CN103074290B - 一株重组大肠杆菌及用该菌株制备磷脂酶a1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株重组大肠杆菌及用该菌株制备磷脂酶A1的方法。本发明成功构建了一株磷脂酶A1基因来源于液化沙雷氏菌CICC No.21538的基因重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCC M 2012423，用该菌株进行液体发酵来制备溶血性磷脂酶A1，其制备方法包括斜面培养、种子培养、自发诱导培养（包括添加渗透性物质）以及粗酶液的提取。利用本发明菌株通过液体发酵制备磷脂酶A1，具有产酶量和酶活性高、生产工艺简单、生产周期短、成本低、易于工艺放大等优点，在油脂精炼、磷脂改性等领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一株重组大肠杆菌及用该菌株进行自诱导发酵来制备磷脂酶A1的方法。
背景技术
磷脂酶A1（PhospholipaseA1，EC 3.1.1.32，简称PLA1）属于水解酶，可专一水解天然磷脂Sn-1位酰基，得到Sn-2酰基溶血磷脂和游离脂肪酸。磷脂酶A1是一种优良的表面活性剂，被广泛应用于食品、医药、饲料和皮革等领域；此外，磷脂酶A1还可应用于植物油脱胶，同传统脱胶方法相比，磷脂酶A1脱胶这种新型脱胶方法具有反应条件温和、副产物少、节能环保等优点，近年来已在油脂精炼行业得到大规模推广。
经证实，许多动物的细胞、组织和毒液含有少量的磷脂酶A1。磷脂酶A1的传统来源为动物胰液，但该来源提取量有限且价格昂贵，已于近几年逐渐被淘汰，取而代之的是从微生物中提取，但提取自微生物的磷脂酶A1大多与细胞膜结合，难以进行规模化生产，因此，研究磷脂酶A1基因在工程菌中的克隆表达并努力提高其产量成为近年来的主要研究方向。国内外利用微生物产磷脂酶A1的起步较晚，且产量普遍较低：1988年，Michael Givskova等从液化沙雷氏菌中提取磷脂酶A1基因在大肠杆菌克隆和表达，其酶活不到1U/ml（Givskov M，Molin S.Secretion of Serratia liquefaciens phospholipase from Eseherichia.coli[J].Mol.Microbiol，1993(8)：229-42.）；2000年，M.Hartmann等使用随机化学突变、单细胞融合以及基因杂交技术，筛选出4株嗜热四膜虫属突变株，其酶活最高达到35.2±2.60U/ml（Hartmann M，etal.Screening forand charaeterization ofphospholipase A1 hypersecretory mutants of Tetrahymena thermophila[J].Appl.Microbiol.Biotechnol，2000(54)：390-396）；2008年，国内付建红等从新疆天山一号冰川冻土中筛选到一株产低温碱性磷脂酶A1的菌株xjF1，初步优化后，酶活力最高达17.5U/ml（付建红，唐辉桂，姚斌，等.一株产低温碱性磷脂酶A1耐冷细菌的筛选及发酵条件的初步研究.工业微生物2008.38：12-16.）。目前商品化的磷脂酶A1产品仅有丹麦诺维信公司的Lecitase NovoTM(Novozymes A/S)，其是通过蛋白质修饰技术由来源于嗜热丝胞菌的脂肪酶改性而来。
因此，寻找更加优良的磷脂酶A1基因并在工程菌中进行克隆表达以期提高其表达水平是亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一株重组大肠杆菌及用该菌株制备磷脂酶A1的方法。利用该菌株通过液体发酵制备磷脂酶A1，具有产酶量和酶活性高、生产工艺简单、成本低、易于工艺放大等优点。
本发明的技术方案如下：
一株重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-pla，保藏编号为CCTCC M 2012423，该重组大肠杆菌包含一段来源于液化沙雷氏菌CICC No.21538的pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
其进一步的技术方案为：
所述重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-pla，CCTCC No.M 2012423由下述方法制得：
（1）以所述液化沙雷氏菌CICC No.21538的基因组为模板，克隆得到所述pla基因；
（2）将步骤（1）所得pla基因克隆到表达载体pET-28a（+）上，得到重组载体pET-pla；
（3）将步骤（2）所得重组载体pET-pla转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到能表达磷脂酶A1的重组大肠杆菌。
本发明还提供了一种用上述重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-pla，CCTCC No.M 2012423制备磷脂酶A1的方法，是以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备磷脂酶A1。
具体步骤如下：
（1）种子培养：将经过斜面培养的所述重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-pla，CCTCC No.M 2012423单菌落接种于种子培养基，于35～37℃振荡培养5～7h，摇床转速180～200r/min；
（2）自诱导发酵培养：将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比1～4％的接种量接种至自诱导发酵培养基，于35～37℃振荡培养3～5h小时，摇床转速180～200r/min；再向所述自诱导发酵培养基中分别添加其总重量0.5～2％的甘氨酸和曲拉通，继续培养12～14h；发酵完毕，得到发酵液；
（3）粗酶液的提取：将上述发酵液离心，收集上清液，即得含磷脂酶A1的粗酶液。
其进一步的技术方案为：
步骤（1）所述斜面培养的培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，氯化钠1，其余成分为水，调节pH值至7.4；所述种子培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，Na2HPO4 25mM，KH2PO4 25mM，NH4Cl 50mM，Na2SO4 5mM，MgSO4 2mM，其余成分为水；上述种子培养基还包括终浓度为100μg/ml的卡那霉素。
步骤（2）所述自诱导发酵培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，甘油5g，Na2HPO4 25mM，KH2PO4 25mM，NH4Cl50mM，Na2SO4 5mM，MgSO4 2mM，FeCl3 50μM，CaCl2 20μM，其余成分为水。
磷脂酶A1酶活测定方法如下：
采用改良NaOH滴定法（Sheelu等，J Am Oil Chem Soc 85：739748，2008）。将4g已乳化的大豆卵磷脂溶于100ml 50mM的磷酸缓冲液（pH7.0），取20ml该溶液和稀释5倍的粗酶液在转速为180r/min的恒温震荡水浴锅中于50℃预热10分钟；取200μL已稀释的粗酶液加入上述反应体系中精确反应10分钟，立即补加15ml的95％乙醇终止反应。用已标定的30mmol/L NaOH溶液滴定上述粗酶液中磷脂酶A1所释放的游离脂肪酸，取pH8.2为滴定终点；磷脂酶A1酶活力定义为：在上述反应条件下，每分钟释放1μmol的游离脂肪酸的酶量定义为一个酶活力单位。
本发明所提供的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-pla，已于2012年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号：CCTCC NO：M 2012423，地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称：重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCC M 2012423。
本发明的有益技术效果如下：
本发明成功构建了一株磷脂酶A1基因来源于液化沙雷氏菌CICC No.21538的基因重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCC M 2012423，分析结果表明，该重组大肠杆菌所包含的磷脂酶A1基因（pla基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示）与GenBank编号X66505.1的磷脂酶A1基因的序列同源性较低，为76.4％，拓宽了磷脂酶A1的基因来源；以该重组大肠杆菌为发酵菌株并通过本发明方法制备磷脂酶A1，产酶量高，经检测胞外酶活性最高可达137.6U/ml；本发明方法生产工艺简单、生产周期短、成本低、易于工艺放大，在油脂精炼、磷脂改性等领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
以下实施例所涉及实验材料如下：大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109和E.coli BL21（DE3）购自宝生物工程（大连）有限公司；液化沙雷氏菌购自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC），保藏编号为：CICC No.21538；pMD18T-simple Vector、T4DNA连接酶和10×T4连接酶Buffer购自宝生物工程（大连）有限公司；pET-28a（+）购自Novagen；限制性内切酶EcoR Ⅰ、HindⅢ以及共用Buffer购自Fermentas。
其他原料和试剂均为市售国产或进口分析纯产品。
实施例1磷脂酶A1基因的克隆
根据NCBI GenBank：X66505.1的基因序列设计引物，其中，上游引物为：5′-CGGAATTCAGTATGTCTTTGAGTTTTACCTCTGC-3′（下划线表示EcoR Ⅰ酶切位点），下游引物为：5'-CCAAGCTTCGTTACTGCTGTCCGTATTGC-3′（下划线表示HindⅢ酶切位点）。
以保藏编号为CICC No.21538的液化沙雷氏菌基因组DNA为模板，运用PCR的方法（引物如上所述）克隆得到磷脂酶A1基因pla，并与载体pMD18T-simple连接得到克隆载体pMD-pla，将该克隆载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109，挑选阳性克隆，测序验证，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，结果表明磷脂酶A1基因克隆成功。序列分析显示，该基因序列与GenBank编号 X66505.1的磷脂酶A1基因序列同源性较低，为76.4％。
实施例2重组载体pET-pla的构建
用EcoR Ⅰ和HindⅢ对重组载体pMD-pla和表达载体pET-28a（+）进行双酶切，酶切反应体系为50μL：载体20μL、酶反应Buffer 5μL、EcoR Ⅰ2.5μL、HindⅢ2.5μL，补充双蒸去离子水至50μL，37℃反应2小时。回收酶切后的目的基因和载体DNA，并用T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系10μL：目的基因2μL、载体DNA 1μL、10×T4连接酶Buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL，双蒸去离子水5μL，于16℃反应12小时。
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109，转化方法如下：
（1）取E.coli JM109 100μL置于无菌1.5ml EP管中；
（2）加入上述连接产物并轻轻混匀；
（3）将上述EP管置于42℃金属浴，精确计时90s，勿摇动EP管；
（4）转移EP管至冰浴中，冷却5～10min；
（5）每管加入无菌SOC培养基800μL，置于37℃培养箱复苏1h；
（6）以8000r/min的转速离心2min，吸去800μL上清培养基，用移液枪轻轻吹吸剩余培养基和细胞，并转移至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB固体平板，涂匀并于37℃培养箱培养16～24h；
（7）挑取阳性克隆，并经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切验证。
实施例3重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCC M 2012423的构建
将构建好的重组载体pET-pla转化大肠杆菌BL21（DE3），转化方法如下：
（1）取E.coli BL21（DE3）100μL置于无菌1.5ml的EP管中；
（2）加入上述重组质粒pET-pla并轻轻混匀；
（3）将上述EP管置于42℃金属浴，精确计时90s，勿摇动EP管；
（4）转移EP管于冰浴中，冷却5～10min；
（5）每管加入无菌SOC培养基800μL，置于37℃培养箱复苏1h；
（6）以8000r/min的转速离心2min，吸去800μL上清培养基，用移液枪轻轻吹吸剩余培养基和细胞，并转移至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB固体平板，涂匀并于37℃培养箱培养16～24小时；
（7）挑取转化子，经EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切验证重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla构建成功，与等体积的30％甘油混匀，于-70℃保藏。
用重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCC M 2012423通过自诱导发酵制备磷脂酶A1
实施例4～实施例8所述斜面培养方法如下：将上述甘油保藏的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCC M 2012423划线接种于斜面培养基，于37℃培养12h；上述斜面培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，氯化钠1，其余成分为水，调节pH值至7.4，于1×105Pa高压下灭菌20min。
所述种子培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，Na2HPO425mM，KH2PO4 25mM，NH4Cl 50mM，Na2SO4 5mM，MgSO4 2mM，其余成分为水，于1×105Pa高压下灭菌20min。
所述自诱导发酵培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，甘油5g，Na2HPO4 25mM，KH2PO4 25mM，NH4Cl 50mM，Na2SO- 45mM，MgSO4 2mM，FeCl3 50μM，CaCl2 20μM，其余成分为水，于1×105Pa高压下灭菌20min。
实施例4
（1）种子培养：将经过斜面培养的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCCM2012423单菌落接种于种子培养基（含终浓度为100μg/ml的卡那霉素），在回旋式摇床上于36℃振荡培养6h，摇床转速180r/min；
（2）自诱导发酵培养：将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比2％的接种量接种至自诱导发酵培养基，自诱导发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于36℃振荡培养4h小时，摇床转速180r/min；分别向自诱导发酵培养基中添加其总重量0.5％的甘氨酸和0.5％的曲拉通，继续培养12h；发酵完毕，得到发酵液；
（3）粗酶液的提取：将上述发酵液于4℃离心10min，转速8000r/min；收集上清液，即得胞外重组磷脂酶A1的粗酶液。
经检测，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活为94.7U/ml。
实施例5
（1）种子培养：将经过斜面培养的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCCM 2012423单菌落接种于种子培养基（含终浓度为100μg/ml的卡那霉素），在回旋式摇床上于36℃振荡培养7h，摇床转速200r/min；
（2）自诱导发酵培养：将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比3％的接种量接种至自诱导发酵培养基，自诱导发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于36℃振荡培养5h小时，摇床转速200r/min；分别向自诱导发酵培养基中添加其总重量0.75％的甘氨酸和0.75％的曲拉通，继续培养13h；发酵完毕，得到发酵液；
（3）粗酶液的提取：同实施例4。
经检测，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活为109.8U/ml。
实施例6
（1）种子培养：将经过斜面培养的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCCM 2012423单菌落接种于种子培养基（含终浓度为100μg/ml的卡那霉素），在回旋式摇床上于37℃振荡培养7h，摇床转速200r/min；
（2）自诱导发酵培养：将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比4％的接种量接种至自诱导发酵培养基，自诱导发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于37℃振荡培养4h小时，摇床转速200r/min；分别向自诱导发酵培养基中添加其总重量1％的甘氨酸和1％的曲拉通，继续培养13h；发酵完毕，得到发酵液；
（3）粗酶液的提取：同实施例4。
经检测，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活为117.2U/ml。
实施例7
（1）种子培养：将经过斜面培养的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCCM 2012423单菌落接种于种子培养基（含终浓度为100μg/ml的卡那霉素），在回旋式摇床上于35℃振荡培养5h，摇床转速180r/min；
（2）自诱导发酵培养：将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比1％的接种量接种至自诱导发酵培养基，自诱导发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于35℃振荡培养3h小时，摇床转速180r/min；分 别向自诱导发酵培养基中添加其总重量2％的甘氨酸和2％的曲拉通，继续培养12h；发酵完毕，得到发酵液；
（3）粗酶液的提取：同实施例4。
经检测，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活为78.3U/ml。
实施例8
（1）种子培养：将经过斜面培养的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla CCTCCM 2012423单菌落接种于种子培养基（含终浓度为100μg/ml的卡那霉素），在回旋式摇床上于37℃振荡培养7h，摇床转速200r/min；
（2）自诱导发酵培养：将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比4％的接种量接种至自诱导发酵培养基，自诱导发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于37℃振荡培养5h小时，摇床转速200r/min；分别向自诱导发酵培养基中添加其总重量0.75％的甘氨酸和1％的曲拉通，继续培养14h；发酵完毕，得到发酵液；
（3）粗酶液的提取：同实施例4。
经检测，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活为137.6U/ml。
综上所述，实施例8所述磷脂酶A1制备方法具有最高的酶活性，为最佳实施例。
Claims (6)
1.一株重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）/pET-pla，保藏编号为CCTCC No.M 2012423，其特征在于：该重组大肠杆菌包含一段来源于液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）CICC No.21538的pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla，CCTCC No.M 2012423，其特征在于由下述方法制得：
（1）以所述液化沙雷氏菌CICC No.21538的基因组为模板，克隆得到所述pla基因；
（2）将步骤（1）所得pla基因克隆到表达载体pET-28a（+）上,得到重组载体pET-pla；
（3）将步骤（2）所得重组载体pET-pla转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到能表达磷脂酶A1的重组大肠杆菌。
3.用权利要求1~2任一项所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla，CCTCC No. M 2012423制备磷脂酶A1的方法，其特征在于以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备磷脂酶A1。
4.根据权利要求3所述制备磷脂酶A1的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）种子培养：将经过斜面培养的所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET- pla，CCTCC No.M 2012423单菌落接种于种子培养基，于35~37℃振荡培养5~7h，摇床转速180~200r/min；
（2）自诱导发酵培养：将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比1~4%的接种量接种至自诱导发酵培养基，于35~37℃振荡培养3~5h，摇床转速180~200r/min；再向所述自诱导发酵培养基中分别添加其总重量0.5~2%的甘氨酸和曲拉通，继续培养12~14h；发酵完毕，得到发酵液；
（3）粗酶液的提取：将上述发酵液离心，收集上清液，即得含磷脂酶A1的粗酶液。
5.根据权利要求4所述制备磷脂酶A1的方法，其特征在于步骤（1）所述斜面培养的培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5 g，葡萄糖8g，氯化钠1g，其余成分为水，调节pH值至7.4；所述种子培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，Na2HPO4 25mM，KH2PO4 25mM，NH4Cl 50 mM，
Na2SO-4 5 mM，MgSO4 2 mM，其余成分为水。
6.根据权利要求4所述制备磷脂酶A1的方法，其特征在于步骤（2）所述
自诱导发酵培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5 g，葡萄糖0.5g，乳糖2 g，甘油5g, Na2HPO4 25mM，KH2PO4 25mM，NH4Cl 50 mM，Na2SO-4 5 mM，MgSO4 2 mM， FeCl3 50μM，CaCl2- 20μM，其余成分为水。
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