tccgccggcc atgaggcgat ggccgccgcc gtccgggacg cgctgggcct ggaaccggtc
2041 cagccgtagc gccgggcgcg cgcttgtcga cgaccaaccc atgccaggct gcagtcacat
2101 ccgcacatag cgcgcgcggg cgatggagta cgcaccatag aggatgagcc cgatgccgac
2161 gatgatgagc agcacactgc cgaagggttg ttccccgagg gtgcgcagag ccgagtccag
2221 acctgcggcc tgctccggat catgggccca accggcgatg acgatcaaca cccccaggat
2281 cccgaaggcg ataccacggg cgacataacc ggctgttccg gtgatgatga tcgcggtccc
2341 gacctgccct gaccccgcac ccgcctccag atcctcccgg aaatcccggg tggccccctt
2401 ccagaggttg tagacacccg cccccagtac caccagcccg gcgaccacaa ccagcaccac
2461 accccagggt tgggatagga cggtggcggt gacatcggtg gcggtctccc catcggaggt
2521 gctgccgccc cgggcgaagg tggaggtggt caccgccagg gagaagtaga ccatggccat
2581 gaccgccccc ttggcccttt ccttgaggtc ctcgcccgcc agcagctggc tcaattgcca
2641 gagtcccagg gccgccaggg cgatgacggc aacccacagg aggaactgcc cacccggagc
2701 ctccgcgatg gtggccaggg cacctgaatt cgaggcctca tcacccgaac cgccggatcc
2761 agtggcgatg cgcaccgcga tccacccgat gaggatgtgc agtatgccca ggacaatgaa
2821 accacctctg gccagggtgg tcagcgcggg gtggtcctcg gcctggtcgg cagcccgttc
2881 gatcgtccgt ttcgcggatc tggtgtcgcc cttatccata gctcccattg aaccgccttg
2941 aggggtgggc ggccactgtc agggcggatt gtgatctgaa ctgtgatgtt ccatcaaccc
//
ノボスフィンゴビウム(Novosphingobium)\アロマティシボランス(aromaticivorans)\GDSx 284 aa
配列番号63
ZP00094165
1 mgqvklfarr capvllalag lapaatvare aplaegaryv algssfaagp gvgpnapgsp
61 ercgrgtlny phllaealkl dlvdatcsga tthhvlgpwn evppqidsvn gdtrlvtlti
121 ggndvsfvgn ifaaacekma spdprcgkwr eiteeewqad eermrsivrq iharaplarv
181 vvvdyitvlp psgtcaamai spdrlaqsrs aakrlarita rvareegasl lkfshisrrh
241 hpcsakpwsn glsapaddgi pvhpnrlgha eaaaalvklv klmk
//
配列番号64
1 tgccggaact caagcggcgt ctagccgaac tcatgcccga aagcgcgtgg cactatcccg
61 aagaccaggt ctcggacgcc agcgagcgcc tgatggccgc cgaaatcacg cgcgaacagc
121 tctaccgcca gctccacgac gagctgccct atgacagtac cgtacgtccc gagaagtacc
181 tccatcgcaa ggacggttcg atcgagatcc accagcagat cgtgattgcc cgcgagacac
241 agcgtccgat cgtgctgggc aagggtggcg cgaagatcaa ggcgatcgga gaggccgcac
301 gcaaggaact ttcgcaattg ctcgacacca aggtgcacct gttcctgcat gtgaaggtcg
361 acgagcgctg ggccgacgcc aaggaaatct acgaggaaat cggcctcgaa tgggtcaagt
421 gaagctcttc gcgcgccgct gcgccccagt acttctcgcc cttgccgggc tggctccggc
481 ggctacggtc gcgcgggaag caccgctggc cgaaggcgcg cgttacgttg cgctgggaag
541 ctccttcgcc gcaggtccgg gcgtggggcc caacgcgccc ggatcgcccg aacgctgcgg
601 ccggggcacg ctcaactacc cgcacctgct cgccgaggcg ctcaagctcg atctcgtcga
661 tgcgacctgc agcggcgcga cgacccacca cgtgctgggc ccctggaacg aggttccccc
721 tcagatcgac agcgtgaatg gcgacacccg cctcgtcacc ctgaccatcg gcggaaacga
781 tgtgtcgttc gtcggcaaca tcttcgccgc cgcttgcgag aagatggcgt cgcccgatcc
841 gcgctgcggc aagtggcggg agatcaccga ggaagagtgg caggccgacg aggagcggat
901 gcgctccatc gtacgccaga tccacgcccg cgcgcctctc gcccgggtgg tggtggtcga
961 ttacatcacg gtcctgccgc catcaggcac ttgcgctgcc atggcgattt cgccggaccg
1021 gctggcccag agccgcagcg ccgcgaaacg gcttgcccgg attaccgcac gggtcgcgcg
1081 agaagagggt gcatcgctgc tcaagttctc gcatatctcg cgccggcacc atccatgctc
1141 tgccaagccc tggagcaacg gcctttccgc cccggccgac gacggcatcc cggtccatcc
1201 gaaccggctc ggacatgctg aagcggcagc ggcgctggtc aagcttgtga aattgatgaa
1261 gtagctactg cactgatttc aaatagtatt gcctgtcagc tttccagccc ggattgttgc
1321 agcgcaacag aaacttgtcc gtaatggatt gatggtttat gtcgctcgca aattgccgtc
1381 gaagggaacg ggcgcgtcgc tcgttaacgt cctgggtgca gcagtgacgg agcgcgtgga
1441 tgagtgatac tggcggtgtc atcggtgtac gcgccgccat tcccatgcct gtacgcgccg
//
S.コエリコラー(coelicolor)\GDSx 268 aa
配列番号65
NP625998.
1 mrrfrlvgfl sslvlaagaa ltgaataqaa qpaaadgyva lgdsyssgvg agsyisssgd
61 ckrstkahpy lwaaahspst fdftacsgar tgdvlsgqlg plssgtglvs isiggndagf
121 adtmttcvlq sessclsria taeayvdstl pgkldgvysa isdkapnahv vvigyprfyk
181 lgttciglse tkrtainkas dhlntvlaqr aaahgftfgd vrttftghel csgspwlhsv
241 nwlnigesyh ptaagqsggy lpvlngaa
//
配列番号66
1 cccggcggcc cgtgcaggag cagcagccgg cccgcgatgt cctcgggcgt cgtcttcatc
61 aggccgtcca tcgcgtcggc gaccggcgcc gtgtagttgg cccggacctc gtcccaggtg
121 cccgcggcga tctggcgggt ggtgcggtgc gggccgcgcc gaggggagac gtaccagaag
181 cccatcgtca cgttctccgg ctgcggttcg ggctcgtccg ccgctccgtc cgtcgcctcg
241 ccgagcacct tctcggcgag gtcggcgctg gtcgccgtca ccgtgacgtc ggcgccccgg
301 ctccagcgcg agatcagcag cgtccagccg tcgccctccg ccagcgtcgc gctgcggtcg
361 tcgtcgcggg cgatccgcag cacgcgcgcg ccgggcggca gcagcgtggc gccggaccgt
421 acgcggtcga tgttcgccgc gtgcgagtac ggctgctcac ccgtggcgaa acggccgagg
481 aacagcgcgt cgacgacgtc ggacggggag tcgctgtcgt ccacgttgag ccggatcggc
541 agggcttcgt gcgggttcac ggacatgtcg ccatgatcgg gcacccggcc gccgcgtgca
601 cccgctttcc cgggcacgca cgacaggggc tttctcgccg tcttccgtcc gaacttgaac
661 gagtgtcagc catttcttgg catggacact tccagtcaac gcgcgtagct gctaccacgg
721 ttgtggcagc aatcctgcta agggaggttc catgagacgt ttccgacttg tcggcttcct
781 gagttcgctc gtcctcgccg ccggcgccgc cctcaccggg gcagcgaccg cccaggcggc
841 ccaacccgcc gccgccgacg gctatgtggc cctcggcgac tcctactcct ccggggtcgg
901 agcgggcagc tacatcagct cgagcggcga ctgcaagcgc agcacgaagg cccatcccta
961 cctgtgggcg gccgcccact cgccctccac gttcgacttc accgcctgtt ccggcgcccg
1021 tacgggtgat gttctctccg gacagctcgg cccgctcagc tccggcaccg gcctcgtctc
1081 gatcagcatc ggcggcaacg acgccggttt cgccgacacc atgacgacct gtgtgctcca
1141 gtccgagagc tcctgcctgt cgcggatcgc caccgccgag gcgtacgtcg actcgacgct
1201 gcccggcaag ctcgacggcg tctactcggc aatcagcgac aaggcgccga acgcccacgt
1261 cgtcgtcatc ggctacccgc gcttctacaa gctcggcacc acctgcatcg gcctgtccga
1321 gaccaagcgg acggcgatca acaaggcctc cgaccacctc aacaccgtcc tcgcccagcg
1381 cgccgccgcc cacggcttca ccttcggcga cgtacgcacc accttcaccg gccacgagct
1441 gtgctccggc agcccctggc tgcacagcgt caactggctg aacatcggcg agtcgtacca
1501 ccccaccgcg gccggccagt ccggtggcta cctgccggtc ctcaacggcg ccgcctgacc
1561 tcaggcggaa ggagaagaag aaggagcgga gggagacgag gagtgggagg ccccgcccga
1621 cggggtcccc gtccccgtct ccgtctccgt cccggtcccg caagtcaccg agaacgccac
1681 cgcgtcggac gtggcccgca ccggactccg cacctccacg cgcacggcac tctcgaacgc
1741 gccggtgtcg tcgtgcgtcg tcaccaccac gccgtcctgg cgcgagcgct cgccgcccga
1801 cgggaaggac agcgtccgcc accccggatc ggagaccgac ccgtccgcgg tcacccaccg
1861 gtagccgacc tccgcgggca gccgcccgac cgtgaacgtc gccgtgaacg cgggtgcccg
1921 gtcgtgcggc ggcggacagg cccccgagta gtgggtgcgc gagcccacca cggtcacctc
1981 caccgactgc gctgcggggc
//
S.アベルミチリス(avermitilis)\GDSx 269 aa
配列番号67
NP827753.
1 mrrsritayv tslllavgca ltgaataqas paaaatgyva lgdsyssgvg agsylsssgd
61 ckrsskaypy lwqaahspss fsfmacsgar tgdvlanqlg tlnsstglvs ltiggndagf
121 sdvmttcvlq sdsaclsrin takayvdstl pgqldsvyta istkapsahv avlgyprfyk
181 lggsclagls etkrsainda adylnsaiak raadhgftfg dvkstftghe icssstwlhs
241 ldllnigqsy hptaagqsgg ylpvmnsva
//
配列番号68
1 ccaccgccgg gtcggcggcg agtctcctgg cctcggtcgc ggagaggttg gccgtgtagc
61 cgttcagcgc ggcgccgaac gtcttcttca ccgtgccgcc gtactcgttg atcaggccct
121 tgcccttgct cgacgcggcc ttgaagccgg tgcccttctt gagcgtgacg atgtagctgc
181 ccttgatcgc ggtgggggag ccggcggcga gcaccgtgcc ctcggccggg gtggcctggg
241 cgggcagtgc ggtgaatccg cccacgaggg cgccggtcgc cacggcggtt atcgcggcga
301 tccggatctt cttgctacgc agctgtgcca tacgagggag tcctcctctg ggcagcggcg
361 cgcctgggtg gggcgcacgg ctgtgggggg tgcgcgcgtc atcacgcaca cggccctgga
421 gcgtcgtgtt ccgccctggg ttgagtaaag cctcggccat ctacgggggt ggctcaaggg
481 agttgagacc ctgtcatgag tctgacatga gcacgcaatc aacggggccg tgagcacccc
541 ggggcgaccc cggaaagtgc cgagaagtct tggcatggac acttcctgtc aacacgcgta
601 gctggtacga cggttacggc agagatcctg ctaaagggag gttccatgag acgttcccga
661 attacggcat acgtgacctc actcctcctc gccgtcggct gcgccctcac cggggcagcg
721 acggcgcagg cgtccccagc cgccgcggcc acgggctatg tggccctcgg cgactcgtac
781 tcgtccggtg tcggcgccgg cagctacctc agctccagcg gcgactgcaa gcgcagttcg
841 aaggcctatc cgtacctctg gcaggccgcg cattcaccct cgtcgttcag tttcatggct
901 tgctcgggcg ctcgtacggg tgatgtcctg gccaatcagc tcggcaccct gaactcgtcc
961 accggcctgg tctccctcac catcggaggc aacgacgcgg gcttctccga cgtcatgacg
1021 acctgtgtgc tccagtccga cagcgcctgc ctctcccgca tcaacacggc gaaggcgtac
1081 gtcgactcca ccctgcccgg ccaactcgac agcgtgtaca cggcgatcag cacgaaggcc
1141 ccgtcggccc atgtggccgt gctgggctac ccccgcttct acaaactggg cggctcctgc
1201 ctcgcgggcc tctcggagac caagcggtcc gccatcaacg acgcggccga ctatctgaac
1261 agcgccatcg ccaagcgcgc cgccgaccac ggcttcacct tcggcgacgt caagagcacc
1321 ttcaccggcc atgagatctg ctccagcagc acctggctgc acagtctcga cctgctgaac
1381 atcggccagt cctaccaccc gaccgcggcc ggccagtccg gcggctatct gccggtcatg
1441 aacagcgtgg cctgagctcc cacggcctga atttttaagg cctgaatttt taaggcgaag
1501 gtgaaccgga agcggaggcc ccgtccgtcg gggtctccgt cgcacaggtc accgagaacg
1561 gcacggagtt ggacgtcgtg cgcaccgggt cgcgcacctc gacggcgatc tcgttcgaga
1621 tcgttccgct cgtgtcgtac gtggtgacga acacctgctt ctgctgggtc tttccgccgc
1681 tcgccgggaa ggacagcgtc ttccagcccg gatccgggac ctcgcccttc ttggtcaccc
1741 agcggtactc cacctcgacc ggcacccggc ccaccgtgaa ggtcgccgtg aacgtgggcg
1801 cctgggcggt gggcggcggg caggcaccgg agtagtcggt gtgcacgccg gtgaccgtca
1861 ccttcacgga ctgggccggc ggggtcgtcg taccgccgcc gccaccgccg cctcccggag
1921 tggagcccga gctgtggtcg cccccgccgt cggcgttgtc gtcctcgggg gttttcgaac
//
ストレプトミセス ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素
配列番号69
ACAGGCCGATGCACGGAACCGTACCTTTCCGCAGTGAAGCGCTCTCCCCCCATCGTTCGC
CGGGACTTCATCCGCGATTTTGGCATGAACACTTCCTTCAACGCGCGTAGCTTGCTACAA
GTGCGGCAGCAGACCCGCTCGTTGGAGGCTCAGTGAGATTGACCCGATCCCTGTCGGCCG
CATCCGTCATCGTCTTCGCCCTGCTGCTCGCGCTGCTGGGCATCAGCCCGGCCCAGGCAG
CCGGCCCGGCCTATGTGGCCCTGGGGGATTCCTATTCCTCGGGCAACGGCGCCGGAAGTT
ACATCGATTCGAGCGGTGACTGTCACCGCAGCAACAACGCGTACCCCGCCCGCTGGGCGG
CGGCCAACGCACCGTCCTCCTTCACCTTCGCGGCCTGCTCGGGAGCGGTGACCACGGATG
TGATCAACAATCAGCTGGGCGCCCTCAACGCGTCCACCGGCCTGGTGAGCATCACCATCG
GCGGCAATGACGCGGGCTTCGCGGACGCGATGACCACCTGCGTCACCAGCTCGGACAGCA
CCTGCCTCAACCGGCTGGCCACCGCCACCAACTACATCAACACCACCCTGCTCGCCCGGC
TCGACGCGGTCTACAGCCAGATCAAGGCCCGTGCCCCCAACGCCCGCGTGGTCGTCCTCG
GCTACCCGCGCATGTACCTGGCCTCGAACCCCTGGTACTGCCTGGGCCTGAGCAACACCA
AGCGCGCGGCCATCAACACCACCGCCGACACCCTCAACTCGGTGATCTCCTCCCGGGCCA
CCGCCCACGGATTCCGATTCGGCGATGTCCGCCCGACCTTCAACAACCACGAACTGTTCT
TCGGCAACGACTGGCTGCACTCACTCACCCTGCCGGTGTGGGAGTCGTACCACCCCACCA
GCACGGGCCATCAGAGCGGCTATCTGCCGGTCCTCAACGCCAACAGCTCGACCTGATCAA
CGCACGGCCGTGCCCGCCCCGCGCGTCACGCTCGGCGCGGGCGCCGCAGCGCGTTGATCA
GCCCACAGTGCCGGTGACGGTCCCACCGTCACGGTCGAGGGTGTACGTCACGGTGGCGCC
GCTCCAGAAGTGGAACGTCAGCAGGACCGTGGAGCCGTCCCTGACCTCGTCGAAGAACTC
CGGGGTCAGCGTGATCACCCCTCCCCCGTAGCCGGGGGCGAAGGCGGCGCCGAACTCCTT
GTAGGACGTCCAGTCGTGCGGCCCGGCGTTGCCACCGTCCGCGTAGACCGCTTCCATGGT
CGCCAGCCGGTCCCCGCGGAACTCGGTGGGGATGTCCGTGCCCAAGGTGGTCCCGGTGGT
GTCCGAGAGCACCGGGGGCTCGTACCGGATGATGTGCAGATCCAAAGAATT
ストレプトミセス ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素
配列番号70
MRLTRSLSAASVIVFALLLALLGISPAQAAGPAYVALGDSYSSGNGAGSYIDSSGDCHRSN
NAYPARWAAANAPSSFTFAACSGAVTTDVINNQLGALNASTGLVSITIGGNDAGFADAMTT
CVTSSDSTCLNRLATATNYINTTLLARLDAVYSQIKARAPNARVVVLGYPRMYLASNPWYC
LGLSNTKRAAINTTADTLNSVISSRATAHGFRFGDVRPTFNNHELFFGNDWLHSLTLPVWE
SYHPTSTGHQSGYLPVLNANSST
パーム油中のジグリセリドの酵素による低減に対するアッセイ
7%ジグリセリドを含有するパーム油1グラムを蓋付きガラスに計量する。
グリセリン50mg及び酵素溶液10μlを添加する。反応混合物を加熱チャンバ中で磁気撹拌機を用いて40℃で20時間撹拌する。100℃に10分間加熱することによって酵素反応を停止させる。酵素溶液の代わりに水10μlを添加した基準試料を同様に処理する。試料を標準手順(以下参照)に従ってGLCによって分析し、脂肪酸、モノグリセリド及びジグリセリドの量を計算する。
計算:
GLC分析の結果から、遊離脂肪酸の増加及びジグリセリドの減少を計算することができる。
Δ%脂肪酸=%脂肪酸(酵素)−%脂肪酸(対照)、
Mv Fa=脂肪酸の平均分子量、
Δ%ジグリセリド=%ジグリセリド(対照)−%ジグリセリド(酵素)、
Mv Di=ジグリセリドの平均分子量、
転移酵素活性は、全酵素活性の百分率として計算される。
WCOT溶融シリカカラム12.5m×0.25mm ID×0.1μ膜厚5%フェニル−メチル−シリコーン(Chrompack社製CP Sil 8 CB)を備えたPerkin Elmer社製Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
キャリアガス:ヘリウム。
インジェクター.PSSIコールドスプリット注入(初期温度50℃ 385℃に昇温)、体積1.0μl
検出器 FID:395℃
乾燥器プログラム: 1 2 3
乾燥器温度、℃ 90 280 350
等温、時間、min 1 0 10
昇温速度、℃/min 15 4
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、単離された形であることが好ましい。「単離された」という用語は、配列が本来天然に付随し、天然に存在する少なくとも1個の他の成分から、その配列が少なくとも実質的に遊離されていることを意味する。
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、精製された形であることが好ましい。「精製された」という用語は、配列が比較的純粋な状態、例えば少なくとも純度約51%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも純度約90%、少なくとも純度約95%又は少なくとも純度約98%であることを意味する。
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチド又は改変に適切であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生するあらゆる細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で周知である。
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書では「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列並びに(その部分などの)その変異体、相同体、断片及び誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖であろうとアンチセンス鎖であろうと、2本鎖でも1本鎖でもよいゲノム、合成又は組換え起源とすることができる。
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離された後に、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が特定された後に、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましいことがあり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を変異させることが望ましいことがある。
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列も包含する。
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、或いはかかるポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列の使用も包含する(以下「相同配列」と記述する)。ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は「同一性」と同等とみなすことができる。
本発明は、本発明の配列に相補的である配列、或いは本発明の配列又はそれに相補的である配列とハイブリッド形成可能である配列も包含する。
本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に定義される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。このベクターを使用して、適合した宿主細胞中で、且つ/又は適合した宿主細胞から、ヌクレオチド配列を複製し、ポリペプチドの形で発現させることができる。発現は、プロモーター/エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む調節配列を用いて制御することができる。原核生物プロモーター及び真核細胞中で機能するプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用することができる。上記2種類以上の異なるプロモーターに由来する配列要素を含むキメラプロモーターを使用することもできる。
「発現ベクター」という用語は、インビボ又はインビトロでの発現が可能な構築体を意味する。
一部の適用例においては、本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞などによって、ヌクレオチド配列の発現を可能にする制御配列に作動可能に結合することができる。例として、本発明は、かかる制御配列に作動可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを包含する。すなわち、このベクターは発現ベクターである。
「構築体」という用語は、「抱合体」、「カセット」、「ハイブリッド」などの用語と同義であり、プロモーターに直接又は間接的に結合し、本発明によって使用される、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に介在するSh1−イントロン、ADHイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー基の提供である。直接又は間接的結合を含む、本発明に関係する「融合」という用語でも同じことが当てはまる。これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターを通常伴うタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを、それらがどちらも天然環境にあるときに包含しない場合もある。
本発明に関係する「宿主細胞」という用語は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドの組換え産生に使用される上記発現ベクターのどちらかを含む任意の細胞を含む。
本発明に関係する「生物」という用語は、本発明によるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び/又はそれらから得られる生成物を含むことができるあらゆる生物を含む。
先に示したように、宿主生物は、原核生物又は真核生物とすることができる。適切な原核生物宿主の例としては、大腸菌及びバチルス サブチリスが挙げられる。
宿主生物は、糸状菌などの真菌とすることができる。適切なかかる宿主の例としては、サーモマイセス(Thermomyces)属、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ムコール(Mucor)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、トリコデルマ(Trichoderma)属などに属するあらゆるメンバーが挙げられる。
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
本発明に適切な宿主生物は植物とすることができる。一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)による論文又は国際公開第01/16308号にある。トランスジェニック植物は、例えば、高レベルの植物ステロールエステル及び植物スタノールエステルを産生することができる。
ポリペプチドは、発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列は、本発明の状況でも使用することができる。
アミノ酸配列の発現を検出し、測定する様々なプロトコールが当分野で知られている。例としては、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)、RIA(radioimmunoassay)及びFACS(fluorescent activated cell sorting)が挙げられる。
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドは、融合タンパク質として生成され、例えば、その抽出及び精製に役立てることができる。融合タンパク質パートナーの例としては、(GST(glutathione-S-transferase)、6xHis、GAL4(DNA結合及び/又は転写活性化ドメイン)、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質パートナーと目的タンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を入れて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることが好都合な場合もある。融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
[実施例]
MONO=モノグリセリド
MAG=モノアシルグリセロール=モノグリセリド
MAGとMONOは本明細書では区別なく使用される。
DAG=ジアシルグリセロール
FFA=遊離脂肪酸
使用系統:
アエロモナス サルモニシダ亜種サルモニシダ(ATCC 14174)をATCCから入手し、LB(Luria-Bertani)培地中で終夜30℃で増殖させた。細胞は遠心分離し、Qiagen Ltd.社のゲノムDNA単離手順によって単離した。ゲノムDNA緩衝剤セット(cat.19060)、プロテアーゼK(cat.19131)及びRNAse A(cat.19101)はすべてQiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX)から入手した。
アエロモナス由来の転移酵素遺伝子のすべてのDNA増幅では、ゲノムDNA(0.2〜1ul)をテンプレートとして用い、pfu DNAポリメラーゼ(2.5単位)を10× pfu緩衝剤10ul、各プライマー(50pmol/ul)1ul、200uMdNTPと一緒に総反応体積100ulで使用した。PCR反応は、プログラム可能なサーマルサイクラー中で以下の条件を用いて実施した:95℃30秒、(95℃30秒、60℃1分及び68℃2分)を30サイクル。追加の伸長を72℃で5分間行った。
レシチンに対する細胞抽出物の酵素活性は、NEFA(Non-Esterified Fatty Acid)キット(Roche, Switzerland)を用いて定量した。
発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを含むBL21(DE3)pLysSをLB培地+100ug/mlアンピシリン中で増殖させ、異なる増殖温度(37℃、30℃&20℃)で振とうしながらインキュベートした。活性脂質アシル基転移酵素を産生する最適条件は、図37に示すように培養物を30℃で増殖させたときであった。
発現ベクターpet12-AsalGCAT=pSMを含む系統BL21(DE3)pLysSを37℃で増殖させ、粗製細胞抽出物を超音波処理によって調製した。組換え酵素は、超音波処理した粗製細胞抽出体からQiagen社製Ni-NTAスピンキットを用いてさらに精製された。NEFAキットを用い、レシチンを基質としたホスホリパーゼ活性。基質レシチン及び反応混合物と一緒にインキュベートし、活性転移酵素を発現するBL21(DE3)pLysSから得られた粗製細胞抽出物は、薄層クロマトグラフィーによって分析され、分解生成物が存在することが判明した(図38参照)。
アエロモナス・ヒドロフィラ(ATCC#7965)をATCCから入手し、LB(Luria-Bertani)培地中で終夜30℃で増殖させた。細胞を遠心分離し、Qiagen Ltd.社のゲノムDNA単離手順によって単離した。ゲノムDNA緩衝剤セット(cat.19060)、プロテアーゼK(cat.19131)及びRNAse A(cat.19101)はすべてQiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX)から入手した。
アエロモナス由来の転移酵素遺伝子のすべてのDNA増幅では、ゲノムDNA(0.2〜1ul)をテンプレートとして用い、pfu DNAポリメラーゼ(2.5単位)を10× pfu緩衝剤10ul、各プライマー(50pmol/ul)1ul、200uMdNTPと一緒に総反応体積100ulで使用した。PCR反応は、プログラム可能なサーマルサイクラー中で以下の条件を用いて実施した:95℃30秒、(95℃30秒、60℃1分及び68℃2分)を30サイクル。追加の伸長を72℃で5分間行った。
AHUS1(5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3' 配列番号44、)及びAHLS1001(5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3' 配列番号57)。
を用いて実施され、C末端ヒスチジンタグが組み込まれた。
発現ベクターpet12a-A.h.GCAT=pSMaを含む大腸菌系統BL21(DE3)pLysSをLB培地+100ug/mlアンピシリン中で増殖させ、OD600=0.6から1.0になるまで振とうしながら37℃でインキュベートした。次いで、培養物はIPTG(0.4mM)を用いて誘導され、インキュベーションはさらに3時間続けられた。試料は、IPTG誘導後0時間、1、2及び3時間目に採取した。酵素活性は、NEFAキットを用いレシチンを基質として試験した(図41)。
発現ベクターpet12a-A.h.GCAT=pSMaを含むBL21(DE3)pLysSをLB培地+100ug/mlアンピシリン中で増殖させ、異なる増殖温度(37℃、30℃&20℃)で振とうしながらインキュベートした。活性GCAT酵素を産生する最適条件は、図42に示すように、培養物を30℃で増殖させたときであった。
発現ベクターpet12a-A.h.GCAT=pSMaを含む系統BL21(DE3)pLysSを37℃で増殖させ、粗製細胞抽出物を超音波処理によって調製した。組換え酵素は、超音波処理した粗製細胞抽出体からQiagen社製Ni-NTAスピンキットを用いてさらに精製された。NEFAキットを用い、レシチンを基質としたホスホリパーゼ活性。(図43)。
プラスミド構築
2種類の異なるバチルス サブチリス発現ベクター(pUB 110&pBE5)を、バチルス サブチリス中でのアエロモナス遺伝子の異種発現に使用した。pUB110ベクターはアルファアミラーゼプロモーターを含み、一方、pBEベクターは融合アエロモナス遺伝子の発現調節領域としてP32プロモーターを有する。pUB110においては、アエロモナスの成熟GCAT遺伝子の最初のアミノ酸は、バチルス サブチリス由来のキシラナーゼシグナルペプチド配列の最後のアミノ酸と制限酵素切断部位Nhe1を介してインフレームで融合させ、成熟タンパク質の前に追加の2個のアミノ酸が生成された。pBE5は、組換えタンパク質を培養ろ液中に分泌するためにNco1部位におけるcgtaseシグナル配列融合を含む。
PCR反応1:usAHncol (5'ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3'、配列番号46)及びlsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3'、配列番号47)
PCR反応2:US-AhnheI (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3'、配列番号48)及びlsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3、配列番号49)
PCR反応3:US-Asncol (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3'、配列番号50)及びlsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3'、配列番号51)
PCR反応4:US-ASnhe1 (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3'、配列番号52)及びlsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3'、配列番号53)。
2種類のアエロモナス種に由来するアシル基転移酵素は、大腸菌中で首尾良く発現された(上記結果)。バチルスpUB110&pBE5遺伝子融合構築体を使用してバチルス サブチリスを形質転換し、カナマイシンプレート上に播くことによって形質転換体を選択した。単離され2xYT中で増殖されたカナマイシン耐性形質転換体は、バチルス中でアエロモナス遺伝子を異種発現することができる。その培養ろ液は、アシル基転移酵素活性とホスホリパーゼ活性の両方に加えて、DGDG(digalactosyldiacylglycerol)ガラクトリパーゼ活性を有する。DGDG(digalactosyldiacylglycerol)に対する活性は、基質である小麦粉由来のDGDG(Sigmaから入手可能)と一緒に培養上清を60分間インキュベーションした後に、図44に示すようにレシチンに対する活性と同様に測定した。培地中で終夜(20〜24時間)から48時間培養した後に、バチルスは分泌タンパク質として酵素を産生した。アエロモナス遺伝子の発現は、バチルス&大腸菌における細胞生存能力及び増殖を妨げる場合があることが判明した。したがって、発現系統を慎重に選択し、増殖条件を最適化して確実に発現するようにする必要がある。例えば、いくつかのバチルス宿主系統(B.s 163、DB104及びOS 21)を、増殖比較のために発現ベクターで形質転換した。B.s163は、2種類のアエロモナス遺伝子で形質転換することができ、活性タンパク質を発現することができる。DB104は、すべての構築体で形質転換することができるが、A.サルモニシダ転移酵素しか発現することができない。
大腸菌発酵:
微生物
2系統のエシェリキア・コリ(Eschericia coli)、すなわち、アエロモナス・ヒドロフィラ(実施例2)脂質アシル基転移酵素を含む1つと、アエロモナス・サルモニシダ脂質アシル基転移酵素、(実施例1)を含む2つがこの試験に使用された。
LB寒天
これらの系統を維持するために使用されたLB寒天板は、10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、15g/L 寒天、100mg/Lアンピシリン及び35mg/Lクロラムフェニコールを含んだ。寒天板は30℃でインキュベートされた。
バイオリアクター培養用接種材料の生成に使用されるLB培地(50mL/振とうフラスコ)は、10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、100mg/Lアンピシリン及び35mg/Lクロラムフェニコールを含んだ。振とうフラスコにLB寒天板から接種して、30℃、200rpmでインキュベートした。
バイオリアクター培養は、10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、8g/L KH2PO4、0.9g/L MgSO4,7H2O、40g/Lグルコース一水和物、0.4mL/ ADD APT(登録商標)Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, The Netherlands)、10mg/L (NH4)2Fe(SO4)2・6H2O、0.7mg/L CuSO4・5H2O、3mg/L ZnSO4・7H2O、3mg/L MnSO4・H2O、10mg/L EDTA、0.1mg/L NiSO4・6H2O、0.1mg/L CoCl2、0.1mg/L H3BO4、0.1mg/L KI、0.1mg/L Na2MoO4・2H2O、1g/Lアンピシリン及び35mg/Lクロラムフェニコールを含む培地4Lが充填された6L社内組み立てバイオリアクター中で実施した。
バイオマスの収集及び均質化に以下の手順を使用した。
1)発酵物からの発酵ブロスを5000×gで4℃で10分間遠心分離し、上清を放出した。このバイオマスは使用するまで−20℃で貯蔵した。バイオマスは、解凍し、20mM NaH2PO4、pH7.4、500mM NaCl、10mMイミダゾール及び完全(EDTAなし)プロテアーゼ阻害剤(Roche, Germany)の500mLに再懸濁した。
2)この懸濁バイオマスをConstant Systems Ltd (Warwick, UK)製細胞粉砕機を用いて2kbar(200MPa)、4℃でホモジナイズした。
3)細胞片は、10,000×g、4℃で30分間遠心分離することによって除去し、続いて上清を収集した。
4)上清は13,700×g、4℃で60分間遠心分離することによってさらに精製し、続いてその上清を収集した。
5)上清を、0.2μm Vacu Capフィルター(Pall Life Sciences, UK)によってろ過し、そのろ液は収集後、直ちにクロマトグラフィー精製にかけた。
(製造者Amersham Biosciencesによって記述された方法に従って)カラム(2.5×10cm)にChelating Sepharose ff.ゲル50mlを詰め、硫酸Niを充填した。カラムは、20mM NaH2PO4、pH7.4、500mM NaCl、10mMイミダゾールの200mlで平衡化した。粗製物400mlを流量5ml/分でカラムにかけた。次いで、カラムは、20mM NaH2PO4、pH7.4、500mM NaCl、10mMイミダゾールを用いて、UV280がベースラインに達するまで洗浄された。次いで、20mM NaH2PO4、pH7.4、500mM NaCl及び500mMイミダゾールの40mlを用いてGCATを溶出させた。
発酵
BAC0318−19、BAC0323−24
微生物
この試験に使用される微生物は、ベクターpUB110OISに挿入されたアエロモナス サルモニシダ転移酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドでバチルス サブチリス宿主系統、#163が形質転換されて生じる。この遺伝子の発現はアルファ−アミラーゼプロモーターによって制御され、転移酵素の分泌はB.サブチリスキシラナーゼシグナル配列によって媒介される(実施例3)。これらの系統は、DIDK0138(発酵BAC0318−19)及びDIDK0153(発酵BAC0323−24)と命名された。
前培養培地
振とうフラスコ(総容積500mL、バッフル付き)に、
NaCl 5g/L
K2HPO4 10g/L
大豆粉 20g/L
酵母エキス、BioSpringer 106 20g/L
消泡剤、SIN260 5mL/L
を含む培地100mLを添加した。
前培養振とうフラスコに凍結培養物を25%(w/v)グリセリン貯蔵物から直接接種した。振とうフラスコを33℃、175rpmで約16時間インキュベートし、50mLを使用して発酵槽に接種した。
発酵は、6L社内組み立て発酵槽中で実施した。
バッチ培地(3L)は、
コーンスティープリカー(50% dw) 40g/L
酵母エキスBioSpringer 153(50% dw) 10g/L
NaCl 5g/L
CaCl2、2H2O 0.25g/L
Mn(NO3)2、H2O 0.2g/L
消泡剤SIN260 1mL/L
(高圧蒸気殺菌後に発酵槽にろ過滅菌された)カナマイシン 50mg/L
を含んだ。
グルコース一水和物 540g/kg
MgSO4、7H2O 4.8g/kg
消泡剤SIN260 4mL/kg
(別個に加圧滅菌された)酵母エキス、BioSpringer 153(50% dw) 150g/kg
を含んだ。
フィード−流量[g/h]=0、AcCO2<0.15
フィード−流量[g/h]=2.85+t・1.54、AcCO2≧0.15及びt<12
フィード−流量[g/h]=21.3、t>12
t:蓄積CO2(AcCO2)が0.15モルに達した時点からの時間(h)
フィード−流量[g/h]=0、AcCO2<0.15
フィード−流量[g/h]=2.0+t・1.08、AcCO2≧0.15及びt<12
フィード−流量[g/h]=15、t>12
t:蓄積CO2(AcCO2)が0.15モルに達した時点からの時間(h)
通気は1vvmに相当する3L/分であった。
温度は33℃であった。
発酵槽は、10cmの距離で配置された2個の8cmφRushton回転翼を備えた。
バイオマスは、16,000×gで10分間室温で遠心分離することによって除去された。上清はフィルター滅菌され、ろ液は精製及び応用試験に使用された。
概要
酵素によるグリセロール分解実験は、パーム油及びグリセリン/水をさまざまな濃度で含む反応器にグリセリン/転移酵素溶液を添加することによって開始された。反応はすべて43℃で磁気撹拌によって24時間実施した。反応後、試料はHPTLCによって分析し、一部の実験においてはその結果はGC分析によって確認した。実施した試行によれば、水濃度(water concentration)とDAG及びMAGレベルにはそれぞれ良好な相関があり、試験した最低水濃度は最高のMAGレベル及び最低のDAGレベルをもたらすことが判明した。
ジグリセリドに関する問題は、生成物のタイプ、例えば、それがマーガリン及びショートニング中にあるかどうかによってある程度左右される。したがって、生成物に応じて、ジグリセリドの存在は負の効果と正の効果の両方を有する。マーガリン製造の場合、適切な粘ちゅう性及び塑性を得るために、必要な結晶構造の脂肪製品のみを使用することができる。β’−結晶形は最も必要な構造であり、小さな結晶及び液体部分を維持する高い能力を示す。大きな結晶を有するとマーガリンの粒状構造が生じるので、最も安定な結晶形(β型)は望ましくない。Hernquist & Anjou (1993)及びWahnelt et al. (1991)によれば、脂肪中にジグリセリドが存在するとβ’からβ結晶への転移が遅くなる。しかし、ジグリセリドはβ’からβへの転移を遅延させるのと同様にα型からβ’型への転移も遅延させる(Walnet et al., 1991)。このため、ジグリセリドの存在は結晶化プロセス全体を遅延させると明確に述べることができる。結晶化が遅いことは、マーガリンの適用に決定的な影響を及ぼす。多量のパーム油を含むマーガリン混合物において結晶化を遅延させる効果は、従来の加工後に製品がいくらか柔らかく、充填が困難になり、その後の結晶化によって所望の食感よりも堅い食感を与え得ることである(Berger, 1990)。利点及び欠点にかかわらず、ジグリセリドの低減と完全な除去との正しいバランスを見出すことが重要であり得る。
パーム油: Palmotex, Aarhus United, Denmark
グリセリン: J. T. Baker, (7044)
DIMODAN(登録商標)P: Danisco A/S, Denmark
酵素:B.サブチリス中で発現させ、実験室規模で発酵させたアエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシル基転移酵素GCAT(転移酵素#196)。
酵素の凍結乾燥
酵素は凍結乾燥前に脱塩した(PD−10脱塩カラム、Amersham Biosciences社製)。脱塩した酵素はグリセリンと混合した(酵素:グリセリン比3.5:1)。試料は凍結乾燥し、10%水を添加した。試料は約20U(ホスホリパーゼ単位)/グラムを含んだ。
基質
0.6%L−αホスファチジルコリン95%植物(Avanti #441601)、0.4%Triton-X 100 (Sigma X-100)及び5mM CaCl2を0.05M HEPES緩衝剤pH7に溶解した。
アッセイ手順:
基質400μLを1.5mL Eppendorf管に添加し、Eppendorf Thermomixer中で37℃で5分間放置した。t=0分に酵素溶液50μLを添加した。酵素の代わりに水を含むブランクも分析した。試料は、Eppendorf Thermomixer中、10*100rpmで37℃で10分間混合した。t=10分にEppendorf管を別のサーモミキサー中に99℃で10分間放置して反応を停止させた。
試料中の遊離脂肪酸は、WAKO GmbH社製NEFA Cキットによって分析された。
pH7における酵素活性PLU−7は、アッセイ条件下で生成されるマイクロモル脂肪酸/分として計算された。
以下の表1及び表2の配合表に従って、パーム油をグリセリン−酵素溶液と反応させた。
反応温度:43℃
磁気撹拌:650rpm
反応時間:20時間
アプリケーター:LINOMAT 5、CAMAGアプリケーター
HPTLCプレート:10×10cm(Merck no. 1.05633)
塗布/溶出時間:8分間
展開流体:16%H3PO4中の6%酢酸銅(II)
WCOT溶融シリカカラム12.5m×0.25mm ID×0.1μm 5%フェニル−メチル−シリコーン(Chrompack社製CP Sil 8 CB)を備えたPerkin Elmer 8420 Capillary Gas Chromatography。
インジェクション:1.5μl スプリット付き
検出器:FID、385℃
オーブン温度、℃ : 80 200 240 360
恒温、時間、分 : 2 0 0 10
温度速度(Temperature rate)、
℃/分 : 20 10 12
実験I:
この実験の目的は、アエロモナス サルモニシダ由来のジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素のグリセロール分解反応によるパーム油中のDAGに対する影響を検討することである。GCATは、コレステロールエステル及びリゾレシチンの形成中に脂肪酸をレシチンコレステロールから転移可能であることが知られている。この試験では、本発明者らは、パーム油中のDAG量を低減しモノグリセリドを生成させるために、DAGを供与体とし、グリセリンを受容体として使用する酵素の可能性を検討した。
転移酵素#196:5%GL:0.5%H2O
HPTLCの結果に基づいて、試料番号2がGC分析用に選択された。HPTLCプレートの視覚的評価をDAGの定量分析によって確認することができるかどうかを見出すために。分析前にグリセリンを遠心分離によって試料から除去し、脂質相のみをGC分析にかけた。GC結果を下記表3に示す。
グリセロール分解生成物中のモノグリセリド及びジグリセリドの含量に関して、HPTLC分析の結果によれば、水濃度とMONO量及びDAG量にはそれぞれ相関があり、水濃度が低いほどDAGは少なく、MONOは多い。
この部分の目的は、パーム油中のDAG低減の最適化を続け、転移酵素#196を用いて転移酵素触媒グリセロール分解を分析することであった。第1の目的は、DAG量がMONO濃度の増加に合わせて低減する十分にバランスのとれた反応に達することである。
実験IIによって、アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシル基転移酵素GCATがパーム油中のジグリセリド量を低減することができるという観察が確認された。5%グリセリンを用いた実験の場合、反応混合物中の水濃度とMAG量及びDAG量との間にそれぞれ相関が認められ、水濃度が低いほどDAGは少なく、MAGは多い。
転移酵素#196:5%GL:1.5%H2O
ジアシルグリセロール:グリセリン転移酵素は、アセトン沈殿によってセライト上に固定される。酵素の20mM TEA緩衝剤pH7溶液10mlをセライト535(Fluka社製)0.1グラムと一緒に室温で2時間ゆっくり撹拌する。
冷アセトン50mlを連続撹拌しながら添加する。
沈殿物を1分間の遠心分離5000gによって単離する。
沈殿物を冷アセトン20mlで2回洗浄する。
セライトを周囲温度で約1時間試みる。
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Claims (31)
- a)食用油をアシル受容体基質及び脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む、食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去する方法であって、前記脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基を転移させる酵素として特徴づけられる方法。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素がアミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、Sから選択される1つ又は複数のアミノ酸残基である)を含む、請求項1に記載の方法。
- 食用油中のジグリセリド量が低減される、請求項1に記載の方法。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素がアシル基をジグリセリドからアシル受容体に転移させ、前記アシル受容体がヒドロキシ基(−OH)を含む任意の化合物である、請求項1又は2に記載の方法。
- ジグリセリドが1,2−ジグリセリドである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- アシル受容体が、食用油に可溶であるアシル受容体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- アシル受容体がアルコールである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- アシル受容体がアルコールである、請求項7に記載の方法。
- アシル受容体がグリセリンである、請求項8に記載の方法。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、H−309を含む、又は配列番号2若しくは配列番号32で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトミセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダから選択される1つ又は複数の属の生物から得られる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が以下のアミノ酸配列、すなわち、(i)配列番号2で示されるアミノ酸配列、(ii)配列番号3で示されるアミノ酸配列、(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列、(iv)配列番号5で示されるアミノ酸配列、(v)配列番号6で示されるアミノ酸配列、(vi)配列番号12で示されるアミノ酸配列、(vii)配列番号20で示されるアミノ酸配列、(viii)配列番号22で示されるアミノ酸配列、(ix)配列番号24で示されるアミノ酸配列、(x)配列番号26で示されるアミノ酸配列、(xi)配列番号28で示されるアミノ酸配列、(xii)配列番号30で示されるアミノ酸配列、(xiii)配列番号32で示されるアミノ酸配列、(xiv)配列番号34で示されるアミノ酸配列、(xv)配列番号55で示されるアミノ酸配列、(xvi)配列番号58で示されるアミノ酸配列、(xvii)配列番号60で示されるアミノ酸配列、(xviii)配列番号61で示されるアミノ酸配列、(xix)配列番号63で示されるアミノ酸配列、(xx)配列番号65で示されるアミノ酸配列、(xxi)配列番号67で示されるアミノ酸配列、(xxii)配列番号70で示されるアミノ酸配列、(xxiii)配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号12、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号55、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67又は配列番号70で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するアミノ酸配列から選択される1つ又は複数の配列を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、以下のヌクレオチド配列、すなわち、
(a)配列番号7で示されるヌクレオチド配列、
(b)配列番号8で示されるヌクレオチド配列、
(c)配列番号9で示されるヌクレオチド配列、
(d)配列番号10で示されるヌクレオチド配列、
(e)配列番号11で示されるヌクレオチド配列、
(f)配列番号13で示されるヌクレオチド配列、
(g)配列番号21で示されるヌクレオチド配列、
(h)配列番号23で示されるヌクレオチド配列、
(i)配列番号25で示されるヌクレオチド配列、
(j)配列番号27で示されるヌクレオチド配列、
(k)配列番号29で示されるヌクレオチド配列、
(l)配列番号31で示されるヌクレオチド配列、
(m)配列番号33で示されるヌクレオチド配列、
(n)配列番号35で示されるヌクレオチド配列、
(o)配列番号54で示されるヌクレオチド配列、
(p)配列番号59で示されるヌクレオチド配列、
(q)配列番号62で示されるヌクレオチド配列、
(r)配列番号64で示されるヌクレオチド配列、
(s)配列番号66で示されるヌクレオチド配列、
(t)配列番号68で示されるヌクレオチド配列、
(u)配列番号69で示されるヌクレオチド配列、
(v)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号54、配列番号59、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68又は配列番号69で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するヌクレオチド配列
から選択される1つ又は複数の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。 - 処理した食用油を1つ又は複数の食品成分と混合して食料品を製造するステップを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 食用油の製造において前記食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去(好ましくは選択的に低減及び/又は除去)するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用。
- 食用油を含む食料品の製造において前記食料品の結晶化特性を改善するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素がアミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、Sから選択される1つ又は複数のアミノ酸残基である)を含む、請求項15又は16に記載の使用。
- 食用油中のジグリセリド量が低減される、請求項15、16又は17のいずれか一項に記載の使用。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素がアシル基をジグリセリドからアシル受容体に転移させ、前記アシル受容体がヒドロキシ基(−OH)を含む任意の化合物である、請求項15から18のいずれか一項に記載の使用。
- ジグリセリドが1,2−ジグリセリドである、請求項15から19のいずれか一項に記載の使用。
- アシル受容体が、食用油に可溶であるアシル受容体である、請求項15から20のいずれか一項に記載の使用。
- アシル受容体がアルコールである、請求項14から19のいずれか一項に記載の使用。
- アシル受容体がアルコールである、請求項22に記載の使用。
- アシル受容体がグリセリンである、請求項23に記載の使用。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、H−309を含む、或いは配列番号2又は配列番号32で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項15から24のいずれか一項に記載の使用。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトミセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダから選択される1つ又は複数の属の生物から得られる、請求項15から25のいずれか一項に記載の使用。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が以下のアミノ酸配列、すなわち、(i)配列番号2で示されるアミノ酸配列、(ii)配列番号3で示されるアミノ酸配列、(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列、(iv)配列番号5で示されるアミノ酸配列、(v)配列番号6で示されるアミノ酸配列、(vi)配列番号12で示されるアミノ酸配列、(vii)配列番号20で示されるアミノ酸配列、(viii)配列番号22で示されるアミノ酸配列、(ix)配列番号24で示されるアミノ酸配列、(x)配列番号26で示されるアミノ酸配列、(xi)配列番号28で示されるアミノ酸配列、(xii)配列番号30で示されるアミノ酸配列、(xiii)配列番号32で示されるアミノ酸配列、(xiv)配列番号34で示されるアミノ酸配列、(xv)配列番号55で示されるアミノ酸配列、(xvi)配列番号58で示されるアミノ酸配列、(xvii)配列番号60で示されるアミノ酸配列、(xviii)配列番号61で示されるアミノ酸配列、(xix)配列番号63で示されるアミノ酸配列、(xx)配列番号65で示されるアミノ酸配列、(xxi)配列番号67で示されるアミノ酸配列、(xxii)配列番号70で示されるアミノ酸配列、(xxiii)配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号12、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号55、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67又は配列番号70で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するアミノ酸配列から選択される1つ又は複数の配列を含む、請求項15から26のいずれか一項に記載の使用。
- 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、以下のヌクレオチド配列、すなわち、
(a)配列番号7で示されるヌクレオチド配列、
(b)配列番号8で示されるヌクレオチド配列、
(c)配列番号9で示されるヌクレオチド配列、
(d)配列番号10で示されるヌクレオチド配列、
(e)配列番号11で示されるヌクレオチド配列、
(f)配列番号13で示されるヌクレオチド配列、
(g)配列番号21で示されるヌクレオチド配列、
(h)配列番号23で示されるヌクレオチド配列、
(i)配列番号25で示されるヌクレオチド配列、
(j)配列番号27で示されるヌクレオチド配列、
(k)配列番号29で示されるヌクレオチド配列、
(l)配列番号31で示されるヌクレオチド配列、
(m)配列番号33で示されるヌクレオチド配列、
(n)配列番号35で示されるヌクレオチド配列、
(o)配列番号54で示されるヌクレオチド配列、
(p)配列番号59で示されるヌクレオチド配列、
(q)配列番号62で示されるヌクレオチド配列、
(r)配列番号64で示されるヌクレオチド配列、
(s)配列番号66で示されるヌクレオチド配列、
(t)配列番号68で示されるヌクレオチド配列
(u)配列番号69で示されるヌクレオチド配列、
(v)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号54、配列番号59、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68又は配列番号69で示される配列のいずれか1つと75%以上同一であるヌクレオチド配列
から選択される1つ又は複数の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項15から27のいずれか一項に記載の使用。 - 脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が結晶化阻害剤と併用される、請求項15から28のいずれか一項に記載の使用。
- 添付の明細書本文及び図に関して実質的に上述された方法。
- 添付の明細書本文及び図に関して実質的に上述された使用。
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