PT1762622E - Método para a produção in situ de um emulsificador num alimento - Google Patents

Método para a produção in situ de um emulsificador num alimento Download PDF

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Jorn Borch Soe
Joern Dalgaard Mikkelsen
Arno De Kreij
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Description

DESCRIÇÃO
"MÉTODO PARA A PRODUÇÃO IN SITU DE UM EMULSIFICADOR NUM ALIMENTO"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar contendo água compreendendo 10-98% de água, um produto de massa ou um produto cozido compreendendo um emulsificador. A presente invenção refere-se ainda a um método de produção de um produto de massa ou um produto cozido compreendendo um emulsificador e a um produto de massa ou cozido compreendendo água obtenível pelo referido método, compreendendo uma aciltransferase de lipido e um emulsificador.
ANTECEDENTES TÉCNICOS A utilização benéfica de fosfolipases e lipases (referidas como enzimas lipolíticas, (EC. 3.1.1.x) utilizadas em aplicações na indústria alimentar e/ou de rações, é conhecida desde há muitos anos.
Por exemplo, no documento EP 0585988 é reivindicado que a adição de lipase a massa resultou num melhoramento no efeito anti-endurecimento. É sugerido que uma lipase obtida a partir de 1
Rhizopus arrhizus, quando adicionada à massa, pode melhorar a qualidade do pão resultante quando utilizada em combinação com gordura vegetal/gordura. 0 documento W094/04035 explica que pode ser obtida uma macieza melhorada adicionando uma lipase à massa sem a adição de qualquer gordura/óleo adicional à massa. Castello, P. ESEGP 89-10 Dez. 1999 Helsinki, demonstra que as lipases exógenas podem modificar o volume do pão.
As enzimas lipolíticas hidrolisam um ou mais dos ácidos gordos dos lípidos presentes na alimentação, o que pode resultar na formação de moléculas emulsificadoras poderosas no alimento, o que proporciona uma funcionalidade comercialmente valiosa. As moléculas que contribuem para as caracteristicas emulsificadoras mais significativas são os produtos de hidrólise parcial, tais como moléculas de liso-fosfolipidos, liso-glicolípidos e mono-glicéridos. Os produtos de hidrólise de lípido polar, tais como liso-fosfolipidos e liso-glicolipidos são particularmente vantajosos. No fabrico de pão, esses emulsificadores derivados in situ podem originar funcionalidade equivalente como emulsificadores, tais como DATEM.
Contudo, a actividade de enzimas lipolíticas também resulta na acumulação de ácidos gordos livres, que pode conduzir à uma funcionalidade prejudicial no alimento. Esta actividade inerente de enzimas lipolíticas limita a sua funcionalidade.
Foram tentadas, na técnica, numerosas soluções para este problema. Contudo, estas resultaram num aumento significativo nos ácidos gordos livres no alimento, particularmente produtos alimentares com elevado teor em água, incluindo, mas não limitados a massas de pão e gema de ovo. 2
Foram utilizadas durante muitos anos fosfolipases, particularmente fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4), para o tratamento de ovos ou de produtos à base de ovos (ver documento US 4034124 e Dutihl & Groger 1981 J. Sei. Food Agric. 32, 451-458, por exemplo). A actividade da fosfolipase durante o tratamento de ovos ou produtos à base de ovos resulta na acumulação de lisolecitina polar, que pode actuar como um emulsificador. O tratamento com fosfolipase de ovos ou produtos à base de ovos pode melhorar a estabilidade, estabilidade térmica sob tratamento com calor, tal como a pasteurização, e resulta num espessamento substancial. Os produtos à base de ovos podem incluir, mas não estão limitados a bolos, maionese, temperos para saladas, molhos, gelados e semelhantes. A utilização de fosfolipases resulta na acumulação de ácidos gordos livres. A acumulação de ácidos gordos livres pode resultar num sabor desagradável acentuado. Adicionalmente, a acumulação de ácidos gordos livres pode resultar num aumento da sensibilidade à oxidação e, por isso, resultar em tempo de armazenamento pobre, descoloração do produto e alteração de outras caracteristicas alimentares criticas, tais como sabor e textura. Recentemente, as enzimas lipoliticas com especificidade para o substrato mais vasta foram comercializadas para o tratamento de gema de ovo e produtos alimentares relacionados. Estes possuem a vantagem de, contrariamente à maioria das fosfolipases A2, não terem origem numa fonte de mamíferos. Contudo, eles resultam na acumulação significativa de ácidos gordos livres, não apenas devido à hidrólise de fosfolípidos, mas também de triglicéridos.
Como mencionado acima, outra área em que as lipases foram utilizadas extensamente é na indústria da panificação. A utilização de fosfolipases na panificação data já dos primeiros anos da década de 1980. 3 0 substrato para as lipases na farinha de trigo é 1,5-3% de lipidos de trigo endógenos, que são uma mistura complexa de lipidos polares e não polares. Os lipidos polares podem ser divididos em glicolipidos e fosfolipidos. Estes lipidos são constituídos por glicerol esterificado com dois ácidos gordos e um grupo polar. 0 grupo polar contribui para a actividade de superfície desses lipidos. A clivagem enzimática de um dos ácidos gordos nestes lipidos conduz a lipidos com uma actividade de superfície muito superior. É bem conhecido que os emulsificadores, tais como DATEM, com actividade de superfície elevada, são muito funcionais quando adicionados à massa.
Contudo, a utilização de lipases (E.C. 3.1.1.X) nos produtos de massa pode possuir um impacto prejudicial na actividade de levedura e/ou um efeito negativo no volume do pão. 0 efeito negativo no volume do pão é, frequentemente, explicado por sobredosagem. A sobredosagem pode conduzir a uma diminuição na elasticidade do glúten que resulta numa massa que é demasiado rígida e, por isso, resulta em volumes de pão reduzidos. Adicionalmente ou alternativamente, essas lipases podem degradar a gordura, óleo ou gordura do leite adicionado à massa, resultando num sabor desagradável na massa e produto cozido. A sobredosagem e o sabor desagradável foram atribuídos à acumulação de ácidos gordos livres na massa.
Nos documentos EP 1193314, EP 0977869 e também em WO 01/39602, a utilização de enzimas lipolíticas activas nos glicolipidos foi relatada como sendo particularmente benéfica na aplicação no fabrico de pão, na medida em que se verificou que os produtos de hidrólise parcial os lisoglicolípidos possuem funcionalidade emulsificadora muito elevada, resultando 4 aparentemente numa proporção mais elevada de funcionalidade emulsificadora positiva comparada com a acumulação prejudicial de ácidos gordos. Contudo, também se verificou que as enzimas possuem actividade não selectiva significativa nos triglicéridos que resultou em elevados ácidos gordos livres desnecessariamente.
Foi relatada a mesma verificação do documento WO 00/32758, que revelou variantes de enzima lipolítica com actividade aumentada em fosfolípidos e/ou glicolípidos, adicionalmente às variantes que tinham uma preferência por ácidos gordos de cadeia longa, mais do que de cadeia curta. Esta última caracteristica, também divulgada no documento WO 01/39602, foi considerada de particular importância para prevenir os sabores desagradáveis associados com a acumulação de ácidos gordos livres de cadeia curta. Contudo, são produzidos ácidos gordos livres significativos . 0 problema da actividade de triglicéridos elevada foi abordado no documento W002/094123, em que é ensinada a utilização de enzimas lipolíticas activas nos lipidos polares (i. e., glicolípidos e fosfolípidos) numa massa, mas substancialmente não activa em triglicéridos ou 1-mono-glicéridos. Contudo, são produzidos ácidos gordos livres significativos.
Algumas enzimas lipolíticas possuem pouca ou nenhuma actividade na forma liso de lipidos polares (e. g., glicolípidos/fosfolípidos). A utilização dessas enzimas foi considerada preferível, na medida em que elas asseguram a acumulação dos liso-lípidos altamente polares, resultando numa funcionalidade óptima. Os ácidos gordos livres, contudo, 5 acumulam-se. Esta funcionalidade selectiva é característica das enzimas fosfolipase A2, e das glicolipases divulgadas nos documentos EP 0977869, EP 1193314, e W001/39602. Foram produzidas variantes de enzimas de enzimas lipolíticas menos selectivas que possuem uma actividade mais baixa nos liso-lípidos polares, quando comparadas com a enzima parental (dovumento WO03/060112) . Contudo, são produzidos ácidos gordos livres significativos. 0 documento WO00/05396 ensina um processo para preparar um alimento compreendendo um emulsificador, em que o material alimentar é colocado em contacto com uma enzima, de um modo a que seja criado um emulsif icador pela enzima a partir de um éster de ácido gordo e um segundo ingrediente funcional é criado a partir de um segundo constituinte. 0 documento WO00/05396 ensina a utilização de, em particular, uma enzima lipase ou esterase. Em nenhum local no documento WO00/05396 é ensinada a utilização especifica de uma aciltransferase de lipido. Adicionalmente, em alimentos com teor em água elevado, a utilização de esterases e lipases, como ensinada no documento WO00/05396, iria resultar na acumulação significativa de ácidos gordos livres.
Uma desvantagem associada à utilização de lipases, incluindo fosfolipases e glicolipases, pode ser provocada pela acumulação de ácidos gordos livres libertados a partir dos lípidos. Nas últimas duas décadas, a utilização de enzimas lipolíticas nos alimentos foi limitada devido ao equilíbrio entre a acumulação prejudicial de ácidos gordos livres e a produção dos liso-lípidos que proporciona funcionalidade positiva. Embora tenham sido tentadas na técnica numerosas estratégias, algumas das quais proporcionaram melhoramentos significativos na 6 funcionalidade, nenhuma abordou e resolveu completamente o problema fundamental na técnica, i. e., a acumulação significativa de ácidos gordos livres em alimentos preparados utilizando enzimas lipolíticas in situ. A presença de níveis elevados de ácidos gordos livres (FFA) em materiais não processados ou em produtos alimentares é geralmente, reconhecida como um defeito na qualidade e os fabricantes e clientes de alimentos, normalmente, incluirão um nível máximo de FFA nas especificações dos alimentos. Os efeitos que resultam de níveis excessivos de FFA podem estar em defeitos organolépticos e/ou funcionais.
Um resultado da lipólise é o ranço hidrolítico, com a formação do sabor "a ranço" caracteristico. Este sabor "a ranço" é especialmente agudo com ácidos gordos de comprimento de cadeia intermédio (C8-C12) que, embora não presentes em concentrações elevadas, podem ser constituintes importantes de, por exemplo, produtos lácteos ou óleos vegetais. Um defeito organoléptico mais comum é devido aos efeitos combinados das enzimas lipolíticas e de processos de oxidação. Os ácidos gordos não saturados são mais sensíveis à oxidação enzimática quando não esterifiçados do que quando esterifiçados em lípidos de acilo.
Os defeitos funcionais em alimentos devidos a níveis elevados de FFA são reconhecidos, mas menos facilmente explicados. Sem desejar estar limitado pela teoria, a hidrólise de lípidos não alterados em ácidos carboxílicos irá aumentar [H+] e produzir grupos carbonilo que podem combinar-se com outros compostos ou iões metálicos. Os ácidos gordos livres também combinam proteínas através de interacções hidrofóbicas e podem complexar-se com o amido durante a cozedura. Os FFA podem 7 também interferir com a acção de agentes activos de superfície, tais como lípidos polares e emulsificadores. (Lipid in Cereal Technology, P.J. Barnes, Academic Press 1983.) 0 documento W003/100044 divulga uma classe de aciltransferases conhecidas como PDATS (ou ATWAX). Estas enzimas utilizam um monoglicérido ou um diglicérido como a molécula aceitadora e fosfatidilcolina (PC) como a molécula dadora, para produzir os produtos seguintes: liso fosfatidilcolina e triacilglicerol e/ou diacilglicerol.
Numa forma de realização, a presente invenção refere-se a melhoramentos na incorporação de proteínas de soro de leite coalhado em produtos alimentares, proporcionando rendimentos melhorados sem prejudicar as qualidades - tais como a textura -das composições e produtos alimentares. São tipicamente preparadas composições de queijo a partir de líquidos lácteos através de processos que incluem o tratamento do líquido com um agente de coagulação. 0 agente coagulante pode ser uma enzima de coagulação, um ácido ou uma cultura bacteriana adequada, ou pode incluir essa cultura. A coalhada que resulta geralmente incorpora caseína transformada, gorduras, incluindo gordura de manteiga natural, e aromatizantes que surgem especialmente quando é utilizada uma cultura bacteriana. A coalhada pode ser separada do soro de leite coalhado liquido, que contém proteínas solúveis não afectadas pela coagulação e que, por isso, não são incorporadas na coalhada. 0 soro de leite coalhado é, por isso, um subproduto do fabrico em processos comerciais que produzem produtos alimentares - tais como queijos. Tradicionalmente, o soro de leite coalhado é eliminado como resíduo não utilizado ou utilizado como fertilizante, ração animal ou processado num ingrediente alimentar. A incapacidade de proteínas de soro de leite coalhado para serem substancialmente retidas na coalhada é um factor importante que contribui para uma falta de eficiência na produção convencional de produtos lácteos - tais como queijos frescos - e para uma redução no rendimento global que se refere à incorporação de todos os sólidos proteicos que estão presentes nos líquidos de partida dos produtos lácteos nos queijos frescos resultantes. Têm havido numerosas tentativas para incluir proteínas de soro de leite coalhado no queijo, e. g., por tratamento do leite com calor, tratamento a quente da coalhada do soro do leite ou por filtração - tal como ultrafiltração.
Existem, também, várias descrições da utilização de proteases específicas para induzir a agregação de proteínas de soro de leite coalhado. Foi demonstrado que uma protease da serina derivada de Bacillus licheniformis possui a capacidade para induzir a agregação de proteínas de soro de leite coalhado (documento US 5523237) .
Contudo, permanecem muitas dificuldades associadas com a adição de proteínas de soro de leite coalhado em processos tais como o fabrico de queijos. Por exemplo, a incorporação da proteína de soro de leite coalhado em queijos está associada com uma deterioração no sabor e na sensação na boca do produto e, além disso, tende a interferir com a coagulação e subsequente processamento do produto. Foram anteriormente relatadas 9 proteases que podem ser adicionadas a leite, para queijo para a hidrólise de proteínas de soro de leite coalhado que resulta na hidrólise significativa das caseínas, como descrito por Madsen, J.S. & Qvist,K.B. (1997) Hydrolysis of milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acid residues. J. Food Sei. 62, 579-582.
Assim, existe uma necessidade na técnica para métodos e composições que proporcionem a incorporação melhorada de proteína do soro de leite coalhado em produtos alimentares embora mantendo as propriedades organolépticas e outras propriedades desejáveis. Essa optimização iria resultar num aumento da eficiência, rendimentos mais elevados de produtos alimentares e custos materiais globais reduzidos.
As aciltransferases de lipase:colesterol são já conhecidas há algum tempo (ver, por exemplo, Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493) . Em particular, descobriram-se as glicerofosfolípido:colesterol aciltransferases (GCAT) que tal como as aciltransferases de lecitina:colesterol (LCAT) de plantas e/ou de mamíferos, irão catalisar a transferência de ácidos gordos entre fosfatidileolina e colesterol.
Upton e Buckley (TIBS 20, Maio de 1995 p 178-179) e Brumlik e Buckley (J. of Bacteriology Abr. 1996 p 2060-2064) ensinam uma lipase/aciltransferase de Aeromonas hydrophila que tem a capacidade para realizar a transferência de acilo para aceitadores de álcool em meio aquoso.
Milton et al. (Biochemistry, 1990, 29, 9072-9078) ensina também a purificação de uma aciltransferase gorda de Aeromonas salmonicida contendo o gene estrutural de A. Hydrophila clonado. 10
Além disso, a sequência de aciltransferase de Ά. Salmonicida foi também inserida na base de dados EBI UNIPROT em 1 de Março de 2001 sob o n° de acesso Q9F7Y6.
ASPECTOS SUMÁRIOS DA PRESENTE INVENÇÃO
De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se a utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar contendo água compreendendo 10-98% de água, um produto de massa ou um produto cozido compreendendo um emulsificador, em que o emulsificador é produzido a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lipido, em que a aciltransferase de lipido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado possui, pelo menos, 2% de actividade de aciltransferase; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: i) dissolver 450 mg de fosfatidilcolina e 50 mg de colesterol em clorofórmio, evaporando sob vácuo até secagem; ii) transferir 300 mg da mistura de colesterol/fosfatidilcolina para um frasco de Wheaton, adicionar 15 mL de tampão HEPES 50 mM pH 7 e dispersar o lipido no tampão durante agitação; iii) aquecer o substrato a 35 °C durante a mistura com um agitador magnético e adicionar 0,25 mL de solução enzimática; iv) retirar amostras de 2 mL aos tempos de reacção 0, 5, 10, 15, 25, 40 e 60 minutos e parar imediatamente a reacção enzimática pela adição de 25 pL de HC1 a 4 M para acidificar o ácido gordo livre; 11 v) adicionar 3 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar e isolar 2 mL da fase de clorofórmio, filtrar através de um filtro de 0,45 μπι num frasco de Dram de 10 mL tarado; vi) evaporar o clorofórmio sob uma corrente de azoto a 60 °C e pesar as amostras; vii) analisar o lípido extraído por GLC.
De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção de um produto de massa ou de um produto cozido compreendendo um emulsificador, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido a um produto de massa contendo 10-98% de água ou um produto cozido, em que a aciltransferase de lípido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado possui, pelo menos, 2% de actividade de aciltransferase; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: (i) dissolver 450 mg de fosfatidilcolina e 50 mg de colesterol em clorofórmio, evaporando sob vácuo até secagem; (ii) transferir 300 mg da mistura de colesterol/fosfatidilcolina para um frasco de Wheaton, adicionar 15 mL de tampão HEPES 50 mM pH 7 e dispersar o lipido no tampão durante agitação; (iii) aquecer o substrato a 35 °C durante a mistura com um agitador magnético e adicionar 0,25 mL de solução enzimática; (iv) retirar amostras de 2 mL aos tempos de reacção 0, 5, 10, 15, 25, 40 e 60 minutos e parar imediatamente a reacção enzimática pela adição de 25 pL de HC1 a 4 M para acidificar o ácido gordo livre; 12 (v) adicionar 3 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar e isolar 2 mL da fase de clorofórmio, filtrar através de um filtro de 0,45 μπι num frasco de Dram de 10 mL tarado; (vi) evaporar o clorofórmio sob uma corrente de azoto a 60 °C e pesar as amostras; (vii) analisar o lípido extraído por GLC.
De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um produto de massa ou cozido contendo água, em que o produto de massa ou cozido compreende 10-98% de água, obtenível pelo método da presente invenção, em que o alimento compreende uma aciltransferase de lípido e um emulsificador, em que a aciltransferase de lípido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado possui, pelo menos, 2% de actividade de aciltransferase; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: (i) dissolver 450 mg de fosfatidilcolina e 50 mg de colesterol em clorofórmio, evaporando sob vácuo até secagem; (ii) transferir 300 mg da mistura de colesterol/fosfatidilcolina para um frasco de Wheaton, adicionar 15 mL de tampão HEPES 50 mM pH 7 e dispersar o lípido no tampão durante agitação; (iii) aquecer o substrato a 35 °C durante a mistura com um agitador magnético e adicionar 0,25 mL de solução enzimática; (iv) retirar amostras de 2 mL aos tempos de reacção 0, 5, 10, 15, 25, 40 e 60 minutos e parar imediatamente a reacção enzimática pela adição de 25 pL de HC1 a 4 M para acidificar o ácido gordo livre; (v) adicionar 3 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar e isolar 2 mL da fase de 13 clorofórmio, filtrar através de um filtro de 0,45 μιτι num frasco de Dram de 10 mL tarado; (vi) evaporar o clorofórmio sob uma corrente de azoto a 60 °C e pesar as amostras; (vii) analisar o lípido extraído por GLC. São também aqui divulgados os seguintes métodos, utilizações, alimentos e aciltransferases de lípidos seguintes.
Um método de produção in situ de um emulsificador num alimento, em que o método é tal que o emulsif icador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método de produção in situ de um emulsif icador e de um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento, em que o método é tal que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento.
Um método de produção in situ de um emulsif icador e de um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método para a produção in situ de, pelo menos, dois emulsificadores num alimento, em que o método compreende o passo de adicionar ao alimento uma aciltransferase de lípido. 14
Um método de produção in situ de, pelo menos, dois emulsificadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento, em que o método é tal que os emulsif icadores são produzidos sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento.
Um método de produção in situ de, pelo menos, dois emulsificadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol num alimento, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método para a produção in situ de um éster de hidrato de carbono num alimento, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método para a produção in situ de um éster de hidrato de carbono juntamente com um emulsificador num alimento, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método de produção in situ de um emulsif icador e um ou mais de um éster de hidrato de carbono; um éster de esterol; um éster de estanol; um éster de proteína; um monoglicérido ou um diglicérido num alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento.
Um método de produção de um alimento compreendendo um emulsificador, em que o método compreende o passo de adicionar ao alimento uma aciltransferase de lípido como aqui definida. 15
Um método de produção de um alimento compreendendo um emulsif icador, em que o método é tal que o emulsif icador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método da produção de um alimento compreendendo um emulsificador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o método é tal que o emulsif icador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método da produção de um alimento compreendendo um emulsificador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método para a produção de um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsificadores, em que o método compreende o passo de adicionar ao alimento uma aciltransferase de lipido.
Um método da produção de um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsif icadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o método é tal que os emulsif icadores são produzidos sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método da produção de um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsif icadores e um éster de esterol e/ou um éster 16 de estanol, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento.
Um método para a produção de um alimento compreendendo um éster de hidrato de carbono, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método para a produção de um alimento compreendendo um éster de hidrato de carbono e um emulsificador, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento.
Um método da produção de um alimento compreendendo um emulsificador e um ou mais de um éster de hidrato de carbono; um éster de esterol; um éster de estanol; um éster de proteína; um monoglicérido ou um diglicérido e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lípido ao alimento.
Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um emulsificador, em que o emulsificador é produzido a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido.
Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um emulsificador, em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o emulsif icador é produzido a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido. 17
Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um emulsificador e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o emulsificador e/ou éster de esterol e/ou éster de estanol é/são produzido(s) a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido.
Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um emulsificador e um éster de esterol e/ou éster de estanol, em que o emulsificador e/ou éster de esterol e/ou éster de estanol é/são produzido(s) a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido.
Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsificadores, em que os dois emulsificadores são produzidos a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido.
Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsif icadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que os emulsificadores são produzidos sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que um ou ambos os emulsif icadores e/ou o éster de esterol e/ou o éster de estanol é/são produzido(s) a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido. 18
Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo, pelo menos, dois emulsificadores e um éster de esterol e/ou um éster de estanol, em que um ou ambos os emulsif icadores e/ou o éster de esterol e/ou o éster de estanol é/são produzido(s) a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lipido.
Utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um éster de hidrato de carbono, em que o éster de hidrato de carbono é produzido a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lipido.
Utilização de uma aciltransferase de lipido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo, pelo menos, um éster de hidrato de carbono e um emulsificador adicional, em que o éster de hidrato de carbono e o emulsificador são produzidos a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido.
Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar, um alimento compreendendo um emulsificador e um ou mais de um éster de hidrato de carbono; um éster de esterol; um éster de estanol; um éster de proteína; um monoglicérido ou um diglicérido e em que o emulsif icador e/ou o éster de hidrato de carbono e/ou o éster de esterol e/ou o éster de estanol e/ou o éster de proteína e/ou o monoglicérido e/ou o diglicérido é/são produzido(s) a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido. 19
Um método da produção in situ de um emulsificador, de um modo preferido, uma lisolecitina e um éster de esterol num alimento à base de ovo, em que o método é tal que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método da produção in situ de um emulsif icador, de um modo preferido, uma lisolecitina e um éster de esterol num alimento à base de ovo, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método de produção de um alimento à base de ovo compreendendo um emulsificador, de um modo preferido, uma lisolecitina e um éster de esterol num alimento à base de ovo, em que o emulsificador é produzido sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento e em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um método de produção de um alimento à base de ovo compreendendo um emulsificador, de um modo preferido, uma lisolecitina e um éster de esterol num alimento à base de ovo, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido ao alimento.
Um alimento obtenível por, de um modo preferido obtido por, um método de acordo com a presente invenção.
Uma composição enzimática alimentar e/ou uma composição enzimática para ração, que contém uma aciltransferase de lipido 20 e a utilização dessa composição nos métodos da presente invenção.
Um método de identificar uma aciltransferase de lipido adequada para utilizar de acordo com a presente invenção, compreendendo os passos de testar uma enzima de interesse utilizando um ou mais dos "Ensaio de Transferase num ambiente de Pouca Água", "Ensaio de Transferase numa Gema de Ovo com Muita Água" ou o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" e seleccionar uma aciltransferase de lipido se é uma que possui uma ou mais das seguintes caracteristicas: (a) quando testada utilizando o "Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água", medida após um período de tempo seleccionado de 30, 20 ou 120 minutos, possui uma actividade de transferase relativa de, pelo menos, 1%; (b) quando testada utilizando o "Ensaio de
Transferase numa Gema de Ovo com Muita Água" numa gema de ovo com 54% de água, possui até 100% de actividade de transferase relativa; ou (c) quando testada utilizando o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" possui, pelo menos, 2% de actividade de aciltransferase.
Uma aciltransferase de lipido identificada utilizando um método aqui divulgado.
Uma enzima de aciltransferase de lipido imobilizada como aqui definida. 21
ASPECTOS DETALHADOS DA PRESENTE INVENÇÃO O termo "aciltransferase de lípido", como aqui utilizado, significa uma enzima que, além de possuir actividade de lipase (geralmente classificada como E.C. 3.1.1.x de acordo com as Recomendações de Nomenclatura de Enzimas (1992) do Comité de Nomenclatura da International Union of Biochemistry e Molecular Biology) também possui actividade de aciltransferase (geralmente classificada como E.C. 2.3.1.x), pela qual a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um ou mais substratos aceitadores, tais como um ou mais dos seguintes: um esterol; um estanol; um hidrato de carbono; uma proteína; uma subunidade de substrato; glicerol.
De um modo preferido, uma aciltransferase de lípido para utilização nos métodos e/ou utilizações da presente invenção é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido (como aqui definido) para um ou mais dos seguintes substratos do aceitador de acilo: um esterol, um estanol, um hidrato de carbono, uma proteína ou suas subunidades, ou um glicerol.
Para alguns aspectos o "aceitador de acilo", de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer composto compreendendo um grupo hidroxilo (-0H), tal como por exemplo, álcoois polivalentes, incluindo glicerol; esterol; estanóis; hidratos de carbono; ácidos de hidroxilo incluindo ácidos de frutos, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico e ácido ascórbico; proteínas ou uma sua subunidade, tais como aminoácidos, hidrolisados de proteína e péptidos (proteína parcialmente hidrolisada) por exemplo; e misturas e seus derivados., de um modo preferido, o "aceitador de acilo", de acordo com a presente invenção, não é água. 22
Numa forma de realizaçao, o aceitador de acilo, de um modo preferido, não é um monoglicérido e/ou um diglicérido.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um esterol e/ou um estanol.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um hidrato de carbono.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para uma proteína ou uma sua subunidade. Adequadamente, a subunidade de proteína pode ser uma ou mais das seguintes: um aminoácido, um hidrolisado de proteína, um péptido, a dipéptido, um oligopéptido, um polipéptido.
Adequadamente, na proteína ou subunidade de proteína, o aceitador de acilo pode ser um ou mais dos seguintes constituintes da proteina ou subunidade de proteína: uma serina, uma treonina, uma tirosina, ou uma cisteína.
Quando a subunidade de proteína é um aminoácido, adequadamente o aminoácido pode ser qualquer aminoácido adequado. Adequadamente, o aminoácido pode ser um ou mais de uma serina, uma treonina, uma tirosina, ou uma cisteína, por exemplo.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para glicerol. 23
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um ácido de hidroxilo. Num aspecto, de um modo preferido, a enzima é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um álcool polivalente.
Num aspecto, uma aciltransferase de lípido pode, além de ser capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um esterol e/ou um estanol, ser adicionalmente capaz de transferir o grupo acilo de um lípido para um ou mais dos seguintes: um hidrato de carbono, uma proteína; uma subunidade de substrato, glicerol.
De um modo preferido, o substrato de lípido no qual actua a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é um ou mais dos seguintes lípidos: um fosfolípido, tal como uma lecitina, e. g., fosfatidilcolina, um triacilglicérido, uma cardiolipina, um diglicérido, ou um glicolípido, tal como digalactosildiglicérido (DGDG), por exemplo. Este substrato lipidico pode ser aqui referido como o "dador de acilo lípido". 0 termo lecitina, como aqui utilizado engloba fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina e fosfatidilglicerol.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, o substrato lipidico no qual uma aciltransferase de lípido actua é um fosfolípido, tal como lecitina, por exemplo, fosfatidilcolina.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, o substrato lipidico é um glicolípido, tal como DGDG por exemplo. 24
De um modo preferido, o substrato lipídico é um lípido alimentar, o que é dizer um componente lipídico de um alimento.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, uma aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é incapaz ou substancialmente incapaz de actuar num triglicérido e/ou um 1-monoglicérido e/ou 2-monoglicérido.
Adequadamente, o substrato lipídico ou dador de acilo lipídico pode ser um ou mais lípidos presentes em um ou mais dos seguintes substratos: gorduras, incluindo gordura de banha, sebo e manteiga; óleos incluindo óleos extraídos a partir de ou derivados de óleo de palma, óleo de girassol, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de sementes de algodão, óleo de noz moída, óleo de milho, azeite, óleo de amendoim, óleo de coco e óleo de colza. A lecitina de soja, colza ou gema de ovo é também um substrato lipídico adequado. 0 substrato lipídico pode ser um lípido de aveia ou outro material à base de plantas contendo galactolípidos.
Num aspecto o dador de acilo de lipidos é, de um modo preferido, lecitina (tal como fosfatidilcolina) em gema de ovo.
Para alguns aspectos da presente invenção, o lípido pode ser seleccionado de lípidos que possuem um comprimento de cadeia de ácido gordo desde 8 até 22 carbonos.
Para alguns aspectos da presente invenção, o lípido pode ser seleccionado de lípidos que possuem um comprimento de cadeia de ácidos gordos desde 16 até 22 carbonos, de um modo mais preferido, desde 16 até 20 carbonos. 25
Para alguns aspectos da presente invenção, o lípido pode ser seleccionado de lípidos que possuem um comprimento de cadeia de ácido gordo não superior a 14 carbonos, adequadamente a partir lipidos que possuem um comprimento de cadeia de ácido gordo desde 4 até 14 carbonos, adequadamente 4 até 10 carbonos, adequadamente 4 até 8 carbonos.
Adequadamente, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode apresentar uma ou mais das seguintes actividades de lipase: actividade de glicolipase (E.C. 3.1.1.26), actividade de triacilglicerol lipase (E.C. 3.1.1.3), actividade de fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4) ou actividade de fosfolipase AI (E.C. 3.1.1.32). O termo "actividade de glicolipase", como aqui utilizado engloba "actividade de galactolipase".
Adequadamente, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode possuir, pelo menos, uma ou mais das seguintes actividades: actividade de glicolipase (E.C. 3.1.1.26) e/ou actividade de fosfolipase AI (E.C. 3.1.1.32) e/ou actividade de fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4).
Para alguns aspectos, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode possuir, pelo menos, actividade de glicolipase (E.C. 3.1.1.26).
Adequadamente, para alguns aspectos, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode ser capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolípido para um ou mais dos seguintes substratos aceitadores: um 26 esterol, um estanol, um hidrato de carbono, uma proteína, glicerol.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolípido para um esterol e/ou um estanol para formar, pelo menos, um éster de esterol e/ou um éster de estanol.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolípido para um hidrato de carbono para formar, pelo menos, um éster de hidrato de carbono.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolípido para uma proteína para formar, pelo menos, éster de proteína (ou um condensado de ácido gordo de proteína).
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um glicolípido e/ou um fosfolípido para glicerol para formar, pelo menos, um diglicérido e/ou um monoglicérido.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, não apresenta actividade de triacilglicerol lipase (E.C. 3.1.1.3). 27
Em alguns aspectos, a aciltransferase de lípido pode ser capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um esterol e/ou um estanol. Assim, numa forma de realização o "aceitador de acilo", de acordo com a presente invenção, pode ser um esterol ou um estanol ou uma combinação de ambos um esterol e um estanol.
Numa forma de realização, adequadamente, o esterol e/ou estanol pode compreender uma ou mais das seguintes características estruturais: i) um grupo hidroxilo 3-beta ou um grupo hidroxilo 3-alfa; e/ou ii) Anéis A:B na posição eis ou anéis A:B na posição trans ou C5-C6 está insaturado.
Aceitadores de acilo de esterol adequados incluem colesterol e fitoesteróis, por exemplo, alfa-sitosterol, beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, campesterol, 5,6-di-hidrosterol, brassicasterol, alfa-spinasterol, beta-spinasterol, gamaspinasterol, deltaspinasterol, fucosterol, dimosterol, ascosterol, serebisterol, episterol, anasterol, hiposterol, condrilasterol, desmosterol, calinosterol, poriferasterol, clionasterol, glicósidos de glicósidos de esterol e outras formas naturais ou sintéticas isoméricas e derivados.
Num aspecto da presente invenção, adequadamente, mais do que um esterol e/ou estanol pode actuar como o aceitador de acilo, adequadamente mais do que dois esteróis e/ou estanóis podem actuar como o aceitador de acilo. Por outras palavras, num aspecto da presente invenção, adequadamente pode ser produzido mais do que um éster de esterol e/ou éster de estanol. 28
Adequadamente, quando o colesterol é o aceitador de acilo um ou mais outros esteróis ou um ou mais estanóis podem também actuar como o aceitador de acilo. Assim, num aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção in situ de ambos um éster de colesterol e, pelo menos, um esterol ou éster de estanol em combinação. Por outras palavras, a aciltransferase de lipido para alguns aspectos da presente invenção pode transferir um grupo acilo de um lipido para ambos colesterol e, pelo menos, um outro esterol e/ou, pelo menos, um estanol.
Num aspecto, de um modo preferido, o aceitador de acilo de esterol é um ou mais dos seguintes: alf a-sitosterol, beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol e campesterol.
Num aspecto, de um modo preferido, o aceitador de acilo de esterol é colesterol. Quando é o caso de o colesterol ser o aceitador de acilo para a aciltransferase de lipido, a quantidade de colesterol livre no alimento é reduzida em comparação com o alimento antes de exposição à aciltransferase de lipido e/ou em comparação com um alimento equivalente que não tenha sido tratado com a aciltransferase de lipido.
Aceitadores de acilo de estanol adequados incluem fitostanóis, por exemplo, beta-sitostanol ou ss-sitostanol.
Num aspecto, de um modo preferido, o aceitador de acilo de esterol e/ou estanol é um esterol e/ou um estanol diferente de colesterol.
Em alguns aspectos, o alimento preparado, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizado para reduzir o colesterol no soro sanguíneo e/ou para reduzir a lipoproteína de baixa 29 densidade. 0 colesterol no soro sanguíneo e as lipoproteinas de baixa densidade têm sido ambos associados a certas doenças em humanos, tais como aterosclerose e/ou doença cardíaca, por exemplo. Por isso, está contemplado que os alimentos preparados, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados para reduzir o risco dessas doenças.
Assim, num aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de um alimento, de acordo com a presente invenção, para utilização no tratamento e/ou prevenção de aterosclerose e/ou doença cardíaca.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um medicamento compreendendo um alimento de acordo com a presente invenção.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento e/ou apresentação de uma doença num doente humano ou animal, cujo método compreende administrar ao doente uma quantidade eficaz de um alimento de acordo com a presente invenção.
Adequadamente, o "aceitador de acilo" de esterol e/ou estanol pode ser encontrado naturalmente no alimento. Alternativamente, o esterol e/ou o estanol pode ser adicionado ao alimento. Quando é o caso de um esterol e/ou um estanol ser adicionado ao alimento, o esterol e/ou estanol pode ser adicionado antes, simultaneamente com, e/ou após a adição da aciltransferase de lípido de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a presente invenção pode englobar a adição de esteróis/estanóis exógenos, particularmente fitoesteróis/fitostanóis, ao alimento antes de, ou 30 simultaneamente com, a adiçao da enzima de acordo com a presente invenção.
Para alguns aspectos, um ou mais esteróis presentes no alimento podem ser convertidos em um ou mais estanóis antes de, ou ao mesmo tempo que a aciltransferase de lípido é adicionada de acordo com a presente invenção. Pode ser empregue qualquer método adequado para converter esteróis em estanóis. Por exemplo, a conversão pode ser realizada através de hidrogenação química, por exemplo. A conversão pode ser realizada antes da adição da aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, ou, simultaneamente, com a adição da aciltransferase de lípido de acordo com a presente invenção. Adequadamente, enzimas para a conversão de esterol em estanóis são ensinadas no documento WO00/061771.
Adequadamente, a presente invenção pode ser empregue para produzir ésteres de fitostanol in situ num alimento. Os ésteres de fitostanol possuem solubilidade melhorada através de membranas de lípido, biodisponibilidade e benefícios de saúde aumentados (ver, por exemplo, o documento WO92/99640).
Em algumas formas de realização da presente invenção o éster de estanol e/ou o éster de esterol pode ser um aromatizante e/ou um modificador de textura. Nesses casos, a presente invenção engloba a produção in situ de aromatizantes e/ou modificadores de textura.
Para alguns aspectos da presente invenção, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode utilizar um hidrato de carbono como o aceitador de acilo. 0 hidrato de carbono aceitador de acilo pode ser um ou mais dos seguintes: um 31 dissacárido, um monossacárido, um dissacárido, um oligossacárido ou um polissacárido., de um modo preferido, o hidrato de carbono é um ou mais dos seguintes: glucose, frutose, anidrofrutose, maltose, lactose, sacarose, galactose, xilose, xilo-oligossacáridos, arabinose, malto-oligossacáridos, tagatose, microtecina, ascopirona P, ascopirona T, cortalcerona.
Adequadamente, o hidrato de carbono "aceitador de acilo" pode ser encontrado naturalmente no alimento. Alternativamente, o hidrato de carbono pode ser adicionado ao alimento. Quando é o caso de o hidrato de carbono ser adicionado ao alimento, o hidrato de carbono pode ser adicionado antes, simultaneamente com, e/ou após a adição de uma aciltransf erase de lipido de acordo com a presente invenção.
Os ésteres de hidrato de carbono podem funcionar como emulsificadores valiosos em alimentos. Assim, quando é o caso de a enzima funcionar para transferir o grupo acilo para um açúcar, a invenção engloba a produção de um segundo emulsificador in situ no alimento.
Em algumas formas de realização, a aciltransferase de lipido pode utilizar ambos um esterol e/ou estanol e um hidrato de carbono como um aceitador de acilo. A utilização de aciltransferase de lipido que pode transferir, então, o grupo acilo para um hidrato de carbono assim como para um esterol e/ou um estanol é particularmente vantajosa para alimentos compreendendo ovos. Em particular, a presença de açúcares, em particular glucose, em ovos e produtos com ovo é, frequentemente, encarada como desvantajosa. A gema de ovo pode compreender até 1% de glucose. Tipicamente, o ovo ou 32 produtos à base de ovo podem ser tratados com glucose oxidase para remover alguma ou toda esta glucose. Contudo, de acordo com a presente invenção, este açúcar indesejado pode ser rapidamente removido "esterifiçando" o açúcar para formar um éster de açúcar.
Para alguns aspectos da presente invenção, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode utilizar uma proteína como o aceitador de acilo. Adequadamente, a proteína pode ser uma ou mais das proteínas que se encontram num produto alimentar, por exemplo, num produto lácteo e/ou um produto cárneo. Apenas a título de exemplo, proteínas adequadas podem ser encontradas na coalhada ou soro de leite, tal como lactoglobulina. Outras proteínas adequadas incluem ovalbumina de ovo, gliadina, glutenina, puroindolina, proteínas de transferência de lípido de grãos e miosina da carne.
Assim, de acordo com a presente invenção, pode ser alcançada uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: produção in situ de um emulsificador sem um aumento em ácidos gordos livres; uma redução na acumulação de ácidos gordos livres no alimento; uma redução nos níveis de colesterol livres no alimento; um aumento em ésteres de esterol e/ou ésteres de estanol; uma redução no colesterol no soro sanguíneo e/ou lipoproteínas de baixa densidade; um aumento em ésteres de hidratos de carbono; uma redução em hidratos de carbono livres indesejados.
Uma vantagem da presente invenção é que o(s) emulsificador(es) é/são preparados in situ no alimento sem um aumento, ou um aumento substancial, no teor de ácidos gordos livres do alimento. A produção de ácidos gordos livres pode ser prejudicial para os alimentos. Em particular, os ácidos gordos 33 livres têm sido ligados a odores desagradáveis e/ou aromas desagradáveis nos alimentos, assim como outros efeitos prejudiciais, incluindo um sabor "a ranço" no queijo, por exemplo, de um modo preferido, o método, de acordo com a presente invenção, resulta na preparação in situ de um emulsificador(es) em que a acumulação de ácidos gordos livres é reduzida e/ou eliminada. Sem desejar estar limitado pela teoria, de acordo com a presente invenção, o ácido gordo que é removido do lipido é transferido pela aciltransferase de lipido para um aceitador de acilo, por exemplo, um esterol e/ou um estanol. Assim, o nível global de ácidos gordos livres no alimento não aumenta, ou aumenta apenas num grau insignificante. Esta é um contraste muito acentuado em relação à situação que ocorre quando são utilizadas lipases (E.C. 3.1.1.x) para produzir emulsificadores in situ. Em particular, a utilização de lipases pode resultar numa quantidade aumentada de ácido gordo livre no alimento, o que pode ser prejudicial. De acordo com a presente invenção, a acumulação de ácidos gordos livres é reduzida e/ou eliminada quando comparada com a quantidade de ácidos gordos livres que teriam sido acumulados tinha sido utilizada uma enzima lipase, em particular uma enzima fosfolipase A, em vez de uma aciltransferase de lipido de acordo com a presente invenção. A utilização de uma aciltransferase de lipido que pode transferir o grupo acilo para um esterol e/ou estanol pode ser particularmente vantajosa para alimentos que compreendem ovos. Em particular, verificou-se que pode ser obtido um produto à base de ovos com propriedades significativamente melhores após tratamento com uma aciltransferase de lipido como aqui definido comparada com produtos à base de ovos tratada com fosfolipase convencional, tal como LipopanF® (Novozymes A/S, Dinamarca), 34
Lecitase Ultra® (Novozymes A/S, Dinamarca) ou Lipomod 22 L de Biocatalysts, por exemplo.
De um modo preferido, a enzima aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode ser caracterizada utilizando os seguintes critérios: (i) a enzima possui actividade de aciltransferase que pode ser definida como actividade de transferência de éster através da qual a parte acilo de uma ligação éster original de um dador de acilo de lipido é transferida para um aceitador de acilo para formar um novo éster; e (ii) a enzima compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S .
De um modo preferido, X do motivo GDSX é L. Assim, de um modo preferido, a enzima, de acordo com a presente invenção, compreende o motivo de sequência de aminoácidos GSDL. 0 motivo GDSX é compreendido de quatro aminoácidos conservados., de um modo preferido, a serina no motivo é uma serina catalítica de uma enzima aciltransferase de lípido. Adequadamente, a serina do motivo GDSX pode estar numa posição correspondente a Ser-16 na enzima lipolítica de Aeromonas hydrophíla apresentada em Brumlik & Buckley (Journal of
Bacteriology Abr. 1996, Vol. 178, N° 7, p 2060-2064).
Para determinar se uma proteína possui o motivo GDSX de acordo com a presente invenção, a sequência é, de um modo 35 preferido, comparada com os perfis de modelo de Markov escondido (perfis HMM) da base de dados pfam.
Pfam é uma base de dados de famílias de domínio de proteína. Pfam contém alinhamentos de sequências múltiplas trabalhados para cada família, assim como modelos de modelo de Markov escondidos (perfis HMM) para identificar estes domínios em novas sequências. Pode ser encontrada uma introdução a Pfam em Bateman A et ai., (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280. Os modelos de
Markov escondidos são utilizados em várias bases de dados que têm como objectivo classificar proteínas, para revisão ver Bateman A e Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Pu bmed&list_uids=12230032&dopt=Abstract http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Pu bMed&list_uids =11752314&dopt=Abstract
Para uma explicação detalhada de modelos de Markov escondidos e sobre como eles são aplicados na base de dados Pfam ver Durbin R, Eddy S, e Krogh A (1998) "Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids". Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. O pacote de programas informáticos Hammer pode ser obtido da Washington University, St Louis, EUA.
Alternativamente, o motivo GDSX pode ser identificado utilizando o pacote de programas informáticos Hammer, as instruções são fornecidas em Durbin R, Eddy S, e Krogh A (1998) "Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids". Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 e as referências aí apresentadas e o perfil HMMER2 proporcionado nesta descrição. 36 A base de dados PFAM pode ser acedida, por exemplo, através de vários servidores que estão presentemente localizados nos seguintes websites. http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml http://pfam. wustl.edu/ http://pfam.jouy.inra.fr/ http://pfam.cgb.ki.se/ A base de dados oferece uma facilidade de pesquisa na qual se pode submeter uma sequência de proteínas. Utilizando os parâmetros por defeito da base de dados, a sequência de proteínas será, então, analisada quanto à presença de domínios Pfam. 0 domínio GDSX é um domínio estabelecido na base de dados e, como tal, a sua presença em qualquer sequência pesquisada será reconhecida. A base de dados devolverá o alinhamento da sequência de consenso Pfam00657 à sequência pesquisada.
Pode ser obtido um alinhamento múltiplo, incluindo Aeromonas salmonicida ou Aeromonas hydrophila: a) manualmente obter um alinhamento da proteína de interesse com a sequência de consenso Pfam00657 e obter um alinhamento de P10480 com a sequência de consenso Pfam00657 seguindo o procedimento descrito acima; ou b) através de base de dados
Após identificação da sequência de consenso Pfam00657 a base de dados oferece a opção de apresentar um 37 alinhamento da sequência a pesquisar com o alinhamento de semente da sequência de consenso Pfam00657. P10480 é parte deste alinhamento de semente e é indicado por GCAT_AERHY. Tanto a sequência a pesquisar como P10480 serão apresentadas na mesma janela. A sequência de referência de Aeromonas hydrophila:
Os resíduos de lipase GSDX de Aeromonas hydrophila estão numerados no ficheiro NCBI P10480, os números deste texto referem-se aos números fornecidos nesse ficheiro que, na presente invenção, são utilizados para determinar resíduos de aminoácidos específicos que, numa forma de realização preferida estão presentes nas enzimas aciltransferase de lípido da invenção. 0 alinhamento Pfam foi realizado (Figura 33 e 34):
Os seguintes resíduos conservados podem ser reconhecidos e, numa forma de realização preferida, podem estar presentes nas enzimas para utilização nas composições e métodos da invenção;
Bloco 1 - bloco GDSX hid hid hid hid Gly Asp Ser hid 28 29 30 31 32 33 34 35
Bloco 2 - bloco GANDY hid Gly hid Asn Asp hid 130 131 132 133 134 135 38
Bloco 3
bloco HPT
His 309
Onde 'hid' significa um resíduo hidrofóbico seleccionado de Met, Ile, Leu, Vai, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.
De um modo preferido, a enzima aciltransferase de lípido para utilização nas composições/métodos da invenção pode ser alinhada utilizando a sequência de consenso Pfam00657.
De um modo preferido, um emparelhamento positivo com o perfil de modelo de markov escondido (perfil HMM) da família de domínios pfam00657 indica a presença do domínio GDSL ou GDSX de acordo com a presente invenção.
De um modo preferido, quando alinhada com a sequência de consenso Pfam00657, a aciltransferase de lípido para utilização nas composições/métodos da invenção possui, pelo menos, um, de um modo preferido mais do que um, de um modo preferido mais do que dois, dos seguintes, um bloco GDSx, um bloco GANDY, um bloco HPT. Adequadamente, a aciltransferase de lípido pode possuir um bloco GDSx e um bloco GANDY. Alternativamente, a enzima pode possuir um bloco GDSx e um bloco HPT., de um modo preferido, a enzima compreende, pelo menos, um bloco GDSx.
De um modo preferido, quando alinhada com a sequência de consenso Pfam00657 a enzima para utilização nas composições/métodos da invenção possuem, pelo menos um, de um modo preferido mais do que um, de um modo preferido mais do que 39 dois, de um modo preferido mais do que três, de um modo preferido mais do que quatro, de um modo preferido mais do que cinco, de um modo preferido mais do que seis, de um modo preferido mais do que sete, de um modo preferido mais do que oito, de um modo preferido mais do que nove, de um modo preferido mais do que dez, de um modo preferido mais do que onze, de um modo preferido mais do que doze, de um modo preferido mais do que treze, de um modo preferido mais do que catorze, dos seguintes resíduos de aminoácidos quando comparados com a sequência de polipéptido de referência A. hydrophília, nomeadamente SEQ ID N° 32: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His. 0 dominio GDSX de pfam00657 é um identificador único que distingue as proteínas que possuem este domínio de outras enzimas. A sequência de consenso Pfam00657 é apresentada na Figura 1 como SEQ ID N° 1. Isto é derivado da identificação da família 00657 de pfam, versão 6 da base de dados, que pode, também, ser aqui referida como pfam00657.6. A sequência de consenso pode ser actualizada utilizando outras entradas da base de dados de pfam.
Por exemplo, as Figuras 33 e 34 apresentam o alinhamento de da família 00657 de pfam, da base de dados versão 11, que pode também ser aqui referida como pfam00657.11. A presença dos blocos GDSx, GANDY e HPT encontra-se na família 00657 de pfam a partir de ambas as entradas da base de 40 dados. Podem ser utilizadas entradas futuras da base de dados de pfam para identificar a família 00657 de pfam.
De um modo preferido, a enzima aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode ser caracterizada utilizando os seguintes critérios: (i) a enzima possui actividade de aciltransferase que pode ser definida como actividade de transferência de éster pela qual a parte acilo de uma ligação éster original de um dador de acilo lípido é transferida para o aceitador de acilo para formar um novo éster; (ii) a enzima compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S. ; (iii) a enzima compreende His-309 ou compreende um resíduo de histidina numa posição correspondente a His-309 na enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila apresentada na Figura 2 (SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32) .
De um modo preferido, o resíduo de aminoácidos do motivo GDSX é L.
Na SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32 os primeiros 18 resíduos de aminoácidos de uma sequência sinal. His-309 da sequência de comprimento total, que é a proteína incluindo a sequência sinal, equivale a His-291 da parte madura da proteína, i. e., a sequência sem a sequência sinal. 41
De um modo preferido, a enzima aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, compreende a seguinte tríade catalítica: Ser-34, Asp-134 e His-309 ou compreende um resíduo de serina, um resíduo de ácido aspártico e um resíduo de histidina, respectivamente, nas posições correspondentes a Ser-34, Asp-134 e His-309 na enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila apresentada na Figura 2 (SEQ ID N° 2) ou Figura 28 (SEQ ID N° 32). Como referido acima, na sequência apresentada na SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32 os primeiros 18 resíduos de aminoácidos formam uma sequência sinal. Ser-34, Asp-134 e
His-309 da sequência de comprimento total, isto é a proteína incluindo a sequência sinal, equivale a Ser-16, Asp-116 e
His-291 da parte madura da proteína, i. e., a sequência sem a sequência sinal. Na sequência de consenso pfam00657, como apresentada na Figura 1 (SEQ ID N° 1) os resíduos do sitio activo correspondem a Ser-7, Asp-157 e His-348.
De um modo preferido, a enzima aciltransferase de lipido de acordo com a presente invenção, pode ser caracterizada utilizando os seguintes critérios: (i) a enzima possui actividade de aciltransferase que pode ser definida como actividade de transferência de éster pela qual a parte acilo de uma ligação éster original de um primeiro dador de acilo de lipido é transferido para um aceitador de acilo para formar um novo éster; e (ii) a enzima compreende, pelo menos, Gly-32, Asp-33,
Ser-34, Asp-134 e His-309 ou compreende resíduos de glicina, ácido aspártico, serina, ácido aspártico e histidina nas posições correspondentes a Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 e His- 309, respectivamente, na 42 enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila apresentada na Figura 2 (SEQ ID N° 2) ou Figura 28 (SEQ ID N° 32).
Adequadamente, a enzima aciltransferase de lipido de acordo com a presente invenção, pode ser obtida, de um modo preferido, obtida, a partir de organismos de um ou mais dos seguintes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacíllus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neissería, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas e Candida.
Adequadamente, a enzima aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode ser obtida, de um modo preferido, obtida, a partir de um ou mais dos seguintes organismos: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neissería meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis e Candida parapsilosis.
Num aspecto, de um modo preferido, a enzima aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, é obtida, de um modo preferido, obtida, a partir de um ou mais de Aeromonas hydrophila ou Aeromonas salmonicida. 43
Adequadamente, a enzima aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos:
(i) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 2 (ver Figura 2)
(ii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 3 (ver Figura 3)
(iii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 4 (ver Figura 4)
(iv) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 5 (ver Figura 5)
(v) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 6 (ver Figura 6)
(vi) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 12 (ver Figura 14)
(vii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 20 (Figura 16)
(viii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 22 (Figura 18)
(ix) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 24 (Figura 20)
(x) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 26 (Figura 22)
(xi) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 28 (Figura 24)
(xii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 30 (Figura 26)
(xiii) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 32 (Figura 28)
(xiv) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 34 (Figura 30) ou uma sequência de aminoácidos que possui 75% ou mais de identidade com qualquer 44
uma das sequências apresentadas como SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 32, ou SEQ ID N° 34.
Adequadamente, a enzima aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 2 ou como SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 32 ou SEQ ID N° 34 ou compreende uma sequência de aminoácidos que possui 75% ou mais, de um modo preferido, 80% ou mais, de um modo preferido, 85% ou mais, de um modo preferido, 90% ou mais, de um modo preferido, 95% ou mais, de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 2 ou a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 3 ou a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 32 ou a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 34. Para os objectivos da presente invenção, o grau de identidade é baseado no número de elementos de sequência que sao iguais. O grau de identidade, de acordo com a presente invenção, pode ser determinado adequadamente por meio de programas de computador conhecidos na técnica, tais como GAP fornecido no pacote de programas GCG (Manual de Programa para o Wisconsin
Package, Versão 8, Agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Blology 48, 443-45) utilizando os seguintes parâmetros para comparação de sequência de polipéptidos: penalização da criação GAP de 3,0 e penalização de extensão de GAP de 0,1. 45
Adequadamente, a enzima aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, compreende uma sequência de aminoácidos que possui 80% ou mais, de um modo preferido, 85% ou mais, de um modo mais preferido, 90% ou mais e, de um modo ainda mais preferido, 95% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências apresentadas como SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 32, ou SEQ ID N° 34. Adequadamente, a enzima aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: (a) uma sequência de aminoácidos apresentada como os residuos de aminoácidos 1-100 da SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32; (b) uma sequência de aminoácidos apresentada como os residuos de aminoácidos 101-200 da SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32; (c) ma sequência de aminoácidos apresentada como os residuos de aminoácidos 201-300 da SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32; ou (d) uma sequência de aminoácidos que possui 75% ou mais, de um modo preferido, 85% ou mais, de um modo mais preferido, 90% ou mais, de um modo ainda mais preferido, 95% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácidos definida em (a) - • (c) acima. 46
Adequadamente, a enzima aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: (a) uma sequência de aminoácidos apresentada resíduos de aminoácidos 28-39 da SEQ ID SEQ ID N° 32; (b) uma sequência de aminoácidos apresentada resíduos de aminoácidos 77-88 da SEQ ID SEQ ID N° 32; (c) uma sequência de aminoácidos apresentada resíduos de aminoácidos 126-136 da SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32; (d) uma sequência de aminoácidos apresentada resíduos de aminoácidos 163-175 da SEQ ID SEQ ID N° 32; (e) uma sequência de aminoácidos apresentada resíduos de aminoácidos 304-311 da SEQ ID SEQ ID N° 32; ou (f) uma sequência de aminoácidos que possui 75% ou mais, de um modo preferido, 85% ou mais, de um modo mais preferido, 90% ou mais, de um modo ainda mais preferido, 95% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácidos definidos em (a)-(e) acima. como os N° 2 ou como N° 2 os ou como os como os N° 2 ou como os N° 2 ou
Adequadamente, a enzima aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode compreender uma sequência de aminoácidos produzida pela expressão de uma ou mais das seguintes sequências de nucleótidos: 47 (a) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N 0 7 (ver Figura 9) ; (b) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N 0 8 (ver Figura 10) r (c) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N 0 9 (ver Figura 11) r (d) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 10 (ver Figura 12) r (e) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 11 (ver Figura 13) r (f) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 13 (ver Figura 15) r (g) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 21 (ver Figura 17) r (h) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 23 (ver Figura 19) r (i) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 25 (ver Figura 21) r (j) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 27 (ver Figura 23) r (k) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 29 (ver Figura 25) r (D a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 31 (ver Figura 27) r (m) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 33 (ver Figura 29) f (n) a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 35 (ver Figura 31) r (o) ou uma sequência de nucleótidos que possui 75% ou mais identidade com qualquer uma das sequências apresentadas como SEQ ID N° 7, 48 SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 33 ou SEQ ID N° 35.
Adequadamente, a sequência de nucleótidos pode possuir 80% ou mais, de um modo preferido, 85% ou mais, de um modo mais preferido, 90% ou mais e, de um modo ainda mais preferido, 95% ou mais de identidade com qualquer ι ama das sequências apresentadas como SEQ ID N° 7, SEQ ID 00 o SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 33 ou SEQ ID N° 35.
Num aspecto, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode ser uma aciltransferase de lecitina:colesterol (LCAT) ou sua variante (por exemplo, uma variante produzida por evolução molecular). São conhecidas na técnica LCAT adequadas e podem ser obtidas a partir de um ou mais dos seguintes organismos por exemplo: mamíferos, ratos, murganhos, galinhas, Drosophila melanogaster, plantas, incluindo Arabidopsis e Oryza sativa, nemátodos, fungos e leveduras.
Numa forma de realização, a enzima aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode ser uma aciltransferase de lípido que se pode obter, de um modo preferido, obtida, a partir de estirpes de E. coli TOP 10 contendo pPet12aAhydro e pPet12aASalmo depositada por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001 Copenhaga K, Dinamarca sob o
Tratado de Budapeste sobre "International Recognition of the 49
Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Procedure at the National Collection of Industrial, Marine and Food Bactéria (NCIMB)" 23 St. Machar Street, Aberdeen Escócia, GB em 22 de Dezembro de 2003 com os números de acesso NICMB 41204 e NCIMB 41205, respectivamente.
De um modo preferido, quando se realiza um método, de acordo com a presente invenção, o produto é produzido sem aumentar ou aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento. O termo "transferase", como aqui utilizado, é utilizado indistintamente com o termo "aciltransferase de lípido".
Adequadamente, a aciltransferase de lípido, como aqui definido, catalisa uma ou mais das seguintes reacções: interesterificação, transesterificação, alcoólise, hidrólise. O termo "interesterificação" refere-se à transferência catalisada enzimaticamente de grupos acilo entre um dador de lípido e aceitador de lípido, em que o dador de lípido não é um grupo acilo livre. O termo "transesterificação", como aqui utilizado, significa a transferência catalisada enzimaticamente de um grupo acilo de um dador de lípido (diferente de um ácido gordo livre) para um aceitador de acilo (diferente de água).
Como aqui utilizado, o termo "alcoólise" refere-se à clivagem enzimática de uma ligação covalente de um derivado ácido por reacção com um álcool ROH, de modo a que um dos produtos se combina com o H do álcool e o outro produto se combina com o grupo OR do álcool. 50
Como aqui utilizado, o termo "álcool" refere-se a um composto de alquilo que contém um grupo hidroxilo.
Como aqui utilizado, o termo "hidrólise" refere-se a uma transferência catalisada enzimaticamente de um grupo acilo de um lipido para o grupo OH de uma molécula de água. A transferência de acilo que resulta da hidrólise requer a separação da molécula de água. 0 termo "sem aumentar ou sem aumentar substancialmente os ácidos gordos livres", como aqui utilizado, significa que, de um modo preferido, a aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, possui 100% de actividade de transferase (i. e., transfere 100% dos grupos acilo de um dador de acilo para o aceitador de acilo, sem actividade hidrolitica); contudo, a enzima pode transferir menos de 100% dos grupos acilo presentes no dador de acilo de lipido para o aceitador de acilo. Nesse caso, de um modo preferido, a actividade de aciltransferase é responsável por, pelo menos, 5%, de um modo mais preferido, pelo menos, 10%, de um modo mais preferido, pelo menos, 20%, de um modo mais preferido, pelo menos, 30%, de um modo mais preferido, pelo menos, 40%, de um modo mais preferido, 50%, de um modo mais preferido, pelo menos, 60%, de um modo mais preferido, pelo menos, 70%, de um modo mais preferido, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% e, de um modo mais preferido, pelo menos, 98% da actividade enzimática total. A % de actividade de transferase (i. e., a actividade de transferase como uma percentagem da actividade enzimática total) pode ser determinada pelo seguinte protocolo: 51
Protocolo para a determinação da de actividade de aciltransferase:
Um alimento ao qual foi adicionado aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode ser extraido seguindo a reacção enzimática com CHCl3:CH3OH 2:1 e a fase orgânica contendo o material lipídico é isolada e analisada por GLC e HPLC de acordo com o procedimento aqui detalhado abaixo. A partir de análise por GLC e HPLC a quantidade de ácidos gordos livres e um ou mais dos ésteres de esterol/estanol; ésteres de hidrato de carbono, ésteres de proteína; diglicéridos; ou monoglicéridos são determinados. Um alimento de controlo ao qual não foi adicionada qualquer enzima de acordo com a presente invenção, é analisado do mesmo modo. Cálculo: A partir dos resultados das análises de GLC e HPLC pode ser calculado o aumento em ácidos gordos livres e ésteres de esterol/estanol, e/ou ésteres de hidrato de carbono, e/ou éster de proteína, e/ou diglicéridos, e/ou monoglicéridos: Δ% ácido gordo = % ácido gordo (enzima) - % ácido gordo(controlo); Mv ácido gordo = pelo molecular médio dos ácidos gordos; A = Δ% éster de esterol/Mv éster de esterol (em que Δ% éster de esterol = % éster de esterol/estanol (enzima) - % éster de esterol/estanol (controlo) e Mv éster de esterol = peso molecular médio dos ésteres de esterol/estanol) - aplicável quando o aceitador de acilo é um esterol e/ou estanol; 52 Β = Δ% de éster de hidrato de carbono/Mv éster de hidrato de carbono (em que Δ % éster de hidrato de carbono = % éster de hidrato de carbono(enzima) - % éster de hidrato de carbono (controlo) e Mv éster de hidrato de carbono = peso molecular médio do éster de hidrato de carbono) - aplicável quando o aceitador de acilo é um hidrato de carbono; C = Δ % éster de proteína/Mv éster de proteína (em que Δ % éster de proteína = % éster de proteína(enzima) - % éster de proteína(controlo) e Mv éster de proteína = peso molecular médio do éster de proteína) - aplicável quando o aceitador de acilo é uma proteína; e D = valor absoluto de diglicérido e/ou monoglicérido/Mv di/monoglicérido (em que Δ % de diglicérido e/ou monoglicérido = % diglicérido e/ou monoglicérido (enzima) - % diglicérido e/ou monoglicérido (controlo) e Mv di/monoglicérido = peso molecular médio do diglicérido e/ou monoglicérido) - aplicável quando o aceitador de acilo é glicerol. A actividade de transferase é calculada como a percentagem da actividade enzimática total: A* + B* + C* + D* x 100 % de actividade de transferase A* + B* + C* + D* + Δ% ácido gordo/(Mv ácido gordo) * - eliminar como apropriado.
Se os ácidos gordos livres são aumentados no alimento eles são, de um modo preferido, aumentados não substancialmente, i. e., num grau significativo. Com isto significa, que o aumento no ácido gordo livre não afecta adversamente a qualidade do alimento. 53
Em alguns aspectos da presente invenção, o termo "sem aumentar substancialmente ácidos gordos livres", como aqui utilizado, significa que a quantidade de ácido gordo livre num alimento ou composição tratada com uma aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, é inferior à quantidade de ácido produzida no alimento ou composição quando uma enzima diferente de uma aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, foi utilizada, tal como, por exemplo, em comparação com a quantidade de ácido gordo livre produzida quando foi utilizada uma enzima de fosfolipase convencional, e. g.f LipopanF® (Novozymes A/S, Dinamarca). 0 termo "in situ", como aqui utilizado, significa que o(s) emulsificador(es) e/ou os ésteres de esterol/estanol e/ou o éster de hidratos de carbono e/ou o éster de proteínas e/ou os mono- ou diglicéridos são produzidos no alimento ou fracção do alimento. Isto contrasta com a situação em que o(s) emulsificador(es) e/ou os ésteres de esterol/estanol e/ou o éster de hidratos de carbono e/ou o éster de proteínas e/ou os mono- ou diglicéridos são produzidos separadamente do alimento e são adicionados como produtos formados no alimento durante a preparação do mesmo. Por outras palavras, o termo "in situ", como aqui utilizado, significa que por uma adição da enzima aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, a um alimento, ou aos ingredientes/materiais alimentares que constituem o alimento, um emulsificador e/ou um éster de esterol e/ou um éster de estanol e/ou um éster de hidrato de carbono e/ou um éster de proteína e/ou um mono- ou diglicérido pode ser produzido a partir de componentes do alimento. Adequadamente, os componentes do alimento podem ser substrato(s) para a enzima.
Se necessário, os componentes do alimento podem ser 54 suplementados através da adição de um ou mais outros componentes cujos outros componentes podem ser iguais aqueles presentes no alimento ou podem ser adicionais em relação aqueles componentes já presentes no alimento. Para evitar qualquer dúvida, numa forma de realização, o método, de acordo com a presente invenção, pode ser a método para a produção de um emulsificador e/ou um éster de esterol e/ou um éster de estanol e/ou um éster de hidrato de carbono e/ou um éster de proteína e/ou um mono- ou diglicérido in situ num alimento e não é um método para preparar um emulsif icador e/ou um éster de esterol e/ou um éster de estanol (por exemplo, está numa forma isolada e/ou purificada) para a adição subsequente a um alimento.
Noutra forma de realização, a aciltransferase de lipase pode ser utilizada durante o processamento do alimento, mas não permanece no alimento. Por exemplo, a aciltransferase de lipase pode ser imobilizada, permitindo que seja reutilizada.
De um modo preferido, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um esterol e/ou estanol e/ou um hidrato de carbono e/ou uma proteína e/ou glicerol quando presente num ambiente polar, de um modo preferido, num ambiente aquoso, de um modo preferido, um alimento contendo água. Adequadamente, o ambiente aquoso pode ser um tampão aquoso ou pode ser a fase aquosa num alimento. 0 termo "ambiente aquoso", como aqui utilizado, de um modo preferido, significa um ambiente em que está ausente um solvente orgânico, de um modo preferido, está ausente um solvente orgânico polar, de um modo mais preferido, em que está ausente um solvente orgânico não comestível. Em particular, o termo "ambiente aquoso" pode referir-se a um ambiente ao qual não foram adicionados solventes orgânicos 55 exógenos, de um modo preferido, sem solventes orgânicos polares. 0 termo solvente orgânico, como aqui utilizado, não engloba óleos alimentares, de um modo preferido, não engloba óleos alimentares que são elevados em lipidos não polares. Numa forma de realização, o termo solvente orgânico pode excluir solventes orgânicos comestíveis, tais como etanol, propilenoglicol e/ou glicerol. Adequadamente, o ambiente aquoso, de acordo com a presente invenção, pode compreender menos do que 80% em volume de solventes orgânicos, menos de 70% em volume de solventes orgânicos, menos de 50% em volume de solventes orgânicos, menos de 30% em volume de solventes orgânicos, de um modo mais preferido, menos de 15% em volume de solventes orgânicos, de um modo mais preferido, menos de 5%. Adequadamente, o alimento pode compreender entre 1 e 5% de solvente orgânico, por exemplo, etanol. Contudo, quando o alimento compreende um tal solvente orgânico, de um modo preferido, é produzido endogenamente no alimento. O mesmo é dizer, quando o alimento compreende um tal solvente orgânico, de um modo preferido, o solvente orgânico não é um solvente orgânico exógeno. O termo "alimento", como aqui utilizado, significa uma substância que é adequada para consumo humano e/ou animal.
Adequadamente, o termo "alimento", como aqui utilizado, pode significar um alimento numa forma que está pronta para o consumo. Alternativamente ou adicionalmente, contudo, o termo alimento, como aqui utilizado, pode significar um ou mais materiais alimentares que são utilizados na preparação de um alimento. Apenas a título de exemplo, o termo alimento engloba tanto bens cozidos produzidos a partir de massa como a massa utilizada na preparação dos referidos bens cozidos. 56 A presente invenção proporciona um alimento, como definido acima, em que o alimento é um produto de massa ou cozido incluindo um ou mais dos seguintes: pães, bolos, produtos de massa doce, massas folhadas, massas liquidas, queques, donuts, biscoitos, bolachas e bolinhos.
De um modo adequado, o alimento de acordo com a presente invenção pode ser um "alimento gourmet", incluindo bolos, pastelaria e semelhantes.
Num aspecto, o alimento de acordo com a presente invenção é um produto de massa ou um produto cozido, tal como um pão, um produto frito, uma merenda, bolos, empadas, bolos de chocolate, bolinhos, talharim, itens de lanche, tais como bolachas de água e sal, biscoitos, pretzels e batatas fritas e pasta. É também aqui divulgado um produto alimentar de origem vegetal, tal como farinhas, pré-misturas, óleos, gorduras, manteiga de cacau, leite em pó, temperos de saladas, margarina, cremes de barrar, manteiga de amendoim, gorduras vegetais, gelado, óleos de cozinha e um produto lácteo, incluindo manteiga, leite, creme, queijo, tal como queijos naturais, processados e imitações numa variedade de formas (incluindo em tiras, em bloco, em fatias ou raspado), queijo em creme, gelado, sobremesas congeladas, iogurte, bebidas de iogurte, gordura de manteiga, gordura de leite anidro, outros produtos lácteos. A enzima, de acordo com a presente invenção, pode melhorar a estabilidade da gordura em produtos lácteos.
Também se divulga um produto alimentar contendo ingredientes de origem animal, tais como produtos cárneos processados, óleos de cozinha, gordura vegetal. 57
Também se divulga uma bebida, um fruto, salada de frutas, um vegetal ou vinho. Em alguns casos, a bebida pode conter até 20 g/L de fitoesteróis adicionados. É ainda divulgada uma ração animal. A ração para animais pode ser enriquecida com fitosterol e/ou fitostanóis, de um modo preferido, com beta-sitosterol/estanol. De um modo adequado, a ração animal pode ser uma ração para aves de capoeira. 0 alimento de acordo com apresente invenção, é um alimento contendo água. Adequadamente o alimento pode compreender 10-98% de água, adequadamente, 14-98%, adequadamente 18-98% de água, adequadamente 20-98%, adequadamente 40-98%, adequadamente 50-98%, adequadamente 70-98%, adequadamente 75-98%.
Para alguns aspectos, de um modo preferido, o alimento de acordo com a presente invenção não é um óleo vegetal puro tal como azeite, óleo de girassol, óleo de amendoim, óleo de colza, por exemplo. Para evitar dúvidas, em alguns aspectos da presente invenção o alimento, de acordo com a presente invenção, pode compreender um óleo, mas, de um modo preferido, o alimento não é composto principalmente de óleo ou misturas de óleo. Para alguns aspectos, de um modo preferido, o alimento compreende menos de 95% de lípidos, de um modo preferido, menos de 90% de lípidos, de um modo preferido, menos de 85%, de um modo preferido, menos de 80% de lípidos. Assim, para alguns aspectos da presente invenção o óleo pode ser um componente do alimento, mas, de um modo preferido, o alimento não é um óleo per se.
Quando se dá o caso de um éster de hidrato de carbono ser produzido, de acordo com a presente invenção, o éster de hidrato 58 de carbono é, de um modo preferido, um éster de oligossacáarido, um éster de monossacárido ou um éster de dissacárido.
Adequadamente, o éster de hidrato de carbono quando produzido, de acordo com a presente invenção, pode ser um ou mais dos seguintes: éster de glucose, éster de frutose, éster de anidrofrutose, éster de maltose, éster de lactose, éster de galactose, éster de xilose, xilo-oligossacárido, éster de arabinose, éster de malto-oligossacárido, éster de tagatose, éster de sacarose, éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T ou éster de cortalcerona.
De um modo preferido, o éster de hidrato de carbono quando produzido, de acordo com a presente invenção, é um ou mais dos seguintes: um mono-éster de hidrato de carbono mono-éster, mono-éster de açúcar, mono-éster de oligossacárido, um mono-éster de trissacárido, mono-éster de dissacárido, um mono-éster de monossacárido, um mono-éster de glucose, um mono-éster de frutose, mono-éster de anidrofrutose, mono-éster de maltose, mono-éster de lactose, mono-éster de galactose, mono-éster de xilose, mono-éster de xilo-oligossacárido, mono-éster de arabinose, mono-éster de malto-oligossacárido, mono-éster de tagatose, mono-éster de sacarose, éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T ou éster de cortalcerona.
Numa forma de realização, o éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T e/ou éster de cortalcerona podem funcionar como um agente antimicrobiano. Alternativamente, ou adicionalmente a isto, o éster de microtecina, éster de ascopirona P, éster de ascopirona T e/ou éster de cortalcerona podem funcionar como um ou ambos de um antioxidante e/ou emulsificador. 59
De um modo preferido, a formação do éster de hidrato de carbono (se existir), de acordo com a presente invenção, é independente da UDP-glucose.
De um modo preferido, o alimento, de acordo com a presente invenção, não compreende UDP-glucose, ou compreende apenas UDP-glucose em quantidades insignificantes.
Adequadamente, o emulsificador, de acordo com a presente invenção, pode ser, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um diglicérido, um monoglicérido, tais como 1-monoglicérido ou uma lisolecitina, tais como lisofosfatidilcolina por exemplo, um digalactosil monoglicérido (DGMG). 0 emulsificador é, de um modo preferido, produzido a partir do dador de acilo de lipido após remoção de um ou mais grupos acilo do referido dador de acilo de lipido. 0 termo lisolecitina, como aqui utilizado, engloba lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidil-inositol, lisofosfatidilserina e lisofosfatidilglicerol.
Quando um dos emulsificadores é um éster de hidrato de carbono, o segundo emulsificador pode ser, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um diglicérido, um monoglicérido, tais como 1-monoglicérido, lisofosfatidilcolina, ou monoglicérido de digalactosilo (DGMG). 0 segundo emulsificador é, de um modo preferido, produzido a partir do dador de acilo de lipido após remoção de um ou mais grupos acilo do referido dador de acilo de lipido. 0 termo lisofosfatidilcolina como aqui utilizado é sinónimo do termo lisolecitina e estes termos podem ser aqui utilizados indistintamente. 60
De um modo preferido, o segundo emulsificador é DGMG. Adequadamente, o DGMG é produzido in situ pela remoção de um grupo acilo de DGDG com a transferência do grupo acilo removido para um hidrato de carbono para formar um éster de hidrato de carbono.
Quando um dos emulsificadores é um éster de proteína e/ou um diglicérido e/ou um monoglicérido, o segundo emulsificador pode ser, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um diglicérido, um monoglicérido, tal como 1-monoglicérido, lisofosfatidilcolina, ou monoglicérido de digalactosilo (DGMG). 0 segundo emulsificador é, de um modo preferido, produzido a partir do dador de acilo de lípido após remoção de um ou mais grupos acilo do referido dador de acilo de lípido. 0 termo lisofosfatidilcolina, como aqui utilizado, é sinónimo do termo lisolecitina e estes termos podem ser aqui utilizados indistintamente.
Numa forma de realização, a aciltransferase de lipido da invenção pode ser utilizado num processo para a preparação de um alimento, tais como um óleo de cozinha, margarina ou creme de barrar, no qual o alimento contém naturalmente, ou foi suplementada com, glicerol, pelo menos, um fosfolípido (por exemplo, lecitina) e/ou glicolípido (por exemplo, digalactosildiglicérido), e opcionalmente um fitosterol ou fitostanol.
Quando utilizado como um óleo de cozinha ou margarina, o alimento pode possuir propriedades anti-espalhamento aumentadas. Adicionalmente ou alternativamente o alimento pode possuir uma ou mais propriedades técnicas benéficas, por exemplo, 61 estabilidade oxidativa melhorada, propriedades de emulsificação melhorada ou benefícios para a saúde. A aciltransferase de lípido da invenção pode estar na preparação de alimentos com baixo teor em gordura, tais como cremes de barrar com baixo teor em gordura, temperos de salada com baixo teor em gordura, maionese com baixo teor em gordura, margarinas com baixo teor em gordura, etc. Nesses produtos alimentares com baixo teor em gordura, o conteúdo em gordura é, tipicamente, reduzido através da adição de emulsificadores e água adicional, comparado com o equivalente com teor em gordura mais elevado.
Verificou-se que as transferases de acilo de lípido utilizadas nas composições e métodos da invenção possuem propriedades únicas quando comparadas com enzimas lipolíticas nas quais possuem uma preferência acentuada para a transferência de grupos acilo dos lípidos para aceitadores diferentes de água, mesmo na presença de água significativa. Numa comparação com enzimas da técnica anterior, verificou-se que a aciltransferase de lípido utilizada na invenção possui uma actividade de transferase relativa elevada na presença de 6% de água, 54% de água, 73% de água, 89% de água e, aproximadamente, 95%. As enzimas lipolíticas testadas não tiveram virtualmente nenhuma actividade de transferase relativa significativa nestas concentrações de água. A actividade de lipase e aciltransferase de uma enzima pode ser avaliada utilizando os seguintes ensaios. Deste modo, a aciltransferase de lípido que possui as características de enzima aqui definidas pode ser obtida/identifiçada. 62
Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado (ver Exemplo 12)
Enzimas, que funcionam como aciltransferases de lípido para utilização nas composições e métodos da invenção, podem ser identificadas de rotina utilizando o ensaio aqui ensinado no Exemplo 12. Este ensaio será de aqui em diante referido como o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado". No Exemplo 12 a enzima aciltransferase de lípido de Aeromonas salmonicida, de acordo com a presente invenção, foi analisada e comparada com uma gama de enzimas lipolíticas não englobadas pela presente invenção. Como pode ser observado, das enzimas lipolíticas apenas LIPOPAN® F (Novozymes, Dinamarca) demonstrou possuir qualquer actividade de transferase e, mesmo assim, apenas a um nível muito baixo (1,3%).
As enzimas adequadas para utilização nas composições e métodos da invenção podem ser identificadas de rotina utilizando o Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado. Utilizando este ensaio, no qual existe um teor em água muito elevado aproximadamente 95%, aciltransferases de lípido, de acordo com a presente invenção, são aqueles que possuem, pelo menos, 2% de actividade de aciltransferase (actividade de transferase relativa), de um modo preferido, pelo menos, 5% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 10% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 15%, 20%, 25% 26%, 28%, 30%, 40% 50%, 60% ou 75% actividade de transferase relativa. Adequadamente, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode possuir menos do que 28%, menos do que 30%, de um modo 63 preferido, menos do que 40%, 50%, actividade de aciltransferase. 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de
Ensaio de Transferase em gema de ovo com elevado teor em água (ver Exemplo 11)
Adicionalmente a utilizar o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" (ver acima), uma aciltransferase de lípido, para utilização, de acordo com a presente invenção, pode ser identificada utilizando o "Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água" ensinado no Exemplo 11.
Numa forma de realização, a aciltransferase de lípido adequada para utilização nos métodos e/ou composições, de acordo com a presente invenção, é aquela que, quando testada utilizando o Ensaio de Transferase em Gema de Ovo em Teor de Água Elevado numa gema de ovo com 54% de água, possui até 100% de actividade de transferase relativa. Na verdade, as experiências em gema de ovo com teor de água elevado demonstraram que no início da experiência a taxa de transferase inicial foi calculada como sendo 100% de actividade de transferase, i. e., sem actividade hidrolítica observada. Em contraste, as enzimas lipolíticas, enzimas utilizadas como controlo, i. e., LIPOPAN® F e fosfolipase A2, não apresentaram actividade de transferase detectável em gema de ovo com 54% de água, ou gema de ovo com conteúdo enriquecido em água (nomeadamente gema de ovo com 73% de água ou 89% de água) ., de um modo preferido, o aumento no teor de água não diminui significativamente a percentagem de actividade de aciltransferase de uma aciltransferase de lípido para utilização nos métodos ou composições de acordo com a presente invenção. 64
Numa forma de realização preferida, em relação ao Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água, com um conteúdo em água de 54%, a aciltransf erase de lípido para utilização na presente invenção possuirá uma percentagem de actividade de aciltransferase inicial (actividade de transferase inicial relativa) medida após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolipido) de, pelo menos, 0,1% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 1% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 5% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 10% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 20% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 30% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 40% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 50% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 60%, de um modo preferido, pelo menos, 70%, de um modo preferido, pelo menos, 80%, de um modo preferido, pelo menos, 90%, de um modo preferido, pelo menos, 95%, de um modo preferido, pelo menos, 99%, de um modo preferido, cerca de 100% de actividade de aciltransferase.
Numa forma de realização preferida, com referência ao Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água, com um teor em água de 54%, e medido após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolipido), uma aciltransferase de lipido para utilização nas composições e métodos da invenção possui actividade de transferase detectável, i. e., actividade de transferase relativa entre 0,1 e 100%, de um modo preferido, pelo menos, 1% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 5% de actividade de transferase relativa, de um modo 65 preferido, pelo menos, 10% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 20% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 30% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 40% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de actividade de transferase relativa. Adequadamente, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode possuir, quando de utiliza o Ensaio de Transferase em Gema de Ovo em Teor de Água Elevado com 54% de teor em água e medido após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolípido), uma percentagem de actividade de aciltransferase (actividade de transferase relativa) inferior a 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%.
Numa forma de realização preferida, com referência ao Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água, com a teor em água de 73%, medido após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolipido), a aciltransferase de lípido para utilização nas composições e métodos da invenção possui actividade de transferase detectável, i. e., actividade de transferase relativa entre 0,1 e 100%, de um modo preferido, pelo menos, 1% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 5% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 10% da actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 20% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 30% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 40% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 45%, 50%, 58%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de actividade de transferase relativa. Adequadamente, a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, 6 6 pode possuir, quando se utiliza o Ensaio de Transferase em Gema de Ovo em Teor de Água Elevado com 73% de teor em água e medido após 10% do consumo da molécula dadora (i. e., fosfolipidos), uma percentagem actividade de aciltransferase (actividade de transferase relativa) inferior a 45%, 47%, 50%, 58%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%.
Numa forma de realização preferida, em relação ao Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água, com um teor em água de 89% e medido após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolipido), a aciltransferase de lipido para utilização nas composições e métodos da invenção possui actividade de transferase detectável, i. e., actividade de transferase relativa entre 0,1 e 100%, de um modo preferido, pelo menos, 1% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 5% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 10% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 20% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 30% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 40% de actividade de transferase relativa, de um modo preferido, pelo menos, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de actividade de transferase relativa. Adequadamente, a aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode possuir, quando se utiliza o Ensaio de Transferase em Gema de Ovo em Teor de Água Elevado com 89% de teor em água e medido após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolipido), uma percentagem de actividade de aciltransferase (actividade de transferase relativa) inferior a 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. 67
Numa forma de realização preferida, em relação ao Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água, a aciltransferase de lipido para utilização nas composições e métodos da invenção possui actividade de transferase relativa significativa (i. e., pelo menos, 0,1% em ambos os teores de água) e possui uma actividade de transferase relativa equivalente em gema de ovo com um teor em água de 54% como numa gema de ovo com um teor em água de 73%, quando medido após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolípido).
Numa forma de realização preferida, em relação ao Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água, a aciltransf erase de lipido para utilização nas composições e métodos da invenção possui actividade de transferase relativa significativa (i. e., pelo menos, 0,1% em ambos os teores em água) e possui uma actividade de transferase relativa equivalente em gema de ovo com um teor em água de 54% como numa gema de ovo com um teor em água de 89%, quando medido após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolípido).
Numa forma de realização preferida, em relação ao Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água, a aciltransf erase de lipido para utilização nas composições e métodos da invenção possui actividade de transferase relativa significativa (i. e., pelo menos, 0,1% em ambos os teores em água) e possui uma actividade de transferase relativa equivalente em gema de ovo com um teor em água de 73% como numa gema de ovo com um teor em água de 89%, quando medido após 10% de consumo da molécula dadora (i. e., fosfolípido). O termo "actividade de transferase relativa equivalente" como aqui referido, significa que a enzima possui uma actividade 68 de transferase relativa (% de actividade de aciltransferase) que é, pelo menos, 2% inferior, de um modo preferido, pelo menos, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% inferior, na gema de ovo com o teor em água superior, em comparação com o da gema de ovo com o teor em água inferior.
Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água
Além de utilizar o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" e, como uma alternativa (ou além de) utilizar o "Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água", aciltransferases de lípido para utilização de acordo com a presente invenção podem ser identificada utilizando o "Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água".
De modo a determinar se uma enzima é uma aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode realizar-se o "Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água", nomeadamente num ambiente oleoso com 6% de água, como se ensinou no
Exemplo 22. Este exemplo ilustra que, num ambiente oleoso com 6% de teor em água, a aciltransferase de lípido da invenção possui uma actividade de transferase relativa elevada, em que as enzimas lipolíticas da técnica anterior possuem actividade hidrolítica.
Numa forma de realização, a aciltransferase de lípido adequada para utilização nos métodos e/ou composições, de acordo com a presente invenção, é uma que, quando testada utilizando o "Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água", medido após um período de tempo seleccionado de 30, 20 ou 120 minutos, possui a actividade de transferase relativa de, pelo menos, 1%, 69 de um modo preferido, pelo menos, 2%, de um modo preferido, pelo menos, 5%, de um modo preferido, pelo menos, 10%, de um modo preferido, pelo menos, 20%, de um modo preferido, pelo menos, 30%, de um modo preferido, pelo menos, 40%, de um modo preferido, pelo menos, 50%, de um modo preferido, pelo menos, 60%, de um modo preferido, pelo menos, 70%, de um modo preferido, pelo menos, 75%. Adequadamente, a aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, pode possuir menos de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ou 80% de actividade quando medido após um período de tempo de 10, 20, 30 ou 120 minutos utilizando o "Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água".
Como descrito acima, a aciltransferase de lipase da invenção pode ser identificada utilizando quer o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" ou no "Ensaio de Transferase em Ambiente de Água Baixo" utilizando colesterol como o aceitador de acilo. Claramente, o especialista na técnica estará rapidamente alertado para, com ajustes óbvios para os métodos analíticos o "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" ou o "Ensaio de Transferase em Ambiente de Água Baixo" pode ser utilizado para determinar a actividade de aciltransferase de lipido para qualquer dador de acilo de lipido ou qualquer combinação de aceitador de acilo. O especialista na técnica iria, se necessário, simplesmente substituir o substrato de dador de acilo (e. g., fosfolípido) com um substrato de dador de acilo alternativo (e. g., glicolípido, triacilglicérido) e/ou substituir o aceitador de acilo (e. g., colesterol) com um aceitador de acilo de substrato alternativo (e. g., um hidrato de carbono, uma proteína, outro esterol, um estanol ou glicerol) . 70 0 termo "elevado em água" como aqui utilizado significa qualquer substrato ou alimento com mais do que 2% de conteúdo em água, de um modo preferido mais do que 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%. 0 termo "baixo em água" como aqui utilizado significa qualquer substrato ou alimento com menos de 6% de conteúdo em água, de um modo preferido, inferior a 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou 0,5%.
De um modo preferido, o método e/ou utilização, de acordo com a presente invenção, pode ser realizado, por exemplo, em alimento a uma temperatura de 15-60 °C, de um modo preferido, a uma temperatura de 20-60 °C, de um modo preferido, 20-50 °C, de um modo preferido, 20-45 °C, de um modo preferido, 20-40 °C. Para alguns aspectos, por exemplo, em massa, de um modo preferido, a temperatura do alimento durante a qual a reacção de aciltransferase ocorre está entre 20 e 40 °C. Para outros aspectos, por exemplo, em relação a produtos lácteos, tais como queijo, a temperatura do alimento pode estar adequadamente entre 30 °C e 60 °C. Ainda noutros aspectos, por exemplo, em relação a maionese, a temperatura do alimento pode estar adequadamente entre 20 e 40 °C, de um modo mais preferido, entre 25 e 30 °C.
De um modo preferido, o emulsificador, produzido de acordo com a presente invenção, compreende menos de 5% em peso do alimento.
De um modo preferido, o emulsificador, produzido de acordo com a presente invenção, compreende desde 0,01 até 4% em peso do alimento. 71
De um modo preferido, o emulsificador, produzido de acordo com a presente invenção, compreende desde 0,01 até 2% em peso do alimento.
De um modo preferido, o emulsificador, produzido de acordo com a presente invenção, compreende desde 0,01 até 1% em peso do alimento.
De um modo preferido, o emulsificador, produzido de acordo com a presente invenção, compreende desde 0,01 até 0,5% em peso do alimento.
De um modo preferido, o emulsificador, produzido de acordo com a presente invenção, compreende desde 0,1 até 0,3% em peso do alimento.
Adequadamente, o método, de acordo com a presente invenção, inclui inactivar ou desnaturar a enzima para proporcionar um alimento compreendendo a enzima numa forma inactiva ou desnaturada. Adequadamente, a enzima pode ser desnaturada quer por cozedura ou por pasteurização. A presente invenção pode compreender, ainda, a utilização de uma aciltransferase de lípido como aqui definido em composições enzimáticas de alimentos e/ou rações, e pode englobar composições enzimáticas de alimentos e/ou rações compreendendo uma aciltransferase de lípido como aqui definido. Essas composições podem conter uma ou mais enzimas adicionais, tais como aquelas aqui listadas. Alternativamente, a composição enzimática da invenção pode ser utilizada em combinação com outros ingredientes/aditivos alimentares, tais como aqueles aqui listados, incluindo outras composições enzimáticas. Através da 72 formulação da aciltransferase de lípido da invenção numa composição de alimento e/ou ração, a enzima pode ser estabilizada para permitir armazenamento prolongado (em condições adequadas) antes da utilização na produção de alimentos e/ou rações. Adicionalmente, a composição enzimática da presente invenção proporciona a enzima numa forma adequada para utilização segura para a aplicação "in situ" na preparação de alimentos e/ou rações ou de ingredientes para utilização na preparação de alimentos e/ou rações. Essas composições podem estar na forma liquida, semilíquida ou sólida/granular. A composição enzimática alimentar pode ser adequadamente uma composição de melhoramento de massa. A composição de melhoramento de massa pode compreender outros componentes benéficos, tais como um emulsificador e/ou outras enzimas como aqui listadas.
As enzimas alimentares são vendidas como concentrados líquidos estabilizados ou como partículas sólidas. A formulação numa composição enzimática alimentar minimiza perdas na actividade enzimática durante o transporte, armazenamento e utilização. As enzimas são frequentemente expostas a humidade, calor ou ambientes oxidativos no processamento de alimentos e bebidas. As formulações aumentam a estabilidade contrariando as forces de desactivação primárias: desnaturação, desactivação do sitio catalítico, e proteólise. A desnaturação ocorre através do desdobrar físico a estrutura proteica terciária de uma enzima sob stress térmico ou químico. Assim que uma enzima começa a desdobrar, torna-se dramaticamente mais vulnerável à desactivação e proteólise. Para minimizar o desdobrar, o formulador pode alterar o ambiente da proteína de modo a induzir uma estrutura de proteína compacta; isto é realizado mais 73 de água da eficazmente através da "exclusão preferencial" superfície da proteína através da adição de compostos associados à água, tais como açúcares, álcoois poli-hídricos e sais liotrópicos. Os melhores modos para combater a inactivação do sítio activo são assegurar níveis suficientes de quaisquer co-factores necessários, adicionar inibidores reversíveis e excluir espécies oxidantes ou reactivas da formulação.
Além da estabilidade enzimática, uma formulação deve cumprir vários requisitos chave secundários, incluindo a conservação contra contaminação microbiana, evitar a precipitação física ou formação de névoa, minimizar a formação de poeiras de sensibilização ou aerossóis e a optimização de critérios estéticos tais como cor e odor. Muitos destes problemas são melhor abordados focando tão "a montante" quanto possível, incluindo a escolha de materiais brutos no processo de fermentação ou recuperação de enzima. As operações a jusante, tais como diafiltração, adsorção, cromatografia, cristalização, e extracção podem ser utilizadas para remover impurezas responsáveis pela cor, odor e precipitação. 0 risco de precipitação física é minimizado pela formulação próximo do ponto isoeléctrico da enzima com solventes hidrofílicos tais como glicerol ou propilenoglicol. Pode também adicionar-se eficazmente níveis moderados de sais de solvatação para evitar quer precipitação salina ou "dissolução reversa". Para evitar a contaminação microbiana, pode utilizar-se uma combinação de filtração, acidificação, e a minimização de água livre; os biocidas podem ser eficazes, mas a gama de produtos químicos aceitáveis para controlar ou matar micróbios está crescentemente circunscrito por regulamentações de saúde e segurança. 74
Dois processos que produzem os grânulos mais resistentes ao atrito até à data são a granulação de alto cisalhamento e revestimento por aspersão de leito fluidizado, ver, por exemplo, T. Becker: "Separation and Purification Processes for Recovery of Industrial Enzymes" em R. K. Singh, S. S. H. Rizvi (eds.) : Bioseparation Processes in Foods, Mareei Dekker, Nova Iorque, pp. 427 - 445. Estes processos utilizam vários ligantes, revestimentos e morfologias de partícula para produzir partículas não friáveis, que ainda protegem as enzimas durante o armazenamento, mas permitem a sua rápida libertação em solução durante a utilização.
Composições enzimáticas alimentares contendo a aciltransferase de lípido da invenção podem ser realizadas utilizando técnicas de formulação convencionais, tais como secagem por aspersão ou formulação líquida.
A aciltransferase de lípido da invenção pode ser expressa em qualquer hospedeiro de expressão adequado. Por exemplo, a aciltransferase de lípido da invenção pode ser expressa em Bacillus subtilis e pode ser purificada por ultrafiltração e/ou por precipitação em etanol e/ou centrifugação, e pode ser subsequentemente seca por aspersão utilizando amido (maltodextrina) como veículo para a enzima. A enzima seca por aspersão pode ser padronizada para a actividade de PLU especificada através da adição de mais veiculo na forma de pó. As técnicas envolvidas estão bem estabelecidas e são de rotina na técnica.
Alternativamente, a aciltransferase de lípido, para utilização de acordo com a presente invenção, por exemplo, a aciltransferase de lípido produzida heterologamente da invenção, 75 uma vez purificada, pode ser estabilizada numa formulação liquida adequada, tal como aquelas baseadas em glicerol. Outros métodos de produzir formulações de enzima estabilizada são descritas nos documentos EP 0770037 e EP 0702712. A aciltransferase na forma de pó também pode ser utilizada em combinação com outras enzimas como aqui listado, para a produção de composições enzimáticas com actividade definida de acordo com a especificação do produto.
Tipicamente, a dosagem da formulação enzimática alimentar está entre 10 g e 1000 g por 1000 kg de alimento, de um modo preferido, 50-200 g por 1000 kg de alimento, de um modo preferido, 75-125 g por 1000 kg de alimento.
De um modo preferido, a enzima, de acordo com a presente invenção, está presente numa forma inactiva ou numa forma de alimento desnaturado.
Numa forma de realização, a enzima, de acordo com a presente invenção, é, de um modo preferido, não imobilizada, em particular, não está imobilizada num suporte sólido.
Numa forma de realização alternativa, a enzima pode ser imobilizada. A aciltransferase de lipido imobilizada pode ser preparada utilizando técnicas de imobilização conhecidas na técnica. Existem vários métodos de preparação de enzimas imobilizadas, que serão óbvias para um especialista na técnica (por exemplo, as técnicas referidas no documento EP 0746608; ou Balcao VM,
Paiva AL, Malcata FX., Enzyme Microb Technol. 1996 May 76 1; 18 (6) : 392-416; ou Reetz MT, Jaeger KE. Chem Phys Lipids. 1998 Jun;93(1-2):3-14; ou Bornscheuer UT, Bessler C, Srinivas R, Krishna SH. Trends Biotechnol. 2002 Out; 20(10):433-7.
Numa forma de realização, o alimento da invenção pode conter ingredientes alimentares, que foram preparados utilizando aciltransferase de lípido imobilizada, mas não contêm a aciltransferase de lípido no ingrediente alimentar ou alimento. Por exemplo, o alimento pode conter um ou mais dos seguintes: um emulsificador, mais do que um emulsificador, um ou mais agentes aromatizantes, um ou mais intensificadores de textura e/ou um ou mais ésteres de esterol, tais como ésteres de fitosterol ou ésteres de fitostanol. A enzima, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada com um ou mais emulsificadores convencionais, incluindo por exemplo, monoglicéridos, ésteres de ácido tartárico de diacetilo de mono- e diglicéridos de ácidos gordos e lecitinas, e. g., obtidas a partir de soja. A enzima, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada com uma ou mais outras enzimas de grau adequado para alimentos. Assim, está dentro do âmbito da presente invenção que, adicionalmente à enzima da invenção, pelo menos, uma outra enzima é adicionada ao alimento. Essas outras enzimas incluem enzimas de degradação de amido, tais como endo- ou exoamilases, pululanases, enzimas de desramificação, hemicelulases incluindo xilanases, celulases, lipases, fosfolipases e proteases. A enzima, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada com uma ou mais outras enzimas de grau adequado para alimentos. Assim, está dentro do âmbito da presente invenção que, adicionalmente à enzima da invenção, pelo menos, uma outra 77 enzima é adicionada ao alimento. Essas outras enzimas incluem enzimas de degradação de amido, tais como endo ou exoamilases, pululanases, enzimas de desramificação, hemicelulases incluindo xilanases, celulases, oxido-redutases, e. g., glucose oxidase, piranose oxidase, oxidase de sulfidrilo ou uma oxidase de hidrato de carbono, tal como uma que oxide maltose, por exemplo, hexose oxidase (HOX), lipases, fosfolipases e hexose oxidase e proteases.
Numa forma de realização preferida, a aciltransferase de lipido é utilizada em combinação com a lipase que possui uma ou mais das seguintes actividades de lipase: actividade de glicolipase (E.C. 3.1.1.26, actividade de lipase de triacilglicerol (E.C. 3.1.1.3), actividade de fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4) ou actividade de fosfolipase AI (E.C. 3.1.1.32). adequadamente, as enzimas lipase são bem conhecidas na técnica e incluem, a título de exemplo as seguintes lipases: LIPOPAN® F e/ou LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca), fosfolipase A2 (e. g.r fosfolipase A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts, LIPOMAX™ de Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Dinamarca), as lipases reveladas nos documentos WO03/97835, EP 0977869 ou EP 1193314. Esta combinação da aciltransferase de lipido como aqui definido e uma lipase pode ser particularmente preferida em produtos de massa ou cozidos ou em produtos alimentares finos, tais como bolos e confeitaria. A utilização de lipases em combinação com a enzima da invenção pode ser particularmente vantajosa nos casos em que pode ser desejável alguma acumulação de ácidos gordos livres, por exemplo, em queijo onde os ácidos gordos livres podem transmitir um sabor desejável, ou na preparação de alimentos será capaz de combinar finos. O especialista na técnica 78 proporções de enzimas lipolíticas, por exemplo, LIPOPAN® F e/ou LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca), fosfolipase A2 (e. g., fosfolipase A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts, LIPOMAX™ de Genecor), LIPOLASE ® (Novozymes A/S, Dinamarca), as lipases reveladas dos documentos WO03/97835, EP 0977869 ou EP 1193314 e a aciltransferase de lipido da presente invenção para proporcionar a proporção desejada de actividade hidrolitica para transferase que resulta num efeito técnico preferido, ou combinação de efeitos técnicos no alimento (tais como aqueles aqui listados em "Efeitos Técnicos").
Tradicionalmente, a indústria de bolos utiliza melhoradores de bolo para a produção de bolos e para garantir bolos de qualidade elevada em termos de sabor, estrutura, qualidade de alimentação e aspecto. Estes melhoradores de bolo são, normalmente, baseados em emulsificadores secos por aspersão num veículo como amido e maltodextrina. Alguns melhoradores de bolo estão também numa forma de gel baseada em emulsificadores, açúcares e água. Estes melhoradores de bolo são muito importantes para a indústria de bolos, de modo a produzir bolos de elevada qualidade. Os melhoradores de bolos, contudo, contêm emulsificadores e outros ingredientes "não naturais" com um E-número. Devido à procura, por parte dos consumidores, para reduzir os números de E-números, a indústria dos bolos solicitou modos alternativos para produzir bolos de elevada qualidade sem utilizar emulsificadores.
Um modo alternativo para produzir bolo é utilizar uma enzima, i. e., uma aciltransf erase de lipido aqui definida ou uma composição enzimática de acordo com a presente invenção. 79 A aciltransferase de lípido, como aqui definido, e/ou a composição enzimática alimentar da presente invenção pode ser utilizada nas preparações de um alimento fino, tal como um bolo. Nesses casos, podem ser formados os seguintes constituintes no alimento fino: i) ésteres de açúcar e lisolecitina (a partir do hidrato de carbono na receita do bolo e a lecitina no ovo que também formam parte da receita do bolo); e/ou ii) péptidos acilados e lisolecitina (através da transferência de um ácido gordo de lecitina para uma proteína ou péptido durante a formação de condensados de proteína-ácido gordo, que são conhecidos por serem emulsificadores altamente eficientes (Herstellung und Anvendungmõglichkeiten von Eiweiss-
Fettsàurekondensaten. Andreas Sander, Eberhard Eilers, Andrea Heilemann, Edith von Kreis.Fett/lipid 99 (1997) N° 4, 115-120) .
Considera-se que,na produção de alguns alimentos finos, particularmente alimentos finos ricos em gordura, tais como bolos, pode ser desejável ter alguma acumulação de ácidos gordos. Por isso, a combinação da utilização de enzimas lipoliticas e a aciltransferase de lípido, como aqui definido, pode ser particularmente benéfica para a produção de alimentos finos ricos em gordura. Alternativamente, podem ser seleccionados ácidos gordos livres adicionais ou sabão de ácido gordo (E470a) e utilizados em combinação com a aciltransferase de lípido. O alimento, de acordo com a presente invenção, pode compreender adequadamente um ou mais dos seguintes aditivos: 80 material de proteína de soja; carotenóides, flavonóides, antioxidantes e fitoquímicos (especialmente antocianonida, carotenóide, bioflavinóide, glutationa, catequina, isoflavona, licopeno, ginsenósido, picnogenol, alcaloide, fitosterol pigeum, sulforafona, resveretol, extracto de sementes de uva ou alimentos contendo ésteres de estanol), vitamina (especialmente vitamina C, vitamina A, vitamina B3, vitamina D, vitamina E, tiamina, riboflavina, niacina, piridoxina, cianocobalamina, ácido fólico, biotina, ácido pantoténico ou vitamina K) , minerais (especialmente cálcio, iodo, magnésio, zinco, ferro, selénio, manganês, crómio, cobre, cobalto, molibdénio ou fósforo), ácido gordo (especialmente ácido gama-linoleico, ácido ucospentaenóico ou ácido decosa-hexaenóico), óleo (especialmente óleo de borragem, óleo de canola com elevado teor em carotenóides ou óleo de semente de linho), aminoácidos (especialmente triptofano, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, valina, leucina, isoleucina, alanina, arginina, ácido aspártico, cistina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, prolina, hidroxiprolina, serina, taurina ou tirosina), enzima (especialmente bromelaína, papaína, amilase, celulase ou coenzima Q) , lenhina, éster de estanol ou bactérias amigáveis (especialmente Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus plantarum ou Streptococcus faecium), ácido fólico, e fibra solúvel.
EFEITO TÉCNICO
Surpreendentemente, as aciltransferases de lípido possuem actividade de aciltransferase significativa em alimentos. Esta 81 actividade tem aplicações surpreendentemente benéficas em métodos para preparação de alimentos. A presente invenção baseia-se na verificação surpreendente que a aciltransferase de lipidos, de acordo com a presente invenção, pode realizar esterificação de hidratos de carbono através de alcoólise, i. e., acil transferência de um lipido, num alimento com um teor em água significativo. A técnica anterior sugere que essas enzimas, se funcionassem de todo deste modo, funcionariam apenas num ambiente de solvente (i. e., em ambientes com teor em água baixo ou nulo). A presente invenção pode proporcionar um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados em produtos de ovo, particularmente maionese: uma estabilidade melhorada ao calor durante a pasteurização; propriedades organoléticas melhoradas, uma consistência melhorada. A presente invenção pode proporcionar um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados em massa e/ou produtos cozidos: um volume especifico melhorado da massa ou dos produtos cozidos (por exemplo, pão e/ou bolo); uma estabilidade melhorada da massa; um índice melhorado da crosta (por exemplo, uma crosta do pão mais fina e/ou estaladiça), um índice de miolo melhorado (por exemplo, uma distribuição de miolo mais homogéneo e/ou uma estrutura de miolo mais fino e/ou um miolo mais macio); um aspecto melhorado (por exemplo, uma superfície lisa sem bolhas ou buracos ou substancialmente sem bolhas ou buracos); um endurecimento reduzido; uma maior suavidade; um odor melhorado; um sabor melhorado. 82 A presente invenção pode proporcionar um efeito benéfico a partir da formação de materiais altamente activos na superfície num alimento sem formação de quantidades substanciais de ácidos gordos livres, que reduzem a capacidade do alimento para oxidar após armazenamento, porque os ácidos gordos livres são mais susceptíveis à oxidação do que os ésteres de ácido gordo correspondentes. Adequadamente, a presente invenção pode proporcionar um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados num alimento: um aspecto melhorado, uma sensação na boca melhorada, uma estabilidade melhorada, em particular uma estabilidade térmica melhorada, um sabor melhorado, uma suavidade melhorada, uma resistência melhorada, uma emulsificação melhorada.
Adequadamente, a presente invenção pode proporcionar um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados em produtos lácteos, tal como gelados, por exemplo: uma sensação na boca melhorada (de um modo preferido, uma sensação na boca mais cremosa); um gosto melhorado; uma fusão melhorada.
Adequadamente, a presente invenção pode proporcionar um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados em ovo ou em produtos lácteos: estabilidade de emulsão melhorada; estabilidade térmica da emulsão; sabor melhorado; redução do mau odor; propriedades de espessamento melhoradas, consistência melhorada.
Efeitos técnicos específicos associados à utilização de uma aciltransferase de lípido como aqui definido na preparação de um alimento estão listados na tabela abaixo: 83
Alimento Efeito 1 Pão, Queques e Donuts Fortalece a massa e aumenta a resistência mecânica e aumenta a capacidade de absorção de água. Aumenta o volume dos produtos cozidos e mantém a suavidade do miolo 2 Massa congelada Previne que se estrague durante a refrigeração 3 Pão-de-ló Provoca um bom volume de bolo e uma textura macia uniforme 4 Biscoitos, bolachas e bolinhos Provoca emulsões estáveis da gordura e evita que se agarre à máquina. Evita o transbordar de produtos ricos em gordura 5 Massa e farinha de rosca Melhora a textura de produtos fritos. 6 Talharim Evita que a massa se agarre à máquina. Aumenta o teor em água e diminui a perda por cozedura. 7 Talharim instantâneo Evita que as massas adiram umas às outras 8 Macarrão Amaciador de massa, evita a adesão durante a cozedura 9 Creme de custarda Torna a pasta de amido com uma textura lisa e cremosa e evita a desidratação. 10 Leite em pó para café Evite a separação de óleo e água 11 Creme de leite fresco Proporciona uma emulsão estável 84 (continuação)
Alimento Efeito 12 Chocolate Evita ou reduz o transbordar 13 Caramelo, rebuçados e nogat Melhora a emulsificação de açúcar derretido e óleo. Evita a separação do óleo. 14 Carne processada, salsichas Melhora a capacidade de retenção da água das salsichas e fiambre e evita a separação da fase oleosa de massas e patê
Adequadamente, a presente invenção pode proporcionar um ou mais dos seguintes efeitos técnicos inesperados no queijo: uma diminuição no efeito de perda de óleo no queijo; um aumento no rendimento do queijo; um melhoramento no sabor; uma redução do mau odor; um sabor "a ranço" reduzido.
Na produção de alimentos, em particular, na produção de queijo, a utilização da aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, proporciona uma vantagem significativa na capacidade de recuperar proteínas solúveis a partir de produtos lácteos. Por exemplo, na produção de queijo quase 20% da proteína total do leite é removida no soro de leite coalhado (i. e., a parte aquosa do leite que permanece após a formação das coalhadas). O soro de leite coalhado compreende as proteínas solúveis do leite, enquanto que as proteínas hidrofóbicas são mantidas na coalhada. Através da utilização da aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, é possível transferir um grupo acilo de um lípido (de um modo preferido, de um glicolípido ou um fosfolípido), para uma proteína (em particular para uma proteína de soro de leite coalhado, tal como lactoglobulina) para formar um condensado de ácido gordo de 85 proteína. Assim, produzindo um produto que é mais hidrofóbico e que irá estar na coalhada antes de ser eluída no soro de leite. Deste modo, mais da proteína do leite pode ser mantida no alimento final, i. e., o produto lácteo final, tal como o queijo.
Num aspecto, a presente invenção é baseada, em parte, na consciência de que os rendimentos de alimentos - tais como queijo - podem ser melhorados através da utilização de uma aciltransferase de lípido. Adicionalmente ou alternativamente, o sabor, textura, estabilidade oxidativa e/ou vida de prateleira do alimento pode ser melhorado. Adicionalmente ou alternativamente, o alimento pode possuir um nível de colesterol reduzido ou teor aumentado de ésteres de fitosterol/estanol.
Sem desejar estar limitado por uma teoria particular, é considerado que o aumento no rendimento pode ser o resultado da transesterificação de proteínas de soro de leite coalhado e péptidos, resultando no aumento significativo na hidrofobicidade das proteínas de soro de leite coalhado e precipitação das proteínas de soro de leite coalhado aciladas na coalhada do queijo.
Em sistemas biológicos, por exemplo, os depósitos das proteínas e enzimas ligadas à membrana são alcançados por dois mecanismos diferentes. As proteínas ligadas à membrana ou possuem vários domínios que se estendem pela membrana ou hidrofóbicos, ou podem possuir alternativamente um ácido gordo ligado à cadeia de polipéptido. Os ácidos gordos possuem, normalmente, um comprimento de cadeia de 14 ou 16 átomos de carbono. Os ácidos gordos estão ligados covalentemente à cadeia do polipéptido em 3 posições diferentes, o aminoácido N-terminal 86 como uma ligação amida, um resíduo de cisteína como uma ligação tioéster, ou um aminoácido serina ou treonina como uma ligação éster. É necessário apenas um ácido gordo por molécula de polipéptido para incorporar a proteína na membrana celular.
Quando um ácido gordo está ligado covalentemente a uma proteína de não membrana, as propriedades físicas e funcionais alterarão drasticamente. 0 documento W097/14713 descreve as proteínas de soja e glúten transformadas em derivados de acilo através do tratamento com uma lipase de Mucor miehei (Lipozyme™, Novozymes) e um ácido gordo em solvente orgânico. A aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada na produção de proteínas aciladas está num ambiente de água baixo ou elevado.
Verificou-se que as proteínas aciladas formam complexos anfifílicos que podem ser utilizados para vários produtos cosméticos. A proteína acilada pode formar géis, ligar água através da retenção de humidade, possui propriedades emulsificantes e é muito activa na interfase entre água e lípido.
Assim, uma composição cosmética compreendendo uma aciltransferase de lípido como aqui definida é aqui divulgada. A utilização de uma aciltransferase como aqui definido para produzir uma composição cosmética também é divulgada. E divulgado um método de produção in situ de um éster de proteína numa composição cosmética, em que o método compreende o passo de adicionar à composição cosmética (ou seus componentes) a aciltransferase de lípido como aqui definido. 87
Muitas proteínas alimentares são solúveis em soluções aquosas e são, por isso, adequadas para modificação in situ pela lipase aciltransferase. Na produção de queijo, a β-lactoglobulina perde-se na fracção de soro de leite coalhado. Após acilação com a lipase aciltransferase, ou a variante de lipase aciltransferase, os resultados iniciais indicam que a β-lactoglobulina pode contudo, ser depositada na superfície de micelas de caseína durante a coagulação do coalho. A β-lactoglobulina possui três sítios de acilação potencial (resíduos de serina) em três ansas de superfície. 0 leite contém quantidades suficientes de lecitina, um substrato adequado para uma enzima aciltransferase de lípido para acilar a β-lactoglobulina. A lisolecitina formada pode possuir um efeito emulsificante adicional.
Os melhoramentos observados com aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, são em comparação com a situação quando são utilizadas as enzimas lipolíticas sem actividade de aciltransferase, tais como triacilglicerol lipases e fosfolipases.
VANTAGENS A criação de um emulsificador e um éster de esterol/estanol in situ de, pelo menos, um constituinte do material alimentar, significa que o material alimentar irá conter, pelo menos, um material aditivo. Isto é vantajoso devido ao melhoramento na facilidade de produção. Por exemplo, sem processamento adicional ou adição de ingredientes ou adição de emulsificadores podem ser necessários. Além disso, o alimento pode conter menos 88 "aditivos". A redução ou eliminação de "aditivos" é desejável para os consumidores e inclusão de aditivos devem frequentemente ser declarados ao consumidor nos ingredientes listados no alimento. Assim, a presente invenção é ainda mais vantajosa.
Uma vantagem da presente invenção pode ser a produção in situ de um emulsificador num alimento sem um aumento prejudicial no conteúdo de ácido gordo livre do alimento. A criação de dois emulsificadores e/ou um éster de hidrato de carbono in situ de, pelo menos, um constituinte do material alimentar, significa que o material alimentar irá conter pelo menos, menos um material aditivo.
Adicionalmente, quando a aciltransferase de lípido actua num glicolipido é possível produzir vantajosamente o emulsificador DGMG in situ sem um aumento prejudicial no conteúdo de ácido gordo livre do alimento. Assim, a redução dos efeitos prejudiciais atribuída a um aumento em ácidos gordos livres, incluindo, mas não limitados a uma redução no sabor "a ranço" no queijo, prevenção de sobredosagem nas propriedades da massa e massa cozida.
Para alguns aspectos, uma vantagem da presente invenção é a redução nos níveis de colesterol livre no alimento.
Para outro aspecto, uma vantagem da presente invenção é o aumento em estanol e/ou ésteres de esterol no alimento. Alguns ésteres de esterol/estanol podem ser aromatizantes e/ou agentes de textura eficazes. Assim, a presente invenção pode resultar não apenas na produção in situ de um emulsificador num alimento, mas, também, a produção in situ de um aromatizante e/ou um 89 agente de textura. Alguns ésteres de esterol/estanol são conhecidos por reduzir o colesterol no soro sanguíneo e/ou lipoproteínas de baixa densidade quando consumidos num alimento. Assim, a presente invenção pode ser utilizada para preparar um alimento com níveis aumentados de ésteres de esterol e/ou ésteres de estanol.
Para alguns aspectos, particularmente quando a enzima, de acordo com a presente invenção, é utilizada em produtos à base de ovo, uma vantagem é a remoção de hidratos de carbono livres indesejados.
Também vantajosamente, as propriedades de emulsificação do alimento são aumentadas, conduzindo a um aspecto melhorado e/ou propriedades de manuseamento e/ou estrutura e/ou consistência e/ou estabilidade ao calor, sem um impacto negativo no sabor.
Adicionalmente, para algumas formas de realização, vantajosamente, o efeito de "sobredosagem" observado quando se utilizam lipases per se, é eficazmente ultrapassado por uma adição de uma enzima de acordo com a presente invenção. Isto é devido, pelo menos em parte, ao facto de os ácidos gordos livres não serem produzidos ou apenas produzidos num grau insignificante quando se utiliza a enzima de acordo com a presente invenção.
ISOLADO
Num aspecto, de um modo preferido, o polipéptido ou proteína para utilização na presente invenção está numa forma isolada. 0 termo "isolado" significa que a sequência é, pelo menos, 90 substancialmente isenta de, pelo menos, um outro componente com o qual a sequência está naturalmente associada na natureza e como se encontra na natureza.
PURIFICADA
Num aspecto, de um modo preferido, o polipéptido ou proteína para utilização na presente invenção está na forma purificada. 0 termo "purificado" significa que a sequência está num estado relativamente puro - e. g. , pelo menos, cerca de 51% puro, ou, pelo menos, cerca de 75%, ou, pelo menos, cerca de 80%, ou, pelo menos, cerca de 90% puro ou, pelo menos, cerca de 95% puro ou, pelo menos, cerca de 98% puro.
CLONAGEM DE UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA UM POLIPÉPTIDO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
Uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que possui as propriedades específicas como aqui definido, ou um polipéptido que é adequado para modificação pode ser isolado a partir de qualquer célula ou organismo produzindo o referido polipéptido. São bem conhecidos na técnica vários métodos para o isolamento de sequências de nucleótidos.
Por exemplo, um ADN genómico e/ou biblioteca de ADNc pode ser construído utilizando ADN cromossómico ou ARN mensageiro a partir do organismo que produz o polipéptido. Se a sequência de aminoácidos do polipéptido é conhecida, as sondas de oligonucleótidos marcados pode ser sintetizada e utilizada para identificar clones codificando polipéptidos da biblioteca 91 genómica preparada a partir do organismo. Alternativamente, uma sonda de oligonucleótido marcado contendo sequências homólogas a outro gene de polipéptido pode ser utilizada para identificar os clones que codificam o polipéptido. No último caso, são utilizadas condições de hibridação e lavagem de restringência mais baixa.
Alternativamente, clones que codificam polipéptidos podem ser identificados através da inserção de fragmentos de ADN genómico num vector de expressão, tal como um plasmideo, transformando bactérias negativas para a enzima com a biblioteca de ADN genómico resultante e, depois, plaqueando as bactérias transformadas em agar contendo uma enzima inibida pelo polipéptido, permitindo, desse modo, que os clones que expressam o polipéptido sejam identificados.
Ainda noutra alternativa, a sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido pode ser preparada sinteticamente através de métodos convencionais estabilizados, e. g.r o método da fosforoamidite descrito por Beucage S.L. et al. (1981)
Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, ou o método descrito por Matthes et ai. (1984) EMBO J. 3, p 801-805. No método da fosforoamidite, os oligonucleótidos são sintetizados, e. g., Num sintetizador de ADN automático, purificados, emparelhados, ligados e clonados em vectores apropriados. A sequência de nucleótidos pode ser de origem mista genómica e sintética, origem mista sintética e de ADNc, ou origem mista genómica e de ADNc, preparada através da ligação de fragmentos de origem sintética, genómica ou de ADNc (como apropriada) de acordo com técnicas convencionais. Cada fragmento ligado corresponde a várias partes da sequência de nucleótidos inteira. 92 A sequência de ADN pode também ser preparada através da reacção em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando iniciadores específicos, por exemplo, como descrito no documento US 4683202 ou em Saiki R K et al. {Science (1988) 239, pp 487-491).
SEQUÊNCIAS DE NUCLEÓTIDOS A presente invenção também engloba sequências de nucleótidos que codificam polipéptidos que possuem as propriedades específicas como aqui definido. O termo "sequência de nucleótidos", como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de oligonucleótidos ou sequência de polinucleótidos e variante, homólogos, fragmentos e seus derivados (tais como as suas porções). A sequência de nucleótidos pode ser de origem genómica ou sintética ou recombinante, que pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples quer represente a cadeia de sentido ou anti-sentido. O termo "sequência de nucleótidos", em relação à presente invenção inclui ADN genómico, ADNc, ADN sintético e ARN., de um modo preferido, significa ADN, de um modo mais preferido, ADNc para a sequência codificante.
Numa forma de realização preferida, a sequência de nucleótidos per se codifica um polipéptido que possui as propriedades específicas como aqui definido não cobre a sequência de nucleótidos nativa no seu ambiente natural quando está ligado à(s) sua(s) sequência(s) associadas naturalmente que está/estão também no seu/seus ambiente natural. Para facilidade de referência, vamos designar esta forma de realização preferida de "sequência de nucleótidos não nativa". A este respeito, o 93 termo "sequência de nucleótidos nativa" significa uma sequência de nucleótidos inteira que está no seu ambiente nativo e quando ligado operacionalmente a um promotor inteiro com o qual está naturalmente associado, cujo promotor está também no seu ambiente nativo. Assim, o polipéptido da presente invenção pode ser expresso por uma sequência de nucleótidos no seu organismo nativo, mas em que a sequência de nucleótidos não está sob o controlo do promotor com o qual está naturalmente associado nesse organismo.
De um modo preferido, o polipéptido não é um polipéptido nativo. A este respeito, o termo "polipéptido nativo" significa um polipéptido inteiro que está no seu ambiente nativo e quando foi expresso pela sua sequência de nucleótidos nativa.
Tipicamente, a sequência de nucleótidos que codifica polipéptidos que possuem as propriedades especificas como aqui definido é preparada utilizando técnicas de ADN recombinante (i. e.r ADN recombinante) . Contudo, numa forma de realização alternativa da invenção, a sequência de nucleótidos pode ser sintetizada, na totalidade ou em parte, utilizando métodos quimicos bem conhecidos na técnica (ver Caruthers MH et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 e Horn T et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
EVOLUÇÃO MOLECULAR
Assim que uma sequência de nucleótidos que codifica a enzima foi isolada ou foi identificada uma sequência de nucleótidos que codifica uma enzima putativa, pode ser desejável modificar a sequência de nucleótidos seleccionada, por exemplo, pode ser 94 desejável mutar a sequência de modo a preparar uma enzima de acordo com a presente invenção.
As mutações podem ser introduzidas utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estes oligonucleótidos contêm sequências de nucleótidos que flanqueiam os sítios de mutação desejados. É divulgado um método adequado em Morinaga et ai. (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Outro método de introdução de mutações em sequências de nucleótidos que codificam enzimas é descrito em Nelson e Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151).
Em vez de mutagénese dirigida, tal como descrito acima, podem introduzir-se mutações aleatoriamente, por exemplo, utilizando um kit comercial, tal como o "GeneMorph PCR mutagenesis kit" da Stratagene ou o "Diversify PCR random mutagenesis kit" da Clontech. 0 documento EP 0583265 refere-se a métodos de optimização de mutagénese baseada na PCR, que pode também ser combinada com a utilização dos análogos de ADN mutagénicos, tais como aqueles descritos no documento EP 0866796. As tecnologias de PCR à prova de erro são adequadas para a produção de variantes de transferases de acilo de lípido com características preferidas. 0 documento W00206457 refere-se à evolução molecular de lipases.
Um terceiro método para obter novas sequências é fragmentar sequências de nucleótidos não idênticas, quer utilizando qualquer número de enzimas de restrição ou uma enzima, tal como DNAse I, e remontar as sequências de nucleótidos completas que codificam para proteínas funcionais. Alternativamente, pode 95 utilizar-se uma ou múltiplas sequências de nucleótidos não idênticas e introduzir mutações durante a remontagem da sequência de nucleótidos total. A mistura de ADN e tecnologias de mistura de familias são adequadas para a produção de
variantes de transferases de acilo de lípido com características preferidas. Métodos adequados para realizar "mistura" podem ser encontrados nos documentos EP0752008, EP1138763, EP1103606. A mistura também pode ser combinada com outras formas de mutagénese de ADN como descrito nos documentos US 6180406 e WO 01/34835.
Assim, é possível produzir numerosas mutações dirigidas ou aleatórias numa sequência de nucleótidos, quer in vivo ou ín vitror e rastrear, subsequentemente, para a funcionalidade do polipéptido codificado por vários meios. Utilizando métodos de recombinação mediada in silico e exo (ver documentos WO 00/58517, US 6344328, US 6361974), por exemplo, pode ser realizada evolução molecular quando a variante produzida retém homologia muito baixa com enzimas ou proteínas conhecidas. Essas variantes assim obtidas podem possuir analogia estrutural significativa com enzimas transferase conhecidas, mas possuem homologia muito baixa de sequências de aminoácidos.
Como um exemplo não limitante, adicionalmente, podem ser recombinadas mutações ou variantes naturais de uma sequência de polinucleótidos com o tipo selvagem ou outras mutações ou variantes naturais para produzir novas variantes. Essas novas variantes podem também ser rastreadas para a funcionalidade melhorada do polipéptido codificado. A aplicação dos métodos de evolução acima mencionados e semelhantes permite a identificação e selecção de variantes das 96 enzimas da presente invenção que possuem caracteristicas preferidas sem qualquer conhecimento anterior da estrutura ou função da proteína, e permite a produção de mutações ou variantes não previsíveis mas benéficas. Existem numerosos exemplos da aplicação da evolução molecular na técnica para a optimização ou alteração de actividade enzimática, esses exemplos incluem, mas não estão limitadas a um ou mais dos seguintes: a expressão optimizada e/ou actividade numa célula hospedeira ou in vitro, actividade enzimática aumentada, substrato alterado e/ou especificidade do produto, estabilidade enzimática ou estrutural aumentada ou diminuída, actividade/especificidade enzimática alterada em condições ambientais preferidas, e. g., temperatura, pH, substrato.
Como será óbvio para um especialista na técnica, utilizando ferramentas de evolução molecular, uma enzima pode ser alterada para melhorar a funcionalidade da enzima.
Adequadamente, a aciltransferase de lípido utilizada na invenção pode ser uma variante, i. e., pode conter, pelo menos, uma substituição, deleção ou adição de aminoácidos, quando comparada com uma enzima parental. As variantes de enzimas retêm, pelo menos, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de homologia com a enzima parental. Enzimas parentais podem incluir qualquer enzima com actividade de esterase ou lipase., de um modo preferido, a enzima parental alinha com a sequência de consenso pfam00657.
Numa forma de realização preferida, uma variante de enzima aciltransferase de lípido retém ou incorpora, pelo menos, um ou mais dos resíduos da aminoácidos da sequência de consenso
Pfam00657 encontrados nos blocos GDSx, GANDY e HPT. 97
Enzimas, tais como lipases com actividade aciltransferase de lipido baixa ou ausente, num ambiente aquoso pode ser mutado utilizando ferramentas de evolução molecular para introduzir ou aumentar a actividade de transferase, produzindo desse modo uma enzima aciltransferase de lipido com actividade de transferase significativa adequada para utilização nas composições e métodos da presente invenção.
Adequadamente, a aciltransferase de lipido para utilização na invenção pode ser uma variante com actividade enzimática aumentada em lipidos polares, de um modo preferido, fosfolipidos e/ou glicolípidos quando comparados com a enzima parental., de um modo preferido, essas variantes também possuem actividade baixa ou nenhuma em lipidos polar liso. A actividade aumentada em lipidos polares, fosfolipidos e/ou glicolípidos podem ser o resultado de hidrólise e/ou actividade de transferase ou uma combinação de ambos.
Aciltransferase de lipidos variante para utilização na invenção pode possuir actividade diminuída nos triglicéridos, e/ou monoglicéridos e/ou diglicéridos em comparação com a enzima parental.
Adequadamente, a enzima variante pode não possuir actividade nos triglicéridos e/ou monoglicéridos e/ou diglicéridos.
Alternativamente, a enzima variante para utilização na invenção pode possuir actividade aumentada nos triglicéridos, e/ou pode, também, possuir actividade aumentada em um ou mais dos seguintes, lipidos polares, fosfolipidos, lecitina, 98 fosfatidilcolina, glicolípidos, digalactosil monoglicérido, monogalactosil monoglicérido. São conhecidas variantes de aciltransferase de lípidos e uma ou mais dessas variantes podem ser adequadas para utilização nos métodos e utilizações, de acordo com a presente invenção, e/ou nas composições enzimáticas de acordo com a presente invenção. Apenas a titulo de exemplo, as variantes de aciltransferase de lipidos são descritas nas seguintes referências de acordo com a presente invenção: Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et ai. J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269 (3): 2146-50; Brumlik et ai. J. Bacteriol 1996 Abr; 178 (7): 2060-4; Peelman et ai. Protein Sei. 1998 Mar; 7(3):587-99.
SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS A presente invenção também engloba sequências de aminoácidos de polipéptidos tendo a propriedades especificas como aqui definido.
Como aqui utilizado, o termo "sequência de aminoácidos" é sinónimo do termo "polipéptido" e/ou do termo "proteína". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinónimo do termo "péptido". A sequência de aminoácidos pode ser preparada/isolada de uma fonte adequada, ou pode ser realizada sinteticamente ou pode ser preparada através da utilização de técnicas de ADN recombinante. 99
Adequadamente, as sequências de aminoácidos podem ser obtidas a partir de polipéptidos isolados aqui ensinados, através de técnicas convencionais.
Um método adequado para determinar sequências de aminoácidos de polipéptidos isolados é como se segue:
Os polipéptidos purificados podem ser liofilizados e 100 pg do material liofilizado pode ser dissolvido em 50 pL de uma mistura de ureia a 8 M e hidrogenocarbonato de amónia a 0,4 M, pH 8,4. A proteína dissolvida pode ser desnaturada e reduzida durante 15 minutos, a 50 °C, após cobrir com azoto e adição de 5 pL de ditiotreitol a 45 mM. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, podem ser adicionados 5 pL de iodoacetamida a 100 mM, para os resíduos de cisteína serem derivados durante 15 minutos à temperatura ambiente na escuridão sob azoto.
Podem ser adicionados 135 pL de água e 5 pg de endoproteinase Lys-C em 5 pL de água à mistura reaccional acima e a digestão pode ser realizada a 37 °C sob azoto durante 24 horas.
Os péptidos resultantes podem ser separados por HPLC de fase reversa numa coluna VYDAC C18 (0,46x15 cm; 10 pm; The Separation Group, Califórnia, EUA) utilizando solvente A: 0,1% TFA em água e solvente B: 0,1% TFA em acetonitrilo. Os péptidos seleccionados podem ser re-cromatografados numa coluna Develosil C18 utilizando o mesmo sistema de solvente, antes da sequenciação N-terminal. A sequenciação pode ser realizada utilizando um sequenciador Applied Biosystems 476A utilizando 100 ciclos rápidos de liquido pulsado de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Califórnia, EUA) .
IDENTIDADE DE SEQUÊNCIA OU HOMOLOGIA DE SEQUÊNCIA A presente invenção também engloba a utilização de sequências que possuem um grau de identidade de sequência ou homologia de sequência com sequências de aminoácidos de um polipéptido que possui as propriedades específicas aqui definidas ou de qualquer sequência de nucleótidos que codifica esse polipéptido (de aqui em diante referido como uma "sequência(s) homóloga(s)"). Aqui, o termo "homólogo" significa uma entidade que possui uma certa homologia com as sequências de aminoácido a analisar e as sequências de nucleótidos a analisar. Aqui, o termo "homologia" pode ser equiparado com "identidade". A sequência de aminoácidos e/ou sequência de nucleótidos homóloga deve proporcionar e/ou codificar um polipéptido que retém a actividade funcional e/ou aumenta a actividade da enzima.
No presente contexto, é tomada uma sequência homóloga para incluir uma sequência de aminoácidos que pode ser, pelo menos, 75, 85 ou 90% idêntica, de um modo preferido, pelo menos, 95 ou 98% idêntica à sequência a ser analisada. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios activos, etc. que a sequência de aminoácidos a ser analisada. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de semelhança (i. e., resíduos de aminoácidos possuindo propriedades químicas/funções semelhantes) , no contexto da presente invenção é preferido, expressar a homologia em termos de identidade de sequência. 101
No presente contexto, é tomada uma sequência homóloga para incluir uma sequência de nucleótidos que pode ser, pelo menos, 75, 85 ou 90% idêntica, de um modo preferido, pelo menos, 95 ou 98% idêntica à sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido da presente invenção (a sequência a ser analisada). Tipicamente, os homólogos irão compreender as mesmas sequências que codificam para os sitios activos, etc., como a sequência a analisar. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de semelhança (i. e., resíduos de aminoácidos que possuem propriedades químicas/funções semelhantes), no contexto da presente invenção é preferido, expressar homologia em termos de identidade de sequência.
Podem ser realizadas comparações de homologia a olho, ou mais normalmente, com o auxílio de programas de comparação de sequências rapidamente disponíveis. Estes programas de computador disponíveis comercialmente podem calcular a % de homologia entre duas ou mais sequências. A % de homologia pode ser calculada em relação a sequências contíguas, i. e., uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido numa sequência é comparado directamente comparada com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isto é denominado um alinhamento "sem intervalos". Tipicamente, esses alinhamentos sem intervalos são realizados apenas em relação a um número relativamente curto de resíduos.
Embora isto seja um método muito simples e consistente, tem que se ter em consideração que, por exemplo, num par de sequências de outra forma idêntica de, uma inserção ou deleção 102 irá provocar que os seguintes resíduos de aminoácidos sejam retirados do alinhamento, resultando, assim, potencialmente, numa grande redução na % de homologia quando é realizado um alinhamento global. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequências são concebidos para produzir alinhamentos óptimos que têm em consideração possíveis inserções e deleções sem penalização indevidamente da classificação da homologia global. Isto é alcançado inserindo "intervalos" na sequência de alinhamento para tentar maximizar a homologia local.
Contudo, estes métodos mais complexos atribuem "penalizações para intervalos" para cada intervalo que ocorra no alinhamento de modo a que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, uma sequência de alinhamento com tão poucos intervalos quanto possível - reflectindo uma relação mais elevada entre as duas sequências comparadas - irá alcançar uma classificação mais elevada do que uma com muitos intervalos. São tipicamente utilizados "custos de intervalos afins" que carregam um custo relativamente elevado para a existência de um intervalo e de uma penalização menor para cada resíduo subsequente no intervalo. Este é o sistema de classificação de intervalos utilizado mais frequentemente. As penalizações de intervalos mais elevadas irão, certamente, produzir alinhamentos optimizados com menos intervalos. A maioria dos programas de alinhamento permitem que as penalizações dos intervalos sejam modificadas. Contudo, é preferido, utilizar os valores por defeito quando se utiliza esse programa informático para comparação de sequências. Por exemplo, quando se utiliza o programa informático Bestfit de GCG Wisconsin a penalização do intervalo por defeito para sequências de aminoácidos é de -12 para um intervalo e -4 para cada extensão. 103 0 cálculo da % de homologia máxima requer, por isso, primeiramente a produção de um alinhamento óptimo, tomando em consideração penalizações de intervalos. Um programa de computador adequado para realizar esse alinhamento é o programa de GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et ai., 1984 Nuc. Acids Research 12 p387) . Exemplos de outros programas de computador que podem realizar comparações de sequências incluem, mas não estão limitadas a, o pacote BLAST (ver Ausubel et ai. 1999 "Short Protocols in Molecular Biology", 4a Ed - Capitulo 18), FASTA (Altschul et ai. 1990 J. Mol. Biol. 403-410) e a suite
GENEWORKS de ferramentas de comparação. Tanto BLAST e FASTA estão disponíveis para pesquisa off-line e on-line (ver Ausubel et ai. 1999, páginas. 7-58 até 7-60). Contudo, para algumas aplicações, é preferido, utilizar o programa GCG Bestfit. Está também disponível uma nova ferramenta, denominada BLAST 2 Sequences, para comparar a sequência de proteína e de nucleótidos (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS
Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento é, tipicamente, não baseado numa comparação de pares de tudo-ou-nada. Em vez disso, é geralmente utilizada uma matriz de classificação de semelhança em escala que atribui classificações a cada comparação par a par com base na semelhança química ou distância evolutiva. Um exemplo dessa matriz normalmente utilizada é a matriz BLOSUM62 - a matriz por defeito para a suite de programas BLAST. Os programas GCG Wisconsin geralmente utilizam os valores por defeito públicos ou uma tabela de comparação de símbolo específica se fornecida (ver manual do utilizador para mais detalhes). Para algumas aplicações, é preferido, utilizar os 104 valores por defeito públicos para o pacote GCG ou no caso de outro programa informático, a matriz por defeito, tal como BL0SUM6 2.
Alternativamente, as percentagens de homologias podem ser calculadas utilizando a característica de alinhamento múltiplo em DNASIS™, (Hitachi Software), com base num algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).
Uma vez que o programa de computador tenha produzido um alinhamento óptimo, é possível calcular a % de homologia, de um modo preferido, a % de identidade de sequência. 0 programa informático faz tipicamente isto como parte da comparação de sequências e cria um resultado numérico.
As sequências também podem possuir deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resulta numa substância funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácido deliberadas podem ser realizadas com base na semelhança na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos desde que a actividade de ligação secundária da substância seja mantida. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos de cabeça polar não carregados que possuem valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina. 105
Podem ser feitas substituições conservadoras, por exemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e, de um modo preferido, na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos um pelo outro:
ALIFÁTICO Não polar GAP ILV Polar - não carregado CSTM NQ Polar - carregado DE KR AROMÁTICO HFWY A presente invenção também engloba a substituição homóloga (substituição e reposição são ambos aqui utilizados para significar a permuta de um resíduo de aminoácido existente, por um resíduo alternativo) que pode ocorrer i. e., substituição de parecido-por-parecido, tal como básico por básico, acídico por acídico, polar por polar etc. Também pode ocorrer substituição não-homóloga i. e., a partir de uma classe de resíduos para outra ou alternativamente envolvendo a inclusão de aminoácidos não naturais, tais como ornitina (de aqui em diante referidas como Z), ácido diaminobutírico de ornitina (de aqui em diante referida como B), norleucina ornitina (de aqui em diante referida como 0) , piririlalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.
Também podem ser realizadas reposições por aminoácidos não naturais. 106
Variantes de sequências de aminoácido podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos da sequência incluindo grupos alquilo, tais como grupos metilo, etilo ou propilo, adicionalmente aos espaçadores de aminoácidos tais como resíduos de glicina ou β-alanina. Uma outra forma de variação, envolvendo a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptóide, será bem entendida pelos especialistas na técnica. Para evitar a dúvida, "a forma peptóide" é utilizada para se referir a variantes de resíduos de aminoácidos em que o grupo α-carbono substituinte está no átomo de azoto do resíduo em vez do α-carbono. Processos para preparar péptidos na forma peptóide são conhecidos na técnica, por exemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 e Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
Sequências de nucleótidos para utilização na presente invenção ou codificando um polipéptido possuindo as propriedades específicas aqui definidas podem incluir nelas nucleótidos sintéticos ou modificados. Vários tipos diferentes de modificação de oligonucleótidos são conhecidos na técnica. Estes incluem metilfosfonato e estruturas de fosforotioato e/ou a adição de acridina ou cadeias de polilisina nas extremidades 3' e/ou 5' da molécula. Para os objectivos da presente invenção, deve ser entendido que as sequências de nucleótidos aqui descritas podem ser modificadas através de qualquer método disponível na técnica. Essas modificações podem ser realizadas de modo a aumentar a actividade in vivo ou a esperança de vida das sequências de nucleótidos. A presente invenção também engloba a utilização de sequências de nucleótidos que são complementares às sequências 107 aqui discutidas ou qualquer derivado, fragmento ou seu derivado. Se a sequência for complementar a um seu fragmento, então, essa sequência pode ser utilizada como uma sonda para identificar sequências codificantes semelhantes noutros organismos, etc.
Os polinucleótidos que não são 100% homólogos às sequências da presente invenção mas caem dentro do âmbito da invenção podem ser obtidos de vários modos. Outras variantes das sequências aí descritas podem ser obtidas, por exemplo, rastreando bibliotecas de ADN produzidas a partir de uma gama de indivíduos, por exemplo, indivíduos de diferentes populações. Adicionalmente, outros homólogos virais/bacterianos, ou celulares particularmente homólogos celulares encontrados em células de mamíferos (e. g., células de rato, murganho, bovino e primatas), podem ser obtidas e esses seus homólogos e fragmentos em geral serão capazes de hibridar selectivamente com as sequências apresentadas na listada de sequência aqui apresentada. Essas sequências podem ser obtidas rastreando com sonda as bibliotecas de ADNc produzidas a partir de bibliotecas de ADN genómico de outra espécie animal e rastreando essas bibliotecas com sondas que compreendem a totalidade ou parte de qualquer uma das sequências nas listagens de sequências anexas em condições de meio para restringência elevada. Aplicam-se considerações semelhantes para obter espécies homólogas e variantes alélicas do polipéptido ou sequências de nucleótidos da invenção.
Variantes e homólogos de estirpe/espécie podem, também, ser obtidos utilizando PCR degenerado que utilizará iniciadores concebidos para se direccionarem a sequências nas variantes e homólogos que codificam para sequências de aminoácidos conservados nas sequências da presente invenção. As sequências conservadas podem ser previstas, por exemplo, alinhando as 108 sequências de aminoácidos de vários variantes/homólogos. Os alinhamentos de sequências podem ser realizados utilizando programas de computador conhecidos na técnica. Por exemplo, o programa GCG Wisconsin PileUp é vastamente utilizado.
Os iniciadores utilizados em PCR degenerados irão conter uma ou mais posições degeneradas e serão utilizados em condições de restringência inferiores àquelas utilizadas para clonar sequências com iniciadores de sequência única contra sequências conhecidas.
Alternativamente, esses polinucleótidos podem ser obtidos por mutagénese dirigida, de sequências caracterizadas. Isto pode ser útil quando, por exemplo, são necessárias alterações de sequências de codão para optimizar preferências de codão para uma célula hospedeira particular em que as sequências de polinucleótidos estão a ser expressas. Podem ser desejadas outras alterações de sequência de modo a introduzir sítios de reconhecimento de polipéptido de restrição, ou para alterar a propriedade ou função dos polipéptidos codificados pelos polinucleótidos.
Os polinucleótidos (sequências de nucleótidos) da invenção podem ser utilizados para produzir um iniciador, e. g., um iniciador de PCR, um iniciador para uma reacção de amplificação alternativa, uma sonda, e. g.r marcada com um marcador revelador por meios convencionais, utilizando marcadores radioactivos ou não radioactivos, ou os polinucleótidos podem ser clonados em vectores. Esses iniciadores, sondas e outros fragmentos terão, pelo menos, 15, de um modo preferido, pelo menos, 20, por exemplo, pelo menos, 25, 30 ou 40 nucleótidos de comprimento, e 109 são também englobados pelo termo polinucleótidos da invenção, como aqui utilizado.
Os polinucleótidos, tais como polinucleótidos de ADN e sondas de acordo com a invenção podem ser produzidos de forma recombinante, sintética, ou através de quaisquer meios disponíveis dos especialistas na técnica. Eles também podem ser clonados através de técnicas convencionais.
Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo um fabrico passo-a-passo da sequência de nucleótidos desejada, um nucleótido de cada vez. As técnicas para o realizar utilizando técnicas automatizadas estão rapidamente disponíveis na técnica.
Os polinucleótidos mais longos serão, geralmente, produzidos utilizando meios recombinantes, por exemplo, utilizando técnicas de clonagem de PCR (reacção em cadeia pela polimerase). Isto irá envolver produzir um par de iniciadores (e. g., desde cerca de 15 até 30 nucleótidos) flanqueando uma região da sequência de direccionamento do lípico que é desejado clonar, colocando os iniciadores em contacto com ARNm ou ADNc obtido de uma célula animal ou humana, realizando uma reacção em cadeia pela polimerase em condições que trazem esta amplificação da região desejada, isolando o fragmento amplificado (e. g., purificando a mistura reaccional num gel de agarose) e recuperando o ADN amplificado. Os iniciadores podem ser concebidos para conter sítios de reconhecimento de enzimas de restrição adequados de modo a que o ADN amplificado possa ser clonado num vector de clonagem adequado. 110
HIBRIDAÇAO A presente invenção também engloba sequências que são complementares às sequências da presente invenção ou sequências que são capazes de hibridar com as sequências da presente invenção ou com as sequências que são complementares a esta. 0 termo "hibridação", como aqui utilizado, pode incluir "o processo pelo qual uma cadeia de ácido nucleico se une com uma cadeia complementar através de emparelhamento de bases", assim como o processo de amplificação como realizado nas tecnologias de reacção em cadeia pela polimerase (PCR). A presente invenção também engloba a utilização de sequências de nucleótidos que são capazes de hibridar com as sequências que são complementares às sequências a analisar aqui discutidas, ou qualquer derivado, fragmento ou seu derivado. A presente invenção também engloba sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridar com as sequências de nucleótidos aqui discutidas.
As condições de hibridação são baseadas na temperatura de fusão (Tm) do complexo de ligação de nucleótidos, como ensinado por Berger e Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) e conferem uma "restringência" definida como explicado abaixo. A restringência máxima ocorre, tipicamente, a cerca de Tm-5 °C (5 °C abaixo da Tm da sonda); restringência elevada a cerca de 5 °C até 10 °C abaixo da Tm; restringência intermédia a 111 cerca de 10 °C até 20 °C abaixo de Tm; e baixa restringência a cerca de 20 °C até 25 °C abaixo Tm. Será entendido pelos especialistas na técnica, que uma hidridação de restringência máxima pode ser utilizada para identificar ou detectar sequências de nucleótidos idênticas enquanto que pode ser utilizada uma hibridação de restringência intermédia (ou baixa) para identificar ou detectar sequências de polinucleótidos semelhantes ou relacionadas.
De um modo preferido, a presente invenção engloba sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridação sob condições de elevada restringência ou condições de restringência intermédia com sequências de nucleótidos que codificam polipéptidos que possuem as propriedades específicas como aqui definido.
De um modo mais preferido, a presente invenção engloba sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridar em condições de elevada restringência (e. g., 65 °C e 0,lxSSC {lxSSC = NaCl a 0,15 M, citrato de Na a 0,015 M pH 7,0}) com sequências de nucleótidos que codificam polipéptidos que possuem as propriedades especificas como aqui definido. A presente invenção também se refere a sequências de nucleótidos que podem hibridar com as sequências de nucleótidos aqui discutidas (incluindo sequências complementares daquelas aqui discutidas). A presente invenção também se refere a sequências de nucleótidos que são complementares às sequências que podem hibridar com as sequências de nucleótidos aqui discutidas (incluindo sequências complementares àquelas aqui discutidas). 112 São também incluídas sequências de polinucleótidos dentro do âmbito da presente invenção, que são capazes de hibridar com as sequências de nucleótidos aqui discutidas nas condições de restringência intermédia a máxima.
Num aspecto preferido, a presente invenção abrange sequências de nucleótidos que podem hibridar com as sequências de nucleótidos aqui discutidas, ou o seu complemento, em condições restringentes (e. g., 50 °C e 0,2xSSC).
Num aspecto mais preferido, a presente invenção cobre sequências de nucleótidos que podem hibridar com as sequências de nucleótidos aqui discutidos ou o seu complemento, em condições de restringência elevada (e. g., 65 °C e 0,lxSSC).
EXPRESSÃO DE POLIPÉPTIDOS
Uma sequência de nucleótidos para utilização na presente invenção ou para codificar um polipéptido possuindo as propriedades específicas, como aqui definido, pode ser incorporado num vector replicável recombinante. O vector pode ser utilizado para replicar e expressar a sequência de nucleótidos, na forma de polipéptido, em e/ou a partir de uma célula hospedeira compatível. A expressão pode ser controlada utilizando sequências de controlo que incluem promotores/intensificadores e outros sinais de regulação de expressão. Podem ser utilizados promotores procarióticos e promotores funcionais em células eucarióticas. Podem ser utilizados promotores específicos para tecido ou específicos para estímulos. Os promotores quiméricos podem também ser 113 utilizados compreendendo elementos de sequência de dois ou mais promotores diferentes acima descritos. 0 polipéptido produzido por uma célula hospedeira recombinante através de expressão da sequência de nucleótidos pode ser secretado ou pode estar contido intracelularmente dependendo da sequência e/ou do vector utilizado. As sequências codificantes podem ser concebidas com sequências sinal que dirigem a secreção das sequências que codificam a substância através de uma membrana de célula procariótica ou eucariótica particular.
VECTOR DE EXPRESSÃO 0 termo "vector de expressão" significa uma construção capaz de expressão in vivo ou in vitro.
De um modo preferido, o vector de expressão é incorporado no genoma do organismo. 0 termo "incorporado" cobre, de um modo preferido, a incorporação estável no genoma. A sequência de nucleótidos da presente invenção ou que codifica para um polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido pode estar presente num vector, no qual a sequência de nucleótidos está ligada operacionalmente a sequências reguladoras, de modo a que as sequências reguladoras sejam capazes de proporcionar a expressão da sequência de nucleótidos através de um organismo hospedeiro adequado, i. e., o vector é um vector de expressão. 114
Os vectores da presente invenção podem ser transformados numa célula hospedeira adequada como descrito abaixo para proporcionar a expressão de um polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido. A escolha do vector, e. g., plasmídeo, cosmideo, virus ou vector fágico, dependerá, frequentemente, da célula hospedeira na qual foi introduzido.
Os vectores podem conter um ou mais genes marcadores de selecção - tais como um gene que confere resistência a antibióticos e. g., resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Alternativamente, a selecção pode ser realizada por co-transformação (como descrito no documento W091/17243).
Os vectores podem ser utilizados in vitro, por exemplo, para a produção de ARN ou utilizados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.
Assim, noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de preparação de sequências de nucleótidos da presente invenção ou sequências de nucleótidos que codificam polipéptidos que possuem as propriedades especificas como aqui definido através da introdução da sequência de nucleótidos num vector replicável, introduzindo o vector numa célula hospedeira compatível e cultivando a célula hospedeira em condições que provocam a replicação do vector. 0 vector pode compreender ainda uma sequência de nucleótidos que permite que o vector se replique na célula hospedeira em 115 questão. Exemplos dessas sequências são as origens de replicação dos plasmideos pUC 19, pACYC177, pUBUO, pE194, pAMB e pIJ702.
SEQUÊNCIAS REGULADORAS
Em algumas aplicações, uma sequência de nucleótidos para utilização na presente invenção ou uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido possuindo as propriedades especificas como aqui definido pode ser ligada operacionalmente a uma sequência reguladora que é capaz de proporcionar a expressão da sequência de nucleótidos, tal como pela célula hospedeira seleccionada. A titulo de exemplo, a presente invenção abrange um vector compreendendo a sequência de nucleótidos da presente invenção ligada operacionalmente a essa sequência reguladora, i. e., o vector é um vector de expressão. 0 termo "ligada operacionalmente" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão numa relação que permite que funcionem no seu modo pretendido. A sequência reguladora "ligada operacionalmente" a uma sequência codificante está ligada de modo a que a expressão da sequência codificante seja alcançada em condições compatíveis com as sequências de controlo. 0 termo "sequências reguladoras" inclui promotores e intensificadores e outros sinais de regulação de expressão. 0 termo "promotor" é utilizado no sentido normal da técnica, e. g., um sítio de ligação da polimerase de ARN. 116 A expressão aumentada da sequência de nucleótidos que codifica a enzima que possui as propriedades especificas como aqui definido pode também ser alcançada através da selecção de regiões reguladoras heterólogas, e. g., regiões de promotor, lider de secreção e terminador.
De um modo preferido, a sequência de nucleótidos da presente invenção pode estar ligada operacionalmente a, pelo menos, um promotor.
Exemplos de promotores adequados para controlar a transcrição da sequência de nucleótidos numa bactéria, fungo ou levedura hospedeira são bem conhecidos na técnica.
CONSTRUÇÕES 0 termo "construção" - que é sinónimo de termos tais como "conjugado", "cassete" e "híbrido" - inclui uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que possui as propriedades específicas como aqui definido para utilização, de acordo com a presente invenção, directamente ou indirectamente ligada a um promotor. Um exemplo de uma ligação indirecta é o fornecimento de um grupo espaçador adequado, tal como uma sequência de intrão, tal como o intrão Shl ou o intrão ADH, vai intermediar o promotor e a sequência de nucleótidos da presente invenção. 0 mesmo é verdade para o termo "fundido" em relação à presente invenção que inclui ligação directa ou indirecta. Em alguns casos, os termos não abrangem a combinação natural da sequência de nucleótidos que codifica a proteína normalmente associada com o promotor do gene selvagem e quando estão ambos no seu ambiente natural. 117 A construção pode conter, ainda, ou expressar um marcador que permite a selecção da construção genética.
Para algumas aplicações, de um modo preferido, a construção compreende, pelo menos, uma sequência de nucleótidos da presente invenção ou uma sequência de nucleótidos que codifica a polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido ligada operacionalmente a um promotor.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS 0 termo "célula hospedeira" - em relação à presente invenção, inclui qualquer célula que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido, ou um vector de expressão como descrito acima e que é utilizada na produção recombinante de um polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido.
Assim, uma outra forma de realização da presente invenção proporciona células hospedeiras transformadas ou transfectadas com uma sequência de nucleótidos da presente invenção ou uma sequência de nucleótidos que expressa um polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido. As células serão seleccionadas para serem compatíveis com o referido vector e podem por exemplo, ser células procarióticas (por exemplo, bactérias), fungos, leveduras ou células vegetais., de um modo preferido, as células hospedeiras não são células humanas.
Exemplos de organismos hospedeiros de bactérias adequadas são bactérias gram negativas ou bactérias gram positivas. 118
Dependendo da natureza da sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que possui as propriedades específicas como aqui definido, e/ou o desejo de outro processamento da proteína expressa, hospedeiros eucarióticos, tais como leveduras ou outros fungos podem ser preferidos. Em geral, são preferidas células de leveduras em relação a células de fungos porque são mais fáceis de manipular. Contudo, algumas proteínas são ainda fracamente secretadas a partir de células de leveduras ou, em alguns casos, não são processadas apropriadamente (e. g., hiperglicosilação em leveduras). Em alguns casos, deve ser seleccionado um organismo hospedeiro de fungos diferentes. A utilização de células hospedeiras adequadas, tais como células hospedeiras de leveduras, fungos e plantas - podem proporcionar modificações de pós-tradução (e. g., miristoilação, glicosilação, truncagem, lapidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina) como pode ser necessária para conferir actividade biológica óptima em produtos de expressão recombinante da presente invenção. uma estirpe de protease A célula hospedeira pode ser deficiente ou protease minus.
ORGANISMO 0 termo "organismo", em relação à presente invenção inclui qualquer organismo que pode compreender uma sequência de nucleótidos, de acordo com a presente invenção, ou uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que possui as propriedades específicas como aqui definido e/ou produtos assim obtidos. 119
Organismos adequados podem incluir um procariota, fungo, levedura ou uma planta. 0 termo "organismo transgénico", em relação à presente invenção inclui qualquer organismo que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido e/ou os produtos daí obtidos e/ou em que um promotor pode permitir a expressão da sequência de nucleótidos que codifica para o polipéptido que possui as propriedades específicas, como aqui definido, no organismo., de um modo preferido, a sequência de nucleótidos é incorporada no genoma do organismo. 0 termo "organismo transgénico" não cobre sequências codificantes de nucleótidos nativas no seu ambiente natural quando estão sob o controlo do seu promotor nativo que está, também, no seu ambiente natural.
Por isso, o organismo transgénico da presente invenção inclui um organismo compreendendo qualquer uma de, ou combinações de, uma sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido, construções como aqui definido, vectores como aqui definido, plasmídeos como aqui definido, células como aqui definido ou os seus produtos. Por exemplo, o organismo transgénico pode também compreender uma sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido que possui as propriedades específicas como aqui definido sob o controlo de um promotor heterólogo. 120
TRANSFORMAÇAO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS/ORGANISMO
Como indicado anteriormente, o organismo hospedeiro pode ser um organismo procariótico ou eucariótico. Exemplos de hospedeiros procarióticos adequados incluem E. coli e Bacillus subtilis.
Os ensinamentos da transformação de hospedeiros procarióticos estão bem documentados na técnica, por exemplo, ver Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se um hospedeiro procariótico é utilizado,, então, a sequência de nucleótidos pode necessitar de ser adequadamente modificada antes da transformação - tal como através da remoção de intrões.
Noutra forma de realização, o organismo transgénico pode ser uma levedura.
As células de fungos filamentosos podem ser transformadas utilizando vários métodos conhecidos na técnica - tais como um processo envolvendo a formação de protoplastos e a transformação dos protoplastos seguida pela regeneração da parede celular, de um modo conhecido. A utilização de Aspergillus como um microrganismo hospedeiro é descrita no documento EP 0238023.
Outro organismo hospedeiro pode ser uma planta. Uma revisão das técnicas gerais utilizadas para transformar plantas pode ser encontrada em artigos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bíol [1991] 42:205-225) e Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Março/Abril 1994 17-27). Outros ensinamentos sobre transformação de plantas podem ser encontrados no documento EP-A-0449375. 121
Ensinamentos gerais sobre a transformação de fungos, leveduras e plantas são apresentados nas seguintes secções.
FUNGOS TRANSFORMADOS
Um organismo hospedeiro pode ser um fungo - tal como um fungo filamentoso. Exemplos desses hospedeiros adequados incluem qualquer membro que pertença ao género Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma e semelhantes.
Ensinamentos sobre a transformação de fungos filamentosos são revistos no documento US-A-5741665 que constata que técnicas convencionais para a transformação de fungos filamentosos e cultura de fungos são bem conhecidos na técnica. Uma revisão exaustiva de técnicas como aplicado a N. crassa é encontrada, por exemplo, em Davis e de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
Outros ensinamentos sobre a transformação de fungos filamentosos são revistos no documento US-A-5674707.
Num aspecto, o organismo hospedeiro pode ser do género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.
Um Aspergillus transgénico, de acordo com a presente invenção, pode também ser preparado pelo seguinte, por exemplo, os ensinamentos de Turner G. 1994 (Vectores for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editores) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier, Amsterdão 1994. pp. 641-666). 122 A expressão genética em fungos filamentosos foi revista em Punt et al., (2002) Trends Biotechnol 2002 Maio; 20 (5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.
LEVEDURAS TRANSFORMADAS
Noutra forma de realização, o organismo transgénico pode ser uma levedura.
Uma revisão sobre os princípios de expressão de genes heterólogos em leveduras é fornecida em, por exemplo, Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, e Curr Opin Biotechnol (1997)
Oct;8(5):554-60. A este respeito, leveduras - tais como as espécies Saccharomyces cerevisie ou Pichia pastoris (ver FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), podem ser utilizadas como um veículo para expressão de genes heterólogos.
Uma revisão sobre os princípios da expressão de genes heterólogos em Saccharomyces cerevisiae e secreção de produtos genéticos é fornecida em E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yesats, Vol 5, Anthony H Rose e J Stuart Harrison, eds, 2a edição, Academic Press Ltd.).
Para a transformação de leveduras, foram desenvolvidos vários protocolos de transformação. Por exemplo, uma Saccharomyces transgénica, de acordo com a presente invenção, pode ser preparada através dos seguintes ensinamentos de Hinnen et al. , (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences 123 275, of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 104); e Ito, H et al., (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
As células de leveduras transformadas podem ser seleccionadas utilizando vários marcadores selectivos - tais como marcadores auxotróficos marcadores de resistência a antibióticos dominantes.
Um organismo hospedeiro de levedura adequado pode ser seleccionado de espécies de leveduras biotecnologicamente relevantes, tais como, mas não limitadas a, espécies de leveduras seleccionadas de Pichia spp., Hansenula spp. , Kluyveromyces, Yarrowinia spp., Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae ou Schizosaccharomyce spp. incluindo Schizosaccharomyce pombe.
Pode ser utilizada uma dadeia da espécie de levedura metilotrófica Pichia pastoris como o organismo hospedeiro.
Numa forma de realização, o organismo hospedeiro pode ser uma espécie de Hansenula, tal como H. polimorpha (como descrito no documento WOOl/39544).
PLANTAS TRANSFORMADAS/CÉLULAS VEGETAIS
Um organismo hospedeiro adequado para a presente invenção pode ser uma planta. Uma revisão das técnicas gerais pode ser encontrada em artigos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) e Christou (Agro-Food-Industry
Hi-Tech Março/Abril 1994 17-27) ou no documento W001/16308. A 124 planta transgénica pode produzir níveis elevados de ésteres de fitosterol e ésteres de fitostanol, por exemplo.
Por isso, a presente invenção também se refere a um método para a produção de uma planta transgénica com níveis elevados de ésteres de fitosterol e ésteres de fitostanol, compreendendo os passos de transformar uma célula vegetal com uma aciltransferase de lípido, como aqui definido, (em particular com um vector de expressão ou construção compreendendo a aciltransferase de lípido como aqui definido) , e cultivar uma planta da célula vegetal transformada.
SECREÇÃO
Frequentemente, é desejável que o polipéptido seja secretado a partir do hospedeiro de expressão para o meio de cultura a partir do qual a enzima pode ser recuperada mais facilmente. De acordo com a presente invenção, a sequência líder de secreção pode ser seleccionada com base no hospedeiro de expressão desejado. Também podem ser utilizadas sequências sinal híbridas com o contexto da presente invenção.
Exemplos típicos de sequências líder de secreção heterólogas são aqueles com origem no gene de amiloglucosidase (AG) de fungo (glaA - ambas as versões de 18 e de 24 aminoácidos, e. g., de Aspergillus) , o gene do factor a (leveduras, e. g., Saccharomyces, Kluyveromyces e Hansenula) ou o gene da a-amilase (Bacillus) . 125
DETECÇAO São conhecidos na técnica uma variedade de protocolos para detectar e medir a expressão da sequência de aminoácidos. Exemplos incluem o ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e separação de células activadas por fluorescência (FACS). São conhecidos na técnica uma larga variedade de marcadores e técnicas de conjugação e podem ser utilizados em vários ensaios nucleicos e de aminoácidos. Várias empresas, tais como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) , Promega (Madison, WI), e US Biochemical Corp (Cleveland, OH) fornecem kits comerciais e protocolos para estes processos.
Moléculas repórter ou marcadores adequados incluem aqueles agentes de radionuclidos, enzimas, fluorescentes, quimio-luminescentes, ou cromogénicos assim como substratos, cofactores, inibidores, partículas magnéticas e semelhantes. Patentes que ensinam a utilização desses marcadores incluem os documentos US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; USA-4,275,149 e US-A-4,366,241.
Também, podem ser produzidas imunoglobulinas recombinantes como apresentado no documento US-A-4,816,567.
PROTEÍNAS DE FUSÃO
Um polipéptido que possui as propriedades específicas como aqui definido pode ser produzido como uma proteína de fusão, por 126 exemplo, para auxiliar na sua extracção e purificação. Exemplos de parceiros de proteína de fusão incluem glutationa-S-transferase (GST) , 6xHis, GAL4 (domínios de ligação de ADN e/ou de activação de transcrição) e β-galactosidase. Também pode ser conveniente incluir um sítio de clivagem proteolítico entre o parceiro da proteína de fusão e a sequência de proteína de interesse para permitir a remoção das sequências da proteína de fusão., de um modo preferido, a proteína de fusão não irá impedir a actividade da sequência da proteína.
Sistemas de expressão de fusão de genes em E. coli foram revistos em Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5):501-6.
Noutra forma de realização da invenção, a sequência de aminoácidos de um polipéptido que possui as propriedades especificas como aqui definido podem ser ligadas a uma sequência heteróloga que codifica uma proteína de fusão. Por exemplo, para o rastreio de bibliotecas de péptidos para agentes capazes de afectar a actividade da substância, pode ser útil codificar uma substância quimérica que expressa um epitopo heterólogo que é reconhecido por um anticorpo disponível comercialmente. A invenção será agora descrita, apenas a título de exemplo, em relação às seguintes Figuras e Exemplos. A Figura 1 apresenta uma sequência de consenso Pfam00657 da base de dados versão 6 (SEQ ID N° 1);
A Figura 2 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 2) obtida do organismo Aeromonas hydrophila (P10480; GI : 121051) ; 127 A Figura 3 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 3) obtida do organismo Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI:996 4017) ; A Figura 4 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 4) obtida do organismo Streptomyces coelicolor A3 (2) (Número de acesso no Genbank NP_631558); A Figura 5 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 5) obtida do organismo Streptomyces coelicolor A3 (2) (Número de acesso no Genbank: CAC42140); A Figura 6 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 6) obtida do organismo Saccharomyces cerevisiae (Número de acesso no Genbank P41734); A Figura 7 apresenta um alinhamento de sequências seleccionadas para a sequência de consenso pfam00657; A Figura 8 apresenta um alinhamento par-a-par da SEQ ID N° 3 com SEQ ID N° 2 apresentando 93% de identidade de sequência de aminoácidos. A sequência sinal está sublinhada. + representa diferenças. O motivo GDSX contendo o sítio activo serina 16, e os sítios activos ácido aspártico 116 e histidina 291 são destacados (ver regiões a sombreado). Os números a seguir ao aminoácido são menos a sequência sinal; A Figura 9 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N° 7) que codifica uma aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, obtida do organismo Aeromonas hydrophila; 128 A Figura 10 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N° 8) que codifica a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, obtida do organismo Aeromonas salmonicida; A Figura 11 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N° 9) que codifica a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, obtida do organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (Número de acesso no Genbank NC_003888.1: 8327480.. 8328367) ; A Figura 12 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N° 10) que codifica a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, obtida do organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (Número de acesso no Genbank AL939131.1: 265480.. 266367); A Figura 13 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N° 11) que codifica a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, obtida do organismo Saccharomyces cerevisiae (Número de acesso no Genbank Z75034); A Figura 14 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 12) obtida do organismo Ralstonia (Número de acesso no Genbank: AL646052); A Figura 15 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N° 13) que codifica a aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, obtida do organismo Ralstonia; 129 A Figura 16 apresenta SEQ ID N° 20. Scoel código de acesso de proteína no NCBI CAB39707.1 GI:4539178 proteína hipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 17 apresenta uma sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 21 que codifica o código de acesso de proteína no NCBI CAB39707.1 GI:4539178 proteína hipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 18 apresenta um aminoácido apresentado na SEQ ID N° 22. Scoe2 código de acesso de proteína no NCBI CAC01477.1 GI: 9716139 proteína hipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 19 apresenta uma sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 23 que codifica Scoe2 código de acesso de proteína no NCBI CAC01477.1 GI:9716139 proteína hipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 20 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 24) Scoe3 código de acesso de proteína no NCBI CAB88833.1 GI: 7635996 proteína putativa secretada. [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 21 apresenta uma sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 25 que codifica Scoe3 código de acesso de proteína no NCBI CAB88833.1 GI:7635996 proteína putativa secretada. [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 22 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 26) Scoe4 código de acesso de proteína no NCBI CAB89450.1 130 GI: 7672261 proteína putativa secretada. [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 23 apresenta uma sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 27 que codifica Scoe4 código de acesso de proteína no NCBI CAB89450.1 GI:7672261 proteína putativa secretada. [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 24 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 28) Scoe5 código de acesso de proteína no NCBI CAB62724.1 GI: 6562793 lipoproteína putativa [Streptomyces coelicolor A3 ( 2) ] ; A Figura 25 apresenta uma sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 29, que codifica Scoe5 código de acesso de proteína no NCBI CAB62724.1 GI:6562793 lipoproteína putativa [Streptomyces coelicolor A3(2)]; A Figura 26 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 30) Sriml código de acesso de proteína no NCBI AAK84028.1 GI: 15082088 GDSL-lipase [Streptomyces rimosus]; A Figura 27 apresenta uma sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N° 31 que codifica Sriml código de acesso de proteína no NCBI AAK84028.1 GI:15082088 GDSL-lipase [Streptomyces rimosus]; A Figura 28 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 32) A aciltransferase de lípido de Aeromonas hydrophila (ATCC N° 7965); 131 A Figura 29 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N° 33) que codifica a aciltransferase de lípido de Aeromonas hydrophíla (ATCC N° 7965); A Figura 30 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 34) de uma aciltransferase de lípido de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCCN0 14174); A Figura 31 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID No 35) que codifica a aciltransferase de lípido de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCCN0 14174); A Figura 32 demonstra que os homólogos dos genes de Aeromonas podem ser identificados utilizando o serviço de ferramentas de pesquisa de alinhamento básico local no National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, EUA e as bases de dados de genoma completo. O motivo GDSX foi utilizado na pesquisa de base de dados e foram identificadas várias sequências/genes que codificam potencialmente enzimas com actividade lipolítica. Os genes foram identificados a partir do género Streptomyces, Xanthomonas e Ralstonia. Como um exemplo abaixo, o gene de Ralstonia solanacearum foi alinhado como o gene de Aeromonas salmonicida (satA). O alinhamento par-a-par apresentou uma identidade de 23%. Pode ser identificado o sítio activo da serina está presente no terminal amino e os resíduos catalíticos histidina e ácido aspártico; A Figura 33 apresenta a sequência de consenso Pfam00657.ll [família 00657, base de dados versão 11] (de aqui em diante denominada Pfam consenso) e o alinhamento de várias sequências com a sequência de consenso Pfam. As setas 132 indicam os resíduos do sítio activo, as caixas sublinhadas indicam três das caixas de homologia indicadas por [Upton C e Buckley JT (1995) Trends Biochem Sei 20; 179-179] . As letras maiúsculas na Pfam consenso indicam resíduos conservados em muitos membros de família. O símbolo - indica uma posição na qual o modelo Markov escondido da Pfam consenso esperava encontrar um resíduo mas não o fez, de modo que é inserida uma interrupção. 0 símbolo indica um resíduo sem um resíduo correspondente no consenso Pfam. As sequências são as sequências de aminoácido listadas nas Figuras 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 e 30. A Figura 34 apresenta a Pfam00657.ll [família 00657, base de dados versão 11] sequência de consenso (de aqui em diante denominada Pfam consenso) e o alinhamento de várias sequências com a sequência de consenso Pfam. As setas indicam os resíduos do sítio activo, as caixas sublinhadas indicam três das caixas de homologia indicadas por [Upton C e Buckley JT (1995) Trends Biochem Sei 20; 179-179] . As letras maiúsculas na Pfam de consenso indicam resíduos conservados em muitos membros da família. 0 símbolo - indica uma posição na qual o modelo Markov escondido da Pfam de consenso espera encontrar um resíduo mas não o fez, por isso, é inserida uma interrupção. O símbolo indica um resíduo sem um resíduo correspondente na Pfam de consenso. As sequências são as sequências de aminoácidos listadas nas Figuras 2, 16, 18, 20, 26, 28 e 30. Todas estas proteínas demonstraram ser activas contra substratos lipídicos. A Figura 35 apresenta um vector de expressão pet12-AsalGCAT= pSM contendo o gene de aciltransferase de lípido C-terminal marcado em His de Aeromonas salmonícida; 133 A Figura 36 apresenta os resultados do teste de extractos celulares num Ensaio de NEFA Kit, que apresenta a actividade de uma aciltransferase de lípido recombinante, de A. salmonicida, em relação a lecitina. Os poços da esquerda para a direita indicam: um controlo positivo, um controlo negativo (i. e., extractos de plasmídeo vazio) e amostras recolhidas após 0, 1, 2 e 3 horas de cultivo após indução com IPTG; A Figura 37 demonstra que a optimização de crescimento de BL21(DE3)pLysS contendo o vector de expressão pet12-AsalGCAT= pSM apresentando cultura a 30 °C resultou na produção de enzima com actividade elevada em relação à lecitina. Os extractos celulares foram testados para a actividade de fosfolipase utilizando o ensaio do NEFA kit. Os poços da esquerda para a direita: controlo positivo; controlo negativo; 20 °C; 30 °C; A Figura 38 apresenta extractos celulares brutos de BL21(DE3)pLysS que expressam aciltransferase de lípido activa incubada com o substrato lecitina e a mistura reaccional foi analisada utilizando cromatografia em camada fina demonstrando a presença de produtos de degradação. Pistas: 1. Sem enzima; 2. + A. sal -10 pL 37 °C; 3. + A.sal -20 pL 37 °C; 4. + A.sal -10 pL 24 °C; 5. + A.sal -20 u 24 °C; A Figura 39 apresenta a purificação parcial da Aciltransferase de Aeromonas salmonicida apresentando a actividade de fosfolipase associada com proteína His-tag purificada. SE = Extractos sonicados, His = Purificado com Ni-NTA spin-kit de Qiagen; 134 A Figura 40 apresenta o vector de expressão petl2-A.h. GCAT=pSMa contendo o gene da Aciltransferase de Glicerolípido (GCAT) C-terminal marcado com His de Aeromonas hydrophila utilizado para transformar a estirpe de E. colí BL21(DE3)pLysS; A Figura 41 apresenta a actividade dos extractos brutos (5 & 10 pL) contendo a enzima GCAT recombinante de Aeromonas hydrophila foi testada em relação à lecitina utilizando o kit para ácido gordo Não-Esterifiçado (NEFA) (Roche, Suiça), apresentando a presença da enzima activa em relação ao fosfolípido, lecitina; A Figura 42 apresenta a optimização da cultura de BL21(DE3)pLysS contendo o vector de expressão pet12-AsalGCAT= pSM demonstrando que a cultura a 30 °C resultou na produção de enzima com actividade elevada em relação à lecitina. Os extractos celulares foram testados para a actividade de fosfolipase utilizando o ensaio do NEFA kit ; A Figura 43 apresenta a purificação parcial das Aciltransferases de Aeromonas hydrophila & A. salmonicida apresentando a actividade de fosfolipase associada com a proteína purificada His-tag. SE = Extractos Sonicados, His = Purificada com Ni- NTA spin-kit da Qiagen); A Figura 44 apresenta a expressão dos genes de Aeromonas em Bacillus subtilis 163 apresentando a produção da enzima secretada com actividade em relação a lecitina e DGDG. pUB-AH = construção contendo o gene de A. hydrophila e 135 pUB-AS, construção com o gene de A. salmonicida, o filtrado da cultura foi incubado com os substratos para 60 minutos. A Figura 45 e Fig. 46 apresentam uma placa de TLC no desenvolvimento do solvente IV (clorofórmio:metanol:água (65:25:4)); Pista 1: 40 mg de sitosterol 30 min: Pista 2: Transferase + 40 mg sitosterol 30 min; Pista 3: Transferase + 80 mg de sitosterol 30 min; Pista 4: Transferase + 40 mg de sitosterol 120 min; Pista 5: Transferase + 80 mg de sitosterol 120 min; Pista 6: Transferase + 40 mg de sitosterol 300 min; Pista 7: 40 mg de sitosterol 300 min; Pista 8: Colesterol; Pista 9: Sitosterol; A Figura 47 apresenta a reacção entre fosfatidilcolina e colesterol que é catalisada por uma aciltransferase de lípido; A Figura 48 apresenta uma análise de TLC de lípidos extraídos de gema de ovo tratada ou não tratada com enzima., 6) 0,31PLU/g Transferase N° 179, 7) l,25PLU/g Transferase N° 178-9., 8) 23,25 PLU/g Fosfolipase N° 3108., 9) Controlo. A Figura 49 apresenta amostras do teste de maionese produzidos a partir da gema de ovo tratada ou não tratada com enzima: 5) Transferase N° 179, 0,31 PLU/g. 6) Transferase N° 178-9, 1,25 PLU/g, 7) Fosfolipase N° 3108, 23.3 PLU/g 8) Controlo, água A Figura 50 apresenta uma TLC (em solvente I) de lípido de gema de ovo tratado com uma aciltransferase de lípido de A. hydrophila; 136 A Figura 51 apresenta uma TLC (em solvente IV) de lípido de gema de ovo tratado com uma aciltransferase de lípido de A. hydrophila; A Figura 52 apresenta uma análise de TLC de lípido de gema de ovo tratado com transferase ao longo do decorrer do tempo; A Figura 53 apresenta a quantidade de ácido gordo e ésteres de colesterol produzidos em função do tempo quando se utiliza uma aciltransferase de lípido (Tranf N° 178-9) comparada com a situação em que se utiliza uma enzima lipolítica de controlo, Thermomyces lanuginosus; A Figura 54 apresenta a actividade de transferase relativa como % de actividade de transferase e hidrolítica em reacções enzimáticas em gema de ovo com teor em água elevado, N° 1991 (fosfolipase A2) e N° 2427 (fosfolipase Al) são fosfolipases de controlo, N° 178 é uma aciltransferase de lípido; A Figura 55 apresenta o efeito do teor em água no ensaio da actividade de transferase da transferase N° 178 nas reacções de transferase em gema de ovo com teor em água elevado; A Figura 56 apresenta a actividade de transferase para uma aciltransferase de lípido (N° 178) em função do tempo de reacção em reacções de transferase na gema de ovo com teor em água elevado; A Figura 57 e a Figura 58 apresentam gráficos que apresentam ácido gordo e éster de colesterol em função do tempo. Os 137 gráficos apresentam os resultados obtidos a partir da análise de GLC no ensaio para medir a actividade de aciltransferase utilizando lecitina e colesterol em tampão como substrato; A Figura 59 apresenta uma TLC em solvente I. Gema de ovo tratada com aciltransferase de lípido N° 138 de Aeromonas salmonidica (pista n°. 1 e 2) ou com a fosfolipase N° 2938 (LIPOPAN® F) (pista n° . 3) ou Gema de ovo não tratada (pista n°. 4); A Figura 60 apresenta uma TLC em solvente IV. Gema de ovo tratada com aciltransferase de lipido N° 138 (pista n°. 1 e 2) ou com Fosfolipase N° 2938 (pista n°. 3). Gema de ovo não tratada (pista n°. 4); A Figura 61 apresenta gema de ovo tratada com aciltransf erase de lipido N° 138 (amostras n° 1 e 2) e com fosfolipase N° 2938 (amostra n°. 3). Gema de ovo não tratada (amostra n°. 4); A Figura 62 apresenta uma emulsão alimentar após 2 horas a 100 °C. 0) Gema de ovo não tratada 1) Gema de ovo tratada com aciltransferase de lipido N° 138 durante 210 minutos. 3) Gema de ovo tratada com a fosfolipase de controlo N° 2938 durante 210 minutos; A Figura 63 apresenta placas de TLC apresentando o rastreio da actividade de transferase em esterol vegetal e glicerol. PC = fosfatidilcolina, LPC = lisofosfatidilcolina; PE = fosfatidiletanolamina; monogl = monoglicérido; 138 A Figura 64 apresenta uma placa de TLC em solvente I, Amostras 1 até 6 após 24 horas e amostras 1 até 4 após 4 horas de tempo de reacção. A análise de TLC confirma a formação do éster de esterol nas amostras 1, 2, 5 e 6; A Figura 65 apresenta uma placa de TLC no solvente I em que a actividade de transferase de uma aciltransferase imobilizada de Aeromonas salmonicida foi testada numa mistura de óleo - com amostras retiradas a 0,5, 1, 3, 6 e 2 4 h;
As Figuras 66 e 67 apresentam placas de TLC no solvente I e IV. Pista 1 = lecitina; Pista 2 = controlo 10 min; Pista 3 = 0, 75 PLU, 10 min; Pista 4 = 0,75 PLU, 60 min; Pista 5 = 0,75 PLU, 220 min; Pista 6 = controlo , 20 h;
Pista 7 = 0,75 PLU, 20h; e Pista 8 = éster de colesterol;
As Figuras 68 e 69 apresentam placas de TLC em solvente IV. Pista 1 = lecitina; Pista 2 = controlo - 10 min;
Pista 3=1 PLU, 10 min; Pista 4=1 PLU, 60 min; Pista 5 = 1 PLU, 180 min; Pista 6 = 1PLU, 220 min;
Pista 7 = 1PLU, 1200 min; Pista 8 = controlo, 1200 min;
Pista 9 = éster de glucose; Pista 10 = colesterol; e
Pista 11 = glucose; A Figura 70 apresenta a reacção entre DGDG e glucose quando catalisada por uma aciltransferase de lípido; A Figura 71 apresenta uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 36) da construção de fusão utilizada para mutagénese do gene da aciltransferase de lipido de Aeromonas hydrophila no 139
Exemplo 17. Os aminoácidos sublinhados sao um péptido sinal da xilanase; A Figura 72 apresenta uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N° 45) que codifica uma enzima de Aeromonas hydrophila incluindo um péptido sinal da xilanase; e A Figura 73 apresenta uma placa de TLC que apresenta claramente a formação do éster de esterol e monoglicérido vegetal. Pista 1 é após 1 hora de tempo de reacção, Pista 2 é após 4 horas de tempo de reacção, Pista 3 é após 24 horas de tempo de reacção e a Pista 4 é um esterol vegetal.
EXEMPLOS
Excepto quando referido, a análise de TLC foi realizada como descrito no Exemplo 6 e a análise de GLC foi realizada como descrito no Exemplo 11. EXEMPLO 1: A clonagem, sequenciação e expressão heteróloga de uma transferase de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida
Estirpes utilizadas:
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC 14174) foi obtida a partir de ATCC e cultivada durante a noite, a 30 °C, em meio Luria-Bertani (LB) . As células foram centrifugadas e o ADN genómico foi isolado utilizando os processos para isolamento de ADN genómico de Qiagen Ltd. Genomic DNA buffer set (cat.19060), protease K (cat. 19131) e RNAse A (cat. 19101) foram todos 140 obtidos de Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX). A estirpe bacteriana hospedeira BL21 (DE3)pLysS (Novagen) foi utilizada para a produção das enzimas recombinantes de Aeromonas. Foram utilizadas células competentes de BL21 (DE3)pLysS como hospedeiros para transformação com o vector de expressão petl2- AsalGCAT=pSM. Os transformantes que continham o plasmideo apropriado foram cultivados, a 37 °C, em meio LB agar contendo 100 pg de ampicilina/mL.
Construção do vector de expressão petl2-AsalGCAT- pSM:
Para todas as amplificações de ADN dos genes da transferase de Aeromonas, foi utilizado ADN genómico (0,2-1 pL) como molde e pfu DNA polimerase (2,5 unidades) com 10 pg de tampão lOx pfu, 1 pL de cada iniciador (50 pmol/pL), 200 pM de dNTP num volume de reacção total de 100 pL. As reacções de PCR foram realizadas num termociclador programável utilizando as seguintes condições: 95 °C durante 30 segundos, 30 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 1 minuto e 68 °C durante 2 minutos. Foi aplicada uma extensão adicional de 5 minutos a 72 °C. A amplificação por PCR do gene da transferase de A. salmonicida foi realizada em 2 reacções de PCR separadas. A reacção de PCR 1 foi realizada utilizando os pares de iniciadores, aslUSNEW (5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3' [SEQ ID N° 36]) e asls950new (5' GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3' [SEQ ID N° 37]) . Foi realizada uma segunda reacção de PCR para incorporar uma Histidina C-terminal tag utilizando o
produto de PCR da primeira reacção e os iniciadores: aslUSNEW 141 (5 'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3' [SEQ ID N° 38]) e AHLS1001 (5' TTGGATCC GAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3 ' [SEQ ID N° 39]). O produto de PCR da segunda reacção foi purificada e digerida com as enzimas de restrição Nde 1 e BamEI.
Foram também digeridos 2 pg de ADN do vector pET 12a com as enzimas de restrição Nde 1 e BamHI e tratados com fosfatase. 0 petl2a tratado com enzima de restrição e o produto de PCR da reacção 2 foram purificados e ligados utilizando o Rapid Ligation Kit (Roche, Suiça). A mistura de ligação foi utilizada para transformar células de E. coli TOPIO. Os transformantes foram plaqueados em meio de LB agar contendo 100 pg/mL de ampicilina. O iniciador do promotor T7 (5'TAATACGACTCACTATAG3' [SEQ ID N° 40]) e o iniciador do terminador T7 (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3' [SEQ ID N° 41]) foram utilizados para verificar as sequências e a orientação dos genes da transferase clonada no vector pET12a. A sequenciação de ADN foi realizada utilizando o ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle sequencing kit com 500 ng de ADN de plasmideo como molde e 3,2 pmol de iniciadores do promotor de T7 e terminador. A construção apresentada na Figura 35 foi utilizada para transformar a estirpe hospedeira de bactérias competentes BL21(DE3)pLysS (Novagen) e transformantes resistentes a ampicilina foram repicados e utilizados para análise de expressão. 142
Expressão da aciltransferase de lípido recombinante de Aeromonas salmonicida
Quantificação da actividade enzimática em relação a lecitina foi determinada em extractos celulares utilizando o kit de Ácido Gordo Não-Esterifiçado (NEFA) (Roche, Suiça).
Na Figura 36, BL21(DE3)pLysS contendo o vector de expressão pet 12-AsalGCAT= pSM foi cultivado em meio LB + 100 pg/mL de ampicilina e incubado com agitação, a 37 °C, até ser alcançada uma ϋΟδοο = 0,6 até 1,0. As culturas são, então, induzidas utilizando IPTG (0,4 mM) e a incubação foi continuada durante as 3 horas seguintes. Foram retiradas amostras às 0 horas, 1, 2, e 3 horas após a indução com IPTG. A Actividade Enzimática foi testada utilizando o kit NEFA e lecitina como substrato.
Optimizaçao da Cultura para a produção de enzimas mais activas BL21 (DE3)pLysS contendo o vector de expressão pet 12-AsalGCAT= pSM foi cultivada em meio LB + 100 pg/mL de ampicilina e incubada com agitação a diferentes temperaturas de crescimento (37 °C, 30 °C, & 20 °C) . A condição óptima para a produção de enzima aciltransferase de lípido activa foi quando as culturas foram cultivadas a 30 °C como apresentado na Figura 37. 143
Purificação parcial de transferase recombinante de Aeromonas salmonicida A estirpe BL21(DE3)pLysS contendo o vector de expressão pet12-AsalGCAT=pSM foi cultivada a 37 °C & foram preparados extractos celulares brutos por sonicação. A enzima recombinante foi, então, purificada a partir dos extractos celulares brutos sonicados utilizando o Ni-NTA spin kit da Qiagen. A actividade de fosfolipase utilizando o NEFA kit & Lecitina como substrato. Extractos celulares brutos da BL21(DE3)pLysS expressando transferase activa incubada com o substrato lecitina e mistura reaccional foi analisada utilizando cromatografia de camada fina demonstrando a presença de produtos de degradação (ver Figura 38).
Purificação Parcial de transferase recombinante de Aeromonas salmonicidae. A estirpe BL21(DE3)pLysS contendo o vector de expressão pet12-AsalGCAT=pSM foi cultivada, a 37 °C, e os extractos celulares brutos foram preparados por sonicação. A enzima recombinante foi ainda purificada a partir do extracto celular bruto sonicado utilizando o Ni-NTA spin kit da Qiagen. Foi testada a actividade de fosfolipase utilizando o NEFA kit e lecitina como substrato (ver Figura 39). EXEMPLO 2 Clonagem e Expressão de transferase de Aeromonas hydrophlla em E. coli
Aeromonas hydrophila (ATCC N° 7965) foi obtida a partir de ATCC e cultivada durante a noite, a 30 °C, em meio Luria-Bertani (LB). As células foram centrifugadas e o ADN genómico foi
isolado utilizando os processos para o isolamento de ADN 144 genómico da Qiagen Ltd. Genomic DNA buffer set (cat. 19060) protease K (cat. 19131) e RNAse A (cat. 19101) foram todos obtidos de Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).
Foi utilizada a estirpe bacteriana hospedeira BL21(DE3)pLysS (Novagen) para a produção das enzimas recombinantes de Aeromonas. Foram utilizadas células competentes de BL21(DE3)pLysS como hospedeiras para transformação com o vector de expressão petl2a- A.h.GCAT=pSMa. Os transformantes que continham o plasmídeo apropriado foram cultivadas, a 37 °C, em meio de LB agar contendo 100 pg de ampicilina/mL.
Construção do vector de expressão petl2a-A.h.GCAT- pSMa:
Para todas as amplificações de ADN do gene da transferase de Aeromonas, o ADN genómico (0,2-1 gL) foi utilizado como molde e foi utilizada pfu DNA polimerase (2,5 unidades) com 10 pL de tampão pfu a ΙΟχ, 1 pL de cada iniciador (50 pmol/gL), 200 μΜ de dNTP num volume de reacção total de 100 gL. As reacções de PCR foram realizadas num termociclador programável utilizando as seguintes condições: 95 °C durante 30 segundos, 30 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 1 minuto e 68 °C durante 2 minutos. Foi aplicada uma extensão adicional de 5 minutos a 72 °C. A amplificação por PCR do gene da transferase de A. hydrophila (ATCC N° 7965) foi realizada em 2 reacções de PCR separadas. 145 A reacção de PCR 1 foi realizada utilizando os pares de iniciadores, AHUS1 (5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGT-C3 ', SEQ ID N° 42) e ahls950 (5 'ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACT-G3', SEQ ID N° 43).
Foi realizada uma segunda reacção de PCR para incorporar uma tag de Histidina C-terminal utilizando o produto de PCR da primeira reacção e os pares de iniciadores:
AHUS1(5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3' SEQ ID N° 44,) e
AHLS1001(5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3' SEQ ID N° 45) . 0 produto de PCR da segunda reacção foi purificado e digerido com as enzimas de restrição Ndel e Bamhl. Também foram digeridos 2 pg do ADN do vector pET 12a com as enzimas de restrição Ndel e BamRI e tratadas com fosfatase. O petl2a tratado com enzima de restrição e o produto de PCR da reacção 2 foram purificados e ligados utilizando o Rapid Ligation Kit (Roche, Suiça). A mistura de ligação foi utilizada para transformar células de E. coli TOPIO. Os transformantes foram plaqueados em meio LB agar contendo 100 pg/mL de ampicilina. O iniciador do promotor T7 (5'TAATACGACTCACTATAG3') e o iniciador do terminador de T7 (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3') foram utilizados para verificar as sequências e a orientação dos genes GCAT clonados no vector pET12a. A sequenciação do ADN foi realizada utilizando o ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle sequencing kit com 500 ng de ADN do plasmídeo como molde e 3,2 pmol dos iniciadores do promotor e terminador de T7. 146 A construção apresentada na Figura 40 foi utilizada para transformar (DE3)pLysS ampicilina expressão. a estirpe hospedeira bacteriana competente BL21 (Novagen) e os transformantes resistentes à foram repicados e utilizados para análise de
Expressão da transferase de Aeromonas hydrophila em BL21(DE3)pLysS A estirpe de E. coli BL21(DE3)pLysS contendo o vector de expressão pet12a-A.h.GCAT= pSMa foi cultivada em meio LB + 100 pg/mL de ampicilina e incubadas com agitação, a 37 °C, até ser atingida uma DCpoo =0,6 até 1,0. As culturas são, então, induzidas utilizando IPTG (0,4 mM) e a incubação foi continuada durante as e horas seguintes. As amostras foram retiradas às 0 horas, 1, 2, e 3 horas após indução com IPTG. A Actividade Enzimática foi testada utilizando o NEFA kit e lecitina como substrato (Figura 41).
Optimização da cultura para a produção de enzimas mais activas BL21(DE3)pLysS contendo o vector de expressão petl2a-A.h.GCAT= pSMa foram cultivadas em meio LB + 100 pg/mL de ampicilina e incubadas com agitação a diferentes temperaturas de crescimento (37 °C, 30 °C, & 20 °C) . A condição óptima para a produção de enzima GCAT activa foi quando as culturas são cultivadas, a 30 °C, como apresentado na Figura 42. 147
Purificação parcial de transferase recombinante de A. hydrophila (GCAT) A estirpe BL21(DE3)pLysS contendo o vector de expressão pet12a-A.h.GCAT=pSMa foi cultivada, a 37 °C, & os extractos celulares brutos foram preparados por sonicação. A enzima recombinante foi ainda purificada a partir dos extractos celulares brutos sonicados utilizando o Ni-NTA spin kit da Qiagen. 0 ensaio da actividade da fosfolipase utilizando o NEFA kit & Lecitina como substrato. (Figura 43). EXEMPLO 3: Expressão de transferases de Aeromonas em Bacillus subtilis 163
Construção do Plasmideo
Foram utilizados dois vectores de expressão diferentes de Bacillus subtilis (pUB 110 & pBE5) para a expressão heteróloga dos genes de Aeromonas em Bacillus subtilis. O vector pUBUO contém o promotor da alfa amilase enquanto que o vector pBE possui o promotor P32 como a região reguladora para a expressão dos genes de Aeromonas fundidos. Em pUBUO, o primeiro aminoácido dos genes GCAT maduros de Aeromonas foram fundidos em grelha com o último aminoácido da sequência do péptido sinal da xilanase de Bacillus subtilis através do sítio de restrição Nhel f criando 2 aminoácidos adicionais em frente das proteínas maduras. O pBE5 contém a sequência sinal da cgtase de fusão no sítio iVcol para a secreção das proteínas recombinantes no filtrado de cultura. 148
As reacções de PCR foram realizadas para obter os genes de Aeromonas fundidos em grelha com as sequências sinal dos vectores pUB 110 e pBE5. As PCR foram realizadas utilizando os seguintes pares de iniciadores para o gene de A. hydrophila:
Reacção de PCR 1: usAHncol (5'ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEQ ID N° 46) e IsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID N° 47)
Reacção de PCR 2: US-Ahnhel (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEQ ID N° 48.) e IsAH (5’TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3, SEQ ID N° 49)
As PCR foram realizadas utilizando os seguintes pares de iniciadores para o gene de A. salmonicida:
Reacção de PCR 3: US-Asncol (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGGC3', SEQ ID N° 50) e IsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID N° 51)
Reacção de PCR 4: US-ASnhel (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEQ ID N° 52) e IsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID N° 53)
Todos os produtos de PCR foram clonados em PCR blunt II (TOPO vector) e sequenciados com iniciadores de sequenciação de sentido directo e reverso.
Os clones das reacções de PCR 1 & 3 foram cortados com Nco1 & Bam Hl e utilizados como inserções para a ligação ao vector pBE5 cortado com Ncol/BamHI/£osfatase. Os clones das reacções de PCR 2 & 4 foram cortados com NheI & Bam Hl e utilizados como 149 inserções para a ligaçao ao vector pUB que foi cortado com Nhe1/BamHI/fosfatase.
Expressão dos genes da transferase de Aeromonas em Bacillus subtilis e caracterização da actividade enzimática.
As aciltransferases das duas espécies de Aeromonas foram expressas com sucesso em E. coli (resultados acima). As construções da fusão do gene de Bacillus pUBUO & pBE5 foram utilizados para transformar Bacillus subtilis e os transformantes foram seleccionados plaqueando em placas de canamicina. Os transformantes resistentes à canamicina isolados e cultivados em 2xYT são capazes de expressão heteróloga dos genes de Aeromonas em Bacillus. Os filtrados da cultura possuem actividade de digalactosildiacilglicerol (DGDG) galactolipase, adicionalmente a possuir ambas as actividades de aciltransferase e fosfolipase. A actividade dirigida a digalactosildiacilglicerol (DGDG) foi medida após 60 minutos de incubação do sobrenadante da cultura com o substrato, a DGDG de farinha de trigo (que se pode obter da Sigma) assim como a actividade dirigida à lecitina como apresentado na Figura 44. Bacillus produziu a enzima após um período de cultura de durante a noite (20-24 horas) até 48 horas no meio de cultura como uma proteína secretada. Em alguns casos, a expressão dos genes de Aeromonas demonstraram interferir com a viabilidade celular e o crescimento em Bacillus & E. coli, é, por isso, necessário seleccionar cuidadosamente as estirpes de expressão e optimizar as condições de crescimento para assegurar a expressão. Por exemplo, foram transformadas estirpes de hospedeiros de Bacillus (B.s 163, DB104 e OS 21) com o vector de expressão para comparação de cultura. B.sl63 é transformável com os 2 genes de 150
Aeromonas e é capaz de expressar a proteína activa. DB104 é transformável com todas as construções, mas é apenas capaz de expressar transferase de A. salmonicida. EXEMPLO 4: Fermentação e Purificação de aciltransferase de lipidos de Aeromonas produzida em E.coli
Fermentações de E.coli:
Microrganismos
Foram utilizadas neste estudo duas estirpes de Eschericia coli, uma contendo uma aciltransferase de lípido de Aeromonas hydrophila (Exemplo 2) e duas contendo aciltransferase de lipidos de Aeromonas salmonicida, (Exemplo 1). A estirpe de E. coli contendo o gene da A. hydrophila foi denominada DIDK0124 e a estirpe de E. coli contendo o gene de A. salmonicida foi denominada DIDK0125. A fermentação com DIDK0124 foi denominada HYDR00303 e a fermentação com DIDK0125 foi denominada SAL0302. A proteína purificada de HYDRO025 foi denominada REF N° 138. A proteína purificada de HYDR00303 foi denominada REF N° 135.
Meio de crescimento e condições de cultura LB-agar
As placas de LB agar utilizadas para manter as estirpes continham: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levedura, 151 5 g/L NaCl, 15 g/L agar, 100 mg/L de ampicilina e 35 mg/L de cloranfenicol. As placas de agar foram incubadas a 30 °C.
Frascos de agitação com LB O meio LB (50 mL por frasco de agitação) utilizado para a produção de material de inoculo para as culturas do biorreactor continha: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levedura, NaCl a 5 g/L, 100 mg/L de ampicilina e 35 mg/L de cloranfenicol. Os frascos de agitação foram inoculados das placas de LB agar e incubadas a 30 °C e 200 rpm.
Cultura em biorreactor
As culturas em biorreactor foram realizadas em biorreactores de 6 L embutidos cheios com 4 L de meio contendo: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levedura, 5 g/L de NaCl, 8 g/L de KH2P04, 0,9 g/L MgS04, 7H20, 40 g/L de mono-hidrato de glucose,
0,4 mL/ ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, Holanda), 10 mg/L (NH4)2Fe (S04)2*6H20, 0,7 mg/L
CuS04 · 5H20, 3 mg/L ZnS04-7H20, 3 mg/L MnS04-H20, 10 mg/L EDTA, 0,1 mg/L NiS04-6H20, 0,1 mg/L CoCl2, 0,1 mg/L H3B04, 0,1 mg/L Kl, 0,1 mg/L Na2Mo04 · 2H20, 1 g/L de ampicilina e 35 mg/L de cloranfenicol.
Os biorreactores foram inoculados com uma quantidade de cultura em LB assegurando o final do crescimento após aproximadamente 20 horas de cultivo (calculadas a partir da taxa de crescimento especifico máxima de 0,6 h_1, a D06oo do frasco de 152 agitaçao com LB e a DCgoo final no biorreactor de, aproximadamente, 20). O SAL0302 foi inoculado com 10 mL de cultura de LB e foi inoculado HYDR00303 com 4 mL de cultura de LB.
Os biorreactores foram operados nas seguintes condições: temperatura de 30 °C, agitação a 800-1000 rpm (dependendo da experiência), arejamento a 5 L/min, pH 6,9, pH controlo 8,75% (p/v) NH3-água e H2SO4 a 2 Μ. A indução foi realizada por adição de isopropil β-D-tiogalactósido até uma concentração final de 0,6 mM, quando foram produzidas 0,4 moles (HYDR00303) e 0,7 moles de CO2, respectivamente.
Recolha
Foi utilizado o seguinte processo para recolher e homogeneizar a biomassa: 1) O caldo de fermentação das fermentações foi centrifugado a 5000 X g e a 4 °C durante 10 minutos, e o sobrenadante foi eliminado. A biomassa foi armazenada a -20 °C até à utilização. A biomassa foi descongelada e ressuspensa em 500 mL de NatbPCg a 20 mM, pH 7,4, NaCl a 500 mM, Imidazole a 10 mM e inibidor de protease completo (sem EDTA) (Roche, Alemanha) . 2) A biomassa suspensa foi homogeneizada a 2 kbar e a 4 °C num sistema de rebentamento celular da Constant Systems Ltd (Warwick, Reino Unido). 153 3) Os resíduos celulares foram removidos por centrifugação a 10000 X g e a 4 °C durante 30 minutos seguido por recolha do sobrenadante. 4) O sobrenadante foi clarificado ainda mais através de centrifugação a 13700 X g e a 4 °C durante 60 minutos, seguido por recolha do sobrenadante. 5) O sobrenadante foi filtrado através de filtros de 0,2 pm Vacu Cap (Pall Life Sciences, Reino Unido) e o filtrado foi recolhido para purificação cromatográfica imediata.
Purificação cromatográfica das Transferases
Foi empacotada uma coluna (2,5 x 10 cm) com 50 mL de Chelating Sepharose ff. gel e carregada com Ni-sulfato (de acordo com o método descrito pelo fabricante, Amersham Biosciences) . A coluna foi equilibrada com 200 mL de NaH2P04 a
20 mM, pH 7 ,4, NaCl a 500 mM, Imidazole a 10 mM. Foi aplicado 400 mL de extracto bruto à coluna a uma taxa de fluxo de 5 mL/min. A coluna foi, então, lavada com NaH2P04 a 2 0 mM, pH 7,4, NaCl a 500 mM, Imidazole a 10 mM até a UV2so ter alcançado a linha de base. A GCAT foi, então, eluída com 40 mL de NaH2PC>4 a 20 mM, pH 7,4, NaCl a 500 mM e Imidazole a 500 mM. 154 EXEMPLO 5: Fermentação e Purificação de aciltransferase de lipidos de Aeromonas produzida em Bacillus subtilis.
Fermentações BAC0318-19, BAC0323-24
Microrganismo
Os microrganismos utilizados neste estudo têm origem na transformação de uma estirpe hospedeira de Bacillus subtilis, N° 163 com um plasmídeo contendo o gene que codifica a transferase de Aeromonas salmonicida inserida no vector pUBUOOIS. A expressão do gene é controlada por um promotor da alfa-amilase, e a secreção da transferase é mediada pela sequência sinal de xilanase de B. subtilis (Exemplo 3). As estirpes foram denominadas DIDK0138 (fermentação BAC0318-19) e DIDK0153 (fermentação BAC0323-24) .
Meio de crescimento e condições de cultura
Meio pré-cultura
Foi adicionado a um frasco de agitação (500 mL de volume total, com deflectores) 100 mL de um meio contendo:
NaCl 5 g/L
10 g/L 20 g/L K2HP04
Farinha de soja
Extracto de levedura, BioSpringer 106 20 g/L
5 mL/L
Antiespuma, SIN260 155 ο ρΗ foi ajustado para 7,0 antes de autoclavar
Após autoclavar foram adicionados 6 mL a 50% (p/p) de
Nutriose por frasco. A canamicina foi adicionada a uma concentração de 50 mg/L após autoclavar.
Inoculação
Foi inoculada uma pré-cultura em frasco de agitação com cultura congelada directamente a partir de um stock de glicerol a 25% (p/v). 0 frasco de agitação foi incubado a 33 °C e 175 rpm durante, aproximadamente, 16 horas, em que 50 mL foi utilizado para inocular o fermentador.
Fermentações
As fermentações foram realizadas em fermentadores embutidos de 6 L. 0 meio descontinuo (3 L) continha:
Água de maceração de milho (50% dw) 40 g/L
Extracto de levedura BioSpringer 153 (50% dw) 10 g/L NaCl 5 g/L
CaCl2, 2H20 0,25 g/L
Mn (N03) 2, H20 0,2 g/L
Anti-espuma SIN260 1 mL/L
Canamicina (esterilizada por filtro para o fermentador após autoclavar 50 mg/L 156 A raçao continha: 540 g/kg 4,8 g/kg 4 mL/kg 150 g/kg
Mono-hidrato de glucose MgS04, 7H20 Anti-espuma SIN260
Extracto de levedura,BioSpringer 153 (50% dw) A ração na fermentação BAC0318 e BAC0323 foi iniciada com base no C02 acumulado, de acordo com as equações abaixo:
Ração - fluxo[g/h]=0,AcCO2 < 0,15
Ração-fluxo[g/h]=2,85 + t*l,54, AcC02 ^ 0,15 e t < 12
Ração - fluxo[g/h]= 21,3, t > 12 t: tempo (horas) a partir do ponto em que o C02 acumulado (AcC02) atingiu as 0,15 moles. A ração na fermentação BAC0319 e BAC0324 foi iniciada com base no C02 acumulado, de acordo com as equações abaixo:
Ração - fluxo[g/h]=0,AcCO2 < 0,15
Ração-fluxo [g/h] =2,0 + fl,08, AcC02 > 0,15 e t < 12
Ração - fluxo[g/h]= 15, t > 12 t: tempo (horas) a partir do ponto em que o C02 acumulado (AcC02) atingiu as 0,15 moles. 157 Ο ρΗ foi controlado a 7,0 adicionando 12,5% (p/v) de NH3-água ou ácido fosfórico a 2 M. 0 arejamento foi de 3 L/min correspondendo a 1 vvm A temperatura foi de 33 °C. 0 fermentador foi equipado com dois impulsores de 8 cm 0 Rushton colocados a uma distância de 10 cm.
Recolha A biomassa foi removida por centrifugação a 16000 X g durante 10 minutos à temperatura ambiente. 0 sobrenadante foi esterilizado por filtração e o filtrado foi utilizado para testes de purificação e aplicação. EXEMPLO 6. Testes de aplicação em gema de ovo.
Nas seguintes experiências a transferase isolada de Aeromonas salmonicida expressa em E. coli foi testada em gema de ovo apenas e em gema de ovo à qual foi adicionado um esterol vegetal.
Material
Transferase de Aeromonas salmonicida REFN° 138 Gema de ovo: de ovo fesco (ovos de galinhas)
Esterol vegetal: β-sitosterol, Sigma S 5753 158
Placas de TLC: Placas de sílica Merck n° 1.05715.0001
Análise de TLC. A placa de TLC foi activada numa câmara aquecida (110 °C) durante V2 h.
Foi vertido 100 mL de solvente de revelação para uma câmara de cromatografia com tampa. As paredes da câmara foram cobertas com papel de filtro (Whatman 2) de modo a saturar a câmara com o vapor de solvente. A placa de TLC foi colocada numa grelha e a amostra foi aplicada na placa de TLC a 2 cm do fundo. A placa de TLC foi, então, colocada na câmara de TLC com o solvente de revelação. Quando o solvente de revelação alcançou os 14 cm do fundo da placa. A placa de TLC foi retirada e seca numa "hotte" e depois colocada na câmara aquecida a 110 °C durante 10 minutos. A placa de TLC foi, então, imersa no reagente de revelação, e seca na câmara aquecida a 110 °C durante 15 minutos
Solvente de revelação: N° IV: Clorofórmio : Metanol : H20 (65:25:4) N° I: P-éter : MTBE : Ácido Acético (60:40:1)
Tampão de Revelação (Vanadato-tampão): 32 g de Na2C03 ad 300 mL H20 (1 M) 18,2 g pentóxido de vanadato (V205) é adicionado e dissolvido durante agitação moderada. 159 A solução é arrefecida até à temperatura ambiente.
É adicionado, cuidadosamente, 460 mL de H2S04 a 2,5 M (46 0 mL H20 + 61 mL de H2S04) . É adicionada água até 1000 mL.
Actividade de Fosfolipase.
Substrato: É dissolvido 0,6% L-oí Fosfatidilcolina Vegetal 95% (Avanti N° 441601) + 0, 4% Triton-X 100 (Sigma X-100) + CaCl2 a 5 mM em tampão HEPES a 0,05 M a pH 7.
Processo.
Foi adicionado 400 pL de substrato a um tubo Eppendorf de 1,5 mL e colocado num Eppendorf thermomixer, a 30 °C, durante 5 minutos.
Para o tempo T = 0, foi adicionado 50 pL de solução de enzima. Também foi analisado um branco com água em vez de enzima. A amostra foi misturada a 1000 rpm em Eppendorf Termomixer, a 30 °C, durante 10 minutos. Para o tempo T=10 min. O tubo Eppendorf foi colocado noutro termomixer, a 99 °C, durante 10 minutos para parar a reacção.
Os ácidos gordos livres nas amostras foram analisados utilizando o NEFA kit de WAKO GmbH. 160 A actividade da enzima PLU-7 pH 7 foi calculada como micromoles de ácido gordo produzida por minuto em condições de ensaio.
Extracção de lipidos.
Foi misturado 1 g de gema de ovo e 7,5 mL de
Clorofórmio:Metanol 2:1 numa Whirley e centrifugada a 750 x g durante 10 minutos.
Foi isolado 3 mL da fase clorofórmio e utilizado para posterior análise de lipidos.
Resultados: A transferase (REF N° 138), de Aeromonas salmonicida expressa em E. coli foi analisada para a actividade de fosfolipase como descrito acima, e foi também testada em gema de ovo com e sem β-sitosterol. A amostra foi agitada com um agitador magnético durante a reacção. A concepção experimental é apresentada na Tabela 1 161
Tabela 1
Teste Tempo de Gema de ovo Sitosterol Transferase reacção a 37 °C N° 138 N° Minutos grama mg Unidades 1 30 1 40 2 30 1 40 0,75 PLU 3 30 1 80 0,75 PLU 4 120 1 40 0,75 PLU 5 120 1 80 0,75 PLU 6 300 1 40 0,75 PLU 8 300 1 40 A reacção foi parada adicionando 7,5 mL de Clorofórmio:Metanol (2:1) e misturada num misturador Whirley durante 30 segundos. A fase de clorofórmio foi isolada por centrifugação e 2 μί da fase de clorofórmio foi transferida para uma placa de TLC em silica pré-activada e eluída com solvente de revelação N° I, e outra placa de TLC no solvente de revelação IV.
Os resultados da análise de TLC são apresentados nas Figuras 45 e 46. A reacção da transferase com uma transferase de Aeromonas salmonicida em gema de ovo, onde o esterol vegetal foi adicionado demonstrou que a enzima transfere ácido gordo da lecitina na gema de ovo para o colesterol durante a formação do éster de colesterol. 0 cromatograma de TLC também indicou que parte do esterol adicionado à gema de ovo foi transferido para o éster de esterol. 162 A quantidade de éster de esterol relativa à quantidade de éster de colesterol formada durante a reacção pode ser analisada por HPLC ou GLC. É conhecido que o éster de esterol reduziu a absorção de colesterol no intestino. É também indicado na literatura que os ésteres de colesterol são menos absorvidos do que o colesterol livre no intestino. Quando é adicionada uma transferase e esterol vegetal é adicionado à gema de ovo, é obtido um produto que provoca absorção de colesterol reduzida e, ao mesmo tempo, é produzida lisolecitina que melhora as propriedades de emulsificação da gema de ovo. Outra vantagem de adicionar a transferase e esterol vegetal à gema de ovo é que o éster de esterol vegetal é ingerido juntamente com o colesterol natural disponível, que se espera possuir o efeito mais elevado na redução da absorção do colesterol. EXEMPLO 7: Modificação de gema de ovo por aciltransferase de lípido de Aeromonas salmonicida.
De acordo com a presente invenção, foi demonstrado que é possível produzir lisolecitina a partir de gema de ovo sem a formação de ácido gordo livre substancial através da utilização de uma transferase. 0 conteúdo da gema de ovo em lecitina é um emulsif icador importante para a produção de maionese com a limitação de a maionese não ser estável ao calor. Foi, por isso, conhecido, durante vários anos, a utilização de fosfolipase do pâncreas para modificar lecitina em gema de ovo para a lisolecitina, que é um emulsif icador mais eficiente. A utilização de gema de ovo 163 modificada pela enzima na produção da maionese contribui com uma estabilidade ao calor da massa da maionese durante a pasteurização. Uma limitação de utilizar a fosfolipase do pâncreas em gema de ovo é que a quantidade de ácido gordo livre também aumenta, o que contribui para reduzir a estabilidade oxidativa devida aos ácidos gordos livres são mais susceptiveis à oxidação do que o éster correspondente. 0 ácido gordo livre também pode contribuir com um sabor "a ranço". A transferase de Aeromonas salmonicida foi expressa com sucesso em B. subtilis e fermentada à escala laboratorial como descrito no Exemplo 5, purificada por cromatografia líquida e utilizada para modificar lípidos de gema de ovo. A gema de ovo modificada por enzima foi utilizada para produzir maionese estável ao calor. A transferase de A. salmonicida pode ser utilizada para produzir lisolecitina e éster de colesterol em gema de ovo sem produção de quantidades significativas de ácidos gordos livres. Isto quer dizer, sem aumentar ou aumentar substancialmente os ácidos gordos livres no alimento. A gema de ovo modificada pela enzima produzida pela transferase demonstrou propriedades de emulsificação melhoradas e pode ser utilizada para maionese estável ao calor.
Esta enzima foi altamente funcional na modificação de gema de ovo através da catalisação da reacção de transferência de lípidos entre lecitina e colesterol Figura 47. 164
Este estudo investigou, ainda, a utilização de transferase para a modificação de gema de ovo e a utilização de gema de ovo modificada na produção de maionese estável ao calor.
Este exemplo descreve a fermentação, isolamento, e aplicação da transferase em gemas de ovo assim como a aplicação da gema de ovo modificada pela enzima em maionese. 0 exemplo é dividido em duas partes: A. Aplicação de transferase em gema de ovo B. Teste da gema de ovo modificada pela enzima em maionese EXPERIMENTAL A. Aplicação Enzima e substrato
Transferase N° 178-9 de A. salmonicida, purificação 2554-100 C73, 15 PLU-7/mL. Transferase N° 179 de A. salmonicida, 18,5 PLU-7/mL.
Fosfolipase AI LECITASE™ Ultra (Novozymes A/S, Dinamarca) Gema de ovo: Gema de ovo liquida com 8% de sal, SANOVA FOODS, DK A análise de TLC foi realizada como descrito previamente (ver acima Exemplo 6).
Actividade de Fosfolipase: Ver exemplos anteriores. 165
Extracção de lípidos 1 g de gema de ovo e 7,5 mL de Clorofórmio: Metanol 2:1 foi misturado num Whirley durante 30 seg. e centrifugado a 750 x g durante 10 minutos. 4 mL da fase de clorofórmio foi isolada e utilizada para posterior análise de lípidos.
Teste de estabilidade de oxidação A estabilidade de oxidação da maionese foi medida num equipamento ML OXIPRESS no qual a amostra é sujeita a stress oxidativo por meio de pressão sob calor numa atmosfera de oxigénio.
Após algum tempo, denominado o período de indução (IP), a oxidação da amostra provoca um certo consumo de oxigénio, que é registado como alteração de pressão de um transdutor de pressão. 0 período de indução superior indica melhor estabilidade de oxidação. Processo.
Foi colocado 5 gramas de maionese num recipiente de vidro e o recipiente de vidro é fechado com o transdutor de pressão. 0 recipiente é cheio com oxigénio até 5 bars. A válvula é aberta para vazar o conteúdo. Este processo é repetido duas vezes e a amostra com 5 bar de atmosfera de oxigénio é colocada a 80 °C. A pressão de oxigénio em função do tempo é medida e o período de indução (IP) calculado em horas. 166
Resultados A transferase purificada da amostra Aeromonas salmonicide N° 179 e N° 178-9 foram utilizadas para tratar gema de ovo como delineada na Tabela 2. 0 teste inicial demonstrou que a transferase GCAT deve ser adicionada com actividade fosfolipase (PLU) muito mais baixa, do que uma fosfolipase comercial. Isto é explicado pelo facto de a GCAT ser uma transferase e, por isso, possuir actividade hidrolítica muito mais baixa do que uma fosfolipase normal.
Tabela 2
Gema de ovo Sanofo 8% de sal 2344-44 C89 18,5 PLU-7/mL Transferase N° 178-9 N° 3108, Lecitase Ultra Água N° Gema de ovo Transferase N° 179 18,5 PLU-7/mL 1500 PLU-7/mL 7/mL grama grama grama mL grama PLU- 7/mL 6 120 2,00 8,00 0,31 7 120 10 0 1,25 8 120 1,86 8, 14 23,25 9 120 10 0
As reacções enzimáticas foram realizadas aumentando o volume da gema de ovo e da enzima numa proveta. As amostras foram colocadas numa câmara de aquecimento a 37 °C, durante agitação lenta. Após 1, 2 e 4 horas de tempo de reacção a amostra foi retirada para análise por TLC. Após 4 horas de tempo de reacção o produto foi armazenado a 5 °C e utilizado para experiências de maionese. 167
As análises de TLC dos lípidos extraídos de gema de ovo tratada com enzima são apresentadas na Figura 48.
As análises de TLC na Figura 48 apresentam um efeito hidrolítico claro de Fosfolipase N° 3108 no triglicérido durante a formação de ácidos gordos livres, assim como alguns mono- e diglicéridos. A fosfolipase N° 3108 parece não ter efeito no colesterol. Ambas as amostras de transferase contribuem claramente para a formação de éster de colesterol concomitante com a redução do teor em colesterol. D. Gema de ovo modificada pela enzima em Maionese
De modo a investigar o efeito da modificação das amostras da gema de ovo mencionado na Tabela 2, os ensaios de aplicação foram realizados em maionese com um teor de gordura de 50%. A maionese contendo gema de ovo não tratada foi também produzida. 0 objectivo da investigação foi determinar o impacto das propriedades da emulsificação das gemas de ovo modificadas enzimaticamente e o impacto na estabilidade ao calor. Todas as amostras de maionese continham o mesmo nível de óleo e foram emulsifiçadas apenas com gema de ovo.
As amostras de maionese foram todas produzidas utilizando um misturador Koruma (Disho V60/10) e aquecidos durante o processamento, a 95 °C, durante 5 minutos.
As amostras das maioneses (Figura 49) produzidas por gema de ovo tratada com enzima eram agradáveis e homogéneas sem 168 separação de óleo. A amostra de controlo separada numa fase de óleo e a água. 0 tamanho de partícula da gotícula de óleo nas amostras de maionese com gema de ovo tratada com enzima foi medida num Malvern Mastersizer. A amostra foi misturada com 0,1 % de SDS em tampão fosfato a 0,1 M pH 7 antes da medição. A leitura foi o tamanho médio de todas as partículas como apresentado na Tabela 3.
Tabela 3.
Experiência Enzima Tamanho médio de partícula, μπι 6 Transferase N° 179, 0,31 PLU-7/g 12,9 7 Transferase N° 178-9, 1,25 PLU-7/g 7,2 8 N° 3108, Lecitase Ultra, 23 PLU-7/g 5, 2
Os resultados da medição do tamanho de partícula demonstrou claramente, o efeito da dosagem aumentada de transferase de A. salmonicida. Com a dosagem elevada de transferase o tamanho de partícula é próximo da maionese produzida por Lecitase Ultra. Deve, contudo, ser tido em consideração que a Lecitase Ultra produz um conjunto de ácidos gordos, o que pode contribuir para uma distribuição de partículas mais fina. O tamanho da gotícula de partícula da maionese preparada com a enzima é significativamente mais pequeno do que o tamanho da gotícula de óleo da maionese preparada sem a enzima (i. e., a maionese de controlo). 169
Estabilidade de oxidaçao A estabilidade de oxidação das amostras de maionese 7 e 8 foram analisadas num ML OXIPRES com resultados apresentados na Tabela 4.
Tabela 4
Amostra Período de indução Período de indução 1. horas de determinação 2. horas de determinação 7 37, 44 38,08 8 35,68 35,52 A medição da estabilidade de oxidação produziu uma diferença significativa mais clara na estabilidade de oxidação. A maionese com gema de ovo, tratada com transferase 179-8, tinha uma melhor estabilidade de oxidação significativa do que a maionese com gema de ovo tratada com Lecitase Ultra. Isto pode ser explicado pelo facto de a Lecitase Ultra produzir mais ácidos gordos livres que são mais susceptiveis à oxidação do que os ésteres de ácido gordo correspondentes.
Uma amostra das gemas de ovo utilizadas para a produção de maionese foi extraída com clorofórmio e os lípidos da gema de ovo foram analisados por GLC com os resultados apresentados na Tabela 5. 170
Tabela 5
Experiência Enzima Ácido gordo Colesterol Éster de colesterol Triglicéridos 6 Transferase N° 179 0,96 0,94 0,49 23,95 7 Transferase N° 178-9 1,84 0,60 1,06 24,54 8 N° 3108, Lecitase Ultra 14, 05 1, 16 0,12 2,45 9 Controlo 0,48 1, 16 0,13 22,87
Os resultados de GLC na Tabela 5 confirmam os resultados da análise de TLC que a Lecitase Ultra produz uma quantidade muito elevada de ácidos gordos livres e uma grande parte do triglicérido é hidrolisada. Por outro lado, a transferase produz apenas quantidades modestas de ácidos gordos livres e não são hidrolisados triglicéridos. É também, claramente demonstrado, que a transferase produz éster de colesterol a partir do colesterol.
Os resultados indicam que a quantidade de PC na maionese "tratada com a enzima" é reduzida em comparação com a maionese de controlo, enquanto que a quantidade de LPC é aumentada na maionese tratada com enzima em comparação com a maionese de controlo. 0 aumento na quantidade de LPC pode bem explicar as propriedades de emulsificação melhoradas da maionese tratada com enzima em comparação com a maionese de controlo. As análises de HPLC e GLC também indicam um nível mais baixo de colesterol livre na maionese tratada com enzima em comparação com a maionese de controlo, provavelmente devido ao colesterol a ser utilizado como uma molécula aceitadora na reacção de transferase que resulta num aumento na quantidade de ésteres de colesterol na maionese tratada com enzima em comparação com a maionese de 171 controlo. Adicionalmente, os resultados indicam que a quantidade de ácidos gordos livres não aumenta significativamente quando a gema de ovo é tratada com a transferase. Os resultados indicam ainda que a quantidade de ácidos gordos livres produzido no alimento tratado com uma aciltransferase de lípido é significativamente inferior à do alimento tratado com a fosfolipase de controlo, isto é verdade mesmo se a quantidade de lisolecitina formada nos alimentos é a mesma. EXEMPLO 8: Efeito da transferase de Aeromonas salmonicida em bolos. 0 efeito da aciltransferase GCAT de Aeromonas salmonicida é testado numa receita de bolo. A enzima é testada isoladamente e em combinação com outras enzimas lipolíticas. As enzimas são adicionadas a alguns dos ingredientes do bolo ou adicionadas juntamente com os outros ingredientes do bolo antes de misturar o bolo.
Resultados preliminares demonstram que a aciltransferase combinada com uma enzima que hidrolisa triglicéridos melhora o volume do bolo e a estrutura do miolo em comparação com um controlo.
Nas experiências seguintes uma transferase de A. salmonicida e suas variantes são testadas isoladamente e em combinação com enzimas que hidrolisam triglicéridos. Estas enzimas são activas nas componentes lipidicas no ovo e na gordura vegetal, assim como nos hidratos de carbono, proteína, glicerol e colesterol (no ovo), que forma uma parte da receita do bolo. 172
Materiais e método
Enzima N° 179, Aciltransferase de Aeromonas salmonicida Grindamyl EXEL 16, Lipase de Thermomyces lanuginisus
Receita do bolo:
Ingredientes O, "O g Açúcar 35/20 20,37 204 Farinha de bolos, Albatros 18, 11 181 Amido de trigo 5,21 52 Fermento 0,36 4 Ovos líquidos pasteurizados 22,63 226 Gordura vegetal Vegao (Aarhus United) 18, 11 181 Pó de trigo 0,68 7 Xarope de glucose, 75% 42 DE 4,53 45 Glicerol 1,36 14 Sal 0,32 3 Óleo de colza 6,34 63 Sorbato de potássio 0,18 1,8
Equipamento:
Misturador: Hobart N50 com uma espátula Forno: Forno para bolos Simon 173
Processo:
Todos os ingredientes devem ser temperados até à temperatura ambiente. 1. Misturar o açúcar e a gordura vegetal num creme durante 3 minutos - começar com a 2a velocidade e acelerar para a 3a velocidade dentro de 30 seg 2. Adicionar os restantes ingredientes - começar na Ia velocidade e acelerar para a 2a velocidade dentro de 30 s - misturar num total de 5 min
3. Medir o volume da massa liquida numa taça de 1 dL 4. As taças de bolo de libra são aspergidas com óleo de espalhar "Babette", e cobertas com papel 5. Pesar 2 x 350 g para dentro das taças de bolo de libra 6. Espalhar a massa uniformemente com uma espátula 7. Antes de colocar no forno - adicionar um fio de óleo no topo do bolo (longitudinalmente no meio - para fazer com que o bolo parta ao meio
8. Cozer durante 50 min. a 180 °C 9. Após cozer retirar as taças do forno, e "deitá-las" sobre a mesa, antes de retirar os bolos das taças 10. Retirar o papel dos bolos e virar ao contrário 11. Os bolos são arrefecidos num gradeamento durante 60 min. antes de pesar e medir o volume
Notas: A(s) enzima(s) utilizada(s) é/são adicionadas no inicio da mistura ou é/são adicionadas a alguns dos ingredientes antes de adicionar aos outros ingredientes do bolo. 174
As enzimas são activas apenas durante a mistura ou reacção dos componentes do bolo e as enzimas são inactivadas durante a cozedura do bolo.
Resultados.
As seguintes experiências são realizadas como apresentado na tabela seguinte: 1 2 3 4 Ovo inteiro G 250 250 250 250 Xarope de glucose, 75% DE 42 G 10 10 10 10 N° 179 aciltransferase, 26 PLU/mL MI 25 25 Grindamyl EXEL 16, Mg 37, 5 37, 5 Água 25
Ovo, Xarope de glucose e enzima são reagidos durante 30 minutos a 37 °C e, pouco tempo depois, os ovos são utilizados para produzir bolo de acordo com a receita mencionada acima.
Os resultados preliminares demonstram que uma combinação de aciltransferase e uma lipase que hidrolisa triglicérido de Thermomyces lanoginosus melhora o volume do bolo e, também, a estrutura do miolo, qualidade e aspecto do alimento é melhorado em comparação com a água de controlo. Os resultados preliminares indicam que no bolo pode ser preferível utilizar uma combinação de aciltransferases de lípido e uma lipase. 175 EXEMPLO 9: O objectivo destas experiências foi testar uma transferase de A. hydrophila expressa em E. coli. A reacção de transferase de A. hydrophila N° 135 (0,5 NEFA-PLU/mL) foi testada em gema de ovo. A concepção experimental é apresentada na Tabela 6.
Tabela 6
Tempo de reacção Gema de ovo N° 135 conc. N° Minutos Grama Unidades, PLU-NEFA 1 30 1 0,000 2 30 2 0,100 3 60 2 0,100 4 150 2 0, 100 5 240 2 0, 100 6 1560 2 0, 100 7 1560 1 0,000 A gema de ovo foi aquecida a 37 °C e a enzima foi adicionada. Após o tempo de reacção foi adicionado 7 mL de CHCI3 :Metanol 2:1 e misturado num Whirley durante 30 seg. A amostra foi centrifugada a 800 x g, durante 10 minutos, e a fase de solvente inferior foi isolada. Foram aplicados 2 pL desta amostra a uma placa de Sílica de TLC e eluída em solvente de eluição IV. Os resultados da análise de TLC são apresentados nas Figuras 50 e 51. 176
Os métodos e materiais mencionados neste Exemplo sao aqueles detalhados nos Exemplos acima.
As amostras desta experiência também foram analisadas por GLC como derivados de TMS. Os resultados da análise de GLC são apresentados na Tabela 7.
Tabela 7. Análise de GLC de lipido de gema de ovo N° Reacção Transferase N° 135 conc. tempo Unidades/g de gema de ovo Ácido gordo livre Colesterol Éster de colesterol min o. Ct o, o 7 Controlo 0 0,25 2, 88 0,34 3 60 0, 025 0,25 2,68 0,56 4 150 0, 025 0,29 1, 85 1, 72 5 240 0, 025 0,53 1, 42 3,54 6 1560 0, 025 0, 95 0,3 4, 43 A partir da análise de GLC do ácido gordo livre, colesterol e éster de colesterol, é possível calcular a concentração molar de cada componente e calcular a % de actividade de transferase como apresentado na Tabela 7. Cálculo de % actividade transferase A partir dos resultados o aumento em ácidos gordos livres, são calculados os ésteres de esterol 177 Δ% ácido gordo = % Ácido gordo (enzima) - % ácido gordo (controlo) Δ % éster de esterol = % esterol/estanol(enzima)-% éster de esterol/estanol (controlo) A actividade da transferase é calculada como a % da actividade enzimática total: % de actividade de transferase = _(A%éster de esterol/(Mv éster de esterol) x 100 A%éster de esterol/(Mv éster de esterol)+Δ% ácido gordo/(Mv ácido gordo) em que:
Mv éster de esterol = peso médio molecular dos ésteres de esterol
Mv ácido gordo = peso médio molecular dos ácidos gordos 178
Tabela 8 Actividade de transferase em gema de ovo de A. Hydrophila N° 135 N° Reacção Transferase N° 135 conc. Tempo Unidades/g gema de ovo Ácido gordo livre Colesterol Éster de colesterol Actividade de transferases Min mM mM mM % 7 Controlo 0 8, 9 74, 5 5, 3 - 3 60 0, 05 8,9 69,3 8,7 100 4 150 0, 05 10,4 47, 8 26, 5 93 5 240 0, 05 18,9 36, 7 54, 6 77 6 1560 0, 05 33,9 7,8 68, 4 48
Ambas as análises de TLC e GLC confirmam que inicialmente a reacção de transferase de A. hydrophila N° 135 é a reacção dominante. Após 150 minutos de tempo de reacção ocorre alguma actividade hidrolitica. Após 1560 minutos a reacção de transferase e a reacção hidrolitica atingiram quase o mesmo nível. Os resultados também indicam que desde que a molécula aceitadora de colesterol esteja disponível, a reacção de transferase é a reacção dominante. Quando a concentração de colesterol diminui, a actividade hidrolitica torna-se mais dominante. EXEMPLO 10: Ensaio para medir a actividade de transferase utilizando gema de ovo como substrato - de aqui em diante referida como o "Ensaio de Gema de Ovo" A aciltransferase de lípido foi isolada a partir de Aeromonas salmonicida e expressa em Bacillus subtilis. 0 objectivo deste trabalho é desenvolver um método analítico, que 179 é capaz de medir ambas as actividades de transferase e hidrolítica das enzimas e, a partir destas análises, é possível definir ambas as actividades de transferase e hidrolítica das enzimas utilizando um substrato que contém lecitina e colesterol.
Neste trabalho foi utilizada gema de ovo como substrato para o ensaio enzimático porque a gema de ovo contém tanto lecitina como colesterol e é conhecido que as transferases e fosfolipases funcionam muito bem neste substrato. A desvantagem da utilização de gema de ovo é que este substrato é uma mistura complexa de água, lípidos e proteínas. Os componentes lipídicos incluem glicéridos, 66,2%; fosfolipidos, 29,6%; e colesterol, 4,2%. Os fosfolípidos consistem em 73% de lecitina, 15% cefalina, e 12% outros fosfolípidos. Dos ácidos gordos, 33% estão saturados e 67% insaturados, incluindo 42% de ácido oleico e 7% de ácido linoleico (ref. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Inc.)
Podem ser esperadas algumas variações na composição de gema de ovo. Na literatura (Biochimica et Biophysica Acta, 1124 (1992) 205-222) é, contudo, mencionado que "A gema de ovo madura da galinha doméstica possui uma composição de lípidos e lipoproteinas marcadamente constante apesar de muita variação nas condições dietéticas e ambientais" e ainda é referido "Como um resultado da gema de ovo continua a proporcionar um produto alimentar de composição quase constante que serve para manter as suas propriedades químicas e físico-químicas para a utilização fiável na cozedura, cosmética e indústrias farmacêuticas" 180
Esta referência indica que a composição de gema de ovo é muito constante e foi, por isso, decidido utilizar gema de ovo de galinhas como substrato para o Ensaio de Gema de Ovo. A quantificação dos produtos de reacção de lípidos de tratamento enzimático de gema de ovo foi realizada por extracção de lípidos do substrato, seguido por análise de GLC dos componentes lipídicos.
Processo Materiais.
Gema de ovo: gema de ovo liquida pasteurizada de Danaeg Products A/S, DK-4000 Roskilde. Tampão HEPES Sigma cat. N° H 3375
Clorofórmio, Grau Analítico
Enzimas.
Aciltransferase de lípido de A. salmonicida purificada N° 178-9
Lipase de Thermomyces lanuginosus. GRINDAMYL EXEL 16, item N° 147060 (Controlo) 181
Ensaio de enzima com substrato de gema de ovo.
Foram pesados 5 gramas de gema de ovo liquida num frasco de Wheaton de 20 mL e aquecido para 35 °C. Foi adicionado 0,25 mL de solução de enzima e foi iniciado um cronómetro. A intervalos regulares foram transferidas amostras de 0,5 g para um frasco de Dram de 10 mL.
Foi adicionado 20 pL de HC1 a 4 M de modo a parar a reacção enzimática e acidificar o sabão de ácido gordo
Foi adicionado 3 mL de clorofórmio. E a amostra foi misturada num misturador Whirley durante 30 s. A amostra foi centrifugada a 3000 g durante 10 min e foi transferido 0,8 mL da fase de clorofórmio para um frasco de Dram revestido. O clorofórmio foi evaporado a 60 °C sob uma corrente de azoto. 0 vidro dram foi novamente selado.
Os lipidos isolados foram analisados por GLC e TLC.
Análise de TLC - como aqui descrito.
Análise de GLC - como aqui descrito.
Resultados
Para o Ensaio de Gema de Ovo utilizando gema de ovo como substrato foi realizada a experiência apresentada na Tabela 9. 182
Tabela 9 1 2 3 Gema de ovo, líquida grama 5 5 5 Transferase N° 178-9, 32 PLU-7/mL* mL LO CM O Lipase de T. lanuginosus, 200 LIPU/mL mL 0,25 Água mL 0,25
Foram retiradas amostras de 0,5 g após 15, 30, 60 120 e 1080 minutos, e o lipido foi isolado por extracção com solventes. Os lípidos foram analisados por TLC utilizando o solvente I e IV respectivamente. A imagem da placa de TLC é apresentada na Figura 52. A análise de TLC indica claramente a actividade da transferase N° 178-9 de A. salmonicida (amostra 3) . Isto pode ser observado a partir da diminuição nos fosfolipidos PC e PE. Os resultados também indicam que as quantidade de lisolecitina LPC não é tão elevada quanto o esperado. Isto pode indicar actividade hidrolitica em lisolecitina ou pode também ser provocada por extracção insuficiente porque a lisolecitina é muito polar e, por isso, pode ser parcialmente distribuída na fase aquosa.
Os lípidos isolados por extracção com solvente foram também analisados por GLC de modo a quantificar a quantidade de ácido gordo livre, colesterol e éster de colesterol. Os resultados de GLC são apresentados na Tabela 10. 183
Tabela 10. Análise por GLC de lípidos de gema de ovo tratada com enzima. Os resultados estão em % baseados no conteúdo lipídico 15 30 60 120 1080 Minutos Minutos Minutos Minutos Minutos Ácidos gordos livres Controlo 1 0, 328 0, 304 0,332 0,333 0,369 T. lanuginosus 2 0, 391 0, 376 0,459 0,627 22,909 A. salmonicida N° 178-9 3 1, 007 1, 668 4, 013 6, 761 15,098 colesterol Controlo 1 3, 075 2, 968 3,103 3,056 3,099 T. lanuginosus 2 3, 130 3, 032 3,045 3,026 3,225 A. salmonicida N° 178-9 3 2, 835 1, 912 0,356 0,220 0,206 Éster de colesterol Controlo 1 T. lanuginosus 2 0, 416 0, 397 0,422 0,408 0,437 A. salmonicida N° 178-9 3 0, 436 0, 400 0,425 0,419 0,416 Triglicéridos Controlo 1 76,153 73,505 75,565 79,344 77,382 T. lanuginosus 2 74,099 74,413 77,079 74,284 21,781 A. salmonicida N° 178-9 3 73,781 73,342 77,857 82,040 72,117 A partir dos resultados foi observado que quase todo o colesterol foi esterificado após 60 minutos na amostra 3. Foi concluído que nos primeiros 30 minutos havia um excesso de substrato para a reacção. Os resultados das amostras retiradas após 15 e 30 minutos foram, por isso, utilizados para calcular as actividades das enzimas. ovo
Com base na informação na tabela 10 e no facto de a gema de conter 27% de lipido, a quantidade de micromoles de ácido 184 gordo e éster de colesterol produzidos por mL de enzima foi calculada com os resultados apresentados na Tabela 11
Os resultados na Tabela 11 foram obtidos através dos seguintes cálculos dos resultados dos ácidos gordos na amostra n°.3 (A. salmonicida, 15 min.) Lípido em 5 g de gema de ovo = 5*0,27 = 1,35 grama 1,35 grama de lípido contém 1,007% de ácidos gordos = 1,35*1,007/100 = 0,01359 grama 0 peso molecular médio de ácidos gordos é 272 0,01359 gram = 0,01359* 1000000/272 pmol = 49,9798 pmol É adicionado 0,25 mL de enzima pmol de ácido gordo/mL enzima = 49,9798/0,25 = 199,9
Tabela 11
Micromole/mL enzima 0 min 15 min 30 min Ácido gordo livre Controlo 65, 01 60,37 T. lanuginosa 77,61 74, 71 Transferase N° 178-9 199,86 331,06 Ester de colesterol Controlo 35, 09 33,50 T. lanuginosa 36,77 33,73 Transferase N° 178-9 119,29 252,15 185
Dos resultados na Tabela 11 é possível calcular a alteração na quantidade de ácido gordo e éster de colesterol provocada pela enzima relativa ao controlo como apresentado na Tabela 12:
Tabela 12. Δ Micromole/mL enzima 0 min 15 min 3 0 min Ácido gordo livre Γ. lanuginosa 0 12,593 14,340 Transf. N° 178-9 0 134,843 270,691 Éster de colesterol Γ. lanuginosa 0 1,677 0,235 Transf. N° 178-9 0 84,196 218,652 A quantidade de ácido gordo ou éster de colesterol produzido em função do tempo é apresentada na Figura 53. A partir do declive da curva a actividade hidrolítica (formação de FFA) e a actividade de aciltransferase de lípido (formação de éster de colesterol) em função do tempo foi calculada. A actividade de transferase relativa (% de actividade de aciltransferase) e a actividade hidrolítica relativa foram, então, calculadas como apresentado na Tabela 13. A actividade de transferase relativa foi determinada utilizando o protocolo para a determinação da % da actividade de aciltransferase como aqui descrito antes. Por exemplo, o cálculo de actividade relativa para N° 178-9:actividade total é actividade de FFA + actividade de transferase = 9,023 + 7,2884 = 16,311 μΓηοΙ/Γηίη/ΓηΙ.. Actividade de 186 transferase relativa= 7,2884*100/16,311=44,7, actividade hidrolítica relativa = 9,023*100/16,311= 55,3
Tabela 13. T. lanuginosa Actividade de FFA 0,4780 pmol/min/mL A. salmonicida N° 178-9 pmol/min/mL T. lanuginosa Éster de colesterol. Actividade 0,0078 pmol/min/mL A. salmonicida N° 178-9 Éster de colesterol. Actividade 7,2884 pmol/min/mL T. lanuginosa Actividade de transferase relativa 1,6 A. salmonicida N° 178-9 44, 7 Γ. lanuginosa Hidrolitica relativa 98,4 A. salmonicida N° 178-9 55,3
Os resultados na Tabela 13 confirmaram que a enzima transferase de A. salmonicida possui uma actividade de transferase significativa, mas os resultados também confirmaram que esta enzima possui uma actividade hidrolitica significativa. A lipase de T. lanuginosus possui, principalmente, actividade hidrolitica, e a actividade de transferase relativa 1, 6 não foi uma prova de qualquer actividade transferase mas foi explicada pela incerteza da análise. 187
Conclusão . A gema de ovo foi utilizada como substrato para a medição de actividade de transferase e hidrolase da aciltransferase de lipido de Aeromonas salmonicida e uma lipase de Thermomyces lanuginosus. Em condições de ensaio havia inicialmente uma relação linear entre o éster de colesterol e a formação de ácido gordo livre e o tempo para a enzima aciltransferase de lipido. Com base nesta relação linear foi possível calcular a actividade hidrolítica (formação de FFA) e a actividade de transferase (formação de éster de colesterol). A actividade hidrolítica e transferase relativa foi também calculada. A aciltransferase de lipido (neste caso uma GCAT) de Aeromonas salmonicida, apresentou actividade hidrolítica e de transferase quase igual nestas condições de ensaio. A lipase de Thermomyces lanuginosus apresentou actividade hidrolítica muito baixa e a actividade de transferase não foi significativa. EXEMPLO 11: Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água.
Introdução A aciltransferase de lipido, de acordo com a presente invenção, foi isolada de Aeromonas salmonicida e expressa em Bacillus subtilis. As experiências iniciais demonstraram que esta enzima é muito eficiente na transferência de ácido gordo da lecitina para colesterol utilizando gema de ovo como um substrato. 188
Nas seguintes experiências a reacção de transferase foi estudada em maior detalhe utilizando gema de ovo como um substrato com especial foco na concentração de água no substrato.
Processo
Materiais.
Gema de ovo: gema de ovo liquida pasteurizada de Danaeg Products A/S, DK-4000 Roskilde. Tampão HEPES Sigma cat. N° . H 3375
Clorofórmio, Grau Analítico Esqualano, grau analítico
Enzimas. N° 178-9 aciltransferase de lípido, de acordo com a presente invenção, a partir de A. salmonicida N° 2427 Fosfolipase AI de Fusarium oxysporum. LIPOPAN® F de Novozymes, DK (enzima lipolítica comparativa) N° 1991 Fosfolipase A2 de Pâncreas, LIPOMOD 22L de Biocatalysts, UK (enzima lipolítica comparativa)
Ensaio de enzima com substrato de gema de ovo.
Foi pesado 5 gramas de substrato de gema de ovo líquido num
frasco de Wheaton de 20 mL e aquecido até 35 °C 189
Foi adicionada solução de água e enzima e foi iniciado um cronómetro. A intervalos regulares foram transferidas amostras de 0,5 g para um frasco de Dram de 10 mL.
Foi adicionado 20 gL de HC1 a 4 M de modo a parar a reacção enzimática e acidificar o sabão de ácido gordo.
Foi adicionado 3 mL e clorofórmio. E a amostra foi misturada num misturador Whirley durante 30 seg. A amostra foi centrifugada a 3000 g durante 10 min e 0,8 mL da fase de clorofórmio foi transferida para um frasco de Dram revestido. O clorofórmio foi evaporado a 60 °C sob uma corrente de azoto. O dram de vidro é novamente pesado.
Os lípidos isolados foram analisados por GLC
Análise de GLC
Cromatógrafo Gasoso Capilar Perkin Elmer Autosystem 9000 equipado com coluna de sílica fundida WCOT de 12,5 m x 0,25 mm ID x 0,1 μ espessura de película 5% de f enil-met ilsilicone (CP Sil 8 CB de Chrompack). Gás de transporte: Hélio.
Injector. Injecção a frio de separação PSSI (temp inicial
50 °C aquecido até 385 °C), volume 1.0 yL Detector FID: 395 °C 190
Programa do forno Temperatura do forno,°C Isotérmico, tempo, min. 1 2 3 90 280 350 1 0 10 4
Taxa de temperatura, °C/min. 15
Preparação da amostra: foi dissolvido 30 mg de amostra em 9 mL Heptano:Piridina, 2:1 contendo padrão interno heptadecano, 0,5 mg/mL. Foi transferida solução de amostra 300 pL para um frasco com friso, foi adicionado 300 pL de MSTFA (N-Metil-N-trimetilsililtrifluoracetamida) e reagido durante 20 minutos a 60 °C. Cálculo: Os factores de resposta para mono-di-triglicéridos e ácido gordo livre foram determinados a partir do Padrão 2 (mono-ditriglicérido), para Colesterol, Colesteril palmitato e Estearato de Colesterilo os factores de resposta foram determinados a partir de material de referência puro (pesando 10 mg de material puro).
Resultados
Foi utilizada gema de ovo contendo esqualeno a 2% como substrato para as reacções. Foi adicionado esqualano como um padrão interno para a análise de GLC, de modo a quantificar os componentes lípidos na gema de ovo. A experiência foi montada como apresentado na Tabela 14. 191
Tabela 14. 1 2 3 4 5 6 7 8 Substrato, gema de ovo com esqualano a 2% g 5 5 5 5 5 5 2,5 2,5 Transferase N° 178-9, 14 PLU-7/mL mL 0,25 0,25 LIPOPAN® Fsolution, 200 PLU-7/mL 0,25 N° 1991 Fosfolipase A2, 6300 PLU/mL 0,25 0,25 Água 0,25 3,8 3,8 8,75 8,75
As amostras foram retiradas após 30, 60 e 120 minutos e analisadas de acordo com o método descrito acima (foram retiradas 0,5 mL (exp 1-4) 0,86 mL (exp. 5-6) e 2,2 mL (exp.7-8) de amostras).
Os resultados da análise de GLC são apresentados na Tabela 15. Os resultados de GLC foram expressos na percentagem do substrato (gema de ovo) . A Tabela também indica o tempo de reacção e a quantidade total de água na mistura reaccional.
Tabela 15.
Enzima Tempo de reacção % de Água GLC GLC GLC minutos na reacção % de Ácido gordo % de colesterol % de Éster de colesterol Controlo 120 54 0,247 0,863 0,083 N° 178 30 54 0,422 0,669 0,445 N° 178 60 54 0,515 0,549 0,672 192 (continuação)
Enzima Tempo de reacção % de Água GLC GLC GLC minutos na reacção % de Ácido gordo % de colesterol % de Éster de colesterol N° 178 120 54 0,711 0,364 1,029 N° 2427 30 54 2,366 0,848 0,090 N° 2427 60 54 3,175 0,837 0,088 N° 2427 120 54 3,926 0,833 0,082 N° 1991 30 54 1,606 0,911 0,083 N° 1991 60 54 1,701 0,838 0,080 N° 1991 120 54 1,781 0,763 0, 053 N° 178 30 73 0,377 0, 764 0, 495 N° 178 60 73 0,488 0,665 0, 719 N° 178 120 73 0,626 0,426 0,931 N° 2427 30 73 2, 471 0, 853 0,092 N° 2427 60 73 3,284 0, 858 0,087 N° 2427 120 73 4, 176 0,837 0,081 N° 178 30 89 0,344 0,720 0,308 N° 178 60 89 0, 443 0, 725 0, 446 N° 178 120 89 0,610 0,597 0,607 N° 2427 30 89 0,510 0, 167 0,010 N° 2427 60 89 0,602 0,133 0,010 N° 2427 120 89 0,867 0,147 0,009
Com base na análise de ácidos gordos, colesterol e éster de colesterol, foi possível calcular a quantidade de ácido gordo livre e éster de colesterol produzido em função do tempo de reacção e do teor em água. Com base nestes resultados foi, então, possível calcular a actividade enzimática total como a soma da formação de ácido gordo e a formação de éster de colesterol. A actividade hidrolítica relativa e a actividade de transferase relativa (i. e., % de actividade de aciltransferase) 193 foram, então, calculadas com os resultados apresentados na Tabela 16.
Os resultados na Tabela 16. foram também analisados estatisticamente utilizando um Multifactor Estatigráfico ANOVA. Os resultados estatísticos na Figura 54 confirmam que a Fosfolipase Al, N° 2427 e a fosfolipase A2, N° 1991 não tinham transferase actividade enquanto que a transferase N° 178-9 apresentou quase 50% de actividade transferase sob estas condições de ensaio. O efeito do teor em água no ensaio na actividade de transferase da transferase N° 178 foi também analisado estatisticamente como apresentado na Figura 55. Estes resultados indicam que, no intervalo desde 54 até 89% de água no ensaio não havia um efeito forte sobre o teor em água na actividade de transferase relativa. 0 impacto do tempo de reacção na actividade de transferase para a transferase N° 178 foi avaliado com os resultados apresentados na Tabela 16 e na Figura 56. Os resultados na Figura 56 indicam que a actividade de transferase relativa diminui em função do tempo de reacção. Isto pode ser explicado pelo facto de a maioria da molécula aceitadora de colesterol ser consumida e, por isso, a actividade hidrolítica relativa aumenta. Os valores negativos para a reacção de transferase apenas para N° 2427 indicam ausência de actividade de transferase na variação para o método analítico. 194
Tabela 16
Enzima Tempo de reacção em minutos % de água na mistura reaccional Ácido gordo produzido Colesterol Consumido Éster de colesterol produzido Actividade hidrolítica Actividade de Transferase N° 178 30 54 0, 175 0, 194 0,362 53 47 N° 178 60 54 0,268 0,314 0,589 52 48 N° 178 120 54 0, 464 0, 499 0, 946 53 47 N° 2427 30 54 2, 119 0, 015 0, 007 100 0 N° 2427 120 54 2, 928 0, 026 0, 005 100 0 N° 2427 60 54 3,679 0,030 -0,001 100 0 N° 1991 30 54 1,359 -0,048 0, 000 100 0 N° 1991 60 54 1, 454 0, 025 -0,003 100 0 N° 1991 120 54 1,534 0,100 -0,030 101 -1 N° 178 30 73 0, 130 0, 099 0, 412 42 58 N° 178 60 73 0,241 0, 198 0,636 47 53 N° 178 120 73 0,379 0, 437 0, 848 51 49 N° 2427 30 73 2,224 0, 410 0, 009 100 0 N° 2427 60 73 3, 037 0, 005 0, 004 100 0 N° 2427 120 73 3, 929 0, 026 -0,002 100 0 N° 178 30 89 0, 097 0, 143 0,225 50 50 N° 178 60 89 0, 196 0, 138 0,363 56 44 N° 178 120 89 0,363 0,266 0,524 62 38 N° 2427 30 89 0,263 0,696 -0,073 113 -13 N° 2427 60 89 0,355 0, 730 -0,073 110 -10 N° 2427 120 89 0,620 0, 716 -0,074 105 -5 195
Conclusão . A aciltransferase de lípido de Aeromonas salmonicida foi testada na gema de ovo como substrato e com níveis diferentes do teor em água. Esta enzima foi comparada com enzimas lipolíticas de controlo, nomeadamente Fosfolipase AI de Fusarium oxysporum e uma Fosfolipase A2 do pâncreas.
Os resultados demonstram que apenas a transferase catalisou a reacção de transferase entre lecitina e colesterol durante a formação de éster de colesterol. Os resultados demonstraram que, no intervalo desde 54% até 89% de água no substrato, a actividade de transferase relativa foi quase a mesma para a transferase de Aeromonas salmonicida. EXEMPLO 12 : O "Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado" para medição da actividade de aciltransferase (e. g., para utilização num alimento utilizando lecitina e colesterol). A aciltransferase de lípido foi isolada a partir de Aeromonas salmonicida e expressa em Bacillus subtilís. Esta enzima é muito eficiente na transferência de ácido gordo da lecitina para colesterol durante a formação de ésteres de colesterol. Foi também demonstrado que a enzima tinha alguma actividade hidrolítica, que é observada pela formação de ácidos gordos livres. As fosfolipases tradicionais (EC3.1.1.4 e EC3.1.1.32) possuem a capacidade de hidrolisar lecitina durante a formação de ácidos gordos livres e lisolecitina e não foram relatadas reacções de transferase para estas enzimas. 196 É aqui detalhado um ensaio que é capaz de medir a actividade hidrolitica e de transferase de enzimas e assim identificar a aciltransferase de lipidos de acordo com a presente invenção, o ensaio utiliza um substrato que contém lecitina e colesterol. Neste trabalho foi utilizado um substrato baseado em fosfatidilcolina e colesterol disperso num tampão. A quantificação de produtos de reacção foi realizada por extracção de lipidos do substrato seguido por análise de GLC das componentes lipídicas.
Processo
Materiais L-alfa-Fosfatidilcolina Vegetal 95% Avanti n°. 441601
Colesterol: Sigma cat. C 8503
Palmitato de Colesterilo, Sigma C 6072
Estearato de Colesterilo, Sigma C 3549
Tampão HEPES Sigma cat. N°. H 3375
Clorofórmio, Grau Analítico.
Enzimas GCAT Purificado de A. salmonicida N° 178-9 A análise de TLC foi realizada como descrito no Exemplo 6. A análise de GLC foi realizada como descrito no Exemplo 11. 197
Resultados: Ensaio de Transferase baseado em fosfatidilcolina e colesterol como substrato.
Seguidamente, a actividade de transferase da transferase foi testada num substrato baseado em fosfatidilcolina e colesterol de acordo com o processo seguinte.
Foi dissolvido 450 mg de fosfatidilcolina (>95% PC Avanti item n° . 441601) e 50 mg de colesterol em clorofórmio e evaporado até à secura sob vácuo. Foi transferido 300 mg de colesterol/fosfatidilcolina para um frasco de Wheaton e foi adicionado 15 mL de tampão HEPES a 50 mM pH 7. O lípido foi disperso no tampão durante a agitação. 0 substrato foi aquecido até 35 °C, durante a mistura com um agitador magnético e foi adicionado 0,25 mL de solução de enzima. Isto é um ambiente de água muito elevado de aproximadamente 95% de água.
Foram retiradas amostras de 2 mL após 0, 5, 10, 15, 25, 40 e 60 minutos de tempo de reacção.
Foi adicionado imediatamente 25 pL de HC1 a 4 M para acidificar o ácido gordo livre e parar a reacção da enzima. Foi adicionado 3,00 mL de clorofórmio e a amostra foi agitada vigorosamente num Whirley durante 30 segundos. A amostra foi centrifugada e foram isolados 2 mL da fase de clorofórmio e filtrados através de filtros de 0,45 pm num frasco de Dram revestido de 10 mL. 0 clorofórmio foi evaporado sob uma corrente de azoto, a 60 °C, e as amostras foram novamente pesadas. O lipido extraído foi analisado por GLC. 198
Os resultados da análise de GLC são apresentados na Tabela 17. Os resultados são expressos em % calculada no lípido extraído. A quantidade de ácido gordo e éster de colesterol formada em função do tempo é ilustrada na Figura 57. Pode concluir-se a partir da Figura 57 que a reacção da enzima não é linear em função do tempo, porque se observa inicialmente uma forte actividade tanto hidrolítica como de transferase. Após aproximadamente 10 minutos e até aproximadamente 60 minutos a reacção apresenta uma resposta quase linear de formação de ácido gordo e éster de colesterol em função do tempo. Foi, por isso, decidido olhar para a reacção enzimática neste intervalo de tempo.
Tabela 17
Minutos 0 5 10 15 25 40 60 Colesterol, % 10,064 8, 943 8, 577 8, 656 8,102 7, 856 7, 809 Éster de colesterol, % 0, 000 1, 571 2, 030 2, 058 2,282 2, 659 3, 081 FFA total, % 0,260 1, 197 1,239 1, 466 2, 445 2, 943 3, 940
Do conhecimento acerca da quantidade de lípido na mistura reaccional e da quantidade de enzima adicionada foi possível calcular a formação de ácido gordo e éster de colesterol expressos em ymol/mL de enzima (Tabela 18 e Figura 58)
Tabela 18
Minutos 10 15 25 40 60 gmol/mL gmol/mL gmol/mL gmol/mL gmol/mL FFA total 58,1 68,7 114,6 138,0 184, 7 Éster de colesterol 88,8 90,0 99,3 115,6 133,8 199 A partir dos resultados na Tabela 18 e do declive das curvas na Figura 58 foi possível calcular a quantidade de ácido gordo e éster de colesterol em função do tempo expressa em μπιοΐ/min por mL de enzima. 0 cálculo da actividade hidrolítica e da actividade da transferase é apresentado na Tabela 19. A actividade de transferase relativa foi determinada utilizando o protocolo para a determinação da % de actividade de aciltransferase como aqui descrito anteriormente.
Tabela 19
Actividade hidrolítica (ácido gordo) 2,52 μπιοΐ/min per mL de enzima Actividade de transferase (éster de colesterol) 0,94 ymol/min per mL de enzima Actividade total 3,45 ymol/min per mL de enzima Actividade Relativa de Transferase 27,1 O, o Actividade hidrolítica Relativa 72,9 o, o
Rastreio de outras enzimas para actividade de transferase. 0 método acima mencionado foi utilizado para rastrear diferentes enzimas lipolíticas para a actividade de transferase 200 e hidrolítica. As enzimas foram testadas como apresentado na
Tabela 20
Tabela 20 1 2 3 4 5 Substrato mL 15 15 15 15 15 Transferase N° 178-9 de A. salmonicida 32 PLU-7/ml mL 0,25 5% de N° 3016, LIPOPAN® F (F. oxysporum) mL 0, 25 5%, Thermomyces lanuginosus mL 0, 25 5% de Candida rugosa N° 2983 mL 0,25 5% de Candida cylindracea N° 3076 mL 0,25 O substrato contendo 300 mg de fosfatidilcolina/colesterol disperso em tampão HEPES a 50 mM pH 7,0 foi aquecido até 35 °C com agitação. A solução de enzima foi adicionada e a amostra foi mantida a 35 °C com agitação. As amostras foram retiradas com intervalos regulares e extraídas com clorofórmio. Os lípidos isolados foram analisados por GLC com os resultados apresentados na Tabela 21.
Tabela 21
Amostra 1 Transferase 178-9 Minutos 0 5 10 15 25 40 60 FFA 1, 216 2, 516 2,983 2,62 2, 894 3, 448 3,911 Colesterol 7, 547 6, 438 6,365 6, 15 6, 136 5, 936 5,662 Éster de Colesterol 0 1, 835 2,177 2, 44 2, 58 2, 851 3,331 201 (continuação) 2 Fusarium oxysporum (LIPOPAN® F) 0 5 10 15 25 40 60 FFA 1,216 1,345 1,796 1,95 2, 487 2, 424 2, 977 Colesterol 7, 547 7,309 7,366 7,33 7, 429 7,341 7,326 Éster de Colesterol 0 0,26 0,386 0,35 0,267 0,36 0,394 3 Thermomyces lanuginosus 0 5 10 15 25 40 60 FFA 1,216 0, 853 0,875 1 0, 896 1, 105 1,009 Colesterol 7,547 7,384 7,639 7,63 7, 675 7, 603 7,529 Éster de Colesterol 0 0 0 0 0 0 0 4 Candida rugosa (Na 2938) 0 5 10 15 25 40 60 FFA 1,216 0, 982 0,987 1, 02 1, 135 1, 131 1,15 Colesterol 7,547 7, 438 7, 656 7, 66 7, 638 7, 575 7, 585 Éster de Colesterol 0 0 0 0 0 0 0 5 Candida cylandracea(Ns 3076) 0 5 10 15 25 40 60 FFA 1, 216 1, 032 1, 097 1,07 1, 203 1, 131 1, 43 Colesterol 7, 547 7, 502 7, 425 7,65 7, 619 7, 502 7, 411 Éster de Colesterol 0 0 0 0 0 0 0
Da análise de GLC foi observado que apenas uma aciltransferase de lípido (178-9) produziu uma quantidade significativa de éster de colesterol e ácidos gordos. A fosfolipase de Fusarium oxysporum também produziu um aumento estável no ácido gordo livre, mas apenas uma quantidade inicial da formação de éster de colesterol foi formada mas não foi observado um aumento no éster de colesterol em função do tempo.
Com base no conhecimento acerca da quantidade de substrato de lipido e das análises de GLC foi possível calcular a 202 actividade de transferase relativa e a actividade hidrolítica relativa com base nos resultados de 10 a 60 minutos de tempo de reacção. Os resultados da Transferase 178-9 e lipase de Fusarium oxysporum são apresentados na Tabela 21. As outras enzimas testadas não apresentaram actividade.
Tabela 21
Transferase 178-9 Fusarium oxysporum Actividade hidrolítica, micromole/min por mL de enzima 1,03 0, 96 Actividade de Transferase, micromole/min por mL de enzima 0,40 0, 01 Actividade total, micromole/min por mL de enzima 1,43 0, 98 Actividade hidrolítica relativa 71, 8 98, 7 Actividade de transferase relativa 28,2 1,3 O resultado apresentado na Tabela 21 confirmou a actividade de transferase significativa de uma aciltransferase de lipido (amostra 178-9). É também observado que a actividade de transferase relativa está em concordância com a experiência mencionada na Tabela 19. É contudo observada uma actividade de transferase muito baixa de fosfolipase de Fusarium oxysporum. Este nível de transferase é tão baixo que cai dentro da incerteza da análise. Como é esperado a fosfolipase de Fusarium oxysporum possui actividade hidrolítica significativa. 203
Conclusão .
Em vez da gema de ovo (apresentada no Exemplo 11) um substrato artificial com base em fosfatidilcolina purificada e foi utilizado colesterol como um substrato para medir a actividade da transferase de Aeromonas salmonicida. Entre 10 minutos e 60 minutos de tempo de reacção o ensaio produziu uma formação quase linear de ácidos gordos livres e éster de colesterol em função do tempo. Com base na actividade entre 10 e 60 minutos de tempo de reacção, foi calculada a actividade hidrolítica e a actividade transferase. A concentração de substratos neste ensaio foi relativamente mais baixa do que na gema de ovo, e a quantidade de água no ensaio foi relativamente superior.
Com base nos resultados do ensaio de uma aciltransferase de lipido (neste momento uma GCAT) de Aeromonas salmonicida num substrato artificial de fosfatidilcolina/colesterol em tampão conclui-se que esta enzima possui actividade de transferase muito boa também num sistema com um teor em água muito elevado. Ambos os ensaios baseados em gema de ovo (ver Exemplo 11) e fosfatidilcolina/colesterol em tampão (Exemplo 12), podem ser utilizados para medir a actividade de transferase e hidrolítica das enzimas. A gema de ovo é preferida do ponto de vista que a actividade hidrolítica e a actividade de transferase é linear em função do tempo, mas a fosfatidilcolina/colesterol em tampão é apenas linear num certo limite de tempo. 204 EXEMPLO 13: Emulsões Alimentares 0 efeito da gema de ovo líquida modificada pela enzima foi testado numa receita padrão de emulsão Alimentar com 60% de óleo.
Os métodos e materiais convencionais sao como os detalhados nos Exemplos acima. A gema de ovo foi tratada com uma aciltransferase de lípido de Aeromonas salmonicida (N° 138) ou fosfolipase, nomeadamente uma enzima LipopanF® comercialmente disponível (Novozymes A/S, Dinamarca) (N° 2938) como apresentado na Tabela 22.
Tabela 22. Tratamento da gema de ovo com a enzima 1 2 3 4 Gema de ovo, Sanofo product no 1123P2 Grama 10 10 10 10 N° 138, 10 PLU/mL MI 1 1 N° 2938, 200 PLU/mL MI 1 Água MI 1 Tempo de reacção Minutos 210 360 210 210 A análise de TLC dos lípidos da gema de ovo da gema de ovo tratada com enzima (Tabela 9) é apresentada nas Figuras 59 e 60.
Nesta experiência, a dosagem de N° 2938 foi aumentada por um factor de 10 e esta produziu uma actividade muito clara na gema do ovo. A quantidade de ácido gordo livre aumentou 205 significativamente e a lecitina (PC) foi hidrolisada a lisolecitina (LPC) . A transferase N° 138 produziu uma reacção de transferase clara porque o colesterol livre foi convertido em éster de colesterol e parte da lecitina foi convertida em lisolecitina.
Outro aspecto interessante da modificação por enzima foi a consistência do produto. A amostra tratada com Fosfolipase N° 2938 ficou muito sólida, em que as amostras tratadas com a aciltransferase de lípido N° 138 mantiveram a mesma consistência liquida da amostra de controlo (ver Figura 61).
Estas gemas de ovo modificadas foram testadas numa receita de Emulsão Alimentar apresentada na Tabela 23.
Tabela 23. Maionese com gema de ovo modificada 0 la 2a 3a 4a 0, o, Ό o, "o o, "o o. "o Rapsólia 60 60 60 60 60 Gema de ovo, produto Sanofo n°1123P2 2,8 Gema de ovo n° 1 Modificada por Enzima 2,8 Gema de ovo n° 2 Modificada por Enzima 2,8 Gema de ovo n° 3 Modificada por Enzima 2,8 Gema de ovo n° 4controlo (não tratada) 2,8 Água 39 36,2 36,2 36,2 36,2 Vinagre, 10% de ácido acético 1 1 1 1 1 206
As gemas de ovo modificadas 1 e 2 foram tratadas com a aciltransferase de lipido; e a gema de ovo 3 modificada foi tratada com a fosfolipase comercialmente disponível. A emulsão alimentar foi produzido como uma emulsão óleo-em-água de acordo com o seguinte procedimento: A gema de ovo e água foram medidos num copo. 0 óleo foi medido separadamente.
Um misturador Turrax (20000 rpm) foi imerso na fase água. O óleo foi bombeado para a fase água a uma velocidade constante durante 2 minutos. A mistura continuou por mais 1 minuto. O vinagre foi, então, adicionada e misturada durante 5 segundos. A estabilidade da emulsão foi testada numa câmara de aquecimento a 100 °C. Após 2 horas, a 100 °C, a emulsão foi avaliada (ver Figura 62). A estabilidade da emulsão de gema de ovo não tratada foi bastante boa nesta experiência. 0 tratamento de gema de ovo com a aciltransferase de lipido N° 138 melhorou, contudo, a estabilidade devido à separação da quantidade de água foi reduzida. A gema de ovo tratada com fosfolipase N° 2938 produziu uma emulsão muito instável com separação quase completa da fase óleo e água a 100 °C. É considerado que, em algumas aplicações, a utilização das composições e métodos da invenção pode proporcionar estabilidade térmica melhorada de emulsões, tais como molhes para saladas de óleo em água e semelhantes. Isto é particularmente importante nas emulsões alimentares que são pasteurizadas para assegurar um tempo de vida longo e/ou são aquecidos antes de servir, e. g., 207 em refeições pré-preparadas para reaquecimento antes de servir (e. g., refeições para microondas). Embora não se deseje estar ligado a qualquer teoria particular, é considerado que em algumas aplicações a acumulação de ácido gordo livre pode ser determinante para a estabilidade térmica destas emulsões. Deve ser reconhecido que a estabilidade térmica melhorada das emulsões alimentares produzidas utilizando os métodos da invenção, pode não ser encontrada, ou mesmo desejável, em todas as aplicações alimentares. Serão óbvias para o especialista da técnica quais as caracteristicas que são desejáveis, e a estabilidade das emulsões pode ser facilmente determinada utilizando um teste simples de aquecimento, equivalente a, por exemplo, pasteurização e ou reaquecimento no microondas. Os inventores descobriram que numa forma de realização preferida, as emulsões alimentares obtidas utilizando as enzimas da invenção tinham uma estabilidade térmica melhorada. EXEMPLO 14: Reacção de transferase em esterol de planta enriquecido em gema de ovo: A transferase de Aeromonas salmonícida foi capaz de catalisar a formação de lisolecitina, monoglicérido e éster de esterol de plantas em gema de ovo enriquecida com esterol de planta e glicerol. A mesma enzima foi também testada num sistema pobre em água contendo óleo de palma, lecitina, esterol de planta e glicerol. Através de análise de TLC e GLC foi mostrado que o monoglicérido e éster de esterol de plantas foram produzidos sob estas condições de reacção. 208
Introdução : A transferase de Aeromonas salmonícída foi testada quanto a actividade de transferase num sistema de lecitina quase isento de água, gordura, esterol de planta e glicerol.
Materiais:
Gema de ovo: gema de ovo líquida pasteurizada de Danaeg Products A/S, DK-4000 Roskilde purificação de transferase GCAT 178-9 , 32 PLU-7/ml(Jornal 2254-100)
Lecitina de soja. Yolkin de Aarhus United, Dinamarca. Óleo de palma 43, de Aarhus United, Dinamarca. L-a-Fosfatidilcolina 95% de Planta (Avanti N° 441601) Sitosterol, Sigma n° S5753
Esterol de planta: Generol N122 de Cognis, Alemanha Glicerol Item n° 085915
Resultados A pesquisa inicial de actividade de transferase em esterol de planta e glicerol foi conduzida em gema de ovo como apresentado na Tabela 24. 209
Tabela 24 1 2 3 4 Gema de ovo Gramas 1 1 1 1 Glicerol Gramas 0,1 0,1 Sitosterol:óleo 3:7 Gramas 0, 13 0,13 1 2 3 4 Transferase N° 178-9 Unidades 1 1 Agua * * *Água correspondente à quantidade de água na solução de enzima = 83 pL
Os ingredientes foram misturados e aquecidos a 37 °C e mantidos a esta temperatura em agitação com um agitador magnético. 0,1 gramas das amostras foram retiradas após 3 e 23 horas e analisadas por TLC.
Os resultados da análise de TLC são apresentados na Figura 63. 0 resultado na Figura 63 indicou que o colesterol e os esteróis de planta foram esterifiçados pela reacção de transferase, concomitantemente com a formação de lisolecitina (amostra 3 e 4), porque quase todo o esterol e colesterol livre foi convertido no éster correspondente na amostra 3.
Os resultados também indicaram que a amostra com apenas glicerol e gema de ovo produziu monoglicérido. A quantidade de monoglicérido necessita ser confirmada por análise de GLC. conjunto
Quando foi adicionado esterol em conjunto com glicerol 210 (amostra 3) a quantidade de monoglicérido foi muito baixa e não detectável por TLC. Isto indicou que desde que houvesse excesso de esterol ou colesterol a reacção de transferase utilizando glicerol era modesta.
Em outra experiência a enzima transferase 178-9 foi adicionada a uma mistura de lecitina de soja, glicerol e esterol de planta, de modo a estudar a actividade catalítica da enzima nesta mistura reaccional. A composição das misturas reaccionais nestas experiências é apresentada na Tabela 25
Tabela 25 1 2 3 4 5 6 Lecitina de soja gramas 1, 875 2,25 1, 875 2,5 3,5 3,5 Esterol de Planta; Generol N 122 gramas 0,225 0,225 0 0 0,225 0,5 Óleo de palma 43 gramas 2,675 2,25 2, 8 2, 125 1, 062 0,831 Glicerol gramas 0,225 0,275 0,325 0,375 0,248 0,238 Transferase N° 178 -9, 32 LU/mL mL 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 A experiência foi realizada misturando os componentes lipídicos em agitação a 46 °C. A enzima foi adicionada e amostras foram retiradas após 4 e 24 horas.
As amostras foram analisadas por TLC como apresentado na
Figura 6 4. 211
As amostras das experiências 2, 4 e 5 após 24 horas de tempo de reacção foram também analisadas por GLC com os resultados apresentados na Tabela 26
Tabela 26 2 4 5 Glicerol o O 3, 16 5, 71 4, 17 Ácidos gordos o, 0 4, 23 5,36 6,67 Mono o, o 2, 24 3,87 3,92 Esterol o, o 2, 13 2,62 Ester de Esterol o, o 2, 89 2, 14
Os resultados confirmaram que a transferase 178-9 foi capaz de catalisar a formação de éster de esterol de plantas e monoglicérido numa mistura reaccional contendo lecitina de soja, glicerol e esterol de planta. Esta mistura reaccional pode ser de interesse para utilização na produção de margarina em que o monoglicérido requerido com as suas propriedades de emulsificação e éster de esterol de plantas para o seu efeito de abaixamento de colesterol.
Conclusão A transferase CGAT de Aeromonas salmonicida foi capaz de catalisar a formação de éster de esterol de plantas e monoglicérido em gema de ovo em que foi adicionado o esterol de planta e glicerol. A mesma enzima também catalisa a formação de éster de esterol de plantas e monoglicérido numa mistura de óleo de palma, lecitina, esterol de planta e glicerol. Esta enzima 212 tem interesse, deste modo, para utilização em margarina e outros óleos contendo produtos alimentares em que o monoglicérido e a lisolecitina são necessários para uma emulsificação melhorada e o éster de esterol de planta para os seus efeitos de abaixamento de colesterol. EXEMPLO 15 : Immobilização de uma aciltransferase de lipido de Aeromonas salmonicida e a utilização na sintese de ésteres de Esterol. A aciltransferase de lipido (neste caso uma GCAT) de A. salmonicida foi imobilizada em Celite por precipitação com acetona. Foram agitados lentamente 10 mL de solução de enzima em 20 mM de TEA tampão pH 7 com 0,1 gramas de Celite 535 535 (de Fluka) durante 2 horas à temperatura ambiente.
Foram adicionados 50 mL de acetona arrefecida em agitação continuada. O precipitado foi isolado por centrifugação a 5000 g durante 1 minuto. O precipitado foi lavado 2 vezes com 20 mL de acetona fria. A Celite foi testada à temperatura ambiente durante cerca de 1 hora. A transferase imobilizada foi testada numa mistura de óleo contendo 13% de Fosfatidilcolina e 7% de esterol de planta. (Tabela 27) 213
Tabela 27 o 0 Lecitina Avanti 12,0 Esterol de planta, Generol 122N 6,6 Palma 43 71, 4 Glicerol 5, 0 Transferase N° 178 Imobilizada, 45 U/g 2,0 Água 3,0
Lecitina, esterol de planta e óleo de soja foram aquecidos a 46 °C e o esterol de planta foi dissolvido. A transferase imobilizada foi adicionada. A reacção de transferase continuou a 46 °C em agitação suave, com um agitador magnético. As amostras foram retiradas para análises após Η, 1 3 6 e 24 horas e analisadas por TLC. A reacção foi interrompida após 24 horas de tempo de reacção e a enzima imobilizada foi removida por filtração.
As amostras foram analisadas por TLC como apresentado na Figura 65. A análise de TLC mostra claramente o efeito da transferase imobilizada de A. salmonicida na transformação de colesterol em éster de colesterol. É também observado que é formada uma pequena quantidade de monoglicérido. Verificou-se também que a enzima possuía uma elevada actividade em ambientes com elevado teor em água (6-89%), a utilização da transferase, e outras transferases para utilização na invenção podem, deste modo, ser 214 também utilizadas em aplicações de enzima imobilizada com um significativo teor em água. Isto permite a substituição dos solventes utilizados pelas lipases correntes imobilizadas na bioconversão de lipidos utilizando transferases. EXEMPLO 16 A transferase de Aeromonas hydrophilia pode transferir de um fosfolípido para um esterol para formar um éster de esterol e/ou uma molécula de açúcar para formar um éster de açúcar. A aciltransferase de lípido de Aeromonas hydrophila expressa em E. coli (Hydro 0303 HVP) , marcada N° 139 foi purificada numa coluna Sepharose FF quelante, HR 2.5/10 e analisada quanto a actividade de fosfolipase. A actividade de transferase foi avaliada em gema de ovo quanto a actividade de enzima e funcionalidade na gema de ovo. A enzima foi também testada em gema de ovo contendo glucose.
Actividade de fosfolipase. A transferase N° 139 isolada a partir de uma coluna Sepharose FF quelante, HR 2.5/10 foi ensaiada por NEFA-PLU(pH7) A actividade foi de 1,15 Unidades NEFA-PLU/mL.
Gema de ovo
Num teste de aplicaçao inicial a transferase N° 139 foi testada em gema de ovo de acordo com o procedimento seguinte. 215 1-grama de gema de ovo fresca foi medida num frasco de 10 ml com tampa de rosca. A preparação de enzima foi adicionada e misturada num misturador de vórtice. A amostra foi colocada a 37 °C e agitada com um agitador magnético. A reacção foi interrompida por adição de 7,5 mL de Clorofórmio:Metanol (2:1) e misturada num misturador Whirley durante 30 segundos. A fase de clorofórmio foi isolada por centrifugação e 2 pL da fase de clorofórmio foram transferidos para uma placa de TLC de silica pré-activada e eluida com tampão de migração N° I e outra placa de TLC em tampão de migração IV, A combinação experimental é apresentada na tabela 28
Tabela 28
Teste Tempo de reacção Gema de ovo Transferase N° 139 N° min. gramas unidades 1 10 1 2 10 1 0,75 NEFA-PLU 3 60 1 0,75 NEFA-PLU 4 300 1 0,75 NEFA-PLU 5 1200 1 6 1200 1 0,75 NEFA-PLU A análise de TLC é apresentada na Figura 66 e Figura 67. A análise de TLC demonstra claramente a reacção de transferase da transferase N° 139. 0 colesterol é convertido em éster de colesterol e a quantidade de lecitina é reduzida. Os resultados 216 contudo também indicam que a lisolecitina é apenas acumulada numa quantidade muito pequena porque a transferase N° 139 também é activa em lisolecitina. Esta observação é apoiada pela formação de ácidos gordos livres (FFA).
Gema de ovo e glucose
Foi demonstrado anteriormente que a transferase de Aeromonas salmonicida (N° 138) foi capaz de utilizar glucose como molécula aceitadora numa reacção de transferase. Foi também testado se a transferase N° 139 pode utilizar glucose como molécula aceitadora. A montagem da experiência é apresentada na Tabela 29.
Tabela 29
Teste Tempo de reacção Gema de ovo Glucose, 70% Transferase N° 139 N° Minutos gramas mg unidades 1 10 1 500 2 10 1 500 1 NEFA-PLU 3 60 1 500 1 NEFA-PLU 4 180 1 500 1NEFA-PLU 5 300 1 500 1 NEFA-PLU 6 1200 1 500 1 NEFA-PLU 7 1200 1 500
Os produtos de reacção foram analisados por TLC (Figuras 68 e Figura 69). 217 A análise de TLC indica a formação de éster de glucose após 220 min. de tempo de reacção (Figura 69 pista 6), mas após 1200 min o tempo de reacção no éster de glucose é observado.
Deve, deste modo, ser concluído que a transferase N° 139 tem actividade de transferase e hidrolítica. Isto é também apoiado pelo facto de que a quantidade de ácidos gordos livres aumenta de forma constante como uma função do tempo de reacção.
Resumo: A transferase de Aeromonas hydrophila foi testada em gema de ovo. Os resultados confirmam que esta enzima catalisa a formação de éster de colesterol concomitantemente com a formação de lisolecitina. Após um tempo de reacção estendido, quando a maior parte do colesterol é consumido, são também formados ácidos gordos livres. Pode, deste modo, concluir-se que a enzima tem actividade de transferase primária, mas também foi observada actividade hidrolítica quando apenas a água está disponível como molécula dadora.
Numa experiência com gema de ovo e glucose foi observado que a transferase de Aeromonas hydrophila é capaz de catalisar a formação de éster de glucose in situ num ambiente de alimento rico em água (Figura 70). 218 EXEMPLO 17: Variantes de uma aciltransferase de lípido de Aeromonas hydrophila (Ahyd2) (SEQ ID Na 36 (ver Figura 71))
As mutações foram introduzidas utilizando o QuikChange® Multi-Site Directed Mutagenesis kit de Stratagene, La Jolla, CA 92037, EUA de acordo com as instruções fornecidas pela
Stratagene.
As variantes na Tyr256 apresentaram uma actividade aumentada para os fosfolipidos.
As variantes na Tyr256 e Tyr260 apresentaram uma actividade aumentada para os galactolipidos.
As variantes na Tyr265 apresentam uma actividade de transferase aumentada com galactolipidos como o dador acilo.
Os números indicam posições na seguinte sequência: Uma enzima de Aeromonas hydrophila cuja sequência de aminoácidos é apresentada na SEQ ID N° 36 na Figura 71 (os aminoácidos sublinhados apresentam um péptido sinal de xilanase). Uma sequência de nucleótidos é como apresentado na SEQ ID N° 54 na FIGURA 72. EXEMPLO 18: Utilização de Reacção de Aciltransferase para a produção de éster de esterol de planta e monoqlicérido para produção de margarina A aciltransferase de Aeromonas salmonicida expressa em Bacillus subtilis foi testada numa mistura de óleo de palma mistura contendo lecitina de planta, esterol de planta e 219 glicerol. A aciltransferase apresentou a capacidade para utilizar esterol de planta e glicerol como moléculas aceitadoras durante a produção de éster de esterol de planta e monoglicérido. A mistura reaccional foi utilizada para produzir margarina de mesa de boa qualidade com base no monoglicérido na mistura reaccional e, ao mesmo tempo, a margarina foi enriquecida com éster de esterol de planta, que mostrou ter um efeito de abaixamento de colesterol. 0 objectivo deste trabalho foi estudar a possibilidade de produzir éster de monoglicérido e esterol de planta por reacção enzimática de lecitina, esterol de planta e glicerol dissolvidos em gordura vegetal.
As experiências iniciais mostraram que foi possível utilizar a aciltransferase de Aeromonas salmonicida para produzir monoglicérido e éster de esterol de planta de lecitina, glicerol e esterol de planta.
Nesta experiência esta mistura reaccional foi utilizada para produzir margarina de mesa.
Materiais: A aciltransferase de lipido de Aeromonas salmonicida, N° 196 C101, 18.6 PLU/g (Journal 2254-104)
Óleo de palma 43, de Aarhus United, DK L-a-Fosfatidilcolina 95% de Planta (Avanti N° 441601)
Esterol de planta: Generol N122 de Cognis, Alemanha Glicerol Item n° 085915
Monoglicérido Destilado, Dimodan HP de Danisco. 220
Produção de Margarina. 1. Misturar os ingredientes da fase água. (Se necessário, pasteurizar a fase de água por aquecimento a aprox. 80 °C). Ajustar pH a 5,5. 2. Fundir a fase gordura e temperar a aprox. 40-45 °C. 3. Aquecer o emulsificador com algum do óleo numa proporção de 1 parte de emulsif icador para 5 partes de óleo a uma temperatura (75-80 °), que é 5-10 °C superior à do ponto de fusão do emulsificador. Quando esta mistura é totalmente fundida e bem agitada, adicioná-la ao restante óleo aquecido, agitando continuamente. 4. Adicionar o aromatizante. 5. Adicionar a fase água à fase gordura, agitando continuamente. 6. Arrefecer num tubo de arrefecimento (capacidade normal, arrefecimento) para uma temperatura exterior de 8-10 °C.
Resultados A aciltransferase de A. salmonícida foi testada em mistura de óleo de palma como apresentado na Tabela 30. Lecitina, esterol de planta, glicerol e óleo de palma foram aquecidos a 221 60 °C em agitaçao de modo a solubilizar o esterol de planta e lecitina.
Tabela 30 o, 0 12 6,6 76,4 5
Substrato:
Lecitina Avanti Esterol de planta, Generol 122N Óleo de palma, ponto de fusão 43 Glicerol O substrato foi arrefecido a 48 °C e a aciltransferase N° 196 foi adicionada na quantidade apresentada na Tabela 31. A mistura reaccional foi mantida a 48 °C durante 24 horas em agitação lenta.
Tabela 31 gramas
Substrato 220
Transferase N° 196 C101, 18.6 PLU/g 15
As amostras da mistura reaccional foram retiradas após 1, 4 e 24 horas de tempo de reacção, e analisadas por TLC no solvente I (Figura 73). Os resultados de TLC mostram claramente a formação de éster de esterol e monoglicérido de plantas. Na 222
Figura 73, a primeira pista é, após 1 hora de tempo de reacção, a Pista 2 é 4 horas de tempo de reacção, a Pista 3 é 24 horas de tempo de reacção e a Pista 4 é um esterol de planta. A reacção foi interrompida após 24 horas de tempo de reacção e os resíduos de esterol de planta não dissolvidos foram removidos e a solução límpida foi utilizada para produzir margarina.
Margarina. A mistura reaccional contendo monoglicérido e éster de esterol de plantas foi utilizada para produzir margarina de mesa com a receita apresentada na Tabela 32. 223
Tabela 32
Jour. N° 3734 1 2 Fase aquosa Fase água 16 16 Sal 0,5 0, 5 Leite magro em pó 1 1 Sorbato de potássio 0,1 0,1 EDTA 0, 015 0, 015 PH 5, 5 5, 5 Fase total 16,6 16,6 Fase gordura Palm 43 25 25 Óleo de colza 75 75 Fase gordura total 83,2 78,4 Dimodan HP 0,2 Mistura reaccional 5 A margarina produzida a partir da mistura reaccional foi avaliada como sendo de boa qualidade com boa capacidade de espalhamento e boa sensação na boca e sem qualquer sabor desagradável. A margarina foi comparada como estando ao nivel de qualidade da margarina de referência produzida utilizando monoglicérido destilado Dimodan HP. 224 A única diferença observada foi a da margarina jour 3734 no 2 com a mistura reaccional foi ligeiramente mais firme, o que foi explicado pelo facto de que esta receita continha mais Palm 43 do que a margarina de referência. EXEMPLO 19: Utilização de uma aciltransferase de lipido durante a produção de pão.
Uma das limitações da utilização de lipases no fabrico de pão é que é formado ácido gordo livre durante a reacção da lipase. É bem conhecido que a formação de demasiado ácido gordo livre terá um impacto negativo no desempenho da farinha na cozedura, porque o glúten fica muito duro e forma-se uma massa baixa (i. e., menos elástico) que não se pode expandir durante a fermentação e cozedura. A formação de ácido gordo livre deve, também, ser evitado do ponto de vista da estabilidade oxidativa, porque os ácidos gordos livres são mais propensos a oxidação lipídica do que o triglicérido correspondente.
Na presente invenção os problemas com a formação de ácido gordo livre quando se adiciona uma enzima lipolítica a uma massa foi ultrapassado utilizando uma aciltransferase de lipido que, em vez de produzir ácidos gordos livres, transfere um ou mais ácidos gordos do dador de acilo de lipido para uma molécula aceitadora que não a água presente na massa, tal como um hidrato de carbono, uma proteína ou péptido ou se utilizados em pão com leite gordo, um esterol, alternativamente ou em combinação com outros aceitadores listados acima podem ser adicionados à massa, por exemplo, fitoesteróis ou fitostanóis., de um modo preferido, 225 a molécula aceitadora numa massa pode ser um ou mais de glucose, sacarose ou maltose e/ou outros hidratos de carbono normalmente disponíveis numa massa.
Nas experiências que se seguem a aciltransferase é testada em experiências de cozedura em mini escala. A formação dos produtos de reacção e os componentes de lípido em massa totalmente testada são extraídos por butanol saturado com água e analisados por HPLC e análise de GLC.
Materiais e métodos Enzimas:
AcilTransferase, 550 PLU-7/mL
Lipopan™ F BG, uma lipase comercial de Novozymes. 12000 LIPU/g ou Grindamyl Exel 16. 12000 LIPU/g Pó de lecitina, 95% de fosfolípido (disponível em Danisco A/S Dinamarca)
Digalactosildiglicérido de farinha branca completa (de Sigma D4651)
Farinha: Solvmel N° 2001084 (farinha branca Danish, obtido de Havnemçllerne, Odense, Dinamarca)
Teste de mini cozedura.
Farinha, 50 gramas, levedura seca 10 gramas, glucose 0,8 gramas, sal 0,8 gramas, 70 ppm de ácido ascórbico e, 400 Brabender unidades de água foram batidos numa taça de 226 mistura de 50 g Brabender, durante 5 min, a 30 °C. O tempo de repouso foi de 10 min. a 34 °C. A massa foi dividida em 15 gramas de massa. Depois foi moldada num dispositivo especial em que a massa é enrolada entre um prato de madeira e um moldura de plexiglas. As massas foram ensaiadas em formas, durante 45 min, a 34 °C, e cozidas num forno caseiro Voss 8 min. A 225 °C. Após cozedura, os pães são arrefecidos à temperatura ambiente e após 20 min. Os pães são divididos e o volume é determinado pelo método de deslocamento de semente de colza. Os pães são também avaliados ao corte e migalha e crosta.
Resultados e conclusão:
Os resultados preliminares indicam que a aciltransferase de lipido demonstra claramente um efeito positivo no volume do pão e na aparência do pão. Em particular, os resultados preliminares indicam que a utilização de uma aciltransferase de lipido resulta num volume de pão especifico aumentado em comparação com o obtido com o controlo (sem enzima) e o obtido com a utilização de uma enzima lipolitica comercialmente disponível, nomeadamente Grindamyl Exel 16 ou LipopanF™. EXEMPLO 20: Gelado convencional com natas gordas A função dos emulsificadores utilizados no gelado é trazer a cristalização de gordura controlada e destabilização suave devido à desabsorção de proteína durante o envelhecimento do gelado. Esta alteração melhora a qualidade do gelado. Os mono-diglicéridos são normalmente utilizados para a produção de gelado, mas é também conhecida a utilização de emulsificadores 227 polares como éster de polissorbato e açúcar na produção de gelado em combinação com mono-diglicérido para facilitar a destabilização controlada de gordura e produzir gelado com uma textura muito boa cremosa e macia ao ser consumido.
Os emulsificadores utilizados para gelado são, normalmente, adicionados à mistura do gelado como um pó. Recentemente, contudo, foi demonstrado que o mono-diglicérido pode ser produzido por reacção enzimática da gordura na receita de gelado utilizando lipases. 0 problema de utilizar lipases é, contudo, que as lipases também catalisam a formação de ácidos gordos livres, quando está disponível água na mistura reaccional.
Foi surpreendentemente demonstrado, contudo, que a aciltransferase de lipido ultrapassa a limitação da lipase porque a aciltransferase é capaz de transferir ácidos gordos da lecitina e outros lípidos para moléculas aceitadoras como esterol, colesterol, glucose, glicerol e proteinas/péptidos sem formação de quantidade significativa de ácidos gordos livres.
Um dos ingredientes principais no gelado são as natas contendo 38% de gordura do leite. As natas também contêm uma pequena quantidade de lecitina, que é uma molécula dadora para a aciltransferase. ("Os complexos lipidos do leite contribuem com cerca de 1% da gordura total do leite e são principalmente compostos por fosfolipidos". Ref. Ullmann's Encyclopedia of Industrial ChemistryCopyright © 2003 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.). As natas também contêm uma pequena quantidade de colesterol, que é uma molécula aceitadora para a aciltransferase. 228 A partir de constituintes do gelado é deste modo possível produzir monoglicérido e emulsificadores polares como éster de liso-lecitina e açúcar, que são conhecidos pelos efeitos benéficos na produção de gelado.
Um outro efeito benéfico da reacção de aciltransferase nas natas é a formação de éster de colesterol, que pode abrandar a absorção de colesterol no intestino.
Receita de gelado
Com emulsificante Com enzima
Natas, 38% 23,65 23,65 Leite magro 53,30 53,30 Leite magro em pó 4,90 11,30 Açúcar 12,00 12,00 Xarope de glucose, 4, 25 4,25 DE 42, 75% TS Glicerol 1,0 1,0 Mistura estabilizante 0,2 0,2 Cremodan SE 30 Aciltransferase de lípido, 500 PLU/g 0,6 0,1 Aromatizantes 0,1 0,1 Grindsted 2976 Cor + + 229
Processo de produção de gelado. 1. Aquecer as natas, xarope de glucose e glicerol a aprox. 40 °C. Adicionar a aciltransferase de lípido e deixar a mistura reagir durante 30 minutos. A amostra é retirada para análise 2. Aquecer todos os outros ingredientes líquidos a aprox. 40° 3. Adicionar os outros ingredientes secos. (a mistura estabilizante é misturada com açúcar antes de adição) 4. Quando os ingredientes secos são dissolvidos, adicionar a mistura natas-glucose. 5. Pasteurizar a 80-85 °C/20-40 segundos 6. Homogeneizar a 80 °C (190 bar para a receita 1 e 175 bar para a receita 2)
7. Arrefecer à temperatura de envelhecimento, 4 °C 8. Congelar num congelador contínuo até o excedente desejado (recomendado 100%)
9. Endurecer em túnel a -40 °C
10. Armazenar abaixo de -25 °C 230
Resultados :
As utilizações da Aciltransferase na produção de gelado contribui para a produção de gelado com muito bom paladar e excelente sensação cremosa na boca em comparação com o gelado produzido utilizando um emulsificador comercial Cremodan SE 30. A fusão do gelado produzido pela aciltransferase de lipido é, também, melhorada.
Exemplo 21: Aciltransferase no Queijo. O queijo é o produto fresco ou sólido maduro ou semi-sólido obtido por leite coagulado, leite magro, leite parcialmente magro, nata, nata de soro de leite coalhado ou leitelho, ou qualquer combinação destes materiais, através da acção da renina ou outros agentes de coagulação adequados, e drenando parcialmente o soro de leite coalhado que resulta desta coagulação. 0 rendimento do queijo depende, em primeiro lugar, do conteúdo em gordura e proteína do leite. 0 sal (particularmente sais de cálcio) e concentrações de proteína, assim como a acidez, são muito importantes para a coagulação, (ref. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright © 2003 de Wiley-VCH Verlag GmbH & Co).
Este esforço foi efectuado de modo a optimizar e aumentar o rendimento do queijo por optimização do processo de preparação do queijo (documento USP 4959229) ou utilizando um método de coagulação melhorado (documento USP 4581240), que aumenta a quantidade de proteína no soro do leite coalhado no coalho. 231
Na presente invenção a quantidade de proteína no coalho do soro de leite coalhado é aumentada por modificação enzimática da proteína do soro de leite coalhado por tratamento do leite durante a preparação do queijo com uma aciltransferase de lípido.
Quando um ácido gordo é covalentemente ligado a uma proteína não membranar como a β-lactoglobulina, as propriedades físicas e funcionais mudarão drasticamente.
Para a produção de queijo da presente invenção a aciltransferase é adicionada ao leite antes ou ao mesmo tempo que a renina é adicionada ao leite.
Durante a precipitação de caseína a aciltransferase é capaz de utilizar lecitina e outros lípidos no leite como dador e péptidos ou proteína como molécula aceitadora durante a formação de proteína acilada ou péptidos acilados. A alteração nas propriedades hidrofóbicas da proteína do leite contribui para uma precipitação de proteína aumentada no coalho durante produção de queijo.
Uma vez que o aumento no rendimento do queijo obtido pela presente invenção tem origem na retenção aumentada de proteínas no coágulo de queijo que são normalmente perdidas no soro, um método adequado, directamente relacionado com o mecanismo da invenção, é baseado na determinação da quantidade de proteína que fica no soro. Menos proteína no soro de leite coalhado significa necessariamente mais proteína no coalho, e maior rendimento do queijo. 232 0 teste para a quantidade de proteína no soro de leite coalhado pode ser realizado da seguinte maneira: leite magro ou completo é aquecido a uma temperatura adequada para a coagulação da renina, tipicamente, 30-35 °C num copo de 100 mL. Opcionalmente, 1% de um iniciador de bactérias do ácido láctico é adicionado, e é adicionada renina convencional numa quantidade correspondente a, e. g., 0,03-0,05%. Quando o leite se tornou num coágulo suficientemente sólido para permitir o seu corte em cubos com um comprimento lateral de cerca de 0,5 cm, este corte é realizado com uma faca afiada. A sinerese é, então, iniciada, e após 30 min de período de espera, que permite que o coalho assente, é drenada uma amostra de soro de leite coalhado, e centrifugada numa centrífuga de laboratório durante 10 min. Esta amostra é analisada quanto ao conteúdo de proteína, utilizando, e. g., o método de Kjeldahl. Alternativamente, e/ou como um suplemento, a amostra pode ser analisada com métodos que permitem o tipo e quantidade dos componentes individuais de proteína a ser estabelecidos. EXEMPLO 22 "Ensaio num Ambiente Pobre em Agua"
Reacçoes de transferase de enzimas lipolíticas num ambiente pobre em água.
Processo Materiais.
Colesterol Sigma cat. C 8503 L-alfa-Fosfatidilcolina 95% (Plant) Avanti N° 441601 233 Óleo de soja, Aarhus United, DK. Clorofórmio, Grau analítico
Enzimas. N° 179, GCAT de A. Salmonicida N° 2427, Fosfolipase AI de Fusarium oxysporum. LIPOPAN® F de Novozymes, Dinamarca N° 1991, Fosfolipase A2 de Pâncreas, LIPOMOD 22L de Biocatalysts, UK N° 2373, Candida Antarctica lipase, Novozyme 525 L de Novozymes Dinamarca.
Ensaio enzimático
Foram dissolvidos 13,1% de lecitina e 6,6% de colesterol em óleo de soja por aquecimento a 60 °C em agitação
O substrato foi medido num vidro de Wheaton de 2 0 mL e aquecido a 46 °C
Foram adicionadas água e solução de enzima e foi iniciado um cronómetro.
Em intervalos regulares 50 mg amostras foram transferidas para um vidro Dram de 10 mL congeladas.
Os lípidos isolados foram analisados por GLC 234
Análise de GLC A análise de GLC foi efectuada como descrito no Exemplo 11.
Resultados A experiência foi estabelecida como apresentado na Tabela 33 0 substrato com base no óleo de soja contendo 13,1% de lecitina e 6,6% de colesterol foi aquecido a 46°C. A solução de enzima foi adicionada e foi iniciado um cronómetro.
Após 30, 60 e 120 minutos de tempo de reacção as amostras foram retiradas para análise de GLC.
Tabela 33 1 2 3 4 5
Substrato grama 5 5 5 5 5 Transferase N° 179-C72, 56 PLU-7/mL mL 0,3 N° 2427, 200 PLU-7/mL mL 0,3 Pâncreas PLA 2 N° 1991 6300 PLU/mL mL 0,3 Novozyme 525 L, N° 2373, 200 LIPU/mL mL o,. Água mL 0,3 % de água 6 6 6 6 6 235
Os resultados da análise GLC são apresentados na Tabela 34. Os resultados são expressos em percentagem com base na composição total da amostra. Com base nos resultados de GLC foi possível calcular a quantidade de ácido gordo e éster de colesterol produzido por reacção enzimática relativamente à amostra controlo sem enzima adicionada. Sob estas condições experimentais a actividade enzimática total foi estimada como a actividade hidrolitica medida como formação de ácido gordo livre e a actividade de transferase estimada como formação de éster de colesterol. A partir destes resultados e da informação acerca do peso molecular de ácido gordo e éster de colesterol foi possível calcular a actividade hidrolitica molar relativa e a actividade de transferase molar relativa como apresentado na Tabela 35.
Tabela 34
Enzima Tempo de Ácidos Colesterol Éster de reacção em gordos o. colesterol minutos o. o, o Controlo 120 0,533 7, 094 0,000 N° 179 30 0,770 5,761 2,229 N° 179 60 0, 852 5,369 2,883 N° 179 120 0,876 4, 900 3,667 N° 2427 30 3,269 7, 094 0,000 N° 2427 60 3,420 7, 094 0,000 N° 2427 120 3,710 7, 094 0,000 N° 1991 30 2, 871 7, 094 0,000 N° 1991 60 3,578 7, 094 0,000 N° 1991 120 3,928 7, 094 0,000 N° 2373 30 1,418 7, 094 0,000 N° 2373 60 1,421 7, 094 0,000 N° 2373 120 1,915 7, 094 0,000 236
Tabela 35
Tempo de Ácidos Colesterol Éster de Actividade Actividade Enzima reacção em gordos produzidos Utilizado colesterol produzido hidrolítica O. de transferase minutos O. N° 179 30 0, 238 1, 334 2, 229 20 80 N° 179 60 0, 319 1, 725 2, 883 21 79 N° 179 120 0, 343 2, 195 3, 667 18 82 N° 2427 30 2, 737 0, 000 0, 000 100 0 N° 2427 60 2,887 0, 000 0, 000 100 0 N° 2427 120 3,177 0, 000 0, 000 100 0 N° 1991 30 2, 338 0, 000 0, 000 100 0 N° 1991 60 3, 046 0, 000 0, 000 100 0 N° 1991 120 3, 395 0, 000 0, 000 100 0 N° 2373 30 0, 885 0, 000 0, 000 100 0 N° 2373 60 0, 888 0, 000 0, 000 100 0 N° 2373 120 1, 383 0, 000 0, 000 100 0
Conclusão
Nestas experiências foi observado que todas as enzimas testadas apresentaram actividade hidrolítica devido à quantidade aumentada de ácido gordo. Contudo, a única enzima que apresentou actividade de transferase foi GCAT de A. salmonicídã. Conclui-se, deste modo, que num sistema oleoso com lecitina e colesterol contendo 6% de água, apenas a fosfolipase AI de 237
Fusarium oxysporum, a fosfolipase A2 de pâncreas e uma lipase de Candida antarctica apresentaram actividade hidrolítica.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em conjunto com as formas de realização preferidas especificas, deve ser entendido que a invenção conforme reivindicada não não deve ser indevidamente limitada a tais formas de realização especificas. De facto várias modificações dos modos de realizar a invenção que são óbvios para os especialistas em bioquímica e biotecnologia ou campos relacionados pretendem estar no âmbito das reivindicações que se seguem.
Lisboa, 4 de Janeiro de 2012 238

Claims (44)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma aciltransferase de lípido para preparar, a partir de um material alimentar contendo água compreendendo 10-98% de água, um produto de massa ou um produto cozido compreendendo um emulsificador, em que o emulsificador é produzido a partir de constituintes do material alimentar pela aciltransferase de lípido, em que a aciltransferase de lipido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado possui, pelo menos, 2% de actividade de aciltransferase; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: (i) dissolver 450 mg de fosfatidilcolina e 50 mg de colesterol em clorofórmio, evaporando sob vácuo até secagem; (ii) transferir 300 mg da mistura de colesterol/fosfatidilcolina para um frasco de Wheaton, adicionar 15 mL de tampão HEPES 50 mM pH 7 e dispersar o lipido no tampão durante agitação; (iii) aquecer o substrato a 35 °C durante a mistura com um agitador magnético e adicionar 0,25 mL de solução enzimática; (iv) retirar amostras de 2 mL aos tempos de reacção 0, 5, 10, 15, 25, 40 e 60 minutos e parar imediatamente a reacção enzimática pela adição de 25 pL de HC1 a 4M para acidificar o ácido gordo livre; (v) adicionar 3 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar e isolar 2 mL da fase de clorofórmio, filtrar através de um filtro de 0,45 pm num frasco de Dram de 10 mL tarado; 1 (vi) evaporar o clorofórmio sob uma corrente de azoto a 60 °C e pesar as amostras; (vii) analisar o lipido extraido por GLC.
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o produto de massa ou o produto cozido é um pão, um produto frito, uma merenda, bolos, empadas, bolos de chocolate, bolinhos, talharim, itens de lanche ou pasta.
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o produto de massa ou o produto cozido é um pão.
  4. 4. Utilização de acordo com as reivindicações 1-3, em que são produzidos, pelo menos, dois emulsificadores.
  5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que, pelo menos, um dos emulsificadores é um éster de hidrato de carbono.
  6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que, pelo menos, um dos emulsificadores é um éster de proteína.
  7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que um ou mais de um éster de esterol ou um éster de estanol ou um éster de proteína ou um éster de hidrato de carbono ou um diglicérido ou um monoglicérido é também produzido in situ no alimento.
  8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o éster de esterol é um ou mais de éster de alfa-sitosterol, éster de beta-sitosterol, éster de estigmasterol, éster de ergoesterol, éster de campesterol ou éster de colesterol. 2
  9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o éster de estanol é um ou mais de beta-sitostanol ou ss-sitostanol.
  10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a aciltransferase de lípido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água numa gema de ovo com 54% de água, possui até 100% de actividade de transferase relativa; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: i) pesar 5 gramas de substrato de gema de ovo liquido num frasco de Wheaton de 20 mL e aquecer até 35 °C; ii) adicionar solução de água e enzima; iii) transferir, a intervalos regulares, amostras de 0,5 g para um frasco de Dram de 10 mL; iv) adicionar 20 pL de HC1 a 4 M para parar a reacção enzimática e acidificar o sabão de ácido gordo; v) adicionar 3 mL de Clorofórmio, misturar a amostra durante 30 segundos e centrifugar a 3000 g durante 10 minutos; vi) transferir 0,8 mL da fase de clorofórmio para um frasco de Dram revestido, evaporar o Clorofórmio a 60 °C sob uma corrente de azoto; pesar o dram de vidro; vii) analisar os lípidos isolados por GLC.
  11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a aciltransferase de lipido é uma que possui uma percentagem inicial de actividade de aciltransferase medida após 10% de consumo da molécula dadora de, pelo menos, 1% de actividade de transferase relativa. 3
  12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que a percentagem inicial de actividade de aciltransferase medida após 10% de consumo da molécula dadora é, pelo menos, 5%.
  13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o substrato aceitador de acilo é um hidrato de carbono, uma proteína, um esterol, um estanol ou glicerol.
  14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o substrato aceitador de acilo é um hidrato de carbono.
  15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a aciltransferase de lípido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água possui uma actividade de transferase relativa de, pelo menos, 1%; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: i) dissolver Lecitina a 13,1% e colesterol a 6,6% em óleo de soja aquecendo até 60 °C durante agitação; ii) pesar o substrato num frasco de Wheaton de 20 mL e aquecer a 46 °C; iii) adicionar solução de água e enzima; iv) transferir, a intervalos regulares, amostras de 50 mg para um frasco de Dram de 10 mL e congelar; v) analisar os lípidos isolados por GLC.
  16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que o substrato aceitador de acilo no ensaio é um hidrato de carbono, uma proteína, um esterol, um estanol ou glicerol.
  17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o substrato aceitador de acilo é um hidrato de carbono. 4
  18. 18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a aciltransferase de lipido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de aciltransferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S.
  19. 19. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a enzima aciltransferase de lipido compreende H-309 ou compreende um resíduo de histidina numa posição correspondente a His-309 na sequência de aminoácidos da enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32.
  20. 20. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a aciltransferase de lipido é obtenível de um organismo de um ou mais dos géneros seguintes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas e Candida.
  21. 21. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a aciltransferase de lipido compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos : (i) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 2; (ii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 3; (iii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 4; (iv) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 5 ; (v) a 5 sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 6; (vi) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 12, (vii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 20, (viii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 22, (ix) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 24, (x) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 26, (xi) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 28, (xii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 30, (xiii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 32, (xiv) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 34, ou uma sequência de aminoácidos que possui 75% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências mostrada como SEQ ID CM o , SEQ ID N 0 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 12, SEQ ID O CM o SEQ ID N° 22 SEQ ID CM o , SEQ ID N° 26, SEQ ID 3 O tO 00 > SEQ ID N° 30 SEQ ID N° 32 ou SEQ ID N° 34.
  22. 22. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o emulsificador é um ou mais dos seguintes: um monoglicérido, uma lisofosfatidilcolina, digalactosilmonoglicérido.
  23. 23. Método de produção de um produto de massa ou um produto cozido compreendendo um emulsificador, em que o método compreende o passo de adicionar uma aciltransferase de lipido a um produto de massa compreendendo 10-98% de água, em que a aciltransferase de lipido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase em Substrato Tamponado possui, pelo menos, 2% de actividade de aciltransferase; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: 6 (i) dissolver 450 mg de fosfatidilcolina e 50 mg de colesterol em clorofórmio, evaporando sob vácuo até secagem; (ii) transferir 300 mg da mistura de colesterol/fosfatidilcolina para um frasco de Wheaton, adicionar 15 mL de tampão HEPES 50 mM pH 7 e dispersar o lípido no tampão durante agitação; (iii) aquecer o substrato a 35 °C durante a mistura com um agitador magnético e adicionar 0,25 mL de solução enzimática; (iv) retirar amostras de 2 mL aos tempos de reacção 0, 5, 10, 15, 25, 40 e 60 minutos e parar imediatamente a reacção enzimática pela adição de 25 pL de HC1 a 4M para acidificar o ácido gordo livre; (v) adicionar 3 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente durante 30 segundos, centrifugar e isolar 2 mL da fase de clorofórmio, filtrar através de um filtro de 0,45 pm num frasco de Dram de 10 mL tarado; (vi) evaporar o clorofórmio sob uma corrente de azoto a 60 °C e pesar as amostras; (vii) analisar o lípido extraído por GLC.
  24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que em que o produto de massa ou o produto cozido é um pão, um produto frito, uma merenda, bolos, empadas, bolos de chocolate, bolinhos, talharim, itens de lanche ou pasta.
  25. 25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou reivindicação 24, em que o produto de massa ou o produto cozido é um pão.
  26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-25 em que são produzidos, pelo menos, 2 emulsificadores. 7
  27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-26, em que a aciltransf erase de lípido é uma que é capaz de transferir um grupo acilo de um lípido para um ou mais dos aceitadores de acilo seguintes: um esterol, um estanol, um hidrato de carbono, uma proteína ou uma sua sub-unidade, glicerol.
  28. 28. Método de acordo com a reivindicação 24, em que, pelo menos, um dos emulsificadores é um éster de hidrato de carbono.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 24, em que, pelo menos, um dos emulsificadores é um éster de proteína.
  30. 30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-29, em que um ou mais de um éster de esterol ou um éster de estanol ou um éster de proteína ou um éster de hidrato de carbono ou um diglicérido ou um monoglicérido é também produzido in situ no alimento.
  31. 31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o éster de esterol é um ou mais de éster de alfa-sitosterol, éster de beta-sitosterol, éster de estigmasterol, éster de ergoesterol, éster de campesterol ou éster de colesterol.
  32. 32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o éster de estanol é um ou mais de beta-sitostanol ou ss-sitostanol.
  33. 33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-32, em que a aciltransferase de lípido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase em Gema de Ovo com Muita Água numa gema de ovo com 54% de água, possui até 100% de actividade de transferase relativa; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: 8 i) pesar 5 gramas de substrato de gema de ovo líquido num frasco de Wheaton de 20 mL e aquecer até 35 °C; ii) adicionar solução de água e enzima; iii) transferir, a intervalos regulares, amostras de 0,5 g para um frasco de Dram de 10 mL; iv) adicionar 20 pL de HC1 a 4 M para parar a reacção enzimática e acidificar o sabão de ácido gordo; v) adicionar 3 mL de Clorofórmio, misturar a amostra durante 30 segundos e centrifugar a 3000 g durante 10 minutos; vi) transferir 0,8 mL da fase de clorofórmio para um frasco de Dram revestido, evaporar o Clorofórmio a 60 °C sob uma corrente de azoto; pesar o dram de vidro; vii) analisar os lípidos isolados por GLC.
  34. 34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a aciltransferase de lípido é uma que possui uma percentagem inicial de actividade de aciltransferase medida após 10% de consumo da molécula dadora de, pelo menos, 1% de actividade de transferase relativa.
  35. 35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a percentagem inicial de actividade de aciltransferase é, pelo menos, 5%.
  36. 36. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o substrato aceitador de acilo é um hidrato de carbono, uma proteína, um esterol, um estanol ou glicerol.
  37. 37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o substrato aceitador de acilo é um hidrato de carbono. 9
  38. 38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-37 em que a aciltransferase de lípido é uma que quando testada utilizando o Ensaio de Transferase num Ambiente de Pouca Água possui uma actividade de transferase relativa de, pelo menos, 1%; compreendendo o referido ensaio de transferase os passos de: i) dissolver Lecitina a 13,1% e colesterol a 6,6% em óleo de soja aquecendo até 60 °C durante agitação; ii) pesar o substrato num frasco de Wheaton de 20 mL e aquecer a 46 °C; iii) adicionar solução de água e enzima; iv) transferir, a intervalos regulares, amostras de 50 mg para um frasco de Dram de 10 mL e congelar; v) analisar os lípidos isolados por GLC.
  39. 39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-38, em que a aciltransferase de lípido é caracterizada como uma enzima que possui actividade de aciltransferase e que compreende o motivo de sequência de aminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S.
  40. 40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-39, em que a enzima aciltransferase de lípido compreende H-309 ou compreende um resíduo de histidina numa posição correspondente a His-309 na sequência de aminoácidos da enzima lipolítica de Ãeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 32.
  41. 41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-40, em que a aciltransferase de lípido é obtenível de um 10 organismo de um ou mais dos géneros seguintes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas e Candida.
  42. 42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-41, em que a aciltransf erase de lipido compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: (i) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 2; (ii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N 0 3 ; ( i i i) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 4; (iv) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID Ν' 3 5; (v) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 6; (vi) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 12, (vii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 20, (viii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 22, (ix) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 24, (x) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 26, (xi) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 28, (xii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 30, (xiii) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 32, (xiv) a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° 34, ou uma sequência de aminoácidos que possui 75% ou mais de identidade com qualquer uma das sequências mostrada como SEQ ID N° 2, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 22 SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID O 00 o SEQ ID N° 32 ou SEQ ID N° 34. 11
  43. 43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-47, em que o emulsif icador é um ou mais dos seguintes: um monoglicérido, uma lisofosfatidilcolina, digalactosilmonoglicérido.
  44. 44. Produto de massa ou cozido contendo água, em que o produto de massa ou cozido compreende 10-98% de água, obtenível pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-43, em que o alimento compreende uma aciltransferase de lípido como definida na reivindicação 23 e um emulsificador. Lisboa, 4 de Janeiro de 2012 12
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