CN107094883A - 利用脂质酰基转移酶生产uht乳的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，其用于改善稳定性，尤其是长期稳定性，和/或改善可辨感官差异，和/或改善气味和/或味道，和/或用于降低胆固醇含量，和/或用于除去或降低UHT乳的乳油化从而降低UHT乳的胆固醇含量。本发明还涉及生产UHT乳的方法，该方法包括将脂质酰基转移酶和乳混合(包括对所述乳进行加工从而使其成为UHT乳的步骤)。所述脂质酰基转移酶优选为具有脂质酰基转移酶活性的多肽。

Description

利用脂质酰基转移酶生产UHT乳的方法
本申请是申请日为2008年8月14日，名称为“方法”的中国专利申请200880103149.5号的分案申请。
相关申请的引用
本申请参考了以下相关申请：US 2002-0009518、US 2004-0091574、WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347、WO2005/066351、2006年2月2日提交的美国申请第60/764,430号、WO2006/008508、国际专利申请号PCT/IB2007/000558和美国申请第11/671,953号。所述每个申请以及各申请中所引用的每篇文献(“申请引用的文献”)，和申请引用的文献中所参考或引用的每篇文献(无论是出现在这些申请的正文中或是在审查过程中)以及在所述审查中用以支持先进专利性的论据，均通过引用并入本文。本文还引用了多份文献(“本文所引用文献”)。因此，每篇本文所引用文献以及本文所引用文献中所引用或参考的每篇文献均通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及UHT乳的制备方法，UHT乳的酶处理方法，经酶处理的UHT乳和酶在处理UHT乳中的应用，以提供预想不到的新技术优点。
背景技术
已知脂质酰基转移酶在食品应用中具有优点。已经发现脂质酰基转移酶在食物中具有显著的酰基转移酶活性。这种活性在食物的制备方法中有令人惊奇的有益应用。
例如，WO 2004/064537公开了通过使用脂质酰基转移酶来原位制备乳化剂的方法和与其相关的优点。
国际专利申请号PCT/IB2001/000558公开了脂质酰基转移酶在(杂合)宿主细胞中的表达，并且该申请通过引用并入本文。
长保存期产品(long-life product)生产中的热处理通常被称为“灭菌”。这是指对所述产品进行强热处理，以使所有相关微生物和多数耐热酶失活。此类产品具有优异的保存性，并能够在室温下长期贮存。许多奶场可以由此将其产品在较大领域内分发，从而发现新的市场。
通常有两种方法用于生产灭菌产品(也被称为用于室温保存的长保存期乳)，即容器内灭菌(in-container sterilisation)或UHT处理，然后通过无菌包装将其装入保护产品免受光和大气氧影响的包装内。本发明可用于任何方法生产的长保存期乳，例如UHT乳。
对于生产商、零售商和消费者来说，如果产品不需要冷藏并可以长期保存而不变质，则会具有许多优点。
这些产品通常被称为UHT产品，具体为UHT乳或UHT调味乳。
接受UHT处理的乳必须具有非常好的质量。原料乳中的蛋白不引起热不稳定非常重要，而如果原料乳质量差则可能出现热不稳定的情况。如果乳(通常为初乳)发酸、具有不利的盐平衡和/或含有过多血清蛋白，则其不适合进行UHT处理。
当乳在高温下长时间保存时，形成某些引起变色(褐变)的化学反应产物。这还使其具有过熟和焦糖味，并且偶尔生成大量沉淀。通过较高温度下的短时间热处理，可以在很大程度上避免这些缺陷。重要的是选择最佳的时间/温度组合，从而能够令人满意地破坏孢子，同时保持乳品的热破坏最小。
已经证明，当对乳进行加热(例如在70-80℃下巴氏灭菌5-20秒)时，出现被称为“奶油浮块现象”的作用。乳的热处理不利于乳的稳定性。
乳的主要成分为水、脂肪、蛋白质、乳糖和矿物质(盐)。乳还含有较少量的其它物质，例如色素、酶、维生素、磷脂(具有脂肪样性质的物质)、固醇和气体。
共同形成“乳脂肪”的很多乳脂具有非常复杂的组成和结构，其组成和结构甚至比大多数其它天然存在的脂肪还要复杂。通常，乳脂肪由甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯、脂肪酸、固醇、类胡萝卜素和维生素(A、D、E和K)组成。其它组分包括磷脂、脂蛋白、甘油酯(gycerides)、脑苷脂、蛋白质、核酸、酶、金属和水。
磷脂由于其两亲性而成为表面活性最好的分子。由于其分子大小相对较大，磷脂都难溶于水和脂肪。在这两种液体中，磷脂都倾向于形成薄片状双层。发现乳的磷脂通常与蛋白密切结合，尤其当位于乳脂肪小球的膜中时更是如此。乳中磷脂的主要部分是卵磷脂，其在中等亲水性下具有表面活性。因此，卵磷脂可以作为助悬剂和分散剂或者作为O/W乳剂和W/O乳剂的乳化剂。
磷脂包含0.8-1.0％的天然乳脂肪。乳中磷脂/卵磷脂的主要类型为磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。
固醇难溶于水，并显示非常小的表面活性。它们易于与磷脂结合。在考虑乳的营养价值时，胆固醇可以被认为是乳的不期望成分。胆固醇包含0.3-0.4％的天然乳脂肪。
EP 1 532 863教导了磷脂酶在处理干酪用乳或干酪用乳成分中的应用。
Tanji等(Res.Bull.Obihiro Univ.,22(2001):89-94)教导了在40℃下使用脂肪酶增强乳脂肪(butter oil)的风味。
JP 57-189637和JP57-189638教导了使用磷脂酶处理乳从而生产发酵乳饮品或酸性乳饮品-其中酶处理在30-45℃下进行。
发明内容
本发明的各个方面体现在权利要求书和以下发明详述中。
本发明的发明人令人惊奇地发现，在UHT乳生产过程中，通过使乳或其部分(fraction)与本文定义的脂质酰基转移酶接触，可以显著改善UHT乳的稳定性，尤其是长期稳定性。
更令人惊奇的是，本发明的发明人发现无需额外的加热步骤即可进行酶处理。由此，可以避免两次加热(即一次用于酶处理，另一次用于UHT处理)对乳的不利影响。这具有以下所述的多个优点。
具体实施方式
本发明的第一方面提供了生产UHT乳的方法，所述方法包括将脂质酰基转移酶与乳或其部分(fraction)混合，和通过超高热处理对经所述酶处理的乳进行处理从而产生UHT乳。
“超高热处理(UTH)”是将乳加热至大约130-150℃并在此保持数秒(例如1-3秒，优选2秒)的过程。本文使用的术语“超高热处理”和“超高温处理”和“高温处理”含义相同。
在一个实施方式中，本文所用术语“超高热处理”的含义包括容器内灭菌和/或UHT处理，然后通过无菌包装将其装入保护产品免受光和大气氧的包装内。
本领域技术人员可以理解，可根据待处理产品确定UHT热处理的时间和温度组合，并可以在一定程度上进行变化。
在灌装之前，可以将热处理后的UHT乳输送至无菌罐进行缓冲。
灌装通常在无菌气氛下进行，此处UHT包装机利用氮气冲洗包装袋，并保持灌装头内的区域充满氮气，从而消除任何空气污染。
本发明的第二方面提供了脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于改善UHT乳的稳定性，尤其是长期稳定性。
本文使用的术语“改善稳定性”表示在储存后(优选在储存至少24小时后)，乳油化(creaming)和/或沉淀和/或絮凝和/或相分离的量减少。适合地，可以在约5℃-35℃之间的温度进行储存。
在一个实施方式中，本文使用的术语“改善稳定性”表示在储存后(优选在储存至少24小时后)，乳油化的量减少，而没有形成沉淀层。适合地，可以在约5℃-35℃之间的温度进行储存。
可以通过Turbiscan(稳定性分析仪/激光光散射仪)(根据本文实施例部分公开的内容)客观地测量乳油化和/或通过压力测试(根据本文实施例部分公开的内容)主观地测量乳油化。
可以通过Turbiscan(根据本文实施例部分公开的内容)客观地测量乳油化和/或通过压力测试(根据本文实施例部分公开的内容)主观地测量絮凝。
可以通过沉淀试验(根据本文实施例部分公开的内容)测量沉淀。
可以通过目测或者通过Turbiscan(根据本文实施例部分公开的内容)测量相分离。
本文使用的术语“改善长期稳定性”是指在长期储存(优选在储存约1-12个月，更优选在储存约3-12个月，优选在储存长达约6个月，优选在储存长达约12个月，更优选在储存至少约6个月)过程中，乳油化的量减少(优选没有形成沉淀层)和/或沉淀和/或絮凝和/或相分离的量减少。适合地，可以在约5℃-35℃之间的温度进行储存。
本发明的第三方面提供了脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于改善UHT乳的可辨感官差异(perceptible sensory difference)。适合地，所述UHT乳的可辨感官差异可以通过本文公开的“三点试验(triangle test)”进行测量。
一方面，所述“可辨感官差异”包括改善的气味和/或味道，例如降低的煮熟味道和/或气味和/或降低的酸败味道和/或气味。
本发明的第四方面提供了脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于降低UHT乳中的胆固醇含量。
可以通过薄层层析(TLC)和/或气相色谱(GLC)测量胆固醇的降低。
本发明的第五方面提供了脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于消除或降低UHT乳中的乳油化(优选没有形成沉淀层)。
适合地，UHT乳稳定性的改善(尤其是长期稳定性)，和/或可辨感官差异的改善，和/或气味和/或味道的改善，和/或胆固醇含量的降低，和/或乳油化的降低(优选不形成沉淀层)表示，当经酶处理的UHT乳(用本发明的酶进行处理)与未经酶处理的UHT乳和/或已经用磷脂酶(具体为被归类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1酶或被归类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2酶)处理的UHT乳相比时的改善。
适合地，UHT乳稳定性的改善(尤其是长期稳定性)，和/或可辨感官差异的改善，和/或气味和/或味道的改善，和/或胆固醇含量的降低，和/或乳油化的降低(优选不形成沉淀层)表示，当经酶处理的UHT乳(用本发明的酶进行处理)与已经用一种或多种磷脂酶处理的UHT乳相比时的改善，所述磷脂酶为：来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的磷脂酶A1(Lipopan FTM)和/或来自异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)的磷脂酶和/或来自镰刀菌(Fusarium venenatum)的磷脂酶A1(YieldMaxTM)和/或来自黑曲霉(Aspergillus niger)的磷脂酶和/或来自紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)的磷脂酶A2和/或来自猪胰的磷脂酶A2和/或来自勃氏块菌(Tuber borchii)的磷脂酶A2。
适合地，UHT乳稳定性的改善(尤其是长期稳定性)，和/或可辨感官差异的改善，和/或气味和/或味道的改善，和/或胆固醇含量的降低，和/或乳油化的降低(优选不形成沉淀层)表示，当经酶处理的UHT乳(用本发明的酶进行处理)与已经用来自尖孢镰刀菌的磷脂酶A1(Lipopan FTM)处理的UHT乳相比时的改善。
优选地，在高温处理前将所述脂质酰基转移酶和乳或其部分混合是有利的。换而言之，可以将所述脂质酰基转移酶加入到原料乳或其部分中，然后对所述经酶处理的原料乳或其部分进行超高热处理(从而产生UHT乳或其部分)。
在本发明的一个实施方式中，本发明可以提供生产UHT乳的方法，所述方法包括使脂质酰基转移酶和UHT乳或其部分混合。适合地，在一些实施方式中，可以在超高热处理乳后向所述乳或其部分中加入所述脂质酰基转移酶。
优选地，将所述脂质酰基转移酶加入到所述乳中并在低于约20℃，优选低于约10℃的温度下孵育。
优选地，将所述脂质酰基转移酶加入到所述乳中并在约1℃-10℃，优选约3℃-7℃，更优选在5℃的温度下孵育。
优选地，所述孵育时间可以有效保证至少5％的转移酶活性，优选至少10％的转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％的转移酶活性。
通过由从乳中的磷脂或三酰基甘油酯至胆固醇的酰基转移形成的胆固醇酯的摩尔量相对于乳中最初具有的胆固醇量来测定转移酶活性。
其中：
胆固醇酯(t)＝截止时间t时，胆固醇酯的量
胆固醇酯(0)＝截止时间0时，胆固醇酯的量
胆固醇(0)＝截止时间0时，乳中胆固醇的量。
通过GLC测定胆固醇和胆固醇酯
气相色谱：
利用气相色谱测量乳样品中的胆固醇和胆固醇酯的含量。
使用以下CG设定：
Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱仪，其配备有WCOT熔凝硅石柱12.5m×0.25mm ID×0.1μm膜厚度5％苯基-甲基-硅酮(CP Sil 8CB，来自Crompack)。
载气：氦。
注射器：PSSI冷分流注射(由最初温度50℃加热至385℃)，体积1.0μl。
检测器FID：395℃。
制备用于GC分析的乳样品：
根据Mojonnier AOAC 989.05，利用乙醇、NH3、MTBE(甲基-叔丁基醚)和p-醚提取乳脂质。将所述脂质部分重新溶解在含有作为内标的十七烷的庚烷/吡啶(2:1)中，通过GC对胆固醇进行测量。
制备用于胆固醇-酯测量的样品：加入异三十烷作为额外的内标。将脂质部分重新溶解在己烷中，并利用NH2Bond Elut柱和己烷洗脱对胆固醇-酯进行浓缩。将样品重新溶解在庚烷/吡啶(2:1)中，通过GC对胆固醇-酯进行测量。
优选地，所述孵育温度和孵育时间的组合可以有效保证至少5％的转移酶活性，优选至少10％的转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％的转移酶活性。
适合地，所述孵育时间可以为5分钟-30小时，适合地，所述孵育时间可以为45分钟-30小时。
在一个实施方式中，所述孵育时间可以为约10小时-约30小时，优选约15小时-25小时，更优选约20小时。
在优选的实施方式中，所述酶处理在约3℃-约10℃(优选约5℃)下进行至少10小时，优选约10-25小时之间，更优选约20小时。
使用较低温度和有效孵育时间的组合为本发明带来了显著的优点。
在本发明的方法和/或应用中，优选在酶处理过程中不加热乳(UHT乳)。
在本发明的方法和/或应用中，优选所述乳仅加热一次(即超高热处理以产生UHT乳)。因此，在本发明中，优选乳(例如UHT乳)在其生产过程中经受的加热步骤不超过1个。
在某些方面，用于本发明任一方法和/或应用的脂质酰基转移酶可以包含GDSx基序和/或GANDY基序。
优选地，将所述脂质酰基转移酶表征为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于以下一个或多个属的生物：气单孢菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分支杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和念珠菌属(Candida)。优选地，所述脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于气单孢菌属的生物。
在本发明的一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶在对应于SEQ ID No.35所示的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80位置上包含天冬氨酸残基。
在本发明的一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是在对应于SEQ ID No.35所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80位置上包含天冬氨酸残基的脂质酰基转移酶。
此外或可选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码的脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列，或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列。适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列。
此外或可选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码的脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列，或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列。适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶具有SEQID No.16或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列，或者具有与其具有至少75％的同一性，优选与其具有至少80％、优选至少85％、优选至少95％、优选至少98％的同一性的氨基酸序列。
术语“UHT乳”表示设计用于室温保存的任何长保存期乳。具体而言，“UHT乳”表示已经接受热处理而使其成为长保存期乳的任何乳，其包含调味的产品和未调味的产品。
适合地，所述方法可以包括除去酶和/或使酶变性的步骤。
适合地，用于本发明的酶可以是固定化酶。
本发明的乳产品为UHT乳或UHT调味乳。
本文无意于涵盖干酪用乳(即不是UHT乳且其随后用于制备干酪的乳)和/或由非UHT乳的乳生产的干酪或干酪产品。
优点
本发明的一个优点是可以显著改善UHT乳的稳定性，尤其是长期稳定性。
本发明的另一个优点是，与没有经过酶处理的UHT乳相比和/或与在其制备过程中已经用磷脂酶(具体而言为被归类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1酶或被归类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2酶，而非本文所述的脂质酰基转移酶)进行处理的UHT乳相比，UHT乳“乳油化”的不利物理影响得到抑制和/或降低。
本文使用的术语“乳油化”表示脂肪小球随时间因不良重力作用而升到乳(例如在容器中)的顶层。
本发明的另一个优点可以是，与没有经过酶处理的UHT乳相比和/或与在其制备过程中已经用磷脂酶(具体而言为被归类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1酶或被归类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2酶，而非本文所述的脂质酰基转移酶)进行处理的UHT乳相比，按照本发明处理的UHT乳的表面张力降低。
本发明的另一个优点可以是，与没有经过酶处理的UHT乳相比和/或与在其制备过程中已经用磷脂酶(具体而言为被归类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1酶或被归类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2酶，而非本文所述的脂质酰基转移酶)进行处理的UHT乳相比，当使用按照本发明处理的UHT乳时，UHT场的污垢减少。
本发明的另一个优点可以是，与在其制备过程中已经用磷脂酶(具体而言为被归类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1酶或被归类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2酶，而非本文所述的脂质酰基转移酶)进行处理的UHT乳相比，按照本发明处理的UHT乳中的游离脂肪酸减少。
更令人惊奇的是，本发明的发明人发现无需额外的加热步骤即可进行酶处理。具体而言，使用本发明的脂质酰基转移酶的酶处理可以在低至约1-25℃的温度下进行，优选低至约1-10℃，优选低至约3-约7℃之间，更优选约5℃。由此，可以避免两次加热(即一次用于UHT处理，随后另一次用于酶处理)乳的不利影响。这样具有许多优点，包括：
a)所述方法更经济并由此有利于UHT乳的生产商；
b)所述乳的加热可以产生不利影响，例如破坏所述乳组分的稳定性，本发明显著降低了这种不利因素；和/或
c)较小改变感官感觉特性。
本发明的另一个优点是减少UHT乳中的胆固醇含量，这可带来主要的健康益处。
适合地，本文所公开的任一特性(例如乳油化)的改善可以与使用以下一种或多种磷脂酶处理的UHT乳进行比较：来自尖孢镰刀菌的磷脂酶A1(Lipopan FTM)，和/或来自镰刀菌的磷脂酶A1(Yield MaxTM)，和/或来自异孢镰刀菌的磷脂酶，和/或来自黑曲霉的磷脂酶，和/或来自紫红链霉菌的磷脂酶A2，和/或来自猪胰的磷脂酶A2，和/或来自勃氏块菌的磷脂酶A2，优选来自尖孢镰刀菌的磷脂酶A1(Lipopan FTM)。
宿主细胞
所述宿主生物可以是原核或真核生物。
在本发明的一个实施方式中，本发明的脂质酰基转移酶在宿主细胞中表达，例如在细菌细胞中，例如在芽孢杆菌，例如在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主细胞中表达。
可选择的宿主细胞有，例如真菌、酵母或植物。
已经发现与其它生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相比，使用地衣芽孢杆菌宿主细胞可使脂质酰基转移酶的表达增加。
已经将来自于杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂质酰基转移酶插入到多个常规表达载体中，所述表达载体经设计分别最适宜在枯草芽孢杆菌、多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)中表达。然而，在多型汉逊酵母、粟酒裂殖酵母和塔宾曲霉中仅检测到极低的水平。这些表达水平低于1μg/ml，因此不可能选择出产生足量蛋白以起始商业生产的细胞(结果未显示)。相反，地衣芽孢杆菌能够产生对商业可行的生产具有吸引力的蛋白水平。
具体而言，已经发现地衣芽孢杆菌中的表达比在aprE启动子控制下的枯草芽孢杆菌表达高约100倍，或比在A4启动子控制下并与纤维素融合时变铅青链霉菌(S.lividans)中的表达高约100倍(结果未显示在本文中)。
所述宿主细胞可以为除枯草芽孢杆菌之外的任何芽孢杆菌细胞。优选地，所述芽孢杆菌宿主细胞可以是以下物种中的一种：地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)。
本发明涉及的术语“宿主细胞”包括具有以下特征的任何细胞：包含本文所定义的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或本文所定义的表达载体，且用于重组制备具有如本文所定义的特异性质的脂质酰基转移酶。
适合地，所述宿主细胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶阴性细胞株(protease minusstrain)和/或α-淀粉酶缺陷或α-淀粉酶阴性细胞株(α-amylase minus strain)。
本文所用的术语“异源”是指源自分离的遗传资源或物种的序列。异源序列是非宿主序列、修饰的序列、来自不同宿主细胞株的序列、或来自宿主细胞的不同染色体位置的同源序列。
“同源”序列是指在相同遗传资源或物种中发现的序列，即其天然存在于宿主细胞的相关物种中。
本文所用的术语“重组脂质酰基转移酶”是指已经通过遗传重组的方式制备的脂质酰基转移酶。例如，将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列插入克隆载体，得到以存在异源脂质酰基转移酶为特征的地衣芽孢杆菌细胞。
调控序列
在一些应用中，可通过如下获得用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶序列：将其编码序列可操作地连接到能够通过例如所选宿主细胞(如地衣芽孢杆菌细胞)提供核苷酸序列表达的调控序列。
例如，可以使用包含可操作地连接到此调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即所述载体是表达载体。
术语“可操作地连接”是指并列放置(juxtaposition)，其中所述组件的关系允许它们能以其希望的方式发挥功能。“可操作地连接”到编码序列的调控序列的连接方式使其能在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其它表达调控信号。
所用的术语“启动子”为本领域的一般含义，如RNA聚合酶结合位点。
也可以通过选择调控区(如启动子、分泌引导子和终止子区)来实现编码具有如本文所定义的特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达，其中所述终止子区本质上不是编码所述酶的核苷酸序列的调控区。
适合地，可以将本发明的核苷酸序列至少可操作地连接到启动子。
适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以可操作地连接编码终止子序列的核苷酸序列。用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的适合的终止子序列的实例包括：α-淀粉酶终止子序列(例如，CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA-SEQ ID No.64)、碱性蛋白酶终止子序列(例如，CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA-SEQ ID No.65)、谷氨酸特异性终止子序列(例如，ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTAT TATTGT-SEQ ID No.66)、果聚糖酶终止子序列(例如，TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT-SEQ ID No.67)和枯草杆菌蛋白酶E终止子序列(如，GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG-SEQ ID No.119)。适合地，可以将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可操作地连接到α-淀粉酶终止子，如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶终止子。
启动子
根据本发明所用的启动子序列可以与编码脂质酰基转移酶的序列异源或同源。
所述启动子序列可以是能够指导脂质酰基转移酶在所选宿主细胞中表达的任何启动子序列。
适合地，所述启动子序列可以与芽孢杆菌(如地衣芽孢杆菌)同源。优选地，所述启动子序列与所选宿主细胞同源。
适合地，所述启动子序列可以与宿主细胞同源。“与宿主细胞同源”是指来源于宿主生物内；即，在宿主生物中自然发现的启动子序列。
适合地，所述启动子序列可以选自由编码以下启动子的核苷酸序列组成的组：α-淀粉酶启动子、蛋白酶启动子、枯草杆菌蛋白酶启动子、谷氨酸特异性蛋白酶启动子和果聚糖蔗糖酶启动子。
适合地，所述启动子序列可以是编码以下启动子的核苷酸序列：LAT(如，来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子，也称作AmyL)、AprL(如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg启动子)、EndoGluC(如，来自地衣芽孢杆菌的谷氨酸特异性启动子)、AmyQ(如，来自解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的α-淀粉酶启动子)和SacB(如，枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶启动子)。
适合在本发明方法中指导核酸序列转录的启动子的其它实例包括：缓慢芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子、和/或苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)CryIIIA基因的启动子。
在优选的实施方式中，所述启动子序列为α-淀粉酶启动子(如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子)。优选地，所述启动子序列包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的-35至-10序列(参见图53和图55)。
所述“-35至-10序列”描述的是相对于转录起始位点的位置。“-35”和“-10”均为框，即多个核苷酸，各包含6个核苷酸，且这些框被17个核苷酸分开。这17个核苷酸通常被称为“间隔子”。图55对此进行了说明，其中-35框和-10框被加下划线。为了避免混淆，本文所用的“-35至-10序列”是指从-35框的起点至-10框的终点的序列，即包括-35框、长度为17个核苷酸的间隔子和-10框。
信号肽
根据所用的序列和/或载体，通过由宿主细胞表达编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所产生的脂质酰基转移酶可以被分泌出或包含在细胞内。
信号序列可以用于指导编码序列分泌通过特定的细胞膜。所述信号序列对脂质酰基转移酶编码序列来说可以是天然的或外源的。例如，所述信号肽编码序列可以是从芽孢杆菌，优选从地衣芽孢杆菌获得的淀粉酶或蛋白酶基因。
可以由一种或多种以下基因获得适合的信号肽编码序列：麦芽糖α-淀粉酶基因、枯草杆菌蛋白酶基因、β-内酰胺酶基因、中性蛋白酶基因、prsA基因和/或酰基转移酶基因。
优选地，所述信号肽为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽、气单孢菌酰基转移酶的信号肽(如，mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No.21)、枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号肽(如，mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa-SEQ ID No.22)或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号肽(如，mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No.23)。适合地，所述信号肽可以为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽。
然而，可以使用能够指导所表达的脂质酰基转移酶进入所选芽孢杆菌宿主细胞(优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞)分泌途径的任何信号肽编码序列。
在本发明的一些实施方式中，可以将编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接到编码所选脂质酰基转移酶的核苷酸序列。
所选脂质酰基转移酶可以在本文所定义的宿主细胞中作为融合蛋白表达。
表达载体
术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。
优选地，所述表达载体被引入到生物(如地衣芽孢杆菌宿主)的基因组中。术语“引入”优选涵盖稳定的引入到基因组中。
如本文所定义的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以存在于载体中，在该载体中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列，使得所述调控序列能够通过适合的宿主生物(如地衣芽孢杆菌)表达所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。
本发明的载体可以被转化到上述的适合宿主细胞中，以表达具有如本文所定义的脂质酰基转移酶活性的多肽。
通常根据其将被引入的宿主细胞来选择载体(如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体、基因组插入物)。本发明可以涵盖发挥等同功能且本领域已知或可知的其它形式的表达载体。
一旦转化到所选择的宿主细胞中，载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并发挥功能，或可以自行整合进入基因组。
所述载体可以包含一个或多个选择性标记基因，如提供抗生素抗性的基因，如提供氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。或者，也可以通过共转化完成选择(如WO91/17243中所述)。
载体可以在体外使用，例如，用于制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。
所述载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序列。所述序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
脂质酰基转移酶
用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码天然的脂质酰基转移酶或脂质酰基转移酶变体。
用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶可以是天然的脂质酰基转移酶或脂质酰基转移酶变体。
例如，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347或WO2006/008508中所述的一种。这些文献通过引用并入本文。
本文所用的术语“脂质酰基转移酶”优选地是指具有酰基转移酶活性的酶(通常被归类为E.C.2.3.1.x，如2.3.1.43)，其中所述酶能够将酰基基团从脂转移到一个或多个受体底物，如以下的一种或多种：固醇、甾烷醇(stanol)、碳水化合物、蛋白、蛋白亚基、糖醇，如抗坏血酸和/或甘油，优选甘油和/或固醇，如胆固醇。
优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是能够将酰基基团从磷脂(如本文所定义)转移到糖醇(如抗坏血酸和/或甘油和/或固醇，优选甘油或固醇，最优选固醇(例如胆固醇))的脂质酰基转移酶。
在一些方面，本发明的“酰基受体”可以是包含羟基基团(-OH)的任何化合物，例如多元醇，包括甘油、固醇、甾烷醇、碳水化合物；羟酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白或其亚基，如氨基酸、蛋白水解产物和肽(部分水解的蛋白)；和其混合物和衍生物。优选地，根据本发明的“酰基受体”不是水。优选地，根据本发明的“酰基受体”是糖醇，如多元醇，最优选为甘油。出于本发明的目的，抗坏血酸也被认为是糖醇。
优选地，所述酰基受体不为甘油单酯。
优选地，所述酰基受体不为甘油二酯。
一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以且能够将酰基基团从脂质转移到甘油，此外还能够将酰基基团从脂质转移到以下的一种或多种物质的脂质酰基转移酶：碳水化合物、蛋白、蛋白亚基、固醇和/或甾烷醇，优选其能够转移到糖醇，如抗坏血酸和/或甘油，最优选其能够转移到固醇如胆固醇和/或植物固醇/甾烷醇。
优选地，脂质酰基作用的脂质底物是以下脂质中的一种或多种：磷脂，如卵磷脂，如磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺。
所述脂底物在本文中可以被称为“脂质酰基供体”。本文所用的术语卵磷脂涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
在一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶优选为不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯的脂质酰基转移酶。
在一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶优选为不表现出三酰基甘油(triacylglycerol)脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)或不表现出显著的三酰基甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)的脂质酰基转移酶。
水解甘油三酯的能力(E.C.3.1.1.3活性)可以根据Food Chemical Codex(3rdEd.,1981,pp 492-493)(其中修改为以葵花油，pH 5.5替代橄榄油，pH 6.5)测定的脂肪酶活性来测定。脂肪酶活性以LUS(葵花油的脂肪酶单位)来计量，其中将1LUS定义为在以上试验条件下每分钟可以从葵花油中释放1μmol脂肪酸的酶量。或者，也可以使用如WO9845453中定义的LUT试验。此文献通过引用并入本文。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以为基本上不能作用于甘油三酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶的LUS/mg可以小于1000，如小于500、如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2、更优选为小于1LUS/mg。可选地，LUT/mg活性小于500，如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2、更优选为小于1LUT/mg。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是基本上不能作用于甘油单酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶可以在LUS试验中使用单油酸酯(M7765 1-油酰-rac-甘油99％)以替代葵花油来测定。将1MGHU定义为在所述试验条件下每分钟可以从甘油单酯中释放1μmol脂肪酸的酶量。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是优选基本上不能作用于甘油三酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶具有的MGHU/mg可以小于5000，如小于1000、如小于500、如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2，更优选为小于1MGHU/mg。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以表现出一种或多种以下磷脂酶活性的脂质酰基转移酶：磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。所述脂质酰基转移酶也可以具有磷脂酶B活性(E.C.3.1.1.5)。
适合地，在一些方面，所述脂质酰基转移酶可以能够将酰基基团从磷脂转移到糖醇，优选为甘油和/或抗坏血酸。
适合地，在一些方面，所述脂质酰基转移酶可以能够将酰基基团从磷脂转移到甾烷醇和/或固醇，优选为胆固醇。
在一些方面，优选用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是能够将酰基基团从磷脂转移到固醇和/或甾烷醇以至少形成固醇酯和/或甾烷醇酯的脂质酰基转移酶。
所述脂质酰基转移酶可以能够将酰基基团从脂质转移到多元醇(如甘油)和/或固醇(如胆固醇或植物固醇)和/或甾烷醇。因此，在一个实施方式中，本发明的“酰基受体”可以为甘油和/或胆固醇或植物固醇和/或甾烷醇。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以使用以下标准进行表征：
所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体(优选为甘油或胆固醇)以形成新的酯；和
所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
优选地，GDSX基序的X为L或Y。更优选地，GDSX基序的X为L。因此，优选本发明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。
GDSX基序由四个保守的氨基酸构成。优选地，该基序中的丝氨酸为所述脂质酰基转移酶的催化丝氨酸。适合地，GDSX基序的丝氨酸的位置对应于Brumlik和Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996,Vol.178,No.7,p 2060-2064)中教导的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶的Ser-16。
为了测定蛋白是否具有本发明的GDSX基序，优选使用WO2004/064537或WO2004/064987(均通过引用并入本文)中公开的方法，将序列与pfam数据库的隐马尔可夫模型谱(hidden markov model profile)(HMM谱)进行比较。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以使用Pfam00657共有序列进行比对(有关完整的解释可参见WO2004/064537或WO2004/064987)。
优选地，与pfam00657结构域家族的隐马尔可夫模型谱(HMM谱)的阳性匹配表示存在本发明的GDSL或GDSX结构域。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶可以具有至少一个、优选为多于一个、更优选为多于两个的下述区(block)：GDSx区、GANDY区、HPT区。适合地，所述脂质酰基转移酶可以具有GDSx区和GANDY区。或者，所述酶可以具有GDSx区和HPT区。优选地，所述酶至少包含GDSx区。更多细节请参见WO2004/064537或WO2004/064987。
优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA、GGNDL，最优选为GANDY。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，与嗜水气单胞菌多肽参考序列(SEQID No.1)相比，用于本发明方法和/或应用的酶具有以下氨基酸残基中的至少一个、优选多于两个、优选多于三个、优选多于四个、优选多于五个、优选多于六个、优选多于七个、优选多于八个、优选多于九个、优选多于十个、优选多于十一个、优选多于十二个、优选多于十三个、优选多于十四个：28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34Ser、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。
Pfam00657GDSX结构域是区分有此结构域的蛋白和其它酶的独特标志。
图3中显示了pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)。其源自于对第6版数据库pfam家族00657(在本文中也可以称为pfam00657.6)的鉴定。
所述共有序列可以通过使用较新版pfam数据库来升级(如参见WO2004/064537或WO2004/064987)。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶：
(i)所述酶具有可以被称为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体(优选为甘油或胆固醇)以形成新的酯，优选分别为甘油单酯或胆固醇酯；
(ii)所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S；
(iii)所述酶包含His-309或在图2和4(SEQ ID No.1或SEQ ID No.3)中所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中对应于His-309的位置上包含组氨酸残基。
优选地，所述GDSX基序的氨基酸残基为L。
在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的His-291。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶为包含以下催化三联体的脂质酰基转移酶：Ser-34、Asp-306和His-309，或在图4(SEQ ID No.3)或图2(SEQ ID No.1)中所示嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中对应于Ser-34、Asp-306和His-309的位置上分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示的序列中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的Ser-34、Asp-306和His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的Ser-16、Asp-288和His-291。在图3(SEQ ID No.2)所示的pfam00657共有序列中，活性位点残基为Ser-7、Asp-345和His-348。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶：
所述酶具有可以被称为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将第一脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和
所述酶至少包含Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134和His-309，或在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中对应于Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-306和His-309的位置上分别包含甘氨酸残基、天冬氨酸残基、丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以由以下核苷酸序列中之一编码：
(a)SEQ ID No.36所示的核苷酸序列(参见图29)；
(b)SEQ ID No.38所示的核苷酸序列(参见图31)；
(c)SEQ ID No.39所示的核苷酸序列(参见图32)；
(d)SEQ ID No.42所示的核苷酸序列(参见图35)；
(e)SEQ ID No.44所示的核苷酸序列(参见图37)；
(f)SEQ ID No.46所示的核苷酸序列(参见图39)；
(g)SEQ ID No.48所示的核苷酸序列(参见图41)；
(h)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(参见图57)；
(i)SEQ ID No.50所示的核苷酸序列(参见图58)；
(j)SEQ ID No.51所示的核苷酸序列(参见图59)；
(k)SEQ ID No.52所示的核苷酸序列(参见图60)；
(l)SEQ ID No.53所示的核苷酸序列(参见图61)；
(m)SEQ ID No.54所示的核苷酸序列(参见图62)；
(n)SEQ ID No.55所示的核苷酸序列(参见图63)；
(o)SEQ ID No.56所示的核苷酸序列(参见图64)；
(p)SEQ ID No.57所示的核苷酸序列(参见图65)；
(q)SEQ ID No.58所示的核苷酸序列(参见图66)；
(r)SEQ ID No.59所示的核苷酸序列(参见图67)；
(s)SEQ ID No.60所示的核苷酸序列(参见图68)；
(t)SEQ ID No.61所示的核苷酸序列(参见图69)；
(u)SEQ ID No.62所示的核苷酸序列(参见图70)；
(v)SEQ ID No.63所示的核苷酸序列(参见图71)；
(w)或
与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ IDNo.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63中所示的任一序列具有70％或更高，优选为75％或更高同一性的核苷酸序列。
适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63中所示的任一序列具有80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高同一性。
在一个实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列为与SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62和SEQ IDNo.63中所示的任一序列具有70％或更高，优选为75％或更高同一性的核苷酸序列。适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62和SEQ ID No.63中所示的任一序列具有80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高同一性。
在一个实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列为与SEQ ID No.49中所示的序列具有70％或更高，75％或更高，80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高同一性的核苷酸序列。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以为包含一个或多个以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶：
(i)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列
(ii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列
(iii)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列
(iv)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列
(v)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列
(vi)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列
(vii)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列
(viii)SEQ ID No.10所示的氨基酸序列
(ix)SEQ ID No.11所示的氨基酸序列
(x)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列
(xi)SEQ ID No.13所示的氨基酸序列
(xii)SEQ ID No.14所示的氨基酸序列
(xiii)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列
(xiv)SEQ ID No.15所示的氨基酸序列
(xv)SEQ ID No.16所示的氨基酸序列
(xvi)SEQ ID No.17所示的氨基酸序列
(xvii)SEQ ID No.18所示的氨基酸序列
(xviii)SEQ ID No.34所示的氨基酸序列
(xix)SEQ ID No.35所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQID No.34或SEQ ID No.35中所示的任一序列具有75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高同一性的氨基酸序列。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含如SEQID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.1或SEQ ID No.15或SEQ ID No.16或SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.15所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.16所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列，或SEQ IDNo.35所示的氨基酸序列具有75％或更高、优选为80％或更高、优选为85％或更高、优选为90％或更高、优选为95％或更高同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含与SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34或SEQ IDNo.35中所示的任一序列具有80％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含一个或多个以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶：
(a)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基1-100所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基101-200所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基201-300所示的氨基酸序列；或
(d)与以上(a)至(c)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适合地，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以包含一个或多个以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；
(d)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或
(f)与以上(a)至(e)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列。
一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是如EP 1 275711中教导的来自于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶。因此，一方面，用于本发明方法和应用中的脂质酰基转移酶可以为包含SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18所教导的氨基酸序列之一的脂质酰基转移酶。
优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以为包含SEQID No.16所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或者包含与SEQ ID No.16具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高、更优选为98％或更高、或更优选为99％或更高的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶。该酶可以认为是酶的变体。
一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以为卵磷脂:胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(如由分子进化产生的变体)的脂质酰基转移酶。
适合的LCAT为本领域已知的，且可以获自于一种或多种如下的生物，如：哺乳动物、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物(包括拟南芥(Arabidopsis)和水稻(Oryza sativa))、线虫、真菌和酵母。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其可以是可获自于，优选获自于含有pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大肠杆菌株TOP 10的脂质酰基转移酶，其中所述大肠杆菌株TOP 10由Danisco A/S ofLangebrogade 1,DK-1001Copenhagen K,Denmark根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在National Collection of Industrial,Marine and FoodBacteria(NCIMB)23St.Machar Street,Aberdeen Scotland,GB，保藏日为2003年12月22日，保藏号分别为NCIMB 41204和NCIMB 41205。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是磷脂甘油酰基转移酶。磷脂甘油酰基转移酶包括分离自气单孢菌，优选为嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优选为杀鲑气单胞菌或其变体的磷脂甘油酰基转移酶。
用于本发明的最优选脂质酰基转移酶由SEQ ID No.1、3、4、15、16、34和35编码。本领域技术人员可以理解，优选酰基转移酶的信号肽在转移酶的表达过程中已被切割掉。SEQID No.1、3、4、15和16的信号肽为氨基酸1-18。因此，最优选的区域为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。当用于测定氨基酸序列同一性的同源性时，优选使用成熟序列进行本文所述的比对。
在一个实施方式中，适合用于本发明的脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列(或由SEQ ID No.16所示的氨基酸序列组成)，或包含与SEQ ID No.16具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列(或由与SEQID No.16具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列组成)。
在一个实施方式中，适合用于本发明的脂质酰基转移酶由包含SEQ ID No.68所示核苷酸序列(或由SEQ ID No.68所示核苷酸序列组成)的核苷酸序列编码，或由包含与SEQID No.68具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的核苷酸序列(或由与SEQ ID No.68具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的核苷酸序列组成)的核苷酸序列编码。
因此，确定同源性(同一性)的最优选区域为SEQ ID No.1和3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、15和16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。SEQ ID No.34和35是来分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白序列，其可以经历或可以未经历翻译后修饰。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是还可分离自喜热裂孢菌(Thermobifida)，优选为褐色喜热裂孢菌(T.fusca)，最优选由SEQ ID No.28编码的脂质酰基转移酶。
适合本发明应用和/或本发明方法的脂质酰基转移酶可以包含以下任一氨基酸序列和/或由以下核苷酸序列编码：
a)核酸，其编码表现出脂质酰基转移酶活性和与SEQ ID No.16所示的多肽序列或与SEQ ID No.68所示的多肽序列具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的多肽；
b)(分离的)多肽，其包含SEQ ID No.16或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列(或由SEQ ID No.16或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列组成)，或包含与SEQ ID No.16或SEQ IDNo.68具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的氨基酸序列(或由与SEQID No.16或SEQ ID No.68具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的氨基酸序列组成)；
c)编码脂质酰基转移酶的核酸，所述核酸包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(或由SEQ ID No.49所示的核苷酸序列组成)，或包含与SEQ ID No.49所示的核苷酸序列具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的核苷酸序列(或由与SEQ ID No.49所示的核苷酸序列具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的核苷酸序列组成)；
d)核酸，所示核酸在中等或高严谨条件下与包含SEQ ID No.49所示核苷酸序列的核酸探针杂交，且编码表现出脂质酰基转移酶活性的多肽；
e)核酸，其是a)、c)或d)所指核酸序列的片段；或
f)多肽，其是b)所指多肽的片段。
用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是还可分离自链霉菌属，优选为阿维链霉菌(S.avermitis)，最优选由SEQ ID No.32编码的脂质酰基转移酶。用于本发明的来自链霉菌的其它可能的酶包括由SEQ ID No.5、6、9、10、11、12、13、14、31和33编码的那些酶。
用于本发明的酶也可以分离自棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选为C.efficiens，最优选由SEQ ID No.29编码。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ IDNo.37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或可以由SEQID No.36、39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列所编码。
在一个实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列选自由以下组成的组：
a)包含SEQ ID No.36所示的核苷酸序列的核酸；
b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.36所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是包含SEQ ID No.37所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或由SEQ ID No.39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列所编码。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.38、40、41、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，以用于本发明所述的应用。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.38、40或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列脂质酰基转移酶，以用于本发明所述的应用。
更优选地，在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.47所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.43或44所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.41所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以由选自以下组成的组的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.36所示核苷酸序列的核酸；
b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.36所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方式中，根据本发明的脂质酰基转移酶可以是可获自于，优选获自于链霉菌株L130或L131的脂质酰基转移酶，所述链霉菌株L130或L131由Danisco A/S ofLangebrogade 1,DK-1001Copenhagen K,Denmark根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在National Collection of Industrial,Marine and FoodBacteria(NCIMB)23St.Machar Street,Aberdeen Scotland,GB，保藏日为2004年6月25日，保藏号分别为NCIMB 41226和NCIMB 41227。
适合地，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是编码脂质酰基转移酶(SEQ ID No.16)的多核苷酸；或可以编码脂质酰基转移酶(SEQID No.16)的氨基酸序列。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是可使用AlignX(使用默认设置的VectorNTI的Clustal W成对比对算法)通过与L131(SEQ ID No.37)序列的比对而鉴定的氨基酸序列。
L131与来自灰色链霉菌(S.avermitilis)和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对说明了GDSx基序(L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守区突出标记在图42中。
与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No.37)比对时，可以鉴定出三个保守区，GDSx区、GANDY区和HTP区(更多细节请参见WO04/064987)。
与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No.37)比对时，
i)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是具有GDSx基序，更优选为选自GDSL或GDSY基序的GDSx基序的脂质酰基转移酶；和/或
ii)用于本发明任一方法和应用中的编码脂质酰基转移酶可以是具有GANDY区，更优选包含氨基GGNDx(更优选为GGNDA或GGNDL) 的GANDY区的脂质酰基转移酶；和/或
iii)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是优选具有HTP区的脂质酰基转移酶；
和优选地，
iv)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是优选具有GDSx或GDSY基序，和包含氨基GGNDx(优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY区，和HTP区(保守的组氨酸)的脂质酰基转移酶。
不受理论限制，可以利用UTH乳中天然存在的脂质酰基转移酶和卵磷脂的反应改变乳本身的组分的表面活性和/或可将其用于降低乳中胆固醇的量。
本文使用的脂质酰基转移酶可被称为甘油磷脂胆固醇酰基转移酶。换而言之，用于本发明应用的所述脂质酰基转移酶优选具有“水解”磷脂并且同时利用来自水解作用的游离脂肪酸使胆固醇酯化的能力，这发挥转移酶反应的功效(即酯交换和/或酯基转移反应)。
“水解”的程度可以表示为磷脂酰胆碱(PC)和/或磷脂酰乙醇胺(PE)分别转化为溶血PC(lyso-PC)或溶血PE(lyso-PE)的比例。通过PC至溶血PC的酶水解作用，改变了磷脂分子的亲水部分(极性头基团)和疏水部分(脂肪酸链)之间的比例。通过除去一个脂肪酸(饱和和/或不饱和脂肪酸)，使疏水部分减少，并由此使整个分子更亲水。此外，可以改变分子空间构象，其可以影响所述分子在分散中形成的相结构(例如胶束)以及与其它分子(例如乳蛋白)的相互作用。
已知溶血卵磷脂产物具有改善的乳化性质。利用高程度的酯交换和/或酯基转移作用，可能在比较性乳化试验中获得较小的油滴平均尺寸。
通过将胆固醇变为胆固醇-酯以及将PC和PE变为溶血PC和溶血PE(其与正常的PC/PE相比均具有较高的表面活性)，可以产生不含胆固醇且乳液稳定性改善的UHT乳产品。这对于主要缺陷之一与乳液稳定性低和乳油化率高相关的UHT乳生产，尤其是调味UHT乳的生产至关重要。
本文定义的脂质酰基转移酶的应用使乳中的颗粒较小，这是UHT乳的优点，而UHT乳中乳油化是非常常见的缺陷。
脂质酰基转移酶的功能是使胆固醇和磷脂转变为胆固醇-酯和溶血磷脂，从而产生两种与O/W乳液相关的具有表面活性性质的成分。现已发现，脂质酰基转移酶促使对乳油化的稳定性改善，并降低UHT乳中的胆固醇水平。因此，终产品将不包含胆固醇或胆固醇量显著降低，并且具有改善的乳液稳定性。
本发明的酶优选不是磷脂酶，如被归类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1或被归类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2。
脂质酰基转移酶变体
在优选的实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以是脂质酰基转移酶变体。
可以使用对磷脂的活性增加的变体，如对磷脂的水解活性增加和/或转移酶活性增加的变体，优选为对磷脂的转移酶活性增加的变体。
优选地，通过如上定义的脂质酰基转移酶的一个或多个氨基酸修饰来制备所述脂质酰基转移酶变体。
适合地，当用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以为脂质酰基转移酶变体的脂质酰基转移酶，在此情况中，所述酶的特征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一种或多种，且其中所述酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组或第7组(如WO2005/066347和下文所定义)限定的一个或多个氨基酸残基处包含任意一个或多个氨基酸修饰。
例如，脂质酰基转移酶变体可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组或第7组(如WO2005/066347和下文所定义)限定的一个或多个氨基酸残基处包含任意一个或多个氨基酸修饰，其中所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480结构模型的结构比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物(crystal structure coordinates)与如WO2005/066347和下文所定义的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对而获得的。
在另一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是脂质酰基转移酶变体，其可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2-图3)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如WO2005/066347和下文所定义的最佳匹配重叠(best fitoverlap)。
适合地，用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No. 34、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.33所示，但在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述组是通过与SEQ ID No.34的序列比对而鉴定出来的。
或者，所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33或SEQ ID No.35所示，并在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480的结构模型的结构比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物与如WO2005/066347和下文所教导的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对而获得的。
或者，所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33或SEQ ID No.35所示，但在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如WO2005/066347和下文所教导的最佳匹配重叠。
优选地，所述亲本酶是包含SEQ ID No.34和/或SEQ ID No.15和/或SEQ ID No.35所示氨基酸序列或与它们同源的酶。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示，但在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的任意一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰。
组的定义
第1组氨基酸：
第1组氨基酸(注意这些是图53和图54的1IVN中的氨基酸)
Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158
高度保守的基序，如GDSx和催化残基从第1组中取消选定(标有下划线的残基)。为了避免争议，第1组定义了在1IVN模型活性位点中的甘油中心碳原子以内的氨基酸残基。
第2组氨基酸：
第2组氨基酸(注意氨基酸的编号是指P10480成熟序列中的氨基酸)
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289和Val290。
第1组中所选残基与第2组的比较表
第3组氨基酸：
第3组氨基酸与第2组相同，但是是指杀鲑气单胞菌(SEQ ID No.4)的编码序列，即第3组中的氨基酸残基编号要大18，这反映了成熟蛋白(SEQ ID No.34)与包含信号序列的蛋白(SEQ ID No.25)中氨基酸编号之间的差异。
杀鲑气单胞菌GDSX(SEQ ID No.4)和嗜水气单胞菌GDSX(SEQ ID No.34)的成熟蛋白有五个氨基酸不同。它们是Thr3Ser、Gln182Lys、Glu309Ala、Ser310Asn和Gly318-，其中杀鲑气单胞菌的残基列在前面，而嗜水气单胞菌的残基列在后面。嗜水气单胞菌蛋白的长度只有317个氨基酸，且在第318位上缺少残基。与嗜水气单胞菌蛋白相比，杀鲑气单胞菌GDSX对极性脂(如半乳糖脂底物)具有相当高的活性。对全部五个氨基酸位置进行了位点扫描。
第4组氨基酸：
第4组氨基酸是S3、Q182、E309、S310和-318。
第5组氨基酸：
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。
第6组氨基酸：
第6组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318。
第6组中的氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.25)中的氨基酸残基，其它序列骨架上的相应氨基酸可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对来确定。
第7组氨基酸：
第7组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318、Y30X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y226X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y230X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、S18X(其中X选自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y)、D157X(其中X选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y)。
第7组中氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.25)中的氨基酸残基，其它序列骨架上的相应氨基酸可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对来确定。
适合地，与亲本酶相比，所述酶变体包含一种或多种以下氨基酸修饰：
S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T或G
E309Q、R或A，优选为Q或R
-318Y、H、S或Y，优选为Y。
优选地，GDSX基序的X是L。因此，优选所述亲本酶包含氨基酸基序GDSL。
适合地，所述第一亲本脂质酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列：SEQID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35。
适合地，所述第二相关脂质酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列：SEQID No.3、SEQ ID No.34、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35。
与所述亲本酶相比，所述酶变体必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方式中，与亲本酶相比，所述酶变体可以包含至少2个、优选为至少3个、优选为至少4个、优选为至少5个、优选为至少6个、优选为至少7个、优选为至少8个、优选为至少9个、优选为至少10个氨基酸修饰。
当在本文中提及具体的氨基酸残基时，可以从序列变体与SEQ ID No.34或SEQ IDNo.35所示的参考序列的比对获得编号。
一方面，优选酶变体包含一种或多种以下氨基酸取代：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W 或Y；和/或
S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；和/或
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
W111A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W 或Y；和/或
P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；和/或
S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W 或Y；和/或
A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选为K；和/或
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W 或Y；和/或
E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y。
此外或可选地，可以有一个或多个C末端延伸。优选地，所述附加的C末端延伸由一个或多个脂肪族氨基酸构成，优选为非极性氨基酸，更优选为I、L、V或G。因此，本发明进一步提供了包含以下C末端延伸中的一个或多个的酶变体：318I、318L、318V、318G。
优选的酶变体可以具有降低的对磷脂如磷脂酰胆碱(PC)的水解活性，还可具有升高的对磷脂的转移酶活性。
优选的酶变体可以具有升高的对磷脂如磷脂酰胆碱(PC)的转移酶活性，也可以升高的对磷脂的水解活性。
一个或多个以下残基的修饰可以产生对磷脂的绝对转移酶活性升高的酶变体：S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88、N87。
可以提供对磷脂的转移酶活性改善的酶变体的优选具体修饰可以选自以下一种或多种：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为N、E、K、R、A、P或M，最优选为S3A；
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K或C；
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为S310T、-318E；
E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为E309R、E、L、R或A；
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，优选为Y179D、T、E、R、N、V、K、Q或S，更优选为E、R、N、V、K或Q；
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W 或Y，优选为N215S、L、R或Y；
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为K22E、R、C或A；
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选为Q289R、E、G、P或N；
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为M23K、Q、L、G、T或S；
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为H180Q、R或K；
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为M209Q、S、R、A、N、Y、E、V或L；
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为L210R、A、V、S、T、I、W或M；
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y，优选为R211T；
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为P81G；
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，优选为V112C；
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选为N80R、G、N、D、P、T、E、V、A或G；
L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为L82N、S或E；
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N88C；
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N87M或G；
一个或多个以下残基的优选修饰产生对磷脂的绝对转移酶活性升高的酶变体：
S3N、R、A、G
M23K、Q、L、G、T、S
H180R
L82G
Y179E、R、N、V、K或Q
E309R、S、L或A
一个优选的修饰是N80D。特别地，当使用参考序列SEQ ID No.35作为骨架时更是如此。因此，参考序列可以为SEQ ID No.16。所述修饰可以与一个或多个其它修饰组合。因此，在本发明的优选实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.35，或与SEQ ID No.35具有75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高、更优选为98％或更高、或更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列。
如上指出，当在本文中提及具体氨基酸残基时，其编号是通过序列变体与SEQ IDNo.34或SEQ ID No.35所示的参考序列的比对获得的。
优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列的脂质，或包含与SEQ ID No.16或SEQ ID No.68具有70％或更高、75％或更高、优选为85％或更高、更优选为90％或更高、更优选为95％或更高、更优选为98％或更高、或更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列的脂质。该酶可以认为是酶变体。
出于本发明的目的，同一性的程度以相同序列元件(element)的数目为基础。根据本发明，可以通过本领域已知的计算机程序的方法(如Vector NTI 10(InvitrogenCorp.))来适当地确定氨基酸序列的同一性程度。对于成对比对，所用的评分优选为空位开放罚分为10.0、空位延伸罚分为0.1的BLOSUM62。
适合地，关于氨基酸序列的同一性程度，在至少20个连续的氨基酸内、优选为至少30个连续的氨基酸内、优选为至少40个连续的氨基酸内、优选为至少50个连续的氨基酸内、优选为至少60个连续的氨基酸内进行测定。
适合地，可以在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶和编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可获自于，优选获自于一种或多种以下属的生物：气单孢菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分支杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌、弯曲菌属、弧菌属、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属、念珠菌属、喜热裂孢菌属和棒状杆菌属。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶和编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可获自于，优选获自于一种或多种以下生物：嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分支杆菌、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、化脓性链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、Streptomyces thermosacchari、灰色链霉菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacteriumdehalogenans)、芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土霉菌(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母、褐色喜热裂孢菌和Corynebacterium efficiens。
一方面，优选用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可获自于，优选获自或来自于气单孢菌、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的一种或多种。
一方面，优选用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可获自于，优选获自或来自于气单孢菌、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中一种或多种的脂质酰基转移酶。
可以利用本文以下公开的实验对具有本发明的脂质酰基转移酶功能的酶进行常规鉴定：
测定转移酶活性的实验
优选通过从乳中的磷脂和/或脂质至胆固醇的酰基转移而形成的胆固醇酯相对于最初胆固醇的量，来计算转移酶的活性。
乳在40℃与酶或水(作为对照)温育30分钟。
通过溶剂萃取分离乳脂质，并通过GLC对所分离的乳脂质进行分析。
根据GLC分析，计算胆固醇(CHL)、胆固醇酯(CHLE)和游离脂肪酸(FFA)的量。
其中：
CHLE(0)＝Mol/l胆固醇酯(对照)
CHLE(t)＝Mol/l胆固醇酯(酶处理)
FFA(0)＝Mol/l游离的脂肪酸(对照)
FFA(t)＝Mol/l游离脂肪酸(酶处理)
可以根据以下进行GLC分析：
GLC分析
Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱仪，其配备有WCOT熔凝硅石柱12.5m×0.25mm ID×0.1μm膜厚度5％苯基-甲基-硅酮(CP Sil 8CB，来自Crompack)。
载气：氦。
注射器：PSSI冷分流注射(由最初温度50℃加热至385℃)，体积1.0μl。
检测器FID：395℃。
样品制备：将30mg样品溶解在含0.5mg/ml内标(十七烷)的9ml庚烷/吡啶(2:1)中。将300μl样品溶液转移到螺口瓶(crimp vial)中，加入300μl MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)，并在60℃反应20分钟。
计算：根据标准2(单-二-三甘油酯)测定单-二-三甘油酯和游离脂肪酸的响应因子，对于胆固醇、胆固醇棕榈酸酯和胆固醇硬脂酸酯，由纯的参考物质(称取10mg纯物质)测定响应因子。
使用该测试，本发明的脂质酰基转移酶是具有至少5％转移酶活性，优选至少10％转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％转移酶活性的脂质酰基转移酶。
本文使用的术语“转移酶”可以与术语“脂质酰基转移酶”互换。
适合地，本文定义的脂质酰基转移酶催化以下一种或多种反应：酯交换、酯基转移、醇解、水解。
术语“酯交换”表示酰基基团在脂质供体和脂质受体之间的酶催化转移，其中所述脂质供体不是游离的酰基基团。
本文使用的术语“酯基转移”表示酰基基团从脂质供体(除游离脂肪酸)向酰基受体(除水)的酶催化转移。
本文使用的术语“醇解”表示通过与醇ROH的反应对酸衍生物的共价键的酶切割，从而使一个产物与醇的H结合，另一个产物与醇的OR基团结合。
本文使用的术语“醇”表示包含羟基基团的烷基化合物。
本文使用的术语“水解”表示酰基基团从脂质向水分子的OH基团的酶催化转移。
本文使用的术语“没有增加或基本没有增加游离脂肪酸”表示，本发明的脂质酰基转移酶优选具有100％转移酶活性(即，将来自酰基供体的100％酰基基团转移到酰基受体上，而没有水解活性)；然而，所述酶可以将脂质酰基供体中存在的小于100％的酰基基团转移到酰基受体。在这种情况下，优选所述酰基转移酶活性占总酶活性的至少5％，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少98％。可以按照上述“转移酶活性试验”测定％转移酶活性(即以总酶活性的百分数表示的转移酶活性)。
在本发明的某些方面，本文使用的术语“基本没有增加游离脂肪酸”表示用本发明的脂质酰基转移酶处理的食用油中游离脂肪酸的量小于用除本发明的脂质酰基转移酶以外的酶处理的食用油中产生的游离脂肪酸的量，例如小于用常规磷脂酶，例如，LecitaseUltraTM(Novozymes A/S,Denmark)时产生的游离脂肪酸的量。
本文使用的术语“乳”可以包含来自动物或植物来源的乳。可能使用来自动物来源的乳，例如单独来自水牛(buffalo)、(传统)奶牛、绵羊、山羊等的乳或组合的乳。还可以使用诸如大豆乳的植物乳，通常与动物乳组合，其通常以低百分数(植物乳)，例如低于15％、或低于20％、或低于25％v/v使用。术语“乳”通常不包括干酪用乳和奶油。
当用于表示产品或组合物时，本文使用的术语“基本由……组成”优选表示所述产品或组合物可以由其它产品或组合物组成，但仅限于其最大浓度优选为10％，例如5％、例如3％、例如3％、例如2％或1％、或0.5％或0.1％时。
对于乳和/或奶油的酶修饰，例如其可以优选使用如低于约30℃的温度，适合地，例如低于20℃，适合地，例如低于10℃。适合地，可以使用1-30℃之间的温度，例如3-20℃之间，例如1-10℃之间。
本发明的酶可以与一种或多种其它合适的食品级酶一起使用。因此，除了本发明的酶外，向所述食品中加入至少一种额外的酶，这也属于本发明的范围。所述额外的酶包括淀粉降解酶，例如内切淀粉酶或外切淀粉酶、支链淀粉酶(pullulanases)、脱支酶，半纤维素酶，包括木聚糖酶、纤维素酶，氧化还原酶，例如过氧化物酶、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶，或者碳水化合物氧化酶，例如氧化麦芽糖的酶，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶，糖脂酶(glycolipases)，半乳糖脂酶(galactolipases)和蛋白酶。
在一个实施方式中，所述酶可以是Dairy HOXTM，其作为去氧剂以延长干酪货架期，同时在比萨烤箱中提供褐变控制。因此，在本发明的一个方面，涉及能够还原食品中的美拉德反应的酶(参见WO02/39828，其通过引用并入本文)在制备本发明的食物材料和/或食品中的应用，所述食品如奶产品(例如干酪)，其中所述酶优选为麦芽糖氧化酶，例如碳水化合物氧化酶，葡萄糖氧化酶和/或己糖氧化酶。
在一个优选的实施方式中，所述脂质酰基转移酶与具有一种或多种以下脂肪酶活性的脂肪酶组合使用：甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.26)，三酰基甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。适合地，脂肪分解酶是本领域熟知的，举例而言，包括以下脂肪分解酶：F和/或ULTRA(Novozymes A/S,Denmark)，磷脂酶A2(例如来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L的磷脂酶A2，来自Genecor的LIPOMAXTM)，(Novozymes A/S,Denmark)，WO03/97835、EP 0 977 869或EP 1 193 314中公开的磷脂酶。本发明所定义的脂质酰基转移酶和脂肪酶的这种组合可能在生面产品或焙烤产品或在精细食物产品(例如蛋糕和甜食)中特别优选。
在一些实施方式中，将脂质酰基转移酶和脂肪分解酶组合使用也可能是有益的，所述脂肪分解酶例如是从小牛、羔羊、仔胃(kid stomach)制备的凝乳酶膏(rennetpaste)，或者Palatase A750L(Novo)、Palatase M200L(Novo)、Palatase M1000(Novo)或Piccantase A(DSM)，以及来自DSM(K,KL,L&C)的动物源Piccantase或Lipomod 187、Lipomod 338(Biocatalysts)。通常这些脂肪酶用在干酪的生产中，从而产生干酪调味剂。这些脂肪酶还可以用于产生经过酶修饰的食品，例如奶制品(例如干酪)，尤其当所述奶制品由乳脂(butterfat)组成，由乳脂产生或者包含乳脂时。所述脂质酰基转移酶与一种或多种所述脂肪酶的组合可以对奶制品(例如干酪)的风味产生有益影响。
脂肪酶与本发明酶的组合使用例如可能需要积聚一些游离脂肪酸的情况中能特别有益，例如在游离脂肪酸可以产生期望的风味的干酪中，或者在精细食品的制备中。本领域技术人员可以按比例组合脂肪分解酶(例如F和/或ULTRA(Novozymes A/S,Denmark))，磷脂酶A2(例如来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L的磷脂酶A2，来自Genecor 的LIPOMAXTM)，(Novozymes A/S,Denmark)，WO03/97835、EP0 977 869或EP 1 193,314中公开的脂肪酶以及本发明的脂质酰基转移酶，从而产生预期比例的水解活性/转移酶活性，由此在食品中产生优选的技术效果或技术效果的组合(例如，在“技术效果”部分列出的那些)。
组合使用脂质酰基转移酶和磷脂酶(例如磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D)也可能是有益的。
所述组合使用可以依次或同时进行，例如脂质酰基转移酶处理可以在所述额外酶处理前或者处理过程中进行。或者，所述额外酶处理也可以在脂质酰基转移酶处理之前或处理过程中进行。
在依次酶处理的情况下，在一些实施方式中，在利用第二个(和/或第三个等)酶处理前，例如通过失活或者通过使用固定化酶除去所使用的第一个酶可能是有益的。
转录后和翻译后修饰
适合地，本发明的脂质酰基转移酶可以由本文公开的任一个核苷酸序列编码。
根据所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。设想用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶包括已经接受转录后和/或翻译后修饰的脂质酰基转移酶。
仅作为举例而言，本文SEQ ID No.49(参见图57)所示的核苷酸序列在宿主细胞(例如地衣芽孢杆菌)中的表达引起转录后和/或翻译后修饰，从而产生本文SEQ ID No.68(参见图73)所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.68与SEQ ID No.16(本文图1所示)相同，除了SEQ ID No.68已将经历了翻译后和/或转录后修饰从而除去38个氨基酸。
分离的
一方面，所述脂质酰基转移酶是回收的/分离的脂质酰基转移酶。因此，所制备的脂质酰基转移酶可以是分离的形式。
另一方面，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是分离的形式。
术语“分离的(或分离)”是指序列或蛋白至少基本不包含至少一种其它成分，这些成分原本与所述序列或蛋白天然结合，并且原本在一起发现。
纯化的
一方面，所述脂质酰基转移酶可以是纯化的形式。
另一方面，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是纯化的形式。
术语“纯化的”是指序列处于相对纯的状态，如至少约51％纯、或至少约75％纯、或至少约80％纯、或至少约90％纯、或至少约95％纯、或至少约98％纯。
克隆编码本发明多肽的核苷酸序列
编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以从产生所述多肽的任何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。
例如，可以使用产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成经标记的寡核苷酸探针，并将其用于从由该生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。或者，也可以使用包含与另一已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用严谨性较低的杂交和清洗条件。
或者，可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，使用所得的基因组DNA文库转化酶为阴性的细菌，并随后将转化的细菌涂布在包含被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此可以鉴定出表达所述多肽的克隆。
再者，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22,p 1859-1869描述的亚磷酰胺法，或Matthes等(1984)EMBO J.3,p 801-805描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或cDNA的片段(根据需要)而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4,683,202或Saiki R K等(Science(1988)239,pp 487-491)中所述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成物或重组物，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。
本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。
在优选的实施方式中，编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列本身不涵盖在其天然环境中存在的天然核苷酸序列，此时该序列与同处于其天然环境中其天然结合序列相连接。为了便于参考，我们将此优选实施方式称为“非天然核苷酸序列”。由此，术语“天然核苷酸序列”是指与处于其天然环境中并与其天然结合的完整启动子(同处于其天然环境中)可操作地连接的完整核苷酸序列。因此，可以利用核苷酸序列在其天然生物中表达本发明的多肽，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中与其天然结合的启动子的控制。
优选地，所述多肽不是天然多肽。由此，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中并已经由其天然核苷酸序列表达的完整多肽。
通常，使用重组DNA技术(即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一个可选实施方式中，可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(参见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码假定酶的核苷酸序列后，可能需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。
可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核苷酸序列。
Morinaga等(Biotechnology(1984)2,p646-649)中公开了适合的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989),180,p 147-151)中描述了向编码酶的核苷酸序列中引入突变的另一种方法。
除了如上文所述的定点诱变，可以随机引入突变，如使用商品试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒。EP 0 583 265提到基于PCR的诱变的优化方法，其也可以结合使用DNA突变类似物，如EP0 866 796中所述的那些。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。
获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。适合进行“改组”的方法可以参见EP0 752 008、EP1 138 763、EP1 103 606。改组也可以与如US 6,180,406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA诱变相结合。
因此，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(in silico)和核酸外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(参见WO 00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但却具有很低的氨基酸序列同源性。
此外，如在非限定性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型或其它突变体或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。
应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体，并能够产生不可预测的但有益的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例包括但不限于以下的一种或多种：优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。
使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
适合地，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移酶变体，即当与亲本酶比较时，所述脂质酰基转移酶可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或添加。变体酶与亲本酶保持至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。适合的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选地，亲本酶与pfam00657共有序列相比对。
在优选的实施方式中，脂质酰基转移酶变体保留或加入了在GDSx、GANDY和HPT区中发现的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。
可以使用分子进化工具使酶(如在含水环境中没有或具有低脂质酰基转移酶活性的脂肪酶)突变，以引入或增强转移酶活性，由此生产适合用于本发明的组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移酶变体，与亲本酶相比，该变体对极性脂质(优选为磷脂和/或糖脂)具有增强的酶活性。优选地，所述变体还可以对溶血极性脂质(lyso polar lipid)具有低活性或无活性。对极性脂质、磷脂和/或糖脂的活性增强可能是由于水解和/或转移酶活性或二者组合的结果。
与亲本酶相比，所述脂质酰基转移酶变体可以对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯具有降低的活性。
适合地，所述酶变体可以没有对甘油三酯、和/或甘油单酯和/或甘油二酯的活性。
或者，所述酶变体可以对甘油三酯具有提高的活性，和/或也对以下的一种或多种具有提高的活性：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。
脂质酰基转移酶变体是已知的，且一种或多种所述变体可以适用于本发明的方法和应用，和/或本发明的酶组合物。仅举例来说，根据本发明可以使用以下文献中阐述的脂质酰基转移酶变体：Hilton&Buckley J Biol.Chem. 1991Jan 15:266(2):997-1000；Robertson等J.Biol.Chem.1994Jan 21；269(3):2146-50；Brumlik等J.Bacteriol1996Apr；178(7):2060-4；Peelman等Protein Sci.1998Mar；7(3):587-99。
氨基酸序列
本发明还涵盖由用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些实例中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。
适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。
一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下：
可以将纯化的多肽冻干，并将100μg的冻干原料溶解于8M尿素和0.4M碳酸氢铵(pH8.4)的50μl混合物中。在覆盖氮气并加入5μl 45mM二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50℃变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以加入5μl 100mM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。
可以向以上反应混合物中加入135μl水和含5μg内切蛋白酶Lys-C的5μl水溶液，并在37℃氮气保护下消化24小时。
可以使用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18柱(0.46x15cm；10μm；The Separation Group,California,USA)上通过反相HPLC分离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新层析。可以使用Applied Biosystems 476A测序仪，根据生产商的说明书(AppliedBiosystems,California,USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。
序列同一性或序列同源性
在此，术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。
在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少75％、85％或90％同一性，优选为至少95％或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选同源性表达序列的同一性。
在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列)有至少75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选为至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选同源性表达序列的同一性。
可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。
可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与其它序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无缺口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。
虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如在其它方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能导致在进行整体比对时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化而实现。
然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有更多缺口的序列比对具有更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分”(Affinegap cost)，即对缺口的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将无疑产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此，最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等1999Short Protocols inMolecular Biology,4th Ed,Chapter 18)和FASTA(Altschul等1990J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等1999,7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI程序。也可以将称为BLAST 2Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMSMicrobiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
虽然可以根据同一性来测定最终的同源性％，但是比对方法本身通常不是基于全是或全非的成对比较。作为代替，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarityscore matrix)，基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为BLOSUM62矩阵(BLAST程序套的默认矩阵)。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者也可能使用所提供的自定义符号比较表(详见用户手册)。对于一些应用，优选使用VectorNTI软件包的默认值。
或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988),Gene 73(1),237-244)类似的算法的Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算同源性％。
一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性％，优选为序列同一性％。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。
如果在测定序列同一性时使用缺口罚分，随后优选使用以下参数进行成对比对：
在一个实施方式中，优选使用具有以上定义的缺口罚分和缺口延伸设定的CLUSTAL来测定核苷酸序列的序列同一性。
适合地，在至少20个连续的核苷酸中、优选为在至少30个连续的核苷酸中、优选为在至少40个连续的核苷酸中、优选为在至少50个连续的核苷酸中、优选为在至少60个连续的核苷酸中、优选为在至少100连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定核苷酸序列中的同一性程度。
在一个实施方式中，本发明氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算机程序的方法，如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)来适当地测定。对于成对比对，所用的矩阵优选为缺口开口罚分为10.0且缺口延伸罚分为0.1的BLOSUM62。
适合地，在至少20个连续的氨基酸中、优选为在至少30个连续的氨基酸中、优选为在至少40个连续的氨基酸中、优选为在至少50个连续的氨基酸中、优选为在至少60个连续的氨基酸中测定氨基酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的次要结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选为在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代：
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或涉及非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
也可以使用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间隔子基团，除氨基酸间隔子如甘氨酸或β-丙氨酸残基外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等,PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中相同的编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物，特别是在哺乳动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，且所述同源物或其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一个序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。例如可以通过比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性可低于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。
或者，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码序列的改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。可能需要其它序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)制备引物，如PCR引物，用于可选扩增反应的引物；探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显色标记物标记的探针；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段的长度可以是至少15个、优选为至少20个、如至少25个、30个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语多核苷酸之内。
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。
通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交或与其互补序列杂交的序列的应用。
本文所用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。
本发明还涵盖所述核苷酸序列的应用，所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的目标序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel (1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol.152,AcademicPress,San Diego CA)中所教导，且给出了如下文所解释的定义的“严谨性”。
最高严谨性通常出现在约(Tm-5)℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨性在比Tm以下约5℃至10℃；中等严谨性在Tm以下约10℃至20℃；且低严谨性出现在Tm以下约20℃至25℃。如本领域技术人员的理解，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列的应用。
更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15MNaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列的应用。
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的应用。
在优选的方面，本发明涵盖能够在严谨性条件(如50℃和0.2xSSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
在更优选的方面，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1xSSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
多肽的表达
可以将用于本发明的核苷酸序列或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制并以多肽形式表达所述核苷酸序列。可以使用包控制序列来控制表达，所述控制序列包括含启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核生物的启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异性启动子。也可以使用包含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
根据所用的序列和/或载体，通过由宿主重组细胞表达核苷酸序列而产生的多肽可以被分泌，或被包含在细胞内。编码序列经设计可以具有信号序列，该信号序列指导编码序列物质分泌通过特定的原核生物或真核细胞膜。
构建体
术语“构建体”，与术语如“结合物(或连接物)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，其包含依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。本发明中的相关术语“融合”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，这些术语不涵盖编码所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合(此时这两者均处于其天然环境中)。
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。
对于一些应用，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。
生物
与本发明有关的术语“生物”包括可包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何生物。
与本发明有关的术语“转基因生物”包括任何包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的生物，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物内表达。优选核苷酸序列被引入到生物的基因组中。
术语“转基因生物”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。
因此，本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或组合的生物：编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定的细胞或其产物。例如，所述转基因生物还可以包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子原本并不与脂质酰基转移酶编码基因相连。
宿主细胞/生物的转化
所述宿主微生物可以是原核或真核生物。
合适的原核宿主的实例包括细菌，例如大肠杆菌和地衣芽孢杆菌，优选地衣芽孢杆菌。
原核宿主的转化的教导在本领域中有详细的记载，例如参见Sambrook 等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,1989,Cold Spring HarborLaboratory Press)。如果使用原核宿主，则在转化前需要适当地修饰核苷酸序列，例如去除内含子。
在另一个实施方式中，所示转基因生物可以为酵母。
可以利用本领域已知的多种方法转化丝状真菌，例如包括原生质体形成和原生质体转化，然后以已知的方式重建细胞壁的方法。在EP 0 238 023中公开了曲霉作为宿主微生物的应用。
另一种宿主生物可以为植物。用于转化植物的常用技术的概述可见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol[1991]42:205-225)和Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。关于植物转化的其它教导可见于EP-A-0449375。
以下部分为关于真菌、酵母和植物转化的一般教导。
转化的真菌
宿主生物可以为真菌，例如丝状真菌。此类宿主的合适实例包括属于嗜热菌属(Thermomyces)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属、青霉属(Penicillium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)和木霉属(Trichoderma)等的任何成员。
关于转化丝状真菌教导的概述见于US-A-5741665，其中声称用于丝状真菌转化以及真菌培养的标准技术是本领域所熟知的。应用于链孢霉(N.crassa)的技术的研究进展见于，例如Davis and de Serres,Methods Enzymol(1971)17A:79-143。
关于丝状真菌的进一步教导的概述见于US-A-5674707。
一方面，所述宿主生物可以为曲霉属，例如黑曲霉。
本发明的转基因曲霉属还可以通过以下制备，例如Turner G.1994(Vectors forgenetic manipulation.In:Martinelli S.D.,Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus:50years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam1994.pp.641-666)的教导。
丝状真菌的基因表达的综述见于Punt等.(2002)Trends Biotechnol 2002May；20(5):200-6,Archer&Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4):273-306。转化的酵母
在另一个实施方式中，所示转基因生物可以为酵母。
酵母中异源基因表达的原则的综述见于，例如Methods MoI Biol(1995),49:341-54,and Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5):554-60。
在这一点上，酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(2000 24(1):45-66)可用作异源基因表达的载体。
在酿酒酵母中的异源基因表达和基因产物的分泌的原则的综述见于EHinchcliffe E Kenny(1993,"Yeast as a vehicle for the expression ofheterologous genes",Yeasts,VoI 5,Anthony H Rose and J Stuart Harrison,eds,2ndedition,Academic Press Ltd.)。
对于酵母的转染，已经开发出了多个转染方法。例如，本发明的转基因酵母可以根据以下教导制备：Hinnen等,(1978,Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA 75,1929)；Beggs,J D(1978,Nature,London,275,104)；和Ito,H et a/(1983,J Bacteriology 153,163-168)。
可以利用各种筛选标记物筛选转化的酵母细胞，例如营养缺陷型标记物、显性抗生素抗性标记物。
合适的酵母宿主生物可以选自在生物技术上相关的酵母种，例如但不限于选自毕赤酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowinia)、酵母菌(包括酿酒酵母)或裂殖酵母菌(包括粟酒裂殖酵母)的酵母种。
甲醇营养型酵母种的菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物。
在一个实施方式中，所述宿主生物可以为汉逊酵母种，例如汉森酵母(H.polymorpha)(如WO01/39544中的阐述)。
转化的植物/植物细胞
适合用于本发明的宿主生物可以为植物。常用技术的综述可见于以下文献：Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mo/β/o/[1991]42:205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)，或者WO 01/16308。转基因植物可以产生，例如水平提高的植物固醇酯和植物甾烷醇酯。
因此，本发明还涉及产生具有增强水平的植物固醇酯和植物甾烷醇酯的转基因植物的方法，其包括以下步骤：利用本文定义的脂质酰基转移酶(尤其是利用包含本文定义的脂质酰基转移酶的表达载体或构建体)转化植物细胞，和由转化的植物细胞培养出植物。
分泌
通常，期望表达宿主将多肽分泌到培养基中，由此可以更容易地回收酶。根据本发明，可以基于所需的表达宿主来选择分泌前导序列。本发明中也可以使用杂合信号序列。
原本不与编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列连接的分泌前导序列的典型实例为那些源于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸两种形式，如来自曲霉菌属)、a-因子基因(酵母，如酵母属、克鲁维酵母和汉逊酵母)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的序列。
检测
本领域已知多种用于检测和测定氨基酸序列表达的操作方法。实例包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。
本领域技术人员已知多种标记物和结合技术，并可以将其用于各种核酸和氨基酸分析。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ)、Promega(Madison,WI)和USBiochemical Corp(Cleveland,OH)为这些方法提供商业试剂盒和操作说明。
适合的报告分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂，以及底物、辅助因子、抑制剂和磁性粒子等。教导这些标记物应用的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如US-A-4,816,567中所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
用于本发明的脂质酰基转移酶可以作为融合蛋白制备，例如以便有助于其提取和纯化。融合蛋白配偶体(partner)的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以去除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。
Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5):501-6已经对大肠杆菌中的基因融合表达系统进行了综述。
具有如本文定义的特定性质的多肽的氨基酸序列可以与非天然序列连接以编码融合蛋白。例如，对于为获得能够影响物质活性的试剂而进行的肽库筛选，其可用于编码表达可被商购抗体所识别的非天然表位的嵌合体。
下文将参照以下附图和实施例，仅以举例的方式描述本发明。
附图说明
图1显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，该突变体具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)(SEQ ID 16)；
图2显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQID No.1)；
图3显示了来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)；
图4显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(P10480；GI:121051)；
图5显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(AAG098404；GI:9964017)；
图6显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.5)(Genbank登录号NP_631558)；
图7显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.6)(Genbank登录号CAC42140)；
图8显示了从生物酿酒酵母获得的氨基酸序列(SEQ ID No.7)(Genbank登录号P41734)；
图9显示了从生物雷尔氏菌属获得的氨基酸序列(SEQ ID No.8)(Genbank登录号AL646052)；
图10显示了SEQ ID No.9。Scoe1NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI:4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图11显示了如SEQ ID No.10所示的氨基酸。Scoe2NCBI蛋白登录号CAC01477.1GI:9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图12显示了氨基酸序列(SEQ ID No.11)。Scoe3NCBI蛋白登录号CAB88833.1GI:7635996的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图13显示了氨基酸序列(SEQ ID No.12)。Scoe4NCBI蛋白登录号CAB89450.1GI:7672261的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图14显示了氨基酸序列(SEQ ID No.13)。Scoe5NCBI蛋白登录号CAB62724.1GI:6562793的推定的脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图15显示了氨基酸序列(SEQ ID No.14)。Srim1NCBI蛋白登录号AAK84028.1GI:15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图16显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.Salmonicida)(ATCC#14174)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.15)；
图17显示了SEQ ID No.19。Scoe1NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI:4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图18显示了用于诱变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.25)。下划线的氨基酸为木聚糖酶信号肽；
图19显示了来自链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.26)；
图20显示了来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.27)；
图21显示了来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.28)；
图22显示了来自Corynebacterium efficiens GDSx 300个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.29)；
图23显示了来自Novosphingobium aromaticivorans GDSx 284个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.30)；
图24显示了来自天蓝色链霉菌GDSx 269个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQID No.31)；
图25显示了来自灰色链霉菌\GDSx 269个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQID No.32)；
图26显示了来自链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.33)；
图27显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.34)(P10480；GI:121051)(注意，这是成熟序列)；
图28显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(SEQID No.35)(注意，这是成熟序列)；
图29显示了来自Streptomyces thermosacchari的核苷酸序列(SEQ ID No.36)；
图30显示了来自Streptomyces thermosacchari的氨基酸序列(SEQ ID No.37)；
图31显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx 548个氨基酸的氨基酸序列(SEQ IDNo.38)；
图32显示了来自褐色喜热裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No.39)；
图33显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.40)；
图34显示了来自Corynebacterium efficiens/GDSx 300个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.41)；
图35显示了来自Corynebacterium efficiens的核苷酸序列(SEQ ID No.42)；
图36显示了来自天蓝色链霉菌/GDSx 268个氨基酸的氨基酸序列(SEQID No.43)；
图37显示了来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.44)；
图38显示了来自灰色链霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No.45)；
图39显示了来自灰色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.46)；
图40显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.47)；
图41显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的核苷酸序列(SEQ ID No.48)；
图42显示了L131与来自灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对,说明了GDSx基序(在L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中均为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守部分均被突出标记；
图43显示了来自近平滑假丝酵母脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.17)；
图44显示了来自近平滑假丝酵母脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.18)；
图45显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的带状显示图。此图使用Deep View Swiss-PDB观测器制作。
图46显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的侧视图(使用Deep ViewSwiss-PDB观测器制作)，黑色部分为活性位点甘油以内的残基。
图47显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的俯视图(使用Deep ViewSwiss-PDB观测器制作)，黑色部分为活性位点甘油以内的残基。
图48显示了比对1；
图49显示了比对2；
图50和51显示了1IVN与P10480的比对(P10480为嗜水气单胞菌酶数据库序列)，此比对从PFAM数据库获得并用在模型构建过程中；和
图52显示了其中P10480为嗜水气单胞菌数据库序列的比对。此序列用于模型构建和位点选择。注意绘制出了完整的蛋白(SEQ ID No.25)，成熟蛋白(等价于SEQ ID No.34)起始于第19位残基。A.sal为杀鲑气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.4)，A.hyd为嗜水气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQID No.34)。所列序列间的差异位置在共有序列中用*表示。
图53显示了在实施例1中使用的基因构建体；
图54显示了在实施例1中使用的密码子优化的基因构建体(no.052907)；和
图55显示了包含LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入物的序列，下划线处为-35框和-10框；
图56显示了在三丁酸甘油酯琼脂上于37℃生长48小时后的BML780-KLM3’CAP50(包含SEQ ID No.16–上面的菌落)和BML780(空宿主菌株–下面的菌落)。
图57显示了来自杀鲑气单胞菌的包含信号序列(preLAT-从第1位至第87 位)的核苷酸序列(SEQ ID No.49)；
图58显示了从生物嗜水气单胞菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.50)；
图59显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.51)；
图60显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.52)(Genbank登录号NC_003888.1:8327480..8328367)；
图61显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.53)(Genbank登录号AL939131.1:265480..266367)；
图62显示了从生物灰色链霉菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.54)(Genbank登录号Z75034)；
图63显示了从雷尔氏菌生物获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.55)；
图64显示了如SEQ ID No.56所示的核苷酸序列，其编码NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI:4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图65显示了如SEQ ID No.57所示的核苷酸序列，其编码Scoe2，NCBI蛋白登录号CAC01477.1GI:9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图66显示了如SEQ ID No.58所示的核苷酸序列，其编码Scoe3，NCBI蛋白登录号CAB88833.1GI:7635996的推定分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图67显示了如SEQ ID No.59所示的核苷酸序列，其编码Scoe4，NCBI蛋白登录号CAB89450.1GI:7672261的推定分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图68显示了如SEQ ID No.60所示的核苷酸序列，其编码Scoe5，NCBI蛋白登录号CAB62724.1GI:6562793的推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图69显示了如SEQ ID No.61所示的核苷酸序列，其编码Srim1，NCBI蛋白登录号AAK84028.1GI:15082088GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图70显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.62)；
图71显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC#14174)的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.63)；
图72显示了来自嗜水气单胞菌的编码包含木聚糖酶信号肽的酶的核苷酸序列(SEQ ID No.24)；
图73显示了具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)的突变的嗜水气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(本文显示为SEQ ID No.16)，和经过翻译后修饰的氨基酸序列(SEQ ID No.68)——SEQ ID No.68的第235位和236位氨基酸残基在翻译后修饰后并没有共价连接，所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥连接在一起。SEQ ID No.68中的第236位氨基酸对应于本文所示的SEQ ID No.16中的第274位氨基酸残基；
图74显示了上部的5mm的Turbiscan测量；
图75显示了底面的5mm的Turbiscan测量；
图76显示了巴氏灭菌乳12983-1-11(对照)、12983-1-12(经酶处理)和UHT乳12983-1-13(对照)、12983-1-14(经酶处理)的表面张力；
图77显示了不含胆固醇和胆固醇酯的乳的气相色谱测量，11和12为巴氏灭菌乳，13和14为UHT乳，样品12和14已由KLM3在5℃酶处理20小时。在比较分析中包含来自ArIa的可商购UHT乳；
图78显示了所提取的溶解在CHCl3:MeOH(2:1)中的巴氏灭菌(90℃)和UHT(142℃)乳脂质的HPTLC结果。标准品(Std)16含有溶解在CHCl3:MeOH(2:1)中的SpectraLipid SoyLecithin Mix Standard(No.SLM43)；
图79显示了含有KLM3的巧克力乳((DK 14636-2-3)的Lumifugation(稳定性分析仪分析)结果；
图80显示了不含KLM3的巧克力乳(DK 14636-2-4)的Lumifugation结果；
图81显示了澄清(％整体透射(transmission))；
图82显示了在15％透射时界面追踪(即监测澄清界面的移动)的结果；和
图83显示了在50％透射时界面追踪(即监测澄清界面的移动)的结果。
实施例1：地衣芽孢杆菌中KLM3'的表达
在地衣芽孢杆菌中将编码脂质酰基转移酶(SEQ.ID No.16，下文称为KLM3')的核苷酸序列(SEQ ID No.49)与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)的信号肽一起作为融合蛋白表达(参见图53和54)。为了优化在芽孢杆菌中的表达，从Geneart(Geneart AG，德国雷根斯堡)订购了经密码子优化的基因构建体(no.052907)。
构建体No.052907包含位于LAT-KLM3’前体基因之前的不完全LAT启动子(仅-10序列)和位于LAT-KLM3’前体基因下游的LAT转录(Tlat)(参见图53和55)。为了构建包含5’末端侧翼具有完全LAT启动子、3’末端侧翼具有LAT终止子的LAT-KLM3’前体基因的XhoI片段，以Plat5XhoI_FW和EBS2XhoI_RV为引物并以基因构建体052907为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增。
Plat5XhoI_FW:
ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg
EBS2XhoI_RV:tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
根据生产商的说明书(退火温度55℃)使用Phusion高保真度DNA聚合酶(Finnzymes OY，芬兰埃斯波)在热循环仪进行PCR。
根据生产商的说明书(Invitrogen,Carlsbad,Calif.USA)，使用限制性酶XhoI消化所得PCR片段，并使用T4DNA连接酶将其连接到经XhoI消化的pICatH中。
如美国专利申请US20020182734(国际公布WO 02/14490)所述，将连接混合物转化进入枯草芽孢杆菌株SC6.1。通过DNA测序确定包含LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入物的序列(BaseClear，荷兰莱顿)，并将正确质粒克隆之一命名为pICatH-KLM3’(ori1)(图 53)。在许可的温度(37℃)下将pICatH-KLM3’(ori1)转化进入地衣芽孢杆菌株BML780(BRA7和BML612的衍生物，参见WO2005111203)。
选择一个新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性(CmR)的转化株并将其命名为BML780(plCatH-KLM3’(ori1))。通过在非许可温度(50℃)下、于含有5μg/ml氯霉素的培养基中培养菌株，使BML780(plCatH-KLM3’(ori1))中的质粒整合到地衣芽孢杆菌基因组的catH区中。选择一个CmR抗性克隆，并将其命名为BML780-plCatH-KLM3’(ori1)。再次在许可温度、没有抗生素的情况下培养BML780-plCatH-KLM3’(ori1)数代以使载体序列环出(loop-out)，随后选择一个对新霉素敏感(neoS)的CmR克隆。在此克隆中，染色体上的plCatH载体序列被切除(包括新霉素抗性基因)，并只留下catH-LATKLM3’盒。随后，通过在氯霉素浓度增加的培养基中/上培养菌株来扩增染色体上的catH-LATKLM3’盒。在扩增数轮后，选择一个克隆(抗50μg/ml氯霉素)，并将其命名为BML780-KLM3’CAP50。为了确定KLM3’表达，使BML780-KLM3’CAP50和BML780(空宿主菌株)在添加有1％三丁酸甘油酯的Heart Infusion(Bacto)琼脂培养板上于37℃下培养48小时。在BML780-KLM3’CAP50菌落周围明显可见澄清的区域(指示脂质酰基转移酶活性)，而宿主菌株BML780周围则不可见(参见图56)。此结果显示在地衣芽孢杆菌株BML780-KLM3’CAP50中表达了大量的KLM3’，且这些KLM3’分子是有功能的。
比较例1
载体构建体
所述质粒构建体为pCS32new N80D，其为携带有第80位氨基酸由Asn取代成Asp的成熟形式天然杀鲑气单胞菌甘油磷酸酯-胆固醇酰基转移酶(KLM3')的编码序列的pCCmini衍生物，所述编码序列在p32启动子的控制下并具有CGTase信号序列。
用于表达的宿主菌株为枯草芽孢杆菌OS21ΔAprE菌株。
以用酯化胆固醇％表示的转移酶活性来计算表达水平，在PC(TPC)为供体和胆固醇为受体分子的反应中，根据参比样品中游离胆固醇和酶样品中游离胆固醇的差值来计算酯化胆固醇％。
培养条件
将单一菌落接种在添加有50mg/l卡那霉素的5ml LB肉汤培养基(酪蛋白酶解物，10g/l；低钠酵母提取物，5g/l；氯化钠，5g/l；惰性制片助剂(Inert tableting aid)，2g/l)中，并于205rpm、30℃温育6小时。将0.7ml此培养物接种到添加有50mg/l卡那霉素和高麦芽糖淀粉水解物溶液(60g/l)的50ml SAS培养基(K2HPO4，10g/l；MOPS(3-吗啡啉丙磺酸)，40g/l；氯化钠，5g/l；消泡剂(Sin 260)，5滴/l；脱脂豆粉，20g/l；Biospringer 106(100％dwYE)，20g/l)中。在30℃、180rmp下继续温育40小时，随后以19000rpm离心30分钟来分离培养物上清液。将上清液转移到清洁试管并直接用于转移酶活性测定。
底物的制备和酶促反应
以9：1的比例称量PC(Avanti Polar Lipids#441601)和胆固醇(Sigma C8503)，将其溶解在氯仿中，并蒸发至干。
通过将3％PC:胆固醇(9:1)分散到50mM HEPES缓冲液(pH 7)中来制备底物。
将0.250ml底物溶液转移到带有螺纹盖的3ml玻璃试管中。加入0.025ml培养物上清液并将混合物在40℃下温育2小时。另使用水代替酶来制备参比样品。将反应混合物在沸水浴中加热10分钟来终止酶反应。进行胆固醇试验分析前向反应混合物中加入2ml 99％的乙醇。
胆固醇试验
将100μl底物在37℃下温育5分钟，随后加入5μl酶反应样品并混合，其中所述底物为含有1.4U/ml胆固醇氧化酶(SERVA Electrophoresis GmbH cat.No 17109)、0.4mg/mlABTS(Sigma A-1888)、6U/ml过氧化物酶(Sigma 6782)的0.1M Tris-HCl(pH 6.6)和0.5％Triton X-100(Sigma X-100)溶液。将反应混合物继续温育5分钟并测量OD405。根据对含有0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.20mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml和0mg/ml胆固醇的99％EtOH溶液的胆固醇标准溶液的分析，计算胆固醇的含量。
结果
此表显示了8个单独表达培养物的平均值
实施例2：乳液稳定性，UHT乳中胆固醇的清除
通过比较在鲜乳和再制乳(recombined milk)基础上产生的普通UHT乳和调味UHT乳中的结果，本文SEQ ID No.68所示的脂质酰基转移酶(下文称为“KLM3”)用于UHT乳中磷脂和胆固醇之间的酯交换和/或酯基转移反应时，具有改善乳液稳定性的作用。
为了避免引起疑问，再制乳为乳的通用术语，其由基于原生乳的固体组分与水混合而产生，并经过某种方式加工从而产生具有与所述原生乳类似特性的乳。
UHT乳和奶油中KLM3的测试
所述样品(再制乳)在奶制品试验工场进行如下加工：
试验(批制备)
1.–使于混合罐中的水/乳加热至40℃，并加入酶
2.-向水中加入脱脂乳粉、糖、其它干燥组分，并保持30分钟
3.-在70℃熔化乳脂肪(butter oil)
4.-向熔化的乳脂肪中加入稳定剂/乳化剂
5.-向乳中加入乳脂肪、稳定剂/乳化剂
6.-加入调味剂
7.-在silverson上中速预混合1分钟
8.-在桶中除气(dearate)约30分钟
所述鲜乳进行步骤1、2、6、7和8。
UHT-(PHE)
9.-预热至90℃(在保温池中放置30秒)
10.-在142℃间接加热3秒
11.-在200bar、75℃进行之后的均质化(downstream homogenisation)
12.-冷却至15℃
13.-无菌灌装
用于所述试验的组分为商购的全乳和/或用于奶制品试验工场的大多数试验的标准原料。
所使用的酶溶液为KLM3样品(K460-在本文显示为SEQ ID No.68)。K460包含1400TIPU单位/ml。
TIPU试验
底物
将0.6％L-α磷脂酰胆碱 95％Plant(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100(SigmaX-100)和5mM CaCl2溶解在0.05M HEPES缓冲液(pH＝7)中。
试验过程：
将400μl底物加入到1.5ml Eppendorf试管中，并在37℃的Eppendorf热混合仪中放置5分钟。在T＝0分钟时，加入50μl酶溶液。同时对以水替代酶的空白进行分析。使样品在37℃的Eppendorf热混合仪中以10*100rpm混合10分钟。在T＝10分钟时，将所述Eppendorf试管在另一个99℃的热混合仪中放置10分钟以终止反应。
利用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。
以在试验条件下每分钟产生脂肪酸的微摩尔数计算酶活性(TIPU，pH 7)。
酶的剂量水平为75和40U/L。本实验的反应时间和温度恒定为40℃、30分钟。
为了评价所述试验的结果，对所有样品进行如下分析：
·固醇和磷脂的剩余含量
·在添加1％SDS的水中的粒径分布
·粘度和沉淀(奶制品试验工场的DLA标准方法)：利用转子2在Brookfield粘度计上于4℃、60rpm测量粘度(厘泊)。通过沉淀试验测量沉淀(％)：使产物样品在20℃、2800g的离心力下离心20分钟(超高速离心)，然后计算沉淀物占总样品的百分比。
通过Malvern Mastersizer S long bed，configuration Alpha，Linse 300R测量粒径。利用标准聚合物将仪器校准至0.993μm±0.021μm的规格。将样品在水中稀释(将2g样品稀释至含1％SDS的10ml水中)。由于聚集将产生错误结果，因此加入SDS以防止颗粒聚集。
结果
分析结果：
样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8
胆固醇 正常水平 完全酯化 完全酯化 完全酯化 正常水平 部分酯化 部分酯化 部分酯化
磷脂 正常水平 不存在 不存在 不存在 正常水平 不存在 不存在 不存在
粒径分析：
样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8
平均粒径(μm) 0.57 0.58 0.58 0.53 0.55 0.54 0.53 0.49
所有样品的平均粒径小于1μm。
对样品进行称重，然后在2800G、20℃超速离心20分钟。离心后，除去上清液并对称量干燥的沉淀物，并计算计算沉淀占原始样品大小的百分数。如上所述，计算粘度(厘泊)和沉淀(％)。
样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8
粘度 5 6 6 22 15 15 17 28
沉淀 2.1 0.8 1.2 0.7 1.4 0.6 0.5 0.5
结果表明，使用KLM3可以改善UHT乳中的乳液稳定性，并可以除去胆固醇。
实施例3：KLM-3酶在巴氏灭菌乳或经UHT处理的乳中的作用
材料和方法
甘油磷脂胆固醇酰基转移酶KLM3(K460)
Recodan RS 100：稳定系统
奶油：商业来源
脱脂乳：商业来源
试验
为了进一步证明在乳中使用KLM3是否具有改善乳液稳定性的作用，进行一下试验步骤，并比较基于再制鲜乳产生的常规UHT乳和巴氏灭菌乳中的结果。在该实验中，酶反应在5℃进行。
巴氏灭菌乳(样品11和12)与UHT乳(样品13和14)中的KLM3试验
组分(％) 11 12 13 14
RECODAN RS 100 0.15 0.15 0.13 0.13
奶油 38％脂(fat) 8.61 8.61 8.66 8.66
脱脂乳 91.24 91.24 91.21 91.21
KLM3，100 U/ml - + - +
温度(℃) 90 90 142 142
保持时间(秒) 30 30 3 3
所述样品在奶制品试验工场进行如下加工：
样品11、12、13和14：
UHT乳-试验(PHE)
1.-将脱脂乳和奶油混合
2.-加入KLM3并搅拌均匀
3.-冷藏过夜(20hr)
4.-将乳加热至60℃，并加入Recodan
样品13和14
5.-预热至90℃(在保温池中放置30秒)
6.-在142℃间接加热3秒
7.-在200bar、75℃下游均质化
8.-冷却至15℃
9.-无菌灌装
样品11和12
10.在70℃和200bar上游均质化(Homogenise up stream)
11.-在90℃巴氏灭菌30秒
12.-冷却至5℃并灌装
用于所述试验的组分为商购的全乳和/或用于奶制品试验工场的大多数试验的标准原料。
酶的剂量水平与本文中显示KLM3在5℃对乳的酶作用的其它实施例中的剂量水平相同。
为了评价所述试验的结果，对所有样品进行如下分析：
·Turbiscan 5天
·UHT样品的压力试验(长期稳定性)
·表面张力
·胆固醇和磷脂酰乙醇胺
·通过三点试验进行感官分析
Turbiscan:
利用Turbiscan MA 2000，通过计算激光束从产物的反向散射测量乳液的稳定性。
在无菌条件下将乳液样品装入无菌的实验试管中，并将试验试管在室温下保存。在5-7天的时间内以规则的时间间隔对样品进行测量。
从实验试管的上部5mm和底部5mm测量样品，其中上层的反向散射的增加表示乳油化，而底部的增加则表示样品中的颗粒沉淀。
中性UHT乳产品的胁迫测试
1.无菌封装(通常在室温下)后，将样品13和14在5℃冷藏过夜
2.然后将样品转移到35℃的温箱中放置24小时
3.将样品转移至5℃冷藏24小时
4.将样品转移至20-25℃的室温下室温24小时
5.将样品转移至5℃冷藏24小时
经所述温度处理后，将样品置于室温下持续2-3天，然后在视觉上评价乳油化、絮凝、沉淀和可能的相分离。
该测试与产品的实际长期稳定性的关联性已经经过2年的观察，证明其具有非常高的关联性。
表面张力：
利用Wilhelmy板，通过的Tensiometer K10测量乳样品的表面张力
气相色谱：
利用气相色谱测量乳样品中的胆固醇和胆固醇酯的含量。
使用以下CG设定：
Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱仪，其配备有WCOT熔凝硅石柱12.5m×0.25mm ID×0.1μm膜厚度 5％苯基-甲基-硅酮(CP Sil 8CB，来自Crompack)。
载气：氦。
注射器：PSSI冷分流注射(由最初温度50℃加热至385℃)，体积1.0μl。
检测器FID：395℃。
制备用于GC分析的乳样品：
根据Mojonnier AOAC 989.05，利用乙醇、NH3、MTBE(甲基-叔丁基醚)和p-醚提取乳脂质。将所述脂质部分重新溶解在含有作为内标的十七烷的庚烷/吡啶(2:1)中，通过GC对胆固醇进行测量。
制备用于胆固醇-酯测量的样品。加入异三十烷作为额外的内标。将脂质部分重新溶解在己烷中，并利用NH2Bond Elut柱和己烷洗脱对胆固醇-酯进行浓缩。将样品重新溶解在庚烷/吡啶(2:1)中，通过GC对胆固醇-酯进行测量。
HPTLC：
利用HPTLC测量巴氏灭菌乳样品和UHT乳样品中磷脂酰乙醇胺(PE)的含量。
点样器：CAMAG applicator AST4。
HPTLC板：20x10cm(Merck no.1.05641)
在使用前，通过在160℃的烤箱中干燥20-30分钟使所述板活化。
点样(application)：利用AST4点样器，将溶解在CHCl3:甲醇(2:1)中的6.0μl提取脂质点样在HPTLC板。
另外，还将含已知浓度的标准成分的标准溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、0.8μl、1.5μl点样在HPTLC板。
工作缓冲液6：乙酸甲酯:CHCl3:1-丙醇:MeOH:0.25％KCl(25:25:25:10:9)
洗脱长度：7cm
显色液体：含6％乙酸铜(Cupriacetate)的16％H3PO4
洗脱后，在160℃的烤箱中使所述板干燥10分钟，冷却并浸在显色液体中(10秒)，然后再在160℃干燥6分钟。对所述板进行目测评价并扫描(Camag TLC扫描仪)。
三点试验(triangle test)
ISO 4120:2004感官分析–方法–三点试验
ISO 4120:2004描述了测定两种产品的样品之间是否存在可辨感官差异或相似性的方法。三点试验是三个可选物的试验(a three-alternative test)，其中一个样品不同于其它两个样品。
针对奇数样品的特性(使用ABB和BAA)及其在品尝中的位置(ABB、BAB、BBA、AAB、ABA、BAA)来平衡该试验。选择可能性(Chance performance)是三分之一，而组中高于此水平的表现提供了可辨差异的证据。所述方法是被迫选择的过程。所述方法应用于测定在单个感官属性或数个感官属性中是否可以存在差异。
结果
TURBISCAN测量
巴氏灭菌乳或UHT乳的Turbiscan测量结果示于下表中以及图74和图75中。
表：巴氏灭菌乳12983-1-11(对照)、12983-1-12(经酶处理)和UHT乳12983-1-13(对照)、12983-1-14(经酶处理)的Turbiscan测量结果
平均上部5mm 相对
平均底部5mm
TURBISCAN测量结果显示了巴氏灭菌样品中乳油化降低、沉淀减少，储存时间太短而不能测定UHT乳中的作用。因此通过胁迫测试来测定UHT乳的储存稳定性。
经酶处理的乳在试验DK 12938中的胁迫测试
样品 胁迫测试后评价，在30℃放置3周
13(无酶处理) 轻微的乳油化0-1mm
14(经酶处理) 样品稳定
在30℃持续3周后，在对照和经酶处理的样品之间观察到显著差异。
表面张力
在20℃下利用Kruss张力仪测量乳样品的表面张力。
结果示于图76。
来自表面测量的结果证明利用KLM3的酶处理对乳的显著作用。
游离胆固醇和胆固醇-酯的气相色谱
乳的胆固醇和胆固醇-酯的气相色谱测量结果示于图77中。
总之，利用KLM3酰基转移酶对巴氏灭菌乳和UHT乳进行酶处理的GC结果证明，该酶能够将胆固醇转化为胆固醇-酯。乳样品的KLM3处理将UHT乳和巴氏灭菌乳中的游离胆固醇降低85-90％。此外，KLM3处理使巴氏灭菌乳和UHT乳中的胆固醇-酯水平分别提高了约6倍和约10倍。由此，可以观察到巴氏灭菌乳和UHT乳的KLM3处理具有降低游离胆固醇的明确作用。
巴氏灭菌乳和UHT乳对照在游离胆固醇和胆固醇-酯水平方面均类似于来自ARLQA的商业UHT乳。
乳的磷脂酰乙醇胺的HPTLC：
从巴氏灭菌乳和UHT乳提取乳脂质并通过HPTLC测量的结果示于图78中。
HPTLC测量
如下表所示，利用KLM3对巴氏灭菌乳和UHT乳的酶处理显示乳中磷脂酰乙醇胺(PE)的含量显著降低。
表：由HPTLC板扫描定量的乳磷脂酰乙醇胺。
在定量中使用了SpectraLipid,Soy Lecithin Mix Standard(No.SLM43)。
作为KLM3酶处理结果的乳中PE含量的降低和由此形成的部分水解的PE(溶血PE)与较好乳液稳定性和较小的随时间而乳油化的趋势相对应。此外，如图77所示，乳PE的减少与胆固醇-酯的形成、游离胆固醇的减少以及更好的乳液稳定性相对应。
三点试验
通过三点试验评价对照和经酶处理的巴氏灭菌乳或UHT乳之间的器官感觉差异。所述试验的结果示于下表。
表：UHT乳和巴氏灭菌(PAST)乳的三点试验
三点试验表明，与没有加入酶的乳相比，利用酶(KLM3)处理没有对UHT乳或巴氏灭菌乳的味道产生负面影响。
实施例4：巧克力乳的制备
材料和方法
甘油磷脂胆固醇酰基转移酶KLM3(K932)(SEQ ID No 68):1128LATU/g来自德国Spectra Lipid的Soy Lecithin Mix Standard(ST16)。
配方
方法
以每升乳0.100ml KLM3的剂量向用于样品DK14636-2-3的巴氏灭菌脱脂乳中加入KLM3(100U/ml)
搅拌2分钟
在5℃冷藏24小时
同时将用于样品DK14636-2-4的乳在5℃冷藏24小时。
在5℃冷藏24小时后，将乳加热至70℃，并加入所有其它组分
加热至90℃，持续30秒
UHT处理(板热交换器)139-142℃/2-4秒
在150bar/50bar和75℃均质化
冷却至10-15℃
转移至冷藏
在5℃以下储存
制备用于GC和TLC分析的可可乳样品：
在12ml带螺纹盖的试验试管中称量2g可可乳。10
加入己烷:异丙醇(3:2)。
在Whirley上混合样品并在旋转混合器(rotamix)上以30rpm提取30分钟。
所述试验试管以1720rcf离心10分钟。分离上部相(8.5ml)。
将5ml溶剂相转移到10ml Dramglass中，并在50℃于氮气下蒸发至干。将样品重新溶解在0.400ml的氯仿:甲醇(2:1)中，并用于TLC分析。
分离另外2ml溶剂相，在50℃于氮气下蒸发，并用于GLC分析。
气相色谱：
利用气相色谱测量来自可可乳样品的脂质中的胆固醇和胆固醇酯含量。
利用以下CG设定：
Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱仪，其配备有WCOT熔凝硅石柱12.5m×0.25mm ID×0.1μm膜厚度 5％苯基-甲基-硅酮(CP Sil 8CB，来自Crompack)。
载气：氦。
注射器：PSSI冷分流注射(由最初温度50℃加热至385℃)，体积1.0μl。
检测器FID：395℃。
HPTLC:
利用HPTLC测量来自可可乳样品的分离脂质中的磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)含量。
点样器：CAMAG applicator AST4。
HPTLC板：20x 10cm(Merck no.1.05641)
在使用前，通过在160℃的烤箱中干燥10分钟使所述板活化。
点样：利用AST4点样器，将溶解在CHCl3:甲醇(2:1)中的6.0μl提取脂质点样在HPTLC板。
另外，还将含已知浓度的标准成分的标准溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、0.8μl、1.5μl点样在HPTLC板。
工作缓冲液6：乙酸甲酯:CHCl3:1-丙醇:MeOH:0.25％KCl(25:25:25:10:9)
洗脱长度：7cm
显色液体：含6％乙酸铜的16％H3PO4
洗脱后，在160℃的烤箱中使所述板干燥10分钟，冷却并浸在显色液体中(10秒)，然后再在160℃干燥6分钟。对所述板进行目测评价并扫描(Camag TLC扫描仪)。根据来自标准磷脂组合物的校准曲线对磷脂组分进行定量。
Turbiscan：
通过测量激光束从产物的反向散射(Lumifugation)，利用Turbiscan MA 2000对乳液的稳定性进行测量。
结果
从用KLM3'处理的可可乳和没有用酶处理的对照样品提取的磷脂的GLC和TLC分析结果见表1。
表1：来自可可乳的磷脂的GLC和TLC分析
表1的结果表明，可可乳中几乎一半胆固醇已经通过酶处理而酯化。并且，经酶处理的样品中磷脂的量减少。结果表明，KLM3’对可可乳中的磷脂酰胆碱的活性高于其对磷脂酰乙醇胺的活性。
含有和不含KLM 3(DK14636-2)的可可乳的Lumifugation(稳定性分析仪分析)
实验：利用300rpm(12xg)、2号离心玻璃进行Lumifugation，结果示于图79(DK14636-2-3)和图80(DK 14636-2-4)。
澄清(整体透射％)：
样品号 透射/小时的变化×103(％)
样品1DK 14636-2-3 64
样品2DK 14636-2-4 72
结果示于图81。
当透射的变化作为澄清率的测量值时，样品2最不稳定。
为了研究澄清(clearance)率，进行界面追踪。
在15％透射的界面追踪，即监测澄清界面的移动(参见图82)
样品号 12xg(μm/秒) 1xg(mm/月)
样品1DK 14636-2-3 0.0067 1.45
样品2DK 14636-2-4 0.0242 5.23
在50％透射时的界面追踪(参见图83)和在15％时的界面追踪(参见图82)显示两个样品在澄清方面的差异，样品1具有约1mm的澄清(50％T)上清液，而样品2具有2mm的透明度较差的上清液。这是样品2中的粒径分布较宽的结果。
结论：
经酶处理的样品是最稳定的样品，并且其具有最窄的粒径分布。
实施例5-KLM3’(K932)与不同磷脂酶的比较
材料和方法
脂质酰基转移酶-KLM3’(K932)
根据WO2005/087818的公开，从异孢镰刀菌CBS 782.83获得的真菌脂肪分解酶(下文指来自Danisco A/S的"KLM1")。来自Novozymes的尖孢镰刀菌的磷脂酶A1(Lipopan FTM)。来自Biocatalysts,UK的猪胰磷脂酶A2(LIPOMOD 699LTM)
来自丹麦ARLA的标准巴氏灭菌完全乳(3.5％脂(fat))。
在储存样品的60天储存期间，针对乳油化的稳定性方面，与参考乳比较，视觉评价乳油化、沉淀和相分离，从而对经酶处理的乳进行研究。
另外，分析乳中游离脂肪酸的量，从而评价终产品中的酸败水平，分析胆固醇和/或磷脂的量从而了解酶反应水平。
试验
乳的制备
表：配方
组分(％)
方法
1.将冷乳与部分酶混合，并将混合物冷藏过夜
2.预热至90℃，持续30秒
3.在142℃UHT处理3秒
4.在75℃和200bar均质化
5.冷却至20℃，并在无菌条件下灌装到6个瓶子中
表：货架寿命的实时试验
将根据之前阐述的UHT处理制备的样品在室温(18-25℃)下储存60天，然后根据乳油化层和最后的相分离或瓶底的沉淀，对样品进行评价。
由经过培训的6人团队对样品进行进一步试验，其中品尝部分为随机的三点试验，样品1(通常的UHT乳)用作所有试验环节的参比样品。
对于稳定性的实时观察和器官感觉的评价，可见样品3(用LIPOPAN FTM酶处理)产生明显偏离的结果，样品具有较低的稳定性和强的脂肪分解味。
KLM3’(样品2和6)的奶油层减少，不形成沉淀层，且与对照1相比显示出明显的改进。
与对照相比，经磷脂酶处理的样品3、4和5也可以使奶油层(虽然与KLM3’的程度不同)减少，但同时也形成了沉淀层。
对于器官感觉特性，与对照1相比，样品2(KLM3’)的过熟味略小。因此，与对照1相比，样品2具有改良的味道。Lipopan FTM(样品3)产生的乳具有不好的器官感觉特性，这可能是由于产生高水平的游离脂肪酸而造成的。
HPTLC和GLC分析
用有机溶剂提取具有表中所示配方的经酶处理的UHT乳，通过HPTLC分析分离脂质的磷脂，通过气相色谱(GLC)分析分离脂质的胆固醇、胆固醇酯和游离脂肪酸(FFA)。
表：乳中主要磷脂的HPTLC分析(PC＝磷脂酰胆碱，PE＝磷脂酰乙醇胺)
表：胆固醇、胆固醇酯和游离脂肪酸(FFA)的GLC分析
HPTLC分析的结果(参见上表)表明，所有被试验的酶都能够水解乳中大部分的磷脂(占77％-92％)，但仅脂质酰基转移酶KLM3’能够在胆固醇酯的形成过程中进行脂肪酸至胆固醇的转移反应。
虽然所有的酶均产生高程度的磷脂水解，但所产生的游离脂肪酸的量明显不同。根据磷脂水解和所产生的游离脂肪酸的量，可在摩尔基础上计算游离脂肪酸与所产生磷脂的相对量(参见下表)。这些结果清楚地表明，微生物的磷脂酶A1产生的游离脂肪酸比KLM3多很多，原因是由于这些磷脂酶不是特异的，其还水解甘油三酯(乳脂肪)。已知胰磷脂酶(Lipomod 699L)对磷脂非常特异，但产生的游离脂肪酸仍比低剂量KLM3’多。在高剂量的KLM3’时，产生的脂肪酸比胰磷脂酶多，但这因为其为对溶血磷脂的活性。由于对甘油三酯的水解活性，Lipopan F产生最高量的游离脂肪酸，这导致了感觉器官试验中的负面评价。
表：相对于水解磷脂的量的游离脂肪酸(FFA)的形成
结论：与对照(没有酶)和相当的磷脂酶相比，KLM3’显示增强的稳定性(奶油层减少，没有形成沉淀层)。不受理论束缚，稳定性增强的原因可能是由于用KLM3’处理的乳中脂肪球的粒径分布减小。
另一个重要的作用是，与相同浓度的磷脂酶相比，KLM3’产生较少的游离脂肪酸。在室温下长期储存过程中，游离脂肪酸可易于导致较多的乳氧化，并由此产生其后的感觉器官问题。因此，高游离脂肪酸含量可以在通常在室温下储存1个月以上的UHT乳中引起明显的问题。
以上说明书提到的全部出版物均通过引用并入本文。本发明所述方法和体系的各种改进和改变对本领域的技术人员来说都是显而易见的，并不脱离本发明的范围和精神。尽管已参照具体优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所主张的发明不仅限于所述具体实施方式。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于生物化学和生物工程或相关领域的技术人员来说都是显而易见的，均应落入本发明权利要求书的范围。

Claims (28)

1.生产UHT乳的方法，其中所述方法包括将脂质酰基转移酶和乳或其部分混合，以及通过超热处理来处理经所述酶处理的乳，从而产生UHT乳。
2.如权利要求1所述的方法，其中将所述脂质酰基转移酶加入到所述UHT乳中，并在低于约20℃，优选低于约10℃的温度下孵育。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中将所述脂质酰基转移酶加入到所述UHT乳中，并在约1℃-约10℃之间，优选约3℃-约7℃之间，更优选约5℃的温度下孵育。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含GDSx基序和/或GANDY基序。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于，其是具有酰基转移酶活性的酶，并且其包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一个或多个：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于本发明任一方法和/或应用的所述脂质酰基转移酶可以得自于，优选得自于以下一个或多个属的生物：气单孢菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分支杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌、弯曲菌属、弧菌属、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和念珠菌属。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶可以得自于，优选得自于气单孢菌属的生物。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽通过表达任一以下所示的核苷酸序列或与其具有75％或更高同一性的核苷酸序列而获得：SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ IDNo.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQID No.63。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽通过表达以下序列而获得：
a)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列或与其具有75％或更高同一性的核苷酸序列；
b)编码所述多肽的核酸，其中所述多肽与SEQ ID No.16所示的多肽序列或与SEQ IDNo.68所示的多肽序列具有至少70％的同一性；或者
c)在中等严谨条件下与核酸探针杂交的核酸，所述核酸探针包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽包含任一以下所示的氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.68。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
12.脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于改善UHT乳的稳定性，尤其是长期稳定性。
13.脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于改善UHT乳的可辨感官差异。
14.脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于改善UHT乳的气味和/或味道。
15.脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于降低UHT乳中的胆固醇含量。
16.脂质酰基转移酶在制备UHT乳中的应用，用于除去或减少UHT乳的乳油化。
17.如权利要求12-16中任一项所述的应用，其中将所述脂质酰基转移酶加入到所述UHT乳中，并在低于约20℃的温度，优选低于约10℃的温度下孵育。
18.如权利要求12-17中任一项所述的应用，其中将所述脂质酰基转移酶加入到UHT乳中，并在约1℃-约10℃之间的温度，优选约3℃-约7℃之间的温度，更优选约5℃的温度下孵育。
19.如权利要求12-18中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶包含GDSx基序和/或GANDY基序。
20.如权利要求12-19中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于，其是具有酰基转移酶活性的酶，并且其包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一个或多个：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
21.如权利要求12-20中任一项所述的应用，其中用于本发明任一方法和/或应用的所述脂质酰基转移酶可以得自于，优选得自于以下一个或多个属的生物：气单孢菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分支杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌属、弯曲菌属、弧菌属、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和念珠菌属。
22.如权利要求21所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶可以得自于，优选得自于气单孢菌属的生物。
23.如权利要求12-22中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽通过表达任一以下所示的核苷酸序列或与其具有75％或更高同一性的核苷酸序列而获得：SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ IDNo.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQID No.63。
24.如权利要求12-23中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽可以通过表达以下序列而获得：
a)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列或者与其具有75％或更高同一性的核苷酸序列；
b)编码所述多肽的核酸，其中所述多肽与SEQ ID No.16所示的多肽序列或与SEQ IDNo.68所示的多肽序列具有至少70％的同一性；或者
c)在中等严谨条件下与核酸探针杂交的核酸，所述核酸探针包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列。
25.如权利要求12-24中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽包含任一以下所示的氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.68。
26.如权利要求12-25中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
27.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述多肽通过在地衣芽孢杆菌中表达而获得。
28.如权利要求24-26中任一项所述的应用，其中所述多肽通过在地衣芽孢杆菌中表达而获得。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113545393A (zh) * 2020-04-23 2021-10-26 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种减少杀菌机结垢的方法、液体乳制品及其制备方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002339115B2 (en) 2001-05-18 2007-03-15 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method of preparing a dough with an enzyme
KR101226156B1 (ko) 2004-07-16 2013-01-24 듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스 효소적 오일-탈검 방법
DK2235151T3 (da) * 2007-12-21 2012-11-19 Dupont Nutrition Biosci Aps Fremgangsmåde til raffinering af spiseolie ved anvendelse af en lipid-acyltransferase
GB0905367D0 (en) * 2009-03-27 2009-05-13 Danisco Method
MX2011012313A (es) 2009-05-19 2011-12-12 Danisco Uso.
PL2456427T3 (pl) 2009-07-22 2015-07-31 Gruenenthal Gmbh Wytłaczana na gorąco postać dawki o kontrolowanym uwalnianiu
GB0920089D0 (en) * 2009-11-17 2009-12-30 Danisco Method
EA201290903A1 (ru) 2010-03-12 2013-06-28 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Способ рафинирования растительного масла и рафинированное растительное масло, полученное указанным способом
GB201007668D0 (en) * 2010-05-07 2010-06-23 Danisco Method
WO2011158203A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Danisco A/S Process
WO2012114232A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process
ES2649912T3 (es) 2011-02-23 2018-01-16 Dupont Nutrition Biosciences Aps Tratamiento enzimático de la clorofila en los aceites vegetales
WO2013104659A2 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process
WO2013104660A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for treating a plant oil comprising hydrolysing chlorophyll or a chlorophyll derivative and involving partial caustic neutralisation
WO2013160372A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for treating plant oil involving addition of serial doses of chlorophyll or chlorophyll derivative degrading enzyme
WO2015150372A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method for increasing crude palm oil yields
JP7024951B2 (ja) * 2016-08-30 2022-02-24 三菱ケミカル株式会社 変異型酵素の製造方法及び変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1275711A1 (de) * 2001-07-11 2003-01-15 Cognis Deutschland GmbH & Co. KG Lipase/Acyltransferase aus Candida parapsilosis
CN1759183A (zh) * 2003-01-17 2006-04-12 丹尼斯科公司 方法
CN1984982A (zh) * 2004-07-16 2007-06-20 丹尼斯科公司 用酶使油脱胶的方法

Family Cites Families (240)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA462382A (en) 1950-01-10 Leach Company Self-loading vehicle
CA805618A (en) 1969-02-04 C. White Halbert Nutritionally improved cereal products
AT110768B (de) 1927-09-29 1928-10-10 Patiag Patentverwertungs Und I Windkraftmaschine.
US2888385A (en) 1952-11-28 1959-05-26 Grandel Felix Process of making a preparation containing lipases and oxidases
US3260606A (en) 1964-04-29 1966-07-12 Taiyo Food Co Ltd Enzymatic treatment of egg
GB1092775A (en) 1965-07-07 1967-11-29 Knud Aunstrup Preparation of amyloglucosidase
US3368903A (en) 1966-02-18 1968-02-13 Vanderbilt Co R T Baked goods dough and method
CH461935A (fr) 1966-05-03 1968-08-31 Menzi Robert Procédé de fabrication de pâtes alimentaires séchées
DE1900959A1 (de) 1969-01-09 1970-08-27 Unilever Nv Verfahren zur Herstellung von Pflanzenphosphatiden mit universeller Emulgierkraft
US3634195A (en) 1969-09-08 1972-01-11 Miles Lab Production of lipase
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
GB1375783A (zh) 1972-02-04 1974-11-27
GB1442418A (en) 1972-12-14 1976-07-14 Procter & Gamble Method of cleansing polyester-containing fabrics
IL46862A (en) 1974-04-08 1977-12-30 Baxter Travenol Lab Lipolytic enzyme flavoring system for fat-containing food
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3973042A (en) 1974-05-10 1976-08-03 Cornell Research Foundation, Inc. Flavor development by microbial lipases in pasteurized milk blue cheese
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
GB1525929A (en) 1974-11-25 1978-09-27 Unilever Ltd Stabilised emulsions comprising phospholipoprotein
GB1577933A (en) 1976-02-11 1980-10-29 Unilever Ltd Fat process and composition
US4160848A (en) 1977-04-18 1979-07-10 Pennwalt Corporation Antistaling agent for bakery products
JPS6049477B2 (ja) 1977-04-19 1985-11-01 協和醗酵工業株式会社 グリセロ−ル酸化酵素およびその製造法ならびにグリセロ−ル酸化酵素を用いるグリセロ−ルの定量法
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4399218A (en) 1980-02-05 1983-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Method and reagent for the determination of glycerin
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
JPS6030488B2 (ja) 1982-11-10 1985-07-17 協和醗酵工業株式会社 生地の改良剤およびそれを含有してなる生地
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DK402583D0 (da) 1983-09-05 1983-09-05 Novo Industri As Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf
US4707364A (en) 1984-01-27 1987-11-17 Miles Laboratories, Inc. Composition for accelerating cheese aging
US4636468A (en) 1984-06-25 1987-01-13 Genencor, Inc. Lipolytic enzyme derived from a aspergillus microorganism having an accelerating effect on cheese flavor development
CA1262654A (en) 1984-08-10 1989-11-07 Takaoki Torigoe Food quality improving agent
NL8402979A (nl) 1984-09-28 1986-04-16 Tno Werkwijze voor het bestrijden van vaatverwelkingsziekten bij gewassen, in het bijzonder de iepeziekte.
JPS61181390A (ja) 1985-02-06 1986-08-14 Amano Pharmaceut Co Ltd 酵素によるグリセライドの製造法
US4689297A (en) 1985-03-05 1987-08-25 Miles Laboratories, Inc. Dust free particulate enzyme formulation
DE3672270D1 (de) 1985-03-06 1990-08-02 Yoshikawa Oil & Fat Verfahren zur herstellung von fettsaeureestern.
US5219733A (en) 1985-03-06 1993-06-15 Yoshikawa Oil & Fat Co., Ltd. Process for preparing fatty acid esters
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS61242542A (ja) 1985-04-22 1986-10-28 Fuji Oil Co Ltd チ−ズ風味材の製造法
US5310679A (en) 1985-05-13 1994-05-10 Artiss Joseph D Composition for reducing turbidity in samples of biological fluids
GB8514707D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
GB8514708D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
GB8525012D0 (en) 1985-10-10 1985-11-13 Cpc International Inc Carbohydrate refining process
GB2185990B (en) 1986-02-05 1990-01-24 Unilever Plc Margarine fat
US5536661A (en) 1987-03-10 1996-07-16 Novo Nordisk A/S Process for the production of protein products in aspergillus
US5874558A (en) 1986-03-17 1999-02-23 Novo Nordisk Nucleic acid encoding a recombinant humicola sp. lipase
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5766912A (en) 1986-03-17 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Humicola lipase produced in aspergillus
JPS62262997A (ja) 1986-05-02 1987-11-16 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ワツクスの製造方法
JPS6344892A (ja) 1986-08-13 1988-02-25 Kao Corp 油脂類のエステル交換反応方法
DE3750450T2 (de) 1986-08-29 1995-01-05 Novo Industri As Enzymhaltiger Reinigungsmittelzusatz.
EP0260573A3 (de) 1986-09-18 1989-03-22 Lucas Meyer GmbH & Co Verfahren zur Herstellung eines hydrolysierten Lecithins, sowie Anwendung des hydrolysierten Lecithins
US5273898A (en) 1986-10-17 1993-12-28 Noro Nordisk A/S Thermally stable and positionally non-specific lipase isolated from Candida
US5108457A (en) 1986-11-19 1992-04-28 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system with modified enzyme
KR900003014B1 (ko) 1986-12-27 1990-05-04 도오아 야꾸힌 고오교오 가부시끼가이샤 양식어(養殖魚)용 사료 첨가제
US5219744A (en) 1987-08-26 1993-06-15 Ajinomoto Co., Inc. Process for modifying fats and oils
ATE125865T1 (de) 1987-08-28 1995-08-15 Novo Nordisk As Rekombinante humicola-lipase und verfahren zur herstellung von rekombinanten humicola-lipasen.
ATE77203T1 (de) 1987-12-21 1992-07-15 Cultor Oy Methode zur verbesserung von mehlteig.
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
DK77788A (da) 1988-02-16 1989-08-17 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af kokosnoedolie
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
EP0334462B2 (en) 1988-03-25 2002-04-24 Genencor International, Inc. Molecular cloning and expression of genes encoding lipolytic enzymes
US5232846A (en) 1988-08-09 1993-08-03 Unitika Ltd. Method for producing a thermostable lipoprotein lipase from streptomyces
GB8906837D0 (en) 1989-03-23 1989-05-10 Unilever Plc Bread improvers
DE3920561A1 (de) 1989-06-23 1991-01-10 Knoll Ag Verfahren zur vermeidung von verdauungsstoerungen bei pflanzenfressenden tieren
US5213968A (en) 1989-08-21 1993-05-25 Nestec S.A. Process for preparing emulsifying agents
DE69004782T2 (de) 1989-09-29 1994-03-17 Unilever Nv Getrocknetes Lyso-Phospholipoprotein enthaltendes Nahrungsmittel.
US5677160A (en) 1989-10-30 1997-10-14 Henkel Corporation Fat splitting process
US5288619A (en) 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
JPH03262492A (ja) 1990-03-06 1991-11-22 P Macneil Gerald モノグリセリドの製造方法
DK19991D0 (da) 1991-02-06 1991-02-06 Novo Nordisk As Proteinpraeparationer
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
US5814501A (en) 1990-06-04 1998-09-29 Genencor International, Inc. Process for making dust-free enzyme-containing particles from an enzyme-containing fermentation broth
EP0468731A1 (en) 1990-07-26 1992-01-29 Oriental Yeast Co., Ltd. Bread improver and method of producing bread
US5869438A (en) 1990-09-13 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
DE69129988T2 (de) 1990-09-13 1999-03-18 Novo Nordisk As Lipase-varianten
US5892013A (en) 1990-09-13 1999-04-06 Novo Nordisk A/S Lipase variants
CA2058056C (en) 1990-12-21 1996-11-05 Chiaki Saito Method of decreasing cholesterol concentration in food
PH31068A (en) 1991-03-07 1998-02-05 Ici Plc Process for the production of terephthalic acid.
DE4112440C1 (zh) 1991-04-16 1992-10-22 Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De
US5914306A (en) 1991-05-01 1999-06-22 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes
DE4115938A1 (de) 1991-05-16 1992-11-19 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen
CA2077020A1 (en) 1991-09-03 1993-03-04 Yoshikazu Isono Process for producing lipoprotein-containing substance having reduced lipid content and food containing substance thus produced
US5879920A (en) 1991-10-07 1999-03-09 Genencor International, Inc. Coated enzyme-containing granule
ES2082354T3 (es) 1991-11-11 1996-03-16 Akzo Nobel Nv Procedimiento para la preparacion de granulados de sal.
EP0558112A1 (en) 1992-02-25 1993-09-01 Unilever N.V. Enzymic diglyceride removal
CA2079839A1 (en) 1992-02-28 1993-08-29 Vincent Destefanis Calcium peroxide and ascorbic acid containing compositions as replacements for bromate in breadmaking
GB2267033B (en) 1992-03-07 1996-01-24 David Garnett Lysophospholipid Animal Feed Supplement
DK42092D0 (zh) 1992-03-27 1992-03-27 Novo Nordisk As
DK73592D0 (da) 1992-06-03 1992-06-03 Novo Nordisk As Nyt enzym
DK0575133T4 (da) 1992-06-16 2008-10-20 Sankyo Lifetech Company Ltd Hidtil ukendt Phospholipase A1, fremgangsmåde til fremstilling deraf og anvendelsen deraf
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
EP0580252A2 (en) 1992-07-20 1994-01-26 Quest International B.V. Improvements in or relating to pectin methyl esterase
EP0585988B1 (en) 1992-07-27 1996-03-13 Gist-Brocades N.V. Enzyme product and method for improving bread quality
DK104592D0 (da) 1992-08-21 1992-08-21 Novo Nordisk As Fremgangsmaade
DK0673429T3 (da) 1992-12-10 2002-10-07 Dsm Nv Fremstilling af heterologe proteiner i filamentøse svampe
US5763383A (en) 1992-12-22 1998-06-09 Novo Nordisk A/S Alkaline lipases
DK154292D0 (da) 1992-12-23 1992-12-23 Novo Nordisk As Nyt enzym
JP2937746B2 (ja) 1993-04-25 1999-08-23 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
ZA943640B (en) 1993-06-07 1995-01-26 Buckman Labor Inc Synergistically stabilized liquid enzymatic compositions
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
DE69429611D1 (de) 1993-10-29 2002-02-14 Dsm Nv Backverbesserende Zusammensetzungen
EP0652289A1 (en) 1993-11-05 1995-05-10 Unilever Plc Random interesterification of triglyceride fats
DE4339556C1 (de) 1993-11-19 1995-02-02 Metallgesellschaft Ag Verfahren zum Entschleimen von Pflanzenöl mittels Enzymen
DK0659344T3 (da) 1993-12-24 2001-10-29 Dsm Nv Tørgærsblanding
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
JP3670284B2 (ja) 1994-02-21 2005-07-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 固定化酵素調製品の製造方法および固定化酵素調製品の使用
AU1806795A (en) 1994-02-22 1995-09-04 Novo Nordisk A/S A method of preparing a variant of a lipolytic enzyme
US5834280A (en) 1994-05-03 1998-11-10 Novo Nordisk A/S Glucose oxidases obtained from a cladosporium
US5741665A (en) 1994-05-10 1998-04-21 University Of Hawaii Light-regulated promoters for production of heterologous proteins in filamentous fungi
DE69501228T2 (de) 1994-05-11 1998-05-07 Amano Pharma Co Ltd Ascorbatoxidase, dafür kodierendes Gen, Verfahren zu ihrer Herstellung und dieselbe verwendende Reagens-Zusammensetzung
MX9600483A (es) 1994-06-16 1997-06-28 Firmenich & Cie Composicion saborizante o sazonadora y proceso.
ATE197371T1 (de) 1994-06-17 2000-11-11 Dsm Nv Zusammensetzung zur brotverbesserung
JPH10507639A (ja) 1994-10-26 1998-07-28 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素界面活性剤組成物
CN1167503A (zh) 1994-10-26 1997-12-10 诺沃挪第克公司 一种具有脂解活性的酶
US5830736A (en) 1994-10-26 1998-11-03 Novo Nordisk A/S Lipolytic enzyme
GB2296011B (en) 1994-12-13 1999-06-16 Solvay Novel fusarium isolate and lipases, cutinases and enzyme compositions derived therefrom
US6093562A (en) 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
JP3394975B2 (ja) 1995-02-22 2003-04-07 セレスター ユーエスエー インク 動物性脂肪からステロールおよび遊離脂肪酸を削減する方法
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
JP3359777B2 (ja) 1995-03-06 2002-12-24 日清製粉株式会社 油揚げ即席麺およびその製造方法
US5919746A (en) 1995-03-30 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
DE69628642T2 (de) 1995-03-30 2004-05-13 Novozymes A/S Alkalisches lypolitsches enzym
US5989599A (en) 1995-04-24 1999-11-23 Nestec S.A. Process for the interesterification of phospholipids
US5912032A (en) * 1995-05-11 1999-06-15 Meiji Milk Products Company, Limited Process of producing calcium-supplemented milk drinks
EP0743017B1 (en) 1995-05-15 2004-09-29 DSM IP Assets B.V. Application of phospholipases in animal feed
GB2301103B (en) 1995-05-23 1999-12-22 Danisco An enzyme system comprising ferulic acid esterase
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
DE69623473T3 (de) 1995-06-07 2009-04-23 Danisco A/S Rekombinante hexose oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung
GB0112226D0 (en) 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
WO1998044804A1 (en) 1997-04-09 1998-10-15 Danisco A/S Improved method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase
CA2224203C (en) 1995-06-07 2003-08-12 Jorn Borch Soe A method for improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
JP4307549B2 (ja) 1995-07-14 2009-08-05 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 脂肪分解活性を有する修飾された酵素
US6495357B1 (en) 1995-07-14 2002-12-17 Novozyme A/S Lipolytic enzymes
DE19527274A1 (de) 1995-07-26 1997-01-30 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase
ES2221934T3 (es) 1995-08-11 2005-01-16 Novozymes A/S Nuevas enzimas lipoliticas.
WO1997011083A1 (en) 1995-09-22 1997-03-27 Medical Research Council Improvements in or relating to mutagenesis of nucleic acids
ATE212189T1 (de) 1995-12-01 2002-02-15 Unilever Nv Mikrowellen erhitzbare knusperige brötchen
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6344328B1 (en) 1995-12-07 2002-02-05 Diversa Corporation Method for screening for enzyme activity
US5756328A (en) 1995-12-20 1998-05-26 Cornell Research Foundation, Inc. Acyltransferase and cDNA encoding acyltransferase
US5942430A (en) 1996-02-16 1999-08-24 Diversa Corporation Esterases
US6001586A (en) 1996-03-29 1999-12-14 Genencor International, Inc. Compartmentalization method for screening microorganisms
WO1997041212A1 (en) 1996-04-25 1997-11-06 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
DE19620649A1 (de) 1996-05-22 1997-11-27 Roehm Gmbh Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus
PT834255E (pt) 1996-10-04 2003-10-31 Nestle Sa Processo de fabrico de um agente aromatizante para bebidas
JP3182381B2 (ja) 1996-10-25 2001-07-03 日清製粉株式会社 麺類の機械製麺法
DE19648343C1 (de) 1996-11-22 1998-02-12 Roehm Gmbh Verfahren zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung
JP3582265B2 (ja) 1996-11-28 2004-10-27 味の素株式会社 改質穀粉及びこれを使用した穀粉加工食品
ES2183113T5 (es) 1996-12-09 2010-03-31 Novozymes A/S Reduccion de componentes con contenido en fosfolipidos en aceites comestibles conteniendo una cantidad elevada de fosforo no hidratable con el uso de una fosfolipasa, de una fosfolipasa de un hongo filamentoso que presenta actividad de fosfolipasa a y/o b.
US6103505A (en) 1996-12-09 2000-08-15 Novo Nordisk A/S Method for reducing phosphorus content of edible oils
DE19701348A1 (de) 1997-01-16 1998-07-23 Roehm Gmbh Protein mit Phospholipaseaktivität
US5821102A (en) 1997-01-21 1998-10-13 Novo Nordisk Biotech Inc. Nucleic acids encoding polyeptides having absidia lipase activity
EP0882797B1 (en) 1997-06-04 2003-07-16 Loders Croklaan B.V. Preparation of symmetrical triglycerides aba
RU2140751C1 (ru) 1997-06-11 1999-11-10 Ассоциация "Ассоя" Пищевая добавка для производства хлеба и хлебобулочных изделий
JP4121186B2 (ja) 1997-06-16 2008-07-23 株式会社日立製作所 セラミックス管の検査方法及びその装置
DE69827712T3 (de) 1997-07-31 2009-07-09 Dsm Ip Assets B.V. Zusammensetzung für Brotverbesserung
DE69830119T2 (de) 1997-10-31 2006-02-23 Amano Enzyme Inc., Nagoya Teigzusammensetzung und derer Herstellung
US6156548A (en) 1997-12-23 2000-12-05 Novo Nordisk A/S Immobilization of enzymes with a fluidized bed for use in an organic medium
WO1999033964A1 (en) 1997-12-23 1999-07-08 Novo Nordisk A/S A process for immobilisation of enzymes
AU3247699A (en) 1998-02-17 1999-09-06 Novo Nordisk A/S Lipase variant
AU3026399A (en) 1998-04-08 1999-11-01 Novo Nordisk A/S An enzymatic oil-degumming process
US6815190B1 (en) 1998-04-12 2004-11-09 Novozymes A/S Cutinase variants
US6365204B1 (en) 1998-04-20 2002-04-02 Novozymes Preparation of dough and baked products
ES2188143T5 (es) 1998-04-20 2008-11-01 Novozymes A/S Preparacion de masa y de productos horneados.
US6866837B2 (en) 1998-06-05 2005-03-15 Mallinckrodt Inc. Radiolabeled peptides for the diagnosis and treatment of breast and prostate tumors and metastases of such tumors
US20030074695A1 (en) 1998-06-24 2003-04-17 Farese Robert V. Plant diacylglycerol O-acyltransferase and uses thereof
ATE442435T1 (de) 1998-07-02 2009-09-15 Calgene Llc Diacylglyzerin-acyltransferase proteine
EP1098988B9 (en) * 1998-07-21 2007-10-24 Danisco A/S Foodstuff
JP3414652B2 (ja) 1998-10-12 2003-06-09 敷島製パン株式会社 小麦粉焼成品、その製造方法および品質改良剤
AU768657B2 (en) 1998-11-10 2003-12-18 Novozymes Japan, Ltd. Polypeptides having lysophospholipase activity and nucleic acids encoding same
RU2235775C2 (ru) 1998-11-27 2004-09-10 Новозимс А/С Способ получения варианта липолитического фермента и липолитический фермент (варианты)
US7312062B2 (en) 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
EP1131416B1 (en) 1998-11-27 2009-09-02 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
PL199746B1 (pl) 1998-12-04 2008-10-31 Novozymes As Wariant kutynazy macierzystej, sekwencja DNA kodująca wariant kutynazy macierzystej, wektor zawierający sekwencję DNA, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania wariantu kutynazy macierzystej, sposób hydrolizy enzymatycznej cyklicznego oligomeru poli(tereftalanu etylenu), sposób barwienia poliestrowej tkaniny lub przędzy, kompozycja detergentowa i sposób polepszania wykończenia specjalnego przędzy lub tkaniny zawierającej PET
JP2000226335A (ja) 1998-12-04 2000-08-15 Amano Pharmaceut Co Ltd 経口用酵素製剤、酵素含有食材及び酵素製剤の服用方法
US6399121B1 (en) 1999-03-16 2002-06-04 Novozymes A/S Process for producing cheese
NZ513959A (en) 1999-03-16 2003-08-29 Novozymes As Process for producing cheese
US6964944B1 (en) 1999-06-02 2005-11-15 Novozymes A/S Chemically modified lipolytic enzyme
EP1057415A1 (en) 1999-06-04 2000-12-06 Societe Des Produits Nestle S.A. Lipase-treated pasta and manufacturing process
US6254645B1 (en) 1999-08-20 2001-07-03 Genencor International, Inc. Enzymatic modification of the surface of a polyester fiber or article
US6337187B1 (en) 1999-11-05 2002-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18891, a novel human lipase
EP1224267B1 (en) 1999-10-14 2011-01-05 Novozymes A/S Lysophospholipase from aspergillus
US6146869A (en) 1999-10-21 2000-11-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having phospholipase B activity and nucleic acids encoding same
GB2358784B (en) 1999-12-03 2004-06-30 Danisco Method of improving dough and bread quality
AU1723801A (en) 1999-12-03 2001-06-12 Danisco A/S Method of improving dough and bread quality
US7078205B2 (en) 2000-02-17 2006-07-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding melanoma associated antigen molecules, aminotransferase molecules, atpase molecules, acyltransferase molecules, pyridoxal-phosphate dependent enzyme molecules and uses therefor
DE10018787A1 (de) 2000-04-15 2001-05-03 Nikolaus Weber Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern
AU2001254622A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Novozymes A/S Laccase mutants
US6511837B2 (en) 2000-06-26 2003-01-28 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
US6558715B1 (en) 2000-10-31 2003-05-06 Novozymes Biotech, Inc. Methods for using lipases in baking
US6432898B1 (en) 2000-10-31 2002-08-13 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having lipase activity and nucleic acids encoding same
US6506588B2 (en) 2000-06-26 2003-01-14 Novozymes, A/S Lipolytic enzymes
US6509182B2 (en) 2000-06-26 2003-01-21 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
EP1298205A4 (en) 2000-07-03 2004-06-16 Mochida Pharm Co Ltd NEW LIPASE
EP1301080B1 (en) 2000-07-06 2011-09-14 Novozymes A/S Method of preparing a dough, or a baked product made from a dough, with addition of lipolytic enzymes
EP1309677B2 (en) * 2000-08-11 2012-04-11 Genencor International, Inc. Bacillus transformation, transformants and mutant libraries
WO2002000908A2 (en) 2000-09-25 2002-01-03 Novozymes A/S Methods for processing crustacean material
US6660491B2 (en) 2000-11-24 2003-12-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. Process for producing dietary sterol fatty acid esters
KR20030078065A (ko) 2001-02-21 2003-10-04 노보자임스 에이/에스 녹말 식품의 제법
US6645749B2 (en) 2001-05-25 2003-11-11 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
US7630836B2 (en) 2001-05-30 2009-12-08 The Kitasato Institute Polynucleotides
ATE342374T1 (de) 2001-08-22 2006-11-15 Haerting Thomas Francis Verfahren zur herstellung von sterol- und stanolestern mittels enzymatischer transesterifikation in lösungsmittel- und wasserfreien medien
DE10142014B4 (de) 2001-08-28 2004-11-11 Degussa Bioactives Deutschland Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin
US7226771B2 (en) 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
SE0201581D0 (sv) * 2002-05-29 2002-05-29 Scandinavian Biotechnology Res New improved acyltransferase
WO2003102118A2 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the pre-treatment of vegetable oils for physical refining
WO2004004467A1 (en) 2002-07-03 2004-01-15 Novozymes A/S Treatment of dough with a lipoxygenase and a lipolytic enzyme
PL214792B1 (pl) 2002-08-19 2013-09-30 Dsm Ip Assets B V Wyizolowane polinukleotydy, wektor, wyizolowane enzymy lipolityczne, sposób wytwarzania enzymów lipolitycznych, rekombinowane komórki gospodarza, sposób wytwarzania ciasta, sposób wytwarzania wyrobu piekarniczego oraz zastosowanie enzymu lipolitycznego
CA2403025A1 (en) 2002-10-08 2004-04-08 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Enzymes with lipase/acyltransferase activity
GB2379165A (en) 2002-10-22 2003-03-05 Dsm Nv Animal feed
JP4300839B2 (ja) 2002-11-14 2009-07-22 セイコーエプソン株式会社 画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラム
JP4851093B2 (ja) 2002-12-11 2012-01-11 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 洗剤組成物
ATE389731T1 (de) 2002-12-12 2008-04-15 Novozymes As Verfahren zur auswahl eines lipolytischen enzyms
JP2006511725A (ja) 2002-12-23 2006-04-06 ノボザイムス ノース アメリカ，インコーポレイティド ポリエステル布の処理方法
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
JP4778887B2 (ja) 2003-01-17 2011-09-21 ダニスコ エイ／エス 脂質アシルトランスフェラーゼの使用
MXPA05007653A (es) * 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
WO2004097012A2 (en) 2003-04-28 2004-11-11 Novozymes A/S Phospholipase and method of producing it
EP1639102A2 (en) 2003-06-19 2006-03-29 Novozymes A/S Phospholipase variants
WO2005005977A2 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Applera Corporation Fluorescent phospholipase assays and compositions
WO2005007818A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 Genencor International, Inc. Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof
JP4327536B2 (ja) 2003-09-01 2009-09-09 レシップ株式会社 券硬貨投入口及びそれを備えた券硬貨分離装置
DK2292743T3 (da) 2003-12-03 2013-11-25 Danisco Us Inc Perhydrolase
JP5697294B2 (ja) 2003-12-24 2015-04-08 デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエス 糖脂質アシル基転移酵素変異体及びその製造方法
US7906307B2 (en) * 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
WO2008090395A1 (en) * 2007-01-25 2008-07-31 Danisco A/S Production of a lipid acyltransferase from transformed bacillus licheniformis cells
BRPI0418107A (pt) 2003-12-24 2007-04-17 Danisco tratamento enzimático de óleos
EP1718724B1 (en) 2004-02-24 2008-08-27 Novozymes A/S Enzyme stabilization in liquid detergents
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
EP1624047B1 (en) 2004-08-06 2006-10-18 De Smet Engineering N.V. Oil recuperation process
EP1794297B1 (en) 2004-09-21 2011-02-23 Novozymes A/S Subtilases
WO2006039541A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 Novozymes, Inc. Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
DE102005039836A1 (de) 2005-08-23 2007-03-01 Cognis Ip Management Gmbh Sterolesterpulver
EP1788080A1 (en) 2005-11-22 2007-05-23 Süd-Chemie Ag Use of a thermostable phospholipase in the degumming of an oil or fat, and a method for obtaining a thermostable phopholipase
CN101200754B (zh) 2007-12-07 2010-06-02 中国农业科学院油料作物研究所 无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法
JP5211852B2 (ja) 2008-05-23 2013-06-12 株式会社Ｉｈｉ 加圧浮上装置及び加圧浮上方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1275711A1 (de) * 2001-07-11 2003-01-15 Cognis Deutschland GmbH & Co. KG Lipase/Acyltransferase aus Candida parapsilosis
CN1759183A (zh) * 2003-01-17 2006-04-12 丹尼斯科公司 方法
CN1984982A (zh) * 2004-07-16 2007-06-20 丹尼斯科公司 用酶使油脱胶的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NERLAND A H: "The nucleotide sequence of the gene encoding GCAT from aeromonas salmonicida ssp. salmonicida", 《JOURNAL OF FISH DISEASES》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113545393A (zh) * 2020-04-23 2021-10-26 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种减少杀菌机结垢的方法、液体乳制品及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009024736A1 (en) 2009-02-26
EA018153B1 (ru) 2013-05-30
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EP2190864B1 (en) 2013-04-10
NZ583047A (en) 2012-03-30
AU2008290273B2 (en) 2014-01-09
BRPI0814971A2 (pt) 2015-02-03
AU2008290273A1 (en) 2009-02-26
CN101917862A (zh) 2010-12-15
ES2415873T3 (es) 2013-07-29
BRPI0816413A2 (pt) 2019-02-12
NZ583006A (en) 2011-06-30
CA2693361C (en) 2015-12-08
US20100215803A1 (en) 2010-08-26

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