JP2015519049A - 固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ及びその製造方法と用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ及びその製造方法と用途を公開する。前述脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、担体に固定化され、天然もしくは人工的突然変異体、または変異種由来のもの、および外来の環状アシルトランスフェラーゼの遺伝子を導入して転換させたもので、前述担体の材料は、無機担体、またはポリプロピレン樹脂担体から選ばれる。また、本発明は、前述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの製造方法と用途を公開する。

Description

本発明は、酵素の固定化技術に関し、特に、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ及びその製造方法と用途に関する。
エキノカンジンは、新規な抗真菌薬として、カンジダ菌やアスペルギルス菌による感染の治療に効果が優れたものである。
このような薬物は、カスポファンギン、ミカファンギン、アニデュラファンギンが代表的である。
エキノカンジン系薬物は、1,3-βグリコシド結合の形成を阻害することによって真菌を抑制することで、人体への障害をより減少させ、効率的で且つできるだけ副作用を低下させるため、使用の過程において従来の抗真菌薬よりも安全である。
FK463(ミカファンギン)は、式[Ie]で示される化合物で、式Ia化合物FR901379を前駆体として側鎖を切断して式[Ic]化合物FR179642を得た後、さらに合成方法によって得たものである。
Anidulafungin(アニデュラファンギン)は、式[If]で示される化合物で、式Ib化合物echinocandin Bを前駆体として側鎖を切断して式[Id]化合物を得た後、さらに合成方法によって得たものである。
脂環式ペプチド物質、例えばFR901379、echinocandin B（エキノカンジンB）、アクレアシンAなどの物質およびその類似体のアシル側鎖を離脱させる酵素について、アクチノプラネス・ウタヘンシス（Actinoplanes utahensis）に属するIFO-13244、（A. utahensis）NRRL-12052から生産される酵素が既に報告されている。
WO97/32975号の特許では、ストレプトマイセス属（Streptomyces）に属する細菌（例えばストレプトマイセス・アヌラツス（Streptomyces anulatus）4811号菌株、ストレプトマイセス・アヌラツス8703号菌株、ストレプトマイセス菌（Streptomyces sp.）6907号菌株）から生産される酵素が報告されている。
また、WO97/47738号の特許では、オイディオデンドロン・テヌイシマム（Oidiodendron tenuissimum）IFO 6797菌株、オイディオデンドロン・テヌイシマムIFO 31963菌株、オイディオデンドロン・テヌイシマムIFO 9951菌株、オイディオデンドロン・テヌイシマムIFO 31812菌株、オイディオデンドロン菌（Oidiodendron sp.）30084号菌株、バーティシリウム菌（Verticillium sp.）30085号菌株から生産される酵素が報告されている。
前述アシルトランスフェラーゼは、培養菌糸やろ液に見られる。
通常、このような生物活性物質を回収する方法は、培養ブイヨンからろ過や遠心で得られる菌糸およびろ液を伝統の方法によって分離、精製し、例えば高濃度塩溶液による抽出、通常の溶媒による抽出、減圧濃縮、冷凍乾燥、pH調整、アニオン交換樹脂やカチオン交換樹脂、結晶、再結晶などで、このアシルトランスフェラーゼが得られる。
特許CN 1161462Cでは、培養液で脂環式ペプチド物質（例えばFR901379、echinocandin Bなど）を転化させる前述酵素の脱アシル化方法が公開されているが、その欠点は、転化系に有機溶媒があって、産物の後処理が困難で、転化速度が遅く、アシルトランスフェラーゼの再利用が不可能で、転化産物の純度が低く、脱アシル後の産物の精製が難しくなることである。
そのため、前述アシルトランスフェラーゼを回収、精製し、この酵素の利用率を向上させるために、前述酵素を固定化する方法を求め続けている。
本発明の目的は、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを提供することである。
また、本発明の目的は、上述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの製造方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、上述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの用途を提供することである。
本発明の第一の側面は、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが担体に固定化された固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを提供する。前述脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、天然もしくは人工的突然変異体、または変異種由来のもの、および外来の環状アシルトランスフェラーゼの遺伝子を導入して転化させたもので、前述担体の材料は、無機担体、または多孔質親水性酵素担体から選ばれる。
前述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、式Ｉで表される化合物におけるR1のアシル基の脱アシル化を触媒し、式ＩＩで表される化合物を生成することに使用されるものである。
式中において、R1はアシル基で、R2はヒドロキシ基またはアシルオキシ基で、R3は水素またはヒドロキシ基で、R4は水素またはヒドロキシ基で、R5は水素またはヒドロキシスルホニルオキシ基で、R6は水素またはアミノホルミル基である。
もう一つの好適な例において、前述アシル基の脱アシル化反応を触媒できる化合物またはその薬学的に許容される塩は、式Ｉaまたは式Ｉbで表されるものである。
一つの好適な例において、前述担体の材料は、以下の無機担体から選ばれ、前述無機担体の全重量に対して、SiO2の含有量が50wt％超で、Al2O3の含有量が1wt％超で、好ましくは触媒担体CELITE、膨張パーライト、セライト、カオリンまたは多孔質ガラスから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前述担体の材料は、ポリメタクリレートを基体としてエポキシドを結合させたものまたはアミノ官能基を含有する多孔質親水性酵素担体から選ばれる多孔質親水性酵素担体で、好ましくはRelizyme EP403、SEPABEADS EC-EP、Relizyme HA403またはSEPABEADS EC-HAから選ばれる。
一つの好適な例において、前述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、担体1gあたりに、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが10〜1000単位（u）、好ましくは20〜600単位（u）固定化されている。
もう一つの好適な例において、前述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、無機担体に固定化され、担体1gあたりに、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが10〜100単位（u）、好ましくは20〜80単位（u）固定化されている。
もう一つの好適な例において、前述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、多孔質親水性酵素担体、例えばポリメタクリレートを基体としてエポキシドを結合させたものまたはアミノ官能基を含有する酵素担体に固定化され、担体1gあたりに、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが100〜1000単位（u）、好ましくは120〜600単位（u）固定化されている。
本発明の第二の側面は、
遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を担体と混合し、吸着、固定化を行うことで、上述のような本発明によって提供される固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを得る工程、
を含む、上述のような本発明によって提供される固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの製造方法を提供する。
上述製造方法において、前述脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、天然もしくは人工的突然変異体、または変異種由来のもの、および外来の環状アシルトランスフェラーゼの遺伝子を導入して転化させたものである。
上述製造方法において、前述菌株は、アクチノマイセス属またはストレプトマイセス属のものである。
上述製造方法において、前述遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液は、菌株を培養し、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を得る、或いは菌株を培養した後、得られた菌糸体を破裂させ、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を得る方法によって得られる。
或いは、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を精製し、不純タンパク質を除去し、より純粋な脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの溶液を得る。
上述製造方法において、前述担体の材料は、無機担体、または多孔質親水性酵素担体から選ばれる。
上述製造方法において、前述無機担体は、前述無機担体の全重量に対して、SiO2の含有量が50wt％超で、Al2O3の含有量が1wt％超で、好ましくは触媒担体CELITE、膨張パーライト、セライト、カオリンまたは多孔質ガラスから選ばれる。
上述製造方法において、前述多孔質親水性酵素担体は、ポリメタクリレートを基体としてエポキシドを結合させたものまたはアミノ官能基を含有する酵素担体から選ばれ、好ましくはRelizyme EP403、SEPABEADS EC-EP、Relizyme HA403またはSEPABEADS EC-HAから選ばれる。
上述製造方法において、前述遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと担体の混合比率は、担体1gあたりに酵素が10〜1000単位（u）、好ましくは担体1gあたりに酵素が20〜600単位（u）である。
上述製造方法において、前述遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと無機担体の混合比率は、担体1gあたりに酵素が10〜100単位（u）、好ましくは担体1gあたりに酵素が20〜80単位（u）である。
上述製造方法において、前述遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと多孔質親水性酵素担体の混合比率は、担体1gあたりに酵素が100〜1000単位（u）、好ましくは担体1gあたりに酵素が120〜600単位（u）である。
上述製造方法において、前述遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液のpH値は4〜9、好ましくは6〜7である。
上述製造方法において、前述遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を担体と混合する温度は0〜80℃、好ましくは20〜35℃、最も好ましくは20〜25℃である。
上述製造方法において、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を担体と混合した後、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと担体に結合された脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを分離し、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを得る。
本発明の第三の側面は、
（a）式Ｉで表される化合物を緩衝溶液と混合し、溶液1を得る工程と、
（b）溶液1を上述のような本発明によって提供される固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと混合し、脱アシル化反応を行い、式ＩＩで表される化合物を得る工程と、
を含む、式ＩＩで表される化合物の製造方法を提供する。
式中において、R1はアシル基で、R2はヒドロキシ基またはアシルオキシ基で、R3は水素またはヒドロキシ基で、R4は水素またはヒドロキシ基で、R5は水素またはヒドロキシスルホニルオキシ基で、R6は水素またはアミノホルミル基である。
もう一つの好適な例において、前述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと式Ｉの化合物の比率は0.01〜10 u/gである。
もう一つの好適な例において、前述工程（a）における緩衝液のpHは4〜9、好ましくは6〜7で、前述工程（a）における緩衝液は、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ニ水素カリウム-リン酸水素ニナトリウム緩衝液およびTris-HCl緩衝液から選ばれる一種または一種以上である。
もう一つの好適な例において、前述工程（b）における脱アシル化反応の温度は20〜70℃、好ましくは40〜50℃である。
もう一つの好適な例において、前述工程（b）では、脱アシル化反応後、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを産物を含有する反応液と分離し、式ＩＩで表される化合物を得る。好ましくは、前述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを産物を含有する反応液と分離する方法は、ろ過または遠心を含む。
このように、本発明は、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを固定化する方法を提供することで、前述アシルトランスフェラーゼを回収、精製し、この酵素の利用率を向上させる。
図1は実施例10の固定化酵素（vi）の脱アシル化産物のHPCL分析スペクトルである。 図2は比較例1の遊離酵素液の脱アシル化産物のHPCL分析スペクトルである。
具体的な実施形態
発明者は、幅広く深く研究したところ、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを固定化する工業的生産方法、およびこの固定化酵素製剤を用いて脂環式ペプチドの側鎖の「アミド基」を脱アシル化して「アミノ基」を形成する生産方法を見つけたが、この方法は、技術が先進で、プロセスが簡単で、操作が便利で、脱アシル化産物の純度が高い。
具体的に、本発明は、微生物Colephoma sp.のF-11899株（FERM BP-2635）によるFR901379物質（特許番号CN1051757A）、微生物Aspergillus nidulansのNrrl 11440株によるechinocandin B（エキノカンジンB）（特許番号US4288549）およびこれらの類似体のアシル側鎖を脱アシル化するアシルトランスフェラーゼの固定化方法、およびこの固定化酵素で脱アシル化する方法に関する。
背景技術および本発明に係る化合物の構造式について、以下の表に示す。
式中において、R1はアシル基で、R2はヒドロキシ基またはアシルオキシ基で、R3は水素またはヒドロキシ基で、R4は水素またはヒドロキシ基で、R5は水素またはヒドロキシスルホニルオキシ基で、且つR6は水素またはアミノホルミル基である。
本発明の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは固定化され、その製造過程は、以下の工程を含む。
a．脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ液を製造する。
b．脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ液を担体と所定の比率で混合し、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを担体の材料に固定化する。
c．脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ液を酵素担体と分離し、固定化された脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを得る。
本発明で使用される脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、その由来が特に制限されないが、天然もしくは人工的突然変異体、または変異種由来のもの、および外来の環状アシルトランスフェラーゼの遺伝子を導入して転化させた前述酵素もすべて含まれる。
前述担体の材料は、無機担体または多孔質親水性酵素担体から選ばれる。
無機担体の利点は、酵素を不活性化させず、担体に吸着した酵素はすべて活性があることであるが、欠点は比活性が低く、単位担体量あたりの吸着できる酵素量が多孔質親水性酵素担体よりも遥かに低いことである。一方、多孔質親水性酵素担体は、より多い酵素が吸着できるが、酵素を部分的に不活性化させ、即ち担体に吸着した酵素は一部だけが活性的で、回収率が低い。
無機担体は、疎水性担体、例えばよく固定化に使用される触媒担体CELITE[化学組成：87％SiO2、0.9％CaO、6.1％Al2O3、1.6％Fe2O3、1.6％Na2O+K2O]、膨張パーライト[化学組成：SiO2(70-75％)、CaO(0.1-2.0％)、Al2O3(12-16％)、Na2O (1.0-5.0％)、Fe2O3(0.1-1.5％)、K2O(1.0-5.0％)]、セライト、カオリンまたは多孔質ガラスなどの担体でもよく、その化学組成は無機担体の全重量に対して、SiO2の含有量が50wt％超で、Al2O3の含有量が1wt％超で、好ましくは触媒担体CELITE、膨張パーライト、セライト、カオリンまたは多孔質ガラスから選ばれ、最も好ましくは触媒担体CELITE、膨張パーライトである。
多孔質親水性酵素担体は、ポリメタクリレートを基体としてエポキシドを結合させたものまたはアミノ官能基を含有する酵素担体でもよい。
例えば、官能基がエポキシドの酵素担体で、Relizyme EP403、SEPABEADS EC-EPを含む。
官能基がヘキシレンジアミンの酵素担体で、Relizyme HA403を含む。
官能基がヘキサメチレンイミンの酵素担体で、SEPABEADS EC-HAを含む。
無機担体による固定化の過程において、酵素と担体の比率の範囲は、担体1gあたりに酵素が10〜100 uで、好ましくは酵素が20〜80 u/g担体である。
酵素の使用量が10u/g担体未満の場合、固定化した酵素の活性が低すぎ、酵素触媒反応が発揮しにくいが、酵素の活性が100u/g担体超の場合、酵素の固定化効率が低すぎ、一部の酵素が遊離の状態で、一度使用すると流される。
多孔質親水性酵素担体による固定化の過程において、酵素と担体の比率の範囲は、担体1gあたりに酵素が100〜1000uで、好ましくは酵素が120〜600u/g担体である。
特に、多孔質親水性酵素担体による固定化の過程において、使用される酵素液は精製したものが好ましく、酵素液における不純タンパク質の比率が低いほど、固定化に有利になる。
無機担体による固定化の条件は、上述で得られた粗製酵素液における脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼに対して、高速液相クロマトグラフィー（HPLC）で酵素活性を測定し、所定の酵素/担体の比率で固形の担体を入れる。
pH4〜9、温度0〜80℃で半時間以上撹拌し、十分に洗浄し、ろ過し、低温で乾燥し、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが得られ、0〜5℃で保存する。
官能基がエポキシドの多孔質親水性酵素担体による固定化の条件は、上述で得られた比較的に純粋な酵素液における脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼに対して、高速液相クロマトグラフィー（HPLC）で酵素活性を測定し、所定の酵素/担体の比率で官能基がエポキシドの酵素担体を入れる。
pH4〜9、温度0〜80℃で24時間以上撹拌し、十分に洗浄し、ろ過し、低温で乾燥し、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが得られ、0〜5℃で保存する。
官能基がアミノ基の多孔質親水性酵素担体による固定化の条件は、予め酵素担体をグルタルアルデヒドで活性化しておき、活性化完了後十分に洗浄して残りのグルタルアルデヒドを除去し、上述で得られた比較的に純粋な酵素液における脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼに対して、高速液相クロマトグラフィー（HPLC）で酵素活性を測定し、所定の酵素/担体の比率でグルタルアルデヒドで活性化した酵素担体を入れ、pH4〜9、温度0〜80℃で24時間以上撹拌し、十分に洗浄し、ろ過し、低温で乾燥し、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが得られ、0〜5℃で保存する。
本発明において、上述酵素活性の単位の定義は、40℃の場合、1時間内で1μmolの産物が生成するのに必要な酵素量を1uと定義する。
手順は、それぞれ17.5mlの粗製酵素液、FR901379を含有するリン酸二水素カリウム緩衝塩（0.25mol/L）のpH6.0の緩衝液5mｌ、2.5mlのメタノールを量って取る。
40℃の水浴の条件で、1時間反応させた。
脱イオン水で適切に希釈し、0.22μmのナイロン膜でろ過し、HPLCで産物の濃度を測定する。
或いは、
本発明において、上述酵素活性の単位の定義は、40℃の場合、1時間内で1μmolの産物が生成するのに必要な酵素量を1uと定義する。
手順は、それぞれ17.5mlの粗製酵素液echinocandin Bのジメチルスルホキシド溶液（100mg/ml）2.5mlを量って取り、1.2M塩化カリウム、0.5Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液5.0mｌを入れる。
40℃の水浴の条件で、1時間反応させた。
メタノールで適切に希釈し、0.22μmのナイロン膜でろ過し、HPLCで産物の濃度を測定する。
本発明の一つの好適な例において、上述工程aでは、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの製造方法は、菌株を培養し、得られた菌糸体を破裂させ、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ液を得る工程を含む。
前述の菌株とは、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを分泌できる優良菌株で、アクチノマイセス属またはストレプトマイセス属のものである。
主に、アクチノプラネス・ウタヘンシス（Actinoplanes utahensis）のIFO-13244、（A. utahensis）NRRL-12052で生産される酵素がある。
WO97/32975号の特許では、ストレプトマイセス属（Streptomyces）に属する細菌（例えばストレプトマイセス・アヌラツス（Streptomyces anulatus）4811号菌株、ストレプトマイセス・アヌラツス8703号菌株、ストレプトマイセス菌（Streptomyces sp.）6907号菌株）から生産される酵素が報告されている。
また、WO97/47738号の特許では、オイディオデンドロン・テヌイシマム（Oidiodendron tenuissimum）IFO 6797菌株、オイディオデンドロン・テヌイシマムIFO 31963菌株、オイディオデンドロン・テヌイシマムIFO 9951菌株、オイディオデンドロン・テヌイシマムIFO 31812菌株、オイディオデンドロン菌（Oidiodendron sp.）30084号菌株、バーティシリウム菌（Verticillium sp.）30085号菌株から生産される酵素が報告されている。
アクチノプラネス・ウタヘンシス（Actinoplanes utahensis）のIFO-13244、（A. utahensis）NRRL-12052、ストレプトマイセス菌（Streptomyces sp.）6907号菌株で生産される酵素が好ましい。
菌株の培養に使用される培地は、ショ糖1〜10％、大豆ペプトン0.1〜0.1％、K2HPO4 0.1〜0.2％、KH2PO4 0.01〜0.1％、MgSO4・7H2O 0.01〜0.05％を含む。培養条件は、25〜36℃、好ましくは30℃で、通気量1〜2vvmで、撹拌速度200〜800r/minである。3〜5日間培養し、大量の菌糸体を得る。
上述で得られた菌糸体は、まず破裂させ、これらの菌体細胞の細胞内酵素を収集することで、より良い脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを得ることができるが、前述の菌体の破裂は、高濃度塩溶液抽出法、超音波破砕法、機械的破砕法、リゾチーム法のような既知の方法で脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを細胞外に転移し、さらにろ過法または遠心法で酵素液を菌糸体と分離し、粗製酵素液を得る。
より良い固定化酵素を得るために、まず、以下のように脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを精製してもよい。上述で得られた粗製酵素液に対して、所定の比率で使用される無機担体を入れて遊離酵素を吸着する。
酵素を吸着した無機担体を酵素液と分離し、十分に洗浄した後、高濃度の塩溶液で脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを無機担体から離脱させ、より純粋な酵素液を得る。
脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの精製過程は、文献 Membrane-associate echinocandin B deacylase of Actinoplanes utahensis: purification,characterization, heterologous cloning and enzymatic deacylation reactionを参照し、限外ろ過、イオン交換樹脂の方法で脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを精製してもよく、この方法はより純粋な酵素液が得られるが、この方法の欠点は酵素の回収率が低いことである。
本発明の固定化酵素による脱アシル化の過程は、以下の工程を含む。
A．緩衝溶液を入れ、脂環式ペプチドを含有する溶液1を調製する。
B．溶液1に固定化アシルトランスフェラーゼを入れ、脱アシル化反応を行う。
C．固定化アシルトランスフェラーゼを産物を含有する反応液と分離する。
ここで、固定化アシルトランスフェラーゼと脂環式ペプチドの比率は0.01〜10u/g、好ましくは0.1〜5u/gである。
工程Aにおいて、前述緩衝液のpHは4〜9、好ましくはpH5〜7、より好ましくはpH約6.0とする。
緩衝液の種類は、0.5Mクエン酸ナトリウム緩衝液、0.5Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液およびTris-HCl緩衝液の一種またはこれらの混合物で、好ましくは0.5Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液である。
工程Bにおいて、前述脱アシル化反応の温度は約20〜70℃とし、好適な温度の範囲は約30〜50℃である。
工程Cにおいて、固定化酵素を産物を含有する反応液と分離する方法は、ろ過法または遠心法を含む。
酵素を適切な担体に固定化した時、本発明の脱アシル化作用は、分けて行うのではなく、連続に撹拌する反応器でうまく行える。
本発明における「脂環式ペプチド物質」または「脂環式ペプチド」とは、ポリペプチド環を含有し、この環にある側鎖が「アシルアミノ基」を含有する物質を指すが、この物質はほかの側鎖を有してもよい。
この「脂環式ペプチド物質」の代表は、FR901379、echinocandin B(エキノカンジンB)で、このような物質は抗真菌活性を有する既知のものである。
当該発明の固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、脂環式ペプチド物質の側鎖の「アミド基」を脱アシル化して「アミノ基」を形成することができ、具体的に、物質FR901379またはその塩のパルミトイル側鎖または物質FR901379を含む、式Ｉで表される化合物のアシル側鎖を脱アシル化し、式ＩＩで表される脂環式ペプチド物質を得ることができる。
ここで用いられるように、「薬学的に許容される塩」は、好ましくは、金属塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、有機塩基と形成した塩（例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩など）など、有機酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩など）、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、アミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）と形成した塩などを含む。
本発明で説明された上述特徴、或いは実施例で説明された特徴は任意に組み合わせることができる。
本願説明書で開示されたすべての特徴はいずれの組成物の様態とも併用することができ、説明書で開示された各特徴は、いずれの相同、同等或いは類似の目的の代替性特徴にも任意に替えることができる。
そのため、特に説明しない限り、開示された特徴は同等或いは類似の特徴の一般的な例にすぎない。
本発明の主な利点は以下の通りである。
1、本発明によって提供される脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの固定化方法は、当該酵素の再利用が可能で、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの利用率が向上し、生産コストが低下し、工業的生産とコストの低下に有利である。
2、本発明の脱アシル化産物の純度が特に顕著に向上する。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。
これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。
以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われた。
別の説明がない限り、すべての百分率、比率、比例或いは部は、重量で計算される。
本発明における重量体積百分率の単位は当業者にとって熟知で、例えば100mLの溶液における溶質の重量を指す。
別の定義がない限り、本文に用いられるすべての専門用語と科学用語は、本分野の技術者に知られている意味と同様である。
また、記載の内容と類似或いは同等の方法及び材料は、いずれも本発明の方法に用いることができる。
ここで記載の好ましい実施方法及び材料は例示のためだけである。
下記実施例において化合物[ＩＩ]のHPLC検出に使用される方法は、以下の通りである。
サンプルをWaters分析性HPLC系で分析する。
FR179642、エキノカンジンB核物質およびほかの類似体の測定に逆相HPLC分析が使用される。
逆相分析はPLATISIL ODSカラム（粒子径5μm、4.6mmi.d×250cm）を使用し、且つ30℃に保持する。
3％アセトニトリル/0.5％リン酸二水素ナトリウムを移動相とし、流速が1ml/分で、且つ210nmにおけるUV検出を行う。
実施例1
アクチノプラネス・ウタヘンシス（Actinoplanes utahensis）のIFO-13244株で生産されるアシルトランスフェラーゼaの調製
アクチノプラネス・ウタヘンシスのIFO-13244株を使用し、US5376634特許における発酵方法に従い、発酵培養を行い、菌糸体の培養液を150L得た。
0.01Mリン酸二水素カリウム緩衝塩を入れ、pHを6.0とし、1.0M塩化カリウムを入れ、低温で撹拌して20時間以上抽出した。
その後、ろ紙を敷いたブフナー漏斗でろ過し、アシルトランスフェラーゼを含有するろ液116L、即ち遊離酵素液（a）を収集し、収集したろ液のHPLCによる酵素活性が2.3×105uであった。
実施例2
アクチノプラネス・ウタヘンシス（A. utahensis）のNRRL-12052株で生産されるアシルトランスフェラーゼbの調製
アクチノプラネス・ウタヘンシスのNRRL-12052株を使用し、US4320053特許における発酵方法に従い、発酵培養を行い、菌糸体の培養液を160L得た。
0.01Mリン酸二水素カリウム緩衝塩を入れ、pHを6.0とし、1.0M塩化カリウムを入れ、低温で撹拌して20時間以上抽出した。
その後、ろ紙を敷いたブフナー漏斗でろ過し、アシルトランスフェラーゼを含有するろ液121L、即ち遊離酵素液（b）を収集し、収集したろ液のHPLCによる酵素活性が2.1×105uであった。
実施例3
ストレプトマイセス菌（Streptomyces sp.）6907号菌株で生産されるアシルトランスフェラーゼcの調製
ストレプトマイセス菌6907号菌株を使用し、WO97/32975特許における発酵方法に従い、発酵培養を行い、菌糸体の培養液を160L得た。
0.01Mリン酸二水素カリウム緩衝塩を入れ、pHを6.0とし、1.0M塩化カリウムを入れ、低温で撹拌して20時間以上抽出した。
その後、ろ紙を敷いたブフナー漏斗でろ過し、アシルトランスフェラーゼを含有するろ液124L、即ち遊離酵素液（c）を収集し、収集したろ液のHPLCによる酵素活性が2.9×105uであった。
実施例4
アシルトランスフェラーゼbの精製
文献Membrane-associate echinocandin B deacylase of Actinoplanes utahensis: purification,characterization, heterologous cloning and enzymatic deacylation reactionの方法を参照して実施例2で得られた粗製酵素液を精製し、最終的に得られた純粋なアシルトランスフェラーゼ3.0L、即ち遊離酵素（d）を得て、収集したろ液のHPLCによる酵素活性が0.5×105uであった。
実施例5
無機担体に固定化されたアシルトランスフェラーゼ
固定化のために、それぞれ50Lの遊離酵素液（a）、（b）、（c）を取り、さらにそれぞれ1.5kgの膨張パーライトを入れ、25℃で撹拌して1時間以上吸着させた。
ろ過で固定化アシルトランスフェラーゼ、即ち固定化酵素（i）、（ii）、（iii）を収集し、0.01Mリン酸二水素カリウム緩衝塩、pH6.0の緩衝液で3回洗浄し、且つ室温で数時間乾燥させた。
当該固定化酵素は使用前に4℃で保存された。
実施例6
官能基がエポキシドの多孔質親水性酵素担体によるアシルトランスフェラーゼの固定化
固定化のために、それぞれ0.8Lの上述実施例4で調製された純粋なアシルトランスフェラーゼ液（d）を2つ取り、それぞれ59.2gの塩化カリウム、および0.01mol/Lのリン酸二水素カリウム緩衝塩、pH7.0を入れ、それぞれ30gのRelizyme EP403と30gのSEPABEADS EC-EPを入れ、25℃で24時間以上撹拌し、ろ過で固定化アシルトランスフェラーゼ、即ち固定化酵素（iv）、（v）を収集し、0.01Mリン酸二水素カリウム緩衝塩、pH7.0の緩衝液で3回洗浄し、且つ室温で数時間乾燥させた。
当該固定化酵素は使用前に4℃で保存された。
実施例7
官能基がアミノ基の多孔質親水性酵素担体によるアシルトランスフェラーゼの固定化
固定化のために、まず以下のように活性化した。それぞれ8gのRelizyme HA403及び8gのSEPABEADS EC-HAを取り、90mLの2％のグルタルアルデヒド溶液、0.02mol/Lのリン酸二水素カリウム緩衝塩、pH8.0を入れ、20〜25℃で1時間撹拌し、上清を除去し、精製水で樹脂を洗浄した。
それぞれ0.4Lの上述実施例4で調製された純粋なアシルトランスフェラーゼ液（d）を2つ取り、2つの活性化された酵素担体を酵素液に入れ、20〜25℃で20時間以上撹拌し、ろ過で固定化アシルトランスフェラーゼ、即ち固定化酵素（vi）、（vii）を収集し、0.01Mリン酸二水素カリウム緩衝塩、pH7.0の緩衝液で3回洗浄し、且つ室温で数時間乾燥させた。
当該固定化酵素は使用前に4℃で保存された。
実施例8
固定化酵素による回分式脱アシル化反応
それぞれFR901379物質の水溶液（20mg/ml、HPLC純度79.2％）2L（FR901379物質20g、16.7mmol）に緩衝液（0.2Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液、pH6.0）2L及び15gの固定化酵素（i）、固定化酵素（ii）、固定化酵素（iii）を入れ、40℃で4時間反応させ、HPLCでFR179642物質の収量と純度を測定した。
実施例9
固定化酵素による回分式脱アシル化反応
それぞれFR901379物質の水溶液（20mg/ml、HPLC純度79.2％）2L（FR901379物質20g、16.7mmol）に緩衝液（0.2Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液、pH6.0）2L及び15gの固定化酵素（iv）、固定化酵素（v）、固定化酵素（vi）、固定化酵素（vii）を入れ、40℃で1時間反応させ、HPLCでFR179642物質の収量と純度を測定した。
比較例1
遊離酵素液による回分式試験
WO97/32975特許における脱アシル方法に従い、FR901379物質の水溶液（100mg/ml、HPLC純度79.2％）100ml（FR901379物質10g、38.35mmol）に緩衝液（0.2Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液、pH6.0）100ml、メタノール100mlを入れた後、遊離酵素液（c）700mlを入れ、40℃で7時間反応させ、転化率が71.1％で、生成したFR17964物質のHPLCによる純度が75.7％で、そのHPLC分析スペクトルは図2と表10に示す。
転化後の液体に対して酵素活性を測定したところ、酵素活性がほとんど検出されなかった。
酵素は転化の過程でほとんど活性を失った。
上述実施例と比較例1から、固定化酵素による脱アシル化は、遊離酵素液の脱アシル化と比べ、顕著に優位であることがわかった。
転化率と産物の純度はともに大幅に向上した。
実施例10
連続撹拌釜式反応器における連続脱アシル化反応
50Lの連続撹拌釜式反応器において45℃でFR901379からFR179642物質への連続脱アシル化反応を行ったが、固定化酵素（vi）0.3kg、FR901379物質の水溶液（20mg/ml、HPLC純度79.2％）20L、緩衝液（0.2Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液、pH6.0）20Lを入れた。
基質は3時間後転化率が95％以上に達し、FR179642物質のHPLCによる純度が95.99％で、そのHPLC分析スペクトルは図1と表6に示す。
固定化されたアシルトランスフェラーゼは少なくとも30時間の安定性と活性を維持することができるため、生産の過程で連続に5回以上再利用することができる。
実施例10と比較例1の比較から、固定化酵素のもう一つの優勢は再利用が可能であることがわかった。
大幅に使用効率を向上させ、環境に対する破壊・汚染を減少する。
実施例11
異なる担体の遊離酵素に対する固定化と固定化酵素による脱アシル化の比較
固定化のために、それぞれ5Lの遊離酵素液（c）を取った後、それぞれ0.15kgの膨張パーライト、セライト（CELITE）および活性炭（SiO2の含有量が1％未満）、分子篩、多孔質ガラスを入れた。
30℃で撹拌して1時間以上吸着させた。
ろ過で固定化アシルトランスフェラーゼ、即ち固定化酵素（Viii）、（ix）、（x）、（xi）、（xii）を収集し、0.01Mリン酸二水素カリウム緩衝塩、pH6.0の緩衝液で3回洗浄し、且つ室温で数時間乾燥させ、当該固定化酵素は使用前に4℃で保存された。
その後、それぞれFR901379物質の水溶液（20mg/ml、HPLC純度79.2％）2L（FR901379物質20g、16.7mmol）に緩衝液（0.2Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液、pH6.0）2L及び15gの（Viii）、（ix）、（x）、（xi）、（xii）を入れ、40℃で4時間反応させ、HPLCでFR179642物質の収量と純度を測定した。
実施例12
異なる比率の担体の遊離酵素に対する固定化と固定化酵素による脱アシル化の比較
固定化のために、それぞれ5Lの遊離酵素液（c）を取り、HPLCによる酵素活性が1.17×104Uで、さらにそれぞれ0.05kg、0.12kg、0.15kg、0.24kg、0.58kg、1.17kg、1.75kgのセライト（CELITE）を入れ、30℃で撹拌して1時間以上吸着させた。
ろ過で固定化アシルトランスフェラーゼを収集し、0.01Mリン酸二水素カリウム緩衝塩、pH6.0の緩衝液で3回洗浄し、HPLCでろ液における酵素活性を測定した。
固定化酵素は室温で数時間乾燥させ、当該固定化酵素は使用前に4℃で保存された。
その後、それぞれFR901379物質の水溶液（20mg/ml、HPLC純度79.2％）1L（FR901379物質10g、8.35mmol）に緩衝液（0.2Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液、pH6.0）1L及び75gの上述で調製された固定化酵素を入れ、40℃で4時間反応させ、HPLCでFR179642物質の生産量と純度を測定した。
実施例13
異なるpHの担体による遊離酵素の固定化の比較
固定化のために、それぞれ5Lの遊離酵素液（a）を取り、HPLCによる酵素活性が1.0×104Uで、さらにそれぞれ0.15kgのセライト（CELITE）を入れ、2mol/Lの塩酸または2mol/Lの水酸化ナトリウム溶液でpHを3.5、4.0、6.0、9.0、9.5とした。
25℃で撹拌して1時間以上吸着させた。
ろ過で固定化アシルトランスフェラーゼを収集した。
固定化酵素は室温で数時間乾燥させ、当該固定化酵素は使用前に4℃で保存された。
その後、それぞれFR901379物質の水溶液（20mg/ml、HPLC純度79.2％）1L（FR901379物質10g、8.35mmol）に緩衝液（0.2Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液、pH6.0）1L及び75gの上述で調製された固定化酵素を入れ、40℃で4時間反応させ、HPLCでFR179642物質の生産量を測定した。
実施例14
echinocandin B のジメチルスルホキシド溶液（100mg/ml）100ml(エキノカンジンBが10g、9.43mmol)に1.2M塩化カリウム、0.5Mリン酸二水素カリウム-リン酸水素二ナトリウム緩衝液500ml、pH7.0を入れた後、固定化酵素（ii）25gを入れ、50℃で2時間転化させ、転化率が85.6％であった。

以上の説明は本発明の好ましい実施例だけで、本発明の実質の技術内容の範囲を限定するものではなく、本発明の実質の技術内容は広義的に出願の請求の範囲に定義され、他の人が完成した技術実体或いは方法は、出願の請求の範囲に定義されたものとまったく同じものであれば、或いは効果が同等の変更であれば、いずれもその請求の範囲に含まれるとみなされる。
本発明の目的は、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを提供することである。
また、本発明の目的は、上述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの製造方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、上述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの用途を提供することである。
本発明の第一の側面は、脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが担体に固定化された固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを提供する。前述脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、天然もしくは人工的突然変異体、または変異種由来のもの、または外来の環状アシルトランスフェラーゼの遺伝子を導入して転化させたもので、前述担体の材料は、無機担体、または多孔質親水性酵素担体から選ばれる。
前述固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、式Ｉで表される化合物におけるR1のアシル基の脱アシル化を触媒し、式ＩＩで表される化合物を生成することに使用されるものである。
上述製造方法において、前述脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、天然もしくは人工的突然変異体、または変異種由来のもの、または外来の環状アシルトランスフェラーゼの遺伝子を導入して転化させたものである。
上述製造方法において、前述菌株は、アクチノマイセス属またはストレプトマイセス属のものである。
上述製造方法において、前述遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液は、菌株を培養し、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を得る、或いは菌株を培養した後、得られた菌糸体を破裂させ、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を得る方法によって得られる。
或いは、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を精製し、不純タンパク質を除去し、より純粋な脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの溶液を得る。
本発明で使用される脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、その由来が特に制限されないが、天然もしくは人工的突然変異体、または変異種由来のもの、または外来の環状アシルトランスフェラーゼの遺伝子を導入して転化させた前述酵素もすべて含まれる。
前述担体の材料は、無機担体または多孔質親水性酵素担体から選ばれる。
無機担体の利点は、酵素を不活性化させず、担体に吸着した酵素はすべて活性があることであるが、欠点は比活性が低く、単位担体量あたりの吸着できる酵素量が多孔質親水性酵素担体よりも遥かに低いことである。一方、多孔質親水性酵素担体は、より多い酵素が吸着できるが、酵素を部分的に不活性化させ、即ち担体に吸着した酵素は一部だけが活性的で、回収率が低い。

Claims (22)

  1. 固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ。
  2. 脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが担体に固定化され、該担体の材料が、無機担体または多孔質親水性担体であることを特徴とする、請求項1に記載の固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ。
  3. 無機担体の全重量に対して、SiO2の含有量が50wt％超で、Al2O3の含有量が1wt％超であることを特徴とする、請求項2に記載の固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ。
  4. 多孔質親水性酵素担体が、ポリメタクリレートを基体としてエポキシドを結合させたもの、またはアミノ官能基を含有する酵素担体から選ばれることを特徴とする、請求項2に記載の製造方法。
  5. 固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼが、式Ｉで表される化合物におけるR1のアシル基の脱アシル化を触媒し、式ＩＩで表される化合物を生成することに使用されることを特徴とする、請求項1に記載の固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ
    （式中において、R1はアシル基で、R2はヒドロキシ基またはアシルオキシ基で、R3は水素またはヒドロキシ基で、R4は水素またはヒドロキシ基で、R5は水素またはヒドロキシスルホニルオキシ基で、R6は水素またはアミノホルミル基である）。
  6. 式Ｉで表される化合物が、式Ｉaまたは式Ｉbで表される化合物またはその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項5に記載の固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ。
  7. 遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を担体と混合し、請求項1〜6のいずれか一項に記載の固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを得る工程、
    を含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼの製造方法。
  8. 脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼは、天然もしくは人工的突然変異体、または変異種由来のもの、および外来の環状アシルトランスフェラーゼの遺伝子を導入して転換させたものであることを特徴とする請求項7に記載の製造方法。
  9. 遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液が、菌株を培養し、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を得る、或いは菌株を培養した後、得られた菌糸体を破裂させ、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を得る方法によって得られることを特徴とする、請求項7に記載の製造方法。
  10. 菌株が、アクチノマイセス属またはストレプトマイセス属のものであることを特徴とする、請求項9に記載の製造方法。
  11. 担体の材料が、無機担体または多孔質親水性酵素担体から選ばれることを特徴とする、請求項7に記載の製造方法。
  12. 遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと担体の混合比率が、担体1gあたりに酵素が10〜1000単位（u）、好ましくは担体1gあたりに酵素が20〜600単位（u）であることを特徴とする、請求項7に記載の製造方法。
  13. 遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼのpH値が4〜9であることを特徴とする、請求項7に記載の製造方法。
  14. 遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液と担体を混合する温度が、0〜80℃、好ましくは20〜35℃であることを特徴とする、請求項7に記載の製造方法。
  15. 遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを含有する溶液を担体と混合した後、遊離の脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと担体に結合された脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを分離し、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを得ることを特徴とする請求項7〜14のいずれか一項に記載の製造方法。
  16. （a）式Ｉで表される化合物を緩衝溶液と混合し、溶液1を得る工程と、
    （b）溶液1を請求項1〜6のいずれか一項に記載の固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと混合し、脱アシル化反応を行い、式ＩＩで表される化合物を得る工程と、
    を含むことを特徴とする、式ＩＩで表される化合物の製造方法
    （式中において、R1はアシル基で、R2はヒドロキシ基またはアシルオキシ基で、R3は水素またはヒドロキシ基で、R4は水素またはヒドロキシ基で、R5は水素またはヒドロキシスルホニルオキシ基で、R6は水素またはアミノホルミル基である）。
  17. 固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼと式Ｉの化合物の比率が0.01〜10u/gであることを特徴とする、請求項16に記載の製造方法。
  18. 工程（a）において、緩衝液のpHが4〜9であることを特徴とする、請求項16に記載の製造方法。
  19. 工程（a）における緩衝液が、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ニ水素カリウム-リン酸水素ニナトリウム緩衝液およびTris-HCl緩衝液から選ばれる一種または一種以上であることを特徴とする、請求項16に記載の製造方法。
  20. 工程（b）における脱アシル化反応の温度が、20〜70℃であることを特徴とする請求項16に記載の製造方法。
  21. 工程（b）において、脱アシル化反応後、固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを産物を含有する反応液と分離し、式ＩＩで表される化合物を得ることを特徴とする、請求項16〜20のいずれか一項に記載の製造方法。
  22. 固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼを産物を含有する反応液と分離する方法が、ろ過または遠心を含むことを特徴とする、請求項21に記載の製造方法。
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