PT1619961E - Método para a produção in situ de um emulsificador num alimento - Google Patents

Método para a produção in situ de um emulsificador num alimento Download PDF

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Arno De Kreij
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Description

DESCRIÇÃO
"MÉTODO PARA A PRODUÇÃO IN SITU DE UM EMULSIFICADOR NUM ALIMENTO"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para a produção in situ de um emulsificador num alimento, através da utilização de uma aciltransferase de lipido. A presente invenção refere-se, ainda, a um método para a produção in situ de um emulsif icador num alimento através da utilização de uma aciltransferase de lipido, em que o método é de modo a que o emulsificador seja produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento. A presente invenção refere-se, ainda, a um método para a produção in situ de, pelo menos, dois emulsificadores num alimento, através da utilização de uma aciltransferase de lipido. A presente invenção também se refere a um método para a produção in situ de um éster de hidrato de carbono e/ou um éster de esterol e/ou um éster de estanol e/ou um éster de proteína e/ou éster de glicerol e/ou um éster de hidroxiácido num alimento através da utilização de uma aciltransferase de lipido. 1 A presente invenção refere-se à utilização de uma composição de enzima alimentar e/ou uma composição de enzima para rações animais, que contém uma aciltransferase de lipido, nos métodos da presente invenção. É divulgado um método de identificação de aciltransferases de lipidos adequadas de acordo com a presente invenção, aciltransferase de lipidos assim identificada e uma aciltransferase de lipido imobilizada.
ANTECEDENTES NA TÉCNICA A utilização benéfica de fosfolipases e lipases (referidas como enzimas lipoliticas, (EC. 3.1.1.x) utilizadas em aplicações na indústria alimentar e/ou de rações, é conhecida desde há muitos anos.
Por exemplo, no documento EP 0585988 é reivindicado que a adição de lipase a massa resultou num melhoramento no efeito anti-endurecimento. É sugerido que uma lipase obtida a partir de Rhizopus arrhizus, quando adicionada à massa, pode melhorar a qualidade do pão resultante quando utilizada em combinação com gordura vegetal/gordura. O documento W094/04035 explica que pode ser obtida uma macieza melhorada adicionando uma lipase à massa sem a adição de qualquer gordura/óleo adicional à massa. Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinki, demonstra que as lipases exógenas podem modificar o volume do pão.
As enzimas lipoliticas hidrolisam um ou mais dos ácidos gordos dos lipidos presentes na alimentação, o que pode resultar na formação de moléculas emulsificadoras poderosas no alimento, 2 o que proporciona uma funcionalidade comercialmente valiosa. As moléculas que contribuem para as caracteristicas emulsificadoras mais significativas são os produtos de hidrólise parcial, tais como moléculas de liso-fosfolipidos, liso-glicolipidos e mono-glicéridos. Os produtos de hidrólise de lipido polar, tais como liso-fosfolipidos e liso-glicolipidos são particularmente vantajosos. No fabrico de pão, esses emulsificadores derivados ín situ podem originar funcionalidade equivalente como emulsificadores, tais como DATEM.
Contudo, a actividade de enzimas lipoliticas também resulta na acumulação de ácidos gordos livres, que pode conduzir à uma funcionalidade prejudicial no alimento. Esta actividade inerente de enzimas lipoliticas limita a sua funcionalidade.
Foram tentadas, na técnica, numerosas soluções para este problema. Contudo, estas resultaram num aumento significativo nos ácidos gordos livres no alimento, particularmente produtos alimentares com elevado teor em água, incluindo, mas não limitados a massas de pão e gema de ovo.
Foram utilizadas durante muitos anos fosfolipases, particularmente fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4), para o tratamento de ovos ou de produtos à base de ovos (ver documento US 4034124 e Dutihl & Groger 1981 J. Sei. Food Agric. 32, 451-458, por exemplo). A actividade da fosfolipase durante o tratamento de ovos ou produtos à base de ovos resulta na acumulação de lisolecitina polar, que pode actuar como um emulsificador. O tratamento com fosfolipase de ovos ou produtos à base de ovos pode melhorar a estabilidade, estabilidade térmica sob tratamento com calor, tal como a pasteurização, e resulta num espessamento substancial. Os produtos à base de ovos podem 3 incluir, mas não estão limitados a bolos, maionese, temperos para saladas, molhos, gelados e semelhantes. A utilização de fosfolipases resulta na acumulação de ácidos gordos livres. A acumulação de ácidos gordos livres pode resultar num sabor desagradável acentuado. Adicionalmente, a acumulação de ácidos gordos livres pode resultar num aumento da sensibilidade à oxidação e, por isso, resultar em tempo de armazenamento pobre, descoloração do produto e alteração de outras caracteristicas alimentares criticas, tais como sabor e textura. Recentemente, as enzimas lipolíticas com especificidade para o substrato mais vasta foram comercializadas para o tratamento de gema de ovo e produtos alimentares relacionados. Estes possuem a vantagem de, contrariamente à maioria das fosfolipases A2, não terem origem numa fonte de mamíferos. Contudo, eles resultam na acumulação significativa de ácidos gordos livres, não apenas devido à hidrólise de fosfolípidos, mas também de triglicéridos.
Como mencionado acima, outra área em que as lipases foram utilizadas extensamente é na indústria da panificação. A utilização de fosfolipases na panificação data já dos primeiros anos da década de 1980. O substrato para as lipases na farinha de trigo é 1,5-3% de lípidos de trigo endógenos, que são uma mistura complexa de lípidos polares e não polares. Os lípidos polares podem ser divididos em glicolípidos e fosfolípidos. Estes lípidos são constituídos por glicerol esterificado com dois ácidos gordos e um grupo polar. O grupo polar contribui para a actividade de superfície desses lípidos. A clivagem enzimática de um dos ácidos gordos nestes lípidos conduz a lípidos com uma actividade de superfície muito superior. É bem conhecido que os 4 emulsificadores, tais como DATEM, com actividade de superfície elevada, são muito funcionais quando adicionados à massa.
Contudo, a utilização de lipases (E.C. 3.1.1.X) nos produtos de massa pode possuir um impacto prejudicial na actividade de levedura e/ou um efeito negativo no volume do pão. 0 efeito negativo no volume do pão é, frequentemente, explicado por sobredosagem. A sobredosagem pode conduzir a uma diminuição na elasticidade do glúten que resulta numa massa que é demasiado rígida e, por isso, resulta em volumes de pão reduzidos. Adicionalmente ou alternativamente, essas lipases podem degradar a gordura, óleo ou gordura do leite adicionado à massa, resultando num sabor desagradável na massa e produto cozido. A sobredosagem e o sabor desagradável foram atribuídos à acumulação de ácidos gordos livres na massa.
Nos documentos EP 1193314, EP 0977869 e também em WO 01/39602, a utilização de enzimas lipolíticas activas nos glicolípidos foi relatada como sendo particularmente benéfica na aplicação no fabrico de pão, na medida em que se verificou que os produtos de hidrólise parcial os lisoglicolípidos possuem funcionalidade emulsificadora muito elevada, resultando aparentemente numa proporção mais elevada de funcionalidade emulsificadora positiva comparada com a acumulação prejudicial de ácidos gordos. Contudo, também se verificou que as enzimas possuem actividade não selectiva significativa nos triglicéridos que resultou em elevados ácidos gordos livres desnecessariamente.
Foi relatada a mesma verificação do documento WO 00/32758, que revelou variantes de enzima lipolítica com actividade aumentada em fosfolípidos e/ou glicolípidos, adicionalmente às 5 variantes que tinham uma preferência por ácidos gordos de cadeia longa, mais do que de cadeia curta. Esta última caracteristica, também divulgada no documento WO 01/39602, foi considerada de particular importância para prevenir os sabores desagradáveis associados com a acumulação de ácidos gordos livres de cadeia curta. Contudo, são produzidos ácidos gordos livres significativos. O problema da actividade de triglicéridos elevada foi abordado no documento WO02/094123, em que é ensinada a utilização de enzimas lipoliticas activas nos lipidos polares (í. e., glicolipidos e fosfolipidos) numa massa, mas substancialmente não activa em triglicéridos ou 1-mono-glicéridos. Contudo, são produzidos ácidos gordos livres significativos.
Algumas enzimas lipoliticas possuem pouca ou nenhuma actividade na forma liso de lipidos polares (e. g., glicolipidos/fosfolipidos) . A utilização dessas enzimas foi considerada preferível, na medida em que elas asseguram a acumulação dos liso-lipidos altamente polares, resultando numa funcionalidade óptima. Os ácidos gordos livres, contudo, acumulam-se. Esta funcionalidade selectiva é caracteristica das enzimas fosfolipase A2, e das glicolipases divulgadas nos documentos EP 0977869, EP 1193314, e WO01/39602. Foram produzidas variantes de enzimas de enzimas lipoliticas menos selectivas que possuem uma actividade mais baixa nos liso-lipidos polares, quando comparadas com a enzima parental (dovumento WO03/060112) . Contudo, são produzidos ácidos gordos livres significativos. 6 0 documento WO00/05396 ensina um processo para preparar um alimento compreendendo um emulsificador, em que o material alimentar é colocado em contacto com uma enzima, de um modo a que seja criado um emulsif icador pela enzima a partir de um éster de ácido gordo e um segundo ingrediente funcional é criado a partir de um segundo constituinte. 0 documento WO00/05396 ensina a utilização de, em particular, uma enzima lipase ou esterase. Em nenhum local no documento WO00/05396 é ensinada a utilização específica de uma aciltransferase de lípido. Adicionalmente, em alimentos com teor em água elevado, a utilização de esterases e lipases, como ensinada no documento WO00/05396, iria resultar na acumulação significativa de ácidos gordos livres.
Uma desvantagem associada à utilização de lipases, incluindo fosfolipases e glicolipases, pode ser provocada pela acumulação de ácidos gordos livres libertados a partir dos lípidos. Nas últimas duas décadas, a utilização de enzimas lipolíticas nos alimentos foi limitada devido ao equilíbrio entre a acumulação prejudicial de ácidos gordos livres e a produção dos liso-lipidos que proporciona funcionalidade positiva. Embora tenham sido tentadas na técnica numerosas estratégias, algumas das quais proporcionaram melhoramentos significativos na funcionalidade, nenhuma abordou e resolveu completamente o problema fundamental na técnica, i. e., a acumulação significativa de ácidos gordos livres em alimentos preparados utilizando enzimas lipolíticas in situ. A presença de níveis elevados de ácidos gordos livres (FFA) em materiais não processados ou em produtos alimentares é geralmente, reconhecida como um defeito na qualidade e os fabricantes e clientes de alimentos, normalmente, incluirão um 7 nível máximo de FFA nas especificações dos alimentos. Os efeitos que resultam de níveis excessivos de FFA podem estar em defeitos organolépticos e/ou funcionais.
Um resultado da lipólise é o ranço hidrolítico, com a formação do sabor "a ranço" característico. Este sabor "a ranço" é especialmente agudo com ácidos gordos de comprimento de cadeia intermédio (C8-C12) que, embora não presentes em concentrações elevadas, podem ser constituintes importantes de, por exemplo, produtos lácteos ou óleos vegetais. Um defeito organoléptico mais comum é devido aos efeitos combinados das enzimas lipolíticas e de processos de oxidação. Os ácidos gordos não saturados são mais sensíveis à oxidação enzimática quando não esterifiçados do que quando esterifiçados em lípidos de acilo.
Os defeitos funcionais em alimentos devidos a níveis elevados de FFA são reconhecidos, mas menos facilmente explicados. Sem desejar estar limitado pela teoria, a hidrólise de lípidos não alterados em ácidos carboxílicos irá aumentar [H+] e produzir grupos carbonilo que podem combinar-se com outros compostos ou iões metálicos. Os ácidos gordos livres também combinam proteínas através de interacções hidrofóbicas e podem complexar-se com o amido durante a cozedura. Os FFA podem também interferir com a acção de agentes activos de superfície, tais como lípidos polares e emulsificadores. (Lipid in Cereal Technology, P.J. Barnes, Academic Press 1983.) 0 documento W003/100044 divulga uma classe de acil transferases conhecidas como PDATS (ou ATWAX). Estas enzimas utilizam um monoglicérido ou um diglicérido como a molécula aceitadora e fosfatidilcolina (PC) como a molécula dadora, para produzir os produtos seguintes: liso fosfatidilcolina e triacilglicerol e/ou diacilglicerol.
Numa forma de realização, a presente invenção refere-se a melhoramentos na incorporação de proteínas de soro de leite coalhado em produtos alimentares, proporcionando rendimentos melhorados sem prejudicar as qualidades - tais como a textura -das composições e produtos alimentares. São tipicamente preparadas composições de queijo a partir de líquidos lácteos através de processos que incluem o tratamento do líquido com um agente de coagulação. 0 agente coagulante pode ser uma enzima de coagulação, um ácido ou uma cultura bacteriana adequada, ou pode incluir essa cultura. A coalhada que resulta geralmente incorpora caseína transformada, gorduras, incluindo gordura de manteiga natural, e aromatizantes que surgem especialmente quando é utilizada uma cultura bacteriana. A coalhada pode ser separada do soro de leite coalhado líquido, que contém proteínas solúveis não afectadas pela coagulação e que, por isso, não são incorporadas na coalhada. A coalhada é, por isso, um subproduto do fabrico em processos comerciais que produzem produtos alimentares - tais como queijos. Tradicionalmente, o soro de leite coalhado é eliminado como resíduo não utilizado ou utilizado como fertilizante, ração animal ou processado num ingrediente alimentar. A incapacidade de proteínas de soro de leite coalhado para serem substancialmente retidas na coalhada é um factor importante que contribui para uma falta de eficiência na produção convencional de produtos lácteos - tais como queijos frescos - e para uma redução no rendimento global que se refere 9 à incorporação de todos os sólidos proteicos que estão presentes nos líquidos de partida dos produtos lácteos nos queijos frescos resultantes. Têm havido numerosas tentativas para incluir proteínas de soro de leite coalhado no queijo, e. g., por tratamento do leite com calor, tratamento a quente da coalhada do soro do leite ou por filtração - tal como ultrafiltração.
Existem, também, várias descrições da utilização de proteases específicas para induzir a agregação de proteínas de soro de leite coalhado. Foi demonstrado que uma protease da serina derivada de Bacillus licheniformis possui a capacidade para induzir a agregação de proteínas de soro de leite coalhado (documento US 5523237).
Contudo, permanecem muitas dificuldades associadas com a adição de proteínas de soro de leite coalhado em processos tais como o fabrico de queijos. Por exemplo, a incorporação da proteína de soro de leite coalhado em queijos está associada com uma deterioração no sabor e na sensação na boca do produto e, além disso, tende a interferir com a coagulação e subsequente processamento do produto. Foram anteriormente relatadas proteases que podem ser adicionadas a leite, para queijo para a hidrólise de proteínas de soro de leite coalhado que resulta na hidrólise significativa das caseínas, como descrito por Madsen, J.S. & Qvist,K.B. (1997) Hydrolysis of milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acid residues. J. Food Sei. 62, 579-582.
Assim, existe uma necessidade na técnica para métodos e composições que proporcionem a incorporação melhorada de 10 proteína do soro de leite coalhado em produtos alimentares embora mantendo as propriedades organolépticas e outras propriedades desejáveis. Essa optimização iria resultar num aumento da eficiência, rendimentos mais elevados de produtos alimentares e custos materiais globais reduzidos.
As aciltransferases de lipase:colesterol são já conhecidas há algum tempo (ver, por exemplo, Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). Em particular, descobriram-se as glicerofosfolípido:colesterol acil transferases (GCAT) que tal como as aciltransferases de lecitina:colesterol (LCAT) de plantas e/ou de mamíferos, irão catalisar a transferência de ácidos gordos entre fosfatidilcolina e colesterol.
Upton e Buckley (TIBS 20, Maio de 1995 p 178-179) e Brumlik e Buckley (J. of Bacteriology Abr. 1996 p 2060-2064) ensinam uma lipase/aciltransferase de Aeromonas hydrophila que tem a capacidade para realizar a transferência de acilo para aceitadores de álcool em meio aquoso.
ASPECTOS SUMÁRIOS DA PRESENTE INVENÇÃO
De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de produção in situ de um emulsificador num alimento contendo água, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento, em que a aciltransferase de lípido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S. 11
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um produto alimentar, um alimento contendo água, compreendendo um emulsificador, em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o emulsificador é criado a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, τ, N, m ou S.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção ín situ de um emulsificador num alimento contendo água, em que o método é tal que o emulsif icador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar a aciltransferase de lípido ao alimento, em que a aciltransferase de lípido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransferase de lípido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção in situ de um emulsif icador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento contendo água, em que o método é tal que o emulsif icador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e 12 em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransferase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção in situ de um emulsificador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento contendo água, em que o método é tal que o emulsif icador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransferase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção in situ de um emulsif icador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento contendo água, em que o método compreende o passo de adicionar a aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, 13 Υ, Η, Q, Τ, Ν, Μ ou S e em que a aciltransferase de lípido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para a produção in situ de, pelo menos, dois emulsificadores num alimento contendo água, em que o método compreende o passo de adicionar ao alimento a aciltransferase de lipido, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, ν, I, F, Y, H, Q, Τ, Ν, M ou S e em que a aciltransferase de lípido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
De acordo com um outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de produção in situ de, pelo menos, dois emulsificadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento contendo água, em que o método é tal que os emulsificadores são produzidos sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar a aciltransferase de lípido ao alimento, em que a aciltransferase de lípido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, Τ, Ν, M ou S e em que a aciltransferase de lípido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
De acordo com um outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de produção in situ de, pelo menos, dois emulsificadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento contendo água, em que o método compreende o passo 14 de adicionar a aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransferase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção in situ de um emulsif icador em que o emulsificador é um éster de hidrato de carbono num alimento contendo água, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, τ, N, M ou S e em que a aciltransferase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção in situ de um éster de hidrato de carbono juntamente com um emulsificador num alimento contendo água, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, v, I, f, y, h, Q, τ, n, m ou S e em que a aciltransferase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase. 15
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção in situ de um emulsificador, e um ou mais de um éster de hidrato de carbono; um éster de esterol; um éster de estanol; um éster de proteína; um monoglicérido ou um diglicérido num alimento contendo água e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransf erase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase. É divulgado um método de produção de um alimento compreendendo um emulsificador, em que o método compreende o passo de adicionar ao alimento uma aciltransferase de lipido como aqui definido. É divulgado um método de produção de um alimento compreendendo um emulsif icador, em que o método é tal que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento; e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento; um método da produção de um alimento compreendendo um emulsificador e um éster de esterol e/ou um estanol, éster, em que o método é tal que o emulsif icador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento; e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento; um método de produção de um alimento compreendendo um emulsificador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o método 16 compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento; um método para a produção de um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsificadores, em que o método compreende o passo de adicionar ao alimento uma aciltransferase de lipido; um método de produção de um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsif icadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o método é tal que os emulsif icadores são produzidos sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento; um método de produção de um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsif icadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento; um método para a produção de um alimento compreendendo um éster de hidrato de carbono, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento; um método para a produção de um alimento compreendendo um éster de hidrato de carbono e um emulsificador, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento; um método de produção de um alimento compreendendo um emulsif icador e um ou mais de um éster de hidrato de carbono; um éster de esterol; um éster de estanol; um éster de proteína; um monoglicérido ou um diglicérido e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento; e a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um emulsificador, em que o emulsificador é criado a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um 17 material alimentar, um alimento contendo água compreendendo um emulsificador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o emulsificador e/ou éster de esterol e/ou éster de estanol é/são criados a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, v, I, F, Y, H, Q, τ, N, M ou S, É divulgada a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um emulsificador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o emulsif icador e/ou éster de esterol e/ou éster de estanol é/são criados a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento contendo água compreendendo, pelo menos, dois emulsificadores, em que os emulsificadores são produzidos sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que os dois emulsificadores são criados a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S. 18
De acordo com um outro aspecto da presente invenção é proporcionada a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento contendo água compreendendo, pelo menos, dois emulsificadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o emulsificadores são produzidos sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que um ou ambos os emulsificadores e/ou o éster de esterol e/ou o éster de estanol é/são criados a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M OU S. É divulgda a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsificadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que um ou ambos os emulsificadores e/ou o éster de esterol e/ou o éster de estanol é/são criados a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido. É divulgada a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um éster de hidrato de carbono, em que o éster de hidrato de carbono é criado a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento contendo água compreendendo, 19 pelo menos, um éster de hidrato de carbono e um outro emulsificador, em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o éster de hidrato de carbono e o emulsificador são criados a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransf erase de lipido, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, τ, N, M ou S.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento contendo água compreendendo um emulsificador e um ou mais de um éster de hidrato de carbono; um éster de esterol; um éster de estanol; um éster de proteína; um monoglicérido ou um diglicérido e em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o emulsificador e/ou o éster de hidrato de carbono e/ou o éster de esterol e/ou o éster de estanol e/ou o éster de proteína e/ou o monoglicérido e/ou o diglicérido é/são criados a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S. 20
De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de produção in situ de um emulsificador, de um modo preferido, uma lisolecitina e um éster de esterol num alimento à base de ovo, em que o método é tal que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransferase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
De acordo com um outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de produção in situ de um emulsificador, de um modo preferido, uma lisolecitina, e um éster de esterol num alimento à base de ovo, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransferase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção de um alimento à base de ovo compreendendo um emulsif icador, de um modo preferido, uma lisolecitina, e um éster de esterol num alimento à base de ovo, em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar 21 substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento, em que a aciltransferase de lípido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransferase de lipido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção de um alimento à base de ovo compreendendo um emulsif icador, de um modo preferido, uma lisolecitina, e um éster de esterol num alimento à base de ovo, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento, em que a aciltransferase de lípido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de acil transferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S e em que a aciltransferase de lípido possui, pelo menos, 5% de actividade de aciltransferase.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona, ainda, um alimento contendo água que se pode obter a partir de, de um modo preferido, um método de acordo com a presente invenção, em que o alimento compreende uma aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, e um emulsificador. É divulgada uma composição de enzima alimentar e/ou uma composição de enzima para rações, que contém uma aciltransferase de lípido, e é revelada a utilização de uma tal composição nos métodos da presente invenção. 22 É aqui divulgado um método de identificação de uma aciltransferase de lipido adequada, compreendendo os passos de testar uma enzima de interesse utilizando um ou mais de "Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água", o "Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água" ou o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" e seleccionar uma aciltransferase de lipido se for uma que possua uma ou mais das seguintes caracteristicas: (a) quando é realizado um teste utilizando o "Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água", medido após um período de tempo seleccionado de 30, 20 ou 120 minutos, possui uma actividade de transferase relativa de, pelo menos, 1%; (b) quando se testa utilizando o "Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água" numa gema de ovo com 54% de água, possui até 100% de actividade de transferase relativa; ou (c) quando se testa utilizando o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" possui, pelo menos, 2% de actividade de aciltransferase e a aciltransferase de lipido identificada utilizando um método de acordo com a presente invenção. É divulgada uma enzima aciltransferase de lipido imobilizada.
ASPECTOS DETALHADOS DA PRESENTE INVENÇÃO O termo "aciltransferase de lipido", como aqui utilizado, significa uma enzima que, além de possuir actividade de lipase (geralmente classificada como E.C. 3.1.1.x de acordo com as
Recomendações de Nomenclatura de Enzimas (1992) do Comité de 23
Nomenclatura da International Union of Biochemistry e Molecular Biology) também possui actividade de aciltransferase (geralmente classificada como E.C. 2.3.1.x), pela qual a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lipido para um ou mais substratos aceitadores, tais como um ou mais dos seguintes : um esterol; um estanol; um hidrato de carbono; uma proteína; uma subunidade de substrato; glicerol.
De um modo preferido, uma aciltransferase de lipido para utilização nos métodos e/ou utilizações da presente invenção é capaz de transferir um grupo acilo de um lipido (como aqui definido) para um ou mais dos seguintes substratos do aceitador de acilo: um esterol, um estanol, um hidrato de carbono, uma proteína ou suas subunidades, ou um glicerol.
Para alguns aspectos o "aceitador de acilo", de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer composto compreendendo um grupo hidroxilo (-0H), tal como por exemplo, álcoois polivalentes, incluindo glicerol; esterol; estanóis; hidratos de carbono; ácidos de hidroxilo incluindo ácidos de frutos, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico e ácido ascórbico; proteínas ou uma sua subunidade, tais como aminoácidos, hidrolisados de proteína e péptidos (proteína parcialmente hidrolisada) por exemplo; e misturas e seus derivados., de um modo preferido, o "aceitador de acilo", de acordo com a presente invenção, não é água.
Numa forma de realização, o aceitador de acilo, de um modo preferido, não é um monoglicérido e/ou um diglicérido. 24
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lipido para um esterol e/ou um estanol.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lipido para um hidrato de carbono.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lipido para uma proteína ou uma sua subunidade. Adequadamente, a subunidade de proteína pode ser uma ou mais das seguintes: um aminoácido, um hidrolisado de proteína, um péptido, a dipéptido, um oligopéptido, um polipéptido.
Adequadamente, na proteína ou subunidade de proteína, o aceitador de acilo pode ser um ou mais dos seguintes constituintes da proteína ou subunidade de proteína: uma serina, uma treonina, uma tirosina, ou uma cisteína.
Quando a subunidade de proteína é um aminoácido, adequadamente o aminoácido pode ser qualquer aminoácido adequado. Adequadamente, o aminoácido pode ser um ou mais de uma serina, uma treonina, uma tirosina, ou uma cisteína, por exemplo.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lipido para glicerol.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lipido para um ácido de hidroxilo. 25
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lipido para um álcool polivalente.
Num aspecto, uma aciltransferase de lipido pode, além de ser capaz de transferir um grupo acilo de um lipido para um esterol e/ou um estanol, ser adicionalmente capaz de transferir o grupo acilo de um lipido para um ou mais dos seguintes: um hidrato de carbono, uma proteína; uma subunidade de substrato, glicerol.
De um modo preferido, o substrato de lipido no qual actua a aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, é um ou mais dos seguintes lípidos: um fosfolípido, tal como uma lecitina, e. g., fosfatidilcolina, um triacilglicérido, uma cardiolipina, um diglicérido, ou um glicolípido, tal como digalactosildiglicérido (DGDG), por exemplo. Este substrato lipídico pode ser aqui referido como o "dador de acilo lipido". 0 termo lecitina, como aqui utilizado engloba fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina e fosfatidilglicerol.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, o substrato lipídico no qual uma aciltransferase de lipido actua é um fosfolípido, tal como lecitina, por exemplo, fosfatidilcolina.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, o substrato lipídico é um glicolípido, tal como DGDG por exemplo.
De um modo preferido, o substrato lipídico é um lipido alimentar, o que é dizer um componente lipídico de um alimento. 26
Para alguns aspectos, de um modo preferido, uma aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é incapaz ou substancialmente incapaz de actuar num triglicérido e/ou um 1-monoglicérido e/ou 2-monoglicérido.
Adequadamente, o substrato lipidico ou dador de acilo lipidico pode ser um ou mais lipidos presentes em um ou mais dos seguintes substratos: gorduras, incluindo gordura de banha, sebo e manteiga; óleos incluindo óleos extraídos a partir de ou derivados de óleo de palma, óleo de girassol, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de sementes de algodão, óleo de noz moida, óleo de milho, azeite, óleo de amendoim, óleo de coco e óleo de colza. A lecitina de soja, colza ou gema de ovo é também um substrato lipidico adequado. 0 substrato lipidico pode ser um lipido de aveia ou outro material à base de plantas contendo galactolipidos.
Num aspecto o dador de acilo de lipidos é, de um modo preferido, lecitina (tal como fosfatidilcolina) em gema de ovo.
Para alguns aspectos da presente invenção, o lipido pode ser seleccionado de lipidos que possuem um comprimento de cadeia de ácido gordo desde 8 até 22 carbonos.
Para alguns aspectos da presente invenção, o lípido pode ser seleccionado de lipidos que possuem um comprimento de cadeia de ácidos gordos desde 16 até 22 carbonos, de um modo mais preferido, desde 16 até 20 carbonos.
Para alguns aspectos da presente invenção, o lípido pode ser seleccionado de lipidos que possuem um comprimento de cadeia de ácido gordo não superior a 14 carbonos, adequadamente a partir 27 lípidos que possuem um comprimento de cadeia de ácido gordo desde 4 até 14 carbonos, adequadamente 4 até 10 carbonos, adequadamente 4 até 8 carbonos.
Adequadamente, uma aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode apresentar uma ou mais das seguintes actividades de lipase: actividade de glicolipase (E.C. 3.1.1.26), actividade de triacilglicerol lipase (E.C. 3.1.1.3), actividade de fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4) ou actividade de fosfolipase AI (E.C. 3.1.1.32). O termo "actividade de glicolipase", como aqui utilizado engloba "actividade de galactolipase".
Adequadamente, uma aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode possuir, pelo menos, uma ou mais das seguintes actividades: actividade de glicolipase (E.C. 3.1.1.26) e/ou actividade de fosfolipase Al (E.C. 3.1.1.32) e/ou actividade de fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4).
Para alguns aspectos, a aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode possuir, pelo menos, actividade de glicolipase (E.C. 3.1.1.26).
Adequadamente, para alguns aspectos, a aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode ser capaz de transferir um grupo acilo de um glicolipido e/ou um fosfolípido para um ou mais dos seguintes substratos aceitadores: um esterol, um estanol, um hidrato de carbono, uma proteína, glicerol. 28
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolipido para um esterol e/ou um estanol para formar, pelo menos, um éster de esterol e/ou um éster de estanol.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolipido para um hidrato de carbono para formar, pelo menos, um éster de hidrato de carbono.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolipido para uma proteína para formar, pelo menos, éster de proteína (ou um condensado de ácido gordo de proteína).
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolipido para glicerol para formar, pelo menos, um diglicérido e/ou um monoglicérido.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, não apresenta actividade de triacilglicerol lipase (E.C. 3.1.1.3) .
Em alguns aspectos, a aciltransferase de lípido pode ser capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um esterol e/ou um estanol. Assim, numa forma de realização o "aceitador de 29 acilo", de acordo com a presente invenção, pode ser um esterol ou um estanol ou uma combinação de ambos um esterol e um estanol.
Numa forma de realização, adequadamente, o esterol e/ou estanol pode compreender uma ou mais das seguintes caracteristicas estruturais: i) um grupo hidroxilo 3-beta ou um grupo hidroxilo 3-alfa; e/ou ii) Anéis A:B na posição eis ou anéis A:B na posição trans ou C5-C6 está insaturado.
Aceitadores de acilo de esterol adequados incluem colesterol e fitoesteróis, por exemplo, alfa-sitosterol, beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, campesterol, 5,6-di-hidrosterol, brassicasterol, alfa-spinasterol, beta-spinasterol, gamaspinasterol, deltaspinasterol, fucosterol, dimosterol, ascosterol, serebisterol, episterol, anasterol, hiposterol, condrilasterol, desmosterol, calinosterol, poriferasterol, clionasterol, glicósidos de glicósidos de esterol e outras formas naturais ou sintéticas isoméricas e derivados.
Num aspecto da presente invenção, adequadamente, mais do que um esterol e/ou estanol pode actuar como o aceitador de acilo, adequadamente mais do que dois esteróis e/ou estanóis podem actuar como o aceitador de acilo. Por outras palavras, num aspecto da presente invenção, adequadamente pode ser produzido mais do que um éster de esterol e/ou éster de estanol. Adequadamente, quando o colesterol é o aceitador de acilo um ou mais outros esteróis ou um ou mais estanóis podem também actuar como o aceitador de acilo. Assim, num aspecto, a presente 30 invenção proporciona um método para a produção in situ de ambos um éster de colesterol e, pelo menos, um esterol ou éster de estanol em combinação. Por outras palavras, a aciltransferase de lipido para alguns aspectos da presente invenção pode transferir um grupo acilo de um lipido para ambos colesterol e, pelo menos, um outro esterol e/ou, pelo menos, um estanol.
Num aspecto, de um modo preferido, o aceitador de acilo de esterol é um ou mais dos seguintes: alfa-sitosterol, beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol e campesterol.
Num aspecto, de um modo preferido, o aceitador de acilo de esterol é colesterol. Quando é o caso de o colesterol ser o aceitador de acilo para a aciltransferase de lipido, a quantidade de colesterol livre no alimento é reduzida em comparação com o alimento antes de exposição à aciltransferase de lipido e/ou em comparação com um alimento equivalente que não tenha sido tratado com a aciltransferase de lipido.
Aceitadores de acilo de estanol adequados incluem fitostanóis, por exemplo, beta-sitostanol ou ss-sitostanol.
Num aspecto, de um modo preferido, o aceitador de acilo de esterol e/ou estanol é um esterol e/ou um estanol diferente de colesterol.
Em alguns aspectos, o alimento preparado, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizado para reduzir o colesterol no soro sanguíneo e/ou para reduzir a lipoproteína de baixa densidade. 0 colesterol no soro sanguíneo e as lipoproteínas de baixa densidade têm sido ambos associados a certas doenças em humanos, tais como aterosclerose e/ou doença cardíaca, por 31 exemplo. Por isso, está contemplado que os alimentos preparados, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados para reduzir o risco dessas doenças.
Assim, num aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de um alimento, de acordo com a presente invenção, para utilização no tratamento e/ou prevenção de aterosclerose e/ou doença cardiaca.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um medicamento compreendendo um alimento de acordo com a presente invenção.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento e/ou apresentação de uma doença num doente humano ou animal, cujo método compreende administrar ao doente uma quantidade eficaz de um alimento de acordo com a presente invenção.
Adequadamente, o "aceitador de acilo" de esterol e/ou estanol pode ser encontrado naturalmente no alimento. Alternativamente, o esterol e/ou o estanol pode ser adicionado ao alimento. Quando é o caso de um esterol e/ou um estanol ser adicionado ao alimento, o esterol e/ou estanol pode ser adicionado antes, simultaneamente com, e/ou após a adição da aciltransferase de lipido de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a presente invenção pode englobar a adição de esteróis/estanóis exógenos, particularmente fitoesteróis/fitostanóis, ao alimento antes de, ou simultaneamente com, a adição da enzima de acordo com a presente invenção. 32
Para alguns aspectos, um ou mais esteróis presentes no alimento podem ser convertidos em um ou mais estanóis antes de, ou ao mesmo tempo que a aciltransferase de lípido é adicionada de acordo com a presente invenção. Pode ser empregue qualquer método adequado para converter esteróis em estanóis. Por exemplo, a conversão pode ser realizada através de hidrogenação quimica, por exemplo. A conversão pode ser realizada antes da adição da aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, ou, simultaneamente, com a adição da aciltransferase de lipido de acordo com a presente invenção. Adequadamente, enzimas para a conversão de esterol em estanóis são ensinadas no documento WO00/061771.
Adequadamente, a presente invenção pode ser empregue para produzir ésteres de fitostanol ín situ num alimento. Os ésteres de fitostanol possuem solubilidade melhorada através de membranas de lipido, biodisponibilidade e benefícios de saúde aumentados (ver, por exemplo, o documento WO92/99640).
Em algumas formas de realização da presente invenção o éster de estanol e/ou o éster de esterol pode ser um aromatizante e/ou um modificador de textura. Nesses casos, a presente invenção engloba a produção in situ de aromatizantes e/ou modificadores de textura.
Para alguns aspectos da presente invenção, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode utilizar um hidrato de carbono como o aceitador de acilo. 0 hidrato de carbono aceitador de acilo pode ser um ou mais dos seguintes: um monossacárido, um dissacárido, um oligossacárido ou um polissacárido., de um modo preferido, o hidrato de carbono é um ou mais dos seguintes: glucose, frutose, anidrofrutose, maltose, 33 lactose, sacarose, galactose, xilose, xilo-oligossacáridos, arabinose, malto-oligossacáridos, tagatose, microtecina, ascopirona P, ascopirona T, cortalcerona.
Adequadamente, o hidrato de carbono "aceitador de acilo" pode ser encontrado naturalmente no alimento. Alternativamente, o hidrato de carbono pode ser adicionado ao alimento. Quando é o caso de o hidrato de carbono ser adicionado ao alimento, o hidrato de carbono pode ser adicionado antes, simultaneamente com, e/ou após a adição de uma aciltransferase de lípido de acordo com a presente invenção.
Os ésteres de hidrato de carbono podem funcionar como emulsificadores valiosos em alimentos. Assim, quando é o caso de a enzima funcionar para transferir o grupo acilo para um açúcar, a invenção engloba a produção de um segundo emulsificador in situ no alimento.
Em algumas formas de realização, a aciltransferase de lipido pode utilizar ambos um esterol e/ou estanol e um hidrato de carbono como um aceitador de acilo. A utilização de aciltransferase de lipido que pode transferir, então, o grupo acilo para um hidrato de carbono assim como para um esterol e/ou um estanol é particularmente vantajosa para alimentos compreendendo ovos. Em particular, a presença de açúcares, em particular glucose, em ovos e produtos com ovo é, frequentemente, encarada como desvantajosa. A gema de ovo pode compreender até 1% de glucose. Tipicamente, o ovo ou produtos à base de ovo podem ser tratados com glucose oxidase para remover alguma ou toda esta glucose. Contudo, de acordo com a presente invenção, este açúcar indesejado pode ser rapidamente 34 removido "esterifiçando" o açúcar para formar um éster de açúcar.
Para alguns aspectos da presente invenção, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode utilizar uma proteina como o aceitador de acilo. Adequadamente, a proteína pode ser uma ou mais das proteínas que se encontram num produto alimentar, por exemplo, num produto lácteo e/ou um produto cárneo. Apenas a título de exemplo, proteínas adequadas podem ser encontradas na coalhada ou soro de leite, tal como lactoglobulina. Outras proteínas adequadas incluem ovalbumina de ovo, gliadina, glutenina, puroindolina, proteínas de transferência de lípido de grãos e miosina da carne.
Assim, de acordo com a presente invenção, pode ser alcançada uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: produção in situ de um emulsificador sem um aumento em ácidos gordos livres; uma redução na acumulação de ácidos gordos livres no alimento; uma redução nos níveis de colesterol livres no alimento; um aumento em ésteres de esterol e/ou ésteres de estanol; uma redução no colesterol no soro sanguíneo e/ou lipoproteínas de baixa densidade; um aumento em ésteres de hidratos de carbono; uma redução em hidratos de carbono livres indesejados.
Uma vantagem da presente invenção é que o(s) emulsificador(es) é/são preparados in situ no alimento sem um aumento, ou um aumento substancial, no teor de ácidos gordos livres do alimento. A produção de ácidos gordos livres pode ser prejudicial para os alimentos. Em particular, os ácidos gordos livres têm sido ligados a odores desagradáveis e/ou aromas desagradáveis nos alimentos, assim como outros efeitos prejudiciais, incluindo um sabor "a ranço" no queijo, por 35 exemplo, de um modo preferido, o método, de acordo com a presente invenção, resulta na preparação in situ de um emulsificador(es) em que a acumulação de ácidos gordos livres é reduzida e/ou eliminada. Sem desejar estar limitado pela teoria, de acordo com a presente invenção, o ácido gordo que é removido do lipido é transferido pela aciltransferase de lipido para um aceitador de acilo, por exemplo, um esterol e/ou um estanol. Assim, o nivel global de ácidos gordos livres no alimento não aumenta, ou aumenta apenas num grau insignificante. Esta é um contraste muito acentuado em relação à situação que ocorre quando são utilizadas lipases (E.C. 3.1.1.x) para produzir emulsificadores in situ. Em particular, a utilização de lipases pode resultar numa quantidade aumentada de ácido gordo livre no alimento, o que pode ser prejudicial. De acordo com a presente invenção, a acumulação de ácidos gordos livres é reduzida e/ou eliminada quando comparada com a quantidade de ácidos gordos livres que teriam sido acumulados tinha sido utilizada uma enzima lipase, em particular uma enzima fosfolipase A, em vez de uma aciltransferase de lipido de acordo com a presente invenção. A utilização de uma aciltransferase de lipido que pode transferir o grupo acilo para um esterol e/ou estanol pode ser particularmente vantajosa para alimentos que compreendem ovos. Em particular, verificou-se que pode ser obtido um produto à base de ovos com propriedades significativamente melhores após tratamento com uma aciltransferase de lipido como aqui definido comparada com produtos à base de ovos tratada com fosfolipase convencional, tal como LipopanF® (Novozymes A/S, Dinamarca), Lecitase Ultra® (Novozymes A/S, Dinamarca) ou Lipomod 22 L de Biocatalysts, por exemplo. 36
De um modo preferido, a enzima aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode ser caracterizada utilizando os seguintes critérios: (i) a enzima possui actividade de acil transferase que pode ser definida como actividade de transferência de éster através da qual a parte acilo de uma ligação éster original de um dador de acilo de lipido é transferida para um aceitador de acilo para formar um novo éster; e (ii) a enzima compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S.
De um modo preferido, X do motivo GDSX é L. Assim, de um modo preferido, a enzima, de acordo com a presente invenção, compreende o motivo de sequência de aminoácidos GSDL. 0 motivo GDSX é compreendido de quatro aminoácidos conservados., de um modo preferido, a serina no motivo é uma serina catalítica de uma enzima aciltransferase de lipido. Adequadamente, a serina do motivo GDSX pode estar numa posição correspondente a Ser-16 na enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila apresentada em Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Abr. 1996, Vol. 178, N° 7, p 2060-2064).
Para determinar se uma proteína possui o motivo GDSX de acordo com a presente invenção, a sequência é, de um modo preferido, comparada com os perfis de modelo de Markov escondido (perfis HMM) da base de dados pfam. 37

Claims (25)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção in situ de um emulsif icador num alimento contendo água, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de aciltransferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M OU S.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que são produzidos, pelo menos, 2 emulsificadores.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a aciltransferase de lípido é uma que é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um ou mais dos aceitadores de acilo que se seguem: um esterol, um estanol, um hidrato de carbono, uma proteína ou uma sua subunidade, glicerol.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que, pelo menos, um dos emulsificadores é um éster de hidrato de carbono.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 2, em que, pelo menos, um dos emulsificadores é um éster de proteína.
  6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que um ou mais de um éster de esterol ou um éster de estanol ou um éster de proteína ou um éster de 1 hidrato de carbono ou um diglicérido ou um monoglicérido é produzido in situ no alimento.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o éster de esterol é um ou mais de éster de alfa-sitosterol, éster beta-sitoesterol, éster de estigmasterol, éster de ergosterol, éster de campesterol ou éster de colesterol.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o éster de estanol é um ou mais de beta-sitostanol ou ss-sitostanol.
  9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a enzima aciltransferase de lípido compreende H-309 ou compreende um resíduo de histidina na posição correspondente a His-309 na sequência de aminoácidos da enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila apresentada na SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32.
  10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a aciltransferase de lípido é obtenível de um organismo de um ou mais dos géneros seguintes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas e Candida.
  11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a aciltransferase de lípido compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 2; (ii) a 2 sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 3; (iii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 4; (iv) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 5; (v) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 6; (vi) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 12, (vii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 20, (viii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 22, (ix) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 24, (x) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 26, (xi) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 28, (xii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 30, (xiii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 32, (xiv) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 34, ou uma sequência de aminoácidos que possui 75% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências apresentada na SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID Nc 1 4, SEQ ID Ν' 5 5 SEQ ID N° 6, SEQ id : N° 12, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 22 SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30 SEQ ID N° 32 OU SEQ ID N° 34.
  12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a aciltransferase de lipido compreende uma sequência de aminoácidos produzida pela expressão de um ou mais das seguintes sequências de nucleótidos: (a) a sequência de nucleótidos como apresentado na SEQ ID N° 7 (ver Figura 9); (b) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 8 (ver Figura 10); 3 (c) a sequência de nucleótidos as apresentada na SEQ ID N° 9 (ver Figura 11); (d) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 10 (ver Figura 12) ; (e) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 11 (ver Figura 13) ; (f) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 13 (ver Figura 15) ; (g) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 21 (ver Figura 17) ; (h) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 23 (ver Figura 19) ; (i) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 25 (ver Figura 21) ; (]) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 27 (ver Figura 23) ; (k) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 29 (ver Figura 25) ; (D a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 31 (ver Figura 27) ; (m) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 33 (ver Figura 29) ; 4 (n) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 35 (ver Figura 31); (o) ou uma sequência de nucleótidos que possui 75% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10 SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 23 SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 31 SEQ ID N° 33 ou SEQ ID N° 35.
  13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o emulsificador é um ou mais dos seguintes: um monoglicérido, uma lisofosfatidilcolina, digalactosilmonoglicérido.
  14. 14. Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento contendo água compreendendo um emulsificador, em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o emulsificador é criado a partir de constituintes do material alimentar por uma aciltransferase de lipido, em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de aciltransferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M OU S.
  15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que, pelo menos, dois emulsificadores são produzidos. 5
  16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que, pelo menos, um dos emulsificadores é um éster de hidrato de carbono.
  17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que, pelo menos, um dos emulsificadores é um éster de proteina.
  18. 18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-15 em que um ou mais de um éster de esterol ou um éster de estanol ou um éster de proteina ou um éster de hidrato de carbono ou um diglicérido ou um monoglicérido é também produzido in situ no alimento.
  19. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o éster de esterol é um ou mais de éster de alfa-sitosterol, éster de beta-sitoesterol, éster de estigmasterol, éster de ergosterol, éster de campesterol ou éster de colesterol.
  20. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o éster de estanol é um ou mais de beta-sitostanol ou ss-sitostanol.
  21. 21. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-20, em que a enzima aciltransferase de lipido compreende H-309 ou compreende um resíduo de histidina na posição correspondente a His-309 numa sequência de aminoácidos da enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila apresentada na SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32.
  22. 22. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-21, em que a aciltransferase de lipido é obtenível de um organismo de um ou mais dos seguintes géneros: Aeromonas, 6 Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, histeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas e Candida.
  23. 23. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-22, em que a aciltransferase de lipido compreende um ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: (i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ id N° 2; (ii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 3; (iii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 4; (iv) a sequência de aminoácidos apresentada na SED ID N° 5; (v) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ id N° 6; (vi) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 12, (vii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 20, (viii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 22, (ix) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 24, (x) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 26, (xi) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 28, (xii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 30, (xiii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 32, (xiv) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 34, ou uma sequência de aminoácidos que possui 75% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID Nc ’ 4, SEQ ID Ν' 3 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID : 12, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 32 ou SEQ ID N° 34. 7 Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-23, em que a aciltransferase de lipido compreende uma sequência de aminoácidos produzida pela expressão de um ou mais das seguintes sequências de nucleótidos: (a) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 7 (ver Figura 9) ; (b) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 8 (ver Figura 10); (c) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 9 (ver Figura 11) ; (d) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 10 (ver Figura 12); (e) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 11 (ver Figura 13); (f) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 13 (ver Figura 15); (g) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 21 (ver Figura 17); (h) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 23 (ver Figura 19); (i) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 25 (ver Figura 21); (j) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 27 (ver Figura 23); (k) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 29 (ver Figura 25); (D a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 31 (ver Figura 27); (m) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 33 (ver Figura 29); (n) a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N° 35 (ver Figura 31); (o) ou uma sequência de nucleótidos que possui 75% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10 SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 23 SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 31 SEQ ID N° 33 ou SEQ ID N° 35.
  24. 25. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-24, em que o emulsificador é um ou mais dos seguintes: um monoglicérido, uma lisofosfatidilcolina, digalactosilmonoglicérido.
  25. 26. Alimento contendo água obtenível pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, em que o alimento 9 compreende a reivindicação aciltransferase de lipido como definido na 1 e um emulsificador. Lisboa, 4 de Janeiro de 2011 10 1/66 Figura 1 SEQ ID N° 1 1 ivafGDSlTd geayygdsdg ggwgagladr 61 ivDalvallP laqslglpnL pPYLsgdflr 121 vlelrqalgl lqellrllpv ldakspdlvt 181 kdnlrqlikr Lrsnngarii vlitlvilnl 241 eavadfneal relaiskled qlrkdglpdv 301 ettkaCCGyQ gryNynrvCG naglcnvtak 361 1 Figura 2 Ltallrlrar prgvdvfnrg isGrtsdGrl GANFAsagAt Ilptsgpfli QvqFkdfksq imiGtHDlit saffgpkste sdrnvsvpef gpIGCIPlkl alalassknv dasgclerln kgadvpyvDl ysifqdldgi qnpsayvyGF acnpssylls flfwDgfHps ekGykavAea SEQ ID N° 2 ssppyyegrf vtqflqkdsf fnlpdlgqnp pqnfglsdqr arsastlnce 1 mkkwfvcllg lvaltvqaad srpafsrivm fgdslsdtgk myskmrgylp 61 sngpvwleql tnefpgltia neaeggptav aynkiswnpk yqvinnldye 121 kpddlvilwv gandylaygw nteqdakrvr daisdaanrm vlngakeill 181 sarsqkwea ashvsayhnq' lllnlarqla ptgmvklfei dkqfaemlrd 241 nacyggsyvw kpfasrsast dsqlsafnpq erlaiagnpl laqavaspma 301 gkmfwdqvhp ttwhaalse paatfiesqy eflah Figura 3 SEQ ID N° 3 1 mkkwfvcllg lialtvqaad trpafsrivm fgdslsdtgk myskmrgylp ssppyyegrf 61 sngpvwleql tkqfpgltia neaeggatav aynkiswnpk yqvynnldye vtqflqkdsf 121 kpddlvilwv gandylaygw nteqdakrvr daisdaanrm vlngakqill fnlpdlgqnp 181 sarsqkwea vshvsayhnk lllnlarqla ptgmvklfei dkqfaemlrd pqnfglsdve 241 npcydggyvw kpfatrsvst drqlsafspq erlaiagnpl laqavaspma rrsasplnce 301 gkmfwdqvhp ttwhaalse raatfietqy eflahg Figura 4 SEQ ID N° 4 1 mpkpalrrvm tatvaavgtl algltdatah aapaqatptl dyvalgdsys agsgvlpvdp 61 anllclrsta nyphviadtt garltdvtcg aaqtadftra qypgvapqld algtgtdlvt 121 ltiggndnst finaitacgt agvlsggkgs pckdrhgtsf ddeieantyp alkeallgvr 181 arapharvaa lgypwitpat adpscflklp laagdvpylr aiqahlndav rraaeetgat 241 yvdfsgvsdg hdaceapgtr wiepllfghs lvpvhpnalg errmaehtmd vlgld 2/66 Figura 5 SEQ ID N° 5 1 mpkpalrrvm tatvaavgtl algltdatah aapaqatptl dyvalgdsys agsgvlpvdp 61 anllclrsta nyphviadtt garltdvtcg aaqtadftra qypgvapqld algtgtdlvt 121 ltiggndnst finaitacgt agvlsggkgs pckdrhgtsf ddeieantyp alkeallgvr 181 arapharvaa lgypwitpat adpscflklp laagdvpylr aigahlndav rraaeetgat 241 yvdfsgvsdg hdaceapgtr wiepllfghs lvpvhpnalg errmaehtmd vlgld Figura 6 SEQ ID N° 6 1 mdyekfllfg dsitefafnt rpiedgkdqy algaalvney trkmdilqrg fkgytsrwal 61 kilpeilkhe snivmatifl gandacsagp qsvplpefld nirqmvslmk syhirpiiig 121 pglvdrekwe kekseeialg yfrtnenfai ysdalaklan eekvpfvaln kafqgeggda 181 wqqlltdglh fsgkgykifh dellkvietf ypqyhpknmq yklkdwrdvl ddgsnims 3/66 Figura 7 Alinhamento da sequência de consenso de pfam00657.6 com P10480 P10480 * - >ivaf GDSITdg................eayygdsdgggwgagladrL iv+fGDSl+d+++ ++ ++ +++++++ +++s+g w ++1 + + 28 IVMFGDSLSDTgkmy skmrgy lps sppY YEGRFSNGP VWLEQLTNEF 74 P10480 tall..rlrarprgvdvfnrgisGrtsdGrlivDalvallFlaqslglpn +1 + ++++++++ +n+ + 75 PGLTiaNEAEGGPTAVAYNKISWNPK------------------------100 P10480 LpPYLsgdflrGANFAsagAtllptsgpfliQvqFJcdfksqvlelrqálg ++ ++ 101 ------------------------------------------YQVINN 106 P10480 llqellrllpvldakspdlvtimiGtNDlitsaffgpkstesdrnvsvpe l++e+ ++1 +++ k+ dlv++++G+ND+ ++ ++ ++++++ 107 LDYEVTQFLQKDSFKPDDLVILWVGANDY--......LAYGWNTEQDAKR 148 P10480 fkdnlrqlikrLrsnngariivlitlvilnlgplGClPlklalalasskn ++d ++++++r+ nga+ ++++nl+ 1G+ P+ 149 VRDAISDAANRMV-LNGAK-----EILLFNLPDLGQNPS-----------181 P10480 vdasgclerlneavadfnealrelaiskledqlrkdglpdvkgadvpyvD ++++ +e + ++a++n++l +la +ql+++g+++++++d ++++ 182 ARSQKWEAASHVSAYHNQLLLNLA-----RQLAPTGMVKLFEIDKQFAE 226 P10480 lysifqdldgiqnpsayv.y....GFe.ttkaCCGyGgr.yNyn.rv.CG + +q+++ + + +a+++++ +++ +++a+++++++ +N+++r+ ++ 227 MLRpPQNFGIiSDQRNACYgGsyvwKPFaSRSASTDSQLSaFNPQeRLalA 276 PI0480 nag. 1. c. nvtakaC. npssyllsf lf wDgf HpsekGykavAeal< - * +++ 1 + ++++a++ +s+ ++++++fwD++Hp+ ++a+ e 277 GNPlIiaQaVASPMAArSASTLNCeGKMFWDQVHPTTWHAAIíSEPA 322 Alinhamento da sequência de consenso de pfam00657.6 com AAG09804 AAG09804 * - >ivafGDSlTdg................eayygdsdgggwgagladrL iv+fGDSl+d+++ ++ ++ +++++++ +++s+g w ++1 + + 28 IVMFGDSLSDTgkmyskmrgylpssppYYEGRFSNGPVWLEQLTKQF 74 AAG09804 tallrlrarprgvdvfnrgisGrtsdGrlivDalvallFlaqslglpnLp +g+++ n + +G+t 75 -.........PGLTIANEAEGGAT-------------------------- 88 AAG09804 PYLsgdflrGANFAsagAtllptsgpfliQvqFkdfksqvlelrqa---- ++++ + ++++ + 89 ............-.......................AVAYNKISWNpkyq 102 AAG09804 ..lgllqellrllpvldakspdlvtimiGtNDlitsaffgpkstesdrnv ++l++e+ ++1 +++ k+ dlv++++G+ND+ ++ ++ ++ 103 vyHNLDYEVTQFLQKDSFKPDDLVlLWVGANDY........LAYGWNTEQ 144 AAG09804 svpefkdnlrqlikrLrsnngariivlitlvilnlgplGClPlklalala ++++++d ++++++r+ nga+ +++++nl+ 1G+ P+ 145 DAKRVRDAl SDAANRMV- LNGAK.....QILLFNLPDLGQNPS....... 181 AAG09804 ssknvdasgclérlneavadfnealrelaiskledqlrkdglpdvkgadv ++++ +e + ++a++n++l +la +ql+++g+++++++d 182----ARSQKWEAVSHVSAYHNKLLLNLA.....RQLAPTGMVKLFEIDK 222 AAG09804 pyvDlysifqdldgiqnpsayv.y... .GFe.ttkaCCGyGgr.yNyn.r +++++ +q+++ + ++ +++++ ++4 t++ +++ +++ + +++r 223 QFAEMLRDPQNFGLSDVENPCYdGgyvwKPFaTRSVSTDRQLSaFSPQeR 272 AAG09804 v. CGnag. 1.c.nvtakaC.npssyll.sflfwDgfHpsekGykavAeal + +++++ 1 + ++++a++ +s ++++++fwD++Hp+ ++a+ e+ 273 LalAGNPlLaQaVASPMARrSASPLNCeGKMFWDQVHPTTWHAALSERA 322 4 / 6 6 AAG09804 Alinhamento da sequência de consenso de pfam00657.6 com NP_631558 NP_631558 * ->ivafGDSlTdgeayygdsdgggwgagladrLtallrlrarprgvdvf +va+GDS ++g +g + +++L + + + ++ + 42 YVALGDSYSAG.........SGVLPVDPANL----LCLRSTANYPHV 75 NP_631558 nrgisGrtsdGrlivD.a.1.vallFlaqslglpnLpPYLsgdflrGANF + ++G++ D + + 4 76 IADTTGAR-----LTDvTcGaAQ--------------------------- 93 NP_631558 AsagAtllptsgpfliQvqFkdfksqvlelrqalgllqellrllpvldak ++ + + + + +4 4+4 94 -----------------------------TADFTRAQYPGVAPQLDALGT 114 WP_631558 SpdlvtimiGtNDl................itsaf fgpkstesdrnvsvp + dlVt+ ÍG+ND ++ + + +++ ++ 4 4k 4+ 4 444 115 GTDLVTLTIGGNDNstfinaitacgtagvlSGGKGSPCKDRHGTSFDDEI 164 NP_631558 efkdn. . lrqlikrLrs. nngariivlitlvilnlg...........plG e 444 144 4 4 43Γ444 4βΓ4 4l 44Í444 444 4 4 G 165 BANTYpaLKEALLGVRArAPHARVAALGYPWITPATadpscflklplAAG 214 HP_6315S8 ClPlklalalassknvdasgclerlneavadfnealrelaiskledqlrk P4 14 44a n a4r a 215 DVPY-...................LRAIOAHLNDAVRRAA----------234 NP_631558 dglpdvkgadvpyvDlysifqdldgiqnpsayvyflPettkaCCGyGgryN 44 4 4yvD4 44 235 ------EETGATYVDFSGVSDG............................250 NP_6315S8 ynrvCGnaglcnvtakaC.npssyll.sflfwDgf...HpsekGykavAe 44aC4 p 444 4 lf 4 4 4 Hp44 G 444Ae al<-* + NP_631558 287 HT 288 Alinhamento da sequência de consenso de pfam00657.6 com CAC42140 CAC42140 * ->ivafGDSlTdgeayygdsdgggwgagladrLtallrlrarprgvdvf 4Va4GDS 44g 4g 4 444L 4 4 4 44 4 42 YVALGDSYSAG---------SGVLPVDPANL----LCLRSTANYPHV 75 CAC42140 nrgisGrtsdGrlivD.a.1.vallFlaqslglpnLpPYLsgdflrGANF 4 44G44 D 4 4 4 76 IADTTGAR.....LTDvTcGaAQ--------------------------- 93 CAC42140 AsagAtllptsgpfliQvgFkdfksqvlelrgalgllqellrllpvldak +++ +4 4 44 444 94.............................TADFTRAQYPGVAPQLDALGT 114 CAC42140 spdlvtimiGtNDl................itsaf fgpkstesdrnvsvp + dlvt4 ÍG4ND ++ 4 4 44 + 44 4 4k 4+4 44+ 115 GTDLVTLTIGGNDNstfinaitacgtagvlSGGKGSPCKDRHGTSFDDEI 1S4 CAC42140 efkdn., lrqlikrLrs. nngariivlitlvilnlg...........plG e 444 I4444 4r444 4ar4 4l 44Í444 444 44 G 165 EANTYpaLKEALLGVRArAPHARVAALGYPWITPATadpscflklplAAG 214 CAC42140 ClPlklalalassknvdasgclerlneavadfnealrelaiskledqlrk P4 14 44a n a4r a 215 DVPY....................LRAIQAHLNDAVRRAA..........234 CAC42140 dglpdvkgadvpyvDlysifqdldgiqnpsayvyGFettkaCCGyGgryN 44 4 4yvD4 44 235------EETGATYVDFSGVSDG............................ 250 CAC42140 ynrvCGnaglcnvtakaC.npssyll.sflfwDgf...HpsekGykavAe 44aC4 p 444 4 lf 4 4 4 Hp44 G 444Ae CAC42140 al<-* + 287 HT 288 5/6 6 Alinhamento da sequência de consenso de pfam00657.6 com P41734 *->ivafGDSlTdg....eayygdsdgggwgagladrLtallrlrarprg P41734 ++fGDS+T+ +++ + + d+ ga+1 + + FLLFGDSITEFafntRPIEDGKDQYALGAALVNEY- +r+ -TRK 43 P41734 P41734 P41734 P41734 P41734 P41734 P41734 vdvfnrgisGrtsdGrlivDalvallFlaqslglpnLpPYLsgdflrGAN +d+ rg++G+t 44 MDILQRGFKGYT...............-...................... 55 FAsagAtllptsgpfliQvqFkdfksqvlelrqalgllqellrllpvlda +r+al++l+e+l+ + 56 ..............................SRWAIiKILPEILKH-----E 70 kspdlvtimiGtNDlitsaifgpkstesdrnvsvpefkdnlrqlikrLrs + + ti++G+ND+ ++ +++ v++pef+dn+rq++++++s 71 SN1VMAT1FLGANDA---------CSAGPQSVPLPEFIDNIRQMVSLMKS 111 nngariivlitlvilnlgplGClPlklalalassknvdasgclerlneav ++++ii++++lv ++ ++ k ++ + + r+ne + 112 YHIRPIIIGPGLVDREKW.............EKEKSEEIALGYFRTNENF 148 adfnealrelaiskledqlrkdglpdvkgadvpyvDlysifqdldgiqnp a + al +la ++ +vp+v l+++fq+ +g++++ 149 AIYSDALAKLA-------- NEEKVPFVALNKAFQQEGGDAWQ 182 sayvyGFettkaCCGyGgryNynrvCGnaglcnvtakaCnpssyllsflf + 1+ 183 Q-------------------- LL 185 wDgfHpsekGykavAealc'- * Dg+H+s kGyk+++++l 186 TDGLHFSGKGYKIFHDEL 203 6/66 Figura 8 sal 1 ΜΚΚΜΡνΟΙίΟίΙΑΙΤνΟΑΑΡΤΚΡΑΡΒΚίνΜΡΟΡΒΙ^ΡΤΰΚΜΥΞΚΜΚΟΐΙ,ΡΒΞΡργΥΕΰΚΡ 60 + + A.hyd 1 MKKWFVCLLGLVALTVQAãDSRPAFSRIVMFGDSÍiSDTGKMYSKMRGYLPSSPPYYEGRF 60 A. sal 61 SNGPVWLEQLTKQFPGLTIANEAEGGATAVAYNKISWNPKYQVINNIíDYEVTQfLQXDSF 120 4·+ + A. hyd 61 SNGPVWLEQLTNEFPGLTIAHEAEGGPTAVAYNKISWNPKYQVINNLDYEVTQFLQKDSF 120 A. sal 121 KPDDLVILWVGAltàYIiAYGVraTEQDAKRVRDAISDAANRMVLNGAKQILLFNLPDLGQNP 180 + A. hyd 121 KPDDLVILVrVGANDYlAYGVOTEQDAKRVRDAISDAANRMVLNGAKEILLFNLPDLGQNP 180 A. sal 181 SARSQKWEAVSHVSAYHNKLLI1NLARQIAPTGMVKI1FEIDKQFAEMLRDPQNFGLSDVE 240 + + ++ A.hyd 181 SARSQKWEAASHVSAYHNQLLLHLARQIjAPTGMVKLFEIDKQFAEMLRDPQNFGLSDQR 240 A. sal 241 NPCYDGGYVWKPFATRSVSTDRQLSAFSPQERIjAIAGNPLLiAQAVASPMARRSASPIjNCE 300 + +++ + + + 4 + + A. hyd 241 NACYGGSYWJKPFASRSASTDSQLSAFNPQERLAIAGNPLLAQAVASPMAARSASTLNCE 300 A. sal 301 GKMFWDQVHPTTWHAALSERAATFIETQYEFLAH 335 4 + A. hyd 301 GKMFWDQVHPTTVVHAALSEPAATFIESQYEFLAH 335 7/6 6 Figura 9 1 ATGAAAAAAT GGTTTGTGTG TTTATTGGGA TTGGTCGCGC TGACAGTTCA GGCAGCCGAC 61 AGCCGTCCCG CCTTCTCCCG GATCGTGATG TTTGGCGACA GCCTCTCCGA TACCGGCMG 121 ATGTACAGCA AGATGCGCGG TTACCTCCCC TCCAGCCCCC CCTACTATGA GGGCCGCTTC 181 TCCAACGGGC CCGTCTGGCT GGAGCAGCTG ACCAACGAGT TCCCGGGCCT GACCATAGCC 241 AACGAGGCGG AAGGCGGACC GACCGCCGTG GCTTACAACA AGATCTCCTG GAATCCCAAG 301 TATCAGGTCA TCAACAACCT GGACTACGAG GTCACCCAGT TCCTGCAAAA AGACAGCTTC 361 AAGCCGGACG atctggtgat cctctgggtc ggcgccaacg actatctggc CTATGGCTGG 421 AACACAGAGC AGGATGCCAA GCGGGTGCGC GACGCCATCA GCGATGCGGC CAACCGCATG 481 GTGCTGAACG GCGCCAAGGA GATACTGCTG TTCAACCTGC CGGATCTGGG CCAGAACCCC 541 TCGGCCCGCA GCCAGAAGGT GGTCGAGGCG GCCAGCCATG TCTCCGCCTA CCACAACOAG 601 CTGCTGCTGA acctggcacg ccagctggct cccaccggca tggtgaagct gttcgagatc 661 GACAAGCAGT TTGCCGAGAT GCTGCGTGAT CCGCAGAACT TCGGCCTGAG CGACCAGAGG 721 AACGCCTGCT ACGGTGGCAG CTATGTATGG AAGCCGTTTG CCTCCCGCAG CGCCAGCACC 781 GACAGCCAGC TCTCCGCCTT CAACCCGCAG GAGCGCCTCG CCATCGCCGG CAACCCGCTG 841 CTGGCCCAGG CCGTCGCCAG CCCCATGGCT GCCCGCAGCG CCAGCACCCT CAACTGTGAG 901 GGCAAGATGT TCTGGGATCA GGTCCACCCC ACCACTGTCG TGCACGCCGC CCTGAGCGAG 961 CCCGCCGCCA CCTTCATCGA GAGCCAGTAC GAGTTCCTCG CCCAC 8/ββ Figura 10 1 ATGAAAAAAT GGTTTGTTTG TTTATTGGGG TTGATCGCGC TGACAGTTCA GGCAGCCGAC 61 ACTCGCCCCG CCTTCTCCCG GATCGTGATG TTCGGCGACA GCCTCTCCGA TACCGGCAAA 121 ATGTACAGCA AGATGCGCGG TTACCTCCCC TCCAGCCCGC CCTACTATGA GGGCCGTTTC 181 TCCAAC3GAC CCGTCTGGCT GGAGCAGCTG ACCAAGCAGT TCCCGGGTCT GACCATCGCC 241 AACGAAGCGG AAGGCGGTGC CACTGCCGTG GCTTACAACA AGATCTCCTG GAATCCCAAG 301 TATCAGGTCT ACAACAACCT GGACTACGAG GTCACCCAGT TCTTGCAGAA AGACAGCTTC 361 AAGCCGGACG ATCTGGTGAT CCTCTGGGTC GGTGCCAATG ACTATCTGGC ATATGGCTGG 421 AATACGGAGC AGGATGCCAA GCGAGTTCGC GATGCCATCA GCGATGCGGC CAACCGCATG 481 GTACTGAACG GTGCCAAGCA GATACTGCTG TTCAACCTGC CGGATCTGGG CCAGAACCCG 541 TCAGCCCGCA GTCAGAAGGT GGTCGAGGCG GTCAGCCATG TCTCCGCCTA TCACAACAAG 601 CTGCTGCTGA ACCTGGCACG CCAGCTGGCC CCCACCGGCA TGGTAAAGCT GTTCGAGATC 661 GACAAGCAAT TTGCCGAGAT GCTGCGTGAT CCGCAGAACT TCGGCCTGAG CGACGTCGAG 721 AACCCCTGCT ACGACGGCGG CTATGTGTGG AAGCCGTTTG CCACCCGCAG CGTCAGCACC 781 GACCGCCAGC TCTCCGCCXT CAGTCCGCAG GAACGCCTCG CCATCGCCGG CAACCCGCTG 841 CTGGCACAGG CCGTTGCCAG TCCTATGGCC CGCCGCAGCG CCAGCCCCCT CAACTGTGAG 901 GGCAAGATGT TCTGGGATCA GGTACACCCG ACCACTGTCG TGCACGCAGC CCTGAGCGAG 961 CGCGCCGCCA CCTTCATCGA GACCCAGTAC GAGTTCCTCG CCCACGGATG A 9 / 6 6 Figura 11 ATGCCGAAGC CTGCCCTTCG CCGTGTCATG GCCCTCGGCC TCACCGACGC CACCGCCCAC GACTACGTCG CCCTCGGCGA CAGCTACAGC GCCAACCTGC TCTGTCTGCG CTCGACGGCC GGCGCCCGCC TCACGGACGT CACCTGCGGC CAGTACCCGG GCGTCGCACC CCAGTTGGAC CTCACCATCG GCGGCAACGA CAACAGCACC GCGGGTGTCC TCAGCGGCGG CAAGGGCAGC GACGACGAGA TCGAGGCCAA CACGTACCCC GCCAGGGCTC CCCACGCCAG GGTGGCGGCT GCCGACCCGT CCTGCTTCCT GAAGCTCCCC GCCATCCAGG CACACCTCAA CGACGCGGTC TACGTGGACT TCTCCGGGGT GTCCGACGGC TGGATCGAAC CGCTGCXCTT CGGGCACAGC GAGCGGCGCA TGGCCGAGCA CACGATGGAC ACCGCGACAG TCGCCGCCGT CGGCACGCTC GCCGCGCCCG CCCAGGCCAC TCCGACCCTG GCCGGCTCCG GCGTCCTGCC CGTCGACCCC AACTACCCCC ACGTCATOGC GGACACGACG GCCGCGCAGA CCGCCGACTT CACGCGGGCC GCGCTCGGCA CCGGCACGGA CCTGGTCACG TTCATCAACG CCATCACGGC CTGCGGCACG CCCTGCAAGG ACAGGCACGG CACCTCCTTC GCGCTCAAGG AGGCGCTGCT CGGCGTCCGC ctcggctacc cgtggatcac cccggccacc ctcgccgccg gtgacgtgcc CTACCTGCGG cggcgggccg ccgaggagac cggagccacc CACGACGCCT GCGAGGCCCC CGGCACCCGC CTCGTTCCCG xccaccccaa cgccctgggc gtcctcggcc tggactga 10/66 Figura 12 TCAGTCCAGG CCGAGGACGT GGGGTGGACG GGAACGAGGC GGCCTCGCAG GCGTCGTGGC CTCCTCGGCG GCCCGCCGGA CACGTCACCG GCGGCGAGGG GATCCACGGG TAGCCGAGAG CAGCGCCTCC TTGAGCGCGG GTGCCTGTCC TTGCAGGGGC CGTGATGGCG TTGATGAAGG CGTGCCGGTG CCGAGCGCGT GTCGGCGGTC TGCGCGGCGC GATGACGTGG GGGTAGTTGG CAGGACGCCG GAGCCGGCGC GGCCTGGGCG GGCGCGGCGT GGCGGCGACT GTCGCGGTCA CCATCGTGTG CTCGGCCATG TGTGCCCGAA GAGCAGCGGT CGTCGGACAC CCCGGAGAAG CCGCGTCGTT GAGGTGTGCC GGAGCTTCAG GAAGCAGGAC CCGCCACCCT GGCGTGGGGA GGTACGTGTT GGCCTCGATC TGCCCTTGCC GCCGCTGAGG TGCTGTTGTC GTTGCCGCCG CCAACTGGGG TGCGACGCCC CGCAGGTGAC GTCCGTGAGG CCGTCGAGCG CAGACAGAGC TGTAGCTGTC GCCGAGGGCG GGGCGGTGGC GTCGGTGAGG TGACACGGCG AAGGGCAGGC CGCCGCTCGC CCAGGGCGTT TCGATCCAGC GGGTGCCGGG TCCACGTAGG TGGCTCCGGT TGGATGGCCC GCAGGTAGGG GGGTCGGCGG TGGCCGGGGT GCCCTGGCGC GGACGCCGAG TCGTCGTCGA AGGAGGTGCC ACACCCGCCG TGCCGCAGGC ATGGTGAGCG TGACCAGGTC GGGTACTGGG CCCGCGTGAA CGGGCGCCCG TCGTGTCCGC AGGTTGGCGG GGTCGACGGG ACGTAGTCCA GGGTCGGAGT COGAGGGCGA GCGTGCCGAC TTCGGCAT 11/66 Figura 13 1 ATGGATTACG AGAAGTTTCT GTTATTTGGG GATTCCATTA CTGAATTTGC TTTTAATACT 61 AGGCCCATTG AAGATGGCAA AGATCAGTAT GCTCTTGGAG CCGCATTAGT CAACGAATAT 121 ACGAGAAAAA TGGATATTCT TCAAAGAGGG TTCAAAGGGT ACACTTCTAG ATGGGCGTTG 181 AAAATACTTC ctgagatttt aaagcatgaa tccaatattg tcatggccac aatatttttg 241 ggtgccaacg atgcatgctc agcaggtccc caaagtgtcc ccctccccga atttatcgat 301 AATATTCGTC AAATGGTATC TTTGATGAAG TCTTACCATA TCCGTCCTAT TATAATAGGA 361 CCGGGGCTAG TAGATAGAGA GAAGTGGGAA AAAGAAAAAT CTGAAGAAAT AGCTCTCGGA 421 TACTTCCGTA CCAACGAGAA CTTTGCCATT TATTCCGATG CCTTAGCAAA ACTAGCCAAT 481 GAGGAAAAAG TTCCCTTCGT GGCTTTGAAT AAGGCGTTTC AACAGGAAGG TGGTGATGCT 541 TGGCAACAAC TGCTAACAGA TGGACTGCAC TTTTCCGGAA AAGGGTACAA AATTTTTCAT 601 GACGAATTAT TGAAGGTCAT TGAGACATTC TACCCCCAAT ATCATCCCAA AAACATGCAG 661 TACAAACTGA AAGATTGGAG AGATGTGCTA GATGATGGAT CTAACATAAT GTCTTGA 12/66 Figura 14 (SEQ ID N° 12) 10 I 20 I 30 | 40 I 50 | 60 I 1 MNLRQWMGAA 1 TAALALGLAA 1 CGGGGTDQSG 1 NPNVAKVQRM 1 WFGDSLSDI 1 GTYTPVAQAV 70 | 80 I 90 I 100 I 110 I 120 I 1 GGGKFTTNPG 1 PIWAETVAAQ 1 LGVTLTPAVM 1 GYATSVQNCP 1 KAGCFDYAQG 1 GSRVTDPNGI 130 I 140 I 150 I 160 I 170 I 180 I 1 GHNGGAGALT 1 YPVQQQLANF 1 YAASNNTFNG 1 NNDWFVLAG 1 SNDIFFWTTA 1 AATSGSGVTP 190 I 200 I 210 I 220 I 230 I 240 I 1 AIATAQVQQA 1 ATDXjVGYVKD 1 MIAKGATQVY 1 VFNLPDSSLT 1 PDGVASGTTG 1 QALLHALVGT 250 I 260 I 270 I 280 I 290 I 300 I 1 FMTTLQSGIiA 310 1 FCSANTLVAS 1 GTSARIIDFN 320 1 GADQSYLFAD 1 AQLTAAIQNG 330 1 GVHPTTAGHR 1 ASFGFANTSA 340 1 LIASMVLARL· 1 RACDATKINA LADNVAH 1 LVPSAGGSSL· 13/66 Figura 15 (SEQ ID N° 13) atgaacctgc gtcaatggat gggcgccgco acggctgccc ttgccttggg cttggccgcg 60 tgcgggggcg gtgggaccga ccagagoggc aatcccaatg tcgccaaggt gcagcgcatg 120 gtggtgttcg gcgacagcct gagcgatatc ggcacctaca cccccgtcgc gcaggcggtg lfiO ggcggoggca agttcaccac caacccgggc ccgatctggg ccgagaccgt ggcogcgcaa 240 ctgggcgtga cgctcacgcc ggcggtgatg ggctacgcca cctccgtgca gaattgcccc 300 aaggccggct gcctcgacta tgcgcagggc ggctcgcgcg tgaccgatcc gaacggcatc 360 ggccacaacg· gcggcgcggg ggcgctgacc tacccggttc agcagcagct cgccaacttc 420 tacgcggcca gcaacaacac attcaacggc aataacgatg tcgtcttcgt gctggccggc 480 agcaacgaca ttttcttctg gaccactgcg gcggccacca gcggctccgg cgtgacgccc 540 gccattgcca cggcccaggt gcagcaggcc gcgacggacc tggtcggcta tgtcaaggac 600 atgatcgcca agggtgcgac gcaggtctac gtgttcaacc tgeccgacag cagcctgacg 660 ccggacggcg tggcaagcgg cacgaccggc caggogctgc tgcacgcgot ggtgggcacg 720 ttcaacacga cgctgcaaag cgggctggcc ggcacctcgg cgcgcatcat cgacttcaac 780 gcacaactga ccgcggcgat ccagaatggc gcctcgttcg gcttcgccaa caccagcgcc 840 cgggcctgcg acgccaccaa gatcaatgcc ctggtgccga gcgccggcgg cagctcgctg 900 ttctgctcgg ccaacacgct ggtggcttcc ggtgcggacc agagctacct gttcgccgac 960 ggcgtgcacc cgaccacggc cggccatcgc ctgatcgcca gcaacgtgct ggcgcgcctg 1020 ccggcggata acgtcgcgea ctga 1044 14/66 Figura 16 (SEQ ID N° 20) 1 migsyvavgd sftegvgdpg pdgafvgwad rlavlladrr pegdftytnl avrgrlldqi 61 vaegvprwg lapdlvsfaa ggndiirpgt dpdevaerfe lavaaltaaa gtvlvttgfd 121 trgvpvlkhl rgkiatyngh vraiadrygc pvldlwslrs vqdrrawdad rlhlspeght 181 rvalragqal glrvpadpdq pwpplpprgt ldvrrddvhw areylvpwig rrlrgessgd 241 hvtakgtlsp daiktriaav a Figura 17 (SEQ ID N° 21) 1 gtgatcgggt cgtacgtggc ggtgggggac agcttcaccg agggcgtcgg cgaccccggc 61 occgacgggg cgttcgtcgg otgggccgac cggotogcog tactgctcgc ggaccggcgc 121 cccgagggcg acttcacgta cacgaacctc gcegtgcgcg gcaggctcct cgaccagatc 181 gtggcggaac aggtcccgcg ggtcgtcgga ctcgcgcocg acctcgtotc gttcgcggcg 241 ggcggcaacg acatcatccg gcocggcacc gatcccgacg aggtcgccga gcggttcgag 301 ctggcggtgg ccgcgctgac cgccgcggcc ggaaccgtcc tggtgaccac cgggttcgac 361 acccgggggg tgcccgtcct caagcacctg cgcggcaaga tcgccacgta caacgggcac 421 gtecgcgeca tcgccgaceg ctacggctgc ccggtgctcg acctgtggtc gctgcggagc 481 gtocaggacc gcagggcgtg ggacgccgac cggctgcaoc tgtcgccgga ggggcacacc 541 cgggtggcgc tgcgcgcggg gcaggccctg ggcctgcgcg tcccggccga ccctgaccag 601 ccctggccgc ccctgccgcc gcgcggcacg ctcgacgtcc ggcgcgacga cgtgcactgg 661 gcgcgcgagt acctggtgcc gtggatcggg cgccggctgc ggggcgagtc gtcgggcgac 721 cacgtgacgg ccaaggggac gctgtcgccg gacgccatca agacgcggat cgcegcggtg 781 gcctga 15/66 Figura 18 (SEQ ID N° 22) 1 mgtnpaytsl vavgdsfteg msdllpdgsy rgwadllatr maarspgfry anlavrgkli 61 ggivdeqvdv aaamgadvit lvgglndtlr pkcdmarvrd lltqaverla phceqlvlmr 121 spgrqgpvle rfrprmealf aviddlagrh gawvdlyga qsladprmwd vdrlhltaeg 1B1 hrrvaeavwq slghepedpe whapipatpp pgwvtrrtad vrfarqhllp wigrrltgrs 241 sgdglpakrp dllpyedpar Figura 19 (SEQ ID N° 23) 1 atgcagacga accccgcgta caccagtctc gtcgccgtcg gcgactcctt caccgagggc 61 atgtcggacc tgctgcccga cggctcctac cgtggctggg ccgacctcct cgccacccgg 121 atggcggccc gctcccccgg cttccggtac gccaacctgg cggtgcgcgg gaagctgatc 191 ggacagatcg tcgacgagca ggtggacgtg gccgccgcca tgggagccga cgtgatcaeg 241 ctggtcggcg ggctcaacga cacgctgcgg cccaagtgcg acatggcccg ggtgcgggac 301 ctgctgaccc aggccgtgga acggctcgcc ccgcactgcg agcagctggt gctgatgcgc 361 agtcccggtc gccagggtcc ggtgotggag cgcttccggc cccgcatgga ggccotgttc 421 gccgtgatcg acgacctggc cgggcggcac ggcgccgtgg tcgtcgacct gtacggggcc 481 cagtcgctgg ccgaccctcg gatgtgggac gtggaccggc tgcacctgac cgccgagggc 541 caccgccggg tcgoggaggc ggtgtggcag tcgctcggcc acgagcccga ggaccccgag 601 tggcacgcgc cgatcccggc gacgccgccg ccggggtggg tgacgcgcag gaccgcggac 661 gtccggttcg cccggcagca cctgctgccc tggataggcc gcaggctgac cgggcgctcg 721 tccggggacg gcctgccggc caagcgcccg gacctgctgc cctacgagga ccccgcacgg 781 tga 16/66 Figura 20 (SEQ ID N° 24) 1 mtrgrdggag apptkhrall aaivtlivai saaiyagasa ddgsrdhalg aggrlprgda 61 apastgawvg awatapaaae pgtettglag rsvrnwhts vggtgaritl snlygqsplt 121 vthasialaa gpdtaaaiad tmrrltfggs arviipaggg vmsdtarlai pyganvlvtt 181 yspipsgpvt yhpqarqtsy ladgdrtadv tavayttptp ywryltaldv lsheadgtw 241 afgdsitdga rsqsdanhrw tdvlaarlhe aagdgrdtpr yswnegisg nrlltsrpgr 301 padnpsglsr fqrdvlertn vkawwlgv ndvlnspela drdailtglr tlvdraharg 361 lrwgatitp fggyggytea retmrgevne eirsgrvfdt wdfdkalrd pydprrmrsd 421 ydsgdhlhpg dkgyarmgav idlaalkgaa pvka Figura 21 (SEQ ID N° 25) 1 atgacccggg gtcgtgacgg gggtgcgggg gcgcocccca ccaagcaccg tgccctgctc 61 gcggcgatcg tcaccctgat agtggcgatc tccgcggcca tataogccgg agcgtccgcg 121 gaçgacggca gcagggacca cgcgctgcag gccggaggcc gtctcccacg aggagacgcc 181 gcccccgcgt ccaccggtgc ctgggtgggc gcctgggcca ccgcaccggc cgcggccgag 241 ccgggcaccg agacgaccgg cctggcgggc cgctccgtgc gcaacgtcgt gcacacctcg 301 gtcggcggca ccggcgcgcg gatcaccctc tcgaacctgt acgggcagtc gccgctgacc 361 gtcacacacg cctcgatcgc cctggccgcc gggcccgaca ccgccgccgc gatcgccgac 421 accatgcgcc ggctcacctt cggcggcagc gcccgggtga tcatcccggc gggcggccag 481 gtgatgagcg acaccgcccg cctcgccatc ccctacgggg cgaacgtcct ggtcaccacg 541 tactceccca tcccgtccgg gccggtgacc taccatccgc aggcccggca gaccagctac 601 ctggccgacg gcgaccgcac ggoggacgtc accgccgtcg cgtacaccac ccccacgccc 661 tactggogct acctgaccgc cctcgacgtg ctgagccacg aggccgacgg cacggtcgtg 721 gcgttcggcg actccatcac cgacggcgcc cgctcgcaga gcgacgccaa ccaccgctgg 781 accgacgtcc tcgccgcacg cctgcacgag gcggcgggcg acggccggga cacgccccgc 841 tacagcgtcg tcaacgaggg catcagcggc aaccggctcc tgaccagcag gccggggcgg 901 ccggccgaca acccgagcgg actgagccgg ttccagcggg acgtgctgga acgcaccaac 961 gtcaaggccg tcgtcgtcgt cctcggcgtc aacgacgtcc tgaacagccc ggaactcgcc 1021 gaccgcgacg ccatcctgac cggcctgcgc accctcgtcg accgggcgca cgcccgggga 1081 ctgcgggtcg tcggcgccac gatcacgccg ttcggcggct acggcggcta caecgaggcc 1141 ogcgagacga tgcggcagga ggtcaacgag gagatccgct ccggccgggt cttcgacacg 1201 gtcgtcgact tcgacaaggc cctgcgcgac ccgtacgacc cgcgccggat gcgctccgac 1261 tacgacagcg gcgaccacct gcaccccggc gacaaggggt acgcgcgcat gggcgcggtc 1321 atcgacctgg ccgcgctgaa gggcgcggcg ccggtcaagg cgtag 17/66 Figura 22 (SEQ ID N° 26) 1 mtsmsrarva rriaagaayg gggiglagaa avglwaevq larrrvgvgt ptrvpnaqgl 61 yggtlptagd pplrlmmlgd staagqgvhr agqtpgalla sglaavaerp vrlgsvaqpg 121 acsddldrqv alvlaepdrv pdicvimvga ndvthrmpat rsvrhlssav rrlrtagaev 181 wgtcpdlgt iervrqplrw larrasrqla aaqtigaveq ggrtvslgdl lgpefaqnpr 241 elfgpdnyhp saegyataam avlpsvcaal glwpadeehp dalrregflp varaaaeaas 301 eagtevaaam ptgprgpwal lkrrrrrrvs eaepsspsgv Figura 23 (SEQ ID N° 27) 1 atgacgagca tgtcgagggc gagggtggcg cggcggatcg cggccggcgc ggcgtacggc 61 ggcggcggca tcggcctggc gggagcggcg gcggtcggtc tggtggtggc cgaggtgcag 121 ctggccagac gcagggtggg ggtgggcacg ccgacocggg tgccgaacgc gcagggactg 181 tacggcggca ccctgcccac ggccggcgac ccgccgctgc ggctgatgat gctgggcgac 241 tccacggccg ccgggcaggg cgtgcaccgg gccgggcaga cgccgggcgc gctgctggcg 301 tccgggctcg cggcggtggc ggagcggceg gtgcggctgg ggtcggtcgc ccagccgggg 361 gcgtgctcgg acgacetgga ccggcaggtg gegetggtgc tcgccgagco ggaccgggtg 421 ccogacatct gcgtgatcat ggtoggcgco aacgacgtca cccaccggat gccggcgacc 481 cgctcggtgc ggcacctgtc ctcggcggta cggcggctgc gcacggccgg tgcggaggtg 541 gtggtcggca cctgtccgga cctgggcacg atcgagcggg tgcggcagcc gctgcgctgg 601 ctggcccggc gggcctcacg gcagctcgcg gcggcacaga ccatcggogc cgtcgagcag 661 ggcgggcgca cggtgtcgct gggcgacctg ctgggtccgg agttcgcgca gaacccgcgg 721 gagctcttcg gccccgacaa ctaccacccc tccgccgagg ggtacgccac ggccgcgatg 781 gcggtactgc octcggtgtg cgccgcgctc ggcctgtggc cggccgacga ggagcacccg 841 gacgcgctgc gccgcgaggg cttcctgceg gtggcgcgcg cggcggcgga ggcggcgtcc 901 gaggcgggta cggaggtcgc egcogocatg cctacggggc ctogggggcc ctgggcgctg 961 ctgaagcgcc ggagacggcg tcgggtgtcg gaggcggaac cgtccagccc gtccggcgtt 1021 tga 18/66 Figura 24 (SEQ ID N° 28) gvagedsvgg dspapsgsps watgssakvd slavrllgka ndacrsttsa mtpvadfraq vwklglcpsm lgdadsldsa fgtdqlshwd wfhpsvdgqa krtrtapawd daaehswnya faeamatlrk atlrrntvrd rlaeiayrav 1 mgrgtdqrtr ygrrrarval aaltaavlgv 61 tspasvaavg dsitrgfdac avlsdcpevs 121 vtgarmadlt aqvtraaqre pelvavmaga 181 klpkaqvyvs sipdlkrlws qgrtnplgkq 241 rvadynevlr evcakdrrcr sddgavhefr 301 taknp Figura 25 (SEQ ID N° 29) 1 atgggtcgag ggacggacca gcggacgcgg tacggccgtc gccgggogcg tgtcgcgctc 61 gccgccctga ccgccgccgt cctgggcgtg ggcgtggcgg gctgcgactc cgtgggcggc 121 gaotcacccg ctccttccgg cagcccgtcg aagcggacga ggacggcgcc cgcctgggac 181 acoagcccgg ogtccgtcgc cgccgtgggc gactccatca cgcgcggctt cgacgcctgt 241 gcggtgctgt cggactgccc ggaggtgtcg tgggcgaccg gcagcagcgc gaaggtcgac 301 tcgctggccg tacggotgct ggggaaggog gaogcggocg agcacagctg gaactacgcg 361 gtcaccgggg cceggatggc ggacctgacc gctcaggtga cgcgggcggc gcagcgcgag 421 ccggagctgg tggcggtgat ggccggggcg aacgacgcgt gccggtocac gacctcggcg 481 atgacgccgg tggcggactt ccgggcgcag ttcgaggagg cgatggccac cctgcgcaag 541 aagctcccca aggcgcaggt gtacgtgtcg agoatoccgg acotcaagcg gotctggtcc 601 cagggccgca ccaacccgct gggcaagcag gtgtggaagc tcggcctgtg cccgtcgatg 661 ctgggcgacg cggactecct ggactcggcg gegaccctgc ggcgcaacac ggtgcgcgac 721 cgggtggcgg actacaacga ggtgctgcgg gaggtctgcg cgaaggaccg gcggtgccgc 781 agcgacgacg gcgcggtgca cgagttccgg ttcggcacgg accagttgag ccactgggac 841 tggttccacc cgagtgtgga cggccaggcc cggctggcgg agatcgccta ccgcgcggcc 901 accgcgaaga atccctga 19/66 Figura 26 (SEQ ID N° 30) 1 mrlsrraata sallltpala lfgasaavsa priqatdyva lgdsyssgvg agsydsssgs 61 ckrstksypa lwaaahtgtr fnftacsgar tgdvlakqlt pvnsgtdlvs itiggndagf 121 adtmttcnlq gesaclaria karayiqqtl paqldqvyda idsrapaaqv wlgyprfyk 181 lggscavgls eksraainaa addinavtak raadhgfafg dvnttfaghe lcsgapwlhs 241 vtlpvensyh ptangqskgy lpvlnsat Figura 27 (SEQ ID N° 31) 1 ttcatcacaa cgatgtcaca acaccggcca tccgggtcat ccctgatcgt gggaatgggt 61 gacaagcctt cccgtgacga aagggtcctg ctacatcaga aatgacagaa atcctgctca 121 gggaggttcc atgagactgt cccgacgcgc ggccacggcg tccgcgctcc tcctcacccc 181 ggcgctcgcg ctcttcggog cgagcgccgc cgtgtccgcg ccgcgaatcc aggccaccga 241 ctaogtggcc ctcggcgact cctactcctc gggggtcggc gcgggcagct acgacagcag 301 cagtggctcc tgtaagcgca gcaccaagtc ctacccggcc ctgtgggccg cctcgcacac 361 cggtacgcgg ttcaacttca ccgcctgttc gggcgcccgc acaggagacg tgctggccaa 421 gcagctgacc ccggtcaact ccggcaccga cctggtcagc attaccatcg gcggcaacga 481 cgcgggcttc gccgacacoa tgaccacctg caacctccag ggcgagagcg cgtgcctggc 541 gcggatcgcc aaggcgcgcg cctacatcca gcagacgctg cccgcccagc tggaccaggt 601 ctacgacgcc atcgacagcc gggcccccgc agcccaggtc gtcgtcctgg gctacccgcg 661 cttctacaag ctgggcggca gctgcgccgt cggtctctcg gagaagtccc gcgcggccat 721 caacgccgec gccgacgaca tcaacgccgt caccgccaag cgcgccgccg accacggctt 781 cgccttcggg gacgtcaaca cgaccttcgo cgggcacgag etgtgctecg gcgccccctg 841 gctgcacago gtcacccttc ccgtggagaa ctcctaccac cccacggcca acggacagtc 901 caagggctac ctgcccgtcc tgaactccgc cacctgatct cgcggctact ccgcccctga 961 cgaagtcccg cccccgggcg gggcttcgcc gtaggtgcgc gtaccgccgt cgcccgtcgc 1021 gccggtggcc ccgccgtacg tgccgccgcc cccggacgcg gtcggttc 20/66 gura 28 (SEQ ID N° 32) 1 MKKVJFVCLLO LVALTVQAAD SRPAFSRIVM FGDSLSDTGK MYSKMRGYLP 51 SSPPYYEGRF SNGPVWLEQL TKQFPGLTIA NEAEGGATAV AYNKISWNPK 101 YQVINNLDYE VTQFLQKDSF KPDDLVILWV GANDYLAYGW NTEQDAKRVR 151 DAISDAANRM VLNGAKQILL FNLPDLGQNP SARSQKWEA VSHVSAYHNQ 201 LLLNLARQLA PTGMVKLFEI DKQFAEMLRD PQNFGLSDVE NPCYDGGYVW 251 KPFATRSVST DRQLSAFSPQ ERLAIAGNPL IíAQAVASPMA RRSASPLNCE 301 GKMFWDQVHP TTWHAALSE RAATFXAHQY EFLAH* 21/66 29 (SEQ ID N° 33) ATGAAAAAAT GGTTTGTGTG TTTATTGGGA TTGGTCGCGC TGACAGTTCA TACTTTTTTA CCAAACACAC AAATAACCCT AACCAGCGCG ACTGTCAAGT GGCAGCCGAC AGTCGCCCCG CCTTTTCCCG GATCGTGATG TTCGGCGACA CCGTCGGCTG TCAGCGGGGC GGAAAAGGGC CTAGCACTAC AAGCCGCTGT GCCTCTCCGA TACCGGCAAA ATGTACAGCA AGATGCGCGG TTACCTCCCC CGGAGAGGCT ATGGCCGTTT TACATGTCGT TCTACGCGCC AATGGAGGGG TCCAGCCCGC CCTACTATGA GGGCCGTTTC TCCAACGGAC CCGTCTGGCT AGGTCGGGCG GGATGATACT CCCGGCAAAG AGGTTGCCTG GGCAGACCGA GGAGCAGCTG ACCAAACAGT TCCCGGGTCT GACCATCGCC AACGAAGCGG CCTCGTCGAC TGGTTTGTCA AGGGCCCAGA CTGGTAGCGG TTGCTTCGCC AAGGCGGTGC CACTGCCGTG GCTTACAACA AGATCTCCTG GAATCCCAAG TTCCGCCACG GTGACGGCAC CGAATGTTGT TCTAGAGGAC CTTAGGGTTC TATCAGGTCA TCAACAACCT GGACTACGAG GTCACCCAGT TCTTGCAGAA ATAGTCCAGT AGTTGTTGGA CCTGATGCTC CAGTGGGTCA AGAACGTCTT AGACAGCTTC AAGCCGGACG ATCTGGTGAT CCTCTGGGTC GGTGCCAATG TCTGTCGAAG TTCGGCCTGC TAGACCACTA GGAGACCCAG CCACGGTTAC ACTATCTGGC CTATGGCTGG AACACGGAGC AGGATGCCAA GCGGGTTCGC TGATAGACCG GAXACCGACC TTGTGCCTCG TCCTACGGTT CGCCCAAGCG GATGCCATCA GCGATGCGGC CAACCGCATG GTACTGAACG GTGCCAAGCA CTACGGTAGT CGCTACGCCG GTTGGCGTAC CATGACTTGC CACGGTTCGT GATACTGCTG TTCAACCTGC CGGATCTGGG CCAGAACCCG TCAGCTCGCA CTATGACGAC AAGTTGGACG GCCTAGACCC GGTCTTGGGC AGTCGAGCGT GTCAGAAGGT GGTCGAGGCG GTCAGCCATG TCTCCGCCTA TCACAACCAG CAGTCTTCCA CCAGCTCCGC CAGTCGGTAC AGAGGCGGAT AGTGTTGGTC CTGCTGCTGA ACCTGGCACG CCAGCTGGCC CCCACCGGCA TGGTAAAGCT GACGACGACT TGGACCGTGC GGTCGACCGG GGGTGGCCGT ACCATTTCGA GTTCGAGATC GACAAGCAAT TTGCCGAGAT GCTGCGTGAT CCGCAGAACT CAAGCTCTAG CTGTTCGTTA AACGGCTCTA CGACGCACTA GGCGTCTTGA TCGGCCTGAG CGACGTCGAG AACCCCTGCT ACGACGGCGG CTATGTGTGG AGCCGGACTC GCTGCAGCTC TTGGGGACGA TGCTGCCGCC GATACACACC AAGCCGTTTG CCACCCGCAG CGTCAGCACC GACCGCCAGC TCTCCGCCTT TTCGGCAAAC GGTGGGCGTC GCAGTCGTGG CTGGCGGTCG AGAGGCGGAA CAGTCCGCAG GAACGCCTCG CCATCGCCGG CAACCCGCTG CTGGCACAGG GTCAGGCGTC CTTGCGGAGC GGTAGCGGCC GTTGGGCGAC GACCGTGTCC CCGTTGCCAG TCCTATGGCC CGCCGCAGCG CCAGCCCCCT CAACTGTGAG GGCAACGGTC AGGATACCGG GCGGCGTCGC GGTCGGGGGA GTTGACACTC GGCAAGATGT TCTGGGATCA GGTACACCCG ACCACTGTCG TGCACGCAGC CCGTTCTACA AGACCCTAGT CCATGTGGGC TGGTGACAGC ACGTGCGTCG CCTGAGCGAG CGCGCCGCCA CCTTCATCGC GAACCAGTAC GAGTTCCTCG GGACTCGCTC GCGCGGCGGT GGAAGTAGCG CTTGGTCATG CTCAAGGAGC CCCAC TGA GGGTG ACT 22/66 Figura 30 (SEQ ID N° 34) 1 MKKWFVCLLG LIALTVQAAD TRPAFSRIVM FGDSLSDTGK MYSKMRGYLP 51 SSPPYYEGRF SNGPVWLEQL TKQFPGLTIA NEAEGGATAV AYNKISWNPK 101 YQVINNLDYE VTQFLQKDSF KPDDLVILWV GANDYLAYGW NTEQDAKRVR 151 DAISDAANRM VLNGAKQILL FNLPDLGQN? SARSQKWEA VSHVSAYHNK 201 LLLNLARQ1A PTGMVKLFEI DKQFAEMLRD PQNFGLSDVE NPCYDGGYVW 251 KPFATRSVST DRQLSAFSPQ ERLAIAGNPL LAQAVASPMA RRSASPLNCE 301 GKMFWDQVHP TTWHAALSE RAATFIETQY EFLAHG* igura 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 901 951 23/66 31 (SEQ ID N° 35) ATGAAAAAAT GGTTTGTTTG TTTATTGGGG TTGATCGCGC TGACAGTTCA TACTTTTTTA CCAAACAAAC AAATAACCCC AACTAGCGCG ACTGTCAAGT GGCAGCCGAC ACTCGCCCCG CCTTCTCCCG GATCGTGATG TTCGGCGACA CCGTCGGCTG TGAGCGGGGC GGAAGAGGGC CTAGCACTAC AAGCCGCTGT GCCTCTCCGA TACCGGCAAA atgtacagca agatgcgcgg ttacctcccc CGGAGAGGCT ATGGCCGTTT TACATGTCGT TCTACGCGCC AATGGAGGGG TCCAGCCCGC CCTACTATGA GGGCCGTTTC TCCAACGGAC CCGTCTGGCT AGGTCGGGCG GGATGATACT CCCGGCAAAG AGGTTGCCTG GGCAGACCGA GGAGCAGCTG ACCAAGCAGT TCCCGGGTCT GACCATCGCC AACGAAGCGG CCTCGTCGAC TGGTTCGTCA AGGGCCCAGA CTGGTAGCGG TTGCTTCGCC AAGGCGGTGC CACTGCCGTG GCTTACAACA AGATCTCCTG GAATCCCAAG TTCCGCCACG GTGACGGCAC CGAATGTTGT TCTAGAGGAC CTTAGGGTTC TATCAGGTCA TCAACAACCT GGACTACGAG GTCACCCAGT TCTTGCAGAA ATAGTCCAGT AGTTGTTGGA cctgatgctc CAGTGGGTCA AGAACGTCTT AGACAGCTTC AAGCCGGACG ATCTGGTGAT CCTCTGGGTC GGTGCCAATG TCTGTCGAAG TTCGGCCTGC TAGACCACTA GGAGACCCAG CCACGGTTAC ACTATCTGGC ATATGGCTGG AATACGGAGC AGGATGCCAA GCGAGTTCGC TGATAGACCG TATACCGACC TTATGCCTCG TCCTACGGTT CGCTCAAGCG GATGCCATCA GCGATGCGGC CAACCGCATG GTACTGAACG GTGCCAAGCA CTACGGTAGT CGCTACGCCG GTTGGCGTAC CATGACTTGC CACGGTTCGT GATACTGCTG TTCAACCTGC CGGATCTGGG CCAGAACCCG TCAGCCCGCA CTATGACGAC AAGTTGGACG GCCTAGACCC GGTCTTGGGC AGTCGGGCGT GTCAGAAGGT GGTCGAGGCG GTCAGCCATG TCTCCGCCTA TCACAACAAG CAGTCTTCCA CCAGCTCCGC CAGTCGGTAC AGAGGCGGAT AGTGTTGTTC CTGCTGCTGA ACCTGGCACG CCAGCTGGCC CCCACCGGCA TGGTAAAGCT GACGACGACT TGGACCGTGC GGTCGACCGG GGGTGGCCGT ACCATTTCGA GTTCGAGATC GACAAGCAAT TTGCCGAGAT GCTGCGTGAT CCGCAGAACT CAAGCTCTAG ctgttcgtta aacggctcta cgacgcacta ggcgtcttga TCGGCCTGAG CGACGTCGAG AACCCCTGCT ACGACGGCGG CTATGTGTGG AGCCGGACTC GCTGCAGCTC TTGGGGACGA TGCTGCCGCC GATACACACC AAGCCGTTTG CCACCCGCAG CGTCAGCACC GACCGCCAGC TCTCCGCCTT TTCGGCAAAC GGTGGGCGTC GCAGTCGTGG CTGGCGGTCG AGAGGCGGAA CAGTCCGCAG GAACGCCTCG CCATCGCCGG CAACCCGCTG CTGGCACAGG GTCAGGCGTC CTTGCGGAGC GGTAGCGGCC GTTGGGCGAC GACCGTGTCC CCGTTGCCAG TCCTATGGCC CGCCGCAGCG CCAGCCCCCT CAACTGTGAG GGCAACGGTC AGGATACCGG GCGGCGTCGC GGTCGGGGGA GTTGACACTC GGCAAGATGT TCTGGGATCA GGTACACCCG ACCACTGTCG TGCACGCAGC CCGTTCTACA agaccctagt ccatgtgggc tggtgacagc acgtgcgtcg cctgagcgag cgcgccgcca ccttcatcga gacccagtac gagttcctcg GGACTCGCTC GCGCGGCGGT GGAAGTAGCT CTGGGTCATG CTCAAGGAGC CCCACGGATG A GGGTGCCTAC T 1001 24/66 Figura 32 satRR.solConsenso satRR.solConsenso satRR»solConsenso satRR.solConsenso satRR.solConsenso sabRR.solConsenso satRR.solConsenso 1 10 20 30 40 50 RDTRPRFSRIVMFGDSLSDTGKMYSKMRGYLPSSPPYYEGRFSH—G QSGNPHVRKVQRHVVFGDSLSDIGT-------YTPVRQRVGGGKFTTNPG ...adnraafqRiVnFGDSLSDiGk.......YIPsaqaygeGrFsn..G 51 60 70 80 90 100 I | PVHLEQLTKQFPGLTIRHEREGGRTRYflYHKISHHPKYQVIHHLDYEVTQ PIMRETVflRQL-GVTLTPflVHGYRTSVQHCPKflGCFDYRQGGSRVTDPHG P!MaEqlaaQl.GITianaaeGgflTaVannkiagnfdYaqgnnrdbttpnq 101 110 120 130 140 150 |--------+----—-—+---------+—-------+------—-1 FLQKDSFKPDDLVILHVGRHDYLRYG—HHTEQDRKRVRDR1SDRRHRHV IGHNGGRGRLTYPVQQQLRNFYRRSHNTFNGNNDVVFVLRGSNDIFFHTT igqndgagaddlp!qqqgRNdYaRsn. *fNg##DakrVraainDaanrnt 151 160 170 180 190 200 | --------+— ----+————+---—---- | LNGRKQILLFNLPDLGQNPSRRSQKVVEflVSHVSRYHNKL-LLHLHRQLR RARTSGSGVTPR1RTRQVQQRRTDLVGYVKDHIRKGRTQVYVFHLPDSSL aaaakqiglf naialaQnqqfias ttlYgeakdh! aaganql * UHLarqla 201 210 220 230 240 250 PTGMVKLFEIDKQFREHLRDPQNFGLSDVENPCYDGGYVHKPFRTRSVST TPDGVflSGTTGQRLLHRLVGTFHTTLQSGLflGTSRRIIDFHRQLTRRIQH ppdgValgeidqalaeaLrdpqNf gLqdgeagcsargidf naqaTaa!qn 251 260 270 280 290 300 I------------------+---------+—-------+---------1 DRQLSRFSPQERLRIRG—HPLLRQRVRSPH—RRRSRSPLHCEGKMFH GflSFGFRHTSRRflCDflTKIHflLVPSflGGSSLFCSRHTLVRSGRDQSYLFfl daqlgaanpqaRaadRg, .NaLlaqRgaSp$.. .Rrrlaapgad#gk$Fa 301 310 320 330 I-------+-----+------1 DQVHPTTVVHRRLSERRRTFIETQYEFLflH DGVHPTTRGHRLIRSNVLflRLLR—DHVflH DqVHPTTagHaaiaeraaariea. * #nlRH 25/66 Figura 33 ▼ Pfam Srimi 38 Scoel 5 scoe2 lo SCoe3 239 Scoe4 75 Sco.e5 65 Ahydl .28 Asall 28 Ahyd2 40 * - >ivafGDSltdggg...............ayygdedgggwgagladrltsla.. rlrargrgvdv YVALGDSYSSGVG.............agSYDSSSGSCKRSTKSYPALWAAS..-----HTGTRF 81 YVAVGDSFTEG- -...............- - VGDPGPDGAFVGWADRLAVLL.. ADRRPEGDFTY 4 7 LVAVGDSFTEG- -...............- -MSDLLPDGSYRGWADLLATRM.. - -AARSPGFRY 50 WAFGDSITDG- -...............ARSQSDANHRWTDVIAARIiHEAA .. GDGRDTPRYSV 283 LMMLGDSTAAG- -.....................QGVHRAGQTPGALLASG.. LAAVAERPVRL 113 VAAVGDSITRGFD.............acAVLSDC PEVS WATGS SAKVDSLAvrLLGKADAAEHS 116 IVMFGDSLSDTGKmyskmrgylpssppyYEGRFSNGPVWLEQLTNEFPGLTiaNEAEGGPTAVA 91 IVMFGDSLSDTGKmyskmrgylpssppyYEGRFSNGPVWLEQLTKQF----..------PGLTI 79 IVMPGDSLSDTGKmyflkmrqylpsBppyYEGRFSNGPVWLEQLTKQFPGLTi aNEAEGGATAVA 103 Pfam fnrgisGrtsdGrlwDarlvatllFlagflGlnlpPYLsgdflrGANFAsagAtllgtslipflni Srimi 82 NFTACSGAR------- 90 Scoel 48 TNLAVRGRL.......................................................... 56 Scoe2 51 ANLAVRGKL........................................................ 59 SCOe3 284 VNEGISGNR............-......-...................................... 292 Scoe4 114 GSVAQPGAC--........................................................ 122 Scoe5 117 WNYAVTGAR...........-.....................-........................ 125 Ahydl 92 YNKISWNPK.......................................................... 100 Asall 80 ANEAE3GAT..............-........................................... 88 Ahyd2 104 YNKISVfNPK............-......-............-................-......-- 112 ▼ Pfam QvqFkdfkskvlelrqa......lgllqellrlvpvldakspdlvtimiGtNDl. · . itvakfgpks Srimi 91......-.........-......- - -TGDVLAKQLTPVNSGTDLVSITIGGNDAgf aDTMTTCNLQG 131 Scoel 57-------------------------LDQIVAEQVPRWGLAFDLVSFAAGGNDI. . .-----1----86 Scoe2 60 .......................--XGQIVDEQVDVAAAMGADVITLVGGLNDT.......... 88 Scoe3 293 -------LLTSRPGRPA......DNPSGLSRFQRDVLERTNVKAVWVLGVNDV.. .........333 SC064 123.......................SDDLDRQVALVLAEPDRVPDICVIMVGANDV. . ........153 Scoe5 126 ..........................MADLTAQVTRAAQREPELVAVMAGANDA. . .....-CR 155 Ahydl 101.............YQVI......NNLDYEVTQFLQKDSFKPDDLVILWVGANDY.. . . .......LA 137 Asall 89......-AVAYNKISWNpkyqvyNNLDYEVTQFLQKDSFKPDlXVILWVGANDY. . .........LA 137 Ahyd2 113-------------YQVI......NMLDYEVTQFLQKDSFKPDDLVILHVGANDY. .........LA 149 Pfam .......tksdrnvsvpef rdnlrklikrLrsangariiilitlvllnlpl...........plGCl Srimi 132 esaclarlAKARAYIQQTLPAQLDQVYDAIDSRAPAA QVWLGYP-........... 176 Scoel 87 ..........RPGTDPDEVAERFELAVAALT-AAAGTVLVTTGFDTRGVP-. ..............125 Scoe2 89 LRPKCDMARVRDLLTQAVERLAPHCEQLVLMRSP- 122 Scoe3 334 LHSPELADRDAILTGLRTLVDRAHARGLRWGATITPFGGYGG-........... 376 Scoe4 154 .......THRMPATRSVRHLSSAVRRLR-TAGAEVWGTCPDLGTIE-..:.............192 ScoeS 156 .......STTSAMTPVADFRAQFEEAMATLR-KKLPKAQVYVSSIPDLKRLwsqgrtnplgkQWIKL· 214 Ahydl 138 .......YGWNTEQDAKRVRDAISDAANRMV-LNGAK-----EILLFNLP-........... 174 Aeall 138 .......YGWNTEQDAKRVRDAISDAANRMV-LNGAK-----QILLFNLP-........... 174 Ahyd2 150 .......YGWNTEQDAKRVRDAISDAANRMV-LNGAK-----QILLFNLP-........... 1B6 Pfam pq.klalalassknvdatgclerlneavadynealrelaei.ek.1.q.aqlrkdglpdlkeanvpy Srimi 177 --.RFYKLGGSCAVGLSEKSRAAINAAADD1NAVTAKRA-.........--ADHGFAF 219 Scoel 126 --.----------------VLKHDRGKIATYNGHVRAIA-.........—DRYGCPV 152 Scoe2 123 .........GRQGPVLERFRPRMEALFAVIDDLA-...........GRHGAW 154 Scoe3 377 - -. YTEARETMRQEVNEEIRSGRVFDTWDFDKALRDPY—------------------412 Scoe4 193 .................-..........RVRQPLRWLaRRaSrQlAAAQTIGAVEQGGRTVSL 227 Scoe5 215 GLcPSMLGDADSLDSAATLRRNTVRDRVADYNEVLREVC--.--.-.AkDRRCRSDDGAVHEFRFGT 273 Ahydl 175 ----DLGQNPSARSQKWEAASHVSAYHNQLLLNLA-RQLAPTGMVKLFEIDKQF 224 Asall 175 ----DLGQNPSARSQKWEAVSHVSAYHNKLLLNLA--.RQLAPTGMVKLFEIDKQF 224 Ahyd2 187 --.----DLGQNPSARSQKWEAVSHVSAYHNQLLLNLA--.RQLAPTGMVKLFEIDKQF 236 Pfam VDlysif qdldgiqnpsayv. y____GFeet. kaCCGyGgr. yNyn. rv. CGnag. 1. ck. vtakaC Srimi 220 GDVNT........................---......,-TFAgHElCSGAPwL.HS.VT----242 Scoel 153 LDLWSLRSVQDRRA------..........---...........-----......166 Scoe2 155 VDLYGAQSLADPRM......---------.---------.---- 168 Seoe3 413 ........................................-----......413 Scoeí 228 GDLLGPEFAQNPREL--------------.---------.---- 242 26/66 - 27S 291 291 303 Scoe5 274 DQL........-.....................................----- Ahydl 225 AEMLRDPQNFGLSDQRNACYgGsyvwKPFASrSASTDSQLSaFNPQeRLalAGNPILaQAvASPMAA Asall 225 AEMLRDPQNFGLSDVENPCYdGgyvwKPFATrSVSTDRQLSaFSPQeRLalAGNPlLaQAvASPMAR Ahyd2 237 AEMLRDPQNFGLSDVENPCYdGgyvwKPFATrSVSTDRQLSaFSFQeRLalAGNPILaQAvASPMAR ▼ Pfam .dassyll.atlfwDgf. HpsekGykavAeal<-* Sriml 243 ........ - -LPVENSyHPTANGQSKGYLPV 263 Scoel 167 ........ - - WDADRL. HLSPEGHTRVALRA 186 Scoe2 169 .-------. - - WDVDRL.HLTAEGHRRVAEAV 188 Scoe3 413 .-DPRRMRsDYDSGDHL.HPGDKGYARMGAVI 441 Scoe4 243 .--FGPDNY.HPSAEGYATAAMAV 262 Scoe5 277 .-------. --SHWDWF.HPSVDGQARLAEIA 296 Ahydl 292 rSASTLNCeGKMFWDQV.HPTTWHAALSEPA 322 Asall 292 rSASPLNCeGKMFWDQV,HPTTWHAALSERA 322 Ahyd2 304 rSASPLNCeGKMFWDQV. HPTTWHAALSERA 334 27/66 Figura 34 T Pfam *->ivafGDsltdggg...............ayygdsdgggwgagladrltsla. .rlrargrgvdv Sriml 3 8 YVALGDSYSSGVG.............agSYDSSSGSCKRSTKSYPALWAAS. .-----HTGTRF 81 Scoel 5 YVAVGDSFTEG- -...............-- VGDPGPDGAFVGWADRLAVLL. .ADRRPEGDFTY 47 Scoe2 10 LVAVGDSFTEG- -...............- -MSDLLPDGSYRGWADLLATRM. . - -AARSPGFRY 50 Ahydl 28 IVMFGDSLSDTGKmyskmrgylpssppyYEGRFSNGPVWLEQLTiJEFPGLTiaNEAEGGPTAVA 91 . Asall 28 IVMFGDSLSDTGKmyskmrgylpssppyYEGRFSNGPVWLEQLTKQF............PGLTI 79 Ahyd2 40 IVMFGDSLSDTGKmyskmrgylps sppyYEGRFSHGPVWLEQLTKQFPGLTi aNEAEGGATAVA 103 Pfam fnrgisGrtsdGrlwDarlvatllFlaqflGlnlpPYLsgdflrGANFAsagAtllgtslipflni Sriffll 82 NFTACSGAR------------------------------------------------------90 Scoel 48 TNLAVRGRL.........................-..................-............. 56 Scoe2 51 ANLAVRGKL....................................-..................... 59 Ahydl 92 YNKISWNPK...........-...............-..............................100 Asall 80 ANEAEGGAT--.................................................-......88 Ahyd2 104 YNKISWNPK.......................................................... 112 Pfam QvqFkdfkskvlelrqa......lgllqellrlvpvldakspdlvtimiGtNDl. ,. xtvakfgpks Sriml 91.......................- - -TGDVLAKQLTPVNSGTDLVSITIGGHDAgfaDTMTTCNLQG 131 Scoel 57 .......................--LDQIVAEQVPRWGLAPDLVSFAAGGNDI. . ......I----86 Scoe2 60 .......................--IGQIVDEQVDVAAAMGADVITLVGGLNDT...----------88 Ahydl 101.............YQVI. .NNLDYEVTQFLQKDSFKPDDLVILWVGAHDY. . . · Asall Ahyd2 89 113 -AVAYNKISWNpkyqvyNNLDYEVTQFLQKDSFKPDDLVILWVGANDY. •.....YQVI......NHLDYEVTQFLQKDS FKPDDLVILWVGAHDY. . . - - -LA 137 --LA 137 -LA 149 .tksdmvsypefrdnlrklikrLreangariiiiitlvllnlplplGCl Pfam 176 125 122 174 174 186 Sriml 132 esaclarlAKARAYlQQTLPAQLDQVYDAIDSRAPAA-----QVWLGYP- Scoel 87 ..........RPGTDPDEVAERFELAVAALT-AAAGTVLVTTGFDTRGVP- SCOe2 89 LRPKCDMARVRDLLTQAVERLAPHCEQLVLMRSP- Ahydl 138 .......YGWMTEQDAKRVRDAISDAANRMV-LNGAK-----EILLFNLP- Asall 138 .......YGWHTEQDAKRVRDAISDAANRMV-LNGAK-----QILLFNLP- Ahyd2 150 .......YGWNTEQDAKRVRDAISDAANRMV - LNGAK-----QILLFMLP- Pfam pqklalalassknvdatgclerlneavadynealrelaeieklqaqlrkdglpdlkeanvpy Sriml 177 --RFYKLGGSCAVGLSEKSRAAINAAADDINAVTAKRA-----------------ADHGFAF 219 Scoel 126 ------------------VLKHLRGKIATYNGHVRAIA.........-.......DRYGCPV 152 Scoe2 123 .............GRQGPVLERFRPRMEALFAVIDDLA.......... GRHGAW 154 Ahydl 175------DLGQNPSARSQKWEAASHVSAYHRQLLLNLA......RQLAPTGMVKLFEIDKQF 224 Asall 175------LLGQNPSARSQKWEAVSHVSAYHNKLLLNLA......RQLAPTGMVKLFEIDKQF 224 Ahyd2 187 ------DLGQNPSARSQKWEAVSHVSAYHNQLLLNLA------RQLAPTGMVKLFEIDKQF 236 Pfam VDlysifqdldgiqnpsayv.y....GFeet.kaCCGyGgr.yNyn.rv.CGnag.l.ck.vtakaC 242 166 168 291 291 303 Sriml 220 GDVNT...............................-TFAgHElCSGAPwL.HS.VT---- Scoel 153 LDLWSLRSVQDRRA..........................----------- Scoe2 155 VDLYGAQSLADPRM..............................-----...... Ahydl 225 AEMLRDPQNFGLSDQRNACYgGsyvwKPFASrSASTDSQLSaFNPQeRLalAGNPlLaQAvASPMAA Asall 225 AEMLRDPQNFGLSDVENPCYdGgyvwKPFATrSVSTDRQLSaFSPQeRLalAGHPILaQAvASPMAR Ahyd2 237 AEMLRDPQHFGLSDVEMPCYdGgyvwKPFATrSVSTDRQLSaFSPQeRLalAGNPILaQAvASPMAR ▼ Pfam .dassyll.atlfwDgf.HpsekGykavAealc-* Sriml 243 ....... - -LPVENSyHPTANGQSKGYLPV 263 Scoel 167 ........ - -WDADRL.HLSPEGHTRVALRA 186 Scoe2 169 --WDVDRL,HLTAEGHRRVAEAV 188 Ahydl 292 rSASTLNCeGKMFWDQV.HPTTWHAALSEPA 322 Asall 292 rSASPLHCeGKMFNDQV.HPTTWHAALSERA 322 Ahyd2 304 rSASPLNCeGKMFWDQV HPTTWHAALSERA 334 66Figura 35 E°°tf IS61SÍ
    29/66 Figura 36
    30/66 31/66 Figura 38
    32/66 Figura 39 Controlos Pos Neg SE His SE His SE His SE His |ΙΜΙΙΙ·ΙΜΐη·ΙΙΜΙΝΙΜΐ·ηΜΜ·Ι·ηΙ·ΜΙ·ΜΙΗΙΙΙΗ·ΜηΜ·Η··ιΜ·ΙΙι·ιι|Μ«ΙΙ··>ΜΙΗΗΙ»Ι·)·<»Ι····« .í'··:··ϊ: ''/***· ‘ ">·~·, ' v 4‘í^ ΐΜΗΐΐΜ··ΐΝ'ιΐΜ··ϊιι<ΐηΜ·<ΜΜ··»Ι·ι·>·ιιιι<··ιιΓΗΐΜ<)ϋη··η««ιύ·Η«Ηΐι<ιι«ι·ιη)»ι··ΐΗΜ< m Enzima de A. hydrophila Enzima de A. salmonicida 33/66 Pi9ura 40 Apâ« (3567,^ Pv«ri (Wf * Pv“r (50W, \ Apa-3 (5113) EC®-' (£638, PSt (4S5lf AP3Iit (40^7^_^
    I j 1 p1"3 1 (1324/ ®3^1 (1Í43) ®PhI (1840/ PvW (1S30, EaS( (2217/ (3703/ ^9ií (2263/ ij Ij*"3 2 (1322/ jjj^I (1322/ j|PV«l (2341/ |“deI (1547, 1 rc motor de Γ7 I ®aI (1585/ 34/66 Figura 41
    Negativo positivo água 35/66 Figura 42 Controlos Positivo negativo 20 °C 30°C
    36/66 Figura 43 A. hvdronhila GCAT controlos pos neg A. sal GCAT
    S'*i#í§tW '···>>&.* 1 " [' J'·?'’ ^ ,V i.v \ '} * v v- '·'.<· · - ·: ♦· v·:· ··' ‘ .. · ·:· ·ν_. . ^ - SE His SE His SE His SE His 37/66 Figura 44 ,y y* c. y Neg Pos Λ •v· 7'.· ; /i' · ’ - 'M \S * ;·^· .·* í'V»<r* riX 7¾¾ vi* - V'-,- .·» · .0 ^ r ·;_( ><· ’í' \’J,\ V C' //Τ' v/te. -Lecitina 60mins Neg Pos >V/^. .-, < >.< ”>‘< λ.<- ? <* '·> ϊ -! · i.· /r-’SS~. i /SvVrv. /c*v : te1 L'v.-v^'^o’· * DGDGóOmins 38/66 Figura 45
    5Osfatidiietánolamina r i -'.i •ir- ·-· ' ' vr. ’ - . ·-·« ·ΐ .v :--:.¾ v . , r .. -¾ . r v - .·· /Λ ·:·; '. · /·*'£ .· . ' · ’ ' : -i -] *.> ? - /1' . r ' ' τπΐ___ JT _ J_ ' j’. /\··' '.'3 /; . -:ί;·% ·' Vj >..v. í ' 1-M, 3 -;·/·. " : v -'~v „* -·:' -=*. h\ -Vj|‘\í:, ' . ' ti' ^ :· ' · / .:· : '-i’ Fosfatidilcolina Lisofosfatidilcolina V V v i
    39/66 Figura 46
    40/66 Figura 47
    Fosfatidilcolina Colesterol
    Lisofosfatidilcolina 41/66 Figura 48 Solvente I de TLC U r · ‘ ‘ ?,·' *'„ . * \ 1..¾ V ' . :i :·. - liV ' ; '.V - b 1 -A '.-v. /f íW;, Éster de colesterol^ Triglicéridàijf ; -l'r : -n-C- rã:: ψ :¾ !·· % •r.4. i ·* / *. Ácidos ; gordos ' ’·' '·</ / S ! i . i. í. i"’ ' -r-l-í- .· ' -:5 ’ .. . ·*. *7 *-·; i- 1 A- 1. - ' · .-· 'i , <' . - V. ír ‘ V- ' Konoglicérido ^ ^ ^ ,,β ' ^ ^ % ^ 6 1 8 9 . ,6 . 7, 8 - 6^- -71. 8 .9- % A 1 h 2 h 4 h 42/66 Figura 4 9
    43/66 Figura 50
    Éster de colesterol Ácido gordo Colesterol Fosfatidilcolina Min. 30 30 60 150 240 15Θ 1560 éster Chi 44/66 Figura 51 TLC de lípidos de gema de ovo tratada com transferase n° 135
    45/66 Figura 52 Lípido de gema de ovo tratada com enzima TLC solv. IV
    Amostra-Tempo 1-30 2-30 3-30 1-60 2-60 3-60 1-120 2-120 3-120 2-15 3-15 46/66 Figura 53 A quantidade de ácido gordo ou éster de colesterol produzido como uma função do tempo
    o FFA T. lanoginosus FFA Transf. #178-9 ▲ Chl.est T. lanoginosus ♦ est.Chl. Transf. #178-9 47/66 Figura 54 Actividade de transferase relativa como % de transferase e hidrolítica
    enzima Ό CD CQ (D aj Ό u aj cu Ό lu H CQ > β H (0 4-> β ϋ 4-) < 48/66 Figura 55 Actividade de transferase para n° 178 como uma função da % de água no ensaio.
    49/66 Figura 56 Actividade de transferase para n° 178 como uma função do tempo de reacção do ensaio 56 f T <D P <D CQ Φ OS d u (tí (L) p m-i -H CQ > d -H OS 4J U U 4J < 53 ; 50 ; 47 ; 44 · 41 t- 30 60 120 Tempo de reacção, Minutos 50/66 Figura 57
    51/66 Figura 58 Análise por GLC de ácido gordo e colesterol
    Minutos ♦ Ácido gordo Éster de colesterol *·ιι·ι i Linear (ácido gordo) *- - - · Linear (éster de colesterol) 52/66 Figura 59 ÍFFA Colesterol ®!píÍ3 Ί · ’ iki «ffi; ί K Sí !%i! ;::; \4fcg' · ;ϊ#·ί ' ϊ,.ί'ί: 4> ,ϊ^ι 4„^·,ί .Ίμ·^- I -,ί t Éster de col, SíSSii^M;;% UA m- •í»i5·^ ;f, y: t, -1**!. - ... 53/66 Figura 60
    54/66 Figura 61
    55/66 Figura 62
    Ο 1 3 56/66 Figura 63 Solv. 1 Solv. TV '.•'•Ésper.· de' esterol· :1 . -J ’Λ' W$' sitostcrol Monogl. Colesterol v· 1 2 ' V" 3 4 r 4 3h -23 h ih 23 h 3 h 23 h 1 -K ' Ϊ1 · * J'X, ; 1 ' ^ J I 2 2 3 3 1 i 3h 23 h 3h 23 h 3 b 23 h 3 h 23 h Figura 64 Éster de esteròl··: I / Triglicérido'.' 57/66 7 ' :¾ - ' -e / ;:/.· ! -··.. . \i; r.·, -.-,/1. . ·., , ; tn4ú3j:L· *«'Λ· W;Ofc*r-»í1: ·*#ί -'*»« 'ifaif •? : zr. ">-# -r ?.' -·. r--,r ,/ -í- v -- • i :y ‘ . i ..··· ,.· ·! .· '.· ·. Ί ! . ,· 1 .: ; V '. ‘ ... ' ‘ - 1 .·' .. :·:ν· -.-7 £ ''.·· .? ··.# /. · (,'?<; -λ : % ! \ ' " 4. /., //-¾ Ácidos gordos-·/.--.-- >i * 4 -V · t. ·. ~ . · “ ··.. , -V; j. ·.·. ·. ;''',rS --‘v ; ,V V. v'V·· 7'·· ;.··“ ,. . / f //-./7-,/ ; 7,- 5' #-/--.-17.7 '7# ;V #;#: .í 7.4® %£ - ,.::./7¾. ..... ··$.. /:.· ·”' ' ?· ·<~ - ·' ‘ * / / ·, * 1 i = - Esteroii / / 7/- / ::,//#7/¾ '.·.$$ ,76.:^^:7/-1 /"£ Ϊ ' ·>.. # :ii / V £ /.#-.:/ 7 '777# £ r^>·' :4':·:ι ':5' .6 1 7 2/ .i/l 77. %·Λ, -/ 7 24b 24b 24b 2<h 24b 24b 58/66 Figura 65
    Éster de esteroí ''já/ )- : XriglieéridoHf;5:;l i 5 ' %# Ácido gordo •:'3' Esterol Monoglicériáò. 5 L 0 % | Horas *,.V$L. Γ 59/66 Figura 66 Λν;· ri;1'5; •*·»^· 'Í 5© II,-; \l . ',V 'i: i?··' 11©#-, i| ;/ ;Z >:‘3 ;.'/ ir- I -¾ ©©'V·© 1 I; I .’ "/ © * © >·:, :χ.·Ύ' .·:!* f ΐ -¾/-/¾ "I; m^... ' ΐ %;© /í .í'-·: 4; - - ' t , „5·; 6- —7: 8- 60/66 67
    Ϊ.Ί·" -I, *' \:f' -ν'?' Λ.:;· :.f,:í«:| mmwí» Ψϊ.\ - --¾ *£:;. &:..>„.* * ;· 7·.:*· ;:^·'·^γ^^.^^^;···^·· A , ·,> 'Vãv¢-¾* -;>*£$.·".·.:,,. ;, ‘· - :,,.¾ ,·:". ,:·, - ,·! ',·/ *' Λ?·*;.'·,;· '; :ί r^r./y^;·, λ: • Ο. '. ·'*: .. -Λ,γ · '..-f '· ·. ' · > <- : * ν,Ύ·'-·^·· · -. .Γ.·;, > '. . · . ·-; ,·'. .·-· · ·'-·.!. · ?'& ·,' :. '% ' è^r^Vf' ^4:0 £ -.'·· ·' Í :“.. - ~·; .·:;, . >. ·,- · ; :,¾ - ' ' ' * ·' Λ -5 "· ν , ^ m :-3 ' "Ιψβ- 61/66 Figura 68 1 1 ", í ·** **>,. 4^ ^ " v , ^ - j Triglicérido /'-Ο Ο ^ ’Ο,.,Ο θ' O .·6 j 1, T T 4 § 6, . Ί $, ,9, 10'’ 11 3 FFA 1# :É' Colesterol * · ’*' Ç Ç p ··· f 3P » f 0¾ 1 2 3 4 5 6 7' 8 9 10 62/66 Pi9Ueã 69 l*c/>
    63/66 Figura 70
    Éster de glucose DGMG 64/66 1 51 101 151 201 251 301 Figura 71 (SEQ ID N° 36) MFKFKKNFLV GLSAALMSIS LFSATASAAS ADSRPAFSRI GKMYSKKRGY LPSSPPYYEG RFSNGPVWLE QLTKQFPGLT AVAYNKISWN PKYQVINNLD YEVTQFLQKD SFKPDDLVIL GWNTEQPAKR VRDAISDAAN RMVLNGAKQI LLFNLPDLGQ EAVSHVSAYH NQLLLNLARQ LAPTGMVKLF EIDKQFAEML VENPCYDGGY VWKPFATRSV STDRQLSAFS PQERLAIAGN MARRSASPLN CEGKMFWDQV HPTTWHAAL SERAATF1AN VMFGDSLSDT IANEAEGGAT WVGAMDYLAY NPSARSQKW RDPQNFGLSD PLLAQAVASP QYEFLAH** 65/66 Figura 72 (SEQ ID N° 54) 1 ATGTTTAAGT TTAAAAAGAA TTTCTTAGTT GGATTATCGG CAGCTTTAAT TACAAATTCA AATTTTTCTT AAAGAATCAA CCTAATAGCC GTCGAAATTA 51 GAGTATTAGC TTGTTTTCGG CAACCGCCTC TGCAGCTAGC GCCGACAGCC CTCATAATCG AACAAAAGCC GTTGGCGGAG ACGTCGATCG CGGCTGTCGG 101 GTCCCGCCTT TTCCCGGATC GTGATGTTCG GCGACAGCCT CTCCGATACC CAGGGCGGAA AAGGGCCTAG CACTACAAGC CGCTGTCGGA GAGGCTATGG 151 GGCAAAATGT ACAGCAAGAT GCGCGGTTAC CTCCCCTCCA GCCCGCCCTA CCGTTTTACA TGTCGTTCTA CGCGCCAATG GAGGGGAGGT CGGGCGGGAT 201 CTATGAGGGC CGTTTCTCCA ACGGACCCGT CTGGCTGGAG CAGCTGACCA GATACTCCCG GCAAAGAGGT TGCCTGGGCA GACCGACCTC GTCGACTGGT 251 AACAGTTCCC GOGTCTGACC ATCGCCAACG AAGCGGAAGG CGGTGCCACT TTGTCAAGGG CCCAGACTGG TAGCGGTTGC TTCGCCTTCC GCCACGGTGA 301 GCCGTGGCTT ACAACAAGAT CTCCTGGAAT CCCAAGTATC AGGTCATCAA CGGCACCGAA TGTTGTTCTA GAGGACCTTA GGGTTCATAG TCCAGTAGTT 351 CAACCTGGAC TACGAGGTCA CCCAGTTCTT GCAGAAAGAC AGCTTCAAGC gttggacctg atgctccagt gggtcaagaa cgtctttctg tcgaagttcg 401 cggacgatct ggtgatcctc tgggtcggtg ccaatgacta tctggcctat gcctgctaga ccactaggag acccagccac ggttactgat agaccggata 451 GGCTGGAACA CGGAGCAGGA TGCCAAGCGG GTTCGCGATG CCATCAGCGA CCGACCTTGT GCCTCGTCCT ACGGTTCGCC CAAGCGCTAC GGTAGTCGCT 501 TGCGGCCAAC CGCATGGTAC TGAACGGTGC CAAGCAGATA CTGCTGTTCA ACGCCGGTTG GCGTACCATG ACTTGCCACG GTTCGTCTAT· GACGACAAGT 551 ACCTGCCGGA TCTGGGCCAG AACCCGTCAG CTCGCAGTCA GAAGGTGGTC TGGACGGCCT AGACCCGGTC TTGGGCAGTC GAGCGTCAGT CTTCCACCAG 601 GAGGCGGTCA GCCATGTCTC CGCCTATCAC AACCAGCTGC TGCTGAACCT CTCCGCCAGT CGGTACAGAG GCGGATAGTG TTGGTCGACG ACGACTTGGA 651 GGCACGCCAG CTGGCCCCCA CCGGCATGGT AAAGCTGTTC GAGATCGACA CCGTGCGGTC GACCGGGGGT GGCCGTACCA TTTCGACAAG CTCTAGCTGT 701 AGCAATTTGC CGAGATGCTG CGTGATCCGC AGAACTTCGG CCTGAGCGAC TCGTTAAACG GCTCTACGAC GCACTAGGCG TCTTGAAGCC GGACTCGCTG 751 GTCGAGAACC CCTGCTACGA CGGCGGCTAT GTGTGGAAGC CGTTTGCCAC CAGCTCTTGG GGACGATGCT GCCGCCGATA CACACCTTCG GCAAACGGTG 801 CCGCAGCGTC AGCACCGACC GCCAGCTCTC CGCCTTCAGT CCGCAGGAAC GGCGTCGCAG TCGTGGCTGG CGGTCGAGAG GCGGAAGTCA GGCGTCCTTG 851 GCCTCGCCAT CGCCGGCAAC CCGCTGCTGG CACAGGCCGT TGCCAGTCCT CGGAGCGGTA GCGGCCGTTG GGCGACGACC GTGTCCGGCA ACGGTCAGGA 901 ATGGCCCGCC GCAGCGCCAG CCCCCTCAAC TGTGAGGGCA AGATGTTCTG TACCGGGCGG CGTCGCGGTC GGGGGAGTTG ACACTCCCGT TCTACAAGAC 951 GGATCAGGTA CACCCGACCA CTGTCGTGCA CGCAGCCCTG AGCGAGCGCG CCTAGTCCAT GTGGGCTGGT GACAGCACGT GCGTCGGGAC TCGCTCGCGC 1001 CCGCCACCTT CATCGCGAAC CAGTACGAGT TCCTCGCCCA CTGATGA GGCGGTGGAA GTAGCGCTTG GTCATGCTCA AGGAGCGGGT GACTACT 6 6 /6 6 Figura 73 !: r y ; * , : 1VK y-H: Éster de esterol de planta Triglicérido ; 1' , ’.t Ρ·Γ/ 7' .I1 ti Diglicérido ·:;.;ί r.· ‘V1 ’i K*· l X Esterol de planta . "yy Monoglícérido RESUMO "MÉTODO PARA A PRODUÇÃO IN SITU DE UM EMULSIFICADOR NUM ALIMENTO" Um método para a produção in situ de um emulsificador num produto alimentar, em que uma aciltransferase de lípido é adicionada ao produto alimentar., de um modo preferido, o emulsificador é produzido sem um aumento ou sem um aumento substancial do conteúdo de ácido gordo livre do produto alimentar., de um modo preferido, a aciltransferase de lipido é uma que é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um ou mais dos seguintes aceitadores de acilo: um esterol, um estanol, um hidrato de carbono, uma proteína ou uma sua subunidade, glicerol., de um modo preferido, em adição a um emulsif icador pode ser produzido um ou mais de um éster de estanol ou de um éster de estanol ou um éster de proteína ou um éster de hidrato de carbono ou um diglicérido ou um monoglicérido. Um ou mais destes podem funcionar como um emulsificador adicional.
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