JP2006521787A - 方法 - Google Patents

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Abstract

脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加する、食料品中で乳化剤をｉｎ ｓｉｔｕ生成する方法。この乳化剤は、食料品の遊離脂肪酸含有量を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成されることが好ましい。脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質から、以下のアシル受容体、すなわち、ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質又はそのサブユニット、グリセリンの１種類または複数に、アシル基を転移させることが可能である脂質アシルトランスフェラーゼであることが好ましい。乳化剤に加えて、スタノールエステル又はスタノールエステル又はタンパク質エステル又は炭水化物エステル又はジグリセリド又はモノグリセリドの１種類若しくは複数を生成できることが好ましい。これらのうちの１種類又は複数は、追加の乳化剤として機能することができる。

Description

本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを使用することによって食料品中で乳化剤をインサイチュ（in situ）生成する方法に関する。
本発明は、さらに、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成される、脂質アシルトランスフェラーゼを使用することによって食料品中で乳化剤をインサイチュ生成する方法にも関する。
本発明は、さらに、脂質アシルトランスフェラーゼを使用することによって食料品中で少なくとも２種類の乳化剤をインサイチュ生成する方法にも関する。
本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを使用することによって、炭水化物エステル、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はグリセリンエステル、及び／又はヒドロキシ酸エステルを食料品中でインサイチュ生成する方法にも関する。
本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを含有する食品酵素組成物及び／又は飼料酵素組成物、並びに本発明の方法におけるそのような組成物の使用に関する。
本発明は、さらに、本発明による適切な脂質アシルトランスフェラーゼを特定する方法、並びにそのようにして特定された脂質アシルトランスフェラーゼにも関する。
本発明は、さらに、固定化脂質アシルトランスフェラーゼにも関する。
以下の関連出願、すなわち、１９９９年７月２０日に出願された米国特許出願第０９／７５０，９９０号、及び米国特許出願第１０／４０９，３９１号を参照されたい。これらの出願の各々、及びこれらの出願の各々において引用された文書の各々（「出願引用文書」）、及びその出願引用文書において参照又は引用された各文書（明細書中でも、又はこれらの出願の手続き中でも）、並びにそのような手続き中に提出された特許性を支持するすべての意見書（ａｒｇｕｍｅｎｔ）を参照により本明細書に援用する。様々な文書が本明細書でも引用されている（「本願引用文書」）。本願引用文書の各々、及び本願引用文書中で引用又は参照された各文書を参照により本明細書に援用する。
食品及び／又は飼料産業用途において使用されるホスホリパーゼ及びリパーゼ（脂肪分解酵素と称する、（ＥＣ．３．１．１．ｘ）が有利に使用されることは長年知られている。
例えば、欧州特許第０ ５８５ ９８８号においては、リパーゼを生地に添加すると、老化作用（ａｎｔｉｓｔａｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）が改善されると主張されている。リゾープスアリズス（Rhizopus arrhizus）から得られるリパーゼは、生地に添加されたときに、ショートニング／脂肪と併用したときに得られるパンの品質を改善できることが示唆されている。国際公開第９４／０４０３５号は、リパーゼを生地に添加することによって、追加の脂肪／油を生地に添加せずに、柔らかさを改善できることを教示している。Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinkiは、外来性リパーゼがパンの体積を改善できることを示している。
脂肪分解酵素は、食品中の脂質から脂肪酸の１個又は複数を加水分解して、商業的に価値のある機能を提供する強力な乳化剤分子を食料品中で形成することができる。最も重要な乳化剤特性に寄与する分子は、リゾリン脂質、リゾ糖脂質、モノグリセリド分子などの部分加水分解生成物である。リゾリン脂質、リゾ糖脂質などの極性脂質加水分解生成物は特に有利である。パンの製造においては、このようなインサイチュで得られる乳化剤は、ＤＡＴＥＭなどの乳化剤と同等の機能を果たすことができる。
しかし、脂肪分解酵素の活性は、遊離脂肪酸の蓄積ももたらし、食料品中に有害な機能をもたらす可能性がある。この脂肪分解酵素固有の活性によって、その機能が制限されている。
この問題の解決が当分野では多数試みられてきた。しかし、これらは、パン生地及び卵黄を含めて、ただしこれらだけに限定されない食料品、特に高含水量の食料品中の遊離脂肪酸がかなり増加する結果になる。
ホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼＡ２（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）は、卵又は卵を主成分とする製品を処理するのに長年使用されてきた（例えば、米国特許第４，０３４，１２４号及びDutihl & Groger 1981 J. Sci. Food Agric. 32,451-458を参照されたい）。卵又は卵を主成分とする製品の処理中に、ホスホリパーゼ活性によって、乳化剤として作用することができる極性リゾレシチンが蓄積される。卵又は卵を主成分とする製品のホスホリパーゼ処理によって、安定性、低温殺菌などの加熱処理における熱安定性が改善され、十分に濃縮することができる。卵を主成分とする製品としては、ケーキ、マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリームなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。ホスホリパーゼを使用すると、遊離脂肪酸が蓄積される。遊離脂肪酸が蓄積すると、かなりの異風味が生じる恐れがある。また、遊離脂肪酸が蓄積すると、酸化されやすくなることがあり、したがって賞味期限が短く、製品が変色し、風味、食感などの他の重要な食品特性が変化することがある。最近、より広範な基質特異性を有する脂肪分解酵素が、卵黄及び関連食料製品の処理のために製品化された。この脂肪分解酵素は、大部分のホスホリパーゼＡ２と異なり、哺乳動物源に由来しないという利点を有する。しかし、この脂肪分解酵素は、リン脂質を加水分解するだけでなく、トリグリセリドも加水分解するために、遊離脂肪酸がかなり蓄積する。
上述したように、リパーゼが広範に使用されている別の分野はパン製造業である。パンを焼くのにホスホリパーゼを使用することは、１９８０年代初頭に遡る。
小麦粉中のリパーゼの基質は、１．５〜３％の内因性コムギ脂質であり、これは、極性脂質と非極性脂質の複雑な混合物である。極性脂質は、糖脂質とリン脂質に分類することができる。これらの脂質は、２個の脂肪酸でエステル化されたグリセリンと１個の極性基で構成されている。極性基は、これらの脂質の界面活性の一因となっている。これらの脂質中の脂肪酸の１個が酵素によって切断されると、脂質の界面活性ははるかに高くなる。ＤＡＴＥＭなどの高い界面活性を有する乳化剤は、生地に添加されたときに、極めて機能的であることは良く知られている。
しかし、生地生成物中のリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．Ｘ）は、酵母活性に有害な影響を及ぼし、且つ／又はパンの体積にマイナスの効果をもたらす恐れがある。パンの体積に対するマイナスの効果は、過量によって説明されることが多い。過量によって、グルテンの弾性が低下し、生地が堅くなり、したがってパンの体積が減少することがある。これに加えて、又はこれとは別に、このようなリパーゼは、生地に添加されたショートニング、油又は乳脂肪を劣化させ、生地及び焼き上げた製品に異風味をもたらす恐れがある。過量及び異風味は、生地中に遊離脂肪酸が蓄積するためである。
欧州特許第１ １９３ ３１４号、欧州特許第０ ９７７ ８６９号及び国際公開第０１／３９６０２号では、部分加水分解生成物であるリゾ糖脂質が極めて高い乳化剤機能を有し、有害な遊離脂肪酸の蓄積よりもプラスの乳化剤機能の比率が明らかに高くなることが判明し、糖脂質に作用する脂肪分解酵素の使用が、パン製造に応用するのに特に有益であることが報告された。しかし、これらの酵素は、トリグリセリドに対してかなり非選択的な活性を有し、不必要に高い遊離脂肪酸を生じることも判明した。
同じ知見が国際公開第００／３２７５８号にも報告された。国際公開第００／３２７５８号は、リン脂質及び／又は糖脂質に対して高い活性を有する脂肪分解酵素変異体と、それに加えて、短鎖脂肪酸ではなく長鎖脂肪酸を好む変異体を開示した。この後者の特徴は、国際公開第０１／３９６０２号にも開示されており、遊離短鎖脂肪酸の蓄積に伴う異風味を防止するのに特に重要と考えられる。しかし、かなりの遊離脂肪酸が生成する。
高トリグリセリド活性の問題は、国際公開第０２／０９４１２３号において検討され、生地中の極性脂質（すなわち、糖脂質及びリン脂質）に対して活性であるが、トリグリセリド又は１−モノ−グリセリドに対しては実質的に不活性な脂肪分解酵素の使用が教示されている。しかし、かなりの遊離脂肪酸が生成する。
一部の脂肪分解酵素は、極性脂質（例えば、糖脂質／リン脂質）のリゾ体に対する活性が低いか、又はない。このような酵素の使用は、高極性リゾ−脂質が確実に蓄積され、最適な機能が得られるので好ましいと考えられている。しかし、遊離脂肪酸もやはり蓄積される。この選択的な機能は、欧州特許第０ ９７７ ８６９号、欧州特許第１ １９３ ３１４号、及び国際公開第０１／３９６０２号に開示されたホスホリパーゼＡ２酵素及びグリコリパーゼに特徴的である。リゾ−極性脂質に対する活性が親酵素よりも低く、選択性のより低い脂肪分解酵素の変異体酵素が製造されている（国際公開第０３／０６０１１２号）。しかし、かなりの遊離脂肪酸が生成する。
国際公開第００／０５３９６号は、乳化剤が酵素によって脂肪酸エステルから生成され、第２の機能成分が第２の構成物質から生成されるように食品材料が酵素と接触している、乳化剤を含む食料品を調製する方法を教示している。国際公開第００／０５３９６号は、特にリパーゼ又はエステラーゼ酵素の使用を教示している。特に脂質アシルトランスフェラーゼを使用することは、国際公開第００／０５３９６号のどこにも教示されていない。また、高含水量の食料品においては、国際公開第００／０５３９６号に教示されたエステラーゼ及びリパーゼの使用によって、かなりの遊離脂肪酸が蓄積するはずである。
ホスホリパーゼ及びグリコリパーゼを含めて、リパーゼの使用に伴う欠点は、脂質から遊離した遊離脂肪酸の蓄積によって生じると考えられる。過去数十年にわたって、食料品における脂肪分解酵素の使用は、有害な遊離脂肪酸の蓄積とプラスの機能を提供するリゾ−脂質の生成とのバランスのために制限されてきた。当分野では多数の戦略が試みられており、その一部はかなりの機能改善をもたらしたが、当分野における基礎的な問題、すなわち、脂肪分解酵素をインサイチュで使用して調製された食料品におけるかなりの遊離脂肪酸の蓄積を徹底して取り扱い、解決したものはない。
原材料又は食料製品中に遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が高レベルで存在することは、一般に品質欠陥と認識されており、食品加工業者及び消費者は、通常、食品規格に最大ＦＦＡレベルを含めている。過剰ＦＦＡレベルの結果生じる作用は、感覚器官が感知し得る欠陥及び／又は機能的な欠陥であり得る。
脂肪分解の結果は加水分解性酸敗であり、特徴的な「石けんのような」風味が形成される。高濃度では存在しないが、例えば、乳製品又は植物油の重要な構成物質であり得る中間的な鎖長（Ｃ８〜Ｃ１２）の脂肪酸で、この「石けんのような」味覚は特に激しい。感覚器官が感知し得るより一般的な欠陥は、脂肪分解酵素と酸化プロセスの複合作用によるものである。不飽和脂肪酸は、アシル脂質中でエステル化されているときよりもエステル化されていないときのほうが、酵素による酸化を受けやすい。
高ＦＦＡレベルによる食品の機能的欠陥は、認識されてはいるが説明が容易ではない。理論に拘泥するものではないが、未変化の脂質のカルボン酸への加水分解によって、［Ｈ＋］が増加し、他の化合物又は金属イオンと結合することができるカルボニル基が生成される。遊離脂肪酸は、疎水性相互作用によってタンパク質とも結合し、調理中にデンプンとも複合体を形成する。ＦＦＡは、極性脂質、乳化剤などの界面活性剤の作用を妨害することもある。（Lipid in Cereal Technology, P. J. Barnes, Academic Press 1983）。
国際公開第０３／１０００４４号は、ＰＤＡＴ（又はＡＴＷＡＸ）として知られるアシルトランスフェラーゼの一クラスを開示している。これらの酵素は、受容体分子としてモノグリセリド又はジグリセリド、供与体分子としてホスファチジルコリン（ＰＣ）を使用して、以下の生成物、すなわち、リゾホスファチジルコリン及びトリアシルグリセロール及び／又はジアシルグリセロールを生成する。
一実施形態においては、本発明は、食料製品中への乳清タンパク質の取り込みを改善し、食品組成物及び製品の食感などの品質を損なわずに収率を改善することに関する。
チーズ組成物は、一般に、凝結剤又は凝固剤で乳製品液体を処理することを含むプロセスによって乳製品液体から調製される。凝結剤は、凝乳酵素、酸、又は適切な細菌培養物とすることができ、或いはこのような培養物を含んでいてもよい。得られる凝乳は、一般に、形質転換カゼイン、天然バター脂肪を含めた脂肪、及び特に細菌培養物を使用するときに生じる香味料を取り込んでいる。凝乳は、凝固作用を受けず、したがって凝乳中に取り込まれない可溶性タンパク質を含有する液体乳清から分離することができる。
したがって、乳清は、チーズなどの食料製品を製造する商用プロセスにおける製造副生物である。乳清は、従来から、使用されない廃棄物として処分され、或いは肥料又は動物の飼料に使用され、或いは食品成分に加工されている。
乳清タンパク質を凝乳中に実質的に確保できないことは、チーズ凝乳などの従来の乳製品製造における効率を低下させ、出発乳製品液体中に存在するすべてのタンパク質固形分を、生成するチーズ凝乳中に取り込むことに関する全収率を低下させる重要な要因である。
例えば乳の加熱処理、乳清の加熱処理、又は限外ろ過などのろ過によって、乳清タンパク質をチーズに含ませる多数の試みがなされてきた。
乳清タンパク質を凝集させる特定のプロテアーゼの使用に関する記述もいくつかある。バチルスリケニホルミス（Bacillus licheniformis）に由来するセリンプロテアーゼは、乳清タンパク質を凝集させる能力を有することが判明している（米国特許第５，５２３，２３７号）。
しかし、チーズ製造などのプロセスにおいては、乳清タンパク質の添加に伴う多数の難点が依然としてある。例えば、乳清タンパク質をチーズに混合することは、製品の味覚及び口当たりの悪化を伴い、また、凝乳と、それに続く製品加工を妨げる傾向にある。乳清タンパク質を加水分解するためにチーズ乳に添加することができると以前に報告されたプロテアーゼは、Madsen, J.S. & Qvist, K.B. (1997) Hydrolysis of milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acid residues. J. Food Sci. 62, 579-582によって記述されたように、カゼインをかなり加水分解する結果になる。
リパーゼ：コレステロールアシルトランスフェラーゼは、かねてから知られている（例えば、Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493を参照されたい）。特に、植物及び／又は哺乳動物のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）のように、ホスファチジルコリンとコレステロールの間の脂肪酸の移動を触媒するグリセロリン脂質：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）が見出されている。
Upton and Buckley (TIBS 20, May 1995 p 178-179)及びBrumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996 p 2060-2064)は、水性媒体中でアルコール受容体へのアシル転移を起こすことができる、アエロモナス ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）由来のリパーゼ／アシルトランスフェラーゼを教示している。
欧州特許第０ ５８５ ９８８号 国際公開第９４／０４０３５号 米国特許第４，０３４，１２４号 欧州特許第１ １９３ ３１４号 欧州特許第０ ９７７ ８６９号 国際公開第０１／３９６０２号 国際公開第００／３２７５８号 国際公開第０２／０９４１２３号 国際公開第０３／０６０１１２号 国際公開第００／０５３９６号 国際公開第０３／１０００４４号 米国特許第５，５２３，２３７号 Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinki Dutihl & Groger 1981 J. Sci. Food Agric. 32,451-458 Lipid in Cereal Technology, P. J. Barnes, Academic Press 1983 Madsen, J.S. & Qvist, K.B. (1997) Hydrolysis of milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acid residues. J. Food Sci. 62, 579-582 Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493 Upton and Buckley (TIBS 20, May 1995 p 178-179) Brumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996 p 2060-2064)
したがって、感覚器官が感知し得る諸特性、及び他の望ましい諸特性を維持しながら、乳清タンパク質の食料製品中への取り込みを改善する方法及び組成物が当分野で求められている。このような最適化によって、効率が向上し、食料製品の収率が増加し、全体の材料コストが減少するはずである。
本発明の第１の態様によれば、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、食料品中で乳化剤をインサイチュ生成する方法が提供される。
別の態様においては、本発明は、食料品中で乳化剤をインサイチュ生成する方法であって、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、食料品中で乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルをインサイチュ生成する方法であって、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、食料品中で乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルをインサイチュ生成する方法を提供する。
本発明の別の態様によれば、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、食料品中で少なくとも２種類の乳化剤をインサイチュ生成する方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、食料品中で少なくとも２種類の乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルをインサイチュ生成する方法であって、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、食料品中で少なくとも２種類の乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルをインサイチュ生成する方法が提供される。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、食料品中で炭水化物エステルをインサイチュ生成する方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、食料品中で炭水化物エステルを乳化剤とともにインサイチュ生成する方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、食料品中で乳化剤、及び炭水化物エステル；ステロールエステル；スタノールエステル；タンパク質エステル；モノグリセリド又はジグリセリドの１種類又は複数をインサイチュ生成する方法を提供する。
本発明の別の態様によれば、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、乳化剤を含む食料品を製造する方法が提供される。
別の態様においては、本発明は、乳化剤を含む食料品を製造する方法であって、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む食料品を製造する方法であって、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む食料品を製造する方法を提供する。
本発明の別の態様によれば、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、少なくとも２種類の乳化剤を含む食料品を製造する方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、少なくとも２種類の乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む食料品を製造する方法であって、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、少なくとも２種類の乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む食料品を製造する方法が提供される。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、炭水化物エステルを含む食料品を製造する方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、炭水化物エステル及び乳化剤を含む食料品を製造する方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、乳化剤、及び炭水化物エステル；ステロールエステル；スタノールエステル；タンパク質エステル；モノグリセリド又はジグリセリドの１種類若しくは複数を含む食料品を製造する方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、乳化剤が脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、乳化剤を含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
別の態様においては、本発明は、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、乳化剤を含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
別の態様においては、本発明は、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、乳化剤、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステルが脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
別の態様においては、本発明は、乳化剤、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステルが脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
別の態様においては、本発明は、少なくとも２種類の乳化剤が脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、少なくとも２種類の乳化剤を含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
本発明の別の態様によれば、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、乳化剤の一方若しくは両方、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステルが脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、少なくとも２種類の乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。
本発明の別の態様によれば、乳化剤の一方若しくは両方、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステルが脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、少なくとも２種類の乳化剤並びにステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。
別の態様においては、本発明は、炭水化物エステルが脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、炭水化物エステルを含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
別の態様においては、本発明は、炭水化物エステル及び乳化剤が脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、少なくとも炭水化物エステル及びさらなる乳化剤を含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
別の態様においては、本発明は、乳化剤、及び／又は炭水化物エステル、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はモノグリセリド、及び／又はジグリセリドが、脂質アシルトランスフェラーゼによって食品材料の構成物質から生成される、乳化剤、及び炭水化物エステル；ステロールエステル；スタノールエステル；タンパク質エステル；モノグリセリド又はジグリセリドの１種類若しくは複数を含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
本発明の別の態様によれば、卵を主成分とする食料品中で乳化剤、好ましくは、リゾレシチン及びステロールエステルをインサイチュで生成する方法であって、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、卵を主成分とする食料品中で乳化剤、好ましくはリゾレシチン、及びステロールエステルをインサイチュ生成する方法が提供される。
別の態様においては、本発明は、卵を主成分とする食料品中で乳化剤、好ましくはリゾレシチン、及びステロールエステルを含む、卵を主成分とする食料品を製造する方法であって、乳化剤が、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを食料品に添加するステップを含む、卵を主成分とする食料品中に乳化剤、好ましくはリゾレシチン、及びステロールエステルを含む、卵を主成分とする食料品を製造する方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、さらに、本発明による方法によって得ることができる、好ましくは得られる食料品を提供する。
別の態様においては、本発明は、さらに、脂質アシルトランスフェラーゼを含有する食品酵素組成物及び／又は飼料酵素組成物、並びに本発明の方法におけるそのような組成物の使用にも関する。
本発明の別の態様によれば、「低水分環境（Ｌｏｗ Ｗａｔｅｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）におけるトランスフェラーゼアッセイ」、「高水分卵黄（Ｈｉｇｈ Ｗａｔｅｒ Ｅｇｇ Ｙｏｌｋ）におけるトランスフェラーゼアッセイ」又は「緩衝基質（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）におけるトランスフェラーゼアッセイ」の１つ若しくは複数を用いて目的酵素を試験するステップと、以下の特性、すなわち、（ａ）「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、３０、２０又は１２０分から選択される時間後に測定して、少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、（ｂ）水分が５４％の卵黄において「高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、最高１００％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、或いは（ｃ）「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性を有することの１つ又は複数を有する脂質アシルトランスフェラーゼである場合にその脂質アシルトランスフェラーゼを選択するステップを含む、本発明によって使用される適切な脂質アシルトランスフェラーゼを特定する方法が提供される。
本発明は、さらに、本発明による方法によって特定される脂質アシルトランスフェラーゼも提供する。
別の態様によれば、本発明は、本明細書に定義する固定化脂質アシルトランスフェラーゼを提供する。
本明細書において使用される「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語は、リパーゼ活性（一般に、国際生化学分子生物学連合の命名委員会の酵素命名法推奨（１９９２）に従ってＥ．Ｃ．３．１．１．ｘに分類される）を有するとともに、アシルトランスフェラーゼ活性（一般に、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類される）も有する酵素を意味し、それによってこの酵素は、脂質から、以下、すなわち、ステロール；スタノール；炭水化物；タンパク質；タンパク質サブユニット；グリセリンの１種類又は複数などの１種類又は複数の受容体基質にアシル基を転移させることが可能である。
本発明の方法及び／又は使用に用いられる脂質アシルトランスフェラーゼは、（本明細書に定義する）脂質から、以下のアシル受容体基質、すなわち、ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質若しくはそのサブユニット、又はグリセリンの１種類又は複数にアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
一部の態様では、本発明による「アシル受容体」は、例えば、グリセリンを含めた多価アルコール；ステロール；スタノール；炭水化物；フルーツ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸及びアスコルビン酸を含めたヒドロキシ酸；タンパク質、又は例えばアミノ酸、タンパク水解物、ペプチド（部分加水分解タンパク質）などのそのサブユニット；それらの混合物及び誘導体などのヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む任意の化合物とすることができる。本発明による「アシル受容体」は水ではないことが好ましい。
一実施形態においては、アシル受容体は、好ましくは、モノグリセリド及び／又はジグリセリドではない。
一態様においては、酵素は、脂質からステロール及び／又はスタノールにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
一態様においては、酵素は、脂質から炭水化物にアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
一態様においては、酵素は、脂質からタンパク質又はそのサブユニットにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。好適には、タンパク質サブユニットは、以下、すなわち、アミノ酸、タンパク水解物、ペプチド、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドの１種類又は複数とすることができる。
好適には、タンパク質又はタンパク質サブユニットにおいては、アシル受容体は、タンパク質又はタンパク質サブユニットの以下の構成物質、すなわち、セリン、トレオニン、チロシン又はシステインの１種類又は複数とすることができる。
タンパク質サブユニットがアミノ酸であるときには、好適には、アミノ酸は、任意の適切なアミノ酸とすることができる。好適には、アミノ酸は、例えば、セリン、トレオニン、チロシン又はシステインの１種類又は複数とすることができる。
一態様においては、酵素は、脂質からグリセリンにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
一態様においては、酵素は、脂質からヒドロキシ酸にアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
一態様においては、酵素は、脂質から多価アルコールにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
一態様においては、脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質からステロール及び／又はスタノールにアシル基を転移させることができるとともに、さらに、脂質から、以下、すなわち、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、グリセリンの１種類又は複数にアシル基を転移させることができる。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが作用する脂質基質は、以下の脂質、すなわち、レシチン、例えばホスファチジルコリンなどのリン脂質、トリアシルグリセリド、カルジオリピン、ジグリセリド、又は例えばジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）などの糖脂質の１種類又は複数であることが好ましい。この脂質基質は、本明細書では「脂質アシル供与体」と呼ぶことができる。本明細書において使用されるレシチンという用語は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びホスファチジルグリセロールを包含する。
一部の態様では、脂質アシルトランスフェラーゼが作用する脂質基質は、レシチン、例えばホスファチジルコリンなどのリン脂質であることが好ましい。
一部の態様では、脂質基質は、例えばＤＧＤＧなどの糖脂質であることが好ましい。
脂質基質は、食品脂質、すなわち食料品の脂質成分であることが好ましい。
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリド、及び／又は１−モノグリセリド、及び／又は２−モノグリセリドに対して作用することができない、或いは実質的に作用することができないことが好ましい。
好適には、脂質基質又は脂質アシル供与体は、以下の基質、すなわち、ラード、タロー及びバター脂肪を含めた脂肪；パーム油、ヒマワリ油、大豆油、サフラワー油、綿実油、落花生油、コーン油、オリーブ油、落花生油、ヤシ油及びなたね油から抽出される、又は誘導される油を含めた油の１種類又は複数の中に存在する１種類又は複数の脂質とすることができる。大豆、アブラナ又は卵黄から得られるレシチンも、適切な脂質基質である。脂質基質は、オートムギ脂質、又はガラクト脂質を含む他の植物系材料とすることができる。
一態様においては、脂質アシル供与体は、好ましくは、卵黄中の（ホスファチジルコリンなどの）レシチンである。
本発明の一部の態様では、脂質は、８〜２２個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
本発明の一部の態様では、脂質は、１６〜２２個の炭素、より好ましくは１６〜２０個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
本発明の一部の態様では、脂質は、１４個以下の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質、好適には４〜１４個の炭素、好適には４〜１０個の炭素、好適には４〜８個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のリパーゼ活性、すなわち、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）の１つ又は複数を示すことができることが好適である。本明細書において使用される「グリコリパーゼ活性」という用語は、「ガラクトリパーゼ活性」を包含する。
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の活性、すなわち、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、及び／又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）、及び／又はホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）の少なくとも１つ又は複数を有することができる。
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくともグリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）を有することができる。
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、糖脂質及び／又はリン脂質から、以下の受容体基質、すなわち、ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質、グリセリンの１種類又は複数にアシル基を転移させることができることが好適である。
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、糖脂質及び／又はリン脂質からステロール及び／又はスタノールにアシル基を転移させて、少なくともステロールエステル及び／又はスタノールエステルを形成できることが好ましい。
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、糖脂質及び／又はリン脂質から炭水化物にアシル基を転移させて、少なくとも炭水化物エステルを形成できることが好ましい。
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、糖脂質及び／又はリン脂質からタンパク質にアシル基を転移させて、少なくともタンパク質エステル（又はタンパク質脂肪酸縮合物)を形成できることが好ましい。
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、糖脂質及び／又はリン脂質からグリセリンにアシル基を転移させて、少なくともジグリセリド及び／又はモノグリセリドを形成できることが好ましい。
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さないことが好ましい。
一部の態様においては、脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を脂質からステロール及び／又はスタノールに転移させることができる。したがって、一実施形態においては、本発明による「アシル受容体」は、ステロール、スタノール、又はステロールとスタノールの組み合わせとすることができる。
一実施形態においては、好適には、ステロール及び／又はスタノールは、以下の構造上の特徴、すなわち、
ｉ）３−βヒドロキシ基又は３−αヒドロキシ基、及び／又は
ii）シス位におけるＡ：Ｂ環、又はトランス位におけるＡ：Ｂ環、又はＣ５〜Ｃ６が不飽和である
の１種類若しくは複数を含むことができる。
適切なステロールアシル受容体としては、コレステロール及び植物ステロール、例えば、α−シトステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、カンペステロール、５，６−ジヒドロステロール、アブラナステロール、α−スピナステロール、β−スピナステロール、ガンマ−スピナステロール、デルタスピナステロール、フコステロール、ディモステロール（ｄｉｍｏｓｔｅｒｏｌ）、アスコステロール（ａｓｃｏｓｔｅｒｏｌ）、セレビステロール（ｓｅｒｅｂｉｓｔｅｒｏｌ）、エピステロール（ｅｐｉｓｔｅｒｏｌ）、アナステロール（ａｎａｓｔｅｒｏｌ）、ハイポステロール（ｈｙｐｏｓｔｅｒｏｌ）、コンドリラステロール（ｃｈｏｎｄｒｉｌｌａｓｔｅｒｏｌ）、デスモステロール、カリノステロール（ｃｈａｌｉｎｏｓｔｅｒｏｌ）、ポリフェラステロール、クリオナステロール、ステロールグリコシド、並びに他の天然又は合成異性体及び誘導体が挙げられる。
本発明の一態様においては、好適には１種類を超えるステロール及び／又はスタノールがアシル受容体として働くことができ、好適には２種類を超えるステロール及び／又はスタノールがアシル受容体として働くことができる。換言すれば、本発明の一態様においては、好適には１種類を超えるステロールエステル及び／又はスタノールエステルを生成することができる。好適には、コレステロールがアシル受容体であるときには、１種類又は複数のさらなるステロール又は１種類又は複数のスタノールもアシル受容体として働くことができる。したがって、一態様においては、本発明は、コレステロールエステルと少なくとも１個のステロール又はスタノールエステルを組み合わせてインサイチュ生成する方法を提供する。換言すれば、脂質アシルトランスフェラーゼは、本発明の一部の態様では、アシル基を脂質からコレステロールと少なくとも１個のさらなるステロール及び／又は少なくとも１個のスタノールに転移させることができる。
一態様においては、ステロールアシル受容体は、以下、すなわち、α−シトステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール及びカンペステロールの１種類若しくは複数であることが好ましい。
一態様においては、ステロールアシル受容体はコレステロールであることが好ましい。コレステロールが脂質アシルトランスフェラーゼのアシル受容体である場合には、食料品中の遊離コレステロール量は、脂質アシルトランスフェラーゼに暴露する前の食料品よりも、且つ／又は脂質アシルトランスフェラーゼで処理されていない同等の食料品よりも減少する。
適切なスタノールアシル受容体としては、フィトスタノール、例えば、β−シトスタノール又はｓｓ−シトスタノールが挙げられる。
一態様においては、ステロール及び／又はスタノールアシル受容体は、コレステロール以外のステロール及び／又はスタノールであることが好ましい。
一部の態様においては、本発明によって調製された食料品を使用して、血清コレステロールを減少させ、且つ／又は低密度リポタンパク質を減少させることができる。血清コレステロール及び低密度リポタンパク質はともに、例えばアテローム性動脈硬化症及び／又は心疾患などのヒトにおけるある種の疾患に関連している。したがって、本発明によって調製された食料品を使用してこのような疾患のリスクを軽減することができると予見される。
したがって、一態様においては、本発明は、アテローム性動脈硬化症及び／又は心疾患の治療及び／又は予防に使用される本発明による食料品の使用を提供する。
別の態様においては、本発明は、本発明による食料品を含む医薬品を提供する。
別の態様においては、本発明は、本発明による食料品の有効量をヒト又は動物患者に投与することを含む、ヒト又は動物患者における疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。
好適には、ステロール及び／又はスタノール「アシル受容体」は、食料品中に自然に存在することができる。或いは、ステロール及び／又はスタノールは、食料品に添加することができる。ステロール及び／又はスタノールを食料品に添加する場合には、ステロール及び／又はスタノールは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの添加前、添加と同時、及び／又は添加後に添加することができる。好適には、本発明は、本発明による酵素の添加前、又は添加と同時に、外来性ステロール／スタノール、特に植物ステロール／フィトスタノールを食料品に添加することを包含することができる。
一部の態様では、食料品中の１種類又は複数のステロールは、本発明によって脂質アシルトランスフェラーゼを添加する前に、又は添加するのと同時に、１種類又は複数のスタノールに転化させることができる。ステロールをスタノールに転化させる任意の適切な方法を使用することができる。例えば、転化は、例えば化学水素化によって実施することができる。転化は、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの添加前に、又は本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの添加と同時に実施することができる。スタノールへのステロールの転化用酵素は、国際公開第００／０６１７７１号において教示されることが好適である。
本発明は、食料品中のインサイチュでフィトスタノールエステルを生成するために使用することが好適である。フィトスタノールエステルは、脂質膜を通る高い溶解性、生物学的利用能、及び健康上の優れた利点を有する（例えば、国際公開第９２／９９６４０号を参照されたい）。
本発明の一部の実施形態においては、スタノールエステル及び／又はステロールエステルは、香味料及び／又は食感付与剤（ｔｅｘｔｕｒｉｓｅｒ）とすることができる。この場合、本発明は、香味料及び／又は食感付与剤のインサイチュ生成を包含する。
本発明の一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル受容体として炭水化物を利用することができる。炭水化物アシル受容体は、以下、すなわち、単糖、二糖、オリゴ糖又は多糖の１種類又は複数とすることができる。炭水化物は、以下、すなわち、グルコース、フルクトース、無水フルクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、ガラクトース、キシロース、キシロオリゴ糖、アラビノース、マルトオリゴ糖、タガトース、ミクロセシン（ｍｉｃｒｏｔｈｅｃｉｎ）、アスコピロン（ａｓｃｏｐｙｒｏｎｅ）Ｐ、アスコピロンＴ、コータルセロン（ｃｏｒｔａｌｃｅｒｏｎｅ）の１種類又は複数であることが好ましい。
炭水化物「アシル受容体」は、食料品中に自然に存在できることが好適である。或いは、炭水化物は食料品に添加することができる。炭水化物を食料品に添加する場合には、炭水化物は、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの添加前、添加と同時、及び／又は添加後に添加することができる。
炭水化物エステルは、食料品中の貴重な乳化剤として機能することができる。したがって、酵素がアシル基を糖に転移させる機能を果たす場合には、本発明は、食料品中の第２のインサイチュ乳化剤の生成を包含する。
一部の実施形態においては、脂質アシルトランスフェラーゼは、ステロール及び／又はスタノール及び炭水化物をアシル受容体として利用することができる。
アシル基を炭水化物並びにステロール及び／又はスタノールに転移させることができる脂質アシルトランスフェラーゼを利用することは、卵を含む食料品では特に有利である。特に、卵及び卵製品中に糖、特にグルコースが存在することは、欠点と見られることが多い。卵黄は、最高１％のグルコースを含むことができる。一般に、卵又は卵を主成分とする製品は、このグルコースの一部又は全部を除去するために、グルコースオキシダーゼで処理することができる。しかし、本発明によれば、この望ましくない糖は、糖を「エステル化」して糖エステルを形成することによって容易に除去することができる。
本発明の一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル受容体としてタンパク質を利用することができる。好適には、タンパク質は、食料製品中、例えば、乳製品及び／又は肉製品中に存在するタンパク質の１種類又は複数とすることができる。単なる例として、適切なタンパク質は、ラクトグロブリンなどの凝乳又は乳清中に存在するタンパク質とすることができる。他の適切なタンパク質としては、卵の卵白アルブミン、グリアジン、グルテニン、プロインドリン（ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ）、穀物の脂質転移タンパク質、肉のミオシンなどが挙げられる。
したがって、本発明によれば、以下の有利な諸特性、すなわち、遊離脂肪酸を増加させない、乳化剤のインサイチュ生成；食料品中の遊離脂肪酸蓄積の減少；食料品中の遊離コレステロールレベルの低下；ステロールエステル及び／又はスタノールエステルの増加；血清コレステロール及び／又は低密度リポタンパク質の減少；炭水化物エステルの増加；望ましくない遊離炭水化物の減少の１つ又は複数を達成することができる。
本発明の利点は、乳化剤が、食料品の遊離脂肪酸含有量を増加させずに、又は実質的に増加させずに、食料品のインサイチュで調製されることである。遊離脂肪酸の生成は、食料品に有害になり得る。特に、遊離脂肪酸は、例えばチーズにおける石けんのような味覚を含めて、他の有害な効果と同様に、食料品中の異臭及び／又は異風味と関連がある。本発明による方法によって、遊離脂肪酸の蓄積が減少する、且つ／又は遊離脂肪酸が蓄積しない、乳化剤のインサイチュ調製がもたらされることが好ましい。理論に拘泥するものではないが、本発明によれば、脂質から除去された脂肪酸は、脂質アシルトランスフェラーゼによってアシル受容体、例えば、ステロール及び／又はスタノールに転移される。したがって、食料品中の遊離脂肪酸全体のレベルは、増加しないか、又は意味のない程度にしか増加しない。これは、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．ｘ）を使用して乳化剤をインサイチュで生成する場合と明確に対比される。特に、リパーゼを使用すると、食料品中の有害になり得る遊離脂肪酸の量が増加することがある。本発明によれば、リパーゼ酵素、特にホスホリパーゼＡ酵素を本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの代わりに使用した場合に蓄積されたであろう遊離脂肪酸量よりも、遊離脂肪酸の蓄積が減少し、且つ／又は遊離脂肪酸が蓄積されない。
アシル基をステロール及び／又はスタノールに転移させることができる脂質アシルトランスフェラーゼを利用することは、卵を含む食料品では特に有利になり得る。特に、例えばＬｉｐｏｐａｎＦ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ））、Ｌｅｃｉｔａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ製Ｌｉｐｏｍｏｄ ２２ Ｌなどの従来のホスホリパーゼで処理された卵を主成分とする製品と比較してかなり良好な諸特性を有する、卵を主成分とする製品が、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼで処理した後に得られることが見出された。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の判定基準、すなわち、
（ｉ）酵素が、脂質アシル供与体のもとのエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を有し、
（ii）酵素が、Ｘが以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個若しくは複数であるアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含む
を用いて特徴づけできることが好ましい。
ＧＤＳＸモチーフのＸはＬであることが好ましい。すなわち、本発明による酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＳＤＬを含むことが好ましい。
ＧＤＳＸモチーフは、４個の保存アミノ酸からなる。モチーフ内のセリンは、脂質アシルトランスフェラーゼの触媒作用性セリンであることが好ましい。ＧＤＳＸモチーフのセリンは、Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064)に教示されたアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＳｅｒ−１６に対応する位置にあることが好適である。
タンパク質が本発明によるＧＤＳＸモチーフを有するかどうかを決定するために、配列は、ｐｆａｍデータベースの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較されることが好ましい。
Ｐｆａｍは、タンパク質ドメインファミリーのデータベースである。Ｐｆａｍは、各ファミリーに対して検証された（ｃｕｒａｔｅｄ）複数の配列アラインメント、並びに新しい配列中のこれらのドメインを特定するためのプロファイル隠れマルコフモデル（プロファイルＨＭＭ）を含む。Ｐｆａｍの概論は、Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280にある。隠れマルコフモデルは、タンパク質を分類するためのいくつかのデータベースにおいて使用されている。総説として、Bateman A and Haft DH（2002）Brief Bioinform 3; 236-245を参照されたい。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12230032&dopt=Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11752314&dopt=Abstract
隠れマルコフモデルの詳細な説明、及びそのモデルをＰｆａｍデータベースに適用する方法については、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4を参照されたい。Ｈａｍｍｅｒソフトウェアパッケージは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡから入手することができる。
或いは、ＧＤＳＸモチーフは、Ｈａｍｍｅｒソフトウェアパッケージによって特定することができる。その説明は、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4及びその中の参考文献にある。ＨＭＭＥＲ２プロファイルは、本明細書中にある。
ＰＦＡＭデータベースは、例えば、現在、以下のウェブサイトにあるいくつかのサーバを介して接続することができる。
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
このデータベースは、タンパク質配列を入力することができる検索機能を提供している。タンパク質配列は、データベースのデフォルトパラメータを用いて、Ｐｆａｍドメインの有無について解析される。ＧＤＳＸドメインは、データベースにおいて確立されたドメインであり、したがって任意の問い合わせ配列中でその有無が確認される。データベースは、問い合わせ配列に対してＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列のアラインメントを返す。
アエロモナス サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）又はアエロモナス ヒドロフィラを含めた複数のアラインメントは、
ａ）マニュアル
上記手順に従って、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を含む目的タンパク質のアラインメント、及びＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列を含むＰ１０４８０のアラインメントを得る；
或いは
ｂ）データベース経由
Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を特定した後に、データベースは、問い合わせ配列のアラインメントをＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列のシードアラインメント（ｓｅｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）に示す選択肢を提供する。Ｐ１０４８０はこのシードアラインメントの一部であり、ＧＣＡＴ＿ＡＥＲＨＹで示される。問い合わせ配列とＰ１０４８０の両方を同じ枠内に示す
によって得ることができる。
アエロモナス ヒドロフィラ基準配列：
アエロモナス ヒドロフィラＧＤＳＸリパーゼの残基は、ＮＣＢＩファイルＰ１０４８０中で番号付けされている。このテキスト中の番号は、好ましい実施形態において本発明の脂質アシルトランスフェラーゼ中に存在する特定のアミノ酸残基を求めるために本発明において使用するファイル中の番号である。
Ｐｆａｍアラインメントを実施した（図３３及び３４）。
以下の保存残基は認識することができ、好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される酵素中に存在することができる。
ブロック１−ＧＤＳＸブロック
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28 29 30 31 32 33 34 35
ブロック２−ＧＡＮＤＹブロック
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
ブロック３−ＨＰＴブロック
His
309
ここで、「ｈｉｄ」は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅから選択される疎水性残基を意味する。
本発明の組成物／方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いて整列させることができることが好ましい。
ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）との正の一致（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｔｃｈ）は、本発明によるＧＤＳＬ又はＧＤＳＸドメインの存在を示すことが好ましい。
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させたときに、本発明の組成物／方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックの少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上を有する。好適には、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘブロック及びＧＡＮＤＹブロックを有することができる。或いは、この酵素は、ＧＤＳｘブロック及びＨＰＴブロックを有することができる。この酵素は、少なくともＧＤＳｘブロックを含むことが好ましい。
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させたときに、本発明の組成物／方法に使用される酵素は、基準Ａ．ヒドロフィラポリペプチド配列、すなわち配列番号３２：２８ｈｉｄ、２９ｈｉｄ、３０ｈｉｄ、３１ｈｉｄ、３２ｇｌｙ、３３Ａｓｐ、３４Ｓｅｒ、３５ｈｉｄ、１３０ｈｉｄ、１３１Ｇｌｙ、１３２Ｈｉｄ、１３３Ａｓｎ、１３４Ａｓｐ、１３５ｈｉｄ、３０９Ｈｉｓと比較したときに、以下のアミノ酸残基の少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは５個以上、好ましくは６個以上、好ましくは７個以上、好ましくは８個以上、好ましくは９個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１１個以上、好ましくは１２個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１４個以上、好ましくは１５個以上を有する。
ｐｆａｍ００６５７ ＧＤＳＸドメインは、このドメインを有するタンパク質を他の酵素から識別する一意的な識別子である。
ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を図１に配列番号１で示す。この配列は、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．６とも呼ばれるｐｆａｍファミリー００６５７、データベースバージョン６の識別子から誘導される。
このコンセンサス配列は、今後公開されるｐｆａｍデータベースを使用して更新することができる。
例えば、図３３及び３４に、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．１１とも呼ばれる、データベースバージョン１１からのファミリー００６５７のｐｆａｍアラインメントを示す。
ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロックは、公開された両方のデータベースのｐｆａｍファミリー００６５７に存在する。将来公開されるｐｆａｍデータベースを使用して、ｐｆａｍファミリー００６５７を特定することができる。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の判定基準、すなわち、
（ｉ）酵素がアシルトランスフェラーゼ活性を有すること（アシルトランスフェラーゼ活性は、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができる）、
（ii）酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含むこと（ここで、Ｘは、以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個若しくは複数である）、
（iii）酵素がＨｉｓ−３０９を含み、又は図２（配列番号２又は配列番号３２）に示すアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含むこと
によって特徴づけできることが好ましい。
ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬであることが好ましい。
配列番号２又は配列番号３２においては、第１の１８アミノ酸残基は、シグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＨｉｓ−２９１に一致する。
好ましくは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の触媒作用の３つ組、すなわち、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９を含み、又は図２（配列番号２）若しくは図２８（配列番号３２）に示すアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９に対応する位置のそれぞれセリン残基、アスパラギン酸残基及びヒスチジン残基を含む。上述したように、配列番号２又は配列番号３２に示す配列において、第１の１８アミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−１１６及びＨｉｓ−２９１に一致する。ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列においては、図１（配列番号１）に示すように、活性部位残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−１５７及びＨｉｓ−３４８に対応する。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の判定基準、すなわち、
（ｉ）酵素がアシルトランスフェラーゼ活性を有すること（アシルトランスフェラーゼ活性は、第１の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができる）、
（ii）酵素が少なくともＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９を含み、又は図２（配列番号２）若しくは図２８（配列番号３２）に示すアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素中のそれぞれＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９に対応する位置のグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジン残基を含むこと
によって特徴づけできることが好ましい。
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の属、すなわち、アエロモナス（Aeromonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ラクトコッカス（Lactococcus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、デサルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、バチルス（Bacillus）、カンピロバクター（Campylobacter）、ビブリオナシエ（Vibrionaceae）、キシレラ（Xylella）、スルフォロブス（Sulfolobus）、アスペルギルス（Aspergillus）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、リステリア（Listeria）、ナイセリア（Neisseria）、メソルヒゾビウム（Mesorhizobium）、ラルストニア（Ralstonia）、ザントモナス（Xanthomonas）及びカンジダ（Candida）の１種類若しくは複数由来の生物から得ることができ、好ましくは得られる。
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の生物、すなわち、アエロモナスヒドロフィラ、アエロモナス サルモニシダ、ストレプトマイセス コエリコラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス リモサス（Streptomyces rimosus）、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ラクトコッカス ラクチス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス ピオゲネス、ストレプトコッカスサーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ラクトバチルス ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、デサルフィトバクテリウム デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）、バチルスｓｐ、カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）、ビブリオナシエ、キシレラ ファスチジオサ（Xylella fastidiosa）、スルフォロブス ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス テレウス（Aspergillus terreus）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、リステリア イノキュア（Listeria innocua）、リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ナイセリア メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、メソルヒゾビウム ロティ（Mesorhizobium loti）、ラルストニア ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）、ザントモナス カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ザントモナス アクソノポディス（Xanthomonas axonopodis）及びカンジダ パラプシロシス（Candida parapsilosis）の１種類若しくは複数から得ることができ、好ましくは得られる。
一態様においては、好ましくは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、アエロモナスヒドロフィラ又はアエロモナス サルモニシダの１種類又は複数から得ることができ、好ましくは得られる。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列（図２参照）
（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列（図３参照）
（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列（図４参照）
（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列（図５参照）
（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列（図６参照）
（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列（図１４参照）
（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列（図１６参照）
（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列（図１８参照）
（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列（図２０参照）
（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列（図２２参照）
（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列（図２４参照）
（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列（図２６参照）
（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列（図２８参照）
（xiv）配列番号３４（図３０）で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上同一であるアミノ酸配列
の１つ若しくは複数を含むことが好適である。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号３２、又は配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含み、或いは配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号３で示されるアミノ酸配列、配列番号３２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３４で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含むことが好適である。
本発明では、同一性の程度は、同じ配列要素の数に基づく。本発明による同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711）（Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45）に備わったＧＡＰなどの当分野で公知のコンピュータプログラムによって、以下のポリペプチド配列比較の設定、すなわち、ＧＡＰクリエーションペナルティー（ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）３．０及びＧＡＰエクステンションペナルティー（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）０．１を用いて、適切に決定することができる。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含むことが好適である。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
（ａ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１〜１００で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１０１〜２００で示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基２０１〜３００で示されるアミノ酸配列、或いは
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列
の１つ若しくは複数を含むことが好適である。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
（ａ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基２８〜３９で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基７７〜８８で示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１２６〜１３６で示されるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１６３〜１７５で示されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基３０４〜３１１で示されるアミノ酸配列、
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列
の１つ若しくは複数を含むことが好適である。
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のヌクレオチド配列、すなわち、
（ａ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列（図９参照）、
（ｂ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列（図１０参照）、
（ｃ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列（図１１参照）、
（ｄ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列（図１２参照）、
（ｅ）配列番号１１で示されるヌクレオチド配列（図１３参照）、
（ｆ）配列番号１３で示されるヌクレオチド配列（図１５参照）、
（ｇ）配列番号２１で示されるヌクレオチド配列（図１７参照）、
（ｈ）配列番号２３で示されるヌクレオチド配列（図１９参照）、
（ｉ）配列番号２５で示されるヌクレオチド配列（図２１参照）、
（ｊ）配列番号２７で示されるヌクレオチド配列（図２３参照）、
（ｋ）配列番号２９で示されるヌクレオチド配列（図２５参照）、
（ｌ）配列番号３１で示されるヌクレオチド配列（図２７参照）、
（ｍ）配列番号３３で示されるヌクレオチド配列（図２９参照）、
（ｎ）配列番号３５で示されるヌクレオチド配列（図３１参照）、
（ｏ）或いは
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３又は配列番号３５で示される配列のいずれか１つと７５％以上同一であるヌクレオチド配列
の発現によって産生されるアミノ酸配列、或いはこれらのヌクレオチド配列の１種類若しくは複数を含むことができる。
好適には、ヌクレオチド配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３又は配列番号３５で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上同一とすることができる。
一態様においては、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、又はその変異体（例えば、分子進化によって造られた変異体）とすることができる。
適切なＬＣＡＴは、当分野で公知であり、例えば以下の生物、すなわち、哺乳動物、ラット、マウス、ヒヨコ、キイロショウジョウバエ、アラビドプシス（Arabidopsis）及びオリザ サティバ（Oryza sativa）を含めた植物、線虫、真菌及び酵母の１種類若しくは複数から得ることができる。
一実施形態においては、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ １、ＤＫ−１００１ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｋ、ＤｅｎｍａｒｋのＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓによって、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ、Ｍａｒｉｎｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）２３ Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ Ｓｔｒｅｅｔ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＧＢにおいて２００３年１２月２２日にそれぞれアクセッション番号ＮＩＣＭＢ ４１２０４及びＮＣＩＭＢ ４１２０５として寄託されたｐＰｅｔ１２ａＡｈｙｄｒｏ及びｐＰｅｔ１２ａＡＳａｌｍｏを収容する大腸菌（E. coli）系統ＴＯＰ １０から得ることができ、好ましくは得られる脂質アシルトランスフェラーゼとすることができる。
本発明による方法を実施するときには、生成物は、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成されることが好ましい。
本明細書において使用される「トランスフェラーゼ」という用語は、「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語と区別なく使用される。
本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の反応、すなわち、エステル交換、エステル転移、アルコール分解、加水分解の１種類若しくは複数を触媒することが好適である。
「エステル交換」という用語は、酵素によって触媒された、脂質供与体と脂質受容体の間のアシル基転移を意味する。ここで、脂質供与体は遊離アシル基ではない。
本明細書において使用される「エステル転移」という用語は、（遊離脂肪酸以外の）脂質供与体から（水以外の）アシル受容体への、酵素によって触媒されたアシル基の転移を意味する。
本明細書において使用される「アルコール分解」という用語は、生成物の一方がアルコールのＨと結合し、もう一方の生成物がアルコールのＯＲ基と結合するような、アルコールＲＯＨとの反応による酸誘導体の共有結合の酵素による切断を意味する。
本明細書において使用される「アルコール」という用語は、ヒドロキシル基を含むアルキル化合物を指す。
本明細書において使用される「加水分解」という用語は、脂質から水分子のＯＨ基への、酵素によって触媒されたアシル基の転移を指す。加水分解から生じるアシル転移には、水分子の分離が必要である。
本明細書において使用される「遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに」という用語は、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが１００％トランスフェラーゼ活性を有する（すなわち、加水分解活性を持たずに、アシル基の１００％をアシル供与体からアシル受容体に転移させる）ことが好ましいが、この酵素が、脂質アシル供与体中のアシル基の１００％未満をアシル受容体に転移させてもよいことを意味する。この場合、アシルトランスフェラーゼ活性は、全酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及びより好ましくは少なくとも９８％を占めることが好ましい。％トランスフェラーゼ活性（すなわち、全酵素活性の百分率としてのトランスフェラーゼ活性）は、以下のプロトコルによって求めることができる。
％アシルトランスフェラーゼ活性を求めるプロトコル：
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが添加される食料品は、以下の詳細な手順に従って、酵素反応後にＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ ２：１で抽出し、脂質材料を含む有機相を単離し、ＧＬＣ及びＨＰＬＣによって分析することができる。ＧＬＣ及びＨＰＬＣ分析から、遊離脂肪酸、及びステロール／スタノールエステル；炭水化物エステル、タンパク質エステル；ジグリセリド；又はモノグリセリドの１種類又は複数の量が求められる。本発明による酵素が添加されない対照食料品も同様に分析される。
計算：
ＧＬＣ及びＨＰＬＣ分析の結果から、遊離脂肪酸、並びにステロール／スタノールエステル、及び／又は炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はジグリセリド、及び／又はモノグリセリドの増加量を計算することができる。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（酵素）−％脂肪酸（対照）；Ｍｖ脂肪酸＝脂肪酸の平均分子量；
Ａ＝Δ％ステロールエステル／Ｍｖステロールエステル（ここで、Δ％ステロールエステル＝％ステロール／スタノールエステル（酵素）−％ステロール／スタノールエステル（対照）及びＭｖステロールエステル＝ステロール／スタノールエステルの平均分子量）−アシル受容体がステロール及び／又はスタノールである場合に適用可能；
Ｂ＝Δ％炭水化物エステル／Ｍｖ炭水化物エステル（ここで、Δ％炭水化物エステル＝％炭水化物エステル（酵素）−％炭水化物エステル（対照）及びＭｖ炭水化物エステル＝炭水化物エステルの平均分子量）−アシル受容体が炭水化物である場合に適用可能；
Ｃ＝Δ％タンパク質エステル／Ｍｖタンパク質エステル（ここで、Δ％タンパク質エステル＝％タンパク質エステル（酵素）−％タンパク質エステル（対照）及びＭｖタンパク質エステル＝タンパク質エステルの平均分子量）−アシル受容体がタンパク質である場合に適用可能；並びに
Ｄ＝ジグリセリド及び／又はモノグリセリド／Ｍｖジ／モノグリセリドの絶対値（ここで、Δ％ジグリセリド及び／又はモノグリセリド＝％ジグリセリド及び／又はモノグリセリド（酵素）−％ジグリセリド及び／又はモノグリセリド（対照）、並びにＭｖジ／モノグリセリド＝ジグリセリド及び／又はモノグリセリドの平均分子量）−アシル受容体がグリセリンである場合に適用可能。
トランスフェラーゼ活性は、全酵素活性の百分率として計算される。
Figure 2006521787
食料品中の遊離脂肪酸が増加する場合には、遊離脂肪酸は実質的に、すなわち、有意な程度に増加しないことが好ましい。すなわち、遊離脂肪酸の増加が食料品の品質に悪影響を及ぼさないことを意味する。
本発明の一部の態様においては、本明細書において使用される「遊離脂肪酸を実質的に増加させずに」という用語は、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼで処理された食料品又は組成物中の遊離脂肪酸の量が、例えば、従来のホスホリパーゼ酵素、例えばＬｉｐｏｐａｎＦ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）が使用されたときに生成される遊離脂肪酸の量など、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ以外の酵素が使用されたときに食料品又は組成物中で生成される遊離脂肪酸の量よりも少ないことを意味する。
本明細書において使用される「インサイチュ」という用語は、乳化剤、及び／又はステロール／スタノールエステル、及び／又は炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はモノ若しくはジグリセリドが、食料品又は食料品の一部内で生成されることを意味する。これは、乳化剤、及び／又はステロール／スタノールエステル、及び／又は炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はモノ若しくはジグリセリドが、食料品とは別に生成され、食料品の調製中に形成済みの製品として食料品に添加される場合とは対照的である。換言すれば、本明細書において使用される「インサイチュ」という用語は、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを食料品、又は食料品を構成する食品成分／材料に添加することによって、乳化剤、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステル、及び／又は炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はモノ若しくはジグリセリドを食料品の成分から生成できることを意味する。好適には、食料品の成分は、酵素の基質とすることができる。必要に応じて、食料品の成分は、１種類若しくは複数のさらなる成分を添加することによって補充することができる。このさらなる成分は、食料品中に存在する成分と同じものでも、食料品中にすでに存在する成分に追加のものでもよい。不確かさを回避するために、一実施形態においては、本発明による方法は、乳化剤、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステル、及び／又は炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はモノ若しくはジグリセリドを食料品中のインサイチュで生成する方法とすることができ、食料品にその後添加する乳化剤、及び／又はステロールエステル、及び／又はスタノールエステル（例えば、単離及び／又は精製された形である）を調製する方法ではない。
別の実施形態においては、リパーゼアシルトランスフェラーゼは、食品加工中に使用することができるが、食料品には残らなくすることができる。例えば、リパーゼアシルトランスフェラーゼを固定化し、再使用することができる。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、極性環境中、好ましくは水系環境中、好ましくは水を含む食料品中に存在するときに、脂質からステロール、及び／又はスタノール、及び／又は炭水化物、及び／又はタンパク質、及び／又はグリセリンにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。好適には、水系環境は、水系緩衝剤とすることができ、又は食料品中の水相とすることができる。本明細書において使用される「水系環境」という用語は、有機溶媒が存在しない、好ましくは極性有機溶媒が存在しない、より好ましくは非食用有機溶媒が存在しない環境を好ましくは意味する。特に、「水系環境」という用語は、外来性有機溶媒、好ましくは極性有機溶媒が添加されていない環境を意味することができる。本明細書において使用される有機溶媒という用語は、食用油を包含せず、非極性脂質が多い食用油を好ましくは包含しない。一実施形態においては、有機溶媒という用語は、エタノール、プロピレングリコール及び／又はグリセリンなどの食用有機溶媒を除外することができる。好適には、本発明による水系環境は、８０体積％未満の有機溶媒、７０体積％未満の有機溶媒、５０体積％未満の有機溶媒、３０体積％未満の有機溶媒、より好ましくは１５体積％未満の有機溶媒、より好ましくは５％未満を含むことができる。好適には、食料品は、１〜５％の有機溶媒、例えば、エタノールを含むことができる。しかし、食料品がこのような有機溶媒を含むときには、食料品中で内因的に生成されることが好ましい。すなわち、食料品がこのような有機溶媒を含むときには、有機溶媒は外来性有機溶媒ではないことが好ましい。
本明細書において使用される「食料品」という用語は、ヒト及び／又は動物が消費するのに適切な物質を意味する。
好適には、本明細書において使用される「食料品」という用語は、すぐに消費できる形の食料品を意味することができる。しかし、それとは別に、又はそれに加えて、本明細書において使用される食料品という用語は、食料品の調製に使用される１種類若しくは複数の食品材料を意味することができる。単なる例として、食料品という用語は、生地から作られる焼いた食品と前記焼いた食品の調製に使用される生地との両方を包含する。
好ましい態様においては、本発明は、以下、すなわち、卵、マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、改質卵黄、及びこれらでできた製品を含めて、ただしこれらだけに限定されない卵を主成分とする製品；パン、ケーキ、甘い生地製品、薄層からなる生地、液状バター、マフィン、ドーナツ、ビスケット、クラッカー及びクッキーを含めた焼いた食品；チョコレート、キャンディ、キャラメル、ハラワ、無糖ガム、砂糖入りガム、風船ガム、ソフト風船ガム、チューインガムを含めたガム、及びプディングを含めた菓子；シャーベットを含めた冷凍製品、好ましくはアイスクリーム及びアイスミルクを含めた冷凍乳製品；チーズ、バター、乳、コーヒークリーム、ホイップクリーム、カスタードクリーム、乳飲料及びヨーグルトを含めた乳製品；ムース、ホイップ野菜クリーム、加工肉製品を含めた肉製品；食用油及び脂肪、発泡及び非発泡ホイップ製品、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、マーガリン、ショートニング、並びに低脂肪及び超低脂肪スプレッドを含めたスプレッド；ドレッシング、マヨネーズ、ディップ、クリームベースのソース、クリームベースのスープ、飲料、スパイスエマルジョン及びソースの１種類若しくは複数から選択される上で定義した食料品を提供する。
好適には、本発明による食料品は、ケーキ、ペーストリー、菓子、チョコレート、ファッジなどを含めた「ファインフード」とすることができる。
一態様においては、本発明による食料品は、パンなどの生地製品又は焼いた製品、油で揚げた製品、スナック、ケーキ、パイ、ブラウニー、クッキー、ヌードル、クラッカー、グラハムクラッカー、プレッツェル及びポテトチップスなどのスナック類、並びにパスタとすることができる。
別の態様においては、本発明による食料品は、小麦粉、プリミックス、油、脂肪、カカオ脂、コーヒー用クリーム、サラダドレッシング、マーガリン、スプレッド、ピーナッツバター、ショートニング、アイスクリーム、料理用油などの植物由来の食料製品とすることができる。
別の態様においては、本発明による食料品は、バター、乳、クリーム、（細切り、ブロック、スライス又は粉を含めて）様々な形の天然、加工及び人造チーズ、クリームチーズなどのチーズ、アイスクリーム、冷菓、ヨーグルト、ヨーグルト飲料、バター脂肪、無水乳脂肪、他の乳製品を含めた乳製品とすることができる。本発明による酵素は、乳製品中の脂肪安定性を改善することができる。
チーズにおける遊離脂肪酸の生成は「石けんのような」味覚と関連があるので、チーズにおいて本発明を利用することが特に有利である。したがって、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、「石けんのような」味覚のないチーズを製造するのに有利である。
別の態様においては、本発明による食料品は、加工肉製品、料理用油、ショートニングなどの動物由来の成分を含む食料製品とすることができる。
別の態様においては、本発明による食料品は、飲料、果実、混合果実、野菜又はワインとすることができる。飲料は、最高２０ｇ／ｌの植物ステロール添加物を含むことができる。
別の態様においては、本発明による食料品は動物飼料とすることができる。動物飼料は、植物ステロール及び／又はフィトスタノール、好ましくはβ−シトステロール／スタノールを強化することができる。好適には、動物飼料は家禽飼料とすることができる。食料品が家禽飼料であるときには、本発明は、本発明による食料品で飼育された家禽によって生産される卵のコレステロール含有量を下げるために使用することができる。
一態様においては、食料品は、以下、すなわち、卵、マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、改質卵黄及びこれらでできた製品を含めた卵を主成分とする製品の１種類若しくは複数から選択されることが好ましい。
本発明による食料品は、水を含む食料品であることが好ましい。好適には、食料品は、１０〜９８％、好適には１４〜９８％、好適には１８〜９８％、好適には２０〜９８％、好適には４０〜９８％、好適には５０〜９８％、好適には７０〜９８％、好適には７５〜９８％の水を含むことができる。
一部の態様では、本発明による食料品は、例えば、オリーブ油、ヒマワリ油、落花生油、なたね油などの純粋な植物由来の油ではないことが好ましい。不確かさを回避するために、本発明の一部の態様においては、本発明による食料品は、油を含むことができるが、主として油又は油の混合物で構成されていないことが好ましい。一部の態様では、好ましくは、食料品は、９５％未満の脂質、好ましくは９０％未満の脂質、好ましくは８５％未満、好ましくは８０％未満の脂質を含む。したがって、本発明の一部の態様では、油を食料品の一成分とすることができるが、食料品は油自体ではないことが好ましい。
本発明の特許請求の範囲は、上記食料品の各々を含むと解釈すべきである。
炭水化物エステルが本発明によって生成される場合には、その炭水化物エステルは、オリゴ糖エステル、単糖エステル又は二糖エステルであることが好ましい。
好適には、炭水化物エステルは、本発明によって生成されるときには、以下、すなわち、グルコースエステル、フルクトースエステル、無水フルクトースエステル、マルトースエステル、ラクトースエステル、ガラクトースエステル、キシロースエステル、キシロオリゴ糖エステル、アラビノースエステル、マルトオリゴ糖エステル、タガトースエステル、スクロースエステル、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル又はコータルセロンエステルの１種類又は複数とすることができる。
炭水化物エステルは、本発明によって生成されるときには、以下、すなわち、炭水化物モノ−エステル、糖モノ−エステル、オリゴ糖モノ−エステル、三糖モノ−エステル、二糖モノ−エステル、単糖モノ−エステル、グルコースモノ−エステル、フルクトースモノ−エステル、無水フルクトースモノ−エステル、マルトースモノ−エステル、ラクトースモノ−エステル、ガラクトースモノ−エステル、キシロースモノ−エステル、キシロオリゴ糖モノ−エステル、アラビノースモノ−エステル、マルトオリゴ糖モノ−エステル、タガトースモノ−エステル、スクロースモノ−エステル、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル又はコータルセロンエステルの１種類又は複数であることが好ましい。
一実施形態においては、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル及び／又はコータルセロンエステルは、抗菌剤として機能することができる。これとは別に、又はこれに加えて、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル及び／又はコータルセロンエステルは、酸化防止剤及び／又は乳化剤の一方又は両方として機能することができる。
本発明による炭水化物エステルの形成は（もしあれば）、ＵＤＰ−グルコースとは無関係であることが好ましい。
本発明による食料品は、ＵＤＰ−グルコースを含まず、又は重要でない量のＵＤＰ−グルコースしか含まないことが好ましい。
好適には、本発明による乳化剤は、例えば、以下、すなわち、ジグリセリド、１−モノグリセリドなどのモノグリセリド、又はリゾホスファチジルコリン、例えば、ジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）などのリゾレシチンの１種類若しくは複数とすることができる。乳化剤は、脂質アシル供与体から１種類若しくは複数のアシル基を除去した後に、脂質アシル供与体から生成されることが好ましい。本明細書において使用されるリゾレシチンという用語は、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルグリセロールを包含する。
乳化剤の１種類が炭水化物エステルである場合には、第２の乳化剤は、例えば、以下、すなわち、ジグリセリド、１−モノグリセリドなどのモノグリセリド、リゾホスファチジルコリン又はジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）の１種類又は複数とすることができる。第２の乳化剤は、脂質アシル供与体から１種類又は複数のアシル基を除去した後に、前記脂質アシル供与体から生成されることが好ましい。本明細書において使用されるリゾホスファチジルコリンという用語は、リゾレシチンという用語と同義であり、これらの用語は、本明細書では区別なく使用することができる。
第２の乳化剤はＤＧＭＧであることが好ましい。ＤＧＭＧは、ＤＧＤＧからアシル基を除去し、除去したアシル基を炭水化物に転移させて炭水化物エステルを形成することによってインサイチュで生成されることが好適である。
乳化剤の１種類がタンパク質エステル、及び／又はジグリセリド、及び／又はモノグリセリドである場合には、第２の乳化剤は、例えば、以下、すなわち、ジグリセリド、１−モノグリセリドなどのモノグリセリド、リゾホスファチジルコリン又はジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）の１種類又は複数とすることができる。第２の乳化剤は、脂質アシル供与体から１種類又は複数のアシル基を除去した後に、前記脂質アシル供与体から生成されることが好ましい。本明細書において使用されるリゾホスファチジルコリンという用語は、リゾレシチンという用語と同義であり、これらの用語は、本明細書では区別なく使用することができる。
一実施形態においては、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、料理用油、マーガリン、スプレッドなどの食料品を調製するプロセスにおいて使用することができる。それによって、食料品は、グリセリン、少なくとも１個のリン脂質（例えば、レシチン）及び／又は糖脂質（例えば、ジガラクトシルジグリセリド）、並びに場合によっては植物ステロール又はフィトスタノールを天然に含み、又はこれらが補充される。
食料品は、料理用油又はマーガリンとして使用されるときには、高い耐プラタリング（ａｎｔｉｐｌａｔｔｅｒｉｎｇ）特性を有することができる。これとは別に、又はこれに加えて、食料品は、１種類又は複数の有利な技術的諸特性、例えば、改善された酸化安定性、改善された乳化特性、又は健康上の利点を有することができる。
一実施形態においては、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、低脂肪スプレッド、低脂肪サラダドレッシング、低脂肪マヨネーズ、低脂肪マーガリンなどの低脂肪食料品の調製物中に存在することができる。このような低脂肪食料製品においては、脂肪含有量は、一般に、乳化剤及び追加の水を添加することによって高脂肪等価物よりも削減される。
本発明の組成物及び方法において使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、かなりの水の存在下でも脂質から水以外の受容体へのアシル基の転移を顕著に優先させる点で、脂肪分解酵素と比較したときに独特の諸特性を有することが見出された。従来技術の酵素と比較して、本発明に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、水分６％、水分５４％、水分７３％、水分８９％及び約９５％の存在下で高い相対トランスフェラーゼ活性を有することが見出された。試験した脂肪分解酵素は、これらの水分濃度においては実質的に意味のある相対トランスフェラーゼ活性を持たなかった。
リパーゼ、及び酵素のアシルトランスフェラーゼ活性は、以下のアッセイによって評価することができる。このようにして、本明細書に定義される酵素特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼを得ること／特定することができる。
緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ（実施例１２参照）
本発明の組成物及び方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼとして機能する酵素は、本明細書の実施例１２に教示するアッセイによって常法に従って特定することができる。このアッセイを以後「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」と称する。実施例１２においては、本発明によるアエロモナスサルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼを分析し、本発明によって包含されないある範囲の脂肪分解酵素と比較した。脂肪分解酵素のうちＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のみがトランスフェラーゼ活性を有するが、極めて低レベル（１．３％）にすぎないことがわかった。
本発明の組成物及び方法に使用するのに適切な酵素は、緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイによって常法に従って特定することができる。極めて高含水量（約９５％）であるこのアッセイによって、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性（相対トランスフェラーゼ活性）、好ましくは少なくとも５％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％ ２６％、２８％、３０％、４０％ ５０％、６０％又は７５％の相対トランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼである。好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、２８％未満、３０％未満、好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％未満のアシルトランスフェラーゼ活性を有することができる。
高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ（実施例１１参照)
「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」(上記参照)を使用するのとは別に（又はその使用に加えて）、本発明によって使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、実施例１１において教示される「高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ」を用いて特定することができる。
一実施形態においては、本発明による方法及び／又は組成物において使用するのに適切な脂質アシルトランスフェラーゼは、５４％の水分を含む卵黄において高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイによって試験したときに、最高１００％の相対トランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼである。実際、高水分卵黄における実験によれば、実験の始めにおける初期トランスフェラーゼ率は、１００％トランスフェラーゼ活性であると計算され、すなわち、加水分解活性は認められなかった。これに対して、対照として使用した脂肪分解酵素、すなわちＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ及びホスホリパーゼＡ２は、５４％の水分を含む卵黄、又は含水量の多い卵黄（すなわち、７３％又は８９％の水分を含む卵黄）において検出可能なトランスフェラーゼ活性を示さなかった。含水量の上昇によって、本発明による方法又は組成物において使用される脂質アシルトランスフェラーゼのアシルトランスフェラーゼ活性百分率が大きく低下しないことが好ましい。
含水量が５４％の高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイに関する好ましい実施形態においては、本発明において使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定された初期アシルトランスフェラーゼ活性百分率（初期相対トランスフェラーゼ活性）が、少なくとも０．１％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも５％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましい少なくとも１０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも２０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも３０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも４０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも５０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％、好ましくは約１００％のアシルトランスフェラーゼ活性である。
含水量が５４％の高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイに関し、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定された好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、検出可能なトランスフェラーゼ活性、すなわち、０．１〜１００％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも５％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましい少なくとも１０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも２０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも３０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも４０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも４５％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の相対トランスフェラーゼ活性を有する。好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、含水量が５４％の高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイによって、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定したときに、アシルトランスフェラーゼ活性百分率（相対トランスフェラーゼ活性）が４５％、４７％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％未満とすることができる。
含水量が７３％の高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイに関し、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定された好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、検出可能なトランスフェラーゼ活性、すなわち、０．１〜１００％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも５％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましい少なくとも１０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも２０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも３０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも４０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも４５％、５０％、５８％、６０％、７０％、８０％又は９０％の相対トランスフェラーゼ活性を有する。好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、含水量が７３％の高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイによって、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定したときに、アシルトランスフェラーゼ活性百分率（相対トランスフェラーゼ活性）が４５％、４７％、５０％、５８％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％未満とすることができる。
含水量が８９％の高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイに関し、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定された好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、検出可能なトランスフェラーゼ活性、すなわち、０．１〜１００％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも５％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましい少なくとも１０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも２０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも３０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも４０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも４５％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の相対トランスフェラーゼ活性を有する。好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、含水量が８９％の高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイによって、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定したときに、アシルトランスフェラーゼ活性百分率（相対トランスフェラーゼ活性）が４５％、４７％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％未満とすることができる。
高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイに関する好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定したときに、かなりの相対トランスフェラーゼ活性を有し（すなわち、両方の含水量において少なくとも０．１％）、含水量が５４％の卵黄において含水量が７３％の卵黄と同じ相対トランスフェラーゼ活性を有する。
高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイに関する好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定したときに、かなりの相対トランスフェラーゼ活性を有し（すなわち、両方の含水量において少なくとも０．１％）、含水量が５４％の卵黄において含水量が８９％の卵黄と同じ相対トランスフェラーゼ活性を有する。
高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイに関する好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、供与体分子（すなわち、リン脂質）が１０％消費された後に測定したときに、かなりの相対トランスフェラーゼ活性を有し（すなわち、両方の含水量において少なくとも０．１％）、含水量が７３％の卵黄において含水量が８９％の卵黄と同じ相対トランスフェラーゼ活性を有する。
本明細書の「同じ相対トランスフェラーゼ活性」という用語は、酵素が、高含水量の卵黄において、低含水量の卵黄におけるそれよりも少なくとも２％低い、好ましくは少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％低い相対トランスフェラーゼ活性（％アシルトランスフェラーゼ活性）を有することを意味する。
低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ
「高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ」及び／又は「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」を使用するのとは別に（又はその使用に加えて）、本発明によって使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって特定することができる。
ある酵素が本発明による脂質アシルトランスフェラーゼであるかどうかを明らかにするために、「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」を、すなわち、実施例２２において教示される６％の水を含む油状環境において実施することができる。この実施例は、従来技術の脂肪分解酵素が加水分解活性を有する含水量６％の油状環境において、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼが高い相対トランスフェラーゼ活性を有することを示している。
一実施形態においては、本発明による方法及び／又は組成物において使用するのに適切な脂質アシルトランスフェラーゼは、「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験し、３０、２０又は１２０分から選択される時間後に測定したときに、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％の相対トランスフェラーゼ活性を有する。好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、１０、２０、３０又は１２０分後に「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって測定したときに、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％未満の活性を有することができる。
上述したように、本発明のリパーゼアシルトランスフェラーゼは、「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」、又はアシル受容体としてコレステロールを用いた「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって特定することができる。「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」又は「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」は、これらの分析方法に明らかな修正を加えて、あらゆる脂質アシル供与体又はあらゆるアシル受容体の組み合わせの脂質アシルトランスフェラーゼ活性を求めるために使用できることを当業者が容易に認識できることは言うまでもない。当業者は、必要に応じて、アシル供与体基質（例えばリン脂質）を別のアシル供与体基質（例えば糖脂質、トリアシルグリセリド）と簡単に置換し、且つ／又はアシル受容体（例えばコレステロール）を別のアシル受容体基質（例えば炭水化物、タンパク質、別のステロール、スタノール又はグリセリン）と置換することができる。
本明細書において使用される「高水分」という用語は、含水量が２％を超える、好ましくは３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を超えるあらゆる基質又は食料品を意味する。
本明細書において使用される「低水分」という用語は、含水量が６％未満、好ましくは５％、４％、３％、２％、１％又は０．５％未満のあらゆる基質又は食料品を意味する。
本発明による方法及び／又は使用は、例えば、食料品中で１５〜６０℃、好ましくは２０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で実施できることが好ましい。一部の態様では、例えば生地中で、アシルトランスフェラーゼ反応が起きている間の食品の温度は２０〜４０℃であることが好ましい。別の態様では、例えばチーズなどの乳製品に関して、食品の温度を好適には３０℃〜６０℃とすることができる。さらに別の態様においては、例えばマヨネーズに関して、食品の温度は、好適には２０〜４０℃、より好ましくは２５〜３０℃とすることができる。
本発明によって製造される乳化剤は、食料品の５ｗｔ％未満であることが好ましい。
本発明によって製造される乳化剤は、食料品の０．０１〜４ｗｔ％であることが好ましい。
本発明によって製造される乳化剤は、食料品の０．０１〜２ｗｔ％であることが好ましい。
本発明によって製造される乳化剤は、食料品の０．０１〜１ｗｔ％であることが好ましい。
本発明によって製造される乳化剤は、食料品の０．０１〜０．５ｗｔ％であることが好ましい。
本発明によって製造される乳化剤は、食料品の０．０１〜０．３ｗｔ％であることが好ましい。
本発明による方法は、酵素を不活性化又は変性して不活性型又は変性型酵素を含む食料品を提供することを含むことが好適である。好適には、酵素は、焼くこと又は低温殺菌によって変性することができる。
本発明は、さらに、食品及び／又は飼料酵素組成物における、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼの使用を包含することができ、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを含む食品及び／又は飼料酵素組成物を包含することができる。このような組成物は、本明細書に列挙するものなどの１種類若しくは複数のさらなる酵素を含むことができる。或いは、本発明の酵素組成物は、他の酵素組成物を含めて、本明細書に列挙するものなどの他の食品成分／添加剤と組み合わせて使用することができる。食品及び／又は飼料組成物内に本発明の脂質アシルトランスフェラーゼを配合することによって、この酵素が安定化され、食品及び／又は飼料の製造に使用する前に（適切な諸条件下で）長期保存が可能になる。また、本発明の酵素組成物は、食料品及び／又は飼料、或いは食品及び／又は飼料調製に使用される成分の調製において、「インサイチュ」での適用に安全に使用するのに適切な形の酵素を提供する。このような組成物は、液体、半液体又は固体／顆粒状の形とすることができる。
一実施形態においては、食品酵素組成物は、適切な生地改善用組成物とすることができる。生地改善用組成物は、本明細書に記載する乳化剤及び／又は他の酵素などの他の有利な成分を含むことができる。
食品酵素は、安定な液体濃縮物又は粒子固体として販売されている。食品酵素組成物へ配合することによって、輸送、貯蔵及び使用中の酵素活性の低下が最小限に抑えられる。酵素は、食品及び飲料加工中に高湿度環境、高温環境又は酸化環境に曝されることが多い。配合は、主要な不活性化力（ｆｏｒｃｅｓ ｏｆ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、すなわち、変性、触媒作用部位の不活性化、及びタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｏｌｙｓｉｓ）に対抗することによって安定性が高められる。変性は、酵素タンパク質の３次構造が熱又は化学的応力下で物理的にほどけることによって起こる。酵素がほどけ始めると、不活性化及びタンパク質分解を劇的により受けやすくなる。ほどけるのを最小限に抑えるために、配合者は、緻密なタンパク質構造が得られるようにタンパク質環境を変えることができる。これは、糖、多価アルコール、離水性塩などの水結合性（ｗａｔｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）化合物を添加してタンパク質表面から水を「優先的に排除」することによって最も効果的に実施される。活性部位不活性化に対抗する最良の方法は、必要なあらゆる補因子を十分なレベルに確保すること、可逆的な阻害剤を添加すること、及び酸化性種又は反応性種を処方から排除することである。
酵素の安定性に加えて、配合物は、微生物混入の予防、物理的沈殿又は濁り形成の回避、感作性ダスト（ｓｅｎｓｉｔｉｓｉｎｇ ｄｕｓｔ）又はエアゾールの形成を最小限に抑えること、及び色、匂いなどの美的判定基準の最適化を含めて、いくつかの重要な第２の要件を満たすべきである。これらの問題の多くは、発酵又は酵素回収プロセスにおける原材料の選択を含めて、できる限り「上流」に焦点を合わせることによって最も良く対処される。ダイアフィルトレーション、吸着、クロマトグラフィー、結晶化、抽出などの下流操作によって、色、匂い及び沈殿の原因となる不純物を除去することができる。物理的沈殿のリスクは、グリセリン、プロピレングリコールなどの親水性溶媒を用いて酵素の等電点付近で配合することによって最小限に抑えられる。中程度のレベルの溶媒和塩を有効に添加して塩析又は「逆塩溶（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓａｌｔｉｎｇ−ｉｎ）」を回避することもできる。微生物の混入を防止するために、ろ過、酸性化、及び遊離水の最少化を併用することができる。殺生物剤も有効な場合があるが、微生物を駆除し、又は死滅させるのに許容される化学物質の範囲は、健康と安全性の規制によって徐々に制限されている。
今までで耐摩擦性に最も優れる顆粒剤を製造する２つのプロセスは、高せん断造粒及び流動層スプレーコーティングである。例えば、R.K. Singh, S.S.H. Rizvi (eds.): Bioseparation Processes in Foods, Marcel Dekker, New York, pp. 427-445のT. Becker: "Separation and Purification Processes for Recovery of Industrial Enzymes"を参照されたい。これらのプロセスは、様々なバインダー、コーティング及び粒子形態を使用して、貯蔵中に酵素をそのまま保護するが、使用中には酵素を溶液中に容易に放出することができる、粉砕されない粒子を製造する。
本発明の脂質アシルトランスフェラーゼを含有する食品酵素組成物は、噴霧乾燥、液体配合（ｌｉｑｕｉｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）などの標準配合技術によって製造することができる。
本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、任意の適切な発現宿主中で発現させることができる。例えば、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、バチルスサチリス（Bacillus subtilis）中で発現させることができ、限外ろ過、及び／又はエタノール中の沈殿、及び／又は遠心分離によって精製することができ、続いて酵素の担体としてデンプン（マルトデキストリン）を用いて噴霧乾燥することができる。噴霧乾燥された酵素は、粉末担体をさらに添加することによって指定のＰＬＵ活性に規格化することができる。関係する技術は、当分野では十分に確立されており、日常的なものである。
或いは、本発明によって使用される脂質アシルトランスフェラーゼ、例えば、異種間で製造される本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、精製後、グリセリンに基づく液体配合物などの適切な液体配合物中で安定化させることができる。安定な酵素配合物を製造する他の方法は、欧州特許第０ ７７０ ０３７号及び欧州特許第０ ７０２ ７１２号に記載されている。
粉末のアシルトランスフェラーゼは、製品仕様に従って規定された活性を有する酵素組成物を製造するために、本明細書に列挙する他の酵素と併用することもできる。
一般に、食品酵素配合物の用量は、１０ｇ〜１０００ｇ／１０００ｋｇ食料品、好ましくは５０〜２００ｇ／１０００ｋｇ食料品、好ましくは、７５〜１２５ｇｍ／１０００ｋｇ食料品である。
本発明による酵素は、食料品中に、不活性型又は変性型で存在することが好ましい。
一実施形態においては、本発明による酵素は、好ましくは固定されず、特に固体担体上に固定されない。
別の実施形態においては、酵素を固定することができる。
固定化脂質アシルトランスフェラーゼは、当分野で既知の固定化技術を用いて調製することができる。固定化酵素を調製する方法は多数あり、それらは当業者には明らかである（例えば、欧州特許第０ ７４６ ６０８号；又はBalcao VM, Paiva AL, Malcata FX., Enzyme Microb Technol. 1996 May 1;18(6):392-416；又はReetz MT, Jaeger KE. Chem Phys Lipids. 1998 Jun;93(1-2):3-14；又はBornscheuer UT, Bessler C, Srinivas R, Krishna SH. Trends Biotechnol. 2002 Oct; 20(10):433-7に記載の技術（これらの各々を参照により本明細書に援用する）。
一実施形態においては、本発明の食料品は、固定化脂質アシルトランスフェラーゼを用いて調製された食品成分を含むことができるが、食品成分又は食料品中に脂質アシルトランスフェラーゼを含まない。例えば、食料品は、以下、すなわち、乳化剤、１種類を超える乳化剤、１種類若しくは複数の香味料、１種類若しくは複数の食感向上剤（ｔｅｘｔｕｒａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、及び／又は植物ステロールエステル、フィトスタノールエステルなどの１種類若しくは複数のステロールエステルの１種類若しくは複数を含むことができる。
本発明による酵素は、例えば、モノグリセリド、脂肪酸のモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、及び例えば大豆から得られるレシチンを含めて、１種類若しくは複数の従来の乳化剤とともに使用することができる。
本発明による酵素は、１種類又は複数の他の適切な食品用酵素と併用することができる。したがって、本発明の酵素に加えて、少なくとも１個のさらなる酵素が食料品に添加されることは、本発明の範囲内にある。このようなさらなる酵素としては、エンド又はエキソアミラーゼなどのデンプン分解酵素、プルラナーゼ、枝切り酵素、キシラナーゼを含めたヘミセルラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼなどが挙げられる。
本発明による酵素は、１種類又は複数の他の適切な食品用酵素と併用することができる。したがって、本発明の酵素に加えて、少なくとも１個のさらなる酵素が食料品に添加されることは、本発明の範囲内にある。このようなさらなる酵素としては、エンド又はエキソアミラーゼなどのデンプン分解酵素、プルラナーゼ、枝切り酵素、キシラナーゼを含めたヘミセルラーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、又はマルトースを酸化する酵素、例えば、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）などの炭水化物オキシダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ及びヘキソースオキシダーゼ、プロテアーゼなどが挙げられる。
好ましい一実施形態においては、脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のリパーゼ活性、すなわち、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）の１つ若しくは複数を有するリパーゼと併用される。好適には、リパーゼ酵素は当技術分野で周知であり、例として、以下のリパーゼ、すなわち、ＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ及び／又はＬＥＣＩＴＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ホスホリパーゼＡ２（例えば、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ製ＬＩＰＯＭＯＤ（商標）２２Ｌ、Ｇｅｎｅｃｏｒ製ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）からのホスホリパーゼＡ２）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、国際公開第０３／９７８３５号、欧州特許第０ ９７７ ８６９号又は欧州特許第１ １９３ ３１４号に教示されたリパーゼなどが挙げられる。本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼとリパーゼのこの組み合わせは、生地、焼いた製品、又はケーキ、菓子などのファインフード製品において特に好ましいことがある。
本発明の酵素と組み合わせたリパーゼの使用は、遊離脂肪酸がいくらか蓄積することがことによると望ましい場合、例えば、遊離脂肪酸が望ましい風味を添えることができるチーズにおいて、又はファインフードの調製において、特に有利なことがある。当業者は、脂肪分解酵素、例えば、ＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ及び／又はＬＥＣＩＴＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ホスホリパーゼＡ２（例えば、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ製ＬＩＰＯＭＯＤ（商標）２２Ｌ、Ｇｅｎｅｃｏｒ製ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）からのホスホリパーゼＡ２）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、国際公開第０３／９７８３５号、欧州特許第０ ９７７ ８６９号又は欧州特許第１ １９３ ３１４号に教示されたリパーゼの一部と、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼを組み合わせて、（本明細書の「技術的効果」の項に列挙するものなどの）食料品における好ましい技術的効果又は技術的効果の組み合わせをもたらす所望の加水分解活性／トランスフェラーゼ活性比を得ることができる。
伝統的に、ケーキ産業は、ケーキの製造にケーキ添加物（ｃａｋｅ ｉｍｐｒｏｖｅｒ）を使用して、味覚、構成、食感品質及び外観の点で確実に質の高いケーキにする。これらのケーキ添加物は、通常、デンプン及びマルトデキストリンのような担体上で噴霧乾燥された乳化剤をもとにしている。一部のケーキ添加物は、乳化剤、糖及び水をもとにしたゲル状でもある。これらのケーキ添加物は、品質の良いケーキを製造するためにケーキ産業にとって極めて重要である。しかし、ケーキ添加物は、乳化剤、及びＥナンバーの他の「非天然」成分を含有する。消費者がＥナンバーの数の削減を求めているために、ケーキ産業は、乳化剤を使用しないで質の良いケーキを製造する代替方法を求めている。
ケーキを製造する別の方法は、酵素、すなわち、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼ、又は本発明による酵素組成物を使用することである。
本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼ及び／又は本発明の食品酵素組成物は、ケーキなどのファインフードの調製に使用することができる。そのような場合には、以下の構成物質、すなわち、
ｉ）（ケーキのレシピ中の炭水化物、及びやはりケーキのレシピの一部をなす卵中のレシチンからの）糖エステル及びリゾレシチン、及び／又は
ii）（高効率乳化剤であることが知られているタンパク質−脂肪酸縮合物の形成中に、レシチンからタンパク質又はペプチドに脂肪酸を転移させることによる）アシル化ペプチド及びリゾレシチン（Herstellung und Anvendungmoglichkeiten von Eiweiss-Fettsaurekondensaten. Andreas Sander, Eberhard Eilers, Andrea Heilemann, Edith von Kreis. Fett/lipid 99 (1997) Nr.4, 115-120）
をファインフード中で形成することができる。
一部のファインフード、特にケーキなどの高脂肪ファインフードの製造においては、脂肪酸がいくらか蓄積することが望ましいこともあると考えられている。したがって、脂肪分解酵素と本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼとの使用の組み合わせは、高脂肪ファインフードの製造に特に有利になり得る。或いは、追加の遊離脂肪酸又は脂肪酸石けん（Ｅ４７０ａ）を選択し、脂質アシルトランスフェラーゼと併用することができる。
本発明による食料品は、好適には、以下の添加剤、すなわち、
大豆タンパク質材料；カロテノイド、フラベノイド（ｆｌａｖｅｎｏｉｄ）、酸化防止剤及び植物化学物質（特に、アントシアノナイド（ａｎｔｈｏｃｙａｎｏｎｉｄｅ）、カロテノイド、ビオフラビノイド（ｂｉｏｆｌａｖｉｎｏｉｄ）、グルタチオン、カテキン、イソフラボン、リコピン、ジンセノサイド、ピクノジェノール、アルカロイド、ピジウム植物ステロール、スルフォラフォン（ｓｕｌｐｈｏｒａｐｈｏｎｅ）、レスベレトル（ｒｅｓｖｅｒｅｔｏｌ）、ブドウ種抽出物、又はスタノールエステルを含む食品）、ビタミン（特に、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＢ３、ビタミンＤ、ビタミンＥ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸、ビオチン、パントテン酸又はビタミンＫ）、ミネラル（特に、カルシウム、ヨウ素、マグネシウム、亜鉛、鉄、セレン、マンガン、クロム、銅、コバルト、モリブデン又はリン）、脂肪酸（特にガンマ−リノール酸、ユコスペンタエン酸（ｕｃｏｓｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）又はデコサヘキサエン酸（ｄｅｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ））、油（特に、ルリヂサ油、高カロテノイドカノーラ油又はアマニ油）、アミノ酸（特に、トリプトファン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、タウリン又はチロシン）、酵素（特に、ブロメライン、パパイン、アミラーゼ、セルラーゼ又は補酵素Ｑ）、リグニン、スタノールエステル又は良性の細菌（特に、ラクトバチルスアシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス ビフィズス（Lactobacillus bifidus）、ラクトバチルス プランタルム（Lactobacillus plantarum）又はストレプトコッカス フェシウム（Streptococcus faecium））、葉酸及び可溶性繊維の１種類若しくは複数を含むことができる。
技術的効果
驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼは、食料品中でかなりのアシルトランスフェラーゼ活性を有する。この活性は、食料品を調製する方法において予想外の有利な用途を有する。
本発明は、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが、かなりの水分を含む食料品中でアルコール分解によって炭水化物エステル化、すなわち、脂質からのアシル転移を行うことができるという驚くべき発見に基づく。従来技術によれば、このような酵素がわずかでもこのようにして機能する場合には、溶媒環境において（すなわち、低含水量又は無水環境において）のみ機能することが示唆される。
本発明は、卵製品、特にマヨネーズにおける以下の予想外の技術的効果、すなわち、低温殺菌中の熱安定性の改善；感覚器官が感知し得る諸特性の改善、粘稠性の改善の１つ若しくは複数を提供することができる。
本発明は、生地及び／又は焼いた製品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、生地又は焼いた製品（例えば、パン及び／又はケーキ）の比体積の改善；生地安定性の改善；外皮成績（ｃｒｕｓｔ ｓｃｏｒｅ）（例えば、薄い、且つ／又はぱりぱりしたパン外皮）の改善、パンの身の成績（ｃｒｕｍｂ ｓｃｏｒｅ）（例えば、より均一なパンの身の分布、及び／又はより細かいパンの身構造、及び／又はより柔らかいパンの身）の改善；外観（例えば、ふくれ又は穴がない、或いはふくれ又は穴が実質的にない滑らかな表面）の改善；老化の減少；柔らかさの向上；匂いの改善；味覚の改善の１つ若しくは複数を提供することができる。
本発明は、さほど遊離脂肪酸を形成せずに、食料品が貯蔵時に酸化されるのを抑制する界面活性の高い材料を食料品中で形成することによって有益な効果を提供することができる。というのは、遊離脂肪酸は、対応する脂肪酸エステルよりも酸化されやすいからである。
本発明は、食料品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、外観の改善、口当たりの改善、安定性の改善、特に、熱安定性の改善、味覚の改善、柔軟性の改善、弾性の改善、乳化の改善の１つ又は複数を提供できることが好適である。
好適には、本発明は、アイスクリームなどの乳製品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、例えば口当たりの改善（好ましくは、よりクリーム状の滑らかな口当たり）、味覚の改善、溶融の改善の１つ又は複数を提供することができる。
好適には、本発明は、卵又は卵製品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、エマルジョンの安定性の改善、エマルジョンの熱安定性、風味の改善、悪臭の減少、濃化特性の改善、粘稠性の改善の１つ又は複数を提供することができる。
本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼの使用に伴う、食料品調製における具体的な技術的効果を下表に示す。
Figure 2006521787
Figure 2006521787
好適には、本発明は、チーズにおける以下の予想外の技術的効果、すなわち、チーズにおけるオイルオフ現象の抑制；チーズ収率の増加；風味の改善；悪臭の減少；「石けんのような」味覚の減少の１つ又は複数を提供することができる。
食料製造、特にチーズ製造においては、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを使用すると、乳製品からの可溶性タンパク質の回収能力にかなりの利点が得られる。例えば、チーズ製造においては、全乳タンパク質のほぼ２０％が乳清（すなわち、凝乳の形成後に残る乳の水分の多い部分）中に取り去られる。乳清は可溶性乳タンパク質を含むのに対して、疎水性タンパク質は凝乳中に留まる。本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを使用することによって、アシル基を脂質から（好ましくは、糖脂質又はリン脂質から）タンパク質（特に、ラクトグロブリンなどの乳清タンパク質）に転移させてタンパク質脂肪酸縮合物を形成することが可能である。したがって、より疎水性であり、乳清中に溶出するのではなく、凝乳中に留まる生成物が生成する。このようにして、より多量の乳タンパク質を最終食料品中に、すなわち、チーズなどの最終乳製品中に維持することができる。
一態様においては、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを使用することによって、チーズなどの食品の収率を改善することができるという理解に一部基づいている。これとは別に、又はこれに加えて、食品の風味、食感、酸化安定性及び／又は品質保持期間を改善することができる。これとは別に、又はこれに加えて、食品のコレステロールレベルを低下させ、又は植物ステロール／スタノールエステルの含量を増加させることができる。
特定の理論に拘泥するつもりはないが、収率の増加は、乳清タンパク質及びペプチドのエステル転移の結果、乳清タンパク質の疎水性がかなり増加し、チーズ凝乳中にアシル化乳清タンパク質が沈殿するためと考えられる。
生物系においては、例えば、膜に結合したタンパク質及び酵素の析出は、２種類の異なる機序によって起こる。膜に結合したタンパク質は、いくつかの膜貫通ドメイン又は疎水性ドメインを有し、或いはポリペプチド鎖に連結された脂肪酸を有する。この脂肪酸は、通常、１４又は１６個の炭素原子の鎖長を有する。この脂肪酸は、３つの異なる位置、すなわち、アミド結合の場合のＮ末端アミノ酸、チオエステル結合の場合のシステイン残基、又はエステル結合の場合のセリン若しくはトレオニンアミノ酸において、ポリペプチド鎖に共有結合する。タンパク質を細胞膜に取り込むには、ポリペプチド分子１個につきわずか１個の脂肪酸しか必要ではない。
脂肪酸が非膜タンパク質に共有結合すると、物理特性及び機能特性が劇的に変わる。国際公開第９７／１４７１３号は、有機溶媒中で、ムコールミーハイ（Mucor miehei）（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）由来のリパーゼ及び脂肪酸を用いた処理によってアシル誘導体に転換された大豆及びグルテンタンパク質を記述している。本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、低水分又は高水分環境において、アシル化タンパク質の生成に使用することができる。
アシル化タンパク質は、いくつかの化粧品に使用することができる両親媒性複合体を形成することに留意されたい。アシル化タンパク質は、ゲルを形成することができ、水分を保持することによって水と結合し、乳化特性を有し、水と脂質の中間相（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）において極めて活性である。
したがって、本発明は、一態様においては、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを含む化粧品組成物を提供することができる。
また、本発明は、化粧品組成物を製造するための本明細書に定義するアシルトランスフェラーゼの使用を提供することができる。
別の態様においては、本発明は、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを化粧品組成物（又はその成分）に添加するステップを含む、化粧品組成物中でタンパク質エステルをインサイチュ生成する方法を提供する。
多数の食品タンパク質は水溶液に可溶であり、したがって、リパーゼアシルトランスフェラーゼによるインサイチュ改変に適している。チーズ製造においては、ラクトグロブリンは乳清画分から失われる。しかし、初期の結果によれば、リパーゼアシルトランスフェラーゼ、又はリパーゼアシルトランスフェラーゼ変異体によるアシル化後に、ｂ−ラクトグロブリンは、レンネット凝固中にカゼインミセル表面に付着することができる。β−ラクトグロブリンは、３個の表面ループ上に３個の可能なアシル化部位（セリン残基）を有する。乳は、十分な量のレシチン、すなわち、β−ラクトグロブリンをアシル化する脂質アシルトランスフェラーゼに適切な基質を含む。形成されるリゾレシチンは、さらに乳化効果を有することができる。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを用いて認められる改良点は、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼなどのアシルトランスフェラーゼ活性のない脂肪分解酵素が使用された場合と対比される。
利点
食品材料の少なくとも１種類の構成物質からの乳化剤及びステロール／スタノールエステルのインサイチュ生成は、食品材料が少なくとも１種類少ない添加材料を含むことを意味する。これは、製造性が向上するので有利である。例えば、さらなる加工、成分の追加、又は乳化剤の追加を不要にすることができる。さらに、食料品が含む「添加剤」を少なくすることができる。「添加剤」の削減又は除去は消費者にとって望ましい。添加剤の含有は食料品の成分リスト中で消費者に公表されなければならないことが多い。したがって、本発明はさらに有利である。
本発明の利点は、食料品の遊離脂肪酸含有量の有害な増加なしに、食料品中で乳化剤をインサイチュ生成できることである。
食品材料の少なくとも１種類の構成物質から２種類の乳化剤及び／又は炭水化物エステルをインサイチュ生成することは、食品材料が少なくとも１種類少ない添加材料を含むことを意味する。
また、脂質アシルトランスフェラーゼが糖脂質に作用するときには、食料品の遊離脂肪酸含有量の有害な増加なしに、乳化剤ＤＧＭＧをインサイチュで有利に生成することができる。したがって、遊離脂肪酸の増加に起因する有害効果の減少は、チーズにおける「石けんのような」味覚の低減、生地及び焼いた生地の諸特性（ｄｏｕｇｈ ｂａｋｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）における過量の防止を含むが、ただしこれらだけに限定されない。
一部の態様では、本発明の利点は、食料品中の遊離コレステロールレベルの低下である。
他の態様では、本発明の利点は、食料品中のスタノール及び／又はステロールエステルの増加である。一部のステロール／スタノールエステルは、有効な香味料及び／又は食感付与剤とすることができる。したがって、本発明は、食料品中の乳化剤のインサイチュ生成だけでなく、香味料及び／又は食感付与剤のインサイチュ生成ももたらすことができる。一部のステロール／スタノールエステルは、食料品中で消費されると、血清コレステロール及び／又は低密度リポタンパク質を減少させることが知られている。したがって、本発明は、ステロールエステル及び／又はスタノールエステルのレベルが高い食料品を調製するのに使用することができる。
一部の態様では、特に、本発明による酵素が、卵を主成分とする製品において使用されたときの利点は、望ましくない遊離炭水化物の除去である。
食料品の乳化特性が向上し、外観、及び／又は取扱い特性、及び／又は構造、及び／又は粘稠性、及び／又は熱安定性が味覚に対する負の影響なしに改善されることも有利である。
また、一部の実施形態では、リパーゼ自体を使用したときに認められる「過量」の効果が、本発明による酵素を添加することによって有効に克服されることが有利である。これは、少なくとも部分的には、本発明による酵素を使用したときに遊離脂肪酸が生成されない、又はわずかしか生成されないということによる。
単離
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、単離された形であることが好ましい。「単離された」という用語は、配列が、その配列が本来天然に付随し、天然に存在する少なくとも１種類の他の成分から少なくとも実質的に遊離していることを意味する。
精製
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、精製された形であることが好ましい。「精製された」という用語は、配列が比較的純粋な状態、例えば少なくとも純度約５１％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも純度約９０％、又は少なくとも純度約９５％、又は少なくとも純度約９８％であることを意味する。
本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチド、又は改変に適切なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生するあらゆる細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で周知である。
例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリは、ポリペプチドを産生する生物から得られる染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が知られている場合には、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、使用して、ポリペプチドをコードするクローンを、生物から調製されるゲノムライブラリから特定することができる。或いは、別の既知のポリペプチド遺伝子と相同の配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを特定することができる。後者の場合には、厳密性の低いハイブリッド形成条件及び洗浄条件が使用される。
或いは、ポリペプチドをコードするクローンは、ゲノムＤＮＡの断片を、プラスミドなどの発現ベクター中に挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリで酵素陰性細菌を形質転換し、次いでポリペプチドによって阻害される酵素を含む寒天上に形質転換細菌を播くことによって特定することができ、それによってポリペプチドを発現するクローンを特定することができる。
さらなる別法においては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準方法、例えば、Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869に記載されたホスホラミダイト法、又はMatthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805によって記載された方法によって合成的に調製することができる。ホスホラミダイト法においては、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置中で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクターにクローン化される。
ヌクレオチド配列は、標準技術に従って合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源の断片を（適宜）連結することによって調製された混合ゲノム・合成起源、混合合成・ｃＤＮＡ起源、又は混合ゲノム・ｃＤＮＡ起源とすることができる。連結された各断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列は、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号又はSaiki R K et al （Science (1988) 239, pp 487-491）に記載された、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
ヌクレオチド配列
本発明は、本明細書に定義する具体的な諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書において使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及び変異体、相同体、（その部分などの）その断片及び誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖であろうとアンチセンス鎖であろうと、２本鎖でも１本鎖でもよい、ゲノム起源、合成起源又は組換え起源とすることができる。
本発明に関係する「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。この用語は、コード配列のＤＮＡ、より好ましくはｃＤＮＡを意味することが好ましい。
好ましい実施形態においては、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、やはりその天然環境にあるその天然に付随する配列に連結されているときに、その天然環境における未変性ヌクレオチド配列を包含しない。参照を容易にするために、本発明者らはこの好ましい実施形態を「変性（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）ヌクレオチド配列」と称する。この点で、「未変性ヌクレオチド配列」という用語は、その固有の環境にあるヌクレオチド配列全体を意味し、それが天然に付随するプロモーター全体に動作可能に連結されるときには、そのプロモーターもその固有の環境にある。したがって、本発明のポリペプチドは、その固有の生物におけるヌクレオチド配列によって発現することができるが、そのヌクレオチド配列は、その生物中で天然に付随するプロモーターの制御下にはない。
ポリペプチドは、未変性ポリペプチドではないことが好ましい。この点で、「未変性ポリペプチド」という用語は、その固有の環境にあり、その未変性ヌクレオチド配列によって発現されたときの、ポリペプチド全体を意味する。
一般に、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製される（すなわち、組換えＤＮＡ）。しかし、本発明の別の実施形態においては、このヌクレオチド配列は、当分野で周知の化学的方法によって全体的又は部分的に合成することができる（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232参照）。
分子進化
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離された後に、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が特定された後に、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましいこともあり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を突然変異させることが望ましいこともある。
突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
適切な方法は、Morinaga et al （Biotechnology (1984) 2, p646-649）に開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)に記載されている。
上述したものなどの部位特異的突然変異誘発の代わりに、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ突然変異誘発キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲランダム突然変異誘発キットなどの市販キットを用いて、突然変異をランダムに導入することができる。欧州特許第０ ５８３ ２６５号は、欧州特許第０ ８６６ ７９６号に記載されたものなどの突然変異原性ＤＮＡアナログと併用することもできる、ＰＣＲに基づく突然変異誘発を最適化する方法について言及している。誤りを犯しやすいＰＣＲ技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼの変異体の生成に適している。国際公開第０２０６４５７号は、リパーゼの分子進化について言及している。
新規配列を得る第３の方法は、任意の数のＤｎａｓｅ Ｉなどの制限酵素又は酵素を用いて、異なるヌクレオチド配列を断片化し、機能タンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再び組み立てることである。或いは、完全ヌクレオチド配列の再組み立て中に、１種類又は複数の異なるヌクレオチド配列を用い、突然変異を導入することができる。ＤＮＡシャフリング及びファミリーシャフリング技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼの変異体を生成するのに適している。「シャフリング」を実施する適切な方法は、欧州特許第０ ７５２ ００８号、欧州特許第１ １３８ ７６３号、欧州特許第１ １０３ ６０６号にある。シャフリングは、米国特許第６，１８０，４０６号及び国際公開第０１／３４８３５号に記載された別の形のＤＮＡ突然変異誘発と組み合わせることもできる。
したがって、多数の部位特異的又はランダムな突然変異をヌクレオチド配列中にｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、続いて、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかを様々な手段によってスクリーニングすることができる。コンピュータ及びエキソ媒介（ｅｘｏ ｍｅｄｉａｔｅｄ）組換え方法（国際公開第００／５８５１７号、米国特許第６，３４４，３２８号、米国特許第６，３６１，９７４号参照）を用いて、例えば、既知の酵素又はタンパク質に対して生成される変異体が極めて低い相同性を有する分子進化を行うことができる。それによって得られるこのような変異体は、既知のトランスフェラーゼに構造がかなり類似しているが、極めて低いアミノ酸配列相同性を有することができる。
また、非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の突然変異体又は自然変異体は、野生型又は他の突然変異体又は自然変異体と組み換えて新しい変異体を生成することができる。このような新しい変異体も、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかでスクリーニングすることができる。
上述及び類似の分子進化方法を適用することによって、タンパク質構造又は機能の予備知識なしに、好ましい諸特性を有する本発明の酵素の変異体を特定し、選択することができ、予測不可能であるが有益な突然変異体又は変異体を生成することができる。当分野では、酵素活性を最適化し、又は変更するために分子進化を適用した多数の例がある。このような例としては、以下、すなわち、宿主細胞中又はｉｎ ｖｉｔｒｏで最適化された発現及び／又は活性、酵素活性の増大、基質及び／又は生成物特異性の変化、酵素又は構造安定性の増大又は低下、好ましい環境条件、例えば温度、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変化の１つ又は複数が挙げられるが、これらだけに限定されない。
当業者には明らかなように、分子進化ツールを使用して、酵素を変化させて酵素の機能を改善することができる。
本発明において使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、変異体とすることができ、すなわち、親酵素と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができることが好適である。変異体酵素は、親酵素と少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の相同性を保持する。適切な親酵素は、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有する任意の酵素を含むことができる。親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整合していることが好ましい。
好ましい実施形態においては、変異体脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロック中のｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列アミノ酸残基の少なくとも１種類若しくは複数を保持し、又は含む。
水系環境において脂質アシルトランスフェラーゼ活性がない、又は低いリパーゼなどの酵素は、分子進化ツールを用いて突然変異させて、トランスフェラーゼ活性を導入し、又は高めることができ、それによって本発明の組成物及び方法に使用するのに適切なかなりのトランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼが生成される。
好適には、本発明において使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、極性脂質、好ましくはリン脂質及び／又は糖脂質に対する酵素活性が親酵素よりも高い変異体とすることができる。このような変異体は、リゾ極性脂質に対しても低い活性を有するか、又は活性を持たないことが好ましい。極性脂質、リン脂質及び／又は糖脂質に対する高い活性は、加水分解及び／又はトランスフェラーゼ活性、或いはそれらの組み合わせの結果であり得る。
本発明に使用される変異体脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリド、及び／又はモノグリセリド、及び／又はジグリセリドに対する活性が親酵素より低くともよい。
変異体酵素は、トリグリセリド、及び／又はモノグリセリド、及び／又はジグリセリドに対して活性を持たないことが好適である。
或いは、本発明に使用される変異体酵素は、トリグリセリドに対して高い活性を有することができ、且つ／又は以下、すなわち、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドの１種類又は複数に対しても高い活性を有することができる。
脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は公知であり、このような変異体の１種類又は複数は、本発明による方法及び使用、並びに／又は本発明による酵素組成物に使用するのに適切なことがある。単なる例として、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、以下の参考文献、すなわち、Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266(2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3): 2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178(7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3): 587-99に記載されており、本発明によって使用することができる。
アミノ酸配列
本発明は、本明細書に定義する具体的な諸特性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列も包含する。
本明細書において使用される「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である場合もある。
アミノ酸配列は、適切な出所から調製／単離することができ、又は合成することができ、又は組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。
好適には、アミノ酸配列は、本明細書に教示される単離ポリペプチドから標準技術によって得ることができる。
単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定するのに適切な一方法は以下のとおりである。
精製ポリペプチドは凍結乾燥させることができ、その凍結乾燥材料１００μｇを８Ｍウレアと０．４Ｍ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ８．４の混合物５０μｌに溶解させることができる。溶解したタンパク質を変性し、窒素で覆い、４５ｍＭジチオスレイトール５μｌを添加した後に、１５分間５０℃で還元することができる。室温に冷却後、１００ｍＭヨードアセトアミド５μｌを添加し、窒素下、暗所において室温で１５分間システイン残基を誘導体化することができる。
水１３５μｌ、及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ ５μｇの５μｌ水溶液を上記反応混合物に添加し、窒素下３７℃で２４時間消化することができる。
得られたペプチドは、逆相ＨＰＬＣによって、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラム（０．４６ｘ１５ｃｍ；１０μｍ；Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）上で、溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、及び溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を用いて分離することができる。選択されたペプチドは、Ｎ末端の配列決定前に、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ１８ カラム上で同じ溶媒系を用いて、再度クロマトグラフにかけることができる。配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７６Ａ配列決定装置を用いて、製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）の指示に従ってパルス液体高速サイクル（ｐｕｌｓｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｆａｓｔ ｃｙｃｌｅｓ）によって実施することができる。
配列同一性又は配列相同性
本発明は、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、或いはそのようなポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列の使用も包含する（以後、「相同配列」と称する）。ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と等しく扱うことができる。
相同アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持し、且つ／又は酵素の活性を高めるポリペプチドを提供及び／又はコードすべきである。
本明細書において、相同配列は、対象配列に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位を含む。相同性は、類似性の面からも考えることができるが（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明では、配列同一性の面から相同性を表現することが好ましい。
本明細書において、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含む。相同性は、類似性の面からも考えることができるが（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明では、配列同一性の面から相同性を表現することが好ましい。
相同性比較は、目視によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを利用して実施することができる。これらの市販コンピュータプログラムは、２個以上の配列間の％相同性を計算することができる。
％相同性は、隣接配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列がもう一方の配列と並べられ、一方の配列中の各アミノ酸がもう一方の配列中の対応するアミノ酸と、１回に１個の残基が直接に比較される。これは、「ギャップのない（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。一般に、このようなギャップのないアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
これは極めて単純で一貫した方法ではあるが、例えば、それ以外は同一である配列対において、１つの挿入又は欠失によって、後続のアミノ酸残基がアラインメントから排除され、したがって、全体的なアラインメントを実施したときに、％相同性が大きく低下する可能性があることを考慮していない。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体の相同性スコアを不当に減少させずに、起こり得る挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、「ギャップ」を配列アラインメントに挿入して局所的相同性が最大限になるようにすることによって実施される。
しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸に対して、２個の比較配列間の高い関連性を反映して、ギャップができるだけ少ない配列アラインメントが、ギャップが多い配列アラインメントよりも高いスコアが得られるように、アラインメント中に存在する各ギャップに「ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）」を割り当てる。ギャップの存在に対しては比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基に対してはペナルティを減少させる「アフィンギャップコスト」が一般に使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適なアラインメントを生じることは言うまでもない。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、このようなソフトウエアを配列比較に用いるときには、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用するときには、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対しては−１２であり、各伸張に対しては−４である。
したがって、最大％相同性を計算するには、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントを作成する必要がある。このようなアラインメントを実行するのに適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウエアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed-Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方ともオフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60参照）。しかし、一部の適用例では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールは、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較することもできる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。
最終％相同性は、同一性の面から測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、一般に、全か無かの対比較に基づいてはいない。その代わり、化学的類似度又は進化距離に基づいて各対ごとの比較に対してスコアが割り当てられるスケールド類似度スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が一般に使用される。通常使用されるこのようなマトリックスの例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、公開デフォルト値、又はもし提供されていれば個別のシンボル比較表（ｓｙｍｂｏｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔａｂｌｅ）を一般に使用する（さらなる詳細については利用者マニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージの場合には公開デフォルト値を、他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
或いは、相同性百分率は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似したアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の複数のアラインメント機能を用いて計算することができる。
このソフトウエアが最適なアラインメントを作成した後に、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。このソフトウエアは、一般に、配列比較の一部としてこれを実行し、数値結果を生成する。
配列は、サイレントな変化をもたらし機能的に等価な物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含むこともある。物質の第２の結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を実施することができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあり、正に帯電したアミノ酸としては、リジン、アルギニンなどがあり、親水性の類似した値を有する非帯電極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンなどがある。
保存的置換は、例えば下表に従って実施することができる。第２のカラムの同じブロック、及び好ましくは第３のカラムの同じ行のアミノ酸を互いに置換することができる。
Figure 2006521787
本発明は、起こり得る相同置換（置換と交換は、本明細書ではともに、既存のアミノ酸残基と別の残基を取り替えることを意味する）、すなわち、塩基性残基と塩基性残基、酸性残基と酸性残基、極性残基と極性残基などの同種（ｌｉｋｅ−ｆｏｒ−ｌｉｋｅ）置換も包含する。非相同置換、すなわち、１クラスの残基から別のクラスの残基への非相同置換、或いはオルニチン（以後、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以後、Ｏと称する）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の介在も含む非相同置換も起こることがある。
交換は、非天然アミノ酸によっても成されうる。
変異体アミノ酸配列は、グリシン、β−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、プロピル基などのアルキル基を含めて、配列の任意の２個のアミノ酸残基の間に挿入することができる適切なスペーサー基を含むことができる。さらに別の形の変異は、１個若しくは複数のペプトイド型アミノ酸残基を含み、当業者には十分知られている。不確かさを回避するために、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基が、残基のα炭素ではなく窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を意味するために使用される。ペプトイド型ペプチドを調製する方法は、当分野で公知であり、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134にある。
本発明に使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、合成又は改変ヌクレオチドをその中に含むことができる。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当分野で知られている。これらの改変は、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格、並びに／或いは分子の３’及び／又は５’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加を含む。本発明では、本明細書に記載するヌクレオチド配列は、当分野で利用可能な任意の方法によって改変できることを理解されたい。このような改変は、ヌクレオチド配列のｉｎ ｖｉｖｏでの活性を高め、又は寿命を延ばすために実施することができる。
本発明は、本明細書に考察する配列、又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的であるヌクレオチド配列の使用も包含する。配列がその断片に相補的である場合には、その配列をプローブとして使用して他の生物などにおける類似のコード配列を特定することができる。
本発明の配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、いくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載する配列の他の変異体は、例えば、ある範囲の個体、例えば、異なる集団からの個体でできているＤＮＡライブラリを探索することによって得ることができる。また、他のウイルス／細菌又は細胞の相同体、特に哺乳動物の細胞（例えばラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）中にある細胞の相同体を得ることができ、このような相同体及びその断片は、一般に、本明細書の配列リストに示す配列と選択的にハイブリッド形成することができる。このような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ、又は他の動物種からのゲノムＤＮＡライブラリを探索することによって、また、添付した配列リスト中の配列のいずれか１つの全部又は一部を含むプローブを用いて、厳密性が中程度〜高い条件下でこのようなライブラリを探索することによって得ることができる。本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得るために、類似の考察が適用される。
変異体及び系統／種相同体は、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする、変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを使用した縮重ＰＣＲによって得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体から得られるアミノ酸配列を整列させることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で既知のコンピュータソフトウエアを使用して実施することができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられている。
縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１個又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される厳密性よりも低い厳密性の条件で使用される。
或いは、このようなポリヌクレオチドは、特徴の明らかな配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に対してコドン優先度を最適化するために、サイレントなコドン配列変化が必要な場合に有用なことがある。制限ポリペプチド認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性又は機能を変えるために別の配列変化が望まれる場合もある。
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を使用して、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、選択的増幅反応用プライマー、プローブ、例えば放射性又は非放射性標識を用いて従来の手段によって明示用標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｌａｂｅｌ）で標識されたプローブを作製することができ、或いはこのポリヌクレオチドをベクターにクローン化することができる。このようなプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチド長であり、本明細書において使用される本発明のポリヌクレオチドという用語によってやはり包含される。
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド及びプローブは、組換え、合成、又は当業者に利用可能なあらゆる手段によって作製することができる。これらは、標準技術によってクローン化することもできる。
一般に、プライマーは、１回に１個のヌクレオチドの所望の核酸配列の段階的な製造を含めた合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを実施する技術を当分野では容易に利用することができる。
より長鎖のポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）クローニング技術を用いて作製される。ＰＣＲクローニング技術は、クローン化が必要な脂質ターゲティング配列領域に隣接する１対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施し、増幅された断片を単離し（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することによって）、増幅されたＤＮＡを回収するものである。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクターにクローン化されるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
ハイブリッド形成法
本発明は、本発明の配列、又は本発明の配列若しくはそれに相補的な配列とハイブリッド形成可能である配列に相補的な配列も包含する。
本明細書において使用される「ハイブリッド形成法」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と連結されるプロセス」、並びにポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術において実行される増幅プロセスを含むものとする。
本発明は、本明細書に考察する対象配列、又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的である配列とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列の使用も包含する。
本発明は、本明細書で考察するヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な配列に相補的である配列も包含する。
ハイブリッド形成条件は、Berger and Kimmel（1987、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）に教示されたようにヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明する規定の「厳密性」を与えるものである。
最大の厳密性は、一般に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低温）で得られ、高い厳密性は、Ｔｍよりも約５℃〜１０℃低温；中程度の厳密性はＴｍよりも約１０℃〜２０℃低温；及び低い厳密性はＴｍよりも約２０℃〜２５℃低温で得られる。当業者には理解されるように、最大の厳密性のハイブリッド形成法は、同一のヌクレオチド配列を特定又は検出するために使用され、一方、中程度の（又は低い）厳密性のハイブリッド形成法は、類似又は関係するポリヌクレオチド配列を特定又は検出するために使用される。
本発明は、厳密性の高い条件、又は中程度の厳密性の条件下で、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的である配列を包含することが好ましい。
より好ましくは、本発明は、厳密性の高い条件下（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ７．０｝）で、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的である配列を包含する。
本発明は、（本明細書で考察するヌクレオチド配列の相補的配列も含めて)本明細書で考察するヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列にも関する。
本発明は、（本明細書で考察するヌクレオチド配列の相補的配列も含めて）本明細書で考察するヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的であるヌクレオチド配列にも関する。
厳密性が中間〜最大である条件下で、本明細書で考察するヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
好ましい態様においては、本発明は、厳密な条件下（例えば、５０℃及び０．２ｘＳＳＣ）で、本明細書で考察するヌクレオチド配列又はその補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を包含する。
より好ましい態様においては、本発明は、厳密性の高い条件下（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ）で、本明細書で考察するヌクレオチド配列又はその補体とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を包含する。
ポリペプチドの発現
本発明に使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。このベクターを使用して、適合した宿主細胞中で、且つ／又は宿主細胞から、ヌクレオチド配列を複製し、ポリペプチドの形で発現させることができる。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む調節配列を用いて制御することができる。原核生物プロモーター、及び真核細胞中で機能するプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用することができる。上述した２種類以上の異なるプロモーターに由来する配列要素を含むキメラプロモーターも使用することができる。
ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞によって生成されるポリペプチドは、使用する配列及び／又はベクターに応じて、分泌されても、細胞内に含まれてもよい。コード配列は、特定の原核細胞膜又は真核細胞膜を通って物質コード配列（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の分泌を誘導するシグナル配列を用いて設計することができる。
発現ベクター
「発現ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現が可能な構築体を意味する。
発現ベクターは、生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。「組み込む」という用語は、ゲノム中への安定な組み込みを好ましくは包含する。
本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を制御配列がもたらすことができるように、ヌクレオチド配列が制御配列に作動可能に結合されたベクター中に存在することができる。すなわち、ベクターは発現ベクターである。
本発明のベクターは、以下に示す適切な宿主細胞に形質転換して、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドを発現することができる。
ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクターの選択は、それが導入される宿主細胞によって決まることが多い。
ベクターは、抗生物質抵抗性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン抵抗性を与える遺伝子などの１種類又は複数の選択可能な標識遺伝子を含むことができる。或いは、選択は、（国際公開第９１／１７２４３号に記載された）同時形質転換によって実施することができる。
ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えばＲＮＡの生成用に使用することができ、又は宿主細胞に形質移入し、又は宿主細胞を形質転換するのに使用することができる。
したがって、さらなる実施形態においては、本発明は、複製可能なベクター中にヌクレオチド配列を導入し、そのベクターを適合性宿主細胞に導入し、そのベクターの複製をもたらす諸条件下でその宿主細胞を増殖させることによって、本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
ベクターは、さらに、当該宿主細胞中でベクターを複製することができるヌクレオチド配列を含むことができる。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製開始点である。
制御配列
一部の適用例においては、本発明に使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞などによって、ヌクレオチド配列の発現を可能にする制御配列に作動可能に結合することができる。例として、本発明は、このような制御配列に作動可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを包含する。すなわち、このベクターは、発現ベクターである。
「作動可能に結合」という用語は、記述した成分が意図したように機能できる関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に結合され」た制御配列は、調節配列に適合した条件下でコード配列が発現されるように連結されている。
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節シグナルを含む。
「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
本明細書に定義する具体的諸特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の増大は、異種調節領域、例えばプロモーター領域、分泌リーダー領域及びターミネーター領域を選択することによって達成することもできる。
本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に結合できることが好ましい。
細菌、真菌又は酵母宿主中でヌクレオチド配列の転写を誘導するのに適切なプロモーターの例は、当分野で周知である。
構築体
「抱合体」、「カセット」、「ハイブリッド」などの用語と同義である「構築体」という用語は、プロモーターに直接又は間接的に結合した、本発明によって使用される、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列に介在するＳｈ１−イントロン、ＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー基の提供である。直接又は間接的結合を含む、本発明に関係する「融合」という用語でも同じことが当てはまる。これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターを通常伴うタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを、それらがどちらも天然環境にあるときに包含しない場合もある。
構築体は、さらに、遺伝子構築体の選択を可能にするマーカーを含み、又は発現させることもできる。
一部の適用例では、構築体は、プロモーターに作動可能に結合された、少なくとも本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
宿主細胞
本発明に関係する「宿主細胞」という用語は、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドの組換え生成において使用される上述した発現ベクターのどちらかを含む任意の細胞を含む。
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドを発現するヌクレオチド配列を形質転換又は形質移入した宿主細胞を提供する。これらの細胞は、前記ベクターに適合するように選択され、例えば、原核（例えば、細菌）細胞、真菌細胞、酵母細胞又は植物細胞とすることができる。宿主細胞は、ヒト細胞ではないことが好ましい。
適切な細菌宿主生物の例はグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。
本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の性質、及び／又は発現タンパク質のさらなるプロセシングの望ましさに応じて、酵母、他の真菌などの真核生物宿主が好ましいことがある。一般に、酵母細胞は、操作が容易であるので、真菌細胞よりも好ましい。しかし、一部のタンパク質は、酵母細胞からうまく分泌されず、適切に処理されない場合もある（例えば、酵母における過剰糖鎖形成（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ））。この場合には、異なる真菌宿主生物を選択すべきである。
酵母、真菌、植物宿主細胞などの適切な宿主細胞を使用すると、本発明の組換え発現産物に対して最適な生物活性を付与するために必要となることがある翻訳後修飾（例えばミリストイル化、グリコシル化、切断、ラピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びチロシン、セリン又はトレオニンリン酸化）が可能になる。
宿主細胞は、プロテアーゼ欠乏、又はプロテアーゼマイナス系統とすることができる。
生物
本発明に関係する「生物」という用語は、本発明によるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／又はそれらから得られる生成物を含むことができるあらゆる生物を含む。
適切な生物としては、原核生物、真菌、酵母又は植物が挙げられる。
本発明に関係する「トランスジェニック生物」という用語は、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／又はそれから得られる生成物を含み、且つ／又はプロモーターによって、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のその生物内での発現が可能になる、あらゆる生物を含む。ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。
「トランスジェニック生物」という用語は、その天然環境にあるその未変性プロモーターの制御下にあるときに、やはりその天然環境にある未変性ヌクレオチドコード配列を包含しない。
したがって、本発明のトランスジェニック生物としては、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書に定義する構築体、本明細書に定義するベクター、本明細書に定義するプラスミド、本明細書に定義する細胞、又はそれらの産物のいずれか１種類若しくは組み合わせを含む生物が挙げられる。例えば、トランスジェニック生物は、異種プロモーターの制御下にある、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。
宿主細胞／生物の形質転換
先に示したように、宿主生物は、原核生物又は真核生物とすることができる。適切な原核生物宿主の例としては、大腸菌及びバチルスサチリスが挙げられる。
原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当分野ではこれまでたくさん書かれており、例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。原核生物宿主が使用される場合には、ヌクレオチド配列は、イントロンの除去などによって形質転換前に適切に改変する必要があることがある。
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
糸状菌細胞は、既知の方法によるプロトプラスト形成、及びプロトプラストの形質転換、それに続く細胞壁の再生を含むプロセスなどの当分野で既知の様々な方法を用いて形質転換することができる。宿主微生物としてアスペルギルスを使用することは、欧州特許第０ ２３８ ０２３号に記載されている。
別の宿主生物は植物とすることができる。植物を形質転換するのに使用される一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の論文にある。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許公開第０４４９３７５号にある。
真菌、酵母及び植物の形質転換に関する全般的な教示を以下のセクションに示す。
形質転換真菌
宿主生物は、糸状菌などの真菌とすることができる。適切なこのような宿主の例としては、サーモマイセス（Thermomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス属、ペニシリウム（Penicillium）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、トリコデルマ（Trichoderma）属などに属するあらゆるメンバーが挙げられる。
糸状真菌を形質転換することに関する教示は、糸状真菌を形質転換する標準技術、及び真菌の培養が当分野で周知であることを述べている米国特許第５７４１６６５号に概説されている。Ｎクラッサ（N. crassa）に適用された技術の広範な総説は、例えば、Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143にある。
糸状菌を形質転換することに関するさらなる教示は、米国特許第５６７４７０７号に概説されている。
一態様においては、宿主生物は、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス属とすることができる。
本発明によるトランスジェニックアスペルギルスは、例えば、Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S. D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)の教示に従って調製することもできる。
糸状菌における遺伝子発現は、Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4): 273-306に概説されている。
形質転換酵母
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
酵母における異種遺伝子発現の原理の総説は、例えば、Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54、及びCurr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5): 554-60にある。
この点で、サッカロミセス セレビシ（Saccharomyces cerevisi）種又はピキア パストリス（Pichia pastoris）種（FEMS Microbiol Rev (2000 24(1): 45-66参照)などの酵母は、異種遺伝子発現用ビヒクルとして使用することができる。
サッカロミセス セレビシエにおける異種遺伝子発現、及び遺伝子産物の分泌の原理の総説は、E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)にある。
酵母の形質転換の場合には、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックサッカロミセスは、Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75,1929)、Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)、及びIto, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168)の教示に従って調製することができる。
形質転換酵母細胞は、栄養要求性マーカー優性抗生物質抵抗性マーカーなどの様々な選択マーカーを使用して選択することができる。
適切な酵母宿主生物は、ピキア（Pichia）種、ハンゼヌラ（Hansenula）種、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ヤンロウイスジア（Yarrowinia）種、S. セレビシエを含めたサッカロミセス種、又はシゾサッカロミセポンベ（Schizosaccharomyce pombe）を含めたシゾサッカロミセ（Schizosaccharomyce）種から選択される酵母種など、ただしこれらだけに限定されない生物工学的に関連する酵母種から選択することができる。
メチロトローフの酵母種ピキア パストリス（Pichia pastoris）の系統を宿主生物として使用することができる。
一実施形態においては、宿主生物は、（国際公開第０１／３９５４４号に記載された）Ｈ．ポリモルファ（H. polymorpha）などのハンゼヌラ種とすることができる。
形質転換植物／植物細胞
本発明に適切な宿主生物が植物の場合もある。一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の論文、又は国際公開第０１／１６３０８号にある。トランスジェニック植物は、例えば、高レベルの植物ステロールエステル及びフィトスタノールエステルを生成することができる。
したがって、本発明は、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを用いて（特に、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを含む発現ベクター又は構築体を用いて）植物細胞を形質転換するステップと、その形質転換された植物細胞から植物を成長させるステップとを含む、高レベルの植物ステロールエステル及びフィトスタノールエステルを含むトランスジェニック植物を生成する方法にも関する。
分泌
ポリペプチドは、発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列は、本発明の状況でも使用することができる。
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（例えば、アスペルギルス由来のｇｌａＡ−１８及び２４アミノ酸型）、ａ因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス、クルイベロミセス及びハンゼヌラ）又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）に由来する分泌リーダー配列である。
検出
アミノ酸配列の発現を検出し、測定する様々なプロトコルが当分野で知られている。例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
多種多様な標識及び抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）技術が当業者に知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイに使用することができる。
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）などのいくつかの会社が、これらの手順用の市販キット及びプロトコルを提供している。
適切なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は色素生産剤、並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号及び同第４，３６６，２４１号が挙げられる。
また、組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号に示したように生成することができる。
融合タンパク質
本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドは、融合タンパク質として生成して、例えば、その抽出及び精製に役立てることができる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質パートナーと目的タンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を入れて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることが好都合な場合もある。融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
大腸菌の遺伝子融合発現系は、Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5): 501-6に概説されている。
本発明の別の実施形態においては、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を異種配列に連結して、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、物質活性に影響を及ぼすことができる薬剤をペプチドライブラリからスクリーニングするために、市販抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用な場合がある。
以下の図及び実施例を単なる例として参照して、本発明を以下に説明する。
実施例
指定した場合を除いて、ＴＬＣ分析を実施例６に記載されたように実施し、ＧＬＣ分析を実施例１１に記載したように実施した。
アエロモナス サルモニシダ亜種由来のトランスフェラーゼのクローニング、配列決定及び異種発現
使用したサルモニシダ系統：
アエロモナス サルモニシダ亜種。サルモニシダ（ＡＴＣＣ １４１７４）をＡＴＣＣから入手し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）中で終夜３０℃で増殖させた。この細胞を遠心分離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．のゲノムＤＮＡ単離手順によって単離した。ゲノムＤＮＡ緩衝剤セット（ｃａｔ．１９０６０）、プロテアーゼＫ（ｃａｔ．１９１３１）及びＲＮＡｓｅ Ａ（ｃａｔ．１９１０１）はすべてＱｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．（Ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃｏｕｒｔ Ｇａｔｗｉｃｋ Ｃｏｕｒｔ，Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＲＨ１０ ２ＡＸ）から入手した。
宿主細菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、組換えアエロモナス酵素の産生に使用した。コンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭの形質転換用宿主として使用した。適切なプラスミドを含む形質転換体を１００−ｕｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢ寒天培地中で３７℃で増殖させた。
発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ−ｐＳＭの構築：
アエロモナス由来のトランスフェラーゼ遺伝子のすべてのＤＮＡ増幅では、ゲノムＤＮＡ（０．２〜１ｕｌ）をテンプレートとして用い、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を１０ｘ ｐｆｕ緩衝剤１０ｕｌ、各プライマー１ｕｌ（５０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、２００ｕＭｄＮＴＰとともに総反応体積１００ｕｌで使用した。プログラム可能なサーマルサイクラー中で以下の条件によってＰＣＲ反応を実施した：９５℃３０秒、（９５℃３０秒、６０℃１分間及び６８℃２分間）を３０サイクル。追加の伸張を７２℃で５分間行った。
Ａ．サルモニシダ由来のトランスフェラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅を２つの別個のＰＣＲ反応で実施した。ＰＣＲ反応１をプライマー対、ａｓ１ＵＳＮＥＷ（５’ＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡ ＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴ ＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧ ＧＧＧ ３’［配列番号３６］）とａｓ１ｓ９５０ｎｅｗ（５’ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＧＴＡ ＣＴＧ３’［配列番号３７］）を用いて実施した。第２のＰＣＲ反応を、第１の反応のＰＣＲ産物及びプライマー：ａｓ１ＵＳＮＥＷ（５’ＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡ ＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴ ＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧ ＧＧＧ ３’［配列番号３８］）及びＡＨＬＳ１００１（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣ ＧＡＡＴＴＣＡＴ ＣＡＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＣ３’［配列番号３９］）を用いて実施して、Ｃ末端ヒスチジンタグを組み込んだ。第２の反応から得られたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素Ｎｄｅ１及びＢａｍＨＩで消化した。ｐＥＴ １２ａベクターＤＮＡ ２ｕｇも制限酵素Ｎｄｅ１及びＢａｍＨＩで消化し、ホスファターゼで処理した。制限酵素で処理したｐｅｔ１２ａと反応２のＰＣＲ産物を精製し、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて連結した。この連結混合物を使用して大腸菌ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。形質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播いた。
Ｔ７プロモータープライマー（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３’［配列番号４０］）及びＴ７ターミネータープライマー（５’ＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ３’［配列番号４１］）を使用して、ｐＥＴ１２ａベクター中のクローン化されたトランスフェラーゼ遺伝子の配列及び配向を検証した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ Ｃｙｃｌｅ配列決定キットを用いて、プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇをテンプレートとして、Ｔ７プロモーター及びターミネータープライマー３．２ｐｍｏｌを使用してＤＮＡ配列を決定した。
図３５に示す構築体を用いて、コンピテントな細菌宿主系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択して発現分析に使用した。
組換えアエロモナス サルモニシダ脂質アシルトランスフェラーゼの発現
レシチンに対する細胞抽出物の酵素活性をＮｏｎ−Ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ（ＮＥＦＡ）キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて定量した。
図３６において、発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをＬＢ培地＋アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ中で増殖させ、ＯＤ６００＝０．６〜１．０になるまで振とうしながら３７℃でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）を用いて培養物を誘導し、さらに３時間インキュベーションを続けた。ＩＰＴＧ誘導後０時間、１、２及び３時間に試料を採取した。ＮＥＦＡキットを用いレシチンを基質として酵素活性を試験した。
より活性な酵素を産生するための増殖最適化
発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをＬＢ培地＋アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ中で増殖させ、異なる増殖温度（３７℃、３０℃＆２０℃）で振とうしながらインキュベートした。活性脂質アシルトランスフェラーゼを産生する最適条件は、図３７に示すように、培養物が３０℃で増殖されるときであった。
組換えアエロモナス サルモニシダトランスフェラーゼの部分精製
発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容する系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出物を超音波処理によって調製した。Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて、超音波処理した粗製細胞抽出物から組換え酵素をさらに精製した。ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質としたホスホリパーゼ活性。活性トランスフェラーゼを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳから得られる粗製細胞抽出物を基質レシチンとともにインキュベートし、反応混合物を薄層クロマトグラフィーによって分析した。分解生成物が存在することがわかった（図３８参照）。
組換えアエロモナス サルモニシダトランスフェラーゼの部分精製。発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容する系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出体を超音波処理によって調製した。Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて、超音波処理した粗製細胞抽出体から組換え酵素をさらに精製した。ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質としてホスホリパーゼ活性を試験した（図３９参照）。
大腸菌中でのアエロモナス ヒドロフィラトランスフェラーゼのクローニング及び発現
アエロモナス ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）をＡＴＣＣから入手し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）中で終夜３０℃で増殖させた。この細胞を遠心分離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．のゲノムＤＮＡ単離手順によって単離した。ゲノムＤＮＡ緩衝剤セット（ｃａｔ．１９０６０）、プロテアーゼＫ（ｃａｔ．１９１３１）及びＲＮＡｓｅ Ａ（ｃａｔ．１９１０１）はすべてＱｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．（Ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃｏｕｒｔ Ｇａｔｗｉｃｋ Ｃｏｕｒｔ，Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＲＨ１０ ２ＡＸ）から入手した。
宿主細菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、組換えアエロモナス酵素の産生に使用した。コンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａの形質転換用宿主として使用した。適切なプラスミドを含む形質転換体を、１００−ｕｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢ寒天培地中で３７℃で増殖させた。
発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ−ｐＳＭａの構築：
アエロモナス由来のトランスフェラーゼ遺伝子のすべてのＤＮＡ増幅では、ゲノムＤＮＡ（０．２〜１ｕｌ）をテンプレートとして用い、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を１０ｘ ｐｆｕ緩衝剤１０ｕｌ、各プライマー１ｕｌ（５０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、２００ｕＭｄＮＴＰとともに総反応体積１００ｕｌで使用した。プログラム可能なサーマルサイクラー中で以下の条件によってＰＣＲ反応を実施した：９５℃３０秒、（９５℃３０秒、６０℃１分間及び６８℃２分間）を３０サイクル。追加の伸張を７２℃で５分間行った。
Ａ．ハイドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）由来のトランスフェラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅を２つの別個のＰＣＲ反応で実施した。
ＰＣＲ反応１をプライマー対、ＡＨＵＳ１（５’ＧＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＧＴＣ３’、配列番号４２）及びａｈｌｓ９５０（５’ＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＧ３’、配列番号４３）を用いて実施した。
第２のＰＣＲ反応を、第１の反応から得られるＰＣＲ産物、及びプライマー対：
ＡＨＵＳ１（５’ＧＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＧＴＣ３’配列番号４４）及びＡＨＬＳ１００１（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣ３’配列番号４５）
を用いて実施して、Ｃ末端ヒスチジンタグを組み込んだ。
第２の反応から得られたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素Ｎｄｅ１及びＢａｍＨＩで消化した。ｐＥＴ １２ａベクターＤＮＡ ２ｕｇも制限酵素Ｎｄｅ１及びＢａｍＨＩで消化し、ホスファターゼで処理した。制限酵素で処理したｐｅｔ１２ａと反応２のＰＣＲ産物を精製し、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて連結した。この連結混合物を使用して大腸菌ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。形質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播いた。
Ｔ７プロモータープライマー（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３’）及びＴ７ターミネータープライマー（５’ＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ３’）を使用して、ｐＥＴ１２ａベクター中のクローン化されたＧＣＡＴ遺伝子の配列及び配向を検証した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ Ｃｙｃｌｅ配列決定キットを用いて、プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇをテンプレートとして、Ｔ７プロモーター及びターミネータープライマー３．２ｐｍｏｌを使用してＤＮＡ配列を決定した。
図４０に示す構築体を用いて、コンピテントな細菌宿主系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択して発現分析に使用した。
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中でのアエロモナス ヒドロフィラトランスフェラーゼの発現
発現ベクターｐｅｔ１２ａ−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａを収容する大腸菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをＬＢ培地＋アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ中で増殖させ、ＯＤ６００＝０．６〜１．０になるまで振とうしながら３７℃でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）を用いて培養物を誘導し、さらに３時間インキュベーションを続けた。ＩＰＴＧ誘導後０時間、１、２及び３時間に試料を採取した。ＮＥＦＡキットを用いレシチンを基質として酵素活性を試験した（図４１）。
より活性な酵素を産生するための増殖最適化
発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをＬＢ培地＋アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ中で増殖させ、異なる増殖温度（３７℃、３０℃＆２０℃）で振とうしながらインキュベートした。活性ＧＣＡＴ酵素を産生する最適条件は、図４２に示すように、培養物が３０℃で増殖されるときであった。
組換えＡ．ヒドロフィラトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）の部分精製
発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａを収容する系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出体を超音波処理によって調製した。Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて、超音波処理した粗製細胞抽出体から組換え酵素をさらに精製した。ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質としたホスホリパーゼ活性アッセイ。（図４３）。
バチルス サチリス１６３中でのアエロモナストランスフェラーゼの発現
プラスミド構築
２種類の異なるバチルス サチリス発現ベクター（ｐＵＢ １１０＆ｐＢＥ５）を、バチルスサチリス中でのアエロモナス遺伝子の異種発現に使用した。ｐＵＢ １１０ベクターはαアミラーゼプロモーターを含み、一方、ｐＢＥベクターは融合アエロモナス遺伝子の発現調節領域としてＰ３２プロモーターを有する。ｐＵＢ １１０においては、アエロモナスの成熟ＧＣＡＴ遺伝子の最初のアミノ酸は、バチルスサチリスのキシラナーゼシグナルペプチド配列の最後のアミノ酸と、制限酵素切断部位Ｎｈｅ１を介してインフレームで融合し、成熟タンパク質の前に追加の２個のアミノ酸が生成された。ｐＢＥ５は、組換えタンパク質を培養ろ液中に分泌する、Ｎｃｏ１部位におけるｃｇｔａｓｅシグナル配列融合を含む。
ｐＵＢ １１０及びｐＢＥ５ベクターのシグナル配列にインフレームで融合したアエロモナス遺伝子を得るためにＰＣＲ反応を実施した。Ａ．ヒドロフィラ遺伝子に対して以下のプライマー対を用いてＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ反応１：ｕｓＡＨｎｃｏｌ（５’ＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣ３’、配列番号４６）及び１ｓＡＨ（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３’、配列番号４７）
ＰＣＲ反応２：ＵＳ−ＡｈｎｈｅＩ（５’ＴＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣ３’、配列番号４８）及び１ｓＡＨ（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３、配列番号４９）
Ａ．サルモニシダ遺伝子に対して以下のプライマー対を用いてＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ反応３：ＵＳ−Ａｓｎｃｏｌ（５’ＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＣＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣ３’、配列番号５０）及び１ｓＡＨ（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３’、配列番号５１）
ＰＣＲ反応４：ＵＳ−ＡＳｎｈｅｌ（５’ＴＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＣＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣ３’、配列番号５２）及び１ｓＡＨ（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３’、配列番号５３）
すべてのＰＣＲ産物は、ＰＣＲ ｂｌｕｎｔ II（ＴＯＰＯベクター）にクローン化され、逆方向＆順方向配列決定プライマーを用いて配列決定された。
ＰＣＲ反応１＆３から得られたクローンは、Ｎｃｏ１＆Ｂａｍ ＨＩで切断され、Ｎｃｏ１／ＢａｍＨ１／ホスファターゼで切断されたｐＢＥ５ベクターを連結する挿入断片として使用された。ＰＣＲ反応２＆４から得られたクローンは、Ｎｈｅ１＆Ｂａｍ Ｈ１で切断され、Ｎｈｅ１／ＢａｍＨ１／ホスファターゼで切断されたｐＵＢベクターを連結する挿入断片として使用された。
バチルス サチリス中でのアエロモナストランスフェラーゼ遺伝子の発現、及びその酵素活性のキャラクタリゼーション
２種類のアエロモナス種に由来するアシルトランスフェラーゼは、大腸菌中で首尾良く発現した（上記結果）。バチルスｐＵＢ１１０＆ｐＢＥ５遺伝子融合構築体を使用してバチルスサチリスを形質転換し、カナマイシンプレート上に播くことによって形質転換体を選択した。単離され２ｘＹＴ中で増殖されたカナマイシン耐性形質転換体は、バチルス中でアエロモナス遺伝子を異種発現することができる。その培養ろ液は、アシルトランスフェラーゼ活性とホスホリパーゼ活性の両方に加えて、ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）ガラクトリパーゼ活性を有する。ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）に対する活性を、培養上清を基質の小麦粉由来のＤＧＤＧ（Ｓｉｇｍａから入手可能）とともに６０分間インキュベーションした後に、図４４に示すようにレシチンに対する活性と同様に測定した。バチルスは、培地中で終夜（２０〜２４時間）〜４８時間培養した後に、分泌タンパク質として酵素を産生した。アエロモナス遺伝子の発現は、バチルス＆大腸菌における細胞生存能力及び増殖を妨げる場合があることが判明した。したがって、発現系統を慎重に選択し、増殖条件を最適化して確実に発現するようにする必要がある。例えば、いくつかのバチルス宿主系統（Ｂ．ｓ １６３、ＤＢ１０４及びＯＳ ２１）は、増殖比較のために発現ベクターで形質転換された。Ｂ．ｓ１６３は、２種類のアエロモナス遺伝子で形質転換することができ、活性タンパク質を発現することができる。ＤＢ１０４は、すべての構築体で形質転換することができるが、Ａ．サルモニシダトランスフェラーゼしか発現することができない。
大腸菌中で産生されるアエロモナス脂質アシルトランスフェラーゼの発酵及び精製
大腸菌発酵：
微生物
２系統のエシェリキア コリ（Eschericia coli）、アエロモナス ヒドロフィラ（実施例２）脂質アシルトランスフェラーゼを含む１つと、アエロモナスサルモニシダ脂質アシルトランスフェラーゼ、（実施例１）を含む２つをこの試験に使用した。
Ａ．ヒドロフィラ遺伝子を含む大腸菌系統はＤＩＤＫ０１２４と命名され、Ａ．サルモニシダ遺伝子を含む大腸菌系統はＤＩＤＫ０１２５と命名された。ＤＩＤＫ０１２４による発酵はＨＹＤＲＯ０３０３と命名され、ＤＩＤＫ０１２５による発酵はＳＡＬ０３０２と命名された。ＨＹＤＲＯ０２５から得られる精製タンパク質はＲＥＦ＃１３８と命名された。ＨＹＤＲＯ０３０３から得られる精製タンパク質はＲＥＦ＃１３５と命名された。
増殖培地及び培養条件
ＬＢ寒天
系統を維持するために使用されたＬＢ寒天板は、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール３５ｍｇ／Ｌを含んだ。寒天板は３０℃でインキュベートされた。
ＬＢ振とうフラスコ
バイオリアクター培養用接種材料の生成に使用されるＬＢ培地（５０ｍＬ／振とうフラスコ）は、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール３５ｍｇ／Ｌを含んだ。振とうフラスコにＬＢ寒天板から接種して、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。
バイオリアクター培養
バイオリアクター培養は、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ ０．９ｇ／Ｌ、グルコース一水和物４０ｇ／Ｌ、ＡＤＤ ＡＰＴ（登録商標）Ｆｏａｍｓｔｏｐ Ｓｉｎ ２６０（ＡＤＤ ＡＰＴ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＧ、Ｈｅｌｍｏｎｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）０．４ｍＬ／、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２６Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ ０．７ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ １０ｍｇ／Ｌ、ＮｉＳＯ４６Ｈ２Ｏ ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２ ０．１ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ４ ０．１ｍｇ／Ｌ、ＫＩ ０．１ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ ０．１ｍｇ／Ｌ、アンピシリン１ｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール３５ｍｇ／Ｌを含む培地４Ｌを充填した６Ｌ社内組み立てバイオリアクター中で実施された。
（最大比増殖速度０．６ｈ−１、ＬＢ振とうフラスコのＯＤ６００、及びバイオリアクターにおける最終ＯＤ６００ 約２０から計算して）約２０時間培養した後に増殖が確実に終了する量のＬＢ培養物をバイオリアクターに接種した。
ＳＡＬ０３０２にＬＢ培養物１０ｍＬを接種し、ＨＹＤＲＯ０３０３にＬＢ培養物４ｍＬを接種した。
バイオリアクターを以下の条件で運転した：温度３０℃、（実験に応じて）撹拌８００〜１０００ｒｐｍ、通気５Ｌ／ｍｉｎ、ｐＨ６．９、ｐＨ調整８．７５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３−水及び２Ｍ Ｈ２ＳＯ４。誘導は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを最終濃度０．６ｍＭまで添加することによって実施され、それぞれ０．４ｍｏｌ（ＨＹＤＲＯ０３０３）及び０．７ｍｏｌのＣＯ２が生成した。
収集
バイオマスの収集及び均質化に以下の手順を使用した。
１）発酵物からの発酵ブロスを５０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離し、上清を排出した。バイオマスを使用するまで−２０℃で貯蔵した。バイオマスを解凍し、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール及び完全（ＥＤＴＡなし）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の５００ｍＬに再懸濁させた。
２）懸濁バイオマスをＣｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ（Ｗａｒｗｉｃｋ、ＵＫ）製細胞粉砕機を用いて２ｋｂａｒ、４℃でホモジナイズした。
３）１０．０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって細胞片を除去し、続いて上清を収集した。
４）１３．７００ｘｇ、４℃で６０分間遠心分離することによって上清をさらに精製し、続いて上清を収集した。
５）０．２μＭ Ｖａｃｕ Ｃａｐフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）を通して上清をろ過し、ろ液を収集してすぐにクロマトグラフィー精製にかけた。
トランスフェラーゼのクロマトグラフィー精製
（製造者Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって記載された方法に従って）カラム（２．５ｘ１０ｃｍ）にＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆｆ．ゲル５０ｍｌを詰め、硫酸Ｎｉを充填した。２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールの２００ｍｌでカラムを平衡にした。粗製物４００ｍｌを流量５ｍｌ／ｍｉｎでカラムにかけた。次いで、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールを用いて、ＵＶ２８０がベースラインに達するまでカラムを洗浄した。次いで、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び５００ｍＭイミダゾールの４０ｍｌを用いてＧＣＡＴを溶出させた。
バチルス サチリス中で産生されるアエロモナス脂質アシルトランスフェラーゼの発酵及び精製
発酵
ＢＡＣ０３１８−１９、ＢＡＣ０３２３−２４
微生物
この試験に使用される微生物はバチルス サチリス宿主系統＃１６３の形質転換から生じ、アエロモナス サルモニシダトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドがベクターｐＵＢ１１０ＯＩＳに挿入されている。この遺伝子の発現は、α−アミラーゼプロモーターによって制御され、トランスフェラーゼの分泌は、Ｂ．サチリスキシラナーゼシグナル配列によって媒介される（実施例３）。これらの系統は、ＤＩＤＫ０１３８（発酵ＢＡＣ０３１８−１９）及びＤＩＤＫ０１５３（発酵ＢＡＣ０３２３−２４）と命名された。
増殖培地及び培養条件
前培養培地
振とうフラスコ（総容積５００ｍＬ、バッフル付き）に、
ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４ １０ｇ／Ｌ
大豆粉 ２０ｇ／Ｌ
酵母抽出物、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ １０６ ２０ｇ／Ｌ
消泡剤、ＳＩＮ２６０ ５ｍＬ／Ｌ
を含む培地１００ｍＬを添加した。
ｐＨは高圧蒸気殺菌前に７．０に調節された。
高圧蒸気殺菌後に、５０％（ｗ／ｗ）Ｎｕｔｒｉｏｓｅ ６ｍＬ／フラスコを添加した。高圧蒸気殺菌後、カナマイシンを濃度５０ｍｇ／Ｌで添加した。
接種
２５％（ｗ／ｖ）グリセリン貯蔵物から凍結培養物を前培養振とうフラスコに直接接種した。振とうフラスコを３３℃、１７５ｒｐｍで約１６時間インキュベートし、発酵槽に接種するのに５０ｍＬを使用した。
発酵
６Ｌ社内組み立て発酵槽中で発酵を実施した。
バッチ培地（３Ｌ）は、
コーンスティープリカー（５０％ｄｗ） ４０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ １５３（５０％ｄｗ）１０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２，２Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ
Ｍｎ（ＮＯ３）２，Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ
消泡剤 ＳＩＮ２６０ １ｍＬ／Ｌ
カナマイシン（高圧蒸気殺菌後、発酵槽にフィルター滅菌 ５０ｍｇ／Ｌ
を含んだ。
供給原料は、
グルコース一水和物 ５４０ｇ／ｋｇ

ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ ４．８ｇ／ｋｇ
Ａｎｔｏｆｏａｍ ＳＩＮ２６０ ４ｍＬ／ｋｇ
酵母抽出物、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ １５３（５０％ｄｗ）１５０ｇ／ｋｇ
（別個に高圧蒸気滅菌）
を含んだ。
発酵ＢＡＣ０３１８及びＢＡＣ０３２３における供給は、以下の式に従って、蓄積したＣＯ２に基づいて開始された。
供給−流量［ｇ／ｈ］＝０、ＡｃＣＯ２＜０．１５
供給−流量［ｇ／ｈ］＝２．８５＋ｔ・１．５４、ＡｃＣＯ２≧０．１５及びｔ＜１２
供給−流量［ｇ／ｈ］＝２１．３、ｔ＞１２
ｔ：蓄積ＣＯ２（ＡｃＣＯ２）が０．１５モルに達した時点からの時間（ｈ）
発酵ＢＡＣ０３１９及びＢＡＣ０３２４における供給は、以下の式に従って、蓄積したＣＯ２に基づいて開始された。
供給−流量［ｇ／ｈ］＝０、ＡｃＣＯ２＜０．１５
供給−流量［ｇ／ｈ］＝２．０＋ｔ・１．０８、ＡｃＣＯ２≧０．１５及びｔ＜１２
供給−流量［ｇ／ｈ］＝１５、ｔ＞１２
ｔ：蓄積ＣＯ２（ＡｃＣＯ２）が０．１５モルに達した時点からの時間（ｈ）
ｐＨは、１２．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３−水又は２Ｍリン酸を添加することによって７．０に制御された。
通気は１ｖｖｍに相当する３Ｌ／ｍｉｎであった。
温度は３３℃であった。
発酵槽は、１０ｃｍの距離で配置された２個の８ｃｍφＲｕｓｈｔｏｎ回転翼を備えた。
収集
バイオマスは、１６，０００ｘｇで１０分間室温で遠心分離することによって除去された。上清をフィルター滅菌し、ろ液を精製及び応用試験に使用した。
卵黄における応用試験
以下の実験においては、Ｅ−コリ中で発現された、アエロモナス サルモニシダから単離されたトランスフェラーゼを、卵黄のみ、及び植物ステロールが添加された卵黄において試験した。
材料
アエロモナス サルモニシダ由来のトランスフェラーゼＲＥＦ＃１３８
卵黄：新鮮な卵（鶏卵）から
植物ステロール：β−シトステロール、Ｓｉｇｍａ Ｓ ５７５３
ＴＬＣプレート：シリカプレート Ｍｅｒｃｋ ｎｒ．１．０５７１５．０００１
ＴＬＣ分析。
ＴＬＣ−プレートを加熱カップボード（１１０℃）中で１／２時間活性化させた。
展開溶媒１００ｍｌを蓋付きのクロマトグラフィーキャンバー（ｃａｍｂｅｒ）に注いだ。チャンバーを溶媒蒸気で飽和させるために、チャンバー壁をろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ ２）で覆った。
ＴＬＣ−プレートを枠内に配置し、試料を底部から２ｃｍのＴＬＣプレート上に付けた。次いで、ＴＬＣプレートを、展開溶媒を含むＴＬＣチャンバー中に置いた。展開溶媒がプレート底部から１４ｃｍに達したとき。ＴＬＣプレートを取り出し、蒸発板（ｆｕｍｅ ｂｏａｒｄ）中で乾燥させ、次いで１１０℃の加熱カップボード中に１０分間置いた。
次いで、ＴＬＣ−プレートを展開試薬に浸漬し、加熱カップボード中で１１０℃で１５分間乾燥させた。
展開溶媒：
Ｎｒ．IV：クロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ（６５：２５：４）
Ｎｒ．Ｉ：Ｐ−エーテル：ＭＴＢＥ：酢酸（６０：４０：１）
展開緩衝剤（バナデート−緩衝剤）：
Ｎａ２ＣＯ３ ３２ｇをＨ２Ｏ ３００ｍｌに加える（１Ｍ）
五酸化バナデート（ｖａｎａｄａｔｅ ｐｅｎｔｏｘｉｄｅ）（Ｖ２Ｏ５）１８．２ｇを添加し、軽く加熱しながら溶解させる。
その溶液を周囲（ａｍｂｉｅｎｔ）まで冷却する。
２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ４６０ｍｌ（Ｈ２Ｏ ４６０ｍｌ＋Ｈ２ＳＯ４ ６１ｍｌ）を慎重に添加する。
水を１０００ｍｌまで添加する。
ホスホリパーゼ活性。
基質：
０．６％Ｌ−αホスファチジルコリン９５％植物（Ａｖａｎｔｉ ＃４４１６０１）＋０．４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（Ｓｉｇｍａ Ｘ−１００）＋５ｍＭ ＣａＣｌ２を０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７中に溶解する。
手順。
基質４００μｌを１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーモキミサー中に３０℃で５分間置いた。
Ｔ＝０まで、酵素溶液５０μｌを添加した。酵素の代わりに水を含むブランクも分析した。
試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で３０℃、１０００ｒｐｍで１０分間混合した。Ｔ＝１０ｍｉｎまで。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管を、９９℃の別のターモキキサー（ｔｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）中に１０分間置いて反応を停止させた。
試料中の遊離脂肪酸をＷＡＫＯ ＧｍｂＨ製ＮＥＦＡキットを用いて分析した。
酵素活性ＰＬＵ−７ ｐＨ７を、アッセイ条件下で生成されるマイクロモル脂肪酸／分として計算した。
脂質抽出。
卵黄１ｇとクロロホルム：メタノール２：１ ７．５ｍｌをＷｈｉｒｌｅｙ上で混合し、７５０ｘｇで１０分間遠心分離した。
クロロホルム相３ｍｌを単離し、さらなる脂質分析に使用した。
結果：
Ｅ−コリ中で発現された、アエロモナス サルモニシダ由来のトランスフェラーゼ（ＲＥＦ＃１３８）を、上述したようにホスホリパーゼ活性について分析し、β−シトステロールを含む卵黄と含まない卵黄においても試験した。試料を反応中マグネチックスターラで撹拌した。実験計画を表１に示す。
Figure 2006521787
クロロホルム：メタノール（２：１）７．５ｍｌを添加して反応を停止させ、Ｗｈｉｒｌｅｙミキサー上で３０秒間混合した。クロロホルム相を遠心分離によって単離し、クロロホルム相２μｌをあらかじめ活性化させたシリカＴＬＣプレートに移し、展開溶媒ｎｒ．Ｉで溶出させ、別のＴＬＣ−プレートを展開溶媒IVで溶出させた。
ＴＬＣ分析の結果を図４５及び４６に示す。
植物ステロールが添加された卵黄におけるアエロモナス サルモニシダ由来のトランスフェラーゼとのトランスフェラーゼ反応によって、コレステロールエステルの形成中に、酵素が卵黄中のレシチン由来の脂肪酸をコレステロールへ転移させることが判明した。ＴＬＣクロマトグラムによっても、卵黄に添加されたステロールの一部がステロールエステルに転移したことが示された。
反応中に形成されたコレステロールエステル量に対するステロールエステル量は、ＨＰＬＣ又はＧＬＣによって分析することができる。
植物ステロールエステルは、腸におけるコレステロールの吸収を減少させることが知られている。コレステロールエステルは、腸において遊離コレステロールよりも吸収されないことが文献においても示されている。トランスフェラーゼ及び植物ステロールを卵黄に添加すると、コレステロール吸収を減少させる生成物が得られ、卵黄の乳化特性を改善するリゾレシチンが同時に生成される。トランスフェラーゼ及び植物ステロールを卵黄に添加するさらなる利点は、コレステロール吸収の削減に最大の効果を有すると予想される植物ステロールエステルが天然の利用可能なコレステロールとともに摂取されることである。
アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼによる卵黄の改変
本発明によれば、トランスフェラーゼを使用することによって、遊離脂肪酸を実質的に形成することなく、リゾレシチンを卵黄から生成できることが今回判明した。
卵黄の含有レシチンは、マヨネーズの製造に重要な乳化剤であるが、マヨネーズが熱に不安定になるという制約がある。したがって、すい臓から得られるホスホリパーゼを用いて、卵黄中のレシチンをより効率的な乳化剤であるリゾレシチンに改変することが、ここ数年知られてきた。マヨネーズ製造に酵素改変卵黄を使用することは、低温殺菌中のマヨネーズの熱安定性を向上させる一助となる。卵黄にすい臓ホスホリパーゼを使用することの限界は、遊離脂肪酸量も増加し、遊離脂肪酸は、対応するエステルよりも酸化されやすいので、酸化安定性が低下する一因となることである。遊離脂肪酸は、石けんのような異味の一因ともなる。
アエロモナス サルモニシダ由来のトランスフェラーゼは、実施例５に記載したように、Ｂ．サチリス中で首尾良く発現され、実験室規模で発酵し、液体クロマトグラフィーによって精製され、卵黄脂質を改変するために使用された。酵素改変卵黄は、熱に安定なマヨネーズを製造するために使用された。
Ａ．サルモニシダ由来のトランスフェラーゼを使用して、卵黄中で遊離脂肪酸をさほど生成せずにリゾレシチン及びコレステロールエステルを生成することができる。すなわち、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに。
トランスフェラーゼによって製造される酵素改変卵黄は、乳化特性が改善され、熱に安定なマヨネーズに使用することができる。
この酵素は、レシチンとコレステロールの脂質転移反応（図４７）を触媒することによって、卵黄を改変するのに極めて機能的であった。
この試験は、卵黄を改変するためにトランスフェラーゼを使用すること、及び熱に安定なマヨネーズの製造において改質卵黄を使用することについてさらに検討した。
この実施例は、卵黄中でのトランスフェラーゼの発酵、単離及び応用、並びにマヨネーズにおける酵素改変卵黄の応用について記述する。この実施例は、２つの部分、すなわち、
Ａ．卵黄におけるトランスフェラーゼの応用
Ｂ．マヨネーズにおける酵素改変卵黄の試験
に分けられる。
実験
Ａ．応用
酵素と基質
Ａ．サルモニシダ由来のトランスフェラーゼ＃１７８−９、精製２５５４−１００ Ｃ７３、１５ＰＬＵ−７／ｍｌ。
Ａ．サルモニシダ由来のトランスフェラーゼ＃１７９、１８．５ＰＬＵ−７／ｍｌ。
ホスホリパーゼＡ１ ＬＥＣＩＴＡＳＥ（商標）Ｕｌｔｒａ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎａｍｒｋ）
卵黄：８％塩を含む液体卵黄、ＳＡＮＯＶＡ ＦＯＯＤＳ、ＤＫ
ＴＬＣ分析を、前述したとおり実施した（上記実施例６参照）。
ホスホリパーゼ活性：上記実施例参照。
脂質抽出
卵黄１ｇとクロロホルム：メタノール２：１ ７．５ｍｌをＷｈｉｒｌｅｙ上で３０秒間混合し、７５０ｘｇで１０分間遠心分離した。
クロロホルム相４ｍｌを単離し、さらなる脂質分析に使用した。
酸化安定性試験
マヨネーズの酸化安定性をＭＬ ＯＸＩＰＲＥＳＳ装置中で測定した。ここで、試料には、酸素雰囲気中の圧力下で熱を加えることによって、酸化的応力がかけられた。
誘導期間（ＩＰ）と呼ばれるある時間の後に、試料の酸化によって、酸素がある程度消費され、圧力変換器の圧力変化として記録される。誘導期間が長いほど、酸化安定性が良好である。
手順。
マヨネーズ５グラムをガラス容器に入れ、そのガラス容器を圧力変換器を用いて閉じる。容器に酸素を５ｂａｒ充填する。弁を開放して容器を空にする。この手順を２回繰り返し、５ｂａｒ酸素雰囲気の試料を８０℃に置く。酸素圧力を時間の関数として測定し、誘導期間（ＩＰ）を時間単位で計算する。
結果
アエロモナス サルモニシダ由来の精製トランスフェラーゼ試料番号＃１７９及び＃１７８−９を使用して表２に概説したように卵黄を処理した。初期試験から、市販ホスホリパーゼよりもはるかに低いホスホリパーゼ（ＰＬＵ）活性のＧＣＡＴトランスフェラーゼを添加すべきであることが判明した。これは、ＧＣＡＴがトランスフェラーゼであり、したがって、通常のホスホリパーゼよりもかなり低い加水分解活性を有するということによって説明される。
Figure 2006521787
ビーカー中で卵黄と酵素を計量することによって酵素反応を実施した。試料を３７℃の温蔵庫中にゆっくり撹拌しながら置いた。反応時間１、２及び４時間後に、ＴＬＣ分析のために試料を取り出した。反応時間４時間後に、生成物を５℃で貯蔵し、マヨネーズ実験に用いた。
酵素処理卵黄から抽出された脂質のＴＬＣ分析結果を図４８に示す。
図４８のＴＬＣ分析結果は、遊離脂肪酸の形成中に、トリグリセリド、並びにいくらかのモノ及びジグリセリドに対するホスホリパーゼ＃３１０８の明確な加水分解効果を示している。ホスホリパーゼ＃３１０８は、コレステロールに対して効果がないと考えられる。両方のトランスフェラーゼ試料は、コレステロール含量の低下と同時にコレステロールエステルの形成に明確に寄与している。
Ｄ．マヨネーズにおける酵素改変卵黄
表２において述べた卵黄試料の改変の効果を検討するために、脂肪含有量５０％のマヨネーズについて応用試験を実施した。未処理卵黄を含むマヨネーズも製造された。
検討の目的は、酵素改変卵黄の乳化特性の影響、及び熱安定性への影響を明らかにすることであった。マヨネーズ試料はすべて同じオイルレベルであり、卵黄のみで乳化された。マヨネーズ試料はすべてＫｏｒｕｍａミキサー（Ｄｉｓｈｏ Ｖ６０／１０）を用いて製造され、加工中に９５℃に５分間加熱された。
酵素処理卵黄によって製造されたマヨネーズ試料（図４９）は良好であり、均一で油の分離はなかった。対照試料は、油相と水相に分離した。
酵素処理卵黄を含むマヨネーズ試料中の油滴の粒径をＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒによって測定した。測定前に試料を０．１％ＳＤＳの０．１Ｍリン酸塩緩衝剤ｐＨ７溶液と混合した。読みは、表３に示すように全粒子の平均サイズであった。
Figure 2006521787
粒径測定の結果は、Ａ．サルモニシダ由来の高用量のトランスフェラーゼの効果を明確に示している。トランスフェラーゼの用量が多いと、粒径はＬｅｃｉｔａｓｅ Ｕｌｔｒａによって製造されるマヨネーズに近くなる。しかし、Ｌｅｃｉｔａｓｅ Ｕｌｔｒａは多数の脂肪酸を生成し、それがより細かな粒子分布の一因となっている可能性があることに留意すべきである。
酵素を用いて調製されるマヨネーズの油滴サイズは、酵素なしで調製されたマヨネーズ（すなわち、対照マヨネーズ）の油滴サイズよりもかなり小さい。
酸化安定性
マヨネーズ試料７及び８の酸化安定性をＭＬ ＯＸＩＰＲＥＳを用いて分析した。結果を表４に示す。
Figure 2006521787
酸化安定性の測定によって、酸化安定性に明確な有意差が現れた。トランスフェラーゼ１７９−８で処理した卵黄を含むマヨネーズは、Ｌｅｃｉｔａｓｅ Ｕｌｔｒａで処理した卵黄を含むマヨネーズよりもかなり良好な酸化安定性を示した。これは、Ｌｅｃｉｔａｓｅ Ｕｌｔｒａが、対応する脂肪酸エステルよりも酸化しやすい遊離脂肪酸をより多く生成するという事実によって説明することができるかもしれない。
マヨネーズ製造に使用される卵黄試料をクロロホルムで抽出し、卵黄から得られる脂質をＧＬＣによって分析した。結果を表５に示す。
Figure 2006521787
表５のＧＬＣ結果によって、Ｌｅｃｉｔａｓｅ Ｕｌｔｒａが極めて多量の遊離脂肪酸を生成し、トリグリセリドの大部分が加水分解されるというＴＬＣ分析の結果が確認された。一方、トランスフェラーゼは、限られた量の遊離脂肪酸しか生成せず、トリグリセリドは加水分解されない。トランスフェラーゼがコレステロールからコレステロールエステルを生成することも明らかである。
これらの結果によれば、「酵素処理」マヨネーズ中のＰＣの量は対照マヨネーズよりも減少し、一方、ＬＰＣの量は、対照マヨネーズよりも酵素処理マヨネーズにおいて増加した。ＬＰＣ量の増加は、酵素処理マヨネーズの乳化特性が対照マヨネーズよりも改善されたことをおそらくは説明している。ＨＰＬＣ分析及びＧＬＣ分析は、酵素処理マヨネーズにおける遊離コレステロールレベルが対照マヨネーズよりも低くなることも示している。これは、おそらく、コレステロールがトランスフェラーゼ反応における受容体分子として使用され、酵素処理マヨネーズにおけるコレステロールエステル量が対照マヨネーズよりも増加するためと考えられる。また、これらの結果は、トランスフェラーゼを用いて卵黄を処理したときに、遊離脂肪酸の量がさほど増加しないことを示している。これらの結果は、さらに、脂質アシルトランスフェラーゼで処理された食料品中で生成される遊離脂肪酸の量が、対照ホスホリパーゼで処理された食料品におけるよりもかなり少ないことを示している。これは、食料品中で形成されるリゾレシチンの量が同じ場合でも当てはまる。
ケーキにおけるアエロモナス サルモニシダトランスフェラーゼの効果
アエロモナス サルモニシダ由来のＧＣＡＴアシルトランスフェラーゼの効果をケーキのレシピにおいて試験する。この酵素を単独で、また、他の脂肪分解酵素と組み合わせて試験する。この酵素を、ケーキを混合する前に、ケーキ成分の一部に添加し、又は他のケーキ成分と一緒に添加する。
予備的な結果によれば、トリグリセリド加水分解酵素と組み合わせたアシルトランスフェラーゼは、ケーキ体積及びパンの身構造を対照よりも改善する。
以下の実験においては、Ａ．サルモニシダ由来のトランスフェラーゼ及び変異体は、単独で、また、トリグリセリド加水分解酵素と組み合わせて試験される。これらの酵素は、ケーキのレシピの一部を形成する、卵中の脂質成分及びショートニングに対して活性であり、並びに（卵中の）炭水化物、タンパク質、グリセリン及びコレステロールに対して活性である。
材料及び方法
酵素
＃１７９、アエロモナス サルモニシダ由来のアシルトランスフェラーゼ
Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ ＥＸＥＬ １６、サーモマイセス ラヌギニサス（Thermomyces lanuginisus）由来のリパーゼ
Figure 2006521787
装置：
ミキサー：Ｈｏｂａｒｔ Ｎ５０とスパチュラ
オーブン：Ｓｉｍｏｎケーキオーブン
手順：
すべての成分を室温に調節しなければならない。
１．糖とショートニングを３分間かき回してクリーム状にする（第２の速度で開始し、３０秒以内に第３の速度にする）
２．残りの成分を添加する（第１の速度で開始し、３０秒以内に第２の速度にする）。合計５分間混合する
３．バターの体積を１ｄｌカップで測定する
４．パウンドケーキ鍋に「Ｂａｂｅｔｔｅ」オイルスプレッドを噴霧し、紙で覆う
５．２ｘ３５０ｇをパウンドケーキ鍋に計量する
６．その塊をスパチュラで広げる
７．オーブンに入れる前に、一すじの油をケーキ表面に添加する（ケーキを中央で切るために中央の長さ方向）
８．１８０℃で５０分間焼く
９．焼いた後、鍋をオーブンから取り出し、それをテーブルの上に「落とし」、鍋からケーキを取り出す
１０．紙をケーキから取り除き、右側を上にする
１１．ケーキを格子の上で６０分間冷却し、計量し、体積を測定する
備考：
使用する酵素は、混合の最初に添加され、又は他のケーキ成分に添加される前にケーキ成分の一部に添加される。
酵素は、ケーキ成分の混合又は反応中にのみ活性であり、ケーキを焼いている間に不活性化される。
結果。
以下の実験を以下の表に示すように実施する。
Figure 2006521787
卵、グルコースシロップ及び酵素を３７℃で３０分間反応させ、その直後に卵を使用して上記レシピに従ってケーキを作る。
予備的な結果によれば、アシルトランスフェラーゼとサーモマイセス ラヌギノサス由来のトリグリセリド加水分解リパーゼの組み合わせによって、ケーキ体積が改善され、パンの身構造、食感品質及び外観が水対照よりも改善される。予備的な結果によれば、ケーキにおいては、脂質アシルトランスフェラーゼとリパーゼを併用することが好ましいことがある。
これらの実験の目的は、大腸菌中で発現されるＡ．ヒドロフィラ由来のトランスフェラーゼを試験することであった
Ａ．ヒドロフィラ＃１３５（０．５ＮＥＦＡ−ＰＬＵ／ｍｌ）のトランスフェラーゼ反応を卵黄中で試験した。実験の設定を表６に示す。
Figure 2006521787
卵黄を３７℃に加熱し、酵素を添加した。反応時間後、ＣＨＣｌ３：メタノール２：１ ７ｍｌを添加し、Ｗｈｉｒｌｅｙ上で３０秒間混合した。
試料を８００ｘｇで１０分間遠心分離し、下層の溶媒相を単離した。この試料２μｌをＴＬＣシリカプレートにかけ、溶出溶媒IV中で溶出させた。ＴＬＣ分析の結果を図５０及び５１に示す。
本実施例に述べる方法及び材料は、上記実施例において詳述したものである。
この実験の試料もＧＬＣによってＴＭＳ誘導体として分析された。ＧＬＣ分析の結果を表７に示す。
Figure 2006521787
遊離脂肪酸、コレステロール及びコレステロールエステルのＧＬＣ分析から、各成分のモル濃度を計算することができ、表７に示すように％トランスフェラーゼ活性を計算することができる。
％トランスフェラーゼ活性の計算
これらの結果から、遊離脂肪酸、ステロールエステルの増加量が計算される。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（酵素)−％脂肪酸（対照)
Δ％ステロールエステル＝％ステロール／スタノールエステル（酵素)−％ステロール／スタノールエステル（対照)
トランスフェラーゼ活性は、全酵素活性の％として計算される。
Figure 2006521787
Figure 2006521787
ＴＬＣ分析とＧＬＣ分析の両方によって、初期には、Ａ．ヒドロフィラ＃１３５のトランスフェラーゼ反応が支配的な反応であることが確認される。反応時間１５０分後に、いくらかの加水分解活性が生じる。１５６０分後に、トランスフェラーゼ反応と加水分解性反応は、ほとんど同じレベルに達する。これらの結果は、受容体分子のコレステロールが利用可能である限り、トランスフェラーゼ反応が支配的な反応であることも示している。コレステロール濃度が減少すると、加水分解活性はより優勢になる。
卵黄を基質として使用してトランスフェラーゼ活性を測定するアッセイ−以後、「卵黄アッセイ」と称する
脂質アシルトランスフェラーゼをアエロモナス サルモニシダから単離し、バチルス サチリス中で発現させた。この研究の目的は、酵素のトランスフェラーゼ活性と加水分解活性の両方を測定することができる分析方法を開発することであり、これらの分析から、レシチン及びコレステロールを含む基質を用いて酵素のトランスフェラーゼ活性と加水分解活性の両方を定義することができる。
この研究においては、卵黄を酵素アッセイ用基質として用いた。というのは、卵黄は、レシチンとコレステロールの両方を含み、トランスフェラーゼとホスホリパーゼがこの基質において極めて良好に働くからである。
卵黄を使用することによる欠点は、この基質が水、脂質及びタンパク質の複雑な混合物であるということである。脂質成分は、グリセリド６６．２％と、リン脂質２９．６％と、コレステロール４．２％とを含む。リン脂質は、レシチン７３％と、ケファリン１５％と、他のリン脂質１２％とからなる。脂肪酸のうち、３３％は飽和であり、６７％は、オレイン酸４２％及びリノール酸７％を含めた不飽和である（Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Inc.参照）。
卵黄組成にはいくらかのばらつきが予想される。しかし、文献（Biochimica et Biophysica Acta, 1124 (1992) 205-222）では、「家畜の雌鶏の成熟卵黄は、食餌及び環境条件が極めて変化に富んでいるにもかかわらず、脂質及びリポタンパク質組成が著しく一定である」と述べられ、さらに、「その結果、卵黄は、組成がほぼ一定な食料製品を提供し続け、パン・菓子製造業、化粧品産業及び医薬品産業において信頼して利用できる化学的及び物理化学的諸特性を維持するのに役立っている」と述べられている。
この参考文献によれば、卵黄組成は極めて一定であり、したがって、雌鶏の卵黄を卵黄アッセイの基質として使用することに決めた。
卵黄の酵素処理から得られる脂質反応生成物の定量は、脂質を基質から抽出し、その後、脂質成分をＧＬＣ分析することによって行われた。
手順
材料。
卵黄：Ｄａｎａｅｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａ／Ｓ、ＤＫ−４０００ Ｒｏｓｋｉｌｄｅの低温殺菌液状卵黄。
ＨＥＰＥＳ緩衝剤Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ ３３７５
クロロホルム、分析グレード
酵素。
Ａ．サルモニシダ由来の精製脂質アシルトランスフェラーゼ＃１７８−９
サーモマイセス ラヌギノサスリパーゼ。ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ ＥＸＥＬ １６、製品番号１４７０６０（対照）
卵黄基質を用いた酵素アッセイ
液状卵黄５グラムを２０ｍｌ Ｗｈｅａｔｏｎガラスに計量し、３５℃に加熱した。
酵素溶液０．２５ｍｌを添加し、ストップウォッチをスタートさせる。
規則的な間隔で試料０．５ｇを１０ｍｌ Ｄｒａｍガラスに移した。
酵素反応を停止させ、脂肪酸石けんを酸性化するために、４Ｍ ＨＣｌ ２０μｌを添加した。
クロロホルム３ｍｌを添加した。試料をＷｈｉｒｌｅｙミキサーで３０秒間混合した。
試料を３０００ｇで１０分間遠心分離し、クロロホルム相０．８ｍｌを、タールで覆われたＤｒａｍガラスに移した。クロロホルムを窒素蒸気下、６０℃で蒸発させた。ｄｒａｍガラスを再度計量した。
単離された脂質をＧＬＣ及びＴＬＣによって分析した。
ＴＬＣ分析−本明細書に記載するとおりである。
ＧＬＣ分析−本明細書に記載するとおりである。
結果
基質として卵黄を用いた卵黄アッセイでは、表９に示す実験を実施した。
Figure 2006521787
試料０．５ｇを１５、３０、６０ １２０及び１０８０分後に取り出し、溶媒抽出によって脂質を単離した。脂質を、それぞれ溶媒Ｉ及びIVを用いたＴＬＣによって分析した。ＴＬＣプレートの写真を図５２に示す。
ＴＬＣ分析によって、Ａ．サルモニシダ由来のトランスフェラーゼ＃１７８−９（試料３）の活性が明確に示された。これは、リン脂質ＰＣ及びＰＥが減少することから知ることができる。これらの結果は、リゾレシチンＬＰＣ量が予想したほど多くはないことも示している。これは、リゾレシチンに対する加水分解活性を示している可能性がある。或いは、リゾレシチンは極性が極めて高く、したがって、水相中に一部分配され得るので、抽出が不十分になって生じた可能性もある。
遊離脂肪酸、コレステロール及びコレステロールエステルを定量するために、溶媒抽出によって単離された脂質もＧＬＣによって分析した。ＧＬＣの結果を表１０に示す。
Figure 2006521787
Figure 2006521787
これらの結果から、試料３において、ほとんどすべてのコレステロールが６０分後にエステル化されることが認められた。最初の３０分間は、反応に対して過剰の基質が存在すると結論された。したがって、１５及び３０分後に取り出された試料からの結果を使用して酵素活性を計算した。
表１０の情報、及び卵黄が２７％の脂質を含むという事実に基づいて、酵素１ｍｌ当たり生成される脂肪酸及びコレステロールエステルのマイクロモル量を計算した。結果を表１１に示す。
表１１の結果は、試料番号３（Ａ．サルモニシダ、１５ｍｉｎ）における脂肪酸の結果の以下の計算によって得られた。
卵黄５ｇ中の脂質＝５＊０．２７＝１．３５グラム
脂質１．３５グラムは脂肪酸１．００７％を含む＝１．３５＊１．００７／１００＝０．０１３５９グラム
脂肪酸の平均分子量は２７２である。
０．０１３５９グラム＝０．０１３５９＊１００００００／２７２μｍｏｌ＝４９．９７９８μｍｏｌ
酵素０．２５ｍｌを添加する
脂肪酸μｍｏｌ／酵素ｍｌ＝４９．９７９８／０．２５＝１９９．９
Figure 2006521787
表１１の結果から、対照に対して、酵素によって引き起こされる脂肪酸及びコレステロールエステルの量の変化を、表１２に示すように計算することができる。
Figure 2006521787
時間の関数として生成される脂肪酸又はコレステロールエステルの量を図５３に示す。
曲線の傾斜から、加水分解活性（ＦＦＡ形成）及び脂質アシルトランスフェラーゼ活性（コレステロールエステル形成）を時間の関数として計算した。次いで、相対トランスフェラーゼ活性（％アシルトランスフェラーゼ活性）及び相対加水分解活性を表１３に示すように計算した。相対トランスフェラーゼ活性は、本明細書に記載する％アシルトランスフェラーゼ活性を求めるプロトコルを用いて求められた。例えば、＃１７８−９の相対活性の計算：全活性はＦＦＡ活性＋トランスフェラーゼ活性＝９．０２３＋７．２８８４＝１６．３１１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌである。相対トランスフェラーゼ活性＝７．２８８４＊１００／１６．３１１＝４４．７、相対加水分解活性＝９．０２３＊１００／１６．３１１＝５５．３
Figure 2006521787
表１３の結果によって、Ａ．サルモニシダ由来のトランスフェラーゼがかなりのトランスフェラーゼ活性を有することが確認された。しかし、この結果によって、この酵素がかなりの加水分解活性を有することも確認された。
Ｔ．ラヌギノサス由来のリパーゼは主に加水分解活性を有し、相対トランスフェラーゼ活性１．６は何らトランスフェラーゼ活性の証拠とはならず、分析の不確実性によって説明された。
結論
アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ、並びにサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼのトランスフェラーゼ及び加水分解酵素活性を測定するための基質として卵黄を使用した。アッセイ条件下では、初期には、脂質アシルトランスフェラーゼのコレステレロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｅｒｏｌ）エステル及び遊離脂肪酸の形成と時間の間に線形関係があった。この線形関係に基づいて、加水分解活性（ＦＦＡ形成）及びトランスフェラーゼ活性（コレステロールエステル形成）を計算することができた。相対加水分解活性及びトランスフェラーゼ活性も計算された。アエロモナスサルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ（この場合、ＧＣＡＴ）は、これらのアッセイ条件下では、加水分解活性とトランスフェラーゼ活性がほぼ等しかった。
サーモマイセス ラヌギノサス由来のリパーゼは、加水分解活性が極めて低く、トランスフェラーゼ活性は大きくなかった。
高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ
序論
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをアエロモナス サルモニシダから単離し、バチルス サチリス中で発現させた。初期実験によれば、この酵素は、基質として卵黄を使用して、レシチンからコレステロールに脂肪酸を転移させるのに極めて効率的である。
以下の実験においては、基質として卵黄を使用し、基質中の水分濃度に特に焦点を合わせて、トランスフェラーゼ反応をさらに詳細に検討した。
手順
材料。
卵黄：Ｄａｎａｅｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａ／Ｓ、ＤＫ−４０００ Ｒｏｓｋｉｌｄｅの低温殺菌液状卵黄。
ＨＥＰＥＳ緩衝剤Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ ３３７５
クロロホルム、分析グレード
スクアラン、分析グレード
酵素。
＃１７８−９ Ａ．サルモニシダ由来の本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ
＃２４２７ フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）由来のホスホリパーゼＡ１。Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、ＤＫ製ＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ（比較用脂肪分解酵素)
＃１９９１ すい臓からのホスホリパーゼＡ２、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ、ＵＫ製ＬＩＰＯＭＯＤ ２２Ｌ（比較用脂肪分解酵素）
卵黄基質を用いた酵素アッセイ
液状卵黄基質５グラムを２０ｍｌ Ｗｈｅａｔｏｎガラスに計量し、３５℃に加熱した。
水と酵素溶液を添加し、ストップウォッチをスタートさせる。
規則的な間隔で試料０．５ｇを１０ｍｌ Ｄｒａｍガラスに移した。
酵素反応を停止させ、脂肪酸石けんを酸性化するために、４Ｍ ＨＣｌ ２０μｌを添加した。
クロロホルム３ｍｌを添加した。試料をＷｈｉｒｌｅｙミキサーで３０秒間混合した。
試料を３０００ｇで１０分間遠心分離し、クロロホルム相０．８ｍｌを、タールで覆われたＤｒａｍガラスに移した。クロロホルムを窒素蒸気下、６０℃で蒸発させた。ｄｒａｍガラスを再度計量する。
単離された脂質をＧＬＣによって分析する。
ＧＬＣ分析
ＷＣＯＴ溶融シリカカラム１２．５ｍ ｘ ０．２５ｍｍＩＤ ｘ ０．１μフィルム厚５％フェニル−メチル−シリコーン（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ製ＣＰ Ｓｉｌ ８ ＣＢ）を備えたパーキンエルマーＡｕｔｏｓｙｓｔｅｍ ９０００キャピラリーガスクロマトグラフ。
キャリアガス：ヘリウム。
インジェクター：ＰＳＳＩコールドスプリット注入（初期温度５０℃ ３８５℃に昇温）、体積１．０μｌ
検出器 ＦＩＤ：３９５℃
乾燥器プログラム： １ ２ ３
乾燥器温度、℃ ９０ ２８０ ３５０
等温、時間、ｍｉｎ １ ０ １０
昇温速度、℃/ｍｉｎ １５ ４
試料調製：試料３０ｍｇを、内部標準ヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含むヘプタン：ピリジン２：１ ９ｍｌに溶解した。試料溶液３００μｌをクリンプバイアルに移し、ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセアミド（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅａｍｉｄ））３００μｌを添加し、６０℃で２０分間反応させた。
計算：モノ−ジ−トリグリセリド及び遊離脂肪酸の応答係数を標準２（モノ−ジ−トリグリセリド）から求めた。コレステロール、パルミチン酸コレステリル及びステアリン酸コレステリルの場合には、純粋な基準材料から応答係数を求めた（純粋材料１０ｍｇを計量）。
結果
スクアラン２％を含む卵黄を反応用基質として用いた。卵黄中の脂質成分を定量するために、ＧＬＣ分析用内部標準としてスクアランを添加した。
実験を表１４に示すように組み立てた。
Figure 2006521787
試料を３０、６０及び１２０分後に取り出し、上記方法に従って分析した（試料０．５ｍｌ（実験１〜４）０．８６ｍｌ（実験５〜６）及び２．２ｍｌ（実験７〜８）を採取した）。
ＧＬＣ分析の結果を表１５に示す。ＧＬＣ結果を基質（卵黄）の百分率で表した。表は、反応時間、及び反応混合物中の総水量も示す。
Figure 2006521787
脂肪酸、コレステロール及びコレステロールエステルの分析に基づいて、反応時間の関数として遊離脂肪酸及び生成コレステロールエステルの量、並びに含水量を計算することができた。次いで、これらの結果に基づいて、脂肪酸形成とコレステロールエステル形成の合計として全酵素活性を計算することができた。次いで、相対加水分解活性及び相対トランスフェラーゼ活性（すなわち、％アシルトランスフェラーゼ活性）を計算した。結果を表１６に示した。
表１６の結果は、Ｓｔａｔｇｒａｐｈｉｃ Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒ ＡＮＯＶＡを用いて統計的にも分析された。図５４の統計結果によれば、ホスホリパーゼＡ１、＃２４２７及びホスホリパーゼＡ２、＃１９９１はトランスフェラーゼ活性を持たないのに対して、トランスフェラーゼ＃１７８−９はこれらのアッセイ条件下でほぼ５０％のトランスフェラーゼ活性を示したことが確認される。
アッセイにおけるトランスフェラーゼ＃１７８のトランスフェラーゼ活性に対する含水量の効果も図５５に示すように統計的に分析された。これらの結果は、このアッセイにおいて、水分５４〜８９％の範囲で、相対トランスフェラーゼ活性に対する含水量の大きな効果はなかったことを示している。
トランスフェラーゼ＃１７８の場合のトランスフェラーゼ活性に対する反応時間の影響を評価した。結果を表１６及び図５６に示す。図５６の結果は、相対トランスフェラーゼ活性が反応時間とともに減少することを示している。これは、受容体分子コレステロールの大部分が消費され、したがって、相対加水分解活性が増加することによって説明し得る。＃２４２７の場合のトランスフェラーゼ反応に対する負の値は、この分析方法のばらつきの範囲内でトランスフェラーゼ活性がないことを示しているにすぎない。
Figure 2006521787
結論。
アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼを、基質として異なるレベルの含水量の卵黄において試験した。この酵素を対照脂肪分解酵素、すなわち、フザリウムオキシスポラム由来のホスホリパーゼＡ１、及びすい臓から得られたホスホリパーゼＡ２と比較した。
その結果によれば、トランスフェラーゼのみがコレステロールエステルの形成中にレシチンとコレステロールのトランスフェラーゼ反応を触媒することが証明された。その結果によれば、基質中の水分が５４％〜８９％の範囲において、相対トランスフェラーゼ活性がアエロモナスサルモニシダ由来のトランスフェラーゼの場合とほぼ同じであることが判明した。
（例えば、レシチン及びコレステロールを用いた食料品に使用する)アシルトランスフェラーゼ活性を測定するための「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」
脂質アシルトランスフェラーゼをアエロモナス サルモニシダから単離し、バチルス サチリス中で発現させた。この酵素は、コレステロールエステルの形成中にレシチンからコレステロールに脂肪酸を転移させるのに極めて効率的である。この酵素は、遊離脂肪酸の形成によって認められるいくらかの加水分解活性を有することも判明した。在来のホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．４及びＥＣ３．１．１．３２）は、遊離脂肪酸及びリゾレシチンの形成中にレシチンを加水分解する能力を有し、これらの酵素ではトランスフェラーゼ反応は報告されていない。
本発明者らは、本明細書において、酵素のトランスフェラーゼ活性と加水分解活性の両方を測定し、したがって本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを特定することができるアッセイを詳述する。このアッセイは、レシチン及びコレステロールを含む基質を使用する。この研究においては、緩衝剤中に散在するホスファチジルコリン及びコレステロールを主体とする基質を使用した。反応生成物の定量は、基質から脂質を抽出し、その後その脂質成分をＧＬＣ分析することによって行われた。
手順
材料
Ｌ−α−ホスファチジルコリン９５％（植物）Ａｖａｎｔｉ ｎｏ．４４１６０１
コレステロール：Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｃ ８５０３
パルミチン酸コレステリル、Ｓｉｇｍａ Ｃ ６０７２
ステアリン酸コレステリル、Ｓｉｇｍａ Ｃ ３５４９
ＨＥＰＥＳ緩衝剤 Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ ３３７５
クロロホルム、分析グレード
酵素
Ａ．サルモニシダ由来の精製ＧＣＡＴ＃１７８−９
ＴＬＣ分析を実施例６に記載したように実施した。
ＧＬＣ分析を実施例１１に記載したように実施した。
結果：ホスファチジルコリン及びコレステロールを基質としたトランスフェラーゼアッセイ
以下において、ホスファチジルコリン及びコレステロールを主体とする基質において、以下の手順に従ってトランスフェラーゼのトランスフェラーゼ活性を試験した。
ホスファチジルコリン（＞９５％ＰＣ Ａｖａｎｔｉ製品番号４４１６０１）４５０ｍｇ及びコレステロール５０ｍｇをクロロホルムに溶解し、減圧下で蒸発乾固させた。コレステロール／ホスファチジルコリン混合物３００ｍｇをＷｈｅａｔｏｎガラスに移し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７ １５ｍｌを添加した。撹拌しながら脂質を緩衝剤に分散させた。
マグネチックスターラで混合しながら基質を３５℃に加熱し、酵素溶液０．２５ｍｌを添加した。これは、水分約９５％の極めて高い水分環境である。
試料２ｍｌを反応時間０、５、１０、１５、２５、４０及び６０分後に取り出した。すぐに４Ｍ ＨＣｌ ２５μｌを添加して、遊離脂肪酸を酸性化し、酵素反応を停止させた。クロロホルム３．００ｍｌを添加し、Ｗｈｉｒｌｅｙ上で試料を３０秒間激しく振とうさせた。試料を遠心分離し、クロロホルム相２ｍｌを単離し、０．４５μｍフィルターを通して、風袋を量った１０ｍｌ Ｄｒａｍガラスにろ過した。クロロホルムを窒素気流下で６０℃で蒸発させ、試料を再度計量した。抽出された脂質をＧＬＣによって分析した。
ＧＬＣ分析の結果を表１７に示す。結果は、抽出された脂質に対して計算された％で表されている。時間の関数として形成される脂肪酸及びコレステロールエステルの量を図５７に示す。図５７から、酵素反応は、初期に高い加水分解活性とトランスフェラーゼ活性の両方が認められるので、時間の関数として線形ではないと結論付けることができる。約１０分後、且つ約６０分まで、反応は、時間の関数として、脂肪酸及びコレステロールエステル形成のほぼ線形応答を示す。したがって、この時間間隔において酵素反応を考察することにした。
Figure 2006521787
反応混合物中の脂質量、及び添加酵素量についての情報から、μｍｏｌ／ｍｌ酵素で表される脂肪酸及びコレステロールエステルの形成を計算することができた（表１８及び図５８）。
Figure 2006521787
表１８の結果、及び図５８の曲線の傾斜から、μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ酵素で表される脂肪酸及びコレステロールエステルの量を時間の関数として計算することができた。
加水分解活性及びトランスフェラーゼ活性の計算を表１９に示す。相対トランスフェラーゼ活性は、本明細書に記載する％アシルトランスフェラーゼ活性を求めるプロトコルを用いて求められた。
Figure 2006521787
トランスフェラーゼ活性による他の酵素のスクリーニング
上記方法を使用して、様々な脂肪分解酵素をトランスフェラーゼ活性及び加水分解活性についてスクリーニングした。表２０に示すように酵素を試験した。
Figure 2006521787
ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７．０ ５０ｍＭ中に散在するホスファチジルコリン／コレステロール３００ｍｇを含む基質を撹拌しながら３５℃に加熱した。酵素溶液を添加し、試料を撹拌しながら３５℃に維持した。試料を規則的な間隔で取り出し、クロロホルムで抽出した。単離した脂質をＧＬＣによって分析した。結果を表２１に示す。
Figure 2006521787
Figure 2006521787
ＧＬＣ分析から、脂質アシルトランスフェラーゼ（１７８−９）のみがかなりの量のコレステロールエステル及び脂肪酸を生成したことが観測された。フザリウムオキシスポラム由来のホスホリパーゼでも遊離脂肪酸が着実に増加したが、初期に少量のコレステロールエステルのみが形成され、経時的なコレステロールエステルの増加は認められなかった。
脂質基質量及びＧＬＣ分析についての情報に基づいて、反応時間１０〜６０分の結果から相対トランスフェラーゼ活性及び相対加水分解活性を計算することができた。トランスフェラーゼ１７８−９及びフザリウムオキシスポラムリパーゼの結果を表２１に示す。試験したその他の酵素は活性を示さなかった。
Figure 2006521787
表２１−ａに示した結果によれば、脂質アシルトランスフェラーゼ（試料１７８−９）由来のかなりのトランスフェラーゼ活性が確認される。相対トランスフェラーゼ活性が表１９に示した実験に良く一致していることも認められる。
しかし、フザリウム オキシスポラムホスホリパーゼ由来のトランスフェラーゼ活性は極めて低かった。このトランスフェラーゼレベルは、あまりにも低く、分析の不確実性の範囲内である。予想したとおり、フザリウムオキシスポラムホスホリパーゼは、かなりの加水分解活性を有する。
結論。
（実施例１１に示した）卵黄の代わりに、精製ホスファチジルコリン及びコレステロールを主体とする人工基質を基質として使用して、アエロモナスサルモニシダ由来のトランスフェラーゼの活性を測定した。反応時間１０分〜６０分において、アッセイは、時間の関数として遊離脂肪酸及びコレステロールエステルをほぼ線形で形成した。反応時間１０〜６０分の活性に基づいて、加水分解活性及びトランスフェラーゼ活性を計算した。
このアッセイにおける基質濃度は、卵黄におけるよりも比較的低く、アッセイにおける水量は比較的高かった。
緩衝剤中のホスファチジルコリン／コレステロールの人工基質における、アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ（この場合はＧＣＡＴ）のアッセイ結果に基づいて、この酵素が極めて高含水量の系においても極めて良好なトランスフェラーゼ活性を有すると結論される。
卵黄（実施例１１参照）、及び緩衝剤中のホスファチジルコリン／コレステロール（実施例１２）に基づく両方のアッセイを使用して、酵素のトランスフェラーゼ活性及び加水分解活性を測定することができる。加水分解活性及びトランスフェラーゼ活性は時間の関数として線形であるが、緩衝剤中のホスファチジルコリン／コレステロールはある制限時間内でのみ線形である点で卵黄が好ましい。
食品エマルジョン
酵素改変液状卵黄の効果を、油６０％を含む標準食品エマルジョンレシピにおいて試験した。
標準方法及び材料は、上記実施例に詳述したとおりである。
アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ（＃１３８）又はホスホリパーゼ、すなわち、市販酵素ＬｉｐｏｐａｎＦ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）（＃２９３８）を用いて表２２に示すように卵黄を処理した。
Figure 2006521787
酵素処理卵黄（表９）から得られる卵黄脂質のＴＬＣ分析を図５９及び６０に示す。
この実験においては、＃２９３８の用量を１０倍に増やした。これによって、卵黄に対する活性が極めて明確になった。遊離脂肪酸の量はかなり増加し、レシチン（ＰＣ）はリゾレシチン（ＬＰＣ）に加水分解された。遊離コレステロールはコレステロールエステルに転化され、レシチンの一部はリゾレシチンに転化されたので、トランスフェラーゼ＃１３８は明確なトランスフェラーゼ反応を示した。
酵素改変の別の興味深い態様は、生成物の粘稠性であった。ホスホリパーゼ＃２９３８で処理した試料は、極めて固くなったのに対して、脂質アシルトランスフェラーゼ＃１３８で処理した試料は対照試料と同じ液体粘稠性を維持した（図６１参照）。
これらの改質卵黄を表２３に示す食品エマルジョンレシピにおいて試験した。
Figure 2006521787
改質卵黄１及び２は、脂質アシルトランスフェラーゼで処理された。改質卵黄３は市販ホスホリパーゼで処理された。
食品エマルジョンは、以下の手順に従って、水中油型エマルジョンとして製造された。卵黄及び水をビーカーに計量した。油を別個に計量した。
Ｔｕｒｒａｘミキサー（２００００ｒｐｍ）を水相に浸漬した。油を水相に一定速度で２分間ポンプ供給した。混合をさらに１分間続けた。次いで、酢を添加し、５秒間混合した。
エマルジョンの安定性を温蔵庫中で１００℃で試験した。１００℃で２時間後に、エマルジョンを評価した（図６２参照）。
この実験における未処理卵黄のエマルジョン安定性は全く良好であった。しかし、脂質アシルトランスフェラーゼ＃１３８で卵黄を処理すると、水分離量が減少するため安定性が向上した。ホスホリパーゼ＃２９３８で処理した卵黄は、極めて不安定なエマルジョンを与え、１００℃では油相と水相がほぼ完全に分離した。
一部の用途においては、本発明の組成物及び方法を使用すると、水中油型サラダドレッシングなどのエマルジョンの熱安定性を向上させることができると考えられる。これは、長い品質保持期間を保証するように低温殺菌される、且つ／又は配膳前に加熱される食品エマルジョンにおいて、例えば配膳前に再加熱するようにあらかじめ調理された食事（例えば、電子レンジ食品）において、特に重要である。特定の理論に拘泥するつもりはないが、遊離脂肪酸の蓄積が、このようなエマルジョンの熱安定性に有害になり得る用途もあると考えられる。本発明の方法によって製造される食品エマルジョンの熱安定性の向上は、すべての食品用途において見られるわけではなく、又は望ましくすらないことを認識すべきである。このような諸特性が望ましい適用分野においては、エマルジョンの安定性は、例えば、低温殺菌及び又はマイクロ波再加熱と同等な簡単な加熱試験によって容易に測定することができることは当業者には明らかである。本発明者らは、好ましい実施形態においては、本発明の酵素を用いて得られる食品エマルジョンは熱安定性が向上することを発見した。
植物ステロールに富む卵黄におけるトランスフェラーゼ反応：
アエロモナス サルモニシダ由来のトランスフェラーゼは、植物ステロール及びグリセリンが豊富な卵黄において、触媒作用によりリゾレシチン、モノグリセリド及び植物ステロールエステルを形成することができた。同じ酵素を、パーム油、レシチン、植物ステロール及びグリセリンを含む低水分系においても試験した。ＴＬＣ分析及びＧＬＣ分析によって、モノグリセリド及び植物ステロールエステルがこれらの反応条件下で生成されることが判明した。
序論：
アエロモナス サルモニシダ由来のトランスフェラーゼのトランスフェラーゼ活性を、レシチン、脂肪、植物ステロール及びグリセリンの水分がほとんどない系において試験した。
材料：
卵黄：Ｄａｎａｅｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａ／Ｓ、ＤＫ−４０００ Ｒｏｓｋｉｌｄｅの低温殺菌液状卵黄。
ＧＣＡＴトランスフェラーゼ精製１７８−９、３２ＰＬＵ−７／ｍｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ ２２５４−１００）
大豆レシチン。Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｔｅｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｙｏｌｋｉｎ
Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｔｅｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ製パーム油４３。
Ｌ−αホスファチジルコリン９５％植物（Ａｖａｎｔｉ ＃４４１６０１）
シトステロール、Ｓｉｇｍａ ｎｏ Ｓ５７５３
植物ステロール：Ｃｏｇｎｉｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ製Ｇｅｎｅｒｏｌ Ｎ１２２
グリセリン製品番号０８５９１５
結果
表２４に示すように卵黄において植物ステロール及びグリセリンについてのトランスフェラーゼ活性の初期スクリーニングを実施した。
Figure 2006521787
これらの成分を混合し、３７℃に加熱し、マグネチックスターラで撹拌しながらこの温度に維持した。
試料０．１グラムを３及び２３時間後に取り出し、ＴＬＣによって分析した。
ＴＬＣ分析の結果を図６３に示す。
図６３の結果は、試料３においてほぼすべての遊離ステロール及びコレステロールが対応するエステルに転化されたので、リゾレシチンの形成と同時にコレステロールと植物ステロールの両方がトランスフェラーゼ反応によってエステル化されたことを示している（試料３及び４）。
これらの結果は、グリセリンと卵黄のみを含む試料がモノグリセリドを生成したことも示している。モノグリセリドの量は、ＧＬＣ分析によって確認する必要がある。ステロールをグリセリンとともに添加したときには（試料３）、モノグリセリドの量は極めて低く、ＴＬＣによって検出不可能であった。これは、過剰のステロール又はコレステロールがある限り、グリセリンを用いたトランスフェラーゼ反応が大きくなかったことを示している。
別の実験においては、反応混合物における酵素の触媒活性を試験するために、トランスフェラーゼ１７８−９を混合物ダイズレシチン、グリセリン及び植物ステロールに添加した。
これらの実験における反応混合物の組成を表２５に示す。
Figure 2006521787
４６℃で撹拌しながら脂質成分を混合することによって実験を実施した。酵素を添加し、４及び２４時間後に試料を取り出した。
図６４に示すように試料をＴＬＣによって分析した。
反応時間２４時間後の実験２、４及び５の試料もＧＬＣによって分析した。結果を表２６に示す。
Figure 2006521787
その結果、トランスフェラーゼ１７８−９は、触媒作用によって、ダイズレシチン、グリセリン及び植物ステロールを含む反応混合物から植物ステロールエステル及びモノグリセリドを形成できることが確認された。このような反応混合物は、モノグリセリドがその乳化特性のために必要とされ、植物ステロールエステルがそのコレステロール低下効果のために必要とされるマーガリン製造に使用するのに興味深いものであり得る。
結論。
アエロモナス サルモニシダ由来のＣＧＡＴトランスフェラーゼは、植物ステロール及びグリセリンが添加された卵黄において、植物ステロールエステル及びモノグリセリドの形成を触媒することができた。このＣＧＡＴトランスフェラーゼは、パーム油、レシチン、植物ステロール及びグリセリンの混合物における植物ステロールエステル及びモノグリセリドの形成も触媒した。したがって、この酵素は、モノグリセリド及びリゾレシチンが乳化を改善するために必要とされ、植物ステロールエステルがそのコレステロール低下効果のために必要とされるマーガリン、及び他の油を含む食料製品に使用するのに興味深い。
アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼの固定化、及びステロールエステルの合成における使用
Ａ．サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ（この場合はＧＣＡＴ）をアセトン沈殿によってセライト上に固定した。２０ｍＭ ＴＥＡ緩衝剤ｐＨ７中の酵素溶液１０ｍｌをセライト５３５ ５３５（Ｆｌｕｋａ製）０．１グラムとともに室温で２時間ゆっくり撹拌した。
連続撹拌しながら冷アセトン５０ｍｌを添加した。
５０００ｇで１分間遠心分離することによって沈殿物を単離した。
沈殿物を冷アセトン２０ｍｌで２回洗浄した。
セライトを周囲温度で約１時間試みた。
この固定化トランスフェラーゼを、ホスファチジルコリン１３％及び植物ステロール７％を含む油混合物において試験した。（表２７）
Figure 2006521787
レシチン、植物ステロール及び大豆油を４６℃に加熱し、植物ステロールを溶解した。固定化トランスフェラーゼを添加した。
マグネチックスターラで軽く撹拌しながら４６℃でトランスフェラーゼ反応を続けた。試料を１／２、１ ３ ６及び２４時間後に分析のために取り出し、ＴＬＣによって分析した。反応時間２４時間後に反応を停止し、固定化酵素をろ過した。
図６５に示すように試料をＴＬＣによって分析した。
ＴＬＣ分析は、コレステロールからコレステロールエステルへの転換におけるＡ．サルモニシダ由来の固定化トランスフェラーゼの効果を明確に示している。少量のモノグリセリドが形成されることも認められた。この酵素は、高含水量（６〜８９％）水環境の環境において高い活性を有することも判明した。したがって、本発明に使用されるこのトランスフェラーゼ、及び他のトランスフェラーゼは、かなりの含水量の固定化酵素用途において使用することもできる。これによって、トランスフェラーゼを用いた脂質の生物変換において、現行の固定化リパーゼによって使用される溶媒の交換が可能になる。
アエロモナス ヒドロフィラトランスフェラーゼは、リン脂質からステロールに転移してステロールエステルを形成し、且つ／又は糖分子に転移して糖エステルを形成することができる
＃１３９と標識された、大腸菌（Ｈｙｄｒｏ ０３０３ ＨＶＰ）中で発現されるアエロモナスヒドロフィラ由来の脂質アシルトランスフェラーゼをＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＨＲ ２．５／１０カラムで精製して、ホスホリパーゼ活性を分析した。卵黄における酵素活性及び機能について、卵黄におけるトランスフェラーゼ活性を評価した。この酵素は、グルコースを含む卵黄においても試験された。
ホスホリパーゼ活性。
Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＨＲ ２．５／１０カラムから単離されたトランスフェラーゼ＃１３９をＮＥＦＡ−ＰＬＵ（ｐＨ７）によって評価した。活性は１．１５単位ＮＥＦＡ−ＰＬＵ／ｍｌであった。
卵黄
初期応用試験において、以下の手順に従って卵黄においてトランスフェラーゼ＃１３９を試験した。
新鮮な卵黄１グラムを、ねじ込み蓋の付いた１０ｍｌフラスコに計量した。酵素調製物を添加し、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合した。試料を３７℃に置き、マグネチックスターラで撹拌した。
クロロホルム：メタノール（２：１）７．５ｍｌを添加して反応を停止し、Ｗｈｉｒｌｅｙミキサー上で３０秒間混合した。クロロホルム相を遠心分離によって単離し、クロロホルム相２μｌをあらかじめ活性化させたシリカＴＬＣプレートに移し、泳動バッファーｎｒ．Ｉで溶出させ、別のＴＬＣ−プレートを泳動バッファーIVで溶出させた。
実験の設定を表２８に示す。
Figure 2006521787
ＴＬＣ分析結果を図６６及び図６７に示す。ＴＬＣ分析結果は、トランスフェラーゼ＃１３９のトランスフェラーゼ反応を明確に実証している。コレステロールはコレステロールエステルに添加され、レシチン量は減少している。しかし、トランスフェラーゼ＃１３９はリゾレシチンに対しても活性であるので、リゾレシチンは極めて少量しか蓄積されないことも結果は示している。この知見は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が形成されることによって支持される。
卵黄及びグルコース
アエロモナス サルモニシダ由来のトランスフェラーゼ（＃１３８）がトランスフェラーゼ反応においてグルコースを受容体分子として使用できることは先に判明している。トランスフェラーゼ＃１３９がグルコースを受容体分子として使用できるかどうかも試験された。実験の設定を表２９に示す。
Figure 2006521787
反応生成物をＴＬＣによって分析した（図６８及び図６９）。
ＴＬＣ分析結果によれば、グルコースエステルは反応時間２２０分後に形成されたが（図６９レーン６）、反応時間１２００分後にはグルコースエステルは認められなかった。
したがって、トランスフェラーゼ＃１３９は、トランスフェラーゼ活性と加水分解活性の両方を有すると結論されなければならない。これは、遊離脂肪酸量が、反応時間の関数として着実に増加するという事実によっても支持される。
概要：
アエロモナス ヒドロフィラ由来のトランスフェラーゼを卵黄において試験した。その結果、この酵素が、リゾレシチンの形成と同時にコレステロールエステルの形成を触媒することが確認された。コレステロールの大部分が消費される長時間にわたる反応の後に、遊離脂肪酸も形成される。したがって、この酵素は主としてトランスフェラーゼ活性を有するが、水のみが供与体分子として利用可能であるときには加水分解活性も認められたと結論することができる。
卵黄及びグルコースを用いた実験においては、アエロモナス ヒドロフィラ由来のトランスフェラーゼは、高水分食品環境において、グルコースエステルの形成をインサイチュで触媒できることが認められた（図７０）。
アエロモナス ヒドロフィラ由来の脂質アシルトランスフェラーゼの変異体（Ａｈｙｄ２）（配列番号３６（図７１参照））
突然変異は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡ製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって提供される指示に従って導入された。
Ｔｙｒ２５６における変異は、リン脂質に対する活性を増大させた。
Ｔｙｒ２５６及びＴｙｒ２６０における変異は、ガラクト脂質に対する活性を増大させた。
Ｔｙｒ２６５における変異は、アシル供与体としてガラクト脂質とともにトランスフェラーゼ活性を増大させる。
これらの数値は、以下の配列、すなわち、そのアミノ酸配列が図７１の配列番号３６として示されるアエロモナスヒドロフィラ由来の酵素（下線を引いたアミノ酸は、キシラナーゼシグナルペプチドである)上の位置を示す。ヌクレオチド配列を図７２の配列番号５４として示す。
マーガリン製造用植物ステロールエステル及びモノグリセリドを製造するためのアシルトランスフェラーゼ反応
バチルス サチリス中で発現されるアエロモナスサルモニシダ由来のアシルトランスフェラーゼを、植物レシチン、植物ステロール及びグリセリンを含むパーム油混合物において試験した。アシルトランスフェラーゼは、植物ステロールエステル及びモノグリセリドの生成中に、植物ステロールとグリセリンの両方を受容体分子として利用することができた。反応混合物は、反応混合物中のモノグリセリドを主体とする良質の卓上マーガリンを製造するために使用され、同時にこのマーガリンは、コレステロール低下効果を有することが判明した植物ステロールエステルが豊富であった。
この研究の目的は、植物性脂肪に溶解したレシチン、植物ステロール及びグリセリンの酵素反応によって、モノグリセリド及び植物ステロールエステルを製造できるかどうかを検討することであった。
初期実験によれば、アエロモナス サルモニシダ由来のアシルトランスフェラーゼを使用して、レシチン、グリセリン及び植物ステロールからモノグリセリド及び植物ステロールエステルを製造することが可能であった。
この実験においては、このような反応混合物を使用して卓上マーガリンを製造した。
材料：
アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ、＃ １９６ Ｃ１０１、１８．６ＰＬＵ／ｇ（Ｊｏｕｒｎａｌ ２２５４−１０４）
Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｔｅｄ、ＤＫのパーム油４３。
Ｌ−αホスファチジルコリン９５％植物（Ａｖａｎｔｉ ＃４４１６０１）
植物ステロール：Ｃｏｇｎｉｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ製Ｇｅｎｅｒｏｌ Ｎ１２２
グリセリン製品番号０８５９１５
蒸留モノグリセリド、Ｄａｎｉｓｃｏ製Ｄｉｍｏｄａｎ ＨＰ。
マーガリン製造。
１．水相成分を混合する。(必要に応じて、水相を約８０℃に加熱して滅菌する)。ｐＨ５．５に調節する。
２．脂肪相を溶融させ、約４０〜４５℃に調整する。
３．乳化剤１部／油５部の比率で乳化剤を油の一部とともにある温度（７５〜８０°）に加熱する。この温度は、乳化剤の融点よりも５〜１０℃高い。この混合物が完全に溶融し、十分撹拌されたら、それを残りの加熱油に添加し、連続して撹拌する。
４．香味料を添加する。
５．水相を脂肪相に添加し、連続して撹拌する。
６．冷却管（ｔｕｂｅ ｃｈｉｌｌｅｒ）（通常能力、通常冷却）中で冷却して出口温度を８〜１０℃にする。
結果
Ａ．サルモニシダ由来のアシルトランスフェラーゼを、表３０に示すように、パーム油混合物において試験した。植物ステロール及びレシチンを溶解させるために、レシチン、植物ステロール、グリセリン及びパーム油を撹拌しながら０℃に加熱した。
Figure 2006521787
基質を４８℃に冷却し、表３１に示す量のアシルトランスフェラーゼ＃１９６を添加した。反応混合物をゆっくり撹拌しながら４８℃で２４時間維持した。
Figure 2006521787
反応時間１、４及び２４時間後に反応混合物から試料を取り出し、ＴＬＣによって溶媒Ｉで分析した（図７３）。ＴＬＣの結果によれば、植物ステロールエステル及びモノグリセリドが形成されたことは明らかである。図７３においては、レーン１は反応時間１時間後であり、レーン２は反応時間４時間であり、レーン３は反応時間２４時間であり、レーン４は植物ステロールである。
反応を反応時間２４時間後に停止し、未溶解植物ステロールの残渣を除去し、透明な溶液をマーガリンの製造に使用した。
マーガリン。
モノグリセリド及び植物ステロールエステルを含む反応混合物を使用して、表３２に示すレシピに従って卓上マーガリンを製造した。
Figure 2006521787
この反応混合物から製造されたマーガリンは、展性が良好であり、食感が良好であり、異風味がない良好な品質であると評価された。このマーガリンは、蒸留モノグリセリドＤｉｍｏｄａｎ ＨＰを使用して製造された基準マーガリンと品質レベルが同等であった。
認められた唯一の違いは、反応混合物を含むマーガリンｊｏｕｒ．３７３４ ｎｏ ２がわずかに堅いことであった。これは、このレシピが基準マーガリンよりも多くのパーム４３を含むことによって説明された。
パン製造中の脂質アシルトランスフェラーゼの使用
パン製造においてリパーゼを使用することの制約の１つは、遊離脂肪酸がリパーゼ反応中に形成されることである。過剰の遊離脂肪酸が形成されると、グルテンが硬くなりすぎ、発酵中及び焼いている間に膨張することができない堅い（ｂｕｃｋｙ）（すなわち、低弾性の）生地が形成されるので、穀粉の焼き性能に負の影響をもたらすことが良く知られている。
遊離脂肪酸は、対応するトリグリセリドよりも脂質酸化されやすいので、遊離脂肪酸の形成は、酸化安定性の点からも回避すべきである。
本発明においては、脂肪分解酵素を生地に添加したときの遊離脂肪酸形成に付随する問題は、脂質アシルトランスフェラーゼを使用することによって克服された。脂質アシルトランスフェラーゼは、遊離脂肪酸を形成する代わりに、１個若しくは複数の脂肪酸を脂質アシル供与体から生地中の炭水化物、タンパク質、ペプチドなどの非水受容体分子に転移させる。或いは乳脂肪とともにパンにおいて使用される場合には、上記他の受容体の代わりに、又は上記他の受容体と組み合わせて、ステロール、例えば、植物ステロール又はフィトスタノールを生地に添加することができる。生地中の受容体分子は、グルコース、スクロース又はマルトース、及び／又は生地中に一般に利用可能な他の炭水化物の１種類若しくは複数であることが好ましい。
以下の実験においては、アシルトランスフェラーゼを小規模の焼き実験において試験する。十分分析された生地における反応生成物及び脂質成分の形成物は、水飽和ブタノールによって抽出され、ＨＰＬＣ及びＧＬＣ分析によって分析される。
材料及び方法
酵素：
アシルトランスフェラーゼ、５５０ＰＬＵ−７／ｍｌ
Ｌｉｐｏｐａｎ（商標）Ｆ ＢＧ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製市販リパーゼ。１２０００ＬＩＰＵ／ｇ又はＧｒｉｎｄａｍｙｌ Ｅｘｅｌ １６．１２０００ＬＩＰＵ／ｇ
レシチン粉末、９５％リン脂質（Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能）
全粒小麦粉から（Ｓｉｇｍａ Ｄ４６５１から）得られるジガラクトシルジグリセリド
穀粉：Ｓｏｌｖｍｅｌ ｎｒ．２００１０８４（Ｈａｖｎｅｍｏｌｌｅｒｎｅ、Ｏｄｅｎｓｅ、Ｄｅｎｍａｒｋから得られるＤａｎｉｓｈ小麦粉）
小規模焼き試験
穀粉、５０グラム、乾燥酵母１０グラム、グルコース０．８グラム、塩０．８グラム、アスコルビン酸７０ｐｐｍ及び水４００Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ単位を、５０ｇ Ｂｒａｂｅｎｄｅｒミキシングボウル中で３０℃で５分間混練する。
静置時間は３４℃で１０分であった。生地は、１５グラム／生地計量された。次いで、木製プレートとプレキシガラス枠の間で生地を圧延する特別な装置で成形した。生地を３４℃で４５分間鍋で寝かせて膨らませ、Ｖｏｓｓ家庭用オーブンで２２５℃で８分間焼いた。
焼いた後にパンを周囲温度に冷却し、２０分後にパンを計量し、なたね置換法（ｒａｐｅ ｓｅｅｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）によって体積を測定した。パンを切り、パンの身及び外皮も評価した。
結果及び結論：
予備的な結果によれば、脂質アシルトランスフェラーゼは、パンの体積とパン外観の両方に対してプラスの効果を示すことが明らかである。特に、予備的な結果によれば、脂質アシルトランスフェラーゼを使用すると、パンの比体積は、対照（酵素なし）によって得られる比体積、及び市販脂肪分解酵素、すなわち、Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ Ｅｘｅｌ １６又はＬｉｐｏｐａｎＦ（商標）を使用して得られる比体積よりも増加する。
乳脂肪（ｄａｉｒｙ ｆａｔ）を含む標準アイスクリーム
アイスクリームに使用される乳化剤の機能は、脂肪結晶化を制御し、アイスクリームの熟成中にタンパク質の脱着による軽い不安定化を起こすことである。この変化は、アイスクリーム品質を向上させる。モノ−ジグリセリドは、アイスクリームの製造に一般に使用されるが、アイスクリーム製造においては脂肪不安定化の制御を容易にし、極めて良好なクリームのような滑らかな食感のアイスクリームを製造するために、ポリソルベート及び糖エステルのような極性乳化剤をモノ−ジグリセリドと併用することも知られている。
アイスクリームに使用される乳化剤は、通常、アイスクリーム混合物に粉末として添加される。しかし、最近、モノ−ジグリセリドは、リパーゼを用いたアイスクリームレシピにおいて脂肪の酵素反応によって製造できることが判明した。しかし、リパーゼを使用することによる問題は、反応混合物において水が利用可能であるときに、リパーゼが遊離脂肪酸の形成も触媒することである。
しかし、驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼは、リパーゼによる制約を克服することが判明した。というのは、アシルトランスフェラーゼは、有意な量の遊離脂肪酸を形成せずに、脂肪酸をレシチン及び他の脂質からステロール、コレステロール、グルコース、グリセリン及びタンパク質／ペプチドのような受容体分子に転移させることができるからである。
アイスクリームにおける主成分の１つは、乳脂肪３８％を含む生クリームである。生クリームは、少量のレシチンも含み、これはアシルトランスフェラーゼの供与体分子である。（「複雑な乳脂質は、全乳脂肪の約１％を占め、主にリン脂質からなる」Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright（著作権）2003 by Wiley−VCH Verlag GmbH & Co. KGaA参照）。生クリームは、少量のコレステロールも含み、これはアシルトランスフェラーゼの受容体分子である。
したがって、アイスクリームの構成物質から、モノグリセリドと、リゾ−レシチン及び糖エステルのような極性乳化剤の両方を生成することができる。これらはアイスクリーム製造において有益な効果のあることが知られている。
生クリームにおけるアシルトランスフェラーゼの反応によるさらなる有益効果は、コレステロールエステルの形成である。これは、腸におけるコレステロールの吸収を遅くする可能性がある。
Figure 2006521787
アイスクリーム製造プロセス。
１．生クリーム、グルコースシロップ及びグリセリンを約４０℃に加熱する。脂質アシルトランスフェラーゼを添加し、その混合物を３０分間反応させる。分析用試料を取り出す。
２．他の液体成分すべてを約４０°に加熱する。
３．他の無水成分を添加する。（安定剤混合物を添加前に糖と混合する）
４．無水成分を溶解するときに、生クリーム−グルコース混合物を添加する。
５．８０〜８５℃／２０〜４０秒低温滅菌する。
６．８０℃（レシピ１の場合は１９０ｂａｒ及びレシピ２の場合は１７５ｂａｒ）で均質化する。
７．熟成温度４℃に冷却する。
８．連続冷凍器中で所望のオーバーラン（推奨１００％）に冷凍する。
９．−４０℃のトンネル中で固める。
１０．−２５℃未満で貯蔵する。
結果：
アイスクリームの製造にアシルトランスフェラーゼを使用すると、市販の乳化剤Ｃｒｅｍｏｄａｎ ＳＥ ３０を用いて製造されたアイスクリームよりも味覚が極めて良好であり、口当たりがクリームのようにすばらしいアイスクリームが製造される一助となる。脂質アシルトランスフェラーゼによって製造されたアイスクリームの溶融も改善される。
チーズにおけるアシルトランスフェラーゼ
チーズは、乳、脱脂乳、部分脱脂乳、クリーム、乳清クリーム、又はバターミルク、又はこれらの材料の任意の組み合わせをレンネット若しくは他の適切な凝結剤によって凝固させ、このような凝固から生じる乳清を部分的に排出することによって得られる新鮮な又は成熟した固体又は半固体の製品である。
チーズの収率は、主として、乳の脂肪及びタンパク質含有量によって決まる。塩（特に、カルシウム塩）及びタンパク質濃度、並びに酸性度は、凝固に極めて重要である。（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright（著作権）2003 by Wiley−VCH Verlag GmbH & Co.）。
チーズ製造手順の最適化（米国特許第４，９５９，２２９号）、又は凝乳中の乳清タンパク質量を増加させる改良凝固方法（米国特許第４，５８１，２４０号）によってチーズ収率を最適化し増加させるためにこのような努力がなされてきた。
本発明においては、凝乳中の乳清タンパク質の量は、脂質アシルトランスフェラーゼを用いたチーズ製造中の乳の処理による乳清タンパク質の酵素改変によって増加する。
脂肪酸がβ−ラクトグロブリンのような非膜タンパク質に共有結合すると、物理特性及び機能特性が劇的に変わる。
本発明のチーズ製造の場合には、アシルトランスフェラーゼは、レンネットが乳に添加される前又はそれと同時に乳に添加される。
カゼインの沈殿中に、アシルトランスフェラーゼは、アシル化タンパク質又はアシル化ペプチドの形成中に乳中のレシチン及び他の脂質を供与体として、ペプチド又はタンパク質を受容体分子として使用することができる。
乳タンパク質の疎水性の変化は、チーズ製造中の凝乳におけるタンパク質沈殿の増加に寄与する。
本発明によって得られるチーズ収率の増加は、乳清中に通常は失われるタンパク質のチーズ凝固物中に保持される量が増加することによるので、本発明の機序に直接関係する適切な方法は、乳清中に失われるタンパク質量の測定に基づく。乳清中のタンパク質が少ないほど、必然的に、凝乳中のタンパク質が多く、チーズ収率が高いことを意味する。
乳清中のタンパク質量の試験は以下のように実施することができる。脱脂乳又は全乳をレンネット凝固に適切な温度、一般には、３０〜３５℃に１００ｍｌビーカー中で加温する。バルク乳酸菌スターター１％を添加し、標準レンネットを例えば０．０３〜０．０５％に相当する量で添加してもよい。一辺の長さが約０．５ｃｍの立方体に切ることができる十分な凝固固体に乳がなったら、このような切断を鋭利なナイフで実施する。それによって離しょうが始まり、凝乳が沈殿し得る３０分の放置期間後、乳清試料を抜き取り、実験室用遠心分離機で１０分間遠心分離する。この試料のタンパク質含量を、例えばケルダール法によって分析する。これとは別に、且つ／又は補足的に、個々のタンパク質成分のタイプ及び量を確定することができる方法によって試料を分析することができる。
「低水分環境におけるアッセイ」
低水分環境における脂肪分解酵素のトランスフェラーゼ反応。
手順
材料。
コレステロールＳｉｇｍａ ｃａｔ．Ｃ ８５０３
Ｌ−α−ホスファチジルコリン９５％（植物）Ａｖａｎｔｉ ＃４４１６０１
大豆油、Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｔｅｄ、ＤＫ。
クロロホルム、分析グレード
酵素。
＃１７９、Ａ．サルモニシダ由来のＧＣＡＴ
＃２４２７ フザリウム オキシスポラム由来のホスホリパーゼＡ１。Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ製ＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ
＃１９９１ すい臓からのホスホリパーゼＡ２、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ、ＵＫ製ＬＩＰＯＭＯＤ ２２Ｌ
＃２３７３、カンジダ アントアークチカ（Candida Antarctica）リパーゼ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ５２５Ｌ。
酵素アッセイ
レシチン１３．１％及びコレステロール６．６％を、撹拌しながら６０℃に加熱することによって大豆油に溶解した。
基質を２０ｍｌ Ｗｈｅａｔｏｎガラスに計量し、４６℃に加熱した。
水と酵素溶液を添加し、ストップウォッチをスタートさせる。
規則的な間隔で試料５０ｍｇを１０ｍｌ Ｄｒａｍガラスに移し、凍結させた。
単離された脂質をＧＬＣによって分析した。
ＧＬＣ分析
ＧＬＣ分析を実施例１１に記載したように実施した。
結果
実験を表３３に示すように組み立てた。
レシチン１３．１％及びコレステロール６．６％を含む大豆油を主体とする基質を４６℃に加熱した。酵素溶液を添加し、ストップウォッチをスタートさせた。
反応時間３０、６０及び１２０分後に、ＧＬＣ分析用試料を取り出した。
Figure 2006521787
ＧＬＣ分析の結果を表３４に示す。結果は、試料全組成に対する百分率で表わしてある。このＧＬＣの結果に基づいて、酵素が添加されていない対照試料と比較して、酵素反応によって製造された脂肪酸及びコレステロールエステルの量を計算することができた。これらの実験条件下では、全酵素活性は、遊離脂肪酸形成として測定される加水分解活性として推定され、トランスフェラーゼ活性はコレステロールエステル形成として推定された。これらの結果、並びに脂肪酸及びコレステロールエステルの分子量についての情報から、表３５に示すように相対モル加水分解活性及び相対モルトランスフェラーゼ活性を計算することができた。
Figure 2006521787
Figure 2006521787
結論
これらの実験においては、脂肪酸量が増加したので、すべての試験酵素が加水分解活性を示すことが認められた。しかし、トランスフェラーゼ活性を示した唯一の酵素はＡ．サルモニシダ由来のＧＣＡＴであった。したがって、水６％を含むレシチン及びコレステロールの油系においては、フザリウムオキシスポラム由来のホスホリパーゼＡ１、すい臓からのホスホリパーゼＡ２、及びカンジダ アントアークチカ由来のリパーゼのみが加水分解活性を示したと結論される。
上記明細書に述べたすべての出版物を参照により本明細書に援用する。本発明に記載の方法及びシステムの様々な改変形態及び変更形態が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連して説明したが、特許請求する本発明をそのような具体的実施形態に不当に限定すべきでないことを理解すべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明白である本発明の記載された実施形態の様々な変形形態が以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
データベースバージョン６からのｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号１）を示す図である。 生物アエロモナス ヒドロフィラ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から得られるアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。 生物アエロモナス サルモニシダ（ＡＡＧ０９８４０４；ＧＩ：９９６４０１７）から得られるアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。 生物ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号４）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６３１５５８）を示す図である。 生物ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号５）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＣ４２１４０）を示す図である。 生物サッカロミセス セレビシエから得られるアミノ酸配列（配列番号６）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４１７３４）を示す図である。 ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列に対する選択配列のアラインメントを示す図である。 アミノ酸配列同一性が９３％である配列番号３と配列番号２の対ごとのアラインメントを示す図である。下線を引いたのはシグナル配列である。＋は相違を示す。活性部位セリン１６を含むＧＤＳＸモチーフ、及び活性部位アスパラギン酸１１６及びヒスチジン２９１を強調表示する（陰影付きの領域を参照）。アミノ酸の後ろの番号は、シグナル配列を引いたものである。 生物アエロモナス ヒドロフィラから得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である。 生物アエロモナス サルモニシダから得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。 生物ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）から得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｃ＿００３８８８．１：８３２７４８０．．８３２８３６７）を示す図である。 生物ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）から得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５４８０．．２６６３６７）を示す図である。 生物サッカロミセス セレビシエから得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ７５０３４)を示す図である。 生物ラルストニアから得られるアミノ酸配列（配列番号１２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ６４６０５２）を示す図である。 生物ラルストニアから得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す図である。 配列番号２０．Ｓｃｏｅ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮定上のタンパク質[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮定上のタンパク質をコードする配列番号２１のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 配列番号２２のアミノ酸．Ｓｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９の保存された仮定上のタンパク質[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 Ｓｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９の保存された仮定上のタンパク質をコードする配列番号２３のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 アミノ酸配列（配列番号２４）Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質をコードする配列番号２５のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 アミノ酸配列（配列番号２６）Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトマイセスコエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質をコードする配列番号２７のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 アミノ酸配列（配列番号２８）Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトマイセスコエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質をコードする配列番号２９のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。 アミノ酸配列（配列番号３０）Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトマイセスリモサス]を示す図である。 Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼをコードする配列番号３１のヌクレオチド配列［ストレプトマイセスリモサス]を示す図である。 アエロモナス ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）由来のアミノ酸配列（配列番号３２）脂質アシルトランスフェラーゼを示す図である。 アエロモナス ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３３）を示す図である。 アエロモナス サルモニシダ亜種サルモニシダ（Salmonicida）（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である。 アエロモナス サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３５）を示す図である。 アエロモナス遺伝子の相同体は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＩＨ、ＭＤ、ＵＳＡの基本的な局所的アラインメント検索ツールサービス、及び完全ゲノムデータベースを用いて特定できることを示す図である。ＧＤＳＸモチーフがデータベース検索に使用され、脂肪分解活性を有する酵素を潜在的にコードするいくつかの配列／遺伝子が特定された。遺伝子は、ストレプトマイセス属、ザントモナス属及びラルストニア属から特定された。以下の例として、ラルストニアソラナセアルムがアエロモナス サルモニシダ（ｓａｔＡ）遺伝子と並べられた。対ごとのアラインメントによって、同一性は２３％であることが判明した。活性部位セリンはアミノ末端に存在し、触媒作用性残基ヒスチジン及びアスパラギン酸を特定することができる。 Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線を引いたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。．記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。 Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線を引いたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。．記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図２、１６、１８、２０、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。これらのタンパク質すべては、脂質基質に対して活性であることが判明した。 Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きアエロモナス サルモニシダ脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを示す図である。 ＮＥＦＡキットアッセイにおいて細胞抽出物を試験した結果を示す図である。組換えＡ．サルモニシダ脂質アシルトランスフェラーゼのレシチンに対する活性を示す。各ウェルは、左から右に、正の対照、負の対照（すなわち、空のプラスミドからの抽出物）、並びにＩＰＴＧ誘導から０、１、２及び３時間培養後に収集された試料である。 発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの増殖最適化を示す図である。３０℃での培養によって、レシチンに対して高い活性を有する酵素が産生されることが示されている。細胞抽出物のホスホリパーゼ活性を、ＮＥＦＡキットアッセイによって試験した。各ウェルは、左から右に、正の対照、負の対照、２０℃、３０℃である。 基質レシチンとともにインキュベートされた、活性脂質アシルトランスフェラーゼを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳから得られる粗製細胞抽出物を示す図である。反応混合物は、薄層クロマトグラフィーによって分析され、分解生成物が存在することが示された。レーン：１．酵素なし；２．＋Ａ．ｓａｌ −１０ｕｌ ３７℃；３．＋Ａ． ｓａｌ −２０ｕｌ ３７℃；４．＋Ａ．ｓａｌ −１０ｕｌ ２４℃；５．＋Ａ． ｓａｌ −２０ｕ ２４℃。 アエロモナス サルモニシダアシルトランスフェラーゼの部分精製を示す図である。ホスホリパーゼ活性が精製Ｈｉｓタグタンパク質と関連することが示されている。ＳＥ＝超音波処理抽出物、Ｈｉｓ＝Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて精製。 Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きアエロモナス ヒドロフィラグリセロ脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）遺伝子を含む発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａを使用して大腸菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した図である。 組換えアエロモナス ヒドロフィラＧＣＡＴ酵素を含む粗製抽出物（５＆１０ｕｌ）のレシチンに対する活性をＮｏｎ−Ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ（ＮＥＦＡ）キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて試験した図である。リン脂質レシチンに対して活性な酵素が存在することを示す。 発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの増殖最適化を示す図である。３０℃での培養によって、レシチンに対して高い活性を有する酵素が産生されることが示されている。細胞抽出物のホスホリパーゼ活性を、ＮＥＦＡキットアッセイによって試験した。 アエロモナス ヒドロフィラ＆Ａ．サルモニシダアシルトランスフェラーゼの部分精製を示す図である。ホスホリパーゼ活性が精製Ｈｉｓタグタンパク質と関連することが示されている。ＳＥ＝超音波処理抽出物、Ｈｉｓ＝Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて精製）。 レシチンとＤＧＤＧの両方に対して活性な分泌酵素が産生されたことを示す、バチルスサチリス１６３におけるアエロモナス遺伝子の発現を示す図である。ｐＵＢ−ＡＨ＝Ａ．ヒドロフィラ遺伝子を含む構築体、及びｐＵＢ−ＡＳ、Ａ．サルモニシダ遺伝子を有する構築体、培養ろ液は、基質とともに６０分間インキュベートされた。 展開溶媒IV（クロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４））中のＴＬＣプレートを示す図である。レーン１：４０ｍｇ シトステロール ３０ｍｉｎ：レーン２：トランスフェラーゼ＋ ４０ｍｇ シトステロール ３０ｍｉｎ；レーン３：トランスフェラーゼ＋ ８０ｍｇ シトステロール ３０ｍｉｎ；レーン４：トランスフェラーゼ＋ ４０ｍｇ シトステロール １２０ｍｉｎ；レーン５：トランスフェラーゼ＋ ８０ｍｇ シトステロール １２０ｍｉｎ；レーン６：トランスフェラーゼ＋ ４０ｍｇ シトステロール ３００ｍｉｎ；レーン７：４０ｍｇ シトステロール ３００ｍｉｎ；レーン８：コレステロール；レーン９：シトステロール。 展開溶媒IV（クロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４））中のＴＬＣプレートを示す図である。レーン１：４０ｍｇ シトステロール ３０ｍｉｎ：レーン２：トランスフェラーゼ＋ ４０ｍｇ シトステロール ３０ｍｉｎ；レーン３：トランスフェラーゼ＋ ８０ｍｇ シトステロール ３０ｍｉｎ；レーン４：トランスフェラーゼ＋ ４０ｍｇ シトステロール １２０ｍｉｎ；レーン５：トランスフェラーゼ＋ ８０ｍｇ シトステロール １２０ｍｉｎ；レーン６：トランスフェラーゼ＋ ４０ｍｇ シトステロール ３００ｍｉｎ；レーン７：４０ｍｇ シトステロール ３００ｍｉｎ；レーン８：コレステロール；レーン９：シトステロール。 脂質アシルトランスフェラーゼによって触媒される、ホスファチジルコリンとコレステロールの反応を示す図である。 酵素処理又は未処理卵黄から抽出された脂質のＴＬＣ分析を示す図である。６）０．３１ＰＬＵ／ｇ トランスフェラーゼ ＃１７９、７）１．２５ＰＬＵ／ｇ トランスフェラーゼ ＃１７８−９、８）２３．２５ＰＬＵ／ｇ ホスホリパーゼ ＃３１０８、９）対照。 酵素処理又は未処理卵黄によって作製されたマヨネーズ試験試料を示す図である。５）トランスフェラーゼ ＃１７９、０．３１ＰＬＵ／ｇ、６）トランスフェラーゼ ＃１７８−９、１．２５ＰＬＵ／ｇ、７）ホスホリパーゼ ＃３１０８、２３．３ＰＬＵ／ｇ ８）対照、水。 Ａ．ヒドロフィラから得られた脂質アシルトランスフェラーゼで処理した卵黄脂質のＴＬＣ（溶媒Ｉ中）を示す図である。 Ａ．ヒドロフィラから得られた脂質アシルトランスフェラーゼで処理した卵黄脂質のＴＬＣ（溶媒IV中）を示す図である。 卵黄からのトランスフェラーゼ処理脂質の経時ＴＬＣ分析を示す図である。 脂質アシルトランスフェラーゼ（Ｔｒａｎｆ ＃１７８−９）を用いたときの時間の関数として生成される脂肪酸及びコレステロールエステルの量を、対照脂肪分解酵素、サーモマイセスラヌギノサスを用いたときと比較したグラフである。 含水量の多い卵黄中の酵素反応におけるトランスフェラーゼと加水分解活性の％としての相対トランスフェラーゼ活性を示すグラフである。＃１９９１（ホスホリパーゼＡ２）及び＃２４２７（ホスホリパーゼＡ１）は対照ホスホリパーゼであり、＃１７８は脂質アシルトランスフェラーゼである。 含水量の多い卵黄中のトランスフェラーゼ反応におけるトランスフェラーゼ＃１７８のトランスフェラーゼ活性に対する、アッセイにおける含水量の効果を示すグラフである。 水分の多い卵黄中のトランスフェラーゼ反応における脂質アシルトランスフェラーゼ（＃１７８）のトランスフェラーゼ活性を反応時間の関数として示すグラフである。 脂肪酸及びコレステロールエステルを時間の関数として示すグラフである。グラフは、緩衝剤中のレシチン及びコレステロールを基質として用いたアシルトランスフェラーゼ活性を測定するためのアッセイにおいて、ＧＬＣ分析で得られた結果を示す。 脂肪酸及びコレステロールエステルを時間の関数として示すグラフである。グラフは、緩衝剤中のレシチン及びコレステロールを基質として用いたアシルトランスフェラーゼ活性を測定するためのアッセイにおいて、ＧＬＣ分析で得られた結果を示す。 溶媒ＩにおけるＴＬＣの図である。アエロモナス サルモニディカ（Aeromonas salmonidica）由来の脂質アシルトランスフェラーゼ＃１３８で処理した卵黄（レーン番号１及び２）、ホスホリパーゼ＃２９３８（ＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ）で処理した卵黄（レーン番号３）、又は未処理卵黄（レーン番号４）。 溶媒IVにおけるＴＬＣの図である。脂質アシルトランスフェラーゼ＃１３８で処理した卵黄（レーン番号１及び２）、ホスホリパーゼ＃２９３８で処理した卵黄（レーン番号３）。未処理卵黄（レーン番号４）。 脂質アシルトランスフェラーゼ＃１３８で処理した卵黄（試料番号１及び２）及びホスホリパーゼ＃２９３８で処理した卵黄（試料番号３）を示す図である。未処理卵黄（試料番号４）。 １００℃で２時間後の食品エマルジョンを示す図である。０）未処理卵黄 １）脂質アシルトランスフェラーゼ＃１３８で２１０分間処理した卵黄。３）対照ホスホリパーゼ＃２９３８で２１０分間処理した卵黄。 植物ステロール及びグリセリンに対するトランスフェラーゼ活性のスクリーニングを示すＴＬＣプレートの図である。ＰＣ＝ホスファチジルコリン、ＬＰＣ＝リゾホスファチジルコリン、ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン、ｍｏｎｏｇｌ＝モノグリセリド。 溶媒Ｉ中の反応時間２４時間後の試料１〜６及び４時間後の試料１〜４のＴＬＣプレートを示す図である。ＴＬＣ分析によって、試料１、２、５及び６においてステロールエステルの形成が確認される。 溶媒Ｉ中のＴＬＣプレートを示す図である。アエロモナス サルモニシダ由来の固定化アシルトランスフェラーゼのトランスフェラーゼ活性を油混合物中で試験した。試料は、０．５、１、３、６及び２４ｈに採取された。 溶媒Ｉ及びIV中のＴＬＣプレートを示す図である。レーン１＝レシチン；レーン２＝対照−１０ｍｉｎ；レーン３＝０．７５ＰＬＵ、１０ｍｉｎ；レーン４＝０．７５ＰＬＵ、６０ｍｉｎ；レーン５＝０．７５ＰＬＵ、２２０ｍｉｎ；レーン６＝対照、２０ｈ；レーン７＝０．７５ＰＬＵ、２０ｈ；及びレーン８＝コレステロールエステル。 溶媒Ｉ及びIV中のＴＬＣプレートを示す図である。レーン１＝レシチン；レーン２＝対照−１０ｍｉｎ；レーン３＝０．７５ＰＬＵ、１０ｍｉｎ；レーン４＝０．７５ＰＬＵ、６０ｍｉｎ；レーン５＝０．７５ＰＬＵ、２２０ｍｉｎ；レーン６＝対照、２０ｈ；レーン７＝０．７５ＰＬＵ、２０ｈ；及びレーン８＝コレステロールエステル。 溶媒IV中のＴＬＣプレートを示す図である。レーン１＝レシチン；レーン２＝対照−１０ｍｉｎ；レーン３＝１ＰＬＵ、１０ｍｉｎ；レーン４＝１ＰＬＵ、６０ｍｉｎ；レーン５＝１ＰＬＵ、１８０ｍｉｎ；レーン６＝１ＰＬＵ、２２０ｍｉｎ；レーン７＝１ＰＬＵ、１２００ｍｉｎ；レーン８＝対照、１２００ｍｉｎ；レーン９＝グルコースエステル；レーン１０＝コレステロール；及びレーン１１＝グルコース。 溶媒IV中のＴＬＣプレートを示す図である。レーン１＝レシチン；レーン２＝対照−１０ｍｉｎ；レーン３＝１ＰＬＵ、１０ｍｉｎ；レーン４＝１ＰＬＵ、６０ｍｉｎ；レーン５＝１ＰＬＵ、１８０ｍｉｎ；レーン６＝１ＰＬＵ、２２０ｍｉｎ；レーン７＝１ＰＬＵ、１２００ｍｉｎ；レーン８＝対照、１２００ｍｉｎ；レーン９＝グルコースエステル；レーン１０＝コレステロール；及びレーン１１＝グルコース。 脂質アシルトランスフェラーゼによって触媒されたときのＤＧＤＧとグルコースの反応を示す図である。 実施例１７においてアエロモナス ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の突然変異誘発に使用された融合構築体のアミノ酸配列（配列番号３６）を示す図である。下線を引いたアミノ酸は、キシラナーゼシグナルペプチドである。 キシラナーゼシグナルペプチドを含むアエロモナス ヒドロフィラ由来の酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）を示す図である。 植物ステロールエステル及びモノグリセリドの形成を明瞭に示すＴＬＣプレートの図である。レーン１は反応時間１時間後であり、レーン２は反応時間４時間後であり、レーン３は反応時間２４時間後であり、レーン４は植物ステロールである。

Claims (43)

  1. 食料品中での乳化剤のインサイチュ生成方法であって、脂質アシルトランスフェラーゼを前記食料品に添加するステップを含む方法。
  2. 少なくとも２種類の乳化剤が生成される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記乳化剤が前記食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、アシル基を脂質から以下のアシル受容体、すなわち、ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質又はそのサブユニット、グリセリンの１種類又は複数に転移させることが可能である脂質アシルトランスフェラーゼである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記乳化剤の少なくとも１種類が炭水化物エステルである、請求項２に記載の方法。
  6. 前記乳化剤の少なくとも１種類がタンパク質エステルである、請求項２に記載の方法。
  7. 前記食料品中でステロールエステル、スタノールエステル、タンパク質エステル、炭水化物エステル、ジグリセリド又はモノグリセリドの中から１種類又は複数がインサイチュ生成される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ステロールエステルが、α−シトステロールエステル、β−シトステロールエステル、スチグマステロールエステル、エルゴステロールエステル、カンペステロールエステル又はコレステロールエステルの１種類又は複数である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記スタノールエステルが１種類又は複数のβ−シトスタノール又はｓｓ−シトスタノールである、請求項６に記載の方法。
  10. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素であることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、Ｈ−３０９を含むか、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、の１つ又は複数を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記乳化剤が、モノグリセリド、リゾホスファチジルコリン又はＤＧＭＧの１種類又は複数である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 乳化剤を含む食料品を食品材料から調製するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、前記乳化剤が、前記食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成され、前記脂質アシルトランスフェラーゼによって前記食品材料の構成物質から生成されることを特徴とする、使用。
  16. 少なくとも２種類の乳化剤が生成される、請求項１５に記載の使用。
  17. 前記乳化剤の少なくとも１種類が炭水化物エステルである、請求項１６に記載の使用。
  18. 前記乳化剤の少なくとも１種類がタンパク質エステルである、請求項１６に記載の使用。
  19. 前記食料品においてステロールエステル、スタノールエステル、タンパク質エステル、炭水化物エステル、ジグリセリド又はモノグリセリドの１種類又は複数もインサイチュ生成される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
  20. 前記ステロールエステルが、α−シトステロールエステル、β−シトステロールエステル、スチグマステロールエステル、エルゴステロールエステル、カンペステロールエステル又はコレステロールエステルの１種類又は複数である、請求項１９に記載の使用。
  21. 前記スタノールエステルが１種類又は複数のβ−シトスタノール又はｓｓ−シトスタノールである、請求項２０に記載の使用。
  22. アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素として前記脂質アシルトランスフェラーゼが特徴づけられる、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の使用。
  23. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｈ−３０９を含むか、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項１５から２２のいずれか一項に記載の使用。
  24. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の使用。
  25. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上同一であるアミノ酸配列、の１つ又は複数を含む、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の使用。
  26. 前記乳化剤が、以下、すなわち、モノグリセリド、リゾホスファチジルコリン、ＤＧＭＧの１種類又は複数である、請求項１５から２５のいずれか一項に記載の使用。
  27. 脂質アシルトランスフェラーゼを含有する食品又は飼料酵素組成物。
  28. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素であることを特徴とする、請求項２７に記載の食品又は飼料酵素組成物。
  29. 前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、Ｈ−３０９を含むか、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項２７又は請求項２８に記載の食品又は飼料酵素組成物。
  30. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の食品又は飼料酵素組成物。
  31. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、の１つ又は複数を含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の食品又は飼料酵素組成物。
  32. 請求項２７から３１のいずれか一項に記載の食品又は飼料酵素組成物の、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の使用、或いは請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法における使用。
  33. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる食料品。
  34. 固定化脂質アシルトランスフェラーゼ酵素。
  35. アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素として前記脂質アシルトランスフェラーゼが特徴づけられる、請求項３４に記載の固定化脂質アシルトランスフェラーゼ。
  36. 前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、Ｈ−３０９を含む、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項３４又は請求項３５に記載の固定化脂質アシルトランスフェラーゼ。
  37. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の固定化脂質アシルトランスフェラーゼ。
  38. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、の１つ又は複数を含む、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の固定化脂質アシルトランスフェラーゼ。
  39. 「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」、「高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ」又は「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」の１つ又は複数を用いて目的とする酵素を試験するステップと、
    （ａ）「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、３０、２０又は１２０分から選択される時間の後に測定して、少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、（ｂ）水分が５４％の卵黄において「高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、最高１００％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、或いは（ｃ）「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、の１つ又は複数の特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼである場合にその脂質アシルトランスフェラーゼを選択するステップとを含む、本発明によって使用される適切な脂質アシルトランスフェラーゼを特定する方法。
  40. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、
    （ａ）「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、３０、２０又は１２０分から選択される時間の後に測定して、少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、（ｂ）水分が５４％の卵黄において「高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、最高１００％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、或いは（ｃ）「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、の２つ以上の特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼである場合に選択される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、（ａ）「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、３０、２０又は１２０分から選択される時間の後に測定して、少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、（ｂ）水分が５４％の卵黄において「高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、最高１００％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、或いは（ｃ）「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、の３つ以上の特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼである場合に選択される、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、（ａ）「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、３０、２０又は１２０分から選択される時間後に測定して、少なくとも１％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、（ｂ）水分が５４％の卵黄において「高水分卵黄におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、最高１００％の相対トランスフェラーゼ活性を有すること、或いは（ｃ）「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験したときに、少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、のすべての特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼである場合に選択される、請求項３９に記載の方法。
  43. 請求項３９から４２のいずれか一項に記載の方法を用いて特定される脂質アシルトランスフェラーゼ。
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