ES2521681T3 - Método para producir un éster de carbohidrato - Google Patents

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Susan Mampusti Madrid
Jørn Dalgaard Mikkelsen
Jørn Borch Søe
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DuPont Nutrition Biosciences ApS
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Abstract

Un método para producir un éster de carbohidrato, método que comprende mezclar un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua para producir un entorno con alto contenido en agua que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido, en el que el donante de acilo no es un éster de carbohidrato, y dicho aceptor de acilo es un carbohidrato; y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicha lípido aciltransferasa cataliza una o ambas de las reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de: i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío; ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación; iii) calentar el sustrato hasta 35°C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0,25ml de disolución de enzima; iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 ml de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre; v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45μm en un vaso Dram de 10ml tarado; vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y escalar las muestras; vii) analizar el lípido extraído por GLC

Description

Método para producir un éster de carbohidrato
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para la bioconversión de lípidos para producir un éster de carbohidrato por el uso de una lípido aciltransferasa.
La presente invención se refiere además al uso de una lípido aciltransferasa para bioconvertir un lípido en un éster de carbohidrato.
La presente invención se refiere además al uso de una lípido aciltransferasa inmovilizada como se define en la presente memoria en métodos y usos de la presente invención.
Antecedentes técnicos
Las lipasas se han usado extensamente en la bioconversión de lípidos para preparar productos con un valor alto, por ejemplo ésteres de azúcar, para uso en un amplio rango de industrias, incluyendo las industrias alimentaria y/o de piensos, las industrias de cosméticos y/o cuidado de la piel, la industria oleoquímica y la industria farmacéutica.
Cuando los procesos de bioconversión requieren la hidrólisis de sustratos lipídicos, pueden usarse enzimas lipolíticas en entornos con alto contenido en agua. Sin embargo, cuando los procesos de bioconversión requieren reacciones de interesterificación o transesterificación tales como por alcoholisis, el uso de lipasas en entornos con alto contenido en agua puede ser perjudicial debido a reacciones de hidrólisis no deseadas, que resultan en bioproductos no deseados y/o rendimientos menores del producto de bioconversión.
Típicamente, los procesos de bioconversión que requieren interesterificación y/o transesterificación han utilizado lipasas en entornos no acuosos tales como sistemas de aceite y/o sistemas de disolvente orgánico tales como en butanol, metanol o hexano. Dichos sistemas proporcionan un entorno en el que tanto la molécula aceptora polar como la molécula donante lipídica pueden estar al menos parcialmente solubilizadas, y la lipasa tiene actividad enzimática suficiente. Aunque para cualquier actividad enzimática se requiere una pequeña cantidad de agua, la cantidad de agua se mantiene estrictamente a un nivel bajo para evitar la actividad hidrolítica de la enzima.
Convencionalmente, los ésteres de azúcar, ésteres de proteína o ésteres de hidroxiácido se han producido por síntesis química usando catalizadores inorgánicos. Los procesos de bioconversión convencionales para la producción de ésteres de azúcar o ésteres de hidroxiácido utilizan lipasas en entornos de disolvente orgánico o fluidos supercríticos en los que sólo está presente (si lo está) una pequeña cantidad de agua.
Lecointe et al Biotechnology Letters, Vol 18., No. 8 (agosto), pp869-874 describen un estudio de varias enzimas lipasas y su actividad en un medio acuoso en la producción de éster de metilo o éster de butilo a partir de metanol y butanol, respectivamente. Lecointe et al enseñan una lipasa/aciltransferasa de Candida parapsilosis que al incrementar las concentraciones de metanol o butanol mostró una actividad de hidrólisis reducida y una capacidad aumentada de la enzima para producir éster de metilo y éster de butilo. El uso de una lipasa/aciltransferasa de C. parapsilosis en la producción de ácido graso hidroxámico se enseña en Vaysse et al J. of Biotechnology 53 (1997) 41-46.
WO 00/05396 describe el uso de un agente de conversión para preparar a partir de un material alimenticio un producto alimenticio que comprende al menos un ingrediente funcional, en el que el al menos un ingrediente funcional se ha generado a partir de al menos un constituyente del material alimentario por el agente de conversión.
Las lipasa:colesterol aciltransferasas son conocidas desde hace un tiempo (véase por ejemplo Buckley -Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). En particular, se han encontrado glicerofosfolípido:colesterol acil transferasas (referidas frecuentemente como GCAT) que, como las lecitina:colesterol aciltransferasas (LCAT) de plantas y/o mamíferos, catalizarán la transferencia de ácido graso entre fosfatidilcolina y colesterol.
US 6066482 describe una aciltransferasa esencialmente pura que es funcional para catalizar la reacción para formar ésteres de azúcar. También se describen un gen aislado que codifica aciltransferasa y un método para formar ésteres de palmitilo de glucosa que comprende hacer reaccionar 1-O-palmitoil-β-D-glucosa consigo misma, con glucosa o con éster parcial de palmitilo de glucosa en presencia de una cantidad catalíticamente eficaz de aciltransferasa.
Upton y Buckley (TIBS 20, mayo 1995 p 178-179) y Brumlik y Buckley (J. of Bacteriology abr. 1996 p 2060-2064) enseñan una lipasa/aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que tiene la capacidad de realizar la transferencia de acilo a aceptores alcohol en un medio acuoso.
Además, Hilton et al (Biochemistry vol. 29, no. 38, 1990 p 9072 - 9078) describen la purificación y estudio espectral de la aciltransferasa grasa microbiana y también se introdujo un precursor de fosfatidilcolina-esterol aciltransferasa de A. hydrophilia en la base de datos EBI UNIPROT el 1 de julio 1989 con el No. de registro P10480.
Aspectos resumidos de la presente invención
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un éster de carbohidrato, método que comprende mezclar un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua para producir un entorno con alto contenido en agua que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido, en el que el donante de acilo no es un éster de carbohidrato, y dicho aceptor de acilo es un carbohidrato; y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicha lípido aciltransferasa cataliza una o ambas de las reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya en el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:
i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;
ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;
iii) calentar el sustrato hasta 35°C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0,25ml de disolución de enzima;
iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 µl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;
v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45µm en un vaso Dram de 10ml tarado;
vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y escalar las muestras;
vii) analizar el lípido extraído por GLC.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una lípido aciltransferasa para producir un éster de carbohidrato por catálisis de una o ambas de alcoholisis o transesterificación en una mezcla de un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua, mezcla que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido, en el que el donante de acilo no es un éster de carbohidrato, y dicho aceptor de acilo es un carbohidrato, en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:
i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;
ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;
iii) calentar el sustrato hasta 35°C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0,25ml de disolución de enzima;
iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 µl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;
v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45 µm en un vaso Dram de 10ml tarado;
vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y escalar las muestras;
vii) analizar el lípido extraído por GLC.
Un éster de carbohidrato puede producirse por un método según la presente invención.
Un farmacéutico, un cosmético, un producto alimenticio, un producto de pienso, una pintura que comprende un éster de carbohidrato puede producirse por un método según la presente invención.
Una enzima lípido aciltransferasa inmovilizada como se define en la presente memoria puede usarse en métodos y usos de la presente invención.
Aspectos detallados de la presente invención
El término "lípido aciltransferasa" tal y como se usa en la presente memoria significa una enzima que además de tener actividad lipasa (clasificada generalmente como E.C. 3.1.1.x según las Recomendaciones de Nomenclatura de Enzimas (1992) del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular) también
tiene actividad aciltransferasa (clasificada generalmente como E.C. 2.3.1.x), mediante lo cual la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a uno o más de los sustratos aceptores siguientes: un carbohidrato; una proteína; una subunidad de proteína o un hidroxi ácido.
Preferiblemente, el "aceptor de acilo" según la presente invención no es agua.
La enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un sustrato lipídico a un carbohidrato.
El carbohidrato aceptor de acilo puede ser uno o más de los siguientes: un monosacárido, un disacárido, un oligosacárido o un polisacárido. Preferiblemente, el carbohidrato es uno o más de los siguientes: glucosa, fructosa, anhidrofructosa, maltosa, lactosa, sacarosa, galactosa, xilosa, xilooligosacáridos, arabinosa, maltooligosacáridos, tagatosa, microtecina, ascopirona P, ascopirona T o cortalcerona.
Los ésteres de carbohidrato pueden funcionar como emulsionantes valiosos por ejemplo en componentes alimentarios.
En un aspecto, la lípido aciltransferasa puede, además de ser capaz de transferir un grupo acilo de un sustrato lipídico a un carbohidrato, la lípido aciltransferasa es además capaz de transferir el grupo acilo de un lípido a uno o más de los siguientes: un esterol y/o un estanol, en particular un fitoesterol y/o un fitoestanol, una proteína, una subunidad de proteína o un hidroxiácido.
Adecuadamente, cuando el sustrato lipídico es un fosfolípido puede ser una lecitina, por ejemplo, fosfatidilcolina. El término lecitina tal y como se usa en la presente memoria engloba fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina y fosfatidilglicerol.
Adecuadamente, cuando el sustrato lipídico es un lisofosfolípido puede ser una lisolecitina, por ejemplo, lisofosfatidilcolina. El término lisofosfatidilcolina tal y como se usa en la presente memoria es sinónimo del término lisolecitina y estos términos pueden usarse en la presente memoria indistintamente.
Adecuadamente, cuando el sustrato lipídico es un glicolípido puede ser digalactosildiglicérido (DGDG) por ejemplo.
El sustrato lipídico puede referirse en la presente memoria como el "donante de acilo lipídico" o "donante de acilo". Estos términos se usan indistintamente en la presente memoria.
Para algunos aspectos, preferiblemente el sustrato lipídico sobre el que actúa la lípido aciltransferasa es un fosfolípido, tal como lecitina, por ejemplo fosfatidilcolina.
Para algunos aspectos, preferiblemente el sustrato lipídico es un glicolípido, tal como DGDG por ejemplo.
Para algunos aspectos, el sustrato lipídico puede ser un lípido alimentario, esto es, un componente lipídico de un producto alimenticio.
Para algunos aspectos, la lípido aciltransferasa según la presente invención puede ser incapaz, o sustancialmente incapaz, de actuar sobre un triglicérido y/o un 1-monoglicérido y/o 2-monoglicérido.
Adecuadamente, el sustrato lipídico o donante de acilo lipídico puede ser uno o más lípidos presentes en uno o más de los sustratos siguientes: grasas, incluyendo manteca, sebo y grasa de mantequilla; aceites incluyendo aceites extraídos de o derivados de aceite de palma, aceite de girasol, aceite de soja, aceite de alazor, aceite de semilla de algodón, aceite de maní, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de coco, y aceite de colza. La lecitina de soja, colza o yema de huevo también es un sustrato lipídico adecuado. El sustrato lipídico puede ser un lípido de avena u otro material basado en plantas que contiene galactolípidos.
Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido puede seleccionarse de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácidos grasos de 8 a 22 carbonos.
Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido puede seleccionarse de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácidos grasos de 16 a 22 carbonos, más preferiblemente de 16 a 20 carbonos.
Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido puede seleccionarse de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácidos grasos de no más de 14 carbonos, adecuadamente de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácidos grasos de 4 a 14 carbonos, adecuadamente 4 a 10 carbonos, adecuadamente 4 a 8 carbonos.
Preferiblemente, el donante de acilo no es un ácido graso libre.
El donante de acilo no es un éster de carbohidrato (azúcar).
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa según la presente invención puede presentar una o más de las actividades lipasa siguientes: actividad glicolipasa (E.C. 3.1.1.26), actividad triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3), actividad fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) o actividad fosfolipasa A1 (B.C. 3.1.1.32). El término "actividad glicolipasa" tal y como se usa en la presente memoria engloba "actividad galactolipasa".
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa según la presente invención puede tener al menos una o más de las actividades siguientes: actividad glicolipasa (E.C. 3.1.1.26) y/o actividad fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32) y/o actividad fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4).
Para algunos aspectos, la lípido aciltransferasa según la presente invención puede tener al menos actividad glicolipasa (E.C. 3.1.1.26).
Adecuadamente, para algunos aspectos la lípido aciltransferasa según la presente invención puede ser capaz de transferir un grupo acilo de un glicolípido y/o un fosfolípido a uno o más de los sustratos aceptores siguientes: un carbohidrato, una proteína, una subunidad de proteína, un hidroxi ácido.
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa según la presente invención es capaz de transferir un grupo acilo de un glicolípido y/o un fosfolípido a un carbohidrato para formar al menos un éster de carbohidrato.
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa según la presente invención es capaz de transferir un grupo acilo de un glicolípido y/o un fosfolípido a una proteína o una subunidad de proteína para formar al menos un éster de proteína (o un condensado de proteína ácido graso) o un éster de subunidad de proteína.
El término "éster de subunidad de proteína" tal y como se usa en la presente memoria significa el éster formado a partir de cualquier subunidad de proteína, tal como un éster de dipéptido, un éster de oligopéptido, un éster de polipéptido o un éster de hidrolizado de proteína por ejemplo.
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa según la presente invención no presenta actividad triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3).
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención puede caracterizarse usando los criterios siguientes:
(i)
la enzima posee actividad acil transferasa que puede definirse como actividad de transferencia de éster mediante la cual la parte acilo de un enlace éster original de un donante de acilo lipídico se transfiere a uno o más de un carbohidrato, proteína, subunidad de proteína o hidroxi ácido aceptores de acilo para formar un nuevo éster, es decir, un éster de carbohidrato y/o un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína y/o un éster de hidroxi ácido; y
(ii)
la enzima comprende el resto de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos de aminoácido siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
Preferiblemente, X del resto GDSX es L. Así, preferiblemente, la enzima según la presente invención comprende el resto de secuencia de aminoácidos GSDL.
El resto GDSX está comprendido por cuatro aminoácidos conservados. Preferiblemente, la serina en el resto es una serina catalítica de la enzima lípido aciltransferasa. Adecuadamente, la serina del resto GDSX puede estar en una posición correspondiente a Ser-16 en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila enseñada en Brumlik y Buckley (Journal of Bacteriology abr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064).
Para determinar si una proteína tiene el resto GDSX según la presente invención, la secuencia se compara preferiblemente con los perfiles del modelo oculto de markov (perfiles HMM) de la base de datos pfam.
Pfam es una base de datos de familias de dominios de proteínas. Pfam contiene alineamientos de secuencia múltiples curados para cada familia así como modelos de perfiles ocultos de Markov (perfil HMM) para identificar estos dominios en nuevas secuencias. Una introducción a Pfam puede encontrarse en Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280. Los modelos ocultos de Markov se usan en varias bases de datos que tienen como objetivo clasificar proteínas, para revisión véase Bateman A y Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids =12230032&dopt=Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids =11752314&dopt=Abstract
Para una explicación detallada de los modelos ocultos de Markov y cómo se aplican en la base de datos Pfam véase Durbin R, Eddy S, y Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. El paquete de software Hammer puede obtenerse en Washington University, St Louis, EEUU.
Alternativamente, el resto GDSX puede identificarse usando el paquete de software Hammer, las instrucciones se proporcionan en Durbin R, Eddy S, y Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 y las referencias citadas en ésta, y el perfil HMMER2 proporcionado en esta especificación.
Se puede acceder a la base de datos PFAM, por ejemplo, a través de varios servidores que están actualmente localizados en los sitios de la red siguientes. http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml http://pfam.wustl.edu/ http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/ La base de datos ofrece un motor de búsqueda en el que se puede introducir una secuencia de proteína. Usando los parámetros por defecto de la base de datos la secuencia de la proteína se analizará para la presencia de dominios Pfam. El dominio GDSX es un dominio establecido en la base de datos y como tal su presencia se reconocerá en cualquier secuencia consultada. La base de datos devolverá el alineamiento de la secuencia consenso Pfam00657 con la secuencia consultada.
Un alineamiento múltiple, incluyendo Aeromonas salmonicida o Aeromonas hydrophila puede obtenerse: a) manualmente obtener un alineamiento de la proteína de interés con la secuencia consenso Pfam00657 y obtener un alineamiento
de P10480 con la secuencia consenso Pfam00657 siguiendo el procedimiento descrito anteriormente; O b) a través de la base de datos Después de identificar la secuencia consenso Pfam00657 la base de datos ofrece la opción de mostrar un
alineamiento de la secuencia consultada con el alineamiento de siembra de la secuencia consenso Pfam00657. P10480 es parte de este alineamiento de siembra y se indica por GCAT_AERHY. Tanto la secuencia consultada como P10480 se mostrarán en la misma ventana.
La secuencia de referencia de Aeromonas hydrophila: Los residuos de lipasa GDSX de Aeromonas hydrophila están numerados en el archivo P10480 de NCBI, los números en este texto se refieren a los números proporcionados en ese archivo que en la presente invención se usa
para determinar residuos de aminoácidos específicos que, en una realización preferida, están presentes en las enzimas lípido aciltransferasas de la invención. Se realizó el alineamiento Pfam (Figura 33 y 34): Pueden reconocerse los residuos conservados siguientes y en una realización preferible pueden estar presentes en
las enzimas para uso en las composiciones y métodos de la invención; Bloque 1 - bloque GDSX
Bloque 2 - bloque GANDY
Bloque 3 - bloque HPT
En el que "hid" significa un residuo hidrofóbico seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa para uso en las composiciones/métodos de la invención puede alinearse usando la secuencia consenso Pfam00657.
Preferiblemente, una concordancia positiva con el perfil del modelo oculto de markov (perfil HMM) de la familia de dominio pfam00657 indica la presencia del dominio GDSL o GDSX según la presente invención.
Preferiblemente, cuando se alinea con la secuencia consenso Pfam00657 la lípido aciltransferasa para uso en las composiciones/métodos de la invención tiene al menos uno, preferiblemente más de uno, preferiblemente más de dos, de lo siguiente, un bloque GDSx, un bloque GANDY, un bloque HPT. Adecuadamente, la lípido aciltransferasa puede tener un bloque GDSx y un bloque GANDY. Alternativamente, la enzima puede tener un bloque GDSx y un bloque HPT. Preferiblemente, la enzima comprende al menos un bloque GDSx.
Preferiblemente, cuando se alinea con la secuencia consenso Pfam00657 la enzima para uso en las composiciones/métodos de la invención tiene al menos uno, preferiblemente más de uno, preferiblemente más de dos, preferiblemente más de tres, preferiblemente más de cuatro, preferiblemente más de cinco, preferiblemente más de seis, preferiblemente más de siete, preferiblemente más de ocho, preferiblemente más de nueve, preferiblemente más de diez, preferiblemente más de once, preferiblemente más de doce, preferiblemente más de trece, preferiblemente más de catorce, de los residuos de aminoácido siguientes cuando se compara con la secuencia de polipéptido de referencia de A.hydrophilia, concretamente SEQ ID No. 32: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His
El dominio GDSX de pfam00657 es un identificador único que distingue proteínas que poseen este dominio de otras enzimas.
La secuencia consenso pfam00657 se presenta en la Figura 1 como SEQ ID No. 1. Ésta deriva de la identificación de la familia pfam 00657, versión 6 de la base de datos, que también puede referirse como pfam00657.6 en la presente memoria.
La secuencia consenso puede actualizarse usando versiones adicionales de la base de datos pfam.
Por ejemplo, las Figuras 33 y 34 muestran el alineamiento pfam de la familia 00657, de la versión 11 de la base de datos, que también puede referirse como pfam00657.11 en la presente memoria.
La presencia de los bloques GDSx, GANDY y HPT se encuentra en la familia pfam 00657 en ambas versiones de la base de datos. Pueden usarse versiones adicionales de la base de datos pfam para identificar la familia pfam 00657.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención puede caracterizarse usando los criterios siguientes:
(i)
la enzima posee actividad acil transferasa que puede definirse como actividad de transferencia de éster mediante la cual la parte acilo de un enlace éster original de un donante de acilo lipídico se transfiere a uno o más de un carbohidrato, proteína, subunidad de proteína o hidroxi ácido aceptores de acilo para formar un nuevo éster, es decir, un éster de carbohidrato y/o un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína y/o un éster de hidroxi ácido;
(ii)
la enzima comprende el resto de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos de aminoácido siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.;
(iii) la enzima comprende His-309 o comprende un residuo de histidina en una posición correspondiente a His-309 en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada en la Figura 2 (SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32).
Preferiblemente, el residuo de aminoácido del resto GDSX es L.
En SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32 los primeros 18 residuos de aminoácidos forman una secuencia señal. His-309 de la secuencia de longitud completa, que es la proteína que incluye la secuencia señal, es igual a His-291 de la parte madura de la proteína, es decir, la secuencia sin la secuencia señal.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención comprende la triada catalítica siguiente: Ser-34, Asp-134 e His-309 o comprende un residuo de serina, un residuo de ácido aspártico y un residuo de histidina, respectivamente, en las posiciones correspondientes a Ser-34, Asp-134 e His-309 en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophile mostrada en la Figura 2 (SEQ ID No. 2) o Figura 28 (SEQ ID No. 32). Como se ha indicado anteriormente, en la secuencia mostrada en SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32 los primeros 18 residuos de aminoácidos forman una secuencia señal. Ser-34, Asp-134 e His-309 de la secuencia de longitud completa, que es la proteína que incluye la secuencia señal, son iguales a Ser-16, Asp-116 e His-291 de la parte madura de la proteína, es decir, la secuencia sin la secuencia señal. En la secuencia consenso pfam00657, como se proporciona en la Figura 1 (SEQ ID No. 1), los residuos del sitio activo corresponden a Ser-7, Asp-157 e His-348.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención puede caracterizarse usando los criterios siguientes:
(i) la enzima posee actividad acil transferasa que puede definirse como actividad de transferencia de éster mediante la cual la parte acilo de un enlace éster original de un primer donante de acilo lipídico se transfiere a uno o más de un carbohidrato, proteína, subunidad de proteína o hidroxi ácido aceptores de acilo para formar un nuevo éster, es decir, un éster de carbohidrato y/o un éster de proteína y/o un éster de subunidad de proteína y/o un éster de hidroxi ácido; y
(ii) la enzima comprende al menos Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 e His-309 o comprende residuos de glicina, ácido aspártico, serina, ácido aspártico e histidina en posiciones correspondientes a Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp134 e His-309, respectivamente, en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada en la Figura 2 (SEQ ID No. 2) o Figura 28 (SEQ ID No. 32).
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención puede obtenerse, preferiblemente se obtiene, de organismos de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención puede obtenerse, preferiblemente se obtiene, de uno o más de los organismos siguientes: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis y Candida parapsilosis.
En un aspecto, preferiblemente la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención puede obtenerse, preferiblemente se obtiene, de uno o más de Aeromonas hydrophila o Aeromonas salmonicida.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes:
(i)
la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2 (véase la Figura 2)
(ii)
la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3 (véase la Figura 3)
(iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4 (véase la Figura 4)
(iv)
la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 5 (véase la Figura 5)
(v)
la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6 (véase la Figura 6)
(vi)
la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12 (véase la Figura 14)
(vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20 (Figura 16)
(viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22 (Figura 18)
(ix)
la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24 (Figura 20)
(x)
la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26 (Figura 22)
(xi)
la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28 (Figura 24)
(xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30 (Figura 26)
(xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32 (Figura 28)
(xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34 (Figura 30) o
una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, o SEQ ID No. 34.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención comprende bien la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2 o como SEQ ID No. 3 o (SEQ ID No. 32 o SEQ ID No. 34 o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más, preferiblemente 80% o más, preferiblemente 85% o más, preferiblemente 90% o más, preferiblemente 95% o más, de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ, ID No. 2 o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3 o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32 o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34.
Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad se basa en el número de elementos de la secuencia que son iguales. El grado de identidad según la presente invención puede determinarse adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica, tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman y Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443
45) usando los ajustes siguientes para comparación de secuencia de polipéptido: penalización por la creación de GAP (hueco) de 3,0 y penalización por la extensión de GAP (hueco) de 0,1.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más y aún más preferiblemente 95% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, o SEQ ID No. 34.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes:
(a)
una secuencia de aminoácidos mostrada como residuos de aminoácidos 1-100 de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32;
(b)
una secuencia de aminoácidos mostrada como residuos de aminoácidos 101-200 de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32;
(c)
una secuencia de aminoácidos mostrada como residuos de aminoácidos 201-300 de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32; o
(d)
una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, aún más preferiblemente 95% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas en (a)-(c) anteriormente.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes:
(a)
una secuencia de aminoácidos mostrada como residuos de aminoácidos 28-39 de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32;
(b)
una secuencia de aminoácidos mostrada como residuos de aminoácidos 77-88 de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32;
(c)
una secuencia de aminoácidos mostrada como residuos de aminoácidos 126-136 de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32;
(d)
una secuencia de aminoácidos mostrada como residuos de aminoácidos 163-175 de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32;
(e)
una secuencia de aminoácidos mostrada como residuos de aminoácidos 304-311 de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32; o
(f)
una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, aún más preferiblemente 95% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas en (a)-(e) anteriormente.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención puede comprender una secuencia de aminoácidos producida por la expresión de una o más de las secuencias de nucleótidos siguientes:
(a)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 7 (véase la Figura 9);
(b)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 8 (véase la Figura 10);
(c)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 9 (véase la Figura 11);
(d)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 10 (véase la Figura 12);
(e)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 11 (véase la Figura 13);
(f)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 13 (véase la Figura 15);
(g)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 (véase la Figura 17);
(h)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 (véase la Figura 19);
(i)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 (véase la Figura 21);
(j)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27 (véase la Figura 23);
(k)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29 (véase la Figura 25);
(l)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 (véase la Figura 27);
(m)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 33 (véase la Figura 29);
(n)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 35 (véase la Figura 31);
(o)
o
una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35.
Adecuadamente, la secuencia de nucleótidos puede tener 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más y aún más preferiblemente 95% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35.
En un aspecto, la lípido aciltransferasa según la presente invención puede ser una lecitina:colesterol aciltransferasas (LCAT) o variante de ésta (por ejemplo, una variante hecha por evolución molecular)
Las LCAT adecuadas se conocen en la técnica y pueden obtenerse a partir de uno o más de los organismos siguientes por ejemplo: mamíferos, rata, ratones, pollos, Drosophila melanogaster, plantas, incluyendo Arabidopsis y Oryza sativa, nematodos, hongos y levadura.
En una realización, la enzima lípido aciltransferasa según la presente invención puede ser la lípido aciltransferasa que puede obtenerse, preferiblemente se obtiene, de las cepas de E. coli TOP 10 que portan pPet12aAhydro y pPet12aASalmo depositadas por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001 Copenhague K, Dinamarca bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos del Procedimiento de Patentes en la National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Escocia, GB el 22 de diciembre 2003 con los números de registro NICMB 41204 y NCIMB 41205, respectivamente.
El término "transferasa" tal y como se usa en la presente memoria es intercambiable con el término "lípido aciltransferasa".
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria cataliza una o ambas de las reacciones siguientes: transesterificación, alcoholisis.
Así, según la presente invención, pueden conseguirse una o más de las propiedades ventajosas siguientes: la bioconversión de lípidos para formar uno o más de un éster de carbohidrato, un éster de proteína, un éster de subunidad de proteína o un éster de hidroxi ácido puede tener lugar en un entorno con alto contenido en agua que no comprende disolvente orgánico o una cantidad reducida de disolvente orgánico comparado con los procesos de bioconversión convencionales.
El término "bioconversión" tal y como se usa en la presente memoria significa la modificación de un compuesto orgánico para producir otro compuesto orgánico y/o la síntesis de compuestos orgánicos a partir de otros compuestos orgánicos por catálisis enzimática.
El término "transesterificación" tal y como se usa en la presente memoria significa la transferencia catalizada por enzima de un grupo acilo de un donante lipídico (distinto de un ácido graso libre) a un aceptor de acilo (distinto de agua). Para evitar dudas, el uso del término "transesterificación" tal y como se usa en la presente memoria incluye la transferencia de un grupo acilo de un donante lipídico a un aceptor de acilo (distinto de agua) en el que el aceptor de acilo comprende un grupo químico adecuado, que puede ser por ejemplo bien un grupo -OH o -SH.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "alcoholisis" se refiere a la escisión enzimática de un enlace covalente de un derivado de ácido por reacción con un grupo alcohol ROH de manera que uno de los productos se combina con el H del grupo alcohol y el otro producto se combina con el grupo OR del grupo alcohol.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "hidrólisis" se refiere a la transferencia catalizada por enzima de un grupo acilo de un lípido al grupo OH de una molécula de agua. La transferencia de acilo que resulta de la hidrólisis requiere la separación de la molécula de agua.
El término "interesterificación" se refiere a la transferencia catalizada por enzima de grupos acilo entre un donante lipídico y aceptor lipídico, en el que el donante lipídico no es un grupo acilo libre. En otras palabras, "interesterificación" se refiere al intercambio de un ácido graso entre dos moléculas de lípido.
En un aspecto, la lípido acil transferasa como se define en la presente memoria cataliza interesterificación.
Adecuadamente, el método o uso según la presente invención puede comprender además una o más de las etapas siguientes: disolver el aceptor de acilo en agua; añadir un donante de acilo lipídico a un aceptor de acilo disuelto para formar un sistema de dos fases o una emulsión; agitar o sonicar la mezcla de reacción; calentar la mezcla de reacción, por ejemplo para desnaturalizar la enzima; separar la fase de agua de la fase de grasa/emulsionante por técnicas de separación estándar, tal como extracción con disolvente o evaporación del agua por ejemplo; fraccionar la fase de grasa por cromatografía de interacción hidrofóbica, cristalización o destilación con alto vacío. Adecuadamente, una o más de las etapas de calentamiento, separación o fraccionamiento pueden realizarse después de que la reacción haya alcanzado el equilibrio.
En una realización, la lipasa acil transferasa para uso en los métodos de la presente invención puede inmovilizarse. Cuando se da el caso de que la enzima está inmovilizada, la mezcla que comprende un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua se pasa a través de una columna por ejemplo que comprende la enzima inmovilizada. Mediante la inmovilización de la enzima, es posible reusarla fácilmente.
Adecuadamente, la enzima inmovilizada puede usarse en un reactor de flujo o en un reactor discontinuo que contiene una mezcla de reacción que comprende un aceptor de acilo disuelto en agua y un donante de acilo lipídico como un sistema de dos fases o como una emulsión. La mezcla de reacción puede agitarse o sonicarse opcionalmente. Una vez que la reacción ha alcanzado el equilibrio por ejemplo, la mezcla de reacción y la enzima inmovilizada pueden separarse. Adecuadamente, el producto de la reacción puede fraccionarse por ejemplo por cromatografía de interacción hidrofóbica, cristalización o destilación con alto vacío.
La lípido acil transferasa inmovilizada puede prepararse usando técnicas de inmovilización conocidas en la técnica. Existen numerosos métodos para preparar enzimas inmovilizadas, que serán evidentes para un experto en la técnica (por ejemplo, las técnicas referidas en EP 0 746 608; o Balcao V.M., Paiva A.L., Malcata F.X., Enzyme Microb Technol. 1996 mayo 1;18(6):392-416; o Retz M.T., Jaeger K.E. Chem Phys Lipids. 1998 junio;93(1-2):3-14; Bornscheuer U.T., Bessler C, Srinivas R, Krishna S.H. Trends Biotechnol. 2002 oct; 20(10):433-7; Plou et al, J. Biotechnology 92 (2002) 55-66; Warmuth et al., 1992. Bio Forum 9, 282-283; Ferrer et al., 2000. J. Chem. Technol. Biotechnol. 75, 1-8; o Christensen et al., 1998. Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105; Petersen y Christenen, 2000, Applied Biocatalysis. Harwood Academic Publishers, Amsterdam. Las técnicas que pueden usarse en la presente memoria incluyen acoplamiento covalente a Eupergit C, adsorción en polipropileno y granulación en sílice por ejemplo.
El término "entorno con alto contenido en agua" tal y como se usa en la presente memoria significa preferiblemente un entorno que tiene un contenido bajo o ausente de disolvente orgánico, preferiblemente con un contenido bajo o ausente de un disolvente orgánico polar. El término disolvente orgánico tal y como se usa en la presente memoria no engloba preferiblemente aceites alimenticios cuando se usa como sustrato lipídico, y no engloba preferiblemente aceites alimenticios que tienen un contenido alto de lípidos no polares por ejemplo. Adecuadamente, el entorno con alto contenido en agua según la presente invención puede comprender menos de 50% en volumen de disolventes orgánicos, menos de 30% en volumen de disolventes orgánicos, más preferiblemente menos de 15% en volumen de disolventes orgánicos, más preferiblemente menos de 5%, más preferiblemente menos de 1%, más preferiblemente menos de 0,5% en volumen de disolvente orgánico, más preferiblemente 0% en volumen de disolventes orgánicos.
Cuando se da el caso de que se produce un éster de carbohidrato según la presente invención, el éster de carbohidrato es preferiblemente un éster de oligosacárido, un éster de monosacárido o un éster de disacárido.
Adecuadamente, el éster de carbohidrato cuando se produce según la presente invención puede ser uno o más de lo siguiente: éster de glucosa, éster de fructosa, éster de anhidrofructosa, éster de maltosa, éster de lactosa, éster de galactosa, éster de xilosa, éster de xilooligosacárido, éster de arabinosa, éster de maltooligosacárido, éster de tagatosa, éster de sacarosa, éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T o éster de cortalcerona.
Preferiblemente, el éster de carbohidrato cuando se produce según la presente invención es uno o más de lo siguiente: un mono-éster de carbohidrato, un mono-éster de azúcar, un mono-éster de oligosacárido, un mono-éster de trisacárido, un mono-éster de disacárido, un mono-éster de monosacárido, un mono-éster de glucosa, un monoéster de fructosa, un mono-éster de anhidrofructosa, un mono-éster de maltosa, un mono-éster de lactosa, un monoéster de galactosa, un mono-éster de xilosa, un mono-éster de xilooligosacárido, un mono-éster de arabinosa, monoéster de maltooligosacárido, mono-éster de tagatosa, mono-éster de sacarosa, éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T o éster de cortalcerona.
En una realización, el éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T y/o éster de cortalcerona puede funcionar como un agente antimicrobiano. Alternativamente o además de esto, el éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T y/o éster de cortalcerona puede funcionar como uno o ambos de un antioxidante y/o emulsionante.
Preferiblemente, la formación del éster de carbohidrato (si existe) según la presente invención es independiente de UDP-glucosa.
Preferiblemente, el producto alimenticio según la presente invención no comprende UDP-glucosa, o sólo comprende UDP-glucosa en cantidades insignificantes.
Se ha encontrado que las lípido aciltransferasas usadas en los métodos de la invención tienen propiedades únicas cuando se comparan con enzimas lipolíticas ya que tienen una referencia marcada para transferir grupos acilo de lípidos a aceptores distintos del agua, incluso en presencia de agua significativa. En una comparación con enzimas de la técnica anterior, se encontró que la lípido acil transferasa usada en la invención tiene una actividad transferasa relativa alta en presencia de 6% de agua, 54% de agua, 73% de agua, 89% de agua y aproximadamente 95%. Las enzimas lipolíticas ensayadas no tenían virtualmente actividad transferasa relativa significativa a estas concentraciones de agua.
El % de actividad transferasa (es decir, la actividad transferasa como un porcentaje de la actividad enzimática total) puede determinarse por el protocolo siguiente:
Protocolo para la determinación del % de actividad aciltransferasa:
Un sustrato al que se ha añadido una lípido aciltransferasa según la presente invención puede extraerse después de la reacción enzimática con CHCl3:CH3OH 2:1 y la fase orgánica que contiene el material lipídico se aísla y analiza por GLC y HPLC según el procedimiento detallado más adelante en la presente memoria. A partir de los análisis de GLC y HPLC se determina la cantidad de ácidos grasos libres y uno o más de ésteres de carbohidrato, ésteres de proteína; ésteres de subunidad de proteína; ésteres de hidroxi ácido. Un sustrato control al que no se ha añadido enzima según la presente invención se analiza de la misma manera.
Cálculos:
A partir de los resultados de los análisis de GLC y HPLC, puede calcularse el incremento en ácidos grasos libres y ésteres de carbohidrato y/o ésteres de proteína y/o ésteres de subunidad de proteína y/o ésteres de hidroxi ácido:
 % ácido graso= % Ácido graso (enzima) - % ácido graso (control); Mv ácido graso= peso molecular promedio de los ácidos grasos;
A=  % éster de proteína/Mv éster de proteína (en el que  % éster de proteína= % éster de proteína (enzima) - % éster de proteína (control) y Mv éster de proteína= peso molecular promedio de los ésteres de proteína) - aplicable cuando el aceptor de acilo es una proteína;
B=  % éster de carbohidrato/Mv éster de carbohidrato (en el que  % éster de carbohidrato= % éster de carbohidrato (enzima) - % éster de carbohidrato (control) y Mv éster de carbohidrato= peso molecular promedio del éster de carbohidrato) - aplicable cuando el aceptor de acilo es un carbohidrato;
C=  % éster de subunidad de proteína/Mv éster de subunidad de proteína (en el que  % éster de subunidad de proteína= % éster de subunidad de proteína (enzima) - % éster de subunidad de proteína (control) y Mv éster de subunidad de proteína= peso molecular promedio del éster de subunidad de proteína) - aplicable cuando el aceptor de acilo es una subunidad de proteína; y
D=  % éster de hidroxi ácido/Mv éster de hidroxi ácido (en el que  % éster de hidroxi ácido= % éster de hidroxi ácido (enzima) - % éster de hidroxi ácido (control) y Mv éster de hidroxi ácido= peso molecular promedio del éster de hidroxi ácido) - aplicable cuando el aceptor de acilo es un hidroxi ácido.
La actividad transferasa se calcula como un porcentaje de la actividad enzimática total:
* - borrar según sea apropiado.
La actividad lipasa y aciltransferasa de una enzima puede evaluarse usando los ensayos siguientes. De esta manera, puede obtenerse/identificarse una lípido aciltransferasa que tiene las características enzimáticas definidas en la presente memoria.
Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado (véase el Ejemplo 6)
Las enzimas que funcionan como lípido aciltransferasas para uso en los métodos de la invención pueden identificarse rutinariamente usando el ensayo enseñado en la presente memoria en el Ejemplo 6. Este ensayo se referirá de aquí en adelante en la presente memoria como el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado. En el Ejemplo 6 la enzima lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida según la presente invención se analizó y comparó con un rango de enzimas lipolíticas no englobadas por la presente invención. Como puede observarse, de
las enzimas lipolíticas se encontró que sólo LIPOPAN® F (Novozymes, Dinamarca) tiene alguna actividad transferasa y sólo un nivel muy bajo (1,3%).
Las enzimas adecuadas para uso en los métodos de la invención pueden identificarse rutinariamente usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado. Usando este ensayo, en el que hay un contenido muy alto de agua aproximadamente 95%, las lípido aciltransferasas según la presente invención son aquellas que tienen al menos 2% de actividad aciltransferasa (actividad transferasa relativa), preferiblemente al menos 5% de actividad transferasa relativa, preferiblemente al menos 10% de actividad transferasa relativa, preferiblemente al menos 15%, 20%, 25% 26%, 28%, 30%, 40% 50%, 60% ó 75% de actividad transferasa relativa. Adecuadamente, la lípido aciltransferasa según la presente invención puede tener menos de 28%, menos de 30%, preferiblemente menos de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% de actividad aciltransferasa.
Ensayo Transferasa en un Entorno con Bajo Contenido en Agua
Como una alternativa a (o además de) usar el "Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado", las lípido aciltransferasas para uso según la presente invención pueden identificarse usando el "Ensayo Transferasa en un Entorno con Bajo Contenido en Agua".
Con el fin de determinar si una enzima es una lípido aciltransferasa según la presente invención, se puede realizar un "Ensayo Transferasa en un Entorno con Bajo Contenido en Agua", concretamente en un entorno graso con 6% de agua como se enseña en el Ejemplo 9. Este ejemplo ilustra que en un entorno graso con un contenido de agua del 6% la lípido aciltransferasa de la invención tiene una actividad transferasa relativa alta, en el que las enzimas lipolíticas de la técnica anterior tienen actividad hidrolítica.
En una realización, la lípido aciltransferasa adecuada para uso en los métodos y/o usos según la presente invención es una que cuando se ensaya usando el "Ensayo Transferasa en un Entorno con Bajo Contenido en Agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado de 30, 20 ó 120 minutos, tiene una actividad transferasa relativa de al menos 1%, preferiblemente al menos 2%, preferiblemente al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 75%. Adecuadamente, la lípido acil transferasa según la presente invención puede tener menos de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ó 80% de actividad cuando se mide después de un periodo de tiempo de 10, 20, 30 ó 120 minutos usando el "Ensayo Transferasa en un Entorno con Bajo Contenido en Agua".
Como se ha descrito anteriormente, la lipasa aciltransferasa de la invención puede identificarse usando bien el "Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado" o en el "Ensayo Transferasa en Entorno con Bajo Contenido en Agua" usando colesterol como el aceptor de acilo. Por supuesto, el experto en la técnica se dará cuenta fácilmente de que, con modificaciones obvias de los métodos analíticos el "Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado" o el "Ensayo Transferasa en Entorno con Bajo Contenido en Agua" pueden usarse para determinar la actividad lípido aciltransferasa para cualquier combinación de donante de acilo lipídico o cualquiera de aceptor de acilo. El experto en la técnica, si es necesario, reemplazará simplemente el sustrato donante de acilo (por ejemplo, fosfolípido) con un sustrato donante de acilo alternativo (por ejemplo, glicolípido, triacilglicérido) y/o reemplazará el aceptor de acilo (por ejemplo, colesterol) con un sustrato aceptor de acilo alternativo (por ejemplo, un carbohidrato, una proteína, una subunidad de proteína o un hidroxi ácido) (por ejemplo véanse los Ejemplos 10-13).
El término "entorno con alto contenido en agua" tal y como se usa en la presente memoria significa cualquier entorno que comprende 5-98% de agua. Preferiblemente, el entorno comprende más de 6% de contenido en agua, preferiblemente más de 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90%. Adecuadamente, el entorno con alto contenido en agua puede estar comprendido por 20-98%, adecuadamente 50-98%, adecuadamente por 70-98%, adecuadamente 75-98% de agua.
En una realización, en la mezcla la proporción de la cantidad de lípido aciltransferasa añadida comparada con el agua es al menos 1:700, preferiblemente 1:10.000, según se mide en peso.
El término "bajo contenido en agua" tal y como se usa en la presente memoria significa cualquier sustrato o producto alimenticio con menos de 5% de contenido en agua, preferiblemente menos de 4%, 3%, 2%, 1% ó 0,5%.
Preferiblemente, el método y/o uso según la presente invención puede realizarse a una temperatura de 15-60°C, preferiblemente a una temperatura de 20-60°C, preferiblemente 20-50°C, preferiblemente 20-45°C, preferiblemente 20-40°C.
Adecuadamente, el método o uso según la presente invención comprende una etapa adicional de purificar y/o aislar el producto de la reacción, concretamente uno o más de un éster de carbohidrato, un éster de proteína, un éster de subunidad de proteína o un éster de hidroxi ácido. Así, preferiblemente el producto de la reacción está en una forma purificada y/o aislada.
El experto en la técnica conoce numerosos métodos para la purificación de ésteres. Sólo como ejemplo, los ésteres producidos por los métodos/usos enseñados en la presente memoria peden purificarse usando cromatografía, tal
como de interacción hidrofóbica, filtración, centrifugación, extracción con disolvente/destilación o cristalización. Las metodologías adecuadas se enseñan en Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA.
La lípido acil-transferasa de la invención puede expresarse en cualquier huésped de expresión adecuado. Por ejemplo, la lípido aciltransferasa de la invención puede expresarse en Bacillus subtilis y puede purificarse por ultrafiltración y/o por precipitación en etanol y/o centrifugación, y puede secarse por pulverización posteriormente usando almidón (maltodextrina) como vehículo para la enzima. La enzima secada por pulverización puede estandarizarse para una actividad especificada PLU añadiendo vehículo adicional en forma de polvo. Las técnicas implicadas están bien establecidas y son rutinarias en la técnica.
En una realización, el método según la presente invención es un proceso in vitro. El método puede ser adecuadamente un proceso continuo o discontinuo.
La enzima según la presente invención puede usarse en combinación con una o más enzimas adicionales. Así, está en el alcance de la presente invención que, además de la enzima de la invención, la mezcla se pone en contacto con al menos una enzima adicional. Dichas enzimas adicionales incluyen enzimas degradadoras de almidón tales como endo-o exoamilasas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas incluyendo xilanasas, celulasas, oxidoreductasas, por ejemplo, glucosa oxidasa o una carbohidrato oxidasa tal como una que oxida maltosa, por ejemplo, hexosa oxidasa (HOX), lipasas fosfolipasas y hexosa oxidasa, y proteasas. La mezcla puede ponerse en contacto con la enzima de la invención y la al menos una enzima adicional al mismo tiempo o secuencialmente.
En una realización, por ejemplo, la lípido aciltransferasa puede usarse en combinación con una lipasa que tiene una
o más de las actividades lipasa siguientes: actividad glicolipasa (E.C. 3.1.1.26), actividad triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3), actividad fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) o actividad fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32). Las enzimas lipasa adecuadas son muy conocidas en la técnica e incluyen como ejemplo las lipasas siguientes: LIPOPAN® F y/o LECITASE®ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca), fosfolipasa A2 (por ejemplo, fosfolipasa A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts, LIPOMAX™ de Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Dinamarca), las lipasas enseñadas en WO03/97835, EP 0 977 869 o EP 1 193 314.
USOS
Así, los métodos según la presente invención producen uno o más de un éster de carbohidrato, un éster de proteína, un éster de subunidad de proteína, un éster de hidroxiácido. Muchos de estos ésteres son emulsionantes útiles. Sólo como ejemplo los ésteres de aminoácido, ésteres de péptido, ésteres de proteína, ésteres de carbohidrato y ésteres de hidroxi ácido (tal como ésteres de ácido tartárico) por ejemplo son emulsionantes funcionalmente importantes. Los emulsionantes son útiles en un amplio rango de industrias, tal como la industria alimentaria, la industria de piensos, la industria de cosméticos (por ejemplo, en bases de cosmético), la industria farmacéutica (tanto en la síntesis como formulación farmacéutica, por ejemplo) y en la industria de pinturas por ejemplo. Los emulsionantes pueden funcionar como agentes humectantes, ingredientes alimenticios e ingredientes activos.
Además, los condensados de proteína ácido graso, debido a sus excelentes propiedades fisiológicas, son adecuados para uso en cosméticos y productos de higiene personal por ejemplo. Por ejemplo, los ésteres de proteína pueden usarse en preparaciones de ducha y baño así como en champúes y limpiadores corporales. Los condensados de proteína ácido graso también pueden ser útiles en composiciones farmacéuticas, por ejemplo como una base.
Los condensados de proteína ácido graso son muy conocidos por su aplicación en la industria cosmética. Convencionalmente, estos productos se producen haciendo reaccionar hidrolizado de proteína con cloruro de ácido graso en condiciones Schotten-Baumann, usando agua como disolvente
(http://www.scf-online.com/english/26 e/rawmaterials26 e .htm#5).
En el desarrollo de los condensados de proteína-ácido graso es posible combinar los recursos renovables de ácidos grasos (de aceite vegetal) y proteína, que puede obtenerse tanto de desecho animal (cuero) como de muchas plantas, para construir una estructura de tensioactivo con una parte hidrofóbica (ácido graso) y una parte hidrofílica (proteína). En este proceso, el cloruro de ácido graso reacciona con el grupo amino del aminoácido y forma el condensado de proteína ácido graso (Véase la Figura 49). Se obtienen productos que tienen una excelente compatibilidad con la piel y además tienen un buen efecto limpiador.
El hecho de que incluso pequeñas adiciones del hidrolizado de proteína acilado tenga un efecto sinérgico en la compatibilidad con la piel de otros tensioactivos es muy importante desde el punto de vista de una formulación técnica. Una explicación para este efecto protector podría residir en el comportamiento anfotérico del producto. Existe una interacción entre el condensado proteína-ácido graso y el colágeno de la piel. Esto da lugar a la formación de una capa protectora, que reduce el ataque excesivo de los tensioactivos sobre las capas superiores de la piel, su efecto desgrasante fuerte y la interacción directa de los tensioactivos aniónicos con la piel.
En la rama cosmética, los tensioactivos basados en proteína se usan principalmente en productos suaves de ducha y baño, champúes suaves, limpiadores faciales basados en tensioactivos, preparaciones de onda fría y fijadores o preparaciones de tensioactivos para bebés.
Los condensados de hidrolizado de proteína ácido graso también son útiles como bases para preparaciones farmacéuticas, por ejemplo para cremas y pomadas que contienen ingredientes activos para la aplicación tópica en la piel.
La presente invención proporciona una nueva manera de producir condensado de proteína ácido graso sin usar cloruro de ácido graso. La reacción según la presente invención se representa en la Figura 50. Esta reacción puede realizarse en agua o sistema de tampón a baja temperatura sin la formación de productos de desecho.
El término "condensado de proteína ácido graso" tal y como se usa en la presente memoria engloba todos los siguientes ésteres de proteína, ésteres de polipéptido, ésteres de dipéptido, ésteres de oligopéptido, ésteres de péptido y ésteres de aminoácido.
Como sabrá fácilmente un experto en la técnica, los ésteres de carbohidrato (particularmente ésteres de azúcar) tienen una aplicación amplia en la industria alimentaria. Otros campos de aplicación incluyen cosméticos, productos de cuidado oral y suministros médicos. Además, estos compuestos pueden usarse como antibióticos, antitumorales, fungicidas e insecticidas. La lípido aciltransferasa según la presente invención es capaz de catalizar la formación de éster de glucosa en un entorno con alto contenido en agua (Figura 51).
Los ésteres producidos según la presente invención encuentran aplicación en los campos siguientes:
Cosméticos: incluyendo emulsiones en aceite esenciales (o/w, HLB 16-18) Emulsiones en aceite de parafina, o/w, HLB 10 - 14; Emulsiones de ácido esteárico; Emulsiones de cera, o/w, HLB 14-16; Emulsiones de lanolina, o/w, HLB 12 -14; Emulsiones de silicona; Pastas de dientes, o/w; Espumas de baño, o/w, HLB 14 - 18; Loción Capilar.
Preparaciones Farmacéuticas: incluyendo en emulsiones de fármaco; bases de pomada; compuesto supositorio, w/o; encapsulación; preparación de inyección.
Agricultura: incluyendo en mejora de suelo; como un aditivo de fertilizante; como limpiadores multiuso; limpiadores para frutas y verduras; limpiadores para lecheras.
Protección de Cultivos: incluyendo en insecticidas naturales; hidrocarburos clorados, y 140; ésteres de ácido fosfórico o/w, HLB 10-14; fungicidas, o/w; herbicidas, o/w.
Industria Alimentaria: incluyendo en pan y bollos; margarina; chocolate; prevención de aparición de grasa, w/o, HLB 5-10; glaseado de azúcar, o/w, HLB 14-16; ablandadores para caramelos y chicle, w/o, HLB. 2 - 4; prevención de pegajosidad, w/o, HLB 2 - 4; aditivos de helados w/o, HLB 4-6; humectantes de leche y levaduras en polvo, w/o, HLB 9 - 11; crema pastelera en polvo, w/o, HLB 2-4; en la industria de bebidas; en frutas y verduras; en saporíferos, w/o y o/w, HLB 10-12; en salsas para carne, ensalada u otras salsas de aderezo, o/w; en colorantes alimentarios, w/o, HLB 2 - 4; o/w, HLB 8 - 18; en inhibidores de la espuma.
El beneficio de usar ésteres de proteína ácido graso, ésteres de hidroxi ácido y ésteres de carbohidrato producidos según la presente invención como emulsionantes en aplicaciones alimentarias es que éstos son componentes compatibles con los alimentos inocuos que son más fácilmente biodegradables comparados con otros emulsionantes usados convencionalmente como ésteres de ácido graso etoxilado por ejemplo. Estos emulsionantes son así más respetuosos con el medioambiente para usar tanto en la industria alimentaria como en la industria no alimentaria.
En una realización, el éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T y/o éster de cortalcerona pueden funcionar como un agente antimicrobiano. Alternativamente o además de esto, el éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T y/o éster de cortalcerona pueden funcionar como uno o ambos de un antioxidante y/o emulsionante.
En una realización, los métodos o usos de la presente invención pueden usarse para producir emulsionantes para uso en formulaciones de fármaco, particularmente en la producción de formulaciones de liberación controlada de ingredientes activos, en el que el ingrediente activo se acila usando la lípido acil-transferasa. Dichas formulaciones de liberación lenta son particularmente útiles para composiciones farmacéuticas administradas oralmente, en las que la hidrólisis gradual del éster en el tracto digestivo proporciona la administración gradual del ingrediente activo. Dichas composiciones aciladas podrían usarse además para una formulación subcutánea o intravenosa.
En otra realización, los métodos o usos de la presente invención pueden usarse para producir catalizadores de transferencia de fase para transferir sales en una disolución de disolventes orgánicos por ejemplo en una reacción orgánica. Por ejemplo, la transferencia de un grupo acilo a un aceptor catiónico apropiado, tal como un hidroxi ácido (ácido cítrico), o alternativamente con un grupo aceptor aniónico, tal como hidroxi-aminas puede producir catalizadores de transferencia de fase para transferir sales en una disolución de disolventes orgánicos.
En otra realización, los métodos de la presente invención pueden usarse para producir profármacos éster de compuestos farmacéuticos con baja disponibilidad biológica y/o baja solubilidad, por ejemplo agentes antivirales como aciclovir y gangaciclovir. El método podría usarse además para otros compuestos medicinales con un grupo hidroxi libre, por ejemplo un grupo hidroxi primario, secundario o terciario.
Preferiblemente, el éster producido según la presente invención se usa en una formulación farmacéutica.
Preferiblemente, el éster producido según la presente invención se usa en un cosmético y/o producto de higiene personal.
Preferiblemente, el éster producido según la presente invención se usa en un producto alimenticio y/o producto de pienso.
El método según la presente invención puede ser una etapa en el proceso de fabricación de uno o más de un farmacéutico, un cosmético, un producto de higiene personal, un producto alimenticio o un producto de pienso.
VENTAJAS
Una ventaja del método según la presente invención es que resulta en la fabricación de un éster de carbohidrato sin la necesidad de usar disolventes orgánicos. Así, la presente invención permite el uso de reducir o eliminar los disolventes orgánicos. Esto tiene muchas ventajas, por ejemplo en costes de producción reducidos, exposición humana y/o medioambiental reducida a disolventes orgánicos, simplificación del proceso de producción.
En la producción de los ésteres para aplicaciones alimentarias, es particularmente ventajoso usar lípidos en lugar de ácidos grasos porque no es necesario eliminar el excedente de lípidos porque éstos pueden formar parte del producto alimenticio en el que se usa el producto de la reacción. Por otra parte, el excedente de ácidos grasos tendría que eliminarse porque éstos son perjudiciales para la mayor parte de los productos alimenticios.
AISLADO
En un aspecto, preferiblemente el polipéptido o proteína para uso en la presente invención está en una forma aislada. El término "aislado" significa que la secuencia carece sustancialmente de al menos un otro componente con el que la secuencia está asociado naturalmente en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza.
En un aspecto, preferiblemente el producto de bioconversión según la presente invención por ejemplo el éster de carbohidrato y/o el éster de proteína y/o el éster de subunidad de proteína y/o el éster de hidroxi ácido se aísla de la mezcla de reacción. El término "aislado" significa que el producto de bioconversión carece sustancialmente de al menos un otro componente con el que el producto de bioconversión está asociado durante la reacción de bioconversión.
PURIFICADO
En un aspecto, preferiblemente el polipéptido o proteína para uso en la presente invención está en una forma purificada. El término "purificado" significa que la secuencia está en un estado relativamente puro - por ejemplo, al menos aproximadamente 51 % puro, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% puro, o al menos aproximadamente 95% puro o al menos aproximadamente 98% puro.
En un aspecto, preferiblemente el producto de bioconversión producido según la presente invención, por ejemplo el éster de carbohidrato y/o el éster de proteína y/o el éster de subunidad de proteína y/o el éster de hidroxi ácido se purifica de la mezcla de reacción y está, por lo tanto, en una forma purificada. El término "purificado" significa que el producto de bioconversión está en un estado relativamente puro - por ejemplo, al menos aproximadamente 51% puro, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% puro, o al menos aproximadamente 95% puro o al menos aproximadamente 98% puro.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el producto de la presente invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable (incluyendo combinaciones de éstos).
Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso en seres humanos o animales en medicina humana y veterinaria y comprenderán típicamente uno cualquiera o más de un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son muy conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.
(A. R. Gennaro edit. 1985). La elección de un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse respecto a la ruta de administración pretendida y práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como - o además de - el vehículo, excipiente o diluyente cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) solubilizantes adecuados.
En la composición farmacéutica pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes saporíferos. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.
Pueden existir diferentes requerimientos de composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de administración. Como ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para ser administrada usando una mini bomba o por una ruta mucosal, por ejemplo, como un pulverizador o aerosol nasal para inhalación o disolución ingerible, o parenteralmente en la que la composición se formula por una forma inyectable, para administración, por ejemplo, por una ruta intravenosa, intramuscular o subcutánea. Alternativamente, la formulación puede diseñarse para administrarse por varias rutas.
Cuando el agente se va a administrar mucosalmente a través de la mucosa gastrointestinal, debe ser capaz de permanecer estable durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal; por ejemplo, debe ser resistente a la degradación proteolítica, estable a pH ácido y resistente a los efectos detergentes de la bilis.
Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inhalación, en la forma de un supositorio o pesario, tópicamente en la forma de una loción, disolución, crema, pomada o polvo con partículas, por el uso de un parche cutáneo, oralmente en la forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos bien solos o mezclados con excipientes, o en la forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes saporíferos o colorantes, o pueden inyectarse parenteralmente, por ejemplo intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente. Para administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en la forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, sales o monosacáridos suficientes para hacer que la disolución sea isotónica con la sangre. Para administración bucal o sublingual las composiciones pueden administrarse en la forma de comprimidos o pastillas que pueden formularse de una manera convencional.
CLONACIÓN DE UNA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA UN POLIPÉPTIDO SEGÚN LA PRESENTE INVENCIÓN
Una secuencia de nucleótidos que codifica bien un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria o un polipéptido que es adecuado para modificación puede aislarse de cualquier célula u organismo que produce dicho polipéptido. En la técnica se conocen varios métodos para el aislamiento de secuencias de nucleótidos.
Por ejemplo, puede construirse una biblioteca de ADN genómico y/o ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce el polipéptido. Si se conoce la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pueden sintetizarse sondas oligonucleotídicas marcadas y usarse para identificar clones que codifican el polipéptido de la biblioteca genómica preparada a partir del organismo. Alternativamente, podría usarse una sonda oligonucleotídica marcada que contiene secuencias homólogas a otro gen de polipéptido conocido para identificar los clones que codifican el polipéptido. En el último caso, se usan condiciones de hibridación y lavado de menor astringencia.
Alternativamente, los clones que producen el polipéptido podrían identificarse insertando fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformando bacterias negativas para la enzima con la biblioteca de ADN genómico resultante y sembrando en placas las bacterias transformadas en agar que contiene una enzima inhibida por el polipéptido, permitiendo de esta manera identificar los clones que expresan el polipéptido expresado.
En una alternativa más adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido puede prepararse sintéticamente por métodos estándar establecidos, por ejemplo, el método de fósforoamidita descrito por Beucage
S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805. En el método de fósforoamidita, se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se hibridan, se ligan y se clonan en vectores apropiados.
La secuencia de nucleótidos puede ser de origen mixto genómico y sintético, origen mixto sintético y de ADNc, o de origen mixto genómico y de ADNc, preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado) según técnicas estándar. Cada fragmento ligado corresponde a varias partes de la secuencia de nucleótidos completa. La secuencia de ADN también puede prepararse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4.683.202 o en Saiki R K et al (Science (1988) 239, pp 487-491).
SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS
La presente invención también engloba secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se define en la presente memoria. El término "secuencia de nucleótidos" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una secuencia de oligonucleótido o secuencia de polinucleótido, y variante, homólogos, fragmentos y derivados de éstos (tal como partes de éstos). La secuencia de nucleótidos
puede ser de origen genómico o sintético o recombinante, que puede ser bicatenaria o monocatenaria bien representando la cadena con sentido o antisentido.
El término "secuencia de nucleótidos" respecto a la presente invención incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferiblemente, significa ADN, más preferiblemente ADNc para la secuencia codificadora.
En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica per se un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria no engloba la secuencia de nucleótidos nativa en su entorno natural cuando está unida a su(s) secuencia(s) asociadas naturalmente que también está/están en su entorno natural. Para facilitar la referencia, llamaremos a esta realización preferida la "secuencia de nucleótidos no nativa". A este respecto, el término "secuencia de nucleótidos nativa" significa una secuencia de nucleótidos completa que está en su entorno natural y cuando está unida de manera operativa a un promotor completo con el que está asociada naturalmente, promotor que también está en su entorno natural. Así, el polipéptido de la presente invención puede expresarse por una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo pero en el que la secuencia de nucleótidos no está bajo el control del promotor con el que está asociada naturalmente en ese organismo.
Preferiblemente, el polipéptido no es un polipéptido nativo. A este respecto, el término "polipéptido nativo" significa un polipéptido completo que está en su entorno natural y cuando se ha expresado por su secuencia de nucleótidos nativa.
Típicamente, la secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se define en la presente memoria se prepara usando técnicas de ADN recombinante (es decir, ADN recombinante). Sin embargo, en una realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos podría sintetizarse, totalmente o en parte, usando métodos químicos muy conocidos en la técnica (véase Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
EVOLUCIÓN MOLECULAR
Una vez se ha aislado una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, o se ha identificado una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima posible, puede ser deseable modificar la secuencia de nucleótidos seleccionada, por ejemplo puede ser deseable mutar la secuencia con el fin de preparar una enzima según la presente invención.
Las mutaciones pueden introducirse usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados.
Un método adecuado se describen en Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Otro método para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican la enzima se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151).
En lugar de mutagénesis dirigida a sitio, tal como se ha descrito anteriormente, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente por ejemplo usando un kit comercial tal como el kit de mutagénesis GeneMorph PCR de Stratagene,
o el kit de mutagénesis aleatoria Diversify PCR de Clontech. EP 0 583 265 se refiere a métodos para optimizar la mutagénesis basada en PCR, que también puede combinarse con el uso de análogos de ADN mutagénicos tales como los descritos en EP 0 866 796. Las tecnologías de PCR tendente a error son adecuadas para la producción de variantes de lípido acil transferasas con características preferidas. WO0206457 se refiere a la evolución molecular de lipasas.
Un tercer método para obtener secuencias nuevas es fragmentar secuencias de nucleótidos no idénticas, bien usando cualquier número de enzimas de restricción o una enzima tal como ADNasa I, y reensamblando las secuencias de nucleótidos completas que codifican proteínas funcionales. Alternativamente, se puede usar una o múltiples secuencias de nucleótidos no idénticas e introducir mutaciones durante el reensamblaje de la secuencia de nucleótidos completa. Las tecnologías de intercambio de cadenas de ADN e intercambio de cadenas en familias son adecuadas para la producción de variantes de lípido acil transferasas con características preferidas. Los métodos adecuados para realizar el "intercambio de cadenas" pueden encontrarse en EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103
606. El intercambio de cadenas también puede combinarse con otras formas de mutagénesis del ADN como se describe en US 6.180.406 y WO 01/34835.
Así, es posible producir numerosas mutaciones dirigidas a sitio o aleatorias en una secuencia de nucleótidos, bien in vivo o in vitro, y posteriormente cribar para funcionalidad mejorada del polipéptido codificado por varios medios. Usando métodos de recombinación in silico y mediados por exo (véase WO 00/58517,US 6.344.328, US 6.361.974), por ejemplo, puede realizarse la evolución molecular en la que la variante producida retiene muy poca homología con enzimas o proteínas conocidas. Dichas variantes obtenidas de esta manera pueden tener una analogía estructural significativa con enzimas transferasa conocidas, pero tienen una homología muy baja en la secuencia de aminoácidos.
Como un ejemplo no limitativo, además, las mutaciones o variantes naturales de una secuencia de polinucleótido pueden recombinarse bien con el tipo salvaje u otras mutaciones o variantes naturales para producir nuevas variantes. Dichas nuevas variantes también pueden cribarse para funcionalidad mejorada del polipéptido codificado.
La aplicación de los métodos de evolución molecular mencionados anteriormente y similares permite la identificación y selección de variantes de las enzimas de la presente invención que tienen características preferidas sin ningún conocimiento previo de la estructura o función de la proteína, y permite la producción de mutaciones o variantes no predecibles pero beneficiosas. Existen numerosos ejemplos de la aplicación de la evolución molecular en la técnica para la optimización o alteración de la actividad de enzimas, dichos ejemplos incluyen, pero no están limitados a uno
o más de los siguientes: expresión y/o actividad optimizada en una célula huésped o in vitro, actividad enzimática incrementada, especificidad de sustrato y/o producto alterada, estabilidad enzimática o estructural incrementada o disminuida, actividad/especificidad enzimática alterada en condiciones medioambientales preferidas, por ejemplo, temperatura, pH, sustrato
Como será evidente para un experto en la técnica, usando herramientas de evolución molecular, una enzima puede alterarse para mejorar la funcionalidad de la enzima.
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa usada en la invención puede ser una variante, es decir, puede contener al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácidos, cuando se compara con una enzima parental. Las enzimas variantes retienen al menos 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de homología con la enzima parental. Las enzimas parentales adecuadas pueden incluir cualquier enzima con actividad esterasa o lipasa. Preferiblemente, la enzima parental se alinea con la secuencia consenso pfam00657.
En una realización preferible, una enzima lípido aciltransferasa variante retiene o incorpora al menos uno o más de los residuos de aminoácidos de la secuencia consenso pfam00657 encontrados en los bloques GDSx, GANDY y HPT.
Las enzimas, tales como lipasas sin o con poca actividad lípido aciltransferasa en un entorno acuoso pueden mutarse usando herramientas de evolución molecular para introducir o aumentar la actividad transferasa, produciendo de esta manera una enzima lípido aciltransferasa con actividad transferasa significativa adecuada para uso en las composiciones y métodos de la presente invención.
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa para uso en la invención puede ser una variante con actividad enzimática aumentada en lípidos polares, preferiblemente fosfolípidos y/o glicolípidos cuando se compara con la enzima parental. Preferiblemente, dichas variantes también tienen poca o ninguna actividad sobre los lípidos liso polares. La actividad aumentada sobre los lípidos polares, fosfolípidos y/o glicolípidos puede ser el resultado de la actividad de hidrólisis y/o transferasa o una combinación de ambas.
Las lípido aciltransferasas variantes para uso en la invención pueden tener una actividad disminuida sobre triglicéridos, y/o monoglicéridos y/o diglicéridos cuando se compara con la enzima parental.
Adecuadamente, la enzima variante puede no tener actividad sobre los triglicéridos y/o monoglicéridos y/o diglicéridos.
Alternativamente, la enzima variante para uso en la invención puede tener actividad incrementada sobre triglicéridos y/o también puede tener actividad incrementada sobre uno o más de los siguientes, lípidos polares, fosfolípidos, lecitina, fosfatidilcolina, glicolípidos, digalactosil monoglicérido, monogalactosil monoglicérido.
Las variantes de lípido aciltransferasas son conocidas, una o más de dichas variantes puede ser adecuada para uso en los métodos y usos de la invención. Por ejemplo, las variantes de lípido aciltransferasas se describen en las referencias siguientes:
Hilton S, Buckley JT. Studies on the reaction mechanism of a microbial lipase/acyltransferase using chemical modification and site-directed mutagenesis.J Biol Chem. 1991 ene 15;266(2):997-1000.
Robertson DL, Hilton S, Wong KR, Koepke A, Buckley JT. Influence of active site and tyrosine modification on the secretion and activity of the Aeromonas hydrophila lipase/acyltransferase.J Biol Chem. 1994 ene 21;269(3):2146-50.
Brumlik MJ, Buckley JT.Identification of the catalytic triad of the lipase/acyltransferase from Aeromonas hydrophila. J Bacteriol. 1996 abr;178(7):2060-4.
Peelman F, Vinaimont N, Verhee A, Vanloo B, Verschelde JL, Labeur C, Seguret-Mace S, Duverger N, Hutchinson G, Vandekerclchove J, Tavernier J, Rosseneu M. A proposed architecture for lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT): identification of the catalytic triad and molecular modeling. Protein Sci. 1998 mar;7(3):587-99.
SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS
La presente invención también engloba secuencias de aminoácidos de polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se define en la presente memoria.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido".
La secuencia de aminoácidos puede prepararse/aislarse de una fuente adecuada, o puede prepararse sintéticamente o puede prepararse por el uso de técnicas de ADN recombinante.
Adecuadamente, las secuencias de aminoácidos pueden obtenerse de los polipéptidos aislados enseñados en la presente memoria por técnicas estándar.
Un método adecuado para determinar las secuencias de aminoácidos de polipéptidos aislados es como sigue:
El polipéptido purificado puede liofilizarse y 100 µg del material liofilizado pueden disolverse en 50 µl de una mezcla de 8 M urea y 0,4 M hidrógeno carbonato de amonio, pH 8,4. La proteína disuelta puede desnaturalizarse y reducirse durante 15 minutes aa 50°C después de cubrir con nitrógeno y adición de 5 µl de 45 mM ditiotreitol. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, pueden añadirse 5 µl de 100 mM yodoacetamida para derivatizar los residuos de cisteína durante 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad bajo nitrógeno.
Pueden añadirse 135 µl de agua y 5 µg de endoproteinasa Lys-C en 5 µl de agua a la mezcla de reacción anterior y la digestión puede realizarse a 37°C bajo nitrógeno durante 24 horas.
Los péptidos resultantes pueden separarse por HPLC en fase reversa en una columna VYDAC C18 (0,46x15cm;10µm; The Separation Group, California, EEUU) usando el disolvente A: 0,1% TFA en agua y disolvente
B: 0,1% TFA en acetonitrilo. Los péptidos seleccionados pueden re-cromatografiarse en una columna Develosil C18 usando el mismo sistema de disolventes, antes de la secuenciación N-terminal. La secuenciación puede hacerse usando un secuenciador Applied Biosystems 476A, usando ciclos rápidos de líquido pulsados según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, California, EEUU).
IDENTIDAD DE SECUENCIA U HOMOLOGÍA DE SECUENCIA
La presente invención también engloba el uso de secuencias que tienen un grado de identidad de secuencia u homología de secuencia con la o las secuencias de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria o con cualquier secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido (referido de aquí en adelante como una o unas "secuencias homólogas"). Aquí, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una determinada homología con las secuencias de aminoácidos objeto y las secuencias de nucleótidos objeto. Aquí, el término "homología" puede equipararse con "identidad".
La secuencia de aminoácidos y/o secuencia de nucleótidos homóloga debería proporcionar y/ codificar un polipéptido que retiene la actividad funcional y/o aumenta la actividad de la enzima.
En el presente contexto, se entiende que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 ó 98% idéntica a la secuencia objeto. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos etc. que la secuencia de aminoácidos objeto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
En el presente contexto, se entiende que una secuencia homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 ó 98% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención (la secuencia objeto). Típicamente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos etc. que la secuencia objeto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
Las comparaciones de homología pueden realizarse a ojo, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos comercialmente disponibles pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.
El % de homología puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina un alineamiento "sin huecos". Típicamente, dichos alineamiento sin huecos se realizan sólo sobre un número relativamente pequeño de residuos.
Aunque éste es un método muy simple y consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en una pareja de secuencias de otra manera idéntica, una inserción o deleción causará que los residuos de aminoácidos siguientes queden fuera del alineamiento, resultando así potencialmente en una gran reducción en el % de homología cuando se realiza un alineamiento global. Consecuentemente, la mayor parte de los métodos de comparación de secuencias
se diseñan para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación global de homología. Esto se consigue insertando "huecos" en el alineamiento de las secuencias para intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada hueco que ocurre en el alineamiento de manera que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencias con tan pocos huecos como es posible - que refleja un mayor grado de relación entre las dos secuencias comparadas conseguirá una puntuación mayor que uno con muchos huecos. Se usan típicamente "costes de hueco afín" que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización menor para cada residuo posterior en el hueco. Éste es el sistema de puntuación de huecos usado más comúnmente. Por supuesto, las penalizaciones altas de hueco producirán alineamientos optimizados con menos huecos. La mayor parte de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones de hueco. Sin embargo, se prefieren usar los valores por defecto cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalización de hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.
El cálculo del % máximo de homología requiere, por lo tanto, en primer lugar, la producción de un alineamiento óptimo, tendiendo en cuenta la consideración de penalizaciones de hueco. Un programa informático adecuado para realizar dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Los ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencia incluyen, pero no están limitados a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y el paquete GENEWORKS de herramientas de comparación. Ambos BLAST y FASTA están disponibles para búsqueda sin conexión y con conexión en la red (véase Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences también está disponible para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineamiento en sí mismo no se basa típicamente en una comparación de parejas de todo o nada. En lugar de esto, se usa generalmente una matriz escalonada de puntuación de similitud que asigna puntuaciones a cada comparación de parejas tomando como base la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz usada comúnmente es la matriz BLOSUM62 - la matriz por defecto para el paquete de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin usan generalmente bien los valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada si se suministra (véase el manual del usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Alternativamente, el porcentaje de homologías puede calcularse usando la característica de alineamiento múltiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basado en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).
Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso en una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden hacerse tomando como base la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se retenga la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
Pueden hacerse sustituciones conservativas, por ejemplo, según la Tabla siguiente. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:
ALIFÁTICO
No polar G A P
I L V
Polar - no cargado
C S T M
N Q
Polar - cargado
D E
K R
AROMÁTICO
H F W Y
La presente invención también engloba sustitución homóloga (sustitución y reemplazo se usan ambos en la presente memoria para significar el intercambio de un residuo de aminoácido existente con un residuo alternativo) que puede ocurrir, es decir, sustitución semejante por semejante tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar etc. La sustitución no homóloga también puede ocurrir, es decir, de una clase de residuo a otra o alternativamente que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (referido de aquí en adelante en la presente memoria como Z), ácido diaminobutírico ornitina (referido de aquí en adelante en la presente memoria como B), norleucina ornitina (referido de aquí en adelante en la presente memoria como O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Los reemplazos también pueden hacerse por aminoácidos no naturales.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre cualesquiera dos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácidos tales como residuos de glicina o β-alanina. Una forma adicional de variación, que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácidos en forma peptoide, será bien entendida por los expertos en la técnica. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se usa para referirse a residuos de aminoácidos variantes en los que el grupo sustituyente del carbono α está en el átomo de nitrógeno del residuo en lugar del carbono α. Los procesos para preparar péptidos en la forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
Las secuencias de nucleótidos para uso en la presente invención o que codifican un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria pueden incluir en ellas nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos diferentes de modificación de oligonucleótidos. Éstos incluyen núcleos de metilfosfonato y fósforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, debe entenderse que las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden realizarse con el fin de aumentar la actividad in vivo o vida útil de las secuencias de nucleótidos.
La presente invención también engloba el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias discutidas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de éstas. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de ésta entonces esa secuencia puede usarse como una sonda para identificar secuencias codificadoras similares en otros organismos etc.
Pueden obtenerse de diferentes maneras polinucleótidos que no son 100% homólogos a las secuencias de la presente invención pero que se encuentran en el alcance de la invención. Pueden obtenerse otras variantes de las secuencias descritas en la presente memoria por ejemplo sondando bibliotecas de ADN preparadas a partir de un rango de individuos, por ejemplo, individuos de diferentes poblaciones. Además, pueden obtenerse otros homólogos virales/bacterianos, o celulares particularmente homólogos celulares encontrados en células de mamíferos (por ejemplo, células de rata, ratón, bovino y primate), y dichos homólogos y fragmentos de éstos en general serán capaces de hibridar selectivamente con las secuencias mostradas en el listado de secuencias de la presente memoria. Dichas secuencias pueden obtenerse sondando bibliotecas de ADNc preparadas a partir de o bibliotecas de ADN genómico de otra especie animal, y sondando dichas bibliotecas con sondas que comprenden todo o parte de una cualquiera de las secuencias de los listados de secuencia adjuntos en condiciones de media a alta astringencia. Se aplican consideraciones similares para obtener homólogos de especies y variantes alélicas de las secuencias de polipéptido o nucleótido de la invención.
También pueden obtenerse variantes y homólogos de cepa/especie usando PCR degenerada que usará cebadores diseñados para tomar como diana secuencias en las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas en las secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas pueden predecirse, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varias variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencia pueden realizarse usando software informático conocido en la técnica. Por ejemplo, el programa GCG Wisconsin PileUp se usa ampliamente.
Los cebadores usados en PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de astringencia menores que las usadas para clonar secuencias con cebadores de secuencia única frente a secuencias conocidas.
Alternativamente, dichos polinucleótidos pueden obtenerse por mutagénesis dirigida a sitio de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se requieren cambios silenciosos en la secuencia de codones para optimizar las preferencias de codones para una célula huésped particular en la que se están expresando las secuencias de polinucleótido. Pueden ser deseables otros cambios de secuencia con el fin de introducir sitios de reconocimiento de restricción de polipéptido, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.
Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos) de la invención pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda, por ejemplo, marcada con un marcador revelador por medios convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de al menos 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo al menos 25, 30 ó 40 nucleótidos, y también están englobados por el término polinucleótidos de la invención tal y como se usa en la presente memoria.
Los polinucleótidos tales como polinucleótidos de ADN y sondas según la invención pueden producirse recombinantemente, sintéticamente o por cualquier otro medio disponible para los expertos en la técnica. También pueden clonarse por técnicas estándar.
En general, los cebadores se producirán por medios sintéticos, que implican una fabricación por etapas de la secuencia de ácido nucleico deseada con un nucleótido cada vez. Las técnicas para conseguir esto usando técnicas automatizadas están fácilmente disponibles en la técnica.
Los polinucleótidos más largos se producirán generalmente usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará preparar una pareja de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una región de la secuencia diana lipídica que se desea clonar, poner en contacto los cebadores con ARNm o ADNc obtenido de una célula animal o humana, realizar una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que produzcan la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de manera que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación adecuado.
HIBRIDACIÓN
La presente invención también engloba secuencias que son complementarias a las secuencias de la presente invención o secuencias que son capaces de hibridar bien con las secuencias de la presente invención o con secuencias que son complementarias a éstas.
El término "hibridación" tal y como se usa en la presente memoria incluirá "el proceso por el que una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de emparejamiento de bases" así como el proceso de amplificación tal y como se realiza en las tecnologías de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La presente invención también engloba el uso de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias que son complementarias a las secuencias objeto discutidas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de éstas.
La presente invención también engloba secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria.
Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión de nucleótidos, como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), y confieren una "astringencia" definida como se explica más adelante.
La astringencia máxima ocurre típicamente a aproximadamente Tm-5°C (5°C por debajo de la Tm de la sonda); astringencia alta a aproximadamente 5°C a 10°C por debajo de la Tm; astringencia intermedia a aproximadamente 10°C a 20°C por debajo de la Tm; y astringencia baja a aproximadamente 20°C a 25°C por debajo de la Tm. Como entenderán los expertos en la técnica, una hibridación con astringencia máxima puede usarse para identificar o detectar secuencias de nucleótidos idénticas mientras la hibridación con astringencia intermedia (o baja) puede usarse para identificar o detectar secuencias de polinucleótido similares o relacionadas.
Preferiblemente, la presente invención engloba secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar en condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia intermedia con secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se define en la presente memoria.
Más preferiblemente, la presente invención engloba secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar en condiciones de astringencia alta (por ejemplo, 65°C y 0,1xSSC {1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-citrato pH 7,0}) con secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se define en la presente memoria.
La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria (incluyendo secuencias complementarias a las discutidas en la presente memoria).
La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a secuencias que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria (incluyendo secuencias complementarias a las discutidas en la presente memoria).
También se incluyen en el alcance de la presente invención secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria en condiciones de astringencia intermedia a máxima.
En un aspecto preferido, la presente invención abarca secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria, o el complemento de éstas, en condiciones astringentes (por ejemplo, 50°C y 0,2xSSC).
En un aspecto más preferido, la presente invención abarca secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos discutidas en la presente memoria, o el complemento de éstas, en condiciones de astringencia alta (por ejemplo, 65°C y 0,1xSSC).
EXPRESIÓN DE POLIPÉPTIDOS
Una secuencia de nucleótidos para uso en la presente invención o para codificar un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria, puede incorporarse en un vector recombinante replicable. El vector puede usarse para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma de polipéptido, en y/o de una célula huésped compatible. La expresión puede controlarse usando secuencias de control que incluyen promotores/potenciadores y otras señales de regulación de la expresión. Pueden usarse promotores procariotas y promotores funcionales en células eucariotas. Pueden usarse promotores específicos de tejido o específicos de estímulo. También pueden usarse promotores quiméricos que comprenden elementos de secuencia de dos o más promotores diferentes descritos anteriormente.
El polipéptido producido por una célula huésped recombinante por expresión de la secuencia de nucleótidos puede secretarse o puede estar contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Las secuencias codificadoras pueden diseñarse con secuencias señal que dirigen la secreción de las secuencias que codifican la sustancia a través de una membrana celular particular procariota o eucariota.
VECTOR DE EXPRESIÓN
El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de expresión in vivo o in vitro.
Preferiblemente, el vector de expresión se incorpora en el genoma del organismo. El término "incorporado" abarca preferiblemente la incorporación estable en el genoma.
La secuencia de nucleótidos de la presente invención o que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria puede estar presente en un vector, en el que la secuencia de nucleótidos está unida de manera operativa con secuencias reguladoras de manera que las secuencias reguladoras son capaces de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos por un organismo huésped adecuado, es decir, el vector es un vector de expresión.
Los vectores de la presente invención pueden transformarse en una célula huésped adecuada como se describe más adelante para proporcionar la expresión de un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria.
La elección del vector, por ejemplo un vector de plásmido, cósmido, virus o fago, dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que va a introducirse.
Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables - tales como un gen que confiere resistencia a antibiótico, por ejemplo, resistencia a amplicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Alternativamente, la selección puede conseguirse por co-transformación (como se describe en WO91/17243).
Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o usarse para transfectar o transformar una célula huésped.
Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método para preparar secuencias de nucleótidos de la presente invención o secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se define en la presente memoria introduciendo una secuencia de nucleótidos en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y creciendo la célula huésped en condiciones que produzcan la replicación del vector.
El vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos que permita que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.
SECUENCIAS REGULADORAS
En algunas aplicaciones, una secuencia de nucleótidos para uso en la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria puede estar unida de manera operativa a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos, tal como por la célula huésped elegida. Como ejemplo, la presente invención abarca un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención unida de manera operativa a dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.
El término "unido de manera operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están relacionados de manera que se permite que funcionen en su manera pretendida. Una secuencia reguladora "unida de manera operativa" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "secuencias reguladoras" incluye promotores y potenciadores y otras señales reguladoras de la expresión.
El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión de una ARN polimerasa.
La expresión potenciada de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria también puede conseguirse por la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, de líder de secreción y terminadoras.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar unida de manera operativa al menos a un promotor.
Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos en un huésped bacteriano, fúngico o de levadura son muy conocidos en la técnica.
CONSTRUCCIONES
El término "construcción" - que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "casete" e "híbrido" - incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria para uso según la presente invención unido directamente o indirectamente a un promotor. Un ejemplo de una unión indirecta es el suministro de un grupo espaciador adecuado tal como una secuencia de intrón, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es cierto para el término "fusionado" en relación con la presente invención que incluye unión directa o indirecta. En algunos casos, los términos no abarcan la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína asociada habitualmente con el promotor del gen de tipo salvaje y cuando ambos están en su entorno natural.
La construcción puede contener o expresar incluso un marcador que permite la selección de la construcción genética.
Para algunas aplicaciones, preferiblemente la construcción comprende al menos una secuencia de nucleótidos de la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria unida de manera operativa a un promotor.
CÉLULAS HUÉSPED
El término "célula huésped" - en relación con la presente invención incluye cualquier célula que comprende bien una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria o un vector de expresión como se ha descrito anteriormente y que se usa en la producción recombinante de un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria.
Así, una realización adicional de la presente invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos de la presente invención o una secuencia de nucleótidos que expresa un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria. Las células se elegirán de
modo que sean compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, de levadura o de planta. Preferiblemente, las células huésped no son células humanas,
Los ejemplos de organismos huésped bacterianos adecuados son bacterias gram negativas o bacterias gram positivas.
Dependiendo de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria, y/o la conveniencia para procesamiento adicional de la proteína expresada, pueden preferirse los huéspedes eucariotas tales como levaduras u otros hongos. En general, se prefieren las células de levadura por encima de las células fúngicas porque es más fácil manipularlas. Sin embargo, algunas proteínas o se secretan poco de la célula de levadura o, en algunos casos, no se procesan apropiadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levadura). En estos casos, debe seleccionarse un organismo huésped fúngico diferente.
El uso de células huésped adecuadas, tales como células huésped de levadura, fúngicas y de planta - puede proporcionar modificaciones posteriores a la traducción (por ejemplo, miristoilación, glicosilación, truncamiento, lapidación y fosforilación de serina o treonina) como puede necesitarse para conferir actividad biológica óptima en productos de expresión recombinante de la presente invención.
La célula huésped puede ser una cepa deficiente en proteasa o sin proteasa.
ORGANISMO
El término "organismo" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que podría comprender una secuencia de nucleótidos según la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria y/o productos obtenidos de ésta.
Los organismos adecuados pueden incluir un procariota, hongo, levadura o una planta.
El término "organismo transgénico" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria y/o los productos obtenidos de ésta, y/o en el que un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria en el organismo. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos se incorpora en el genoma del organismo.
El término "organismo transgénico" no abarca secuencias de nucleótidos codificadoras nativas en su entorno natural cuando están bajo el control de su promotor nativo que también está en su entorno natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico de la presente invención incluye un organismo que comprende una cualquiera, o combinaciones de, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria, construcciones como se define en la presente memoria, vectores como se define en la presente memoria, plásmidos como se define en la presente memoria, células como se define en la presente memoria, o los productos de éstos. Por ejemplo, el organismo transgénico también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria bajo el control de un promotor heterólogo.
TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS/ORGANISMO HUÉSPED
Como se ha indicado anteriormente, el organismo huésped puede ser un organismo procariota o eucariota. Los ejemplos de huéspedes procariotas adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilis.
Las enseñanzas sobre la transformación de huéspedes procariotas están bien documentadas en la técnica, por ejemplo véase Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Si se usa un huésped procariota, puede ser necesario modificar adecuadamente la secuencia de nucleótidos antes de la transformación - tal como por eliminación de intrones.
En otra realización, el organismo transgénico puede ser una levadura.
Las células de hongos filamentosos pueden transformarse usando varios métodos conocidos en la técnica - tal como un proceso que implica la formación de protoplastos y transformación de los protoplastos seguido de la regeneración de la pared celular de una manera conocida. El uso de Aspergillus como un microorganismo huésped se describe en EP 0 238 023.
Otro organismo huésped puede ser una planta. Una revisión de las técnicas generales usadas para transformar plantas puede encontrarse en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech marzo/abril 1994 17-27). Pueden encontrarse enseñanzas adicionales sobre la transformación de plantas en EP-A-0449375.
En las secciones siguientes se presentan enseñanzas generales sobre la transformación de hongos, levaduras y plantas.
HONGO TRANSFORMADO
Un organismo huésped puede ser un hongo - tal como un hongo filamentoso. Los ejemplos de dichos huéspedes adecuados incluyen cualquier miembro que pertenece a los géneros Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma y semejantes.
Las enseñanzas sobre la transformación de hongos filamentosos se revisan en US-A-5741665 que expone que las técnicas estándar para la transformación de hongos filamentosos y el cultivo de los hongos son muy conocidas en la técnica. Una revisión extensa de las técnicas según se aplican a N. crassa se encuentra, por ejemplo, en Davis y de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
Las enseñanzas adicionales sobre la transformación de hongos filamentosos se revisan en US-A-5674707.
En un aspecto, el organismo huésped puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.
Un Aspergillus transgénico según la presente invención también puede prepararse siguiendo, por ejemplo, las enseñanzas de Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. En: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editores) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666).
La expresión génica en hongos filamentosos se ha revisado en Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 Mayo;20(5):200-6, Archer y Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.
LEVADURA TRANSFORMADA
En otra realización, el organismo transgénico puede ser una levadura.
Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en levaduras se proporciona, por ejemplo, en Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, y Curr Opin Biotechnol (1997) oct;8(5):554-60
A este respecto, puede usarse la levadura - tal como las especies Saccharomyces cerevisi o Pichia pastoris (véase FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), como un vehículo para la expresión de genes heterólogos.
Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y secreción de los productos génicos se proporciona por E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, eds, 2a edición, Academic Press Ltd.).
Para la transformación de levaduras, se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, puede prepararse un Saccharomyces transgénico según la presente invención siguiendo las enseñanzas de Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Acadenry of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275, 104); e Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153,163-168).
Un organismo huésped levadura adecuado puede seleccionarse de las especies de levadura biotecnológicamente relevantes tales como, pero no limitado a, especies de levadura tales como Pichia sp., Hansenula sp o especies de Kluyveromyces, Yarrowinia o una especie de Saccharomyces incluyendo Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenece a Schizosaccharomyce tal como, por ejemplo, la especie S. pombe.
Puede usarse una cepa de la especie de levadura metilotrófica Pichia pastoris como el organismo huésped.
En una realización, el organismo huésped es una especie de Hansenula, tal como Hansenula polymorpha (como se describe en WO01/38544).
Las células de levadura transformadas pueden seleccionarse usando varios marcadores selectivos - tal como marcadores auxotróficos marcadores de resistencia a antibiótico dominantes.
PLANTAS/CÉLULAS DE PLANTA TRANSFORMADAS
Un organismo huésped adecuado para la presente invención puede ser una planta. Una revisión de las técnicas generales puede encontrarse en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech marzo/abril 1994 17-27), o en WO01/16308. La planta transgénica puede producir niveles aumentados de ésteres de fitoesterol y ésteres de fitoestanol, por ejemplo.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para la producción de una planta transgénica con niveles aumentados de ésteres de fitoesterol y ésteres de fitoestanol, que comprende las etapas de transformar una célula de planta con una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria (en particular con un vector de expresión o construcción que comprende una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria), y crecer una planta a partir de la célula de planta transformada.
SECRECIÓN
Frecuentemente, es deseable que el polipéptido se secrete del huésped de expresión al medio de cultivo del que la enzima puede recuperarse más fácilmente. Según la presente invención, la secuencia líder de la secreción puede seleccionarse tomando como base el huésped de expresión deseado. También pueden usarse secuencias señal híbridas en el contexto de la presente invención.
Los ejemplos típicos de secuencias líder de la secreción heterólogas son aquellas que se originan del gen de la amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA - ambas versiones 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus), el gen del factor a (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de la α-amilasa (Bacillus).
DETECCIÓN
En la técnica se conoce una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y separación celular activada por fluorescencia (FACS).
Los expertos en la técnica conocen una variedad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden usarse en varios ensayos de ácido nucleico y aminoácidos.
Varias empresas tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), y US Biochemical Corp (Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para estos procedimientos.
Las moléculas informadoras o marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y semejantes. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen US-A-3.817.837; US-A-3.850.752; USA-3.939.350; US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; US-A-4.275.149 y US-A-4.366.241.
También, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en US-A-4.816.567.
PROTEÍNAS DE FUSIÓN
Un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria puede producirse como una proteína de fusión, por ejemplo, para facilitar la extracción y purificación de éste. Los ejemplos de parejas de proteína de fusión incluyen glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de unión a ADN y/o activación transcripcional) y β-galactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica entre la pareja de la proteína de fusión y la secuencia de proteína de interés para permitir la eliminación de secuencias de la proteína de fusión. Preferiblemente, la proteína de fusión no dificulta la actividad de la secuencia de proteína.
Los sistemas de expresión de fusiones génicas en E. coli se han revisado en Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5):501-6.
En otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria puede ligarse a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para cribar bibliotecas de péptidos para agentes capaces de influir en la actividad de la sustancia, puede ser útil codificar una sustancia quimérica que expresa un epítopo heterólogo que es reconocido por un anticuerpo disponible comercialmente.
La invención se describirá ahora, sólo como ejemplo, con referencia a las Figuras y Ejemplos siguientes.
La Figura 1 muestra una secuencia consenso pfam00657 de la versión 6 de la base de datos (SEQ ID No. 1);
La Figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 2) obtenida del organismo Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051);
La Figura 3 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 3) obtenida del organismo Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI:9964017);
La Figura 4 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 4) obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank número de registro NP_631558);
La Figura 5 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 5) obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank número de registro: CAC42140);
La Figura 6 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 6) obtenida del organismo Saccharomyces cerevisiae (Genbank número de registro P41734);
La Figura 7 muestra un alineamiento de secuencias seleccionadas con la secuencia consenso pfam00657;
La Figura 8 muestra un alineamiento por parejas de SEQ ID No. 3 con SEQ ID No. 2 mostrando 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos. La secuencia señal está subrayada. + indica diferencias. El resto GDSX que contiene el sitio activo serina 16, y los sitios activos ácido aspártico 116 e histidina 291 están remarcados (véanse las regiones sombreadas). Los números después del aminoácido es menos la secuencia señal;
La Figura 9 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 7) que codifica una lípido acil transferasa según la presente invención obtenida del organismo Aeromonas hydrophila;
La Figura 10 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 8) que codifica una lípido acil transferasa según la presente invención obtenida del organismo Aeromonas salmonicida;
La Figura 11 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 9) que codifica una lípido acil transferasa según la presente invención obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank número de registro NC_003888.1:8327480..8328367);
La Figura 12 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 10) que codifica una lípido acil transferasa según la presente invención obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank número de registro AL939131.1:265480..266367);
La Figura 13 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 11) que codifica una lípido acil transferasa según la presente invención obtenida del organismo Saccharomyces cerevisiae (Genbank número de registro Z75034);
La Figura 14 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 12) obtenida del organismo Ralstonia (Genbank número de registro: AL646052);
La Figura 15 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 13) que codifica una lípido acil transferasa según la presente invención obtenida del organismo Ralstonia;
La Figura 16 muestra SEQ ID No. 20. Proteína hipotética conservada Scoe1 con código de registro de proteína NCBI CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 17 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 que codifica la proteína hipotética conservada con código de registro de proteína NCBI CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 18 muestra un aminoácido mostrado como SEQ ID No.22. Proteína hipotética conservada Scoe2 con código de registro de proteína NCBI CAC01477.1 GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 19 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 que codifica la proteína hipotética conservada Scoe2 con código de registro de proteína NCBI CAC01477.1 GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 20 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.24) Proteína secretada posible Scoe3 con código de registro de proteína NCBI CAB88833.1 GI:7635996. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 21 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No.25 que codifica la proteína secretada posible Scoe3 con código de registro de proteína NCBI CAB88833.1 GI:7635996. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 22 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.26) Proteína secretada posible Scoe4 con código de registro de proteína NCBI CAB89450.1 GI:7672261. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 23 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No.27 que codifica la proteína secretada posible Scoe4 con código de registro de proteína NCBI CAB89450.1 GI:7672261. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 24 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.28) Lipoproteína posible Scoe5 con código de registro de proteína NCBI CAB62724.1 GI:6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 25 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29 que codifica la lipoproteína posible Scoe5 con código de registro de proteína NCBI CAB62724.1 GI:6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La Figura 26 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.30) GDSL-lipasa Sriml con código de registro de proteína NCBI AAK84028.1 GI:15082088 [Streptomyces rimosus];
La Figura 27 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No.31 que codifica la GDSL-lipasa Srim1 con código de registro de proteína NCBI AAK84028.1 GI:15082088 [Streptomyces rimosus];
La Figura 28 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 32) Una lípido acil transferasa de Aeromonas hydrophila (ATCC #7965);
La Figura 29 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 33) que codifica una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (ATCC #7965);
La Figura 30 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 34) de una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida subsp. Sahnonicida (ATCC#14174);
La Figura 31 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 35) que codifica una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC#14174);La Figura 32 muestra que los homólogos de los genes de Aeromonas pueden identificarse usando el servicio de herramienta de búsqueda de alineamiento local básico en el National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, EEUU y las bases de datos de genoma completo. El resto GDSX se usó en la búsqueda de la base de datos y se identificaron varias secuencias/genes que potencialmente codifican enzimas con actividad lipolítica. Se identificaron genes de los géneros Streptomyces, Xanthomonas y Ralstonia. Como un ejemplo más adelante, Ralstonia solanacearum se alineó con el gen de Aeromonas salmonicida (satA). El alineamiento por parejas mostró un 23% de identidad. La serina del sitio activo está presente en el extremo amino y pueden identificarse los residuos catalíticos histidina y ácido aspártico;
La Figura 33 muestra la secuencia consenso Pfam00657.11 [familia 00657, versión 11 de la base de datos] (denominada de aquí en adelante consenso Pfam) y el alineamiento de varias secuencias con la secuencia consenso Pfam. Las flechas indican los residuos del sitio activo, las cajas subrayadas indican tres de las cajas de homología indicadas por [Upton C y Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Las letras mayúsculas en el consenso Pfam indican residuos conservados en muchos miembros de la familia. El símbolo - indica una posición en la que el modelo oculto de Markov del consenso Pfam esperaba encontrar un residuo pero no lo hizo, de manera que se inserta un hueco. El símbolo indica un residuo sin un residuo correspondiente en el consenso Pfam. Las secuencias son las secuencias de aminoácidos listadas en las Figuras 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 y 30.
La Figura 34 muestra la secuencia consenso Pfam00657.11 [familia 00657, versión 11 de la base de datos] (denominada de aquí en adelante consenso Pfam) y el alineamiento de varias secuencias con la secuencia consenso Pfam. Las flechas indican los residuos del sitio activo, las cajas subrayadas indican tres de las cajas de homología indicadas por [Upton C y Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Las letras mayúsculas en el consenso Pfam indican residuos conservados en muchos miembros de la familia. El símbolo - indica una posición en la que el modelo oculto de Markov del consenso Pfam esperaba encontrar un residuo pero no lo hizo, de manera que se inserta un hueco. El símbolo indica un residuo sin un residuo correspondiente en el consenso Pfam. Las secuencias son las secuencias de aminoácidos listadas en las Figuras 2, 16, 18, 20, 26, 28, y 30. Se encontró que todas estas proteínas eran activas frente a sustratos lipídicos.
La Figura 35 muestra un vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM que contiene el gen de la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida con etiqueta de His C terminal;
La Figura 36 muestra los resultados de ensayar extractos celulares en un Kit de Ensayo NEFA, que representa la actividad de una lípido aciltransferasa recombinante de A. salmonicida, frente a lecitina. Los pocillos de izquierda a derecha indican: un control positivo, un control negativo (es decir, extractos de plásmido vacío) y muestras recogidas después de 0, 1, 2 y 3 horas de cultivo después de inducción con IPTG;
La Figura 37 muestra la optimización del crecimiento de BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM que muestra que el cultivo a 30 °C resultó en la producción de la enzima con alta actividad frente a lecitina. Los extractos celulares se ensayaron para actividad fosfolipasa usando el kit de ensayo NEFA. Pocillos de izquierda a derecha: control positivo; control negativo; 20°C; 30°C;
La Figura 38 muestra extractos celulares crudos de BL21(DE3)pLysS que expresan lípido aciltransferasa activa incubados con el sustrato lecitina y la mezcla de reacción se analizó usando cromatografía en capa fina que muestra la presencia de productos de degradación. Carriles: 1. Sin enzima; 2. + A.sal -10ul 37°C; 3. + A. sal-20ul 37°C; 4. + A.sal - 10ul 24°C; 5. + A. sal -20u 24°C;
La Figura 39 muestra la purificación parcial de la Acil Transferasa de Aeromonas salmonicida que muestra la actividad fosfolipasa asociada con la proteína con etiqueta His purificada. SE = Extractos sonicados, His = Purificada con Ni-NTA spin-kit de Qiagen;
La Figura 40 muestra el vector de expresión pet12-A.h. GCAT=pSMa que contiene el gen de la Glicerolípido Acil Transferasa (GCAT) de Aeromonas hydrophila con etiqueta His C terminal se usó para transformar la cepa de E.coli BL21(DE3)pLysS;
La Figura 41 muestra la actividad de los extractos crudos (5 y 10ul) que contienen la enzima GCAT recombinante de Aeromonas hydrophila se ensayó frente a lecitina usando el kit de Ácido Graso no Esterificado (NEFA) (Roche, Suiza), que muestra la presencia de enzima activa frente al fosfolípido, lecitina;
La Figura 42 muestra la optimización del crecimiento de BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12-ASalGCAT= pSM que muestra que el cultivo a 30°C resultó en la producción de la enzima con alta actividad frente a lecitina. Los extractos celulares se ensayaron para actividad fosfolipasa usando el ensayo del kit NEFA;
La Figura 43 muestra la purificación parcial de las Acil Transferasas de Aeromonas hydrophila y A. salmonicida que muestra la actividad fosfolipasa asociada con la proteína con etiqueta His purificada. SE = Extractos sonicados, His = Purificada con Ni-NTA spin-kit de Qiagen);
La Figura 44 muestra la expresión de los genes de Aeromonas en Bacillus subtilis 163 que muestra la producción de enzima secretada con actividad tanto frente a lecitina como DGDG. pUB-AH= construcción que contiene el gen de A. hydrophila y pUB-AS, construcción con el gen de A. salmonicida, El filtrado del cultivo se incubó con los sustratos durante 60 minutos.
La Figura 45 y Figura 46 muestran gráficos que representan ácido graso y éster de colesterol como una función del tiempo. Los gráficos representan los resultados obtenidos por análisis de GLC en el ensayo para la medida de la actividad aciltransferasa en un producto alimenticio usando lecitina y colesterol en tampón como sustrato;
La Figura 47 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 36) de la construcción de fusión usada para mutagénesis del gen de la lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila en el Ejemplo 17. Los aminoácidos subrayados es un péptido señal de xilanasa;
La Figura 48 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 54) que codifica una enzima de Aeromonas hydrophila que incluye un péptido señal de xilanasa;
La Figura 49 muestra la estructura de condensados de proteína-ácido graso de aminoácidos;
La Figura 50 muestra un esquema que representa la reacción entre un ácido graso de fosfatidilcolina cuando se transfiere al grupo hidroxilo libre de aminoácidos que tienen un grupo hidroxilo libre disponible para esterificación, por ejemplo, tirosina o serina; y
La Figura 51 muestra un esquema de la reacción entre DGDG y glucosa cuando está catalizada por una lípido aciltransferasa
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: La clonación, secuenciación y expresión heteróloga de una transferasa de Aeromonos salmonicida subsp. Salmonicida
Cepas usadas:
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC 14174) se obtuvo de ATCC y se creció toda la noche a 30°C en medio Luria-Bertani (LB). Las células se centrifugaron y el ADN genómico se aisló usando los procedimientos para el aislamiento de ADN genómico de Qiagen Ltd. El conjunto de tampones de ADN genómico (cat. 19060), proteasa K (cat. 19131) y ARNasa A (cat. 19101) se obtuvieron todos de Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).
Se usó la cepa bacteriana huésped BL21(DE3)pLysS (Novagen) para la producción de enzimas recombinantes de Aeromonas. Se usaron células competentes de BL21(DE3)pLysS como huésped para la transformación con el vector de expresión pet12-AsaIGCAT=pSM. Los transformantes que contenían el plásmido apropiado se crecieron a 37°C en medio agar LB que contenía 100-ug de ampicilina/ml.
Construcción del vector de expresión pet12-AsalGCAT- pSM:
Para todas las amplificaciones del ADN de los genes de transferasa de Aeromonas, se usó el ADN genómico (0,2-1 ul) como molde y se usó ADN polimerasa pfu (2,5 unidades) con 10ul de tampón 10x pfu, 1ul de cada cebador (50pmoles/ul), 200 uMdNTP en un volumen total de reacción de 100ul. Las reacciones de PCR se realizaron en un ciclador térmico programable usando las condiciones siguientes: 95 °C durante 30 segundos, 30 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 2 minutos. Se aplicó una extensión adicional de 5 minutos a 72 °C.
La amplificación por PCR del gen de transferasa de A. salmonicida se realizó en 2 reacciones de PCR separadas. La reacción de PCR 1 se realizó usando parejas de cebadores, as1USNEW(5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3' [SEQ ID No. 68]) y asls950new (5'GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3' [SEQ ID No. 37]). Se realizó una segunda reacción de PCR para incorporar una etiqueta de Histidina C terminal usando el producto de PCR de la primera reacción y los cebadores: as1USNEW(5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3' [SEQ ID No. 38]) y AHLS1001(5'TTGGATCC GAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3' [SEQ ID No. 39]). El producto de PCR de la segunda reacción se purificó y se digirió con enzimas de restricción Ndel y BamHI. También se digirieron 2 ug de vector de ADN pET 12a con enzimas de restricción Nde1 y BamHI y se trató con fosfatasa. El pet12a y el producto de PCR de la reacción 2 tratados con las enzimas de restricción se purificaron y ligaron usando el Kit Rapid Ligation (Roche, Suiza). La mezcla de ligación se usó para transformar células de E. coli TOP10. Los transformantes se sembraron en placas en medio agar LB que contenía 100ug/ml de ampicilina.
El cebador del promotor T7 (5'TAATACGACTCACTATAG3' [SEQ ID No. 40]) y el cebador del terminador T7 (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3' [SEQ ID No. 41]) se usaron para verificar las secuencias y la orientación de los genes de Transferasa clonados en el vector pET12a. La secuenciación de ADN se realizó usando el kit de secuenciación ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle con 500ng de ADN plasmídico como molde y 3,2pmoles de cebadores del promotor y terminador T7.
La construcción mostrada en la Figura 35 se usó para transformar la cepa huésped bacteriana competente BL21(DE3)pLysS (Novagen) y los transformantes resistentes a ampicilina se escogieron y se usaron para análisis de expresión.
Expresión de la lípido aciltransferasa recombinante de Aeromonas salmonicida
La cuantificación de la actividad de la enzima frente a lecitina se determinó en extractos celulares usando el kit Ácido Graso no Esterificado (NEFA) (Roche, Suiza).
En la Figura 36, se creció BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM en medio LB + 100ug/ml de ampicilina y se incubó con agitación a 37°C hasta que se alcanzó una DO600 = 0,6 a 1,0. Los cultivos se indujeron usando IPTG (0,4mM) y la incubación continuó durante las 3 horas siguientes. Se tomaron muestras a 0 horas, 1, 2, y 3 horas después de la inducción con IPTG. La Actividad de la Enzima se ensayó usando el kit NEFA y lecitina como sustrato.
Optimización del Crecimiento para la producción de enzimas más activas
Se creció BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM en medio LB + 100µg/ml ampicilina y se incubó con agitación a diferentes temperaturas de crecimiento (37°C, 30°C, y 20 °C). La condición óptima para la producción de enzima lípido aciltransferasa activa fue cuando los cultivos se crecieron a 30°C como se muestra en la Figura 37.
Purificación parcial de la transferasa recombinante de Aeromonas salmonicida
Se creció la cepa BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12-AsalGCAT=pSM a 37°C y se prepararon extractos celulares crudos por sonicación. La enzima recombinante se purificó adicionalmente a partir de los extractos celulares crudos sonicados usando el Ni-NTA spin kit de Qiagen. Actividad fosfolipasa usando el kit NEFA y Lecitina como sustrato. Los extractos celulares crudos de BL21(DE3)pLysS que expresan transferasa activa se incubaron con el sustrato lecitina y la mezcla de reacción se analizó usando cromatografía en capa fina que muestra la presencia de productos de degradación (véase la Figura 38).
Purificación parcial de la transferasa recombinante de Aeromonas salmonicidae. Se creció la cepa BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12-AsalGCAT=pSM a 37°C y se prepararon extractos celulares crudos por sonicación. La enzima recombinante se purificó adicionalmente a partir del extracto celular crudo sonicado usando el Ni-NTA spin kit de Qiagen. Se ensayó la actividad fosfolipasa usando el kit NEFA y lecitina como sustrato (véase la Figura 39).
EJEMPLO 2 Clonación y Expresión de la transferasa de Aeromonas hydrophila en E. coli
Aeromonas hydrophila (ATCC #7965) se obtuvo de ATCC y se creció toda la noche a 30°C en medio Luria-Bertani (LB). Las células se centrifugaron y el ADN genómico se aisló usando los procedimientos para el aislamiento de ADN genómico de Qiagen Ltd. El conjunto de tampones de ADN genómico (cat. 19060), proteasa K (cat. 19131) y ARNasa A (cat. 19101) se obtuvieron todos de Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).
Se usó la cepa bacteriana huésped BL21(DE3)pLysS (Novagen) para la producción de enzimas recombinantes de Aeromonas. Se usaron células competentes de BL21(DE3)pLysS como huésped para la transformación con el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT=pSMa. Los transformantes que contenían el plásmido apropiado se crecieron a 37 °C en medio agar LB que contenía 100-ug de ampicilina/ml.
Construcción del vector de expresión pet12a-A.h.GCAT- pSMa:
Para todas las amplificaciones del ADN del gen de transferasa de Aeromonas, se usó el ADN genómico (0,2-1 ul) como molde y se usó ADN polimerasa pfu (2,5 unidades) con 10ul de tampón 10x pfu, 1ul de cada cebador (50pmoles/ul), 200 uMdNTP en un volumen total de reacción de 100ul. Las reacciones de PCR se realizaron en un ciclador térmico programable usando las condiciones siguientes: 95 °C durante 30 segundos, 30 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 2 minutos. Se aplicó una extensión adicional de 5 minutos a 72 °C.
La amplificación por PCR del gen de transferasa de A. hydrophila (ATCC #7965) se realizó en 2 reacciones de PCR separadas.
La
reacción de PCR 1 se realizó usando las parejas de cebadores, AHUS1
(5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3',
SEQ ID No. 42) y ahls950
(5'ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3', SEQ ID No. 43).
Se realizó una segunda reacción de PCR para incorporar una etiqueta de Histidina C terminal usando el producto de PCR de la primera reacción y las parejas de cebadores:
AHUS1(5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3 SEQ ID No. 44, ) y
AHLS1001(5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3' SEQ ID No. 45).
El producto de PCR de la segunda reacción se purificó y se digirió con enzimas de restricción Nde1 y BamHI. También se digirieron 2 ug de vector de ADN pET 12a con enzimas de restricción Nde1 y BamHI y se trató con fosfatasa. El pet12a y el producto de PCR de la reacción 2 tratados con las enzimas de restricción se purificaron y ligaron usando el Kit Rapid Ligation (Roche, Suiza). La mezcla de ligación se usó para transformar células de E. coli TOP10. Los transformantes se sembraron en placas en medio agar LB que contenía 100ug/ml de ampicilina.
El cebador del promotor T7 (5'TAATACGACTCACTATAG3') y el cebador del terminador T7 (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3') se usaron para verificar las secuencias y la orientación de los genes GCAT clonados en el vector pET12a. La secuenciación de ADN se realizó usando el kit de secuenciación ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle con 500ng de ADN plasmídico como molde y 3,2pmoles de cebadores del promotor y terminador T7.
La construcción mostrada en la Figura 40 se usó para transformar la cepa huésped bacteriana competente BL21 (DE3)pLysS (Novagen) y los transformantes resistentes a ampicilina se escogieron y se usaron para análisis de expresión.
Expresión de la transferasa de Aeromonas hydrophila en BL21(DE3)pLysS
La cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT= pSMa se creció en medio LB + 100ug/ml de ampicilina y se incubó con agitación a 37°C hasta que se alcanzó una DO600 = 0,6 a 1,0. Los cultivos se indujeron usando IPTG (0,4mM) y la incubación continuó durante las 3 horas siguientes. Se tomaron muestras a 0 horas, 1, 2, y 3 horas después de la inducción con IPTG. Se ensayó la Actividad de la Enzima usando el kit NEFA y lecitina como sustrato (Figura 41).
Optimización del Crecimiento para la producción de enzimas más activas
Se creció BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT= pSMa en medio LB + 100ug/ml de ampicilina y se incubó con agitación a diferentes temperaturas de crecimiento (37°C, 30 °C, y 20 °C). La condición óptima para la producción de enzima GCAT activa fue cuando los cultivos se crecieron a 30°C como se muestra en la Figura 42.
Purificación parcial de la transferasa recombinante de A.hydrophila (GCAT)
La cepa BL21(DE3)pLysS que porta el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT=pSMa se creció a 37°C y se prepararon extractos celulares crudos por sonicación. La enzima recombinante se purificó adicionalmente a partir de los extractos celulares crudos sonicados usando el Ni-NTA spin kit de Qiagen. Ensayo de actividad fosfolipasa usando el kit NEFA y Lecitina como sustrato. (Figura 43).
EJEMPLO 3: Expresión de transferasas de Aeromonas en Bacillus subtilis 163
Construcción de Plásmidos
Se usaron dos vectores de expresión diferentes de Bacillus subtilis (pUB 110 y pBE5) para la expresión heteróloga de los genes de Aeromonas en Bacillus subtilis. El vector pUB110 contiene el promotor de alfa amilasa mientras el vector pBE tiene el promotor P32 como la región reguladora para la expresión de los genes de Aeromonas fusionados. En pUB110, el primer aminoácido de los genes GCAT madura de Aeromonas se fusionó en marco con el último aminoácido de la secuencia del péptido señal de xilanasa de Bacillus subtilis mediante el sitio de restricción Nhe1, creando 2 aminoácidos adicionales al frente de las proteínas maduras. pBE5 contiene la fusión de la secuencia señal cgtasa en el sitio Nco1 para la secreción de las proteínas recombinantes en el filtrado del cultivo.
Se realizaron reacciones de PCR para obtener los genes de Aeromonas fusionados en marco con las secuencias señal de los vectores pUB 110 y pBE5. Se realizaron PCR usando las parejas de cebadores siguientes para el gen de A. hydrophila:
Reacción de PCR 1: usAHncol (5'ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEQ ID No. 46) y 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID No. 47)
Reacción de PCR 2: US-AhnheI (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEQ ID No. 48.) y IsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3, SEQ ID No. 49)
Se realizaron PCR usando las parejas de cebadores siguientes para el gen de A. salmonicida:
Reacción de PCR 3: US-Asncol (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEQ ID No. 50) y IsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID No. 51)
Reacción de PCR 4: US-ASnhel (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEQ ID No. 52) y IsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID No. 53)
Todos los productos de PCR se clonaron en PCR blunt II (vector TOPO) y se secuenciaron con cebadores de secuenciación inversos y directos.
Los clones de las reacciones de PCR 1 y 3 se cortaron con Nco1 y Bam HI y se usaron como insertos para ligación en el vector pBE5 cortado con Nco1/BamH1/fosfatasa. Los clones de las reacciones de PCR 2 y 4 se cortaron con Nhe1 y Bam H1 y se usaron como insertos para ligación en el vector pUB que se cortó con Nhe1/BamH1/fosfatasa.
Expresión de los genes transferasa de Aeromonas en Bacillus subtilis y caracterización de la actividad de la enzima.
Las acil transferasas de las dos especies de Aeromonas se han expresado con éxito en E. coli (resultados anteriormente). Las construcciones de fusión génica de Bacillus pUB110 y pBE5 se usaron para transformar Bacillus subtilis y los transformantes se seleccionaron sembrando en placas en placas de kanamicina. Los transformantes resistentes a kanamicina que se aislaron y crecieron en 2xYT son capaces de expresión heteróloga de los genes de Aeromonas en Bacillus. Los filtrados de los cultivos tienen actividad digalactosildiacilglicerol (DGDG) galactolipasa, además de tener actividades tanto acil transferasa como fosfolipasa. La actividad frente a digalactosildiacilglicerol (DGDG) se midió después de 60 minutos de incubación del sobrenadante del cultivo con el sustrato, DGDG de harina de trigo (que se puede obtener en Sigma) así como la actividad frente a lecitina como se muestra en la Figura
44. Bacillus produjo la enzima después de cultivo de toda la noche (20-24 horas) a 48 horas en el medio de cultivo como una proteína secretada. En algunos casos, se ha mostrado que la expresión de los genes de Aeromonas interfiere con la viabilidad y crecimiento celulares en Bacillus y E. coli, es, por lo tanto, necesario seleccionar cuidadosamente cepas de expresión y optimizar las condiciones de crecimiento para asegurar la expresión. Por ejemplo, varias cepas huésped de Bacillus (B.s 163, DB104 y OS 21) se transformaron con los vectores de expresión para comparaciones de crecimiento. B.s163 se puede transformar con los 2 genes de Aeromonas y es capaz de expresar la proteína activa. DB104 se puede transformar con todas las construcciones pero sólo es capaz de expresar la transferasa de A. salmonicida.
EJEMPLO 4: Fermentación y Purificación de lípido aciltransferasas de Aeromonas producidas en E. coli
Fermentaciones de E. coli:
Microorganismos
Se usaron en este estudio dos cepas de Eschericia coli, una que contiene una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (Ejemplo 2) y dos que contienen lípido aciltransferasas de Aeromonas salmonicida (Ejemplo 1).
La cepa de E. coli que contiene el gen de A. hydrophila se denominó DIDK0124 , y la cepa de E. coli que contiene el gen de A. salmonicida se denominó DIDK0125. La fermentación con DIDK0124 se denominó HYDRO0303 y la fermentación con DIDK0125 se denominó SAL0302. La proteína purificada de HYDRO025 se denominó REF#138. La proteína purificada de HYDRO0303 se denominó REF#135.
Medio de crecimiento y condiciones de cultivo
Agar LB
Las placas de agar LB usadas para el mantenimiento de las cepas contenía: 10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 5 g/L NaCl, 15 g/L agar, 100 mg/L ampicilina y 35 mg/L cloranfenicol. Las placas de agar se incubaron a 30°C.
Matraz oscilante de LB
El medio LB (50 mL por matraz oscilante) usado para la producción de material de inóculo para los cultivos en bioreactor contenía: 10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 5 g/L NaCl, 100 mg/L ampicilina y 35 mg/L cloranfenicol. Los matraces oscilantes se inocularon a partir de las placas de agar LB y se incubaron a 30°C y 200 rpm.
Cultivo en el bioreactor
Los cultivos en el bioreactor se realizaron en bioreactores construidos in situ de 6 L llenos con 4 L de medio que contenía: 10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 5 g/L NaCl, 8 g/L KH2PO4, 0,9 g/L MgSO4, 7H2O, 40 g/L glucosa monohidrato, 0,4 mL/ ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, Holanda), 10 mg/L (NH4)2Fe(SO4)26H2O, 0,7 mg/L CuSO4·5H2O, 3 mg/L ZnSO4·7H2O, 3 mg/L MnSO4H2O, 10 mg/L EDTA, 0,1 mg/L NiSO4·6H2O, 0,1 mg/L CoCl2, 0,1 mg/L H3BO4, 0,1 mg/L KI, 0,1 mg/L Na2MoO4·2H2O, 1 g/L ampicilina y 35 mg/L cloranfenicol.
Los bioreactores se inocularon con una cantidad de cultivo LB asegurando el fin del crecimiento después de aproximadamente 20 horas de cultivo (calculado a partir de la máxima velocidad de crecimiento específica de 0,6 h-1, la DO600 del matraz oscilante de LB y la DO600 final en el bioreactor de aproximadamente 20).
Se inoculó SAL0302 con 10 mL de cultivo LB, y se inoculó HYDRO0303 con 4 mL de cultivo LB.
Los bioreactores se operaron en las condiciones siguientes: temperatura 30°C, agitación 800-1.000 rpm (dependiendo del experimento), aireación 5 L/min, pH 6,9, pH control 8,75% (p/v) NH3-agua y 2 M H2SO4. La inducción se logró por la adición de isopropil β-D-tiogalactósido a una concentración final de 0,6 mM, cuando se produjeron 0,4 moles (HYDRO0303) y 0,7 moles CO2 respectivamente.
Recogida
Se usó el procedimiento siguiente para recoger y homogeneizar la biomasa:
1) El caldo de fermentación de las fermentaciones se centrifugó a 5.000 × g y 4°C durante 10 minutos, y se desechó el sobrenadante. La biomasa se almacenó a -20°C hasta el uso. La biomasa se descongeló y se resuspendió en 500 mL de 20 mM NaH2PO4, pH 7,4, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol e inhibidor de proteasa completo (sin EDTA) (Roche, Alemania).
2) La biomasa suspendida se homogeneizó a 2 kbares y 4°C en un disruptor celular de Constant Systems Ltd (Warwick, Reino Unido).
3) Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 10.000 × g y 4°C durante 30 minutos seguido de recogida del sobrenadante.
4) El sobrenadante se aclaró adicionalmente por centrifugación a 13.700x g y 4°C durante 60 minutos, seguido de recogida del sobrenadante.
5) El sobrenadante se filtró a través de filtros de 0,2 µm Vacu Cap (Pall Life Sciences, Reino Unido) y el filtrado se recogió para purificación cromatográfica inmediata.
Purificación cromatográfica de las Transferasas
Se empaquetó una columna (2,5 x 10 cm) con 50 ml de gel de Sefarosa Quelante ff. y se cargó con Ni-sulfato (según el método descrito por el fabricante, Amersham Biosciences). La columna se equilibró con 200 ml de 20 mM NaH2PO4, pH 7,4, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol. Se aplicaron 400 ml de crudo a la columna a un caudal de 5 ml/min. La columna se lavó con 20 mM NaH2PO4, pH 7,4, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol hasta que la UV280 alcanzó la línea base. La GCAT se eluyó con 40 ml de 20 mM NaH2PO4, pH 7,4, 500 mM NaCl y 500 mM Imidazol.
EJEMPLO 5: Fermentación y Purificación de lípido aciltransferasas de Aeromonas producidas en Bacillus subtilis.
Fermentaciones
BAC0318-19, BAC0323-24
Microorganismo
Los microorganismos usados en este estudio se originan de la transformación de una cepa huésped de Bacillus subtilis, #163 con un plásmido que contiene el gen que codifica la transferasa de Aeromonas salmonicida insertado en el vector pUB110OIS. La expresión del gen está controlada por un promotor de alfa-amilasa, y la secreción de la transferasa está mediada por la secuencia señal de la xilanasa de B. subtilis (Ejemplo 3). Las cepas se denominaron DIDK0138 (fermentación BAC0318-19) y DIDK0153 (fermentación BAC0323-24).
Medio de crecimiento y condiciones de cultivo Medio pre-cultivo
Se añadieron a un matraz oscilante (500 mL de volumen total, con deflectores) 100 mL de un medio que contenía:
NaCl
5 g/L
K2HPO4
10 g/L
Harina de soja
20 g/L
Extracto de levadura, BioSpringer 106
20 g/L
Antiespumante, SIN260
5 mL/L
5 el pH se ajustó a 7,0 antes de autoclavar
Después de autoclavar, se añadieron 6 mL 50% (p/p) de Nutriosa por matraz. Se añadió kanamicina a una concentración de 50 mg/L después de autoclavar.
Inoculación
Se inoculó un matraz oscilante de pre cultivo con cultivo congelado directamente de una preparación madre de 10 glicerol 25% (p/v). El matraz oscilante se incubó a 33°C y 175 rpm durante aproximadamente 16 horas, después de lo cual se usaron 50 mL para inocular el fermentador.
Fermentaciones Las fermentaciones se realizaron en fermentadores construidos in situ de 6 L. El medio discontinuo (3 L) contenía:
Licor de maíz fermentado (50% dw)
40 g/L
Extracto de levadura BioSpringer 153 (50% dw)
10 g/L
NaCl
5 g/L
CaCl2, 2H2O
0,25 g/L
Mn(NO3)2, H2O
0,2 g/L
Antiespumante SIN260
1 mL/L
Kanamicina (esterilizada por filtración al fermentador después de autoclavar
50 mg/L
La alimentación contenía:
Glucosa monohidrato
540 g/kg
MgSO4, 7H2O
4,8 g/kg
Antiespumante SIN260
4 mL/kg
Extracto de levadura, BioSpringer 153 (50% dw) (autoclavado separadamente)
150 g/kg
La alimentación en la fermentación BAC0318 y BAC0323 se empezó tomando como base el CO2 acumulado, según las ecuaciones siguientes: Alimentación-caudal[g/h]= 0, AcCO2 < 0,15 Alimentación-caudal[g/h]= 2,85 + t1,54, AcCO2  0,15 y t< 12 Alimentación-caudal[g/h]= 21,3, t > 12
t:
tiempo (horas) desde el punto en el que el CO2 acumulado (AcCO2) alcanzó 0,15 moles.
La alimentación en la fermentación BAC0319 y BAC0324 se empezó tomando como base el CO2 acumulado, según las ecuaciones siguientes: Alimentación-caudal[g/h]= 0, AcCO2 < 0,15 Alimentación-caudal[g/h]= 2,0 + t1,08, AcCO2  0,15 y t< 12 Alimentación-caudal[g/h]= 15, t > 12
t:
tiempo (horas) desde el punto en el que el CO2 acumulado (AcCO2) alcanzó 0,15 moles. El pH se controló a 7,0 añadiendo 12,5% (p/v) NH3-agua ó 2M ácido fosfórico. La aireación fue 3 L/min correspondiente a 1 vvm. La temperatura fue 33°C. El fermentador estaba equipado con dos propulsores de 8 cm Ø Rushton situados con una distancia de 10 cm.
Recogida
La biomasa se eliminó por centrifugación a 16.000x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se esterilizó por filtración y el filtrado se usó para purificación y ensayos de aplicación.
EJEMPLO 6: El "Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado" para la medida de la actividad aciltransferasa de una enzima.
La lípido aciltransferasa se aisló de Aeromonas salmonicida y se expresó en Bacillus subtilis. Esta enzima es muy eficaz para transferir ácido graso de lecitina a colesterol durante la formación de ésteres de colesterol. También se ha mostrado que la enzima tiene alguna actividad hidrolítica, que se observa por la formación de ácido graso libre. Las fosfolipasas tradicionales (EC3.1.1.4 y EC3.1.1.32) tienen la capacidad de hidrolizar lecitina durante la formación de ácidos grasos libres y lisolecitina, y no se han indicado reacciones transferasa para estas enzimas.
Detallamos en la presente memoria un ensayo que es capaz de medir la actividad tanto transferasa como hidrolítica de enzimas y así identificar lípido aciltransferasas según la presente invención, el ensayo usa un sustrato que contiene lecitina y colesterol. En este trabajo, se usó un sustrato basado en fosfatidilcolina y colesterol dispersado en un tampón. La cuantificación de los productos de la reacción se hizo por extracción de lípidos del sustrato seguido de análisis por GLC de los componentes lipídicos.
Procedimiento Materiales L-alfa-Fosfatidilcolina 95% (Planta) Avanti no. 441601 Colesterol: Sigma cat. C 8503 Palmitato de Colesterilo, Sigma C 6072 Estearato de Colesterilo, Sigma C 3549 Tampón HERPES Sigma cat. No. H 3375 Cloroformo, Grado analítico. Enzimas GCAT Purificada de A. salmonicida #178-9 Análisis por TLC.
La placa de TLC se activó en una vitrina calefactora (110°C) durante ½ h.
Se vertieron 100 ml de tampón de corrida en una cámara de cromatografía con tapa. Las paredes de la cámara se cubrieron con papel de filtro (Whatman 2) con el fin de saturar la cámara con el vapor del disolvente. La placa de TLC se puso en un marco y la muestra se aplicó en la placa de TLC 2 cm desde la parte inferior. La
placa de TLC se puso en la cámara de TLC con el tampón de corrida. Cuando el tampón de corrida alcanzó 14 cm desde la parte inferior de la placa, la placa de TLC se sacó y se secó en cámara de humos y se puso en la vitrina calefactora a 110 °C durante 10 minutos.
La placa de TLC se sumergió en el reactivo de revelado y se secó en la vitrina calefactora a 110 °C durante 15 minutos Tampón de corrida: Nr. IV: Cloroformo: Metanol : H2O (65:25:4) Nr.I: P-éter: MTBE : Ácido acético (60:40:1) Tampón de revelado (tampón Vanadato): 32 g Na2CO3 y 300 ml H2O (1M) Se añaden 18,2 g de pentóxido de vanadato (V2O5) y se disuelve durante calentamiento suave. La disolución se enfría hasta temperatura ambiente. Se añaden cuidadosamente 460 ml de 2,5 M H2SO4. (460 ml H2O +61 ml H2SO4) Se añade agua hasta 1.000 ml.
Análisis por GLC Cromatógrafo de Gas Capilar Pekin Elmer Autosystem 9000 equipado con una columna de sílice fusionada WCOT 12,5 m x 0,25 mm DI x 0,1 µ espesor de la película 5% fenil-metilsilicona (CP Sil 8 CB de Chrompack).
Gas vehicular: Helio. Inyector. PSSI inyección con división en frío (temp inicial 50°C calentado hasta 385°C), volumen 1,0µl Detector FID: 395°C
Programa del horno:
1 2 3
Temperatura del horno, °C.
90 280 350
Isotérmico, tiempo, min.
1 0 10
Velocidad de la temperatura, °C/min.
15 4
Preparación de la muestra: Se disolvieron 30 mg de muestra en 9 ml Heptano:Piridina, 2:1 que contiene el estándar interno heptadecano, 0,5 mg/ml. Se transfirieron 300µl de disolución de muestra a un vial con tapón engargolado, se añadieron 300 µl MSTFA (N-Metil-N-trimetilsilil-trifluoraceamida) y se hizo reaccionar durante 20 minutos a 60°C.
Cálculos: Los factores de respuesta para mono-di-triglicéridos y ácido graso libre se determinan a partir del Estándar 2 (mono-di-triglicérido). Los factores de respuesta para Colesterol, Palmitato de Colesterilo y Estearato de Colesterilo se determinaron a partir de materiales de referencia puros.
Resultados: Ensayo transferasa basado en fosfatidilcolina y colesterol como sustrato.
En lo que sigue, se ensayó la actividad transferasa de la transferasa en un sustrato basado en fosfatidilcolina y colesterol según el procedimiento siguiente.
Se disolvieron 450 mg de fosfatidilcolina (>95% PC Avanti producto no. 441601) y 50 mg de colesterol en cloroformo y se evaporó a sequedad en vacío. Se transfirieron 300 mg de mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton y se añadieron 15 ml de tampón 50mM HEPES pH 7. El lípido se dispersó en el tampón durante la agitación. El sustrato se calentó hasta 35°C durante el mezclado con un agitador magnético y se añadieron 0,25 ml de disoluciónde enzima. Éste es un entorno con alto contenido en agua de aproximadamente 95% de agua.
Se tomaron muestras de 2 ml después de 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción. Inmediatamente, se añadieron 25 µl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre y parar la reacción enzimática. Se añadieron 3,00 ml de cloroformo y la muestra se agitó vigorosamente en un Whirley durante 30 segundos. La muestra se centrifugó y se aislaron 2 ml de la fase de cloroformo y se filtraron a través de filtros de 0,45-µm en un vaso Dram de
5 10 ml tarado. El cloroformo se evaporó bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y las muestras se escalaron de nuevo. El lípido extraído se analizó por GLC.
Los resultados del análisis por GLC se muestran en la Tabla 1. Los resultados se expresan en % calculado sobre el lípido extraído. Se ilustra la cantidad de ácido graso y éster de colesterol formados como una función del tiempo en la Figura 45. Puede concluirse a partir de la Figura 45 que la reacción enzimática no es lineal como una función del
10 tiempo, porque se observa una actividad tanto hidrolítica como transferasa inicialmente fuerte. Después de aproximadamente 10 minutos y hasta aproximadamente 60 minutos, la reacción muestra una respuesta casi lineal de formación de ácido graso y éster de colesterol como una función del tiempo. Por lo tanto, se decidió observar la reacción enzimática en este intervalo de tiempo.
Tabla 1
Minutos
0 5 10 15 25 40 60
Colesterol, %
10,064 8,943 8,577 8,656 8,102 7,856 7,809
Éster de colesterol, %
0,000 1,571 2,030 2,058 2,282 2,659 3,081
FFA total, %
0,260 1,197 1,239 1,466 2,445 2,943 3,940
A partir del conocimiento acerca de la cantidad de lípido en la mezcla de reacción y la cantidad de enzima añadida fue posible calcular la formación de ácido graso y éster de colesterol expresada en umoles/ml de enzima (Tabla 2 y Figura 46).
Tabla 2
Minutos
10 15 25 40 60
µmoles/ml
µmoles/ml
µmoles/ml
µmoles/ml
µmoles/ml
FFA total
58,1 68,7 114,6 138,0 184,7
Éster de colesterol
88,8 90,0 99,3 115,6 133,8
A partir de los resultados de la Tabla 2 y la pendiente de las curvas de la Figura 46 fue posible calcular la cantidad de ácido graso y éster de colesterol como una función del tiempo expresada en µmoles/min por ml enzimas.
El cálculo de la actividad hidrolítica y la actividad transferasa se muestra en la Tabla 3. La actividad transferasa relativa se determinó usando el protocolo para la determinación del % de actividad aciltransferasa como se ha 25 descrito anteriormente en la presente memoria.
Tabla 3
Actividad hidrolítica (ácido graso)
2,52 µmoles/min por ml enzima
Actividad transferasa (éster de colesterol)
0,94 µmoles/min por ml enzima
Actividad total
3.45 µmoles/min por ml enzima
Actividad Transferasa relativa
27,1 %
Actividad hidrolítica relativa
72,9 %
Cribado de otras enzimas para actividad transferasa.
El método mencionado anteriormente se usó para cribar diferentes enzimas lipolíticas para actividad transferasa e 30 hidrolítica. Las enzimas se ensayaron como se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4
1
2 3 4 5
Sustrato
ml 15 15 15 15 15
#178-9Transferasa A. salmonicida 32 PLU-7/ml
ml 0,25
5% #3016, LIPOPAN® F (F. oxysporum)
ml 0,25
5%, Thermomyces lanuginosus
ml 0,25
5% Candida rugosa #2983
ml 0,25
5% Candida cylindracea #3076
ml 0,25
El sustrato que contenía 300mg de fosfatidilcolina/colesterol dispersado en tampón 50 mM HEPES pH 7,0 se calentó hasta 35 °C con agitación. Se añadió la disolución de enzima y la muestra se mantuvo a 35 °C con agitación. Las muestras se tomaron a intervalos regulares y se extrajeron con Cloroformo. Los lípidos aislados se analizaron por GLC con los resultados mostrados en la Tabla 5.
Tabla 5
Muestra
1
Transferasa 178-9
Minutos 0 5 10 15 25 40 60
FFA 1,216 2,516 2,983 2,62 2,894 3,448 3,911
Colesterol 7,547 6,438 6,365 6,15 6,136 5,936 5,662
Éster de Col. 0 1,835 2,177 2,44 2,58 2,851 3,331
2
Fusarium oxysporum (LIPOPAN® F) 0 5 10 15 25 40 60
FFA 1,216 1,345 1,796 1,95 2,487 2,424 2,977
Colesterol 7,547 7,309 7,366 7,33 7,429 7,341 7,326
Éster de Col. 0 0,26 0,386 0,35 0,267 0,36 0,394
3
Thermomyces lanuginosus 0 5 10 15 25 40 60
FFA 1,216 0,853 0,875 1 0,896 1,105 1,009
Colesterol 7,547 7,384 7,639 7,63 7,675 7,603 7,529
Éster de Col. 0 0 0 0 0 0 0
4
Candida rugosa (#2938) 0 5 10 15 25 40 60
FFA 1,216 0,982 0,987 1,02 1,135 1,131 1,15
Colesterol 7,547 7,438 7,656 7,66 7,638 7,575 7,5851
Éster de Col. 0 0 0 0 0 0 0
(continuación)
5
Candida cylandracea (#3076) 0 5 10 15 25 40 60
FFA 1,216 1,032 1,097 1,07 1,203 1,131 1,43
Colesterol 7,547 7,502 7,425 7,65 7,619 7,502 7,411
Éster de Col. 0 0 0 0 0 0
A partir del análisis por GLC se observó que sólo la lípido aciltransferasa (178-9) producía una cantidad significativa de éster de colesterol y ácidos grasos. La fosfolipasa de Fusarium oxysporum también proporcionó un incremento 5 estable de ácido graso libre pero sólo se formó una cantidad inicial pequeña de formación de éster de colesterol pero no se observó un incremento en éster de colesterol como una función de tiempo.
Tomando como base el conocimiento acerca de la cantidad de sustrato lipídico y los análisis por GLC fue posible calcular la actividad transferasa relativa y la actividad hidrolítica relativa tomando como base los resultados de 10 a 60 minutos de tiempo de reacción. Los resultados de la Transferasa 178-9 y la lipasa de Fusarium oxysporum se
10 muestran en la Tabla 6. Las demás enzimas ensayadas no mostraron actividad.
Tabla 6
Transferasa 178- 9
Fusarium oxysporum
Actividad hidrolítica, micromoles/min por ml enzima
1,03 0,96
Actividad transferasa, micromoles/min por ml enzima
0,40 0,01
Actividad total, micromoles/min por ml enzima
1,43 0,98
Actividad hidrolítica relativa
71,8. 98,7
Actividad transferasa relativa
28,2 1,3
El resultado mostrado en la Tabla 6 confirma una actividad transferasa significativa de la lípido aciltransferasa (muestra 178-9). También se observa que la actividad transferasa relativa concuerda bien con el experimento
15 mencionado en la Tabla 3.
Sin embargo, se observa una actividad transferasa muy baja de la fosfolipasa de Fusarium oxysporum. Este nivel de transferasa es tan bajo que se encuentra en la incertidumbre del análisis. Como se esperaba, la fosfolipasa de Fusarizrm oxysporum tiene una actividad hidrolítica significativa.
Conclusión.
20 Un sustrato artificial basado en fosfatidilcolina y colesterol purificados se usó como un sustrato para medir la actividad de transferasa de Aeromonas salmonicida. Entre 10 minutos y 60 minutos de tiempo de reacción, el ensayo proporcionó una formación casi lineal de ácidos grasos libres y éster de colesterol como una función del tiempo. Tomando como base la actividad entre 10 y 60 minutos de tiempo de reacción, se calcularon la actividad hidrolítica y la actividad transferasa.
25 Tomando como base los resultados del ensayo de la lípido aciltransferasa (en este caso una GCAT) de Aeromonas salmonicida en un sustrato artificial de fosfatidilcolina/colesterol en tampón se concluye que esta enzima tiene una actividad transferasa muy buena también en un sistema con un contenido en agua muy alto.
La fosfatidilcolina/colesterol en ensayo con tampón, puede usarse para medir la actividad transferasa e hidrolítica de una enzima. La fosfatidilcolina/colesterol en tampón sólo es lineal en un determinado límite de tiempo.
30 EJEMPLO 7: Inmovilización de una lípido aciltransferasa de Aeromonas salinonicida
Una lípido aciltransferasa (en este caso una GCAT) de A. salmonicida se inmovilizó en Celite 535 535 (de Flulca) por precipitación con acetona. Se agitaron lentamente 10 ml de disolución de enzima en tampón 20 mM TEA pH 7 con 0,1 gramos de Celite 535 535 (de Fluka) durante 2 horas a temperatura ambiente.
Se añadieron 50ml de acetona fría durante agitación continua. El precipitado se aisló por centrifugación 5.000 g durante 1 minuto. El precipitado se lavó 2 veces con 20 ml de acetona fría. El Celite se secó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. También se ha mostrado que la enzima tiene una alta actividad en entornos con alto contenido en agua (6-89%), el
uso de la transferasa, y otras transferasas para uso en la invención también pueden usarse por lo tanto en
aplicaciones con enzima inmovilizada con un contenido en agua significativo. Esto permite el reemplazo de los
disolventes usados por las lipasas inmovilizadas actuales en la bioconversión de lípidos usando transferasas.
EJEMPLO 8: Variantes de una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (Ahvd2) (SEQ ID No. 36 (véase la Figura 47)).
Se introdujeron mutaciones usando el kit de Mutagénesis Dirigida Multi-Sitio QuikChange® de Stratagene, La Jolla, CA 92037, EEUU según las instrucciones proporcionadas por Stratagene.
Las variantes en Tyr256 mostraron una actividad incrementada frente a fosfolípidos.
Las variantes en Tyr256 y Tyr260 mostraron una actividad incrementada frente a galactolípidos.
Las variantes en Tyr265 muestran una actividad transferasa incrementada con galactolípidos como el donante de acilo.
Los números indican las posiciones en la secuencia siguiente: Una enzima de Aeromonas hydrophila cuya secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID No. 36 en la Figura 47 (los aminoácidos subrayados muestran un péptido señal de xilanasa). La secuencia de nucleótidos es como se muestra como SEQ ID No. 54 en la Figura
48.
EJEMPLO 9 "Ensayo en Entorno con bajo Contenido en Agua"
Reacciones transferasa de enzimas lipolíticas en entorno con bajo contenido en agua. Procedimiento Materiales. Colesterol Sigma cat. C 8503 L-alfa-Fosfatidilcolina 95% (Planta) Avanti #441601 Aceite de soja, Aarhus United, DK. Cloroformo, Grado analítico Enzimas. #179, GCAT de A. Salmonicida #2427, Fosfolipasa A1 de Fusarium oxysporum. LIPOPAN® F de Novozymes, Dinamarca #1991, Fosfolipasa A2 de Páncreas, LIPOMOD 22L de Biocatalysts, Reino Unido #2373, lipasa de Candida
Antarctica, Novozyme 525 L de Novozymes Dinamarca. Ensayo enzimático Se disolvieron 13,1 % Lecitina y 6,6% colesterol en aceite de soja calentando hasta 60 °C durante agitación El sustrato se escaló en un vaso Wheaton de 20 ml y se calentó hasta 46 °C Se añadieron agua y disolución de enzima y se puso en marcha un cronómetro. A intervalos regulares, se transfirieron muestras de 50 mg a un vaso Dram de 10ml y se congelaron. Los lípidos
aislados se analizaron por GLC
Análisis por GLC Para los protocolos de análisis por GLC - véase el ejemplo 6
Resultados
El experimento se puso a punto como se muestra en la Tabla 8.
El sustrato basado en aceite de soja que contenía 13,1 % lecitina y 6,6% colesterol se calentó hasta 46°C. Se añadió la disolución de enzima y se puso en marcha un cronómetro. Después de 30, 60 y 120 minutos de tiempo de reacción, se tomaron muestras para análisis por GLC.
Tabla 8
Sustrato Gramo 5 5 5 5 5 Transferasa #179-C72, 56 PLU-7/ml Ml 0,3 #2427, 200 PLU-7/ml Ml 0,3 Páncreas PLA 2 #1991 6300 PLU/ml Ml 0,3 Novozyme 525 L, #2373, 200 LIPU/ml Ml 0,3
Agua Ml 0,3
% de agua 66666
Los resultados del análisis por GLC se muestran en la Tabla 9. Los resultados se expresan en porcentaje basado en la composición total de la muestra. Tomando como base los resultados de GLC fue posible calcular la cantidad de ácido graso y éster de colesterol producida por la reacción enzimática respecto a la muestra control sin enzima añadida. En estas condiciones experimentales, la actividad enzimática total se estimó como la actividad hidrolítica medida como formación de ácido graso libre y la actividad transferasa estimada como la formación de éster de colesterol. A partir de estos resultados y la información acerca del peso molecular de ácido graso y éster de colesterol, fue posible calcular la actividad hidrolítica molar relativa y la actividad transferasa molar relativa como se muestra en la Tabla 10.
Tabla 9
Enzima Tiempo de reacción minutos Ácido graso % Colesterol % % Éster de colesterol
Control 120 0,533 7,094 0,000
#179 30 0,770 5,761 2,229
#179 60 0,852 5,369 2,883
#179 120 0,876 4,900 3,667
#2427 30 3,269 7,094 0,000
#2427 60 3,420 7,094 0,000
#2427 120 3,710 7,094 0,000
#1991 30 2,871 7,094 0,000
#1991 60 3,578 7,094 0,000
#1991 120 3,928 7,094 0,000
Enzima
Tiempo de reacción minutos Ácido graso % Colesterol % % Éster de colesterol
#2373
30 1,418 7,094 0,000
#2373
60 1,421 7,094 0,000
#2373
120 1,915 7,094 0,000
Tabla 10
Tiempo de Ácido graso Colesterol Éster de colesterol Actividad Actividad
Enzima
reacción minutos producido Usado producido hidrolítica % Transferasa %
#179
30 0,238 1,334 2,229 20 80
#179
60 0,319 1,725 2,883 21 79
#179
120 0,343 2,195 3,667 18 82
#2427
30 2,737 0,000 0,000 100 0
#2427
60 2,887 0,000 0,000 100 0
#2427
120 3,177 0,000 0,000 100 0
#1991
30 2,338 0,000 0,000 100 0
#1991
60 3,046 0,000 0,000 100 0
#1991
120 3,395 0,000 0,000 100 0
#2373
30 0,885 0,000 0,000 100 0
#2373
60 0,888 0,000 0,000 100 0
#2373
120 1,383 0,000 0,000 100 0
Conclusión
En estos experimentos, se observó que todas las enzimas ensayadas mostraron actividad hidrolítica ya que se incrementó la cantidad de ácido graso. Sin embargo, la única enzima que mostró actividad transferasa fue GCAT de
A. salmonicida. Por lo tanto, se concluye que en un sistema graso con lecitina y colesterol que contiene 6% de agua, la fosfolipasa A1 de Fusarizan oxysporum, fosfolipasa A2 de páncreas y una lipasa de Candida antarctica sólo mostraron actividad hidrolítica.
Ejemplo 10: Producción de éster de carbohidrato con lípido aciltransferasa inmovilizada según la presente invención.
Los ésteres de carbohidrato de ácidos grasos como ésteres de sacarosa y ésteres de glucosa se producen tradicionalmente por la reacción de un ácido graso o un jabón de ácido graso y el carbohidrato a alta temperatura (Journal of the Americal Oil Chemists' Society (1978) 55; 4; 398-401) Sin embargo, este procedimiento tiene la desventaja de formar reacciones secundarias y subproductos coloreados.
En la presente invención, los ésteres de carbohidrato de ácidos grasos se producen por una reacción transferasa usando lecitina como donante de ácido graso y un carbohidrato como glucosa como molécula aceptora.
La reacción se realiza en un reactor de flujo con una lípido aciltransferasa inmovilizada en un soporte sólido.
Procedimiento.
Se disuelven 100 gramos de glucosa en 1.000 ml de agua durante agitación, se dispersan 200 gramos de fosfatidilcolina en la fase de agua durante agitación y se calienta hasta 40°C.
El pH se ajusta a pH 6,5.
Se empaqueta un reactor de flujo con 100 g de una lípido aciltransferasa de A. salmonicida inmovilizada en un soporte sólido. El reactor de flujo se pone en una cabina de calentamiento a 40 °C. La mezcla de reacción se bombea en la columna con 2 ml/min. Se recoge el producto de la reacción. El agua en el producto de la reacción se elimina por evaporación en vacío con película fina y se aíslan los lípidos.
El éster de glucosa se separa de los demás lípidos por fraccionamiento con disolvente. Los ésteres de carbohidrato pueden usarse para muchas aplicaciones, tales como emulsionantes eficaces en la industria alimentaria y no alimentaria.
Ejemplo 11 - En la presente memoria se describe como referencia la producción de éster de proteína con una lípido aciltransferasa.
Los condensados de ácido graso de aminoácidos, péptidos o proteínas pueden producirse por una reacción con transferasa. En esta reacción, la fosfatidilcolina se usa como donante para la transferencia de ácido graso al grupo hidroxilo libre de aminoácidos (tal como tirosina, serina o treonina) que tienen un grupo hidroxilo libre disponible para esterificación.
Procedimiento 1.
Se disuelven 50 gramos de 1-tirosina (o serina o treonina) en 1.000 ml de agua durante agitación, se dispersan 200 gramos de fosfatidilcolina en la fase de agua durante agitación y se calienta hasta 40°C.
El pH se ajusta a pH 7 y se mantiene a este pH con NaOH o HCl.
Se añaden 50 ml de la enzima lípido aciltransferasa de A. salmonicida y la reacción se continúa a 40°C con agitación.
Se toman muestras a intervalos regulares y se analizan por TLC y HPLC.
Después de 20 h de tiempo de reacción, la reacción ha alcanzado el equilibrio y la reacción se para.
Se aíslan condensado de tirosina ácido graso, lecitina y lisolecitina del medio de reacción por centrifugación según métodos estándar (véase "Centrifiges, Filtering" en - Ulhnann's Encyclopedia of Industrial Chemistry por ejemplo (2002) por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA).
El condensado de tirosina ácido graso se purifica adicionalmente por cromatografía en columna de interacción hidrofóbica y la fracción que contiene el condensado tirosina ácido graso se aísla y el disolvente se elimina por evaporación. (véase 'Basic Principles of Chromatography' en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.)
Procedimiento 2.
En lo que sigue, se ensayó la actividad transferasa de una lípido aciltransferasa en un sustrato basado en fosfatidilcolina y 1-tirosina según el procedimiento siguiente.
Se escalaron 450 mg de fosfatidilcolina (>95% PC Avanti producto no. 441601) y 50 mg de 1-tirosina en un vaso Wheaton y se añaden 15 ml de tampón 50mM HEPES pH 7. El lípido se dispersa en el tampón durante agitación.
El sustrato se calienta hasta 35°C mientras se mezcla con un agitador magnético y se añaden 0,25 ml de Transferasa 10 PLU/ml.
Se toman muestras de 2 ml después de 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción.
Inmediatamente, se añaden 25 µl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre y parar la reacción enzimática. Se añaden 3,00 ml de cloroformo y la muestra se agita vigorosamente en un Whirley durante 30 segundos. La muestra se centrifuga y se aíslan 2 ml de la fase de cloroformo y se filtran a través de filtros de 0,45-µm en un vaso Dram de 10 ml tarado.
El cloroformo se evapora bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y la muestra se escala de nuevo. El lípido extraído se analiza por TLC.
Ejemplo 12 - Se describe como referencia la producción de éster de hidroxi ácido (en particular éster de ácido láctico) con una lípido aciltransferasa.
Los hidroxi ésteres de ácidos grasos se producen tradicionalmente por la reacción entre un ácido graso y un hidroxi ácido a alta temperatura usando sales inorgánicas o iones metálicos como catalizadores (véase por ejemplo Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Quinta edición, Volumen 3. Edible Oil and Fat Products: Products and Application Technology, página 502-511.) Sin embargo, este procedimiento tiene la desventaja de formar reacciones secundarias y subproductos coloreados.
Los ésteres de hidroxi ácido de ácidos grasos pueden producirse por una reacción transferasa usando lecitina como donante de ácido graso y un hidroxi ácido (en particular ácido láctico) como molécula aceptora.
Procedimiento.
Se disuelven 50 gramos de ácido láctico en 1.000 ml de agua mientras se agita, se dispersan 200 gramos de fosfatidilcolina en la fase de agua durante agitación y se calienta hasta 40°C.
El pH se ajusta a pH 6,5 y se mantiene a este pH con NaOH o HCl.
Se añaden 50 ml de la enzima lípido aciltransferasa de A. salmonicida y la reacción se continúa a 40°C mientras se agita.
Se toman muestras a intervalos regulares y se analizan por TLC y GLC.
Después de 20 h de tiempo de reacción, la reacción ha alcanzado el equilibrio y la reacción se para.
Se aíslan éster de ácido láctico, lecitina y lisolecitina del medio de reacción por centrifugación según métodos estándar (véase "Centrifiges, Filtering" en Ulhnann's Encyclopedia of Industrial Chemistry por ejemplo (2002) por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA).
El éster de ácido láctico se purifica adicionalmente por destilación molecular y se obtiene un éster de ácido láctico de ácido graso con una alta pureza.
Ejemplo 13 - Se describe como referencia la producción de éster de ácido cítrico con una lípido aciltransferasa.
Ensayo transferasa basado en fosfatidilcolina y ácido cítrico como sustrato.
En lo que sigue, se ensaya la actividad transferasa de una lípido aciltransferasa de A. salmonicida en un sustrato basado en fosfatidilcolina y ácido cítrico según el procedimiento siguiente.
Se escalan 450 mg de fosfatidilcolina (>95% PC Avanti producto no. 441601) y 50 mg de ácido cítrico en un vaso Wheaton y se añaden 15 ml de tampón 50mM HEPES pH 7. El lípido se dispersa en el tampón durante agitación.
El sustrato se calienta hasta 35°C durante el mezclado con un agitador magnético y se añaden 0,25 ml de lípido aciltransferasa de A. Salmonicida 10 PLU/ml.
Se toman muestras de 2 ml después de 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción.
Inmediatamente, se añaden 25 µl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre y parar la reacción enzimática. Se añaden 3,00 ml de cloroformo y la muestra se agita vigorosamente en un Whirley durante 30 segundos. La muestra se centrifuga y se aíslan 2 ml de la fase de cloroformo y se filtran a través de filtros de 0,45-µm en un vaso Dram de 10 ml tarado.
El cloroformo se evapora bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y la muestra se escala de nuevo. El lípido extraído se analiza por TLC.
Aunque la presente invención se ha descrito en conexión con realizaciones específicas preferidas, debe entenderse que la invención según se reivindica no debe limitarse excesivamente a dichas realizaciones específicas. De hecho, se pretende que varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, que son obvias para los expertos en los campos de la bioquímica y biotecnología o campos relacionados, estén en el alcance de las reivindicaciones siguientes.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> DANISCO A/S 5 <120> MÉTODO
<130> P015575EPA
<150> GB 0301121.0 10 <151>
<150> GB 0301122.8
<151>
15 <150> GB 0301117.8
<151>
<150> GB 0301120.2
<151>
20
<150> GB 0301119.4
<151>
<150> GB 0301118.6 25 <151>
<150> GB 0330016.7
<151> 30 <150> US 60/489441
<151>
<160> 68 35 <170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 361
<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia consenso 45 <400> 1
<210> 2
<211> 335
<212> PRT
<213> Aeromonas hydrophila
<400> 2
<210> 3
<211> 336
<212> PRT
<213> Aeromonas salmonicida
<400> 3
<210> 4
<211> 295
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 4
<210> 5
<211> 295
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 5
<210> 6
<211> 238
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 6
<210> 7
<211> 1005
<212> ADN
<213> Aeromonas hydrophila
<400> 7
<210> 8
<211> 1011
<212> ADN
<213> Aeromonas salmonicida
<400> 8
<210> 9
<211> 888
<212> ADN 15 <213> Streptomyces coelicolor
<400> 9
<210> 10
<211> 888
<212> ADN
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 10
<210> 11 15 <211> 717
<212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 11
5 <210> 12
<211> 347
<212> PRT
<213> Ralstonia sp.
10 <400> 12
5 <210> 13
<211> 1044
<212> ADN
<213> Ralstonia sp.
10 <400> 13
<210> 14
<211> 295
<212> PRT
<213> Aeromonas hydrophila
<400> 14
<210> 15
<211> 295
<212> PRT
<213> Aeromonas salmonicida
<400> 15
<210> 16
<211> 247
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 16
<210> 17
<211> 247
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 17
<210> 18 10 <211> 198
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 18 15 5 <210> 19
<211> 317
<212> PRT
<213> Aeromonas salmonicida
10 <400> 19
<210> 20
<211> 261
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 20
<210> 21
<211> 786
<212> ADN
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 21
<210> 22
<211> 260
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 22
<210> 23
<211> 783
<212> ADN
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 23
<210> 24
<211> 454
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 24
<210> 25
<211> 1365
<212> ADN
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 25
<210> 26
<211> 340 10 <212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 26
<210> 27
<211> 1023
<212> ADN
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 27
<210> 28
<211> 305
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 28
<210> 29
<211> 918
<212> ADN
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 29
<210> 30 15 <211> 268
<212> PRT
<213> Streptomyces rimosus
<400> 30
<210> 31
<211> 1068
<212> ADN
<213> Streptomyces rimosus
<400> 31
<210> 32
<211> 335 10 <212> PRT
<213> Aeromonas hydrophila
<400> 32
<210> 33
<211> 1008
<212> ADN
<213> Aeromonas hydrophila
<400> 33
<210> 34
<211> 336
<212> PRT 15 <213> Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida
<400> 34
<210> 35
<211> 1011
<212> ADN
<213> Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida
<400> 35
<210> 36 15 <211> 347
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Construcción de fusión
<400> 36
<210> 37
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 37
<210> 38
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 38
<210> 39
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 39
<210> 40
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 40
<210> 41
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 41
<210> 42
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 42
<210> 43
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 43
<210> 44
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 44
<210> 45
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 45
<210> 46
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 46
<210> 47
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 47
<210> 48
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 48
<210> 49
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 49 <210> 50
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 50
<210> 51
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 51
<210> 52
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 52
<210> 53
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 53
<210> 54
<211> 1047
<212> ADN
<213> Aeromonas hydrophila
<400> 54
<210> 55
<211> 320
<212> PRT
<213> Ralstonia solanacearum
<400> 55
<210> 56
<211> 226
<212> PRT
<213> Streptomyces rimosus
<400> 56
<210> 57
<211> 182
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 57
<210> 58
<211> 179
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 58
<210> 59
<211> 203
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 59
<210> 60
<211> 188
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 60
<210> 61
<211> 231
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 61
<210> 62
<211> 295
<212> PRT
<213> Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida
<400> 62
<210> 63
<211> 295
<212> PRT
<213> Aeromonas hydrophila
<400> 63
<210> 64
<211> 4 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Resto de secuencia 10
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4) .. (4)
<223> Xaa puede ser uno de los residuos de aminoácidos siguientes Leu, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, His, Gln, Thr, Asn, Met o Ser.
<400> 64
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Bloque 1 bloque GDSX
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (1) .. (4)
<223> Xaa es un residuo hidrofóbico seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (8) .. (8)
<223> Xaa es un residuo hidrofóbico seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<400> 65
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Bloque 2 bloque GANDY
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (1) .. (1)
<223> Xaa es un residuo hidrofóbico seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (3) .. (3)
<223> Xaa es un residuo hidrofóbico seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (6) .. (6)
<223> Xaa es un residuo hidrofóbico seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<400> 66
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Resto de secuencia
<400> 67
<210> 68
<211> 35
<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
15 <400> 68

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para producir un éster de carbohidrato, método que comprende mezclar un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua para producir un entorno con alto contenido en agua que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido, en el que el donante de acilo no es un éster de carbohidrato, y dicho aceptor de acilo es un carbohidrato; y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicha lípido aciltransferasa cataliza una o ambas de las reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:
    i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;
    ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;
    iii) calentar el sustrato hasta 35°C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0,25ml de disolución de enzima;
    iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 µl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;
    v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45µm en un vaso Dram de 10ml tarado;
    vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y escalar las muestras;
    vii) analizar el lípido extraído por GLC.
  2. 2.
    Un método según la reivindicación 1 en el que la lípido aciltransferasa está inmovilizada.
  3. 3.
    Un método según la reivindicación 1 o reivindicación 2 en el que el método comprende purificar el éster de carbohidrato.
  4. 4.
    Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad acil transferasa y que comprende el resto de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
  5. 5.
    Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa se clasifica como E.C. 2.3.1.x.
  6. 6.
    Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa puede obtenerse de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.
  7. 7.
    Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2; (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3; (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SED ID No. 5; (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6; (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32,
    (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 o SEQ ID No. 34.
  8. 8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos producida por la expresión de una o más de las secuencias de nucleótidos siguientes:
    (a)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 7 (véase la Figura 9);
    (b)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 8 (véase la Figura 10);
    (c)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 9 (véase la Figura 11);
    (d)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 10 (véase la Figura 12);
    (e)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 11 (véase la Figura 13);
    (f)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 13 (véase la Figura 15);
    (g)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 (véase la Figura 17);
    (h)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 (véase la Figura 19);
    (i)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 (véase la Figura 21);
    (j)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27 (véase la Figura 23);
    (k)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29 (véase la Figura 25);
    (l)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 (véase la Figura 27);
    (m)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 33 (véase la Figura 29);
    (n)
    la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 35 (véase la Figura 31);
    (o)
    o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35.
  9. 9. Uso de una lípido aciltransferasa para producir un éster de carbohidrato por catálisis de una o ambas de alcoholisis o transesterificación en una mezcla de un donante de acilo, un aceptor de acilo y agua, mezcla que comprende 5-98% de agua, en el que dicho donante de acilo es un sustrato lipídico seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glicolípido o un lisoglicolípido, en el que el donante de acilo no es un éster de carbohidrato, y dicho aceptor de acilo es un carbohidrato, en el que la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el Ensayo Transferasa en Sustrato Tamponado tiene al menos 2% de actividad aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo transferasa las etapas de:
    i) disolver 450mg de fosfatidilcolina y 50mg de colesterol en cloroformo, evaporar a sequedad en vacío;
    ii) transferir 300mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton, añadir 15ml de tampón 50mM HEPES pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;
    iii) calentar el sustrato hasta 35°C durante el mezclado con un agitador magnético y añadir 0,25ml de disolución de enzima;
    iv) tomar muestras de 2 ml a 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y parar inmediatamente la reacción enzimática por la adición de 25 µl de 4M HCl para acidificar el ácido graso libre;
    v) añadir 3ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45µm en un vaso Dram de 10ml tarado;
    vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60°C, y escalar las muestras;
    vii) analizar el lípido extraído por GLC.
  10. 10.
    Uso según la reivindicación 9 en el que la lípido aciltransferasa está inmovilizada.
  11. 11.
    Uso según la reivindicación 9 en el que el éster de carbohidrato se purifica.
  12. 12.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad acil transferasa y que comprende el resto de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
  13. 13.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 en el que la lípido aciltransferasa se clasifica como E.C.
  14. 2.3.1.x.
  15. 14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en el que la lípido aciltransferasa puede obtenerse de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfatobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella,
    Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.
  16. 15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-14 en el que la lípido aciltransferasa comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2; (ii) la 5 secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3; (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SED ID No. 5; (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6; (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ 10 ID No. 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ 15 ID No. 30, SEQ ID No. 32 o SEQ ID No. 34.
  17. 16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos producida por la expresión de una o más de las secuencias de nucleótidos siguientes:
    (a) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 7 (véase la Figura 9);
    20 (b) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 8 (véase la Figura 10);
    (c) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 9 (véase la Figura 11);
    (d) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 10 (véase la Figura 12);
    (e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 11 (véase la Figura 13);
    (f) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 13 (véase la Figura 15);
    25 (g) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 (véase la Figura 17);
    (h) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 (véase la Figura 19);
    (i) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 (véase la Figura 21);
    (j) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27 (véase la Figura 23);
    (k) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29 (véase la Figura 25);
    30 (l) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 (véase la Figura 27);
    (m) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 33 (véase la Figura 29);
    (n) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 35 (véase la Figura 31);
    (o) o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o o más de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ 35 ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35.
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