ES2304736T3 - Procedimiento para desacilar lipopeptidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la separación enzimática de la cadena latera de N-acilo de lipopéptidos con la formación del núcleo correspondiente, en donde (a) el lipopéptido se prepara fermentativamente, donde el lipopéptido está unido celularmente a la biomasa, y la biomasa se separa con el lipopéptido que se adhiere, (b) la biomasa con el lipopéptido que se adhiere de la etapa (a) se resuspende en un sistema acuoso, (c) una desacilasa apropiada en forma disuelta o sólida se añade a la suspensión de la biomasa de la etapa (b), y se forma el correspondiente núcleo, y (d) el núcleo se aísla de forma opcional y se purifica, caracterizado porque el lipopéptido obtenido en la etapa (a) después de finalizada la fermentación como biomasa unida celularmente se hace reaccionar sin ulterior purficación en la etapa (c) directamente con una desacilasa, con lo cual se separa la cadena de N-acilo unida a través de un enlace amida.
Description
Procedimiento para desacilar lipopéptidos.
Los lipopéptidos son ciclohexapéptidos que se
pueden obtener por fermentación y que poseen una actividad
antifúngica sistémica, donde inhiben la
(1,3)-\beta-D-glucano
sintasa, una enzima clave de la biosíntesis de la pared celular de
los hongos. Además, los lipopéptidos tienen una actividad
antibacteriana (Exp. Opin. Invest Drugs 2000, 9,
1797-1813). Se sabe que los lipopéptidos poseen
propiedades fisicoquímicas desfavorables como la dificultad de
disolución en agua o una inestabilidad en solución alcalina. Más
allá de ello, los lipopéptidos naturales muestran graves efectos
colaterales como daños del endotelio venoso, destrucción e
inflamaciones de tejidos o efectos tóxicos locales en el sitio de
aplicación.
Por ello, existe la necesidad de la síntesis de
nuevos lipopéptidos con mejores propiedades farmacocinéticas y
quimioterapéuticas, así como una menor toxicidad. Estas
modificaciones semisintéticas consisten, en general, en la
introducción de grupos ácidos o básicos en la estructura molecular y
en el reemplazo del ácido alifático natural de la cadena lateral
por componentes acilo aromáticos. En especial, a la conversión de la
cadena lateral del ácido graso (cadena lateral de
N-acilo) se le atribuye una importancia central en
las síntesis parciales de lipopéptidos. Esto sucede en general de
modo tal que la cadena lateral de N-acilo de
lipopéptidos con una desacilasa natural, asociada a células o
generada de forma recombinante de gran especificidad de sustrato se
separa por vía enzimática y el ciclo peptídico resultante, el
llamado núcleo, se reacila con un ácido activado modificado (por
ejemplo, documentos EP 1 189 932; EP 1 189 933).
La solicitud de patente europea EP 0 460 882
describe la desacilación de la posición lipídica del acilo de
lipopéptidos por medio de la equinocandina B desciclasa purificada.
La enzima se produce por fermentación de Actinoplanes
utahensis (NRRL12052), con lo cual está asociada a células
después de la fermentación y se disuelve primero por medio de un
tratamiento salino de las células antes de purificar la enzima
disuelta obtenida de esta manera en un procedimiento de ocho
etapas.
En general, la separación de la cadena lateral
enzimática a partir de lipopéptidos se produce de modo tal que se
mezcla el lipopéptido purificado con un cultivo o con un
sobrenadante de cultivo de un microorganismo que produce una
desacilasa de mayor especificidad de sustrato. Puede ser una cepa
natural de Actinoplanes utahensis (por ejemplo, NRRL 12052;
documentos WO00/75177 y WO00/75178) o un productor de desacilasa
recombinante como, por ejemplo, una cepa de Streptomyces
lividans modificada de modo recombinante. Otra alternativa de
procedimiento es añadir una desacilasa purificada a la solución o
suspensión del lipopéptido purificado. Después de realizada la
separación de la cadena lateral, se libera el sobrenadante de la
reacción de componentes insolubles y se purifica el núcleo
hidrosoluble contenido en el filtrado. Esta forma de procedimiento
que emplea sustratos purificados o parcialmente purificados no es
utilizable en ciertos casos y en gran escala técnica.
J. Antibiotics XLI(8), pág.
1085-1091 (1988) indica un procedimiento para la
desacilación de lipopéptidos en composiciones impuras.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la separación enzimática de la cadena lateral de
N-acilo a partir de lipopéptidos con la formación
del correspondiente núcleo, en donde
- (a)
- el lipopéptido se prepara fermentativamente, donde el lipopéptido está unido celularmente a la biomasa, y la biomasa se separa con el lipopéptido que se adhiere,
- (b)
- la biomasa de la etapa fermentativa (a) con el lipopéptido que se adhiere se resuspende en un sistema acuoso,
- (c)
- una desacilasa apropiada en forma disuelta o sólida se añade a la suspensión de la biomasa de la etapa (b), y se forma el correspondiente núcleo, y
- (d)
- el núcleo se aísla de forma opcional y se purifica,
caracterizado porque el lipopéptido obtenido en
la etapa (a) después de finalizada la fermentación como biomasa
unida celularmente se hace reaccionar sin ulterior purificación en
la etapa (c) directamente con una desacilasa, con lo cual se separa
la cadena de N-acilo unida a través de un enlace
amida.
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, se hace reaccionar en otra etapa
(e) el núcleo con un derivado de ácido en un lipopéptido
semisintético de la fórmula, en donde la función amida generada se
sustituye con un grupo fenil-heteroaril
(C_{5}-C_{8})-fenilo,
C(O)-bifenilo o
C(O)-terfenilo.
\newpage
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la separación enzimática de la cadena lateral de
N-acilo R_{11} de lipopéptidos de la fórmula
(I)
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
R_{1} = H, OH o NR_{x}R_{y}, en donde
R_{x} y R_{y} son, de modo independiente
entre sí, H o alquilo (C_{1}-C_{6}),
R_{2} = H, OH,
NH(CH_{2})_{2}NH_{2},
R_{3} = H, OH,
R_{4} = H, Me, NH_{2},
-NH-C(=NH)NH_{2},
R_{5} = H, Me,
CH_{2}-C(=O)NH_{2},
CH_{2}CH_{2}NH_{2},
R_{6} = H, OH,
R_{7} = H, OH,
R_{8} = H, OSO_{3}H, OSO_{3}Na,
NH-C(=O)CH_{2}NH_{2},
R_{9} = Me, y
R_{10} = H, OH,
R_{11} = un grupo
C(O)-alquilo
(C_{6}-C_{24}), un grupo
C(O)-alquenilo
(C_{6}-C_{24}), un grupo
C(O)-alcadienilo
(C_{6}-C_{24}), o un grupo
C(O)-alcatrienilo
(C_{6}-C_{24}),
con la formación del correspondiente núcleo de
la fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
en donde
R_{1}-R_{10} tienen el significado mencionado
para la fórmula (I), y en donde los grupos alquilo, alquenilo,
alcadienilo y alcatrienilo en los compuestos de la fórmula (I) y
(II), siempre que estén presentes, pueden ser ramificados o
lineales,
en donde
- 1.
\;
(a) - el lipopéptido de la fórmula (I) se prepara fermentativamente, donde el lipopéptido está unido celularmente a la biomasa, y la biomasa se separa con el lipopéptido que se adhiere,
- 2.
\;
(b) - la biomasa de la etapa fermentativa (a) con el lipopéptido que se adhiere se resuspende en un sistema acuoso,
- 3.
\;
(c) - una desacilasa apropiada en forma disuelta o sólida se añade a la suspensión de la biomasa de la etapa (b), y se forma el correspondiente núcleo de la fórmula (II), y
- 4.
\;
(d) - el núcleo se aísla de forma opcional y se purifica,
caracterizado porque el lipopéptido obtenido en
la etapa (a) después de finalizada la fermentación como biomasa
unida celularmente se hace reaccionar sin ulterior purificación en
la etapa (c) directamente con una desacilasa, con lo cual se separa
la cadena de N-acilo unida a través de un enlace
amida.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la separación enzimática de la cadena lateral de
N-acilo R_{20} de lipopéptidos de la fórmula
(I)
en
donde
R_{12}, R_{13}, R_{14}, R_{15},
R_{16}, R_{17}, R_{18}, R_{19}, R_{x} y R_{y}
- de modo independiente entre sí, son H o alquilo (C_{1}-C_{6}), y
R_{20} = un grupo
C(O)-CH(CH_{2}COR_{21})-NH-CO-alquilo
(C_{6}-C_{24}),
- un grupo C(O)-CH(CH_{2}COR_{21})-NH-CO-alquenilo (C_{6}-C_{24}), un grupo C(O)-CH(CH_{2}COR_{21})-NH-CO-alcadienilo (C_{6}-C_{24}), o un grupo C(O)-CH(CH_{2}COR_{21})-NH-CO-alcatrienilo (C_{6}-C_{24}), en donde R_{21} es OH o NH_{2},
con la formación del correspondiente núcleo de
la fórmula (IV)
en donde R_{12}, R_{13},
R_{14}, R_{15}, R_{16}, R_{17}, R_{18}, R_{19}, R_{x}
y R_{y} tienen el significado mencionado para la fórmula (III), y
en donde los grupos alquilo, alquenilo, alcadienilo y alcatrienilo,
siempre que estén presentes en los compuestos de la fórmula (IIII) y
(IV), pueden ser ramificados o
lineales,
en donde
- 1.
\;
(a) - el lipopéptido de la fórmula (III) se prepara fermentativamente, donde el lipopéptido está unido celularmente a la biomasa, y la biomasa se separa con el lipopéptido que se adhiere,
- 2.
\;
(b) - la biomasa de la etapa fermentativa (a) con el lipopéptido que se adhiere se resuspende en un sistema acuoso,
- 3.
\;
(c) - una desacilasa apropiada en forma disuelta o sólida se añade a la suspensión de la biomasa de la etapa (b), y se forma el correspondiente núcleo de la fórmula (IV), y
- 4.
\;
(d) - el núcleo se aísla de forma opcional y se purifica, caracterizado porque el lipopéptido obtenido en la etapa (a) después de finalizada la fermentación como biomasa unida celularmente se hace reaccionar sin ulterior purificación en la etapa (c) directamente con una desacilasa, con lo cual se separa la cadena de N-acilo unida a través de un enlace amida.
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, se hace reaccionar en otra etapa
(e) el núcleo (IV) con un derivado de ácido en un lipopéptido
semisintético de la fórmula (III'), en donde el grupo R_{20} se
define como un grupo
C(O)-fenil-heteroaril
(C_{5}-C_{8})-fenilo,
C(O)-bifenilo o
C(O)-terfenilo.
Alquilo (C_{1}-C_{6}) es un
radical hidrocarbonado con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C. Ejemplos
de radicales alquilo (C_{1}-C_{6}) son metilo,
etilo, n-propilo, isopropilo
(1-metiletilo), n-butilo, isobutilo
(2-metilpropilo), sec-butilo
(1-metilpropilo), ter-butilo
(1,1-dimetiletilo), n-pentilo,
isopentilo, ter-pentilo, neopentilo y hexilo.
Alquilo (C_{6}-C_{24}) es
correspondientemente un radical hidrocarbonado con 6 a 24 átomos de
C. Los radicales alquilo pueden ser lineales o ramificados. Como
radicales alquilo (C_{6}-C_{24}) se prefieren
restos de ácido graso, por ejemplo, hexilo, octilo, decanilo,
undecanilo, dodecanilo, tridecanilo, tetradecanilo (miristilo),
pentadecanilo, hexadecanilo, heptadecanilo, octadecanilo
(estearilo), nonadecanilo, eicosanilo, dicosanilo,
9,11-dimetil-tridecanilo,
11-metil-tridecanilo.
El anterior aislamiento y costosa purificación
del material de partida lipopeptídico no tiene lugar en esta forma
de procedimiento, ya que el lipopéptido unido a la biomasa se emplea
directamente en la etapa de desacilación. El procedimiento según la
invención es apropiado, por ello, para la escala técnica. Las
impurezas y subproductos que se hallan en la solución nutriente
compleja de la etapa de procedimiento (a), se eliminan de manera
simple, por ejemplo, por filtración o centrifugación, antes de
realizar en la etapa de procedimiento (b) la desacilación. Las
impurezas y subproductos son, por ejemplo, componentes de los
medios, productos metabólicos de la cepa o enzimas.
Opcionalmente, se lava con agua la biomasa
obtenida en la etapa de procedimiento (a) con el lipopéptido que se
adhiere antes de la resuspensión en la etapa de procedimiento
(b).
El sistema acuoso para la resuspensión del
lipopéptido unido celularmente en la etapa (b) del procedimiento
según la invención es agua o una solución tampón acuosa,
preferentemente con un valor pH de 7,2 a 4,5, con preferencia
especial de 6,0 a 5,0, con preferencia particular un valor pH de
5,5. Como soluciones tampón se pueden usar todas las soluciones
conocidas por el especialista. La posterior desacilación se puede
llevar a cabo en el intervalo de pH de 4 a 9; se prefiere un
intervalo de pH de 4,6 a 7,8 con una acción óptima de la enzima a pH
6-6,2.
El procedimiento según la invención se refiere
preferentemente a los compuestos de la fórmula (I), en los que
R_{11}
o
\vskip1.000000\baselineskip
El material de partida lipopeptídico de la
fórmula (I) es accesible por fermentación. Los ejemplos para los
lipopéptidos de la fórmula (I) son:
- \bullet
- aculeacina (documento US 4212858)
- \bullet
- desoximulundocandina (documento EP 438813)
- \bullet
- derivados de equinocandina, por ejemplo, equinocandina B, C o D (documento EP 1189933; FEBS Letters 1984, 173(1), 134-138)
- \bullet
- FR901379 (Biochim. Biophys. Acta 2002, 1587, 224-233)
- \bullet
- mulundocandina (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 1123-1128)
- \bullet
- siringomicina (FEBS Letters 1999, 462, 151-154)
Con preferencia, se puede emplear en el
procedimiento según la invención desoximulundocandina,
equinocandina B o mulundocandina como sustrato.
La preparación de compuestos desacilados de la
fórmula (II) permite la preparación de lipopéptidos (I')
semisintéticos con propiedades farmacológicas, farmacocinéticas o
quimioterapéuticas mejoradas, en donde en otra etapa (e) se reacila
el núcleo (II) con un derivado de ácido, por ejemplo, un
correspondiente ácido en presencia de dimetilaminopiridina (DMAP)
en dimetilformamida (DMF) (J. Antibiot. 1999, 52(7),
674-676). A modo de ejemplo, es accesible FK463 a
partir de FR901379 por medio de desacilación con
FR901379-acilasa a través del correspondiente
núcleo FR179642 y posterior acilación con una cadena lateral de
benzoílo que contiene isoxazolilo (Biochim. Biophys. Acta 2002,
1587, 224-233).
También se pueden desacilar compuestos de la
fórmula (I) preparados de forma semisintética en el procedimiento
según la invención en el correspondiente compuesto de la fórmula
(II).
Los lipopéptidos (I') semisintéticos
corresponden a compuestos de la fórmula (I), pero se distinguen en
la definición del radical R_{11}. En los lipopéptidos (I')
semisintéticos, se definen los radicales
R_{1}-R_{10} como para el compuesto (I), y el
grupo R_{11} se define como un grupo
C(O)-fenil-heteroaril
(C_{5}-C_{8})-fenilo,
C(O)-bifenilo o
C(O)-terfenilo, en donde los grupos fenilo,
bifenilo, terfenilo o heteroarilo no están sustituidos o están
sustituidos con uno o dos grupos seleccionados del grupo alquilo
(C_{1}-C_{10}) u Oalquilo
(C_{1}-C_{10}). En los compuestos (I'), los
radicales fenilo pueden no estar sustituidos o pueden estar mono- o
polisustituidos, por ejemplo, mono-, di- o trisustituidos, con
radicales iguales o diferentes. En radicales fenilo monosustituidos,
el sustituyente se puede hallar en la posición 2, en la posición 3
o en la posición 4. El fenilo disustituido puede estar sustituido
en la posición 2,3, la posición 2,4, la posición 2,5, la posición
2,6, la posición 3,4 o la posición 3,5. En los radicales fenilo
trisustituidos, los sustituyentes se pueden hallar en la posición
2,3,4, en la posición 2,3,5, en la posición 2,4,5, en la posición
2,4,6, en la posición 2,3,6 o en la posición 3,4,5. Los radicales
heteroarilo (C_{5}-C_{8}) son compuestos
anulares aromáticos con un total de 5, 6, 7 u 8 átomos, en los que
uno o varios átomos del anillo son átomos de oxígeno, átomos de
azufre o átomos de nitrógeno, por ejemplo, 1, 2 o 3 átomos de
nitrógeno, 1 ó 2 átomos de oxígeno, 1 ó 2 átomos de azufre o una
combinación de distintos heteroátomos, por ejemplo, un átomo de
nitrógeno y un átomo de oxígeno. Los radicales heteroarilo pueden
estar unidos a través de todas las posiciones, por ejemplo, a través
de la posición 1, de la posición 2, de la posición 3, de la
posición 4, de la posición 5, de la posición 6, de la posición 7 o
de la posición 8. Los radicales heteroarilo pueden no estar
sustituidos o pueden estar mono- o polisustituidos con radicales
iguales o diferentes. Heteroarilo es en especial furanilo, tienilo,
pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo,
oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, piridilo,
pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, indazolilo,
quinolilo, isoquinolilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo
y cinolinilo. Como radicales heteroarilo rige en especial el
isoxazolilo.
Los compuestos de la fórmula (I') se describen,
por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP1189933.
Los ejemplos para los lipopéptidos
semisintéticos de la fórmula (I) son:
- \bullet
- A-1720132 (Antimicrob. Agents Chemother. 1998, 42, 389-393)
- \bullet
- A-192411.29 (Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 44, 1242-1246)
- \bullet
- caspofungina (MK-0991; Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 41, 2326-2332)
- \bullet
- FK463 (Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 44, 57-62)
- \bullet
- pneumocandinas, por ejemplo, pneumocandina A o B (Tetrahedron Lett. 1992, 33(32), 4529-4532)
\vskip1.000000\baselineskip
Además, con el procedimiento según la invención
es posible preparar a partir de lipopéptidos (I) accesibles por
fermentación por medio de desacilación/reacilación otros
lipopéptidos accesibles en principio por fermentación.
Un ejemplo especialmente preferido de un
lipopéptido (I) es la desoximulundocandina (V)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde en el procedimiento según
la invención se prepara por desacilación a partir de
desoximulundocandina (V) el núcleo de desoximulundocandina
(VI):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los lipopéptidos de la fórmula (III) se conocen
de las solicitudes de patente europeas EP629636 y EP1068223.
El procedimiento según la invención se refiere
preferentemente a compuestos de la fórmula (III), en los que
R_{12}, R_{13}, R_{14}, R_{15}, R_{16}, R_{17},
R_{18}, R_{19}, R_{x} y R_{y} son iguales a H.
\newpage
El procedimiento según la invención se refiere,
además, con preferencia a compuestos de la fórmula (III), en los que
R_{20} es
Un ejemplo de especial preferencia de un
lipopéptido (III) es el compuesto de la fórmula (VII)
en donde por desacilación se
prepara el correspondiente núcleo
(VIII):
Una ventaja del procedimiento según la invención
es que, como sustrato de la desacilación, se usa un lipopéptido (I)
o (III) no purificado, que aún se adhiere a la biomasa en suspensión
acuosa, la purificación del material de partida se torna obsoleta y
así es posible una producción del núcleo (II) o (IV) en gran escala
técnica.
Para la desacilación, se emplean enzimas
naturales con un amplio espectro de acción en forma pura o
parcialmente purificada. Los ejemplos de las desacilasas son
equinocandina B (ECB) desacilasa que se obtiene por cultivo de una
especie de Actinoplanes utahensis (La Verne et al., J.
Antibiotics 1989, 42, 382-388), o
polimixina-desacilasa (161-16081
Fatty Acylase, Pure; 164-16081 Fatty Acylase, Crude;
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). La ECB desacilasa de
Actinoplanes utahensis también se puede clonar y expresar en
Streptomyces lividans. La preparación de una enzima
recombinante de amplia especificidad de sustrato en una cepa
transformada de Streptomyces lividans se prefiere porque, de
esta manera, se pueden obtener rendimiento de enzimas
significativamente mayores. La desacilasa se puede añadir en la
etapa (c) en forma aislada como solución o como sólido a la biomasa
de la fermentación de lipopéptido y se prepara preferentemente antes
por separado y se concentra. Los métodos para la purificación de
lipopéptido-desacilasa de Actinoplanes
utahensis son conocidos (ver el documento EP460882). La
desacilación se realiza según métodos estándar. Por ejemplo, la
desacilación con polimixina acilasa se lleva a cabo según Yasuda
et al, Agric. Biol. Chem., 53,3245 (1989) y Kimura, Y., et
al., Agric. Biol. Chem., 53,497 (1989).
De la cepa Actinoplanes utahensis NRRL
12052, se aisló un fragmento de DNS que codifica la desacilasa. El
fragmento se clonó (plásmido pCS1) y se reclonó (plásmido pCS2), y
el plásmido pCS2 se transformó en una cepa S. lividans. De
una colonia individual de la cepa recombinante de S. lividans se
prepararon suspensiones de esporas y se almacenaron en ampollas a
-20ºC.
Clonación de la desacilasa: El DNS
cromosómico de Actinoplanes utahensis NRRL 12052 se aisló, se
digirió con EcoRI y BglII y se separó en un gel de
agarosa, se aislaron fargmentos de DNS con una longitud de
7-9 kb y se clonaron en el plásmido pUC19 (interfase
de EcoRI/BamHI). La ligación se transformó en E.
coli y se investigaron 250 clones resistentes a ampicilina
resultantes (50 \mug/ml) por medio de PCR. El cebador se
sintetizó sobre la base de la secuencia de DNS publicada de la
desacilasa (ver número de acceso GenBank a la base de datos de
secuencias de nucleótidos D90543; J. Inokoshi et al, Gene
1992, 119, 29-35).
El plásmido pCS1 contiene el fragmento buscado
de 8 kb de EcoRI/BglII de A. utahensis NRRL
12052. También se confirmó por digestión de la restricción del
fragmento y comparación con los datos de la literatura (ver J.
Inokoshi et al, Gene 1992, 119, 29-35). El
plásmido pCS1 se digirió con EcoRI/HindIII y el
fragmento de 8 kb se clonó con la acilada en el plásmido pWHM3
(interfase de EcoRI/HindIII; ver J. Vara et
al, J. Bacteriology 1989, 171, 5872-5881) y se
transformó en E. coli. Los transformantes se seleccionaron
con ampicilina (50 \mug/ml). El plásmido resultante pCS2 contiene
el fragmento de 8 kb de EcoRI/HindIII con la
desacilasa.
El plásmido pCS2 se transformó luego por
transformación de protoplastos de polietilenglicol (PEG) en la cepa
Streptomyces lividans TK64 JT46, se plaqueó en medio R2YE
(Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics, The John
Innes Foundation, 2000, page 408) y se seleccionaron clones con
tiostreptona a las 24 horas (20 \mug/ml). Los transformantes
resultantes resistentes a tiostreptona se individualizaron (en medio
1) y se verificó su productividad en medio de TSB en un émbolo de
agitación. De un clon positivo, se prepararon suspensiones de
esporas (medio 1) y se almacenaron a -20ºC en 20% de glicerol. Se
pueden consultar métodos generales biomoleculares (Ligation,
Transformation, PCR, Restriktionsverdau, Agarosegele) en Sambrook
et al. (en "Molecular Cloning", Cold Spring Habor
Laboratory Press, Second Edition, 1989, ISBN
0-87969-906-6) y
métodos para el aislamiento de DNS cromosómico de actinomicetes y
transformación de Streptomyces lividans, se pueden hallar
métodos especiales para la PCR de DNS a partir de Actinomicetes,
así como regeneración de protoplastos en Hopwood et al. (en
"Practical Streptomyces Genetics", The John Innes Foundation,
2000, ISBN
0-7084-0623-8).
El medio 1 mencionado en el párrafo anterior
contiene los siguientes componentes:
\vskip1.000000\baselineskip
Para la producción de la enzima, se usó una cepa
recombinante de Streptomyces lividans, tal como se describió
en el Ejemplo 1. Una cepa de este tipo se puede cultivar en una
fermentación en lote o lotes de alimentación. La cadena de proceso
normal contenía un precultivo (medio TSB) en el émbolo de agitación
que se incubó durante tres días a 28ºC y 220 rpm. Con este émbolo,
se puede inocular directamente un fermentador hasta 2000 L
(0,15-6% en v/v de inóculo). De modo alternativo,
también se puede agregar un segundo precultivo en escala
10-50 L en la cadena de proceso, a fin de acelerar
la velocidad de crecimiento en la etapa principal por aumento del
inóculo.
Producción fermentativa de la enzima:
Para la reactivación de las esporas, se derritió lentamente un
tubito de una ampolla. Con 200 \mul de la suspensión contenida, se
inyectó de forma estéril un matraz de Erlenmeyer que contenía 500 ml
del siguiente medio [adicionalmente 10 \mug/ml de tiostreptona (50
mg/ml de DMSO)]:
Medio del precultivo: medio TSB
(Soybean-Casein-Digest Medium
U.S.P.; medio ya preparado; OXOID LTD, Inglaterra; producto N.º
CM129).
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\vskip1.000000\baselineskip
Al final del precultivo, se transfirió este en
un fermentador según las indicaciones de inoculación, que contenía
el siguiente medio:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La solución de sal mineral 1 añadida el medio de
cultivo principal posee la siguiente composición:
\vskip1.000000\baselineskip
La esterilización del medio se puede realizar
con vapor directo o en autoclave (a 121-125ºC y
1,1-1,2 bar). Después de la esterilización, el
valor pH era de aprox. 6,5. La fuente de carbón se añadió por
separado y de forma estéril, con lo cual decayó el valor pH a
aprox. 6. Tras completar el medio hasta el volumen deseado, se
cumplieron las siguientes condiciones de fermentación durante la
fermentación:
Temperatura: 25-33ºC, con
preferencia 28ºC,
Presión: 0,5-1 bar, con
preferencia 0,5 bar
Velocidad de la punta del agitador:
1-2 m/s,
Gasificación: 0,25-1,5 wm, con
preferencia 0,5 wm,
pO_{2}: >10% (controlado)
Regulación del pH a 6,5-7,2 con
ácido fosfórico y/o lejía de sodio,
con preferencia pH 7,0 (controlado).
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, se puede emplear un
antiespumante, por ejemplo, un poliéster ramificado portador de
grupos hidroxilo, con preferencia Desmophen® (Bayer Material
Science, Leverkusen, Alemania).
Después de aprox. 100 horas, se consumió la
fuente de carbón y se hallaron entre 50-150 U/ L en
la solución de fermentación.
Después de regular estos parámetros e inocular
con el volumen deseado de inóculo, se alcanzó el máximo de
productividad a las 72-120. La expresión de la
enzima se realizó con crecimiento acoplado y no debió ser inducida.
Para controlar la expresión o bien la producción de la enzima, se
empleó para la determinación de la actividad enzimática un ensayo
rápido offline (ver el Ejemplo 3). La fermentación finalizó al
momento de la máxima productividad. Al utilizar un procedimiento
por lotes de alimentación, se pudo aumentar la productividad y el
rendimiento tiempo-espacio de manera considerable.
Para ello, se usó preferentemente una solución de glucosa
(1-5 g/l*h) en lote de alimentación, aumentando
simultáneamente el rendimiento a través de la velocidad de agitación
(regulación del pO_{2} > 10%).
\vskip1.000000\baselineskip
Para controlar la actividad enzimática durante
la preparación fermentativa de la desacilasa, durante el aislamiento
de la enzima o durante la separación enzimática de la cadena lateral
de lipopéptidos como desoximulundocandina, sirve el siguiente ensayo
enzimático rápido:
\newpage
A 500 \muL de una solución precalentada hasta
60ºC de 2,5 g/L de desoximulundocandina (V), 0,5% v/v de Brij 35 en
200 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 5,5), se añaden 20 \muL
de una muestra que contenía desacilasa. La solución se incuba bajo
agitación durante 10 minutos a 60ºC. La desacilación se detiene
luego por adición de 480 \muL de ácido fosfórico al 0,85% v/v.
Después de centrifugar y separar los componentes
insolubles, se determina la cantidad del núcleo formado de
desoximulundocandina (VI) en un análisis acompañante de HPLC. Para
ello, se inyectan 5 \muL de la solución en una columna
Merck-Purospher-Star-RP
(4*55 mm) y se eluye con un gradiente lineal de tres minutos de
4\rightarrow20% v/v de acetonitrilo, acidificado con 0,1% v/v de
ácido fosfórico, con un flujo de 2,5 ml/min. La detección se
realiza a \lambda = 220 nm. El núcleo posee un tiempo de retención
de 1,4 minutos. La cuantificación se realiza por medio de un
estándar externo.
Una unidad (unit) (U) de actividad de desacilasa
se define como la cantidad de enzima que se requiere en las
condiciones de análisis descritas para producir en un minuto 1
\mumol de núcleo de desoximulundocandina.
Se diluyen muestras de enzimas altamente
concentradas, tal como se producen, por ejemplo, durante el
aislamiento de la desacilasa, con 200 mM de tampón de fosfato de
sodio (pH 5,5) hasta una concentración cuantificable correctamente
en el ensayo enzimático de 5-200 U/mL. En muestras
de enzimas que contienen la desoximulundocandina o el núcleo de
desoximulundocandina, se usa un sustrato análogo, por ejemplo, el
compuesto (VII) en el ensayo rápido. El núcleo resultante (VIII) se
detectó con un tiempo de retención de 2,4 minutos.
Para aislar la enzima, se separó el sobrenadante
de soluciones de cultivo que se prepararon como se describió con
anterioridad, por medio de métodos conocidos en sí, con preferencia
por centrifugación y luego se concentró, por ejemplo, por medio de
ultrafiltración. A modo de ejemplo, después de terminada la
fermentación, se mataron soluciones de cultivo (aprox. 2000 L) de
la cepa recombinante Streptomyces lividans eventualmente con
agentes desinfectantes apropiados y se separó el sobrenadante con
contenido de enzima con un separador (por ejemplo, tipo Westfalia
SC 35) con un rendimiento de 1000-1300 l/h. La
biomasa separada se descartó. La calidad de la separación
sólido-líquido se puede ensayar por medición de la
densidad óptica a \lambda = 540 nm en el curso de clarificación.
Para la concentración del sobrenadante clarificado, se prefiere un
factor de concentración de aprox. 10-20 en
comparación con su volumen original, usando membranas de
poliéter-sulfona con un límite de exclusión nominal
(cut-off) de 10-50 kDa, con
preferencia de 20 kDa. La tasa de flujo en circulación era de 4500
l/h con una presión transmembrana de 2,5-3,5 bar; el
flujo del permeato se redujo durante la filtración de
20-30 l/hm^{2} iniciales a 4-10
l/hm^{2}. El permeato se descartó.
Los concentrados acuosos de enzimas (retentatos)
se pudieron almacenar fríos en esta forma y luego se emplearon
directamente para la desacilación de lipopéptidos.
De modo alternativo, también resulta precipitar
la enzima por adición de 2-propanol con una
concentración final del 40-60% v/v, con preferencia
del 50-55% v/v. La precipitación se puede llevar a
cabo en el intervalo de temperaturas de 0-25ºC, con
preferencia en el intervalo de 4-10ºC, con
preferencia especial a 6ºC. La desacilasa también se puede
precipitar en lugar de 2-propanol con acetona, sin
embargo, 1-propanol como agente precipitante es
menos apropiado. El sobrenadante se decantó y luego se centrifugó la
enzima de la suspensión residual una vez terminada la precipitación
(por ejemplo, con una centrífuga tubular CEPA) y se almacenó fría en
forma húmeda hasta posterior uso.
La enzima húmeda obtenida en pellets se disolvió
en un tampón de fosfato de concentración apropiada. Se filtran los
componentes insolubles. El filtrado claro se empleó directamente
después de la determinación de la actividad para la desacilación de
la desoximulundocandina.
El precipitado también se puede conservar de
modo estable después de una adición previa de aditivos como sales
(por ejemplo, sulfato de amonio), azúcares (por ejemplo, glucosa) o
alcoholes de azúcar como sorbitol o manitol en forma liofilizada
durante un período prolongado. Se prefiere el uso de un precipitado
enzimático porque, de esta manera, se pueden eliminar componentes
del medio de la fermentación de Streptomyces lividans antes
de la separación de la cadena lateral.
Para preparar péptidos cíclicos de la fórmula
(II), también denominados núcleo, se obtuvieron previamente los
correspondientes lipopéptidos de la fórmula (I) para usar como
sustrato (derivados de N-acilo exocíclicos del
núcleo) por cultivo de los correspondientes microorganismos de
manera fermentativa. Por ejemplo, se obtiene la
desoximulundocandina (V) insoluble en agua que se adhiere a la
biomasa por cultivo de Aspergillus sydowii, tal como se
describe en la solicitud de patente europea 0 438 813 A1 y luego
vuelve a presentarse:
Para la producción de desoximulundocandina, se
reprodujo un productor de Aspergillus sydowii, con
preferencia un productor seleccionado por mejora de cepas clásica,
en un proceso de fermentación en lotes. La desoximulundocandina es
un metabolito secundario clásico que recién se forma después de
aprox. tres días:
La cepa de Aspergillus sydowii productora
de desoximulundocandina se cultivó en un matraz de Erlenmeyer como
precultivo. Los matraces se inyectaron con 1 ml de una suspensión de
esporas directamente desde la ampolla. Se cumplieron los siguientes
parámetros: T = 28ºC; 240 rpm, 48-72 horas.
Como medio de precultivo, se emplea:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El valor pH era, después de la esterilización
del medio, de 6,9 y era, al final del cultivo, de
7-7,5. El valor PMV (percent mycelial volume) era de
entre el 15 y el 20%. Para un proceso industrial, se fermentó un
segundo precultivo que se realizó en las mismas condiciones y con el
mismo medio.
El fermentador principal se inyectó con
1-6% de inóculo de un cultivo de agitación o un
prefermentador y contenía el siguiente medio:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Densidad de inoculación: 0,5-6%,
con preferencia 1-2%,
Temperatura: 25-33ºC, con
preferencia 27-30ºC,
Gasificación: 0-1,5 vvm, con
preferencia 0,5-0,8 vvm,
Velocidad de la punta del agitador: 1,4 m/s (en
función del agitador utilizado)
\vskip1.000000\baselineskip
La fermentación se realizó a T =
25-35ºC, con preferencia a 28-32ºC.
Se aplicó una ligera sobrepresión de 0,2-1 bar y se
reguló de forma continua una concentración de oxígeno disuelto
>30%. Para ello, se utilizó con preferencia una cascada de
velocidad creciente del agitador (comenzando con 95 rpm, velocidad
de la punta 1,2 m/s) y tasa creciente de gasificación (comenzando
con 0,2 N/m^{3}). El valor pH no debió ser regulado durante la
fermentación. Para mejorar la robustez del proceso, es muy útil. El
valor pH estaba en el intervalo de 5,5-7; con
preferencia 6,2-6,5. A partir de la
24-30 hora, se reguló el valor pH con ácido
sulfúrico en 6,5. Para evitar la formación de espuma, se pueden
usar diferentes antiespumantes, se prefieren Desmophen 3600 o Hodag
AFM-5. Para la producción de desoximulundocandina,
se espera una morfología preferida durante todo el proceso de
fermentación. Este pequeño crecimiento en forma de pellet se
influencia por medio de la elección del agitador; es
particularmente apropiado un agitador de disco para un crecimiento
de tipo pellet.
La fermentación total puede durar más de 240
horas, momento en el que la tasa de formación de producto es
constante durante un período prolongado y el final de la
fermentación se establece a través de análisis acompañante offline.
La concentración de producto al final de una fermentación estaba en
el intervalo de 800-1200 mg/l de
desoximulundocandina.
Antes de cosechar la biomasa, se regula el valor
pH a un valor pH de 6,5 a 5,5, con preferencia 6,0, la estabilidad
óptima de la desoximulundocandina.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez finalizada la fermentación, se separó el
caldo de cultivo en sobrenadante de cultivo y biomasa. Para ello,
se pueden utilizar distintas técnicas de filtración y separación
convencionales. Con preferencia, se usa una prensa filtrante. La
biomasa se lavó una vez con agua eventualmente en la prensa
filtrante y luego se pasó para la desacilación a un recipiente de
reacción. El filtrado y el agua de lavado se descartaron.
Luego se resuspendió la biomasa en agua junto
con el lipopéptido que se adhiere, con preferencia en una cantidad
de 1-2 veces en agua. A modo de ejemplo, se
resuspendieron después de terminada la fermentación de
desoximulundocandina 30-50 kg de biomasa húmeda en
100-150 litros de agua, siendo la concentración
inicial de desoximulundocandina para desacilación de entre
0,5-1,5 g/L. La suspensión se agitó hasta que se
formó una masa homogénea.
La suspensión se reguló al valor pH deseado.
Para separar la cadena lateral, se combinó luego la mezcla de
reacción con una solución de desacilasa, en donde se utilizaron
20-50 unidades de enzima por gramo de lipopéptido,
con preferencia 25-40 U/g, equivalentes a
25-150 U/L, con preferencia 25-80
U/L.
El proceso de desacilación en sí se realizó
-después de disolver la enzima en un tampón de fosfato- a
temperaturas de 20-80ºC; se prefirió un intervalo
de temperaturas de 20-40ºC, con preferencia especial
de 30-35ºC. Mayores temperaturas pueden favorecer
la formación de subproductos como la apertura de anillos y/o la
deshidratación. La velocidad de agitación era en un fermentador de
200 L de 100-250 rpm, con preferencia de
120-180 rpm.
La desacilasa se puede usar en el intervalo de
pH de 4 a 9; se prefiere un intervalo de pH de 4,6 a 7,8 con una
acción óptima de la enzima a pH 5,2-6,2. Se deben
evitar mayores valores de pH, ya que también en este caso se
produce la formación de subproductos de anillo abierto o
deshidratados de las fórmulas (IX) y (X) de manera incrementada:
El tiempo de reacción de la reacción de
desacilación varía y depende fuertemente del valor pH seleccionado
y la temperatura seleccionada. El final de la separación enzimática
del ácido de la cadena lateral se determina por medio de HPLC
analítica acompañante por medición de la formación del núcleo en el
sobrenadante de reacción. A modo de ejemplo, en caso de una
desacilación de desoximulundocandina en escala de 200 L, se realizó
la desacilación por completo después de 20-30
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
La desacilación de la desoximulundocandina se
realizó según el Ejemplo 6.1. En este caso, se comprimió la micela
de desoximulundocandina y se lavó con agua. Luego se realizó la
resuspensión en el mismo volumen de agua y la desacilación en el
núcleo a pH 5,5 y 30ºC:
Filtrado de cultivo: 160 litros
Pureza del filtrado de cultivo: 72,3% de sup.
(HPLC)
Carga: 3,8 g/L
Fracción principal: 55 litros
Pureza de la fracción principal: 95,1% de sup.
(HPLC)
Núcleo del liofilizado: 34,1 g (rendimiento del
30%)
Pureza del liofilizado: 88,0% de sup. (HPLC) -
78,4% p/p (contra estándar interno).
\vskip1.000000\baselineskip
Después de terminada la desacilación, se
centrifugó o filtró la biomasa de Aspergillus sydowii,
adicionando eventualmente un agente auxiliar de filtrado. La
biomasa separada se descartó. El filtrado claro que contiene el
núcleo hidrosoluble se purificó luego por cromatografía en columna.
Como fase estacionaria sirvió un polímero hidrofóbico como
copolimerizados de poliestireno-vinilbenceno,
poliacrilatos o polimetacrilatos. De modo alternativo, también se
puede purificar el núcleo en un intercambiador catiónico por
cromatografía. Se prefiere una purificación por cromatografía en
columna de un copolímero de estireno-vinilbenceno
como fase estacionaria.
Como eluyente (fase móvil) sirvió el agua, a la
que se añadieron ácidos orgánicos y alcoholes como cosolventes para
aumentar la selectividad. Se prefiere como fase móvil agua que
contiene pequeñas cantidades de ácido acético y 1- o
2-propanol. La adición de ácido sirve para el
empobrecimiento dirigido de impurezas existentes como compuestos de
anillo abierto o deshidratados.
El eluato se captó de modo fraccionado y las
fracciones que contenían el núcleo -después de una cuantificación
realizada por medio de HPLC analítica acompañante- se combinaron y
se concentraron por nanofiltración. Para la nanofiltración, se
emplearon membranas que pueden retener 50-70% de
cloruro de sodio, con preferencia 50% de NaCl.
El concentrado del núcleo obtenido (retentato)
luego se liofilizó o se secó por pulverización. El núcleo sólido
resultante se pudo emplear directamente y sin purificación adicional
como material de partida para la reacilación con ácidos de cadena
lateral activada.
Después de terminada la separación enzimática de
la cadena lateral, se filtra una preparación de desacilación de
1000 litros a través de una prensa filtrante. La biomasa separada se
lava en la prensa filtrante con agua y luego se descarta. El
filtrado y el agua de lavado se combinan y se clarifican por
filtrado nuevamente a través de una capa (Seitz tipo
K-200). La solución filtrada deberá tener un valor
pH de 6-6,5. Eventualmente, se valor pH se deberá
ajustar posteriormente con ácido acético 2 M o solución 2 M de
hidróxido de sodio.
Se cargan 750 litros de la solución clara que
puede contener entre 500-700 mg/L del núcleo de
desoximulundocandina con un flujo lineal de 100-200
cm/h en una columna de cromatografía, que está rellena con 25 litros
de Amberchrom®-CG161m como fase estacionaria. La altura del lecho
de la fase estacionaria es de 26 cm, el diámetro interno de la
columna es de 35 cm. La conductividad de la solución no es
crítica.
Durante el curso total de la cromatografía, se
miden y registran la absorción a \lambda= 280 nm, el valor pH y
la conductividad de modo continuo. El curso de la columna se capta
en una fracción y se descarta después de ensayo por HPLC.
Una vez terminada la carga, se lava la fase
estacionaria con agua purificada bajo un flujo lineal de
100-150 cm/h hasta que la absorción medida de forma
continua en el derrame de la columna haya alcanzado prácticamente
la línea de base. La solución se lavado se reúnen en una única
fracción y se descarta después del ensayo de HPLC.
Tras finalizar el lavado, se eluye
isocráticamente el núcleo de desoximulundocandina bajo un flujo
lineal de 100-150 cm/h con 10 volúmenes de lecho.
Para la desorción, se usa agua a la que se añade, para elevar la
selectividad, 0,1% v/v de ácido acético y 2% v/v de
2-propanol (o 1-propanol). El eluato
se capta en fracciones de 5-25 litros, en donde el
tamaño de la fracción se controla por medio de la absorción medida y
registrada continuamente.
De todas las fracciones se extraen alícuotas y
allí se miden, por medio de análisis de HPLC acompañante, la pureza
y el contenido de núcleo de desoximulundocandina. Las fracciones que
contienen el núcleo se purifican con una pureza > 90% de sup.
Luego se concentra el eluato total (50-100 litros)
por medio de nanofiltración en el factor 2-5 usando
una membrana cuya retención de cloruro de sodio es del 50%.
El retentato obtenido luego se filtra de forma
estéril y luego se liofiliza o se seca por pulverización. Las
fracciones marco de la purificación por cromatografía en columna del
núcleo de desoximulundocandina se pueden reciclar.
Una vez terminado el secado, se envasa el núcleo
sólido obtenido de desoximulundocandina después de análisis por HPLC
en recipientes de plástico apropiados. Los recipientes se conservan
hasta su posterior uso a -25ºC.
Claims (12)
1. Procedimiento para la separación enzimática
de la cadena latera de N-acilo de lipopéptidos con
la formación del núcleo correspondiente, en donde
(a) el lipopéptido se prepara fermentativamente,
donde el lipopéptido está unido celularmente a la biomasa, y la
biomasa se separa con el lipopéptido que se adhiere,
(b) la biomasa con el lipopéptido que se adhiere
de la etapa (a) se resuspende en un sistema acuoso,
(c) una desacilasa apropiada en forma disuelta o
sólida se añade a la suspensión de la biomasa de la etapa (b), y se
forma el correspondiente núcleo, y
(d) el núcleo se aísla de forma opcional y se
purifica,
caracterizado porque el lipopéptido
obtenido en la etapa (a) después de finalizada la fermentación como
biomasa unida celularmente se hace reaccionar sin ulterior
purficación en la etapa (c) directamente con una desacilasa, con lo
cual se separa la cadena de N-acilo unida a través
de un enlace amida.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el lipopéptido tiene la fórmula (I)
y en
donde
R_{1} = H, OH o NR_{x}R_{y}, en donde
R_{x} y R_{y} son, de modo independiente
entre sí, H o alquilo (C_{1}-C_{6}),
R_{2} = H, OH,
NH(CH_{2})_{2}NH_{2},
R_{3} = H, OH,
R_{4} = H, Me, NH_{2},
-NH-C(=NH)NH_{2},
R_{5} = H, Me,
CH_{2}-C(=O)NH_{2},
CH_{2}CH_{2}NH_{2},
R_{6} = H, OH,
R_{7} = H, OH,
R_{8} = H, OSO_{3}H, OSO_{3}Na,
NH-C(=O)CH_{2}NH_{2},
R_{9} = Me, y
R_{10} = H, OH,
R_{11} = un grupo
C(O)-alquilo
(C_{6}-C_{24}), un grupo
C(O)-alquenilo
(C_{6}-C_{24}), un grupo
C(O)-alcadienilo
(C_{6}-C_{24}), o un grupo
C(O)-alcatrienilo
(C_{6}-C_{24}),
\newpage
con la formación del correspondiente núcleo de
la fórmula (II)
en donde
R_{1}-R_{10} tienen el significado mencionado
para la fórmula (I), y en donde los grupos alquilo, alquenilo,
alcadienilo y alcatrienilo en los compuestos de la fórmula (I) y
(II), siempre que estén presentes, pueden ser ramificados o
lineales.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en donde en otra etapa
(e) el núcleo (II) se hace reaccionar con un
derivado de ácido en un lipopéptido de la fórmula (I')
semisintético, en el que R_{1}-R_{10} tienen el
significado mencionado para la fórmula (I) y el grupo R_{11} se
define como un grupo
C(O)-fenil-heteroaril
(C_{5}-C_{8})-fenilo,
C(O)-bifenilo o
C(O)-terfenilo.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 ó 3, en donde el alquilo
(C_{6}-C_{24}) en el radical R_{11} del
compuesto (I) significa n-hexilo,
n-octilo, n-decanilo,
n-undecanilo, n-dodecanilo,
n-tridecanilo, n-tetradecanilo,
n-pentadecanilo, n-hexadecanilo,
n-heptadecanilo, n-octadecanilo,
n-nonadecanilo, n-eicosanilo,
n-dicosanilo,
9,11-dimetil-tridecanilo o
11-metil-tridecanilo.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 4, en donde en el compuesto (I) R_{11}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 5, en donde en la etapa (a) se prepara el
compuesto desoximulundocandina (V)
y se forma en la etapa (c) el
núcleo de desoximulundocandina
(VI)
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el lipopéptido tiene la fórmula (III)
en
donde
R_{12}, R_{13}, R_{14}, R_{15},
R_{16}, R_{17}, R_{18}, R_{19}, R_{x} y R_{y} son, de
modo independiente entre sí, H o alquilo
(C_{1}-C_{6}), y
R_{20} = un grupo
C(O)-CH(CH_{2}COR_{21})-NH-CO-alquilo
(C_{6}-C_{24}),
un grupo
C(O)-CH(CH_{2}COR_{21})-NH-CO-alquenilo
(C_{6}-C_{24}), un grupo
C(O)-CH(CH_{2}COR_{21})-NH-CO-alcadienilo
(C_{6}-C_{24}), o un grupo
C(O)-CH(CH_{2}COR_{21})-NH-CO-alcatrienilo
(C_{6}-C_{24}), en donde R_{21} es OH o
NH_{2},
con la formación del correspondiente núcleo de
la fórmula (IV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{12}, R_{13},
R_{14}, R_{15}, R_{16}, R_{17}, R_{18}, R_{19}, R_{x}
y R_{y} tienen el significado mencionado para la fórmula (III), y
en donde los grupos alquilo, alquenilo, alcadienilo y alcatrienilo,
siempre que estén presentes en los compuestos de la fórmula (III) y
(IV), pueden ser ramificados o
lineales
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en donde R_{12}, R_{13}, R_{14}, R_{15},
R_{16}, R_{17}, R_{18}, R_{19}, R_{x} y R_{y} son
iguales a H.
9. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 7 u 8, en donde R_{20} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 7 a 9, en donde en la etapa (a) se prepara el
compuesto (VII)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
y se forma en la etapa (c) el
compuesto
(VIII)
11. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde la desacilasa se obtuvo por
cultivo de Actinoplanes utahensis.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde la desacilasa se obtiene
recombinantemente por cultivo de Streptomyces lividans
transformada.
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