ES2879249T3 - Polipéptidos que tienen actividad de desmetilación - Google Patents

Abstract

Un proceso para degradar y/o modificar celulosa en un sustrato de biomasa lignocelulósica, donde dicho proceso comprende la etapa de poner en contacto dicho sustrato con una polisacárido monooxigenasa lítica (LPMO) y una polifenoloxidasa, donde la polifenoloxidasa comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la SEQ ID NO: 45, y donde la polifenoloxidasa comprende o consiste en un dominio de tirosinasa central, y donde la polifenoloxidasa es capaz de desmetilar un mono- o di-metoxifenol sustituido con R representado por la fórmula [1], [2 ] o [3]: **(Ver fórmula)** donde R puede ser cualquier átomo o resto químico individual.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos que tienen actividad de desmetilación

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad a la Solicitud de Patente de los Países Bajos N° NL2015020, presentada el 24 de junio 2015.

Campo de la invención

La presente descripción se refiere al área de las enzimas fúngicas, más en particular de las polifenoloxidasas (PPO). La descripción se basa en una clase de PPO recién descubierta, en base a su actividad enzimática, es decir, la desmetilación de mono- o di-metoxifenoles sustituidos con R tales como los presentes en la lignina, compuestos derivados de la lignina y/o en la biomasa lignocelulósica. Esta actividad enzimática recientemente descubierta hace que estas enzimas sean muy adecuadas para una gran cantidad de nuevas aplicaciones en la industria.

Antecedentes de la invención

La lignina es un biopolímero natural, que se puede extraer de la biomasa, por ejemplo, de la madera. La lignina se obtiene como un subproducto de la industria del papel y la pulpa y de las industrias de biorrefinerías, así como de una variedad de productos agrícolas de bajo valor como paja, rastrojo de maíz y bagazo. En las biorrefinerías, la biomasa lignocelulósica se pretrata usando, por ejemplo, ácido sulfúrico u otros ácidos diluidos, agua caliente (hidrotérmico), un pH elevado (alcalino) agregando, por ejemplo, hidróxido de calcio, sodio o potasio, o amoníaco para descomponer la lignocelulosa y producir una fracción de lignina como coproducto. Por ejemplo, la lignina se coproduce como lignina de sulfito, sulfonato, kraft, soda, organosolv (por ejemplo Pan y col., Biotechnol. Bioeng. 2005, 20 de mayo; 90(4): 473­ 81), o como biolignina (WO2009/092749).

Los productos potenciales de alto valor de la lignina aislada incluyen fibra de carbono de bajo coste, plásticos y elastómeros termoplásticos y combustibles o productos químicos actualmente derivados del petróleo. Por ejemplo, se considera que la lignina es un posible sustituto del fenol, por ejemplo, en la síntesis de resinas de fenol-formaldehído (PF).

La baja reactividad de la lignina debido a su estructura química impide la utilización comercial a gran escala de la lignina. La desmetilación aumenta la reactividad de la lignina al formar restos de catecol en la macromolécula de lignina (Hu y col. BIORESOURCES, Vol.6 (3), 3515-3525: 2011).

La lignina es un heteropolímero aromático que consta de tres monolignoles (o alcoholes hidroxicinamílicos), alcohol coniferílico (de guaiacilo o unidad "G" cuando está incorporado en el polímero de lignina), alcohol sinapílico (de siringilo o unidad "S" cuando está incorporado en el polímero de lignina) y alcohol p-cumarílico (unidad de p-hidroxifenilo H cuando está incorporado en el polímero de lignina), que están metoxilados en varios grados (Vanholme et al, Plant Physiology, julio de 2010, vol. 153, págs. 895-905, 2012).

La estructura de la lignina depende del tipo de planta y del procedimiento de aislamiento de la lignina. Por ejemplo, la proporción de grupos siringilo (S), guaiacilo (G) e hidroxifenilo (H) en la lignina es diferente en árboles, pastos y paja. Especialmente, la reactividad de las ligninas que son ricas en grupos S y, en menor medida, en grupos G (mono y diortofenoles), se verá potenciada por la desmetilación.

Se sabe que la lignina o los materiales derivados de la lignina pueden tratarse para escindir los grupos metoxi (se hace referencia a los documentos US 2.816.832, US 2.840.614, US 2.908.716, US 3.326.980 y US 4.250.088). Cada uno de estos métodos desmetila la lignina hasta cierto punto; sin embargo, estos métodos operan a alta temperatura y/o presión, lo que los hace intensivos en el consumo de energía y pueden dar como resultado la modificación de la estructura de la lignina. Por tanto, es deseable identificar métodos de desmetilación más suaves.

Una alternativa a la desmetilación termoquímica es una desmetilación biológica. Se han descrito varios sistemas biológicos para desmetilar lignina y/o compuestos derivados de la lignina. Estos sistemas biológicos se basan, por ejemplo, en la actividad de lacasas, transferasas dependientes de tetrahidrofolato o dioxigenasas para catalizar la desmetilación de la lignina. Una desmetilación catalizada por lacasa tiene el inconveniente de que no es muy específica, mientras que la transferasa dependiente de tetrahidrofolato y la dioxigenasa descritas para la cepa SYK-6 de Sphingomonas paucimobilis son enzimas intracelulares, lo que hace que el aislamiento de las enzimas sea laborioso y caro. Sería deseable obtener nuevos métodos para la desmetilación. El documento WO 2014/081700 describe polipéptidos fúngicos recombinantes. El documento WO 2012/068236 describe nuevas oxidorreductasas fúngicas. El documento WO 2015/035029 describe procesos para incrementar la hidrólisis enzimática de materia celulósica. El documento WO 2014/186567 describe la mejora de la hidrólisis enzimática mediante un pre­ acondicionamiento enzimático. Finalmente, el documento WO 2008/134259 describe la detoxificación de materiales pretratados que contienen lignocelulosa.

Breve resumen de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones. En el presente documento se proporcionan polifenoloxidasas (PPO) capaces de desmetilar un mono- o di-metoxifenol sustituido con R representado por

las fórmulas [1], [2] o [3] anteriores, en las que R puede ser cualquier átomo individual o resto químico. R puede ser un resto orgánico. Preferiblemente, dichas PPO comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos de al menos una de las SEQ ID NO: 37, 41 o 45. Preferiblemente, la PPO es una enzima que comprende un dominio central de tirosinasa. La PPO puede obtenerse de un hongo, preferiblemente un Myceliophthora. La PPO puede obtenerse de Myceliophthora thermophila C1. Preferiblemente, la PPO es una enzima que libera metanol de un di-metoxifenol sustituido en R representado por donde R es un resto orgánico. Preferiblemente, el mono- o di-metoxifenol sustituido con R es un di-metoxifenol sustituido con R representado por la fórmula [1].

En el presente documento se proporcionan métodos de desmetilación de un mono- o di-metoxifenol sustituido con R representado por la fórmula [1], [2] o [3], en la que R puede ser cualquier átomo individual o resto químico, que comprende poner en contacto un sustrato que comprende dicho mono- o di-metoxifenol sustituido con R con una polifenoloxidasa (PPO) capaz de desmetilar dicho mono- o di-metoxifenol sustituido con R como se proporciona en el presente documento. El sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R puede comprender además, o ponerse en contacto con, una sal de cobre. La sal de cobre se puede seleccionar del grupo que consiste en CuSO4, CuCl2, CuBr2, CuF2, Cu(OH)2 y Cu(NO3)2. En algunas descripciones, la concentración de sal de cobre es de 1 a 1000 |uM. En algunas descripciones, el sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R tiene un pH entre 5,0 y 8,0. En algunas descripciones, el método se realiza a una temperatura entre 20 y 60°C. En algunas descripciones, el mono- o di-metoxifenol sustituido en R es ácido siríngico, ácido sinápico, siringol y/o una combinación de los mismos. En el método de desmetilación proporcionado en el presente documento la fuente del mono- o di-metoxifenol sustituido en R puede ser lignina.

En el presente documento se proporcionan procesos para aumentar la reactividad de la lignina o de biomasa que comprende lignina, donde dichos procesos comprenden un método de desmetilación proporcionado en el presente documento. También se proporcionan en este documento procesos para la conversión de lignina o de biomasa que comprende lignina en productos tales como biocombustibles, macromoléculas y/o productos químicos aromáticos, donde dichos procesos comprenden un método de desmetilación proporcionado en este documento.

En el presente documento se proporcionan procesos para degradar y/o modificar la celulosa en un sustrato que comprende hemicelulosa, donde dicho proceso comprende la etapa de poner en contacto dicho sustrato con una enzima accesoria y una PPO capaz de desmetilar un mono o di-metoxifenol sustituido con R representado por la fórmula [1], [2] o [3], donde R puede ser cualquier átomo individual o resto químico. En realizaciones, el proceso comprende la etapa de mezclar un mono- o di-metoxifenol sustituido con R representado por la fórmula [1], [2] o [3] donde R puede ser cualquier átomo individual o resto químico. La enzima accesoria es una polisacárido monooxigenasa lítica (LPMO) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 93. En realizaciones, el proceso es un proceso para sacarificación, para degradar DDG, para cocción, para preparar masa, para clarificar zumos de frutas, verduras o cereales, para macerar verduras o alimentos y/o para aumentar la digestibilidad y/o las propiedades nutricionales de materias primas animales o alimentos para animales.

En el presente documento se proporcionan vectores de expresión que codifican una PPO capaz de desmetilar un compuesto de fórmula [1], [2] o [3] donde R puede ser cualquier átomo individual o resto químico. En algunas descripciones, la PPO comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 41 o 45. En algunas descripciones, vectores de expresión pueden codificar adicionalmente una LPMO que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 93.

También se proporcionan en el presente documento células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión proporcionados en el presente documento.

Se proporcionan en el presente documento formulaciones líquidas, en pasta o sólidas para su uso en los métodos de desmetilación proporcionados el presente documento, donde dicha formulación comprende una PPO proporcionada en el presente documento, y preferiblemente comprende además una o más enzimas adicionales. En algunas descripciones, la formulación comprende además una LPMO que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 93.

En el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden un sustrato que comprende mono- o dimetoxifenol sustituido con R, donde dicha composición comprende además una PPO descrita en este documento, un vector de expresión descrito en este documento, una célula hospedante descrita en este documento, una formulación líquida, en pasta o sólida descrita en este documento y/o una combinación de los mismos. En algunas descripciones, la composición es una mezcla de sacarificación de biomasa, una composición o masa de cocción, un pienso para animales o una premezcla de piensos, material lignocelulósico, papel y/o pulpa.

En el presente documento se proporcionan los usos en un método o proceso de una PPO descrita en el presente documento, de un vector de expresión descrito en el presente documento, de una célula hospedante descrita en el presente documento, de una formulación líquida, en pasta o sólida descrita en el presente documento, y/o de una composición proporcionada en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Propuesta de reacción catalizada por PPO7 con ácido siríngico. La enzima de la presente invención cataliza la desmetilación de compuestos fenólicos sustituidos con dimetoxi (sustituyentes orto). La enzima también cataliza la posterior oxidación del catecol a la quinona.

Figura 2: Espectros de absorbancia diferencial (blanco de ácido siríngico sustraído) de la reacción del ácido siríngico con PPO7 y PPO2 purificadas después de 24 h.

Figura 3: Cambio de color visual tras la incubación de ácido siríngico con PPO7, PPO2 purificadas y blanco tal como se describe en el Ejemplo.

Figura 4: Datos de UV-VIS de las reacciones de PPO sin purificar con ácido sináptico (Figura 4a), ácido siríngico (Figura 4b) y siringol (Figura 4c). Se restaron los blancos de enzimas.

Figura 5: Datos de UHPLC (Figura 5a), MS (Figura 5b) y MS2 (Figura 5c) correspondientes a la reacción de PPO con ácido siríngico. Los datos confirman la formación de ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico.

Descripción detallada

Para definir adicionalmente esta invención, se proporcionan aquí los siguientes términos y definiciones.

En el presente documento se describe el descubrimiento de la desmetilación catalizada por PPO de lignina, de compuestos derivados de lignina y de otros mono- o di-metoxifenoles sustituidos en R, tal como se define en el presente documento. Hasta donde sabemos, no se ha observado previamente que una PPO (de tipo tirosinasa) catalice dicha actividad. Tal como se usa en este documento, los términos "lignina", "lignen", "sacarificación", "azúcares fermentables", "biomasa", "material lignocelulósico", "biomasa agrícola", "cultivos energéticos", "celulosa" y "hemicelulosa" son para ser entendidos aquí tal como se definen en el documento WO2013/159005 A2. Tal como se usa en este documento, "oxidorreductasa", "oxidasa", "monooxigenasas", "hidroxilasas", "deshidrogenasas", "celobiosa deshidrogenasa", "celobiosa deshidrogenasas", "celobiosa oxidasas", "carbohidrasa", "glucósido hidrolasa", "glicosil hidrolasa", "glicosidasa", "endoglucanasa", "celobiohidrolasa" y "hemicelulasa", "xilanasa", "pmananasa", "endo-1,4-p-manosidasa", "manano endo-1,6-a-manosidasa", "p-manosidasa", "galactanasa", "endo-p-1,6-galactasa", "arabinogalactano endo-1,4-p-galactosidasa", "glucoamilasa", "p-hexosaminidasa", "p-N-acetilglucosaminidasa", "a-L-arabinofuranosidasa", "a-N-arabinofuranosidasa", "a-arabinofuranosidasa", "arabinosidasa", "arabinofuranosidasa", "endo-arabinasa", "exo-arabinasa", "p-xilosidasa", "quitosanasa", "exopoligalacturonasa", "acetil xilano esterasa", "acetilmanano esterasa", "esterasa ferúlica", "esterasa de ácido ferúlico", "esterasa de ácido cumárico", "pectato liasa", "pectina liasas", "endo-1,3-p-glucanasa", "laminarinasa", "liquenasa", "glicosidasas" y "ligninasa" deben entenderse en el presente documento tal como se definen en el documento WO 2013/159005 A2.

Tal como se usa en este documento, una "biomasa" se entiende aquí como se define en el documento WO2013/159005 A2, es decir, que incluye materiales que contienen celulosa y/o hemicelulosa. Generalmente, estos materiales también contienen pectina, lignina, proteínas, carbohidratos (como almidón y azúcar) y cenizas. La lignocelulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en los tallos, hojas, vainas, cáscaras y mazorcas de plantas u hojas, ramas y madera de árboles. La biomasa puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen, tal como biomasa agrícola, productos orgánicos comerciales, residuos de construcción y demolición, residuos sólidos urbanos, residuos de papel y residuos de jardín. Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, remolacha azucarera, soja, maíz, cáscaras de maíz, grano de maíz, incluida la fibra de los granos, productos y subproductos de la molienda de granos tales como maíz, tabaco, trigo y cebada (incluida la molienda en húmedo y en seco), así como los residuos sólidos urbanos, los residuos de papel y los residuos de jardín. La biomasa también puede ser, aunque sin limitación, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos, residuos de papel y residuos de fabricación de pulpa y papel. La "biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, maíz y cáscaras de maíz, cultivos energéticos, algas, frutas, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, cortezas, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, cultivos leñosos de rotación corta, arbustos, pastos varilla, árboles, verduras, cáscaras de frutas, enredaderas, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cáscaras de avena, turba, compost de hongos y maderas duras y blandas (sin incluir maderas con materiales nocivos). Además, la biomasa agrícola incluye materiales de desecho orgánicos generados a partir de procesos agrícolas, incluidas las actividades agrícolas y forestales, incluidos específicamente los desechos de madera forestal. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de las mencionadas anteriormente individualmente o en cualquier combinación o mezcla de las mismas. La “biomasa agrícola” incluye ramas, arbustos, cañas, maíz y cáscaras de maíz, cultivos energéticos, algas, frutas, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, cultivos leñosos de rotación corta, arbustos, pastos varilla, árboles, verduras, cáscaras de frutas, enredaderas, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cáscaras de avena, turba, compost de hongos y maderas duras y blandas ( sin incluir maderas con materiales nocivos). Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados a partir de procesos agrícolas, incluidas las actividades de formación y silvicultura, que incluyen específicamente los residuos de madera forestal. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de las mencionadas anteriormente individualmente o en cualquier combinación o mezcla de las mismas.

Tal como se usa en este documento, un "resto orgánico" es un átomo de H u O, un grupo -OH o un alquilo ramificado, lineal o cíclico que está opcionalmente sustituido y que puede variar desde un solo átomo hasta una estructura grande, opcionalmente ramificada.

Tal como se usa en este documento, la referencia a una "enzima" incluye enzimas o proteínas naturales o de tipo silvestre de longitud completa (los términos enzima y proteína se usan aquí de manera intercambiable) y sus formas glicosiladas o modificadas de cualquier otro modo, proteínas de fusión o cualquier fragmento u homólogo o variante de dicha enzima o proteína. Preferiblemente, una enzima es una enzima o proteína aislada. Una enzima o proteína aislada debe entenderse en el presente documento como una enzima o proteína (incluido un polipéptido o péptido) que ha sido separada de su medio natural (es decir, que ha sido objeto de manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas recombinantemente, proteínas producidas sintéticamente, proteínas complejadas con lípidos, proteínas solubles y proteínas aisladas asociadas con otras proteínas, por ejemplo. Como tal, "aislado" no refleja hasta qué punto se ha purificado la proteína. Preferiblemente, una proteína aislada se produce recombinantemente. Adicionalmente, y a modo de ejemplo, una “proteína de M. thermophila" o una "enzima de M. thermophila" se refieren a una proteína (que generalmente incluye un homólogo o variante de una proteína de origen natural) de Myceliophthora thermophila, o a una proteína que se ha producido de otra manera a partir del conocimiento de la estructura (por ejemplo, la secuencia) y preferiblemente de la función de una proteína natural de Myceliophthora thermophila. En otras palabras, una proteína de M. thermophila incluye cualquier proteína que tenga una estructura y una función sustancialmente similares a las de una proteína de M. thermophila o que es un homólogo o variante biológicamente activo (es decir, tiene actividad biológica) de una proteína natural de M. thermophila como se describe en detalle en este documento. Como tal, una proteína de M. thermophila puede incluir proteínas purificadas, parcialmente purificadas, recombinantes, mutadas/modificadas y sintéticas.

Tal como se usa en este documento, la frase "actividad biológica" de una proteína se refiere a cualquier función(es) exhibida(s) o realizada(s) por la proteína que se atribuye(n) a la forma natural de la proteína medida u observada in vitro o in vivo. Un fragmento de proteína comprende preferiblemente un dominio de una proteína que tiene la actividad catalítica de la enzima de longitud completa. Un fragmento de proteína incluye, aunque sin limitación, un fragmento que comprende un dominio catalítico (CD) y/o un módulo de unión a carbohidratos (CBM). Por ejemplo, un fragmento de proteína puede comprender un CD de una proteína pero no un CBM de la proteína o un CBM de una proteína pero no un CD. De manera similar, se pueden combinar dominios de diferentes proteínas. Los fragmentos de proteína que comprenden un CD, CBM o combinaciones de los mismos para cada proteína descrita en el presente documento se pueden producir fácilmente usando técnicas estándar conocidas en la técnica.

Una enzima o proteína, que incluye un homólogo, variante o fragmento de la misma biológicamente activo, tiene al menos una característica de actividad biológica de una proteína de tipo silvestre o de origen natural. Tal como se discutió anteriormente, en general, la actividad biológica o la acción biológica de una proteína se refiere a cualquier función exhibida o realizada por la proteína que se atribuye a la forma natural de la proteína medida u observada in vivo (es decir, en el entorno fisiológico natural de la proteína) o in vitro (es decir, en condiciones de laboratorio). La actividad biológica de una proteína como se describe en este documento puede incluir una actividad enzimática (actividad catalítica y/o actividad de unión al sustrato), tal como oxidasas, oxigenasas, monooxigenasas, monooxigenasas de Baeyer-Villiger, dioxigenasas, peroxidasas, deshidrogenasas, reductasas que catalizan una reacción de oxidación-reducción o cualquier otra actividad descrita en este documento. Las actividades biológicas específicas de las proteínas descritas en el presente documento se describen en detalle en el presente documento y en los Ejemplos. Los métodos para detectar y medir la actividad biológica de una proteína tal como se describe en este documento incluyen, aunque sin limitación, los ensayos descritos en la sección de Ejemplos incluida más adelante. Dichos ensayos incluyen, aunque sin limitación, la medición de la actividad enzimática (por ejemplo, de la actividad catalítica), la medición de la unión al sustrato y similares. Otros ensayos y métodos para examinar la actividad de las enzimas se encuentran en las Solicitudes de Patente de EE.UU. 60/806.876, 60/970.876, 11/487.547, 11/775.777, 11/833.133, y 12/205.694 y en las Publicaciones de Solicitudes de Patente de EE.UU. US20080076159A1, US20090099079A1, US20070238155A1, US20090280105A1.

Cabe destacar que no se requiere que una enzima o proteína (incluidos homólogos o variantes) tenga una actividad biológica de tipo actividad catalítica. Una proteína puede ser una proteína truncada, mutada o inactiva, o carecer de al menos una actividad de la enzima de tipo silvestre, por ejemplo. Las proteínas inactivas pueden ser útiles en algunos ensayos de cribado. Los métodos para medir los niveles de expresión de una proteína incluyen, aunque sin limitación: transferencia de Western, inmunocitoquímica, citometría de flujo u otros ensayos basados en inmunología; ensayos basados en una propiedad de la proteína que incluyen, aunque sin limitación, unión a ligandos o interacción con otras proteínas asociadas.

Las modificaciones de una proteína, tal como en un homólogo o variante, pueden dar como resultado proteínas que tienen la misma actividad biológica que la proteína de origen natural, o proteínas que tienen una actividad biológica aumentada o disminuida en comparación con la proteína de origen natural. Las modificaciones que dan como resultado una disminución en la expresión de la proteína o una disminución en la actividad de la proteína, pueden denominarse inactivación (completa o parcial), regulación a la baja o disminución de la acción de una proteína. De manera similar, las modificaciones que dan como resultado un aumento en la expresión de la proteína o un aumento en la actividad de la proteína, pueden denominarse amplificación, sobreproducción, activación, mejora, regulación al alza o aumento de la acción de una proteína.

Tal como se usa en este documento, los términos "modificación", "mutación" y "variante" se pueden usar indistintamente con respecto a las modificaciones/mutaciones en la secuencia de aminoácidos de una proteína de M. thermophila (o de secuencias de nucleótidos) descritas en este documento.

El término "modificación" también se puede usar para describir modificaciones post-traduccionales en una proteína o péptido que incluyen, aunque sin limitación, metilación, farnesilación, carboximetilación, geranilación de geranilo, glicosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmilación y/o amidación. La modificación también puede incluir la escisión de un péptido señal, o metionina, u otras porciones del péptido que requieren escisión para generar el péptido maduro.

Tal como se usa en este documento, los términos "homólogo" o "variantes" se usan para referirse a una proteína o péptido que difiere de una proteína o péptido natural (es decir, la proteína "prototipo" o "de tipo silvestre") por modificaciones menores a la proteína o péptido de origen natural, pero que mantiene la estructura de la cadena lateral y la proteína básica de la forma de origen natural. Dichos cambios incluyen, aunque sin limitación: cambios en una o unas pocas cadenas laterales de aminoácidos; cambios en uno o unos pocos aminoácidos, incluyendo eliminaciones (por ejemplo, una versión truncada de la proteína o péptido), inserciones y/o sustituciones; cambios en la estereoquímica de uno o algunos átomos; y/o derivatizaciones menores, que incluyen pero no se limitan a, por ejemplo: metilación, glicosilación y fosforilación. Un homólogo o variante puede tener propiedades mejoradas, disminuidas o sustancialmente similares en comparación con la proteína o péptido de origen natural. Un homólogo o variante puede incluir un agonista de una proteína o un antagonista de una proteína.

Los homólogos o variantes pueden ser el resultado de una variación alélica natural o de una mutación natural. Una variante alélica de origen natural de un ácido nucleico que codifica una proteína es un gen que se encuentra esencialmente en la mismo localización (o localizaciones) en el genoma que el gen que codifica dicha proteína, pero que, debido a variaciones naturales causadas por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene una secuencia similar pero no idéntica. Homólogo también puede ser el resultado de una duplicación y reordenamiento de genes, lo que da como resultado una ubicación diferente. Las variantes alélicas típicamente codifican proteínas que tienen una actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el que se comparan. Una clase de variantes alélicas puede codificar la misma proteína pero tener diferentes secuencias de nucleótidos debido a la degeneración del código genético. Las variantes alélicas también pueden comprender alteraciones en las regiones no traducidas 5' o 3' del gen (por ejemplo, en regiones de control regulador). Las variantes alélicas son bien conocidas por los especialistas en la técnica.

Se pueden producir homólogos o variantes usando técnicas conocidas en la técnica para la producción de proteínas que incluyen, aunque sin limitación, modificaciones directas a la proteína de origen natural, síntesis directa de proteínas o modificaciones a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína usando, por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes para efectuar una mutagénesis aleatoria o dirigida.

Una proteína modificada también incluye una proteína de fusión que incluye un dominio de una proteína tal como se describe en este documento (incluido un homólogo o variante) unido a uno o más segmentos de fusión, que son típicamente heterólogos en secuencia respecto a la secuencia de la proteína (es decir, diferentes a la secuencia de proteínas). Los segmentos de fusión adecuados en una proteína modificada incluyen, aunque sin limitación, segmentos que pueden: mejorar la estabilidad de una proteína; proporcionar otra actividad biológica deseable; y/o ayudar con la purificación de la proteína (por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad). Un segmento de fusión adecuado puede ser un dominio de cualquier tamaño que tenga la función deseada (por ejemplo, que confiere una mayor estabilidad, solubilidad, acción o actividad biológica; y/o que simplifica la purificación de una proteína). Los segmentos de fusión se pueden unir a los extremos amino y/o carboxilo del dominio de una proteína tal como se describe en el presente documento y pueden ser susceptibles de escisión para permitir la recuperación directa de la proteína. Las proteínas de fusión se producen preferiblemente cultivando una célula recombinante transfectada con una molécula de ácido nucleico de fusión que codifica una proteína que incluye el segmento de fusión unido al extremo carboxilo y/o amino terminal de un dominio de una proteína tal como se describe en el presente documento. Por consiguiente, las proteínas descritas en el presente documento también incluyen productos de expresión de fusiones de genes (por ejemplo, utilizadas para sobreexpresar formas activas solubles de la proteína recombinante), de genes mutagenizados (tal como genes que tienen modificaciones de codones para mejorar la transcripción y la traducción de genes), y de genes truncados (tales como genes a los que se han eliminado los módulos de unión a la membrana para generar formas solubles de una proteína de membrana, o genes a los que se han eliminado las secuencias señal que son poco toleradas en un hospedante recombinante particular).

Una proteína modificada también incluye una proteína tal como se describe aquí que ha sido modificada por sustitución conservativa de aminoácidos. "Sustituciones conservativas de aminoácidos" se refiere a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos preferidos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alaninavalina y asparagina-glutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descrita en este documento son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo de las secuencias descritas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácidos es conservativo. Las sustituciones conservativas preferidas para cada uno de los aminoácidos de origen natural son las siguientes: Ala a Ser; Arg a Lys; Asn a Gln o His; Asp a Glu; Cys a Ser o Ala; Gln a Asn; Glu a Asp; Gly a Pro; His a Asn o Gln; Ile a Leu o Val; Leu a Ile o Val; Lys a Arg; Gln o Glu; Met a Leu o Ile; Phe a Met, Leu o Tyr; Ser a Thr; Thr a Ser; Trp a Tyr; Tyr a Trp o Phe; y Val a Ile o Leu.

Una proteína o polipéptido definidos como "que consiste esencialmente en" una secuencia de aminoácidos especificada, es una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento producida a partir de al menos uno, y hasta aproximadamente 20, aminoácidos heterólogos adicionales que flanquean cada uno de los extremos C-y/o N-terminales de la secuencia de aminoácidos especificada. Los aminoácidos heterólogos son una secuencia de aminoácidos que no se encuentran naturalmente (es decir, no se encuentran en la naturaleza, in vivo) que flanquean la secuencia de aminoácidos especificada, o que no están relacionados con la función de la secuencia de aminoácidos especificada, o que no serían codificados por los nucleótidos que flanquean la secuencia de nucleótidos de origen natural que codifica la secuencia de aminoácidos especificada como ocurre en el gen, si tales nucleótidos en la secuencia de origen natural se tradujeron empleando el uso de codones estándar para el organismo del que se deriva la secuencia de aminoácidos dada. Además, y únicamente a modo de ejemplo, una proteína a la que se hace referencia como derivada se deriva de un organismo particular, tal como un hongo como se ha definido aquí anteriormente.

Muchas de las enzimas y proteínas descritas en este documento pueden ser dianas deseables para su modificación y uso en los procesos descritos en este documento. Estas proteínas se han descrito en términos de función y secuencia de aminoácidos (y de secuencia de nucleótidos que las codifica) de proteínas representativas de tipo silvestre. Los homólogos o variantes de una proteína contemplada comprenden preferiblemente, consisten esencialmente en, o consisten en, una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 35%, 45%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, y más preferiblemente idéntica en al menos un 95%, idéntica en un 96%, 97%, y más preferiblemente idéntica en al menos aproximadamente un 99%, o cualquier porcentaje de identidad entre 35% y 99%, en números enteros (es decir, 36%, 37%, etc.), a una secuencia de aminoácidos descrita en este documento que representa la secuencia de aminoácidos de una enzima o proteína descrita en este documento (que incluye un dominio biológicamente activo de una proteína de longitud completa). Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del homólogo o variante tiene una actividad biológica de la proteína de referencia o de tipo silvestre o de un dominio biológicamente activo de la misma (por ejemplo, un dominio catalítico). Cuando se indican posiciones de mutación, se usa típicamente la posición de aminoácido del tipo silvestre. El tipo silvestre también puede denominarse "progenitor". Además, cualquier generación anterior a la variante en cuestión puede ser progenitora.

El tamaño mínimo de una proteína y/o un homólogo, variante o fragmento es un tamaño suficiente para tener actividad biológica o, cuando no se requiere que la proteína tenga dicha actividad, suficiente para ser útil para otro propósito asociado con una proteína tal como se describe en este documento, como para la producción de anticuerpos que se unen a una proteína de origen natural. Preferiblemente, la proteína descrita en este documento tiene al menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250 aminoácidos de longitud, etc., hasta la longitud completa de cada proteína, e incluyendo cualquier tamaño intermedio en incrementos de un entero (un aminoácido). No hay límite, aparte de un límite práctico, en el tamaño máximo de dicha proteína en el sentido de que la proteína puede incluir una porción de una proteína o una proteína de longitud completa, más una secuencia adicional (por ejemplo, una secuencia de proteína de fusión), si se desea.

Tal como se usa en este documento, a menos que se especifique lo contrario, la referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una evaluación de homología que se realiza usando: 1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST usando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácidos nucleicos con parámetros predeterminados estándar, donde la secuencia de consulta se filtra para regiones de baja complejidad de forma predeterminada (descrito en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. y Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402); 2) una alineación BLAST 2 (usando los parámetros descritos a continuación); 3) PSI-BLAST con los parámetros predeterminados estándar (BLAST iterado de posición específica); y/o 4) Homología CAZy determinada utilizando parámetros predeterminados estándar de la base de datos Carbohydrate Active EnZymes (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, págs. 3-12) y/o aplicando una estrategia similar utilizando bases de datos como la base de datos Foly (sitio web: foly.esil.univ-mrs.fr) y la PeroxiBase (sitio web: peroxibase.isb-sib.ch).

Cabe destacar que debido a algunas diferencias en los parámetros estándar entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, se podría reconocer que dos secuencias específicas tienen una homología significativa usando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST usando una de las secuencias como secuencia de consulta puede no identificar la segunda secuencia en las coincidencias superiores. Además, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada y fácil de usar de una búsqueda de "perfil", que es una forma sensible de buscar homólogos o variantes de secuencia. El programa primero realiza una búsqueda en la base de datos BLAST con espacios vacíos. El programa PSI-BLAST utiliza la información de cualquier alineación significativa devuelta para construir una matriz de puntuación específica de la posición, que reemplaza la secuencia de consulta para la siguiente ronda de búsqueda en la base de datos. Por lo tanto, debe entenderse que el porcentaje de identidad se puede determinar utilizando cualquiera de estos programas.

Se pueden alinear dos secuencias específicas entre sí usando la secuencia BLAST 2 como se describe en Tatusova y Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250. La alineación de secuencia BLAST 2 se realiza en blastp o blastn usando el algoritmo BLAST 2.0 para realizar una búsqueda BLAST con huecos (BLAST 2.0) entre las dos secuencias, lo que permite la introducción de huecos (eliminaciones e inserciones) en la alineación resultante. Para mayor claridad en el presente documento, se realiza una alineación de secuencia BLAST 2 usando los parámetros predeterminados estándar como se indica a continuación.

Para blastn, usando la matriz 0 BLOSUM62:

Recompensa por coincidencia = 1

Penalización por falta de coincidencia = -2

Penalizaciones de hueco abierto (5) y hueco de extensión (2)

gap x_dropoff (50) espera (10) tamaño de palabra (11) filtro (activado)

Para blastp, usando la matriz 0 BLOSUM62:

Penalizaciones de hueco abierto (11) y de hueco de extensión (1)

gap x_dropoff (50) espera (10) tamaño de palabra (3) filtro (activado).

A menos que se indique lo contrario en el presente documento, la identidad con una SEQ ID NO dada significa una identidad basada en la longitud completa de dicha secuencia (es decir, en toda su longitud o en su totalidad).

Tal como se usa en este documento, el término "contiguo" o "consecutivo", con respecto a las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos descritas en este documento, significa estar conectado en una secuencia ininterrumpida. Por ejemplo, para que una primera secuencia comprenda 30 aminoácidos contiguos (o consecutivos) de una segunda secuencia, significa que la primera secuencia incluye una secuencia ininterrumpida de 30 residuos de aminoácidos que es 100% idéntica a una secuencia ininterrumpida de 30 residuos de aminoácidos de la segunda secuencia. De manera similar, para que una primera secuencia tenga "100% de identidad" o sea "100% idéntica" con respecto a una segunda secuencia, significa que la primera secuencia coincide exactamente con la segunda secuencia sin espacios entre nucleótidos o aminoácidos. Una proteína tal como se describe en este documento, que incluye un homólogo o variante, preferiblemente incluye una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es suficientemente similar a una secuencia de aminoácidos natural para que una secuencia de nucleótidos que codifica el homólogo o variante sea capaz de hibridarse en condiciones de severidad moderadas, altas o muy altas (descritas a continuación) para (es decir, con) una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína natural (es decir, al complemento de la cadena de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos natural). Preferiblemente, un homólogo o variante de una proteína está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de severidad baja, moderada o alta con el complemento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO 1-6, 10, 13, 14, 17, 18, 21,22, 25, 26, 29, 30, 33, 34, 37, 38, 41,42, 45 y 46. Tales condiciones de hibridación se describen en detalle más adelante.

Un complemento de secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína tal como se describe en este documento se refiere a la secuencia de nucleótidos de la cadena de ácido nucleico que es complementaria a la cadena que codifica la proteína. Se apreciará que un ADN bicatenario que codifica una secuencia de aminoácidos dada comprende un ADN monocatenario y su cadena complementaria tiene una secuencia que es un complemento del ADN monocatenario. Como tales, las moléculas de ácido nucleico pueden ser bicatenarias o monocatenarias, e incluyen aquellas moléculas de ácido nucleico que forman híbridos estables en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos tal como las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID. NOs 1-6, 10, 13, 14, 17, 18, 21,22, 25, 26, 29, 30, 33, 34, 37, 38, 41,42, 45 o 46 o una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs 7-9, 11, 12, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 31, 32, 35, 36, 39, 40, 43, 44, 47 o 48. Los métodos para deducir una secuencia complementaria son conocidos por los especialistas en la técnica. Cabe señalar que, dado que las tecnologías de secuenciación de ácidos nucleicos no están completamente libres de errores, las secuencias presentadas en este documento, en el mejor de los casos, representan secuencias aparentes de las proteínas descritas en este documento.

Tal como se usa en este documento, la referencia a condiciones de hibridación se refiere a condiciones de hibridación estándar bajo las cuales se usan moléculas de ácido nucleico para identificar moléculas de ácido nucleico similares. Tales condiciones estándar se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook y col., ver anterior, (ver específicamente las páginas 9.31-9.62). Además, las fórmulas para calcular las condiciones apropiadas de hibridación y lavado para lograr la hibridación que permita diversos grados de falta de coincidencia de nucleótidos se describen, por ejemplo, en Meinkoth y col., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth y col., ver anterior.

Más particularmente, las condiciones de hibridación y lavado de severidad moderada, tal como se hace referencia en este documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia de nucleótidos con la molécula de ácido nucleico que se usa como sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 30% o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado de alta severidad, tal como se hace referencia en este documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia de nucleótidos con la molécula de ácido nucleico que se usa como sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 20% o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado de muy alta severidad, tal como se hace referencia en este documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia de nucleótidos con la molécula de ácido nucleico que se usa como sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 10% o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Tal como se discutió anteriormente, un especialista en la técnica puede usar las fórmulas de Meinkoth et al., ver anterior, para calcular las condiciones apropiadas de hibridación y lavado para lograr estos niveles particulares de falta de coincidencia de nucleótidos. Tales condiciones variarán, dependiendo de si se están formando híbridos de ADN:ARN o ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para los híbridos de ADN:ADN son 10°C menos que para los híbridos de ADN:ARN. Preferiblemente, las condiciones de hibridación severas para los híbridos de ADN:ADN incluyen la hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (0,9 M de Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 35°C (menor severidad), más preferiblemente, entre aproximadamente 28°C y aproximadamente 40°C (más severo), e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 45°C (aún más severo), con condiciones de lavado adecuadas. Preferiblemente, las condiciones de hibridación rigurosas para los híbridos de ADN:ARN incluyen la hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (0,9 M de Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 45°C, más preferiblemente, entre aproximadamente 38°C y aproximadamente 50°C, e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 55°C, con unas condiciones de lavado igualmente severas. Estos valores se basan en cálculos de una temperatura de fusión (Tf) para moléculas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos, 0% de formamida y un contenido de G C de aproximadamente 40%. Alternativamente, la Tf se puede calcular empíricamente tal como se establece en Sambrook et al., ver anterior, páginas 9.31 a 9.62. En general, las condiciones de lavado deberían ser lo más severas posible y deberían ser apropiadas para las condiciones de hibridación elegidas. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de condiciones de salinidad y temperatura que están aproximadamente 20-25°C por debajo de la Tf calculada de un híbrido particular, y las condiciones de lavado típicamente incluyen una combinación de condiciones de salinidad y temperatura que están aproximadamente 12-20°C por debajo de la Tf calculada del híbrido particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para su uso con híbridos de ADN:ADN incluye una hibridación de 2 a 24 horas en 6X SSC (50% de formamida) a aproximadamente 42°C, seguida de etapas de lavado que incluyen uno o más lavados a temperatura ambiente en aproximadamente 2X SSC, seguido de lavados adicionales a temperaturas más altas y menor fuerza iónica (por ejemplo, al menos un lavado a aproximadamente 37°C en aproximadamente 0,1X-0,5X SSC, seguido de al menos un lavado a aproximadamente 68°C en aproximadamente 0,1X 0,5X SSC).

Una molécula de ácido nucleico incluye una molécula de ácido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las enzimas o proteínas descritas en este documento, incluido un fragmento o un homólogo o variante de dichas proteínas, descritas anteriormente. Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de una proteína que no tiene actividad biológica, y también pueden incluir porciones de un gen o polinucleótido que codifica la proteína que no son parte de la región codificante de la proteína (por ejemplo, intrones o regiones reguladoras de un gen que codifica la proteína). Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir una secuencia de nucleótidos que sea útil como sonda o cebador (secuencias de oligonucleótidos). Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico aislada. Tal como se usa en este documento, una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) que se ha extraído de su medio natural (es decir, que ha sido objeto de manipulación humana) y puede incluir ADN, ARN o derivados de ADN o ARN, incluido el ADNc. Como tal, "aislada" no refleja el grado en que se ha purificado la molécula de ácido nucleico. Aunque la frase "molécula de ácido nucleico" se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física, y la frase "secuencia de nucleótidos" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico, las dos frases se pueden usar indistintamente, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de nucleótidos, que es capaz de codificar una proteína. Una molécula de ácido nucleico aislada puede aislarse de su fuente natural o ser producida utilizando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o mediante síntesis química. Las moléculas de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico aisladas pueden incluir, por ejemplo, genes, variantes alélicas naturales de genes, regiones codificantes o porciones de las mismas y regiones codificantes y/o reguladoras modificadas por inserciones, eliminaciones, sustituciones y/o inversiones de nucleótidos de manera tal que las modificaciones no interfieran sustancialmente con la capacidad de la molécula de ácido nucleico para codificar una proteína o para formar híbridos estables en condiciones severas con elementos aislados de genes naturales. Una molécula de ácido nucleico puede incluir degeneraciones. Tal como se usa en este documento, la degeneración de nucleótidos se refiere al fenómeno en el que un aminoácido puede ser codificado por diferentes codones de nucleótidos. Por tanto, la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína descrita en el presente documento puede variar debido a degeneraciones. Cabe destacar que no se requiere que una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento codifique una proteína que tenga actividad proteica. Una molécula de ácido nucleico puede codificar una proteína truncada, mutada o inactiva, por ejemplo. Además, las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento son útiles como sondas y cebadores para la identificación, aislamiento y/o purificación de otras moléculas de ácido nucleico. Si la molécula de ácido nucleico es un oligonucleótido, tal como una sonda o cebador, el oligonucleótido preferiblemente varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 o aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nucleótidos, y más preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud.

La referencia a un gen incluye todas las secuencias de nucleótidos relacionadas con un gen natural (es decir, de tipo silvestre), tales como regiones reguladoras que controlan la producción de la proteína codificada por ese gen (tales como, aunque sin limitación, regiones de control de transcripción, traducción o post-traducción) así como la propia región codificante. Un gen puede ser una variante alélica de origen natural que incluye una secuencia similar pero no idéntica a la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína determinada. Las variantes alélicas se han descrito anteriormente. Los genes pueden incluir o excluir uno o más intrones o cualquier parte de los mismos, o cualquier otra secuencia, o que no esté incluida en el ADNc de esa proteína. Las frases "molécula de ácido nucleico" y "gen" se pueden usar indistintamente cuando la molécula de ácido nucleico comprende un gen como se ha descrito anteriormente.

Los genes modificados incluyen genes naturales modificados por sustitución, inserción y/o eliminación de secuencias de nucleótidos simples o múltiples, que pueden ocurrir dentro de la secuencia codificante, incluidos exones de regiones que codifican un polipéptido, o en regiones flanqueantes, tal como regiones reguladoras típicamente aguas arriba (por ejemplo, promotores, potenciadores y secuencias relacionadas), aguas abajo (por ejemplo, terminación transcripcional y señales poli(A)) o regiones internas (por ejemplo, intrones) que afectan la transcripción, traducción y/o activación de un polipéptido o molécula reguladora de interés. La activación de un polipéptido, por ejemplo, puede requerir la eliminación de una o más regiones polipeptídicas N-terminales, C-terminales o internas, y/o la modificación posttraduccional de residuos de aminoácidos específicos, como por glicosilación, amidación, etc., que puede alterar el direccionamiento, la degradación y la actividad catalítica de una enzima.

Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico tal como se describe en este documento se produce usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación, etc.) o mediante síntesis química. Las moléculas de ácido nucleico incluyen cualquier molécula de ácido nucleico y sus homólogos o variantes que son parte de un gen descrito en este documento y/o que codifican una proteína descrita en este documento, incluidas, entre otras, variantes alélicas naturales y moléculas de ácido nucleico modificadas (homólogos o variantes ) donde se han insertado, eliminado, sustituido y/o invertido nucleótidos de tal manera que tales modificaciones proporcionen el efecto deseado sobre la actividad biológica de las proteínas o sobre la actividad de la molécula de ácido nucleico. Las variantes alélicas y las proteínas homólogas o variantes (por ejemplo, proteínas codificadas por homólogos o variantes de ácidos nucleicos) se han discutido en detalle anteriormente.

Se puede producir un homólogo o variante de molécula de ácido nucleico (es decir, que codifica un homólogo o variante de una proteína descrita en el presente documento) utilizando varios métodos conocidos por los especialistas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al.). Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico se pueden modificar usando una variedad de técnicas que incluyen, entre otras, mutagénesis clásica y técnicas de ADN recombinante (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, tratamiento químico, escisión con enzimas de restricción, ligación de fragmentos de ácido nucleico y/o amplificación por PCR), o síntesis de mezclas de oligonucleótidos y ligación de grupos de mezcla para "construir" una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de las mismas. Otro método para modificar una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína es el barajado de genes (es decir, la reproducción molecular) (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 5.605.793 a nombre de Stemmer; Minshull y Stemmer; 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 284-290; Stemmer, 1994, P.N.A.S. USA 91: 10747-10751). Esta técnica se puede utilizar para introducir de manera eficiente múltiples cambios simultáneos en la proteína. Los homólogos o variantes de moléculas de ácido nucleico se pueden seleccionar mediante hibridación con un gen o polinucleótido, o mediante cribado para la función de una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico (es decir, para la actividad biológica).

El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico tal como se describe en este documento es un tamaño suficiente para codificar una proteína (incluido un fragmento, homólogo o variante de una proteína de longitud completa) que tiene actividad biológica, suficiente para codificar una proteína que comprende al menos un epítopo que se une a un anticuerpo, o lo suficiente para formar una sonda o cebador oligonucleotídico que es capaz de formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína natural (por ejemplo, en condiciones de severidad moderada, alta o alta). Como tal, el tamaño de la molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína puede depender de la composición del ácido nucleico y del porcentaje de homología o identidad entre la molécula de ácido nucleico y la secuencia complementaria, así como de las condiciones de hibridación en sí mismas (por ejemplo, temperatura, concentración salina, y concentración de formamida). El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico que se usa como cebador oligonucleotídico o como sonda es típicamente de al menos alrededor de 12 a alrededor de 15 nucleótidos de longitud si las moléculas de ácido nucleico son ricas en GC y al menos alrededor de 15 a alrededor de 18 bases de longitud si son ricos en AT. No hay límite, aparte de un límite práctico, en el tamaño máximo de una molécula de ácido nucleico tal como se describe en este documento, ya que la molécula de ácido nucleico puede incluir una porción de una secuencia que codifica una proteína, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de longitud completa (incluido un gen), incluido cualquier fragmento de longitud entre aproximadamente 20 nucleótidos y el número de nucleótidos que componen el ADNc de longitud completa que codifica una proteína, en números enteros (por ejemplo, 20, 21,22, 23, 24, 25 nucleótidos), o múltiples genes, o porciones de los mismos. La frase "que consiste esencialmente en", cuando se usa en referencia a una secuencia de nucleótidos en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos especificada que puede estar flanqueada por al menos uno, y hasta aproximadamente 60, nucleótidos heterólogos adicionales en cada uno de los extremos 5 y/o 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos especificada. Los nucleótidos heterólogos no se encuentran de forma natural (es decir, no se encuentran en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos especificada tal como ocurre en el gen natural, o no codifican una proteína que imparte función adicional alguna a la proteína o que cambia la función de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos especificada.

Una molécula de ácido nucleico tal como se describe en el presente documento puede ser una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente que está ligada operativamente a al menos una secuencia de control de la expresión. Más particularmente, una molécula de ácido nucleico recombinante comprende típicamente un vector recombinante y una cualquiera o más de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Tal como se usa en este documento, un vector recombinante es una molécula de ácido nucleico diseñada (es decir, producida artificialmente) que se utiliza como herramienta para manipular una secuencia de nucleótidos de elección y/o para introducir dicha secuencia de nucleótidos en una célula hospedante. Por tanto, el vector recombinante es adecuado para su uso en la clonación, secuenciación y/o manipulación de la secuencia de nucleótidos de elección, tal como expresando y/o administrando la secuencia de nucleótidos de elección en una célula hospedante para formar una célula recombinante. Dicho vector contiene típicamente secuencias de nucleótidos que no se encuentran de forma natural adyacentes a la secuencia de nucleótidos que se va a clonar o administrar, aunque el vector también puede contener secuencias reguladoras de nucleótidos (por ejemplo, promotores, regiones no traducidas) que se encuentran adyacentes de forma natural a las secuencias de nucleótidos descritas en este documento o que son útiles para la expresión de las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento (discutidas en detalle más adelante). El vector puede ser ARN o ADN, procariótico o eucariótico, y típicamente es un plásmido. El vector se puede mantener como un elemento extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o se puede integrar en el cromosoma de una célula hospedante recombinante, aunque es preferible que el vector permanezca separado del genoma. El vector completo puede permanecer en su lugar dentro de una célula hospedante, o bajo ciertas condiciones, puede eliminarse el ADN de plásmido, dejando atrás la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. Una molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo el control del promotor cromosómico, bajo el control del promotor plásmido o nativo, o bajo una combinación de varios controles de promotor. Pueden integrarse en el cromosoma copias únicas o múltiples de la molécula de ácido nucleico. Un vector recombinante descrito en este documento puede contener al menos un marcador seleccionable.

Un vector recombinante usado en una molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento puede ser un vector de expresión. Tal como se usa en este documento, la frase "vector de expresión" se usa para referirse a un vector que es adecuado para la producción de un producto codificado (por ejemplo, una proteína de interés, tal como una enzima como se describe en este documento). Una secuencia de nucleótidos que codifica el producto que se va a producir (por ejemplo, la proteína u homólogo o variante de la misma) puede insertarse en un vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína que se va a producir se inserta en el vector de una manera que liga operativamente la secuencia de nucleótidos a las secuencias reguladoras en el vector, que permiten la transcripción y traducción de la secuencia de nucleótidos dentro de la célula hospedante recombinante. Normalmente, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye al menos una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento ligada operativamente a una o más secuencias de control de la expresión (por ejemplo, secuencias de control de la transcripción o secuencias de control de la traducción). Tal como se usa en este documento, la frase "molécula recombinante" o "molécula de ácido nucleico recombinante" se refiere principalmente a una molécula de ácido nucleico o secuencia de nucleótidos ligada operativamente a una secuencia de control de la transcripción, pero se puede usar indistintamente con la frase "molécula de ácido nucleico", cuando tal molécula de ácido nucleico es una molécula recombinante como se describe en el presente documento. Tal como se usa en este documento, la frase "ligada operativamente" se refiere a enlazar una molécula de ácido nucleico a una secuencia de control de expresión de una manera tal que la molécula pueda expresarse cuando se transfecte (es decir, se transforme, transduzca, transfecte, conjugue o conduzca) en una célula hospedante. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan el inicio, la elongación o la terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tales como las secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda funcionar en una célula u organismo hospedante en el que se va a introducir la molécula de ácido nucleico recombinante. Las secuencias de control de la transcripción también pueden incluir cualquier combinación de una o más de las anteriores.

Las moléculas de ácido nucleico recombinantes también pueden contener secuencias reguladoras adicionales, tales como secuencias reguladoras de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante. Una molécula recombinante, incluidas las que están integradas en el cromosoma de la célula hospedante, también puede contener señales secretoras (es decir, secuencias de nucleótidos del segmento señal) para permitir que una proteína expresada sea secretada por la célula que produce la proteína. Los segmentos de señal adecuados incluyen un segmento de señal que está asociado de forma natural a la proteína que se va a expresar o a cualquier segmento de señal heterólogo capaz de dirigir la secreción de la proteína como se describe en el presente documento. Una molécula recombinante puede comprender una secuencia líder para permitir que una proteína expresada se suministre e inserte en la membrana de una célula hospedante. Las secuencias líder adecuadas incluyen una secuencia líder que está asociada de forma natural a la proteína, o cualquier secuencia líder heteróloga capaz de dirigir la administración e inserción de la proteína a la membrana de una célula.

El término "transfección" se usa generalmente para referirse a cualquier método mediante el cual una molécula de ácido nucleico exógena (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) puede insertarse en una célula. El término "transformación" puede usarse indistintamente con el término "transfección" cuando dicho término se usa para referirse a la introducción de moléculas de ácido nucleico en células o plantas microbianas y describe un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por parte del microorganismo, que es esencialmente sinónimo del término "transfección". Las técnicas de transfección incluyen, aunque sin limitación, transformación, bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.

Un "xilo-oligómero" se define en el presente documento como un oligómero que se produce después de la escisión del enlace p-1,4 en la estructura del xilano. Preferiblemente, un xilo-oligómero es un xilano con enlaces en (3-(1 — ^4), opcionalmente sustituido, que consta de 2 a 50, o 2 a 30, o de 2 a 15, o de 2 a 10, o de 2 a 7 residuos de xilano. Un xilo-oligómero sustituido puede ser, aunque sin limitación, un xilo-oligómero sustituido con arabino, acetilo, glucorono y/o metilglucurono. Un "xilo-oligómero oxidado" es un xilo-oligómero que se oxida en el átomo de carbono C1 y/o C4 del xilo-oligómero.

Un "gluco-oligómero" se define aquí como un oligómero que se produce después de la escisión del enlace p-1,4 en la cadena principal de la celulosa. Preferiblemente, un gluco-oligómero es un glucano con enlaces en p-(1 — 4) que consta de 2 a 50, o 2 a 30, o preferiblemente de 2 a 15, o 2 a 10, o lo más preferiblemente de 2 a 6 residuos de glucano. Un "gluco-oligómero oxidado" es un gluco-oligómero que está oxidado en el átomo de carbono C1 y/o C4 del glucooligómero.

La palabra "aproximadamente" cuando se usa en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10) significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado más/menos el 10% del valor.

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usa en su sentido no limitativo para indicar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos no mencionados específicamente no están excluidos. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto claramente requiera que haya uno y sólo uno de los elementos. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno".

La presente invención se refiere a una actividad enzimática recientemente descubierta, es decir, a la desmetilación de un mono- o di-metoxifenol sustituido con R por enzimas polifenoloxidasa (PPO), en donde dicho mono- o di-metoxifenol sustituido con R está representado por la fórmula [1], [2] o [3], preferiblemente por la fórmula [1] o [2], lo más preferiblemente por la fórmula [1]. Dentro de cada una de las fórmulas [1], [2] y [3], R puede ser cualquier átomo individual o resto químico, pero preferiblemente es un resto orgánico tal como se define aquí, preferiblemente que comprende o consiste en 1 -1000 átomos, donde preferiblemente cada átomo se selecciona del grupo que consiste en C, N, H, O y S. R preferiblemente es -H, -OH, -COOH, -CH=CHCOOH, -CH2=CH2CH3OH o mono-, di- o polímero de lignina. El mono- o di-metoxifenol sustituido con R representado por la fórmula [1], [2] o [3] es, por ejemplo, cualquiera seleccionado del grupo que consiste en coniferilo, sinapilo, ácido siríngico, ácido sinápico, ácido ferúlico, ácido vainílico, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxicinámico, 2-metoxifenol (guayacol) y siringol. Se apreciará que se pueden emplear combinaciones de tales mono- o di-metoxifenoles sustituidos con R. El mono o di-metoxifenol sustituido con R es, por ejemplo, ácido 3-hidroxi-4-metoxicinámico, 4-hidroxi-3-metoxifenilactona, aldehído de coniferilo, ácido ferúlico, guayacol, hesperidina, ácido homovanílico, ácido vanílico, 4-alilo-2,4-metoxifenol, ácido 3,4-dihidroxibenzoico, 3-metilcatecol, ácido cafeico, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico o ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxicinámico. El mono-metoxifenol sustituido con R puede ser, por ejemplo, ácido 3-hidroxi-4-metoxicinámico, 4-hidroxi-3-metoxifenilactona, coniferil aldehído, ácido ferúlico, guayacol, ácido homovanílico, ácido vanílico o ácido cafeico. El di-metoxifenol sustituido con R puede ser, por ejemplo, 4-alil-2,4-metoxifenol. El dimetoxifenol sustituido con R puede ser, por ejemplo, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico o ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxicinámico. El mono- o di-metoxifenol sustituido con R representado por las fórmulas [1], [2] o [3], en las que R se define como se ha indicado anteriormente, se indica aquí además como un "mono- o di-metoxifenol sustituido con R".

Los mono- o di-metoxifenoles sustituidos con R están presentes en la lignina o en los materiales derivados de la lignina. Los inventores descubrieron que las PPO desmetilan di-metoxifenoles sustituidos con R tales como el ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico (ácido siríngico) con la formación de ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico, y con la liberación simultánea de metanol (ver Figura 1 y los Ejemplos). El modo de acción de la PPO es importante para mejorar la reactividad de la lignina o de los materiales derivados de la lignina y permitir su valorización.

En el presente documento se describe una enzima que pertenece a una clase de enzimas, es decir, las polifenoloxidasas fúngicas de tipo tirosinas o PPO, para las cuales se ha establecido por primera vez la desmetilación de compuestos mono- o di-metoxifenol sustituidos con R, tales como dimetoxifenol (siringol), ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico (ácido siríngico) y ácido 3-(4-hidroxi-3,5-dimetoxifenil)prop-2-enoico (ácido sinápico). Preferiblemente, la enzima consiste en un dominio de tirosinasa central común, preferiblemente de la familia con el número de acceso NCBI pfam00264 (Volbeda y Hol, J. Mol. Biol. Volumen 209(2): páginas 249-279, 1989). Preferiblemente, la enzima es una enzima que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100%, a cualquiera de SEQ ID NO: 37 (PPO4), SEQID NO: 41 (PPO6) y SEQ ID NO: 45 (PPO7). Las SEQ ID NO: 37, 41 y 45 representan la forma madura de PPO4, PPO6 y PPO7, respectivamente. Las s Eq ID NO: 38, 42 y 46 representan PPO4, PP06 y PPO7 que incluyen la secuencia señal, respectivamente. Preferiblemente, la enzima es una enzima que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100%, a cualquiera de SEQ ID NO: 37 (PPO4), Se Q ID NO: 41 (PPO6) o SEQ ID NO: 45 (PPO7) y comprende un dominio de tirosinasa central común, preferiblemente de la familia con el número de acceso NCBI pfam00264. Preferiblemente, dicha PPO se puede obtener a partir de un hongo, preferiblemente del género Myceliophthora. Ser "obtenible a partir de" debe entenderse aquí como que la enzima se origina en el organismo indicado, es decir, es producida naturalmente por el organismo indicado en forma de enzima nativa. Más preferiblemente, la PPO se origina en el hongo M. thermophila C1 o derivados del mismo, como un hongo M. thermophila C1 seleccionado entre Garg 27K, (N° de acceso VKM F-3500D), UV13-6 (N2 de acceso VKM F-3632 D); NG7C-19 (N2 de acceso VKM F-3633 D); UV18-25 (N2 de acceso VKM F-3631 D); cepa W1L (N2 de acceso CBS122189) o W1L#100L (N2 de acceso CBS122190), preferiblemente un M. thermophila C1 (N° de acceso VKM F-3500D).

Preferiblemente, la PPO de la descripción, preferiblemente para su uso en un método o proceso de la descripción, tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100%, con respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 37 (PPO4), SEQ ID NO: 41 (PPO6) o SEQ ID NO: 45 (PPO7), es capaz de desmetilar un mono- o di-metoxifenol sustituido con R tal como se define en el presente documento. Ser capaz de desmetilar un mono- o di-metoxifenol sustituido con R tal como se define en el presente documento, debe entenderse aquí como que tiene al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, preferiblemente al menos un 40%, de la actividad de desmetilación de PPO7 evaluada mediante un método conocido en la técnica para evaluar la actividad de desmetilación, preferiblemente usando un ensayo como se ejemplifica aquí y cuando se usa un mono- o di-metoxifenol sustituido con R como sustrato, preferiblemente dicho mono- o di-metoxifenol sustituido con R es ácido siríngico. En resumen, en dicho método, la secuencia codificante de la enzima de la descripción se clona en un vector pChi que posteriormente se transforma en la cepa W1 L#100.1 Apyr5AAlp1 de Myceliophthora thermophila C1 usando el marcador pyr5 como se ejemplifica en el presente documento (Ejemplo 1). Se realizan fermentaciones y posteriormente, se recolecta el caldo, se filtra para eliminar la biomasa fúngica, se concentra y se dializa frente a KPi 20 mM pH 7,0 más KCl 150 mM utilizando una membrana PES de 5 kDa (Vivacell® 70, Sartorius) como se ejemplifica aquí (Ejemplo 2). Opcionalmente, las muestras se liofilizan posteriormente para su almacenamiento y/o se purifican como se ejemplifica en el presente documento (Ejemplo 5). La actividad desmetilante de la enzima sin purificar o purificada se puede determinar midiendo una absorbancia negativa aumentada entre 230 nm y 300 nm de disolución de ácido siríngico incubada con la enzima (a temperatura ambiente durante 24 h en comparación con 0 h), preferiblemente como se ejemplifica aquí (Ejemplo 6). Se entiende aquí que una enzima de la descripción tiene al menos un 10% (o más) de la actividad de desmetilación de PPO7 si la enzima muestra un aumento en la absorbancia negativa que es al menos dicho porcentaje (es decir, 10% o más) del aumento obtenido al expresar, producir y purificar PPO7 exactamente en las mismas condiciones (es decir, utilizando la secuencia codificante de PPO7, SEQ ID NO: 48).

La actividad desmetilante de la enzima sin purificar o purificada también se puede determinar midiendo la producción de metanol de la disolución de ácido siríngico incubada con la enzima (a temperatura ambiente durante 90 h) como se ejemplifica en la presente memoria (Ejemplo 8). Se entiende que una enzima de la descripción tiene al menos el 10% (o más) de la actividad de desmetilación de PPO7 si la enzima muestra un aumento en la producción de metanol que es al menos dicho porcentaje (es decir, 10% o más) del aumento encontrado cuando se expresa, se produce y se purifica PPO7 exactamente en las mismas condiciones (es decir, utilizando la secuencia codificante de PPO7, SEQ ID NO: 48).

Preferiblemente, la enzima de la descripción tiene una actividad de desmetilación óptima en presencia de una sal de cobre a una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 pM, preferiblemente entre aproximadamente 20 y aproximadamente 1000 pM, en donde dicha sal de cobre se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en CuSO4, CuCl2, CuBr2, CuF2, Cu(OH)2 y Cu(NO3)2. Preferiblemente, la enzima de la descripción tiene una actividad de desmetilación óptima a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0. Preferiblemente, la enzima de la descripción tiene una actividad de desmetilación óptima a una temperatura entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60°C. Preferiblemente, la enzima de la descripción tiene actividad de desmetilación en presencia de una sal de cobre a una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 pM, preferiblemente entre aproximadamente 20 y aproximadamente 1000 pM, en donde dicha sal de cobre se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en CuSO4, CuCl2, CuBr2, CuF2, Cu(OH)2 y Cu(NO3)2, a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 y a una temperatura entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60°C.

Preferiblemente, la enzima de la descripción es capaz de desmetilar el ácido siríngico mono- o di-metoxifenol sustituido con R. Preferiblemente, la enzima es capaz de desmetilar un sustrato que comprende di-metoxifenol sustituido con R (representado por la fórmula I, en la que R es un resto orgánico). Más preferiblemente, la enzima de la descripción es capaz de desmetilar el ácido sinápico y siringol mono- o di-metoxifenol sustituido con R, preferiblemente como se evalúa en un método como se ejemplifica en el presente documento (Ejemplo 7). Preferiblemente, la enzima de la descripción es capaz de desmetilar lignina y compuestos derivados de lignina a partir de sustratos tales como paja de trigo, rastrojo de maíz, la fracción de peso molecular más bajo del fraccionamiento de lignina y lignina modificada con carboxi (trigo o maíz), preferiblemente según se evalúa como se ejemplifica aquí (Ejemplo 9). Preferiblemente, la enzima de la descripción no es capaz de desmetilar 3-dimetoxibenceno y ácido 3,5-dimetoxibenzoico, por ejemplo, según se evalúa como se ejemplifica en el presente documento (Ejemplo 9).

En el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las enzimas del primer aspecto. Como se detalla en mayor profundidad en la sección de definiciones, la molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir porciones de un gen o polinucleótido que codifica la proteína que no son parte de la región codificante de la proteína (por ejemplo, intrones o regiones reguladoras de un gen que codifica la proteína ) y pueden ser bicatenarios, monocatenarios y pueden incluir ADN, ARN o derivados de ADN o ARN, incluyendo ADNc, sondas y cebadores.

Preferiblemente, dicha secuencia de ácido nucleico codificante tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, o más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a SEQ ID n O: 39 (ADNc que codifica PPO4), 40 (ADN genómico ''ADNg'' que codifica PPO4), SEQ ID NO: 43 (Ad Nc que codifica PPO6), SEQ ID NO: 44 (ADNg que codifica PPO6), SEQ ID NO: 47 (ADNc que codifica PPO7) o SEQ ID NO: 48 (ADNg que codifica PPO7). Preferiblemente, dicha secuencia de ácido nucleico codificante tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, o más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a SEQ ID NO: 40 (ADNg que codifica PPO4), 44 (ADNg que codifica p Po 6) o 48 (ADNg que codifica PPO7). Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico aislada. Preferiblemente, dentro de la molécula de ácido nucleico, la secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de las enzimas descritas está ligada operativamente a al menos una secuencia de control de expresión y es preferiblemente parte de un vector de expresión (recombinante), tal como se detalla en mayor profundidad en la sección de definiciones y/o tal como se ejemplifica específicamente en el presente documento (Ejemplo 1).

Opcionalmente, la molécula de ácido nucleico codifica una o más enzimas adicionales. La molécula de ácido nucleico puede ser un vector de expresión (vector quimérico) que codifica al menos dos enzimas de cualquiera de los complejos multienzimáticos descritos en este documento, preferiblemente dichas al menos dos enzimas son la enzima PPO de la descripción y la LPMO AA9 o LPMO9B como se define en este documento y como se define en los documentos EP15158572 o WO2010/107303A2, respectivamente. También se incluye un vector de expresión (vector quimérico) que se expresa en la enzima PPO, LPMO, y una enzima que codifica una celulasa, por ejemplo, una endoglucanasa. Preferiblemente, dentro de dicho vector quimérico, la secuencia que codifica dicha LPMO AA9 codifica para una enzima LPMO que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o al menos un 99% con respecto a la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a la SEQ ID NO: 7, donde SEQ ID NO: 7 representa el ADNc que codifica MLPMO9A. Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a la s Eq ID NO: 8, donde SEQ ID NO: 8 representa el ADNg que codifica MÍLPMO9A, donde el ADNg debe entenderse en el presente documento como que abarca secuencias de intrones. Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a la s Eq ID NO: 91, donde SEQ ID n O: 91 representa el ADNg que codifica MÍPMO9B. Opcionalmente, dentro de dicho vector quimérico, la secuencia que codifica dicha endoglucanasa codifica una enzima endoglucanasa que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100%, con respecto a SEQ iD NO: 3, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 30. Preferiblemente, dicha secuencia codificante de endoglucanasa tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a la SEQ ID NO: 9, donde SEQ ID NO: 9 representa el ADNc que codifica TvEG I tal como se define en el presente documento. Preferiblemente, dicha secuencia codificante de endoglucanasa tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96% , 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a la SEQ iD NO: 9 (a Dnc que codifica TvEG I), SEQ ID NO: 11 (ADNc que codifica MtEG VIII), SEQ ID NO: 15 (ADNc que codifica MtEG II), SEQ ID NO: 19 (ADNc que codifica MtEG I), SEQ ID NO: 23 (ADNc que codifica MtEG III), SEQ ID NO: 27 (ADNc que codifica MtEG V), SEQ ID NO: 31 (ADNc que codifica MtEG VI). Preferiblemente, dicha secuencia de nucleótidos que codifica endoglucanasa tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 700%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a SEQ ID NO: 12 (ADNg que codifica MtEG VIII), SEQ ID NO: 16 (ADNg que codifica MtEG II), SEQ ID NO: 20 (ADNg que codifica MtEG I), SEQ ID NO: 24 (ADNg que codifica MtEG III), SEQ ID NO: 28 (ADNg que codifica MtEG V), SEQ ID NO: 32 (ADNg que codifica MtEG Vi).

El especialista en la técnica apreciará que el uso de tecnologías de ADN recombinante puede mejorar el control de la expresión de moléculas de ácido nucleico transfectadas manipulando, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácido nucleico dentro de la célula hospedante, la eficiencia con la que esas moléculas de ácido nucleico se transcriben, la eficacia con la que se traducen las transcripciones resultantes y la eficacia de las modificaciones post-traduccionales. Además, la secuencia promotora podría modificarse mediante ingeniería genética para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo. Las técnicas recombinantes útiles para controlar la expresión de moléculas de ácido nucleico incluyen, aunque sin limitación, la integración de las moléculas de ácido nucleico en uno o más cromosomas de la célula hospedante, la adición de secuencias de estabilidad del vector a plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control de la transcripción (por ejemplo , promotores, operadores, potenciadores), sustituciones o modificaciones de señales de control de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas), la modificación de moléculas de ácido nucleico para corresponder con el uso de codones de la célula hospedante y la eliminación de secuencias que desestabilizan los tránscritos.

En el presente documento se describe una célula hospedante que comprende una molécula de ácido nucleico de la descripción. Preferiblemente, dicha célula hospedante se transfecta con un vector de expresión descrito en este documento y dicha célula hospedante es capaz de expresar la enzima descrita en este documento codificada por dicho vector de expresión. La célula hospedante de la descripción puede ser, aunque sin limitación, cualquier bacteria, hongo (por ejemplo, hongos filamentosos o levadura o setas), algas, plantas, insectos o células animales que se pueden transfectar. Preferiblemente, la célula hospedante es una célula cultivada. La célula hospedante (por ejemplo, una célula hospedante u organismo de producción) puede incluir cualquier microorganismo (por ejemplo, una bacteria, un protista, un alga, un hongo u otro microbio) y es preferiblemente una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso. Los géneros bacterianos adecuados incluyen, aunque sin limitación, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas y Streptomyces. Las especies bacterianas adecuadas incluyen, aunque sin limitación, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus brevis, Pseudomonas aeruginosa y Streptomyces lividans. Los géneros adecuados de levadura incluyen, aunque sin limitación, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces y Phaffia. Las especies de levadura adecuadas incluyen, aunque sin limitación, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia canadensis, Kluyveromyces marxianus y Phaffia rhodozyma.

Los géneros de hongos adecuados incluyen, aunque sin limitación, Chrysosporium, Thielavia. Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Corynascus, Cryptococcus, Acremonium, Tolypocladium, Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola, y Trichoderma, Talaromyces, Rasamsonia y anamorfos y teleomorfos de los mismos. Las especies de hongos adecuadas incluyen, aunque sin limitación, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Absidia coerulea, Rhizopus oryzae, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosum, Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris , Sporotrichum termófilo, Sporotrichum cellulophilum. Chaetomium globosum, Corynascus heterothallicus, Talaromyces emersonii, Rasamsonia elnersonii y Talaromyces flavus.

La célula hospedante de la descripción puede ser una célula o un microorganismo modificados genéticamente. Preferiblemente, la célula hospedante se modifica/optimiza para la producción de la enzima de la descripción. Preferiblemente, la célula hospedante se modifica para producir cantidades reducidas o carece de la producción de enzimas que interfieren/compiten con la expresión y/o la secreción de la enzima descrita en este documento y/o con la actividad enzimática del método descrito en este documento. Tal célula hospedante puede modificarse para regular a la baja la actividad de la enzima interferente. La regulación a la baja se puede lograr, por ejemplo, mediante la introducción de inhibidores (químicos o biológicos) de la actividad enzimática, manipulando la eficiencia con la que se transcriben dichas moléculas de ácido nucleico, la eficiencia con la que se traducen las transcripciones resultantes y la eficiencia de modificaciones post-traduccionales, o por mutación, alteración o eliminación de genes, es decir, "anulando" la copia endógena del gen. Una "desactivación" de un gen se refiere a una técnica de biología molecular mediante la cual el gen del organismo se vuelve inoperante, de modo que la expresión del gen se reduce o elimina sustancialmente. Alternativamente, la actividad de la enzima puede regularse positivamente. También se contempla en el presente documento la regulación a la baja de la actividad de una o más enzimas mientras que simultáneamente se regula al alza la actividad de una o más enzimas para lograr el resultado deseado.

Preferiblemente, se usa una cepa baja en celulosa. Preferiblemente, la célula hospedante es una célula fúngica de la cepa Cl (VKM F-3500 D) o una cepa mutante derivada de la misma (por ejemplo, UV13-6 (N° de acceso VKM F-3632 D); NG7C-19 (N2 de acceso VKM F-3633 D); UV18-25 (VKM F-3631D), W1L (CBS122189) o W1L#100L (CBS122190)). Preferiblemente, la cepa hospedante es una cepa con expresión reducida de proteasa y (hemi-)celulasa, más preferiblemente libre de expresión de proteasa y (hemi-)celulasa. En el caso más preferido, la cepa hospedante es W1L#100.1Apyr5AA1p1, también denominada cepa LC (Visser H y col., Ind. Biotechnol. 7: 214-222, 2011, y WO2010/107303). Tal como se describe en la Patente de EE.UU. n° 6.015.707 o en la Patente de EE.UU. n° 6.573.086, se aisló una cepa llamada Cl (N° de acceso VKM F-3500 D) de muestras de suelo alcalino forestal del lago Sola, en el Lejano Oriente de la Federación de Rusia. Esta cepa fue depositada en la Colección de Microorganismos de toda Rusia de la Academia de Ciencias de Rusia (VKM), (www.vkm.ru; Bakhurhina St. 8, Moscú, Rusia, 113184; Prospekt Nauki No. 5, Pushchino, Región de Moscú, 142290, Rusia), bajo los términos del T ratado de Budapest sobre la Regulación Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patentes el 29 de agosto de 1996, (por A.P. Sinitsyn, O.N. Okunev, I.V. Solov'eva, V.M. Chernoglasov, M.A. Emalfarb, A. Ben-Bassat; "FermTech" LTD Acad. Kapitsky str. 32-2, Moscú, 117647, Rusia) como Chrysosporium lucknowense Garg 27K, VKM F-3500 D. Se han producido varias cepas mutantes de Cl y estas cepas también se han depositado en la Colección de Microorganismos de toda Rusia de la Academia de Ciencias de Rusia (VKM), (Bakhurhina St. 8, Moscú, Rusia , 113184, Prospekt Nauki No. 5, Pushchino, Región de Moscú, 142290, Rusia), según los términos del Tratado de Budapest sobre la reglamentación internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes el 2 de septiembre de 1998 (por O.N. Okunev , A.P. Sinitsyn, V.M. Chernoglasov y M.. Emalfarb; "FermTech" LTD, Acad. Kapitsy str., 32-2, Moscú, 117647, Rusia) o en el Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Holanda, a los efectos del Procedimiento de Patente, el 5 de diciembre de 2007 (por Dyadic Nederland B.V., Nieuwe Kanaal 7s, 6709 PA Wageningen, Países Bajos). Por ejemplo, se mutagenizó la cepa Cl sometiéndola a luz ultravioleta para generar la cepa UV13-6 (N° de acceso VKM F-3632 D; depositada en VKM el 2 de septiembre de 1998)). Posteriormente, esta cepa se volvió a mutar con N-metil-N'-nitro-N nitrosoguanidina para generar la cepa NG7C-19 (N° de acceso VKM F-3633 D; depositada en VKM el 2 de septiembre de 1998). Esta última cepa, a su vez, fue sometida a mutación por luz ultravioleta, dando como resultado la cepa UV18-25 (N° de acceso Vk M F-3631 D; depositada en VKM el 2 de septiembre de 1998). Esta cepa, a su vez, fue sometida nuevamente a mutación por luz ultravioleta, lo que resultó en la cepa W1L (N° de acceso CBS122189; depositada en CBS el 5 de diciembre de 2007), que posteriormente fue sometida a mutación por luz ultravioleta, dando como resultado la cepa W1L#100L (N° de acceso CBS122190; depositada en CBS el 5 de diciembre de 2007). La cepa Cl se clasificó inicialmente como Chrysosporium lucknowense en base a las características morfológicas y de crecimiento del microorganismo, tal como se discute en detalle en la Patente de EE.UU. n° 6.015.707, la Patente de EE.UU. n° 6.573.086 y la patente PCT/NL2010/000045. La cepa Cl se reclasificó posteriormente como Myceliophthora thermophila en base a pruebas genéticas. La C. luknowense también ha aparecido en bibliografía como Sporotrichum thermophile.

También se prefiere una célula o microorganismo genéticamente modificado, que esté modificado para presentar una reducción o eliminación de las actividades enzimáticas que provocan la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o gluconolactona/ácido glucónico. Las enzimas que causan la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o gluconolactona/ácido glucónico incluyen. Preferiblemente, dicha célula o microorganismo modificado genéticamente es una cepa fúngica que carece de genes funcionales que codifican enzimas que provocan la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o gluconolactona/ácido glucónico, por ejemplo, puede generarse mediante eliminación de genes, alteración de genes, silenciamiento o mutación de genes; o por eliminación, alteración o mutación de secuencias reguladoras de la expresión génica, tales como secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias activadoras del promotor y secuencias que codifican factores de transcripción; o por mutación aleatoria o dirigida al sitio de los genes que codifican las enzimas que provocan la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o gluconolactona/ácido glucónico. Preferiblemente, el hongo modificado es un hongo modificado en el que se ha eliminado, alterado o mutado uno o más genes que codifican las enzimas responsables de la producción de uno o más productos seleccionados entre celobionolactona, ácido celobiónico, gluconolactona y ácido glucónico, que codifican una celobiosa deshidrogenasa (CDH). Preferiblemente, el uno o más genes codifican una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos de la celobiosa deshidrogenasa (CDH) seleccionada de un grupo de polipéptidos que tienen al menos un 90%, 95% o 99% de homología con cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID NOS: 4-6. El hongo modificado puede ser un hongo modificado en el que el gen que codifica la celobiosa deshidrogenasa (CDH) CDH1 (SEQ ID NO: 4), CDH2 (SEQ ID NO: 5) o CDH3 (SEQ ID NO: 6) está eliminado, alterado o mutado. Preferiblemente, el hongo modificado es un hongo en el que la actividad de CDH se reduce entre aproximadamente un 50% y aproximadamente el 100%, o al menos un 75%, 90% o 95%, cuando se mide mediante un ensayo de reducción de ferricianuro. Preferiblemente, el gen que codifica CDH1 (SEQ ID NO: 4) o que codifica CDH2 (SEQ ID NO: 5) en Myceliophthora thermophila Cl están boqueados. Más preferiblemente, los genes que codifican CDH1 y CDH2 en Myceliophthora thermophila Cl están ambos bloqueados (bloqueo doble), preferiblemente tal como se describe en los WO2013/159005A2 y WO2012/061432A1.

Otras células hospedantes adecuadas incluyen células de insectos (más particularmente células de Drosophila melanogaster, células Sf9 y Sf21 de Spodoptera frugiperda y células High-Five de Trichoplusia), células de nematodos (particularmente células de C. elegans), células de ave, células anfibias (particularmente célulasde Xenopus laevis), células de reptiles y células de mamíferos (más particularmente células de humanos, simios, caninos, roedores, bovinos u ovinos, por ejemplo, NIH3T3, CHO (células de ovario de hámster chino), COS, VERO, BHK, HEK y otras células de roedor o humanas).

La presente descripción también contempla organismos modificados genéticamente tales como algas, bacterias y plantas transformadas con una o más moléculas de ácido nucleico de la descripción. Las plantas pueden usarse para la producción de enzimas, y/o como los materiales de lignina, lignocelulósicos, celulósicos y/o hemicelulósicos usados como sustrato en un método de la descripción. En la técnica se conocen métodos para generar plantas recombinantes. Por ejemplo, se han desarrollado numerosos métodos para la transformación de plantas, incluidos protocolos de transformación biológica y física. Ver, por ejemplo, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. y Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) págs. 67-88. Además, se encuentran disponibles vectores y métodos de cultivo in vitro para la transformación de células o tejidos vegetales y la regeneración de plantas. Ver, por ejemplo, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. y Thompson, J.E. Eds, (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) págs. 89-119.

El método más utilizado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. Ver, por ejemplo, Horsch y col., Science 227: 1229 (1985). En numerosas referencias se proporcionan descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y de métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, incluyendo Gruber et al., ver anterior, Miki et al., ver anterior, Moloney y col., Plant Cell Reports 8: 238 (1989), y las Patentes de EE.UU. n24.940.838 y 5.464.763.

Otro método de transformación de plantas aplicable de forma general es la transformación mediada por microproyectiles, ver por ejemplo, Sanford y col., Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), Sanford, J.C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Sanford, J.C., Physiol. Plant 79: 206 (1990), Klein y col., Biotechnology 10: 268 (1992). Otro método para el suministro físico de ADN a las plantas es la sonicación de células diana. Zhang y col., Bio/Technology 9: 996 (1991). Alternativamente, se ha utilizado la fusión de liposomas o esferoplastos para introducir vectores de expresión en plantas. Deshayes y col., EMBO J., 4: 2731 (1985), Christou y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84: 3962 (1987). También se ha reportado la captación directa de ADN en protoplastos utilizando precipitación de CaCh, alcohol polivinílico o poli-L-ornitina. Hain y col., Mol. Gen. Genet. 199: 161 (1985) y Draper y col., Plant Cell Physiol. 23: 451 (1982). También se ha descrito la electroporación de protoplastos y células y tejidos completos. Donn et al., en Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin y col., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992) y Spencer y col., Plant Mol. Biol, 24: 51-61 (1994).

En el presente documento se describe una composición o formulación enzimática que comprende al menos la enzima de la descripción.

La composición enzimática puede ser un producto de fermentación sin purificar, que surge preferiblemente de microorganismos recombinantes que codifican la enzima de la descripción, o una preparación que se origina en un producto de fermentación sin purificar que ha sido purificado o parcialmente purificado usando procedimientos de purificación de proteínas conocidos en la técnica. Alternativamente, la enzima de la composición enzimática es una proteína o péptido que se produce sintéticamente (por ejemplo, químicamente, tal como mediante síntesis de péptidos) o de forma recombinante en una forma sustancialmente pura.

La formulación que comprende enzima puede ser una composición libre de células o una composición que comprende una célula hospedante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la enzima tal como se define aquí, que preferiblemente es capaz de expresar la enzima tal como se define aquí.

La composición enzimática puede ser una composición multienzimática, que se entiende que comprende la enzima de la descripción y al menos una enzima adicional (diferente). Una enzima adicional se entiende aquí como una enzima que es de naturaleza diferente a la enzima PPO de la descripción, y que preferiblemente tiene una actividad enzimática diferente. Las composiciones multienzimáticas específicas tal como se definen en este documento comprenden la enzima de la descripción y al menos una enzima adicional que es particularmente adecuada para su uso en un método como se detalla a continuación en el presente documento. La enzima adicional también puede surgir de un producto de fermentación sin purificar (opcionalmente purificado) y/o producirse sintética o recombinantemente en una forma sustancialmente pura.

Preferiblemente, la composición enzimática o multienzimática es adecuada para su uso en un método o proceso descrito en el presente documento.

La composición enzimática o multienzimática de la descripción puede ser una formulación líquida, en pasta o sólida que comprende la enzima de la descripción. Preferiblemente, la formulación sólida es una formulación sólida que tiene el aspecto físico de un granulado o un polvo. Una formulación preferida es una formulación que comprende o consiste en gránulos o microgránulos revestidos o no revestidos. La formulación líquida, en pasta o sólida se puede formular según métodos conocidos en la técnica, preferiblemente utilizando métodos conocidos en la técnica de formulación de enzimas y/o composiciones multienzimáticas, materias primas, materias primas químicas, premezclas de piensos, complementos alimenticios, mejoradores del pan, agentes de tratamiento de harinas y/o productos farmacéuticos. Preferiblemente, la formulación líquida, en pasta o sólida de acuerdo con este aspecto es una composición enzimática o multienzimática, materia prima, materia prima química, materia prima animal, premezcla alimenticia, complemento alimenticio, mejorador del pan, agente de tratamiento de la harina y/o producto farmacéutico, en donde preferiblemente dicha composición comprende uno o más compuestos adicionales conocidos en la técnica por ser adecuados para su uso en dicha composición. Preferiblemente, la composición comprende estabilizadores conocidos en la técnica para la estabilización de enzimas, por ejemplo, un antioxidante, un agente reductor, un polímero tal como PVP, PVA, PEG u otro polímero adecuado conocido por ser beneficioso para la estabilidad de polipéptidos en composiciones sólidas o líquidas.

Preferiblemente, los granulados o el polvo aglomerado tienen una distribución estrecha de tamaño de partícula con más del 95% (en peso) de las partículas en el intervalo de 10 a 2000 pm, preferiblemente de 25 a 500 pm. Los granulados y polvos aglomerados se pueden preparar mediante métodos convencionales, por ejemplo, pulverizando la enzima de la descripción y opcionalmente otras enzimas sobre un vehículo en un granulador de lecho fluido. El portador puede consistir en núcleos particulados que tengan un tamaño de partícula adecuado. El vehículo puede ser soluble o insoluble, por ejemplo, una sal (tal como NaCl o sulfato de sodio), un azúcar (tal como sacarosa o lactosa), un alcohol de azúcar (tal como sorbitol), almidón, arroz, sémola de maíz o soja. Por tanto, la descripción también proporciona un gránulo que comprende una composición que comprende la enzima de la descripción y, opcionalmente, enzimas adicionales, tal como se define en el presente documento.

Debe entenderse que cualquiera de las enzimas descritas específicamente en el presente documento puede combinarse con una o más de las enzimas descritas en el presente documento, o con cualquier otra enzima disponible y adecuada, para producir una composición multienzimática. La descripción no está restringida ni limitada a las combinaciones ejemplares específicas enumeradas a continuación. Uno o más componentes de una composición multienzimática (distintos de la enzima de la presente descripción) pueden obtenerse o derivarse de un microbio, planta u otra fuente, o de una combinación de los mismos.

La descripción proporciona una composición multienzimática, que comprende al menos la enzima de la descripción, que se utiliza en un método para la conversión de lignina o un sustrato que contiene lignina en un producto de valor añadido, por ejemplo, la producción de biocombustibles, macromoléculas y/o productos químicos aromáticos. Dicha composición de múltiples enzimas, preferiblemente para usar en un proceso para producir macromoléculas tales como dispersantes, emulsionantes, aglutinantes, secuestrantes, fibras de carbono, modificadores de polímeros, resinas y adhesivos, preferiblemente comprende además una o más enzimas que catalizan específicamente cualquiera de las reacciones de sulfonación, introducción de restos etoxi, epoxi, vinilo y/o carbonilo, despolimerización, reticulación intermolecular, carbonilación, carboxilación, aminación, epoxidación, deseterificación, oxidación y bioconjugación.

Una composición multienzimática adicional, preferiblemente para uso en un proceso para producir monómeros aromáticos tales como benceno, tolueno, xileno, fenol, moléculas de lignina monomérica de ácido tereftálico, preferiblemente comprende además enzimas que catalizan especialmente la deshidroxilación, la desalquilación, la hidrogenolisis, la despolimerización (selectiva), la polimerización, la sulfonación.

La composición multienzimática que comprende al menos la enzima de la descripción puede comprender además enzimas para degradar un material lignocelulósico y/o hemicelulósico, o un fragmento biológicamente activo de una enzima para degradar un material lignocelulósico y/o hemicelulósico. Dicha composición de múltiples enzimas es útil en particular para la sacarificación de (hemi-)celulosa con el fin de obtener un producto fermentable tal como azúcares. Aparte de la enzima de la descripción, la composición multienzimática puede comprender además al menos una celobiohidrolasa, al menos una xilanasa, al menos una endoglucanasa, al menos una p-glucosidasa, al menos una pxilosidasa y al menos una enzima accesoria. Preferiblemente, la composición de múltiples enzimas está libre de enzimas que conducen a la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o gluconolactona/ácido glucónico. Se puede seleccionar una xilanasa del grupo que consiste en: endoxilanasas, exoxilanasas y p-xilosidasas. Las enzimas accesorias incluyen una enzima seleccionada del grupo que consiste en: celulasa, glucosidasa, polisacárido monooxigenasa lítica (también denominada en la técnica, por ejemplo, GH61 o polipéptido que tiene actividad celulolítica potenciada), xilanasa, xilosidasa, ligninasa, glucuronidasa, arabinofuranosidasa, arabinasa, arabinogalactanasa, esterasa de ácido ferúlico, lipasa, pectinasa, glucomanasa, amilasa, laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, galactosidasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitosanasa, exo-p-D-glucosaminidasa, celobiosa deshidrogenasa y acetilxilano esteresa. Una enzima accesoria preferida es una LPMO de la familia AA9 (LPMO AA9), preferiblemente se obtiene de Myceliophthora, preferiblemente tal como se define en el documento EP 151585 72, que más preferiblemente se obtiene de Myceliophthora thermophila C1. Preferiblemente, la LPMO es una enzima que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o al menos 100%, a la SEQ ID NO: 1. La LPMO representada por la SEQ ID NO: 1 es una LPMO de la familia AA9, denominada MLPMO9A, originaria de Myceliophthora thermophila C1 (n° de registro VKM F-3500D). La secuencia de aminoácidos de la MLPM09A que incluye la secuencia señal está definida por la SEQ ID NO: 2. Una enzima adicional preferida es una LPMO9B, tal como se define en el presente documento. La composición multienzimática puede comprender además al menos una hemicelulasa. Una hemicelulasa puede seleccionarse del grupo que consiste en una xilanasa, una arabinofuranosidasa, una acetil xilano esterasa, una glucuronidasa, una endogalactanasa, una mananasa, una endoarabinasa, una exoarabinasa, una exogalactanasa, una ácido ferúlico esterasa, una galactomananasa, una xiloglucanasa, y mezclas de las mismas. Se puede seleccionar una xilanasa del grupo que consiste en endoxilanasas, exoxilanasas y p-xilosidasas en ausencia de enzimas que conduzcan a la formación de celobionolactona/ácido celobiónico y/o gluconolactona/ácido glucónico. La composición de múltiples enzimas puede comprender además al menos una celulasa. La composición multienzimática también puede incluir oxidasas, oxigenasas, monooxigenasas, monooxigenasas de Baeyer-Villiger, dioxigenasas, peroxidasas, deshidrogenasas, reductasas que catalizan una reacción de oxidación-reducción. La composición multienzimática puede comprender además al menos una proteína para degradar un material que contiene arabinoxilano, o un fragmento de la misma que tiene actividad biológica. La composición multienzimática puede comprender además al menos una endoxilanasa, al menos una p-xilosidasa y al menos una arabinofuranosidasa. Una arabinofuranosidasa puede comprender una arabinofuranosidasa con especificidad hacia residuos de xilosa mono sustituidos, una arabinofuranosidasa con especificidad hacia residuos de xilosa doble sustituida o una combinación de los mismos. Las composiciones multienzimáticas de un método también pueden incluir ligninasas y lipasas. Si bien la composición multienzimática puede contener muchos tipos de enzimas, se contemplan mezclas que comprenden enzimas que aumentan o mejoran la liberación de azúcares de la biomasa, o mezclas de sacarificación de la biomasa. También se prefieren las mezclas que comprenden enzimas que son capaces de degradar las paredes celulares y liberar el contenido celular. Se contemplan combinaciones sinérgicas de enzimas y métodos relacionados. La descripción incluye métodos para identificar las proporciones y composiciones óptimas de enzimas. Estos métodos implican pruebas para identificar la composición enzimática óptima y las proporciones para la conversión eficiente de cualquier sustrato de biomasa en los azúcares que lo constituyen. Los ejemplos siguientes incluyen ensayos que pueden usarse para identificar proporciones y composiciones óptimas de enzimas con las que degradar materiales (ligno)celulósicos. Las enzimas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, las enzimas descritas en las Publicaciones de Solicitud PCT N° WO03/027306, WO200352118_A2, WO200352054_A2, WO200352057_A2, WO200352055_A2, WO200352056_A2, WO200416760_A2, WO9210581_A1, WO200448592_A2, WO200443980_A2, WO200528636_A2, WO200501065_A2, WO2005/001036, WO2005/093050, WO200593073_A1, WO200674005_A2, WO2009/149202, WO2011/038019, WO2010/141779, WO2011/063308, WO2012/125951, WO2012/125925, WO2012125937, WO/2011/153276, WO2014/093275, WO2014/070837, WO2014/070841, WO2014/070844, WO2014/09328 1, WO2014/093282, WO2014/093287, WO2014/093294, WO2015/084596, WO201517254_A1, WO201517255_A1, WO201517256_A1, o WO2016/069541.

La descripción también proporciona una composición multienzimática, que comprende al menos la enzima de la descripción, que se utiliza en un método para clarificar y/o aumentar la velocidad de filtración y/o disminuir la formación de turbidez de zumos y/o bebidas tales como vino y cerveza. Tal composición multienzimática preferiblemente comprende además una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9, tal como se ha definido aquí anteriormente), pectinasa, carboximetilcelulasa y/o amilasa.

La descripción también proporciona una composición multienzimática, que comprende al menos la enzima de la descripción, que se utiliza en un método para macerar verduras y/o frutas. Tal composición multienzimática preferiblemente comprende además una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 u otra LPMO tal como se ha definido aquí anteriormente), pectinasa, carboximetilcelulasa y/o amilasa.

La descripción también proporciona una composición multienzimática, que comprende al menos la enzima de la descripción, que se utiliza en un método para aumentar la digestibilidad y/o las propiedades nutricionales de materias primas para animales o alimentos para animales, tales como, entre otros, forraje agrícola y piensos de grano. Tal composición multienzimática preferiblemente comprende además al menos una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente).

La descripción también proporciona una composición multienzimática, que comprende al menos la enzima de la descripción, que se utiliza en un método para aumentar la calidad de los productos de panadería o mejorar las características texturales (calidad de rotura y trituración y calidad de la miga) de productos de panadería tales como, entre otros, pan, por ejemplo preferiblemente para aumentar el volumen del producto de panadería, por ejemplo una barra alta y/o ligera de pan integral. Tal composición multienzimática preferiblemente comprende además una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente), una celulasa, tal como beta-glucanasa, celulasa, celobiohidrolasa y/o beta-glucosidasa. Preferiblemente, la preparación de celulasa es un complejo de celulasas y/o hemicelulasas, preferiblemente obtenido de Trichoderma sp., más preferiblemente de T. reesei. También se prefieren las preparaciones de celulasa obtenidas de Aspergillus, preferiblemente obtenidas de A. niger. Una composición de celulasa adecuada puede ser CELLUCLAST™ (disponible en Novozymes) o Bakezyme® XU, Bakezyme® XE, BakeZyme® X-cell o Bakezyme® W (todas disponibles en DSM). La una o más enzimas adicionales para uso en un método de la descripción pueden comprender además enzimas adicionales, por ejemplo, glucoamilasa, a-amilasa, xilanasa, proteasa, lipasa, fosfolipasa, que pueden usarse junto con la LPMO en la masa o la composición. La enzima adicional puede ser de cualquier origen, incluidos mamíferos y plantas, y preferiblemente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico). La glucoamilasa en esta composición multienzimática puede ser una glucoamilasa que tenga una identidad de secuencia de al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% con la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa G1 o G2 de A. niger (Boel et al (1984), EMBO J. 3 (5), pág. 1097-1102), la glucoamilasa de A. awamori descrita en WO84/02921, o la glucoamilasa de A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949). La amilasa puede ser fúngica o bacteriana, por ejemplo, una aamilasa maltogénica de B. stearothermophilus o una a-amilasa de Bacillus, por ejemplo, B. licheniformis o B. amyloliquefaciens, una beta-amilasa, por ejemplo, de plantas (por ejemplo, soja) o de fuentes microbianas (por ejemplo, de Bacillus), una glucoamilasa, por ejemplo, de A. niger, o una a-amilasa fúngica, por ejemplo, de A. oryzae. Las a-amilasas maltogénicas comerciales adecuadas incluyen NOVAMYLO (Novozymes A/S) y OPTICAKE® (Novozymes A/S). Las composiciones de a-amilasa fúngica comerciales adecuadas incluyen, por ejemplo, BAKEZYME P 300 (disponible en DSM) y FUNGAMYL 2500 SG, FUNGAMYL 4000 BG, FUNGAMYL 800 L, FUNGAMYL ULTRA BG y FUNGAMYL u Lt RA SG (disponibles en Novozymes A/S). La hemicelulasa puede ser una pentosanasa, por ejemplo, una xilanasa que puede ser de origen microbiano, por ejemplo, derivada de una bacteria u hongo, tal como una cepa de Aspergillus, en particular de A. aculeatus, A. niger, A. awamori, o A. tubigensis, de una cepa de Trichoderma, por ejemplo, T. reesei, o de una cepa de Humicola, por ejemplo, H. insolens. Las preparaciones de xilanasa disponibles comercialmente adecuadas para su uso en la presente invención incluyen PENTOPAN MONO BG y PENTOPAN 500 BG (disponibles en Novozymes), GRINDAMYL POWERBAKE (disponible en Danisco) y BAKEZYME BXP 5000 y BAKEz Ym E BXP 5001 (disponibles en DSM). La proteasa puede ser de Bacillus, por ejemplo, B. amyloliquefaciens. La lipasa puede derivar de una cepa de Thermomyces (Humicola), Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus o Pseudomonas, en particular de T. lanuginosus (H. lanuginosa), Rhizomucor miehei, C. antarctica, A. niger, R. delemar, R. arrhizus o P. cepacia. La fosfolipasa puede tener actividad de fosfolipasa A1, A2, B, C, D o de lisofosfolipasa; puede tener o no actividad lipasa. Puede ser de origen animal, por ejemplo, de páncreas, veneno de serpiente o veneno de abeja, o puede ser de origen microbiano, por ejemplo, de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, tal como Aspergillus o Fusarium, por ejemplo, de A. niger, A. oryzae o F. oxysporum. Una lipasa/fosfolipasa preferida de F. oxysporum se describe en el documento WO 98/26057. Además, se pueden usar las variantes descritas en el documento WO 00/32758. La enzima adicional puede ser de cualquier origen, incluidos mamíferos y plantas, y preferiblemente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico) y puede obtenerse mediante técnicas utilizadas convencionalmente en la técnica. Las composiciones de fosfolipasa adecuadas son LIPOPAN F y LIPOPAN XTRA (disponibles en Novozymes) o PANAMORE GOLDEN y PANAMORE SPRING (disponibles en DSM).

La descripción también proporciona una composición multienzimática, que comprende al menos la enzima de la descripción, que se utiliza en la producción de xilo-oligómeros, (XO) o xilo-oligómeros oxidados, que se pueden utilizar en agricultura y en la industria farmacéutica y de productos alimenticios. Se sabe que los XO tienen efectos prebióticos, ya que no se hidrolizan ni se absorben en el tracto gastrointestinal superior, y afectan al hospedante estimulando selectivamente el crecimiento o la actividad de una o varias bacterias en el colon, mejorando así la salud. Además, se cree que los XO reducen los niveles de colesterol, mantienen la salud gastrointestinal y mejoran la disponibilidad biológica de calcio. Además, los XO inhiben la retrogradación del almidón, mejorando las propiedades nutricionales y sensoriales de los alimentos. La LPMO tal como se define en este documento es muy adecuada para la producción de XO debido a la baja actividad de exoxilanasa y/o de p-xilosidasa. Esto es beneficioso ya que la actividad de exoxilanasa y/o de p-xilosidasa da como resultado la producción de xilosa, que tiene efectos inhibidores sobre la producción de XO. Tal composición multienzimática preferiblemente comprende además al menos una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente).

Una composición multienzimática preferida de la descripción es cualquier composición multienzimática tal como se ha definido anteriormente que comprende la enzima de la descripción y una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente). Los inventores han encontrado que la enzima de la descripción tiene un efecto sorprendente sobre la actividad enzimática de LPMO, que da como resultado la degradación/modificación de la hemicelulosa, sobre sustratos que comprenden (hemi)celulosa y mono o di metoxifenoles sustituidos con R. Sin pretender establecer ninguna teoría, este efecto sorprendente puede deberse a la producción de agentes reductores debido a la actividad desmetilante recientemente descubierta de la enzima de la descripción.

También se prefiere una composición multienzimática de la descripción que es cualquier composición multienzimática, tal como se ha definido anteriormente, que comprende la enzima de la descripción y una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente), y que opcionalmente comprende además una endoglucanasa, preferiblemente una endoglucanasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (que codifica 7VEG I), la SEQ ID NO: 10 (que codifica MtEG VIII), la SEQ ID NO: 14 (que codifica MtEG II), la SEQ ID n O: 18 (que codifica MtEG I), la SEQ ID NO: 22 (que codifica MtEG III), la SEQ ID NO: 26 (que codifica MtEG V) o la SEQ ID NO: 30 (que codifica MtEG VI), y/o una endoglucanasa tal como se define aquí que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99%, a las SEQ ID NO: 3, s Eq ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 30.

Las enzimas de la composición multienzimática pueden ser proporcionadas a partir de diversas fuentes. En una descripción, las enzimas pueden producirse cultivando organismos tales como bacterias, algas, hongos y plantas que producen las enzimas de forma natural o en virtud de haber sido modificadas genéticamente para expresar la enzima o las enzimas. En otra descripción, al menos una enzima de la composición multienzimática es una enzima disponible comercialmente. Las composiciones multienzimáticas pueden estar compuestas por enzimas de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan enzimas; (3) caldo complejo (como el que resulta del crecimiento de una cepa microbiana en un medio, donde las cepas secretan proteínas y enzimas al medio); (4) lisatos celulares de cepas cultivadas como en (3); y (5) material vegetal que expresa enzimas capaces de degradar la lignocelulosa. En algunas descripciones, la enzima accesoria es una glucoamilasa, una pectinasa o una ligninasa.

Las composiciones multienzimáticas, en algunas descripciones, comprenden microorganismos o un producto de fermentación sin purificar de microorganismos. Un producto de fermentación sin purificar se refiere al caldo de fermentación, que se ha separado de la biomasa de microorganismos (por filtración, por ejemplo). En general, los microorganismos se cultivan en fermentadores, opcionalmente se centrifugan o filtran para eliminar la biomasa y, opcionalmente, se concentran, se formulan y se secan para producir una(s) enzima(s) o una composición multienzimática que es un producto de fermentación sin purificar. En otras descripciones, la(s) enzima(s) o composiciones multienzimáticas producidas por el microorganismo (incluido un microorganismo modificado genéticamente tal como se describe en este documento) se someten a una o más etapas de purificación, como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía y/o ultrafiltración, que dan como resultado una(s) enzima(s) parcialmente purificada(s) o purificada(s). Si el microorganismo ha sido modificado genéticamente para expresar la(s) enzima(s), la(s) enzima(s) incluirán enzimas recombinantes. Si el microorganismo modificado genéticamente también expresa naturalmente la(s) enzima(s) u otras enzimas útiles en un método de la descripción, como para la sacarificación lignocelulósica o cualquier otra aplicación útil mencionada en este documento, la(s) enzima(s) pueden incluir enzimas tanto naturales como recombinantes.

Preferiblemente, la composición multienzimática para uso en un método de la descripción comprende al menos aproximadamente 500 ng, y preferiblemente al menos aproximadamente 1 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 5 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 10 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 25 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 75 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 100 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 250 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 500 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 750 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 1 mg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 5 mg, de una enzima, una proteína (aislada) que comprende cualquiera de las proteínas u homólogos, variantes o fragmentos de la misma discutidos en este documento. Tal composición multienzimática puede incluir cualquier vehículo con el que la proteína esté asociada en virtud del método de preparación de proteínas, el método de purificación de proteínas o la preparación de la proteína para su uso en cualquier método de acuerdo con la presente descripción. Por ejemplo, tal vehículo puede incluir cualquier tampón, extracto o medio adecuado que sea adecuado para combinar con la proteína de la presente descripción de modo que la proteína se pueda usar en cualquier método descrito en el presente documento de acuerdo con la presente descripción.

En una realización de la descripción, una o más enzimas de la composición multienzimática de la descripción están unidas a un soporte sólido, es decir, es una enzima inmovilizada. Tal como se usa en este documento, una enzima inmovilizada incluye enzimas aisladas inmovilizadas, células microbianas inmovilizadas que contienen una o más enzimas de la descripción, otras células intactas estabilizadas que producen una o más enzimas de la descripción y homogeneizados de célula/membrana estabilizados. Las células intactas estabilizadas y los homogeneizados de células/membranas estabilizadas incluyen células y homogeneizados de microorganismos de origen natural que expresan las enzimas de la descripción y, preferiblemente, de microorganismos modificados genéticamente tal como se describe en otra parte del presente documento. Por tanto, aunque los métodos para inmovilizar enzimas se analizan a continuación, se apreciará que dichos métodos son igualmente aplicables para inmovilizar células microbianas y, en tal descripción, las células pueden lisarse, si se desea. Una variedad de métodos para inmovilizar una enzima se describen en Industrial Enzymology 2nd Ed., Godfrey, T. y West, S. Eds., Stockton Press, Nueva York, N.Y., 1996, págs. 267-272; Immobilized Enzymes, Chibata, I. Ed., Halsted Press, Nueva York, N.Y., 1978; Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology, Laskin, A. Ed., Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, California, 1985; y Applied Biochemistry and Bioengineering, vol. 4, Chibata, I. y Wingard, Jr., L. Eds, Academic Press, Nueva York, N.Y., 1983.

La enzima PPO de la descripción en la formulación puede ser una enzima o proteína tal como se define aquí, por ejemplo, un producto de fermentación sin purificar, o una preparación de proteína que ha sido purificada o parcialmente purificada (por ejemplo, de un microorganismo) usando procedimientos de purificación de proteínas conocidos en la técnica, o una enzima, proteína o péptido que se puede producir sintéticamente (por ejemplo, químicamente, tal como por síntesis de péptidos) o de forma recombinante. La PPO de la formulación también puede ser una molécula de ácido nucleico tal como se define aquí, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante y/o vector y/o célula hospedante que codifica dicha enzima PPO tal como se define en el presente documento. La formulación que comprende p Po puede ser una composición libre de células o una composición que comprende una célula hospedante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la PPO tal como se define aquí, que preferiblemente es capaz de expresar la PPO tal como se define en este documento. La misma descripción se aplica a la referencia a otras enzimas, proteínas o péptidos descritos en este documento y a otras fuentes microbianas para tales proteínas o péptidos.

Las composiciones enzimáticas o multienzimáticas, en algunas descripciones, comprenden microorganismos o un producto de fermentación sin purificar de microorganismos. Un producto de fermentación sin purificar se refiere al caldo de fermentación, que se ha separado de la biomasa de microorganismos (por filtración, por ejemplo). En general, los microorganismos se cultivan en fermentadores, opcionalmente se centrifugan o filtran para eliminar la biomasa y, opcionalmente, se concentran, se formulan y se secan para producir una(s) enzima(s) o una composición multienzimática que es un producto de fermentación sin purificar. En otras descripciones, la(s) enzima(s) o composiciones multienzimáticas producidas por el microorganismo (incluido un microorganismo modificado genéticamente tal como se describe a continuación) se someten a una o más etapas de purificación, como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía y/o ultrafiltración, que dan como resultado una(s) enzima(s) parcialmente purificada(s) o purificada(s). Si el microorganismo ha sido modificado genéticamente para expresar la(s) enzima(s), la(s) enzima(s) incluirán enzimas recombinantes. Si el microorganismo modificado genéticamente también expresa naturalmente la(s) enzima(s) u otras enzimas útiles para la sacarificación lignocelulósica o para cualquier otra aplicación útil mencionada aquí, la(s) enzima(s) pueden incluir enzimas tanto naturales como recombinantes.

Preferiblemente, la composición enzimática o multienzimática para usar en un método de la descripción que comprende al menos aproximadamente 500 ng, y preferiblemente al menos aproximadamente 1 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 5 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 10 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 25 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 75 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 100 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 250 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 500 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 750 pg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 1 mg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 5 mg, de una enzima, una proteína (aislada) que comprende cualquiera de las proteínas u homólogos, variantes, o fragmentos de los mismos discutidos en este documento. Tal composición multienzimática puede incluir cualquier vehículo con el que la proteína esté asociada en virtud del método de preparación de proteínas, del método de purificación de proteínas o de la preparación de la proteína para uso en cualquier método de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, tal vehículo puede incluir cualquier tampón, extracto o medio adecuado que sea adecuado para combinar con la proteína de la presente descripción de modo que la proteína se pueda usar en cualquier método descrito en el presente documento, de acuerdo con la presente descripción.

En una descripción, una o más enzimas para su uso en un método de la descripción están unidas a un soporte sólido, es decir, es una enzima inmovilizada. Tal como se usa en este documento, una enzima inmovilizada incluye enzimas aisladas inmovilizadas, células microbianas inmovilizadas que contienen una o más enzimas de la descripción, otras células intactas estabilizadas que producen una o más enzimas de la descripción y homogeneizados de célula/membrana estabilizados. Las células intactas estabilizadas y los homogeneizados de células/membranas estabilizadas incluyen células y homogeneizados de microorganismos de origen natural que expresan las enzimas de la descripción y, preferiblemente, de microorganismos modificados genéticamente tal como se describe en otra parte del presente documento. Por tanto, aunque los métodos para inmovilizar enzimas se analizan a continuación, se apreciará que dichos métodos son igualmente aplicables para inmovilizar células microbianas y las células se pueden lisar, si se desea. Una variedad de métodos para inmovilizar una enzima se describen en Industrial Enzymology 2nd Ed., Godfrey, T. y West, S. Eds., Stockton Press, Nueva York, N.Y., 1996, págs. 267-272; Immobilized Enzymes, Chibata, I. Ed., Halsted Press, Nueva York, N.Y., 1978; Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology, Laskin, A. Ed., Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, California, 1985; y Applied Biochemistry and Bioengineering, vol. 4, Chibata, I. y Wingard, Jr., L. Eds, Academic Press, Nueva York, N.Y., 1983.

En el presente documento se describe un método/proceso para producir una enzima de la descripción y/o una composición multienzimática de la descripción. Preferiblemente, dicho método o proceso abarca la etapa de transfectar una célula hospedante con una o más moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, vectores de expresión, que pueden ser vectores de expresión de la descripción, por ejemplo, en una célula hospedante que puede ser tal como se describe en el presente documento. Se pueden producir una o más proteínas codificadas por dicha molécula de ácido nucleico o vector de expresión cultivando la célula hospedante transfectada en condiciones eficaces para producir la proteína. En este documento se incluye una célula hospedante que produce al menos dos enzimas de un complejo multienzimático tal como se describe en el presente documento, preferiblemente dichas al menos dos enzimas o la PPO de la descripción y la LPMO AA9 tal como se describe en el presente documento. En algunos casos, la proteína puede recuperarse y, en otros, la célula puede recolectarse en su totalidad, cualquiera de los cuales puede usarse en una composición. Los microorganismos para su uso como células hospedantes se cultivan en un medio de fermentación apropiado. Un medio de fermentación apropiado o eficaz se refiere a cualquier medio en el que la célula albergada, cuando se cultiva, es capaz de expresar la enzima de la descripción. Los microorganismos pueden cultivarse mediante cualquier proceso de fermentación que incluye, aunque sin limitación, fermentación discontinua o batch, semicontinua, con recirculación de células y continua. En general, las cepas de hongos se cultivan en fermentadores, opcionalmente se centrifugan o filtran para eliminar la biomasa y, opcionalmente, se concentran, se formulan y se secan para producir una(s) enzima(s) o una composición multienzimática que es un producto de fermentación sin purificar. Las condiciones particularmente adecuadas para el cultivo de hongos filamentosos se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n° 6.015.707 y en la Patente de EE.UU. n° 6.573.086, ver anterior.

Opcionalmente, el método o proceso comprende además recuperar la composición enzimática y/o multienzimática de la descripción. Dependiendo del vector y del sistema hospedante usados para la producción, las proteínas resultantes pueden permanecer dentro de la célula recombinante; ser secretadas al medio de cultivo; ser secretadas en un espacio entre dos membranas celulares; o quedar retenidas en la superficie exterior de una membrana celular. La frase "recuperar la enzima" se refiere a recolectar todo el medio de cultivo que contiene la proteína y opcionalmente implica etapas adicionales de separación o purificación. La composición enzimática y/o multienzimática producida se puede purificar utilizando una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, entre otras, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de concanavalina A, cromatoenfoque y precipitación diferencial o solubilización, dando como resultado una enzima sustancialmente pura. Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la enzima en cualquier método de acuerdo con la presente descripción, es decir, sustancialmente libre de contaminantes, de otras proteínas y/o productos químicos que puedan interferir o que interferirían con su uso en un método de la presente descripción (por ejemplo, que podría interferir con la actividad enzimática), o que al menos sería indeseable para su inclusión con una enzima de la descripción cuando se usa en un método de la presente descripción (descrito en detalle a continuación). Preferiblemente, una enzima "sustancialmente pura", tal como se hace referencia en este documento, es una enzima que puede producirse mediante cualquier método (es decir, por purificación directa de una fuente natural, de forma recombinante o sintética), y que se ha purificado a partir de otros componentes proteicos de modo que la enzima constituya al menos aproximadamente el 80% en peso de la proteína total en una composición determinada (por ejemplo, la enzima de interés es aproximadamente el 80% de la proteína en una disolución/composición/tampón), y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 85%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 91%, y más preferiblemente en al menos aproximadamente el 92%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 93%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 94%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 96%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 97%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 99%, en peso de la proteína total en una composición dada.

En el presente documento se describe un método de desmetilación (o método desmetilante) de un mono- o dimetoxifenol sustituido con R en un sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R, donde dicho método comprende la etapa de poner en contacto dicho sustrato con una enzima de la descripción y/o una composición multienzimática de la descripción. Preferiblemente, el sustrato que comprende mono o di-metoxifenol sustituido con R es lignina o biomasa de lignina, o mezcla de sacarificación de biomasa de lignina o un compuesto derivado de lignina, más preferiblemente lignina o biomasa de lignina o mezcla de sacarificación de biomasa de lignina rica en grupos S y/o grupos G, más preferiblemente rica en grupos S. La lignina o biomasa de lignina rica en grupos S y/o grupos G se entiende aquí como lignina o biomasa de lignina en la que el porcentaje total de unidades S y G juntas es al menos el 80% de la cantidad total de S, G y H. Ejemplos de dichos recursos de biomasa que son ricos en unidades S y G son: paja de trigo, paja de arroz, paja de cebada, cáñamo, festuca alta, yute, sisal, hoja de planta de banano, pino loblolly, pícea (Picea Abies), Eucalyptus globus, Eucalyptus grandis, péndula de abedul, haya, acacia, Carpinus betulus MWL (lignina de madera molida), Eucryphia codrifolia MWL, Bambusa sp. MWL y Fagurs sylvatica. Ejemplos de los mismos que son específicamente ricos en unidades S (es decir, al menos el 60% del total de S, G y H): yute, sisal, Eucalyptus globus, Eucalyptus grandis, péndula de abedul, Carpinus betulus MWL, Fagus sylvatica. Preferiblemente, dicha lignina es lignina de bajo peso molecular, tal como biolignina y/o lignina organosoluble. El sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R también puede ser cualquier sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R que no sea derivado de lignina. Los mono- o di-metoxifenoles sustituidos con R preferidos comprendidos dentro de dicho sustrato se seleccionan, aunque sin limitación, del grupo que consiste en: ácido siríngico, ácido vanílico, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico, ácido sinápico, ácido ferúlico, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxicinámico, siringol, 2-metoxifenol (guayacol), 3-metoxicatecol y cualquier combinación de los mismos.

Preferiblemente, el sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R comprende además entre aproximadamente 1 y 1000 pM de una sal de cobre, preferiblemente entre 20 y aproximadamente 1000 pM de una sal de cobre, donde dicha sal de cobre se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en CuSÜ4, CuCl2, CuBr2, CuF2, Cu(OH)2 y Cu(NÜ3)2. Preferiblemente, el pH entre el sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R está entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0. Preferiblemente, la etapa del método se realiza a una temperatura entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60°C. Incluso más preferiblemente, el sustrato que comprende mono o di-metoxifenol sustituido con R comprende además entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 pM de una sal de cobre, preferiblemente entre 20 y aproximadamente 1000 pM de una sal de cobre, donde dicha sal de cobre se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en CuSO4, CuCl2, CuBr2, CuF2, Cu(OH)2 y Cu(NO3)2, tiene un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 y la etapa del método se realiza a una temperatura entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60°C.

Preferiblemente, el método de desmetilación es parte de un proceso más amplio (es decir, que comprende etapas adicionales), tal como se detalla a continuación. Preferiblemente, dicho proceso comprende además la etapa de poner en contacto el sustrato con cualquier enzima adicional de la composición multienzimática específica, tal como se indica que es útil para dicho proceso según se detalla en el cuarto aspecto de este documento, ya sea de una vez (por ejemplo, mediante la adición de una composición multienzimática) o secuencialmente.

Preferiblemente, el método de desmetilación es parte de un proceso para convertir la lignina en un producto de valor añadido, por ejemplo, la producción de biocombustibles, macromoléculas y/o productos químicos aromáticos.

En una descripción, el método de desmetilación forma parte del proceso para producir macromoléculas tales como dispersantes, emulsionantes, aglutinantes, secuestrantes, fibras de carbono, modificadores de polímeros, resinas y adhesivos, donde el proceso de producción aprovecha las propiedades de polímero y polielectrolito de la lignina. Dicho proceso preferiblemente comprende además la etapa de sulfonación, introducción de restos etoxi, epoxi, vinilo y/o carbonilo, despolimerización, reticulación intermolecular, aumento de la funcionalidad fenólica (tal como carbonilación, carboxilación, aminación, epoxidación y desesterificación) y/o hilado en fundido.

En una descripción adicional, el método de desmetilación es parte del proceso para producir monómeros aromáticos tales como benceno, tolueno, xileno, fenol, moléculas de lignina monomérica de ácido tereftálico. Preferiblemente, dicho proceso comprende además la etapa de catálisis, tal como deshidroxilación, desalquilación, hidrogenolisis, despolimerización, polimerización, sulfonación. Una etapa de despolimerización es preferiblemente una etapa de despolimerización selectiva. Una etapa de despolimerización selectiva puede dar lugar a compuestos aromáticos complejos que son difíciles de preparar mediante rutas petroquímicas convencionales. A su vez, estos monómeros aromáticos pueden servir como unidades de construcción para conversiones adicionales, tal como para polimerización.

En una descripción adicional, el método de desmetilación puede ser parte de un proceso para obtener productos fermentables, tales como azúcares (proceso de sacarificación), a partir de la biomasa y/o material lignocelulósico degradado, preferiblemente biomasa rica en (hemi)celulosa. Preferiblemente, dicho material lignocelulósico es un residuo agrícola o un residuo producido por la agricultura y la silvicultura. El material lignocelulósico puede degradarse parcial o completamente a azúcares fermentables. Se contemplan niveles económicos de degradación a costes comercialmente viables. Preferiblemente, dicho método comprende además la etapa de poner en contacto el sustrato con al menos una celobiohidrolasa, al menos una xilanasa, al menos una endoglucanasa, al menos una p-glucosidasa, al menos una p-xilosidasa y al menos una enzima accesoria, donde dichas enzimas están incluidas en una composición multienzimática tal como se define aquí, y/o se proporcionan como compuestos individuales. En el presente documento se describen endoglucanasas, p-glucosidasas, p-xilosidasas, enzimas accesorias y/u otras enzimas opcionales útiles en un proceso de sacarificación.

Preferiblemente, el método de desmetilación es parte de un proceso para disolver la pulpa para la producción de productos químicos como, entre otros, rayón, celofán y varios productos químicos como ésteres de celulosa (acetatos, nitratos, propionatos y butiratos) y éteres de celulosa (carboximetil celulosa y metil y etil celulosa) y etanol (por ejemplo, como biocombustible bioetanol). También se prefiere el método para blanquear el papel y la pulpa. El sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R (ya sea presente en el sustrato o añadido como parte del método) en esta descripción comprende o consiste en papel o pulpa, preferiblemente pulpa de madera blanda y/o de madera dura. El método puede usarse para mejorar la capacidad de blanqueo de la pulpa en la industria de la pulpa y el papel.

En una descripción adicional, el método de desmetilación forma parte de un proceso para degradar el Grano Seco de Destilería (DDG), donde el sustrato comprende preferiblemente DDG derivado de maíz, en azúcares. En ciertas descripciones, se libera al menos el 10% de los azúcares fermentables. Preferiblemente, se libera al menos el 15% de los azúcares, o se libera al menos el 20% de los azúcares, o se libera al menos el 23% de los azúcares, o se libera al menos el 24% de los azúcares, o se libera al menos el 25% de los azúcares, o se libera al menos el 26% de los azúcares, o se libera al menos el 27% de los azúcares, o se libera al menos el 28% de los azúcares.

Preferiblemente, el proceso de desmetilación comprende un proceso de pretratamiento. En general, un proceso de pretratamiento dará como resultado que los componentes de la lignocelulosa sean más accesibles para aplicaciones posteriores, tal como la digestión por enzimas. El pretratamiento puede ser un pretratamiento químico, físico o biológico. La lignocelulosa puede haber sido tratada previamente para liberar algunos o todos los azúcares, como en el caso de los DDG. También pueden usarse tratamientos físicos, tales como trituración, ebullición, congelación, trituración, infiltración al vacío y similares, con los métodos de la invención. En una realización, el tratamiento térmico comprende calentar el material lignocelulósico a 121°C durante 15 minutos. Un tratamiento físico como la trituración puede permitir que se utilice una mayor concentración de lignocelulosa en los métodos de la invención. Una concentración más alta se refiere a aproximadamente el 20%, hasta aproximadamente el 25%, hasta aproximadamente el 30%, hasta aproximadamente el 35%, hasta aproximadamente el 40%, hasta aproximadamente el 45% o hasta aproximadamente el 50% de lignocelulosa. La lignocelulosa también puede ponerse en contacto con un ion metálico, luz ultravioleta, ozono y similares. Los procesos de pretratamiento adicionales son conocidos por los especialistas en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, tratamiento organosolv, tratamiento de explosión de vapor, impregnación de cal con tratamiento de explosión de vapor, tratamiento con peróxido de hidrógeno, tratamiento con peróxido de hidrógeno/ozono (peroxona), tratamiento con ácido, tratamiento con ácido diluido y tratamiento con base, incluida la tecnología de explosión de fibra de amoníaco (AFEX). Los detalles sobre tecnologías y procesos de pretratamiento se pueden encontrar en Wyman y col., Bioresource Tech. 96: 1959 (2005); Wyman y col., Bioresource Tech. 96: 2026 (2005); Hsu, "Pretreatment of biomass" en Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, Taylor y Francis Eds., p. 179-212 (1996); y Mosier y col., Bioresource Tech. 96: 673 (2005).

En algunas descripciones, los pasos del método/proceso pueden realizarse una o más veces en su totalidad o en parte. Es decir, se pueden realizar uno o más pretratamientos, seguidos de una o más reacciones con una composición de un método de la descripción. Las enzimas pueden agregarse en una sola dosis o pueden agregarse en una serie de pequeñas dosis. Además, el proceso completo puede repetirse una o más veces según sea necesario. Por tanto, se contemplan uno o más tratamientos adicionales con calor y enzimas.

Los métodos descritos anteriormente dan como resultado la producción de azúcares fermentables. Durante o después del método, los azúcares fermentables pueden recuperarse y/o purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Los azúcares pueden someterse a un procesamiento posterior; por ejemplo, también se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración.

En una realización adicional, se proporciona un método/proceso, que comprende el método de desmetilación, que es para producir una sustancia orgánica, que comprende sacarificar un material lignocelulósico con una cantidad eficaz de la enzima de la descripción y LPMO tal como se define en este documento para fermentar el material lignocelulósico sacarificado obtenido con uno o más microorganismos, y recuperando la sustancia orgánica de la fermentación. Los azúcares liberados de la biomasa se pueden convertir en productos de fermentación útiles que incluyen, entre otros, aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para piensos, productos químicos especiales, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, incluido el etanol combustible. Los productos específicos que pueden producirse mediante los métodos descritos en este documento incluyen, entre otros, biocombustibles (incluido el etanol); ácido láctico; plásticos; productos químicos especiales; ácidos orgánicos, incluidos ácido cítrico, ácido succínico, ácido itacónico y maleico; disolventes; complementos alimenticios para animales; productos farmacéuticos; vitaminas; aminoácidos, tales como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; enzimas industriales, tales como proteasas, celulasas, amilasas, glucanasas, lactasas, lipasas, liasas, oxidorreductasas y transferasas; y materias primas químicas. Los métodos descritos en el presente documento también son útiles para generar materias primas para la fermentación, por microorganismos fermentadores. En una realización, el método comprende además la adición de al menos un organismo fermentador. Tal como se usa en el presente documento, "organismo fermentador" se refiere a un organismo capaz de fermentar, como bacterias y hongos, incluida la levadura. Tales materias primas tienen un valor nutritivo adicional por encima del valor nutritivo proporcionado por los azúcares liberados.

Las una o más enzimas adicionales para uso en un método/proceso de la presente invención preferiblemente también comprenden combinaciones de enzimas que descomponen o modifican la lignina o el material que contiene lignina, reduciendo o previniendo la adsorción no deseada de otros componentes de las composiciones multienzimáticas aplicadas. Dichas combinaciones o mezclas de enzimas pueden incluir una composición multienzimática que contiene al menos una proteína del organismo hospedante o una o más enzimas u otras proteínas de otros microorganismos, plantas u organismos similares. Se contemplan combinaciones de enzimas sinérgicas y métodos relacionados. La invención incluye métodos para identificar las proporciones y composiciones óptimas de enzimas con las que degradar cada lignina y material lignocelulósico. Estos métodos implican pruebas para identificar la composición enzimática óptima y las proporciones para la conversión eficiente de cualquier sustrato de biomasa en los azúcares que lo constituyen. Los ejemplos siguientes incluyen ensayos que pueden usarse para identificar proporciones y composiciones óptimas de enzimas con las que degradar materiales lignocelulósicos.

El método de desmetilación también puede ser parte de un proceso que se utiliza como método para clarificar y/o aumentar la velocidad de filtración y/o disminuir la formación de turbidez de zumos y/o bebidas tales como vino y cerveza. En esta realización, el sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R preferiblemente comprende o consiste en zumo de frutas o verduras tales como, aunque sin limitación, manzana, piña, naranja y tomate, ciruela, zumo de arándanos y/o cereales, tales como, entre otros, cebada, maíz, trigo, centeno, avena y maíz. En esta descripción, las una o más enzimas adicionales para usar en un método de la invención comprenden además preferiblemente una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente), pectinasa, carboximetilcelulasa y/o amilasa.

En una descripción adicional, el método de desmetilación forma parte de un proceso para macerar verduras y/o frutas. En esta descripción, el sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R es una fruta y/o una verdura. En esta descripción, las una o más enzimas adicionales para usar en un método comprenden además preferiblemente una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente), pectinasa, carboximetilcelulasa y/o amilasa.

En otra descripción, el método de desmetilación forma parte de un proceso para la extracción de café, aceites vegetales y almidón, donde el método comprende poner en contacto el sustrato con la enzima de la descripción y una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente) .

En otra descripción, el método de desmetilación forma parte de un proceso de producción de xilitol, un edulcorante valioso que tiene aplicaciones tanto en la industria farmacéutica como en la alimentaria, donde el método comprende poner en contacto el sustrato con la enzima de la descripción y una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente).

En otra descripción, el método de desmetilación de la invención forma parte de un proceso para aumentar la digestibilidad y/o las propiedades nutricionales de materias primas para animales o alimentos para animales, tales como, entre otros, forraje agrícola y pienso de grano, donde el método comprende poner en contacto el sustrato con la enzima de la descripción y una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente). Dicha materia prima animal contiene preferiblemente cereales (por ejemplo, cebada, trigo, maíz, centeno o avena) o subproductos de cereales. Preferiblemente, el sustrato en esta realización comprende o consiste en materia prima para animales tal como, pero sin limitarse a, forraje agrícola y pienso de grano, preferiblemente que comprende cereales, cereal y/o disolución de cereales.

En otra descripción, el método de desmetilación forma parte de un proceso para aumentar la calidad de los productos de panadería y/o mejorar las características texturales (calidad de rotura y trituración y calidad de la miga) de los productos de panadería como, entre otros, el pan. Preferiblemente, el método se aplica para aumentar el volumen del producto de panadería, por ejemplo,. una barra alta y/o ligera de pan integral. En esta descripción, las una o más enzimas adicionales para su uso en un método de la descripción comprenden además preferiblemente una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 tal como se ha definido aquí anteriormente), una celulasa, tal como beta-glucanasa, celulasa, celobiohidrolasa y/o beta-glucosidasa. Preferiblemente, la preparación de celulasa es un complejo de celulasas y/o hemicelulasas, preferiblemente obtenido de Trichoderma sp., más preferiblemente de T. reesei. También se prefieren las preparaciones de celulasa obtenidas de Aspergillus, preferiblemente obtenidas de A. niger. Una composición de celulasa adecuada puede ser CELLUCLAST™ (disponible en Novozymes) o Bakezyme® XU, Bakezyme® XE, BakeZyme® X-cell o Bakezyme® W (todos disponibles en DSM). Las una o más enzimas adicionales para su uso en un método de la invención pueden comprender además enzimas adicionales, por ejemplo, glucoamilasa, a-amilasa, xilanasa, proteasa, lipasa, fosfolipasa y pueden usarse junto con la LPMO en la masa o la composición. La enzima adicional puede ser de cualquier origen, incluidos mamíferos y plantas, y preferiblemente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico). La glucoamilasa para su uso en la presente descripción también incluye glucoamilasas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85% , al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa G1 o G2 de A. N iger(Boel y col. (1984), EMBO J. 3 (5), pág. 1097-1102), la glucoamilasa de A. awamoridescrita en el documento WO84/02921, o la glucoamilasa de A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), pág. 941-949). La amilasa puede ser fúngica o bacteriana, por ejemplo, una a-amilasa maltogénica de B. stearothermophilus o una a-amilasa de Bacilus, por ejemplo de B. licheniformis o B. amyhliquefaciens, una beta-amilasa, por ejemplo de plantas (por ejemplo, soja) o de fuentes microbianas (por ejemplo de Bacillus), una glucoamilasa, por ejemplo de A. niger, o una a-amilasa fúngica, por ejemplo de A. oryzae. Las a-amilasas maltogénicas comerciales adecuadas incluyen NOVAMYLO (Novozymes A/S) y OPTICAKE® (Novozymes A/S). Las composiciones de a-amilasa fúngica comerciales adecuadas incluyen, por ejemplo, BAKEZYME P 300 (disponible en DSM) y FUNGAMYL 2500 SG, FUNGAMYL 4000 BG, FUNGAMYL 800 L, FUNGAMYL ULTRA BG y f Un Ga MYL ULTRA Sg (disponibles en Novozymes A/S). La hemicelulasa puede ser una pentosanasa, por ejemplo, una xilanasa que puede ser de origen microbiano, por ejemplo, derivada de una bacteria u hongo, tal como una cepa de Aspergillus, en particular de A. aculeatus, A. niger, A. awamorí, o A. tubigensis, de una cepa de Trichoderma, por ejemplo T. reesei, o de una cepa de Humicola, por ejemplo H. insolens. Las preparaciones de xilanasa disponibles comercialmente adecuadas incluyen PENTOPAN MONO BG y PENTOPa N 500 BG (disponibles en Novozymes), GRINDAMYL POWERBAKE (disponible en Danisco) y bAk EZYME BXP 5000 y BAKEZYME BXP 5001 (disponibles en DSM). La proteasa puede ser de Bacillus, por ejemplo, de B. amyloliquefaciens. La lipasa puede derivar de una cepa de Thermomyces (Humicola), Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus o Pseudomonas, en particular de T. lanuginosus (H. lanuginosa), Rhizomucormiehei, C. antarctica, A. niger; R. delemar, R. arrhizus o P. cepacia. La fosfolipasa puede tener actividad de fosfolipasa A1, A2, B, C, D o de lisofosfolipasa; puede tener o no actividad lipasa. Puede ser de origen animal, por ejemplo, de páncreas, veneno de serpiente o veneno de abeja, o puede ser de origen microbiano, por ejemplo, de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, tal como Aspergillus o Fusarium, por ejemplo, de A. niger, A. oryzae o F. oxysporum. Una lipasa/fosfolipasa preferida de F. oxysporum se describe en el documento WO 98/26057. Además, se pueden usar las variantes descritas en el documento WO 00/32758. La enzima adicional puede ser de cualquier origen, incluidos mamíferos y plantas, y preferiblemente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico) y puede obtenerse mediante técnicas utilizadas convencionalmente en la técnica. Las composiciones de fosfolipasa adecuadas son LIPOPAN F y LIPOPAN XTRA (disponibles en Novozymes) o PANAMORE Go LDEN y PANAm Or E SPRING (disponibles en Ds M). En esta descripción, el sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R preferiblemente comprende o consiste en una composición de panadería o una masa, que comprende preferiblemente una harina tal como harina integral. La harina integral es una harina que puede obtenerse moliendo o machacando el grano de cereal integral. Cuando se usa para panadería, generalmente se agrega a otras harinas blancas más refinadas para proporcionar nutrientes (especialmente fibra y proteína), textura y cuerpo al producto terminado. La palabra "entero" se refiere al hecho de que se utilizan para hacer la harina no sólo el endospermo almidonado, sino también el salvado y el germen.

En otra descripción, el método de desmetilación es parte de un proceso para producir xilooligómeros (XO) o xilooligómeros oxidados, que pueden usarse en productos farmacéuticos, agrícolas y de piensos. Se sabe que los XO tienen efectos prebióticos, ya que no se hidrolizan ni se absorben en el tracto gastrointestinal superior, y afectan al hospedante estimulando selectivamente el crecimiento o la actividad de una o varias bacterias en el colon, mejorando así la salud. Además, se cree que los XO reducen los niveles de colesterol, mantienen la salud gastrointestinal y mejoran la disponibilidad biológica de calcio. Además, los XO inhiben la retrogradación del almidón, mejorando las propiedades nutricionales y sensoriales de los alimentos.

El método de desmetilación puede ser parte de un proceso en el que está presente ácido ferúlico. El método de desmetilación puede ser parte de un proceso en el que un sustrato se pone en contacto con esterasa de ácido ferúlico (FAE) en condiciones en las que se produce monometoxifenol sustituido con R. El sustrato puede ser un sustrato de biomasa lignocelulósica pretratado. El sustrato puede ponerse en contacto con esterasa de ácido ferúlico, LPMO y PPO. La esterasa de ácido ferúlico puede ser idéntica en al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 98%, a la secuencia de aminoácidos de XynZ de Clostridium thermocellum (SEQ ID NO: 73), FAE Tipo D de Neurospora crassa (SEQ ID NO: 74), FAE Tipo C de Talaromyces stipitatus (SEQ ID NO: 75), FAE de Thielavia terrestris (SEQ ID NO: 76), de Plantillas Humicola (SEQ ID NO: 77), de Ruminococcus sp. (SEQ ID NO: 78), de PC-2 de Orpinomyces sp. (SeQ ID NO: 79), de Schizophyllum commune (SEQ ID NO: 80, SeQ ID NO: 81), de Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 82), FAE tipo A de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 83), FAE tipo B de Aspergillus niger (s Eq ID NO: 84), Fa E tipo C de Emericella nidulans (SEQ ID NO: 85), de Fusarium oxysporum (SeQ ID NO: 86), FaeA1 de Myceliophthora thermophila C1 (SEQ ID NO: 87), FaeA2 de Myceliophthora thermophila C1 (SEQ ID NO: 88), FaeB1 de Myceliophthora thermophila C1 (SEQ ID NO: 89), o FaeB2 de Myceliophthora thermophila C1 (SEQ ID NO: 90). Cuando la secuencia dada comprende una secuencia señal, el especialista en la técnica apreciará que la esterasa de ácido ferúlico puede ser idéntica en al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente en un 98%, a la secuencia de aminoácidos de la secuencia madura (que no comprende la secuencia señal). La LPMO puede ser idéntica en al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 98%, a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 93. La PPO puede ser idéntica en al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 98% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 41 o 45. La LPMO puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 93. La PPO puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41. La PPO puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 .

Normalmente, la cantidad de PPO en una composición para su uso en un método/proceso de la invención dependerá de la cantidad de mono- o di-metoxifenoles sustituidos con R presentes en el sustrato a degradar y/o modificar. La cantidad de enzima (en el presente documento debe entenderse como PPO y/o enzima adicional) puede ser de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 mg de enzima o composición enzimática por gramo de mono- o dimetoxifenoles sustituidos con R; o de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg de enzima o composición enzimática por gramo de mono- o di-metoxifenoles sustituidos con R. La invención abarca el uso de cualquier cantidad adecuada o suficiente de PPO entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 200 mg de PPO por gramo de mono- o di-metoxifenoles sustituidos con R, en incrementos de 0,05 mg (es decir, 0,1 mg, 0,15 mg, 0,2 mg ... 199,9 mg, 199,95 mg, 200 mg).

Además, la cantidad de PPO en una composición para su uso en un método/proceso de la descripción puede estar entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 1000 mg de enzima por kg de materia seca del sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R, o 0,5-100 mg/kg, o 0,5-100 mg/kg o 0,5-50 mg/kg, o 1-25 mg/kg o 1-15 mg/kg, o 2-10 mg/kg enzima/kg de materia seca del sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R.

La descripción también se refiere a un proceso comercial que comprende el método de desmetilación, como el lavado o tratamiento de ropa o tejidos, procesos de detergente, piensos, alimentos, horneado, bebidas, biocombustibles, preparación de almidón, licuefacción, biorrefinado, destintado y bioblanqueo de papel y pulpa, dispersión de aceite y residuos, y tratamiento de corrientes residuales.

La PPO para uso en un método puede ser una enzima o proteína tal como se define en el presente documento. La PPO para uso en un método también puede ser una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ácido nucleico recombinante y/o un vector, que codifica dicha PPO tal como se define en el presente documento. En una descripción, la PPO para uso en un método forma parte de una composición libre de células. En otra descripción, donde la PPO para uso en un método es una molécula de ácido nucleico, dicha molécula de ácido nucleico forma parte de una célula hospedante tal como se define en este documento, preferiblemente un organismo modificado genéticamente tal como se define en este documento, que preferiblemente se modifica para expresar recombinantemente la PPO para uso en un método.

En una descripción, el método de desmetilación de la descripción en el que se cultiva un microorganismo modificado genéticamente en un medio nutritivo que comprende el mono- o di-metoxifenol sustituido con R que se va a desmetilar.

Cuando se añaden más enzimas después del método de desmetilación, las condiciones (tales como temperatura y pH) pueden alterarse para que sean óptimas para la enzima adicional antes, durante o después de la adición de la enzima adicional. También se incluyen múltiples rondas de adición de enzimas. La enzima adicional también puede estar presente en el sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R en sí mismo como resultado de la modificación genética de la planta. El medio nutritivo usado en una reacción de fermentación también puede comprender una o más enzimas accesorias.

En un aspecto, la invención proporciona un método o proceso para degradar y/o modificar (hemi)celulosa, por ejemplo en un sustrato que comprende (hemi)celulosa, donde dicho método comprende la etapa de poner en contacto la composición de sustrato que comprende (hemi)celulosa con una LPMO (preferiblemente la LPMO AA9 o LPMO9B tal como se ha definido aquí anteriormente) y una PPO. Preferiblemente, dicha PPO es una PPO tal como se define en el presente documento. El método puede ser un método para degradar o modificar xilano, por ejemplo, en un sustrato que comprende xilano.

Una PPO alternativa que se puede usar en los métodos descritos en este documento, aparte de la PPO descrita, es preferiblemente una PPO que comprende o consiste en un dominio de tirosinasa central común, preferiblemente de la familia con el número de acceso del NCBI pfam00264 (Volbeda y Hol, J. Mol. Biol. Volumen 209 (2): páginas 249­ 279,1989) y preferiblemente comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente en al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100%, a cualquiera de las SEQ ID NO: 49 (PPO1), SEQ ID NO: 53 (PPO3), SEQ ID NO: 57 (PPO8 ), SEQ ID NO: 61 (PPO5), SEQ ID NO: 65 (PPO 10) o SEQ ID NO: 69 (PPO9). Las SeQ ID n O: 49, 53, 57, 61, 65 y 69 representan la forma madura de PPO1, PPO3, PPO8, PPO5, PPO10 y PPO9, respectivamente. Las SEQ ID NO: 50, 54, 58, 62, 66 y 70 representan PPO1, PPO3, PPO8, PPO5, PPO10 y PPO9, incluida la secuencia señal, respectivamente. Preferiblemente, dicha PPO se puede obtener a partir de un hongo, preferiblemente del género Myceliophthora. Por ser "obtenible a partir de" debe entenderse aquí como que la enzima se origina en el organismo indicado, es decir, es producida de forma natural por el organismo indicado como una enzima nativa. Más preferiblemente, la PPO se origina en el hongo M. thermophila C1 o derivados del mismo, tal como un hongo M. thermophila C1 seleccionado de Garg 27K (n° de acceso VKM F-3500D), UV13-6 (n° de acceso VKM F-3632 D); NG7C-19 (n° de acceso VKM F-3633 D); UV18-25 (n° de acceso VKM F-3631 D); cepa W1L (n° de acceso CBS122189) o W1 L#100L (n° de acceso CBS122190), preferiblemente una M. thermophila C1 (n° de acceso VKM F-3500D).

Preferiblemente, la PPO alternativa está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, o más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a la SeQ ID NO: 51 (ADNc que codifica p Po 1), SEQ ID NO: 52 (ADNg que codifica PPO1), SEQ ID NO: 55 (ADNc que codifica PPO3), SEQ ID NO: 56 (ADNg que codifica PPO3), SEQ ID NO: 59 (ADNc que codifica PPO8), SEQ ID n O: 60 (ADNg que codifica PPO8), s Eq ID NO: 63 (ADNc que codifica PPO5), SEQ ID NO: 64 (ADNg que codifica PPO5), SEQ ID NO: 67 (ADNc que codifica PPO10), SEQ ID NO: 68 (ADNg que codifica PPO10), SEQ iD NO: 71 (ADNc que codifica PP09) o SEQ ID NO: 72 (ADNg que codifica PPO9). Preferiblemente, dicha secuencia de ácido nucleico codificante tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, o más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con respecto a la SEQ ID NO: 52 (ADNg que codifica PPO1), SEQ ID NO: 56 (ADNg que codifica PPO3), SEQ ID NO: 60 (ADNg que codifica PPO8), SEQ ID NO: 64 (ADNg que codifica PPO5), SEQ ID NO: 68 (ADNg que codifica PPO10) o SEQ ID NO: 72 (ADNg que codifica PPO9).

Dependiendo de la cantidad de mono- o di-metoxifenol sustituido con R presente en un sustrato que comprende hemicelulosa, el método comprende además la etapa de añadir y/o mezclar mono- o di-metoxifenol sustituido con R, preferiblemente una cantidad sustancial de mono- o di-metoxifenol sustituido con R.

En una descripción de la invención, el sustrato que comprende (hemi)celulosa está sustancialmente libre de mono- o di-metoxifenol sustituido con R. Un método o proceso de esta descripción comprende la etapa de añadir una cantidad sustancial de mono- o di-metoxifenol sustituido con R.

En una realización adicional, el sustrato que comprende (hemi)celulosa sí comprende mono o di-metoxifenol sustituido con R, sin embargo, en una cantidad o concentración subóptima o en una forma que es menos accesible para la desmetilación por parte la enzima PPO. Un método o proceso de esta realización también comprende la etapa de añadir una cantidad sustancial de mono- o di-metoxifenol sustituido con R.

En otra realización más, el sustrato que comprende (hemi)celulosa comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R en una cantidad o concentración óptimas y en una forma accesible para la desmetilación por parte de la enzima PPO. Un método o proceso de esta realización no requiere ninguna etapa adicional de adición de un mono- o dimetoxifenol sustituido en R.

Un método de este aspecto y de cada realización de este documento abarca un método en el que la LPMO, la PPO y/o el mono- o di-metoxifenol sustituido con R se ponen en contacto, se añaden y/o se mezclan con el sustrato que comprende (hemi)celulosa simultáneamente, y secuencialmente.

En la descripción, la PPO es PPO7 y el mono- o di-metoxifenol sustituido con R es ácido siríngico, ácido sinápico, ácido 3-hidroxi-4-metoxicinámico, 4-hidroxi-3-metoxifenilactona, coniferil aldehído, ácido ferúlico, guayacol, hesperidina, ácido homovanílico, ácido vanílico, ácido 3,4-dihidroxibenzoico, ácido cafeico, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxicinámico o combinaciones de los mismos.

Se entiende aquí que un sustrato que está sustancialmente libre de mono- o di-metoxifenol sustituido con R no comprende cantidades apreciables de mono- o di-metoxifenol sustituido con R, es decir, menos de aproximadamente 0,1%, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01%, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01% o lo más preferiblemente menos de aproximadamente 0,0001% del peso seco total del sustrato.

La adición o mezcla de una cantidad sustancial de mono- o di-metoxifenol sustituido con R se entiende aquí como la adición o mezcla de una cantidad de mono- o di-metoxifenol sustituido con R que da como resultado un aumento en la degradación y/o la modificación de (hemi)celulosa, opcionalmente un aumento en la producción de XO.

En realizaciones, dicho sustrato que comprende (hemi)celulosa comprende xilano que consiste en grandes cadenas de xilano lineales, no sustituidas, preferiblemente tal como está presente en el xilano de avena espelta y en el xilano de abedul. Preferiblemente, dicho sustrato que comprende xilano no consiste solo en, o preferiblemente no comprende principalmente, o incluso más preferiblemente no comprende, xilano que tiene sustituyentes de arabinosilo presentes en la cadena principal de p-1,4-xilano tal como el xilano ramificado presente en el arabinoxilano de trigo. Preferiblemente, el xilano a degradar y/o modificar del sustrato que comprende xilano es xilano que consta de grandes cadenas de xilano lineales, sin sustituir, preferiblemente tal como está presente en el xilano de avena espelta y en el xilano de madera de abedul. Preferiblemente, el xilano que se va a degradar y/o modificar en el sustrato que comprende xilano no es xilano que tiene sustituyentes arabinosilo presentes en la cadena principal de p-1,4-xilano tal como el xilano ramificado presente en el arabinoxilano de trigo.

Preferiblemente, dicho sustrato que comprende (hemi)celulosa comprende celulosa, más preferiblemente celulosa asociada a hemicelulosas y/o celulosa amorfa. Opcionalmente, dicho sustrato que comprende (hemi)celulosa de este método está sustancialmente libre de compuestos mono- o di-metoxifenol sustituidos con R tal como se definen en el presente documento. Opcionalmente, los compuestos mono- o di-metoxifenol sustituidos con R tal como se definen en el presente documento se añaden como parte del método, preferiblemente antes de poner en contacto el sustrato que comprende (hemi)celulosa con la enzima accesoria y la PPO.

Preferiblemente, el mono- o di-metoxifenol sustituido con R que se va a añadir puede ser cualquier compuesto que comprenda mono- o di-metoxifenol sustituido con R tal como se define en el presente documento. Se prefieren dentro de este método el mono- o di-metoxifenol sustituido con R de bajo peso molecular, tal como el presente en la biolignina y/o la lignina organosolv. Incluso más preferido para su uso en el método del presente aspecto es el uso de monómeros de ácido siríngico, ácido vanílico, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico, ácido sinápico, ácido ferúlico, ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxicinámico, siringol, 2-metoxifenol (guayacol), 3-metoxicatecol o cualquier combinación de los mismos.

Preferiblemente, el sustrato comprende además entre aproximadamente 1 y 1000 pM de una sal de cobre, preferiblemente entre 20 y aproximadamente 1000 pM de una sal de cobre, donde dicha sal de cobre se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en CuSO4, CuCl2, CuBr2, CuF2, Cu(OH)2 y Cu(NO3)2. Preferiblemente, el pH del sustrato está entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0. Preferiblemente, el método se realiza a una temperatura entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60°C. Incluso más preferiblemente, el sustrato comprende además entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 pM de una sal de cobre, preferiblemente entre 20 y aproximadamente 1000 pM de una sal de cobre, donde dicha sal de cobre se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en CuSO4, CuCÍ2, CuBr2, CuF2, Cu(OH)2 y Cu(NO3)2, tiene un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 y el método se realiza a una temperatura entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60°C.

Preferiblemente, el método de este aspecto es parte de un método o proceso para sacarificación, para disolver pulpa para la producción de productos químicos, para blanquear papel y pulpa, para degradación de DDG, para producir una sustancia orgánica, para clarificación y/o para aumentar la tasa de filtración y/o para disminuir la formación de turbidez en zumos y/o bebidas tales como vino y cerveza, para la extracción de café, aceites vegetales y almidón, para la producción de xilitol, para aumentar la digestibilidad y/o las propiedades nutricionales de materias primas para animales o de piensos para animales, y para aumentar la calidad de los productos de panadería y/o mejorar las características texturales (calidad de rotura y trituración y calidad de la miga) de los productos de panadería tales como, entre otros, pan, tal como se describe más detalladamente en este documento, y pueden comprender etapas adicionales tal como se describe adicionalmente en el presente documento, como poner en contacto el sustrato con otras enzimas indicadas como particularmente adecuadas para dicho proceso descrito en el presente documento.

En el presente documento se describe un sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R y/o un sustrato tal como se define en cualquiera de los aspectos anteriores, que comprende además la enzima PPO de la descripción, la molécula de ácido nucleico de la descripción, la célula hospedante de la composición enzimática o formulación de la descripción. Preferiblemente, dicho sustrato que comprende mono- o di-metoxifenol sustituido con R y/o un sustrato que comprende xilano es adecuado para su uso en un método o proceso de la descripción.

Ejemplo 1: Clonación de secuencias codificantes de polipéptido de PPO de Myceliophthora thermophila C1 que tienen actividad desmetilante

Se sintetizó (GeneArt) el ADN genómico que codifica PPO2 (SEQ ID NO: 36), PPO4 (SEQ ID NO: 40), PPO6 (SEQ ID NO: 44) y PPO7 (SEQ ID NO: 48) y se clonó en el vector pChi como se ha descrito anteriormente (WO 2010/107303 A2). Transformación de la cepa W1 L#100.1 Apyr5AAlp1 usando el marcador pyr5 tal como se ha descrito previamente.

Ejemplo 2: Preparación de polipéptidos PPO que tienen actividad desmetilante

Se prepararon PPO4, PPO6 y PPO7 con actividad desmetilante y PPO2 tal como se describió anteriormente. En resumen, la fermentación de la cepa W1 L#100.1 Apyr5AAlp1 que sobreexpresa la PPO se realizó tal como se describe en el documento WO 2010/107303 A2, se recolectó el caldo, se filtró para eliminar la biomasa fúngica, se concentró y se dializó contra KPi 20 mM pH 7,0 más KC1 150 mM usando una membrana PES de 5 kDa (Vivacell® 70, Sartorius). Posteriormente, las muestras se liofilizaron para su almacenamiento.

Ejemplo 3: Ensayo de actividad de catecol oxidasa

La actividad de la PPO se determinó midiendo la tasa inicial de oxidación de 3-metoxicatecol a 400 nm (coeficiente de extinción utilizado: £ 1200 M-1cm-1). Una unidad de actividad se define como la cantidad de actividad de PPO que oxida 1 pmol de 3-metoxicatecol a quinona por minuto. El sustrato se utilizó a una concentración de 4 mM.

Ejemplo 4: Caracterización de polipéptidos PPO que tienen actividad desmetilante

Los pH óptimos se determinaron midiendo la tasa inicial de oxidación de 3-metoxicatecol a diferentes pH, a temperatura ambiente y usando una concentración de CuSO4 de 10 pM. El pH se varió en el rango de pH 3-9 usando tampones Carmody. Se aplicó una carga de enzima que dio como resultado valores de absorbancia A400 en el rango de 0,1-1. La concentración de proteínas se determinó mediante el método BCA.

Las concentraciones óptimas de cobre para las PPO se determinaron al pH óptimo variando la concentración de CuSO4 en el rango de 1-1000 pM. En estos experimentos, el pH se controló usando tampón Bis-Tris 50 mM pH 7,0.

Los óptimos de temperatura se determinaron midiendo la absorbancia A400 después de 1 hora de incubación a temperaturas en el rango de 20 a 70 °C. En estos experimentos, el pH se controló usando tampón Bis-Tris 50 mM pH 7,0. Se utilizaron concentraciones de cobre (20 o 50 pM) para prevenir la oxidación química como actividad de fondo a las concentraciones de cobre más altas.

Tabla 1. Óptimos determinados para PPO 4, 6 y 7

Ejemplo 5: Purificación de PPO7 con actividad desmetilante y purificación de PPO2

El material liofilizado de PPO7 se disolvió en agua MilliQ, se filtró con filtros de 0,45 pm, se aplicó en una columna Source™ 30Q de 50 mL (XK16/20, GE Healthcare) equilibrada con KPi 20 mM pH 7,0 y se eluyó usando un gradiente de KCl de 0 a 1 M (por pasos) en dicho tampón con un caudal de 3,5 mL por minuto. Como segunda etapa de purificación, se usó una columna de Phenyl Sepharose™ Fast Flow 6 (alto sub) de 50 mL (XK16/20, GE Healthcare) equilibrada con KPi 10 mM pH 7,0 más sulfato de amonio 1 M. Se realizó una elución escalonada para tamponar sin sulfato de amonio a un caudal de 3,5 mL por minuto. Las fracciones agrupadas se concentraron y dializaron frente a KPi 20 mM pH 7,0 más KCl 150 mM usando una membrana de PES de 5 kDa (Vivacell® 70, Sartorius). La etapa de purificación final se realizó en una columna Superdex® 200 PG de 120 mL (HiLoad 16/600) equilibrada con KPi 20 mM pH 7,0 más KCl 150 mM a un caudal de 1 mL por minuto. Las fracciones puras se agruparon y concentraron usando una membrana de PES de 5 kDa (Vivacell® 70, Sartorius).

El material liofilizado de PPO2 se disolvió en agua MilliQ, se filtró en filtros de 0,45 pm, se aplicó a una columna Source™ 30Q de 50 mL (XK16/20, GE Healthcare) equilibrada con KPi 10 mM pH 7,0 y se eluyó usando un gradiente de KCl de 0 a 1 M (por pasos) en dicho tampón a un caudal de 3,5 mL por minuto. Como segunda etapa de purificación, se usó una columna de 20 mL de Butyl Sepharose™ Fast Flow (HiPrep 16/10, GE Healthcare) equilibrada con KPi 10 mM pH 7,0 más sulfato amónico 1,5 M. Se realizó una elución escalonada para tamponar sin sulfato de amonio a un caudal de 4 mL por minuto. Las fracciones agrupadas se concentraron usando una membrana de PES de 5 kDa (Vivacell® 70, Sartorius). Finalmente, se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex® 200 PG de 120 mL (HiLoad 16/600) equilibrada con KPi 20 mM pH 7,0 más KCl 150 mM a un caudal de 1 mL por minuto. Las fracciones puras se agruparon y concentraron usando una membrana de PES de 5 kDa (Vivacell® 70, Sartorius).

Ejemplo 6: Conversión de ácido siríngico por polipéptidos PPO que tienen actividad desmetilante

Se incubó ácido siríngico (12 mM, 2,38 g/L) con PPO7 y PPO2 del Ejemplo 5 (0,048 g/L, 2% de carga (p/p)) en tampón BisTris 50 mM pH 6,5 con CuSO4 10 pM. Se incluyó el blanco preparado sin la adición de enzima. Las incubaciones se realizaron en viales de HPLC con un volumen de reacción total de 750 pL a temperatura ambiente durante 24 h. La reacción se detuvo añadiendo 21 pL de HCl 1 M para reducir el pH a -3. Se filtraron las muestras y se midieron los espectros de absorbancia (230-1000 nm, intervalo de 2 nm). La Figura 2 muestra la diferencia de espectros de absorbancia (restado el blanco de ácido siríngico) después de 24 h de incubación. La conversión de ácido siríngico indujo el pico negativo en la diferencia de espectros de absorbancia entre 230 y 300 nm, que fue más significativo para PPO7 que para PPO2. Además, los productos de reacción de PPO7 dieron como resultado un aumento espectral entre 300 y 500 nm (que se confirmó por el cambio de color visual del vial de reacción; ver Figura 3). Cabe señalar que cualquier cambio en la absorbancia en el tiempo indica la conversión del ácido siríngico.

Ejemplo 7: Conversión de ácido siríngico, ácido sinápico y siringol por polipéptidos PPO que tienen actividad de desmetilación

Se incubaron ácido siríngico, ácido sinápico y siringol (4 mM) con PPO2, 4, 6 y 7 sin purificar del Ejemplo 5 en tampón BisTris 100 mM pH 6,0 o 7,0 con CuSO4 50 pM. Se dosificaron las PPO sin purificar en la proteína diana con una concentración final de 8,2 pg/mL. Se incluyeron blancos de sustrato preparados sin la adición de enzima y blancos de enzima sin la adición de sustrato. Las incubaciones se realizaron en placas de microvaloración con un volumen de reacción total de 150 pL a temperatura ambiente durante aproximadamente 120 h. Después de 2, 22 y 118 h se midió la absorbancia a 400 nm. La Figura 4 muestra datos de UV-VIS a 400 nm; se restaron los blancos de enzima.

La PPO7 y la PPO6 pudieron convertir ácido siríngico, ácido sinápico y siringol, mientras que la PPO4 solo pudo usar ácido siríngico como sustrato. La PPO2 no mostró actividad significativa sobre esos sustratos en comparación con los blancos de sustrato.

Ejemplo 8: Desmetilación del ácido siríngico

Se incubó ácido siríngico (12 mM, 2,38 g/L) con PPO7 del Ejemplo 2 (1,2 pM, 0,048 g/L, 2% de carga (p/p)) en tampón BisTris 50 mM pH 6,5 con CuSO4 10 pM. Se incluyó el blanco preparado sin la adición de enzima. Las incubaciones se realizaron en viales con espacio de cabeza de GC con un volumen de reacción total de 1 mL por duplicado a temperatura ambiente durante aproximadamente 90 h. La reacción se detuvo añadiendo 28 pL de HCl 1 M para reducir el pH a -3. Una de las réplicas se analizó mediante GC para determinar la formación de metanol. Se incluyó un intervalo de calibración de metanol de 0,23 a 11,6 mM en tampón con HCl. La segunda réplica se analizó usando UHPLC y se confirmó la formación de ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico usando MSMS (ver Figura 5). La Tabla 1 muestra las concentraciones de ácido siríngico, metanol y ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico. La PPO7 catalizó la desmetilación del ácido siríngico, lo que resultó en la formación de ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico y metanol.

Tabla 1. Concentraciones (mM) de ácido siríngico (UHPLC), metanol (GC) y ácido 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzoico

(UHPLC)

Ejemplo 9: Desmetilación de compuestos modelo de tipo lignina, de lignina y de compuestos derivados de lignina por parte del polipéptido PPO7 que tiene actividad desmetilante

Los compuestos modelo ácido siríngico, siringol, 1,3-dimetoxibenceno y ácido 3,5-dimetoxibenzoico (12 mM) se incubaron con la PPO7 del Ejemplo 2 (carga al 2% (p/p)) en tampón BisTris 50 mM pH 6,5 con 10 gM de CuSO4. Para el ácido siríngico y el siringol, se incluyó la PPO2 del Ejemplo 2 como control. Se incubaron lignina y compuestos derivados de lignina (10 g/L) con la PPO7 del Ejemplo 2 (0,5 g/L, 5% de carga (p/p)). La PPO2 del Ejemplo 2 se incluyó como control y se incubó usando las mismas condiciones. Se incluyeron los blancos preparados sin la adición de enzima. Las incubaciones se realizaron en viales con espacio de cabeza GC con un volumen de reacción total de 1 mL a 25 °C durante aproximadamente 48 h mientras se agitaba. La reacción se detuvo añadiendo 28 gL de HCl 1 M para reducir el pH a ~3. Las muestras se analizaron por GC para determinar la formación de metanol. Se incluyó un intervalo de calibración de metanol de 0,23 a 11,5 mM en tampón con HCl. La Tabla 2 muestra las concentraciones de metanol determinadas por GC.

La PPO7 catalizó la desmetilación del ácido siríngico y del siringol, mientras que la PPO2 no lo hizo. Las incubaciones en 1,3-dimetoxibenceno y ácido 3,5-dimetoxibenzoico no mostraron liberación de metanol para la PPO7.

Con la lignina y los compuestos derivados de lignina, la PPO7 mostró una mayor concentración de metanol en comparación con el blanco.

Tabla 2. Concentración de metanol (mM) determinada por GC.

Ejemplo 10: Clonación, preparación y purificación de LPMO9B de M yceliophthora thermophila

El ADN que codifica LPMO9B (SEC ID NO: 91; secuencia de aminoácidos: SEC ID NO: 92; secuencia de aminoácidos "madura" sin la secuencia señal: SEC ID NO: 93) se amplificó a partir de ADN genómico y se clonó en el vector pChi tal como se ha descrito previamente (WO 2010/107303 A2). La transformación de la cepa W1L#100.lApyr5AAlp1 se realizó usando el marcador pyr5 y la LPMO9B se preparó por fermentación de la cepa W1L#100.lApyr5AAlp1 que sobreexpresa LPMO tal como se describe en el documento WO 2010/107303 A2. Se recolectó el caldo, se filtró para eliminar la biomasa fúngica, se concentró y se dializó contra fosfato de potasio 10 mM pH 7,0 más KCl 150 mM usando una membrana de PES de 5 kDa (Vivacell® 70, Sartorius). Se purificó la MtLPMO9B en tres pasos cromatográficos posteriores a partir de las correspondientes preparaciones de enzimas dializadas utilizando un sistema de cromatografía preparativa ÁKTA-Explorer (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La preparación enzimática que contiene la LPMO9B se cargó en una columna Source 30Q (50 mL, GE Healthcare). Se utilizó un tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,8) para preequilibrar la columna. La elución se realizó usando un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M en tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,8) a caudal de 10 mL min-1 y se monitorizó a 220 y 280 nm. Las fracciones que contenían la LPMO9B se agruparon y se concentraron mediante ultrafiltración (Amicon Ultra, corte de peso molecular de 3 kDa, Merck Millipore, Cork, Irlanda) y posteriormente se cargaron en una columna Source 30S (50 mL, GE Healthcare). Se usó un tampón de acetato de sodio 20 mM (pH 5,0) para pre-equilibrar la columna y la elución se realizó usando un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M en acetato de sodio 20 mM (pH 5,0) a un caudal de 5 mL min-1. Las fracciones máximas se agruparon, se concentraron y se cargaron en una columna Source 30S (50 mL, GE Healthcare preequilibrada con tampón de acetato de sodio 10 mM (pH 5,0)). La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón de partida y posteriormente se eluyó usando un gradiente lineal de KCl de 0 a 1 M en acetato de sodio 20 mM (pH 5,0) a un caudal de 5 mL min-1. Las fracciones que contenían la LPMO9B purificada se reunieron y se concentraron como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 11: Celulosa amorfa regenerada (ensayo de hidrólisis RAC con LPMO9B y PPO2, PPO7 o AbTyr en presencia de agente reductor de dimetoxifenol, ácido sinápico o ácido siríngico

Purificación de tirosinasa AbTyr de champiñón: La tirosinasa de champiñón sin purificar se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.) y se purificó como se ha descrito anteriormente (Kuijpers TFM y col. (2014) “Potato and Mushroom Polyphenol Oxidase Activities Are Differently Modulated by Natural Plant Extracts”. Journal of Agricultural and Food Chemistry 62 (1): 214-221 y Kuijpers TFM, Gruppen H, Sforza S, van Berkel WJH y Vincken J-P (2013) “The antibrowning agent sulfite inactivates Agaricus bisporus tyrosinase through covalent modification of the copper-B site”. FEBS Journal 280 (23): 6184-6195). La actividad de la fracción de tirosinasa purificada se definió como el aumento de la A280 en 0,001 U por minuto utilizando L-tirosina como sustrato de referencia. La actividad determinada de la fracción utilizada en este trabajo fue de 3000 U mL-1. Se determinó que la concentración de proteína de esta fracción era de 270 pg/mL. La determinación de proteínas se realizó mediante el método BCA.

Los agentes reductores ácido sinápico y ácido siríngico se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). El RAC se preparó a partir de Avicel hinchándolo en ácido fosfórico, (Zhang YHP, Cui J, Lynd LR y Kuang LR (2006) “A transition from cellulose swelling to cellulose dissolution by o-phosphoric acid: Evidence from enzymatic hydrolysis and supramolecular structure”. Biomacromolecules 7 (2): 644-648). Se disolvió el RAC en tampón fosfato 50 mM (pH 5,0) hasta una concentración final de 1,5 mg/mL. Se añadió cloruro de cobre hasta una concentración final de 2,5 pM y dimetoxi que contenía agente reductor ácido sinápico o ácido siríngico hasta una concentración final de 2 mM. Se añadió LPMO9B (5 pg/mL) con o sin PPO2 (5 pg/mL), PPO7 (5 pg/mL) o Ab Tyr (7,5 U/mL) y se incubaron durante 24 h a 50 °C en un rotador de cabeza sobre cola en porciones de 1 mL de volumen total (rotador Stuart®, Bibby Scientific LTD, Stone, Reino Unido) a 20 rpm. Los productos se analizaron mediante HPAEC y MALDI-TOF MS tal como se ha descrito anteriormente (Frommhagen M, Sforza S, Westphal AH, Visser J, Hinz SW, Koetsier MJ et al. “Discovery of the combined oxidative cleavage of plant xylan and cellulose by a new fungal polysaccharide monooxygenase”. Biotechnology for Biofuels. 2015; 8: 101. doi:10.1186/s13068-015-0284-1). Los resultados se muestran en la Tabla 3 (ver a continuación). La actividad indicada como "Actividad*" representa la liberación total de glucooligosacáridos no oxidados y oxidados con C1 de RAC incubados con LPMO9B en presencia de ácido sinápico o siríngico como agente reductor y con la adición de AbTyr, PPO7 o PPO2. La actividad de LPMO9B equivale al 100%, no se detectó actividad para LPMO9B en ausencia de un agente reductor, todas las incubaciones se realizaron por duplicado. Las desviaciones estándar fueron inferiores al 2%.

Tabla 3. RAC incubado con LPMO9B en presencia de agente reductor de dimetoxifenol ácido sinápico o ácido siríngico con o sin adición de AbTyr, PPO7 o PPO2

Ejemplo 12: Ensayo de hidrólisis RAC con LPM09B y PPO7 o AbTyr en presencia de agentes reductores fenólicos

Los agentes reductores fenólicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Se preparó RAC tal como se ha descrito anteriormente y se disolvió en tampón fosfato 50 mM (pH 5,0) hasta una concentración final de 1,5 mg/mL. Se añadió cloruro de cobre hasta una concentración final de 2,5 pM y un agente reductor fenólico hasta una concentración final de 2 mM. Se añadió LPMO9B (5 pg/mL) con o sin PPO7 (5 pg/mL) o AbTyr (7,5 U/mL) y se incubaron durante 24 h a 50 °C en un rotador de cabeza sobre cola en porciones de 1 mL de volumen total (rotador Stuart®, Bibby Scientific LTD, Stone, Reino Unido) a 20 rpm. Los productos se analizaron mediante HPAEC y MALDI-TOF MS tal como se ha descrito anteriormente (Frommhagen M, Sforza S, Westphal AH, Visser J, Hinz SW, Koetsier MJ et al. “Discovery of the combined oxidative cleavage of plant xylan and cellulose by a new fungal polysaccharide monooxygenase”. Biotechnology for Biofuels. 2015; 8: 101. doi:10.1186/s13068-015-0284-1). Los resultados se muestran en la Tabla 4 (incluida a continuación). La Actividad indicada como Actividad * representa la liberación total

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para degradar y/o modificar celulosa en un sustrato de biomasa lignocelulósica, donde dicho proceso comprende la etapa de poner en contacto dicho sustrato con una polisacárido monooxigenasa lítica (LPMO) y una polifenoloxidasa, donde la polifenoloxidasa comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la SEQ ID NO: 45, y donde la polifenoloxidasa comprende o consiste en un dominio de tirosinasa central, y donde la polifenoloxidasa es capaz de desmetilar un mono- o di-metoxifenol sustituido con R representado por la fórmula [1 ], [2 ] o [3]:

donde R puede ser cualquier átomo o resto químico individual.

2. El proceso de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de mezclar un mono- o di-metoxifenol sustituido con R representado por la fórmula [1], [2] o [3].

3. El proceso de la reivindicación 2, donde R es un resto orgánico.

4. El proceso de la reivindicación 2 o 3, donde el mono- o di-metoxifenol sustituido con R está representado por la fórmula [1].

5. El proceso de la reivindicación 4, donde el mono- o di-metoxifenol sustituido con R es ácido siríngico o ácido sinápico.

6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho sustrato comprende una concentración 1­ 1000 pM de una sal de cobre.

7. El proceso de la reivindicación 6, donde la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en CuSO4, CuCl2, CuBr2, CuF2, Cu(OH)2 y Cu(NO3)2.

8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el proceso se lleva a cabo a un pH entre 5,0 y 8,0.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el proceso se lleva a cabo a una temperatura entre 20 y 60°C.

10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, donde la polifenoloxidasa se puede obtener de un hongo.

11. El proceso de la reivindicación 10, donde el hongo es Myceliophthora thermophila.

12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la polifenoloxidasa comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la SEQ ID NO: 45.

13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha LPMO comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 93.

14. El proceso de la reivindicación 13, donde la LPMO comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 93.