ES2661213T3 - Método para la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio - Google Patents

Método para la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio Download PDF

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Jørn Dalgaard Mikkelsen
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Abstract

Un método para la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio compuesto de 10-98% de agua, en donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al producto alimenticio, y en donde la lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12.

Description

Método para la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para la producción in situ de un emulsionante dentro de un producto alimenticio mediante el uso de una lípido aciltransferasa.
Antecedentes técnicos
El uso beneficioso de fosfolipasas y lipasas (denominadas enzimas lipolíticas (EC. 3.1.1.x)) usadas en aplicaciones industriales de alimentos y/o piensos se conoce desde hace muchos años.
Por ejemplo, en el documento EP 0585988 se reivindica que la adición de lipasa a masa da como resultado una mejora en el efecto antienvejecimiento. Se sugiere que cuando se añade una lipasa obtenida de Rhizopus arrhizus a la masa, puede mejorar la calidad del pan resultante cuando se usa en combinación con materia grasa/grasa. El documento WO94/04035 enseña que se puede obtener un mejor ablandamiento añadiendo una lipasa a la masa sin la adición de ninguna grasa/aceite adicional a la masa. Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinki, muestra que lipasas exógenas pueden modificar el volumen del pan.
Las enzimas lipolíticas hidrolizan uno o más ácidos grasos de los lípidos presentes en el alimento, lo cual puede dar como resultado la formación de potentes moléculas emulsionantes dentro del producto alimenticio que proporcionan funcionalidad comercialmente valiosa. Las moléculas que contribuyen a las características emulsionantes más significativas son los productos de hidrólisis parcial, tales como moléculas de liso-fosfolípidos, liso-glucolípidos y monoglicéridos. Los productos de hidrólisis de lípidos polares, tales como los liso-fosfolípidos y liso-glucolípidos son particularmente ventajosos. Al hacer pan, dichos emulsionantes obtenidos in situ pueden dar funcionalidad equivalente a los emulsionantes, tales como DATEM.
Sin embargo, la actividad de enzimas lipolíticas también da como resultado la acumulación de ácidos grasos libres, lo que puede conducir a una funcionalidad perjudicial en el producto alimenticio. Esta actividad inherente de las enzimas lipolíticas limita su funcionalidad.
Se han intentado numerosas soluciones a este problema en la técnica. Sin embargo, estas dan como resultado un aumento significativo de ácidos grasos libres en el producto alimenticio, en particular en productos alimenticios con alto contenido de agua, que incluyen, pero no se limitan a masas de pan y yema de huevo.
Las fosfolipasas, en particular la fosfolipasa A2 (E.C.3.1.1.4), se ha usado durante muchos años para el tratamiento de los productos de huevo o basados en huevo (véase el documento US 4.034.124 y Dutihl & Groger 1981 J. Sci. Food Agric. 32, 451-458 por ejemplo). La actividad de la fosfolipasa durante el tratamiento de los productos de huevo o basados en huevo puede mejorar la estabilidad, la estabilidad térmica en el tratamiento con calor tal como la pasteurización y producir un espesamiento sustancial. Los productos basados en huevo pueden incluir, pero no se limitan a pastel, mayonesa, aliños de ensaladas, salsas, helados y similares. El uso de fosfolipasas da como resultado la acumulación de ácidos grasos libres. La acumulación de ácidos grasos libres puede producir un mal sabor significativo. Además, la acumulación de ácidos grasos libres puede dar como resultado una mayor susceptibilidad a la oxidación y por lo tanto dar una menor vida en anaquel, decoloración del producto y alteración de otras características críticas del alimento tales como el sabor y textura. Recientemente, se han comercializado enzimas lipolíticas con especificidad de sustrato más amplia para el tratamiento de productos con yema de huevo y productos alimenticios relacionados. Estas tienen la ventaja de que, a diferencia de la mayoría de las fosfolipasas A2, no proceden de una fuente de mamífero. Sin embargo, producen una acumulación significativa de ácidos grasos libres, no solo debido a la hidrólisis de fosfolípidos, sino también a los triglicéridos.
Como se ha mencionado antes, otro campo donde las lipasas se han usado extensamente es en la industria de la panadería. El uso de fosfolipasas en el horneado de masas viene de principios de la década de 1980. El sustrato para las lipasas en la harina de trigo es 1,5-3% de lípidos de trigo endógenos, que son una mezcla compleja de lípidos polares y no polares. Los lípidos polares se pueden dividir en glucolípidos y fosfolípidos. Estos lípidos están compuestos de glicerol esterificado con dos ácidos grasos y un grupo polar. El grupo polar contribuye a la tensión superficial de estos lípidos. La escisión enzimática de uno de los ácidos grasos en estos lípidos conduce a lípidos con una tensión superficial mucho mayor. Es bien conocido que los emulsionantes, tales como DATEM, con una alta tensión superficial son muy funcionales cuando se añaden a masa.
Sin embargo, el uso de lipasas (E.C. 3.1.1.X) en productos de masas puede tener un impacto perjudicial en la actividad de la levadura y/o un efecto negativo en el volumen del pan. El efecto negativo en el volumen del pan se explica a menudo por la sobredosificación. La sobredosificación puede conducir a una disminución de la elasticidad del gluten lo que produce una masa que es demasiado rígida y por lo tanto da como resultado volúmenes de pan reducidos. Además, o alternativamente, dichas lipasas pueden degradar la materia grasa, aceite o grasa de la leche añadida a la masa, dando como resultado mal sabor en la masa y el producto horneado. La sobredosificación y el mal sabor se han atribuido a la acumulación de ácidos grasos en la masa.
En los documentos EP 1193314, EP 0977869 y también en WO 01/39602, se describía que el uso de enzimas lipolíticas activas sobre glucolípidos era particularmente beneficioso en la elaboración de pan, ya que se encontró que los productos de hidrólisis parcial, los liso-glucolípidos, tenían una funcionalidad emulsionante muy alta, que parece que produce una proporción mayor de función emulsionante positiva comparado con la acumulación perjudicial de ácidos grasos. Sin embargo, también se encontró que las enzimas tenían una actividad no selectiva significativa sobre triglicéridos lo que producía innecesariamente una cantidad alta de ácidos grasos libres.
Se describían los mismos hallazgos en el documento WO 00/32758, que describía variantes de enzimas lipolíticas con actividad potenciada sobre los fosfolípidos y/o glucolípidos, además de variantes que tenían una preferencia por ácidos grasos de cadena larga en lugar de corta. Esta última característica, también descrita en el documento WO 01/39602, se consideró de particular importancia para prevenir el mal sabor asociado con la acumulación de ácidos grasos de cadena corta libres. Sin embargo, se produce una cantidad significativa de ácidos grasos libres.
El problema de la actividad de los triglicéridos superiores se abordaba en el documento WO02/094123, donde se enseña el uso de enzimas lipolíticas activas sobre lípidos polares (es decir, glucolípidos y fosfolípidos) en una masa, pero sustancialmente no activas sobre triglicéridos o 1-monoglicéridos. Sin embargo, se produce una cantidad significativa de ácidos grasos libres.
Algunas enzimas lipolíticas tienen actividad baja o no tienen actividad en la forma liso de los lípidos polares (p. ej., glucolípidos/fosfolípidos). Se ha considerado preferible el uso de dichas enzimas ya que aseguran la acumulación de los lisolípidos muy polares, produciendo una funcionalidad óptima. Sin embargo, los ácidos grasos libres se acumulan. Esta funcionalidad selectiva es característica de enzimas fosfolipasas A2 y las glucolipasas descritas en los documentos EP 0977869, EP 1193314 y WO01/39602. Se han producido enzimas variantes de menor selectividad lipolítica que tienen una menor actividad sobre los lípidos liso polares cuando se comparan con la enzima original (documento WO03/060112). Sin embargo, se produce una cantidad significativa de ácidos grasos libres.
El documento WO00/05396 enseña un procedimiento para preparar un producto alimenticio que comprende un emulsionante, en donde el producto alimenticio se pone en contacto con una enzima de modo que la enzima genera un emulsionante a partir de un éster de ácido graso y se genera un segundo ingrediente funcional a partir de un segundo constituyente. El documento WO00/05396 enseña el uso en particular de una enzima lipasa o esterasa. En ninguna parte del documento WO00/05396 se enseña el uso específico de una lípido aciltransferasa. Además, en productos alimenticios con alto contenido de agua, se enseña en el documento WO00/05396 que el uso de las esterasas y lipasas daría como resultado una acumulación significativa de ácidos grasos libres.
Una desventaja asociada con el uso de lipasas, incluyendo las fosfolipasas y glucolipasas, la puede causar la acumulación de ácidos grasos libres liberados de los lípidos. A lo largo de las últimas dos décadas, el uso de enzimas lipolíticas en productos alimenticios se ha limitado debido al equilibrio entre la acumulación perjudicial de ácidos grasos libres y la producción de los liso-lípidos que proporcionan funcionalidad positiva. Aunque se han intentado numerosas estrategias en la técnica, algunas de las cuales proporcionan mejoras significativas en la funcionalidad, ninguna ha abordado y solucionado el problema fundamental de la técnica, es decir, la acumulación significativa de ácidos grasos libres en productos alimenticios preparados usando enzimas lipolíticas in situ.
La presencia de niveles altos de ácidos grasos libres (AGL) en las materias primas o productos alimenticios en general se reconoce como un defecto de calidad y los procesadores de alimentos y clientes normalmente incluirán un nivel máximo de AGL en las especificaciones del alimento. Los efectos que resultan de niveles en exceso de AGL pueden ser defectos organolépticos y/o funcionales.
Un resultado de la lipolisis es el rancio, con la formación del característico sabor “saponáceo”. Este sabor “saponáceo” es especialmente agudo con ácidos grasos de longitud de cadena intermedia (C8-C12) que, aunque no están presentes en altas concentraciones, pueden ser constituyentes importantes, por ejemplo, de productos lácteos
o aceites vegetales. El defecto organoléptico más común se debe a los efectos combinados de enzimas lipolíticas y procesos de oxidación. Los ácidos grasos insaturados son más susceptibles a la oxidación enzimática cuando no están esterificados que cuando están esterificados en los acil-lípidos.
Los defectos funcionales en alimentos debido a altos niveles de AGL se han reconocido, pero se han explicado menos fácilmente. Sin querer estar limitados por la teoría, la hidrólisis de los lípidos no cambiados a ácidos carboxílicos aumentará la [H+] y producirá grupos carbonilo que se pueden combinar con otros compuestos o iones metálicos. Los ácidos grasos libres también se combinan con proteínas por interacciones hidrófobas y pueden formar complejo con el almidón durante la cocción. Los AGL también pueden interferir con la acción de agentes tensioactivos, tales como lípidos polares y emulsionantes. (Lipid in Cereal Technology, P.J. Barnes, Academic Press 1983.)
El documento WO03/100044 describe una clase de acil transferasas conocidas como PDAT (o ATWAX). Estas enzimas usan un monoglicérido o un diglicérido como la molécula aceptora y fosfatidilcolina (PC) como la molécula donadora para producir los siguientes productos: liso-fosfatidilcolina y triacilglicerol y/o diacilglicerol.
En una realización, la presente invención se refiere a mejoras en la incorporación de proteínas de suero lácteo en productos alimenticios, proporcionando mejores rendimientos sin deteriorar cualidades, tales como la textura, de las composiciones y productos alimenticios.
Las composiciones de queso se preparan típicamente a partir de líquidos lácteos por procedimientos que incluyen tratar el líquido con un agente de coagulación o cuajado. El agente de coagulación puede ser una enzima de cuajado, un ácido o un cultivo bacteriano adecuado, o puede incluir dicho cultivo. La cuajada que resulta en general incorpora caseína transformada, grasas que incluyen grasa de mantequilla natural, y aromatizantes que surgen en especial cuando se usa un cultivo bacteriano. La cuajada se puede separar del suero lácteo líquido, que contiene proteínas solubles no afectadas por la coagulación y por lo tanto no se han incorporado a la cuajada.
Por lo tanto, el suero lácteo es un subproducto de la fabricación en procedimientos comerciales que producen productos alimenticios, tales como quesos. Tradicionalmente, el suero lácteo se desecha como un residuo no usado
o se usa como fertilizante o pienso animal o se procesa en un ingrediente alimentario.
La incapacidad de las proteínas del suero lácteo para ser sustancialmente retenidas en la cuajada es un factor importante que contribuye a una falta de eficacia en la producción convencional de productos lácteos, tales como requesones, y a una reducción en el rendimiento general relacionado con la incorporación de todos los sólidos de proteínas que están presentes en los líquidos lácteos de partida en los requesones resultantes.
Ha habido numerosos intentos de incluir proteínas de suero lácteo en el queso, p. ej., por tratamiento con calor de la leche, tratamiento con calor del suero lácteo o por filtración, tal como ultrafiltración.
También hay varias descripciones sobre el uso de proteasas específicas para inducir la agregación de proteínas del suero lácteo. Se ha mostrado que una serina proteasa derivada de Bacillus licheniformis tiene la capacidad de inducir la agregación de proteínas lácteas (documento US 5.523.237).
Sin embargo, siguen quedando muchas dificultades asociadas con la adición de proteínas del suero lácteo en procedimientos tales como la elaboración de quesos. Por ejemplo, la incorporación de proteínas del suero lácteo en quesos está asociada con un deterioro en el sabor y la sensación en la boca del producto, y además tiende a interferir con el cuajado y posterior procesamiento del producto. Las proteasas que se ha descrito previamente que se pueden añadir a la leche del queso para la hidrólisis de proteínas del suero lácteo producen hidrólisis significativa de las caseínas como describen Madsen, J.S. y Qvist, K.B. (1997) “Hydrolysis of milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acid residues”. J Food Sci. 62, 579-582.
Por lo tanto, son necesarios en la técnica métodos y composiciones que proporcionen la incorporación mejorada de proteína del suero lácteo en productos alimenticios, mientras que mantienen las propiedades organolépticas y otras propiedades deseables. Dicha optimización daría como resultado una mayor eficacia, rendimientos mayores de los productos alimenticios y menores costes de material en general.
Las lipasa:colesterol aciltransferasas se conocen desde hace algún tiempo (véase, por ejemplo, Buckley -Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). En particular, se ha encontrado que las glicerofosfolípido:colesterol aciltransferasas (GCAT), que como la lecitina:colesterol aciltransferasas de plantas y/o mamíferos (LCAT), catalizarán la transferencia de ácidos grasos entre la fosfatidilcolina y el colesterol.
Upton y Buckley (TIBS 20, Mayo 1995 p 178-179) y Brumlik y Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996 p 2060-2064) enseñan una lipasa/aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que tiene la capacidad de llevar a cabo la transferencia de acilo a aceptores de alcohol en medio acuoso.
El documento EP1275711 describe una lipasa/aciltransferasa de Candida parapsilosis.
Hilton S. et al. (Biochemistry (1990) 29: 9072-9078) describe una acil graso-transferasa purificada de líquidos sobrenadantes de cultivo de un mutante de Aeromonas salmonicida que contiene el gen estructural de Aeromonas hydrophila clonado.
Aspectos resumidos de la presente invención
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método de producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio, compuesto de 10-98% de agua, en donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al producto alimenticio, y en donde la lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una lípido aciltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12, para preparar a partir de un material alimenticio un producto alimenticio compuesto de 10-98% de agua que comprende un
emulsionante, en donde el emulsionante es generado in situ a partir de constituyentes del material alimenticio por la lípido aciltransferasa.
En otro aspecto, la presente invención se refiere en general al uso de una composición enzimática de alimento o pienso, que contiene una lípido aciltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12, de acuerdo con los usos y métodos de la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona además un producto alimenticio que comprende 10-98% de agua que se puede obtener por, preferiblemente obtenido por, un método de acuerdo con la presente invención, que comprende una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria y un emulsionante.
Aspectos detallados de la presente invención
La expresión “lípido aciltransferasa” como se usa en la presente memoria, significa una enzima que además de tener actividad de lipasa (clasificada en general como E.C. 3.1.1.x de acuerdo con las Recomendaciones de nomenclatura de enzimas (1992) del Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) también tiene actividad de aciltransferasa (en general clasificada como E.C. 2.3.1.x), de modo que la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a uno o más sustratos aceptores, tales como uno o más de los siguientes: un esterol; un estanol; un hidrato de carbono; una proteína; una subunidad de proteína; glicerol.
Preferiblemente la lípido aciltransferasa para usar en los métodos y/o usos de la presente invención, es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido (como se define en la presente memoria) a uno o más de los siguientes sustratos aceptores de acilo: un esterol, un estanol, un hidrato de carbono, una proteína o subunidades de la misma
o un glicerol.
Para algunos aspectos, el “aceptor de acilo” de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier compuesto que comprende un grupo hidroxi (-OH), tales como por ejemplo, alcoholes polivalentes, incluyendo el glicerol; esteroles; estanoles; hidratos de carbono; hidroxiácidos incluyendo ácidos de frutos, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico y ácido ascórbico; proteínas o una subunidad de las mismas, tales como aminoácidos, hidrolizados de proteínas y péptidos (proteína parcialmente hidrolizada) por ejemplo; y mezclas y derivados de los mismos. Preferiblemente, el “aceptor de acilo” de acuerdo con la presente invención no es agua.
En una realización, el aceptor de acilo preferiblemente no es un monoglicérido y/o un diglicérido.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a un esterol y/o un estanol.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a un hidrato de carbono.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a una proteína o una subunidad de la misma. De forma adecuada, la subunidad de proteína puede ser uno o más de los siguientes: un aminoácido, un hidrolizado de proteína, un péptido, un dipéptido, un oligopéptido, un polipéptido.
De forma adecuada en la proteína o subunidad de proteína, el aceptor de acilo pude ser uno o más de los siguientes constituyentes de la proteína o subunidad de proteína: una serina, una treonina, una tirosina o una cisteína.
Cuando la subunidad de proteína es un aminoácido, adecuadamente el aminoácido puede ser cualquier aminoácido adecuado. Adecuadamente el aminoácido puede ser uno o más de una serina, una treonina, una tirosina o una cisteína, por ejemplo.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a glicerol.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a un hidroxiácido.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a un alcohol polivalente.
En un aspecto, la lípido aciltransferasa puede, además de ser capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a un esterol y/o un estanol, puede ser capaz adicionalmente de transferir el grupo acilo de un lípido a uno o más de los siguientes: un hidrato de carbono, una proteína, una subunidad de proteína, glicerol.
Preferiblemente, el sustrato lipídico sobre el que actúa la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, es uno o más de los siguientes lípidos: un fosfolípido, tal como lecitina, p. ej., fosfatidilcolina, un triglicérido, una cardiolipina, un diglicérido o un glucolípido, tal como digalatosildiglicérido (DGDG), por ejemplo. Este sustrato lipídico se puede denominar en la presente memoria como el “donador de acilo de lípido”. El término lecitina, como se usa en la presente memoria abarca fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina y fosfatidilglicerol.
Para algunos aspectos, preferiblemente el sustrato lipídico sobre el que actúa la lípido aciltransferasa es un fosfolípido, tal como lecitina, por ejemplo, fosfatidilcolina.
Para algunos aspectos, preferiblemente el sustrato lipídico es un glucolípido, tal como por ejemplo DGDG.
Preferiblemente, el sustrato lipídico es un lípido alimentario, es decir, un componente lipídico de un producto alimenticio.
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención no es capaz, o no es sustancialmente capaz, de actuar sobre un triglicérido y/o un 1-monoglicérido y/o 2-monoglicérido.
Adecuadamente, el sustrato lipídico o donador de acilo de lípido puede ser uno o más lípidos presentes en uno o más de los siguientes sustratos: grasas, incluyendo, manteca de cerdo, sebo y grasa de mantequilla, aceites que incluyen aceites extraídos o derivados de aceite de palma, aceite de girasol, aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de maní, aceite de coco y aceite de colza. La lecitina de la soja, colza o yema de huevo también es un sustrato lipídico adecuado. El sustrato lipídico puede ser un lípido de avena u otro material vegetal que contiene galactolípidos.
En un aspecto, el donador de acilo de lípido preferiblemente es lecitina (tal como fosfatidilcolina) en la yema de huevo.
Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido se puede seleccionar de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácido graso de 8 a 22 átomos de carbono.
Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido se puede seleccionar de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácido graso de 16 a 22 átomos de carbono, más preferiblemente de 16 a 20 átomos de carbono.
Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido se puede seleccionar de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácido graso no mayor de 14 carbonos, de forma adecuada de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácido graso de 4 a 14 átomos de carbono, adecuadamente de 4 a 10 carbonos, adecuadamente de 4 a 8 carbonos.
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede presentar una o más de las siguientes actividades de lipasa: actividad de glucolipasa (E.C. 3.1.1.26), actividad de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3), actividad de fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) o actividad de fosfolipasa A1 (E.C. 3.1,1.32). La expresión "actividad de glucolipasa" como se usa en la presente memoria abarca "actividad de galactolipasa".
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede tener una o más de las siguientes actividades: actividad de glucolipasa (E.C. 3.1.1.26) y/o actividad de fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32) y/o actividad de fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4).
Para algunos aspectos, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede tener al menos actividad de glucolipasa (E.C. 3.1.1.26).
Adecuadamente, para algunos aspectos la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de transferir un grupo acilo de un glucolípido y/o un fosfolípido a uno o más de los siguientes sustratos aceptores: un esterol, un estanol, un hidrato de carbono, una proteína, glicerol.
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención es capaz de transferir un grupo acilo de un glucolípido y/o un fosfolípido a un esterol y/o un estanol para formar al menos un éster de esterol y/o un éster de estanol.
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención es capaz de transferir un grupo acilo de un glucolípido y/o un fosfolípido a un hidrato de carbono para formar al menos un éster de hidrato de carbono.
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención es capaz de transferir un grupo acilo de un glucolípido y/o un fosfolípido a una proteína para formar al menos un éster de proteína (o un condensado de proteína y ácido graso).
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención es capaz de transferir un grupo acilo de un glucolípido y/o un fosfolípido a glicerol para formar al menos un diglicérido y/o un monoglicérido.
Para algunos aspectos, preferiblemente la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención no presenta actividad de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3).
En algunos aspectos, la lípido aciltransferasa puede ser capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a un esterol y/o un estanol. Por lo tanto, en una realización, el “aceptor de acilo" de acuerdo con la presente invención puede ser bien un esterol o un estanol o una combinación de tanto un esterol como un estanol.
En una realización, adecuadamente el esterol y/o estanol pueden comprender una o más de las siguientes características estructurales:
i) un grupo 3-beta-hidroxi o un grupo 3-alfa-hidroxi; y/o
ii) los anillos A:B en posición cis, o los anillos A:B en posición trans, o C5-C6 es insaturado.
Los esteroles aceptores de acilo adecuados incluyen colesterol y fitoesteroles, por ejemplo, alfa-sitosterol, betasitosterol, estigmasterol, ergosterol, campesterol, 5,6-dihidrosterol, brasicasterol, alfa-espinasterol, beta-espinasterol, gammaespinasterol, deltaespinasterol, fucosterol, dimosterol, ascosterol, serebisterol, episterol, anasterol, hiposterol, condrilasterol, desmosterol, calinosterol, poriferasterol, clionasterol, glucósidos de esteroles, y otras formas isómeras naturales o sintéticas y derivados.
En un aspecto de la presente invención, adecuadamente más de un esterol y/o estanol pueden actuar como el aceptor de acilo, adecuadamente más de dos esteroles y/o estanoles pueden actuar como el aceptor de acilo. En otras palabras, en un aspecto de la presente invención, se pueden producir más de un éster de esterol y/o éster de estanol. Adecuadamente, cuando el colesterol es el aceptor de acilo, uno o más esteroles adicionales o uno o más estanoles pueden actuar como el aceptor de acilo. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para la producción in situ tanto de un éster de colesterol como al menos un éster de esterol o estanol en combinación. En otras palabras, para algunos aspectos de la presente invención, la lípido aciltransferasa puede transferir un grupo acilo desde un lípido a tanto colesterol como al menos un esterol adicional y/o al menos un estanol.
En un aspecto, preferiblemente el esterol aceptor de acilo es uno o más de los siguientes: alfa-sitosterol, betasitosterol, estigmasterol, ergosterol y campesterol.
En un aspecto, preferiblemente el esterol aceptor de acilo es colesterol. Cuando es el caso que el colesterol es el aceptor de acilo para la lípido aciltransferasa, la cantidad de colesterol libre en el producto alimenticio se reduce comparado con el producto alimenticio antes de la exposición a la lípido aciltransferasa y/o cuando se compara con un producto alimenticio equivalente que no se ha tratado con la lípido aciltransferasa.
Los estanoles aceptores de acilo adecuados incluyen fitoestanoles, por ejemplo beta-sitostanol o ss-sitostanol.
En un aspecto, preferiblemente el esterol y/o estanol aceptor de acilo es un esterol y/o un estanol distinto del colesterol.
El producto alimenticio preparado de acuerdo con la presente invención se puede usar para reducir el colesterol en el suero sanguíneo y/o para reducir las lipoproteínas de baja densidad.
El colesterol del suero sanguíneo y las lipoproteínas de baja densidad se han asociado ambos con algunas enfermedades en seres humanos, tales como la aterosclerosis y/o enfermedades cardiacas, por ejemplo. Por lo tanto, está previsto que los productos alimenticios preparados de acuerdo con la presente invención se puedan usar para reducir el riesgo de dichas enfermedades.
La presente descripción se refiere al uso de un producto alimenticio de acuerdo con la presente invención para usar en el tratamiento y/o prevención de la aterosclerosis y/o enfermedad cardiaca.
La presente descripción se refiere además a un medicamento que comprende un producto alimenticio de acuerdo con la presente invención.
Se describe además en la presente memoria un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad en un paciente humano o animal, cuyo método comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un producto alimenticio de acuerdo con la presente invención.
Adecuadamente, el esterol y/o el estanol “aceptor de acilo” se puede encontrar de forma natural en el producto alimenticio. Alternativamente, el esterol y/o el estanol se pueden añadir antes, simultáneamente con y/o después de la adición de la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención. Adecuadamente, la presente invención puede abarcar la adición de esteroles/estanoles exógenos, en particular fitoesteroles/fitoestanoles, al producto alimenticio antes de o simultáneamente con la adición de la enzima de acuerdo con la presente invención.
Para algunos aspectos, uno o más esteroles presentes en el producto alimenticio se pueden convertir en uno o más estanoles antes o al mismo tiempo que se añade la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención. Se puede usar cualquier método adecuado para convertir esteroles en estanoles. Por ejemplo, la conversión se puede llevar a cabo por hidrogenación química, por ejemplo. La conversión se puede realizar antes de la adición de la adición de la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención o simultáneamente con la adición de la
lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención. De forma adecuada, las enzimas para la conversión de esteroles en estanoles se enseñan en el documento WO00/061771.
Adecuadamente, la presente invención se puede usar para producir ésteres de fitoestanol in situ en un producto alimenticio. Los ésteres de fitoestanol tienen mayor solubilidad a través de las membranas lipídicas, biodisponibilidad y mayores beneficios para la salud (véase, por ejemplo, el documento WO92/99640).
En algunas realizaciones de la presente invención el éster de estanol y/o el éster de esterol pueden ser un agente aromatizante y/o un texturizador. En cuyos casos, la presente invención abarca la producción in situ de agentes de sabor y/o texturizadores.
Para algunos aspectos de la presente invención, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede usar un hidrato de carbono como el aceptor de acilo. El hidrato de carbono aceptor de acilo puede ser uno o más de los siguientes: un monosacárido, un disacárido, un oligosacárido o un polisacárido. Preferiblemente, el hidrato de carbono es uno o más de los siguientes: glucosa, fructosa, anhidrofructosa, maltosa, lactosa, sacarosa, galactosa, xilosa, xilooligosacáridos, arabinosa, maltooligosacáridos, tagatosa, microtecina, ascopirona P, ascopirona T, cortalcerona.
Adecuadamente, el hidrato de carbono “aceptor de acilo” se puede encontrar de forma natural dentro del producto alimenticio. Alternativamente, se puede añadir el hidrato de carbono al producto alimenticio. Cuando es el caso en que se añade el hidrato de carbono al producto alimenticio, el hidrato de carbono se puede añadir antes, simultáneamente con y/o después de la adición de la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención.
Los ésteres de hidratos de carbono pueden funcionar como emulsionantes valiosos en productos alimenticios. Por lo tanto, cuando es el caso en que la enzima funciona para transferir el grupo acilo a un azúcar, la invención abarca la producción de un segundo emulsionante in situ en el producto alimenticio.
En algunas realizaciones, la lípido aciltransferasa puede usar tanto esterol como/o estanol y un hidrato de carbono como un aceptor de acilo.
El uso de la lípido aciltransferasa que puede transferir el grupo acilo a un hidrato de carbono así como a un esterol y/o un estanol, es particularmente ventajoso para productos alimenticios que comprenden huevos. En particular, la presencia de azúcares, en particular de glucosa, en huevos y productos de huevo, se ve a menudo como una desventaja. La yema de huevo puede comprender hasta 1% de glucosa. Típicamente los productos de huevo o basados en huevo se pueden tratar con glucosa oxidasa para eliminar algo o toda esta glucosa. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención este azúcar no deseado se puede eliminar fácilmente por “esterificación” del azúcar para formar un éster de azúcar.
Para algunos aspectos de la presente invención, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede usar una proteína como el aceptor de acilo. Adecuadamente, la proteína puede ser una o más de las proteínas encontradas en un producto alimentario, por ejemplo, en un producto lácteo y/o un producto de carne. A modo de ejemplo solo, pueden ser proteínas adecuadas las encontradas en la cuajada o suero lácteo, tales como la lactoglobulina. Otras proteínas adecuadas incluyen la ovoalbúmina de huevo, gliadina, glutenina, puroindolina, proteínas de transferencia de lípidos desde los granos, y miosina de la carne.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se pueden lograr una o más de las siguientes propiedades ventajosas: producción in situ de un emulsionante sin un aumento de ácidos grasos libres; una reducción en la acumulación de ácidos grasos libres en el producto alimenticio; una reducción de los niveles de colesterol libre en el producto alimenticio; un aumento de ésteres de esteroles y/o ésteres de estanoles; una reducción en el colesterol del suero sanguíneo y/o lipoproteínas de baja densidad; un aumento de ésteres de hidratos de carbono; una reducción de hidratos de carbono libres no deseados.
Una ventaja de la presente invención es que el o los emulsionantes se preparan in situ en el producto alimenticio sin un aumento, o un aumento sustancial, del contenido de ácidos grasos libres del producto alimenticio. La producción de ácidos grasos libres puede ser perjudicial para los productos alimenticios. En particular, los ácidos grasos libres se han conectado con malos olores y/o malos sabores en productos alimenticios, así como otros efectos perjudiciales, que incluyen un sabor saponáceo en el queso, por ejemplo. Preferiblemente, el método de acuerdo con la presente invención produce en la preparación in situ un emulsionante(s) en donde la acumulación de ácidos grasos libres se reduce y/o elimina. Sin querer estar limitados por la teoría, de acuerdo con la presente invención, el ácido graso que se elimina del lípido es transferido por la lípido aciltransferasa a un aceptor de acilo, por ejemplo, un esterol y/o un estanol. Por lo tanto, el nivel general de ácidos grasos libres en el producto alimenticio no aumenta o aumenta solo en un grado insignificante. Esto está en fuerte contraposición con la situación en la que se usan lipasas (E.C. 3.1.1.x) para producir emulsionantes in situ. En particular, el uso de lipasas puede dar como resultado una mayor cantidad de ácidos grasos libres en el producto alimenticio, lo cual puede ser perjudicial. De acuerdo con la presente invención, la acumulación de ácidos grasos libres se reduce y/o elimina cuando se compara con la cantidad de ácidos grasos libres que se habrían acumulado si se usara una enzima lipasa, en particular una enzima fosfolipasa A, en lugar de la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención.
El uso de una lípido aciltransferasa que puede transferir el grupo acilo de un esterol y/o estanol, puede ser particularmente ventajoso para productos alimenticios que comprenden huevo. En particular, se ha encontrado que se puede obtener un producto basado en huevo con propiedades significativamente mejores siguiendo el tratamiento con una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria, comparado con productos basados en huevo tratados con fosfolipasas convencionales, tales como LipopanF® (Novozymes A/S, Dinamarca)), Lecitase Ultra® (Novozymes A/S, Dinamarca) o Lipomod 22 L de Biocatalysts, por ejemplo.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención se puede caracterizar usando los siguientes criterios:
(i)
la enzima tiene actividad de aciltransferasa que se puede definir como actividad de transferencia de éster, de modo que la parte acilo de un enlace éster original de un donador de acilo de lípido se transfiere a un aceptor de acilo para formar un nuevo éster; y
(ii)
la enzima comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, en donde X es uno o más de los siguientes restos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
Preferiblemente, X del motivo GDSX es L. Por lo tanto, preferiblemente la enzima de acuerdo con la presente invención comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GSDL.
El motivo GDSX está compuesto de cuatro aminoácidos conservados. Preferiblemente, la serina dentro del motivo es una serina catalítica de la enzima lípido aciltransferasa. De forma adecuada, la serina del motivo GDSX puede estar en una posición que corresponde a la Ser-16 en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila que se enseña en Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064).
Para determinar si una proteína tiene el motivo GDSX de acuerdo con la presente invención, la secuencia se compara preferiblemente con los perfiles del modelo oculto de Márkov (perfiles HMM) de la base de datos Pfam.
Pfam es una base de datos de familias de dominios de proteínas. Pfam contiene alineamientos múltiples de secuencias curados para cada familia, así como perfiles de modelos ocultos de Márkov (perfiles de HMM) para identificar estos dominios en nuevas secuencias. Se puede encontrar una introducción a Pfam en Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280. Los modelos ocultos de Márkov se usan en una serie de bases de datos que se dirigen a la clasificación de proteínas, para una revisión véase Bateman A y Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids =12230032&dopt=Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids =11752314&dopt=Abstract
Para una explicación detallada de los modelos ocultos de Márkov y como se aplican en las bases de datos Pfam, véase Durbin R, Eddy S, y Krogh A (1998) “Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids”. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. El paquete de programas Hammer se puede obtener de la Washington University, St Louis, EE.UU.
Alternativamente, el motivo GDSX se puede identificar usando el paquete de programas Hammer, las instrucciones se proporcionan en Durbin R, Eddy S, y Krogh A (1998) “Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids”. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4, y referencias citadas en el mismo, y se proporciona el perfil HMMER2 dentro de esta memoria descriptiva.
Se puede acceder a base de datos PFAM, por ejemplo, por varios servidores que están actualmente localizados en los siguientes sitios de internet.
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
La base de datos ofrece un centro de búsqueda donde se puede introducir una secuencia de proteína. Usando los parámetros por defecto de la base de datos, se analizará entonces en la secuencia de proteína la presencia de dominios Pfam. El dominio GDSX es un dominio establecido en la base de datos, y como tal se reconocerá su presencia de cualquier secuencia consultada. La base de datos devolverá el alineamiento de la secuencia de consenso Pfam00657 a la secuencia consultada.
Un alineamiento múltiple, que incluye Aeromonas salmonicida o Aeramonas hydrophila, se puede obtener:
a) de forma manual
se obtiene un alineamiento de la proteína de interés con la secuencia de consenso Pfam00657 y se obtiene un alineamiento de P10480 con la secuencia de consenso Pfam00657 siguiendo el procedimiento descrito antes;
o
b) por la base de datos
después de identificar la secuencia de consenso Pfam00657, la base de datos ofrece la opción de mostrar un alineamiento de la secuencia consultada con el alineamiento semilla de la secuencia de consenso Pfam00657. P10480 es parte de este alineamiento semilla y se indica por GCAT_AERHY. Tanto la secuencia consultada como P10480 se presentarán en la misma ventana.
La secuencia de referencia de Aeromonas hydrophila:
Los restos de la lipasa GDSX de Aeromonas hydrophila están numerados en el fichero de NCBI P10480, los números en este texto se refieren a los números dados en este fichero que en la presente invención se usa para determinar los restos de aminoácidos específicos que, en una realización preferida, están presentes en las enzimas lípido aciltransferasas de la invención.
Se llevó a cabo el alineamiento Pfam (figura 33 y 34):
Se pueden reconocer los siguientes restos conservados y en una realización preferida pueden estar presentes en las enzimas para usar en las composiciones y métodos de la invención:
Bloque 1 -bloque GDSX
Bloque 2 -bloque GANDY
Bloque 3 -bloque HPT
Donde “hid” significa un resto hidrófobo seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa para usar en las composiciones/métodos de la invención, se puede alinear usando la secuencia de consenso Pfam00657.
Preferiblemente, una correspondencia positiva con el perfil del modelo oculto de Márkov (perfil HMM) de la familia de dominios Pfam00657 indica la presencia del dominio GDSL o GDSX de acuerdo con la presente invención.
Preferiblemente, cuando se alinea con la secuencia de consenso Pfam00657, la lípido aciltransferasa para usar en las composiciones/métodos de la invención tiene al menos uno, preferiblemente más de uno, preferiblemente más de dos de los siguientes: un bloque GDSx, un bloque GANDY, un bloque HPT. Adecuadamente la lípido aciltransferasa puede tener un bloque GDSx y un bloque GANDY. Alternativamente, la enzima puede tener un bloque GDSx y un bloque HPT. Preferiblemente, la enzima comprende al menos un bloque GDSx.
Preferiblemente, cuando se alinea con la secuencia de consenso Pfam00657, la enzima para usar en las composiciones/métodos de la invención tiene al menos uno, preferiblemente más de uno, preferiblemente más de dos, preferiblemente más de tres, preferiblemente más de cuatro, preferiblemente más de cinco, preferiblemente más de seis, preferiblemente más de siete, preferiblemente más de ocho, preferiblemente más de nueve, preferiblemente más de diez, preferiblemente más de once, preferiblemente más de doce, preferiblemente más de trece, preferiblemente más de catorce, de los siguientes restos de aminoácidos cuando se compara con la secuencia del polipéptido de referencia de A. hydrophilia, en concreto la SEQ ID No. 32: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.
El dominio GDSX de Pfam00657 es un identificador único que distingue proteínas que tienen este dominio de otras enzimas.
La secuencia de consenso Pfam00657 se presenta en la figura 1 como SEQ ID No. 1. Esta se obtiene de la identificación de la familia pfam 00657, base de datos versión 6, que también se puede denominar pfam00657.6 en la presente memoria.
La secuencia de consenso se puede actualizar usando lanzamientos adicionales de la base de datos Pfam.
Por ejemplo, las figuras 33 y 34 muestran el alineamiento de Pfam de la familia 00657, de la base de datos de la versión 11, que también se puede denominar pfam00657.11, en la presente memoria.
La presencia de los bloques GDSx, GANDY y HPT se encuentra en la familia de Pfam 00657 de ambos lanzamientos de las bases de datos. Se pueden usar futuros lanzamientos de la base de datos Pfam para identificar la familia de Pfam 00657.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención se puede caracterizar usando los siguientes criterios:
(i)
la enzima tiene actividad de aciltransferasa que se puede definir como una actividad de transferencia de éster, de modo que la parte acilo de un enlace éster original de un donador de acilo de lípido se transfiere al aceptor de acilo para formar un nuevo éster;
(ii)
la enzima comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, en donde X es uno o más de los siguientes restos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.;
(iii) la enzima comprende His-309 o comprende un resto de histidina en una posición que corresponde a His-309 en la enzima lipolítica Aeromonas hydrophila mostrada en la figura 2 (SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32).
Preferiblemente, el resto de aminoácido del motivo GDSX es L.
En la SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32 los primeros 18 restos de aminoácidos forman una secuencia señal. La. His309 de la secuencia de longitud completa, es decir la proteína que incluye la secuencia señal, equivale a la His-291 de la parte madura de la proteína, es decir, la secuencia sin la secuencia señal.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención comprende la siguiente triada catalítica: Ser-34, Asp-134 e His-309 o comprende un resto de serina, un resto de ácido aspártico y un resto de histidina, respectivamente, en las posiciones que corresponden a la Ser-34, Asp-134 e His-309 en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada en la figura 2 (SEQ ID No. 2) o figura 28 (SEQ ID No. 32). Como se ha expuesto antes, en la secuencia mostrada en la SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 32, los 18 primeros restos de aminoácidos forman una secuencia señal. Ser-34, Asp-134 e His-309 de la secuencia de longitud completa, que es la proteína que incluye la secuencia señal, equivalen a Ser-16, Asp-116 e His-291 de la parte de proteína madura, es decir, la secuencia sin la secuencia señal. En la secuencia de consenso Pfam00657, como se da en la figura 1 (SEQ ID No. 1) los restos del sitio activo corresponden a Ser-7, Asp-157 e His-348.
Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención se puede caracterizar usando los siguientes criterios:
(i)
la enzima tiene actividad de aciltransferasa que se puede definir como una actividad de transferencia de éster, de modo que la parte acilo de un enlace éster original de un primer donador de acilo de lípido se transfiere a un aceptor de acilo para formar un nuevo éster; y
(ii)
la enzima comprende al menos Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 e His-309 o comprende restos de glicina, ácido aspártico, serina, ácido aspártico e histidina en las posiciones que corresponden a Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 e His-309, respectivamente, en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila lipolytic mostrada en la figura 2 (SEQ ID No. 2) o la figura 28 (SEQ ID No. 32).
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención se puede obtener, preferiblemente se obtiene, de organismos de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfltobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención se puede obtener, preferiblemente se obtiene, de organismos de uno o más de los siguientes organismos: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfltobacterium dehalogenans, Bacillus sp, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis y Candida parapsilosis.
En un aspecto, preferiblemente la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención se puede obtener, preferiblemente se obtiene, de uno o más de Aeromonas hydrophila o Aeromonas salmonicida.
La enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 12.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2 o como SEQ ID No. 3, o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más, preferiblemente 80% o más, preferiblemente 85% o más, preferiblemente 90% o más, preferiblemente 95% o más, con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2 o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3.
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad se basa en el número de elementos de la secuencia que son iguales. El grado de identidad de acuerdo con la presente invención se puede determinar de forma adecuada mediante programas de ordenador conocidos en la técnica, tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45) usando los ajustes para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalización por creación de hueco de 3,0 y penalización por extensión de hueco de 0,1.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más, 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más e incluso más preferiblemente 95% o más, con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 12.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos:
(a)
una secuencia de aminoácidos mostrada como los restos de aminoácidos 1-100 de la SEQ ID No. 2;
(b)
una secuencia de aminoácidos mostrada como los restos de aminoácidos 101-200 de la SEQ ID No. 2;
(c)
una secuencia de aminoácidos mostrada como los restos de aminoácidos 201-300 de la SEQ ID No. 2; o
(d)
una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, incluso más preferiblemente 95% o más, con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas en los apartados (a)-(c) anteriores.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos:
(a)
una secuencia de aminoácidos mostrada como los restos de aminoácidos 28-39 de la SEQ ID No. 2;
(b)
una secuencia de aminoácidos mostrada como los restos de aminoácidos 77-88 de la SEQ ID No. 2;
(c)
una secuencia de aminoácidos mostrada como los restos de aminoácidos 126-136 de la SEQ ID No. 2;
(d)
una secuencia de aminoácidos mostrada como los restos de aminoácidos 163-175 de la SEQ ID No. 2;
(e)
una secuencia de aminoácidos mostrada como los restos de aminoácidos 304-311 de la SEQ ID No. 2; o
(f)
una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, incluso más preferiblemente 95% o más, con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas en los apartados (a)-(e) anteriores.
Adecuadamente, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia de aminoácidos producida por la expresión de una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos:
(a)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 7 (véase la figura 9);
(b)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 8 (véase la figura 10);
(c)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 9 (véase la figura 11);
(d)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 10 (véase la figura 12);
(e)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 11 (véase la figura 13);
(f)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 13 (véase la figura 15);
(g)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 (véase la figura 17);
(h)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 (véase la figura 19);
(i)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 (véase la figura 21);
(j)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27 (véase la figura 23);
(k)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29 (véase la figura 25);
(l)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 (véase la figura 27);
(m)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 33 (véase la figura 29);
(n)
la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 35 (véase la figura 31);
(o)
o
una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de 75% o más con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35.
Adecuadamente, la secuencia de nucleótidos puede tener una identidad de 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más e incluso más preferiblemente 95% o más, con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35.
En un aspecto, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede ser una lecitina:colesterol aciltransferasas (LCAT) o variante de la misma (por ejemplo, una variante hecha por evolución molecular).
Las LCAT adecuadas son bien conocidas en la técnica y se pueden obtener de uno o más de los siguientes organismos, por ejemplo: mamíferos, rata, ratones, pollos, Drosophila melanogaster, plantas, que incluyen Arabidopsis y Oryza sativa, nematodos, hongos y levaduras.
En una realización, la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede ser la lípido aciltransferasa que se puede obtener, preferiblemente se obtiene, de las cepas de E. coli TOP 10 que albergan pPet12aAhydro y pPet12aASalmo depositadas por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, Dinamarca, bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes, en la National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, Reino Unido, el 22 de diciembre de 2003 con los números de acceso NICMB 41204 y NCIMB 41205, respectivamente.
Preferiblemente, cuando se lleva a cabo un método de acuerdo con la presente invención, el producto se produce sin aumentar o sin aumentar sustancialmente los ácidos grasos libres en el producto alimenticio.
El término “transferasa” como se usa en la presente memoria, es intercambiable con el término “lípido aciltransferasa”.
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria, cataliza una o más de las siguientes reacciones: interesterificación, transesterificación, alcoholisis, hidrolisis.
El término "interesterificación" se refiere a la transferencia enzimática catalizada de grupos acilo entre un donador lipídico y un aceptor de lípido, en donde el donador lipídico no es un grupo acilo libre.
El término "transesterificación" como se usa en la presente memoria significa la transferencia enzimática catalizada de un grupo acilo de un donador lipídico (distinto de un ácido graso libre) a un aceptor de acilo (distinto de agua).
Como se usa en la presente memoria, el término "alcoholisis" se refiere a la escisión enzimática de un enlace covalente de un derivado de ácido por reacción con un alcohol ROH, de modo que uno de los productos se combina con el H del alcohol y el otro producto se combina con el grupo OR del alcohol.
Como se usa en la presente memoria, el término “alcohol” se refiere a un compuesto alquilo que contiene un grupo hidroxilo.
Como se usa en la presente memoria, el término “hidrólisis” se refiere a la transferencia enzimática catalizada de un grupo acilo de un lípido al grupo OH de la molécula de agua. La transferencia de acilo que resulta de la hidrólisis requiere la separación de la molécula de agua.
La expresión “sin aumentar o sin aumentar sustancialmente los ácidos grasos libres” como se usa en la presente memoria significa que preferiblemente la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención tiene 100% de actividad de transferasa (es decir, transfiere 100% de los grupos acilo de un donador de acilo al aceptor de acilo, sin actividad hidrolítica); sin embargo, la enzima puede transferir menos de 100% de los grupos acilo presentes en el donador de acilo de lípido al aceptor de acilo. En cuyo caso, preferiblemente la actividad de aciltransferasa explica al menos 5%, más preferiblemente al menos 10%, más preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente al menos 98% de la actividad enzimática total. El % de actividad de transferasa (es decir, la actividad de transferasa como un porcentaje de la actividad enzimática total) se puede determinar por el siguiente protocolo:
Protocolo para la determinación del % de actividad de aciltransferasa:
Un producto alimenticio al que se le ha añadido una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, se puede extraer siguiendo la reacción enzimática con CHCl3:CH3OH 2:1 y se aísla la fase orgánica que contiene el material lipídico y se analiza por GLC y HPLC de acuerdo con el procedimiento detallado en lo sucesivo. A partir de los análisis de GLC y HPLC, se determina la cantidad de ácidos grasos libres y uno o más de loe ésteres de esterol/estanol; ésteres de hidratos de carbono, ésteres de proteínas; diglicéridos; o monoglicéridos. Se analiza de la misma forma un producto alimenticio de referencia al que no se le ha añadido la enzima de acuerdo con la presente invención.
Cálculo:
A partir de los resultados de los análisis de GLC y HPLC se puede calcular el aumento de los ácidos grasos libres y ésteres de esterol/estanol y/o ésteres de hidratos de carbono y/o ésteres de proteínas y/o diglicéridos y/o monoglicéridos:
Δ % de ácidos grasos = % Ácidos grasos (enzima) -% ácidos grasos (referencia); Mv ácidos grasos = peso molecular medio de los ácidos grasos;
A = Δ % ésteres de esterol/Mv ésteres de esterol (donde Δ % ésteres de esterol = % ésteres de esterol/estanol (enzima) -% ésteres de esterol/estanol (referencia) y Mv ésteres de esterol = peso molecular medio de los ésteres de esterol/estanol) -aplicable donde el aceptor de acilo es un esterol y/o estanol;
B = Δ % ésteres de hidratos de carbono/Mv ésteres de hidratos de carbono (donde Δ % ésteres de hidratos de carbono = % ésteres de hidratos de carbono (enzima) -% ésteres de hidratos de carbono (referencia) y Mv ésteres de hidratos de carbono = peso molecular medio de los ésteres de hidratos de carbono) -aplicable cuando el aceptor de acilo es un hidrato de carbono;
C = Δ % ésteres de proteínas/Mv ésteres de proteínas (donde Δ % ésteres de proteínas = % ésteres de proteínas (enzima) -% ésteres de proteínas (referencia) y Mv ésteres de proteínas = peso molecular medio de los ésteres de proteínas) -aplicable cuando el aceptor de acilo es una proteína; y
D = valor absoluto de diglicérido y/o monoglicérido/Mv di/monoglicérido (donde Δ% diglicérido y/o monoglicérido = % diglicérido y/o monoglicérido (enzima) -% diglicérido y/o monoglicérido (referencia) and Mv di/monoglicérido = peso molecular medio del diglicérido y/o monoglicérido) -aplicable cuando el aceptor de acilo es glicerol.
La actividad de transferasa se calcula como un porcentaje de la actividad enzimática total:
* -eliminar según sea adecuado.
Si los ácidos grasos libres han aumentado en el producto alimenticio, preferiblemente no han aumentado sustancialmente, es decir, en un grado significativo. Por esto se entiende que el aumento de ácidos grasos libres no afecta de forma adversa a la calidad del producto alimenticio.
En algunos aspectos de la presente invención, la expresión “sin aumentar sustancialmente los ácidos grasos libres” como se usa en la presente memoria, significa que la cantidad de ácidos grasos libres en un producto alimenticio o composición tratados con una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, es menor que la cantidad de ácidos grasos libres producidos en el producto alimenticio o composición cuando se ha usado una enzima distinta de una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, tal como por ejemplo, comparado con la cantidad de ácidos grasos libres producidos cuando se ha usado una enzima fosfolipasa convencional, p. ej., LipopanF® (Novozymes A/S, Dinamarca).
La expresión “in situ” como se usa en la presente memoria significa que el o los emulsionantes y/o los ésteres de esterol/estanol y/o los ésteres de hidratos de carbono y/o los ésteres de proteínas y/o los mono o diglicéridos, son producidos dentro del producto alimenticio o fracción del producto alimenticio. Esto contrasta con la situación donde el o los emulsionantes y/o los ésteres de esterol/estanol y/o los ésteres de hidratos de carbono y/o los ésteres de proteínas y/o los mono o diglicéridos se producen por separado del producto alimenticio y se añaden como productos formados al producto alimenticio durante la preparación del mismo. En otras palabras, la expresión “in situ” como se usa en la presente memoria significa que por la adición de la enzima lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención a un producto alimenticio, o a ingredientes/materiales alimentarios que constituyen el producto alimenticio, se puede producir un emulsionante y/o un éster de esterol/estanol y/o un éster de hidrato de carbono y/o un éster de proteína y/o un mono o diglicérido, a partir de los componentes del producto alimenticio. De forma adecuada, los componentes del producto alimenticio pueden ser el o los sustratos para la enzima. Si es necesario, los componentes del producto alimenticio se pueden complementar por la adición de uno o más componentes adicionales, cuyos componentes adicionales pueden ser los mismos que están presentes en el producto alimenticio o pueden ser adicionales a los componentes que ya están presentes en el producto alimenticio. Para evitar dudas, en una realización, el método de acuerdo con la presente invención puede ser un método para la producción de un emulsionante y/o un éster de esterol y/o un éster de estanol y/o un éster de hidrato de carbono y/o un éster de proteína y/o un mono o diglicérido in situ en un producto alimenticio y no es un método para preparar un emulsionante y/o un éster de esterol y/o un éster de estanol (por ejemplo, está en una forma aislada y/o purificada) para la posterior adición a un producto alimenticio.
En otra realización, la lipasa aciltransferasa se puede usar durante el procesamiento del alimento, pero no permanecer en el producto alimenticio. Por ejemplo, la lipasa aciltransferasa se puede inmovilizar, permitiendo ser reutilizada.
Preferiblemente, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a un esterol y/o estanol y/o un hidrato de carbono y/o una proteína y/o un glicerol, cuando está presente en un entorno polar, preferiblemente en un entorno acuoso, preferiblemente productos alimenticios que contienen agua. De forma adecuada, el entorno acuoso puede ser un tampón acuoso o puede ser la fase acuosa en un producto alimenticio. La expresión “entorno acuoso” como se usa en la presente memoria preferiblemente significa un entorno en el que está ausente un disolvente orgánico, preferiblemente está ausente un disolvente orgánico polar, más preferiblemente está ausente un disolvente orgánico no comestible. En particular, la expresión “entorno acuoso” se puede referir a un entorno al que no se han añadido disolventes orgánicos exógenos, preferiblemente no disolventes orgánicos polares. La expresión disolvente orgánico como se usa en la presente memoria no abarca aceites alimentarios, preferiblemente no abarca aceites alimentarios que tienen alto contenido de lípidos no polares. En una realización, la expresión disolvente orgánico puede excluir disolventes orgánicos comestibles, tales como etanol, propilenglicol y/o glicerol. De forma adecuada, el entorno acuoso de acuerdo con la presente invención puede comprender menos de 80% en volumen de disolventes orgánicos, menos de 70% en volumen de disolventes orgánicos, menos de 50% en volumen de disolventes orgánicos, menos de 30% en volumen de disolventes orgánicos, más preferiblemente menos de 15% en volumen de disolventes orgánicos, más preferiblemente menos de 5%. Adecuadamente, el producto alimenticio puede comprender entre 1 y 5% de disolvente orgánico, por ejemplo, etanol. Sin embargo, cuando el producto alimenticio comprende dicho disolvente orgánico, preferiblemente es producido de forma endógena dentro de producto alimenticio. Es decir, cuando el producto alimenticio comprende dicho disolvente orgánico, preferiblemente el disolvente orgánico no es un disolvente orgánico exógeno.
La expresión “producto alimenticio” como se usa en la presente memoria, significa una sustancia que es adecuada para el consumo humano y/o animal.
Adecuadamente, la expresión “producto alimenticio” como se usa en la presente memoria, significa un producto alimenticio en una forma que está lista para consumir. Sin embargo, alternativamente o además, el término producto alimenticio, como se usa en la presente memoria, puede significar uno o más materiales alimentarios que se usan en la preparación de un producto alimenticio. Solo a modo de ejemplo, el término producto alimenticio abarca tanto artículos horneados producidos a partir de una masa, así como la masa usada en la preparación de dichos productos alimenticios horneados.
En un aspecto preferido, el producto alimenticio para usar en la invención se selecciona de uno o más de los siguientes: huevo, productos basados en huevo, que incluyen pero no se limitan a mayonesa, aliños de ensaladas, salsas, helados, huevo en polvo, yema de huevo modificada y productos hechos a partir de los mismos; artículos horneados, que incluyen panes, pasteles, productos de masas dulces, masas laminadas, masas líquidas, madalenas, galletas, galletas saladas y galletas dulces; productos de confitería que incluyen chocolate, dulces, caramelos, halawa, caramelos de goma que incluyen caramelos de goma sin azúcar y edulcorados con azúcar, chicle de globo, chicle de globo blando, chicles y púdines; productos congelados que incluyen sorbetes, preferiblemente productos lácteos congelados, que incluyen helados y helados de leche; productos lácteos, que incluyen queso, mantequilla, leche, crema para café, crema batida, crema pastelera, bebidas de leche y yogures; mousses, cremas vegetales batidas, productos de carne, que incluyen productos de carne procesada; aceites y grasas comestibles, productos batidos aireados y no aireados, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, margarina, materia grasa y producto alimenticio untable, que incluyen productos alimenticios untables
bajas en grasa y muy bajas en grasa; aliños, mayonesas, salsas untables, salsas basadas en nata, sopas basadas en nata, bebidas, emulsiones y salsas de condimento.
Adecuadamente, el producto alimenticio puede ser un “producto alimenticio selecto”, que incluye pasteles, pasteles, confitería, chocolates, fudge y similares.
En un aspecto, el producto alimenticio puede ser un producto de masa o un producto horneado, tal como un pan, un producto frito, un tentempié, tortas, pasteles, brownies, galletas, fideos, tentempiés como galletas saladas, galletas Graham, pretzels, patatas fritas y pasta.
En un aspecto adicional, el producto alimenticio puede ser un producto alimentario procedente de plantas tales como harinas, premezclas, aceites, grasas, manteca de cacao, blanqueador de café, aderezos para ensaladas, margarina, productos alimenticios untables, mantequilla de cacahuete, mantecas, helado, aceites de cocina.
En otro aspecto, el producto alimenticio puede ser un producto lácteo que incluye mantequilla, lecha, nata, queso tal como quesos naturales, procesados e imitaciones en una variedad de formas (que incluyen en tiras, bloques, láminas o rallado), queso crema, helado, postres helados, yogur, bebidas de yogur, grasa de mantequilla, grasa láctea anhidra, otros productos lácteos. La enzima usada de acuerdo con la presente invención puede mejorar la estabilidad de la grasa en productos lácteos.
Es particularmente ventajoso usar la presente invención en el queso, ya que la producción de ácidos grasos libres en el queso está asociada con un sabor “saponáceo”. Por lo tanto, el uso de una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, produce ventajosamente queso sin un sabor “saponáceo”.
En otro aspecto, el producto alimenticio puede ser un producto alimentario que contiene ingredientes procedentes de animales, tales como productos de carne procesados, aceites de cocina, materias grasas.
En un aspecto adicional, el producto alimenticio puede ser una bebida, una fruta, fruta mezclada, una verdura o vino. En algunos casos, la bebida puede contener hasta 20 g/l de fitoesteroles añadidos.
En otro aspecto, el producto alimenticio puede ser un pienso para animales. El pienso para animales puede estar enriquecido con fitoesterol y/o fitoestanol, preferiblemente beta-sitosterol/estanol. Adecuadamente, el pienso para animales puede ser un pienso para aves de corral. Cuando el producto alimenticio es pienso para aves de corral, la presente invención se puede usar para reducir el contenido de colesterol de los huevos producidos por las aves de corral alimentadas con el producto alimenticio.
En un aspecto preferiblemente el producto alimenticio se selecciona de uno o más de los siguientes: huevos, productos basados en huevo, que incluyen mayonesa, aliños de ensaladas, salsas, helados, huevo en polvo, yema de huevo modificada y productos hechos a partir de los mismos.
El producto alimenticio para usar en la presente invención es un producto alimenticio que contiene agua compuesto de 10-98% de agua, adecuadamente de 14-98%, adecuadamente de 18-98% de agua, adecuadamente de 20-98%, adecuadamente de 40-98%, adecuadamente de 50-98%, adecuadamente de 70-98%, adecuadamente de 75-98%.
Para algunos aspectos, preferiblemente el producto alimenticio no es un aceite vegetal puro, tal como aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de colza, por ejemplo. Para evitar dudas, en algunos aspectos de la presente invención, el producto alimenticio puede comprender un aceite, pero preferiblemente el producto alimenticio no está compuesto principalmente de aceite o mezclas de aceite. Para algunos aspectos, preferiblemente el producto alimenticio comprende menos de 95% de lípidos, preferiblemente menos de 90% de lípidos, preferiblemente menos de 85%, preferiblemente menos de 80% de lípidos. Por lo tanto, para algunos aspectos de la presente invención, el aceite puede ser un componente del producto alimenticio, pero preferiblemente el producto alimenticio no es un aceite por sí solo.
Las reivindicaciones de la presente invención deben entenderse para incluir cada uno de los productos alimenticios citados antes.
Cuando es el caso de que se produce un éster de hidrato de carbono de acuerdo con la presente invención, el éster de hidrato de carbono preferiblemente es un éster de oligosacárido, un éster de monosacárido o un éster de disacárido.
Adecuadamente, el éster de hidrato de carbono cuando se produce de acuerdo con la presente invención, puede ser uno o más de los siguientes: éster de glucosa, éster de fructosa, éster de anhidrofructosa, éster de maltosa, éster de lactosa, éster de galactosa, éster de xilosa, éster de xilooligosacárido, éster de arabinosa, éster de maltooligosacárido, éster de tagatosa, éster de sacarosa, éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T o éster de cortalcerona.
Preferiblemente, el éster de hidrato de carbono cuando se produce de acuerdo con la presente invención es uno o más de los siguientes: un monoéster de hidrato de carbono, un monoéster de azúcar, un monoéster de oligosacárido, un monoéster de trisacárido, un monoéster de disacárido, un monoéster de monosacárido, un
monoéster de glucosa, un monoéster de fructosa, monoéster de anhidrofructosa, monoéster de maltosa, monoéster de lactosa, monoéster de galactosa, monoéster de xilosa, monoéster de xilooligosacárido, monoéster de arabinosa, monoéster de maltooligosacárido, monoéster de tagatosa, monoéster de sacarosa, éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T o éster de cortalcerona.
En una realización, el éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T o éster de cortalcerona, pueden funcionar como un agente antimicrobiano. Alternativamente o además, el éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T y/o éster de cortalcerona, pueden funcionar como uno de o tanto como un antioxidante como/o un emulsionante.
Preferiblemente, la formación del éster de hidrato de carbono (si hay) de acuerdo con la presente invención, es independiente de la UDP-glucosa.
Preferiblemente, el producto alimenticio no comprende UDP-glucosa, o solo comprende UDP-glucosa en cantidades insignificantes.
Adecuadamente, el emulsionante de acuerdo con la presente invención puede ser, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un diglicérido, un monoglicérido, tal como 1-monoglicérido o una lisolecitina, tal como lisofosfatidilcolina por ejemplo, un digalactosil monoglicérido (DGMG). El emulsionante preferiblemente se produce a partir del donador de acilo de lípido después de la eliminación de uno o más grupos acilo de dicho donador de acilo de lípido. El término lisolecitina como se usa en la presente memoria abarca lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilinositol, lisofosfatidilserina y lisofosfatidilglicerol.
Cuando uno de los emulsionantes es un éster de hidrato de carbono, el segundo emulsionante puede ser, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un diglicérido, un monoglicérido, tal como 1-monoglicérido, lisofosfatidilcolina,
o digalactosil monoglicérido (DGMG). El segundo emulsionante preferiblemente se produce a partir del donador de acilo de lípido después de la eliminación de uno o más grupos acilo a partir de dicho donador de acilo de lípido. El término lisofosfatidilcolina como se usa en la presente memoria es sinónimo del término lisolecitina y estos términos se pueden usar de forma intercambiable en la presente memoria.
Preferiblemente, el segundo emulsionante es DGMG. Adecuadamente, el DGMG se produce in situ por eliminación de un grupo acilo del DGDG con transferencia del grupo acilo eliminado a un hidrato de carbono para formar un éster de hidrato de carbono.
Cuando uno de los emulsionantes es un éster de proteína y/o un diglicérido y/o un monoglicérido, el segundo emulsionante puede ser, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un monoglicérido, tal como 1-monoglicérido, lisofosfatidilcolina, o digalactosil monoglicérido (DGMG). El segundo emulsionante preferiblemente se produce a partir del donador de acilo de lípido después de eliminación de uno o más de los grupos acilo de dicho donador de acilo de lípido. El término lisofosfatidilcolina como se usa en la presente memoria es sinónimo del término lisolecitina y estos términos se pueden usar de forma intercambiable en la presente memoria.
En una realización, la transferencia de acilo de lípido de la invención se puede usar en un procedimiento para preparar un producto alimenticio tal como un aceite de cocina, margarina o producto alimenticio untable, de modo que el producto alimenticio contiene de forma natural o se ha complementado con glicerol, al menos un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) y/o glucolípido (por ejemplo, digalactosildiglicérido), y opcionalmente un fitoesterol o fitoestanol.
Cuando se usa como un aceite de cocina o margarina, el producto alimenticio puede tener propiedades antiadherentes potenciadas. Además, o alternativamente el producto alimenticio puede tener una o más propiedades técnicas beneficiosas, por ejemplo, mejor estabilidad oxidativa, mejores propiedades de emulsión o beneficios para la salud.
En una realización, la lípido aciltransferasa de la invención puede estar en la preparación de productos alimenticios bajos en grasas tales como productos alimenticios untables bajos en grasas, aliños para ensaladas bajos en grasas, mayonesa baja en grasas, margarinas bajas en grasas, etc. En dichos productos alimenticios bajos en grasas, el contenido de grasa típicamente se reduce por la adición de emulsionantes y agua adicional, comparado con su equivalente con mayor contenido de grasa.
Las lípido aciltransferasas usadas en las composiciones y métodos de la invención, se ha encontrado que tienen propiedades únicas cuando se comparan con enzimas lipolíticas en cuanto que tienen una notable preferencia por la transferencia de grupos acilo de lípidos a aceptores distintos del agua, incluso en presencia de cantidad significativa de agua. En una comparación con enzimas de la técnica anterior, se encontró que la lípido aciltransferasa usada en la invención tenía una actividad de transferasa relativamente alta en presencia de 6% de agua, 54% de agua, 73% de agua, 89% de agua y aproximadamente 95%. Las enzimas lipolíticas ensayadas no tienen prácticamente actividad de transferasa relativa significativa en estas concentraciones de agua.
La actividad de lipasa y aciltransferasa de una enzima se puede evaluar usando los siguientes ensayos. De este modo, se puede obtener/identificar una lípido aciltransferasa que tiene las características de enzima definidas en la presente memoria.
Ensayo de transferasa en sustrato tamponado (véase el ejemplo 12)
Las enzimas que funcionan como lípido aciltransferasas para usar en las composiciones y métodos de la invención se pueden identificar rutinariamente usando el ensayo enseñado en la presente memoria en el ejemplo 12. Este ensayo en lo sucesivo se denominará “ensayo de transferasa en sustrato tamponado”. En el ejemplo 12, la enzima lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida de acuerdo con la presente invención, se analizó y se comparó con una variedad de enzimas lipolíticas que no están abarcadas por la presente invención. Como puede verse, de las enzimas lipolíticas se encontró que solo LIPOPAN® F (Novozymes, Dinamarca) tenía alguna actividad de transferasa y solo en un nivel muy bajo (1,3%).
Las enzimas adecuadas para usar en las composiciones y métodos de la invención se pueden identificar rutinariamente usando el ensayo de transferasa en sustrato tamponado. Usando este ensayo, en el que hay un contenido de agua muy alto, aproximadamente 95%, las lípido aciltransferasas de acuerdo con la presente invención son aquellas que tienen al menos 2% de actividad de aciltransferasa (actividad relativa de transferasa), preferiblemente al menos 5% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 10% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 15%, 20%, 25% 26%, 28%, 30%, 40% 50%, 60% o 75% de actividad relativa de transferasa. Adecuadamente, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, puede tener menos de 28%, menos de 30%, preferiblemente menos de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de actividad de aciltransferasa.
Ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua (véase el ejemplo 11)
Como una alternativa al uso (o además de) el “ensayo de transferasa en sustrato tamponado” (véase antes), una lípido aciltransferasa para usar de acuerdo con la presente invención se puede identificar usando el “ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua” enseñado en el ejemplo 11.
En una realización, la lípido aciltransferasa adecuada para usar en los métodos y/o composiciones de acuerdo con la presente invención es una que cuando se ensaya usando el ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua en una yema de huevo con 54% de agua, tiene hasta 100% de actividad relativa de transferasa. Realmente, los experimentos en yema de huevo con alto contenido de agua muestran que al inicio del experimento, se calculó que la tasa de transferasa inicial era 100% de actividad de transferasa, es decir, no se observaba actividad hidrolítica. En cambio, las enzimas lipolíticas usadas como referencia, es decir, LIPOPAN® F y fosfolipasa A2, no mostraron actividad de transferasa detectable en yema de huevo con 54% de agua, o yema de huevo con contenido enriquecido en agua (en concreto, yema de huevo con 73% de agua u 89% de agua). Preferiblemente, el aumento del contenido de agua no disminuye significativamente el porcentaje de actividad de aciltransferasa de una lípido aciltransferasa para usar en los métodos y composiciones de acuerdo con la presente invención.
En una realización preferida, con referencia al ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua, con un contenido de agua de 54%, una lípido aciltransferasa para usar en la presente invención tendrá un porcentaje inicial de actividad de aciltransferasa (actividad relativa de transferasa inicial) medida después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido) de al menos 0,1% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 1% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 5% de actividad relativa de transferasa, preferible al menos 10% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 20% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 30% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 40% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 50% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, preferiblemente al menos 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de actividad de aciltransferasa.
En una realización preferida, con referencia al ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua, con un contenido de agua de 54%, y medido después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido), la lípido aciltransferasa para usar en los métodos y composiciones de la invención tiene actividad de transferasa detectable, es decir, actividad relativa de transferasa entre 0,1 y 100%, preferiblemente al menos 1% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 5% de actividad relativa de transferasa, preferible al menos 10% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 20% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 30% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 40% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de actividad relativa de transferasa. Adecuadamente, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede tener, cuando se usa el ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua con 54% de contenido de agua y medido después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido), un porcentaje de actividad de aciltransferasa (actividad relativa de transferasa) de menos de 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.
En una realización preferida, con referencia al ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua, con un contenido de agua de 73%, medido después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido), la lípido aciltransferasa para usar en los métodos y composiciones de la invención tiene actividad de transferasa detectable, es decir, actividad relativa de transferasa entre 0,1 y 100%, preferiblemente al menos 1% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 5% de actividad relativa de transferasa, preferible al menos 10% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 20% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 30% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 40% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 45%, 50%, 58%, 60%, 70%, 80% o 90% de actividad relativa de transferasa. Adecuadamente, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede tener, cuando se usa el ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua con 73% de contenido de agua y medido después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido), un porcentaje de actividad de aciltransferasa (actividad relativa de transferasa) de menos de 45%, 47%, 50%, 58%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.
En una realización preferida, con referencia al ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido de agua, con un contenido de agua de 89%, y medido después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido), la lípido aciltransferasa para usar en las composiciones y métodos de la invención tiene actividad de transferasa detectable, es decir, actividad relativa de transferasa entre 0,1 y 100%, preferiblemente al menos 1% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 5% de actividad relativa de transferasa, preferible al menos 10% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 20% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 30% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 40% de actividad relativa de transferasa, preferiblemente al menos 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de actividad relativa de transferasa. Adecuadamente, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede tener, cuando se usa el ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido de agua con 89% de contenido de agua y medido después de 10% consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido), un porcentaje de actividad de aciltransferasa (actividad relativa de transferasa) de menos de 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.
En una realización preferida, con referencia al ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido de agua, una lípido aciltransferasa para usar en las composiciones y métodos de la invención tiene significativa actividad relativa de transferasa (es decir, al menos 0,1% en ambos contenidos de agua), y tiene una actividad relativa de transferasa equivalente en yema de huevo con un contenido de agua de 54% y en una yema de huevo con un contenido de agua de 73%, cuando se mide después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido).
En una realización preferida, con referencia al ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido de agua, una lípido aciltransferasa para usar en las composiciones y métodos de la invención tiene significativa actividad relativa de transferasa (es decir, al menos 0,1% en ambos contenidos de agua), y tiene una actividad relativa de transferasa equivalente en yema de huevo con un contenido de agua de 54% que en una yema de huevo con un contenido de agua de 89%, cuando se mide después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido).
En una realización preferida, con referencia al ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido de agua, una lípido aciltransferasa para usar en las composiciones y métodos de la invención tiene significativa actividad relativa de transferasa (es decir, al menos 0,1% en ambos contenidos de agua), y tiene una actividad relativa de transferasa equivalente en la yema de con un contenido de agua of 73% y en una yema de huevo con un contenido de agua de 89%, cuando se mide después de 10% de consumo de la molécula donadora (es decir, fosfolípido).
La expresión "actividad relativa de transferasa equivalente" como se hace referencia en la presente memoria, significa que la enzima tiene una actividad relativa de transferasa (% de actividad de aciltransferasa) que es al menos 2% inferior, preferiblemente al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% inferior, en la yema de huevo con el mayor contenido de agua comparado con aquella en la yema de huevo con el menor de contenido de agua.
Ensayo de transferasa en entorno con bajo contenido de agua
Como una alternativa al uso (o además) del "ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido de agua" y/o el "ensayo de transferasa en sustrato tamponado", las lípido aciltransferasas para usar de acuerdo con la presente invención se pueden identificar usando el "ensayo de transferasa en un entorno con bajo contenido de agua".
Con el fin de determinar si una enzima es una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, se puede llevar a cabo un "ensayo de transferasa en un entorno con bajo contenido de agua", en concreto en un entorno oleoso con 6% de agua como se enseña en el ejemplo 22. Este ejemplo ilustra que en un entorno oleoso con 6% de contenido de agua, la lípido aciltransferasa de la invención tiene una actividad relativa de transferasa alta, donde las enzimas lipolíticas de la técnica anterior tienen actividad hidrolítica.
En una realización, la lípido aciltransferasa adecuada para usar en los métodos y/o composiciones de acuerdo con la presente invención, es una que cuando se ensaya usando el "ensayo de transferasa en un entorno con bajo
contenido de agua", medida después de un periodo de tiempo seleccionado de 30, 20 o 120 minutos, tiene una actividad relativa de transferasa de al menos 1%, preferiblemente al menos 2%, preferiblemente al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 75%. Adecuadamente, la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención puede tener menos de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, u 80% de actividad cuando se mide después de un periodo de tiempo de 10, 20, 30 o 120 minutos usando el "ensayo de transferasa en un entorno con bajo contenido de agua".
Como se ha descrito antes, la lípido aciltransferasa de la invención se puede identificar usando el “ensayo de transferasa en sustrato tamponado” o en el “ensayo de transferasa en entorno con bajo contenido de agua” usando colesterol como el aceptor de acilo. Por supuesto, el experto en la técnica comprenderá fácilmente, que con modificaciones obvias de los métodos analíticos, el “ensayo de transferasa en sustrato tamponado” o el “ensayo de transferasa en entorno con bajo contenido de agua” se pueden usar para determinar la actividad de la lípido aciltransferasa para cualquier donador de acilo de lípido o cualquier combinación de aceptor de acilo. Si es necesario, el experto en la técnica simplemente sustituiría el sustrato donador de acilo (p. ej., fosfolípido) por un sustrato donador de acilo alternativo (p. ej., glucolípido, triacilglicérido) y/o sustituiría el receptor de acilo (p. ej., colesterol) por un sustrato aceptor de acilo alternativo (p. ej., un hidrato de carbono, una proteína, otro esterol, un estanol o glicerol).
La expresión “alto contenido en agua” como se usa en la presente memoria, significa cualquier sustrato o producto alimenticio con más de 2% de contenido de agua, preferiblemente más de 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%.
La expresión “bajo contenido en agua” como se usa en la presente memoria, significa cualquier sustrato o producto alimenticio con menos de 6% de contenido de agua, preferiblemente menos de 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o 0,5%.
Preferiblemente, el método y/o uso de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, en producto alimenticio a una temperatura de 15-60°C, preferiblemente a una temperatura de 20-60°C, preferiblemente 20-50°C, preferiblemente 20-45°C, preferiblemente 20-40°C. Para algunos aspectos, Por ejemplo, en una masa, preferiblemente la temperatura del alimento en la que tiene lugar la reacción de la aciltransferasa es entre 20 y 40°C. Para otros aspectos, por ejemplo, con respecto a productos lácteos tales como queso, la temperatura del alimento puede ser adecuadamente entre 30°C y 60°C. En otros aspectos más, por ejemplo, con relación a la mayonesa, la temperatura del alimento puede ser adecuadamente entre 20 y 40°C, más preferiblemente entre 25 y 30°C.
Preferiblemente, el emulsionante producido de acuerdo con la presente invención comprende menos de 5% en peso del producto alimenticio.
Preferiblemente, el emulsionante producido de acuerdo con la presente invención comprende de 0,01 a 4% en peso del producto alimenticio.
Preferiblemente, el emulsionante producido de acuerdo con la presente invención comprende de 0,01 to 2% en peso del producto alimenticio.
Preferiblemente, el emulsionante producido de acuerdo con la presente invención comprende de 0,01 a 1% en peso del producto alimenticio.
Preferiblemente, el emulsionante producido de acuerdo con la presente invención comprende de 0,01 a 0,5% en peso del producto alimenticio.
Preferiblemente, el emulsionante producido de acuerdo con la presente invención comprende de 0,01 a 0,3% en peso del producto alimenticio.
Adecuadamente, el método de acuerdo con la presente invención incluye inactivar o desnaturalizar la enzima para proporcionar un producto alimenticio que comprende la enzima en una forma inactiva o desnaturalizada. Adecuadamente, la enzima se puede desnaturalizar horneando o por pasteurización.
La presente descripción puede abarcar además el uso de una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria en composiciones enzimáticas de alimentos y/o piensos, y puede abarcar composiciones de enzimas de alimentos y/o piensos que comprenden una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria. Dichas composiciones pueden contener una o más enzimas adicionales, tales como las citadas en la presente memoria. Alternativamente, la composición enzimática de la invención se puede usar en combinación con otros ingredientes/aditivos alimentarios, tales como los citados en la presente memoria, que incluyen otras composiciones de enzimas. Mediante la formulación de la lípido aciltransferasa de la invención dentro de una composición de alimento y/o pienso, la enzima se puede estabilizar para permitir el almacenamiento prolongado (en condiciones adecuadas) antes de usar en la producción del alimento y/o pienso. Además, la composición enzimática de la presente invención proporciona la enzima en una forma adecuada para uso seguro para la aplicación “in situ” en la preparación de productos alimenticios y/o productos de piensos, o ingredientes para usar en la preparación de alimento y/o pienso. Dichas composiciones pueden estar en forma líquida, semilíquida o sólida/granular.
La composición enzimática del alimento puede ser adecuadamente una composición que mejora la masa. La composición que mejora la masa puede comprender otros componentes beneficiosos tales como un emulsionante y/u otras enzimas citadas en la presente memoria.
Las enzimas alimentarias se venden como concentrados líquidos estabilizados o como sólidos en partículas. La formulación en la composición enzimática alimentaria minimiza la pérdida de actividad enzimática durante el transporte, almacenamiento y uso. Las enzimas a menudo están expuestas a humedad, calor o entornos oxidativos en el procesamiento de alimentos y bebidas. Las formulaciones potencian la estabilidad contrarrestando las fuerzas principales de desactivación: desnaturalización, desactivación del sitio catalítico y proteolisis. La desnaturalización se produce por el desplegado físico de la estructura terciaria de una proteína enzima por estrés térmico o químico. Una vez que la enzima empieza a desplegarse se vuelve notablemente más vulnerable a la desactivación y proteolisis. Para minimizar el desplegado, el formulador puede alterar el entorno de la proteína para así inducir una estructura de proteína compacta; esto se hace de la forma más eficaz mediante la “exclusión preferencial” de agua de la superficie de la proteína, añadiendo compuestos que se asocian con el agua tales como azúcares, alcoholes polihídricos y sales liotrópicas. Las mejores formas de combatir la inactivación del sitio activo son asegurar niveles suficientes de cualesquiera cofactores requeridos, añadir inhibidores reversibles, y excluir especies oxidantes o reactivas de la formulación.
Además de la estabilidad enzimática, una formulación debería cumplir varios requisitos secundarios clave, que incluye la conservación frente a contaminación microbiana, evitar la precipitación física o formación de turbidez, minimizar la formación de polvos o aerosoles sensibilizantes, y la optimización de criterios estéticos tales como el color y olor. Muchos de estos problemas se abordan mejor centrándose “lo más arriba” posible, que incluye la elección de las materias primas en la fermentación o procedimiento de recuperación de enzima. Las operaciones corriente abajo tales como la diafiltración, adsorción, cromatografía, cristalización y extracción se pueden usar para eliminar impurezas responsables del color, olor y precipitación. El riesgo de precipitación física se minimiza mediante la formulación cerca del punto isoeléctrico de la enzima con disolventes hidrófilos tales como glicerol o propilenglicol. También se pueden añadir eficazmente niveles moderados de sales solvatantes para evitar la “precipitación por sales” o “inversión de la solubilización por sales”. Para evitar la contaminación microbiana, se puede usar una combinación de filtración, acidificación y la minimización de agua libre; pueden ser eficaces los biocidas, pero la variedad de productos químicos aceptables para controlar o matar microbios está cada vez más circunscrito a regulaciones de salud y seguridad.
Dos procedimientos que producen los gránulos más resistentes al desgaste hasta la fecha son la granulación de alta cizalladura y el recubrimiento por pulverización en lecho fluidizado, véase por ejemplo, T. Becker: "Separation and Purification Processes for Recovery of Industrial Enzymes" en R. K. Singh, S. S. H. Rizvi (eds.): Bioseparation Processes in Foods, Marcel Dekker, New York, pp. 427-445. Estos procedimientos usan diferentes aglutinantes, recubrimientos y morfologías de partículas para producir partículas no friables que todavía protegen a las enzimas durante el almacenamiento, pero permiten que estén listas para su liberación en solución durante el uso.
Las composiciones enzimáticas alimentarias que contienen la lípido aciltransferasa de la invención, se pueden hacer usando técnicas de formulación convencionales, tales como secado por atomización o formulación líquida.
La lípido aciltransferasa de la invención se puede expresar en cualquier hospedante de expresión adecuado. Por ejemplo, la lípido aciltransferasa de la invención se puede expresar en Bacillus subtilis y se puede purificar por ultrafiltración y/o por precipitación en etanol y/o centrifugación, y posteriormente se puede secar por atomización usando almidón (maltodextrina) como vehículo para la enzima. La enzima secada por atomización se puede normalizar respecto a la actividad PLU especificada añadiendo vehículo adicional en forma de polvo. Las técnicas implicadas están bien establecidas y son rutinarias en la técnica.
Alternativamente, la lípido aciltransferasa para usar de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, la lípido aciltransferasa de la invención producida de forma heteróloga, una vez purificada se puede estabilizar en una formulación líquida adecuada, tal como las basadas en glicerol. Se describen otros métodos para hacer formulaciones enzimáticas estabilizadas en los documentos EP 0770037 y EP 0702712.
La lípido aciltransferasa en forma de polvo también se puede usar en combinación con otras enzimas citadas en la presente memoria, para la producción de composiciones enzimáticas con actividad definida de acuerdo con la especificación del producto.
Típicamente, la dosificación de la formulación enzimática alimentaria es entre 10 g y 1000 g por 1000 kg de producto alimenticio, preferiblemente 50-200 g por 1000 kg de producto alimenticio, preferiblemente, 75-125 g por 1000 kg de producto alimenticio.
Preferiblemente, la enzima de acuerdo con la presente invención está presente en una forma inactiva o en una forma desnaturalizada en el producto alimenticio.
En una realización, la enzima de acuerdo con la presente invención preferiblemente no está inmovilizada, en particular no está inmovilizada sobre un soporte sólido.
En una realización alternativa, la enzima puede estar inmovilizada.
La lípido aciltransferasa inmovilizada se puede preparar usando técnicas de inmovilización conocidas en la técnica. Hay numerosos métodos para preparar enzimas inmovilizadas, que serán evidentes para un experto en la técnica (por ejemplo, las técnicas a las que se hace referencia en el documento EP 0746608; o Balcao VM, Paiva AL, Malcata FX., Enzyme Microb Technol. 1996 May 1;18(6):392-416; o Reetz MT, Jaeger KE. Chem Phys Lipids. 1998 Jun;93(1-2):3-14; o Bornscheuer UT, Bessler C, Srinivas R, Krishna SH. Trends Biotechnol. 2002 Oct; 20(10):433-7.
En una realización, el producto alimenticio puede contener ingredientes alimenticios, que se han preparado usando la lípido aciltransferasa inmovilizada, pero no contienen la lípido aciltransferasa en el ingrediente alimenticio o producto alimenticio. Por ejemplo, el producto alimenticio puede contener uno o más de los siguientes: un emulsionante, más de un emulsionante, uno o más agentes de sabor, uno o más potenciadores de la textura y/o uno
o más ésteres de esterol, tales como ésteres de fitoesterol o ésteres de fitoestanol.
La enzima de acuerdo con la presente invención se puede usar con uno o más emulsionantes convencionales, que incluyen, por ejemplo, monoglicéridos, ésteres de ácido diacetil-tartárico y mono-y diglicéridos de ácidos grasos, y lecitinas p. ej., obtenidas de la soja.
La enzima de acuerdo con la presente invención se puede usar con una o más enzimas de calidad alimentaria adecuadas. Por lo tanto, está dentro del alcance de la presente invención que, además de la enzima de la invención, se añade al menos otra enzima adicional al producto alimenticio. Dichas enzimas adicionales incluyen enzimas que degradan el almidón tales como endo o exoamilisas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas que incluyen xilanasas, celulasas, lipasas, fosfolipasas, y proteasas.
La enzima de acuerdo con la presente invención se puede usar con una o más de otras enzimas de calidad alimentaria. Por lo tanto, está dentro del alcance de la presente invención que, además de la enzima de la invención, se añade al menos una enzima adicional al producto alimenticio. Dichas enzimas adicionales incluyen enzimas que degradan el almidón tales como endo o exoamilisas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas que incluyen xilanasas, celulasas, oxidorreductasas, p. ej., glucosa oxidasa, piranosa oxidasa, sulfhidril oxidasa o un hidrato de carbono oxidasa, tal como una que oxida maltosa, por ejemplo, hexosa oxidasa (HOX), lipasas, fosfolipasas y hexosa oxidasa, y proteasas.
En una realización preferida, la lípido aciltransferasa se usa en combinación con una lipasa que tiene una o más de las siguientes actividades de lipasa: actividad de glucolipasa (E.C. 3.1.1.26), actividad de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3), actividad de fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) o actividad de fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32). Adecuadamente, las enzimas lipasas son bien conocidas en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, las siguientes lipasas: LIPOPAN® F y/o LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca), fosfolipasa A2 (p. ej., fosfolipasa A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts, LIPOMAX™ de Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Dinamarca), las lipasas que se enseñan en los documentos WO03/97835, EP 0977869 o EP 1193314. Esta combinación de una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria y una lipasa, puede ser particularmente preferida en masas o productos horneados o en productos alimenticios selectos tales como pasteles y confitería.
El uso de lipasas en combinación con la enzima de la invención, puede ser particularmente ventajoso en casos donde puede ser deseable la acumulación de ácidos grasos libres, por ejemplo, en el queso donde los ácidos grasos libres pueden impartir un sabor deseado, o en la precipitación de alimentos selectos. El experto en la técnica podrá combinar proporciones de enzimas lipolíticas, por ejemplo, LIPOPAN® F y/o LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca), fosfolipasa A2 (p. ej., fosfolipasa A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts, LIPOMAX™ de Genecor), LIPOLASE ® (Novozymes A/S, Dinamarca), las lipasas enseñadas en los documentos WO03/97835, EP 0977869 o EP 1193314 y la lípido aciltransferasa de la presente invención para proporcionar la relación deseada de actividad hidrolítica a transferasa que dé como resultado un efecto técnico preferido o combinación de efectos técnicos en el producto alimenticio (tales como los citados en la presente memoria en “Efectos técnicos”).
Tradicionalmente, la industria de los pasteles usa mejoradores de pasteles para la producción de pasteles y para asegurar pasteles de alta calidad en términos de sabor, estructura, calidad al comerlo y aspecto. Estos mejoradores de pasteles normalmente se basan en emulsionantes secados por atomización en un vehículo tal como almidón o maltodextrina. Algunos mejoradores de pasteles también están en forma de gel basado en emulsionantes, azúcares y agua. Estos mejoradores de pasteles son muy importantes para la industria de los pasteles con el fin de producir pasteles de alta calidad. Sin embargo, los mejoradores de pasteles contienen emulsionantes y otros ingredientes “no naturales” con un número E. Debido a la demanda de los consumidores de reducir los números de los números E, la industria de los pasteles ha pedido formas alternativas de producir pasteles de calta calidad sin usar emulsionantes.
Una forma alternativa de producir pastel es el uso de una enzima, es decir, la lípido aciltransferasa definida en la presente memoria o una composición enzimática como se define en la presente memoria.
La lípido aciltransferasa y/o la composición enzimática alimentaria como se define en la presente memoria, se pueden usar en preparaciones de un alimento selecto, tal como un pastel. En dichos casos, se pueden formar los siguientes constituyentes en el alimento selecto:
i) ésteres de azúcares y lisolecitina (a partir de hidratos de carbono de la receta del pastel y la lecitina en el huevo que también que también forma parte de la receta del pastel); y/o
ii) péptidos acilados y lisolecitina (por transferencia de un ácido graso de la lecitina a una proteína o péptido durante la formación de condensados de proteína-ácido graso, que se sabe que son emulsionantes muy eficaces (Herstellung und Anvendungmöglichkeiten von Eiweiss-Fettsaurekondensaten. Andreas Sander, Eberhard Eilers, Andrea Heilemann, Edith von Kreis.Fett/lípido 99 (1997) Nr. 4, 115-120).
Se considera que en la producción de algunos alimentos selectos, en particular en alimentos selectos con alto contenido en grasa, como pasteles, puede ser conveniente tener alguna acumulación de ácidos grasos. Por lo tanto, la combinación del uso de enzimas lipolíticas y la lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria, puede ser particularmente beneficiosa para la producción de alimentos selectos con alto contenido de grasa. Alternativamente, se pueden seleccionar ácidos grasos libres adicionales o jabón de ácido graso (E470a) y usar en combinación con la lípido aciltransferasa.
El producto alimenticio usado de acuerdo con la presente invención puede comprender adecuadamente uno o más de los siguientes aditivos:
material de proteína de soja; carotenoides, flavonoides, antioxidante y productos fitoquímicos (en especial antocianinas, carotenoide, bioflavinoide, glutatión catequina, isoflavona, licopeno, ginsenósido, iycnogenol, alcaloide, fitoesterol pygeum, sulforafona, resveretol, extracto de semilla de uvas o alimento que contiene ésteres de estanol), vitamina (en especial vitamina C, vitamina A, vitamina B3, vitamina D, vitamina E, tiamina, riboflavina, niacina, piridoxina, cianocobalamina, ácido fólico, biotina, ácido pantoténico o vitamina K), minerales (en especial calcio, yodo, magnesio, zinc, hierro, selenio, manganeso, cromo, cobre, cobalto, molibdeno o fósforo), ácido graso (en especial ácido gamma-linoleico, ácido eicospentaenoico o ácido decosahexaenoico), aceite (en especial aceite de borraja, aceite de canola con alto contenido en carotenoides o aceite de semillas de lino), aminoácidos (en especial triptófano, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, valina, leucina, isoleucina, alanina, arginina, ácido aspártico, cistina, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, prolina, hidroxiprolina, serina, taurina o tirosina), enzima (en especial bromelaína, papaína, amilasa, celulasa o coenzima Q), lignina, éster de estanol o bacterias beneficiosas (en especial Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus plantarum o Streptococcus faecium), ácido fólico y fibra soluble.
Efecto técnico
Sorprendentemente, la lípido aciltransferasa tiene actividad de aciltransferasa significativa en productos alimenticios. Esta actividad tiene aplicaciones sorprendentemente beneficiosas en métodos de preparación de productos alimenticios.
La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que las lípido aciltransferasas de acuerdo con la presente invención puede realizar esterificación de hidratos de carbono vía alcoholisis, es decir, transferencia de acilo de un lípido, en un producto alimenticio con un contenido de agua significativo. La técnica anterior sugiere que dichas enzimas funcionaran en alguna medida de esta forma funcionarían solo en un entorno con disolvente (es decir, en entornos con bajo contenido de agua o sin agua).
La presente invención puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos inesperados en productos de huevo, en particular mayonesa: una estabilidad mejorada frente al calor durante la pasteurización; mejores propiedades organolépticas, una mejor consistencia.
La presente invención puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos inesperados en masas y/o productos horneados; un mejor volumen específico sea de la masa o de los productos horneados (por ejemplo de pan y/o de pasteles); una mejor estabilidad de la masa; una mejor calificación de la corteza (por ejemplo, una corteza de pan más fina y/o más crujiente), un mejor calificación de la miga (por ejemplo, una distribución de la miga más homogénea y/o una estructura de la miga más fina y/o una miga más blanda); un menor endurecimiento; una mejor blandura; un mejor olor; un mejor sabor.
La presente invención puede proporcionar un efecto beneficioso por la formación de materiales muy tensioactivos en un producto alimenticio sin formación de cantidad sustancial de ácidos grasos libres, que reducen la estabilidad del producto alimenticio frente a la oxidación en el almacenamiento, porque los ácidos grasos libres tienen más tendencia a la oxidación que los correspondientes ésteres de ácidos grasos. Adecuadamente, la presente invención puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos inesperados en un producto alimenticio: un mejor aspecto, una mejor sensación en la boca, una mejor estabilidad, en particular una mejor estabilidad térmica, un mejor sabor, una mejor blandura, una mejor resiliencia, una mejor emulsificación.
Adecuadamente, la presente invención puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos inesperados en productos lácteos, tales como helados por ejemplo: una mejor sensación en la boca (preferiblemente una sensación en la boca más cremosa); un mejor sabor, una mejor fusión.
Adecuadamente, la presente invención puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos inesperados en huevos o productos de huevo: mejor estabilidad de la emulsión; estabilidad térmica de la emulsión; mejor sabor; menor mal olor; mejores propiedades de espesamiento, mejor consistencia.
Los efectos técnicos específicos asociados con el uso de una lípido aciltransferasa como se definen en la presente memoria en la preparación de un producto alimenticio se citan en la siguiente tabla:
Producto alimenticio
Efecto
1
Pan, muffins y donuts Fortalece la masa y aumenta la resistencia mecánica y aumenta la capacidad de absorción de agua. Aumenta el volumen de los productos horneados y mantiene la blandura de la miga
2
Masa congelada Evita que se estropee durante la refrigeración
3
Bizcocho Hace un buen volumen de bizcocho y una textura blanda uniforme
4
Galleta dulce, galleta salada y galleta Hace emulsiones estables de grasa y evita la pegajosidad a la máquina. Evita la eflorescencia en productos con alto contenido en grasa
5
Rebozado y empanado Mejora la textura de productos fritos
6
Fideos Evita que la masa se pegue a la máquina. Aumenta el contenido de agua y disminuye la pérdida en la cocción
7
Fideos instantáneos Evita que los fideos se adhieran entre sí
8
Pasta El acondicionador de masa previene la adherencia al cocinar.
9
Crema pastelera Hace la pasta de almidón con una textura suave y cremosa y evita la deshidratación
10
Blanqueante de café Evita la separación de aceite y agua
11
Crema batida Proporciona emulsión estable
12
Chocolate Evita o reduce la eflorescencia
13
Caramelo, dulces y turrón Mejora la emulsión del azúcar fundido y azúcar. Previene la separación de aceite.
14
Carne procesada, salchichas Mejora la capacidad de mantener agua de las salchichas y jamón y evita la separación de la fase de aceite de pastas y paté
Adecuadamente, la presente invención puede proporcionar uno o más de los siguientes efectos técnicos inesperados en el queso: una disminución del efecto de pérdida de aceite en el queso; un aumento del rendimiento de queso; una mejora en el sabor; un mal olor reducido; un sabor “saponáceo” reducido.
En la producción de alimentos, en particular en la producción de queso, el uso de la lípido aciltransferasa de acuerdo
10 con la presente invención proporciona una ventaja significativa en la capacidad para recuperar proteínas solubles de los productos lácteos. Por ejemplo, en la producción de queso casi 20% de todas las proteínas de la leche se separan en el suero lácteo (es decir la parte acuosa de la leche que queda después de formar cuajadas). El suero lácteo comprende proteínas lácteas solubles, mientras que las proteínas hidrófobas se mantienen en la cuajada. Mediante el uso de la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención, se puede transferir un grupo acilo
15 desde un lípido (preferiblemente desde un glucolípido o un fosfolípido) a una proteína (en particular a una proteína láctea tal como la lactoglobulina) para formar un condensado de proteína y ácido graso. Por lo tanto, producción de un producto que es más hidrófobo y que permanecerá en la cuada en lugar de ser eluído en el suero lácteo. De este modo, más de la proteína láctea se puede mantener en el producto alimenticio final, es decir, el producto lácteo final tal como el queso.
20 En un aspecto, la presente invención se basa en parte en el hecho de que los rendimientos de alimentos, tales como el queso, pueden mejorar mediante el uso de una lípido aciltransferasa. Además o alternativamente, el sabor, textura, estabilidad oxidativa y/o la vida en anaquel del alimento pueden mejorar. Además, o alternativamente, el alimento puede tener un menor nivel de colesterol o un contenido potenciado de ésteres de fitoesterol/esterol.
Sin querer estar limitados por una teoría particular, se considera que el aumento del rendimiento puede ser resultado
25 de la transesterificación de las proteínas lácteas y péptidos, dando como resultado un aumento significativo de la hidrofobicidad de las proteínas lácteas y precipitación de las proteínas lácteas aciladas en la cuajada de queso.
En los sistemas biológicos, por ejemplo, la deposición de proteínas y enzimas unidas a membrana se logra por dos mecanismos diferentes. Las proteínas unidas a membrana bien tienen una serie de dominios que se extienden en la membrana o hidrófobos, o tienen alternativamente un ácido graso unido a la cadena de polipéptido. Los ácidos
grasos normalmente tienen una longitud de cadena de 14 a 16 átomos de carbono. Los ácidos grasos están covalentemente unidos a la cadena de polipéptido en 3 posiciones diferentes, el aminoácido N terminal como un enlace amida, un resto de cisteína como un enlace tioéster, o un aminoácido serina o treonina como un enlace éster. Solo es necesario un ácido graso por molécula de polipéptido para incorporar la proteína en la membrana celular.
Cuando un ácido graso se une covalentemente a una proteína que no es de membrana, las propiedades físicas y funcionales cambian notablemente. El documento WO97/14713 describe las proteínas de soja y gluten transformadas en derivados de acilo por tratamiento con una lipasa de Mucor miehei (Lipozyme™, Novozymes), y un ácido graso en un disolvente orgánico. La lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención se puede usar en la producción de proteínas aciladas en un entorno de alto o bajo contenido de agua.
Muchas proteínas de alimentos son solubles en soluciones acuosas y por lo tanto adecuadas para la modificación in situ por la lípido aciltransferasa. En la producción de queso, la β-lactoglobulina se pierde en la fracción de suero lácteo. Después de acilación con una lípido aciltransferasa, o una variante de lípido aciltransferasa, los resultados iniciales indican que, no obstante, la ß-lactoglobulina, se puede depositar en la superficie de la micela de caseína durante la coagulación del cuajo, la β-lactoglobulina tiene tres sitios de acilación potenciales (restos de serina) sobre tres bucles de la superficie. La leche contiene suficientes cantidades de lecitina, un sustrato adecuado para que una enzima lípido aciltransferasa acile la β-lactoglobulina. La lisolecitina formada puede tener un efecto emulsionante adicional.
Las mejoras observadas con la lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención se comparan con cuando se usan enzimas lipolíticas sin actividad de aciltransferasa, tales como triacilglicerol lipasas y fosfolipasas.
Ventajas
La generación de un emulsionante y un éster de esterol/estanol in situ a partir de al menos un constituyente del material alimenticio, significa que el material alimenticio contendrá al menos un material aditivo menos. Esto es una ventaja debido a la mejora en la facilitad de producción. Por ejemplo, no se requiere el procesamiento o adición de ingredientes o adición de emulsionantes adicionales. Además, el producto alimenticio contiene menos “aditivos”. La reducción o eliminación de “aditivos” es deseable por los consumidores y la inclusión de aditivos a menudo se debe declarar al consumidor en la lista de ingredientes del producto alimenticio. Por lo tanto, la presente invención es más ventajosa.
Una ventaja de la presente invención puede ser la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio sin un aumento perjudicial del contenido de ácidos grasos libres en el producto alimenticio.
La generación de dos emulsionantes y/o un éster de hidrato de carbono in situ a partir de la menos un constituyente del material alimenticio, significa que el material alimenticio contendrá al menos un material aditivo menos.
Además, cuando la lípido aciltransferasa actúa sobre un glucolípido, se pueden producir de forma ventajosa el emulsionante DGMG in situ sin un aumento perjudicial del contenido de ácidos grasos libres en el producto alimenticio. Por lo tanto, se reducen efectos perjudiciales atribuidos a un aumento en los ácidos grasos libres, que incluyen, pero no se limitan a una reducción del sabor “saponáceo” en el queso, prevención de sobredosis en la masa y propiedades de la masa horneada.
Para algunos aspectos, una ventaja de la presente invención es la reducción de los niveles de colesterol libre en el producto alimenticio.
Para otro aspecto, una ventaja de la presente invención es el aumento de los ésteres de estanol y/o esterol en el producto alimenticio. Algunos ésteres de estanol y/o esterol pueden ser saborizantes y/o texturizantes efectivos. Por lo tanto, la presente invención puede dar como resultado no solo la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio, sino también la producción in situ de un aromatizante y/o un texturizante. Se sabe que algunos ésteres de estanol y/o esterol reducen el colesterol en el suero sanguíneo y/o las lipoproteínas de baja densidad cuando se consumen en un producto alimenticio. Por lo tanto, la presente invención se puede usar para preparar un producto alimenticio con mayores niveles de ésteres de estanol y/o esterol.
Para algunos aspectos, en particular cuando la enzima de acuerdo con la presente invención se usa en productos basados en huevo, una ventaja es la eliminación de hidratos de carbono libres no deseados.
También ventajosamente, las propiedades de emulsión del producto alimenticio mejoran, conduciendo a mejores propiedades de aspecto y/o manipulación y/o estructura y/o consistencia y/o estabilidad térmica sin un impacto negativo en el sabor.
Además, para algunas realizaciones ventajosamente el efecto de “sobredosis” observado cuando se usan lipasas, se supera eficazmente mediante la adición de una enzima de acuerdo con la presente invención. Esto se debe al menos en parte al hecho de que no se producen ácidos grasos libres o se producen solo en un grado insignificante cuando se usa la enzima de acuerdo con la presente invención.
Aislado
En un aspecto, preferiblemente el polipéptido o proteína para usar en la presente invención está en una forma aislada. El término “aislado” significa que la secuencia está al menos sustancialmente exenta de al menos algún otro componente con el que la secuencia se encuentra asociada de forma natural y como se encuentra en la naturaleza.
Purificado
En un aspecto, preferiblemente el polipéptido o proteína para usar en la presente invención está en una forma purificada. El término “purificado” significa que la secuencia está en un estado relativamente puro, p. ej., al menos aproximadamente 51% puro, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% puro, o al menos aproximadamente 95% puro o al menos aproximadamente 98% puro.
Clonación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con la presente invención
Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria o un polipéptido que es adecuado para la modificación, se puede aislar de cualquier célula u organismo que produce dicho polipéptido. Se conocen diferentes métodos en la técnica para el aislamiento de secuencias de nucleótidos.
Por ejemplo, se puede construir una biblioteca de ADN genómico y/o cADN usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce el polipéptido. Si la secuencia de aminoácidos del polipéptido es conocida, se pueden sintetizar sondas de oligonucleótidos marcadas y usar para identificar los clones que codifican el polipéptido a partir de la biblioteca genómica preparada a partir del organismo. Alternativamente, se podría usar una sonda de oligonucleótido marcada que contiene secuencias homólogas a otro polipéptido de gen para identificar clones que codifican el polipéptido. En el último caso, se usan condiciones de hibridación y lavado de menor restricción.
Alternativamente, los clones que codifican polipéptidos se podrían identificar por inserción de fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformación de bacterias negativas para la enzima con la biblioteca de ADN genómico resultante, y después cultivo en placa de las bacterias transformadas en agar que contiene una enzima inhibida por el polipéptido, permitiendo así que los clones expresen el polipéptido que se va a identificar.
En una alternativa adicional más, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se puede preparar de forma sintética por métodos estándar establecidos, p. ej., el método de la fosforamidita descrito por Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, pág. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO J. 3, pág 801
805. En el método de la fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, p. ej., en un sintetizador de ADN automático, se purifican, reasocian, ligan y clonan en vectores apropiados.
La secuencia de nucleótidos puede ser de origen mixto genómico y sintético, de origen mixto sintético y de ADNc, o de origen mixto genómico y de ADNc, preparada por ligado de fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea adecuado) de acuerdo con técnicas estándar. Cada fragmento ligado corresponde a diferentes partes de la secuencia de nucleótidos entera. La secuencia de ADN también se puede preparar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.683.202 o en Saiki R K et al (Science (1988) 239, pág. 487-491).
Secuencias de nucleótidos
La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen propiedades específicas como se define en la presente memoria. La expresión “secuencia de nucleótidos” como se usa en la presente memoria se refiere a una secuencia de oligonucleótido o secuencia de polinucleótido, y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de la misma (tal como partes de la misma). La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico o sintético o recombinante, la cual puede ser bicatenaria o monocatenaria represente la cadena del mismo sentido o de sentido contrario.
La expresión “secuencia de nucleótidos” en relación con la presente invención incluye ADN genómico, cADN, ADN sintético y ARN. Preferiblemente significa ADN, más preferiblemente cADN para la secuencia codificante.
En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos por sí misma que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se definen en la presente memoria, no cubre la secuencia de nucleótidos natural en su entorno natural cuando está unida a su o sus secuencias asociadas de forma natural que está/están en su entorno natural. Como referencia, se puede llamar a esta realización preferida la “secuencia de nucleótidos no natural”. En relación con esto, la expresión “secuencia de nucleótidos natural” significa una secuencia de nucleótidos entera que está en su entorno natural y cuando está operativamente unida a un promotor entero con el que está naturalmente asociado, cuyo promotor también está en su entorno natural. Por lo tanto, el polipéptido de la presente invención puede ser expresado por una secuencia de nucleótidos en su organismo natural, pero en donde la secuencia de nucleótidos no está bajo el control del promotor con el que está naturalmente asociado dentro de ese organismo.
Preferiblemente, el polipéptido no es un polipéptido natural. En relación con esto, la expresión “polipéptido natural” significa un polipéptido entero que está en su entorno natural y cuando ha sido expresado por su secuencia de nucleótidos natural.
Típicamente, la secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se definen en la presente memoria, se prepara usando técnicas de ADN recombinante (es decir ADN recombinante). Sin embargo, en una realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos podría sintetizarse entera o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
Evolución molecular
Una vez que se ha aislado la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, o se ha identificado una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima putativa, puede ser deseable modificar la secuencia de nucleótidos seleccionada, por ejemplo, puede ser deseable mutar la secuencia con el fin de preparar una enzima de acuerdo con la presente invención.
Las mutaciones se pueden introducir usando oligonucleótidos sintéticos. Las secuencias de nucleótidos contienen oligonucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados.
Se describe un método adecuado en Morinaga et al. (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Se describe otro método de introducción de mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican enzimas se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, pág. 147-151).
En lugar de la mutagénesis dirigida, como se ha descrito antes, se pueden introducir mutaciones de forma aleatoria usando, por ejemplo, un kit comercial tal como el kit de mutagénesis GeneMorph PCR de Stratagene, o el kit de mutagénesis aleatoria de Diversify PCR de Clontech. El documento EP 0583265 se refiere a métodos de optimización de mutagénesis basada en PCR, que también se pueden combinar con el uso de análogos de ADN mutagénicos tales como los descritos en el documento EP 0866796. Las tecnologías de PCR propensas a error son adecuadas para la producción de variantes de lípido aciltransferasas con características preferidas. El documento WO0206457 se refiere a la evolución molecular de lipasas.
Un tercer método para obtener nuevas secuencias es fragmentar secuencias de nucleótidos no idénticas, sea usando cualquier número de enzimas de restricción o una enzima tal como la Dnasa I, y volviendo a ensamblar secuencias de nucleótidos completas que codifican proteínas funcionales. Alternativamente, se pueden usar una o múltiples secuencias de nucleótidos no idénticas e introducir mutaciones durante el ensamblaje de nuevo de la secuencia de nucleótidos completa. El barajado de ADN y las tecnologías de barajado de familias son adecuados para la producción de variantes de lípido aciltransferasas con características preferidas. Se pueden encontrar métodos adecuados para llevar a cabo el “barajado” en los documentos EP075008, EP1138763, EP1103606. El barajado también se puede combinar con otras formas de mutagénesis de ADN como se describe en los documentos US 6.180.406 y WO 01/34835.
Por lo tanto, se pueden producir numerosas mutaciones dirigidas o aleatorias en una secuencia de nucleótidos, sea in vitro o in vivo, y posteriormente cribar la funcionalidad mejorada del polipéptido codificado por varios medios. Usando métodos de recombinación mediada por exo e in silico (véanse los documentos WO 00/58517, US 6.344.328, US 6.361.974), por ejemplo, se puede llevar a cabo la evolución molecular donde la variante producida retiene una homología muy baja con respecto a las enzimas o proteínas conocidas. Dichas variantes obtenidas de esta forma pueden tener analogía estructural significativa con enzimas transferasa conocidas, pero tienen una homología de secuencia de aminoácidos muy baja.
Como un ejemplo no limitante, además, se pueden recombinar mutaciones o variantes naturales de una secuencia de polipéptidos con el tipo natural u otras mutaciones o variantes naturales para producir nuevas variantes. Dichas nuevas variantes también se pueden cribar según la funcionalidad mejorada del polipéptido codificado.
La aplicación de los métodos de evolución molecular mencionados antes y similares permite la identificación y selección de variantes de las enzimas de la presente invención que tienen características preferidas sin ningún conocimiento previo de la estructura o función de la proteína, y permite la producción de mutaciones no predecibles pero beneficiosas o variantes. Hay muchos ejemplos de la aplicación de la evolución molecular en la técnica para la optimización o alteración de la actividad enzimática, dichos ejemplos incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: expresión y/o actividad optimizada en una célula hospedante o in vitro, mayor actividad enzimática, sustrato alterado y/o especificidad del producto, mayor o menor estabilidad enzimática o estructura, actividad/especificidad enzimática alterada en condiciones ambientales preferidas, p. ej., temperatura, pH, sustrato.
Como será evidente para un experto en la técnica, mediante el uso de herramientas de evolución molecular, se puede alterar una enzima para mejora la funcionalidad de la enzima.
Las enzimas, tales como las lipasas sin actividad o actividad baja de lípido aciltransferasa en un entorno acuoso se pueden hacer mutar usando herramientas de evolución molecular para introducir o potenciar la actividad de
transferasa, produciendo de esta forma una enzima lípido aciltransferasa con actividad de transferasa significativa adecuada para usar en las composiciones y métodos de la presente invención.
Adecuadamente, la lípido aciltransferasa para usar en la invención puede ser una variante con actividad enzimática potenciada en lípidos polares, preferiblemente fosfolípidos y/o glucolípidos cuando se compara con la enzima original. Preferiblemente, dichas variantes tienen actividad baja o no tienen actividad en lípidos polares liso. La actividad potenciada en lípidos polares, fosfolípidos y/o glucolípidos puede ser el resultado de la hidrólisis y/o actividad de transferasa o una combinación de ambos.
Las lípido aciltransferasas variantes para usar en la invención pueden tener una menor actividad en triglicéridos y/o monoglicéridos y/o diglicéridos comparados con la enzima original.
Adecuadamente, la enzima variante puede no tener actividad en triglicéridos y/o monoglicéridos y/o diglicéridos.
Alternativamente, la enzima variante para usar en la invención puede tener mayor actividad en triglicéridos, y/o puede tener también mayor actividad en uno o más de los siguientes lípidos polares, fosfolípidos, lecitina, fosfatidillcolina, glucolípidos, digalactosil-monoglicérido, monogalactosil-monoglicérido.
Las variantes de lípido aciltransferasas son conocidas, y una o más de dichas variantes puede ser útil para usar en los métodos y usos de acuerdo con la presente invención y/o en las composiciones enzimáticas de acuerdo con la presente invención. A modo de ejemplo solo, las variantes de lípido aciltransferasas descritas en las siguientes referencias se pueden usar de acuerdo con la presente invención: Hilton y Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3):2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3):587-99.
Secuencias de aminoácidos
La presente invención también abarca secuencias de aminoácidos de polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se definen en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “secuencia de aminoácidos” es sinónima del término “polipéptido” y/o del término “proteína”. En algunos casos, la expresión “secuencia de aminoácidos” es sinónima del término “péptido”.
La secuencia de aminoácidos se puede preparar/aislar a partir de una fuente adecuada, o se puede hacer de forma sintética o se puede preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinantes.
Adecuadamente, las secuencias de aminoácidos se pueden obtener a partir de polipéptidos aislados enseñados en la presente memoria, por técnicas convencionales.
Un método adecuado para determinar secuencias de aminoácidos a partir de polipéptidos aislados es como sigue:
El polipéptido purificado se puede liofilizar, y 100 µg de material liofilizado se puede disolver en 50 µl de una mezcla de urea 8 M e hidrogenocarbonato amónico 0,4 M, pH 8,4. La proteína disuelta se puede desnaturalizar y reducir durante 15 minutos a 50ºC, seguido de cubrimiento con una capa de nitrógeno y adición de 5 µl de ditiotreitol 45 mM. Después de enfriar a temperatura ambiente, se pueden añadir 5 µl de yodoacetamida 100 mM para derivatizar los restos de cisteína durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad en atmósfera de nitrógeno.
Se pueden añadir 135 µl de agua y 5 µg de endoproteínasa Lys-C en 5 µl de agua a la mezcla de reacción anterior y la digestión se puede llevar a cabo a 37ºC en atmósfera de nitrógeno durante 24 horas.
Los péptidos resultantes se pueden separar por HPLC de fase inversa en una columna VYDAC C18 (0,46x15 cm; 10 µm; The Separation Group, California, EEUU.) usando el disolvente A: TFA al 0,1% en agua y el disolvente B: TFA al 0,1% en acetonitrilo. Los péptidos seleccionados se pueden volver a cromatografiar en una columna Develosil C18 usando el mismo sistema de disolvente, antes de la secuenciación N-terminal. La secuenciación se puede hacer usando un secuenciador Applied Biosystems 476A usando ciclos rápidos de líquido pulsado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, California, EE.UU.).
Identidad de secuencia y homología de secuencia
La presente invención también abarca el uso de secuencias que tienen un grado de identidad de secuencia o una homología de secuencia con la o las secuencias de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido (en lo sucesivo denominado una “secuencia(s) homóloga(s)”). Aquí, el término “homólogo” significa una entidad que tiene una determinada homología con las secuencias de aminoácidos objeto y las secuencias de nucleótidos objeto. Aquí, el término “homología” se puede equiparar con “identidad”.
La secuencia de aminoácidos homóloga y/o secuencia de nucleótidos debería proporcionar y/o codificar un polipéptido que retiene la actividad funcional y/o potencia la actividad de la enzima.
En el presente contexto, una secuencia homóloga se considera que incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 75, 85 o 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 o 98% idéntica a la secuencia objeto. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos etc. que la secuencia de aminoácidos objeto. Aunque la homología siempre se puede considerar en términos de similitud (es decir, restos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
En el presente contexto, una secuencia homóloga se considera que incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos 75, 85 o 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 o 98% idéntica a la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención (la secuencia objeto). Típicamente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos etc. que la secuencia objeto. Aunque la homología siempre se puede considerar en términos de similitud (es decir, restos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
Las comparaciones de homología se pueden llevar a cabo a simple vista, o más habitualmente con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de ordenador disponibles en el mercado pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.
El % de homología se puede calcular a lo largo de secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en la secuencia se compara directamente con el correspondiente aminoácido en la otra secuencia, un resto cada vez. Esto se llama alineamiento “sin huecos”. Típicamente, dichos alineamientos sin hueco se llevan a cabo solo a lo largo de un número relativamente corto de restos.
Aunque esto es un método muy sencillo y consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o eliminación hará que los siguientes restos de aminoácidos estén fuera de alineamiento, dando como resultado potencialmente una gran reducción en el % de homología cuando se lleve a cabo un alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta posibles inserciones y eliminaciones sin penalizar innecesariamente la puntuación de homología global. Esto se logra insertando “huecos” en el alineamiento de las secuencias para intentar maximizar la homología global.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan “penalizaciones por hueco” a cada hueco que aparece en el alineamiento de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con tan pocos huecos como sea posible, que refleja mayor relación entre las dos secuencias comparadas, logrará una puntuación mayor que una con muchos huecos. Típicamente se usan “costes de huecos afines” que cargan un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización menor para cara resto siguiente en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos usado más habitualmente. Las penalizaciones por huecos altas por supuesto producirán alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa dicho software para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete de programas GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.
El cálculo de % de homología máximo requiere, por lo tanto, primero la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta penalizaciones por huecos. Un programa de ordenador adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento en el paquete de programas GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Los ejemplos de otro software que puede llevar a cabo comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan, al paquete de programas BLAST (véase Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed capítulo 18), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Para BLAST y FASTA están disponibles búsquedas desconectado o conectado (véase Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. También está disponible una nueva herramienta llamada BLAST 2 Sequences para la comparación de secuencias de proteínas y nucleótidos (véase, FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 1878 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
Aunque el % final de homología se puede medir en términos de identidad, el propio procedimiento de alineamiento típicamente no se basa en una comparación de parejas de todo o nada. En su lugar, en general se usa una matriz de puntuación de similitud escalonada, que asigna puntuaciones a cada comparación de parejas basado en la similitud química o distancia de evolución. Un ejemplo de dicha matriz usada habitualmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin en general usan los valores por defecto públicos, o una tabla de comparación de símbolos personalizada si se suministra (véase el manual del usuario para detalles adicionales). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete de programas GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Alternativamente, el porcentaje de homologías se puede calcular usando la característica de alineamiento múltiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basado en un algoritmo análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).
Una vez que el programa ha producido un alineamiento óptimo, se puede calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El programa típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
Las secuencias pueden tener eliminaciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos deliberadas basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos siempre que se retenga la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, y tirosina.
Se pueden hacer sustituciones conservativas, por ejemplo de acuerdo con la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma fila en la tercera columna se pueden sustituir entre sí.
ALIFÁTICO
No polar G A P
I L V
Polar -no cargado
C S T M
N Q
Polar -cargado
D E
K R
AROMÁTICO
H F W Y
La presente invención también abarca la sustitución homóloga (sustitución y reemplazo se usan ambos en la presente memoria para indicar el intercambio de un resto de aminoácido existente por un resto alternativo) que se puede producir, es decir, sustitución de similar por similar, tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También se puede producir sustitución no homóloga, es decir, de una clase de resto por otra o alternativamente que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (denominado en lo sucesivo Z), ácido diaminobutírico ornitina (denominado en lo sucesivo B), norleucina ornitina (denominado en lo sucesivo O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Las sustituciones también se pueden hacer por aminoácidos no naturales.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que se pueden insertar entre cualesquiera dos restos de aminoácidos de la secuencia que incluye grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores aminoácidos tales como restos glicina o β-alanina. Una forma adicional de variación implica la presencia de uno o más restos de aminoácidos en forma peptoide, que entenderán bien los expertos en la técnica. Para evitar dudas, “la forma peptoide” se usa para referirse a los restos de aminoácidos variantes en donde el grupo sustituyente del carbono α está en el átomo de nitrógeno del resto en lugar de en el carbono α. Los procedimientos para preparar péptidos en forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
Las secuencias de nucleótidos para usar en la presente invención o que codifican un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, pueden incluir dentro de las mismas nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la técnica una serie de tipos diferentes de modificaciones de oligonucleótidos. Estos incluyen cadenas principales de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de acridina o cadenas de polilisina en los extremos 3’ y/o 5’ de la molécula. Para los fines de la presente invención, se entiende que las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria se pueden modificar por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones se pueden llevar a cabo con el fin de potenciar la actividad in vivo o la vida útil de las secuencias de nucleótidos.
La presente invención también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias descritas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado del mismo. Si la secuencia es complementaria a un fragmento del mismo, entonces la secuencia se puede usar como una sonda para identificar secuencias codificantes similares en otros organismos etc.
Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a las secuencias de la presente invención, pero están dentro del alcance de la invención, se pueden obtener en una serie de formas. Otras variantes de las secuencias descritas en la presente memoria se pueden obtener, por ejemplo, mediante la detección de bibliotecas de ADN hechas a partir de una variedad de individuos, por ejemplo, individuos de diferentes poblaciones. Además, se pueden obtener otros homólogos víricos/bacterianos o celulares, en particular homólogos celulares encontrados en células de mamíferos
(p. ej., células de rata, ratón, bovino y primates) y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar selectivamente con las secuencias mostradas en la lista de secuencias de la presente memoria. Dichas secuencias se pueden obtener por detección de bibliotecas de cADN hechas a partir de bibliotecas de ADN genómico de otras especies animales, y detección de dichas bibliotecas con sondas que comprenden todo o parte de una cualquiera de las secuencias en las listas de secuencias adjuntas en condiciones de restricción de media a alta. Se aplican consideraciones similares para obtener especies homólogas y variantes alélicas de las secuencias de polipéptidos o de nucleótidos de la invención.
Las variantes y homólogos de cepa/especie también se pueden obtener usando PCR degenerada que usará cebadores diseñados para dirigirse a secuencias en las variantes y homólogos que codifican las secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas se pueden predecir, por ejemplo, por alineamiento de las secuencias de aminoácido de varias variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencia se pueden llevar a cabo usando programas de ordenador conocidos en la técnica. Por ejemplo, se usa ampliamente el programa GCG Wisconsin PieUp.
Los cebadores usados en la PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de restricción más bajas que las usadas para las secuencias de clonación con cebadores de secuencia individuales contra secuencias conocidas.
Alternativamente, dichos polinucleótidos se pueden obtener por mutagénesis dirigida de las secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil donde se requieren, por ejemplo, cambios de secuencias de codón silenciosas para optimizar las preferencias de codones para una célula hospedante particular en la que se están expresando las secuencias de polinucleótidos. Se pueden desear otros cambios de secuencias con el fin de introducir sitios de reconocimiento de polipéptidos de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.
Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos) de la invención se pueden usar para producir un cebador, p. ej., un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda, p. ej., marcada con un marcador de descripción por medios convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán al menos 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo, al menos 25, 30 o 40 nucleótidos de longitud, y también están abarcados por el término polinucleótidos de la invención como se usa en la presente memoria.
Los polinucleótidos tales como polinucleótidos de ADN y sondas de acuerdo con la invención se pueden producir de forma recombinante, sintética o por cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También se pueden clonar por técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán por medios sintéticos, que implican una fabricación por pasos de un nucleótido cada vez de la secuencia de ácido nucleico deseada. Las técnicas para llevar a cabo esto usando técnicas automáticas están fácilmente disponibles en la técnica.
En general, los polinucleótidos más largos se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas de clonación de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará hacer una pareja de cebadores
(p. ej., de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una región de la secuencia de lípido objetivo que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con el mARN o cADN obtenido de una célula animal o humana, llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que producen la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (p. ej., purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores se pueden diseñar para contener sitios de enzimas de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados, de modo que el ADN amplificado se puede clonar en un vector de clonación adecuado.
Hibridación
La presente invención también abarca secuencias que son complementarias de las secuencias de la presente invención o secuencias que son capaces de hibridar bien con las secuencias de la presente invención o con secuencias que son complementarias a las mismas.
El término “hibridación” como se usa en la presente memoria incluirá “el procedimiento por el cual una cadena de ácido nucleico se junta con una cadena complementaria mediante emparejamiento de bases” así como el procedimiento de amplificación llevado a cabo en las tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La presente invención también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias que son complementarias de las secuencias objeto descritas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas.
La presente invención también abarca secuencias que son complementarias de las secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria.
Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión de nucleótidos, como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), y confieren una “restricción” definida como se explica a continuación.
La restricción máxima típicamente se produce a aproximadamente Tm-5°C (5°C por debajo de la Tm de la sonda); la restricción alta aproximadamente de 5°C a 10°C por debajo de la Tm; la restricción intermedia aproximadamente de 10°C a 20°C por debajo de la Tm; y la restricción baja aproximadamente de 20°C a 25°C por debajo de la Tm. Como entenderán los expertos en la técnica, se puede usar una hibridación con restricción máxima para identificar o detectar secuencias de nucleótidos idénticas, mientras que se puede usar una hibridación con restricción intermedia (o baja) para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos similares o relacionadas.
Preferiblemente, la presente invención abarca secuencias que son complementarias de las secuencias que son capaces de hibridar en condiciones de restricción alta o en condiciones de restricción intermedia, con secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se definen en la presente memoria.
Más preferiblemente, la presente invención abarca secuencias que son complementarias de las secuencias que son capaces de hibridar en condiciones de restricción alta (p. ej., 65°C y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M, citrato-Na 0,015 M a pH 7,0}) con secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas como se definen en la presente memoria.
La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria (que incluyen secuencias complementarias a las descritas en la presente memoria).
La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias de las secuencias que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria (que incluyen secuencias complementarias a las descritas en la presente memoria).
También están incluidas en el alcance de la presente invención secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria en condiciones de restricción de intermedia a máxima.
En un aspecto preferido, la presente invención cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria, o las complementarias de las mismas, en condiciones de restricción (p. ej., 50°C y 0,2xSSC).
En un aspecto más preferido, la presente invención cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria, o las complementarias de las mismas, en condiciones de restricción alta (p. ej., 65°C y 0,1xSSC).
Expresión de polipéptidos
Una secuencia de nucleótidos para usar en la presente invención o para codificar un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, se puede incorporar en un vector replicable recombinante. El vector se puede usar para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma de polipéptido, en y/o a partir de una célula hospedante compatible. La expresión se puede controlar usando secuencias de control que incluyen promotores/potenciadores y otras señales de regulación de la expresión. Se pueden usar promotores de procariotas y promotores funcionales en células eucariotas. Se pueden usar promotores específicos de tejido o específicos de estímulo. También se pueden usar promotores quiméricos que comprenden elementos de secuencia de dos o más promotores diferentes descritos antes.
El polipéptido producido por una célula recombinante hospedante por expresión de la secuencia de nucleótidos puede ser secretada o puede estar contenida de forma intracelular dependiendo de la secuencia y/o vector usados. Las secuencias codificantes se pueden diseñar con secuencias señal que dirigen la secreción de las secuencias de nucleótidos de la sustancia a través de una membrana de célula procariota o eucariota particular.
Vector de expresión
La frase “vector de expresión” significa una construcción capaz de expresión in vivo o in vitro.
Preferiblemente, el vector de expresión se incorpora en el genoma del organismo. El término “incorpora” preferiblemente cubre la incorporación estable del genoma.
La secuencia de nucleótidos de la presente invención o que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se definen en la presente memoria, puede estar presente en un vector, en el que la secuencia de
nucleótidos está operativamente unida a secuencias reguladoras de modo que las secuencias reguladoras son capaces de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos por un organismo hospedante adecuado, es decir, el vector es un vector de expresión.
Los vectores de la presente invención se pueden transformar en una célula hospedante adecuada como se describe más adelante para proporcionar un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria.
La elección del vector, p. ej., plásmido, cósmido, virus o vector fago, dependerá a menudo de la célula hospedante en la que se va a introducir.
Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, tal como un gen que confiere resistencia a antibióticos, p. ej., resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Alternativamente, la selección se puede llevar a cabo por cotransformación (como se describe en el documento WO91/17243).
Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o se pueden usar para transfectar o transformar una célula hospedante.
Por lo tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un método para hacer secuencias de nucleótidos de la presente invención o secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria, por introducción de una secuencia de nucleótidos en un vector replicable, introducción del vector en una célula hospedante compatible, y cultivando la célula hospedante en condiciones que producen la replicación del vector.
El vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos que permite que el vector se multiplique en la célula hospedante en cuestión. Los ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.
Secuencias reguladoras
En algunas aplicaciones, una secuencia de nucleótidos para usar en la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, se puede unir operativamente a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos, tal como por la célula hospedante elegida. A modo de ejemplo, la presente invención cubre un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención operativamente unida a dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.
La expresión “operativamente unido” se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia reguladora “operativamente unida” a una secuencia codificante está ligada de modo que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
La expresión “secuencias reguladoras” incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión.
El término “promotor” se usa en el sentido normal de la técnica, p. ej., un sitio de unión de ARN polimerasa.
La expresión potenciada de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, se puede lograr por selección de regiones reguladoras heterólogas, p. ej., regiones promotora, líder de secreción y terminadora.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar operativamente unida a al menos un promotor.
Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos en un hospedante bacteriano, fúngico o levadura, son bien conocidos en la técnica.
Construcciones
El término “construcción”, que es sinónimo de términos tales como “conjugado”, “casete” e “híbrido”, incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, para usar de acuerdo con la presente invención directa o indirectamente unido a un promotor. Un ejemplo de una unión indirecta es proporcionar un grupo espaciador adecuado tal como una secuencia de intrón, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, intermedio del promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es cierto para el término “fusionado” en relación con la presente invención, en la que incluye la unión directa
o indirecta. En algunos casos, los términos no cubren la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína normalmente asociada con el promotor de gen de tipo natural y cuando están ambos en su entorno natural.
La construcción puede incluso contener o expresar un marcador que permite la selección de la construcción genética.
Para algunas aplicaciones, preferiblemente la construcción comprende al menos una secuencia de nucleótidos de la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, operativamente unida a un promotor.
Células hospedantes
La expresión “célula hospedante” en relación con la presente invención, incluye cualquier célula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria o un vector de expresión como se ha descrito antes y que se usa en la producción recombinante de un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se definen en la presente memoria.
Por lo tanto, una realización adicional de la presente invención proporciona células hospedantes transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos de la presente invención o una secuencia de nucleótidos que expresa un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria. Las células se elegirán para ser compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo, bacterianas), fúngicas, de levadura o plantas. Preferiblemente, las células hospedantes no son células humanas.
Los ejemplos de organismos hospedantes bacterianos adecuados son bacterias Gram negativas o bacterias Gram positivas.
Dependiendo de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, y/o la conveniencia de procesamiento adicional de la proteína expresada, se pueden preferir hospedantes eucariotas tales como levaduras u otros hongos. En general, se prefieren las células de levaduras frente a las células fúngicas debido a su mayor facilidad de manipulación. Sin embargo, algunas proteínas son secretadas pobremente de la célula de levadura, o en algunos casos no son procesadas de forma adecuada (p. ej., hiperglucosilación en la levadura). En estos casos, se debe seleccionar un organismo hospedante fúngico diferente.
El uso de células hospedante adecuadas, tales como células hospedantes de levadura, fúngicas y de plantas, pueden proporcionar modificaciones postraduccionales (p. ej., miritoilación, glucosilación, truncado, lapidado y fosforilación de tirosina, serina y treonina) según se necesite para conferir actividad biológica óptima en productos de expresión recombinantes de la presente invención.
La célula hospedante puede ser una cepa deficiente en proteasa o negativa en proteasa.
Organismo
El término “organismo” en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que puede comprender una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria y/o productos obtenidos a partir de estas.
Los organismos adecuados pueden incluir un procariota, hongo, levadura o una planta.
La expresión “organismo transgénico” en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria y/o los productos obtenidos a partir de estas, y/o en donde el promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria dentro del organismo. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos se incorpora en el genoma del organismo.
La expresión “organismo transgénico” no cubre las secuencias de nucleótidos codificantes naturales en su entorno natural cuando se usan bajo el control de su promotor natural que también está en su entorno natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico de la presente invención incluye un organismo que comprende una cualquiera de, o combinaciones de, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, construcciones como se definen en la presente memoria, vectores como se definen en la presente memoria, plásmidos como se definen en la presente memoria, células como se definen en la presente memoria, o los productos de los mismos. Por ejemplo, el organismo transgénico también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, bajo el control de un promotor heterólogo.
Transformación de células/organismos hospedantes
Como se ha indicado antes, el organismo hospedante puede ser un organismo procariota o eucariota. Los ejemplos de hospedantes procariotas adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilis.
Las enseñanzas sobre la transformación de células procariotas están bien documentadas en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Si se usa un hospedante procariota, entonces puede ser necesario modificar adecuadamente la secuencia de nucleótidos antes de transformación, de modo que se eliminen los intrones.
En otra realización el organismo transgénico puede ser una levadura.
Las células fúngicas filamentosas se pueden transformar usando diferentes métodos conocidos en la técnica, tal como un procedimiento que implica la formación de protoplastos y transformación de los protoplastos seguido de regeneración de la pared celular de una forma conocida. El uso de Aspergillus como un microorganismo hospedante se describe en el documento EP 0238023.
Otro organismo hospedante puede ser una planta. Se puede encontrar una revisión de las técnicas generales usadas para transformar plantas en artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27). Se pueden encontrar enseñanzas adicionales en transformación de plantas en el documento EP-A-0449375.
Se presentan enseñanzas generales en la transformación de hongos, levaduras y plantas en las siguientes secciones.
Hongos transformados
Un organismo hospedante puede ser un hongo, tal como un hongo filamentoso. Los ejemplos de dichos hospedantes adecuados incluyen cualquier miembro que pertenezca a los géneros Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma y similares.
Se revisan enseñanzas sobre la transformación de hongos filamentosos en el documento US-A-5741665 que afirma que las técnicas convencionales para la transformación de hongos filamentosos y el cultivo de hongos son bien conocidas en la técnica. Se encuentra una amplia revisión de las técnicas aplicadas a N. crassa, por ejemplo, en Davis y de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
Se revisan enseñanzas adicionales en la transformación de hongos filamentosos en el documento US-A-5674707.
En un aspecto, el organismo hospedante puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.
También se puede preparar un Aspergillus transgénico de acuerdo con la presente invención siguiendo, por ejemplo, las enseñanzas de Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. En: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666).
La expresión de genes en hongos filamentosos se ha revisado en Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May;20(5):200-6, Archer y Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.
Levaduras transformadas
En otra realización, el organismo transgénico puede ser una levadura.
Una revisión de los principios de expresión de genes heterólogos se proporciona, por ejemplo, en Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, y Curr Opin Biotechnol (1997) Oct;8(5):554-60
En relación con esto, se pueden usar levaduras, tales como las especies Saccharomyces cerevisi o Pichia pastoris (véase FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), como un vehículo para la expresión de genes heterólogos.
Se da una revisión de los principios de expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y secreción de productos génicos en E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, eds, 2ª edición, Academic Press Ltd.).
Para la transformación de levaduras, se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, un Saccharomyces transgénico de acuerdo con la presente invención se puede preparar siguiendo las enseñanzas de Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); y Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
Las células de levadura transformadas se pueden seleccionar usando diferentes marcadores selectivos, tales como marcadores auxótrofos, marcadores de resistencia a antibióticos dominantes.
Un organismo hospedante de levadura adecuado se puede seleccionar de especies de levaduras biotecnológicamente relevantes tales como, pero no limitado a especies seleccionadas de Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces, Yarrowinia spp., Saccharomyces spp., incluyendo S. cerevisiae, o Schizosaccharomyce spp. incluyendo Schizosaccharomyce pombe.
Se puede usar una cepa de la especie de levadura metilotrófica Pichia pastoris como el organismo hospedante.
En una realización, el organismo hospedante puede ser una especie Hansenula, tal como H. polymorpha (como se describe en el documento WO01/39544).
Plantas/células vegetales transformadas
Un organismo hospedante adecuado para la presente invención puede ser una planta. Se puede encontrar una revisión de las técnicas generales en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27), o en el documento WO01/16308. La planta transgénica puede producir niveles potenciados de ésteres de fitoesterol y ésteres de fitoestanol, por ejemplo.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para la producción de una planta transgénica con niveles potenciados de ésteres de fitoesterol y ésteres de fitoestanol, que comprende las etapas de transformar una célula de planta con una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria (en particular con un vector de expresión o construcción que comprende una lípido aciltransferasa como se define en la presente memoria), y cultivar una planta a partir de la célula de planta transformada.
Secreción
A menudo es deseable que el polipéptido sea secretado del hospedante de expresión en el medio de cultivo del cual la enzima se puede recuperar más fácilmente. De acuerdo con la presente invención, la secuencia líder de secreción se puede seleccionar basándose en el hospedante de expresión deseado. Las secuencias señal híbridas también se pueden usar con el contexto de la presente invención.
Los ejemplos típicos de secuencias líder de secreción heterólogas son las que proceden del gen de amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA -las versiones tanto de 18 como de 24 aminoácidos p. ej., de Aspergillus), el gen del a-factor (levaduras p. ej., Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de la α-amilasa (Bacillus).
Detección
Se conoce una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de la secuencia de aminoácidos en la técnica. Los ejemplos incluyen análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y separación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y se pueden usar en diferentes ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos.
Una serie de empresas tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), y US Biochemical Corp (Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para estos procedimientos.
Las moléculas indicadoras adecuadas o marcadores incluyen los agentes radionucleidos, enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes y cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen US-A-3.817.837; US-A-3.850.752; US-A3.939.350; US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; USA-4.275.149 y US-A-4.366.241.
También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en el documento US-A-4.816.567.
Proteínas de fusión
Se puede producir un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria como una proteína de fusión, por ejemplo, para ayudar a su extracción y purificación. Los ejemplos de parejas de las proteínas de fusión incluyen glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de activación transcripcional y/o unión al ADN) y β-galactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica entre la pareja de la proteína de fusión y la secuencia de la proteína de interés, para permitir la separación de las secuencias de la proteína de fusión. Preferiblemente la proteína de fusión no impedirá la actividad de la secuencia de la proteína.
Los sistemas de expresión de fusión de genes en E. coli se han revisado en Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5):501
6.
En otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, se puede ligar a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para el cribado en bibliotecas de péptidos de agentes capaces de afectar a la actividad de la sustancia, puede ser útil codificar una sustancia quimérica que exprese un epítopo heterólogo que es reconocido por un anticuerpo disponible en el mercado.
La invención ahora se describirá, solo a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.
La figura 1 muestra una secuencia de consenso pfam00657 de la base de datos versión 6 (SEQ ID No. 1);
La figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 2) obtenida del organismo Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051);
La figura 3 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 3) obtenida del organismo Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI:9964017);
La figura 4 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 4) obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acceso en Genbank NP_631558);
La figura 5 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 5) obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acceso en Genbank: CAC42140);
La figura 6 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 6) obtenida del organismo Saccharomyces cerevisiae (número de acceso en Genbank P41734);
La figura 7 muestra un alineamiento de secuencias seleccionadas con la secuencia de consenso pfam00657;
La figura 8 muestra un alineamiento por parejas de la SEQ ID No. 3 con SEQ ID No. 2 que muestra 93% de identidad de secuencia de aminoácidos. La secuencia señal está subrayada. + indica diferencias. El motivo GDSX que contiene el sitio activo serina 16, y los sitios activos ácido aspártico 116 e histidina 291 están destacados (véanse las regiones sombreadas). Los números después del aminoácido son menos la secuencia señal;
La figura 9 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 7) que codifica una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención obtenida del organismo Aeromonas hydrophila;
La figura 10 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 8) que codifica una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención obtenida del organismo Aeromonas salmonicida;
La figura 11 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 9) que codifica una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acceso en Genbank NC_003888.1:8327480..8328367);
La figura 12 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 10) que codifica una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención obtenida del organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acceso en Genbank AL939131.1:265480..266367);
La figura 13 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 11) que codifica una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención obtenida del organismo Saccharomyces cerevisiae (número de acceso en Genbank Z75034);
La figura 14 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 12) obtenida del organismo Ralstonia (número de acceso en Genbank: AL646052);
La figura 15 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 13) que codifica una lípido aciltransferasa de acuerdo con la presente invención obtenida del organismo Ralstonia;
La figura 16 muestra la SEQ ID No. 20. Proteína hipotética conservada Scoe1 con código de acceso de proteína en el NCBI CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 17 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 21 que codifica la proteína hipotética conservada con código de acceso de proteína en el NCBI CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 18 muestra un aminoácido mostrado como SEQ ID No.22. Proteína hipotética conservada Scoe2 con código de acceso de proteína en el NCBI CAC01477.1 GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 19 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 23 que codifica la proteína hipotética conservada Scoe2 con código de acceso de proteína en el NCBI CAC01477.1 GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3 (2)];
La figura 20 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.24) que codifica la proteína hipotética conservada Scoe3 con código de acceso de proteína en el NCBI CAB88833.1 GI:7635996 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 21 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 25 que codifica la proteína putativa secretada Scoe3 con código de acceso de proteína en el NCBI CAB88833.1 GI:7635996. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 22 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.26) de la proteína putativa secretada Scoe4 con código de acceso de proteína en el NCBI CAB89450.1 GI:7672261. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 23 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 27 que codifica la proteína putativa secretada Scoe4 con código de acceso de proteína en el NCBI CAB89450.1 GI:7672261. [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 24 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 28) de la lipoproteína putativa Scoe5 con código de acceso de proteína en el NCBI CAB62724.1 GI:6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 25 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 29, que codifica la lipoproteína putativa Scoe5 con código de acceso de proteína en el NCBI CAB62724.1 GI:6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)];
La figura 26 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 30) de la GDSL-lipasa Srim1 con código de acceso de proteína en el NCBI AAK84028.1 GI:15082088 [Streptomyces rimosus];
La figura 27 muestra una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 31 que codifica la GDSL-lipasa Srim1 con código de acceso de proteína en el NCBI AAK84028.1 GI:15082088 [Streptomyces rimosus];
La figura 28 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 32), una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (ATCC nº 7965);
La figura 29 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 33) que codifica una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (ATCC nº 7965);
La figura 30 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 34) de una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC nº 14174);
La figura 31 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No 35) que codifica una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC nº 14174);
La figura 32 muestra que se pueden identificar homólogos de los genes de Aeromonas usando el servicio de búsqueda de alineamientos local básico en the National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, EE.UU. y las bases de datos de genomas completos. Se usó el motivo GDSX en la búsqueda de la base de datos y se identificaron una serie de secuencias/genes que codifican potencialmente enzimas con actividad lipolítica. Se identificaron genes del género Streptomyces, Xanthomonas y Ralstonia. Como un ejemplo, a continuación se alineó el gen de Ralstonia solanacearum con el de Aeromonas salmonicida (satA). El alineamiento por pares mostró 23% de identidad. El sitio activo de serina está presente en el extremo amino y se pueden identificar los restos catalíticos histidina y ácido aspártico;
La figura 33 muestra la secuencia de consenso Pfam00657.11 [familia 00657, base de datos versión 11] (en lo sucesivo llamada secuencia de consenso Pfam) y el alineamiento de diferentes secuencias con la secuencia de consenso Pfam. Las flechas indican los restos del sitio activo, los recuadros subrayados indican tres de los recuadros de homología indicadas por [Upton C y Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Las letras mayúsculas en la secuencia de consenso Pfam indican restos conservados en miembros de la familia. El símbolo indica una posición donde el modelo oculto de Markov de la secuencia de consenso Pfam esperaba encontrar un resto pero no lo hizo, por lo que se insertaba un hueco. El símbolo . indica un resto sin un resto correspondiente en la secuencia de consenso Pfam. Las secuencias son las secuencias de aminoácidos citadas en las figuras 16, 8, 20, 22, 24, 26, 28 y 30.
La figura 34 muestra la secuencia de consenso Pfam00657.11 [familia 00657, base de datos versión 11] (en lo sucesivo llamada secuencia de consenso Pfam) y el alineamiento de diferentes secuencias con la secuencia de consenso Pfam. Las flechas indican los restos del sitio activo, los recuadros subrayados indican tres de los recuadros de homología indicadas por [Upton C y Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Las letras mayúsculas en la secuencia de consenso Pfam indican restos conservados en miembros de la familia. El símbolo indica una posición donde el modelo oculto de Markov de la secuencia de consenso Pfam esperaba encontrar un resto pero no lo hizo, por lo que se inserta un hueco. El símbolo . indica un resto sin un resto correspondiente en la secuencia de consenso Pfam. Las secuencias son las secuencias de aminoácidos citadas en las figuras 2, 16, 18, 20, 26, 28 y 30. Se encontró que todas estas proteínas eran activas frente a sustratos lipídicos.
La figura 35 muestra un vector de expresión petl2-AsalGCAT= pSM que contiene el gen de la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida C terminal marcado con His;
La figura 36 muestra los resultados de ensayos de extractos celulares en un ensayo de kit NEFA, que representa la actividad de una lípido aciltransferasa de A. salmonicida, recombinante, contra la lecitina. Los pocillos de izquierda a derecha indican: una referencia positiva, una referencia negativa (es decir, extractos de plásmido vacío) y muestras recogidas después de 0, 1, 2 y 3 horas de cultivo después de inducción con IPTG;
La figura 37 muestra la optimización del crecimiento de BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM, que muestra que el cultivo a 30ºC da como resultado la producción de enzima con alta actividad
contra la lecitina. Se ensayó en los extractos celulares la actividad de fosfolipasa usando el kit de ensayo NEFA. Pocillos de izquierda a derecha: referencia positiva; referencia negativa; 20°C; 30°C;
La figura 38 muestra extractos celulares brutos de BL21(DE3)pLysS que expresa la lípido aciltransferasa activa incubada con el sustrato de lecitina y la mezcla de reacción se analizó usando cromatografía de capa fina que muestra la presencia de productos de degradación. Calles: 1. sin enzima; 2. + A.sal -10 ul 37°C; 3. + A. sal -20 ul 37°C; 4. + A.sal -10 ul 24°C; 5. + A. sal -20 u 24°C;
La figura 39 muestra la purificación parcial de la aciltransferasa de Aeromonas salmonicida que muestra la actividad de fosfolipasa asociada con proteína marcada con His purificada. SE = extractos tratados con ultrasonidos, His = purificado con el kit Ni-NTA spin de Qiagen;
La figura 40 muestra el vector de expresión pet12-A.h. GCAT=pSMa que contiene el gen de la glicerolípido aciltransferasa (GCAT) C-terminal marcada con His de Aeromonas hydrophilun que se usó para transformar la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS;
La figura 41 muestra la actividad de los extractos brutos (5 y 10 ul) que contienen la enzima GCAT de Aeromonas hydrophila recombinante, que se ensayó frente a la lecitina usando el kit de ácidos graso no esterificado (NEFA) (Roche, Suiza), que muestra le presencia de la enzima activa frente al fosfolípido, lecitina;
La figura 42 muestra la optimización del crecimiento de BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM que muestra que el cultivo a 30ºC dio como resultado la producción de enzima con alta actividad frente a la lecitina. Se ensayó en los extractos celulares la actividad de fosfolipasa usando el kit de ensayo NEFA;
La figura 43 muestra la purificación parcial de aciltransferasas de Aeromonas hydrophila y A. salmonicida que muestran la actividad de fosfolipasa asociada con la proteína marcada con His purificada. SE = extractos tratados con ultrasonidos, His = purificado con el kit Ni-NTA spin de Qiagen);
La figura 44 muestra la expresión de los genes de Aeromonas en Bacillus subtilis 163 que muestra la producción de enzima secretada con actividad frente a la lecitina y DGDG. pUB-AH= construcción que contiene el gen de A. hydrophila y pUB-AS, construcción con el gen de A. salmonicida, el filtrado del cultivo se incubó con los sustratos durante 60 minutos.
La figura 45 y fig. 46 muestran una placa de TLC en el disolvente de desarrollo IV (cloroformo:metanol:agua (65:25:4)); Banda 1: 40 mg de sitosterol 30 min: Banda 2: Transferasa + 40 mg de sitosterol 30 min; Banda 3: Transferasa + 80 mg de sitosterol 30 min; Banda 4: Transferasa + 40 mg de sitosterol 120 min; Banda 5: Transferasa + de 80 mg sitosterol 120 min; Banda 6: Transferasa + 40 mg de sitosterol 300 min; Banda 7: 40 mg de sitosterol 300 min; Banda 8: Colesterol; Banda 9: Sitosterol;
La figura 47 representa la reacción entre la fosfatidilcolina y el colesterol que es catalizada por la lípido aciltransferasa;
La figura 48 muestra un análisis de TLC de lípidos extraídos de yema de huevo tratada con enzima y no tratada, 6) 0,31 PLU/g de transferasa nº 179, 7) 1,25 PLU/g de transferasa nº 178-9., 8) 23,25 PLU/g de fosfolipasa nº 3108., 9) Referencia.
La figura 49 muestra muestras de ensayo de mayonesa producidas con yema de huevo tratada con enzima y no tratada: 5) Transferasa nº 179, 0,31 PLU/g. 6) Transferasa nº 178-9, 1,25 PLU/g, 7) Fosfolipasa nº 3108, 23,3 PLU/g 8) Referencia, agua.
La figura 50 muestra un análisis de TLC (en disolvente I) de lípidos de la yema de huevo tratada con una lípido aciltransferasa de A. hydrophila;
La figura 51 muestra un análisis de TLC (en disolvente IV) de lípidos de la yema de huevo tratada con una lípido aciltransferasa de A. hydrophila;
La figura 52 muestra un análisis de TLC de lípidos tratados con transferasa de yema de huevo, a lo largo del tiempo;
La figura 53 muestra la cantidad de ácido graso y éster de colesterol producida en función del tiempo cuando se usa una lípido aciltransferasa (Tranf nº 178-9) comparada con cuando se usa una enzima lipolítica de referencia, Thermomyces lanuginosus;
La figura 54 muestra actividad relativa de transferasa como % de transferasa y actividad hidrolítica en reacciones enzimáticas en yema de huevo con alto contenido de agua, el nº 1991 (fosfolipasa A2) y nº 2427 (fosfolipasa A1) son fosfolipasas de referencia, el nº 178 es una lípido aciltransferasa;
La figura 55 muestra el efecto del contenido de agua en el ensayo en la actividad de transferasa de la transferasa nº 178 en reacciones de transferasa en yema de huevo con alto contenido de agua;
La figura 56 muestra la actividad de transferasa para una lípido aciltransferasa (nº 178) en función del tiempo de reacción en reacciones de transferasa en yema de huevo con alto contenido de agua;
La figura 57 y figura 58 muestran gráficas que representan el ácido graso y éster de colesterol en función del tiempo. Las gráficas representan los resultados obtenidos por el análisis de GLC en el ensayo para la medición de la actividad de aciltransferasa usando lecitina y colesterol en tampón como sustrato;
La figura 59 muestra un análisis de TLC en el disolvente I. Yema de huevo tratada con lípido aciltransferasa nº 138 de Aeromonas salmonidica (banda nº 1 y 2) o con una fosfolipasa nº 2938 (LIPOPAN® F) (banda nº 3) o yema de huevo no tratada (banda nº 4);
La figura 60 muestra un análisis de TLC en el disolvente IV. Yema de huevo tratada con lípido aciltransferasa nº 138 (banda nº 1 y 2) o con Fosfolipasa nº 2938 (banda nº 3). Yema de huevo no tratada (banda nº 4);
La figura 61 muestra yema de huevo tratada con lípido aciltransferasa nº 138 (muestras nº 1 y 2) y con fosfolipasa nº 2938 (muestra nº 3). Yema de huevo no tratada (banda nº 4);
La figura 62 muestra una emulsión de alimento después de 2 horas a 100ºC. 0) Yema de huevo no tratada 1) Yema de huevo tratada con lípido aciltransferasa nº 138 durante 210 minutos. 3) Yema de huevo tratada con la fosfolipasa de referencia nº 2938 durante 210 minutos;
La figura 63 muestra placas de TLC que muestran el cribado de la actividad de transferasa en esterol y glicerol de plantas. PC = fosfatidilcolina, LPC = lisofosfatidilcolina; PE = fosfatidiletanolamina; monogl = monoglicérido;
La figura 64 muestra una placa de TLC en el disolvente I, Muestras 1 a 6 después de 24 horas, y muestras de 1 a 4 después de 4 horas de tiempo de reacción. El análisis de TLC confirma la formación del éster de esterol en las muestras 1, 2, 5 y 6;
La figura 65 muestra una placa de TLC en el disolvente I donde la actividad de transferasa de una aciltransferasa inmovilizada de Aeromonas salmonicida se analizó en una mezcla de aceite, con las muestras tomadas a las 0,5, 1, 3, 6 y24 h;
Las figuras 66 y 67 muestran placas de TLC en el disolvente I y IV. Banda 1 = lecitina; Banda 2 = referencia -10 min; Banda 3 = 0,75 PLU, 10 min; Banda 4 = 0,75 PLU, 60 min; Banda 5 = 0,75 PLU, 220 min; Banda 6 = referencia, 20 h; Banda 7 = 0,75 PLU, 20 h; y Banda 8 = éster de colesterol;
Las figuras 68 y 69 muestran placas de TLC en el disolvente IV. Banda 1 = lecitina; Banda 2 = referencia -10 min; Banda 3 = 1 PLU, 10 min; Banda 4 = 1 PLU, 60 min; Banda 5 = 1 PLU, 180 min; Banda 6 = 1PLU, 220 min; Banda 7 = 1PLU, 1200 min; Banda 8 = referencia, 1200 min; Banda 9 = éster de glucosa; Banda 10 = colesterol; y Banda 11 = glucosa;
La figura 70 muestra la reacción entre DGDG y glucosa cuando es catalizada por una lípido aciltransferasa;
La figura 71 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 36) de la construcción de fusión usada para la mutagénesis del gen de la lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila en el ejemplo 17. Los aminoácidos subrayados son un péptido señal de xilanasa;
La figura 72 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 54) que codifica una enzima de Aeromonas hydrophila que incluye un péptido señal de xilanasa; y
La figura 73 muestra una placa de TLC que muestra claramente la formación del éster de fitoesterol y monoglicérido. La Banda 1 es después de 1 hora de tiempo de reacción, la banda 2 es después de 4 horas de tiempo de reacción, la banda 3 es después de 24 de tiempo de reacción y la banda 4 es un esterol de planta.
Ejemplos
Excepto donde se indique, el análisis de TLC se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 6 y el análisis de GLC se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 11.
Ejemplo 1: La clonación, secuenciación y expresión heteróloga de una transferasa de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida
Cepas usadas:
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC 14174) se obtuvo de ATCC y se cultivó durante la noche a 30°C en medio Luria-Bertani (LB). Las células se centrifugaron y se aisló ADN genómico usando los procedimientos para el aislamiento de ADN genómico de Qiagen Ltd. El conjunto de tampón de ADN genómico (cat.19060), proteasa K (cat. 19131) y RNAsa A (cat. 19101) se obtuvieron todos de Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).
Se usó la cepa bacteriana hospedante BL21(DE3)pLysS (Novagen) para la producción de enzimas de Aeromonas recombinantes. Se usaron células competentes de BL21(DE3)pLysS como hospedante para la transformación con el vector de expresión pet12-AsalGCAT=pSM. Los transformantes que contenían el plásmido adecuado se cultivaron a 37ºC en medio agar LB que contenía 100 ug ampicilina/ml.
Construcción del vector de expresión pet12-AsalGCAT-pSM:
Para todas las amplificaciones de ADN de los genes de transferasa de Aeromonas, se usó ADN genómico (0,2-1 ul) como molde y ADN polimerasa pfu (2,5 unidades) con 10 ul de 10x tampón de pfu, 1 ul de cada cebador (50 pmol/ul), dNTP 200 uM en un volumen de reacción total de 100 ul. Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo en un ciclador térmico programable usando las siguientes condiciones: 95ºC durante 30 segundos, 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos. Se aplicó una extensión adicional de 5 minutos a 72ºC.
La amplificación por PCR del gen de transferasa de A. salmonicida se llevó a cabo en 2 reacciones de PCR separadas. La reacción de PCR 1 se llevó a cabo usando las parejas de cebadores, as1USNEW(5’AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3’ [SEQ ID No. 68]) y asls950new (5’ GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3’ [SEQ ID No. 37]). Se llevó a cabo una segunda reacción de PCR para incorporar un marcador de histidina C-terminal usando el producto de la PCR de la primera reacción y los cebadores: as1USNEW(5’AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3’ [SEQ ID No. 38]) and AHLS1001(5’TTGGATCC GAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3’ [SEQ ID No. 39]). El producto de la PCR de la segunda reacción se purificó y se digirió con las enzimas de restricción Nde1 y BamHI. También se digirieron 2 ug de ADN del vector pET 12a con las enzimas de restricción Nde1 y BamHI, y se trataron con fosfatasa. El pet12a tratado con enzimas de restricción y el producto de la PCR de la segunda reacción se purificaron y se ligaron usando el kit de ligado rápido (Roche, Suiza). La mezcla de ligado se usó para transformar células de E. coli TOP10. Los transformantes se cultivaron en placa en medio agar LB que contenía ampicilina 100 ug/ml.
El cebador del promotor de T7 (5’TAATACGACTCACTATAG3’ [SEQ ID No. 40]) y el cebador del terminador de T7 (5’CTAGTTATTGCTCAGCGG3’ [SEQ ID No. 41]) se usaron para verificar las secuencias y la orientación de los genes de transferasa clonados en el vector pET12a. La secuenciación de ADN se llevó a cabo usando el kit de secuenciación ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle con 500 ng de ADN plasmídico como molde y 3.2 pmol de cebadores de promotor y terminador de T7.
La construcción mostrada en la figura 35 se usó para transformar la cepa hospedante bacteriana competente BL21(DE3)pLysS (Novagen) y los transformantes resistentes a ampicilina se recogieron y se usaron para el análisis de expresión.
Expresión de la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida
La cuantificación de la actividad enzimática frente a la lecitina se determinó en extractos celulares usando el kit de ácido graso no esterificado (NEFA) (Roche, Suiza).
En la figura 36, BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM se cultivó en medio LB
+ ampicilina 100 ug/ml y se incubó con agitación a 37°C hasta que se alcanza una DO600 = de 0,6 a 1,0. Después los cultivos se inducen usando IPTG (0,4 mM) y se continúa la incubación durante las siguientes 3 horas. Se tomaron muestras a las 0 hora, 1, 2, y 3 horas después de inducción con IPTG. La actividad enzimática se ensayó usando el kit de NEFA y lecitina como sustrato.
Optimización del crecimiento para la producción de enzimas más activas
BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de expresión pet12-AsalGCAT= pSM se cultivó en medio LB + ampicilina 100 ug/ml y se incubó con agitación a diferentes temperaturas de crecimiento (37°C, 30°C, y 20 °C). Las condiciones óptimas para la producción de la enzima lípido aciltransferasa activa eran cuando los cultivos se desarrollaron a 300C como se muestra en la figura 37.
Purificación parcial de la transferasa de Aeromonas salmonicida recombinante
La cepa BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de expresión pet12-AsalGCAT=pSM se cultivó a 37°C y los extractos celulares brutos se prepararon por ultrasonidos. La enzima recombinante se purificó más de los extractos celulares brutos tratados con ultrasonidos usando el kit Ni-NTA spin de Qiagen. Actividad de fosfolipasa usando el kit NEFA y lecitina como sustrato. Los extractos celulares brutos de BL21(DE3)pLysS que expresan la transferasa activa se incubaron con el sustrato lecitina y la mezcla de reacción se analizó usando cromatografía en capa fina que muestra la presencia de productos de degradación (véase la figura 38).
Purificación parcial de la transferasa de Aeromonas salmonicidae recombinante. La cepa BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de expresión pet12-AsalGCAT=pSM se cultivó a 37°C y los extractos celulares brutos se prepararon por ultrasonidos. La enzima recombinante se purificó más de los extractos celulares brutos tratados con
ultrasonidos usando el kit Ni-NTA spin de Qiagen. Se analizaron la actividad de fosfolipasa usando el kit NEFA y lecitina como sustrato (véase la figura 39).
Ejemplo 2. Clonación y expresión de transferasa de Aeromonas hydrophila en E. coli
Aeromonas hydrophila (ATCC nº 7965) se obtuvo de ATCC y se cultivó durante la noche a 30°C en medio Luria-Bertani (LB). Las células se centrifugaron y el ADN genómico se aisló usando los procedimientos para el aislamiento del ADN genómico de Qiagen Ltd. El conjunto de tampón de ADN genómico (cat.19060), proteasa K (cat. 19131) y RNAsa A (cat. 19101) se obtuvieron todos de Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).
Se usó la cepa bacteriana hospedante BL21(DE3)pLysS (Novagen) para la producción de enzimas de Aeromonas recombinantes. Se usaron células competentes de BL21(DE3)pLysS como hospedante para la transformación con el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT=pSMa. Los transformantes que contenían el plásmido adecuado se cultivaron a 37ºC en medio agar LB que contenía 100 ug ampicilina/ml.
Construcción del vector de expresión pet12a-A.h.GCAT=pSMa:
Para todas las amplificaciones de ADN del gen de transferasa de Aeromonas, se usó ADN genómico (0,2-1 ul) como molde y ADN polimerasa pfu (2,5 unidades) con 10 ul de 10x tampón de pfu, 1 ul de cada cebador (50 pmol/ul), dNTP 200 uM en un volumen de reacción total de 100 ul. Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo en un ciclador térmico programable usando las siguientes condiciones: 95ºC durante 30 segundos, 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos. Se aplicó una extensión adicional de 5 minutos a 72ºC.
La amplificación por PCR del gen de transferasa de A. hydrophila (ATCC nº 7965) se llevó a cabo en 2 reacciones de PCR separadas.
La reacción de PCR 1 se llevó a cabo usando la pareja de cebadores, AHUS1 (5’GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3’, SEQ ID No. 42) y ahls950 (5’ATGGTGATGGTGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3’, SEQ ID No. 43).
Se llevó a cabo una segunda reacción de PCR para incorporar un marcador de histidina C-terminal usando el producto de la PCR de la primera reacción y la pareja de cebadores:
AHUS1(5’GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3’ SEQ ID No. 44,) y AHLS1001(5’TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3’ SEQ ID No. 45).
El producto de la PCR de la segunda reacción se purificó y se digirió con las enzimas de restricción Nde1 y BamHI. También se digirieron 2 ug de ADN del vector pET 12a con las enzimas de restricción Nde1 y BamHI, y se trataron con fosfatasa. El pet12a tratado con enzimas de restricción y el producto de la PCR de la segunda reacción se purificaron y se ligaron usando el kit de ligado rápido (Roche, Suiza). La mezcla de ligado se usó para transformar células de E. coli TOP10. Los transformantes se cultivaron en placa en medio agar LB que contenía ampicilina 100 ug/ml.
El cebador del promotor de T7 (5’TAATACGACTCACTATAG3’) y el cebador del terminador de T7 (5’CTAGTTATTGCTCAGCGG3’) se usaron para verificar las secuencias y la orientación de los genes de GCAT clonados en el vector pET12a. La secuenciación de ADN se llevó a cabo usando el kit de secuenciación ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle con 500 ng de ADN plasmídico como molde y 3,2 pmol de cebadores de promotor y terminador de T7.
La construcción mostrada en la figura 40 se usó para transformar la cepa hospedante bacteriana competente BL21(DE3)pLysS (Novagen) y los transformantes resistentes a ampicilina se recogieron y se usaron para el análisis de expresión.
Expresión de la transferasa de Aeromonas hydrophila en BL21(DE3)pLysS
La cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS que albergaba el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT= pSMa se cultivó en medio LB + ampicilina 100 ug/ml y se incubó con agitación a 37°C hasta que se alcanza una DO600 = de 0,6 a 1,0. Después los cultivos se inducen usando IPTG (0,4 mM) y se continúa la incubación durante las siguientes 3 horas. Se tomaron muestras a las 0 hora, 1, 2, y 3 horas después de inducción con IPTG. La actividad enzimática se ensayó usando el kit de NEFA y lecitina como sustrato (figura 41).
Optimización del crecimiento para la producción de enzimas más activas
BL21 (DE3)pLysS que alberga el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT= pSMa se cultivó en medio LB + ampicilina 100 ug/ml y se incubó con agitación a diferentes temperaturas de crecimiento (37°C, 30°C y 20 °C). Las condiciones óptimas para la producción de la enzima GCAT activa eran cuando los cultivos se desarrollaron a 30ºC como se muestra en la figura 42.
Purificación parcial de la transferasa de transferasa de A. hydrophila recombinante (GCAT)
La cepa BL21(DE3)pLysS que alberga el vector de expresión pet12a-A.h.GCAT=pSMa se cultivó a 37°C y los extractos celulares brutos se prepararon por ultrasonidos. La enzima recombinante se purificó más de los extractos celulares brutos tratados con ultrasonidos usando el kit Ni-NTA spin de Qiagen. Análisis de la actividad de fosfolipasa usando el kit NEFA y lecitina como sustrato (figura 43).
Ejemplo 3: Expresión de transferasas de Aeromonas en Bacillus subtilis 163
Construcción del plásmido
Se usaron dos vectores de expresión diferentes de (pUB 110 y pBE5) para la expresión heteróloga de genes de Aeromonas en Bacillus subtilis. El vector pUB110 contiene el promotor de la alfa amilasa mientras que el vector pBE tiene el promotor P32 como la región reguladora para la expresión de los genes fusionados de Aeromonas. En pUB110, el primer aminoácido de los genes de GCAT maduros de Aeromonas se fusionó en el marco con el último aminoácido de la secuencia del péptido señal xilanasa de Bacillus subtilis por el sitio de restricción Nhe1, creando 2 aminoácidos adicionales frente a las proteínas maduras. pBE5 contiene la fusión de la secuencia señal cgtase en el sitio Nco1 para la secreción de las proteínas recombinantes en el filtrado del cultivo.
Se llevaron a cabo reacciones de PCR para obtener los genes de Aeromonas fusionados en el marco con las secuencias señal de los vectores pUB 110 y pBE5. Las PCR se llevaron a cabo usando las siguientes parejas de cebadores para el gen de A. hydrophila:
Reacción de PCR 1: usAHncol (5’ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3’, SEQ ID No. 46) y lsAH (5’TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3’, SEQ ID No. 47)
Reacción de PCR 2: US-AhnheI (5’TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3’, SEQ ID No. 48.) y lsAH (5’TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3, SEQ ID No. 49)
Las PCR se llevaron a cabo usando la siguiente pareja de cebadores para el gen de A. salmonicida:
Reacción de PCR 3: US-Asncol (5’TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3’, SEQ ID No. 50) y IsAH (5’TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3’, SEQ ID No. 51)
Reacción de PCR 4: US-ASnhe1 (5’TTGCTAGCGCCGACACTCC’zCCCCGCC3’, SEQ ID No. 52) y IsAH (5’TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3’, SEQ ID No. 53)
Todos los productos de la PCR se clonaron en PCR-Blunt II (vector TOPO) y se secuenciaron con cebadores de secuenciación inversos y directos.
Los clones de las reacciones de PCR 1 y 3 se cortaron con Nco1 y Bam HI y se usaron como insertos para el ligado del vector pBE5 cortado con Nco1/BamH1/fosfatasa. Los clones de las reacciones de PCR 2 y 4 se cortaron con Nhe1 y Bam H1 y se usaron como insertos para el ligado del vector pUB que se cortó con Nhe1/BamH1/fosfatasa.
Expresión de los genes de transferasa de Aeromonas en Bacillus subtilis y caracterización de la actividad enzimática
Las acil transferasas de dos especies de Aeromonas se han expresado satisfactoriamente en E. coli (resultados antes). Las construcciones de fusión de genes pUB110 y pBE5 de Bacillus se usaron para transformar Bacillus subtilis y los transformantes se seleccionaron por cultivo en placas con kanamicina. Los transformantes resistentes a la kanamicina aislados y cultivados en 2xYT son capaces de expresión heteróloga de los genes de Aeromonas en Bacillus. Los filtrados de los cultivos tienen actividad de digalactosildiacilglicerol (DGDG) galactolipasa, además de tener actividades tanto de transferasa como de fosfolipasa. La actividad hacia el digalactosildiacilglicerol (DGDG) se midió después de 60 minutos de incubación del líquido sobrenadante del cultivo con el sustrato, DGDG de harina de trigo (se puede obtener de Sigma) así como la actividad hacia la lecitina como se muestra en la figura 44. Bacillus produjo la enzima después de una noche (20-24 horas) a 48 horas de cultivo en el medio de cultivo como una proteína secretada. En algunos casos, la expresión de los genes de Aeromonas se ha mostrado que interfiere con la viabilidad celular y crecimiento en Bacillus y E. coli, por lo tanto es necesario seleccionar con cuidado cepas de expresión y optimizar las condiciones de crecimiento para asegurar la expresión. Por ejemplo, se transformaron varias cepas hospedantes de Bacillus (B.s 163, DB104 y OS 21) con los vectores de expresión para comparación de crecimiento. B.s163 se puede transformar con los 2 genes de Aeromonas y es capaz de expresar la proteína activa. DB104 se puede transformar con todas las construcciones pero solo es capaz de expresar la transferasa de A. salmonicida.
Ejemplo 4: Fermentación y purificación de lípido aciltransferasas de Aeromonas producidas en E. coli
Fermentaciones de E. coli:
Microorganismos
Se usaron en este estudio dos cepas de Eschericia coli, una que contenía lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (ejemplo 2) y dos que contenían lípido aciltransferasas de Aeromonas salmonicida, (ejemplo 1).
La cepa de E. coli que contenía el gen de A. hydrophila se llamó DIDK0124, y la cepa de E. coli que contenía el gen de A. salmonicida se llamó DIDK0125. La fermentación con DIDK0124 se llamó HYDRO0303 y la fermentación con DIDK0125 se llamó SAL0302. La proteína purificada de HYDRO025 se llamó REF nº 138. La proteína purificada de HYDRO0303 se llamó REF nº 135.
Medios de crecimiento y condiciones de cultivo
LB-agar
Las placas de agar LB usadas para mantener las cepas contenían: triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 5 g/l, agar 15 g/l, ampicilina 100 mg/l y cloranfenicol 35 mg/l. Las placas de agar se incubaron a 30°C.
Matraz de agitación con LB
El medio LB (50 ml por matraz de agitación) usado para la producción del material de inóculo para los cultivos en biorreactor contenía: triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 5 g/l, ampicilina 100 mg/l y cloranfenicol 35 mg/l. Los matraces de agitación se inocularon a partir de las placas de agar LB, y se incubaron a 30°C y 200 rpm.
Cultivo en biorreactor
Los cultivos de biorreactor se llevaron a cabo en biorreactores hechos en el laboratorio de 6 litros cargados con 4 litros de medio que contenía: triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 5 g/l, KH2PO4 8 g/l, MgSO4.7H2O 0,9 g/l, glucosa monohidrato 40 g/l, 0,4 ml/ ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, Países Bajos), (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 10 mg/l, CuSO4·5H2O 0,7 mg/l, ZnSO4·7H2O 3 mg/l, MnSO4·H2O 3 mg/l, EDTA 10 mg/l, NiSO4·6H2O 0,1 mg/l, CoCl2 0,1 mg/l, H3BO4 0,1 mg/l, KI 0,1 mg/l, Na2MoO4·2H2O 0,1 mg/l, ampicilina 1 g/l y cloranfenicol 35 mg/l.
Los biorreactores se inocularon con una cantidad de cultivo LB asegurando el final del crecimiento después de aproximadamente 20 horas de cultivo (calculado a partir de la velocidad de crecimiento específica máxima de 0,6 h-1 , la DO600 del matraz de agitación con LB y la DO600 final en el biorreactor de aproximadamente 20).
SAL0302 se inoculó con 10 ml del cultivo de LB, y HYDRO0303 se inoculó con 4 ml del cultivo de LB.
Los biorreactores se hicieron trabajar en las siguientes condiciones: temperatura 30°C, agitación 800-1000 rpm (dependiendo del experimento), aireación 5 l/min, pH 6,9, pH referencia NH3-agua al 8,75% (p/v) y H2SO4 2 M. La inducción se logró por adición de isopropil-β-D-tiogalactósido a una concentración final de 0,6 mM, cuando se produjeron 0,4 moles (HYDRO0303) y 0,7 moles de CO2 respectivamente.
Recolección
Se usó el siguiente procedimiento para la recolección y homogeneización de la biomasa:
1) El caldo de fermentación de las fermentaciones se centrifugó a 5000 x g y 4°C durante 10 minutos, y el líquido sobrenadante se descargó. La biomasa se almacenó a -20ºC hasta su uso. La biomasa se descongeló y se volvió a suspender en 500 ml de NaH2PO4 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, Imidazol 10 mM e inhibidor de proteasa completo (exento de EDTA) (Roche, Alemania).
2) La biomasa suspendida se homogeneizó a 2 kbar y 4°C en un homogeneizador celular de Constant Systems Ltd (Warwick, Reino Unido).
3) Los residuos celulares se separaron por centrifugación a 10.000 x g y 4°C durante 30 minutos seguido de recolección del líquido sobrenadante.
4) El líquido sobrenadante se clarificó más por centrifugación a 13.700 x g y 4°C durante 60 minutos, seguido de recolección del líquido sobrenadante.
5) El líquido sobrenadante se filtró a través de filtros Vacu Cap de 0,2 mm (Pall Life Sciences, Reino Unido) y el filtrado se recogió para la inmediata purificación cromatográfica.
Purificación cromatográfica de las transferasas
Una columna (2,5 x 10 cm) se empaquetó con 50 ml de gel de Sepharose ff. quelante y se cargó con Ni-sulfato (de acuerdo con el método descrito por el fabricante, Amersham Biosciences). La columna se equilibró con 200 ml de NaH2PO4 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, Imidazol 10 mM. Se aplicaron 400 ml del producto bruto a la columna con un caudal de 5 ml/min. Después la columna se lavó con NaH2PO4 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, Imidazol 10 mM hasta que la UV280 alcanzó la línea base. La GCAT se eluyó con 40 ml de NaH2PO4 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM e Imidazol 500 mM.
Ejemplo 5: Fermentación y purificación de lípido aciltransferasas de Aeromonas producidas en Bacillus subtilis.
Fermentaciones
BAC0318-19, BAC0323-24
Microorganismo
Los microorganismos usados en este estudio proceden de la transformación de una cepa hospedante de Bacillus subtilis, nº 163, con un plásmido que contenía el gen que codifica la transferasa de Aeronaonas salmonicida insertada en el vector pUB110OIS. La expresión del gen es controlada por un promotor de alfa-amilasa, y la secreción de la transferasa es mediada por la secuencia señal de xilanasa de B. subtilis (ejemplo 3). Las cepas se denominaron DIDK0138 (fermentación BAC0318-19) y DIDK0153 (fermentación BAC0323-24).
Medios de crecimiento y condiciones de cultivo
Medio de precultivo
A un matraz agitado (volumen total de 500 ml, con deflactores) se añadieron 100 ml de un medio que contenía:
NaCl 5 g/l K2HPO4 10 g/l Harina de soja 20 g/l Extracto de levadura, BioSpringer 106 20 g/l Antiespumante, SIN260 5 ml/l
El pH se ajustó a 7,0 antes de tratamiento en autoclave
Después del tratamiento en autoclave se añadieron 6 ml de Nutriosa al 50% (p/p) por matraz. Se añadió kanamicina en una concentración de 50 mg/l después de tratamiento en autoclave. Inoculación Un matraz de agitación de precultivo se inoculó con cultivo congelado directamente de un cultivo madre en glicerol al
25% (p/v). El matraz de agitación se incubó a 33ºC y 175 rpm durante aproximadamente 16 horas, tras lo cual se usaron 50 ml para inocular el fermentador. Fermentaciones Las fermentaciones se llevaron a cabo en fermentadores de 6 litros construidos en el laboratorio. El medio del lote (3 litros) contenía
Licor de maceración del maíz (50% en ad) 40 g/l Extracto de levadura BioSpringer 153 (50% en ad) 10 g/l NaCl 5 g/l CaCl2, 2H2O 0,25 g/l Mn(NO3)2, H2O 0,2 g/l Antiespumante SIN260 1 ml/l Kanamicina (esterilizada por filtración después del autoclave) 50 mg/l
La alimentación contenía: Glucosa monohidrato 540 g/kg
MgSO4.7 H2O 4,8 g/l Antiespumante SIN260 4 ml/kg Extracto de levadura, BioSpringer 153 (50% en ad) (en autoclave por separado) 150 g/kg
La alimentación en la fermentación de BAC0318 y BAC0323 se inició basada en el CO2 acumulado, de acuerdo con las siguientes ecuaciones: Alimentación -flujo [g/h] = 0, AcCO2 < 0,15 Alimentación -flujo [g/h] = 2,85 + t·1,54, AcCO2 ≥ 0,15 y t < 12 Alimentación -flujo [g/h] = 21,3, t > 12
t:
tiempo (horas) desde el punto en el que el CO2 acumulado (AcCO2) alcanzaba 0,15 moles. La alimentación en la fermentación de BAC0319 y BAC0324 se inició basada en el CO2 acumulado, de acuerdo con las siguientes ecuaciones: Alimentación -flujo [g/h] = 0, AcCO2 < 0,15
Alimentación -flujo [g/h] = 2,0 + t·1,08, AcCO2 ≥ 0,15 y t < 12 Alimentación -flujo [g/h] = 15, t > 12
t:
tiempo (horas) desde el punto en el que el CO2 acumulado (AcCO2) alcanzaba 0,15 moles. El pH se controló a 7,0 por adición de NH3-agua al 12,5% (p/v) o ácido fosfórico 2 M. La aireación era 3 l/min que corresponde a 1 vvm. La temperatura era 33ºC. El fermentador se equipó con 2 impulsores Rushton de 8 cm de Ø colocados con una distancia de 10 cm. Recolección La biomasa se separó por centrifugación a 16.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El líquido
sobrenadante se esterilizó por filtración y el filtrado se usó para la purificación y ensayos de aplicación. Ejemplo 6. Ensayos de aplicación en yema de huevo En los siguientes experimentos la transferasa aislada de Aeromonas salmonicida expresada en E. coli se ensayó en
la yema de huevo sola y en yema de huevo a la que se había añadido un fitoesterol. Material Transferasa de Aeromonas salmonicida REF nº 138 Yema de huevo: de huevo fresco (huevos de gallina) Esterol de planta: β-sitosterol, Sigma S 5753 Placas de TLC: placa de sílice Merck nº 1.05715.0001 Análisis de TLC. La placa de TLC se activó en una estufa (110ºC) durante ½ h. Se vertieron 100 ml de disolvente de desarrollo en una cámara de cromatografía con tapa. Las paredes de la cámara
se cubrieron con papel de filtro (Whatman 2) con el fin de saturar la cámara con el vapor del disolvente. La placa de TLC se puso en un marco y la muestra se aplicó sobre la placa de TLC a 2 cm del fondo. Después la placa de TLC se puso en la cámara de TLC con el disolvente de desarrollo. Cuando el disolvente de desarrollo
alcanzó 14 cm desde el fondo de la placa, la placa de TLC se sacó y se secó en una tabla de vapores y después se puso en la estufa a 110ºC durante 10 minutos. Después la placa de TLC se sumergió en el reactivo de revelado, y se secó en la estufa a 110ºC durante 15 minutos Disolvente de desarrollo: Nº IV: Cloroformo : metanol : H2O (65:25:4)
Nº I: P-éter : MTBE : Ácido acético (60:40:1) Tampón de revelado (tampón de vanadato) 32 g de Na2CO3 y 300 ml de H2O (1 M) Se añaden18,2 g de pentóxido de vanadato (V2O5) y se disuelven durante calentamiento suave. La solución se enfría a temperatura ambiente. Cuidadosamente se añaden 460 ml de H2SO4 2,5 M. (460 ml de H2O + 61 ml de H2SO4) Se añade agua hasta 1000 ml. Actividad de fosfolipasa. Sustrato: 0,6% de L-α fosfatidilcolina al 95% vegetal (Avanti nº 441601) + Triton -X 100 al 0,4% (Sigma-X-100) + CaCl2 5 mM
se disuelve en tampón HEPES 0,05 M, pH 7. Procedimiento Se añadieron 400 µl de sustrato a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se puso en un termomezcaldor Eppendorf a 30ºC
durante 5 minutos.
En el tiempo T = 0 se añadieron 50 µl de solución enzimática. También se analizó un blanco con agua en lugar de la enzima. Se mezcló la muestra a 1000 rpm en el termomezclador Eppendorf a 30ºC durante 10 minutos. En el tiempo T = 10
min. Se puso el tubo Eppendorf en otro termomezclador a 99ºC durante 10 minutos para interrumpir la reacción. Se analizaron los ácidos grasos libres en las muestras utilizando un kit NEFA de WAKO GmbH. Se calculó la actividad enzimática de PLU-7 a pH 7 como micromoles de ácido graso producidos por minuto en las
condiciones del ensayo. Extracción de lípidos Se mezcló 1 g de yema de huevo y 7,5 ml de cloroformo:metanol 2:1 en un Whirley y se centrifugó a 750 x g durante
10 minutos. Se aislaron 3 ml de la fase de cloroformo y se usaron para el posterior análisis de lípidos. Resultados: Se analizó la actividad de fosfolipasa en la transferasa (REF. nº 138) de Aeromonas salmonicida expresada en E.
coli como se ha descrito anteriormente y se determinó también en la yema de huevo con o sin β-sitosterol. La
muestra se agitó con un agitador magnético durante la reacción. El diseño experimental se muestra en la Tabla 1. Tabla 1
Ensayo
Tiempo de reacción a 37°C Yema de huevo Sitosterol Transferasa nº 138
Nº
Minutos gramos mg Unidades
1
30 1 40
2
30 1 40 0,75 PLU
3
30 1 80 0,75 PLU
4
120 1 40 0,75 PLU
5
120 1 80 0,75 PLU
6
300 1 40 0,75 PLU
8
300 1 40
La reacción se interrumpió añadiendo 7,5 ml de cloroformo:metanol (2:1) y se mezcló en un mezclador Whirley durante 30 segundos. Se aisló la fase de cloroformo por centrifugación y se transfirieron 2 µl de la fase de cloroformo
47 5
a una placa de TLC de sílice activada previamente y se eluyó con disolvente de desarrollo nº I, y otra placa de TLC en disolvente de desarrollo nº IV.
Los resultados de los análisis de TLC se muestran en las figuras 45 y 46.
La reacción de transferasa con una transferasa de Aeromonas salmonicida en yema de huevo en la que se añadió fitoesterol ha mostrado que la enzima transfiere ácido graso de la lecitina en la yema de huevo al colesterol durante la formación del éster de colesterol. El cromatograma de TLC indicó además, que la parte del esterol añadida a la yema de huevo se transfería al éster de esterol.
La cantidad de éster de esterol en relación con la cantidad de éster de colesterol formado durante la reacción se puede analizar por HPLC o GLC.
Se sabe que los ésteres de esteroles vegetales reducen la absorción del colesterol en el intestino. Se indica además en la bibliografía que los ésteres de colesterol son absorbidos menos que el colesterol libre en el intestino. Cuando una transferasa y fitoesterol se añaden a la yema de huevo se obtiene un producto que causa absorción reducida del colesterol, y al mismo tiempo se produce lisolecitina que mejora las propiedades emulsionantes de la yema de huevo. Una ventaja adicional de añadir transferasa y fitoesterol a la yema de huevo es que el éster de fitoesterol es ingerido junto con el colesterol natural disponible, que se espera que tenga el mayor efecto sobre la reducción de la absorción del colesterol.
Ejemplo 7: Modificación de la yema de huevo por la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida
De acuerdo con la presente invención ahora se ha mostrado que es posible producir lisolecitina de yema de huevo sin formación sustancial de ácidos grasos libres mediante el uso de una transferasa.
El contenido en lecitina de la yema de huevo es un emulsionante importante para la producción de mayonesa con la limitación de que la mayonesa no es estable al calor. Por lo tanto, se conoce desde hace varios años el uso de una fosfolipasa del páncreas para modificar la lecitina en la yema de huevo a lisolecitina, que es un emulsionante más eficaz. El uso de la yema de huevo modificada por enzimas en la producción de la mayonesa contribuye a una mejor estabilidad al calor de la mayonesa durante la pasteurización. Una limitación del uso de la fosfolipasa del páncreas en la yema de huevo es que la cantidad de ácido graso libre también aumenta, lo que contribuye a una menor estabilidad oxidativa porque los ácidos grasos libres son más propensos a la oxidación que el éster correspondiente. El ácido graso libre puede contribuir también a un sabor saponáceo.
La transferasa de Aeromonas salmonicida se expresó con éxito en B. subtilis y se fermentó a escala de laboratorio como se describe en el ejemplo 5, se purificó por cromatografía de líquidos y se usó para modificar los lípidos de la yema de huevo. La yema de huevo modificada por enzimas se usó para producir mayonesa estable al calor.
La transferasa de A. salmonicida se puede usar para producir lisolecitina y éster de colesterol en la yema de huevo sin la producción de cantidades significativas de ácidos grasos libres. Es decir, sin aumentar o aumentar sustancialmente los ácidos grasos libres en el alimento.
La yema de huevo modificada con enzima producida por la transferasa presentaba propiedades mejoradas de emulsión y se puede usar para la producción de mayonesa estable al calor.
Esta enzima era muy funcional en la modificación de la yema de huevo catalizando la reacción de transferencia de lípidos entre la lecitina y el colesterol, figura 47.
Este estudio investigó más el uso de transferasa para la modificación de la yema de huevo y el uso de la yema de huevo modificada en la producción de mayonesa estable al calor.
Este ejemplo describe la fermentación, aislamiento y aplicación de la transferasa en yemas de huevo, así como la aplicación de la yema de huevo modificada con enzimas en la mayonesa. El ejemplo se divide en dos partes:
A. Aplicación de la transferasa en la yema de huevo
B. Ensayo de la yema de huevo modificada con enzimas en la mayonesa
Parte experimental
A. Aplicación
Enzima y sustrato
Transferasa nº 178-9 de A. salmonicida, purificación 2554-100 C73, 15 PLU-7/ml.
Transferasa nº 179 de A. salmonicida, 18,5 PLU-7/ml.
Fosfolipasa A1 LECITASETM ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca)
Yema de huevo: yema de huevo líquida con 8% de sal, SANOVA FOODS, DK El análisis de TLC se realizó como se ha descrito anteriormente (véase el ejemplo 6 anterior). Actividad de la fosfolipasa: véase los ejemplos anteriores. Extracción de lípidos 1 g de yema de huevo, 7,5 ml de cloroformo:metanol 2:1 se mezclaron en un Whirley durante 30 s y se centrifugaron
a 750 durante x g durante 10 minutos. Se aislaron 4 ml de la fase de cloroformo y se usaron para el análisis de lípidos posterior. Ensayo de estabilidad a la oxidación La estabilidad a la oxidación de la mayonesa se midió en un equipo ML OXIPRESS en el que la muestra se somete
a estrés oxidativo mediante calor a presión en una atmósfera de oxígeno. Después de un determinado tiempo, denominado periodo de inducción (IP), la oxidación de la muestra produce un
determinado consumo de oxígeno, que se registra como cambio de presión de un transductor de presión. El periodo de inducción mayor indica mejor estabilidad a la oxidación. Procedimiento Se colocan 5 gramos de mayonesa en un recipiente de vidrio y se cierra el recipiente de vidrio con el transductor de
presión. Se llena el recipiente con oxígeno hasta 5 bares. Se abre la válvula para vaciar el recipiente. Este procedimiento se repite dos veces y se pone la muestra con atmósfera de oxígeno a 5 bares a 80ºC. La presión de oxigeno se mide en función del tiempo y se calcula el período de inducción (IP) en horas.
Resultados La transferasa purificada de Aeromonas salmonicida de las muestras nº 179 y nº 178-9 se usaron para tratar la yema de huevo como se resume en la tabla 2. La prueba inicial ha mostrado que la transferasa GCAT debería añadirse con mucha menos actividad de fosfolipasa (PLU), que una fosfolipasa comercial. Esto se explica por el hecho de que GCAT es una transferasa y por consiguiente tiene mucha menos actividad hidrolítica que una fosfolipasa normal. Tabla 2
Yema de huevo Sanofo 8% de sal
2344-44 C89 18,5 PLU-7/ml Transferasa nº 178-9 nº 3108, Lecitasa Ultra Agua
nº
Yema de huevo Transferasa nº179 18,5 PLU-7/ml 1500 PLU-7/ml 7/ml
gramos
gramos
gramos
ml gramos PLU-7/ml
6
120 2,00 8,00 0,31
7
120 10 0 1,25
8
120 1,86 8,14 23,25
9
120 10 0
Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo pesando la yema de huevo y la enzima en un vaso de precipitados. Se colocaron las muestras en una estufa a 37ºC durante la agitación lenta. Después de 1, 2 y 4 horas de tiempo de reacción se extrajo una muestra para análisis de TLC. Después de 4 horas de tiempo de reacción el producto se almacenó a 5ºC y se utilizó para los experimentos con mayonesa.
El análisis de TLC de los lípidos extraídos de la yema de huevo tratada con enzimas se muestra en la figura 48.
Los análisis de TLC de la figura 48 presentan un efecto hidrolítico claro de la fosfolipasa nº 3108 en triglicéridos durante la formación de ácidos grasos libres, así como de algunos mono-y diglicéridos. La fosfolipasa nº 3108 parece no tener efecto sobre el colesterol. Ambas muestras de transferasa contribuyen claramente a la formación de éster de colesterol simultáneamente con la reducción del contenido de colesterol.
D. Yema de huevo modificada con enzimas en mayonesa
Con el fin de investigar el efecto de la modificación de las muestras de yema de huevo mencionadas en la tabla 2, se realizaron pruebas de aplicación en la mayonesa con un contenido en grasa del 50%. También se produjo una mayonesa que contenía yema de huevo sin tratar.
El objetivo de la investigación era determinar el impacto de las propiedades emulsionantes de la yema de huevo modificada con enzimas y el impacto en la estabilidad al calor. Todas las muestras de mayonesa contenían el mismo nivel de aceite y se emulsionaron sólo con yema de huevo.
Todas las muestras de mayonesa se produjeron usando un mezclador Koruma (Disho V60/10) y se calentaron durante el tratamiento a 95ºC durante 5 minutos.
Las muestras de las mayonesas (figura 49) producidas por la yema de huevo tratada con enzimas eran adecuadas y homogéneas sin separación de aceite. La muestra de referencia se separó en una fase de aceite y una acuosa.
El tamaño de partículas de la gotita de aceite en las muestras de mayonesa con yema de huevo tratada con enzimas se midió en un Mastersizer Malvern. Se mezcló la muestra con 0,1% de SDS en tampón fosfato 0,1 M, pH 7, antes de la medición. La lectura fue el tamaño medio de todas las partículas como se muestra en la tabla 3.
Tabla 3
Experimento
Enzima Tamaño medio de partículas, mm
6
Transferasa nº 179, 0,31 PLU-7/g 12,9
7
Transferasa nº 178-9, 1,25 PLU-7/g 7,2
8
nº 3108, Lecitasa Ultra, 23 PLU-7/g 5,2
Los resultados de la medición del tamaño de partículas muestran claramente el efecto del aumento de dosis de transferasa de A. salmonicida. Con la dosis alta de transferasa el tamaño de partícula está próximo al de la mayonesa producida por Lecitasa Ultra. Debe tenerse en mente, no obstante, que la Lecitasa Ultra produce muchos ácidos grasos, que pueden contribuir a una distribución de partículas más fina.
El tamaño de la gotita de aceite de la mayonesa preparada con la enzima es significativamente más pequeño que el tamaño de la gotita de aceite de la mayonesa preparada sin la enzima (es decir, la mayonesa de referencia).
Estabilidad a la oxidación
La estabilidad a la oxidación de las muestras 7 y 8 de mayonesa se analizó en un ML OXIPRESS con los resultados mostrados en la Tabla 4.
Tabla 4
Muestra
Periodo de inducción Periodo de inducción
1. determinación de horas
2. determinación de horas
7
37,44 38,08
8
35,68 35,52
La medición de la estabilidad a la oxidación proporcionó una diferencia significativa clara en la estabilidad a la oxidación. La mayonesa con yema de huevo tratada con transferasa 179-8 tenía una estabilidad a la oxidación significativa mejor que la mayonesa con yema de huevo tratada con Lecitasa Ultra. Esto puede explicarse por el hecho que la Lecitasa Ultra produce más ácidos grasos libres que son más propensos a la oxidación que los correspondientes ésteres de ácidos grasos.
Se extrajo una muestra de las yemas de huevo usadas para la producción de mayonesa con cloroformo, y los lípidos de la yema de huevo se analizaron por GLC con los resultados presentados en la tabla 5.
Tabla 5 5
Experimento
Enzima Ácido graso Colesterol Éster de colesterol Triglicérido
6
Transferasa nº 179 0,96 0,94 0,49 23,95
7
Transferasa nº 178-9 1,84 0,60 1,06 24,54
Experimento
Enzima Ácido graso Colesterol Éster de colesterol Triglicérido
8
nº 3108, Lecitasa Ultra 14,05 1,16 0,12 2,45
9
Referencia 0,48 1,16 0,13 22,87
Los resultados de la GLC en la tabla 5 confirman los resultados del análisis de TLC de que la Lecitasa Ultra produce una cantidad muy elevada de ácidos grasos libres y una gran parte de los triglicéridos se hidrolizan. Por otra parte, la transferasa produce solamente una cantidad modesta de ácidos grasos libres y los triglicéridos no se hidrolizan. También se muestra claramente que la transferasa produce éster de colesterol procedente del colesterol.
Los resultados indican que la cantidad de PC en la mayonesa "tratada con enzimas" es reducida en comparación con la mayonesa de referencia, mientras que la cantidad de LPC aumenta en la mayonesa tratada con enzima en comparación con la mayonesa de referencia. El aumento de la cantidad de LPC puede explicar bien las propiedades mejoradas de emulsión de la mayonesa tratada con enzimas en comparación con la mayonesa de referencia. Los análisis de HPLC y GLC indican además un nivel inferior de colesterol libre en la mayonesa tratada con enzimas en comparación con la mayonesa de referencia, probablemente debido a que el colesterol está siendo usado como molécula aceptora en la reacción de la transferasa produciendo un aumento en la cantidad de ésteres de colesterol en la mayonesa tratada con enzimas en comparación con la mayonesa de referencia. Además, los resultados indican que la cantidad de ácidos grasos libres no aumenta de manera significativa cuando la yema de huevo se trata con la transferasa. Los resultados indican además que la cantidad de ácidos grasos libres producidos en el producto alimenticio tratado con la lípido aciltransferasa es significativamente menor que en el producto alimenticio tratado con la fosfolipasa de referencia, esto es cierto incluso aunque la cantidad de lisolecitina formada en los alimentos es la misma.
Ejemplo 8: Efecto de la transferasa de Aeromonas salmonicida en pasteles
El efecto de la aciltransferasa GCAT de Aeromonas salmonicida se prueba en una receta de pastel. La enzima se prueba sola y combinada con otras enzimas lipolíticas. Las enzimas se añaden a alguno de los ingredientes del pastel o se añaden junto con los demás ingredientes del pastel antes de mezclar el pastel.
Los resultados preliminares muestran que la aciltransferasa combinada con una enzima de hidrólisis de triglicéridos mejora el volumen del pastel y la estructura de la miga en comparación con una referencia.
En los siguientes experimentos una transferasa de A. salmonicida y sus variantes se prueban solas y combinadas con enzimas que hidrolizan triglicéridos. Estas enzimas son activas en los componentes lipídicos en el huevo y la materia grasa así como en los hidratos de carbono, proteínas, glicerol y colesterol (en el huevo), que forman parte de la receta del pastel.
Materiales y método
Enzima
Aciltransferasa nº 179 de Aeromonas salmonicida
Grindamyl EXEL 16, Lipasa de Thermomyces lanuginosus
Receta del pastel:
Ingredientes
% g
Azúcar 35/20
20,37 204
Harina para pastel, Albatros
18,11 181
Almidón de trigo
5,21 52
Levadura en polvo
0,36 4
Huevo entero líquido pasteurizado
22,63 226
Materia grasa Vegao (Aarhus United)
18,11 181
Suero lácteo en polvo
0,68 7
Jarabe de glucosa ,75% 42 DE
4,53 45
Glicerol
1,36 14
Sal
0,32 3
Aceite de semilla de colza
6,34 63
Sorbato potásico
0,18 1,8
Equipo: Mezclador: Hobart N50 con una espátula Horno: horno para pasteles Simon Procedimiento: Todos los ingredientes deben estar a temperatura ambiente.
1.
Se forma una crema con el azúcar y materia grasa durante 3 minutos -empezar a la 2ª velocidad y pasar a la 3ª velocidad en 30 s
2.
Añadir los ingredientes restantes -empezar a la 1ª velocidad y pasar a la 2ª velocidad en 30 s -5 min de mezcla total
3.
Medir el volumen de la masa en una taza de 1 dl
4.
Los moldes de pastel de una libra se pulverizan con aceite "Babette" se extiende y se cubre con papel
5.
Se pesan 2 x 350 g en los moldes de pastel de una libra
6.
Se extiende la masa uniformemente con una espátula
7.
Antes de ponerla en el horno, se añade un chorro de aceite en la parte superior del pastel (longitudinalmente en el medio) para hacer que el pastel se rompa en el medio
8.
Hornear durante 50 min a 180ºC
9.
Después del horneado sacar el molde del horno y "dejarlo caer" sobre la mesa, antes de sacar los pasteles de los moldes.
10.
Sacar el papel de los pasteles y darles la vuelta hacia arriba.
11.
Los pasteles se enfrían sobre una rejilla durante 60 min, antes de pesar y medir el volumen Observaciones La o las enzimas usadas se añaden al comienzo del mezclado o se añaden a algunos de los ingredientes del pastel
antes de añadir los otros ingredientes del pastel.
Las enzimas son solamente activas durante el mezclado o la reacción de los componentes del pastel y las enzimas se inactivan durante la cocción del pastel. Resultados Se llevan a cabo los siguientes experimentos como se muestra en la tabla siguiente:
1
2 3 4
Huevo entero
g 250 250 250 250
Jarabe de glucosa, 75% DE 42
g 10 10 10 10
nº 179 aciltransferasa, 26 PLU/ml
ml 25 25
Grindamyl EXEL 16,
mg 37,5 37,5
Agua
25
El huevo, jarabe de glucosa y enzima se hacen reaccionar durante 30 minutos a 37ºC y poco después se usan los huevos para producir pastel según la receta mencionada anteriormente.
Los resultados preliminares demuestran que una combinación de aciltransferasa y una lipasa que hidroliza triglicéridos de Thermomyces lanoginosus, mejora el volumen del pastel y también mejora la estructura de la miga, la calidad y aspecto del alimento en comparación con una referencia con agua. Los resultados preliminares indican que en el pastel puede ser preferible usar una combinación de lípido aciltransferasa y una lipasa.
Ejemplo 9: El objeto de estos experimentos era probar una transferasa de A. hydrophila expresada en E. coli
La reacción con transferasa de A. hydrophila nº 135 (0,5 NEFA-PLU/ml) se probó en yema de huevo. El montaje experimental se muestra en la tabla 6.
Tabla 6
Tiempo de reacción
Yema de huevo nº 135 conc.
Nº
Minutos Gramos Unidades, PLU-NEFA
1
30 1 0,000
2
30 2 0,100
3
60 2 0,100
4
150 2 0,100
5
240 2 0,100
6
1560 2 0,100
7
1560 1 0,000
La yema de huevo se calentó a 37ºC y se añadió la enzima. Después del tiempo de reacción se añadieron 7 ml de CHCl3:Metanol 2:1 y se mezcla en un Whirley durante 30 s.
La muestra se centrifugó a 800 x g durante 10 min y se aisló la fase inferior de disolvente. Se aplicaron 2 µl de esta 5 muestra sobre una placa de sílice de TLC y se eluyó en el disolvente de elución IV. Los resultados del análisis de TLC se muestran en las figuras 50 y 51.
Los métodos y materiales mencionados en este ejemplo son los que se describen en los ejemplos anteriores.
Las muestras de este experimento también se analizaron por GLC como derivados de TMS. Los resultados de los análisis de GLC se muestran en la tabla 7.
10 Tabla 7. Análisis de GLC de lípidos de yema de huevo
Nº
Tiempo Transferasa nº 135 conc.
de reacción
Unidades/g de yema de huevo Ácidos grasos libres Colesterol Éster de colesterol
min
% % %
7
Referencia 0 0,25 2,88 0,34
3
60 0,025 0,25 2,68 0,56
4
150 0,025 0,29 1,85 1,72
5
240 0,025 0,53 1,42 3,54
6
1560 0,025 0,95 0,3 4,43
A partir del análisis GLC de ácidos grasos libres, colesterol y éster del colesterol se puede calcular la concentración molar de cada componente y calcular el % de actividad de transferasa como se muestra en la tabla 7. Cálculo del % de actividad de transferasa A partir de los resultados se calculan los aumentos en ácido graso libre y ésteres de esterol: 15  % ácidos grasos = % ácidos grasos (enzima) -% ácidos grasos (referencia)  % ésteres de esterol = % ésteres de esterol/estanol (enzima) -% ésteres de esterol/estanol (referencia) La actividad de la transferasa se calcula como % de la actividad enzimática total:
% de actividad de transferasa =
( % ésteres de esterol/(Mv ésteres de esterol)) x 100
 % ésteres de esterol/(Mv ésteres de esterol) +  % ácidos grasos/(Mv ácidos grasos) dónde: 20 Mv ésteres de esterol = peso molecular medio de los ésteres de esterol
Mv ácidos grasos = peso molecular medio de los ácidos grasos Tabla 8. Actividad de transferasa en la yema de huevo de A. hydrophila nº 135
Nº
Tiempo Transferasa nº 135 conc.
de reacción
Unidades/g de yema de huevo Ácidos grasos libres Colesterol Éster de colesterol Actividad de transferasa
min
mM mM mM %
7
Referencia 0 8,9 74,5 5,3 -
3
60 0,05 8,9 69,3 8,7 100
4
150 0,05 10,4 47,8 26,5 93
5
240 0,05 18,9 36,7 54,6 77
6
1560 0,05 33,9 7,8 68,4 48
Tanto los análisis por TLC como por GLC confirman que inicialmente la reacción de la transferasa de A. hydrophila nº 135 es la reacción dominante. Después de 150 minutos de tiempo de reacción se produce alguna actividad hidrolítica. Después de 1560 minutos la reacción de transferasa y la reacción hidrolítica han alcanzado casi el mismo nivel. Los resultados indican también que siempre y cuando la molécula aceptora de colesterol esté disponible, la reacción de transferasa es la reacción dominante. Cuando la concentración de colesterol disminuye la actividad hidrolítica se hace más dominante.
Ejemplo 10: Ensayo para la medición de la actividad de transferasa usando yema de huevo como sustrato denominado en lo sucesivo "Ensayo de yema de huevo"
Se aisló una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida y se expresó en Bacillus subtilis. El objeto de este trabajo es desarrollar un método analítico, que sea capaz de mejorar la actividad tanto de transferasa como hidrolítica de las enzimas, y a partir de estos análisis es posible definir la actividad tanto de transferasa como la hidrolítica de las enzimas usando un sustrato que contiene lecitina y colesterol.
En este trabajo se usó yema de huevo como sustrato para el ensayo enzimático porque la yema de huevo contiene tanto lecitina como colesterol y es sabido que las transferasas y las fosfolipasas actúan muy bien en este sustrato.
El inconveniente de usar yema de huevo es que este sustrato es una mezcla compleja de agua, lípidos y proteínas. Los componentes lipídicos incluyen 66,2% de glicéridos; 29,6% de fosfolípidos y 4,2% de colesterol. Los fosfolípidos están constituidos por 73% de lecitina, 15% de cefalina y 12% de otros fosfolípidos. De los ácidos grasos, el 33% son saturados y el 67% insaturados, que incluyen 42% de ácido oleico y 7% de ácido linoleico (ref. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Inc.).
Cabe esperar algunas variaciones en la composición de la yema de huevo. En la bibliografía (Biochimica et Biophysica Acta, 1124 (1992) 205-222) se menciona sin embargo que: "La yema de huevo madura de las gallinas domésticas tiene una composición de lípidos y lipoproteínas notablemente constante a pesar de la mucha variación en la dieta y en las condiciones ambientales" y además se cita "Como resultado la yema de huevo continúa proporcionando un producto alimenticio de composición casi constante que sirve para mantener sus propiedades químicas y físico-químicas para el uso fiable en las industrias de panificación, cosmética y farmacéutica".
Esta referencia indica que la composición de la yema de huevo es muy constante y se decidió por consiguiente usar yema de huevo de gallinas como sustrato para el ensayo con yema de huevo.
La cuantificación de los productos de la reacción de lípidos del tratamiento enzimático de la yema de huevo se realizó mediante extracción de lípidos del sustrato seguido de análisis GLC de los componentes lipídicos.
Procedimiento
Materiales
Yema de huevo: yema de huevo líquida pasteurizada de Danæg Products A/S, DK-4000 Roskilde.
Tampón HEPES, Sigma cat. nº H 3375.
Cloroformo, calidad analítica
Enzimas
Lípido aciltransferasa purificada de A. salmonicida nº 178-9.
Lipasa de Thermomyces lanuginosus. GRINDAMYL EXEL 16, nº de artículo 147060 (referencia). Ensayo enzimático con sustrato de yema de huevo En un vaso Wheaton de 20 ml se pesaron 5 g de yema de huevo líquida y se calentó a 35ºC, se añadieron 0,25 ml
de solución enzimática y se puso en marcha un cronómetro. A intervalos regulares se transfirieron muestras de 0,5 g a un vaso Dram de 10 ml. Se añadieron 20 µl de HCl 4 M con el fin de detener la reacción enzimática y acidificar el jabón de ácido graso. Se añadieron 3 ml de cloroformo y la muestra se mezcló en un mezclador Whirley durante 30 s. Se centrifugó la muestra a 3000 g durante 10 min y se transfirieron 0,8 ml de la fase cloroformo a un vaso Dram
tarado. Se evaporó el cloroformo a 60ºC bajo una corriente de nitrógeno. Se pesó de nuevo el vaso Dram. Se analizaron los lípidos aislados por GLC y TLC. Análisis por TLC -como se describe en la presente memoria. Análisis por GLC -como se describe en la presente memoria. Resultados Se llevó a cabo el experimento mostrado en la tabla 9 para el ensayo de yema de huevo usando yema de huevo
como sustrato. Tabla 9
1
2 3
Yema de huevo, líquida
gramos 5 5 5
Transferasa nº 178-9, 32 PLU-7/ml*
ml 0,25
Lipasa de T. lanuginosus, 200 LIPU/ml
ml 0,25
Agua
ml 0,25
Se tomaron muestras de 0,5 g después de 15, 30, 60, 120 y 1.080 minutos, y se aislaron los lípidos por extracción con disolvente. Se analizaron los lípidos por TLC usando el disolvente I y IV respectivamente. La fotografía de la placa de la TLC se muestra en la figura 52.
El análisis por TLC indica claramente la actividad de la transferasa nº 178-9 de A. salmonicida (muestra 3). Esto puede verse por la disminución de los fosfolípidos PC y PE. Los resultados también indican que la cantidad de lisolecitina LPC no es tan alta como se esperaba. Esto puede indicar actividad hidrolítica en la lisolecitina o puede ser causado también por extracción insuficiente porque la lisolecitina es muy polar y por consiguiente podría estar parcialmente distribuida en la fase acuosa.
Los lípidos aislados por extracción con disolvente se analizaron también por GLC con el fin de cuantificar la cantidad de ácido graso libre, colesterol y éster de colesterol. Los resultados de la GLC se muestran en la tabla 10.
Tabla 10. Análisis por GLC de lípidos de la yema de huevo tratada con enzimas. Los resultados están en % basados en el contenido en lípidos
15
30 60 120 1080
Minutos
Minutos
Minutos
Minutos
Minutos
Ácidos grasos libres
Referencia 1 0,328 0,304 0,332 0,333 0,369
T. lanuginosus
2 0,391 0,376 0,459 0,627 22,909
A. salmonicida nº
3 1,007 1,668 4,013 6,761 15,098
178-9
Colesterol
Referencia 1 3,075 2,968 3,103 3,056 3,099
T. lanuginosus
2 3,130 3,032 3,045 3,026 3,225
A. salmonicida nº
3 2,835 1,912 0,356 0,220 0,206
178-9
15 30 60 120 1080 Minutos Minutos Minutos Minutos Minutos Éster de colesterol Referencia 1 0,416 0,397 0,422 0,408 0,437
T. lanuginosus 2 0,436 0,400 0,425 0,419 0,416
A. salmonicida nº 3 1,414 2,988 6,107 6,694 5,760 178-9
Triglicéridos Control 1 76,153 73,505 75,565 79,344 77,382
T. lanuginosus 2 74,099 74,413 77,079 74,284 21,781
A. salmonicida nº 3 73,781 73,342 77,857 82,040 72,117 178-9
A partir de los resultados se observó que casi todo el colesterol estaba esterificado después de 60 minutos en la muestra 3. Se concluyó que en los primeros 30 minutos había sustrato en exceso para la reacción. Los resultados de las muestras tomadas después de 15 y 30 minutos se usaron por consiguiente para calcular las actividades de las enzimas.
5 Basándose en la información de la tabla 10 y en el hecho que la yema de huevo contiene 27% de lípidos, se calculó la cantidad de ácido graso y éster de colesterol en micromoles producida por ml de enzimas, cuyos resultados mostrados en la tabla 11.
Los resultados en la Tabla 11 se obtuvieron en los siguientes cálculos de los resultados de los ácidos grasos en la muestra nº 3 (A. Salmonicida, 15 min.).
10 Lípidos en 5 g en yema de huevo = 5 x 0,27 = 1,35 gramos
1,35 gramos de lípidos contienen 1,007% de ácidos grasos = 1,35 x 1,007/100 = 0,01359 gramos
El peso molecular medio de los ácidos grasos es 272
0,01350 gramos = 0, 01359 x 1.000.000/272 µmoles = 49,9798 µmoles
Se añaden 0,25 ml de enzima
15 µmoles de ácido graso/ml de enzima = 49,9798/0,25 = 199,9
Tabla 11
Micromoles/ml enzima 0 min 15 min 30 min
Ácidos grasos libres Referencia 65,01 60,37
T. lanuginosa 77,61 74,71 Transferasa nº 178-9 199,86 331,06
Éster de colesterol Referencia 35,09 33,50
T. lanuginosa 36,77 33,73 Trans. nº 178-9 119,29 252,15
A partir de los resultados de la tabla 11 se puede calcular el cambio en la cantidad de ácidos grasos y éster de colesterol producido por la enzima con respecto a la referencia, como se muestra en la tabla 12.
Tabla 12 5
Δ Micromoles/ml enzima
0 min 15 min 30 min
Ácidos grasos libres
T. lanuginosus 0 12,593 14,340
Transf. nº178-9
0 134,843 270,691
Éster de colesterol
T. lanuginosus 0 1,677 0,235
Δ Micromoles/ml enzima
0 min 15 min 30 min
Transf. nº178-9
0 84,196 218,652
La cantidad de ácido graso o de éster de colesterol producida en función del tiempo se muestra en la figura 53.
A partir de la pendiente de la curva se calculó la actividad hidrolítica (formación de AGL) y la actividad de lípido aciltransferasa (formación de éster de colesterol) en función del tiempo. La actividad de transferasa relativa (% de actividad de aciltransferasa) y la actividad hidrolítica relativa se calcularon a continuación como se muestra en la tabla 13. La actividad de transferasa relativa se determinó usando el protocolo para la determinación del % de actividad de actividad de aciltransferasa como se ha descrito en lo que antecede. Por ejemplo, el cálculo de la actividad relativa para el nº 178-9: La actividad total es la actividad de AGL + actividad de transferasa = 9,023+7,2884 = 16,311 µmoles/min/ml. Actividad relativa de transferasa = 7,2884 x 100/16,311 = 44,7, Actividad relativa hidrolítica = 9,023 x 100/16,311 = 55,3.
Tabla 13
T. lanuginosus
Actividad de AGL 0,4780 µmol/min/ml
A. salmonicida nº 178-9
Actividad de AGL 9,0230 µmol/min/ml
T. lanuginosus
Éster de colesterol. Actividad 0,0078 µmol/min/ml
A. salmonicida nº 178-9
Éster de colesterol. Actividad 7,2884 µmol/min/ml
T. lanuginosus
Actividad relativa de transferasa 1,6
A. salmonicida nº 178-9
44,7
T. lanuginosus
Actividad relativa hidrolítica 98,4
A. salmonicida nº 178-9
55,3
Los resultados en la tabla 13 confirmaron que la enzima transferasa de A. salmonicida tiene una actividad significativa de transferasa, pero los resultados confirmaron también que esta enzima tiene una actividad hidrolítica significativa.
La lipasa de T. lanuginosus principalmente tiene actividad hidrolítica y la actividad relativa de transferasa 1,6 no era una prueba de actividad de transferasa alguna, pero se explicó por la incertidumbre de los análisis.
Conclusión
Se usó yema de huevo como sustrato para la medición de actividad de transferasa e hidrolasa de la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida y de una lipasa de Thermomyces lanuginosus. En las condiciones del ensayo hubo inicialmente una relación lineal entre la formación de éster de colesterol y de ácido graso libre y el tiempo para la enzima lípido aciltransferasa. Basándose en esta relación lineal se pudo calcular la actividad hidrolítica (formación de AGL) y la actividad de transferasa (formación de éster de colesterol). Se calculó también la actividad relativa hidrolítica y de transferasa. La lípido aciltransferasa (en este caso una GCAT) de Aeromonas salmonicida, demostró casi igual actividad hidrolítica y de transferasa en estas condiciones de ensayo.
La lipasa de Thermomyces lanuginosus presentó muy poca actividad hidrolítica y la actividad de transferasa no era significativa.
Ejemplo 11: Ensayo de transferasa en yema de huevo con alto contenido en agua
Introducción
Se aisló una lípido aciltransferasa según la presente invención de Aeromonas salmonicida y se expresó en Bacillus subtilis. Los experimentos iniciales han mostrado que esta enzima es muy eficaz en la transferencia de ácido graso desde la lecitina al colesterol utilizando yema de huevo como sustrato.
En los siguientes experimentos se estudió la reacción de la transferasa con más detalle usando yema de huevo como sustrato con atención especial en la concentración de agua en el sustrato.
Procedimiento
Materiales
Yema de huevo: Yema de huevo líquida pasteurizada de Danæg Products A/S, DK-4000 Roskilde.
Tampón HEPES, de Sigma nº cat. H 3375
Cloroformo, calidad analítica Escualeno, calidad analítica Enzimas nº 178-9 lípido aciltransferasa según la presente invención de A. salmonicida nº 2427 Fosfolipasa A1 de Fusarium oxysporum. LIPOPAN® F de Novozymes, DK (enzima lipolítica comparativa) nº 1991 fosfolipasa A2 del páncreas, LIPOMOD 22L de Biocatalysts, U.K. (enzima lipolítica comparativa). Ensayo enzimático con sustrato de yema de huevo Se pesaron 5 gramos de sustrato de yema de huevo líquida en un vaso Wheaton de 20 ml y se calentó a 35ºC. Se añadió agua y solución enzimática y se puso en marcha un cronómetro. A intervalos regulares se transfirieron muestras de 0,5 g a un vaso Dram de 10 ml. Se añadieron 20 µl de HCl 4 M con el fin de detener la reacción enzimática y acidificar el jabón de ácido graso. Se añadieron 3 ml de cloroformo y la muestra se mezcló en un mezclador Whirley durante 30 s. Se centrifugó la muestra a 3.000 g durante 10 min y se transfirieron 0,8 ml de la fase cloroformo a un vaso Dram
tarado. Se evaporó el cloroformo a 60ºC en una corriente de nitrógeno. El vaso Dram se pesa de nuevo. Se analizan los lípidos aislados por GLC. Análisis GLC Un cromatógrafo de gases capilar Autosystem 9000 de Perkin Elmer equipado con una columna de sílice fundida
WCOT de 12,5 m x 0,25 mm de DI x 0,1 µ de espesor de película de 5% de fenil-metilsilicona (CP Sil 8 CB de Chrompack). Gas portador: helio Inyector. Inyección dividida en frío inyección PSSI (temp. inicial 50ºC calentado hasta 385ºC), volumen 1,0 µl
Detector FID: 395ºC
Programa del horno: Temperatura del horno, ºC Isoterma, tiempo min. Velocidad de calentamiento, ºC/min
1 90 1 15 2 280 0 4 3 350 10
Preparación de la muestra: Se disolvieron 30 mg de muestra en 9 ml de heptano:piridina, 2:1 que contenía el patrón interno heptadecano, 0,5 mg/ml. Se transfirieron 300 µl de la solución de la muestra a un vial con tapón plegable sobre el recipiente, se añadieron 300 µl de MSTFA (N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida) y se hicieron reaccionar durante 20 minutos a 60ºC.
Cálculo: Se determinaron los factores de respuesta para mono-di-triglicéridos y ácidos grasos libres a partir del patrón 2 (mono-di-triglicéridos), para el colesterol, palmitato de colesterilo y estearato de colesterilo los factores de respuesta se determinaron a partir del material de referencia puro (pesada del material puro 10 mg).
Resultados
Se utilizó yema de huevo que contenía 2% de escualeno como sustrato para las reacciones. Se añadió escualeno como patrón interno para el análisis por GLC, con el fin de cuantificar los componentes lipídicos en la yema de huevo.
El experimento se configuró como se muestra en la tabla 14.
Tabla 14
1
2 3 4 5 6 7 8
Sustrato, yema de huevo con 2% de escualeno
g 5 5 5 5 5 5 2,5 2,5
Transferasa nº 178-9, 14 PLU-7/ml
ml 0,25 0,25 0,13
Solución LIPOPAN® F, 200 PLU-7/ml
ml 0,25 0,13
nº 1991 Fosfolipasa A2, 6300 PLU/ml
ml 0,25 0,25
Agua
ml 0,25 3,8 3,8 8,75 8,75
Se tomaron muestras después de 30, 60 y 120 minutos y se analizaron según el método descrito anteriormente (se tomaron las muestras de 0,5 ml (exp. 1-4) 0,86 ml (exp. 5-6) y 2,2 ml (exp. 7-8)).
Los resultados del análisis GLC se muestran en la tabla 15. Los resultados de GLC se expresaron en porcentaje del sustrato (yema de huevo). La tabla también indica el tiempo de reacción y la cantidad total de agua en la mezcla de reacción.
Tabla 15
Enzima
Tiempo de reacción % agua GLC GLC GLC
minutos
en la reacción % ácidos grasos % colesterol % éster de colesterol
Referencia
120 54 0,247 0,863 0,083
nº 178
30 54 0,422 0,669 0,445
nº 178
60 54 0,515 0,549 0,672
nº 178
120 54 0,711 0,364 1,029
nº 2427
30 54 2,366 0,848 0,090
nº 2427
60 54 3,175 0,837 0,088
nº 2427
120 54 3,926 0,833 0,082
nº 1991
30 54 1,606 0,911 0,083
nº 1991
60 54 1,701 0,838 0,080
nº 1991
120 54 1,781 0,763 0,053
nº 178
30 73 0,377 0,764 0,495
nº 178
60 73 0,488 0,665 0,719
nº 178
120 73 0,626 0,426 0,931
nº 2427
30 73 2,471 0,853 0,092
nº 2427
60 73 3,284 0,858 0,087
nº 2427
120 73 4,176 0,837 0,081
nº 178
30 89 0,344 0,720 0,308
nº 178
60 89 0,443 0,725 0,446
nº 178
120 89 0,610 0,597 0,607
nº 2427
30 89 0,510 0,167 0,010
nº 2427
60 89 0,602 0,133 0,010
nº 2427
120 89 0,867 0,147 0,009
Basándose en los análisis de ácidos grasos, colesterol y éster de colesterol se puedo calcular la cantidad de ácidos grasos libres y éster de colesterol producida en función del tiempo de reacción y del contenido de agua. Basándose
10 en estos resultados se pudo calcular la actividad enzimática total como la suma de la formación de ácidos grasos y la formación de éster de colesterol. Después se calcularon la actividad relativa hidrolítica y la actividad relativa de transferasa (es decir, el % de actividad de aciltransferasa) con los resultados presentados en la tabla 16.
Los resultados en la tabla 16, se analizaron también estadísticamente usando Statgraphic Multifactor ANOVA. Los resultados estadísticos en la figura 54 confirman que la fosfolipasa A1, nº 2427 y la fosfolipasa A2, nº 1991 no tienen actividad de transferasa mientras que la transferasa nº 178-9 presentó casi 50% de actividad de transferasa en estas condiciones de ensayo.
5 El efecto del contenido de agua en el ensayo sobre la actividad de la transferasa nº 178 se analizó también estadísticamente como se muestra en la figura 55. Estos resultados indican que en el intervalo entre 54 y 89% de agua en el ensayo, no existía ningún efecto fuerte del contenido de agua sobre la actividad relativa de transferasa.
El impacto del tiempo de reacción en la actividad de transferasa para la transferasa nº 178 se evaluó con los resultados mostrados en la tabla 16 y figura 56. Los resultados en la figura 56 indican que la actividad relativa de
10 transferasa disminuye en función del tiempo de reacción. Esto puede explicarse por el hecho de que la mayor parte de la molécula de colesterol aceptora se consume y por consiguiente aumenta la actividad relativa hidrolítica. Los valores negativos para la reacción de transferasa para el nº 2427 solo indican que no hay actividad de transferasa dentro de la variación del método analítico.
Tabla 16
Enzima
Tiempo de reacción minutos % agua en la mezcla de reacción Ácidos grasos producidos Colesterol consumido Éster de colesterol producido Actividad hidrolítica % Actividad de transferasa %
nº 178
30 54 0,175 0,194 0,362 53 47
nº 178
60 54 0,268 0,314 0,589 52 48
nº 178
120 54 0,464 0,499 0,946 53 47
nº 2427
30 54 2,119 0,015 0,007 100 0
nº 2427
120 54 2,928 0,026 0,005 100 0
nº 2427
60 54 3,679 0,030 -0,001 100 0
nº 1991
30 54 1,359 -0,048 0,000 100 0
nº 1991
60 54 1,454 0,025 -0,003 100 0
nº 1991
120 54 1,534 0,100 -0,030 101 -1
nº 178
30 73 0,130 0,099 0,412 42 58
nº 178
60 73 0,241 0,198 0,636 47 53
nº 178
120 73 0,379 0,437 0,848 51 49
nº 2427
30 73 2,224 0,010 0,009 100 0
nº 2427
60 73 3,037 0,005 0,004 100 0
nº 2427
120 73 3,929 0,026 -0,002 100 0
nº 178
30 89 0,097 0,143 0,225 50 50
nº 178
60 89 0,196 0,138 0,363 56 44
nº 178
120 89 0,363 0,266 0,524 62 38
nº 2427
30 89 0,263 0,696 -0,073 113 -13
nº 2427
60 89 0,355 0,730 -0,073 110 -10
nº 2427
120 89 0,620 0,716 -0,074 105 -5
15 Conclusión
La lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida se analizó en yema de huevo como sustrato y con diferentes cantidades de contenido en agua. Esta enzima se comparó con enzimas lipolíticas de referencia, en concreto fosfolipasa A1 de Fusarium oxysporum y una fosfolipasa A2 del páncreas.
Los resultados han demostrado que solamente la transferasa catalizó la reacción de transferasa entre la lecitina y el
20 colesterol durante la formación del éster de colesterol. Los resultados mostraron que en el intervalo de 54% a 89% de agua en el sustrato la actividad relativa de transferasa fue casi la misma que para la transferasa de Aeromonas salmonicida.
Ejemplo 12: El "ensayo de transferasa en sustrato tamponado" para la medición de la actividad de aciltransferasa (p. ej., para usar en un producto alimenticio que usa lecitina y colesterol)
La lípido aciltransferasa se aisló de Aeromonas salmonicida y se expresó en Bacillus subtilis. Esta enzima es muy eficaz para transferir ácidos grasos de la lecitina al colesterol durante la formación de ésteres de colesterol. Se ha mostrado además que la enzima tiene alguna actividad hidrolítica, que se observa por la formación de ácido graso libre. Las fosfolipasas tradicionales (EC 3.1.1.4 y EC 3.1.1.32) tienen capacidad de hidrolizar lecitina durante la formación de los ácidos grasos libres y de lisolecitina, y no se han descrito reacciones de transferasa para estas enzimas.
Se detalla en la presente memoria un ensayo que puede medir la actividad tanto de transferasa como hidrolítica de las enzimas y de este modo identificar lípido aciltransferasas según la presente invención, el ensayo usa un sustrato que contiene lecitina y colesterol. En este trabajo se usó un sustrato basado en fosfatidilcolina y colesterol dispersado en un tampón. La cuantificación de los productos de reacción se hizo mediante extracción de lípidos del sustrato seguido de análisis por GLC de los componentes lipídicos.
Procedimiento
Materiales
L-alfa-fosfatidilcolina al 95% (vegetal) Avanti nº 441601
Colesterol: Sigma cat. C 8503 d
Palmitato de colesterilo, Sigma C 6072
Estearato de colesterilo, Sigma C 3549
Tampón HEPES, Sigma cat. nº H 3375
Cloroformo, calidad analítica.
Enzimas
GCAT purificada de A. salmonicida nº 178-9
El análisis por TLC se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 6.
El análisis por GLC se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 11.
Resultados: ensayo de transferasa basado en fosfatidilcolina y colesterol como sustrato.
A continuación, se determinó la actividad de transferasa de la transferasa en un sustrato basado en fosfatidilcolina y colesterol según el procedimiento siguiente.
Se disolvieron 450 mg de fosfatidilcolina (> 95% PC Avanti artículo nº 441601) y 50 mg de colesterol en cloroformo y se evaporó a sequedad al vacío. Se transfirieron 300 mg de la mezcla colesterol/fosfatidilcolina a un vaso Wheaton y se añadieron 15 ml de tampón HEPES 50 mM, a pH 7. El lípido se dispersó en el tampón durante la agitación.
Se calentó el sustrato a 35ºC durante el mezclado con un agitador magnético y se añadieron 0,25 ml de solución enzimática. Este es un medio con muy alto contenido de agua de aproximadamente 95% de agua.
Se tomaron muestras de 2 ml después de 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción.
Inmediatamente se añadieron 25 µl de HCl 4 M para acidificar los ácidos grasos libres y detener la reacción enzimática. Se añadieron 3,00 ml de cloroformo y la muestra se agitó enérgicamente en un Whirley durante 30 segundos. Se centrifugó la muestra y se aislaron 2 ml de la fase de cloroformo y se filtraron a través de filtros de 0,45 µm en un vaso Dram tarado de 10 ml. El cloroformo se evaporó bajo una corriente de nitrógeno a 60ºC, y las muestras se pesaron de nuevo. Se analizó el lípido extractado por GLC.
Los resultados del análisis GLC se muestran en la tabla 17. Los resultados se expresan en % calculado respecto al lípido extraído. La cantidad de ácido graso y éster de colesterol formado en función del tiempo se ilustra en la figura
57. Puede concluirse de la figura 57 que la reacción enzimática no es lineal en función del tiempo, porque se observa una actividad hidrolítica y de transferasa inicialmente fuerte. Después de aproximadamente 10 minutos y hasta aproximadamente 60 minutos la reacción presenta una respuesta casi lineal de formación de ácido graso y éster de colesterol en función del tiempo. Se decidió por tanto observar en la reacción enzimática en este intervalo de tiempo.
Tabla 17
Minutos
0 5 10 15 25 40 60
Colesterol, %
10,064 8,943 8,577 8,656 8,102 7,856 7,809
Éster de colesterol, %
0,000 1,571 2,030 2,058 2,282 2,659 3,081
AGL total, %
0,260 1,197 1,239 1,466 2,445 2,943 3,940
A partir del conocimiento sobre la cantidad de lípido en la mezcla de reacción y de la cantidad de enzima añadida se pudo calcular la formación de ácido graso y de éster de colesterol expresado en µmol/ml de enzima (tabla 18 y figura 58)
Tabla 18
Minutos
10 15 25 40 60
µmol/ml
µmol/ml
µmol/ml
µmol/ml
µmol/ml
AGL total
58,1 68,7 114,6 138,0 184,7
Éster de colesterol
88,8 90,0 99,3 115,6 133,8
A partir de los resultados de la tabla 18 y de la pendiente de las curvas en la figura 58, se pudo calcular la cantidad de ácido graso y éster de colesterol en función del tiempo, expresado en µmol/min por ml de enzima.
El cálculo de la actividad hidrolítica y de la actividad de transferasa se presenta en la tabla 19. La actividad relativa de transferasa se determinó usando el protocolo para la determinación del % de actividad de aciltransferasa como 10 se ha descrito en lo que antecede.
Tabla 19
Actividad hidrolítica (ácido graso)
2,52 µmol/min por ml enzima
Actividad de transferasa (éster de colesterol)
0,94 µmol/min por ml enzima
Actividad total
3,45 µmol/min por ml enzima
Actividad relativa de transferasa
27,1 %
Actividad relativa hidrolítica
72,9 %
Cribado de otras enzimas según la actividad de transferasa El procedimiento mencionado anteriormente se usó para cribar diferentes enzimas lipolíticas según la actividad de transferasa e hidrolítica. Las enzimas se ensayaron como se muestra en la tabla 20. 15 Tabla 20
1
2 3 4 5
Sustrato
ml 15 15 15 15 15
nº 178-9, Transferasa de A. salmonicida 32 PLU-7/ml
ml 0,25
5% nº 3016, LIPOPAN® F (F. oxysporum)
ml 0,25
5%, Thermomyces lanuginosus
ml 0,25
5% Candida rugosa nº 2983
ml 0,25
5% Candida cylindracea nº 3076
ml 0,25
El sustrato que contenía 300 mg de fosfatidilcolina/colesterol dispersado en tampón HEPES 50 mM, a pH 7,0, se calentó a 35ºC con agitación. Se añadió solución enzimática y la muestra se mantuvo a 35ºC en agitación. Se tomaron muestras a intervalos regulares y se extrajeron con cloroformo. Se analizaron los lípidos aislados por GLC con los resultados mostrados en la tabla 21.
Tabla 21
Muestra
1
Transferasa 178-9
Minutos
0 5 10 15 25 40 60
AGL
1,216 2,516 2,983 2,62 2,894 3,448 3,911
Colesterol
7,547 6,438 6,365 6,15 6,136 5,936 5,662
Éster de col.
0 1,835 2,177 2,44 2,58 2,851 3,331
2
Fusarium oxysporum (LIPOPAN® F) 0 5 10 15 25 40 60
AGL
1,216 1,345 1,796 1,95 2,487 2,424 2,977
Colesterol
7,547 7,309 7,366 7,33 7,429 7,341 7,326
Éster de col.
0 0,26 0,386 0,35 0,267 0,36 0,394
3
Thermomyces lanuginosus 0 5 10 15 25 40 60
AGL
1,216 0,853 0,875 1 0,896 1,105 1,009
Colesterol
7,547 7,384 7,639 7,63 7,675 7,603 7,529
Éster de col.
0 0 0 0 0 0 0
4
Candida rugosa (nº 2938) 0 5 10 15 25 40 60
AGL
1,216 0,982 0,987 1,02 1,135 1,131 1,15
Colesterol
7,547 7,438 7,656 7,66 7,638 7,575 7,585
Éster de col.
0 0 0 0 0 0 0
5
Candida cylandracea (nº 3076) 0 5 10 15 25 40 60
AGL
1,216 1,032 1,097 1,07 1,203 1,131 1,43
Colesterol
7,547 7,502 7,425 7,65 7,619 7,502 7,411
Éster de col.
0 0 0 0 0 0
A partir del análisis por GLC se observó que solamente la lípido aciltransferasa (178-9) producía una cantidad significativa de éster de colesterol y de ácidos grasos. La fosfolipasa de Fusarium oxysporum también proporcionó un aumento constante en el ácido graso libre pero solamente se formó una pequeña cantidad inicial de éster de
5 colesterol pero no se observó aumento de éster de colesterol en función del tiempo.
Basándose en el conocimiento de la cantidad del sustrato lipídico y en los análisis por GLC se pudo calcular la actividad relativa de transferasa y la actividad relativa hidrolítica basadas en los resultados de 10 a 60 minutos de tiempo de reacción. Los resultados de la transferasa 178-9 y de la lipasa de Fusaruim oxysporum se muestran en la Tabla 21. Las demás enzimas probadas no mostraron actividad.
10 Tabla 21
Transferasa 178-9
Fusarium oxysporum
Actividad hidrolítica, micromol/min por ml enzima
1,03 0,96
Actividad de transferasa, micromol/min por ml enzima
0,40 0,01
Actividad total, micromol/min por ml enzima
1,43 0,98
Actividad relativa hidrolítica
71,8 98,7
Actividad relativa de transferasa
28,2 1,3
Los resultados mostrados en la tabla 21 confirman una actividad de transferasa significativa de la lípido aciltransferasa (muestra 178-9). Se observa también que la actividad relativa de transferasa está muy de acuerdo con la del experimento mencionado en la tabla 19.
Sin embargo, se observó una actividad de transferasa muy baja de la fosfolipasa de Fusaruim oxysporum. Este nivel de transferasa es tan bajo que está comprendido dentro de la incertidumbre del análisis. Como cabía esperar la fosfolipasa de Fusaruim oxysporum tiene una actividad hidrolítica significativa.
Conclusión
5 En lugar de yema de huevo (mostrada en el ejemplo 11) se usó un sustrato artificial basado en fosfatidilcolina purificada y colesterol como sustrato para medir la actividad de la transferasa de Aeromonas salmonicida. Entre 10 minutos y 60 minutos de tiempo de reacción el ensayo proporcionó una formación casi lineal de ácidos grasos libres y de éster de colesterol en función del tiempo. Basándose en la actividad entre 10 y 60 minutos de tiempo de reacción se calculó la actividad hidrolítica y la actividad de transferasa.
10 La concentración de sustratos en este ensayo era relativamente menor que en la yema de huevo, y la cantidad de agua en el ensayo era relativamente mayor.
Basándose en los resultados del ensayo de la lípido aciltransferasa (en este caso una GCAT) de Aeromonas salmonicida en un sustrato artificial de fosfatidilcolina/colesterol en tampón, se llega a la conclusión de que esta enzima presenta una actividad de transferasa muy buena también en un sistema con un contenido de agua muy alto.
15 Los ensayos tanto basados en yema de huevo (véase el ejemplo 11) como en fosfatidilcolina/colesterol en tampón (ejemplo 12), pueden usarse para medir la actividad de transferasa e hidrolítica de las enzimas. Se prefiere la yema de huevo desde el punto de vista de que la actividad hidrolítica y de transferasa es lineal en función del tiempo, pero la fosfatidilcolina/colesterol en el tampón es solamente lineal dentro de un determinado límite de tiempo.
Ejemplo 13: Emulsiones alimenticias
20 Se ensayó el efecto de la yema de huevo líquida modificada con enzimas en una receta estándar de emulsión de alimento con 60% de aceite.
Los métodos normalizados y los materiales son como para los detallados en los ejemplos anteriores.
Se trató la yema de huevo con una lípido aciltransferasa procedente de Aeromonas salmonicida (nº 138) o fosfolipasa, en concreto una enzima Lipopan F® disponible en el mercado (Novozymes A/S, Dinamarca) (nº 2938)
25 como se muestra en la tabla 22.
Tabla 22. Tratamiento enzimático de la yema de huevo
1
2 3 4
Yema de huevo, Sanofo producto nº 1123P2
Gramos 10 1 210 10 1 360 10 1 210 10 1 210
nº 138, 10 PLU/ml
ml
nº 2938, 200 PLU/ml
ml
Agua
ml
Tiempo de reacción
Minutos
El análisis por TLC de los lípidos de yema de huevo procedentes de yema de huevo tratada con enzimas (tabla 9) se muestra en las figuras 59 y 60.
En este experimento se aumentó la dosis de nº 2938 en un factor de 10 y esto dio una actividad muy evidente en la
30 yema de huevo. La cantidad de ácido graso libre aumento de manera significativa y la lecitina (PC) se hidrolizó a lisolecitina (LPC). La transferasa nº 138 proporcionó una reacción de transferasa clara debido a que el colesterol libre se convirtió en éster de colesterol y parte de la lecitina se convirtió en lisolectina.
Otro aspecto interesante de la modificación enzimática fue la consistencia del producto. La muestra tratada con fosfolipasa nº 2938 se volvió muy sólida, mientras que las muestras tratadas con la lípido aciltransferasa nº 138
35 mantuvieron la misma consistencia líquida que la muestra de referencia (véase la figura 61).
Estas yemas de huevo modificadas se ensayaron en una receta de emulsión alimenticia mostrada en la Tabla 23.
Tabla 23. Mayonesa con yema de huevo modificada con enzima 5
0
1a 2a 3a 4a
%
%
%
%
%
Aceite de colza
60 60 60 60 60
0
1a 2a 3a 4a
%
%
%
%
%
Yema de huevo, Sanofo producto nº , 1123P2
2,8
Yema de huevo modifica con enzima nº 1
2,8
Yema de huevo modifica con enzima nº 2
2,8
Yema de huevo modifica con enzima nº 3
2,8
Yema de huevo de referencia (no tratada) nº 4
2,8
Agua
39 36,2 36,2 36,2 36,2
Vinagre, ácido acético al 10%
1 1 1 1 1
Las yemas de huevo 1 y 2 modificadas se trataron con la lípido aciltransferasa; y la yema de huevo 3 modificada se trató con la fosfolipasa disponible en el mercado.
La emulsión alimenticia se produjo como una emulsión de aceite en agua según el siguiente procedimiento: se pesó la yema de huevo y el agua en un vaso de precipitados. Se pesó el aceite por separado.
Se sumergió en la fase acuosa un mezclador Turrax (20000 rpm). El aceite se bombeó a la fase acuosa a una velocidad constante de 2 minutos. El mezclado continuó durante 1 minuto más. Después se añadió el vinagre y se mezcló durante 5 segundos.
La estabilidad de la emulsión se determinó en una estufa a 100ºC. Después de 2 horas a 100ºC se evaluó la emulsión (véase la figura 62).
La estabilidad de la emulsión de la yema de huevo sin tratar era bastante buena en este experimento. El tratamiento de la yema de huevo con la lípido aciltransferasa nº 138, sin embargo, mejoró la estabilidad debido a que se redujo la cantidad de separación de agua. La yema de huevo tratada con fosfolipasa nº 2938 proporcionó una emulsión muy inestable con casi separación completa de la fase de aceite y de agua a 100ºC.
Se considera que en algunas aplicaciones el uso de las composiciones y métodos de la invención puede proporcionar un aumento de la estabilidad térmica de las emulsiones, tal como aliños de ensalada de aceite en agua y similares. Esto es particularmente importante en las emulsiones de alimentos que están pasteurizadas para asegurar larga vida en anaquel y/o se calientan antes de servirlas, por ejemplo, en las comidas preparadas previamente para recalentarlas antes de servirlas (por ejemplo, comidas para microondas). Aunque no se desea estar ligado por ninguna teoría en particular, se considera que en algunas aplicaciones la acumulación de ácido graso libre puede ser perjudicial para la estabilidad térmica de dichas emulsiones. Debe reconocerse que el aumento de la estabilidad térmica de las emulsiones alimenticias producido usando los métodos de la invención puede no encontrarse o incluso ser deseable, en todas las aplicaciones alimenticias. Será evidente para un experto en la materia que las aplicaciones de dichas características son deseables, y que la estabilidad de las emulsiones puede determinarse fácilmente usando unas sencillas pruebas de calor, equivalentes a, por ejemplo, la pasteurización y/o recalentamiento en microondas. Los autores de la invención han descubierto que en una realización preferida las emulsiones alimenticias obtenidas utilizando las enzimas de la invención tienen mayor estabilidad térmica.
Ejemplo 14: Reacción de transferasa en yema de huevo enriquecida con fitoesterol
La transferasa procedente de Aeromonas salmonicida era capaz de catalizar la formación de lisolecitina, monoglicérido y ésteres de fitoesterol en yema de huevo enriquecida con fitoesterol y glicerol. La misma enzima se probó también en un sistema con bajo contenido de agua que contenía aceite de palma, lecitina, fitoesterol y glicerol. Mediante los análisis de TLC y GLC se mostró que el monoglicérido y los ésteres de esteroles vegetales se producían en estas condiciones de reacción.
Introducción
Se ensayó la actividad de transferasa en la transferasa de Aeromonas salmonicida en el sistema de lecitina, grasa, fitoesterol y glicerol casi exento de agua.
Materiales:
Yema de huevo: Yema de huevo líquida pasteurizada de Danæg Products A/S, DK-4000 Roskilde
Purificación de transferasa GCAT 178-9, 32 PLU-7/ml (Journal 2254-100)
Lecitina de soja, Yolking de Aarhus United, Dinamarca.
Aceite de palma 43, de Aarhus United, Dinamarca. L-α fosfatidilcolina al 95% vegetal (Avanti nº 441601) Sitosterol, Sigma nº S5753 Fitoesterol: Generol N122 de Cognis, Alemania. Glicerol artículo nº 085915 Resultados El cribado inicial de la actividad de transferasa en fitoesterol y glicerol se llevó a cabo en yema de huevo como se
muestra en la Tabla 24. Tabla 24
1
2 3 4
Yema de huevo
Gramos 1 1 1 1
Glicerol
Gramos 0,1 0,1
Sitosterol:olie 3:7
Gramos 0,13 0,13
Transferasa nº 178-9
Unidades 1 1
Agua
* *
*Agua correspondiente a la cantidad de agua en la solución enzimática = 83 µl
10 Se mezclaron los ingredientes y se calentaron a 37ºC y se mantuvo a esta temperatura durante la agitación con un agitador magnético.
Se tomaron muestras de 0,1 gramo después de 3 y 23 horas y se analizaron por TLC.
Los resultados del análisis TLC se muestran en la figura 63.
El resultado en la figura 63 indicó que tanto el colesterol como los esteroles vegetales estaban esterificados por la
15 reacción con transferasa, simultánea con la formación de lisolecitina (muestras 3 y 4), porque casi todo el esterol y colesterol libres se convirtieron en el éster correspondiente en la muestra 3.
Los resultados indicaban también que la muestra solo con glicerol y yema de huevo producía monoglicérido. La cantidad de monoglicérido necesita ser confirmada por análisis GLC. Cuando se añadió esterol junto con glicerol (muestra 3) la cantidad de monoglicérido fue muy baja y no era detectable por TLC. Esto indicaba que con tal que
20 exista exceso de esterol o colesterol la reacción con transferasa que usa glicerol era modesta.
En otro experimento la enzima transferasa 178-9 se añadió a una mezcla de lecitina de soja, glicerol y fitoesterol con el fin de estudiar la actividad catalítica de la enzima en esta mezcla de reacción.
La composición de las mezclas de reacción en estos experimentos se muestra en la Tabla 25.
Tabla 25
123456 Lecitina de soja gramos 1,875 2,25 1,875 2,5 3,5 3,5 Fitoesterol; Generol N 122 gramos 0,225 0,225 0 0 0,225 0,5 Aceite de palma 43 gramos 2,675 2,25 2,8 2,125 1,062 0,831 Glicerol gramos 0,225 0,275 0,325 0,375 0,248 0,238
Transferasa nº 178 -9, 32 PLU/ml ml 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
25 El experimento se realizó mezclando los componentes lipídicos durante agitación a 46ºC. Se añadió la enzima y se sacaron muestras después de 4 y 24 horas.
Se analizaron las muestras por TLC como se muestra en la figura 64.
También se analizaron muestras de los experimentos 2, 4 y 5 después de 24 horas de reacción por GLC, cuyos resultados se muestran en la Tabla 26.
Tabla 26
Glicerol % 3,16 5,71 4,17
Ácidos grasos % 4,23 5,36 6,67
Mono % 2,24 3,87 3,92
Esterol % 2,13 2,62
Éster de esterol % 2,89 2,14
Los resultados confirmaban que la transferasa 178-9 podía catalizar la formación de ésteres de fitoesteroles y
5 monoglicéridos a partir de una mezcla de reacción que contenía lecitina de soja, glicerol y fitoesterol. Dicha mezcla de reacción podía tener interés para usar en la producción de margarina donde se necesita monoglicérido por sus propiedades emulsionantes y ésteres de fitoesteroles para su efecto de reducción del colesterol.
Conclusión
La transferasa CGAT de Aeromonas salmonicida podía catalizar la formación de ésteres de fitoesteroles y
10 monoglicérido en la yema de huevo donde se añadió fitoesterol y glicerol. La misma enzima también catalizó la formación de ésteres de fitoesteroles y monoglicérido en una mezcla de aceite de palma, lecitina, fitoesterol y glicerol. Por lo tanto, esta enzima es de interés para usar en margarina y otros productos alimenticios que contienen aceite donde se necesitan monoglicérido y lisolecitina para mejorar la emulsión y el éster de fitoesterol para sus efectos de reducción del colesterol.
15 Ejemplo 15: Inmovilización de una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida y uso en la síntesis de ésteres de esteroles
Una lípido aciltransferasa (en este caso una GCAT) de Aeromonas salmonicida se inmovilizó sobre Celite por precipitación con acetona. Se agitaron lentamente 10 ml de solución enzimática en tampón TEA 20 mM a pH 7, con 0,1 gramo de Celite 535 535 (de Fluka) durante 2 horas a temperatura ambiente.
20 Se añadieron 50 ml de acetona fría durante la agitación continuada.
El precipitado se aisló por centrifugación a 5.000 g durante 1 minuto.
El precipitado se lavó 2 veces con 20 ml de acetona fría.
Se probó el Celite a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora.
La transferasa inmovilizada se probó en una mezcla de aceite que contiene 13% de fosfatidilcolina y 7% de 25 fitoesterol (Tabla 27).
Tabla 27
%
Lecitina Avanti
12,0
Fitoesterol, Generol 122N
6,6
Palm 43
71,4
Glicerol
5,0
Transferasa nº 178 inmovilizada, 45 U/g
2,0
Agua
3,0
Se calentaron lecitina, fitoesterol y aceite de soja a 46ºC y se disolvió el fitoesterol. Se añadió la transferasa inmovilizada.
La reacción de la transferasa continuó a 46ºC durante agitación suave con un agitador magnético. Se tomaron 30 muestras para análisis después de 1/2, 1, 3, 6 y 24 horas y se analizaron por TLC. La reacción se detuvo después de 24 horas de tiempo de reacción y la enzima inmovilizada se separó por filtración.
Las muestras se analizaron por TLC como se muestra en la figura 65.
El análisis por TLC muestra claramente el efecto de la transferasa inmovilizada de A. salmonicida en la transformación del colesterol en éster de colesterol. Se observó también que se forma una pequeña cantidad de monoglicérido. Se había mostrado que la enzima también tiene una actividad elevada en entornos acuosos con alto
5 contenido en agua (6-89%), por lo tanto, la transferasa y otras transferasas para usar en la invención también puede usarse en aplicaciones de enzimas inmovilizadas con un significativo contenido de agua. Esto permite la sustitución de los disolventes usados por las lipasas inmovilizadas actuales en la bioconversión de lípidos que usan transferasas.
Ejemplo 16. La transferasa de Aeromonas hydrophila puede transferir de un fosfolípido a un esterol para formar un 10 éster de esterol y/o a una molécula de azúcar para formar un éster de azúcar
Una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila expresada en E. coli (Hydro 0303 HVP) marcada nº 139 se purificó en una columna de Sefarosa Quelante FF, HR2,5/10 y se analizó la actividad de fosfolipasa. La actividad de transferasa se evaluó en la yema de huevo para la actividad enzimática y funcionalidad en la yema de huevo. La enzima se probó también en la yema de huevo que contenía glucosa.
15 Actividad de fosfolipasa
La transferasa nº 139 aislada de una columna de Sefarosa Quelante FF HR 2,5/10 se ensayó por NEFA/PLU (pH 7). La actividad era de 1,15 unidades de NEFA/PLU/ml.
Yema de huevo
En un ensayo de aplicación inicial la transferasa nº 139 se probó en la yema de huevo según el siguiente 20 procedimiento.
Se pesó 1 gramo de yema de huevo fresca en un matraz de 10 ml con tapa de rosca. Se añadió la preparación enzimática y se mezcló en un mezclador Vortex. Se colocó la muestra a 37ºC y se agitó con un agitador magnético.
La reacción se detuvo añadiendo 7,5 ml de cloroformo:etanol (2:1) y se mezcló en un mezclador Whirley durante 30 segundos. Se aisló por centrifugación la fase de cloroformo y se transfirieron 2 µl de la fase de cloroformo a una
25 placa de TLC de sílice preactivada y se eluyó con tampón de desarrollo nº I y otra placa de TLC en tampón de desarrollo IV.
La configuración experimental se presenta en la Tabla 28.
Tabla 28
Ensayo
Tiempo de reacción Yema de huevo Transferasa nº 139
nº
min gramos unidades
1
10
1
2
10 1 0,75 NEFA-PLU
3
60 1 0,75 NEFA-PLU
4
300 1 0,75 NEFA-PLU
5
1200 1
6
1200 1 0,75 NEFA-PLU
El análisis por TLC se muestra en la figura 66 y en la figura 67. El análisis por TLC demuestra claramente la reacción
30 con transferasa de la transferasa nº 139. El colesterol se convierte en éster de colesterol y la cantidad de lecitina se reduce. Sin embargo, estos resultados indican además que la lisolecitina se acumula solamente en muy pequeña cantidad porque la transferasa nº 139 es también activa en la lisolecitina. Esta observación está apoyada por la formación de ácidos grasos libres (AGL).
Yema de huevo y glucosa
35 Se ha mostrado anteriormente que una transferasa de Aeromonas salmonicida (nº 138) podía usar glucosa como molécula aceptora en una reacción con transferasa. Se ha ensayado también si la transferasa nº 139 puede usar glucosa como molécula aceptora. La configuración experimental se observa en la tabla 29.
Tabla 29
Ensayo
Tiempo de reacción Yema de huevo Glucosa, 70% Transferasa nº 139
nº
min gramos mg unidades
1
10 1 500
2
10 1 500 1 NEFA-PLU
3
60 1 500 1 NEFA-PLU
4
180 1 500 1 NEFA-PLU
5
300 1 500 1 NEFA-PLU
6
1200 1 500 1 NEFA-PLU
7
1200 1 500
Los productos de reacción se analizaron por TLC (figura 68 y figura 69).
El análisis por TLC indica la formación de éster de glucosa después de 220 min de tiempo de reacción (figura 69 banda 6) pero después de 1.200 min de tiempo de reacción no se aprecia éster de glucosa.
5 Debe concluirse por consiguiente que la transferasa nº 139 presenta actividad tanto de transferasa como hidrolítica. Esto está también apoyado por el hecho de que la cantidad de ácidos grasos libres aumenta regularmente en función del tiempo de reacción.
Resumen
La transferasa procedente de Aeromonas hydrophila se ensayó en la yema de huevo. Los resultados confirman que
10 esta enzima cataliza la formación de éster de colesterol simultáneamente con la formación de lisolecitina. Después de un tiempo de reacción prolongado cuando la mayor parte del colesterol se ha consumido se forman también ácidos grasos. Por consiguiente, puede concluirse que la enzima tiene actividad principal de transferasa pero también se observó actividad hidrolítica cuando solo estaba disponible agua como molécula donadora.
En un experimento con yema de huevo y glucosa se ha observado que la transferasa de Aeromonas hydrophila
15 puede catalizar la formación de éster de glucosa in situ en un medio alimenticio con alto contenido en agua (figura 70).
Ejemplo 17: Variantes de una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (Ahyd2) (SEQ ID No. 36 (véase la figura 71))
Se introdujeron mutaciones utilizando el kit QuikChange® de mutagénesis dirigida a varios sitios de Strategene, La 20 Jolla, CA 92037, EE.UU., siguiendo las instrucciones proporcionadas por Stratagene.
Las variantes en Tyr256 presentaban una mayor actividad hacia los fosfolípidos.
Las variantes en Tyr256 y Tyr260 presentaban una mayor actividad frente a los galactolípidos.
Las variantes en Tyr265 presentan una mayor actividad de transferasa con galactolípidos como el donador de acilo.
Los números indican posiciones en la siguiente secuencia: Una enzima Aeromonas hydrophila cuya secuencia de
25 aminoácidos se muestra como SEQ ID No. nº 36 en la figura 71 (los aminoácidos subrayados muestran un péptido señal de xilanasa). La secuencia de nucleótidos es como muestra la SEQ ID No. 54 en la FIGURA 72.
Ejemplo 18: Uso de la reacción de aciltransferasa para la producción de un éster de fitoesterol y monoglicérido para la producción de margarina
Se probó una aciltransferasa de Aeromonas salmonicida expresada en Bacillus subtilis en una mezcla de aceite de
30 palma que contenía lecitina vegetal, fitoesterol y glicerol. La aciltransferasa presentaba la capacidad de usar tanto fitoesterol como glicerol como moléculas aceptoras durante la producción de un éster de fitoesterol y monoglicérido. La mezcla de reacción se usó para producir margarina de mesa de buena calidad basándose en el monoglicérido en la mezcla de reacción y al mismo tiempo la margarina se enriqueció con éster de fitoesterol, que se ha mostrado que tiene un efecto reductor de colesterol.
35 El objetivo de este trabajo era estudiar la posibilidad de producir monoglicérido y éster de fitoesterol por reacción enzimática de la lecitina, fitoesterol y glicerol disueltos en grasa vegetal.
Los experimentos iniciales han demostrado que se podía usar aciltransferasa de Aeromonas salmonicida para producir monoglicérido y éster de fitoesterol a partir de lecitina, glicerol y fitoesterol. En este experimento dicha mezcla de reacción se usó para producir margarina de mesa. Materiales Lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida, nº 196 C101, 18,6 PLU/g (Journal 2254-104) Aceite de palma 43, de Aarhus United, DK L-a fosfatidilcolina al 95% vegetal (Avanti nº 441601) Fitoesterol: Generol N122 de Cognis, Alemania Glicerol artículo nº 085915 Monoglicérido destilado, Dimodan HP de Danisco. Producción de margarina
1.
Se mezclan los ingredientes de la fase acuosa. (Si se requiere se pasteuriza la fase acuosa calentando a aprox. 80ºC). Se ajusta el pH a 5,5.
2.
Se funde la fase grasa y se templa a aprox. 40-45ºC.
3.
Se calienta el emulsionante con algo del aceite en una proporción de una parte de emulsionante a 5 partes de aceite a una temperatura (75-80ºC), que es 5-10ºC mayor que el punto de fusión del emulsionante. Cuando esta mezcla está totalmente fundida y bien agitada, se añade al aceite caliente restante, agitando continuamente.
4.
Se añade el aromatizante.
5.
Se añade la fase acuosa a la fase grasa, agitando continuamente.
6.
Se enfría en un refrigerante de tubos (capacidad normal, enfriamiento normal) hasta una temperatura de salida entre 8 y 10ºC.
Resultados
La aciltransferasa de A. salmonicida se ensayó en una mezcla de aceite de palma como se muestra en la tabla 30. La lecitina, fitoesterol, glicerol y aceite de palma se calentaron a 60ºC durante la agitación con el fin de disolver el
fitoesterol y la lecitina.
Tabla 30
Sustrato
%
Lecitina de Avanti Fitoesterol, Generol 122 N Aceite de palma, punto de fusión 43 Glicerol
12 6,6 76,4 5
El sustrato se enfrió a 48ºC y se añadió aciltransferasa nº 196 en la cantidad mostrada en la tabla 31. La mezcla de reacción se mantuvo a 48ºC durante 24 horas durante agitación lenta.
Tabla 31
gramos
Sustrato 220
Transferasa nº 196 C101, 18,6 PLU/g 15
Se tomaron muestras de la mezcla de reacción después de 1, 4 y 24 horas de tiempo de reacción y se analizaron por TLC en el disolvente I (figura 73). Los resultados de TLC muestran claramente la formación del éster de fitoesterol y monoglicérido. En la figura 73, la primera banda es después de 1 hora de tiempo de reacción, la banda 2 es de 4 horas de tiempo de reacción, la banda 3 es de 24 horas de tiempo de reacción y la banda 4 es un fitoesterol.
La reacción se detuvo después de 24 horas de tiempo de reacción y los residuos del fitoesterol no disueltos se eliminaron y la solución transparente se usó para producir margarina.
Margarina La mezcla de reacción que contenía monoglicérido y éster de fitoesterol se usó para producir margarina de mesa según la receta mostrada en la tabla 32.
Tabla 32
Jour. Nº 3734
1 2
Fase acuosa
Fase acuosa
16 16
Sal
0,5 0,5
Leche desnatada en polvo
1 1
Sorbato potásico
0,1 0,1
EDTA
0,015 0,015
PH
5,5 5,5
Fase acuosa total
16,6 16,6
Fase grasa
Palma 43
25 25
Aceite de colza
75 75
Fase grasa total
83,2 78,4
Dimodan HP
0,2
Mezcla de reacción
5
La margarina producida de la mezcla de reacción fue evaluada de buena calidad con buena extensibilidad y buena sensación en boca y sin falta de sabor. La margarina estaba en un nivel de calidad comparable con la margarina de referencia producida usando monoglicérido destilado Dimodan HP.
10 La única diferencia observada era que la margarina jour. 3734 nº 2 con la mezcla de reacción era ligeramente más consistente, lo que se explicó por el hecho de que esta receta contenía más Palma 43 que la margarina de referencia.
Ejemplo 19: Uso de una lípido aciltransferasa durante la producción de pan
Una de las limitaciones de usar lipasas en la elaboración del pan es que se forman ácidos grasos libres durante la
15 reacción de la lipasa. Es bien sabido que la formación de demasiado ácido graso libre tendrá un impacto negativo en el rendimiento de la cocción de la harina porque el gluten da demasiada rigidez y se forma una masa voluminosa (es decir menos elástica) que no puede expandirse durante la fermentación y la cocción.
La formación de ácidos grasos libres debería evitarse también desde el punto de la estabilidad oxidativa, porque los ácidos grasos libres son más propensos a la oxidación de los lípidos que el triglicérido correspondiente.
20 En la presente invención se han superado los problemas de formación de ácidos grasos libres al añadir una enzima lipolítica a una masa, usando una lípido aciltransferasa que, en lugar de producir ácidos grasos libres, transfiere uno
o más ácidos grasos desde el donador de acilo de lípido a una molécula aceptora que no es agua presente en la masa, tal como un hidrato de carbono, una proteína o un péptido, o si se usa en el pan con grasa de leche, se puede añadir un esterol, alternativamente o combinado con otros aceptores citados anteriormente a la masa, por ejemplo
25 fitoesteroles o fitoestanoles. Preferentemente, la molécula aceptora en una masa puede ser una o más de glucosa, sacarosa o maltosa y/u otros hidratos de carbono normalmente disponibles en una masa.
En los siguientes experimentos se ensaya la aciltransferasa en experimentos de cocción a miniescala. La formación de productos de reacción, y los componentes lipídicos en la masa totalmente probada se extrae mediante butanol saturado en agua y se analiza por análisis de HPLC y GLC.
30 Materiales y métodos
Enzimas Aciltransferasa, 550 PLU-7/ml
LipopanTM F BG, lipasa comercial de Novozymes, 12000 LIPU/g o Grindamyl Exel 16. 12000 LIPU/g.
Lecitina en polvo, 95% de fosfolípidos (disponible en Danisco A/S, Dinamarca)
Digalactosil diglicérido de harina de trigo integral (de Sigma D4651)
Harina: Sølvmel nº 2001084 (harina de trigo danesa adquirida en Havnemøllerne, Odense, Dinamarca)
Ensayo de minicocción
50 gramos de harina, 10 gramos de levadura seca, 0,8 gramos de glucosa, 0,8 gramos de sal, 70 ppm de ácido ascórbico y 400 unidades Brabender de agua se amasaron en un recipiente de mezclado Brabender de 50 g durante 5 min a 30ºC.
El tiempo restante fue de 10 min a 34ºC. La masa se ajustó a 15 gramos de masa. A continuación se moldeó en un dispositivo especial donde la masa se lamina entre una placa de madera y un marco de plexiglás. Las masas se pusieron en moldes de lata durante 45 min a 34ºC y se cocieron en un horno doméstico Voss 8 min a 225ºC.
Después de la cocción se enfrían los panes a temperatura ambiente y después de 20 min se pesan los panes y se determina el volumen por el método del desplazamiento de semillas de colza. Se cortan además los panes y se evalúa la miga y la corteza.
Resultados y conclusión
Los resultados preliminares indican que la lípido aciltransferasa demuestra claramente un efecto positivo tanto en el volumen del pan como en el aspecto del pan. En particular, los resultados preliminares indican que el uso de la lípido aciltransferasa produce un aumento del volumen de pan específico en comparación con el obtenido con la referencia (sin enzima) y con el obtenido con el uso de una enzima lipolítica disponible en el mercado, es decir Grindamyl Exel 16 o Lipopan FTM.
Ejemplo 20: Helado convencional con grasa de leche
La función de los emulsionantes usados en el helado es efectuar la cristalización controlada de la grasa y la desestabilización ligera debido a la desorción de las proteínas durante el envejecimiento del helado. Este cambio mejora la calidad del helado. Los monodiglicéridos se usan normalmente para la producción del helado pero se conoce también el uso de emulsionantes polares como los polisorbatos y los ésteres de azúcar en la producción de helados combinados con monodiglicéridos para facilitar la desestabilización controlada de la grasa y producir helados con muy buena cremosidad y textura suave en la boca.
Los emulsionantes usados para helados se añaden normalmente a la mezcla de helados en forma de polvo. Recientemente se ha demostrado sin embargo que pueden producirse mono-diglicéridos por acción enzimática de la grasa en la receta del helado usando lipasas. El problema de usar lipasas es, sin embargo, que las lipasas también catalizan la formación de ácidos grasos libres cuando el agua está disponible en la mezcla de reacción.
Sin embargo, se ha mostrado sorprendentemente que la lípido aciltransferasa supera la limitación por lipasa porque la aciltransferasa puede transferir ácido graso desde la lecitina y otros lípidos a moléculas aceptoras como esterol, colesterol, glucosa, glicerol y proteínas/péptidos sin la formación de una cantidad significativa de ácidos grasos libres.
Uno de los principales ingredientes en el helado es la crema de la leche que contiene 38% de grasa de leche. La crema de la leche contiene también cantidades más pequeñas de lecitina que es una molécula donadora para la aciltransferasa ("los lípidos complejos de la leche totalizan aproximadamente el 1% de la grasa total de la leche y están compuestos principalmente por fosfolípidos". Ref. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright® 2003 por Wiley VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.). La crema de la leche contiene también pequeñas cantidades de colesterol que es una molécula aceptora para la aciltransferasa.
Por lo tanto, a partir de los constituyentes del helado se puede producir tanto monoglicéridos como emulsionantes polares como lisolecitina y éster de azúcar, que son conocidos por sus efectos beneficiosos en la producción de helados.
Un efecto beneficioso adicional de la reacción de la aciltransferasa en la crema de la leche es la formación del éster de colesterol, que puede reducir la absorción del colesterol en el intestino.
Receta de helado
Con emulsionante Con enzima
Crema de leche, 38% 23,65 23,65 Leche desnatada 53,30 53,30 Leche desnatada en polvo 4,90 11,30 Azúcar 12,00 12,00 Jarabe de glucosa, DE 42, 75% TS 4,25 4,25 Glicerol 1,0 1,0 Mezcla de estabilizante 0,2 0,2 Cremodan SE 30 0,6 Lípido aciltransferasa, 500 PLU/g 0,1 Saborizante Grindsted 2976 0,1 0,1 Color + +
Procedimiento de producción de helado
1. Se calientan crema de leche, jarabe de glucosa y glicerol a aprox. 40ºC. Se añade la lípido aciltransferasa y se deja reaccionar la mezcla durante 30 minutos. Se toma una muestra para análisis.
5 2. Se calientan todos los demás ingredientes líquidos a aprox. 40ºC.
3.
Se añaden los demás ingredientes secos. (la mezcla estabilizante se mezcla con azúcar antes de la adición).
4.
Cuando los ingredientes secos están disueltos se añade la mezcla de crema de leche-glucosa
5.
Se pasteuriza entre 80 a 85ºC/20 a 40 segundos.
6.
Se homogeneiza a 80ºC (190 bares para la receta 1 y 175 bares para la receta 2)
10 7. Se enfría a la temperatura de envejecimiento, 4ºC
8.
Se congela en un congelador continuo hasta el recorrido deseado (recomendada del 100%)
9.
Se endurece en un túnel a -40ºC.
10.
Se almacena por debajo de -25ºC
Resultados
15 El uso de aciltransferasa en la producción de helados contribuye a la producción de helado con muy buen sabor y excelente sensación cremosa en el paladar comparable a los helados producidos usando un emulsionante comercial Cremodan Se 30. El derretido del helado producido por la lípido aciltransferasa mejora también.
Ejemplo 21: Aciltransferasa en queso
El queso es el producto sólido o semisólido, fresco o madurado obtenido por coagulación de la leche, leche
20 descremada, leche parcialmente descremada, crema, crema de suero de leche o suero de la leche, o por cualquier combinación de estos materiales, mediante la acción del cuajo o de otros agentes coagulantes adecuados y drenando parcialmente el suero que resulta de dicha coagulación.
El rendimiento en queso depende principalmente de los contenidos en grasa y proteína de la leche. La sal (particularmente sales de calcio) y las concentraciones de proteínas, así como la acidez, son muy importantes para
25 la coagulación (ref. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright® 2003 por Wiley VCH Verlag GmbH & Co).
Dichos esfuerzos se han hecho con el fin de optimizar y aumentar el rendimiento en queso mediante la optimización del procedimiento de elaboración del queso (patente US nº 4.959.229) o el uso del procedimiento mejorado de coagulación (patente US nº 4.581.240), que aumenta la cantidad de proteína del suero lácteo en la cuajada.
En la presente invención la cantidad de proteínas del suero lácteo en la cuajada aumenta por modificación enzimática de la proteína del suero lácteo por tratamiento de la leche durante la elaboración del queso con una lípido aciltransferasa.
Cuando un ácido graso está unido por enlace covalente a una proteína que no es de membrana como la β
lactoglobulina, las propiedades físicas y funcionales cambiarán drásticamente. Para la producción de queso de la presente invención se añade aciltransferasa a la leche antes o al mismo tiempo que se añade el cuajo a la leche.
Durante la precipitación con caseína la aciltransferasa puede usar lecitina y otros lípidos en la leche como donadores y péptidos o proteínas como molécula aceptora durante la formación de la proteína acilada o de los péptidos acilados.
El cambio en las propiedades hidrófobas de la proteína de la leche contribuye a aumentar la precipitación de
proteínas en la cuajada durante la producción de queso. Puesto que el aumento en el rendimiento en queso obtenido por la presente invención se origina a partir de una mayor retención en el coágulo de queso de proteínas que normalmente se pierden en el suero lácteo, un método adecuado, directamente relacionado con el mecanismo de la invención, se basa en la determinación de la cantidad de proteína que acaba en el suero lácteo. Menos proteína en el suero lácteo significa necesariamente más proteína en la cuajada y mayor rendimiento en queso.
El ensayo de la cantidad de proteína en el suero lácteo se puede llevar a cabo de la siguiente manera. Leche descremada o entera se calienta a una temperatura adecuada para la coagulación con cuajo, típicamente a 30-35ºC en un vaso de precipitados de 100 ml. Opcionalmente se añade 1% de un iniciador de bacterias del ácido láctico a granel, y se añade cuajo normal en una cantidad correspondiente a p. ej., 0,03-0,05%. Cuando la leche se ha convertido en un coágulo sólido suficiente para permitir que se pueda cortar en pequeños cubos de una longitud de lado de aproximadamente 0,05 cm, se lleva a cabo dicho corte con un cuchillo afilado. Se inicia de este modo la sinéresis y después de 30 minutos de período de espera, esto permite que se asiente la cuajada, se extrae una muestra de suero lácteo, y se centrifuga en una centrifugadora de laboratorio durante 10 min. En esta muestra se analiza el contenido de proteínas, usando por ejemplo el método Kjeldahl. Alternativamente, y/o como complemento, la muestra puede analizarse por métodos que permiten establecer el tipo y cantidad de los componentes proteicos individuales.
Ejemplo 22. "Ensayo en entorno con poca cantidad de agua" Reacciones de transferasa de enzimas lipolíticas en un entorno con poca cantidad de agua. Procedimiento Materiales Colesterol Sigma cat. C 8503 L-alfa-fosfatidilcolina al 95% (vegetal) Aventi nº 441601 Aceite de soja, Aarhus United, DK Cloroformo, calidad analítica Enzimas Nº 179, GCAT de A. salmonicida Nº 2427, fosfolipasa A1 de Fusarium oxysporum, LIPOPAN® F de Novozymes, Dinamarca Nº 1991, fosfolipasa A2 del páncreas, LIPOMOD 22L de Biocatalysts, UK Nº 2373, lipasa de Candida antarcica, Novozyme 525 L de Novozymes, Dinamarca. Ensayo enzimático Se disolvieron 13,1% de lecitina y 6,6% de colesterol en aceite de soja calentando a 60ºC durante la agitación. Se pesó el sustrato en un vaso Wheaton de 20 ml y se calentó a 46ºC. Se añadió agua y la solución enzimática y se puso en marcha un cronómetro. A intervalos regulares se transfirieron muestras de 50 mg a un vaso Dram de 10 ml y se congelaron.
Los lípidos aislados se analizaron por GLC.
Análisis de GLC
El análisis de GLC se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 11.
Resultados
5 El experimento se configuró como se muestra en la tabla 33.
El sustrato basado en aceite de soja que contenía 13,1% de lecitina y 6,6% de colesterol se calentó a 46ºC. Se añadió la solución enzimática y se puso en marcha un cronómetro.
Después de 30, 60 y 120 minutos de tiempo de reacción se tomaron muestras para el análisis por GLC.
Tabla 33
Sustrato gramos 5 5 5 5 5 Transferasa nº 179-C72, 56 PLU-7/ml ml 0,3 nº 2427, 200 PLU-7/ml ml 0,3 PLA 2 de páncreas nº 1991 6300 PLU/ml ml 0,3 Novozyme 525 L, nº 2373, 200 LIPU/ml 0,3 Agua ml 0,3 % de agua 66666
10 Los resultados del análisis de GLC se muestran en la tabla 34. Los resultados están expresados en porcentaje respecto a la composición total de la muestra. Basándose en los resultados de la GLC se podía calcular la cantidad de ácidos grasos y de éster de colesterol producida por la reacción enzimática con respecto a la muestra de referencia sin enzima añadida. En estas condiciones experimentales la actividad enzimática total se calculó como la actividad hidrolítica medida como la formación de ácidos grasos libres y la actividad de transferasa calculada como
15 formación éster de colesterol. A partir de estos resultados y de la información sobre el peso molecular del ácido graso y del éster de colesterol se pudo calcular la actividad hidrolítica molar relativa y la actividad molar relativa de transferasa como se muestra en la tabla 35.
Tabla 34
Enzima Tiempo de reacción minutos Ácido graso % Colesterol % Éster de colesterol %
Referencia 120 0,533 7,094 0,000 nº 179 30 0,770 5,761 2,229 nº 179 60 0,852 5,369 2,883 nº 179 120 0,876 4,900 3,667 nº 2427 30 3,269 7,094 0,000 nº 2427 60 3,420 7,094 0,000 nº 2427 120 3,710 7,094 0,000 nº 1991 30 2,871 7,094 0,000 nº 1991 60 3,578 7,094 0,000 nº 1991 120 3,928 7,094 0,000 nº 2373 30 1,418 7,094 0,000 nº 2373 60 1,421 7,094 0,000 nº 2373 120 1,915 7,094 0,000
Tabla 35
Enzima Tiempo de Ácido graso Colesterol Éster de colesterol Actividad Actividad de
reacción minutos producido usado producido hidrolítica transferasa % %
nº 179
30 0,238 1,334 2,229 20 80
nº 179
60 0,319 1,725 2,883 21 79
nº 179
120 0,343 2,195 3,667 18 82
nº 2427
30 2,737 0,000 0,000 100 0
nº 2427
60 2,887 0,000 0,000 100 0
nº 2427
120 3,177 0,000 0,000 100 0
nº 1991
30 2,338 0,000 0,000 100 0
nº 1991
60 3,046 0,000 0,000 100 0
nº 1991
120 3,395 0,000 0,000 100 0
nº 2373
30 0,885 0,000 0,000 100 0
nº 2373
60 0,888 0,000 0,000 100 0
nº 2373
120 1,383 0,000 0,000 100 0
Conclusión
En estos experimentos se observó que todas las enzimas ensayadas presentaban actividad hidrolítica debido a la
cantidad aumentada de ácidos grasos. Sin embargo, la única enzima que presentaba actividad de transferasa era
GCAT de A. salmonicida. Se concluye por consiguiente que en un sistema oleoso con lecitina y colesterol que 5 contiene 6% de agua, la fosfolipasa A1 de Fusarium oxysporum, la fosfolipasa A2 del páncreas y una lipasa de
Candida antarcica únicamente presentaban actividad hidrolítica.
Lista de Secuencias
<110> Danisco A/S
<120> Método para la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio 10 <130> P015574EPC
<150> GB 0301121.0
<151>
<150> GB 0301120.2
<151> 15 <150> GB 0301119.4
<151>
<150> GB 0301118.6
<151>
<150> US 60/489,441 20 <151>
<150> GB 0330016.7
<151>
<150> GB 0301122.8
<151> 25 <150> GB 0301117.8
<151>
<160> 68
<170> PatentIn versión 3.5
<2:10> 1 30 <211> 361
<212> PRT
<213>
Secuencia Artificial
<220>
<223>
Secuencia de consenso
<400>
1
5
<210> <211> <212> <213> 2 335 PRT Aeromonas hydrophila
<400>
2
5
<210> <211> <212> <213> 3 336 PRT Aeromonas salmonicida
<400>
3
<210>
4
<211>
295
81
<212>
PRT
<213>
Streptomyces coelicolor
<400>
4
5
<210> <211> <212> <213> 5 295 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
5
5
<210> <211> <212> <213> 6 238 PRT Saccharomyces cerevisiae
<400>
6
5
<210> <211> <212> <213> 7 1005 ADN Aeromonas hydrophila
<400>
7
5
<210> <211> <212> <213> 8 1011 ADN Aeromonas salmonicida
<400>
8
10
<210> <211> <212> <213> 9 888 ADN Streptomyces coelicolor
<400>
9
5
<210> <211> <212> <213> 10 888 ADN Streptomyces coelicolor
<400>
10
<210> <211> <212> <213>
11 717 ADN Saccharomyces cerevisiae
5
<400> 11
10
<210> <211> <212> <213> 12 347 PRT Ralstonia sp.
<400>
12
5
<210> <211> <212> <213> 13 1044 ADN Ralstonia sp.
<400>
13
10
<210> <211> <212> <213> 14 295 PRT Aeromonas hydrophila
<400>
14
<210>
15
<211>
295
91
<212>
PRT
<213>
Aeromonas salmonicida
<400>
15
5
<210> <211> <212> <213> 16 247 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
16
5
<210> <211> <212> <213> 17 247 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
17
5
<210> <211> <212> <213> 18 198 PRT Saccharomyces cerevisiae
<400>
18
5
<210> <211> <212> <213> 19 317 PRT Aeromonas salmonicida
<400>
19
5
<210> <211> <212> <213> 20 261 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
20
<210>
21
<211>
786
<212>
ADN
98
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 21
5
<210> <211> <212> <213> 22 260 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
22
5
<210> <211> <212> <213> 23 783 ADN Streptomyces coelicolor
<400>
23
5
<210> <211> <212> <213> 24 454 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
24
5
<210> <211> <212> <213> 25 1365 ADN Streptomyces coelicolor
<400>
25
<210>
26
<211>
340
10
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<400> 26
5
<210> <211> <212> <213> 27 1023 ADN Streptomyces coelicolor
<400>
27
5
<210> <211> <212> <213> 28 305 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
28
5
<210> <211> <212> <213> 29 918 ADN Streptomyces coelicolor
<400>
29
5
<210> <211> <212> <213> 30 268 PRT Streptomyces rimosus
<400>
30
5
<210> <211> <212> <213> 31 1068 ADN Streptomyces rimosus
<400>
31
10
<210> <211> <212> <213> 32 335 PRT Aeromonas hydrophila
<400>
32
5
<210> <211> <212> <213> 33 1008 ADN Aeromonas hydrophila
<400>
33
<210> 34
<211> 336
<212>
PRT
<213>
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida
<400>
34
5
<210> <211> <212> <213> 35 1011 ADN Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida
<400>
35
5
<210> <211> <212> <213> 36 347 PRT Secuencia Artificial
<220> <223>
Construcción de fusión
<400>
36
5
<210> <211> <212> <213> 37 27 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
37
gtgatggtgg gcgaggaact cgtactg
27
10
<210> <211> <212> <213> 38 35 ADN Secuencia Artificial
15
<220> <223> Cebador
<400>
38
agcatatgaa aaaatggttt gtttgtttat tgggg
35
20
<210> <211> <212> <213> 39 39 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
39
ttggatccga attcatcaat ggtgatggtg atggtgggc
39
<210> <211> <212> <213>
40 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
40
taatacgact cactatag
18
<210> <211> <212> <213>
41 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
41
ctagttattg ctcagcgg
18
<210> <211> <212> <213>
42 41 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
42
gtcatatgaa aaaatggttt gtgtgtttat tgggattggt c
41
<210> <211> <212> <213>
43 30 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
43
atggtgatgg tgggcgagga actcgtactg
30
<210> <211> <212> <213>
44 41 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
44
gtcatatgaa aaaatggttt gtgtgtttat tgggattggt c
41
<210> <211> <212>
45 39 ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 45 ttggatccga attcatcaat ggtgatggtg atggtgggc
<210> <211> <212> <213>
46 26 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
46
atgccatggc cgacagccgt cccgcc
26
<210> <211> <212> <213>
47 27 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
47
ttggatccga attcatcaat ggtgatg
27
<210> <211> <212> <213>
48 26 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
48
ttgctagcgc cgacagccgt cccgcc
26
<210> <211> <212> <213>
49 27 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
49
ttggatccga attcatcaat ggtgatg
27
<210> <211> <212> <213>
50 26 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
50
ttgccatggc cgacactcgc cccgcc
26
<210>
51
<211> <212> <213>
27 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
51
ttggatccga attcatcaat ggtgatg
27
<210> <211> <212> <213>
52 26 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
52
ttgctagcgc cgacactcgc cccgcc
26
<210> <211> <212> <213>
53 27 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
53
ttggatccga attcatcaat ggtgatg
27
<210> <211> <212> <213>
54 1047 ADN Aeromonas hydrophila
<400>
54
5
<210> <211> <212> <213> 55 320 PRT Ralstonia solanacearum
<400>
55
5
<210> <211> <212> <213> 56 226 PRT Streptomyces rimosus
<400>
56
5
<210> <211> <212> <213> 57 182 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
57
5
<210> <211> <212> <213> 58 179 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
58
5
<210> <211> <212> <213> 59 203 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
59
5
<210> <211> <212> <213> 60 188 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
60
5
<210> <211> <212> <213> 61 231 PRT Streptomyces coelicolor
<400>
61
5
<210> <211> <212> <213> 62 295 PRT Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida
<400>
62
5
<210> <211> <212> <213> 63 295 PRT Aeromonas hydrophila
<400>
63
<210>
64
<211>
4
128
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Motivo de secuencia
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_NUEVA
<222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser uno de los siguientes restos de aminoácidos Leu, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, His, Gln, Thr, Asn, Met o Ser.
<400> 64
<210>
65
<211>
8
<212>
PRT
<213>
Secuencia Artificial
<220>
<223>
Bloque 1 -bloque GDSX
<220>
<221>
CARACTERÍSTICA_NUEVA
<222>
(1)..(4)
<223>
Xaa es un resto hidrófobo seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<220>
<221>
CARACTERÍSTICA_NUEVA
<222>
(8)..(8)
<223>
Xaa es un resto hidrófobo seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<400>
65
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Bloque 2 -bloque GANDY
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_NUEVA
<222> (1)..(1)
<223> Xaa es un resto hidrófobo seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_NUEVA
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es un resto hidrófobo seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_NUEVA
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es un resto hidrófobo seleccionado de Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr o Phe.
<400> 66
<210> 67
<211> 5
<212> <213>
PRT Secuencia Artificial
<220> <223>
Motivo de secuencia
5
<400> 67
10
<210> <211> <212> <213> 68 35 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
68
agcatatgaa aaaatggttt gtttgtttat tgggg
35
15

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio compuesto de 10-98% de agua, en donde el método comprende la etapa de añadir una lípido aciltransferasa al producto alimenticio, y en donde la lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12.
  2. 2.
    Un método según la reivindicación 1, en donde se producen al menos 2 emulsionantes.
  3. 3.
    Un método según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la lípido aciltransferasa tiene actividad de lipasa y de aciltransferasa, en donde la enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a un esterol y/o estanol o un hidrato de carbono.
  4. 4.
    Un método según la reivindicación 2, en donde al menos uno de los emulsionantes es un éster de hidrato de carbono o un éster de proteína.
  5. 5.
    Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se produce uno o más de un éster de esterol o un éster de estanol o un éster de proteína o un éster de hidrato de carbono o un diglicérido o un monoglicérido in situ en el producto alimenticio.
  6. 6.
    Un método según la reivindicación 5, en donde el éster de esterol es uno o más de éster de colesterol, éster de alfa-sitosterol, éster de beta-sitosterol, éster de estigmasterol, éster de ergosterol o éster de campesterol, o el éster de estanol es uno o más de beta-sitostanol o ss-sitostanol.
  7. 7.
    Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que tiene actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, en donde X es uno o más de los siguientes restos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M
    o S.
  8. 8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el ensayo de transferasa en sustrato tamponado tiene al menos 2% de actividad de aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo de transferasa las etapas de:
    i) disolver 450 mg de fosfatidillcolina y 50 mg de colesterol en cloroformo, evaporar hasta sequedad a vacío;
    ii) transferir 300 mg de mezcla de colesterol/fosfatidillcolina a un vaso Wheaton, añadir 15 ml de tampón HEPES 50 mM a pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación;
    iii) calentar el sustrato a 35°C durante la mezcla con un agitador magnético y añadir 0,25 ml de solución enzimática;
    iv) tomar muestras de 2 ml a los 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y detener inmediatamente la reacción enzimática por adición de 25 µl de HCl 4 M para acidificar el ácido graso libre;
    v) añadir 3 ml de cloroformo y agitar enérgicamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2 ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45 µm en un vaso Dram tarado de 10 ml;
    vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60ºC, y pesar las muestras;
    vii) analizar el lípido extraído por cromatografía de gas-líquido (GLC).
  9. 9.
    Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el emulsionante es uno o más de los siguientes: un monoglicérido, una lisofosfatidilcolina o digalactosil-monoglicérido (DGMG).
  10. 10.
    Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el producto alimenticio es un producto de carne, incluyendo un producto de carne procesado.
  11. 11.
    Uso de una lípido aciltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 75% o más con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12, para preparar a partir de un material alimenticio un producto alimenticio compuesto de 10-98% en peso de agua que comprende un emulsionante, en donde el emulsionante se genera in situ a partir de los constituyentes de la materia alimenticia por la lípido aciltransferasa.
  12. 12.
    Uso según la reivindicación 11, en donde se producen al menos dos emulsionantes.
  13. 13.
    Uso según la reivindicación 12, en donde al menos uno de los emulsionantes es un éster de hidrato de carbono
    o un éster de proteína.
  14. 14.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde también se produce in situ uno o más de un éster de esterol o un éster de estanol o un éster de proteína o un éster de hidrato de carbono o un diglicérido o un
    monoglicérido en el producto alimenticio.
  15. 15.
    Uso según la reivindicación 14, en donde el éster de esterol es uno o más de éster de colesterol, éster de alfasitosterol, éster de beta-sitosterol, éster de estigmasterol, éster de ergosterol o éster de campesterol, o el éster de estanol es uno o más de beta-sitostanol o ss-sitostanol.
  16. 16.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que tiene actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, en donde X es uno o más de los siguientes restos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
  17. 17.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el ensayo de transferasa en sustrato tamponado tiene al menos 2% de actividad de aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo de transferasa las etapas de:
    i) disolver 450 mg de fosfatidillcolina y 50 mg de colesterol en cloroformo, evaporar hasta sequedad a vacío;
    ii) transferir 300 mg de mezcla de colesterol/fosfatidillcolina a un vaso Wheaton, añadir 15 ml de tampón HEPES 50 mM a pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación; iii) calentar el sustrato a 35°C durante la mezcla con un agitador magnético y añadir 0,25 ml de solución enzimática; iv) tomar muestras de 2 ml a los 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y detener inmediatamente la
    reacción enzimática por adición de 25 µl de HCl 4 M para acidificar el ácido graso libre;
    v) añadir 3 ml de cloroformo y agitar enérgicamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2 ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45 µm en un vaso Dram tarado de 10 ml; vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60ºC, y pesar las muestras; vii) analizar el lípido extraído por cromatografía de gas-líquido (GLC).
  18. 18.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11-17, en donde el producto alimenticio es un producto de carne, incluyendo un producto de carne procesado.
  19. 19.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en donde el emulsionante es uno o más de los siguientes: un monoglicérido, una lisofosfatidilcolina o digalactosil-monoglicérido (DGMG).
  20. 20.
    Uso de una composición enzimática de alimento o pienso, que contiene una lípido aciltransferasa como se define en la reivindicación 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 11-19, o en el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
  21. 21.
    Uso de una composición enzimática de alimento o pienso según la reivindicación 20, en donde la lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que tiene actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, en donde X es uno o más de los siguientes restos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.
  22. 22.
    Uso de una composición enzimática de alimento o pienso según la reivindicación 20 o reivindicación 21, en donde la lípido aciltransferasa es una que cuando se ensaya usando el ensayo de transferasa en sustrato tamponado tiene al menos 2% de actividad de aciltransferasa; comprendiendo dicho ensayo de transferasa las etapas de:
    i) disolver 450 mg de fosfatidillcolina y 50 mg de colesterol en cloroformo, evaporar hasta sequedad a vacío;
    ii) transferir 300 mg de mezcla de colesterol/fosfatidillcolina a un vaso Wheaton, añadir 15 ml de tampón HEPES 50 mM a pH 7 y dispersar el lípido en el tampón durante la agitación; iii) calentar el sustrato a 35°C durante la mezcla con un agitador magnético y añadir 0,25 ml de solución enzimática; iv) tomar muestras de 2 ml a los 0, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos de tiempo de reacción y detener inmediatamente la
    reacción enzimática por adición de 25 µl de HCl 4 M para acidificar el ácido graso libre;
    v) añadir 3 ml de cloroformo y agitar enérgicamente durante 30 segundos, centrifugar y aislar 2 ml de la fase de cloroformo, filtrar a través de un filtro de 0,45 µm en un vaso Dram tarado de 10 ml; vi) evaporar el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno a 60ºC, y pesar las muestras; vii) analizar el lípido extraído por cromatografía de gas-líquido (GLC).
  23. 23. Un producto alimenticio que comprende 10-98% de agua que se puede obtener por el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende una lípido aciltransferasa como se define en la
    reivindicación 1 y un emulsionante.
    Figura 38
ES10178355.3T 2003-01-17 2004-01-15 Método para la producción in situ de un emulsionante en un producto alimenticio Expired - Lifetime ES2661213T3 (es)

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