JPS60501738A - 工業微生物種中の分子クロ−ニングおよび発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 工業微生物種中の分子クローニングおよび発現発明の背景 発明の分野 ポリペプチドを高収率で生産するため工業華細胞微住物株をＡ、Ｆｌ換えＤＮＡ を有する宿主として使用することに相当の関心が存在する。多くの工業的に重要 な酵素、例えはデンプン分解酵素およびタンパク分解酵素はバチルス属の微４ト 物、例えばＢ、ザチリス゛（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ、アミロリクエファ シェンス（Ｂ、　、ａｍｙｌ。

１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　、Ｂ、リヘニホルミス（Ｂ、　ｌ　ｉｃｈｅｎｉ ｆｏｒｍｉｓ）　、＋３゜ステアロセルモフィルス（Ｂ、　ｓｔｅａｒｏＬｈｅ ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　、およびＢ。

コアギユランス（８，ｃｏａｇｕＩａｎ禮、により生産される。発酵槽中ムこ非 常に丈夫で安定な菌株が使用される。さらに菌株はファージ感染および、さらに 遺伝子交換、すなわち−！！通の形質転（９干１１ｊｆｉによるＤＮＡの導入、 に耐性である。臂通の工業菌株はまた栄養培地に対する高価なアミノ酸の添加を 避りるために原栄養体である。

工業菌株の他の特徴は１週間はどの長さであることかてさ、る発ｔ７の終りまで のその高い生産性、ブロスを消費するときの安定な細胞濃度、および高い生産性 、通常少くとも約ｏ　５％ｗ　／　ｖの分泌タンパク質、である。さらに、培地 中にＤＮＡの実質的な分解があるようにＤ　Ｎ　Ａ　ｓｏｓの実質的な分泌があ ることがバチルスでしばしば認められる。

工業菌株の遺伝子修飾耐性およびそれを飢餓にするのを困難にするその原栄養特 性のために、それらは形質転換乙こ対する耐性を示す。従って、］ニ工業菌株へ ＤＮＡを導入する有効な方法を提供することは非常に有用であり、その場合にＤ ＮＡは工業菌株中に安定に保持され、工業菌株の生存能力および活性の喪失また 実質的な喪失がなく、内生およびりも生のポリペプチドまたはクンバク２ 質性産物の高い収率を得ることかできよう。

さらに、宿主細胞の修飾または形質転換が内生遺伝子または先に導入した遺伝子 のコピー数を増加することを含む場合に細胞の選択が困難であり、その場合に遺 伝子は外在選択と関連がない。

従って、追加の遺伝子（増加したコピー数）の存在を検出および選択できる有効 な方法をもつことが非常に望ましい。

従来技術の説明 Ｂ、サチリスの遺伝子操作はヨ不ダ他、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｓ、　 Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、（１９７３）５０ニア６５−７７０；ヨ不ダおよびマル２７４〜 ２７６、により報告された。Ｂ、サチリスの一定の有効形質転換性研究室菌株、 例えばσ−アミラーセ、β−アミラーゼ、シヒ１０￥酸還元酵素４インターフェ ロン！−ゝよびインン：、リン、の生産性改良に関する組換えＤＮＡ技術の良好 な応用か報告された（Ｐａｌｖａ、　Ｇｅｎｅ（１９８２）−ｊ、ｊ９：８１− ８７；シノミャ他、八ｇｒｉｃ、Ｒｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９８］）　４５： 　１７３３〜１７３５；Ｇｒａｙミスト壌分離体の遺伝子操作における困難はＴ ｈｏｒｎｅおよび５ｔｕｆｆ。

、１．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９６６）９１　；　１０１２−１０１４、によ り幸Ｕ告さねている。また英国特許出願ＣＢ２．０９＋、６２８号；ヨーｒ」７ パ特許出願０．０３４．４７０号、ヨーロッパ特許出願０．８３２．２３８号； およびヨーロッパ特許出願０，０７７．１０９号、３　１寺！（口ＨＧＯ−５０ １７３８（３）その開示はｐＵＲ１５２３に関するので参照によりここに加えら れる、を参照されたい。

発明の概要 遺伝子的に修飾された単細胞微生物株、殊に工業バチルス株、を含む新規な方法 および生成物が提供される。工業菌株宿主中に発現できる関心のある遺伝子を含 む染色体外ＤＮＡが適当な細菌宿主、便宜には工業菌株に関連する研究室菌株宿 主、およびＪ’業菌株と組合上だ修飾細菌宿主中−・融合条件のもとで導入され る。

関心のある遺伝子（類）を含む工業菌株の細胞は関心のある遺伝子に関連したマ ーカーによりｉＭ択される。

図面の？、？ｉ華な説明 第１図はプラスミドｐＧＢ３３の線図であり、第２図はプラスタ）ｐＧ　Ｂ　３ ４の線図−（あり、第３図はプラスタＦ　ｐ　Ｌ　Ｃ２８の線図であり、第４図 はプラスミドｐ　Ｌ　Ｃ８３の線図であり、第５図はプラスタＦ　ｐ　ｌ　Ｃ８ ７の線図であり、第６図はプラスタｌ’　ｐ　Ｇ　Ｐ　３５の線図であり、第７ 図はプラスミドｐ　Ｌ、　Ｐ　３３の線図であり、第８図はプラスタＦ　ｐ　Ｌ 　Ｐ　８７の線図であり、第９図は種々のハチルス工業菌株により分泌された生 成物のクンバク質分子量マーカーに関するＳＤＳポリアクリルアミドゲル−電気 体動図である。

特定態様の説明 ポリペプチド生成物を好収率で生産するために発酵に使用する−［巣卑細胞微生 物株を遺伝子操作する方法か提供される。バチルス株が他の微生物の例証として 使用される。生ずる修飾された工業菌株は、工業菌株の所望の特性を保持し、同 時に内生（同種）または外生（異種）の遺伝子の表現生成物の高い収率を与える 。

この方法は、ＤＮＡを複製することができ、染色体外ＤＮＡの導入か容易に可能 である細菌宿主中へ染色体外ＤＮＡを導入することを含む。染色体外要素を含む 修飾された細菌宿主細胞は次いで工業バチルス株と融合条件のもとで組合され、 そこで受容株バチルス細胞を、次に染色体外要素か生ずる関心のある遺伝子また は遺伝子類の存在について選択することができる。

本発明は次の部分に分けることができる・ｆｉｌバチルス宿主中の高められた発 現が望まれる遺伝子を含むプラスミド構築体の調製ｔ（２）工業バチルス菌株と の融合に使用できる和合性宿主（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｈｏｓｔ）中のプラスミ ド構築体のクローニング、（３）プラスミド構築体を含む宿主と−［業バチルス 株との融合、そのような工業菌株の選択を含む、および（４）関心の遺伝子の表 現生成物を４１ユ産するための適当な栄養培地中の前記菌株の生長。

関心のある遺伝子（１１）は前核細胞または真核細胞の遺伝子であることができ る。これらの遺伝子はＩＪＨ菌遺伝子、単相ｔｌＦ７　微生物遺伝子、１Ｔｉｌ ｉ　７Ｌ動物遺伝子などを含むごとができる。構造遺伝子は合成、ゲノムＤＮＡ からの分離、ｃ　ＤＮＡからの調製またはそれらの組合せを含む種々の方法で調 製することかできる。遺伝子の種々の操作法がよく知られ、制限消化、切除（ｒ ｅｓｅｃｔｉｏｎ）　、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、ｉｎ　ｖｉｌ、ｒｏ突然変 異誘発、プライマー１１ト復、リンカ−およびアダプターの使用なとが含まれる 。征って、宿主から得られるｌ）　Ｎ　Ａ配列は、ＤＮＡ構築の要件により種々 の方法で操作することができる。Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ、　Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、　ｙ、＋　１９８２　参 照。

遺伝子か、二丁業バチルス株により認、汽される転写および翻訳の開始および終 結の調節シグナルを有する宿主から得られる場合には、通常工業バチルス宿主中 に発現できるンス）−ロンを与えるために構造遺伝子の５′−および３′−フラ ンキング領域（ｆｒａｎｋｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）を維持することが便宜であろう 。転写開始領域は、適当な状態において、関心の構造遺伝子の高水準の発現が得 られる前に宿主か高密度に生長できるように構造的または誘導的発現を与えるこ とができる。

構造遺伝子が、調節シグナルがバチルスにより認識されない源からである場合に 、バチルスにより認識される調節領域を得、開始および終結の調節シグナルの間 に構造ｊｎ伝子を挿入することが必要であろう。ある場合には、自身の停止二Ｉ ｌ：ン（類）を有する外生構造遺伝子をリーディングフレーム中、自然調節シグ ナルを有する外生バチルス構造遺伝子のＮ　末端二Ｉトンの背後に挿入すること ができる。生ずる生成物はそのとき若」二の、例えば０〜３０（ｌｔｌｌの１、 追加Ｎ−末端アミノ酸を有することができる。あるいは、オペロンを調製Ｊるこ とかでき、その場合に里−プロモータか複数のポリペブチＬをツーＩずろ７１２ ・−１ビン、／ヤーＦ？　ｊｔＪ、へのΦ７・。

写開始を与える。

ある場合には、表現生成物が分泌されることが望ましいがもしれない。表現生成 物が自然に分泌され、リーダーシグナルおよびプ「１セノソングシグナル（類） がバチルス宿下により認識される場合に、これは何ら困難を要しない。しかし、 ４１−放物が普通には分泌されないか、またはバチルスが分泌シグナルおよび（ または）ブロセノソングシグナル（類）を認識しない、ずなわらシグナルかバチ ルスに十分な程度に機能しない場合には、ハチルスボリペブチトの分泌シグナル およびブロセソノングソグづ一ル（類）を二１−１するＤＮＡ配列を分離または 合成し、それらを適当なリーディングフレーム中の構造遺伝子の５′一端に接合 することが必要６ であろう。

構造遺伝子は酵素、ホルモン、リンフ才力イン、サーフェスタンパク質、血液タ ンパク質、構造クンバク質、免疫グロブリンなどのような種々のポリペプチドま たはタンパク質を、哺乳動物、華細胞微生物、例えば細菌、菌類例えば酵母菌ま たは線状菌、藻類、原生動物など、植物、あるいは他のＤＮＡ源から表現するこ とができる。特に重要なものは酵素、より詳し７くはヒドロラーゼ、より詳しく はプロテアーゼおよびツノカリダーゼ（ｓａｃｃａｒｉｄａｓｅ）である。その ような酵素の例はエキソペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、セリンおよび非セ リンブロテアーセ、α−およびβ−アミラーゼ（殊に耐熱性のα−アミラーセ） などである。

和合性宿主並びにバチルス株に使用できる広い数のヘクターか存在する場合には 、複製系は和合性宿１−およびバチルス株に対し同しでも異なっていてもよい。

（ヘクターは１つまたはより多くの宿Ｊと和合性の複製系、通常宿土中の、少く とも１つの便宜な、通常独自の制限部位を選択するマーカーを意味ずろ。）通常 、和合性宿主、非１．業用または研究室バチルス株を右することは便利であろう が、しかしこれは必須ではなくである場合には他の生物、例えばＥ、　ｃｏｌｉ 、を使用することかできる。ヘククーは１つまたはより多くの複製系を含むので 少くとも和合性宿主中でクローニングされることができる。複製系は高または低 コピー数、好ましくは少くとも約１０、一般に約１００を超えないコピー数を与 えることができる。

工業バチルス株中の構造遺伝子の組込みを望むか染色体外要素」−の保持を望む かにより、バチルスに対する複製系が含まれ、または含まれないことができる。

あるいは、組込みのために、ヘクターまたはプラスミド構築体中の相同のストレ ッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）にバチルスゲノムを与え組換えの確率を高めることがで きる。

複製系に加えて、少くとも１つのマーカーが存在し、１つより多くのマーカー、 通常約３個を超えないマーカーが存在することができる。マーカーは宿主中で発 現できる構造遺伝子を意味し、それが生存選択を与える。［生存選択−１は栄養 要求性宿主に原栄養性、生物致死剤またはウィルス耐性をｈえることを意味する 。

原栄養性のために種々の遺伝子、例えばｌｅｕ、　ａｕｒａ、　ｔｒｐ　などを 用いることができる。生物致死剤耐性のためにこれは例えばｎｅｏ。

Ｃａｍ１　ｔｅｔ、　ｔｕｎ、　ｋａｎなど、抗生物質に対する耐性を含むこ吉 ができる。他のマーカーには重金属、免疫など（５，二対づる耐＋’Ｌか含まれ る。種々のＩ）　Ｎ　Ａ配列は、種々の源から詔専Ｌ、接合し２て１つまたはよ り多くの便宜な、好ましくは独自の制限部（＼ンを含む・＼ククーを与え、その ような部位に、または失っ１−フラクメン１−の代わりに、構造遺伝子の挿入ま たは置換を可能にしプラスミツト構築体を与えることができる。

ブラスミ１↑：を整体か調製されれは、次Ｑこそれを和合１（［またはクローニ ング宿主として示す適当な和合性宿主中でクロンすることができる。便宜な、容 易に形質転換される、プラスミド構築体の複写および融合による工業バチルス株 への転移をすえる任意の宿＋を用いることができる。形質転換の高い効率を有し 、通常栄養要求性および（または）抗体物質感受性である多数の研究室菌株を利 用できる。プラスミＩ・構築体のクローニングに対するバチルス宿主の使用は、 それが１つの複製系並びに同・マーカーの和合性宿主および工業菌株の両方にお ＬＪる生存選択に対する使用を可能にする点で多くの利点を有する。従って、大 抵はプラスミド構築体か適当なバチルス宿主中でクロンされよう。バチルス宿」 二は工業宿主と同しバチルス株である必要がなく、主に便宜士選択される。プラ スミド構築体は常法、例えば形質転換により、カルシウム沈殿ＤＮＡ、接合、ま たは他の便宜な方法を用いて和合性宿主中へ導入することができる。和合性宿主 は次いで適当な栄養培地中で、プラスミツト構築体を含む宿主を選択する選択条 件のもとで生長さゼることができる。栄養要求性宿主のために栄養培地は必要栄 養素を欠き、一方生物致死剤耐性のために細胞傷害量の化物致死剤（頚）例えは 抗生物質（頽）が栄養培地中に使用される。

和合性宿主を十分な密度に生長さセた後、次に和合性宿主を処理して融合のため の細胞を調製する。

便宜に、細胞は原形質体の形成前または形成中に細胞傷害剤−（殺（ｋｉｌｌ） される。抗件物質を含め、種々の試薬を使用できるが、しかし、司−ドアセトア ミ）・が便利かつ有効であることが認められ、後の融合を］一部し２ない。原形 質体は普通のツノ法、例えばリソチームまたはチモリアーセ（ｚｙｍｏｌｙａｓ ｅ）処理Ｑこより細胞から調製され、原形質体は、原形質体の結合性を維持する ために適当なニイスモラリティを有する適当な媒質中に慎重Ｇこ懸濁さ相る。

工業バチルス受容体株もまた和合性宿主菌株と同様に処理し７て原形質体を形成 するが、しかし生存可能細胞が原形質体の調製に使用される。工業バチルス株の 所望特徴を有する種々のバチルス株、例えばサチリス、レヘニホルミス、アミロ リフエフアンシス、スデアし！セルモフィルス、およびコアギユランス、好まし くはりヘニホルミスおよびサチリス、を使用することができる。］二業バチルス 株は土壌中の分離あるいは寄託所または耐性の源から入手できる生物から選ばれ 、あるいはそのようなバチルス株の修飾により得られる。工業バチルス株は遺伝 子交換、例えはファージ感染または形質転換、乙こ耐性であることに特徴かある 。菌株は安定であり、胞子形成が可能であるこ吉も可能でないこともできる。

それらは原栄養性であり、内生タンパク質生成物、例えば酵素、α−アミラーゼ および種々のプロテアーゼの高い収量を与える。

それらはまたＤＮＡ、、、を分泌することが認められ、ぞオフが培地中でＤＮＡ の分解を生し、遺伝子交換に対する保護をＬＪ−える。

死（ｄｅａｄ）和合性宿主原形質体と生存可能工業バチルス宿王原形質体とは適 当なフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）の存在Ｆ　？、ｆ４１１＃〒さ拍る。所望の効 率を与える任意のフソゲンを使用できるが、大抵はポリ１−チレングリコールが 非常に便利で、融合の高い効率を９えることが認められる。死ｊ京形質体とバチ ルス受容体株との割合は好ましくは少くともＩ：ｌであり、過剰の死片形質体を 用いる、二とができる。短時間後Ｑこフソゲン混合物は適当な栄ｊ２培地お、１ 、ひＩバＨｅされた培地中で古注じた細胞で、便宜乙こは寒大平扱トｒ’Ｅ　゛ ｌ’扱培前培養−４とにより置換される。次い−（クロンは付加ｌ’Ｍ造げｔ包 子のイａ−ａ＋の検出のために適当な方法でスクリーン−４ろことかできる。Ｉ ４弓・の方法を、殊に酵素か含まれる場合に用いる、−とが−（き、そ才８よよ く確立された検出法を有する。あるし料、１、酵素か、′曾［拘７”（いｌ！− 合に、または利用できる検出糸かない馬力ＬｉＺは、抗体、Ｉ−）　Ｎ△−Ｖた はハイブリット形成、あるいハタ１物検定をりｒ：ＩンのスクリーＪ−ンクに使 用しプラスミツト構築体の存在！−９よひ関心の構造遺伝１′（類）の発現を測 定することができる。

プラスミド構築体または染色体に組込まｌたブラスミ［構築体類またはそれらの フラグメントを含む丁業？＼ナルス宿１−は次い−ご栄養培地中で普通の発酵条 件のもとで」ユ長さゼる。発酵はブ１−］スが消耗するまで続けることができる 。生成物が分泌された場合には、生成物は常法、例えば抽出、り［１マドクラフ イー、電気泳動など、によりブロスから分離するごとかでさる。４ト成物か細胞 質中に保持されている場合には細胞を遠心分離、ろ過などにより収１０ 穫し、機械的せん断、洗剤、リソチームまたは他の方法により溶解し、生成物を 前記のように分離することができる。王題の方法を用いることにより内生ポリペ プチドの非常に高い収量、通常親細胞の収量の少くとも約１５０％倍、より普通 には少くとも１７５％、好ましくは親細胞の収量の約２００％倍、を達成するこ とができる。

以下の実施例は例証として、そして限定としてではなく提供される。

実施例Ｉ 染色体ＤＮＡの分離 Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ 、　０ｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔ　Ｌｌｌａａｒｒｚ　ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａ ｎｄｓ　（以下ＣＢＳと記す）に１９８３年７月６日にＮｏ、４７０．８３とし て寄託したＢ、リヘニホルミス工業株Ｔ５の染色体ＤＮＡを３７℃で通気丁に生 長させた３Ｌ培養から分離した。細胞は５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡＳ−ロークー中 ０分間１０．００Ｏｒｐｍで回転沈降させ、２５％ｗ／ｖスクロースおよび５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ７！を含むｌ　Ｑｍ６のスクロース−Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８ ，０中に懸濁させ、Ｑ、５ｍｆｆリソチーム７容７夜（２０ｍｇ／ｒｒｌりの添 加により溶解し、３７°Ｃで１５分間インキュベートした。ＥＤＴＡ（０，５Ｍ ）２ｍβを添加し、０°Ｃで５分間インキュベートした後、２０％（ｗ／ｖ）） デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１ｒｒ＋７！を加えた。次いで懸濁液を■：１ フェノールークロロホルム混合物で抽出した。上澄み液を分離し、純エタノール ２容を慎重に載せ、その後ＤＮＡをガラス棒を用いて分離した。１０μｇ／ｍβ リボヌクレアーゼを含有する蒸留水に溶解した後、ＤＮＡ懸濁液を１１フェノー ル−クロロホルムで抽出し、エタノール２容で沈殿さセ、ＴＥ緩衝液（ずなわち 、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣａＸｐＨ８，Ｏ）中に 再び七、濁した。

実施例■ プラスミドＤＮＡの分離 プラスミドｐＵＢ１１０を含むＢ、ザチリス株］Ｇ２０　（ヨーロッパ特許明細 書０．０２１．４６８号参照）を、５　／Ｊ　ｊ！　／　ｍ　ｊ！ネオマイノン を加えたｌ　Ｌ　ｐｅｎａｓｓａｙブロス培地中で一夜生長させた。５ｏｒｖａ １１モデルＧＳＡローター中で５．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心分離した後、］ 　５５ｍ７＋スクロースーＴｒｉｓ緩衝液に再び懸濁させ、細胞を実施例Ｉに記 載したように溶解し、Ｉ乙１）　Ｔ　ＡおよびＳＤＳで処理した。ＮａＣ１をＩ Ｍの最終濃度に添加した後、１−澄み液を４℃で一夜貯蔵し、次いで５ｏｒｖａ 　ｌ　ｌ　タイプ５Ｓ３４０−ター中で１２．５００ｒｐｍで４５分間遠心分離 した。上澄み液の上部７０％（Ｗ／Ｖ）をＤＮＡ、、、を含まないＲＮＡ、、、 ２０　ｐｇ／ｍβで処理しく３７’Ｃで０．５時間）、フェノール−クロロホル ム（１：　］）混合物で抽出し、次にクロロホルムψ独で抽出した。

抽出した上澄み液から、５Ｍ　ＮａＣ／　０．２容および４０％（Ｗ／■）ポリ エチレングリコール６．０００．０．２５容を添加することによりＩ）ＮＡを沈 殿させ、次に４°Ｃで１６時間インキュベートした。沈殿および遠心分離（１２ ，５００ｒｐｍで３０分、５ｏｒｖａｌｌタイプ３３３４０−ター）した後、Ｄ ＮＡを２−３　ｍ　ＰのＴＥ緩衝液（実施例■中のように）に再び懸濁さセ、分 散物を４　Ｍ　Ｎａ０１１でｐＨ１２，０にした。次いでｐ）ｌを８．５に調整 し、懸濁液をフェノールで抽出した。抽出物をエタノールで沈殿させた後、プラ スミドＤＮＡを少量のＴＥ緩衝液中に再び懸濁させた。

プラスミドｐＵＲ１５２３（ヨーロッパ特許明細書Ａ−７７，１０９号参照）Ｄ ＮＡをＥ、コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）からＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ。

２ 記載された方法により分離した。

実施例■ ａ）　α−アミラーセ含有絹換えプラスミドｐＧＢ３３およびｐＧＢ３４（第１ 図および第２図）の構築 バチルス生産株′Ｉ゛５から分離した〈実施例■に記載した）染色体１）　Ｎ　 Ａ　５μｇおよびＢ、サチリスｌＧ２０から分離した〈実施例ＩＩに記載した） ｐＵＢｌｌｏ、］ｐｇをＥＣ０ＲＩで消化した。６５°Ｃで７５分間の制限酵素 の熱変性の後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ ！ｐｌ＋７．　６．１０ｍＭ　ＭｇＣ７！ｚ　、１０ｍＭジチオトレイトール（ ＤＴＴ）、０．２！ｚｍρウシ血清アルブミン、０．５ｍＭＡＴＰおよびＴ４リ ガーセ１単位を含むリガーセ混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　−Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）２０ｍ／中に再び懸濁させた。混合物を４°Ｃで一夜連結させた９連結した 混合物を実施例１■に記載したように１３．サチリス中へ転移さゼた。プラスミ ドＤＮＡを選択した組換え微生物から分離しく実施例ｒｌに記ｉ１ｉνの方法を 用いた）、制限エンドヌクし・アーゼで分析した。プラスミｊ”ｐＧＲ３３はｐ 　Ｕ　ｆ３１　！、　Ｏおよびα−アミラーゼンスＩ・ロンを含む約３　ｋｂｐ の染色体ＥＣ０ＲＩフラグメントの絹換え体であった。ｐ　Ｇ　Ｂ　３３を制限 エントヌクレアーゼＨｉｎｄ　ＩｌｌおよびＢａｍＨＩて消化し、次いでＳ１エ キソヌクレアーゼ切除およびＴ４による連結をするとｐＧＢ３４（第２図）が生 じ、それはなおα−アミラーゼシストロンをかまうが、しかし多くの不便な制限 部位を含むＤＮＡセグメントを欠く。Ｂ、→ＪチリスＩ　−８５（−ｔｒｐ−） 中のプラスミドｐＧＢ３３およびＢ、サチリス］　Ｓ　−５３（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、０ｈｉｏ、Ｕ　Ｓ　Ａ）中のｐ 　Ｇ　Ｂ　３４はそれぞれ１９８３年７月６日に階４．６６．８３およびＴｈ４ ６７．８３としてＣＢ、Ｓに寄託された。

ｂ）　ギモシン含有組換えプラスミドｐ　Ｌ　Ｃ２８、ｐ　Ｌ　Ｃ８３およびｐ ＋、、ｃ８７（第３図、第４図および第５図）の構築ｐＧＢ３４ＤＮＡ０．５μ ｇおよびｐＵＲ１５２３、ウシキモシンのための遺伝子をかくまうＥ、コリプラ スミド、０．５μｇをＰｓｔｌで消化した。実施例■ａ記載のようＧこ熱変性お よび連結した後、混合物を形質転換に用いた。選択した形質転換体（実施例■に 記載した選択手順を用いた）から分離したプラスミＦ’　Ｄ　Ｎ　Ａを制限エン （・ヌクレアーゼで分析した。選択されたプラスミド、ｐＬＣ２８と称ず、はｐ 　Ｇ　１３３４の独特のＰｓｔ■部位中へ挿入されたｐＵＲ１５２３のキモノン 遺伝子を含むＰｓｔｌフラグメントの組換え体であった（第３図）。ｐ＋−、Ｃ ２８を制限エントヌクレアーゼ（：ｅａ　Ｉで切り、次いでエキソヌクレアーゼ Ｂａβ３１で切除し、１゛４　リガーセで連結するとｐ　Ｌ　Ｃ８３（第４図） がヰし、それはキ４ニンンの１こめの遺伝子を含むが、もはや多くの不便な制限 部位を有するＩ）　Ｎ　Ａフラグメントを含まない。ともにＢ、→フチリスｌ５ −５３中のプラスミ１ｐ　Ｌ　Ｃ２８およびｐ　ｌ−Ｃ８３は１９８３年７月６ Ｆ］ｃこそれぞれＮａ４．６９．８３および１ｋ４６８．８３とＬ　テＣＨＳ　 ｌコ寄託された。

α−アミラーゼ転写および翻訳開始調節配列の背後の相中にキモノン遺伝子を配 置するために、ｐ　Ｌ　Ｃ８３をＰｓｉで消化し、ヌクレアーゼＳｔで切除し、 １゛４　リガーセで連結し７た。得られたプラスミドはｐＬｃ８７と称され、配 列分＋１「により正ξ７い配置および配向を有することかボされた。第５図参照 。

Ｃ）　プロテアーゼ含有組換えプラスミＦ　ｐ　ｌ−Ｐ　３３およびｐ　＋、、 　Ｐ８７　（第７図および第８図）の構築 １４ プロテアーゼ生産Ｂ、サチリス１６８　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＧｅｎｅＬｉｃＳ ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、　０ｈｉｏ）の染色体ＤＮＡ　 Ｉ　Ｏ０８ｇを制限酵素Ｃβａ＋で消化した。フェノール抽出後ＤＮＡフラグメ ントを１％アガロースゲル上で分離した。エレクトロエリューションにより若干 のＤＮＡフラクションをゲルから溶離し、ＣＩ！ａ　＋で線状にしたｐＧＢ３５ （ハチルスヘクターｐＧＬ＋　１２　＼Ｗ、　Ｍ、　ｄｅ　Ｖｏｓ、　Ｔｈｅｓ ｉｓ　１ｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｒｏｎｉｎ（Ｈｅｎ１９８３、および ｐＧＢ３３のα−アミラーセ遺伝子を含む組換えブラスミＩ・、第６Ｍ参照）と 連結さセた。連結生成物を実施例■に記載したように反応性Ｂ、サチリスＲＵＢ ３３１細胞中へ転移させた。得られたクロラムフェニコール耐性形質転換体を０ ６４％カゼイン−アミロース平板上で詩められたプｌ−）ヶアーゼ活（：Ｉ’、 　（ｐｒｏＭ　）および低下したα−アミラーセ牛産能力（ａｍｙ”　）につい て分析した。プラスミドＤＮＡをｐｒｏｔ’　ａｍｙ−形質転換体から分離し、 制限部位地図を作成した。　ｐ　１．　Ｐ　３３はセリンブロテアーセをコーＩ ・する構造遺伝子を含む３．３ｋｂｐ（Ｊ！ａ　＋フラグメントを含むようＧこ 思われる（第７図）。ｐ　＋−，Ｐ８７　（第８図）は非セリンプロテアーゼに 対する遺伝子情報を含む１．８ｋｂｐの染色体（Ｊ！ａ　ｌインサー１〜を有す る。

実施例■ バチルス株の形質転換 細胞懸濁液１ｍｐ、および連結したＩ）ＮＡｌμｇを３７°（゛で０．５時間、 穏やかに振りまぜてインキュベートすることによりＢ　サチリス］、　−８５（ ｔｒｐ−ａｍｙ−）を形質転換した（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓおよび５ ｐｉｚｉ（Ｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９６１）　８１　：　 ７４１−７４６）。形質転換体を、０．０２％（Ｗ／■）カサミノ酸（Ｉｌｉｆ ｃｏ）および１０ｇｇ　／　ｒｎβ抗生物質を添加した最少培地寒天平板上で抗 生物質耐性について選択した。こわらの形質転換体は次に所望の構造遺伝子の存 在について分析した。

α−アミラーゼの場合には、０６％（Ｗ／Ｖ）Ｋｌおよび０．３％（Ｗ／Ｖ）＋ ２を含有する溶液で平板を覆った後ハロ（ｈａｌｏｓ）をめることにより；生物 活性酵素のＮ〜末端アミノ酸配列によりｉｌ　ｖｉｔｒｏ合成した３２ｐ標識Ｄ ＮＡプ１コープに対する正のハイブリッド形成により；酵素に対する抗体との免 疫沈殿により、および比較エレクトロフォー力ソング６．′：より行なった。

キモシンの場合には、正のｊｘ択を３２ｐ標識ｐ　Ｕ　Ｒ１５２３ＤＮＡとのハ イブリッド形成を経て、および抗キモンン抗体による免疫沈殿により行なった。

ハチルスブロテアーセに対する遺伝子を同定するため、形質転換体をそのカゼイ ン最少培地寒天平板［−のハロの形成能力について試験した。セリンおよび非セ リンプロテアーゼ間の差異は５ｃｈｅｉｎｅｒおよびＱ　旧（４１ｙの方法（Ａ ｎａｌ、　ＲｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ　（１９８２）１２卒：　５８−６９）に より決定した。

選択された形質転換体を細胞融合試験乙こおいて供与体菌株とて使用した。

実施例Ｖ 細胞融合および再生 形質転換したＢ、サチリス株（ｐＧＢ３３を含む丁３　サチリス株］−８５、ｐ ＬＣ８７を含むＢ、→ノ゛チリス株１ｓ−５３またはｐＬＰ３３を含むＦ３　、 サチリス株ＰＵＢ３３１）を、ソノ中に関連抗生物質を有する５０ｍ７＋ＮＢＳ Ｇ−Ｘ培地（Ｔｈｏｒｎｅおよび５ｔｕ１１．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　 （１９６６）　９１　：　１０１２−１０２０（表■、ｐｌｏ］４））中３７° Ｃて一夜律長さセた。培養物を新ＮＢＳＧ−Ｘ倍地で１：１に希釈し、Ｉ　Ｏｍ ’Ｍヨードアセトアミ６ト ＧＳΔローター中で５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１．５Ｍスクロー ス、０．　０　６Ｍ　Ｍｇ（、Ｌｚおよび０．０６Ｍマレアートを含有する１０ ｍ＃ＳＭＭ緩衝液中に再び懸濁した後、細胞を２ｍｇ／　ｍ　（２リソチームの 存在下に３７°Ｃで２時間インキュー、−トすることにより細胞を原形質体化し た。原形質体を回転沈降させ（１０分Ｘ　５．Ｏ　Ｏ　Ｏｒｐｍ　）　、５ｍ／ 　ＳＭＭＬ緩衝液（１．５Ｍスクース、０．０６ＭＭｇＣβ２および０．００６ Ｍマレアートを溶解したＬブロス）中に再び懸濁し、混合し、再ひベレットにし た。再懸濁後、原形質体を受容体菌株Ｔ５の原形質体、前記のように原形質体化 した生存ｉＪ能細胞、と混合し、約３０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリ：ｌ−ル ６．０００の存在下に２分間インートゴーヘートした。ＳＭＭＩ−媒質による１ ：３希釈および遠心分離後、ベレットを少量のＳＭＭＬ媒質中に再び惹溺した。

次いて１００μρアリコートを、０．７％（ｗ　／　ｖ）　ＫｚｌｌＰＯ４、０ ．３％（Ｗ／Ｖ）　Ｋ１１２ＰＯい　０．１２５％（　ｗ　／　ｖ　）　（ＮＩ ＋４）　２Ｓ０４、０．０３５％（Ｗ／　ｖ　）　ｈｓＯ４・７　１（２０　、 １　、５％（Ｗ／Ｖ）寒天、３　７％（ｗ／ｖ）Ｋｃｐ．０．１％（Ｗ／Ｖ）グ ルコース；０．２％（Ｗ／ｖ）　ＭｎＳＯ４　、０．　２　％　（ｗ／ｖ）　Ｚ ｎＳＯ４　、０．　２　％　（Ｗ／Ｖ）ＣｏＣ７！２、０．５％（ｗ／　ｖ）　 ＦｅＳＯ，　、６％（ｗ／ｖ）ＮａＣ７！および０．５％（ｗ，’　ｖ）ＣａＣ ／ｚを含有する０　１％（Ｗ／Ｖ）胞子）４液を補足した０．０１％（Ｗ／Ｖ） ウシ血清アルブミンを含む再生寒天平板上で平板培養した。さらにこれらの平板 は関連抗生物質、ｐＧＢ３３、ｐＬＰ３３およびｐ　ｌ−　Ｃ　８　７の場合に １００〜１６０μｇネオマイシンを含有した。３７°Ｃで少くとも７２時間イン キュベートした後、平板を、受容体菌株は耐性であるが供与体菌株が受感性であ る他の抗生物質もまた含有するウシ心臓浸出液（　ｈｅａｒｔ−ｉｎｆｕｓｉｏ ｎ　）寒天平板十でレプリカ平板培養した。

Ａ型として示す融合体（ｆｕｓａｎｔ）は実施例１■に記載した方法により分析 した。α−アミラーゼの場合に手順は次のように繰返した。

Ａ型融合体をｐＧＢ３６　Ｄリメトプリムに対する耐性をインニ１ードする遺伝 子を含むｐＴＬ１２（クナカおよびカワノ、Ｇｅｎｅ（１　９　８　０）１立： １３１〜１３６）およびＢ　リヘ二゛ポルミスαーアミラーゼをコート−する遺 伝子を含むｐ　Ｇ　＋３　３　３のＰ．’ｃｏＲ１制限フラグメントの組換えプ ラスミド〕を含むＢ．、−ＩＪチリ久原形質体と融合させるとＢ型として示す融 合体か牛し７た。Ａ型およびＢ型の融合体はともに、３２ｐ標識プラスミ）’　 ｐ　Ｇ　Ｂ　３　３を用いるケノム分析により、および比較Ｓ　Ｄ　Ｓゲル−電 気泳動により特性化した。最後に、得られた融合体を種々の酵素の発酵生産のた めに選択した。

実施例■ 遺伝子的に操作したバチルス什産株Ｑこよるα−アミラーゼ、プ■ー１テアーゼ およびキモシンの発酵生産 ｐＧＢ３３を含むＢ．サチリス株１−８５との融合により　〈実施例■に記載し たように）得られたＢ．リヘニホルミス′１゛５の遺伝子約６こ操作した生産菌 株を］−菜栄養フロス中で、分泌し７たクンバク質の生産が少（とも０　５％Ｗ 　／　Ｖであるような、α−アミラーゼが主成分である、発酵条件のもとて７日 間ｔＤＷした。この操作した菌株の生産を親菌株Ｂ．リヘニホルミス′［５の生 産と比較した。生産菌株Ｂ．リヘニボルミスＴ５により分泌された生成物（第９ 図レーン３参照）およびｐＧＢ３３を含む遺伝子的に操作した菌株Ｂ．リヘニホ ルミスＴ５により分泌された生成物（第９図レーン２参照）のＳＤＳポリアクリ ルアミＩゲル−電気体動図により示されるように、αーアミラーセの生産はプラ スミト１８ ｐＧＢ３３の導入により相当に増加した。

類偵の結果がプラスミドｐＬＰ３３、その導入はプロテアーゼの生産を改良した 、およびプラスミドｐ　Ｌ　Ｃ８７、その導入はキモシンを生産できるＢ、リヘ ニホルミス１゛５株を生した、で得られた。

表Ｉはそれぞれの遺伝子的に操作した微生物の改良の量的表示の要約結果を示す 。

料　２α−アミラーゼ遺伝子 木本＊　３α−アミラーセ遺（入を 主題の方法はバチルスに非常に良好であることを示した。しかし、バチルス以外 の多くの単細胞微生物が工業的発酵に使用され、そしてそれらを効率的な形質転 換を受りつけなくする工業）＼チ／Ｌス株のような性質を有する。従って主題の 方法は、前核生物および真核生物例えば他の細菌、菌類例えば酵母菌および線状 菌、原生動物、藻類などの工業菌株で適用を見出す、−とができよう。属の種、 例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンシタ（Ｃａｎｄｉｄａ ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ）、クルイヘロマイセスＣＫ！ｕｙ ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ペニシラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）　、シュードモナ ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　は殊に重要であ る。

これらの生物中およびバチルス乙こついて示した部分中で殊に重要なものは内生 ポリペブーｆ−　１・、例えばαーアミラーセ、アミｌ’：Ｉクルコソダーセ、 カタラーセ、セルラーセ、キモシン、βーガラクトノダーセ、グリコースイソメ ラーセ、ヘミセルラーゼ、インへルダーセ、ラクターゼ、リバーセ、ベクチナー セ、ベクチノエステラーゼ、ベニンジンアミダーセ、ペニンリナーセ、プロテア ーゼ、エキソ−およびエントーペクチダーゼ、プルラナーセ並びにキシラナーゼ の」二業生産である。また外生タンパク質例えは、呻乳動物の血液タンパク質例 えば因子■、（゛およびＲ、血清アルブミン、組織プラスミノーゲン活性化因子 、他の血液因子例えば■、■、■、■、Ｘ．ＸｌおよびＸｌｌ　、リンフメカイ ン、インクーノＬロン例えばα−、β−およびＴ−、哺乳動物の酵素、細胞表面 レセプター、免疫グロブリンなどが重要である。

上記結果から相同または異種の遺伝子を工業バチルス株中・・、安定に導入し、 一方菌株の所望特性を保持し、バチルス宿主に内）１の所望の表現生成物を増加 した生産、または関心のある新規表現生成物の生産における高い受容能力を与え るための簡単で効率的な手順が提供されることが明らかである。転移の高い効率 か達成され、実質的な相同関係がプラスミド構築物と工業バチルス株染色体との 間に存在する場合に構造遺伝子の１つまたは複数のコピー組込みを達成できる。

主題の方法は、現在存在する工業ノ＼チルス株を関心のある種々のポリペブチ１ −およびタンパク質の効率的な発酵生産を与えるために修飾する能力を非常に高 める。

前記の発明は理解を平明にするために例示および実施例としてかなり詳しく記載 されたりれども、一定の変更および変形を請求の範囲内で実施できることか明ら か一〇あろう。

Ｆｉｇ．　Ｉ ｃｏＲＩＩ 国際調査報告 Ｉｎｔｕｒｖ＋１ｏｎａｌＡｏｐ１１ｅ＋ｔｌｏｎＮｏ、ｐ（Ｔ／］Ｌ８４／Ｑ ＱＱ２１　：！Ａ＋’１ＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＭ　ＩＮＴＥＲ１ＩＡ’ｒＩＯＮＡ Ｌ　ＳＥＡ、ＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号０発　明　者　アンドレオリ　ベ ーター　ミハ　洲＠発　明　者　フォス　イヴオンネ　ヨハンナ　４＠発明者　 ファン　ニー　ヤン　ヘントリ　洲ツク ｏ発　明　者　ムーレナース　レオ　イエ−」ニス　エム ト オランタ国３０５５ニーイエ−ロッテルダム　モレンラーン　１１１オランダ国 　１１０６デーエル　アムステルダム　ゼット　オー　ワーノ オ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　単細胞微生物株宿主中の安定な保持および関心のあるポリペプチドの表現 が可能なりＮＡを前記単細胞微生物株宿主中へ効率的に導入する方法であって、 フッケンの存在下に、容易に形質転換できる第１宿王中に保持できる染色体外要 素として前記ＤＮＡを含む前記第１宿主の細胞と前記単細胞微生物株宿主細胞と を、前記菌株宿主細胞の選択を与える条件のもとで組合せ、それにより前記ＤＮ Ａを前記菌株宿主細胞へ転移させ；前記ＤＮＡを含む単細胞微生物株を選択する ことを含む方法。 ２　単細胞微生物株宿主が工業菌株宿主である、請求の範囲第１ｘＢδ己載の方 法。 ３、　工業菌株宿主がヘクターＧこよる遺伝子修飾に耐性である、請求の範囲第 ２項記載の方法。 ４、　ヘクターがプラスミド、ファージまたはコスミｌ゛である、請求の範囲第 ３項記載の方法。 ｓ、ｊ：業菌株宿主が工業醗酵条件のもとで少くとも０．５％ｗ／ｖの分泌タン パク質生産水準を有する、請求の範囲第２項記載の方法。 ６（ａ）所望のタンパク質またはポリペプチドをコートする遺伝子を含むＤＮＡ をフラグメントにし、 （ｂ）　ヘククーを前記フラグメントにしたＤＮＡに連結させ、ｔｃ）前記の連 結したヘクターで補助細胞を形質転換し、（ｄ＋　形質転換した細胞を所望遺伝 子の存在および場合によりその発現について選択し、場合により前記形質転換補 助細胞を不活性化し、 （Ｇ）　選択した宿、］：、微生物からの細胞の原形質体と前記場合により不活 性化さねた形質転換補助細胞とを融合させ、（ｆ）　所望のタンパク質またはポ リペプチドをコートする遺伝子を含み、所望のタンパク質またはポリペプチドを 生産するための増加した能力を有する、融合、再生された細胞を選択づる、 ことを含む、所望のタンパク質またはポリペプチドを生産する増加した能力を有 する微生物を特徴する請求の範囲第１項記載の方法。 ７、所望のタンパク質またはポリペプチドをコートする遺伝子を含むＤＮＡが１ つまたはより多くの制限酵素によりフラグメン）・にされる、請求の範囲第６項 記載の方法。 １！、ｊ＄細胞微生物株宿主が細菌、酵母菌およびｍ類からなる群から選ばれる 、請求の範囲第１項記載の方法。 ９　フソゲンの存在下に、容易に形質転換できる第１　＋’＋ｉｉ核牛吻宿土中 に保持できる染色体外要素としてＤ　ＮＡを含むＹｌ；）起筆１宿主細胞と工業 バチルス株宿主細胞とを、ｉｉ？ｉ記Ｔ業バチルス株宿王細胞の選択を与える釜 件のも吉で（■合一１！、そわに、１り前記ＤＮＡを前記工業バチルス株宿土細 胞へ転移さセ；　＋ｉｉｉ記１）　Ｎ　Ａを含む工業バチルス株宿主細胞を選択 づることを含む、工業バチルス株宿主中の安定な保持および関心のあるポリペプ チドの表現か可能なＩ）　Ｎ　Ａを前記工業バチルス株Ｉｌ！ｆ］；中−・効率 的に導入する請求の範囲第１項記載の方法。 １０、Ｉ業バチルス株が閑株すヘニホルミスである、請求の範囲第９項記載の方 法。 １１　ポリペプチドがハヂルス株の内生酵素である、請求の範囲第９項記載の方 法。 １２、内生酵素がα−アミラーゼ、好ましくは耐シノー慴α−アミラーセ、また はプロテアーゼである、請求の範囲第１１項記載の力２３ 法。 １３、＊細胞微生物株の選択を与える条件が殺した第１前核生物行主細胞を用い ることである、請求の範囲第１項記載の方法。 １４、工業バチルス株宿主中の安定な保持および関心のあるポリペプチドの表現 が可能なり’Ｎ　Ａを前記工業バチルス株宿主中へ交率的に導入する方法であっ て、フッケンの存在下に、容易に升質転換でき、バチルス中で機能できる複製系 を有するブラスミＦ構築体中にＤＮＡを含む第１死バチルス宿主細胞と前記工首 バチルス株宿王細胞とを組合せ、そこで前記細胞が原形質体Ｊして存在し、それ により前記１）　Ｎ　Ａを前記工業バチルス株宿」細胞へ転移させ、前記ＤＮＡ を含む工業ハヂルス株宿主細胞杢選択することを含む方法。 １５　工業バチルス株宿主が菌株リヘニホルミスである、請求のφｊ囲第１４項 記載の方法。 １＆、関心のあるポリペプチドがバチルス内仕酵素である、請求σ範囲第３１項 記載の方法。 １７、ｒ）ＮＡが工業バチルス株宿王の染色体中へ組込まれる、請ｊの範囲第１ ６項記載の方法。 １８、酵素がα−アミラーゼ、好ましくは耐熱性α−アミラーセ、またはプロテ アーゼである、請求の範囲第１６項記載の方法。 １９、請求の範囲第９項記載の方法により調製された工業ハチルシ株宿主細胞を 生長さ一〇、前記Ｉ）　Ｎ　Ａにより表現されたポリペ）チトを分１することを 含む、Ｔ業バチルス株中で関心のあるＨリペプチドを製造する方法。 ２０、ポリペプチドが工業バチルス宿主菌株細胞により分泌され、分離が前記ポ リペブチｌを栄養培地から分離することである、請求の範囲第１９項記載の方法 。 ２１、分泌されるポリペプチドがα−アミラーゼ、好ましくは耐熱宿　性α−ア ミラーゼ、またはプロテアーゼである、請求の範囲第２０項記載の方法。 へ２、特許請求の範囲第１２項記載の方法により生産され、親細胞にょ効　り生 産されるα−アミラーゼの量を基にして少くとも１５０％形　の量のα−アミラ ーゼ、または親細胞により生産されるプロテアーゼの量を基にして少くとも１５ ０％の量のプロテアーゼを業　それぞれ生産できる工業バチルス宿主菌株細胞。 ト２３．　菌株がリヘニホルミスである、請求の範囲第２２項記載の１主　業バ チルス菌株細胞。 を　２４１段階（ｂ）ノ連結生成物がｐ　Ｇ　＋３３３、ｐＧＢ３４、ｐ　Ｌ、 　Ｃ２８、ｐ　１．　Ｃ８３およびｐｌｃ８７からなる群から選ばれるプラズミ 範　）−である、請求の範囲第６項記載の方法。 ２５、ＣＢＳにＮｏ、４６６．８’３として寄言ト＼れ人：ブラスミｌ”ｐＧＲ の　３３、ＣＢＳにＮｏ、４６７．８３としで寄託さＪまたブー）スミ１ｐ　Ｇ 　Ｂ　３４、ＣＢ’ＳにＮｏ、４６９．８３として寄託された請求　スミトｐＬ Ｃ２８，およびＣＢＳニＮｏ、４６８．．８３とし−ｃ寄託されたブラスミ）ｐ Ｌｃ８３からなる君Ｙがら選はｌｉ″ｌるプラスミド。 ・　２、特許請求の範囲第１項〜第２４項のいずれが一項に記載の方法にス　よ り得られる、所望のタンパク質またはポリペプチドを生産ずプ　る増加された能 力を有する遺伝子的に操作された微生物。 ボ　２７．　ｐＧＢ３３、ｐＧ１３３４、ｐｌ−Ｃ２８，ｐＬＣ８３およびｐＬ 　Ｃ８７からなる群から選はれるプラスミドを含む、請求の範囲第１８項記載の 遺伝子的に操作された微生物。 ・　２８．　ヘククーによる遺伝子修飾に耐性であるバチルス宿主微生物の細胞 と、遺伝子情報を取込むことができ、そして所望の遺伝５ 情報が先に挿入された、場合により不活性化される補助菌株の細胞との原形質体 融合により形成される、挿入されたＤＮＡを含む属バチルスの遺伝子的に操作さ れた微生物。 ２９、α−アミラーゼを生産し、α−アミラーゼをコードする少くとも２つの安 定な遺伝子を含む、請求の範囲第２８項記載・の遺伝子的に操作された微生物。 ３０、請求の範囲第２６項〜第２９項のいずれが一項に記載の遺伝子的に操作さ れた微生物をタンパク質またはポリペブチＩ・の生産に使用する方法。 ３１、関心のポリペプチドがバチルス外注酵素である、請求の範囲第」４項記載 の方法。 ３２、ＤＮＡが工業バチルス株宿−すの染色体中に組込まれる、請求の範囲第３ １項記載の方法。 ３３、酵素がキモシンである、請求の範囲第３１項記載の方法。