JP7079447B2 - 微生物の酵素生産性を制御する方法 - Google Patents
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Description
[1]微生物にパルス電界を印加することを特徴とする、微生物の酵素生産性を制御する方法。
[2]微生物の培養中の培養液にパルス電界を印加する工程を含む、[1]に記載の方法。
[3]培養中において、前記パルス電界を発生させる電極部に培養液が循環する、[2]に記載の方法。
[4]培養中に繰り返しパルス電界が印加される、[2]又は[3]に記載の方法。
[5]前記パルス電界のパルス波形が減衰振動波形である、[1]~[4]のいずれか一項に記載の方法。
[6]前記パルス電界の電界強度が10kV/cm~50kV/cmである、[1]~[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]アミラーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、蛋白質脱アミド酵素及びプルラナーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[8]α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ロイシンペプチダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、PPLアミノペプチダーゼ及びSAPAアミノペプチダーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[9]前記微生物が、糸状菌、放線菌、酵母及び細菌からなる群より選択される微生物である、[1]~[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]前記微生物が、アスペルギルス属、ムコール属、リゾムコール属、リゾプス属、ペニシリウム属、トラメテス属、ストレプトマイセス属、カンジダ属、サッカロマイセス属、スポロボロマイセス属、クルイベロマイセス属、ピケア属、クリプトコッカス属、バチルス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、バークホルデリア属、クロストリジウム属、ミロセシウム属、クレブシエラ属、クリセオバクテリウム属及びエスケリチア属からなる群より選択される微生物である、[1]~[8]のいずれか一項に記載の方法。
[11]前記微生物が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、ムコール・ヤバニカス、バチルス・サチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・サーキュランス、ストレプトマイセス・グリセウス及びストレプトマイセス・サーモカルボキシダスからなる群より選択される微生物である、[1]~[8]のいずれか一項に記載の方法。
[12]前記酵素生産性の制御が、以下の(1)~(8)のいずれかである、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法:
(1)前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、α-アミラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ及びPPLアミノペプチダーゼ、エステラーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が上方制御されるもの、前記パルス電界の印加が培養中の誘導期に実施され、α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、エステラーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が下方制御されるもの、或いは前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、SAPAアミノペプチダーゼの生産量が下方制御されるもの;
(2)前記微生物がアスペルギルス・ニガーであり、前記パルス電界の印加が培養中の定常期に実施され、α-アミラーゼ及び/又はプロテアーゼの生産量が上方制御されるもの;
(3)前記微生物がムコール・ヤバニカスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、α-アミラーゼ及び/又はβ-グルコシダーゼの生産量が上方制御されるもの;
(4)前記微生物がバチルス・サチルスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、ロイシンアミノペプチダーゼの生産量が上方制御されるもの;
(5)前記微生物がバチルス・アミロリケファシエンスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、リパーゼの生産量が上方制御されるもの或いはセルラーゼの生産量が下方制御されるもの;
(6)前記微生物がバチルス・サーキュランスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、β-ガラクトシダーゼの生産量が上方制御されるもの;
(7)前記微生物がストレプトマイセス・グリセウスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、β-グルコシダーゼの生産量が上方制御されるもの、或いはα-アミラーゼの生産量が下方制御されるもの;
(8)前記微生物がストレプトマイセス・サーモカルボキシダスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、プロテアーゼの生産量が上方制御されるもの。
[13]前記パルス電界の印加が培養中の誘導期に実施され、β-ガラクトシダーゼの生産量が上方制御される、[1]~[6]、[9]~[11]のいずれか一項に記載の方法。
[14]前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、α-アミラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ロイシンペプチダーゼ、PPLアミノペプチダーゼ及びリパーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が上方制御される、[1]~[6]、[9]~[11]のいずれか一項に記載の方法。
[15]前記パルス電界の印加が培養中の定常期に実施され、α-アミラーゼ及び/又はプロテアーゼの生産量が上方制御される、[1]~[6]、[9]~[11]のいずれか一項に記載の方法。
[16]前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、プロテアーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[17]前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、ペプチダーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[18]前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の誘導期及び又は対数期に実施され、β-ガラクトシダーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[19]前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、α-ガラクトシダーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[20]前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、α-アミラーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[21]前記微生物がアスペルギルス・ニガーであり、前記パルス電界の印加が培養中の定常期に実施され、プロテアーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[22]前記微生物がアスペルギルス・ニガーであり、前記パルス電界の印加が培養中の定常期に実施され、α-アミラーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[23]前記微生物がバチルス・サチルスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、ペプチダーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[24]前記微生物がバチルス・サーキュランスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、β-ガラクトシダーゼの産生量が上方制御される、[1]~[6]のいずれか一項に記載の方法。
[25][1]~[24]のいずれか一項に記載の方法を適用して培養した微生物の培養液及び/又は菌体より、酵素を回収する工程、を含む、酵素組成物の製造方法。
[26][1]~[24]のいずれか一項に記載の方法を適用して培養した微生物の培養液から菌体を除去する工程、を含む、酵素組成物の製造方法。
[27]菌体除去後の培養液を精製する工程を更に含む、[26]に記載の製造方法。
[28][25]~[27]のいずれか一項に記載の製造方法で得られた酵素組成物。
[29][2]に記載の方法に使用する培養システムであって、培養容器と、その電極が該培養容器の内部に設けられるパルス電界発生装置と、を含む培養システム。
[30][3]又は[4]に記載の方法に使用する培養システムであって、循環路を備えた培養容器と、前記循環路に送液するための送液手段と、パルス電界発生装置と、を含み、該パルス電界発生装置の電極部が前記循環路に付設されている、培養システム。
本発明の第1の局面は、微生物の酵素生産性を制御する方法(以下、「本発明の制御方法」とも呼ぶ)に関する。本発明の制御方法は、酵素の生産に用いる微生物に対してパルス電界を印加する点に特徴を有する。典型的には、微生物の培養中の培養液にパルス電界を印加し、酵素生産性を制御する。本発明の制御方法に供する微生物のことを説明の便宜上、「生産株」と呼ぶことがある。培養方法は常法に従えばよく、通常は、使用する生産株の生育、増殖に適した培地及び培養条件(温度、酸素濃度等)を採用する。
(1)生産株アスペルギルス・オリゼ(例えばRIB40株)
パルス電界の印加時期:誘導期、対数期、定常期
生産される酵素の例:α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、PPLアミノペプチダーゼ、エステラーゼ、SAPAアミノペプチダーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ
生産量が増加する酵素の例:α-アミラーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)、α-ガラクトシダーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)、β-ガラクトシダーゼ(好ましくは誘導期から対数期にかけて複数の時期にパルス電界を印加)、プロテアーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)、ロイシンアミノペプチダーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)、PPLアミノペプチダーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)、エステラーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)
生産量が減少する酵素の例:α-アミラーゼ(好ましくは誘導期にパルス電界を印加)、α-グルコシダーゼ(好ましくは誘導期にパルス電界を印加)、β-グルコシダーゼ(好ましくは誘導期から対数期にパルス電界を印加)、α-ガラクトシダーゼ(好ましくは誘導期にパルス電界を印加)、ロイシンアミノペプチダーゼ(好ましくは誘導期にパルス電界を印加)、SAPAアミノペプチダーゼ(好ましくは対数期~定常期にパルス電界を印加)、エステラーゼ(好ましくは誘導期にパルス電界を印加)
パルス電界の印加時期:対数期、定常期
生産される酵素の例:α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、酸性ホスファターゼ、リパーゼ
生産量が増加する酵素の例:α-アミラーゼ(好ましくは定常期にパルス電界を印加)、プロテアーゼ(好ましくは定常期にパルス電界を印加)
生産量が減少する酵素の例:α-ガラクトシダーゼ(好ましくは定常期にパルス電界を印加)、β-ガラクトシダーゼ(好ましくは定常期にパルス電界を印加)
パルス電界の印加時期:対数期、定常期
生産される酵素の例:α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、リパーゼ
生産量が増加する酵素の例:α-アミラーゼ(好ましくは定常期にパルス電界を印加)、β-グルコシダーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)
パルス電界の印加時期:対数期
生産される酵素の例:α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、リパーゼ
生産量が増加する酵素の例:ロイシンアミノペプチダーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)
パルス電界の印加時期:対数期、定常期
生産される酵素の例:α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、リパーゼ
生産量が増加する酵素の例:リパーゼ(好ましくは対数期から定常期にパルス電界を印加)
生産量が減少する酵素の例:セルラーゼ(好ましくは対数期から定常期にパルス電界を印加)
パルス電界の印加時期:対数期
生産される酵素の例:α-アミラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ
生産量が増加する酵素の例:β-ガラクトシダーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)
パルス電界の印加時期:対数期、定常期
生産される酵素の例:α-アミラーゼ、β-グルコシダーゼ、プロテアーゼ
生産量が増加する酵素の例:β-グルコシダーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)
生産量が減少する酵素の例:α-アミラーゼ(好ましくは対数期から定常期にパルス電界を印加)
パルス電界の印加時期:対数期
生産される酵素の例:α-アミラーゼ、プロテアーゼ
生産量が増加する酵素の例:プロテアーゼ(好ましくは対数期にパルス電界を印加)
微生物を利用した酵素の生産系に本発明の制御方法を適用すると、適用しない場合とは異なる酵素生産性を示すことになる。従って、特徴的な酵素組成物を製造することが可能となる。そこで本発明の第2の局面は、本発明の制御方法の用途として、酵素組成物の製造方法(以下、「本発明の製造方法」とも呼ぶ)を提供する。尚、「酵素組成物」とは、少なくとも1種類の酵素を含む組成物である。従って、特定の1種類の酵素のみを含む(実質的な夾雑酵素活性がない)場合も、酵素組成物に該当する。
アスペルギルス・オリゼRIB40株、アスペルギルス・ニガーNBRC 9455株、ムコール・ヤバニカスIAM 6108株、バチルス・サチルスJCM 1465、バチルス・アミロリケファシエンスIFO 3034株、バチルス・サーキュランスATCC 21590株、ストレプトマイセス・グリセウスIFO 12875株、ストレプトマイセス・サーモカルボキシダスJCM 10367株
各微生物菌株を培養し、所定の時期(誘導期、対数期前期、対数期後期、定常期)にパルス電界を印加した。その後、所定のタイミングで培養液又は菌体を回収し、酵素活性測定用のサンプルを調製した。培養液については、遠心分離により上清を回収し、細胞外サンプルとした。菌体内容物については、遠心分離による沈殿物を、酸化アルミニウム処理
により破砕し、その遠心上清を回収し、細胞内サンプルとした。各サンプルについて各種酵素活性を測定した。以下、微生物菌株毎に培地・培養条件、パルス電界の印加条件を示す。
(1)アスペルギルス・オリゼRIB40株
培地・培養条件:50% ふすま培地、28℃培養
高電界パルス印加条件:電界強度 15 kV/cm又は30 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
培地・培養条件:50% ふすま培地、28℃培養
高電界パルス印加条件:電界強度 15 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
培地・培養条件:50% ふすま培地、28℃培養
高電界パルス印加条件:電界強度 15 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
培地・培養条件:SCD培地、28℃培養
高電界パルス印加条件:電界強度 15 kV/cm又は30 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
培地・培養条件:SCD培地、28℃培養
高電界パルス印加条件:電界強度 15 kV/cm又は30 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
培地・培養条件:YM broth培地、28℃培養
高 電界パルス印加条件:電界強度 30 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
培地・培養条件:YM broth培地、28℃培養
高電界パルス印加条件:電界強度 30 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
培地・培養条件:YM broth培地、28℃培養
高電界パルス印加条件1:電界強度 30 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
高電界パルス印加条件2:電界強度 30 kV/cm;印加回数 400ショット;繰返し数 3 pps;波形 減衰振動波
培地・培養条件:YM broth培地、28℃培養
高電界パルス印加条件1:電界強度 30 kV/cm;印加回数 100ショット;繰返し数 1 pps;波形 減衰振動波
高電界パルス印加条件2:電界強度 30 kV/cm;印加回数 400ショット;繰返し数 3 pps;波形 減衰振動波
<糸状菌(アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、ムコール・ヤバニカス)>
培養4時間後:誘導期
培養18時間後、培養22時間後:対数期前期
培養39時間後、培養44時間後:対数期後期
培養66時間後:定常期(静止期)
培養21時間後、培養22時間後:対数期前期
培養43時間後、培養44時間後:対数期後期
培養65時間後:定常期(静止期)
培養43時間後、培養44時間後:対数期前期
培養65時間後:対数期後期
*接種菌体量が少なく生育が遅れたため、他のバチルス属細菌と異なる
培養21時間後:対数期前期
培養43時間後:対数期後期
培養65時間後:定常期(静止期)
<使用緩衝液>
100 mmol/L 酢酸緩衝液 pH 4.2
100 mmol/L 酢酸緩衝液 pH 5.0
100 mmol/L リン酸緩衝液 pH 7.0
100 mmol/L PIPES緩衝液 pH 7.1
100 mmol/L ホウ酸緩衝液 pH 9.2
可溶性でんぷん(メルク製)を1.0 g/dLになるように緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の5分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、20 mmol/Lヨウ素溶液を反応液の6分の1量添加し、ヨウ素でんぷん反応による発色を540 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
p-ニトロフェニルα-D-グルコピラノシド(シグマアルドリッチ製)を12 mmol/Lになるように緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、1 g/dL炭酸ナトリウム溶液を反応液の等量添加し、遊離したp-ニトロフェノールの発色を420 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
p-ニトロフェニルβ-D-グルコピラノシド(シグマアルドリッチ製)を12 mmol/Lになるように緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、1 g/dL炭酸ナトリウム溶液を反応液の等量添加し、遊離したp-ニトロフェノールの発色を420 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
p-ニトロフェニルα-D-ガラクトピラノシド(シグマアルドリッチ製)を12 mmol/Lになるように緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、1 g/dL炭酸ナトリウム溶液を反応液の等量添加し、遊離したp-ニトロフェノールの発色を420 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
p-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド(シグマアルドリッチ製)を12 mmol/Lになるように緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、1 g/dL炭酸ナトリウム溶液を反応液の等量添加し、遊離したp-ニトロフェノールの発色を420 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
Cellazyme C tablets(セラザイム製)1錠あたり10 mLの緩衝液に懸濁し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の13分の1量添加して反応開始した。反応終了後、反応液をセルロースフィルターでろ過し、ろ液に含まれるアゾ色素結合低分子を590 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
p-ニトロフェニル-アセテート(和光純薬工業製)を12 mmol/Lになるように、30 g/dLエタノールを含む緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、遊離したp-ニトロフェノールの発色を420 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
p-ニトロフェニル-ステアレート(シグマアルドリッチ製)を0.31 mmol/Lになるように、30 g/dLエタノールを含む緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、遊離したp-ニトロフェノールの発色を420 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
カゼイン(カルビオケム製)を0.1 g/dLになるように緩衝液に溶解または懸濁し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の10分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、400 mmol/Lトリクロロ酢酸溶液を基質溶液の等量添加後、15,000回転、10分間遠心分離して得られた上清中の可溶化したペプチドを280 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
p-ニトロフェニル-ホスフェイト(和光純薬工業製)を2 mmol/Lになるように緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の5分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、1 g/dL炭酸ナトリウム溶液を反応液の等量添加し、遊離したp-ニトロフェノールの発色を420 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
L-ロイシン- p-ニトロアニリド(和光純薬工業製)を4.8 mmol/Lになるように5 g/dLのジメチルスルホキシド(和光純薬工業製)を含む緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、遊離したp-ニトロアニリドの発色を450 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
L-アラニン- p-ニトロアニリド(和光純薬工業製)を4.8 mmol/Lになるように5 g/dLのジメチルスルホキシド(和光純薬工業製)を含む緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、遊離したp-ニトロアニリドの発色を450 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
L-ピログルタミル-L-フェニルアラニル-L-ロイシン- p-ニトロアニリド(和光純薬工業製)を2.4 mmol/Lになるように20 g/dLのジメチルスルホキシド(和光純薬工業製)を含む緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、遊離したp-ニトロアニリドの発色を450 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
スクシニル-L-アラニル-L-プロリル-L-アラニン- p-ニトロアニリド(和光純薬工業製)を2.4 mmol/Lになるように10 g/dLのジメチルスルホキシド(和光純薬工業製)を含む緩衝液に溶解し、基質溶液とした。これに、適当希釈した酵素サンプル溶液を基質溶液の4分の1量添加して反応開始した。酵素活性は、遊離したp-ニトロアニリドの発色を450 nmの吸光度で測定し、各条件においてパルス電界を全く印加しなかった培養サンプルの測定値に対する相対値として見積もった。
(1)アスペルギルス・オリゼRIB40株(印加時期と電界強度の検討)
パルス電界の印加時期と電界強度が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養4時間後(誘導期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養4時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(c)培養4時間後と培養18時間後(対数期前期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(d)培養4時間後と培養18時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(e)培養18時間後に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(f)培養18時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(g)培養18時間後と培養39時間後(対数期後期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(h)培養18時間後と培養39時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養44時間後(対数期後期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養66時間後(定常期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養22時間後(対数期前期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養44時間後(対数期後期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(c)培養66時間後(定常期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養22時間後(対数期前期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養44時間後(対数期後期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(c)培養66時間後(定常期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養22時間後(対数期前期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養44時間後(対数期後期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(c)培養66時間後(定常期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期と電界強度が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養22時間後(対数期前期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養22時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(c)培養44時間後(対数期後期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(d)培養44時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期と電界強度が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養22時間後(対数期前期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養22時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(c)培養44時間後(対数期後期)に電界強度15kV/cmのパルス電界を印加
(d)培養44時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養21時間後(対数期前期)に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養43時間後(対数期後期)に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(c)培養21時間後と培養43時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(d)培養21時間後と培養43時間後と培養65時間後(定常期)に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(e)培養43時間後と培養65時間後に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養43時間後(対数期前期)に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
(b)培養43時間後と培養65時間後(対数期後期)に電界強度30kV/cmのパルス電界を印加
パルス電界の印加時期及びショット回数が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養21時間後(対数期前期)に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(b)培養21時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
(c)培養43時間後(対数期後期)に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(d)培養43時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
(e)培養21時間後と培養43時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(f)培養21時間後と培養43時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
(g)培養21時間後と培養43時間後と培養65時間後(定常期)に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(h)培養21時間後と培養43時間後と培養65時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
(i)培養43時間後と培養65時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(j)培養43時間後と培養65時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
パルス電界の印加時期及びショット回数が異なる以下の試験群を設定した。
(a)培養21時間後(対数期前期)に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(b)培養21時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
(c)培養43時間後(対数期後期)に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(d)培養43時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
(e)培養21時間後と培養43時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(f)培養21時間後と培養43時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
(g)培養21時間後と培養43時間後と培養65時間後(定常期)に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(h)培養21時間後と培養43時間後と培養65時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
(i)培養43時間後と培養65時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数100のパルス電界を印加
(j)培養43時間後と培養65時間後に電界強度30kV/cm、ショット回数400のパルス電界を印加
Claims (23)
- 微生物にパルス電界を印加することを特徴とする、微生物の酵素生産性を制御する方法であって、前記微生物が、アスペルギルス属、ムコール属、ストレプトマイセス属、及びバチルス属からなる群より選択される微生物であり、前記パルス電界のパルス波形が減衰振動波形である方法。
- 微生物の培養中の培養液にパルス電界を印加する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 培養中において、前記パルス電界を発生させる電極部に培養液が循環する、請求項2に記載の方法。
- 培養中に繰り返しパルス電界が印加される、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記パルス電界の電界強度が10kV/cm~50kV/cmである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- アミラーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、蛋白質脱アミド酵素及びプルラナーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ロイシンペプチダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、PPLアミノペプチダーゼ及びSAPAアミノペプチダーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、ムコール・ヤバニカス、バチルス・サチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・サーキュランス、ストレプトマイセス・グリセウス及びストレプトマイセス・サーモカルボキシダスからなる群より選択される微生物である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素生産性の制御が、以下の(1)~(8)のいずれかである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法:
(1)前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、α-アミラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ及びPPLアミノペプチダーゼ、エステラーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が上方制御されるもの、前記パルス電界の印加が培養中の誘導期に実施され、α-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、エステラーゼからなる群より選択される一以上の酵素の生産量が下方制御されるもの、或いは前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、SAPAアミノペプチダーゼの生産量が下方制御されるもの;
(2)前記微生物がアスペルギルス・ニガーであり、前記パルス電界の印加が培養中の定常期に実施され、α-アミラーゼ及び/又はプロテアーゼの生産量が上方制御されるもの;
(3)前記微生物がムコール・ヤバニカスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、α-アミラーゼ及び/又はβ-グルコシダーゼの生産量が上方制御されるもの;
(4)前記微生物がバチルス・サチルスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、ロイシンアミノペプチダーゼの生産量が上方制御されるもの;
(5)前記微生物がバチルス・アミロリケファシエンスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、リパーゼの生産量が上方制御されるもの或いはセルラーゼの生産量が下方制御されるもの;
(6)前記微生物がバチルス・サーキュランスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、β-ガラクトシダーゼの生産量が上方制御されるもの;
(7)前記微生物がストレプトマイセス・グリセウスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期及び/又は定常期に実施され、β-グルコシダーゼの生産量が上方制御されるもの、或いはα-アミラーゼの生産量が下方制御されるもの;
(8)前記微生物がストレプトマイセス・サーモカルボキシダスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、プロテアーゼの生産量が上方制御されるもの。 - 前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、プロテアーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、ペプチダーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の誘導期及び又は対数期に実施され、β-ガラクトシダーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、α-ガラクトシダーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がアスペルギルス・オリゼであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、α-アミラーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がアスペルギルス・ニガーであり、前記パルス電界の印加が培養中の定常期に実施され、プロテアーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がアスペルギルス・ニガーであり、前記パルス電界の印加が培養中の定常期に実施され、α-アミラーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がバチルス・サチルスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、ペプチダーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物がバチルス・サーキュランスであり、前記パルス電界の印加が培養中の対数期に実施され、β-ガラクトシダーゼの産生量が上方制御される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~18のいずれか一項に記載の方法を適用して培養した微生物の培養液及び/又は菌体より、酵素を回収する工程、を含む、酵素組成物の製造方法。
- 請求項1~18のいずれか一項に記載の方法を適用して培養した微生物の培養液から菌体を除去する工程、を含む、酵素組成物の製造方法。
- 菌体除去後の培養液を精製する工程を更に含む、請求項20に記載の製造方法。
- 請求項2に記載の方法に使用する培養システムであって、培養容器と、その電極が該培養容器の内部に設けられるパルス電界発生装置と、を含む培養システム。
- 請求項3又は4に記載の方法に使用する培養システムであって、循環路を備えた培養容器と、前記循環路に送液するための送液手段と、パルス電界発生装置と、を含み、該パルス電界発生装置の電極部が前記循環路に付設されている、培養システム。
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