ES2294575T3 - Tratamiento enzimatico de aceites. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para reducir y/o eliminar el diglicérido de un aceite comestible, que comprende a) mezclar un aceite comestible con un sustrato aceptor de acilo y una diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de ácido graso CoA, en el que la diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de ácido graso CoA se caracteriza como una enzima que en un aceite comestible transfiere un grupo acilo desde un diglicérido al glicerol, y en la que la diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de CoA comprende el motivo de la secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de entre los restos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
Description
Tratamiento enzimático de aceites.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para la eliminación y/o la reducción enzimática del
diglicérido (preferentemente el 1,2-diacilglicérido)
a partir de un aceite comestible.
Los aceites y grasas están constituidos por
mezclas complejas de triacilgliceroles (TAG), diacilgliceroles
(DAG), ácidos grasos libres y otros componentes en menor proporción.
La cristalización de estas mezclas depende de las características
de los TAG (estructura, longitud de la cadena, saturación comparada
con la insaturación y similares) y la interacción de estos TAG con
cada uno de los demás. Con respecto a la presencia de los DAG,
estudios anteriores han demostrado que presentan un efecto
significativo sobre las propiedades físicas de los aceites y
grasas. Éstas varían desde la velocidad de cristalización, cambios
de polimorfismo, punto de fusión, tamaño del cristal y
cristalografía (Siew, 2001).
En la mayoría de los aceites que se extraen de
las semillas aceitosas, el efecto de los DAG es menos pronunciado,
ya que los DAG están solamente presentes en pequeñas cantidades.
Principalmente en el aceite de palma y aceite de oliva, que son
aceites que contienen grandes cantidades naturales de DAG, sin
embargo, la calidad de estos aceites empeora si los DAG están
presentes en los mismos.
El aceite de palma obtenido a partir de la palma
de aceite (Elaeis guineensis) es un aceite comestible
comercialmente importante. El aceite de palma ha sido una grasa
importante y un recurso de aceite para la industria alimentaria
debido a varias propiedades ventajosas, tal como la alta
productividad, bajo precio, alta estabilidad térmica y oxidativa y
plasticidad a baja temperatura. Además, en comparación con otros
aceites vegetales, el aceite de palma es una fuente rica de
vitamina E antioxidante.
Una composición química típica del aceite de
palma refinado es de aproximadamente 93% de triglicéridos, 6% de
diglicéridos y 1% de monoglicéridos (MAG) (Okiy, 1977).
Cuando el aceite de palma cristaliza, se forma
una red tridimensional compleja de los presentes componentes. En
teoría se describe que cuanto mayor es la diversidad de los bloques
de construcción (TAG, DAG y MAG) en la red, más complicada será la
red y más lenta tendrá lugar la cristalización (Jacobsberg & Ho,
1976). Esta teoría fue confirmada por Drozdowski (1994). Además,
sus estudios demostraron que cuanto mayor era la variación de la
composición en ácido graso en la molécula de triacilglicerol, más
difícil resultaba la transición entre las diferentes fases
cristalinas.
cristalinas.
Como se mencionó anteriormente, un alto
contenido de diglicéridos en el aceite de palma afecta a sus
propiedades de cristalización (Okiy et al., 1978, Okiy,
1978).
La presencia de diglicéridos en dichos aceites
presenta inconvenientes. En particular, los diglicéridos en los
aceites comestibles (en particular en el aceite de palma) pueden
conducir a un aceite de baja calidad.
Los problemas que se refieren al contenido de
diglicérido en el aceite de palma y en otros aceites y grasas
comestibles han representado el tema de muchos estudios y pueden
encontrarse en la bibliografía diferentes soluciones para intentar
superar el problema del exceso de diglicéridos.
El productor japonés de enzimas Amano en su
página principal (Amano Enzyme Inc., 2004), recomendaba un
procedimiento enzimático para eliminar diglicéridos en grasas y
aceites. Este procedimiento está basado en la utilización de una
enzima LIPASA G "AMANO" 50 que puede degradar diglicéridos a
ácidos grasos libres y glicerol. Esta enzima es un hidrolizante de
diglicéridos (DAG) y/o (MAG). Los ácidos grasos libres producidos
son eliminados por destilación al vacío o cristalización
fraccionada.
El documento EP 0 558 112 describe un
procedimiento para la hidrólisis enzimática de diglicéridos
residuales en preparaciones de triglicérido en emulsiones. El
procedimiento está basado en la hidrólisis del diglicérido con
Lipasa G de Amano, Japón (supra). El procedimiento fue
potenciado realizando la reacción enzimática en una emulsión para
la degradación de diglicérido a ácidos grasos y glicerol. La fase
acuosa se separa tras la reacción y la enzima se reutiliza
parcialmente.
El documento JP 62061590 da a conocer una
mantequilla hidrogenada que contiene bajas cantidades de
diglicérido, que se prepara tratando aceites o grasas con una
enzima parcialmente específica del diglicérido (por ejemplo, una
lipasa) en presencia de una cantidad catalítica de agua y mediante
una lipasa que es una enzima 1,3-específica en
presencia de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos u otros aceites
o grasas de glicérido. El producto es mantequilla hidrogenada
especialmente adecuado para su utilización como sustituto de la
manteca de cacao. Por lo tanto, la lipasa G y la lipasa de
Rhizopus deremer (enzima 1,3-específica) se
mezclaron con tierra de diatomeas y se granularon. Los gránulos se
mezclaron con fracción de punto de fusión medio de palma (5,7% de
diglicéridos, índice de ácido 0,25) y agua (10% con respecto a la
enzima específica de glicérido parcial). La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 1 h., y las enzimas y el agua se
eliminaron para proporcionar una manteca hidrogenada que contenía
1,2% de diglicérido (índice de ácido 10,5).
La técnica anterior da así a conocer maneras de
reducir o eliminar el contenido de diglicérido en el aceite de
palma y otros aceites comestibles mediante reacciones enzimáticas.
Estos procedimientos se basan en la hidrólisis de diglicérido con
una lipasa hidrolizante de diglicérido específica durante la
formación de los ácidos grasos libres y glicerol. Los ácidos grasos
libres pueden eliminarse a continuación mediante diferentes
procedimientos como la destilación al vacío o el
fraccionamiento.
El inconveniente de utilizar una enzima
específica hidrolizante de diglicéridos es la formación desventajosa
de los ácidos grasos libres. Estos ácidos grasos libres han de
eliminarse del aceite de palma. Por lo tanto, la formación de ácidos
grasos libres se considera con frecuencia como pérdida de
producto.
Para superar los problemas de la eliminación del
ácido graso libre y la pérdida de producto producida por la
formación de ácido graso libre los solicitantes han descubierto un
nuevo procedimiento para superar los problemas de alto contenido en
diglicéridos en el aceite de palma y otros aceites vegetales.
La eliminación enzimática de los diglicéridos
del aceite de palma se ha dado a conocer mediante la utilización de
lipasas, que típicamente son enzimas hidrolizantes de
triacilglicerol 1,3-específicas (E.C. 3.1.1.3) (por
ejemplo véanse los documentos JP 6206590 o EP 0 652 289). El
documento WO 00/05396 da a conocer entre otros el tratamiento de un
material alimentario que puede comprender glicerol con una lipasa
para efectuar la glicerólisis en un medio con poco agua.
Sin embargo, tanto las enzimas hidrolizantes
(lipasas) del triacilglicerol 1,3 específicas y las enzimas
hidrolizantes de DAG/MAG producen un aumento significativo de los
ácidos grasos libres en el aceite, y también producen la hidrólisis
de los monoglicéridos.
Sin embargo, en algunos aceites vegetales para
algunas aplicaciones, por ejemplo, puede resultar deseable aumentar
el contenido de monoglicéridos del aceite ya que esto proporciona
funcionalidad emulsionante. Por lo tanto, en un aspecto resulta
preferido reducir el contenido en diglicéridos sin disminuir el
contenido en monoglicéridos. En otros aspectos puede reducirse
preferentemente tanto el contenido en diglicéridos como en
monoglicéridos.
Las enzimas lipasas pueden también producir un
aumento perjudicial de DAG debido a la hidrólisis del
triacilglicerol (TAG), la mayor parte del lípido presente en
aceites alimenticios.
En los documentos WO 2000/36114, US 2003/0028923
y US 2003/0074695 se da a conocer la transformación de una planta
con un ácido nucleico que presenta una secuencia que codifica una
enzima diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) o una secuencia
complementaria a ésta. La enzima DGAT dada a conocer en estos
documentos cataliza la etapa final en la "serie de reacciones de
Kennedy" en la que un diacilglicerol (DAG) se combina con los
grupos acilos de acil CoA para formar un triglicérido (TAG). Por lo
tanto, estos documentos dan a conocer la producción de plantas
transgénicas con composiciones y/o contenidos de TAG. Las enzimas
DGAT dadas a conocer en estos documentos no son lípido acil
transferasas y/o diglicérido:glicerol aciltransferasas según la
presente invención.
En particular, las DGAT requieren la presencia
de acil CoA o ácido graso CoA para funcionar. La acil CoA no
resulta adecuada su utilización comercial para el tratamiento de
aceites comestibles ya que su coste es prohibitivo. Sin embargo,
estas enzimas no funcionan sin la presencia de acil CoA. Además las
reacciones enzimáticas que se basan en ácido
graso-CoA son muy difíciles de controlar
industrialmente.
Además, todos estos documentos dan a conocer que
con frecuencia es deseable reducir la expresión de las enzimas DGAT
en un vegetal, para reducir así la cantidad de DAG en la planta.
Esto contrasta notablemente con la presente invención que en última
instancia requiere la conservación y/o producción de TAG a la vez
que reduce los diglicéridos (DAG) en un aceite comestible.
El documento WO 03/100044 da a conocer una
fosfolípidos:diacilglicerol aciltransferasa (PDAT) que cataliza la
formación de triglicéridos (TAG) mediante una aciltransferencia de
fosfolípidos (lecitina) entre otros a diacilgliceroles (DAG). Las
PDAT requieren fosfolípidos como donantes de acilo. Esto contrasta
notablemente con la presente invención en la que el donante de
acilo son los DAG. Este documento no da a conocer la eliminación de
DAG del aceite comestible utilizando una lípido aciltransferasa
según la presente invención.
Se ha descubierto que la utilización de lípido
aciltransferasas independientes de ácido graso CoA como se define
en la presente memoria, diglicérido:glicerol aciltransferasas
independientes de ácido graso CoA, producen la reducción selectiva
y/o eliminación de diglicéridos (preferentemente
1,2-diglicéridos) de los aceites comestibles.
\newpage
El término "selectivo" tal como se utiliza
en la presente memoria significa que en un medio de aceite
comestible la enzima utiliza diglicéridos (DAG), preferentemente
1,2-diglicéridos, como sustrato preferentemente para
triacilglicéridos (DAG) o monoglicéridos (MAG). Por lo tanto, los
diglicéridos pueden eliminarse y/o reducirse del aceite comestible
a la vez que dejan la cantidad de triglicérido inalterada en el
aceite (o considerablemente inalterada). La cantidad de
monoglicéridos en el aceite permanece inalterada (o
considerablemente inalterada) o puede aumentar. En algunas
aplicaciones, la cantidad de monoglicérido en el aceite puede
reducirse.
En un aspecto de la presente invención se
proporciona un procedimiento para reducir y/o eliminar el
diglicérido de un aceite comestible, que comprende a) mezclar un
aceite comestible con un sustrato receptor de acilo y una
diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de ácido graso
CoA, en la que la diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA se caracteriza como una enzima que
en un aceite comestible puede transferir un grupo acilo desde un
diglicérido al glicerol, en el que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independientemente de CoA según la presente
invención es una aciltransferasa que comprende el motivo de la
secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los
restos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o
S.
Propiamente, el procedimiento según la presente
invención puede comprender además añadir el aceite comestible
tratado o una fracción del mismo a uno o más constituyentes
alimenticios para formular un producto alimenticio, tal como por
ejemplo margarina o un producto para untar.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona incluso además la utilización de una
diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de ácido graso
CoA caracterizada como una enzima que en un aceite comestible puede
transferir un grupo acilo desde un diglicérido al glicerol, en la
preparación de un producto alimenticio, para mejorar las
propiedades de cristalización del producto alimenticio, en el que la
diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de CoA según la
presente invención es una aciltransferasa que comprende el motivo
de la secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los
restos de aminoácido siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o
S.
En otro aspecto la presente invención
proporciona la utilización de una diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA caracterizada como
una enzima que en un aceite comestible puede transferir un grupo
acilo desde un diglicérido al glicerol, en la preparación de un
aceite comestible, para reducir y/o eliminar (preferentemente
reducir y/o eliminar selectivamente) diglicérido de dicho aceite
comestible, en el que la diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de CoA según la presente invención es una
aciltransferasa que comprende el motivo de la secuencia de
aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los siguientes restos
de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
En la presente memoria se da a conocer la
utilización de una diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA caracterizada como enzima que en
un aceite comestible puede transferir un grupo acilo desde un
diglicérido al glicerol, en la preparación de un producto
alimenticio, reduciendo y/o eliminando (preferentemente reduciendo
y/o eliminando de manera selectiva) diglicérido de dicho producto
alimenticio.
En la presente memoria se da a conocer también
la utilización de una diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de una enzima que en un aceite comestible puede
transferir un grupo acilo desde un diglicérido al glicerol, en la
preparación de un aceite comestible, para mejorar las propiedades de
cristalización de un aceite comestible.
Las expresiones "lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA" y "diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA" tal como se
utilizan en la presente memoria significan una enzima que presenta
actividad de aciltransferasa (clasificada generalmente como E.C.
2.3.1.x según las Enzyme Nomenclature Recommendations (1992) of the
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry
and Molecular Biology), mediante la cual la enzima puede transferir
un grupo acilo desde un diglicérido a uno o más sustratos
receptores).
receptores).
De este modo, la "lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA" o la "diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA" es una enzima
que presenta actividad de aciltransferasa (clasificada generalmente
como E.C. 2.3.1.x), pero que no es una diacilglicerol
aciltransferasa (DGAT) o una fosfolípido:diacilglicerol
aciltransferasa (PDAT). Las DGAT se clasifican típicamente como E.C.
2.3.1.20. Las PDAT se clasifican típicamente como E.C. 2.3.1.158.
La lípido aciltransferasa independiente de ácido graso CoA o la
diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de ácido graso
CoA es una enzima que presenta actividad de aciltransferasa, pero
que no es ninguna enzima clasificada como E.C. 2.3.1.20 o E.C.
2.3.1.158.
La enzima lípido aciltransferasa independiente
de ácido graso CoA o la enzima diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA es la que es capaz en un aceite
comestible de transformar un grupo acilo desde el DAG al glicerol.
Por lo tanto, la reacción catalizada por la enzima según la presente
invención es la siguiente:
Diglicérido
(DAG) + glicerol \rightarrow 2 monoglicéridos
(MAG)
\newpage
Esto contrasta notablemente con las enzimas
conocidas como diacilglicerol aciltransferasas (o diacilglicerol
O-aciltransferasa) (DGAT) (dichas enzimas están clasificadas
como E.C. 2.3.1.20) que catalizan la etapa final en el procedimiento
de Kennedy, es decir:
1,2-DAG + acil CoA
\rightarrow CoA + triacilglicerol
(TAG)
Para evitar dudas, las DGAT no son lípido
aciltransferasas independientes de ácido graso CoA o
diglicérido:glicerol aciltransferasa independientes de ácido graso
CoA según la presente invención.
La reacción catalizada por la enzima según la
presente invención contrasta notablemente también con la catalizada
por las enzimas conocidas como fosfolípidos:diacilglicerol
aciltransferasa (PDAT), es decir:
Fosfolípidos
(tal como lecitina) + 1,2-DAG \rightarrow
triacilglicerol (TAG) +
lisofosfolípido
Para evitar dudas, las PDAT no son lípido
aciltransferasas independientes de ácido graso CoA o
diglicérido:glicerol aciltransferasa independientes de ácido graso
CoA según la presente invención.
Preferentemente, la lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA o la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA es una enzima
clasificada como E.C. 2.3.1.73.
Propiamente, la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA puede ser
independiente de la membrana, es decir, puede ser una proteína que
no esté, en su medio natural, asociada a una membrana por la
presencia de un dominio de anclaje a la membrana o de expansión de
la membrana.
Para evitar las dudas, la lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA no es una enzima dada a conocer en
ninguno de los documentos WO 03/100044, WO 2000/36114, US
2003/0028923 o US 2003/0074695.
Además de tener actividad de aciltransferasa la
enzima puede tener actividad de lipasa, por ejemplo actividad de
fosfolipasa (clasificada generalmente como E.C. 3.1.1.x).
La lípido aciltransferasa independiente de ácido
graso CoA es una diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente
de ácido graso CoA. Estas expresiones pueden utilizarse
indistintamente en la presente memoria.
La diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA es una aciltransferasa que
comprende el motivo de la secuencia de aminoácidos GDSX, en el que
X es uno o más de los siguientes restos de aminoácido L, A, V, I, F,
Y, H, Q, T, N, M o S.
La expresión "diglicérido:glicerol
aciltransferasa" tal como se utiliza en la presente memoria es
sinónimo de la expresión "diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA".
Para evitar dudas, la expresión "ácido graso
CoA" es la misma que las expresiones
"acil-CoA", "ácido graso enzima CoA" y
"acil-Co enzima A". Estas expresiones pueden
utilizarse indistintamente en la presente memoria.
El aceite comestible utilizado en un
procedimiento o utilización según la presente invención puede estar
en forma de aceite en bruto o puede ser un aceite refinado.
En una forma de realización, preferentemente la
cantidad de diglicérido se reduce en lugar de eliminarse
completamente.
El término "reducido" tal como se utiliza
en la presente memoria significa que la cantidad de diglicérido en
un aceite comestible tratado con la enzima según la presente
invención es inferior a la cantidad de diglicérido en el aceite
comestible antes del tratamiento enzimático.
Preferentemente, los diglicéridos no se eliminan
completamente del aceite comestible.
En algunas aplicaciones, tal como la utilización
del aceite tratado en margarinas y/o grasa sólida, la cantidad de
diglicéridos, particularmente 1,2-diglicéridos,
debería reducirse hasta un punto en el que la velocidad de
cristalización de la mezcla de grasas produzca
beta-cristales pequeños. La cantidad de
1,2-diglicérido con respecto a la cantidad de
diglicérido total en el aceite de palma depende de las condiciones
de tiempo y almacenamiento del aceite. Para los aceites comerciales
la proporción de
1,3-diglicérido:1,2-diglicérido es
1,8:3,3. La eliminación de los 1,2-diglicéridos
tendrá el impacto máximo sobre las propiedades de la
cristalización.
Como resultará evidente para el experto en la
materia la reducción de la cantidad de diglicérido puede controlarse
mediante el tiempo de reacción y la temperatura de la reacción. En
un reactor de flujo con una enzima inmovilizada la reacción puede
estar controlada por el caudal.
\newpage
La lípido aciltransferasa para su utilización en
los procedimientos y/o utilizaciones de la presente invención puede
transferir un grupo acilo desde un diglicérido a un receptor de
acilo, en el que el receptor de acilo es cualquier compuesto que
comprenda un grupo hidroxi (-OH).
Propiamente, el término "diglicérido" tal
como se utiliza en la presente memoria significa uno o más de
1,2-diglicérido o 1,3-diglicérido.
Preferentemente, el diglicérido es un
1,2-diglicérido.
Los términos "diglicérido" y
"diacilglicerol" se utilizan indistintamente en la presente
memoria.
El término "diglicérido" no comprende
digalactosildiglicérido (DGDG) ni/o lecitina, por ejemplo
fosfatidilcolina.
El receptor de acilo es el que es soluble en un
aceite comestible.
El receptor de acilo es el glicerol.
Por lo tanto, en una forma de realización la
presente invención proporciona un procedimiento de reducción y/o
eliminación de diglicéridos de un aceite comestible, que comprende
a) mezclar un aceite comestible tanto con glicerol como con
diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de ácido graso
CoA, en la que la diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA está caracterizada como una enzima
que posee actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo de
la secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los
siguientes restos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o
S.
Preferentemente, la lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA puede escindir el enlace acilo
entre un(os) resto(s) de ácido graso y un eje central
de glicerol de un sustrato lipídico, en la que preferentemente el
sustrato lipídico es un diglicérido, preferentemente
1,2-diglicérido.
Preferentemente, la lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA no actúa sobre los triglicéridos
y/o monoglicéridos. En otras palabras, preferentemente la lípido
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA es selectiva para
los diglicéridos, preferentemente selectiva para los
1,2-diglicéridos. El sustrato lipídico puede
denominarse en la presente memoria "donante de lípido
acil".
Por lo tanto según la presente invención, pueden
conseguirse una o más de las siguientes propiedades ventajosas:
reducción en el contenido de diglicéridos de un aceite comestible;
una reducción en el contenido de diglicéridos de un aceite
comestible sin reducción en el contenido de triglicéridos del aceite
comestible; una reducción en el contenido en diglicéridos del
aceite comestible sin aumentar el contenido en monoglicéridos; una
reducción en el contenido en diglicéridos del aceite comestible sin
aumentar el contenido en monoglicéridos; una reducción de
diglicéridos y una reducción en el contenido en monoglicéridos de un
aceite comestible; una reducción en el contenido de diglicérido del
aceite comestible sin un aumento significativo en el contenido de
ácidos grasos en el aceite comestible.
Preferentemente, la lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA lleva a cabo una reacción de
alcoholisis (glicerólisis) transfiriendo un grupo acilo del ácido
graso procedente del diglicérido (preferentemente el
1,2-DAG) a un alcohol (glicerol) produciendo de este
modo dos moléculas de monoglicérido, es decir, una de diglicérido y
la otra de glicerol junto con el grupo acilo aceptado.
Preferentemente, X del motivo GDSX es L. Por lo
tanto, preferentemente la enzima comprende el motivo GSDL de la
secuencia de aminoácidos.
El motivo GDSX está compuesto por cuatro
aminoácidos conservados. Preferentemente, la serina dentro del
motivo es una serina catalítica de la enzima lípido
aciltransferasa. Propiamente, la serina del motivo GDSX puede estar
en una posición correspondiente a la Ser-16 en la
enzima lipolítica de Aeromonas hidrofila dada a conocer en
Brumlik & Buckey (Journal of Bacteriology abr. 1996, vol.
178, nº 7, pág. 2060-2064).
Para determinar si una proteína tiene el motivo
GDSX, se compara preferentemente la secuencia con los perfiles del
modelo de Markov ocultos (perfiles HMM) de la base de datos
pfam.
Pfam es una base de datos de las familias del
dominio de proteínas. Pfam contiene alineaciones de secuencia
múltiple curadas para cada familia así como modelos de Markov de
perfil oculto (perfiles HMM) para identificar estos dominios en
nuevas secuencias. Una introducción a Pfam puede encontrarse en
Bateman A. et al. (2002) Nucleic Acids Res.
30; 276-280. Los modelos de Markov ocultos se
utilizan en numerosas bases de datos que ayudan a clasificar las
proteínas, para un estudio véase Bateman A. y Haft D. H. (2002)
Brief Bioinform 3; 236-245.
\vskip1.000000\baselineskip
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12230032&dopt=Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11752314&dopt=Abstract
\newpage
Para una explicación detallada de los modelos
ocultos de Markov y de cómo se aplican en la base de datos Pfam
véase Durbin R., Eddy S. y Krogh A. (1998) Biological sequence
analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids.
Cambridge University Press, ISBN
0-521-62041-4. El
paquete informático Hammer puede adquirirse en la Washington
University, St. Louis, EUA.
Alternativamente, el motivo GDSX puede
identificarse utilizando el paquete informático Hammer, las
instrucciones se proporcionan en Durbin R., Eddy S. y Krogh A.
(1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of
proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN
0-521-62041-4 y las
referencias en la misma, y el perfil HMMER2 proporcionado en esta
memoria.
Puede accederse a la base de datos PFAM, por
ejemplo, a través de varios servidores que están actualmente
situados en las siguientes páginas de la red.
\vskip1.000000\baselineskip
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
\vskip1.000000\baselineskip
La base de datos ofrece una herramienta de
búsqueda en la que uno puede introducir una secuencia proteica.
Utilizando los parámetros por defecto de la base de datos se
analizará a continuación la presencia de los dominios Pfam en la
secuencia de proteínas. El dominio GDSX es un dominio demostrado en
la base de datos y como tal su presencia en cualquier secuencia
buscada será reconocido. La base de datos devolverá la alineación de
la secuencia de consenso Pfam00657 a la secuencia buscada:
Una alineación múltiple, que incluye
Aeromonas salmonicida o Aeromonas hydrophila puede
obtenerse mediante:
a) manual
- \quad
- obtener una alineación de la proteína de interés con la secuencia de consenso Pfam00657 y obtener una alineación de P10480 con la secuencia de consenso Pfam00657 siguiendo el procedimiento descrito anteriormente; o
b) mediante la base de datos
- \quad
- Después de la identificación de la secuencia de consenso Pfam00657 la base de datos ofrece la opción que consiste en mostrar una alineación de la secuencia buscada con la alineación del origen y está indicada por GCAT_AERHY. Tanto la secuencia buscada como P10480 se presentarán en la misma ventana.
Secuencia de referencia de Aeromonas
hydrophila:
Los restos de GDSX lipasa de Aeromonas
hydrophila están numerados en NCBI archivo P10480, las cifras en
este texto se refieren a las cifras proporcionadas en esta fila que
se utilizan en la presente invención para determinar los restos de
aminoácidos específicos que, en una forma de realización preferida
están presentes en las enzimas lípido aciltransferasa de la
invención.
La alineación de Pfam se realizó (Figura 33 y
34):
Los restos conservados siguientes pueden
reconocerse y en una forma de realización preferida pueden estar
presentes en las enzimas para su utilización en las composiciones y
procedimientos de la invención;
En los que "hid" significa un resto
hidrófobo seleccionado de entre Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys,
His, Lys, Trp, Tyr, Phe.
Preferentemente la enzima lípido aciltransferasa
para su utilización en las composiciones/procedimientos de la
invención puede alinearse utilizando la secuencia de consenso
Pfam00657.
Preferentemente, una compatibilidad positiva con
el perfil del modelo de Markov oculto (perfil HMM) de la familia del
dominio pfam00657 indica la presencia del dominio GDSL o GDSX según
la presente invención.
Preferentemente cuando se alinea con la
secuencia de consenso Pfam00657 la lípido aciltransferasa para su
utilización en las composiciones/procedimientos de la invención
presenta por lo menos uno, preferentemente más de uno,
preferentemente más de dos, de los siguientes, un bloque GDSx, un
bloque GANDY, un bloque HPT. Propiamente, la lípido aciltransferasa
puede tener un bloque GDSx y un bloque GANDY. Alternativamente, la
enzima puede tener un bloque GDSx y un bloque HPT. Preferentemente
la enzima comprende por lo menos un bloque GDSx.
Preferentemente, cuando se alinea con la
secuencia de consenso Pfam00657 la enzima para su utilización en
las composiciones/procedimientos de la invención tiene por lo menos
uno, preferentemente más de dos, preferentemente más de tres,
preferentemente más de cuatro, preferentemente más de cinco,
preferentemente más de seis, preferentemente más de siete,
preferentemente más de ocho, preferentemente más de nueve,
preferentemente más de diez, preferentemente más de once,
preferentemente más de doce, preferentemente más de trece,
preferentemente más de catorce, de los siguientes restos de
aminoácido cuando se compara con la secuencia polipeptídica de
referencia de A. hydrophilia, a saber la SEC. ID. nº: 32:
28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid,
131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.
El dominio GDSX de pfam00657 es un identificador
único que distingue las proteínas que poseen este dominio de otras
enzimas.
La secuencia de consenso pfam00657 se representa
en la Figura 1 como SEC. ID. nº: 1. Ésta procede de la
identificación de la familia 00657 de pfam, base de datos versión
6, que puede también denominarse como pfam00657.6 en la presente
memoria.
La secuencia de consenso puede actualizarse
utilizando además las ediciones de la base de datos de pfam.
Por ejemplo, las Figuras 33 y 34 presentan la
alineación de pfam de la familia 00657, de la base de datos versión
11, que puede también denominarse pfam00657.11 en la presente
memoria.
La presencia de los bloques GDSx, GANDY y HPT se
encuentra en la familia 00657 de pfam de ambas ediciones de la base
de datos.
Las ediciones futuras de la base de datos de
pfam pueden utilizarse para identificar la familia 00657 de
pfam.
Preferentemente, la enzima lípido
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA puede
caracterizarse utilizando los criterios siguientes:
- (i)
- la enzima posee actividad de aciltransferasa que puede definirse como actividad para la transferencia de éster mediante la cual la parte acilo de un enlace éster original de un donante de lípido acil se transfiere al receptor de acilo para formar un nuevo éster;
- (ii)
- la enzima comprende el motivo de la secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los siguientes restos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S;
- (iii)
- la enzima comprende His-309 o comprende un residuo de histidina en una posición correspondiente a His-309 en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila representada en la Figura 2 (SEC. ID. nº: 2 o SEC. ID. nº: 32).
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el resto de aminoácido del
motivo GDSX es L.
En la SEC. ID. nº: 2 o la SEC. ID. nº: 32 los
primeros 18 restos de aminoácido forman una secuencia señal.
His-309 de la secuencia completa, que es la proteína
que incluye la secuencia señal, es igual a His-291
de la parte madura de la proteína, es decir, la secuencia sin la
secuencia señal.
Preferentemente, la enzima lípido
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA comprende la
siguiente triada catalítica: Ser-34,
Asp-134 e His-309 o comprende un
resto de serina, un resto de ácido aspártico y un resto de
histidina, respectivamente, en las posiciones correspondientes a
Ser-34, Asp-134 e
His-309 en la enzima lipolítica de Aeromona
hydrophila representada en la Figura 2 (SEC. ID. nº: 2) o en la
Figura 28 (SEC. ID. nº: 32). Como se indicó anteriormente, en la
SEC. ID. nº: 2 o la SEC. ID. nº: 32 los primeros 18 restos de
aminoácido forman una secuencia señal. Ser-34,
Asp-134 e His-309 de la secuencia
completa, que es la proteína que incluye la secuencia señal, es
igual a Ser-16, Asp-116 e
His-291 de la parte madura de la proteína, es
decir, la secuencia sin la secuencia señal. En la secuencia de
consenso pfam00657, como se proporciona en la Figura 1 (SEC. ID.
nº: 1), los restos con punto activo corresponde a
Ser-7, Asp-157 e
His-348.
Preferentemente, la enzima lípido
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA puede
caracterizarse utilizando los criterios siguientes:
- (i)
- la enzima posee actividad de aciltransferasa que puede definirse como actividad para la transferencia de éster mediante la cual la parte acilo de un enlace éster original de un donante de lípido acil se transfiere al receptor de acilo para formar un nuevo éster;
- (ii)
- la enzima comprende por lo menos Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 e His-309 o comprende restos de glicina, ácido aspártico, serina, ácido aspártico e histidina en las posiciones correspondientes a Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 e His-309, respectivamente en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila representada en la Figura 2 (SEC. ID. nº: 2) o en la Figura 28 (SEC. ID. nº: 32).
\vskip1.000000\baselineskip
Propiamente, la enzima lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA puede obtenerse, preferentemente
obtenerse, de organismos de uno o más de los géneros siguientes:
Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus,
Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium,
Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus,
Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria,
Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.
Propiamente, la enzima lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA puede obtenerse, preferentemente
obtenerse, de uno o más de los organismos siguientes: Aeromonas
hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor,
Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes,
Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium
dehalogenans, Bacillus sp, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae,
Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces
cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe,
Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis,
Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris,
Xanthomonas axonopodis y Candida parapsilosis.
En otro aspecto, la enzima lípido
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA puede
preferentemente obtenerse, preferentemente ser obtenida, de uno o
más de entre Aeromonas hydrophila o Aeromonas
salmonicida.
Propiamente, la enzima lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA comprende una o más de las
secuencias de aminoácido siguientes:
- (i)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 2 (véase la Figura 2)
- (ii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 3 (véase la Figura 3)
- (iii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 4 (véase la Figura 4)
- (iv)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 5 (véase la Figura 5)
- (v)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 6 (véase la Figura 6)
- (vi)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 12 (véase la Figura 14)
- (vii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 20 (véase la Figura 16)
- (viii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 22 (véase la Figura 18)
- (ix)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 24 (véase la Figura 20)
- (x)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 26 (véase la Figura 22)
- (xi)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 28 (véase la Figura 24)
- (xii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 30 (véase la Figura 26)
- (xiii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 32 (véase la Figura 28)
- (xiv)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 34 (véase la Figura 30)
- (xv)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 55 (véase la Figura 52)
- (xvi)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 58
- (xvii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 60
- (xviii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 61
- (xix)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 63
- (xx)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 65
- (xxi)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 67
- (xxii)
- la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 70 o
- (xxiii)
- una secuencia de aminoácidos que tiene el 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias representadas como SEC. ID. nº: 2, SEC. ID. nº: 3, SEC. ID. nº: 4, SEC. ID. nº: 5, SEC. ID. nº: 6, SEC. ID. nº: 12, SEC. ID. nº: 20, SEC. ID. nº: 22, SEC. ID. nº: 24, SEC. ID. nº: 26, SEC. ID. nº: 28, SEC. ID. nº: 30, SEC. ID. nº: 32, SEC. ID. nº: 34, SEC. ID. nº: 55, SEC. ID. nº: 58, SEC. ID. nº: 60, SEC. ID. nº: 61, SEC. ID. nº: 63, SEC. ID. nº: 65, SEC. ID. nº: 67 o SEC. ID. nº: 70.
\vskip1.000000\baselineskip
Propiamente, la enzima lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA comprende la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 2 o como SEC. ID. nº: 3
o SEC. ID. nº: 32 o SEC. ID. nº: 34 o comprende una secuencia de
aminoácido que presenta el 75% o más, preferentemente el 80% o más,
preferentemente el 85% o más, preferentemente el 90% o más,
preferentemente el 95% o más, de identidad con la secuencia de
aminoácidos presentada como SEC. ID. nº: 2 o la secuencia de
aminoácidos presentada como SEC. ID. nº: 3 o la secuencia de
aminoácidos presentada como SEC. ID. nº: 32 o la secuencia de
aminoácidos presentada como SEC. ID. nº: 34.
Para los objetivos de la presente invención, el
grado de identidad se basa en el número de elementos de la
secuencia que son iguales. El grado de identidad puede determinarse
propiamente mediante programas informáticos conocidos en la
materia, tal como GAP proporcionado por el paquete del programa GCG
(Program Manual for de Wisconsin Package, versión 8, agosto 1994,
Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,
US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular
Biology 48, 443-45) utilizando los ajustes
siguientes para la comparación de la secuencia de polipéptidos:
penalidad por creación de GAP de 3,0 y penalidad de la prolongación
de GAP de 0,1.
Propiamente, la enzima lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene el 80% o más, preferentemente el 85% o más,
más preferentemente el 90% o más e incluso más preferentemente el
95% o más de identidad con cualquiera de las secuencias
representadas como SEC. ID. nº: 2, SEC. ID. nº: 3, SEC. ID. nº: 4,
SEC. ID. nº: 5, SEC. ID. nº: 6, SEC. ID. nº: 12, SEC. ID. nº: 20,
SEC. ID. nº: 22, SEC. ID. nº: 24, SEC. ID. nº: 26, SEC. ID. nº: 28,
SEC. ID. nº: 30, SEC. ID. nº: 32, SEC. ID. nº: 34, SEC. ID. nº: 55,
SEC. ID. nº: 58, SEC. ID. nº: 60, SEC. ID. nº: 61, SEC. ID. nº: 63,
SEC. ID. nº: 65, SEC. ID. nº: 67 o SEC. ID. nº: 70.
Propiamente, la enzima lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA comprende uno o más de las
siguientes secuencias de aminoácidos:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 1 a 100 de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 o de la SEC. ID. nº: 32;
- (b)
- una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 101 a 200 de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 o de la SEC. ID. nº: 32;
- (c)
- una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 201 a 300 de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 o de la SEC. ID. nº: 32; o
- (d)
- una secuencia de aminoácidos que presenta el 75% o más, preferentemente el 85% o más, más preferentemente el 90% o más, aun más preferentemente el 95% o más identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas en (a) a (c) anteriormente.
Propiamente, la enzima lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA comprende uno o más de las
siguientes secuencias de aminoácidos:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 28-39 de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 o de la SEC. ID. nº: 32;
- (b)
- una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 77-88 de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 o de la SEC. ID. nº: 32;
\global\parskip0.900000\baselineskip
- (c)
- una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 126-136 de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 o de la SEC. ID. nº: 32;
- (d)
- una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 163-175 de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 o de la SEC. ID. nº: 32;
- (e)
- una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 304-311 de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 o de la SEC. ID. nº: 32; o
- (f)
- una secuencia de aminoácidos que presenta el 75% o más, preferentemente el 85% o más, más preferentemente el 90% o más, aun más preferentemente el 95% o más identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas en (a) a (e) anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Propiamente, la enzima lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA puede comprender una secuencia de
aminoácidos producida por la expresión o una o más de las siguientes
secuencias nucleotídicas:
- (a)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 7 (véase la Figura 9);
- (b)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 8 (véase la Figura 10);
- (c)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 9 (véase la Figura 11);
- (d)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 10 (véase la Figura 12);
- (e)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 11 (véase la Figura 13);
- (f)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 13 (véase la Figura 15);
- (g)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 21 (véase la Figura 17);
- (h)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 23 (véase la Figura 19);
- (i)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 25 (véase la Figura 21);
- (j)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 27 (véase la Figura 23);
- (k)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 29 (véase la Figura 25);
- (l)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 31 (véase la Figura 27);
- (m)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 33 (véase la Figura 29);
- (n)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 35 (véase la Figura 31);
- (o)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 54 (véase la Figura 51);
- (p)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 59;
- (q)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 62;
- (r)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 64;
- (s)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 66;
- (t)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 68;
- (u)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 69 o
- (v)
- una secuencia nucleotídica que tiene el 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias representadas como SEC. ID. nº: 7, SEC. ID. nº: 8, SEC. ID. nº: 9, SEC. ID. nº: 10, SEC. ID. nº: 11, SEC. ID. nº: 13, SEC. ID. nº: 21, SEC. ID. nº: 23, SEC. ID. nº: 25, SEC. ID. nº: 27, SEC. ID. nº: 29, SEC. ID. nº: 31, SEC. ID. nº: 33, SEC. ID. nº: 35, SEC. ID. nº: 54, SEC. ID. nº: 59, SEC. ID. nº: 62, SEC. ID. nº: 64, SEC. ID. nº: 66, SEC. ID. nº: 68 o SEC. ID. nº: 69.
\vskip1.000000\baselineskip
Propiamente la secuencia nucleotídica puede
presentar el 80% o más, preferentemente 85% o más, más
preferentemente el 90% o más, y todavía más preferentemente el 95%
o más identidad con cualquiera de las secuencias representadas como
SEC. ID. nº: 7, SEC. ID. nº: 8, SEC. ID. nº: 9, SEC. ID. nº: 10,
SEC. ID. nº: 11, SEC. ID. nº: 13, SEC. ID. nº: 21, SEC. ID. nº: 23,
SEC. ID. nº: 25, SEC. ID. nº: 27, SEC. ID. nº: 29, SEC. ID. nº: 31,
SEC. ID. nº: 33, SEC. ID. nº: 35, SEC. ID. nº: 54, SEC. ID. nº: 59,
SEC. ID. nº: 62, SEC. ID. nº: 64, SEC. ID. nº: 66, SEC. ID. nº: 68 o
SEC. ID. nº: 69.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA puede ser una lecitina:colesterol
aciltransferasa (LCAT) o una variante de la misma (por ejemplo una
variante preparada por evolución molecular).
Las LCAT adecuadas son conocidas en la técnica y
pueden obtenerse a partir de uno o más de los organismos
siguientes, por ejemplo: mamíferos, rata, ratones, pollos,
Drosophila melanogaster, plantas, incluyendo
Arabidopsis y Oryza sativa, nemátodos, hongos y
levaduras.
En una forma de realización la enzima lípido
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA puede ser la
lípido aciltransferasa que puede obtenerse, preferentemente
obtenida, a partir de las cepas TOP 10 de E. coli que
albergan ppET12\alpha Ahydro y ppET12\alpha ASalmo depositadas
por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001
Copenhague K, Dinamarca bajo el Tratado de Budapest en el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para
el Procedimiento de Patente en la National Collection of Industrial,
Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen
Escocia, GB el 22 de diciembre de 2003 con los números de registro
NICMB 41204 y NCIMB 41205, respectivamente.
Preferentemente, al realizar un procedimiento
según la presente invención el producto se produce sin aumentar o
aumentar considerablemente los ácidos grasos libres en el producto
alimenticio.
El término "transferasa" tal como se
utiliza en la presente memoria es intercambiable con la expresión
"lípido aciltransferasa".
Propiamente, la lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA tal como se define en la presente
memoria cataliza una o más de las reacciones siguientes:
interesterificación, transesterificación, alcohólisis e
hidrólisis.
El término "interesterificación" se refiere
a la transferencia enzimática catalizada de grupos acilo entre el
donante lípido y el receptor lípido, en la que el donante lípido no
es un grupo acilo libre.
El término "transesterificación" tal como
se utiliza en la presente memoria significa la transferencia
enzimática catalizada de un grupo acilo procedente de un donante
lípido (distinto de un ácido graso libre) a un receptor acilo
(distinto de agua).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "alcohólisis" se refiere a la escisión enzimática de
un enlace covalente de un derivado ácido por reacción con alcohol
ROH de modo que uno de los productos se combina con el H del
alcohol y el otro producto se combina con el grupo OR del
alcohol.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "alcohol" se refiere a un compuesto alquílico que
contiene un grupo hidroxilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "hidrólisis" se refiere a la transferencia enzimática
catalizada de un grupo acilo procedente de un lípido al grupo OH de
una molécula de agua. La transferencia de acilo que procede de la
hidrólisis requiere la separación de la molécula de agua.
La expresión "sin aumentar o sin aumentar
considerablemente los ácidos grasos libres" tal como se utiliza
en la presente memoria significa que preferentemente la lípido
aciltransferasa según la presente invención presenta 100% de
actividad de transferasa (es decir, transfiere el 100% de los grupos
acilo de un donante acilo al receptor de acilo, sin actividad
hidrolítica) en un medio de aceite comestible; sin embargo, la
enzima puede transferir menos del 100% de los grupos acilo
presentes en el donante lípido acilo al receptor acilo. En cuyo
caso, preferentemente la actividad de la aciltransferasa totaliza
por lo menos el 30%, más preferentemente por lo menos el 40%, más
preferentemente por lo menos el 50%, más preferentemente por lo
menos el 70%, más preferentemente por lo menos el 80%, más
preferentemente por lo menos el 90% y más preferentemente por lo
menos el 98% del total de la actividad enzimática. El % de actividad
de transferasa (es decir, la actividad de la transferasa como
porcentaje de la actividad enzimática total) puede determinarse por
el protocolo siguiente:
Un aceite comestible al que se le ha añadido una
lípido aciltransferasa independiente de ácido graso CoA puede
extraerse siguiendo la reacción enzimática con CHCl_{3}:CH_{3}OH
2:1 y la fase orgánica que contiene el material lipídico se aísla y
analiza por GLC según el procedimiento detallado a continuación en
la presente memoria. A partir de los análisis de GLC la cantidad de
ácidos grasos libres y diglicéridos se determina. Un aceite
comestible de referencia al que no se ha añadido ninguna enzima
según la presente invención se analiza de la misma manera.
A partir de los resultados de los análisis por
GLC puede calcularse el aumento en ácidos grasos libres y la
disminución en diglicéridos:
\Delta% ácido graso = % ácido graso (enzima) -
% ácido graso (referencia);
Mv Fa = peso molecular medio de los ácidos
grasos;
\Delta% diglicérido = % diglicérido
(referencia) - % diglicérido (enzima);
Mv Di = peso molecular medio de diglicérido;
La actividad de la transferasa se calcula como
porcentaje de la actividad enzimática total:
Si los ácidos grasos libres aumentan en el
aceite comestible preferentemente no aumentan considerablemente, es
decir, en un grado significativo. Esto significa que el aumento en
ácido graso no afecta desfavorablemente la calidad del aceite
comestible.
En algunos aspectos de la presente invención, la
expresión "sin aumentar considerablemente los ácidos grasos
libres" tal como se utiliza en la presente memoria, significa que
la cantidad de ácido graso libre en un aceite comestible tratado
con una lípido aciltransferasa es inferior a la cantidad de ácido
graso libre producida en un aceite comestible o composición en la
que una enzima distinta de una lípido aciltransferasa se ha
utilizado, tal como por ejemplo en comparación con la cantidad de
ácido graso libre producido cuando una lipasa convencional por
ejemplo la lipasa de Pseudomonas cepacia (Lipase PS, Amano
Japón) o una lipasa de Rhizopus oryzae (Lipase F, Amano
Japón).
Propiamente, puede eliminarse cualquier glicerol
restante en el aceite comestible después que la reacción ha tenido
lugar, por ejemplo, por centrifugación o destilación al vacío.
Opcionalmente, puede eliminarse la enzima del
aceite comestible una vez que ha tenido lugar la reacción
enzimática. Alternativamente, la enzima puede simplemente
desactivarse y permanecer en el aceite comestible. Propiamente, la
enzima puede desactivarse calentando, por ejemplo.
En una forma de realización la lípido
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA para su utilización
en los procedimientos de la presente invención puede inmovilizarse.
Cuando se da el caso de que la enzima se inmoviliza, una mezcla que
comprende un receptor acilo y el aceite comestible puede pasarse a
través de una columna que comprende por ejemplo la enzima
inmovilizada. Al inmovilizar la enzima es posible reutilizarla
fácilmente.
Propiamente la enzima inmovilizada puede
utilizarse en un reactor de flujo o en un reactor discontinuo que
contiene una mezcla de reacción que comprende un receptor acilo y un
aceite comestible como sistema de dos fases. La mezcla de reacción
puede opcionalmente agitarse o tratarse por ultrasonidos. Una vez la
reacción ha alcanzado el equilibrio, por ejemplo, la mezcla de
reacción y la enzima inmovilizada pueden separarse. Propiamente, el
receptor acilo en exceso (tal como en exceso de glicerol) puede
eliminarse después de la reacción, por ejemplo por centrifugación o
destilación al vacío.
La lípido aciltransferasa inmovilizada puede
prepararse utilizando técnicas de inmovilización conocidas en la
técnica. Existen numerosos procedimientos de preparación de enzimas
inmovilizadas, que resultarán evidentes para un experto en la
materia (por ejemplo las técnicas citadas en la patente EP 0 746
608; o en Balcao V. M., Paiva A. L., Malcasa F. X., Enzyme
Microb. Technol. 1 de mayo de 1996;
18(6):392-416; o Retz M. T., Jaeger K. E.
Chem. Phys. Lipids. junio de 1998;
93(1-2):3-14; Bornscheuer U.
T., Bessler C., Srinivas R., Krishna S. H. Trenes
Biotechnol. octubre de 2002;
20(10):433-7; Plou et al., J.
Biotechnology 92 (2002) 55-66; Warmuth et
al., 1992. Bio Forum 9, 282-283; Ferrer et
al., 2000. J. Chem. Technol. Biotechnol. 75,
1-8; o Christensen et al., 1998.
Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105; Petersen y
Christensen, 2000, Applied Biocatalysis. Harwood Academic
Publishers, Amsterdam. Las técnicas que pueden utilizarse en la
presente memoria incluyen el acoplamiento covalente a Eupergit C, la
adsorción en polipropileno y la granulación con sílice, por
ejemplo.
Preferentemente, el aceite comestible es
cualquier aceite comestible que contenga un diglicérido,
preferentemente una cantidad significativa de diglicérido.
Preferentemente, el aceite comestible es uno o
más de los siguientes aceites: aceites extraídos o procedentes de
aceite de palma, oleína de palma, estearina de palma, fracción media
de palma o cualquier fracción de aceite de palma o de aceite de
oliva.
Más preferentemente, el aceite comestible es
aceite de palma y/u oleína de palma y/o estearina de palma.
Con respecto a la mezcla de aceite comestible,
sustrato receptor de acilo y lípido aciltransferasa, el experto en
la materia apreciará fácilmente que puede realizarse en cualquier
combinación y/o orden. Únicamente a título de ejemplo, el sustrato
aceptor de acilo puede mezclarse con el aceite comestible seguido de
la adición de la lípido aciltransferasa. Alternativamente, el
aceite comestible puede mezclarse con la lípido aciltransferasa
seguido de la adición del sustrato aceptor de acilo.
Alternativamente, la lípido aciltransferasa y el sustrato receptor
de acilo pueden mezclarse seguido de mezclado de la mezcla
enzima/sustrato con el aceite comestible. Alternativamente, desde
luego, las tres sustancias (a saber el aceite comestible, el
sustrato receptor de acilo y la lípido aciltransferasa) pueden
mezclarse simultáneamente.
Preferentemente el procedimiento se realiza a
una temperatura superior al punto de fusión del aceite
comestible.
Propiamente el procedimiento puede realizarse a
una temperatura entre 30 y 50ºC, preferentemente entre 35 y 45ºC,
preferentemente entre 40 y 45ºC.
Preferentemente, la enzima se añade al aceite
comestible en bruto o refinado. Preferentemente la presente
invención no comprende el tratamiento enzimático de un aceite
comestible cuando se mezcla con agua que contiene constituyentes.
De este modo, la presente invención prevé el tratamiento de un
aceite comestible por sí mismo, es decir, en un medio con poco
agua.
Aunque puede añadirse agua al aceite antes o
durante el procedimiento de la presente invención, en la forma de
realización más preferida no se añade agua. Si está presente el agua
en el aceite comestible, preferentemente existe menos del 10% de
agua presente, más preferentemente menos del 7,5%, menos del 5%,
menos del 1%, menos del 0,5%, menos del 0,4%, menos del 0,3%, menos
del 0,2% o menos del 0,1% de agua presente. Propiamente, entre el
0,1 y el 1% de agua puede estar presente en el aceite
comestible.
En una forma de realización el aceite comestible
utilizado en un procedimiento según la presente invención puede
enriquecerse con uno o más donantes de acilo y/o puede enriquecerse
con uno o más receptores de acilo y/o puede enriquecerse tanto con
uno o más receptores de acilo como con uno o más donantes de acilo.
"Enriquecido con" significa que el donante de acilo y/o el
receptor de acilo no está presente de forma natural en el aceite
comestible y se añade al mismo tiempo, inmediatamente después y/o
inmediatamente antes de poner el aceite comestible en contacto con
la lípido aciltransferasa según la presente invención.
Propiamente, el donante de acilo suplementario
puede ser distinto de un DAG. Propiamente el donante de acilo
suplementario puede ser por ejemplo un fosfolípido (por ejemplo
lecitina).
Propiamente, el receptor de acilo suplementario
puede ser el glicerol. Propiamente, sin embargo puede ser un
receptor de acilo distinto del glicerol, por ejemplo un esterol
vegetal y/o un estanol vegetal, por ejemplo. Propiamente, el
receptor de acilo suplementario puede ser una combinación de
glicerol y uno o más receptores de acilo adicionales.
La utilización de un aceite enriquecido con un
fosfolípido permite que se produzca en el aceite un emulsionante
adicional (liso-fosfolípido). La utilización de un
aceite enriquecido con un esterol vegetal y/o un estanol vegetal
permite que se produzca en el aceite comestible tanto un éster de
esterol vegetal como/o un éster de estanol vegetal. Tanto los
ésteres de esterol vegetal como los ésteres de estanol vegetal se ha
publicado que presentan efectos reductores del colesterol en el
suero sanguíneo cuando se incorporan a la dieta.
La interesterificación enzimática que utiliza
lipasas inmovilizadas, tal como Lipozyme® TL IM, lipasa
1,3-específica (Novozymes, Dinamarca) se utiliza
para reducir la cantidad de ácidos grasos trans en aceites para
utilización dietética y/o para modificar las características de
fusión de los aceites y grasas comestibles.
Durante la interesterificación, uno o dos de los
ácidos grasos poliinsaturados en los triglicéridos del aceite
alimenticio pueden sustituirse con un ácido graso de otro aceite
bajo en ácidos grasos trans, tal como el aceite de palma. Esta
transferencia de ácidos grasos del aceite de palma permite la
modificación del punto de fusión del aceite alimenticio sin
introducción de los ácidos grasos trans. La inmovilización de las
lipasas se describe en las patentes US nº 5.776.741, US nº
4.798.793 y US nº 5.156.963. La patente US nº 6.284.501 describe la
interesterificación de fosfolípidos.
Una transferasa inmovilizada puede producirse
utilizando la misma tecnología utilizada para las lipasas.
En una forma de realización, la lípido
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA descrita en la
presente memoria puede utilizarse en combinación con una lipasa de
interesterificación. La interesterificación de la lipasa y las
etapas de la aciltransferasa se realizan preferentemente por
separado.
En otro aspecto, la lípido aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA descrita en la presente memoria
puede utilizarse en combinación con inhibidores de cristalización
convencionales.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para mejorar las propiedades de
cristalización en un producto alimenticio que comprende un aceite
comestible, que comprende mezclar un aceite comestible con un
sustrato receptor de acilo y una diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA como se describe
en la presente memoria y opcionalmente un inhibidor de
cristalización adicional.
En una forma de realización la presente
invención proporciona la diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA para la preparación de un producto
alimenticio que comprende un aceite comestible para mejorar las
propiedades de cristalización del producto alimenticio, en la que la
diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de CoA es una
aciltransferasa que comprende el motivo de la secuencia de
aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los restos de
aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
Propiamente pueden añadirse opcionalmente uno o
más inhibidores de cristalización adicionales.
La presente invención proporciona además incluso
la utilización de una diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA como se describe en la presente
memoria para la preparación de un producto alimenticio que
comprende un aceite comestible para mejorar las propiedades de
cristalización de dicho producto alimenticio.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona la utilización de una diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA como se describe
en la presente memoria en combinación con un inhibidor de
cristalización para la preparación de un producto alimenticio que
comprende un aceite comestible para mejorar las propiedades de
cristalización de dicho producto alimenticio.
El inhibidor de cristalización adicional puede
ser cualquier inhibidor de cristalización convencional tal como uno
o más de los triestearatos de sorbitán, lecitinas, PGE o
polisorbatos, por ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención mediante la utilización
del procedimiento dado a conocer en la presente memoria, y en
particular mediante la selección de las enzimas dadas a conocer en
la presente memoria para su utilización en el procedimiento
reivindicado, para eliminar o reducir el diglicérido de un aceite
comestible o en el mismo, puede efectuarse una reducción selectiva
en el diglicérido sobre mono- y di-glicérido, sin
una disminución en los triglicéridos y/o un aumento significativo
en los ácidos grasos libre (FFA).
El hecho de que el presente procedimiento pueda
realizarse sin aumentar considerablemente el contenido en ácido
graso libre del aceite comestible resuelve el problema de la pérdida
de producto.
Si un aceite de palma en bruto se trata con una
lipasa convencional es necesario eliminar el aceite graso libre
durante el refinado del aceite, pero si un aceite de palma refinado
se trata con la lípido aciltransferasa según la presente invención
(negando de este modo la necesidad de tratar el aceite de palma en
bruto con una lipasa convencional) no es necesario eliminar los
ácidos grasos porque el contenido de ácido graso no aumenta
considerablemente.
Además o alternativamente, la presente invención
produce la eliminación y/o reducción de los diglicéridos de o en un
aceite comestible, sin disminución significativa en las
concentraciones de monoglicérido.
Además o alternativamente, la presente invención
produce la eliminación y/o reducción de los diglicéridos de o en un
aceite comestible, a la vez que aumentan las concentraciones de
monoglicérido en el aceite comestible. Esto contrasta con las
enzimas de la técnica anterior que utilizan monoglicérido como
sustrato y por consiguiente reducen la cantidad de monoglicérido en
el aceite comestible.
La presente invención presenta ventajas ya que
no requiere la adición de ácido graso CoA. Esto contrasta
notablemente con las DGAT dependientes de acil CoA. Más bien la
enzima según la presente invención se basa en la presencia (y
adición si es necesario) de glicerol, que es un artículo
económico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los diglicéridos retrasan la cristalización en
margarinas y grasas sólidas a base de aceite de palma.
Durante muchos años, los autores han apreciado
un aumento estacionario en el crecimiento del consumo del aceite de
palma, parcialmente debido a la disponibilidad localizada,
parcialmente debido a la economía doméstica y principalmente debido
al rendimiento. La presencia del aceite de palma en productos de
tipo margarina/grasa sólida se observa que aumenta la calidad en
\beta' de una mezcla de aceite. Sin embargo, la utilización de
aceite de palma se restringió previamente a la utilización de
estearina de palma, y oleína de palma, con alguna utilización de
pepitas de palma y sus fracciones. Actualmente, esto es más variado,
debido a los tratadores de confitería y alimentación que necesitan
propiedades de fusión muy específicas.
Con los clientes que tratan de aumentar la
utilización del aceite de palma en las formulaciones, la industria
está observando más resultados de cristalización que nunca antes.
Cuando sea necesario añadir activadores de "procristal" para
iniciar la cristalización en formulaciones bajas en trans o sin
trans impidiendo o retardando de este modo la formación tras el
cristal antes del punto de utilización. También se ha observado
aumentó el interés en anticristalizadores, tales como los
triestearatos de sorbitán, lecitinas, PGE, polisorbatos, que
permitirán, el retraso del crecimiento del cristal. Esto es un
síntoma de la presencia de mucho diglicérido.
Las ventajas comerciales de la presente
invención pueden ser una o más de entres las siguientes:
a) reduce la necesidad de añadir monoglicérido
adicional al aceite comestible durante el tratamiento y/o
posteriormente durante la utilización. El monoglicérido es un
emulsionante ampliamente utilizado en los sistemas de
alimentación.
b) disminuye los diglicéridos desde
aproximadamente 6 a 8% a aproximadamente 4 a 5%, y aún más.
c) aumenta la flexibilidad de la capacidad de la
planta (fábrica), por consiguiente reducción en los costes
operatorios de producción.
d) permite mayores disminuciones en los
resultados de la poscristalización.
e) en algunas formulaciones, sería posible
eliminar algunos triglicéridos del aceite completamente saturado,
porque los autores reducen la necesidad de favorecer el cristal. A
este respecto los fabricantes añaden de manera convencional
triglicéridos totalmente saturados a las formulaciones con objeto de
"favorecer" la formación del cristal y resolver la formación
retardada del cristal indeseable en el producto posventa. Dicha
formación del cristal es un síntoma de que presenta una cantidad
significativa de aceite de palma o sus componentes en una
formulación, que contendría concentraciones de diglicéridos
suficientes para retardar el crecimiento de cristal al tipo de
cristal deseado (es decir, preferentemente
beta-prima en el caso de las margarinas y grasas
sólidas) durante la preparación. Sin embargo, mediante la
utilización de aceite de palma tratado según la presente invención,
el contenido en diglicérido está suficientemente reducido en una
mezcla o formulación dada de modo que la necesidad de la acción de
triglicérido completamente saturado para ayudar al desarrollo del
cristal se hace menos importante.
f) permite mayor diversificación hacia las
mezclas a base de aceite de palma, con costes de aceite líquido
incrementados y sin los cambios del procedimiento principal.
g) permite la sustitución de anticristalizadores
y/o la sustitución parcial de anticristalizadores.
Actualmente, los autores contemplan la
legislación y la opinión pública contra la utilización de ácidos
trans en productos alimenticios (Fødevareministeriet, Dinamarca
2003). Así, esto ha conducido a problemas de rendimiento. Los
fabricantes cuando sea posible pueden desear intercambiar con las
soluciones a base de aceite de palma debido a las grandes
concentraciones de isómeros C:16:0 y C:18:0 descubiertos en este
tipo de aceite. El resultado es que los autores están empezando a
apreciar un aumento del consumo de aceite de palma en la economía
doméstica que anteriormente no utilizaba aceite de palma.
Se formulan equivalentes de manteca de cacao
(CBE) a partir de grasas de la especialidad tales como el aceite
palma fraccionado, en particular fracciones medias de aceite de
palma (PMF), grasa de karité fraccionada así como muchas otras
grasas exóticas. Por razones económicas resulta favorable incluir
tantas PMF como sea posible en el CBE. De hecho muchos CBE pueden
contener solamente fracciones de palma. El aspecto más delicado de
la fabricación del chocolate es la cristalización de la grasa. Los
diglicéridos tendrán un impacto negativo sobre la cristalización,
por ejemplo el desmoldeado puede ser un serio problema (Siew,
2001).
La calidad del triglicérido afecta en gran
medida el funcionamiento, y esto es evidente, en los ejemplos de
una fórmula típica de aceite que contiene ácido trans para margarina
de mesa con 82% de grasa convencional, frente a la versión exenta
de trans que contiene una fracción de estearina de palma
interesterificada típica y pepitas de palma como provisión dura,
teniendo ambos perfiles de SFC similares. La velocidad reducida y
la calidad de la cristalización pueden producir un síntoma conocido
como "aceitado". A su vez esto exige la necesidad de
activadores del cristal, tales como los MAG duros. Además, el
retraso en la formación del cristal estabilizado conduce al síntoma
conocido como "arenosidad" con lo cual la transformación del
tipo de cristal deseado revierte opcionalmente a la forma Beta más
estable, y así proporciona una textura arenosa. Este síntoma es un
problema específico de tipo
industrial.
industrial.
Durante la producción química de grasas para su
utilización en los productos alimenticios ricos en grasa sólida
tales como las margarinas, productos para untar,
confitería/chocolates, los ácidos grasos trans se introducen en el
aceite alimenticio durante un procedimiento de hidrogenación
(endurecimiento). Esto permite la modificación de la temperatura de
fusión del aceite alimenticio para asegurar una consistencia
adecuada del producto alimenticio final, por ejemplo, una margarina
de mesa, que es sólida pero extendible a temperatura ambiente, o un
chocolate que es sólido durante el almacenamiento, pero se funde en
la boca.
Sin embargo, la producción química utiliza
grandes cantidades de disolventes tales como hexano que se
consideran peligrosos para el medio ambiente y la salud y requieren
la eliminación completa del disolvente antes de la utilización del
aceite/grasa modificado como ingrediente alimenticio.
En muchos países la utilización de la
hidrogenación parcial para la producción alimenticia está siendo
limitada por la legislación y los controles reguladores, y muchos
productores de alimentos principales están actualmente cambiándose a
alternativas con poco trans.
El aceite preparado por el procedimiento de la
invención puede utilizarse como ingrediente para la margarina y/o
los productos para untar.
\vskip1.000000\baselineskip
La manteca de cacao contiene una composición
única que proporciona un producto de confitería sólido que se funde
en la boca. Con el fin de sustituir la manteca de cacao utilizando
alternativas más económicas, los aceites vegetales se han
hidrogenado para producir ácidos grasos trans, aumentando de este
modo el punto de fusión del aceite alimenticio para proporcionar un
producto de confitería sólido similar que se funda a la temperatura
del cuerpo. Dichos aceites vegetales modificados son conocidos como
equivalentes de la manteca de cacao (CBE) o, en el caso en que las
grasas modificadas mejoren las características del producto de
chocolate, los sustitutivos de la manteca de cacao (CBR). Un
problema principal con los CBE y los CBR es que la hidrogenación de
los aceites vegetales produce grasas trans que se consideran que son
perjudiciales para la salud y la temperatura. Esto ha conducido a
la utilización de aceites vegetales con poco trans, o a fracciones
de los mismos, que presentan una temperatura de fusión mayor. El
aceite de palma y las fracciones de aceite de palma se consideran
ventajosas a este respecto como un componente principal bajo en los
CBR/CBE trans.
Las grasas de sustitución de la manteca de cacao
(CBR) se utilizan para proporcionar características preferidas a
los productos de chocolate tales como no templado, posendurecimiento
reducido, estabilidad, resistente al florecimiento. Es
particularmente deseable utilizar grasas sin láurico/sin trans tales
como el aceite de palma. Las propiedades de cristalización de las
grasas utilizadas en los CBR desempeñan una función clave para
asegurar un equilibrio adecuado entre la fusión del producto en la
boca a la vez que conservan las características preferidas
anteriores. La utilización de grasas con poco trans, tal como el
aceite de palma, en las mezclas de CBR es particularmente deseable
por razones de salud. La utilización del aceite de palma en los CBR
se describe en el documento EP 0293194.
El aceite preparado según el procedimiento de la
presente invención puede utilizarse como ingrediente para chocolate,
por ejemplo en una mezcla de grasa tal como sustitutivo y/o
equivalente de la manteca de cacao.
\vskip1.000000\baselineskip
Las enzimas diglicérido:glicerol aciltransferasa
adecuadas para su utilización según la presente invención y/o en
los procedimientos de la presente invención pueden comprender
cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos y/o ser
codificadas por las siguientes secuencias nucleotídicas:
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 58
\newpage
SEC. ID. nº: 59
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 60
SEC. ID. nº: 61
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 62
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC. ID. nº: 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 65
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC. ID. nº: 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 67
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC. ID. nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC. ID. nº: 69
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 70
\vskip1.000000\baselineskip
Se pesa en un vidrio con tapa 1 gramo de aceite
de palma que contiene 7% de diglicérido.
Se añaden 50 mg de glicerol y 10 \mul de
solución de enzima. Se agita la mezcla de reacción con un agitador
magnético en una cámara de calentamiento a 40ºC durante 20 horas. La
reacción de la enzima se interrumpe calentando a 100ºC durante 10
minutos. Una muestra de referencia a la que se le añaden 10 \mul
de agua en lugar de solución enzimática se trata de la misma
manera. Las muestras se analizan por GLC según los procedimientos
habituales (véase a continuación en la presente memoria) y se
calculan las cantidades de ácidos grasos, monoglicérido y
diglicérido.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los resultados de los análisis por
GLC puede calcularse el aumento en ácidos grasos libres y la
disminución en diglicéridos:
\Delta% ácido graso = % ácido graso (enzima) -
% ácido graso (referencia);
Mv Fa = peso molecular medio de los ácidos
grasos;
\Delta% diglicérido = % diglicérido
(referencia) - % diglicérido (enzima);
Mv Di = peso molecular medio de diglicérido;
La actividad de la transferasa se calcula como
porcentaje de la actividad enzimática total:
Cromatógrafo de gases capilar Autosystem 9000 de
Perkin Elmer provisto de columna WCOT de sílice fundida de 12,5 m
\times 0,25 mm DI \times 0,1 \mu de espesor de película de 5%
de fenil-metil-silicona (CP Sil 8 CB
de Chrompack).
Gas portador: helio
Inyector. Inyección de corte en frío PSSI (temp.
inicial 50ºC calentado hasta 385ºC), volumen 1,0 \mul
Preparación de la muestra: Se disolvieron 30 mg
de la muestra en 9 ml de heptano:piridina, 2:1 que contiene
heptadecano patrón interno, 0,5 mg/ml. 300 \mul de la solución de
la muestra se transfirieron a un vial translúcido, se añadieron 300
\mul de MSTFA
(N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamid)
y se hicieron reaccionar durante 20 minutos a 60ºC.
En un aspecto, preferentemente el polipéptido o
proteína para su utilización en la presente invención está en forma
aislada. El término "aislada" significa que la secuencia está
por lo menos considerablemente exenta de por lo menos otro
componente con el que la secuencia se asocia de forma natural en la
naturaleza y se encuentra en la naturaleza.
En un aspecto, preferentemente el polipéptido
proteína para su utilización en la presente invención está en forma
purificada. El término "purificadas" significa que la secuencia
está en estado relativamente puro, por ejemplo por lo menos
aproximadamente 51% de pureza o por lo menos aproximadamente 75% o
por lo menos aproximadamente 80% o por lo menos aproximadamente 90%
de pureza o por lo menos aproximadamente 98% de pureza.
Una secuencia nucleotídica que codifica un
polipéptido que presenta las propiedades específicas definidas en
la presente memoria o un polipéptido que es adecuado para la
modificación puede aislarse de alguna célula u organismo que
produce dicho polipéptido. Varios procedimientos son bien conocidos
en la técnica para el aislamiento de secuencias nucleotídicas.
Por ejemplo, puede construirse un banco de ADN
genómico y/o de ADNc utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero
procedente del organismo que produce el polipéptido. Si la secuencia
de aminoácidos del polipéptido es conocida, pueden sintetizarse y
utilizarse sondas de oligonucleótido marcado y utilizarse para
identificar los clones que codifican el polipéptido procedentes de
la genoteca preparada a partir del organismo. Alternativamente, una
sonda de oligonucleótido marcado que contiene las secuencias
homólogas a las de otro gen del polipéptido conocido podrían
utilizarse para identificar los clones que codifican el polipéptido.
En este último caso, se utilizan las condiciones de hibridación y
de lavado de severidad menor.
Alternativamente, los clones que codifican el
polipéptido podrían identificarse insertando fragmentos de ADN
genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, bacteria
negativa a la enzima transformante con el banco de ADN genómico
resultante y a continuación colocando en placas las bacterias
transformadas en agar-agar que contiene una enzima
inhibida por el polipéptido, permitiendo de este modo que los clones
expresen el polipéptido que debe identificarse.
Incluso en otra alternativa, la secuencia
nucleotídica que codifica el polipéptido puede prepararse
sintéticamente por los procedimientos habituales establecidos, por
ejemplo el método de la fosforoamidita descrito por Beucage S. L.
et al. (1981) Tetrahedron Letters 22, pág.
1859-1869, o el método descrito por Matthes et
al. (1984) EMBO J. 3, pág. 801-805. En el
método de la fosforoamidita, se sintetizan oligonucleótidos, por
ejemplo en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se
hibridan, se ligan y se clonan en vectores apropiados.
La secuencia nucleotídica puede ser de origen
genómico mixto y sintético, sintético mixto y de origen de ADNc, o
genómico mixto y origen de ADNc, preparada ligando fragmentos de
origen sintético, genómico o de ADNc (como proceda) según técnicas
habituales. Cada fragmento ligado corresponde a varias partes de la
secuencia nucleotídica completa. La secuencia de ADN puede también
prepararse por reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando
cebadores específicos, por ejemplo como los descritos en el
documento US nº 4.683.202 o en Saiki R. K. et al. (Science
(1988) 239, págs. 487-491).
La presente invención comprende también la
utilización de secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos
que presentan las propiedades específicas definidas en la presente
memoria. La expresión "secuencia nucleotídica" utilizada en la
presente memoria se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o a
una secuencia de polinucleótido, y a las variantes, homólogos,
fragmentos y derivados de las mismas (tales como partes de la
misma). La secuencia nucleotídica puede ser de origen genómico,
sintético o recombinante, que puede ser bicatenaria o monocatenaria
según que represente la cadena transcrita o complementaria.
La expresión "secuencia nucleotídica"
incluye el ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferentemente
significa ADN, más preferentemente ADNc para la secuencia de
codificación.
En una forma de realización preferida, la propia
secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que presenta las
propiedades específicas definidas en la presente memoria no
comprende la secuencia nucleotídica natural en su medio natural
cuando está unida a su(s) secuencia(s)
asociada(s) de manera natural que está(n) también en
su(s) medio(s)
natural(es). Para facilidad de mención, esta forma de realización preferida se denominará "secuencia nucleotídica no natural". A este respecto, la expresión "secuencia nucleotídica natural" significa una secuencia nucleotídica completa que está en su medio natural y cuando se une operativamente a un activador completo con el que se asocia de manera natural, activador que está también en su medio natural. Por lo tanto, el polipéptido para su utilización en la presente invención puede ser expresado por una secuencia nucleotídica en su organismo natural pero en la que la secuencia nucleotídica no está bajo el control del activador con el que está asociada de manera natural en este
organismo.
natural(es). Para facilidad de mención, esta forma de realización preferida se denominará "secuencia nucleotídica no natural". A este respecto, la expresión "secuencia nucleotídica natural" significa una secuencia nucleotídica completa que está en su medio natural y cuando se une operativamente a un activador completo con el que se asocia de manera natural, activador que está también en su medio natural. Por lo tanto, el polipéptido para su utilización en la presente invención puede ser expresado por una secuencia nucleotídica en su organismo natural pero en la que la secuencia nucleotídica no está bajo el control del activador con el que está asociada de manera natural en este
organismo.
Preferentemente el polipéptido no es un
polipéptido natural. A este respecto, la expresión "polipéptido
natural" significa un polipéptido completo que está en su medio
natural y cuando ha sido expresado por su secuencia nucleotídica
natural.
Típicamente, la secuencia nucleotídica que
codifica los polipéptidos que presentan las propiedades específicas
definidas en la presente memoria se prepara utilizando técnicas de
ADN recombinante (es decir, ADN recombinante). Sin embargo, en una
forma de realización alternativa de la invención, la secuencia
nucleotídica pudo sintetizarse, en su totalidad o en parte,
utilizando procedimientos químicos bien conocidos en la materia
(véanse Caruthers MH. et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp.
Ser. 215-23 y Horn T. et al. (1980)
Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225-232).
Una vez se ha aislado la secuencia nucleotídica
que codifica la enzima, o se ha identificado una secuencia posible
nucleotídica que codifica la enzima, puede ser deseable modificar la
secuencia nucleotídica seleccionada, por ejemplo puede ser deseable
mutar la secuencia con objeto de preparar una enzima según la
presente invención.
Pueden introducirse mutaciones utilizando
nucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias
nucleotídicas que flanquean los puntos de mutación deseados.
Un procedimiento adecuado se da a conocer en
Morinaga et al. (Biotechnology (1984) 2, págs.
646-649). Otro procedimiento para introducir
mutaciones en secuencias nucleotídicas que codifican la enzima se
describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989),
180, pág. 147-151).
En lugar de la mutagénesis dirigida al sitio tal
como se describió anteriormente, se pueden introducir mutaciones al
azar por ejemplo utilizando un kit comercial tal como el kit para
mutagénesis por PCR GeneMorph de Stratagene, o el kit para
mutagénesis aleatoria por PCR Diversify de Clontech. La patente EP 0
583 265 se refiere a los métodos de optimización de la mutagénesis
basada en PCR, que pueden también combinarse con la utilización de
análogos de ADN mutagénico tales como los descritos en la patente EP
0 866 796. Las tecnologías de PCR propensas a error son adecuadas
para la producción de variantes de acil transferasas de lípidos con
características preferidas. El documento WO 0206457 se refiere a la
evolución molecular de las lipasas.
\newpage
Un tercer procedimiento para obtener nuevas
secuencias consiste en fragmentar secuencias nucleotídicas no
idénticas, ya sea utilizando cualquier número de enzimas de
restricción o una enzima tal como la Dnasa I, y reensamblando las
secuencias nucleotídicas completas que codifican proteínas
funcionales. Alternativamente se puede utilizar una o múltiples
secuencias nucleotídicas no idénticas e introducir mutaciones
durante el reensamblado de la secuencia nucleotídica completa. Las
tecnologías de mezclado de ADN y de mezclado de la familia son
adecuadas para la producción de variantes de lípido aciltransferasas
con características preferidas. Los procedimientos adecuados para
realizar el "mezclado" pueden encontrarse en las patentes EP 0
752 008, EP 1 138 763 y EP 1 103 606. El mezclado puede también
combinarse con otras formas de mutagénesis de ADN tal como se
describe en los documentos US nº 6.180.406 y WO 01/34835.
De este modo, es posible producir numerosas
mutaciones dirigidas al sitio o aleatorias en una secuencia
nucleotídica, ya sea in vivo o in vitro, y cribar
posteriormente para la funcionalidad mejorada del polipéptido
codificado por varios medios. Utilizando en los procedimientos de
recombinacion mediados por sílico y exo (véanse los documentos WO
00/58517, US nº 6.344.328 y US nº 6.361.974), por ejemplo, puede
realizarse la evolución molecular en la que la variante producida
conserva muy poca homología con enzimas o proteínas conocidas.
Dichas variantes obtenidas de este modo pueden presentar analogía
estructural significativa con conocidas enzimas transferasa, pero
presentan muy poca homología de secuencia de aminoácidos.
Como un ejemplo no limitativo, además, las
mutaciones o variantes naturales de una secuencia polinucleotídica
pueden recombinarse con el tipo natural u otras mutaciones o
variantes naturales para producir nuevas variantes. En dichas
nuevas variantes puede también identificarse la funcionalidad
mejorada del polipéptido codificado.
La aplicación de los métodos de evolución
molecular mencionados anteriormente y similares permite la
identificación y selección de variantes de las enzimas para su
utilización en la presente invención que presentan características
preferidas sin ningún conocimiento previo de la estructura o función
proteica, y permite la producción de mutaciones o variantes no
previsibles pero beneficiosas. Existen numerosos ejemplos de la
aplicación de la evolución molecular en la técnica para la
optimización o alteración de la actividad enzimática, tales ejemplos
incluyen, pero no se limitan a una o más de las siguientes:
expresión optimizada y/o actividad en la célula hospedadoras o
in vitro, aumento de actividad enzimática, sustrato alterado
y/o especificidad de producto, aumento o disminución de estabilidad
enzimática o estructural, actividad enzimática alterada,
especificidad en las condiciones ambientales preferidas, por
ejemplo temperatura, pH y sustrato.
Como resulta evidente para un experto en la
materia, utilizando herramientas de evolución molecular puede
alterarse una enzima para mejorar la funcionalidad de la enzima.
Propiamente, la aciltransfereasa de lípido
utilizada en la invención puede ser una variante, es decir puede
contener por lo menos una sustitución, deleción o adición de
aminoácido, cuando se compara con una enzima progenitora. Las
enzimas variantes conservan por lo menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,
70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de homología con la enzima
progenitora. Las enzimas progenitoras adecuadas pueden incluir
cualquier enzima con actividad de esterasa o de lipasa.
Preferentemente, la enzima progenitora se alinea a la secuencia de
consenso pfam00657.
En una forma de realización preferida una enzima
lípido aciltransferasa variante conserva o incorpora por lo menos
uno o más de los restos de aminoácidos con la secuencia de consenso
pfm00657 descubierto en los bloques GDSx, GANDY y HPT.
Las enzimas, tales como las lipasas sin ninguna
o poca actividad de lípido aciltransferasa en un medio acuoso
pueden mutarse utilizando herramientas de evolución molecular para
introducir o aumentar la actividad de transferasa, produciendo de
este modo una enzima lípido aciltransferasa con significativa
actividad de transferasa adecuada para su utilización en las
composiciones y procedimientos de la presente invención.
Propiamente, la lípido aciltransferasa para su
utilización en la invención puede ser una variante con actividad
enzimática aumentada en lípidos polares, preferentemente
fosfolípidos y/o glicolípidos cuando se compara con la enzima
progenitora. Preferentemente, dichas variantes presentan también
poca o ninguna actividad sobre los lípidos lisopolares. La
actividad aumentada sobre los lípidos polares, fosfolípidos y/o
glucolípidos puede ser el resultado de la hidrólisis y/o de la
actividad de la transferasa o una combinación de ambas.
Las variantes de las lípido aciltransferasas
para su utilización en la invención pueden presentar actividad
disminuida sobre los triglicéridos y/o monoglicéridos y/o
diglicéridos en comparación con la enzima progenitora.
Propiamente la enzima variante puede no
presentar actividad sobre los triglicéridos y/o monoglicéridos y/o
diglicéridos.
Alternativamente, la enzima variante para su
utilización en la invención puede presentar aumento de actividad
sobre los triglicéridos y/o puede también presentar aumento de
actividad sobre uno o más de los siguientes, lípidos polares,
fosfolípidos, lecitina, fosfatidilcolina, glucolípidos,
monoglicérido de digalactosilo y monoglicérido monogalactosilo.
Las variantes de lípido aciltransferasas son
conocidas, y una o más de dichas variantes pueden ser adecuadas
para su utilización en los procedimientos y utilizaciones según la
presente invención y/o en las composiciones enzimáticas. Únicamente
a título de ejemplo, las variantes de lípido aciltransferasas se
describen en las referencias siguientes pueden utilizarse según la
presente invención: Hilton & Buckley J. Biol. Chem. 15
de enero de 1991: 266 (2): 997-1000; Robertson et
al. J. Biol. Chem. 21 de enero de 1994;
269(3):2146-50; Brumlik et al. J.
Bacteriol abril de 1996; 178 (7): 2060-4;
Peelman et al. Protein Sci. Marzo de 1998;
7(3):587-99.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se utiliza en la presente memoria la
expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término
"polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos
casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del
término "péptido".
La secuencia de aminoácidos puede prepararse o
aislarse de una fuente adecuada, o puede prepararse por síntesis o
puede prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN
recombinante.
Propiamente, las secuencias de aminoácidos
pueden obtenerse a partir de los polipéptidos aislados dados a
conocer en la presente memoria por técnicas convencionales.
Un procedimiento adecuado para determinar las
secuencias de aminoácidos procedentes de polipéptidos aislados es el
siguiente:
El polipéptido purificado puede liofilizarse y
pueden disolverse 100 \mug del material liofilizado en 50 \mul
de una mezcla de urea 8 M y de bicarbonato amónico 0,4 M, pH 8,4. La
proteína disuelta puede desnaturalizarse y reducirse durante 15
minutos a 50ºC después de cubrir con nitrógeno y la adición de 5
\mul de ditiotreitol 45 mM. Después de enfriar a temperatura
ambiente, pueden añadirse 5 \mul de yodoacetamida 100 mM para
modificar los restos de cisteína durante 15 minutos a temperatura
ambiente a la oscuridad bajo nitrógeno.
Pueden añadirse 135 \mul de agua y 5 \mug de
endoproteinasa Lys-C en 5 \mul de agua a la mezcla
de reacción anterior y puede realizarse la digestión a 37ºC bajo
nitrógeno durante 24 horas.
Los péptidos resultantes pueden separarse por
HPLC en fase inversa en una columna VYDAC C18 (0,46\times15 cm;
10 \mum; The Separation Group, California, EUA) utilizando el
disolvente A: 0,1% de TFA en agua y disolvente B: 0,1% de TFA en
acetonitrilo. Los péptidos seleccionados pueden volver a
cromatografiarse en una columna Develosil C18 utilizando el mismo
sistema disolvente, antes del secuenciado del terminal N. El
secuenciado puede realizarse utilizando un secuenciador 476A de
Applied Biosystems que utiliza ciclos rápidos de líquido pulsado
según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems,
California, EUA).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención comprende asimismo la
utilización de secuencias que tienen un grado de identidad
secuencial o de homología secuencial con la(s)
secuencia(s) de aminoácidos de un polipéptido que presenta
las propiedades específicas definidas en la presente memoria o de
cualquier secuencia nucleotídica que codifica dicho polipéptido (en
adelante denominado "secuencia(s) homóloga(s)").
En la presente memoria, el término "homólogo" significa una
entidad que presenta una determinada homología con las secuencias de
aminoácidos del asunto y las secuencias nucleotídicas del asunto. En
la presente memoria, el término "homología" puede ser igual a
"identidad".
La secuencia de aminoácidos homóloga y/o la
secuencia nucleotídica debería proporcionar y/o codificar un
polipéptido que conserva la actividad funcional y/o aumenta la
actividad de la enzima.
En el presente contexto, una secuencia homóloga
se considera que incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser
por lo menos 75, 85 o 95% idéntica preferentemente, por lo menos 95
ó 98% idéntica a la secuencia en cuestión. Típicamente, los
homólogos comprenderán los mismos puntos activos etc. como la
secuencia de aminoácidos en cuestión. Aunque la homología puede
considerarse también desde el punto de vista de similitud (es decir
restos de aminoácidos que presentan propiedades/funciones químicas
similares) en el contexto de la presente invención se prefiere
expresar la homología desde el punto de vista de la identidad
secuencial.
En el presente contexto, una secuencia homóloga
se considera que incluye una secuencia nucleotídica que puede ser
por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95
ó 98% idéntica a la secuencia nucleotídica que codifica un
polipéptido de la presente invención (la secuencia en cuestión).
Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos puntos activos
etc. como la secuencia de aminoácidos en cuestión. Aunque la
homología puede considerarse también desde el punto de vista de
similitud (es decir restos de aminoácidos que presentan
propiedades/funciones químicas similares) en el contexto de la
presente invención se prefiere expresar la homología desde el punto
de vista de la identidad secuencial.
Las comparaciones de homología pueden realizarse
a simple vista, o con más frecuencia, con la ayuda de programas de
comparación de secuencias muy disponibles. Estos programas
informáticos disponibles en el mercado pueden calcular el % de
homología entre dos o más secuencias.
El % de homología puede calcularse en secuencias
contiguas, es decir una secuencia se alinea con otra secuencia y
cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el
aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un resto a la vez.
Esto se denomina alineación "no separada". Típicamente dichas
alineaciones no separadas se realizan solamente sobre un número
relativamente corto de restos.
Aunque esto es un procedimiento muy simple y
consistente, no puede considerar que, por ejemplo, en un par de
secuencias de otro modo idénticas, una inserción o deleción dé lugar
a que los siguientes restos de aminoácidos se coloquen fuera de la
alineación, resultando de este modo en potencia una gran reducción
en % de homología cuando se realiza una alineación global. Por
consiguiente, la mayoría de los procedimientos de comparación de
secuencias se designan para producir alineaciones óptimas que tengan
en cuenta posibles inserciones o deleciones sin penalizar
indebidamente la puntuación global de la homología. Esto se consigue
insertando "huecos" en la alineación de la secuencia para
tratar de maximizar la homología local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos
asignan "penalidades por hueco" a cada hueco que se produce en
la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos
idénticos, una alineación de la secuencia con tan pocos huecos como
sea posible (que refleja mayor relevancia entre las dos secuencias
comparadas), conseguirá una puntuación mayor que la de muchos
huecos. Se utilizan típicamente los "costes de hueco afines"
que cargan un coste relativamente elevado de la existencia de un
hueco y una penalidad más pequeña para cada resto posterior en el
hueco. Éste es el sistema de puntuación del hueco utilizado más
frecuentemente. Penalidades altas del hueco producirán desde luego
alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los
programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por
hueco. Sin embargo, resulta preferido utilizar los valores por
defecto cuando se utiliza dicho programa informático para las
comparaciones de secuencias. Por ejemplo al utilizar el paquete GCG
de Wisconsin Bestfit la penalización por hueco por defecto para las
secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada
ampliación.
El cálculo del % de homología máximo requiere
por lo tanto en primer lugar la producción de una alineación
óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un programa
informático adecuado para realizar dicha alineación es el paquete
GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984 Nucleic Acids
Research 12 pág. 387). Ejemplos de otros programas informáticos
que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no
se limitan al paquete BLAST (véase Ausubel et al. 1999
Short Protocols in Molecular Biology, 4ª ed. - capítulo 18),
FASTA (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol.
403-410) y el GENEWORKS juego de herramientas de
comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la
búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al.
1999, páginas 7 a 58 hasta 7 a 60). Sin embargo, para algunas
aplicaciones, es preferible utilizar el programa GCG Bestfit. Una
nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences está también
disponible para comparar secuencias proteicas y nucleotídicas
(véase FEMS Microbiol. Lett. 1999 174(2):
247-50; FEMS Microbiol. Lett. 1999
177(1): 187-8 y
tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
Aunque el % de homología final puede medirse
desde el punto de vista de la identidad, el propio proceso de
alineación no está típicamente basado en una comparación del par
todo o nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de
puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada
comparación en pares basada en la similitud química o en la
distancia de evolución. Un ejemplo de dicha matriz utilizada
normalmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para la
serie de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin utilizan
generalmente los valores públicos por defecto o una tabla de
comparación de símbolos habitual se suministra (véase el manual del
usuario para más detalle). Para algunas aplicaciones, es preferible
utilizar los valores públicos por defecto para el paquete CGC, o en
caso de otro programa informático, la matriz por defecto, tal como
BLOSUM62.
Alternativamente, puede calcularse el porcentaje
de homologías utilizando la característica de alineación múltiple
en DNASIS^{TM} (programa informático de Hitachi), basado en un
algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988),
Gene 73(1), 237-244).
Una vez el programa informático ha producido una
alineación óptima, es posible calcular el % de homología,
preferentemente el % de identidad de las secuencias. El programa
informático típicamente lo realiza como parte de la comparación de
secuencias y genera un resultado numérico.
Las secuencias pueden presentar también
deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que
producen un cambio imperceptible y dan como resultado una sustancia
funcionalmente equivalente. Las sustituciones deliberadas de
aminoácidos pueden realizarse basándose en la similitud en la
polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia, y/o la
naturaleza anfipática de los restos con el fin de que la actividad
de unión secundaria de la sustancia se conserve. Por ejemplo, los
aminoácidos con carga negativa incluyen el ácido aspártico y el
ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen la
lisina y la arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza
polares sin carga que presentan valores de hidrofilia similares
incluyen la leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina,
asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y
tirosina.
Pueden realizarse sustituciones conservadoras,
por ejemplo según la tabla siguiente. Los aminoácidos en el mismo
bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en
la tercera columna pueden sustituirse unos por otros:
El procedimiento de la presente invención
comprende también la sustitución homóloga (sustitución y
reemplazamiento se utilizan ambos en la presente memoria para
significar el intercambio de un resto de aminoácido existente, con
un resto alternativo) que puede ocurrir, es decir, sustitución
similar por similar tal como básico por básico, ácido por ácido,
polar por polar, etc. La sustitución no homóloga puede producirse
también es decir, a partir de una clase de resto a otra o
alternativamente que implica la inclusión de aminoácidos no
naturales tal como la ornitina (en adelante denominada Z), ácido
diaminobutírico ornitina (denominado en adelante B), norleucina
ornitina (denominado en adelante O), piriilalanina, tienilalanina,
naftilalanina y fenilglicina.
Pueden realizarse asimismo reemplazamientos por
aminoácidos no naturales.
Las variantes de secuencias de aminoácidos
pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse
entre cualquiera de dos restos de aminoácidos de la secuencia que
incluyen grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo
además de espaciadores de aminoácido tales como restos de glicina o
\beta-alanina. Otra forma de variación, que
implica la presencia de uno o más restos de aminoácidos en forma
peptoide, resultará evidente para los expertos en la materia. Para
evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a
restos de aminoácidos variantes en los que el grupo sustituyente
\alpha-carbono está en el átomo de nitrógeno del
resto en lugar de en el carbono \alpha. Los procedimientos para
preparar los péptidos en forma peptoide son conocidos en la
técnica, por ejemplo Simon R. J. et al., PNAS (1992)
89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trenes
Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
Las secuencias nucleotídicas para su utilización
en la presente invención o que codifican un polipéptido que
presenta las propiedades específicas definidas en la presente
invención pueden incluir en su interior nucleótidos sintéticos o
modificados. Numerosos tipos diferentes de modificación a los
oligonucleótidos son conocidas en la materia. Éstos incluyen ejes
centrales de fosfonato de metilo y fosforotioato y/o la adición de
acridina o de cadenas de polilisina en los terminales 3' y/o 5' de
la molécula. Para los objetivos de la presente invención, debe
interpretarse que las secuencias nucleotídicas descritas en la
presente memoria pueden modificarse por cualquier método disponible
en la técnica. Dichas modificaciones pueden realizarse con el fin de
mejorar la actividad in vivo o la duración de la vida de las
secuencias nucleotídicas.
La presente invención comprende también la
utilización de secuencias nucleotídicas que son complementarias de
las secuencias expuestas en la presente memoria, o cualquier
derivado, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es
complementaria de un fragmento de la misma entonces la secuencia
puede utilizarse como sonda para identificar secuencias de
codificación similares en otros organismos, etc.
Los polinucleótidos que no son homólogos al 100%
con las secuencias de la presente invención pero que no están
comprendidos dentro del alcance del procedimiento de la invención
pueden obtenerse de numerosas maneras. Otras variantes de las
secuencias descritas en la presente memoria pueden obtenerse por
ejemplo sondando bancos de ADN preparados a partir de un registro
de individuos, por ejemplo individuos de diferentes poblaciones.
Además, otros homólogos víricos/bacterianos o celulares
particularmente homólogos celulares se encuentran en las células de
mamífero (por ejemplo células de rata, ratón, bovinos y primates)
pueden obtenerse y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en
general podrán hibridarse selectivamente a las secuencias
representadas en el listado de secuencias en la presente memoria.
Dichas secuencias pueden obtenerse sondando bancos de ADNc
preparados a partir de bancos de ADN genómico de otras especies
animales, y sondando dichas librerías con sondas que comprenden
toda o parte de alguna de las secuencias en los listados de
secuencias adjuntos en condiciones de media a alta severidad.
Similares consideraciones se aplican para obtener especies homólogas
y variantes alelas de las secuencias polipeptídica o nucleotídica
de la invención.
Pueden obtenerse asimismo variantes y homólogos
de cepas/especies utilizando PCR degenerada que utilizará cebadores
diseñados para secuencias diana en las variantes y homólogos que
codifican secuencias de aminoácido conservadas dentro de las
secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas
pueden predecirse, por ejemplo, alineando las secuencias de
aminoácidos de varios variantes/homólogos. Las alineaciones
secuenciales pueden realizarse utilizando programas informáticos
conocidos en la materia. Por ejemplo el programa GCG Wisconsin
PileUp se utiliza ampliamente.
Los cebadores utilizados en la PCR degenerada
contendrán una o más posiciones degeneradas y se utilizarán en
condiciones de severidad inferiores a las utilizadas para clonar las
secuencias con cebadores de secuencias aislados frente a secuencias
conocidas.
Alternativamente, dichos polinucleótidos pueden
obtenerse por mutagénesis dirigida al sitio de secuencias
caracterizadas. Esto puede ser útil cuando por ejemplo se requieran
cambios imperceptibles de secuencia del codón para optimizar las
preferencias del codón para una célula hospedadora específica en la
que las secuencias polinucleotídicas se están expresando. Pueden
desearse otros cambios de secuencia con el fin de introducir puntos
de reconocimiento del polipéptido de restricción, o para alterar la
propiedad o función de los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos.
Los polinucleótidos (secuencias nucleotídicas)
para su utilización en la invención pueden utilizarse para producir
un cebador, por ejemplo un cebador de PCR, un cebador para una
reacción de ampliación alternativa, una sonda por ejemplo marcada
con un marcador del descubrimiento por medios convencionales
utilizando marcadores radioactivos o no radioactivos o los
polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores,
sondas y otros fragmentos serán por lo menos 15, preferentemente
por lo menos 20, por ejemplo por lo menos 25, 30 ó 40 nucleotídicos
de longitud y están también comprendidos en el término
polinucleótidos de la invención utilizado en la presente
memoria.
Los polinucleótidos tales como los
polinucleótidos de ADN y sondas pueden ser producidos de manera
recombinante, por síntesis o por cualquier medio disponible por los
expertos en la materia. Pueden también clonarse por técnicas
convencionales.
En general, los cebadores serán producidos por
medios sintéticos, lo que implica una preparación en etapas de la
secuencia del ácido nucleico deseada un nucleótido cada vez. Las
técnicas para su realización que utilizan técnicas automáticas están
fácilmente disponibles en la técnica.
Los polinucleótidos más largos generalmente se
producirán utilizando medios recombinantes, por ejemplo utilizando
técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de polimerasa).
Ésta implicará la preparación de un par de cebadores (por ejemplo
de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una zona de la
secuencia diana del lípido que se desea clonar, poniendo los
cebadores en contacto con el ARNm o el ADNc obtenidos de una célula
animal o humana, realizando una reacción en cadena de polimerasa en
condiciones que producen la ampliación de la zona deseada, aislando
el fragmento ampliado (por ejemplo purificando la mezcla de reacción
en un gel de agarosa) y recuperando el ADN ampliado. Los cebadores
pueden diseñarse para que contengan puntos de reconocimiento de la
enzima de restricción adecuados de modo que el ADN ampliado pueda
clonarse en un vector de clonación adecuado.
La presente utilización comprende también
secuencias que son complementarias de las secuencias de la presente
invención o secuencias que pueden hibridar a las secuencias para su
utilización en la presente invención o a secuencias que son
complementarias de éstas.
El término "hibridación" tal como se
utiliza en la presente memoria incluirá "el procedimiento mediante
el que una cadena de ácido nucleico se une a una cadena
complementaria por emparejamiento de bases" así como el
procedimiento de ampliación realizado en tecnologías de reacción en
cadena de polimerasa (PCR).
La presente invención también comprende la
utilización de secuencias nucleotídicas que pueden hibridarse con
las secuencias que son complementarias de las secuencias en cuestión
expuestas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o
derivado de las mismas.
La presente invención comprende asimismo la
utilización de secuencias que son complementarias de las secuencias
que pueden hibridarse con las secuencias nucleotídicas expuestas en
la presente memoria.
Las condiciones de hibridación se basan en la
temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión al nucleótido, tal
como se da a conocer en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular
Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic
Press, San Diego, CA), y confieren una "severidad" definida
como se explica a continuación.
La máxima severidad se produce típicamente a
aproximadamente Tm-5ºC (5ºC por debajo de la Tm de
la sonda); la severidad elevada entre aproximadamente 5ºC y 10ºC
por debajo de Tm; la severidad intermedia entre aproximadamente
10ºC y 20ºC por debajo de Tm; y la severidad baja entre
aproximadamente 20ºC y 25ºC por debajo de Tm. Como apreciarán los
expertos en la materia, puede utilizarse una hibridación de
severidad máxima para identificar o detectar secuencias
nucleotídicas idénticas mientras que una hibridación con severidad
intermedia (o baja) puede utilizarse para identificar o detectar
secuencias polinucleotídicas similares o relacionadas.
La presente invención comprende la utilización
de secuencias que son complementarias de las secuencias que pueden
hibridarse en condiciones de severidad alta o condiciones de
severidad intermedia con secuencias nucleotídicas que codifican
polipéptidos que presentan las propiedades específicas definidas en
la presente memoria.
Más preferentemente, la presente invención
comprende secuencias que son complementarias de las secuencias que
pueden hibridarse en condiciones de severidad elevadas (por ejemplo
65ºC y 0,1\timesSSC {1\timesSSC = NaCl 0,15 M,
citrato-Na 0,015 M, pH 7,0}) con las secuencias
nucleotídicas que codifican polipéptidos que presentan propiedades
específicas definidas en la presente memoria.
La presente invención se refiere también a la
utilización de secuencias nucleotídicas que pueden hibridarse con
las secuencias nucleotídicas expuestas en la presente memoria
(incluyendo secuencias complementarias de las expuestas en la
presente memoria).
Asimismo están comprendidas dentro del alcance
de la presente invención las secuencias de polinucleótidos que
pueden hibridarse con las secuencias nucleotídicas expuestas en la
presente memoria en condiciones de severidad intermedia a
máxima.
En un aspecto preferido, la presente invención
comprende la utilización de secuencias nucleotídicas que pueden
hibridarse con las secuencias nucleotídicas expuestas en la presente
memoria, o el complemento de las mismas, en condiciones severas (por
ejemplo 50ºC y 0,2\timesSSC).
En un aspecto más preferido, la presente
invención comprende la utilización de secuencias nucleotídicas que
pueden hibridarse con las secuencias nucleotídicas expuestas en la
presente memoria, o con el complemento de las mismas, en
condiciones de alta severidad (por ejemplo 65ºC y
0,1\timesSSC).
Una secuencia nucleotídica para su utilización
en la presente invención o para codificar un polipéptido que
presenta las propiedades específicas definidas en la presente
memoria puede incorporarse a un vector recombinante replicable. El
vector puede utilizarse para replicar y expresar la secuencia
nucleotídica, en forma de polipéptido, en y/o de una célula
hospedadora compatible. La expresión puede controlarse utilizando
secuencias de control que incluyen activadores/potenciadores y
otras señales de regulación de la expresión. Pueden utilizarse
activadores procarióticos y los activadores funcionales en las
células eucarióticas. Pueden utilizarse activadores específicos
para el tejido o específicos para los estímulos. Pueden utilizarse
asimismo activadores híbridos que comprenden elementos de la
secuencia de dos o más activadores diferentes descritos
anteriormente.
El polipéptido producido por una célula
hospedadora recombinante mediante la expresión de la secuencia
nucleotídica puede segregarse o puede estar contenido dentro de la
célula dependiendo de la secuencia y/o el vector utilizados. Las
secuencias de codificación pueden diseñarse con secuencias señal
cuya secreción directa de la sustancia que codifica las secuencias a
través de una membrana de célula procariótica o eucariótica
determinada.
La expresión "vector de expresión"
significa un montaje capaz de expresión in vivo o in
vitro.
Preferentemente, el vector de expresión se
incorpora al genoma del organismo. El término "incorpora"
comprende preferentemente la incorporación estable al genoma.
La secuencia nucleotídica para su utilización en
la presente invención o la codificación para un polipéptido que
presenta las propiedades específicas definidas en la presente
memoria puede estar presente en un vector, en el que la secuencia
nucleotídica está operativamente ligada a las secuencias reguladoras
de modo que las secuencias reguladoras pueden proporcionar la
expresión de la secuencia nucleotídica mediante un organismo
hospedador adecuado, es decir, el vector es un vector de
expresión.
Los vectores para su utilización en la presente
invención pueden transformarse en una célula hospedadora adecuada
tal como se describe a continuación para proporcionar la expresión
de un polipéptido que presenta las propiedades específicas definidas
en la presente memoria.
La selección del vector, por ejemplo, plásmido,
cósmido, virus o vector fago, con frecuencia dependerán de la célula
hospedadora en la que debe introducirse.
Los vectores pueden contener uno o más genes
marcadores seleccionables, tales como un gen que comunica
resistencia a antibióticos por ejemplo, resistencia a la
ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina.
Alternativamente, la selección puede realizarse por cotransformación
(como se describe en el documento WO 91/17243).
Los vectores pueden utilizarse in vitro,
por ejemplo para la producción de ARN o utilizarse para transferir o
transformar una célula hospedadora.
Además se da a conocer un procedimiento de
preparación de secuencias nucleotídicas para su utilización en la
presente invención o de secuencias nucleotídicas que codifican
polipéptidos que presentan las propiedades específicas definidas en
la presente memoria introduciendo una secuencia nucleotídica en un
vector replicable, introduciendo el vector en una célula
hospedadora compatible y cultivando la célula hospedadora en
condiciones que produzcan la replicación del vector.
El vector puede comprender además una secuencia
nucleotídica que permita al vector replicarse en un célula
hospedadora en cuestión. Ejemplos de dicha secuencia son los
orígenes de la replicación de plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110,
pE194, pAMB1 y pIJ702.
En algunas aplicaciones, una secuencia
nucleotídica para su utilización en la presente invención o una
secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que presenta las
propiedades específicas definidas en la presente memoria puede
estar unida operativamente a una secuencia reguladora que puede
proporcionar la expresión de la secuencia nucleotídica, tal como
mediante la célula hospedadora seleccionada. A título de ejemplo, la
presente invención comprende la utilización de un vector que
comprende las secuencias nucleotídicas de la presente invención
operativamente unidas a dicha secuencia reguladora, es decir el
vector es un vector de expresión.
La expresión "operativamente unida" se
refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos
presentan una relación que les permite funcionar de la manera
deseada. Una secuencia reguladora "operativamente unida" a una
secuencia de codificación está unida de tal manera que la expresión
de la secuencia de codificación se consigue en condiciones
compatibles con las secuencias de control.
La expresión "secuencias reguladoras"
incluye los activadores y potenciadores y otras señales de
regulación de la expresión.
El término "activador" se utiliza en el
sentido normal de la técnica, por ejemplo un punto de unión de la
ARN polimerasa.
El aumento de la expresión de la secuencia
nucleotídica que codifica la enzima que presenta las propiedades
específicas definidas en la presente memoria puede también
conseguirse mediante la selección de zonas reguladoras heterólogas,
por ejemplo zonas de activador, principal de secreción y de
finalizador.
Preferentemente, la secuencia nucleotídica para
su utilización en la presente invención puede estar operativamente
unida a por lo menos un activador.
Ejemplos de activadores adecuados para dirigir
la transcripción de la secuencia nucleotídica en un hospedador
bacteriano, micótico o de levadura son bien conocidos en la
materia.
El término "montaje", que es sinónimo de
términos como "conjugado", "casete" e "híbrido",
incluye una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que
presenta las propiedades específicas definidas en la presente
memoria para su utilización según la presente invención directa o
indirectamente unido a un activador. Un ejemplo de una unión
indirecta es el aporte de un grupo espaciador adecuado tal como una
secuencia intrónica, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH,
intermedio del activador y la secuencia nucleotídica de la presente
invención. Lo mismo es válido para el término "fusionado" en
relación con la presente invención que incluye la unión directa o
indirecta. En algunos casos, los términos no comprenden la
combinación natural de la secuencia nucleotídica que codifica la
proteína normalmente asociada al activador génico natural y cuando
están ambos en su medio natural.
El montaje puede contener incluso o expresar un
marcador que permite la selección del montaje genético.
Para algunas aplicaciones, el montaje comprende
preferentemente por lo menos una secuencia nucleotídica de la
presente invención o una secuencia nucleotídica que codifica un
polipéptido que presenta las propiedades específicas definidas en
la presente memoria operativamente unido a un activador.
La expresión "célula hospedadora", en
relación con la presente invención comprende cualquier célula que
comprenda una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido
que presenta las propiedades específicas definidas en la presente
memoria o un vector de expresión descrito anteriormente y que se
utiliza en la producción recombinante de un polipéptido que presenta
las propiedades específicas definidas en la presente memoria.
De este modo, una forma de realización adicional
de la presente invención proporciona células hospedadoras
transformadas o transfectadas con una secuencia nucleotídica de la
presente invención o una secuencia nucleotídica que expresa un
polipéptido que presenta las propiedades específicas definidas en la
presente memoria. Las células se seleccionarán para que sean
compatibles con dicho vector y puedan ser por ejemplo procarióticas
(por ejemplo, células bacterianas), micóticas, de levadura o
vegetales. Preferentemente, las células hospedadoras no son células
humanas.
Ejemplos de organismos hospedadores bacterianos
adecuados son las bacterias gram negativas o gram positivas.
Dependiendo de la naturaleza de la secuencia
nucleotídica que codifica un polipéptido que presenta las
propiedades específicas definidas en la presente memoria, y/o la
conveniencia de tratar más la proporciona expresada, pueden
preferirse las células eucarióticas tales como levaduras u otros
hongos. En general, se prefieren las células de levadura sobre las
células de hongos porque son más fáciles de manipular. Sin embargo,
algunas proteínas se segregan poco en la célula de levadura, o en
algunos casos no se tratan de manera apropiada (por ejemplo la
hiperglucosilación en levaduras). En estos casos, se seleccionaría
un organismo hospedador micótico.
La utilización de células hospedadoras
adecuadas, tales como células hospedadoras de levadura, de hongos y
vegetales, puede proporcionar modificaciones después de la
traducción (por ejemplo miristoilación, glucosilación,
truncamiento, lapidación y fosforilación de tirosina, serina o
treonina) o puede ser necesario proporcionar actividad biológica
óptima en los productos de expresión recombinante de la presente
invención.
La célula hospedadora puede ser una cepa
insuficiente en proteasa o desprovista de proteasa.
El término "organismo" en relación con la
presente invención comprende cualquier organismo que pueda
comprender una secuencia nucleotídica según la presente invención o
una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que presenta
las propiedades específicas definidas en la presente memoria y/o los
productos obtenidos de la misma.
Los organismos adecuados pueden incluir un
procariota, hongo, levadura o una planta.
La expresión "organismo transgénico" en
relación con la presente invención incluye cualquier organismo que
comprenda una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que
presenta las propiedades específicas definidas en la presente
memoria y/o los productos obtenidos de la misma, y/o en la que un
activador puede permitir la expresión de la una secuencia
nucleotídica que codifica un polipéptido que presenta las
propiedades específicas definidas en la presente memoria en el
organismo. Preferentemente la secuencia nucleotídica se incorpora al
genoma del organismo.
La expresión "organismo transgénico" no
comprende las secuencias de codificación del nucleótido natural en
su medio natural cuando están bajo el control de su activador
natural que está también en su medio natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico de la
presente invención incluye un organismo que comprende cualquiera de
entre una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que
presenta las propiedades específicas definidas en la presente
memoria, los montajes definidos en la presente memoria, los vectores
definidos en la presente memoria, los plásmidos definidos en la
presente memoria, las células definidas en la presente memoria, o
combinaciones de los mismos o los productos de los mismos. Por
ejemplo el organismo transgénico puede comprender también una
secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que presenta las
propiedades específicas definidas en la presente memoria bajo el
control de un activador heterólogo.
Tal como se indicó al principio, el organismo
hospedador puede ser un organismo procariótico o eucariótico.
Ejemplos de células hospedadoras procarióticas adecuadas incluyen a
E. coli y Bacillus subtilis.
Lo dado a conocer sobre la transformación de
hospedadores procarióticos está bien documentado en la técnica, por
ejemplo véase Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edición, 1989. Si se utiliza un hospedador
procariótico entonces la secuencia nucleotídica puede necesitar
modificarse de manera adecuada antes de la transformación, tal como
mediante la eliminación de intrones.
En otra forma de realización el organismo
transgénico puede ser una levadura.
Las células de hongos filamentosos pueden
transformarse utilizando varios procedimientos conocidos en la
técnica, tales como un procedimiento que implica la formación del
protoplasto y la transformación de los protoplastos seguida de la
regeneración de la pared celular de manera conocida. La utilización
de Aspergillus como microorganismo hospedador se describe en
la patente EP 0 238 023.
Otro organismo hospedador puede ser un vegetal.
Un estudio de las técnicas generales utilizadas para transformar
plantas puede encontrarse en los artículos por Potrykus (Annu.
Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. [1991]
42:205-225) y Christou
(Agro-Food-Industry
Hi-Tech 17-27 marzo/abril de 1994).
Más enseñanzas sobre la transformación vegetal pueden encontrarse
en el documento EP-A-0449375.
Las enseñanzas generales sobre la transformación
de hongos, levaduras y vegetales se presentan en los apartados
siguientes.
Un organismo hospedador puede ser un hongo, tal
como un hongo filamentoso. Ejemplos de dichos hospedadores
adecuados incluyen cualquier miembro que pertenece a los géneros
Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor,
Neurospora, Trichoderma y similares.
Las enseñanzas sobre transformación de hongos
filamentosos se estudian en el documento
US-A-5741665 que afirma que las
técnicas convencionales para la transformación de hongos
filamentosos y el cultivo de los hongos son bien conocidas en la
materia. Un estudio extenso de las técnicas aplicadas a N.
crassa se encuentra, por ejemplo en Davis y de Serres,
Methods Enzymol. (1971) 17A: 79-143.
Más enseñanzas sobre la transformación de hongos
filamentosos se estudian en el documento
US-A-5674707.
En un aspecto el organismo hospedador puede ser
del género Aspergillus tal como Aspergillus niger.
Un Aspergillus transgénico según la
presente invención puede prepararse también siguiendo, por ejemplo,
las instrucciones de Turner G. 1994 (Vectors for genetic
manipulation. En: Martinelli S. D., Kingborn J. R. (editores)
Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology
vol. 29. Elsevier Amsterdam 1994. págs.
641-666).
La expresión génica en hongos filamentosos ha
sido estudiada en Punt et al. (2002) Trends
Biotechnol. Mayo de 2002; 20(5):200-6,
Archer & Peberdy Crit. Rev. Biotechnol. (1997)
17(4):273-306.
En otra forma de realización, el organismo
transgénico puede ser una levadura.
Un estudio de los principios de la expresión
génica heteróloga en levaduras se proporcionan en, por ejemplo,
Methods Mol. Biol. (1995), 49:341-54, y
Curr. Opin. Biotechnol. (1997) oct;
8(5):554-60.
A este respecto, puede utilizarse levadura, tal
como las especies Saccharomyces cerevisi o Pichia
pastoris (véase FEMS Microbiol. Rev. (2000
24(1):45-66), puede utilizarse como vehículo
para la expresión génica heteróloga.
Un estudio de los principios de la expresión
génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y de la
secreción de los productos génicos es proporcionado por E.
Hinchcliffe E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression
of heterologous genes", Yeasts, vol. 5, Anthony H. Rose y
J. Stuart Harrison, eds. 2ª edición, Academic Press Ltd.).
Para la transformación de la levadura se han
desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, un
Saccharomyces transgénico según la presente invención puede
prepararse siguiendo las enseñanzas de Hinnen et al., (1978,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA
75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Nature, Londres, 275,
104); e Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153,
163-168).
Las células transformadas pueden seleccionarse
utilizando varios marcadores selectivos, tales como marcadores con
resistencia a antibióticos dominantes de marcadores auxótrofos.
Un organismo hospedador de levadura adecuado
puede seleccionarse de entre especies de levaduras
biotecnológicamente relevantes como pero no limitadas a, especies
de levaduras seleccionadas de entre Pichia spp.,
Hansenula spp., Kluyveromyces, Yarrowinia spp.,
Saccharomyces spp., incluyendo S. cerevisiae, o
Schizosaccharomyce spp. incluyendo Schizosaccharomyce
pombe.
Una cepa de la especie de levadura metilótropa
Pichia pastoris puede utilizarse como organismo
hospedador.
En una forma de realización, el organismo
hospedador puede ser una especie Hansenula, tal como H.
polymorpha (descrita en el documento WO 01/39544).
Un organismo hospedador adecuado para la
presente invención puede ser una planta. Un estudio de las técnicas
generales puede encontrarse en los artículos de Potrykus (Annu.
Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. [1991]
42:205-225) y Christou
(Agro-Food-Industry
Hi-Tech 17-27 marzo/abril de 1994),
o en el documento WO 01/16308. La planta transgénica puede producir
niveles aumentados de ésteres de fitosterol y ésteres de fitostanol,
por ejemplo.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere también a un procedimiento para la producción de una planta
transgénica con niveles aumentados de ésteres de fitosterol y
ésteres de fitostanol, que comprende las etapas de transformar una
célula vegetal con una lípido aciltransferasa como se define en la
presente memoria (en particular con un vector de expresión o
montaje que comprende una lípido aciltransferasa como se define en
la presente memoria) y cultivar una planta a partir de la célula
vegetal transformada.
Con frecuencia, es deseable que el polipéptido
se segregue del hospedador de expresión en el medio de cultivo a
partir del cual la enzima puede ser más fácilmente recuperada. Según
la presente invención, la secuencia principal de secreción puede
seleccionarse basándose en el hospedador de expresión deseado. Las
secuencias señal híbridas pueden utilizarse también en el contexto
de la presente invención.
Ejemplos típicos de secuencias principales de
secreción heterólogas son las que se originan a partir del gen
(glaA, ambas de 18 y 24 aminoácidos versiones por ejemplo de
Aspergillus) de la amiloglucosidasa micótica (AG), el gen
del factor a (levaduras por ejemplo Saccharomyces,
Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de la
\alpha-amilasa (Bacillus).
Una variedad de protocolos para detectar y medir
la expresión de la secuencia de aminoácidos es conocida en la
materia. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunosorbente con enzima
ligada (ELISA), el radioinmunoanálisis (RIA) y la clasificación de
células activadas fluorescentes (FACS).
Una amplia variedad de marcadores y técnicas de
conjugación son conocidas por los expertos en la materia y pueden
utilizarse en varios ensayos de aminoácidos y ácidos nucleicos.
Numerosas compañías tales como Pharmacia Biotech
(Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), y US Biochemical Corp
(Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para estos
procedimientos.
Moléculas indicadoras o marcadores adecuados
incluyen los radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes,
quimioluminiscentes o cromógenos así como sustratos, cofactores,
inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que
dan a conocer la utilización de dichos marcadores incluyen los
documentos US-A-3.817.837;
US-A-3.850.752;
US-A-3.939.350;
US-A-3.996.345;
US-A-4.277.437;
US-A-4.275.149 y
US-A-4.366.241.
Asimismo, pueden producirse inmunoglobulinas
recombinantes tal como se muestra en el documento
US-A-4.816.567.
Un polipéptido que presenta las propiedades
específicas definidas en la presente memoria puede producirse como
proteína de fusión, por ejemplo para ayudar a la extracción y
purificación de la misma. Ejemplos de acompañantes de la proteína
de fusión incluyen la
glutation-S-transferasa (GST),
6\timesHis, GAL4 (dominios de unión del ADN y/o de activación de
la transcripción) y \beta-galactosidasa. Asimismo
puede ser conveniente incluir una secuencia de escisión
proteolítica entre el acompañante de la proteína de fusión y la
secuencia proteica de interés que permita la eliminación de las
secuencias de la proteína de fusión. Preferentemente la proteína de
fusión no impedirá la actividad de la secuencia de la proteína.
Los sistemas de expresión de la fusión génica en
E. coli han sido estudiados en Curr. Opin. Biotechnol.
(1995) 6(5):501-6.
En otra forma de realización de la invención, la
secuencia de aminoácido de un polipéptido que presenta las
propiedades específicas definidas en la presente memoria puede
ligarse a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de
fusión. Por ejemplo, para el cribado de bancos de péptidos
destinados a agentes capaces de afectar la actividad de la
sustancia, puede ser útil para codificar una sustancia híbrida que
expresa un epítopo heterólogo que es reconocido por un anticuerpo
disponible en el mercado.
La invención se describirá a continuación,
únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a las Figuras y
Ejemplos siguientes.
La Figura 1 presenta una secuencia de consenso
pfam00657 de la base de datos versión 6 (SEC. ID. nº: 1);
la Figura 2 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 2) obtenida a partir del organismo
(Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051);
la Figura 3 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 3) obtenida a partir del organismo
(Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI:9964017);
la Figura 4 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 4) obtenida a partir del organismo
Streptomyces coelicolor A3(2) (número de registro en
Genbank NP_631558);
la Figura 5 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 5) obtenida a partir del organismo
Streptomyces coelicolor A3(2) (número de registro en
Genbank CAC42140);
la Figura 6 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 6) obtenida a partir del organismo
Saccharomyces cerevisiae (número de registro en Genbank
P41734);
la Figura 7 presenta una alineación de las
secuencias seleccionadas para la secuencia de consenso
pfam00657;
la Figura 8 presenta una alineación por pares de
la SEC. ID. nº: 3 con la SEC. ID. nº: 2 que presenta 93% de
identidad de la secuencia de aminoácidos. La secuencia señal está
subrayada. + indica diferencias. El motivo GDSX que contiene el
punto activo serina 16 y los puntos activos ácido aspártico 116 e
histidina 291 están resaltados (véase las zonas sombreadas). Los
números después del aminoácido es menos la secuencia señal;
la Figura 9 presenta una secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº: 7) que codifica una lípido aciltransferasa obtenida a
partir del organismo Aeromonas hydrophila;
la Figura 10 presenta una secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº: 8) que codifica una lípido aciltransferasa obtenida a
partir del organismo Aeromonas salmonicida;
la Figura 11 presenta una secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº: 9) que codifica una lípido aciltransferasa obtenida a
partir del organismo Streptomyces coelicolor A3(2)
(número de registro de Genbank
NC_003888.1:8327480..
8328367);
8328367);
la Figura 12 presenta una secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº: 10) que codifica una lípido aciltransferasa obtenida a
partir del organismo Streptomyces coelicolor A3(2)
(número de registro de Genbank AL939131.1:265480..236667);
la Figura 13 presenta una secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº: 11) que codifica una lípido aciltransferasa obtenida a
partir del organismo Saccharomyces cerevisiae (número de
registro de Genbank Z75034);
la Figura 14 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 12) obtenida a partir del organismo
Ralstonia (número de registro de Genbank AL646052);
la Figura 15 presenta una secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº: 13) que codifica una lípido aciltransferasa obtenida a
partir del organismo Ralstonia;
la Figura 16 presenta la SEC. ID. nº: 20.
Proteína Scoe1 NCBI código CAB39707.1 GI:4539178 proteína hipotética
conservada [Streptomyces coelicolor A3(2)];
la Figura 17 presenta una secuencia nucleotídica
representada como SEC. ID. nº: 21 que codifica la proteína NCBI
código de registro CAB39707.1 proteína hipotética conservada
GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
la Figura 18 presenta una secuencia de
aminoácidos SEC. ID. nº: 22 representada como proteína que codifica
a la proteína Scoe2 NCBI código de registro CAC01477.1 proteína
hipotética conservada GI:9716139 [Streptomyces coelicolor
A3(2)];
la Figura 19 presenta una secuencia nucleotídica
representada como SEC. ID. nº: 23 que codifica la proteína Scoe2
NCBI código de registro CAC01477.1 proteína hipotética conservada
GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
la Figura 20 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 24) que codifica la proteína Scoe3 NCBI
código de registro CAB88833.1 proteína posible segregada GI:7635996
[Streptomyces coelicolor A3(2)];
la Figura 21 presenta una secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 25 que codifica la
proteína Scoe3 NCBI código de registro CAB88833.1 proteína posible
segregada GI:7635996 [Streptomyces coelicolor
A3(2)];
la Figura 22 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 26) que codifica la proteína Scoe4 NCBI
código de registro CAB89450.1 proteína posible segregada GI:7672261
[Streptomyces coelicolor A3(2)];
la Figura 23 presenta una secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 27 que codifica la
proteína Scoe4 NCBI código de registro CAB89450.1 proteína posible
segregada GI:7672261 [Streptomyces coelicolor
A3(2)];
la Figura 24 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 28) que codifica la proteína Scoe5 NCBI
código de registro CAB62724.1 proteína posible segregada GI:6562793
[Streptomyces coelicolor A3(2)];
la Figura 25 presenta una secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 29 que codifica la
proteína Scoe5 NCBI código de registro CAB62724.1 lipoproteína
posible GI:6562793 [Streptomyces coelicolor
A3(2)];
la Figura 26 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 30) código de registro de la proteína
Srim1 NCBI AAK84028.1 GI:5082088 GDSL-lipasa
[Streptomyces rimosus];
la Figura 27 presenta una secuencia nucleotídica
representada como SEC. ID. nº: 31 que codifica la proteína Srim1
NCBI código de registro AAK84028.1 GI:5082088
GDSL-lipasa [Streptomyces rimosus];
la Figura 28 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 32) de una lípido aciltransferasa de
Aeromonas hydrophila (ATCC nº 7965);
la Figura 29 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 33) que codifica una lípido
aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (ATCC nº 7965);
la Figura 30 presenta una secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 34) de una lípido aciltransferasa de
Aeromonas salmonicida subesp. Salmonicida (ATCC nº
14174);
\newpage
la Figura 31 presenta una secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº: 35) que codifica una lípido aciltransferasa de
Aeromonas salmonicida subesp. Salmonicida (ATCC nº
14174);
la Figura 32 demuestra que los homólogos de los
genes de Aeromonas pueden ser identificados utilizando el
servicio de herramienta para búsqueda de la alineación local básica
en el National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, EUA y
las bases de datos de genoma completo. Se utilizó el motivo GDSX en
la búsqueda en la base de datos y se identificaron numerosas
secuencias/genes que codifican potencialmente enzimas con actividad
lipolítica. Se identificaron genes del género Streptomyces,
Xanthomonas y Ralstonia. Como ejemplo a continuación, se
alineó Ralstonia solanacearum al gen (satA) de Aeromona
salmonicida. La alineación por pares demostró el 23% de
identidad. La serina del punto activo está presente en el terminal
amino y los restos catalíticos histidina y ácido aspártico pueden
identificarse;
la Figura 33 presenta la secuencia de consenso
Pfam00657.11 [familia 00657, base de datos versión 11] (denominada
en adelante consenso Pfam) y la alineación de varias secuencias con
la secuencia de consenso Pfam. Las flechas indican los restos con
punto activo, las casillas subrayadas indican tres de las casillas
con homología indicadas por [Upton C. y Buckley J. T. (1995)
Trends Biochem. Sci. 20; 179-179]. Las
letras mayúsculas en el consenso Pfam indican restos conservados en
muchos miembros de la familia. El símbolo - indica una posición en
la que el modelo de Markov oculto del consenso Pfam se espera que
encuentre un resto pero no lo encuentra, de modo que se inserta un
hueco. El símbolo . indica un resto sin un resto correspondiente en
el consenso Pfam. Las secuencias son las secuencias de aminoácidos
comprendidas en las Figuras 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 y 30.
La Figura 34 presenta la secuencia de consenso
Pfam00657.11 [familia 00657, base de datos versión 11] (denominada
en adelante consenso Pfam) y la alineación de varias secuencias con
la secuencia de consenso Pfam. Las flechas indican los restos con
punto activo, las casillas subrayadas indican tres de las casillas
con homología indicadas por [Upton C. y Buckley J. T. (1995)
Trends Biochem. Sci. 20; 179-179]. Las
letras mayúsculas en el consenso Pfam indican restos conservados en
muchos miembros de la familia. El símbolo - indica una posición en
la que el modelo de Markov oculto del consenso Pfam se espera que
encuentre un resto pero no lo encuentra, de modo que se inserta un
hueco. El símbolo . indica un resto sin un resto correspondiente en
el consenso Pfam. Las secuencias son las secuencias de aminoácidos
listadas en las Figuras 2, 16, 18, 20, 26, 28 y 30. Todas estas
proteínas se descubrió que eran activas frente a sustratos de
lípidos.
La Figura 35 presenta un vector de expresión
pet12-AsalGCAT= pSM que contiene el gen de lípido
aciltransferasa de Aeromonas salmonicida etiquetado en His
del terminal C;
la Figura 36 presenta los resultados de la
prueba de los extractos celulares en un kit de análisis NEFA, que
representa la actividad de una lípido aciltransferasa de A.
salmonicida recombinante, hacia la lecitina. Los pocillos de
izquierda a derecha indican: una referencia positiva, una referencia
negativa (es decir extractos del plásmido vacío) y muestras
recogidas después de 0, 1, 2 y 3 horas de cultivo después de la
inducción por IPTG;
la Figura 37 presenta la optimización del
crecimiento de BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de
expresión pet12-AsalGCAT= pSM que muestra el cultivo
a 30ºC resultante en la producción de enzima con gran actividad para
la lecitina. Se determinó la actividad de fosfolipasa en los
extractos celulares utilizando el kit de análisis NEFA. Pocillos de
izquierda a derecha: referencia positiva; referencia negativa; 20ºC;
30ºC;
la Figura 38 presenta los extractos celulares en
bruto de BL21(DE3)pLysS que expresa la lípido
aciltransferasa activa incubada con el sustrato lecitina y la mezcla
de reacción se analizó utilizando cromatografía en capa fina que
presenta la presencia de productos de degradación. Franjas: 1. Sin
enzima; 2. +A. sal-10 \mul 37ºC; 3. +A. sal -20
\mul 37ºC; 4. + A. sal -10 \mul 24ºC; 5. + A. sal -20 \mu
24ºC;
la Figura 39 presenta la purificación parcial de
la aciltransferasa de Aeromonas salmonicida que presenta la
actividad de fosfolipasa asociada a la proteína purificada con
etiqueta His. SE = extractos tratados con ultrasonidos, His =
purificado con kit Ni-NTA spin de Qiagen;
la Figura 40 presenta el vector de expresión
pet12-A.h. GCAT=pSMa que contiene el gen
glicerolípido aciltransferasa (GCAT) de Aeromonas hydrophila
etiquetado con His en el terminal C se utilizó para transformar la
cepa BL21(DE3)pLysS de E. coli;
la Figura 41 presenta la actividad de los
extractos en bruto (5 y 10 \mul) que contienen la enzima
recombinante GCAT de Aeromonas hydrophila se determinó para
con la lecitina utilizando el kit de ácido graso no esterificado
(NEFA) (Roche, Suiza), que presenta la presencia de enzima activa
para con el fosfolípido, lecitina;
la Figura 42 presenta la optimización del
crecimiento de BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de
expresión pet12-AsalGCAT= pSM que muestra el cultivo
a 30ºC resultante en la producción de enzima con gran actividad para
la lecitina. Se determinó la actividad de fosfolipasa en los
extractos celulares utilizando el kit de análisis NEFA.
la Figura 43 presenta la purificación parcial de
las acil transferasas de Aeromonas hydrophila y A.
salmonicida que presenta la actividad de fosfolipasa asociada a
la proteína purificada con etiqueta His. SE = extractos tratados con
ultrasonidos, His = purificado con kit Ni-NTA spin
de Qiagen;
la Figura 44 presenta la expresión de los genes
de Aeromonas en Bacillus subtilis 163 que presenta la
producción de la enzima segregada con actividad tanto para lecitina
como para DGDG. El montaje pUB-AH= que contiene el
gen de A. hydrophila y pUB-AS, montaje con el
gen de A. salmonicida, el filtrado del cultivo se incubó con
los sustratos durante 60 minutos.
La Figura 45 presenta una secuencia (SEC. ID.
nº: 36) de aminoácidos del montaje de fusión utilizado para la
mutagénesis del gen de lípido aciltransferasa de Aeromonas
hydrophila en el Ejemplo 17. Los aminoácidos subrayados son un
péptido señal de xilanasa;
la Figura 46 presenta una secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº: 45) que codifica una enzima de Aeromonas
hydrophila que incluye un péptido señal de xilanasa;
la Figura 47 presenta el resultados del análisis
por HPTLC en el Experimento I;
la Figura 48 presenta el resultados del análisis
por HPTLC en el Experimento II;
la Figura 49 presenta una curva de calibración
para las soluciones patrón de monoglicérido;
la Figura 50 presenta una curva de calibración
para las soluciones patrón de diglicérido;
la Figura 51 presenta una secuencia nucleotídica
que codifica una enzima lípido aciltransferasa según la presente
invención de Streptomyces (SEC. ID. nº: 54);
la Figura 52 presenta una secuencia
polipéptídica que codifica una enzima lípido aciltransferasa según
la presente invención de Streptomyces (SEC. ID. nº: 55).
\vskip1.000000\baselineskip
Para evitar dudas, pueden utilizarse las
siguientes abreviaturas en la presente memoria:
MONO = monoglicérido
MAG = monoacilglicerol = monoglicérido
MAG y MONO son intercambiables en la presente
memoria.
DAG = diacilglicerol
FFA = ácido graso libre
La Aeromonas salmonicida subesp.
Salmonicida (ATCC 14174) se adquirió en ATCC y se cultivó
durante la noche a 30ºC en medio Luria-Bertani
(LB). Las células se centrifugaron y el ADN genómico se aisló
utilizando los procedimientos para aislamiento del ADN genómico de
la serie del tampón de ADN genómico de Qiagen Ltd. (cat. 19060),
proteasa K (cat. 19131) y ARNasa A (cat. 19101) se adquirieron todos
en Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10
2AX).
Se utilizó la cepa BL21(DE3)pLysS
(Novagen) hospedadora bacteriana para la producción de enzimas
recombinantes de Aeromonas. Se utilizaron células
competentes de BL21(DE3)pLysS como hospedadoras para
la transformación con el vector de expresión
pet12-AsalGCAT=pSM.
Los transformantes que contienen el plásmido
apropiado se cultivaron a 37ºC en medio con
agar-agar LB que contenía 100 \mug de
ampicilina/ml.
Para todas las ampliaciones de ADN de los genes
de transferasa de Aeromonas, se utilizó ADN genómico (0,2 a
1 \mul) como plantilla y pfu ADN polimerasa (2,5 unidades)
se utilizó con 10 \mul de 10x tampón pfu, 1 \mul de cada
cebador (50 pmoles/\mul), 200 \muMdNTP en un volumen de reacción
total de 100 \mul. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un
ciclador térmico programable utilizando las siguientes condiciones:
95ºC durante 30 segundos, 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos,
60ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos. Se aplicó una
prolongación adicional de 5 minutos a 72ºC.
La ampliación por PCR del gen de transferasa de
A. salmonicida se llevó a cabo en 2 reacciones de PCR por
separado. La reacción 1 de PCR se llevó a cabo utilizando pares
cebadores, como 1USNEW (5' AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG
3' [SEC. ID. nº: 56] y asls950new (5' GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC
GTA CTG 3' [SEC. ID. nº: 37]). Se llevó a cabo una segunda reacción
de PCR para incorporar una etiqueta de histidina
C-terminal utilizando el producto de PCR de la
primera reacción y los cebadores: as1USNEW (5' AGCATATGAAAA
AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3' [SEC. ID. nº: 38]) y AHLS1001 (5'
TTGGATCC GAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC 3' [SEC. ID. nº:
39]). El producto de PCR de la segunda reacción se purificó y
digirió con enzimas de restricción Nde1 y BamHI. 2 \mug de ADN
vector pET 12a se digirieron también con las enzimas de restricción
Nde1 y BamHI y se trató con fosfatasa. La enzima de restricción
tratada con pET12\alpha y el producto de PCR de la reacción 2 se
purificaron y se ligaron utilizando el kit de ligadura rápida
(Roche, Suiza). La mezcla de ligadura se utilizó para transformar
las células TOP10 de E. coli. Los transformantes se colocaron
en placas en medio LB con agar-agar que contenía 100
\mug/ml de ampicilina.
El cebador activador T7 (5' TAATACGACTCACTATAG
3' [SEC. ID. nº: 40]) y el cebador terminador T7 (5'
CTAGTTATTGCTCAGCGG 3' [SEC. ID. nº: 41]) se utilizaron para
verificar las secuencias y la orientación de los genes de
transferasa clonados en el vector pET12\alpha. Se realizó el
secuenciado de ADN utilizando el kit de secuenciado ABI Prism®
BigDye^{TM} Terminators Cycle con 500 ng de ADN plásmido como
plantilla y 3,2 pmoles de cebadores iniciadores T7 y
terminadores.
El montaje presentado en la Figura 35 se utilizó
para transformar la cepa BL21(DE3)pLysS (Novagen)
hospedadora bacteriana competente y los transformantes resistentes
a ampicilina se seleccionaron y se utilizaron para análisis de
expresión.
Se determinó la cuantificación de la actividad
enzimática para la lecitina en extractos celulares utilizando el kit
de ácido graso no esterificado (NEFA) (Roche, Suiza).
En la Figura 36, BL21(DE3)pLysS
que alberga el vector de expresión pet12-AsalGCAT=
pSM se cultivó en medio LB + 100 \mug/ml de ampicilina y se
incubó con agitación a 37ºC hasta que se alcanza una DO_{600} =
0,6 a 1,0. Los cultivos se indujeron a continuación utilizando IPTG
(0,4 mM) y se continuó la incubación durante las 3 horas
siguientes. Las muestras se tomaron a las 0 horas, 1, 2 y 3 horas
tras la inducción con IPTG. Se determinó la actividad enzimática
utilizando el kit NEFA y lecitina como sustrato.
El BL21(DE3)pLysS que alberga el
vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM se cultivó
en medio LB + 100 \mug/ml de ampicilina y se incubó con agitación
a diferentes temperaturas de cultivo (37ºC, 30ºC y 20ºC). El estado
óptimo para la producción de la enzima activa lípido aciltransferasa
fue cuando los cultivos se cultivaron a 30ºC como se muestra en la
Figura 37.
La cepa BL21(DE3)pLysS que alberga
el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM se
cultivó a 37ºC y se prepararon extractos celulares en bruto por
tratamiento con ultrasonidos. La enzima recombinante se purificó más
en los extractos celulares en bruto tratados con ultrasonidos
utilizando el kit Ni-NTA spin de Qiagen. Se
determinó la actividad de fosfolipasa utilizando el kit NEFA y
lecitina como sustrato. Los extractos celulares en bruto de
BL21(DE3)pLysS que expresan la transferasa activa se
incubaron con la lecitina sustrato y la mezcla de reacción se
analizó utilizando cromatografía en capa fina que demuestra la
presencia de productos de degradación (véase la Figura 38).
La cepa BL21(DE3)pLysS que alberga
el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM se
cultivó a 37ºC y se prepararon extractos celulares en bruto por
tratamiento con ultrasonidos. La enzima recombinante se purificó más
en los extractos celulares en bruto tratados con ultrasonidos
utilizando el kit Ni-NTA spin de Qiagen. Se
determinó la actividad de fosfolipasa utilizando el kit NEFA y
lecitina como sustrato. (véase la Figura 39).
\vskip1.000000\baselineskip
La Aeromonas hydrophila (ATCC 7965) se
adquirió en ATCC y se cultivó durante la noche a 30ºC en medio
Luria-Bertani (LB). Las células se centrifugaron y
el ADN genómico se aisló utilizando los procedimientos para
aislamiento del ADN genómico de la serie del tampón de ADN genómico
de Qiagen Ltd. (cat. 19060), proteasa K (cat. 19131) y ARNasa A
(cat. 19101) se adquirieron todos en Qiagen Ltd. (Boundary court
Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).
Se utilizó la cepa BL21(DE3)pLysS
(Novagen) hospedadora bacteriana para la producción de enzimas
recombinantes de Aeromonas. Se utilizaron células
competentes de BL21(DE3)pLysS como hospedadoras para
la transformación con el vector de expresión
pET12\alpha-A.h.GCAT=pSMa. Los transformantes que
contienen el plásmido apropiado se cultivaron a 37ºC en medio con
agar-agar LB que contenía 100 \mug de
ampicilina/ml.
Para todas las ampliaciones de ADN de los genes
de transferasa de Aeromonas, se utilizó ADN genómico (0,2 a
1 \mul) como plantilla y pfu ADN polimerasa (2,5 unidades)
se utilizó con 10 \mul de 10x tampón pfu, 1 \mul de cada
cebador (50 pmoles/\mul), 200 \muMdNTP en un volumen de reacción
total de 100 \mul. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un
ciclador térmico programable utilizando las siguientes condiciones:
95ºC durante 30 segundos, 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos,
60ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos. Se aplicó una
prolongación adicional de 5 minutos a 72ºC.
La ampliación por PCR del gen de transferasa de
A. hydrophila (ATCC #7965)se llevó a cabo en 2
reacciones de PCR por separado.
La reacción 1 de PCR se llevó a cabo utilizando
pares cebadores, como AHUS1 (5'
GTCATATGAAAAAATGGTT
TGTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3', SEC. ID. nº: 42 y aHls950 (5' ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCG
TACTG 3' SEC. ID. nº: 43).
TGTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3', SEC. ID. nº: 42 y aHls950 (5' ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCG
TACTG 3' SEC. ID. nº: 43).
Se llevó a cabo una segunda reacción de PCR para
incorporar una etiqueta de histidina C-terminal
utilizando el producto de PCR de la primera reacción y los
cebadores:
AUS1 (5'
GTCATATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC 3' SEC. ID. nº: 44)
y AHLS1001 (5'
TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC 3' SEC. ID. nº: 57).
El producto de PCR de la segunda reacción se
purificó y digirió con enzimas de restricción Nde1 y BamHI. 2
\mug de ADN vector pET 12a se digirieron también con las enzimas
de restricción Nde1 y BamHI. 2 Mg del vector pET12\alpha de ADN
se digirió también con enzimas de restricción Nde1 y BamHI y se
trató con fosfatasa. El pET12\alpha tratado con enzima de
restricción y el producto de PCR de la reacción 2 se purificaron y
se ligaron utilizando el kit de ligadura rápida (Roche, Suiza). La
mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células TOP10 de
E. coli. Los transformantes se colocaron en placas en medio
LB con agar-agar que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina.
El cebador activador T7 (5' TAATACGACTCACTATAG
3' ) y el cebador terminador T7 (5' CTAGTTATTGCT
CAGCGG 3') se utilizaron para verificar las secuencias y la orientación de los genes de transferasa clonados en el vector pET12\alpha. Se realizó el secuenciado de ADN utilizando el kit de secuenciado ABI Prism® BigDye^{TM} Terminators Cycle con 500 ng de ADN plásmido como plantilla y 3,2 pmoles de cebadores iniciadores T7 y terminadores.
CAGCGG 3') se utilizaron para verificar las secuencias y la orientación de los genes de transferasa clonados en el vector pET12\alpha. Se realizó el secuenciado de ADN utilizando el kit de secuenciado ABI Prism® BigDye^{TM} Terminators Cycle con 500 ng de ADN plásmido como plantilla y 3,2 pmoles de cebadores iniciadores T7 y terminadores.
El montaje presentado en la Figura 40 se utilizó
para transformar la cepa BL21(DE3)pLysS (Novagen)
hospedadora bacteriana competente y los transformantes resistentes
a ampicilina se seleccionaron y se utilizaron para análisis de
expresión.
La cepa BL21(DE3)pLysS de E.
coli que alberga el vector de expresión pET12\alpha -A.h.GCAT=
pSMa se cultivó en medio LB + 100 \mug/ml de ampicilina y se
incubó con agitación a 37ºC hasta que se alcanza una DO_{600} =
0,6 a 1,0. Los cultivos se indujeron a continuación utilizando IPTG
(0,4 mM) y se continuó la incubación durante las 3 horas
siguientes. Las muestras se tomaron a las 0 horas, 1, 2 y 3 horas
tras la inducción con IPTG. Se determinó la actividad enzimática
utilizando el kit NEFA y lecitina como sustrato (Figura 41).
El BL21(DE3)pLysS que alberga el
vector de expresión pET12\alpha -A.h.GCAT= pSMa se cultivó en
medio LB + 100 \mug/ml de ampicilina y se incubó con agitación a
diferentes temperaturas de cultivo (37ºC, 30ºC y 20ºC). El estado
óptimo para la producción de la enzima activa GCAT fue cuando los
cultivos se cultivaron a 30ºC como se muestra en la Figura 42.
La cepa BL21(DE3)pLysS que alberga
el vector de expresión pET12\alpha -A.h.GCAT= pSMa se cultivó a
37ºC y se prepararon extractos celulares en bruto por tratamiento
con ultrasonidos. La enzima recombinante se purificó más en los
extractos celulares en bruto tratados con ultrasonidos utilizando el
kit Ni-NTA spin de Qiagen. Se determinó la
actividad de fosfolipasa utilizando el kit NEFA y lecitina como
sustrato (Figura 43).
Se utilizaron dos vectores de expresión
diferentes de Bacillus subtilis (pUB 110 y pBE5) para la
expresión heteróloga de los genes de Aeromonas en
Bacillus subtilis. El vector pUB110 contiene el activador
alfa amilasa mientras que el vector pBE tiene el activador P32 como
zona reguladora para la expresión de los genes fusionados de
Aeromonas. En pUB110, el primer aminoácido de los genes
maduros de GCAT de Aeromonas se fusionaron en el marco con
los últimos aminoácidos de la secuencia péptido señal de xilanasa de
Bacillus subtilis mediante la secuencia de restricción Nhe1,
que crea 2 aminoácidos adicionales enfrente de las proteínas
maduras. El pBE5 contiene la fusión de la secuencia señal cgtasa en
el punto Nco1 para la secreción de las proteínas recombinantes en el
filtrado del cultivo.
Se llevaron a cabo las reacciones PCR para
obtener los genes fusibles de Aeromonas en el marco para las
secuencias señal de los vectores pUB 110 y pBE5. Se llevaron a cabo
las PCR utilizando los siguientes pares de cebador para el gen de
A. hydrophila:
- Reacción 1 de PCR:
- usAHnco1 (5' ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEC. ID. nº: 46) y 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEC. ID. nº: 47)
- Reacción 2 de PCR:
- US-AhnheI (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEC. ID. nº: 48) y 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3, SEC. ID. nº: 49)
\vskip1.000000\baselineskip
Las PCR se purificaron utilizando los siguientes
pares cebadores para el gen de A. salmonicida:
- Reacción 3 de PCR:
- US-Asnco1 (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEC. ID. nº: 50) y 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEC. ID. nº: 51)
- Reacción 4 de PCR:
- US-ASnhe1 (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEC. ID. nº: 52) y 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEC. ID. nº: 53).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los productos de PCR se clonaron en el
truncamiento II por PCR (vector TOPO) y se secuenciaron con
cebadores de secuenciado complementario y transcrito.
Los clones de las reacciones 1 y 3 de PCR se
cortaron con Nco1 y Bam HI y se utilizaron como inserciones para la
ligadura al vector pBE5 cortado con Nco1/BamH1/fosfatasa. Los clones
de las reacciones 2 y 4 por PCR se cortaron con Nhe1 y Bam H1 y se
utilizaron como inserciones para la ligadura al vector pUB que se
cortó con Nhe1/BamH1/fosfatasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las aciltransferasas de las dos especies de
Aeromonas se han expresado con éxito en E. coli
(resultados anteriores). Se utilizaron montajes de la fusión génica
pUB110 y pBE5 de Bacillus para transformar Bacillus
subtilis y se seleccionaron los transformantes colocándolos en
placas de kanamicina. Los transformantes resistentes a la
kanamicina aislados y cultivados en 2\timesYT pueden expresión
heteróloga de los genes de Aeromonas en Bacillus. Los
filtrados del cultivo presentan actividad de
digalactosildiacilglicerol (DGDG) galactolipasa, además de
presentar actividades tanto de aciltransferasa como de fosfolipasa.
La actividad para digalactosildiacilglicerol (DGDG) se midió
después de 60 minutos de incubación del sobrenadante del cultivo
con el sustrato, DGDG de harina de trigo (forma que se puede
adquirir en Sigma) así como la actividad para con lecitina como se
muestra en la Figura 44. El Bacillus produjo la enzima
durante la noche (20 a 24 horas) a 48 horas de cultivo en el medio
de cultivo como proteína segregada. En algunos casos, la expresión
de los genes de Aeromonas se ha demostrado que interfiere con
la viabilidad celular y el cultivo en Bacillus y E.
coli, es por consiguiente necesario seleccionar minuciosamente
las cepas de expresión y optimizar las condiciones de cultivo para
asegurar la expresión. Por ejemplo, varias cepas hospedadoras de
Bacillus (B.s 163, DB104 y OS 21) se transformaron con los
vectores de expresión para comparación de cultivos. B.s163 es
transformable con los 2 genes de Aeromonas y puede expresar
la proteína activa. DB104 puede transformarse con todos los montajes
pero solamente puede expresar la transferasa de A.
salmonicida.
En este estudio se utilizaron dos cepas de
Escherichia coli, una que contenía una lípido aciltransferasa
de Aeromonas hydrophila (Ejemplo 2) y dos que contenían
lípido aciltransferasas de Aeromonas salmonicida, (Ejemplo
1).
La cepa de E. coli que contenía el gen de
A. hydrophila se denominó DIDK0124 y la cepa de E.
coli que contenía el gen de A. salmonicida se denominó
DIDK0125. La fermentación con DIDK0124 se denominó HYDRO0303 y la
fermentación con DIDK0125 se denominó SAL0302. La proteína
purificada a partir de HYDRO025 se denominó REFnº138. La proteína
purificada procedente de HYDRO0303 se denominó REFnº135.
\vskip1.000000\baselineskip
Las placas con LB agar-agar
utilizadas para mantener las cepas contenían: 10 g/l de triptona, 5
g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de
agar-agar, 100 mg/l de ampicilina y 35 mg/l de
cloranfenicol. Las placas con agar-agar se incubaron
a 30ºC.
El medio LB (50 ml por matraz agitado) utilizado
para la producción del material del inóculo para los cultivos del
biorreactor contenían: 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de
levadura, 5 g/l de NaCl, 100 mg/l de ampicilina y 35 mg/l de
cloranfenicol. Los matraces en agitación se inocularon en placas de
LB agar-agar y se incubaron a 30ºC y 200 rpm.
Se llevaron a cabo cultivos en el biorreactor en
biorreactores de 6 l de construcción propia rellenos con 4 l de
medio que contenían: 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de
levadura, 5 g/l de NaCl, 8 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,9 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 40 g/l de glucosa monohidratada, 0,4 ml
de ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond,
Holanda), 10 mg/l de
(NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}\cdot6H_{2}O,
0,7 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 3 mg/l de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3 mg/l de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 10
mg/l de EDTA, 0,1 mg/l de NiSO_{4}\cdot6H_{2}O, 0,1 mg/l de
CoCl_{2}, 0,1 mg/l de H_{3}BO_{4}, 0,1 mg/l de KI, 0,1 mg/l
de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 1 g/l de ampicilina y 35 mg/l
de cloranfenicol.
Los biorreactores se hicieron funcionar con una
cantidad de cultivo LB que asegura el final del cultivo después de
aproximadamente 20 horas de cultivo (calculado a partir de la tasa
de crecimiento específico máximo de 0,6 h^{-1}, la DO_{600} del
matraz en agitación LB y la DO_{600} final en el biorreactor de
aproximadamente 20).
Se inoculó SAL0302 con 10 ml de cultivo LB y se
inoculó HYDRO0303 con 4 ml de cultivo LB.
Los biorreactores se operaron en las condiciones
siguientes: temperatura 30ºC, agitación 800 a 1.000 rpm (dependiendo
del experimento), aireación 5 l/min., pH 6,9, pH de referencia
8,75% (p/v) NH_{3}-agua y H_{2}SO_{4} 2 M. La
inducción se consiguió por adición de isopropil
\beta-D-tiogalactósido hasta una
concentración final de 0,6 mM, cuando se produjeron 0,4 moles
(HYDRO0303) y 0,7 moles de CO_{2} respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó el siguiente procedimiento para la
recolección y homogeneización de la biomasa:
- 1)
- El caldo de cultivo de la fermentación procedente de las fermentaciones se centrifugó a 5.000 \times g y 4ºC durante 10 minutos, y se descargó el sobrenadante. Se almacenó la biomasa a -20ºC hasta su utilización. Se descongeló la biomasa y se volvió a poner en suspensión en 500 ml de NaH_{2}PO_{4} 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM e inhibidor de proteasa completo (exento de EDTA) (Roche, Alemania).
- 2)
- Se homogeneizó la biomasa en suspensión a 2 kbares y 4ºC en un triturador celular de Constant Systems Ltd. (Warwick, UK).
- 3)
- Se eliminaron los residuos celulares por centrifugación a 10.000 \times g y 4ºC durante 30 minutos seguido de recogida del sobrenadante.
- 4)
- Se clarificó más el sobrenadante por centrifugación a 13.700 \times g y 4ºC durante 60 minutos, seguido de recogida del sobrenadante.
- 5)
- Se filtró el sobrenadante a través de filtros Vacu Cap de 0,2 \mum (Pall Life Sciences, UK) y el filtrado se recogió para purificación cromatográfica inmediata.
\vskip1.000000\baselineskip
Se rellenó una columna (2,5 \times 10 cm) con
50 ml de gel Chelating Sepharose ff. y se cargó con sulfato de
níquel (según el método descrito por el fabricante, Amersham
Biosciences). Se equilibró la columna con 200 ml de
NaH_{2}PO_{4} 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM. Se
aplicaron 400 ml del producto en bruto a la columna a un caudal de
5 ml/min. Se lavó la columna a continuación con NaH_{2}PO_{4} 20
mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM hasta que la UV_{280}
alcanzó la línea de referencia. La GCAT se eluyó a continuación conn
40 ml de NaH_{2}PO_{4} 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM e imidazol 500
mM.
\vskip1.000000\baselineskip
BAC0318-19,
BAC0323-24.
\vskip1.000000\baselineskip
Los microorganismos utilizados en este estudio
se originan a partir de la transformación de una cepa hospedadora
de Bacillus subtilis, nº 163 con un plásmido que contiene el
gen que codifica la transferasa de Aeromonas salmonicida
insertada en el vector pUB110OIS. La expresión del gen se controla
mediante un activador de alfa-amilasa, y la
secreción de la transferasa se media por la secuencia señal de
silanasa de B. subtilis (Ejemplo 3). Las cepas se denominan
DIDK0138 (fermentación BAC0318-19) y DIDK0153
(fermentación BAC0323-24).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron a un matraz en agitación (500 ml de
volumen total, con tabiques) 100 ml de un medio que contiene:
- NaCl
- 5 g/l
- K_{2}HPO_{4}
- 10 g/l
- Harina de soja
- 20 g/l
- Extracto de levadura, BioSpringer 106
- 20 g/l
- Antiespumante, SIN260
- 5 ml/l
Se ajustó el pH a 7,0 antes de la esterilización
en autoclave
Después de la esterilización en autoclave se
añadieron 6 ml de Nutriose al 50% (p/p) por matraz. Se añadió
kanamicina a una concentración de 50 mg/l después de la
esterilización en autoclave.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó un matraz en agitación de precultivo
con cultivo congelado directamente a partir de una solución madre
en glicerol al 25% (p/v). El matraz en agitación se incubó a 33ºC y
175 rpm durante aproximadamente 16 horas, utilizándose así 50 ml
para inocular el fermentador.
Las fermentaciones se llevaron a cabo en 6 l en
fermentadores de construcción propia.
El medio del lote (3 l) contenía:
- Solución saturada con maíz (50% de peso muerto)
- 40 g/l
- Extracto de levadura BioSpringer 153 (50% de peso muerto)
- 10 g/l
- NaCl
- 5 g/l
- CaCl_{2}, 2H_{2}O
- 0,25 g/l
- Mn(NO_{3})_{2}, H_{2}O
- 0,2 g/l
- Antiespumante SIN260
- 1 m/l
- Kanamicina (esterilizada en filtro para el fermentador después de esterilización en autoclave)
- \\[2.1mm]{}\hskip0.9cm 50 mg/l
\vskip1.000000\baselineskip
La alimentación contenía:
- Glucosa monohidratada
- 540 g/kg
- MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 4,8 g/kg
- Antiespumante SIN260
- 4 ml/kg
- Estraco de levadura, Bio Springer 153 (50% de peso muerto) (esterilizado en autoclave por separado)
- \\[2.1mm]{}\hskip0.9cm 150 g/kg
\vskip1.000000\baselineskip
La alimentación en la fermentación BAC0318 y
BAC0323 se inició basándose en el CO_{2} acumulado, según las
ecuaciones siguientes:
Caudal de alimentación [g/h] = 0, AcCO_{2}
< 0,15
Caudal de alimentación [g/h] = 2,85 +
t\cdot1,54, AcCO_{2} \geq 0,15 y t<12
Caudal de alimentación [g/h] = 21,3, t>12
t: tiempo (horas) desde el momento
en que el CO_{2} (AcCO_{2}) acumulado alcanzó 0,15
moles.
\vskip1.000000\baselineskip
La alimentación en la fermentación BAC0319 y
BAC0324 se inició basándose en el CO_{2} acumulado, según las
ecuaciones siguientes:
Caudal de alimentación [g/h] = 0, AcCO_{2}
< 0,15
Caudal de alimentación [g/h] = 2,0 +
t\cdot1,08, AcCO_{2} \geq 0,15 y t<12
Caudal de alimentación [g/h] = 1,5, t>12
t: tiempo (horas) desde el momento
en que el CO_{2} (AcCO_{2}) acumulado alcanzó 0,15
moles.
\vskip1.000000\baselineskip
El pH se controló a 7,0 añadiendo 12,5% (p/v) de
NH_{3}-agua o ácido fosfórico 2 M.
La aireación fue de 3 l/min correspondiente a 1
vvm.
La temperatura fue de 33ºC.
El fermentador se equipó con dos agitadores de
hélice Rushton de 8 cm Ø dispuestos a una distancia de 10 cm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eliminó la biomasa por centrifugación a
16.000 \times g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El
sobrenadante se esterilizó en filtro y el filtrado se utilizó para
la purificación y los ensayos de la aplicación.
Se iniciaron experimentos de glicerólisis
enzimática mediante la adición de la solución de
glicerol/transferasa al reactor que contenía aceite de palma y
glicerol/agua en concentraciones variables. Todas las reacciones se
realizaron a 43ºC, utilizando agitación magnética durante 24 horas.
Después de la reacción, se analizaron las muestras HPTLC y en
algunos experimentos se confirmó el resultado por análisis GC. Las
pruebas realizadas demostraron que había una buena correlación
entre la concentración en agua y las concentraciones de las DAG y
MAG respectivamente: las concentraciones en agua inferiores
determinadas dieron la concentración mayor de MAG y la concentración
más baja de DAG.
Basándose en las pruebas, puede concluirse que
era posible reducir la cantidad de las DAG en aceite de palma
mediante una reacción catalizada por transferasa en la que la enzima
utilizó las DAG como moléculas donantes y glicerol como molécula
receptora, en una reacción de glicerólisis en la que se sintetizaron
monoglicéridos. Esto contrastaba con la reacción de glicerólisis
con lipasas que hidrolizan triglicérido convencionales en las que la
cantidad de DAG aumenta.
Además, puede concluirse que la concentración en
agua produce un impacto significativo sobre el rendimiento
sintetizado de monoglicéridos y la cantidad de DAG. Se obtuvo la
correlación siguiente: concentración en agua baja (<1%) y 5% de
glicerol da un rendimiento en MAG aumentado y una concentración
disminuida de las DAG. Los resultados obtenidos también demuestran
que principalmente el isómero 1,2 del diglicérido tiende a
reducir-
se.
se.
Es sabido que los diglicéridos, especialmente
los isómeros 1,2 retardan la cristalización de las grasas. Este
efecto produce la cristalización posterior de productos grasos como
la margarina y las grasas sólidas, lo que favorece la formación de
cristales grandes (arenosidad). En determinadas mezclas de grasa se
observó que los diglicéridos mejoran la estabilidad de los
cristales \beta'. Una reducción pero no una eliminación completa
de los diglicéridos en el aceite de palma resultaría por
consiguiente preferida. De este modo puede concluirse que una
reducción de diglicérido producirá una calidad del aceite mejor y
más uniforme; hecho que no debe ser subestimado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los problemas referentes a los diglicéridos
dependen en alguna medida del tipo de producto, por ejemplo si está
en forma de margarina y grasa sólida. Por lo tanto, dependiendo del
producto la presencia de diglicéridos tendrá efectos tanto
negativos como positivos. Para la producción de margarina, puede
utilizarse únicamente el producto graso de estructura cristalina
requerida con objeto de obtener consistencia y plasticidad
apropiadas. La forma cristalina \beta' es la estructura más
requerida, presentando pequeños cristales y una gran capacidad para
mantener la fracción líquida. La forma cristalina más estable (forma
\beta) resulta indeseable, ya que al tener cristales grandes
produce la estructura en grano de la margarina. Según Hernquist y
Anjou (1993) y Wahnelt et al. (1991) la presencia de
diglicéridos en la grasa retarda la transición del cristal \beta'
a \beta. Pero ya que los diglicéridos retardan la transición de
\beta' a \beta, también retardan la transición de la forma
\alpha a la forma \beta' (Walnet et al., 1991). Por este
motivo puede definirse que la presencia de los diglicéridos retarda
el proceso total de cristalización. La cristalización lenta produce
un impacto crucial sobre la aplicación de la margarina. El efecto de
retardar la cristalización en las mezclas de margarina que
contienen una parte elevada de aceite de palma consiste en que
después del tratamiento convencional el producto puede ser algo
blando, lo que produce dificultades de envasado y la cristalización
posterior puede conducir a una textura más firme de la deseada
(Berger, 1990). A pesar de las ventajas e inconvenientes, puede ser
importante encontrar un equilibrio correcto entre la eliminación
reducida y total de los diglicéridos.
Se ha descubierto sorprendentemente que es
posible reducir la cantidad de diglicérido en el aceite de palma
por glicerólisis enzimática del aceite de palma utilizando una
lípido aciltransferasa, por ejemplo la GDSx lípido aciltransferasa
de Aeromonas salmonicida. Sin pretender ceñirse a la teoría,
en este proceso la enzima se añade al aceite de palma junto con una
pequeña cantidad de glicerol y la enzima cataliza la reacción
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la reacción el excedente de glicerol puede
separarse, si se estima necesario, fácilmente de la mezcla de
reacción por centrifugación u otros procedimientos.
La ventaja de este proceso es que la cantidad de
diglicérido (preferentemente el 1,2 diglicérido) se reduce mediante
una reacción de glicerólisis catalizada por una enzima que es
específica para el diglicérido sin utilizar el triglicérido como
donante para la reacción de transferasa.
Los monoglicéridos productos de la reacción no
han de eliminarse de la mezcla de reacción, pero pueden utilizarse
de manera ventajosa como un emulsionante eficaz para la producción
de productos alimenticios como la margarina y las grasas sólidas.
El procedimiento resuelve de este modo dos problemas. Ante todo la
cantidad de diglicérido y preferentemente se elimina el 1,2
diglicérido, que produce un impacto negativo sobre las propiedades
de cristalización de los triglicéridos. En segundo lugar el
producto de la reacción monoglicérido puede utilizarse como un
emulsionante eficaz en la producción de productos alimenticios como
la margarina y las grasas sólidas.
En una forma de realización, se prefiere
eliminar los monoglicéridos producidos (si existen) mediante la
reacción con transferasa.
Propiamente, si la reacción con transferasa se
ha llevado a cabo en el aceite de palma en bruto, el monoglicérido
y/o glicerol y/o los restos de agua (si existen) pueden eliminarse
mediante un proceso de desodorización durante el proceso de refino
del aceite comestible.
Otra ventaja muy interesante de la utilización
de la líquido aciltransferasa es que esta enzima es menos
dependiente del contenido de agua en la mezcla de reacción y debido
a que esta enzima es una transferasa tiene lugar baja actividad
hidrolítica o ninguna, lo que significa que la cantidad de ácidos
grasos libres no aumenta de manera significativa.
El bien sabido que el contenido en agua en las
reacciones de glicerólisis es muy importante cuando las enzimas
lipolíticas como las lipasas se utilizan en este proceso
(Kristensen, 2004). Incluso pequeñas cantidades de agua, que son
necesarias para la mayoría de las reacciones lipolíticas producirán
la formación de una cantidad significativa de ácidos grasos libres.
Este problema puede resolverse utilizando la lípido aciltransferasa
en la reacción de
glicerólisis.
glicerólisis.
Otro aspecto es que las lipasas conocidas en la
técnica para catalizar la reacción de glicerólisis, utilizan
principalmente triglicérido como donante durante la formación del
diglicérido en lugar de reducir la cantidad de
diglicérido.
diglicérido.
\vskip1.000000\baselineskip
- Aceite de palma:
- Palmotex, Aarhus United, Dinamarca
- Glicerol:
- J. T. Baker, (7044)
- DIMODAN® P:
- Danisco A/S, Dinamarca
- Enzima:
- Lípido aciltransferasa GCAT de Aeromonas salmonicida
expresada en B. subtilis y fermentada a
escala de laboratorio (Transferasa nº 196).
Se desalaron las enzimas (columnas de desalado
PD-10, Amersham Biosciences) antes de la
liofilización. Las enzimas desaladas se mezclaron con glicerol
(relación enzima:glicerol 3,5:1). La muestra se liofilizó y se
añadió 10% de agua. La muestra contenía aproximadamente 20 U
(unidades de fosfolipasa) por gramo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 95% de L-\alpha
fosfatidilcolina al 0,6% vegetal (Avanti nº 441601), 0,4% de
Triton-X 100 (Sigma X-100) y
CaCl_{2} 5 mM en tampón HEPES 0,05 M pH 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 400 \mul de sustrato a un tubo
Eppendorf de 1,5 ml y se colocaron en un termomezclador Eppendorf a
37ºC durante 5 minutos. En el tiempo t=0 min, se añadieron 50 \mul
de solución enzimática. También se analizó un blanco con agua en
lugar de enzima. La muestra se mezcló a 10*100 rpm en un
termomezclador Eppendorf a 37ºC durante 10 minutos. En el tiempo
t=10 min el tubo Eppendorf se colocó en otro termomezclador a 99ºC
durante 10 minutos para interrumpir la reacción.
El ácido graso libre en las muestras se analizó
utilizando el kit NEFA C de WAKO GmbH.
Se calculó la actividad enzimática
PLU-7 a pH 7 como ácido graso en micromoles
producido por minuto en las condiciones de ensayo
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo reaccionar aceite de palma con la
solución de glicerol-enzima según la siguiente
receta en las Tablas 1 y 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se pesó el aceite de palma en un vidrio Wheaton
20 ml y se añadieron glicerol/enzima y agua opcional. La mezcla se
colocó en el bloque de calentamiento (bloque de calentamiento
Multitherm HP 15 Stheating calentado con agitación diferencial (15
pocillos) controlado por un termostato Thermomodul 40 ST de
VARIOMAG) y se hizo reaccionar en las siguientes condiciones:
- Temperatura de reacción:
- 43ºC
- Agitación magnética:
- 650 rpm
- Tiempo de reacción:
- 20 horas
Se inactivó la enzima en la mezcla de reacción a
97,5ºC en 10 min. Después de la reacción la muestra se homogeneizó
(Ultra Turrax) durante 20 s. y se tomó una muestra homogénea para
análisis adicionales.
\vskip1.000000\baselineskip
- Aplicador: aplicador LINOMAT 5, CAMAG
- Placa de HPTLC: 10 \times 10 cm (Merck nº 1.05633)
\vskip1.000000\baselineskip
La placa se activó antes de utilizar secando en
una estufa a 180ºC durante 20 a 30 minutos.
- Aplicación: 2,0 \mul de una solución al 2,0% de aceite de palma reaccionado disuelto en cloroformo:metanol (2:1) se aplicó a la placa de HPTLC utilizando el aplicador LINOMAT 5.
- Tampón de serie: P-éter:MTBE:ácido acético (50:50:1)
- Tiempo de aplicación/elución: 8 minutos.
- Fluido de revelado: Cupriacetato al 6% en H_{3}PO_{4} al 16%
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la elución se secó la placa en una
estufa a 180ºC durante 10 minutos, se enfrió y se sumergió en el
fluido de revelado y a continuación se secó más en 20 minutos a
180ºC. Se evaluó la placa visualmente y se escaneó (ScanWizard 5)
directamente.
En el Experimento II los componentes se
cuantifican por Adobe photoshop 6,0 y la cantidad de MAG y DAG se
calculó a partir de las curvas de calibración de las soluciones
patrón de DAG y MAG (véase las Figuras 49 y 50).
\vskip1.000000\baselineskip
Cromatógrafo de gases capilar Perkin Elmer 8420
provisto de una columna de sílice fundida WCOT de 12,5 m \times
0,25 mm D.I. \times 0,1 \mum de
fenil-metil-silicona al 5% (CP Sil 8
CB de Crompack).
- Portador: helio.
- Inyeccion: 1,5 \mul con desdoblamiento.
- Detector: FID, 385ºC.
\hskip0.7cm
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de la muestra: se disolvieron 50 mg
de lípido en 12 ml de heptano:piridina (2:1) que contenía 2 mg/ml
del patrón interno heptadecano. Se transfirieron 500 \mul de la
muestra a un vial traslúcido. Se añadieron 100 \mul de MSTFA
(N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida)
y la reacción se incubó durante 15 minutos a 60ºC.
Cálculo: Se determinaron los factores de
respuesta para
mono-di-triglicéridos, ácidos grasos
libres a partir de las mezclas de referencia de estos componentes.
Basándose en estos factores de respuesta se calcularon los lípidos
en las muestras.
Experimento
I
El objetivo de este experimento consistió en
examinar el impacto de una diglicérido:glicerol aciltransferasa de
Aeromonas salmonicida en las DAG en el aceite de palma
mediante reacción de glicerólisis. Es sabido que un GCAT puede
transferir ácido graso procedente de lecitina al colesterol durante
la formación del éster del colesterol y lisolecitina. En este
estudio los autores investigaron la posibilidad de la enzima de
utilizar las DAG como donante y glicerol como receptor con objeto
de reducir la cantidad de las DAG en el aceite de palma y producir
monoglicérido.
Es bien conocido en la bibliografía el utilizar
enzimas como lipasas para catalizar las reacciones de glicerólisis.
En estas reacciones los triglicéridos son el sustrato principal y
los mono y diglicéridos son los productos de la reacción. En estos
procedimientos la cantidad de diglicéridos aumenta
significativamente y la cantidad de diglicéridos producidos está en
el nivel o altura de la cantidad de monoglicérido producido
(Kristensen, 2004).
Se determinaron cuatro composiciones de la
muestra diferentes y se compararon con una referencia de aceite de
palma mezclada con glicerol al 5% pero sin enzima y tratada de la
misma manera que las muestras. La Figura 47 presenta el resultado
del análisis HPTLC de la muestra en la tabla 1.
Los resultados obtenidos a partir de los
análisis HPTLC demuestran que la cantidad de las DAG varía según
las condiciones de reacción (haciendo referencia a la relación entre
GL:H_{2}O). Igual para todas las reacciones fue que los isómeros
1,3 de diglicérido estaban en proporción mayor que los isómeros
1,2-(2,3-) de diglicérido. Esta observación puede confirmarse por
la teoría, que dice que la relación de isómero 1,3 a isómero 1,2-
(2,3-) en el aceite de palma en bruto es 7:3 (Siew y Ng, 1999;
Timms, 2004). Además, analizando el resultado, la placa de HPTLC
demuestra que la transferasa reduce con éxito la cantidad de DAG. La
reducción puede en alguna medida correlacionarse con la cantidad de
MONO sintetizado.
Si se compara el isómero 1,2 con el isómero 1,3
las DAG en la figura 1 parece que las 1,2 DAG se reducen
principalmente por la reacción catalizada por enzimas. Esto está de
acuerdo con el hecho de que la transferasa presente una especificada
preferida por los ácidos grasos en la posición sn2.
En los experimentos realizados se utilizaron
diferentes concentraciones de agua en el intervalo entre 0,5 y
5,5%. A partir del resultado parece que la concentración de agua
presenta un impacto significativo sobre la cantidad sintetizada de
MONO combinada con la cantidad reducida de DAG. En este caso la
transferasa nº 196 demuestra que si el sistema contiene baja
concentración de agua se forma una concentración de MONO aumentada
y se observa la correspondiente cantidad disminuida de DAG. El
experimento también investiga si la cantidad de glicerol presenta
un efecto sobre el equilibrio en el sistema (Banda 5: 10% de GL:1%
de H_{2}O). La transferasa nº 196 demuestra que una concentración
mayor de glicerol (que significa también doble dosis de actividad
enzimática) la dosis no produce una concentración mayor de MONO.
Preferentemente la presente invención se realiza
en un medio con poca agua, es decir menos de aproximadamente 1%.
Una de las ventajas de trabajar con transferasas
en lugar de lipasas es que la síntesis de la dosis de MONO no se
correlaciona con el aumento excesivo en la concentración de FFA.
Este hecho se confirma en el presente experimento. La Figura 1
demuestra que ninguna de las reacciones presentan banda clara de FFA
(la banda FFA era de esperar que fuera visible entre 1,3 DAG y
TAG).
A partir de este experimento puede resumirse que
la concentración óptima de glicerol y agua para la transferasa nº
196 es la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Transferasa nº 196: 5% de GL:0,5% de
H_{2}O.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de la muestra en el análisis
HPTLC no incluía la determinación del peso específico, debido a
esto no fue posible calcular la concentración de los diferentes
componentes en las mezclas de reacción. Debido a esto la
observación se basa únicamente en la evaluación visual.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en los resultados de HPTLC se
seleccionó la muestra nº 2 para el análisis de GC. Para hallar si
la evaluación visual de las placas de HPTLC se pudo confirmar por
análisis cuantitativo de DAG. Antes del análisis se eliminó el
glicerol de la muestra por centrifugación y solamente se expuso la
fase de lípido al análisis de GC. Los resultados de GC se presentan
en la Tabla 3 a continuación.
Analizando el resultado del estudio de GC se
encontró que la muestra seleccionada se diferencia de la referencia
en un contenido mayor de MONO y un rendimiento inferior de DAG. Esta
observación apoya los resultados obtenidos en el análisis HPTLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Haciendo referencia al contenido de
monoglicéridos y diglicéridos en el producto de la glicerólisis, los
resultados del análisis HPTLC indicaban que existe una correlación
entre la concentración de agua y las cantidades de MONO y DAG,
respectivamente: la concentración menor de agua, menor de DAG y
mayor de MONO.
El análisis por GC confirmó el grado de
reducción en DAG. En este experimento la cantidad reducida de
recuentos de DAG para el 7,1% de la cantidad total de diglicéridos
del aceite de palma (Tabla 4).
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Experimento
II
El objetivo de esta parte fue continuar la
optimización de la reducción de DAG en el aceite de palma y analizar
la glicerólisis catalizada por transferasa utilizando transferasa nº
196. El propósito principalmente consiste en alcanzar una reacción
bien equilibrada en la que la cantidad de DAG se ha reducido en el
tiempo con aumento de concentración de MONO.
En esta parte del trabajo experimental se
analizaron seis composiciones de muestras diferentes y se compararon
con una referencia de aceite de palma mezclado con glicerol al 5%
(Tabla 2). La referencia se expuso al mismo perfil de calentamiento
que las reacciones enzimáticas, lo que hace posible observar y
determinar el grado de degradación térmica durante la reducción. La
Figura 48 presenta el resultado del análisis HPTLC.
A partir de los resultados en la Figura 48
parece que especialmente la cantidad de MAG es variable. El análisis
HPTLC demuestra que en las muestras que contienen 5% de glicerol
(bandas: 1 a 3) existe una relación continua entre la concentración
de agua y el rendimiento de MAG: la disminución de la cantidad de
agua en la mezcla de reacción es seguida del aumento de rendimiento
de MAG. La misma tendencia se observa en las reacciones que
contienen 10% de glicerol (banda: 5 a 7).
Según la cantidad de diglicéridos, no fue
posible diferenciar las muestras basadas únicamente en la evaluación
visual de la placa de HPTLC. Por consiguiente, para poder
distinguir entre las muestras, se cuantificaron los componentes
analizando los materiales patrón con una composición conocida de MAG
y DAG. Se escanearon las placas de HPTLC y se manipularon mediante
Adobe Photoshop 6.0 y se calcularon más mediante la ayuda de un
cálculo macro construido (Microsoft Excel 2000). El análisis
cuantitativo de los componentes analizados por HTPLC se presenta en
la Tabla 5 a continuación.
La investigación apoya la evaluación visual y
proporciona una imagen fina del nivel variable de diglicéridos. En
los resultados se aprecia que el grado mayor de reducción en la
cantidad de DAG se consiguió en la muestra nº 1 (5% de GL:1,5% de
H_{2}O). Además se observa que esta muestra también contiene la
cantidad mayor de MAG.
\vskip1.000000\baselineskip
El Experimento II confirmó las observaciones de
que una lípido aciltransferasa GCAT de Aeromonas salmonicida
podía reducir la cantidad de diglicéridos en el aceite de palma.
Para los experimentos con 5% de glicerol se halló una correlacion
entre la concentración de agua en la mezcla de reacción y las
cantidades de MAG y DAG, respectivamente: la concentración inferior
de agua, la inferior de DAG y mayor de MAG.
HPTLC cuantificó el grado de reducción (véase
Tabla 5). A partir de los resultados parece que la cantidad reducida
de recuentos de DAG para 13,29% de la cantidad total de diglicéridos
en el aceite de palma y la cantidad de MONO sintetizado aumentó
desde 0,01% (ref.) hasta 0,38% (muestra nº 1).
A partir de este experimento puede resumirse que
la concentración óptima de glicerol y agua para la transferasa nº
196 es la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Transferasa nº 196: 5% de GL:1,5% de
H_{2}O.
\vskip1.000000\baselineskip
Comparando estas observaciones con el resultado
obtenido en el Experimento I, se confirma que se obtiene una
continuidad adecuada en los resultados. La concentración óptima de
agua está comprendida supuestamente entre 0 y 1% de H_{2}O
dependiendo de la actividad enzimática y del contenido de
glicerol.
Basándose en los dos experimentos realizados, se
puede extraer la conclusión de que es posible reducir la cantidad
de las DAG en el aceite de palma mediante una reacción catalizada
por transferasa, en la que la enzima utiliza las DAG como moléculas
donantes y glicerol como molécula receptora, en una reacción de
glicerólisis en la que se sintetizan monoglicéridos. Esto está en
acusado contraste con la reacción de glicerólisis con lipasas que
hidrolizan triglicéridos convencionales en la que la cantidad de DAG
aumenta debido a la actividad de la hidrólisis parcial de la lipasa
que hidroliza triglicéridos.
Basándose en el hecho de que la estructura de
diglicéridos es una mezcla de isómeros 1,2 y 1,3 y que la
transferasa es específica para la posición sn2, incluso una pequeña
reducción en la cantidad de diglicérido tendrá un impacto físico
enorme sobre los productos a base de aceite de palma.
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La diacilglicerol:glicerol transferasa se
inmoviliza sobre Celite mediante precipitación en acetona. 10 ml de
solución enzimática en tampón TEA 20 mM pH 7 se agita lentamente con
0,1 gramo de Celite 535 (de Fluka) durante 2 horas a temperatura
ambiente.
Se añaden 50 ml de acetona fría durante la
agitación continua.
Se aísla el precipitado por centrifugación a
5.000 g durante 1 minuto.
Se lava 2 veces el precipitado con 20 ml de
acetona fría.
Se ensaya el Celite a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 hora.
La transferasa inmovilizada se analiza en aceite
de palma (véase la tabla a continuación):
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El aceite de palma y el glicerol se calientan a
42ºC. Se añadió transferasa inmovilizada.
La reacción de transferasa continuó a 42ºC
durante la agitación suave con un agitador magnético. Se tomaron
muestras para análisis después de ½, 1, 3, 6 y 24 horas y se
analizaron por HPTLC. La reacción se interrumpió después de 24 horas
de tiempo de reacción y se filtró la enzima inmovilizada.
El análisis HPTLC presenta claramente el efecto
de diacilglicerol:glicerol inmovilizado de A. salmonicida
mediante la formación de monoglicérido y la reducción de diglicérido
en aceite de palma.
\vskip1.000000\baselineskip
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Dato: 21.06.04
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(Formulario pasa a página
siguiente)
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<110> Danisco A/S
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<120> Procedimiento
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> P021904WO
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/IB2004/004374
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-12-23
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0330016.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-12-24
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/IB04/00655
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<151>
2004-01-15
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0416023.0
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<151>
2004-07-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US10/898775
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-07-26
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pfam00567 secuencia de consenso
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<400> 1
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\newpage
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<210> 2
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<211> 335
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<212> PRT
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<213> Aeromonas hydrophila
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 336
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<212> PRT
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<213> Aeromonas salmonicida
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 295
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<212> PRT
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<213> Streptomyces coelicolor
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 295
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<212> PRT
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<213> Streptomyces coelicolor
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 238
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<212> PRT
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<213> Saccharomyces cerevisiae
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1005
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<212> ADN
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<213> Aeromonas hydrophila
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 1011
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<212> ADN
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<213> Aeromonas salmonicida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 888
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<212> ADN
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<213> Streptomyces coelicolor
\newpage
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 888
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<212> ADN
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<213> Streptomyces coelicolor
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
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<211> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Saccharomyces cerevisiae
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 347
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<212> PRT
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<213> Ralstonia
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 1044
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<212> ADN
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<213> Ralstonia
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 0
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Sin secuencia
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 0
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Sin secuencia
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<400> 15
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<211> 0
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Sin secuencia
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 0
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Sin secuencia
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<400> 17
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<211> 0
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Sin secuencia
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<400> 18
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<211> 0
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Sin secuencia
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<400> 19
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína hipotética conservada de
Streptomyces coelicolor
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<400> 20
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 786
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Streptomyces coelicolor
hipotética conservada
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<400> 21
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<210> 22
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<211> 260
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<212> PRT
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Streptomyces coelicolor
hipotética conservada
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<400> 22
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<210> 23
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<211> 783
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Streptomyces coelicolor
hipotética conservada
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<400> 23
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<210> 24
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<211> 454
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína segregada posible de
Streptomyces coelicolor
\newpage
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<400> 24
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<210> 25
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<211> 1365
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína segregada posible de
Streptomyces coelicolor
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<400> 25
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<210> 26
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<211> 340
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína segregada posible de
Streptomyces coelicolor
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<400> 26
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<210> 27
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<211> 1023
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Streptomyces coelicolor
posible
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<400> 27
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<210> 28
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<211> 305
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lipoproteína posible de
Streptomyces coelicolor
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<400> 28
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 29
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<211> 918
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lipoproteína posible de
Streptomyces coelicolor
\newpage
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<400> 29
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<210> 30
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<211> 268
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<212> PRT
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<213> Streptomyces rimosus
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<400> 30
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<210> 31
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<211> 1068
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<212> ADN
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<213> Streptomyces rimosus
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<400> 31
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aeromonas hydrophila
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<400> 32
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<210> 33
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<211> 2016
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<212> ADN
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<213> Aeromonas hydrophila
\newpage
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<210> 34
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<211> 336
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<212> PRT
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<213> Aeromonas salmonicida subsp.
Salmonicida
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<400> 34
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<210> 35
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<211> 2022
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Aeromonas salmonicida sibsp.
Salmonicida
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<400> 35
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<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo de fusión
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<400> 36
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador asls950new
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador 1 USNEW
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<210> 39
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> promotor T7
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> T7 cebador terminador
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\hfill18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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\hfill41
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador ahls950
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\hfill30
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<210> 44
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<211> 41
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador AHUS1
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<400> 44
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\hfill41
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<210> 45
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<211> 2094
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<212> ADN
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<213> Aeromonas hydrophila
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<400> 45
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<210> 46
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador lsAH
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
US-AhnheI
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> cebador lsAH
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
US-Asncol
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<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> lsAH
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\hfill27
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<210> 52
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
US-ASnhe1
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<400> 52
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador lsAH
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\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Streptomyces
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
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<210> 56
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador 1USNEW
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<400> 56
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\hfill35
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<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> AHLS1001
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\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermobifida fusca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3000
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermobifida fusca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Thermobifida fusca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium efficiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3000
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium efficiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Novosphingobium
aromaticivorans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Novosphingobium
aromaticivorans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces coelicolor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2000
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces coelicolor
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces avermitilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1980
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces avermitilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Procedimiento para reducir y/o eliminar el
diglicérido de un aceite comestible, que comprende a) mezclar un
aceite comestible con un sustrato aceptor de acilo y una
diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de ácido graso
CoA, en el que la diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente
de ácido graso CoA se caracteriza como una enzima que en un
aceite comestible transfiere un grupo acilo desde un diglicérido al
glicerol, y en la que la diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de CoA comprende el motivo de la secuencia de
aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de entre los restos de
aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el diglicérido es un 1,2-diglicérido.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la enzima diglicérido:glicerol aciltransferasa
independiente de ácido graso CoA comprende H-309 o
comprende un resto de histidina en la posición correspondiente a
His-309 en la secuencia de aminoácidos de la enzima
lipolítica de Aeromonas hydrophila representada como la SEC.
ID. nº: 2 o la SEC. ID. nº: 32.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA puede obtenerse a
partir de un organismo de entre uno o más de los géneros siguientes:
Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus,
Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium,
Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus,
Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria,
Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA comprende una o más
de entre las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 2; (ii) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 3; iii) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 4; (iv) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 5; (v) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 6; (vi) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 12; (vii) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 20; (viii) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 22; (ix) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 24; (x) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 26; (xi) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 28; (xii) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 30; (xiii) la
secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 32; (xiv) la
secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 34; (xv) la
secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 55; (xvi) la
secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 58; (xvii)
la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 60;
(xviii) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº:
61; (xix) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº:
63; (xx) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº:
65; (xxi) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº:
67; (xxii) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID.
nº: 70 o (xxiii) una secuencia de aminoácidos que presenta el 75% o
más de identidad con cualquiera de las secuencias representadas como
SEC. ID. nº: 2, SEC. ID. nº: 3, SEC. ID. nº: 4, SEC. ID. nº: 5, SEC.
ID. nº: 6, SEC. ID. nº: 12, SEC. ID. nº: 20, SEC. ID. nº: 22, SEC.
ID. nº: 24, SEC. ID. nº: 26, SEC. ID. nº: 28, SEC. ID. nº: 30, SEC.
ID. nº: 32, SEC. ID. nº: 34, SEC. ID. nº: 55, SEC. ID. nº: 58, SEC.
ID. nº: 60, SEC. ID. nº: 61, SEC. ID. nº: 63, SEC. ID. nº: 65, SEC.
ID. nº: 67 o SEC. ID. nº: 70.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA comprende una
secuencia de aminoácidos codificada por una o más de las secuencias
nucleotídicas siguientes:
- (a)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 7;
- (b)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 8;
- (c)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 9;
- (d)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 10;
- (e)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 11;
- (f)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 13;
- (g)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 21;
- (h)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 23;
- (i)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 25;
- (j)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 27;
- (k)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 29;
- (l)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 31;
- (m)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 33;
- (n)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 35;
- (o)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 54;
- (p)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 59;
- (q)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 62;
- (r)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 64;
- (s)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 66;
- (t)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 68;
- (u)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 69 o
- (v)
- una secuencia nucleotídica que presenta el 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias representadas como SEC. ID. nº: 7, SEC. ID. nº: 8, SEC. ID. nº: 9, SEC. ID. nº: 10, SEC. ID. nº: 11, SEC. ID. nº: 13, SEC. ID. nº: 21, SEC. ID. nº: 23, SEC. ID. nº: 25, SEC. ID. nº: 27, SEC. ID. nº: 29, SEC. ID. nº: 31, SEC. ID. nº: 33, SEC. ID. nº: 35, SEC. ID. nº: 54, SEC. ID. nº: 59, SEC. ID. nº: 62, SEC. ID. nº: 64, SEC. ID. nº: 66, SEC. ID. nº: 68 o SEC. ID. nº: 69.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende mezclar el aceite
comestible tratado con uno o más de los constituyentes alimenticios
para formular un producto alimenticio.
8. Utilización de una diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA
caracterizada como una enzima que en un aceite comestible
transfiere un grupo acilo desde un diglicérido al glicerol, en la
preparación de un aceite comestible, para reducir y/o eliminar
(preferentemente reducir y/o eliminar selectivamente) diglicérido
procedente de dicho aceite comestible, en la que la
diglicérido:glicerol aciltransferasa independiente de CoA comprende
el motivo de la secuencia de aminoácidos GDSX, en la que X es uno o
más de los restos de aminoácido siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q,
T, N, M o S.
9. Utilización de una diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA
caracterizada como una enzima que en un aceite comestible
transfiere un grupo acilo desde un diglicérido al glicerol, en la
preparación de un producto alimenticio que comprende un aceite
comestible para mejorar las propiedades de cristalización de dicho
producto alimenticio, en la que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de CoA comprende el motivo de la
secuencia de aminoácidos GDSX, en la que X es uno o más de los
siguientes restos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o
S.
10. Utilización según la reivindicación 8 ó 9,
en la que la cantidad de diglicérido en el aceite comestible
se
reduce.
reduce.
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en la que el diglicérido es un
1,2-diglicérido.
12. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en la que la enzima diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA comprende
H-309 o comprende un resto de histidina en la
posición correspondiente a His-309 en la secuencia
de aminoácidos de la enzima lipolítica de Aeromona hydrophila
representada en la SEC. ID. nº: 2 o en la SEC. ID. nº: 32.
13. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en la que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA puede obtenerse a
partir de un organismo de entre uno o más de los géneros siguientes:
Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus,
Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium,
Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus,
Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria,
Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.
14. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 13, en la que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA comprende una o más
de las secuencias de aminoácidos siguientes: (i) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 2; (ii) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 3; (iii) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 4; (iv) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 5; (v) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 6; (vi) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 12; (vii) la secuencia de
aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 20; (viii) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 22; (ix) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 24; (x) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 26; (xi) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 28; (xii) la secuencia
de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 30; (xiii) la
secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 32; (xiv) la
secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 34; (xv) la
secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 55; (xvi) la
secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 58; (xvii)
la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº: 60;
(xviii) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº:
61; (xix) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº:
63; (xx) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº:
65; (xxi) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID. nº:
67; (xxii) la secuencia de aminoácidos representada como SEC. ID.
nº: 70 o (xxiii) una secuencia de aminoácidos que presenta el 75% o
más de identidad con cualquiera de las secuencias representadas como
SEC. ID. nº: 2, SEC. ID. nº: 3, SEC. ID. nº: 4, SEC. ID. nº: 5, SEC.
ID. nº: 6, SEC. ID. nº: 12, SEC. ID. nº: 20, SEC. ID. nº: 22, SEC.
ID. nº: 24, SEC. ID. nº: 26, SEC. ID. nº: 28, SEC. ID. nº: 30, SEC.
ID. nº: 32, SEC. ID. nº: 34, SEC. ID. nº: 55, SEC. ID. nº: 58, SEC.
ID. nº: 60, SEC. ID. nº: 61, SEC. ID. nº: 63, SEC. ID. nº: 65, SEC.
ID. nº: 67 o SEC. ID. nº: 70.
15. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 14, en la que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA comprende una
secuencia de aminoácidos codificada por una o más de las secuencias
nucleotídicas siguientes:
- (a)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 7;
- (b)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 8;
- (c)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 9;
- (d)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 10;
- (e)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 11;
- (f)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 13;
- (g)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 21;
- (h)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 23;
- (i)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 25;
- (j)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 27;
- (k)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 29;
- (l)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 31;
- (m)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 33;
- (n)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 35;
- (o)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 54;
- (p)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 59;
- (q)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 62;
- (r)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 64;
- (s)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 66;
- (t)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 68;
- (u)
- la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 69 o
- (v)
- una secuencia nucleotídica que presenta el 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias representadas como SEC. ID. nº: 7, SEC. ID. nº: 8, SEC. ID. nº: 9, SEC. ID. nº: 10, SEC. ID. nº: 11, SEC. ID. nº: 13, SEC. ID. nº: 21, SEC. ID. nº: 23, SEC. ID. nº: 25, SEC. ID. nº: 27, SEC. ID. nº: 29, SEC. ID. nº: 31, SEC. ID. nº: 33, SEC. ID. nº: 35, SEC. ID. nº: 54, SEC. ID. nº: 59, SEC. ID. nº: 62, SEC. ID. nº: 64, SEC. ID. nº: 66, SEC. ID. nº: 68 o SEC. ID. nº: 69.
16. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 15, en la que la diglicérido:glicerol
aciltransferasa independiente de ácido graso CoA se utiliza en
combinación con un inhibidor de cristalización.
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