JPH02418A - 遺伝子の発現を高める方法 - Google Patents
遺伝子の発現を高める方法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は遺伝子の発現を高める方法に関する。
近年、遺伝子組換え技術を用いて、酵母で有用蛋白質を
生産させるための研究がさかんに行なわれている。これ
は遺伝子によっては、大腸菌などの原核生物では不可能
であった発現が、真核生物である酵母を用いることによ
って可能になったためであり、その例の１つとしては免
疫原性のあるＢ型肝炎ウィルス表面抗原の発現がある。
生産させるための研究がさかんに行なわれている。これ
は遺伝子によっては、大腸菌などの原核生物では不可能
であった発現が、真核生物である酵母を用いることによ
って可能になったためであり、その例の１つとしては免
疫原性のあるＢ型肝炎ウィルス表面抗原の発現がある。
また、ヒトリゾチームの様にジスルフィド結合が多い蛋
白を生産させる場合には、大腸菌や枯草菌を用いた菌体
内あるいは分泌発現では不活性型のヒトリゾチームとし
て生産されるが、酵母を用いた分泌発現では、活性型の
ヒトリゾチームとして生産される〔吉相等（Ｙｏｓｈｉ
ｍｕｒａ、に、、ｅｔ ａｔ、） 、 ｒバイオケミカ
ルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーション
（Ｂｉｏｅｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ
ｍｕｎ、）ノ 、１４５． ７１２ （１９８７）
） 。
白を生産させる場合には、大腸菌や枯草菌を用いた菌体
内あるいは分泌発現では不活性型のヒトリゾチームとし
て生産されるが、酵母を用いた分泌発現では、活性型の
ヒトリゾチームとして生産される〔吉相等（Ｙｏｓｈｉ
ｍｕｒａ、に、、ｅｔ ａｔ、） 、 ｒバイオケミカ
ルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーション
（Ｂｉｏｅｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ
ｍｕｎ、）ノ 、１４５． ７１２ （１９８７）
） 。
しかし、一般に酵母における異種遺伝子の発現量は大腸
菌に比べて低く、従って酵母における遺伝子発現量を高
めることは、異種蛋白質の工業生産にとって極めて重要
である。
菌に比べて低く、従って酵母における遺伝子発現量を高
めることは、異種蛋白質の工業生産にとって極めて重要
である。
ｒ問題点を解決するための手段〕
本発明者らは、サツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ Ｈ２
２Ｒ−株（ＩＦＯ１０１３４，ＦＲＩ ＦＥＲＭ
ＢＰ−８０４）が他の酵母よりも遺伝子の発現量が高い
ことを見出し、サツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ Ｈ２
２Ｒ−株の性質を研究した結果、驚くべきことにこの株
は呼吸欠損株であることを見出し、さらに他の酵母につ
いても鋭意研究を重ねた。その結果、本発明者らは、遺
伝子の発現プラスミドで形質転換させた酵母（組換え体
）の呼吸欠損株（ρ−）がその親株（ρ＋）よりも遺伝
子の発現量が高いこと、即ち酵母の呼吸能を欠損させる
ことによって遺伝子の発現が高まることを見出し１本発
明を完成した。
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ Ｈ２
２Ｒ−株（ＩＦＯ１０１３４，ＦＲＩ ＦＥＲＭ
ＢＰ−８０４）が他の酵母よりも遺伝子の発現量が高い
ことを見出し、サツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ Ｈ２
２Ｒ−株の性質を研究した結果、驚くべきことにこの株
は呼吸欠損株であることを見出し、さらに他の酵母につ
いても鋭意研究を重ねた。その結果、本発明者らは、遺
伝子の発現プラスミドで形質転換させた酵母（組換え体
）の呼吸欠損株（ρ−）がその親株（ρ＋）よりも遺伝
子の発現量が高いこと、即ち酵母の呼吸能を欠損させる
ことによって遺伝子の発現が高まることを見出し１本発
明を完成した。
酵母は嫌気的条件でも好気的条件でも生育が可能であり
、前者の場合は細胞質内の解糖系により、後者の場合に
は、ミトコンドリア内の酸化的リン酸化により、生育に
必要なＡＴＰを獲得している。
、前者の場合は細胞質内の解糖系により、後者の場合に
は、ミトコンドリア内の酸化的リン酸化により、生育に
必要なＡＴＰを獲得している。
従って、ミトコンドリアＤＮＡの一部あるいは全部を欠
失させることによって呼吸欠損株（ρ−）を得ることが
出来る（酵母の解剖、柳島直彦、大嶋泰治、大隅正子編
、講談社すイエンティフィク、ｐ１８７〜１４７．１９
８１年）、なお、ミトコンドリアＤＮＡの全部が欠失し
た呼吸欠損株をρ°と表わすことがあるが、本出願では
ρ−とρ°を総称してρ−と表わす。
失させることによって呼吸欠損株（ρ−）を得ることが
出来る（酵母の解剖、柳島直彦、大嶋泰治、大隅正子編
、講談社すイエンティフィク、ｐ１８７〜１４７．１９
８１年）、なお、ミトコンドリアＤＮＡの全部が欠失し
た呼吸欠損株をρ°と表わすことがあるが、本出願では
ρ−とρ°を総称してρ−と表わす。
即ち、本発明は酵母にとって異種の遺伝子を含むＤＮＡ
で形質転換させ、かつ呼吸能が欠損した酵母〔ただし、
サツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃ
ｅｓ ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ Ｈ２２Ｒ−株を除
く〕に関するものである。
で形質転換させ、かつ呼吸能が欠損した酵母〔ただし、
サツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃ
ｅｓ ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ Ｈ２２Ｒ−株を除
く〕に関するものである。
本発明の酵母菌株としては、例えばサッカロミセスセレ
ビシェ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ ）Ｋ ３３−７ Ｂ （ａ １ｅｕ２
ｈｉｓ ｐｈｏ８０ ｐｈｏｎ） 、サッカロミセスセ
レビシェ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ） ＮＡ８７−１１Ａ （ａ １ｅｕ２ ｈ
ｉｓ３ ｔｒｐｌ ｐｈｏ３ ｐｈｏ５）、サッカロミ
セスセレビシェ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ （ａ １ａ
ｕ２ ｈｉｓ４ ｐｈ。
ビシェ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ ）Ｋ ３３−７ Ｂ （ａ １ｅｕ２
ｈｉｓ ｐｈｏ８０ ｐｈｏｎ） 、サッカロミセスセ
レビシェ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ） ＮＡ８７−１１Ａ （ａ １ｅｕ２ ｈ
ｉｓ３ ｔｒｐｌ ｐｈｏ３ ｐｈｏ５）、サッカロミ
セスセレビシェ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ （ａ １ａ
ｕ２ ｈｉｓ４ ｐｈ。
９ ｃａｎｌ ）サッカロミセスセレビシェ （Ｓ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡＸ−５００（ａ Ｌｅｕ
２ ｈｉｓ４ ｕｒａ３１ｙｓｌｃａｎｌ）などが挙げ
られる。上記のサッカロミセスセレビシェ （Ｓ、 ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ３３−７ Ｂはサッカロミセ
スセレビシェ （Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ） Ｎ
Ａ７９−ＩＯＣＣ金子等（Ｋａｎａｋｏ、 Ｙ、ｅｔ
ａｌ、） 、 ｒモレキュラーアンドセルラーバイオロ
ジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡＸ−５００（ａ Ｌｅｕ
２ ｈｉｓ４ ｕｒａ３１ｙｓｌｃａｎｌ）などが挙げ
られる。上記のサッカロミセスセレビシェ （Ｓ、 ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ３３−７ Ｂはサッカロミセ
スセレビシェ （Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ） Ｎ
Ａ７９−ＩＯＣＣ金子等（Ｋａｎａｋｏ、 Ｙ、ｅｔ
ａｌ、） 、 ｒモレキュラーアンドセルラーバイオロ
ジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。
Ｄｉａｌ、） Ｊ 、５．２４８ （１９８５））とサ
ッカロミセスセレビシェ （Ｓ、 ｃｓｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ） Ａ Ｈ２２Ｒ−［宮之原等（Ｍｉｙａｎｏｈａ
ｒａ、Ａ、、ａｔ ａｌ、） 、 ｒプロシージング
オブザナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、Ｊ 、
８０．１ （１９８３）〕との交雑によって作成したも
のであり、サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ８７−１１Ａはモレキュラーセ
ルラーバイオロジ（Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）
、 ４．７７１ （１９８４）に記載されている。ま
た、サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） ＮＡ ７４−３Ａ は（財）発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）にＩＦＯ−１０４３０として保管され、また工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に ＦＥＲＭ
Ｐ−９６９１として寄託されティる。ＮＡＸ−５０Ｄは
ＮＡ７４−３ＡとＡＸ６６−Ｉ Ｂ （ａ １ｅｕ２
ｕｒａ３１ｙｓｌ ｐｈａ３）との交雑によって作成し
たものであり、ＡＸ６６−ＩＢは（財）発酵研究所の研
究室保存株であり、同所より入手可能である。
ッカロミセスセレビシェ （Ｓ、 ｃｓｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ） Ａ Ｈ２２Ｒ−［宮之原等（Ｍｉｙａｎｏｈａ
ｒａ、Ａ、、ａｔ ａｌ、） 、 ｒプロシージング
オブザナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、Ｊ 、
８０．１ （１９８３）〕との交雑によって作成したも
のであり、サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ８７−１１Ａはモレキュラーセ
ルラーバイオロジ（Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）
、 ４．７７１ （１９８４）に記載されている。ま
た、サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） ＮＡ ７４−３Ａ は（財）発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）にＩＦＯ−１０４３０として保管され、また工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に ＦＥＲＭ
Ｐ−９６９１として寄託されティる。ＮＡＸ−５０Ｄは
ＮＡ７４−３ＡとＡＸ６６−Ｉ Ｂ （ａ １ｅｕ２
ｕｒａ３１ｙｓｌ ｐｈａ３）との交雑によって作成し
たものであり、ＡＸ６６−ＩＢは（財）発酵研究所の研
究室保存株であり、同所より入手可能である。
遺伝子の発現に用いるプロモーターとしては、酵母で機
能できるものなら何でもよく、例えばグリセラルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｇ Ｌ Ｄ）の
プロモーター、抑制酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨ
Ｏ５）のプロモーターウリジン−ニリン酸ガラクトース
−４−エピメラーゼ遺伝子（Ｇａｌ １０ ）のプロモ
ーター、ガラクトキナーゼ遺伝子（Ｇａｌ １ ）のプ
ロモーターフォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子（Ｐ
ＧＫ）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子（Ａ Ｄ Ｈ）のプロモーター、インベルターゼ遺
伝子（ＳＵＣ２）のプロモーター、ヒスチジノールリン
酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＩＳ５）のプロ
モーター、α−ファクター遺伝子のプロモーターなどが
挙げられる。
能できるものなら何でもよく、例えばグリセラルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｇ Ｌ Ｄ）の
プロモーター、抑制酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨ
Ｏ５）のプロモーターウリジン−ニリン酸ガラクトース
−４−エピメラーゼ遺伝子（Ｇａｌ １０ ）のプロモ
ーター、ガラクトキナーゼ遺伝子（Ｇａｌ １ ）のプ
ロモーターフォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子（Ｐ
ＧＫ）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子（Ａ Ｄ Ｈ）のプロモーター、インベルターゼ遺
伝子（ＳＵＣ２）のプロモーター、ヒスチジノールリン
酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＩＳ５）のプロ
モーター、α−ファクター遺伝子のプロモーターなどが
挙げられる。
本発明において、酵母で発現される遺伝子の産物として
は動物の酵素、成長因子、ホルモン、リンホカイン、ウ
ィルス蛋白などがあり、その具体例としては、ヒトリゾ
チーム、プロティンジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ
）、プロティンキナーゼＣ，ヒトＥ Ｇ Ｆ （ｅｐｉ
ｄｅｒ＋ｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｅｒ）、塩基
性ＦＧＦ、神経成長因子、成長ホルモン、インシュリン
、インターフェロンα、インターフェロンβ、インター
フェロンγ、インターロイキン２、Ｂ型肝炎ウィルス表
面抗原、ＨＴＬＶ−１ｇａｇ蛋白、リンホトキシンなど
が挙げられる。また、糸状菌あるいは細菌の遺伝子を用
いてもよい。
は動物の酵素、成長因子、ホルモン、リンホカイン、ウ
ィルス蛋白などがあり、その具体例としては、ヒトリゾ
チーム、プロティンジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ
）、プロティンキナーゼＣ，ヒトＥ Ｇ Ｆ （ｅｐｉ
ｄｅｒ＋ｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｅｒ）、塩基
性ＦＧＦ、神経成長因子、成長ホルモン、インシュリン
、インターフェロンα、インターフェロンβ、インター
フェロンγ、インターロイキン２、Ｂ型肝炎ウィルス表
面抗原、ＨＴＬＶ−１ｇａｇ蛋白、リンホトキシンなど
が挙げられる。また、糸状菌あるいは細菌の遺伝子を用
いてもよい。
これらの遺伝子の上流にシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡを連結させて１分泌発現させてもよい。シグナル
ペプチドとしては酵母で機能するものであれば何でもよ
く、例えば卵白リゾチームおよびその改良型、ヒトリゾ
チーム、グルコアミラーゼ、α−ファクター、キラー因
子などのシグナルペプチドが挙げられ、シグナルペプチ
ドコード領域と発現したい遺伝子との間にプロペプチド
をコードする領域を挿入することによってその分泌効率
を更に高めてもよい。
ＤＮＡを連結させて１分泌発現させてもよい。シグナル
ペプチドとしては酵母で機能するものであれば何でもよ
く、例えば卵白リゾチームおよびその改良型、ヒトリゾ
チーム、グルコアミラーゼ、α−ファクター、キラー因
子などのシグナルペプチドが挙げられ、シグナルペプチ
ドコード領域と発現したい遺伝子との間にプロペプチド
をコードする領域を挿入することによってその分泌効率
を更に高めてもよい。
本発明に用いるベクターとしては、酵母で機能するもの
であれば何でもよく、例えばｐｓＨ１９〔原島等（Ｈａ
ｒａｓｈｉｍａ、 Ｓ、、ａｔ ａｌ、） 、 ｒモレ
キュラーセルラーバイオロジー（Ｍｏ１．Ｃａ１１．Ｂ
ｉｏｌ、） Ｊ、 ４．７７１ （１９８４） ） 、
ｐ Ｓ ＨＩ３−１ （ヨーロッパ特許出願公開
Ｅ Ｐ −Ａ −０２３５４３０）などが挙げられ、こ
れらにプロモーターを挿入することによって発現ベクタ
ーが得られる。
であれば何でもよく、例えばｐｓＨ１９〔原島等（Ｈａ
ｒａｓｈｉｍａ、 Ｓ、、ａｔ ａｌ、） 、 ｒモレ
キュラーセルラーバイオロジー（Ｍｏ１．Ｃａ１１．Ｂ
ｉｏｌ、） Ｊ、 ４．７７１ （１９８４） ） 、
ｐ Ｓ ＨＩ３−１ （ヨーロッパ特許出願公開
Ｅ Ｐ −Ａ −０２３５４３０）などが挙げられ、こ
れらにプロモーターを挿入することによって発現ベクタ
ーが得られる。
遺伝子を発現させるプラスミドは上記の発現ベクターの
プロモーターの下流に遺伝子を挿入することによって得
られるが、この場合、遺伝子の下流にターミネータ−を
挿入することによって該遺伝子の発現量を高めることが
できる。このターミネータ−としては、例えばフォスフ
ォグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）、２μＤＮＡ
のＦＬＰ遺伝子、インベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）な
どのターミネータ−が挙げられる。
プロモーターの下流に遺伝子を挿入することによって得
られるが、この場合、遺伝子の下流にターミネータ−を
挿入することによって該遺伝子の発現量を高めることが
できる。このターミネータ−としては、例えばフォスフ
ォグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）、２μＤＮＡ
のＦＬＰ遺伝子、インベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）な
どのターミネータ−が挙げられる。
本発明における発現プラスミドを構築するための方法は
公知であり、文献たとえば〔「モレキュラー〇クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） Ｊ （
１９８２）、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）］に記載されている。
公知であり、文献たとえば〔「モレキュラー〇クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） Ｊ （
１９８２）、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）］に記載されている。
発現プラスミドは酵母で遺伝子を発現できるプラスミド
であれば何でもよく、遺伝子産物を菌体内に生産させる
もの（菌体内発現）でも、菌体外に生産させるもの（分
泌発現）でもよい。分泌発現としてはヒトリゾチーム分
泌プラスミドｐＧＥＬ１２５（吉相等（Ｙｏｓｈｉｍｕ
ｒａＪ、、ｅｔ ａｌ、） 、 ｒバイオケミカルアン
ドバイオフィジカルリレサーチコミュニケーション ｍｕｎ．）Ｊ 、１４５， ７１２ （１９８７） ）
、Ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５， ｐ ＧＦＬ７２５Ｔ，ｐＴ
ＦＬ７１０Ｔ，ｐＴＦＬ７７１Ｔ。
であれば何でもよく、遺伝子産物を菌体内に生産させる
もの（菌体内発現）でも、菌体外に生産させるもの（分
泌発現）でもよい。分泌発現としてはヒトリゾチーム分
泌プラスミドｐＧＥＬ１２５（吉相等（Ｙｏｓｈｉｍｕ
ｒａＪ、、ｅｔ ａｌ、） 、 ｒバイオケミカルアン
ドバイオフィジカルリレサーチコミュニケーション ｍｕｎ．）Ｊ 、１４５， ７１２ （１９８７） ）
、Ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５， ｐ ＧＦＬ７２５Ｔ，ｐＴ
ＦＬ７１０Ｔ，ｐＴＦＬ７７１Ｔ。
ｐＴＦＬ７８０Ｔ；ヒトＥＧＦ分泌プラスミドｐＧＦＥ
２１３などが挙げられる。
２１３などが挙げられる。
上記のようにして得られた発現プラスミドを用いて酵母
を形質転換する。形質転換の方法それ自体は公知であり
、たとえばリチウム法〔伊藤等（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．
） 、 ｒジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．）Ｊ 、 １５３， １６３
（１９ｇ３））。
を形質転換する。形質転換の方法それ自体は公知であり
、たとえばリチウム法〔伊藤等（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．
） 、 ｒジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．）Ｊ 、 １５３， １６３
（１９ｇ３））。
プロトプラスト法〔ヒンネン等（Ｒｉｎｎｅｎ ｅｔ
ａｌ、）［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）Ｊ 、 ７５．１９２７
（１９７８））などが挙げられる。このようにして発
現プラスミドを有する酵母（組換え体）を得る。
ａｌ、）［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）Ｊ 、 ７５．１９２７
（１９７８））などが挙げられる。このようにして発
現プラスミドを有する酵母（組換え体）を得る。
呼吸能を有する酵母（親株ρ１）から呼吸欠損株（ρ−
）を得る方法自体は公知であり１例えば、〔「ラボラト
リ−・コース・マニュアル・フォー・メソッズ・イン・
イースト・ジェネティクス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃ
ｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃＳ） Ｊ 、コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
）を得る方法自体は公知であり１例えば、〔「ラボラト
リ−・コース・マニュアル・フォー・メソッズ・イン・
イースト・ジェネティクス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃ
ｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃＳ） Ｊ 、コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
１９８６）に記載されている。即ち、親株をエチジウム
ブロマイドを含む培地で培養したのち、炭素源としてグ
ルコースを含む培地では生育できるが、グリセロールを
含む培地では生育できない菌株を分離することによって
呼吸欠損株を容易に得ることができる。また頻度は低い
が親株の単一コロニーの中から呼吸欠損株を得ることが
できる。ここで言う親株が、発現プラスミドを有する形
質転換株（組換え体）の場合には、その呼吸欠損株を得
ることによって目的とする遺伝子発現量が高い組換え体
を直接に得ることが出来る。また親株が発現プラスミド
を保持しない場合には、その呼吸欠損株を得たのち、こ
れに発現プラスミドを導入することによって目的の組換
え体が得られる。
ブロマイドを含む培地で培養したのち、炭素源としてグ
ルコースを含む培地では生育できるが、グリセロールを
含む培地では生育できない菌株を分離することによって
呼吸欠損株を容易に得ることができる。また頻度は低い
が親株の単一コロニーの中から呼吸欠損株を得ることが
できる。ここで言う親株が、発現プラスミドを有する形
質転換株（組換え体）の場合には、その呼吸欠損株を得
ることによって目的とする遺伝子発現量が高い組換え体
を直接に得ることが出来る。また親株が発現プラスミド
を保持しない場合には、その呼吸欠損株を得たのち、こ
れに発現プラスミドを導入することによって目的の組換
え体が得られる。
このようにして得られた形質転換株＜ｍ換え体）をそれ
自体公知の方法で培養する。
自体公知の方法で培養する。
培地としては５例えばパークホルダー（Ｂｕｒｋｈ。
１ｄｅｒ）最少培地〔「アメリカンジャーナルオブボタ
ニー（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｂａｔ、） 、 ３０．２０６
（１９４３））あるいはその改変培地〔東江等（丁ｏｈ
−ｅ 、Ａ、ａｔ ａｌ、）「ジャーナルオブバクテリ
オロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） Ｊ 、 １１
３．７２７ （１９７３））、または低リン酸培地〔東
江等（Ｔｏｈ−Ｅ、Ａ、ｅｔ ａｌ、） ｒジャーナ
ルオブバクテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、
）Ｊ 、 ＩＩＬ７２７ （１９７３））などが挙げら
れる。培養は通常１５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜
８７℃で１０−１６８時間、好ましくは７２〜１４４時
間行う。振どう培養でも静置培養でも良いが、必要に応
じて通気や撹拌を加えることもできる。
ニー（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｂａｔ、） 、 ３０．２０６
（１９４３））あるいはその改変培地〔東江等（丁ｏｈ
−ｅ 、Ａ、ａｔ ａｌ、）「ジャーナルオブバクテリ
オロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） Ｊ 、 １１
３．７２７ （１９７３））、または低リン酸培地〔東
江等（Ｔｏｈ−Ｅ、Ａ、ｅｔ ａｌ、） ｒジャーナ
ルオブバクテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、
）Ｊ 、 ＩＩＬ７２７ （１９７３））などが挙げら
れる。培養は通常１５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜
８７℃で１０−１６８時間、好ましくは７２〜１４４時
間行う。振どう培養でも静置培養でも良いが、必要に応
じて通気や撹拌を加えることもできる。
培養終了後、それ自体公知の方法で細胞と上清とを分離
する。たとえば、細胞内に残存するヒト・リゾチームま
たはヒトＥＧＦは、当分野における通常の方法、たとえ
ば超音波破砕法、フレンチプレスなどを利用した破砕法
、Ｈ砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破砕法
などにより細胞を破砕する。さらに必要ならば、トリト
ン−Ｘ１００、デオキシコーレートなどの界面活性剤を
加えることによって産生されたヒト・リゾチームを抽出
する。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出
液中に含まれるヒト・リゾチームもしくはヒト・ＥＧＦ
は通常の蛋白質精製法、例えば塩析１等電点沈殿、ゲル
ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等）などにしたがっ
てＭＨされ、目的とするヒトリゾチームまたはヒトＥＧ
Ｆを得ることができる。
する。たとえば、細胞内に残存するヒト・リゾチームま
たはヒトＥＧＦは、当分野における通常の方法、たとえ
ば超音波破砕法、フレンチプレスなどを利用した破砕法
、Ｈ砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破砕法
などにより細胞を破砕する。さらに必要ならば、トリト
ン−Ｘ１００、デオキシコーレートなどの界面活性剤を
加えることによって産生されたヒト・リゾチームを抽出
する。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出
液中に含まれるヒト・リゾチームもしくはヒト・ＥＧＦ
は通常の蛋白質精製法、例えば塩析１等電点沈殿、ゲル
ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等）などにしたがっ
てＭＨされ、目的とするヒトリゾチームまたはヒトＥＧ
Ｆを得ることができる。
上記で得られるヒトリゾチーム活性はミクロコツカスル
ーテラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ）菌
体の吸光度の減少を指標とした吉相（Ｙｏｓｈｉｍｕｒ
ａ Ｊら〔バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサ
ーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。
ーテラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ）菌
体の吸光度の減少を指標とした吉相（Ｙｏｓｈｉｍｕｒ
ａ Ｊら〔バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサ
ーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）」、旦５，７１２ （１９８
７））によって記載されている方法で測定することがで
きる。また、ヒトＥＧＦはラジオイムノアッセイ（アマ
ジャム社で販売）、フィブロブラスト・リセプター・ア
ッセイ〔プロシージングオブザナショナルアカデミーオ
ブサイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、）ＵＳＡ、、７２．１８７１（１９７５）］ ｔ
とテ定量すルコトカテキる。 ヒトリゾチームおよびヒ
トＥＧＦ以外の遺伝子産物についても公知の方法に従っ
て分離精製される。
７））によって記載されている方法で測定することがで
きる。また、ヒトＥＧＦはラジオイムノアッセイ（アマ
ジャム社で販売）、フィブロブラスト・リセプター・ア
ッセイ〔プロシージングオブザナショナルアカデミーオ
ブサイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、）ＵＳＡ、、７２．１８７１（１９７５）］ ｔ
とテ定量すルコトカテキる。 ヒトリゾチームおよびヒ
トＥＧＦ以外の遺伝子産物についても公知の方法に従っ
て分離精製される。
実施例
以下に、参考例および実施例をもって本発明を更に詳し
く説明するが、本発明はこれに限定されることはない。
く説明するが、本発明はこれに限定されることはない。
参考例１
ヒトリゾチーム分泌プラスミドｐＧＦＬ７３５の青菜
大腸菌ベクターｐＢＲ３２２５μｇに制限酵素Ｂ ａ
ｌ Ｉ １．５ユニツトを加え、４０μａの反応液（
ｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ （Ｐ Ｈ７，５） 、
１０ｍＭ ＭｇＣＤ、、 １ ｍＭジチオスレイト
ール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏＱ））中で８７℃、
５時間反応させたのち、常法通りフェノール抽出後ＤＮ
Ａをエタノール沈殿させた。このＤＮＡにリン酸化した
Ｘｈｏｌリンカ−ｄ （ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ） （Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）５０ｎｇを
加え、常法にしたがってＴ４ＤＮＡリガーゼで両者を結
合させた。
ｌ Ｉ １．５ユニツトを加え、４０μａの反応液（
ｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ （Ｐ Ｈ７，５） 、
１０ｍＭ ＭｇＣＤ、、 １ ｍＭジチオスレイト
ール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏＱ））中で８７℃、
５時間反応させたのち、常法通りフェノール抽出後ＤＮ
Ａをエタノール沈殿させた。このＤＮＡにリン酸化した
Ｘｈｏｌリンカ−ｄ （ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ） （Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）５０ｎｇを
加え、常法にしたがってＴ４ＤＮＡリガーゼで両者を結
合させた。
この反応液で大腸菌ＤＨＩ株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性の形質転換体か
らアルカリ抽出法〔バレンボイムおよびドリー（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏｌｙ、Ｊ、） 。
ンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性の形質転換体か
らアルカリ抽出法〔バレンボイムおよびドリー（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏｌｙ、Ｊ、） 。
「ヌクレイツク アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ−）Ｊ＋″７．１５１３ （１９７９）
）でプラスミドを抽出しＢａ１ＩサイトがＸｈｏＩサイ
トに変換されたプラスミドｐＢＲ３２２Ｘを得た。
１ｄｓＲｅｓ−）Ｊ＋″７．１５１３ （１９７９）
）でプラスミドを抽出しＢａ１ＩサイトがＸｈｏＩサイ
トに変換されたプラスミドｐＢＲ３２２Ｘを得た。
池原（Ｉｋｅｈａｒａ）らの報告「ケミカルアンドファ
ーマシューティカルブレティン（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ
。
ーマシューティカルブレティン（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ
。
Ｂｕｌｌ、）Ｊ、 ３４．２２０２ （１９８６））で
は例えば第１表に示したような、５２個のオリゴヌクレ
オチド・ブロックに分割して、ヒト・リゾチーム遺伝子
を調製している６ 第１表 玉鎖番号 Ｕ Ｉ ＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＵ ２
ＴＴＧＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＡＴＵ ３ ＴＡＧＣＣ
ＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＵ ４ ＡＧＡＴＴＧＧＧ
ＴＡＴＧＧＡＣＵ ５ ＧＧＣＴＡＣＣＧ丁ＧＧＴ
ＡＴＴＵ ６ ＴＣＴＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＧＧＵ
７ ＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＣＴＡＡＧＵ ８ ＴＧ
ＧＧＡＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＵ ９ ＡＣＴＡ
ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＴＵ １０ ＴＡＣＡＡＣＧＣ
ＴＧＧＣＧＡＣＵｌｌ ＣＧＴＴＣＴＡＣＡＧＡＣＴ
ＡＴＧＧＵ１２ ＴＡＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＡＡＣ
ＴＵ１３ ＣＴＡＧＡ丁Ａ丁ＴＧＧ丁Ｇ下鎖番号 Ｌ ２６ ＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＡＡＣＬ ２５
ＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＡＣＬ ２４ ＧＴＡ
ＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＬ ２３ ＴＣＴＡＴＴＴ
ＴＧＧＣＡＴＣＴＬ ２２ ＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＧ
ＣＧＡＣＬ ２１ ＣＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡ丁ＡＣ
ＣＣＴＧＬ ２０ ＴＧＧＧＴＣＡＣＧＧＡＣＡＡＣ
Ｌ １９ ＴＣＴＣＴＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＬ １８
ＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＬ １７ ＧＴ
ＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＬ １６ ＡＡＡＧＣＴＧＡ
ＧＣＡＡＧＡＴＬ １５ ＡＡＧＴＧＡＣＡＧＧＣＧ
ＴＴＧＡＣＬ １４ ＧＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴ
ＴＧＣＵ１４ ＴＡＡＣＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣ
Ｌｌ３ ＣＡＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＴＡＴＵ１５
ＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＡＡＣＧＣＣＬ１２ Ｃ
ＴＡＧＡＧＴＴＡＡＴＴＴＧＧＵ１６ ＴＧＴＣＡＣ
ＴＴＡＴＣＴＴＧＣＬｌｌ ＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴＡ
ＧＴＣＴＧＴＵ１７ ＴＣＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡ
Ｇ ＬＩＯＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＵ１
８ ＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴ Ｌ９
ＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＧＴＡＧＣＵ１９ ＧＣＴＧ
ＴＴＧＣＣＴＧＣＧＣＴ Ｌ８ ＴＣＴＡＧＴ
ＧＴＴＡＴＡＧＣＣＧＵ２０ ＡＡＧＡＧＡＧＴＴ
ＧＴＣＣＧＴ Ｌ７ ＧＡＴ丁ＣＣＣＡ
ＣＴ丁ＡＧＣＡＡＧＵ２１ ＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＧ
ＴＡＴＴ Ｌ ６ ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＧＴＴ
ＧＧＣＵ２，２ ＡＧＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴ
Ｌ５ ＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＧＵ２３
ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＬ４ ＧＴＡＧ
ＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＵ２４ ＣＡＡＡＡＴＡＧＡ
ＧＡＴＧＴＣＬ３ ＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴ
Ｕ２５ ＡＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＣＡＡＧＧ
Ｌ２ ＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＡＴＣ１Ｊ２６
ＴＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＴＡＧＣＬｌ、 Ｔ
ＣＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＴＣ第１表のＵ２の代り
にＵ２−ｔａｑとしてＣＧＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＡＴを
、Ｌ２の代りにＬ２−ｔａｑとり、てＴＣＴＧＧＣＴＡ
ＡＴＴＣＧＣＡＴＣＴＣＴを、池原らの報告にしたがっ
て合成した。次にＵ２−ｔ ａ ｑ、Ｕ３−Ｕ２６．Ｌ
２−ｔａｑ＋ｒ、ａ〜Ｌ２６の各フラグメントを用いて
池原らの報告にしたがってオリゴヌクレオチドブロック
のハイブリッドを形成させた（第１図参照）。
は例えば第１表に示したような、５２個のオリゴヌクレ
オチド・ブロックに分割して、ヒト・リゾチーム遺伝子
を調製している６ 第１表 玉鎖番号 Ｕ Ｉ ＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＵ ２
ＴＴＧＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＡＴＵ ３ ＴＡＧＣＣ
ＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＵ ４ ＡＧＡＴＴＧＧＧ
ＴＡＴＧＧＡＣＵ ５ ＧＧＣＴＡＣＣＧ丁ＧＧＴ
ＡＴＴＵ ６ ＴＣＴＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＧＧＵ
７ ＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＣＴＡＡＧＵ ８ ＴＧ
ＧＧＡＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＵ ９ ＡＣＴＡ
ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＴＵ １０ ＴＡＣＡＡＣＧＣ
ＴＧＧＣＧＡＣＵｌｌ ＣＧＴＴＣＴＡＣＡＧＡＣＴ
ＡＴＧＧＵ１２ ＴＡＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＡＡＣ
ＴＵ１３ ＣＴＡＧＡ丁Ａ丁ＴＧＧ丁Ｇ下鎖番号 Ｌ ２６ ＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＡＡＣＬ ２５
ＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＡＣＬ ２４ ＧＴＡ
ＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＬ ２３ ＴＣＴＡＴＴＴ
ＴＧＧＣＡＴＣＴＬ ２２ ＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＧ
ＣＧＡＣＬ ２１ ＣＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡ丁ＡＣ
ＣＣＴＧＬ ２０ ＴＧＧＧＴＣＡＣＧＧＡＣＡＡＣ
Ｌ １９ ＴＣＴＣＴＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＬ １８
ＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＬ １７ ＧＴ
ＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＬ １６ ＡＡＡＧＣＴＧＡ
ＧＣＡＡＧＡＴＬ １５ ＡＡＧＴＧＡＣＡＧＧＣＧ
ＴＴＧＡＣＬ １４ ＧＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴ
ＴＧＣＵ１４ ＴＡＡＣＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣ
Ｌｌ３ ＣＡＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＴＡＴＵ１５
ＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＡＡＣＧＣＣＬ１２ Ｃ
ＴＡＧＡＧＴＴＡＡＴＴＴＧＧＵ１６ ＴＧＴＣＡＣ
ＴＴＡＴＣＴＴＧＣＬｌｌ ＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴＡ
ＧＴＣＴＧＴＵ１７ ＴＣＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡ
Ｇ ＬＩＯＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＵ１
８ ＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴ Ｌ９
ＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＧＴＡＧＣＵ１９ ＧＣＴＧ
ＴＴＧＣＣＴＧＣＧＣＴ Ｌ８ ＴＣＴＡＧＴ
ＧＴＴＡＴＡＧＣＣＧＵ２０ ＡＡＧＡＧＡＧＴＴ
ＧＴＣＣＧＴ Ｌ７ ＧＡＴ丁ＣＣＣＡ
ＣＴ丁ＡＧＣＡＡＧＵ２１ ＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＧ
ＴＡＴＴ Ｌ ６ ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＧＴＴ
ＧＧＣＵ２，２ ＡＧＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴ
Ｌ５ ＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＧＵ２３
ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＬ４ ＧＴＡＧ
ＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＵ２４ ＣＡＡＡＡＴＡＧＡ
ＧＡＴＧＴＣＬ３ ＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴ
Ｕ２５ ＡＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＣＡＡＧＧ
Ｌ２ ＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＡＴＣ１Ｊ２６
ＴＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＴＡＧＣＬｌ、 Ｔ
ＣＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＴＣ第１表のＵ２の代り
にＵ２−ｔａｑとしてＣＧＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＡＴを
、Ｌ２の代りにＬ２−ｔａｑとり、てＴＣＴＧＧＣＴＡ
ＡＴＴＣＧＣＡＴＣＴＣＴを、池原らの報告にしたがっ
て合成した。次にＵ２−ｔ ａ ｑ、Ｕ３−Ｕ２６．Ｌ
２−ｔａｑ＋ｒ、ａ〜Ｌ２６の各フラグメントを用いて
池原らの報告にしたがってオリゴヌクレオチドブロック
のハイブリッドを形成させた（第１図参照）。
これらの各群をＴ４ ＤＮＡ リガーゼによって連
結したのち、両５″末端を酵素的にリン酸化した。
結したのち、両５″末端を酵素的にリン酸化した。
プラスミドｐＢＲ３２２Ｘ２．６μｇに６ユニツトの制
限酵素ＸｈｏＴと６ユニツトの制限酵素ＣＱａＴとを３
５）ｔＱの反応液［３３ｍＭ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆ
ｆｅｒ ｐ Ｈ７，９，６６ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ａｃｓｔａｔａ、１０ｍＭｍａｇｎｅｓｉｕｒｍ ａ
ｃｅｔａｔｅ、 ０．５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏＱ。
限酵素ＸｈｏＴと６ユニツトの制限酵素ＣＱａＴとを３
５）ｔＱの反応液［３３ｍＭ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆ
ｆｅｒ ｐ Ｈ７，９，６６ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ａｃｓｔａｔａ、１０ｍＭｍａｇｎｅｓｉｕｒｍ ａ
ｃｅｔａｔｅ、 ０．５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏＱ。
０．０１％Ｂ５Ａｌ中で８７℃、１時間作用させた後、
フェノールで除蛋白し、冷エタノールで沈殿させた。該
ＤＮＡ （２００ｎ ｇ）を上記で調製したヒトリゾチ
ーム遺伝子断片１１００ｎと混合し、１０μＱの反応液
Ｃ６６ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ −ＨＣＱ （ｐ Ｈ７，
６）。
フェノールで除蛋白し、冷エタノールで沈殿させた。該
ＤＮＡ （２００ｎ ｇ）を上記で調製したヒトリゾチ
ーム遺伝子断片１１００ｎと混合し、１０μＱの反応液
Ｃ６６ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ −ＨＣＱ （ｐ Ｈ７，
６）。
１０ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ 、 １０ｍ Ｍ ｓｐａｒｍ
ｉｄｉｎｅ、 １００ｍ Ｍ ＭｇＣ２２，１５０ｍＭ
ＤＴＴ、２ｍｇ／ｍＱ ＢＳＡ。
ｉｄｉｎｅ、 １００ｍ Ｍ ＭｇＣ２２，１５０ｍＭ
ＤＴＴ、２ｍｇ／ｍＱ ＢＳＡ。
５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ〕中で１４℃で一夜作
用させてＤＮＡを結合させた。この反応液を用いて大腸
菌ＤＨＩ株をコーエン（Ｃｏｈｅｎ）らの方法（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９．
２１１０（１９７２））にしたがって形質転換した。得
られた形質転換体からアルカリ抽出法（前出）によって
プラスミドを単離し、分子量および制限酵素による分解
パターンを調べ、ヒトリゾチーム遺伝子断片が挿入され
たｐＬＹｓ２２１を得た。ｐＬＹｓ２２１のＥｃ ｏ
Ｒｒ −Ｘ ｈ ｏ ｒ断片を分離し、ジオキシヌクレ
オチド合成鎖停止法によってその塩基配列を決定したと
ころ第２図に示したように予想通りヒト・リゾチーム遺
伝子ＴａｑＩ−ＸｈｏＩ断片が得られた。
用させてＤＮＡを結合させた。この反応液を用いて大腸
菌ＤＨＩ株をコーエン（Ｃｏｈｅｎ）らの方法（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９．
２１１０（１９７２））にしたがって形質転換した。得
られた形質転換体からアルカリ抽出法（前出）によって
プラスミドを単離し、分子量および制限酵素による分解
パターンを調べ、ヒトリゾチーム遺伝子断片が挿入され
たｐＬＹｓ２２１を得た。ｐＬＹｓ２２１のＥｃ ｏ
Ｒｒ −Ｘ ｈ ｏ ｒ断片を分離し、ジオキシヌクレ
オチド合成鎖停止法によってその塩基配列を決定したと
ころ第２図に示したように予想通りヒト・リゾチーム遺
伝子ＴａｑＩ−ＸｈｏＩ断片が得られた。
この配列はヒト・リゾチームのアミノ酸配列のうち４番
目のＧｌｕから１３０番目のＶａｌまでをコードする。
目のＧｌｕから１３０番目のＶａｌまでをコードする。
卵白リゾチームのシグナルペプチドの公知のアミノ酸配
列〔ユングニー等（Ｊｕｎｇ、Ａ、 ａｔ ａｌ、）
。
列〔ユングニー等（Ｊｕｎｇ、Ａ、 ａｔ ａｌ、）
。
「プロシージングオブザナショナルアカデミーオブサイ
エンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）Ｊ
７７゜５７５９ （１９８０） ）の４番目のロイシ
ンをフェニルアラニンに、６番目のイソロイシンをロイ
シンに、および８番目のバリンをアラニンに置換し、さ
らに高発現させることを目的に、■コドンは酵母におけ
るコドン使用頻度の高いものを優先的に選択する。■発
現量を高めるためＡＴＧの上流は酵母ＰＧＫ遺伝子の配
列を用いる、■ハイブリッドシグナル（ｈｙｂｒｉｄ
ｓｉｇｎａｌ）の構築を可能にする。
エンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）Ｊ
７７゜５７５９ （１９８０） ）の４番目のロイシ
ンをフェニルアラニンに、６番目のイソロイシンをロイ
シンに、および８番目のバリンをアラニンに置換し、さ
らに高発現させることを目的に、■コドンは酵母におけ
るコドン使用頻度の高いものを優先的に選択する。■発
現量を高めるためＡＴＧの上流は酵母ＰＧＫ遺伝子の配
列を用いる、■ハイブリッドシグナル（ｈｙｂｒｉｄ
ｓｉｇｎａｌ）の構築を可能にする。
の点を考慮してヌクレオチド配列を決定した０合成した
ヌクレオチド配列は第３図に示したが、５′末端にＸｈ
ｏｌサイトが、３″末端はヒト・リゾチームのコード領
域を含むＴａｑｌサイトがそれぞれもうけられている。
ヌクレオチド配列は第３図に示したが、５′末端にＸｈ
ｏｌサイトが、３″末端はヒト・リゾチームのコード領
域を含むＴａｑｌサイトがそれぞれもうけられている。
全配列は８個のオリゴヌクレオチドブロック（＃１〜＃
８）から成り、これらはホスフォアミダイト法〔カルー
ザースエムエッチ等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ，ｅ
ｔ ａｌ） ； ｒテトラヘドロン・レターズ（Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）Ｊ ２２゜１８
５９ （１９８１））によって合成した。
８）から成り、これらはホスフォアミダイト法〔カルー
ザースエムエッチ等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ，ｅ
ｔ ａｌ） ； ｒテトラヘドロン・レターズ（Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）Ｊ ２２゜１８
５９ （１９８１））によって合成した。
まず、＃２〜＃７をそれぞれ１０μＱ （５μｇ）づつ
混合し、これに１０倍濃度のキナーゼバッファー（に１
ｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ） （０，５Ｍ Ｔ ｒ ｉ
ｓ −ＨＣＱ 。
混合し、これに１０倍濃度のキナーゼバッファー（に１
ｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ） （０，５Ｍ Ｔ ｒ ｉ
ｓ −ＨＣＱ 。
０．１Ｍ Ｍ ｇ ＣＱ２．０．１Ｍメルカプトエタノ
ール。
ール。
ｐＨ７，６） ２０μＱ、１０ｍＭ ＡＴＰ ２
０ｐＱ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造社製）
２０μａ（５０ｕ）、蒸留水８０μａを加えて８７℃で
２時間反応させた後、５５℃で２０分処理して反応をと
めた。
０ｐＱ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造社製）
２０μａ（５０ｕ）、蒸留水８０μａを加えて８７℃で
２時間反応させた後、５５℃で２０分処理して反応をと
めた。
この反応液に＃１および＃８をそれぞれ１０ μＱ（５
μｇ）を加え、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ社製）１０μ０を
加えて１４℃で一夜反応させた。反応液１０％ポリアク
リルアミド電気泳動にかけ、７６ｂｐのフラグメントを
切り出し電気泳動溶出によってゲルから抽出した。これ
を４５μＱの蒸留水に溶解し、これに１０倍濃度のキナ
ーゼバッファー（前出）６ｐＱ、１０ｍＭ ＡＴＰ ６
μＱ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（前出）２ｐＱ
（５ｕ）を加え、８７°Ｃで１時間反応させたのち一２
０℃で保存した。
μｇ）を加え、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ社製）１０μ０を
加えて１４℃で一夜反応させた。反応液１０％ポリアク
リルアミド電気泳動にかけ、７６ｂｐのフラグメントを
切り出し電気泳動溶出によってゲルから抽出した。これ
を４５μＱの蒸留水に溶解し、これに１０倍濃度のキナ
ーゼバッファー（前出）６ｐＱ、１０ｍＭ ＡＴＰ ６
μＱ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（前出）２ｐＱ
（５ｕ）を加え、８７°Ｃで１時間反応させたのち一２
０℃で保存した。
なお、第３図ではアミノ酸の一文字記号による表記（Ｉ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会確認規則）を行って
いる。
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会確認規則）を行って
いる。
例 Ａ：アラニン
Ｂ：アスパラギン酸もしくはアスパラギンＣニジスティ
ン Ｄ：アスパラギン酸 Ｅ：グルタミン酸 Ｆ：フェニルアラニン Ｇニゲリシン Ｈ：ヒスチジン Ｉ：イソロイシン に：リジン Ｌ：ロイシン Ｍ：メチオニン Ｎ：アスパラギン Ｐニブロリン Ｑ：グルタミン Ｒ：アルギニン Ｓ：セリン Ｔ：スレオニン ■：バリン Ｗニトリブトファン Ｙ：チロシン Ｚ：グルタミン酸もしくはグルタミン Ｘ：未知もしくは他のアミノ酸 プラスミドｐＬＹ５２２１２３６μｇをＥＣ０Ｒ１にツ
ポンジーン社製） １２０ ｕ、 ｘｈ ｏ Ｉにッポ
ンジーン社製）１２０ｕで８７℃、２時間処理し、ヒト
・リゾチームコード領域を切り出した。
ン Ｄ：アスパラギン酸 Ｅ：グルタミン酸 Ｆ：フェニルアラニン Ｇニゲリシン Ｈ：ヒスチジン Ｉ：イソロイシン に：リジン Ｌ：ロイシン Ｍ：メチオニン Ｎ：アスパラギン Ｐニブロリン Ｑ：グルタミン Ｒ：アルギニン Ｓ：セリン Ｔ：スレオニン ■：バリン Ｗニトリブトファン Ｙ：チロシン Ｚ：グルタミン酸もしくはグルタミン Ｘ：未知もしくは他のアミノ酸 プラスミドｐＬＹ５２２１２３６μｇをＥＣ０Ｒ１にツ
ポンジーン社製） １２０ ｕ、 ｘｈ ｏ Ｉにッポ
ンジーン社製）１２０ｕで８７℃、２時間処理し、ヒト
・リゾチームコード領域を切り出した。
このフラグメントをさらにＴａｑｌ にツボフジ−２
社製）２６ｕで６５℃、１時間処理して、Ｎ末端を一部
欠いたヒト・リゾチームコード領域を切り出した。
社製）２６ｕで６５℃、１時間処理して、Ｎ末端を一部
欠いたヒト・リゾチームコード領域を切り出した。
このフラグメント約１μｇに前出のシグナル配列をコー
ドするＤＮＡ０．５μｇを混合してＴ４−リガーゼ（前
出）８００ｕの存在下で１６℃、１６時間反応させたの
ち、 Ｘｈ ｏ Ｉ （４２ｕ）処理した。
ドするＤＮＡ０．５μｇを混合してＴ４−リガーゼ（前
出）８００ｕの存在下で１６℃、１６時間反応させたの
ち、 Ｘｈ ｏ Ｉ （４２ｕ）処理した。
得られたＸｈｏｌフラグメント１０ｎｇと酵母の発現ベ
クターｐＧＬＤ９０６−１ （特開昭６１−４３９９１
）をＸｈｏｌ処理したベクター１ｎｇ とを混合して
この両者をＴ４リガーゼの存在下で結合させた。
クターｐＧＬＤ９０６−１ （特開昭６１−４３９９１
）をＸｈｏｌ処理したベクター１ｎｇ とを混合して
この両者をＴ４リガーゼの存在下で結合させた。
この反応液でエシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ
Ｈｌを前述の方法で形質転換し、ＧＬＤプロモーター
の下流にシグナル配列コード領域およびヒト・リゾチー
ム遺伝子がプロモーターと同一方向に挿入されたプラス
ミドを多数得た。そのうちの一つをｐＧＦＬ７３５と命
名して以下の実験に共した（第４図参照）。
Ｈｌを前述の方法で形質転換し、ＧＬＤプロモーター
の下流にシグナル配列コード領域およびヒト・リゾチー
ム遺伝子がプロモーターと同一方向に挿入されたプラス
ミドを多数得た。そのうちの一つをｐＧＦＬ７３５と命
名して以下の実験に共した（第４図参照）。
参考例２
ヒトリゾチーム 泌プラスミド Ｐ Ｆ Ｌ７２５Ｔの
Ｕ（第５図参照） ＨＢｓＡｇ修飾Ｐ３１発現プラスミドＰＧＬＤＰ３１−
ＲｃＴ（ヨーロッパ出願公開−０２３５４３０）よりＰ
ＧＫターミネータ−を含む０．２８ｋｂ Ａｈａｍ−
３ａｌｌ断片を単離し、この断片にＳａｌ■リンカ−ｐ
ＧＧＴｃＧＡｃｃをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち
５ａｌｌで処理した。アガロースゲル電気泳動によって
０．２８ｋｂ Ｓａ ｌ ｌ断片と該断片に結合して
いない５ａｌＩリンカ−とを分離し、ＤＥＡＥセルロー
ス紙を用いるＤＮＡの単離法〔ワインバーグジーアンド
ハマーショルドエムエル等（ｌｌｉｎｂｅｒｇ、 Ｇ、
＆ Ｈａｍｍａｒｓｋｊ。
Ｕ（第５図参照） ＨＢｓＡｇ修飾Ｐ３１発現プラスミドＰＧＬＤＰ３１−
ＲｃＴ（ヨーロッパ出願公開−０２３５４３０）よりＰ
ＧＫターミネータ−を含む０．２８ｋｂ Ａｈａｍ−
３ａｌｌ断片を単離し、この断片にＳａｌ■リンカ−ｐ
ＧＧＴｃＧＡｃｃをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち
５ａｌｌで処理した。アガロースゲル電気泳動によって
０．２８ｋｂ Ｓａ ｌ ｌ断片と該断片に結合して
いない５ａｌＩリンカ−とを分離し、ＤＥＡＥセルロー
ス紙を用いるＤＮＡの単離法〔ワインバーグジーアンド
ハマーショルドエムエル等（ｌｌｉｎｂｅｒｇ、 Ｇ、
＆ Ｈａｍｍａｒｓｋｊ。
ｌｄ、Ｍ、−Ｌ、）、 ｒヌクレイツク アシッズリサ
ーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）、 ８．２
５３ （１９８０） ）によってアガロースゲルから０
．２８ｋｂ Ｓａ ｌ ｌ断片を得た。
ーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）、 ８．２
５３ （１９８０） ）によってアガロースゲルから０
．２８ｋｂ Ｓａ ｌ ｌ断片を得た。
卵白リゾチームシグナルペプチドを用いるヒトリゾチー
ム分泌プラスミドｐＧＥＬ１２５（吉相等（Ｙｏｓｈｉ
ｍｕｒａ、 Ｋ、 ａｔ ａｌ、） 、 ｒバイオケミ
カルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーショ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、
Ｃｏｍ＋ｉｕｎ、）Ｊ、１４５゜７１２ （１９８７）
）をＢａｍＨＩとＸ ｈ ｏ Ｉで切断し。
ム分泌プラスミドｐＧＥＬ１２５（吉相等（Ｙｏｓｈｉ
ｍｕｒａ、 Ｋ、 ａｔ ａｌ、） 、 ｒバイオケミ
カルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーショ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、
Ｃｏｍ＋ｉｕｎ、）Ｊ、１４５゜７１２ （１９８７）
）をＢａｍＨＩとＸ ｈ ｏ Ｉで切断し。
ＧＬＤプロモーターおよび卵白リゾチームシグナルペプ
チド−ヒトリゾチームコード領域を含む１゜５ｋｂＢａ
ｍＨＩ−Ｘｈｏ ｌ断片と残りの部分の。
チド−ヒトリゾチームコード領域を含む１゜５ｋｂＢａ
ｍＨＩ−Ｘｈｏ ｌ断片と残りの部分の。
８．４ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ 断片をアガロ
ースゲル電気泳動で分離し、それぞれを単離した。
ースゲル電気泳動で分離し、それぞれを単離した。
上記のＧＬＰプロモーター、卵白リゾチームシグナルペ
プチドコード領域およびヒトリゾチームコード領域を含
む１．５ｋ ｂ Ｂ ａ ｍＨＩ−Ｘｈ 。
プチドコード領域およびヒトリゾチームコード領域を含
む１．５ｋ ｂ Ｂ ａ ｍＨＩ−Ｘｈ 。
ｌ断片の３′末端（Ｘｈｏ１部位）にＰＧＫターミネー
タ−を含む０．２８ｋｂ Ｓａ １１断片を、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結したのちアガロースゲル電気泳動に
かけ、１．８ｋｂ ＢａｍＨｆ−３ａ １■断片を単
離した。
タ−を含む０．２８ｋｂ Ｓａ １１断片を、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結したのちアガロースゲル電気泳動に
かけ、１．８ｋｂ ＢａｍＨｆ−３ａ １■断片を単
離した。
得られた１、８ｋｂ ＢａｍＨＩ−８ａ ｌ ｌ断片
と８．４ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片とをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結し、これを用いてエシェリキア・コ
ＩＪ’ （Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＤＨ
１の形質転換を行った。アンピシリン耐性の形質転換株
からプラスミドを調製し、これをｐＧＥＬ１２５Ｔと命
名した。
と８．４ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片とをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結し、これを用いてエシェリキア・コ
ＩＪ’ （Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＤＨ
１の形質転換を行った。アンピシリン耐性の形質転換株
からプラスミドを調製し、これをｐＧＥＬ１２５Ｔと命
名した。
参考例１で得られたヒトリゾチーム分泌プラスミドｐＧ
ＦＬ７３５から、改良型シグナルペプチドおよびヒトリ
ゾチームをコードする０、５ｋｂＸｈｏｆ断片を単離し
た。一方、ＰＨ０，５プロモーターを有する発現ベクタ
ーｐＰＨＯ１７−１（ヨーロッパ出願公開−０２３５４
３０）をＸｈｏｌで切断したのち、０．５ｋｂＸｈｏｌ
断片とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、エシェリキアコリ
（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＤＨｌの形質転換を行った。得ら
れたアンピシリン耐性の形質転換株からプラスミドを調
製し、これをｐ Ｐ Ｆ Ｌ７２５と命名した。
ＦＬ７３５から、改良型シグナルペプチドおよびヒトリ
ゾチームをコードする０、５ｋｂＸｈｏｆ断片を単離し
た。一方、ＰＨ０，５プロモーターを有する発現ベクタ
ーｐＰＨＯ１７−１（ヨーロッパ出願公開−０２３５４
３０）をＸｈｏｌで切断したのち、０．５ｋｂＸｈｏｌ
断片とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、エシェリキアコリ
（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＤＨｌの形質転換を行った。得ら
れたアンピシリン耐性の形質転換株からプラスミドを調
製し、これをｐ Ｐ Ｆ Ｌ７２５と命名した。
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＥＬ１２５Ｔ
およびｐＰＦＬ７２５はいずれもプロモータ−の上流お
よびヒトリゾチームコード領域の中にＸｂａｌ切断部位
を有する。そこで両プラスミドをＸｂａｌで切断し、ｐ
ＰＦＬ７２５の１．７ｋ ｂ Ｘｂａｒ断片と ｐＧＥ
Ｌ１２５Ｔの７．９ｋｂ ＸｂａＩ断片とをＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結したのち、エシェリキア コリ（
Ｅ、 ｃｏｌｉ） Ｄ ＨＬの形質転換を行った。得ら
れたアンピシリン耐性の形質転換株からプラスミドを単
離し、これをＰＰＦＬ７２５Ｔと命名した。
およびｐＰＦＬ７２５はいずれもプロモータ−の上流お
よびヒトリゾチームコード領域の中にＸｂａｌ切断部位
を有する。そこで両プラスミドをＸｂａｌで切断し、ｐ
ＰＦＬ７２５の１．７ｋ ｂ Ｘｂａｒ断片と ｐＧＥ
Ｌ１２５Ｔの７．９ｋｂ ＸｂａＩ断片とをＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結したのち、エシェリキア コリ（
Ｅ、 ｃｏｌｉ） Ｄ ＨＬの形質転換を行った。得ら
れたアンピシリン耐性の形質転換株からプラスミドを単
離し、これをＰＰＦＬ７２５Ｔと命名した。
参考例３
ヒトリゾチーム 泌プラスミド Ｔ Ｆ Ｌ７１０Ｔの
ｌ簗（第６図） 参考例１で得られたヒトリゾチーム分泌プラスミドｐＧ
ＦＬ７３５から２．３ｋｂＸｂａＩ断片を、また参考例
２で得られたプラスミドｐＧＦＬ１２５Ｔから７．９ｋ
ｂＸｂａＩ断片をそれぞれ単離したのち両者をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結し、Ｅ、ｃｏｌ、１ＤＨＩの形質転換
を行った。アンピシリン耐性の形質転換株からプラスミ
ドを単離し、これをＰＧＦＬ７３５Ｔと命名した。
ｌ簗（第６図） 参考例１で得られたヒトリゾチーム分泌プラスミドｐＧ
ＦＬ７３５から２．３ｋｂＸｂａＩ断片を、また参考例
２で得られたプラスミドｐＧＦＬ１２５Ｔから７．９ｋ
ｂＸｂａＩ断片をそれぞれ単離したのち両者をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結し、Ｅ、ｃｏｌ、１ＤＨＩの形質転換
を行った。アンピシリン耐性の形質転換株からプラスミ
ドを単離し、これをＰＧＦＬ７３５Ｔと命名した。
プラスミド ｐ ＢＭ １５０ （ｒモレキュラーセル
ラーバイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）
Ｊ、 ４．１４４０（１９８４）） のＧａ１ｌＯプ
ロモーターの上流にある２７５ｂｐ Ｓａｉｌ−Ｂａ
ｍＨ断片を、５ａｃＵ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｂｇ
ｌｌＩなどの制限酵素部位を有するマルチリンカ−（第
８図）（約４０ｂｐ）に置換して得られたプラスミド
Ｐ２Ｓ５からＧａ１ｌＯプロモーターを含む、０．７ｋ
ｂＢｇＩＩＩ−ＥｃｏＲｒ断片にＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ
アダプターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｂｇ
ｌ■およびＸｈｏｆで処理し、アガロースゲル電気泳動
１ｃＪニツチ０．７ｋ ｂ Ｂ ｇ Ｉ ＩＴ−Ｘｈ
ｏ Ｉ断片を単離した。
ラーバイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）
Ｊ、 ４．１４４０（１９８４）） のＧａ１ｌＯプ
ロモーターの上流にある２７５ｂｐ Ｓａｉｌ−Ｂａ
ｍＨ断片を、５ａｃＵ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｂｇ
ｌｌＩなどの制限酵素部位を有するマルチリンカ−（第
８図）（約４０ｂｐ）に置換して得られたプラスミド
Ｐ２Ｓ５からＧａ１ｌＯプロモーターを含む、０．７ｋ
ｂＢｇＩＩＩ−ＥｃｏＲｒ断片にＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ
アダプターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｂｇ
ｌ■およびＸｈｏｆで処理し、アガロースゲル電気泳動
１ｃＪニツチ０．７ｋ ｂ Ｂ ｇ Ｉ ＩＴ−Ｘｈ
ｏ Ｉ断片を単離した。
一方、プラスミド ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５ＴのＧＬＤプ
ロモーターを含む１．１ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ
１断片を除去し、これにＧａ１ｌＯプロモーターを含む
ＢｇｌＩｒ−ＸｈｏＩ断片を連結させ、エシェリキアコ
リ（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈ１の形質転換を行った。
ロモーターを含む１．１ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ
１断片を除去し、これにＧａ１ｌＯプロモーターを含む
ＢｇｌＩｒ−ＸｈｏＩ断片を連結させ、エシェリキアコ
リ（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈ１の形質転換を行った。
得られたアンピシリン耐性の形質転換株からプラスミド
を単離し、これをｐＴＦＬ７１０Ｔと命名した。
を単離し、これをｐＴＦＬ７１０Ｔと命名した。
参考例４
ヒトＥＧＦ 泌プラスミドＰＧＦＥ２１３のＷ築（第
７図参照） 参考例１の第３図に示した＃５および＃７の代りに第７
図に示す＃９を、＃６および＃８の代りに＃ｌＯをそれ
ぞれ化学合成し、＃１〜＃４とともにＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結して、改良型シグナルペプチドとヒトＥＧＦの
Ｎ末端側をコードする７６ｂｐ Ｘｈｏｌ−Ｈｉｎｆ
Ｉ断片を調製した６プラスミドｐＴＢ８７０（谷内（Ｔ
ａｎｉｙａｍａ）ら、「ジャーナルオブタケダリサーチ
ラボラトリーズ（Ｊ、Ｔａｋａｄａ 、Ｒｅｓ、 Ｌａ
ｂ、）Ｊ、 ４５，１３６ （１９８６）、特開昭６１
−８８８８１ ）によりＮ末端側が一部欠失しているヒ
トＥＧＦをコードする０、１６ｋｂ Ｈｉｎｆ ＩＰ
ｓｔｌ断片を単離し、その５′末端に上記の７６ｂｐ
Ｘｈｏｌ−Ｈｉｎｆ１ｗｉｒ片をＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼで連結したのちＸｈｏｌおよびＰｓｔｌで処理し、
０．２４ ｋｂ Ｘｈｏｌ−Ｐｓｔｌ断片を単癲した
。この断片にＰ ｓ ｔ Ｉ−Ｓｍａ Ｉアダプターを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ連結したのち、ＸｈｏｌおよびＳｍ
ａｌで処理し、改良型シグナルペプチドとヒトＥＧＦを
コードする０、２４ｋ ｂ Ｘｈ ｏ １−Ｓｍａ
Ｔ断片を単離した。
７図参照） 参考例１の第３図に示した＃５および＃７の代りに第７
図に示す＃９を、＃６および＃８の代りに＃ｌＯをそれ
ぞれ化学合成し、＃１〜＃４とともにＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結して、改良型シグナルペプチドとヒトＥＧＦの
Ｎ末端側をコードする７６ｂｐ Ｘｈｏｌ−Ｈｉｎｆ
Ｉ断片を調製した６プラスミドｐＴＢ８７０（谷内（Ｔ
ａｎｉｙａｍａ）ら、「ジャーナルオブタケダリサーチ
ラボラトリーズ（Ｊ、Ｔａｋａｄａ 、Ｒｅｓ、 Ｌａ
ｂ、）Ｊ、 ４５，１３６ （１９８６）、特開昭６１
−８８８８１ ）によりＮ末端側が一部欠失しているヒ
トＥＧＦをコードする０、１６ｋｂ Ｈｉｎｆ ＩＰ
ｓｔｌ断片を単離し、その５′末端に上記の７６ｂｐ
Ｘｈｏｌ−Ｈｉｎｆ１ｗｉｒ片をＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼで連結したのちＸｈｏｌおよびＰｓｔｌで処理し、
０．２４ ｋｂ Ｘｈｏｌ−Ｐｓｔｌ断片を単癲した
。この断片にＰ ｓ ｔ Ｉ−Ｓｍａ Ｉアダプターを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ連結したのち、ＸｈｏｌおよびＳｍ
ａｌで処理し、改良型シグナルペプチドとヒトＥＧＦを
コードする０、２４ｋ ｂ Ｘｈ ｏ １−Ｓｍａ
Ｔ断片を単離した。
参考例１で得られたプラスミドｐＧＦＬ７３５のヒトリ
ゾチームコード領域の下流にあるＸｈｏｒ部位をＳｍａ
１部位に改良して得られたプラスミドｐ Ｇ Ｆ Ｌ７
３５Ｓ ｍをＸｈｏ ｒ、Ｓｍａ ｒで切断して改良型
ジクナルペプチドとヒトリゾチームをコードする ＤＮ
Ａ ＦＭ片を除去し、代りに上記の０．２４ ｋｂ
Ｘｈ ｏ Ｉ−Ｓｍａ Ｉ断片を挿入してプラスミドｐ
ＧＦＥ１０１を得た。
ゾチームコード領域の下流にあるＸｈｏｒ部位をＳｍａ
１部位に改良して得られたプラスミドｐ Ｇ Ｆ Ｌ７
３５Ｓ ｍをＸｈｏ ｒ、Ｓｍａ ｒで切断して改良型
ジクナルペプチドとヒトリゾチームをコードする ＤＮ
Ａ ＦＭ片を除去し、代りに上記の０．２４ ｋｂ
Ｘｈ ｏ Ｉ−Ｓｍａ Ｉ断片を挿入してプラスミドｐ
ＧＦＥ１０１を得た。
プラスミドｐＧＬＤＰ３１ＲｃＴ （前出）よりＰＧＫ
ターミネータ−を含む０．２８ｋｂ ＡｈａｌｌＩ−
Ｘｈｏｌ断片を単離し、これをプラスミドｐＳＰ６４（
リボプローブ（Ｒｉｂｏｐｒａｂｅ）社、米国）のＳｍ
ａ ｒ−８ａ ｌ １部位に挿入し、プラスミドｐｓＰ
６４−Ｔ （ＰＧＫ）を得た。該プラスミドがらＰＧＫ
ターミネータ−を含むＥｃｏＲＴ−Ｐｓｔｌ断片を単離
し、これにＰｓｔｌ−８ｍａＴアダプターおよびＳ ｍ
ａ Ｉ −Ｅ ｃ ｏ ＲＩアダプターを付加したの
ち、上記のプラスミドｐＧＦＥ１０１のＳｍａｒ部位に
挿入し、ヒトＥＧＦ分泌プラスミドｐＧＦＥ２１３を得
た。
ターミネータ−を含む０．２８ｋｂ ＡｈａｌｌＩ−
Ｘｈｏｌ断片を単離し、これをプラスミドｐＳＰ６４（
リボプローブ（Ｒｉｂｏｐｒａｂｅ）社、米国）のＳｍ
ａ ｒ−８ａ ｌ １部位に挿入し、プラスミドｐｓＰ
６４−Ｔ （ＰＧＫ）を得た。該プラスミドがらＰＧＫ
ターミネータ−を含むＥｃｏＲＴ−Ｐｓｔｌ断片を単離
し、これにＰｓｔｌ−８ｍａＴアダプターおよびＳ ｍ
ａ Ｉ −Ｅ ｃ ｏ ＲＩアダプターを付加したの
ち、上記のプラスミドｐＧＦＥ１０１のＳｍａｒ部位に
挿入し、ヒトＥＧＦ分泌プラスミドｐＧＦＥ２１３を得
た。
実施例１
影３１町換遵ｊし社１−
参考例１で得たヒトリゾチーム分泌プラスミドｐＧＦＬ
７３５を用いてリチウム法（前出）でサツカロミセスセ
レビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ） Ｋ３３−７ Ｂ （ａ １ｅｕ２ ｈ
ｉｓ ｐｈｏ８０ ｐｈｏ８）、サツカロミセスセレビ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） ＮＡ８７−１１Ａ （ａ １ｅｕ２ ｈｉｓ
３ ｔｒｐｌ ｐｈｏ３ ｐｈｏ５）およびサツカロミ
セスセレビシェ（Ｓ、 ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ
Ａ７４−３ Ａ （ａ １ｅｕ２ ｈｉｓ４ ｐｈｏ９
ｃａｎｌ ）の形質転換を行い、それぞれ形質転換体
サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） Ｋ３３−７８／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５．サツカ
ロミセスセレビシェ（Ｓ。
７３５を用いてリチウム法（前出）でサツカロミセスセ
レビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ） Ｋ３３−７ Ｂ （ａ １ｅｕ２ ｈ
ｉｓ ｐｈｏ８０ ｐｈｏ８）、サツカロミセスセレビ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） ＮＡ８７−１１Ａ （ａ １ｅｕ２ ｈｉｓ
３ ｔｒｐｌ ｐｈｏ３ ｐｈｏ５）およびサツカロミ
セスセレビシェ（Ｓ、 ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ
Ａ７４−３ Ａ （ａ １ｅｕ２ ｈｉｓ４ ｐｈｏ９
ｃａｎｌ ）の形質転換を行い、それぞれ形質転換体
サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） Ｋ３３−７８／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５．サツカ
ロミセスセレビシェ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ８７−１１ Ａ ／
ｐ Ｇ Ｆ Ｌ ７３５およびサツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ
／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５を得た。
ｐ Ｇ Ｆ Ｌ ７３５およびサツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ
／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５を得た。
参考例２で得たヒトリゾチーム分泌プラスミドｐ Ｐ
Ｆ Ｌ ７２５Ｔ、参考例３で得たヒトリゾチーム分泌
プラスミドｐＴＦＬ７１０Ｔおよび参考例４で得たヒト
ＥＧＦ分泌プラスミドＰＧＦＥ２１３を用いてリチウム
法でサツカロミセスセレビシェ（Ｓ。
Ｆ Ｌ ７２５Ｔ、参考例３で得たヒトリゾチーム分泌
プラスミドｐＴＦＬ７１０Ｔおよび参考例４で得たヒト
ＥＧＦ分泌プラスミドＰＧＦＥ２１３を用いてリチウム
法でサツカロミセスセレビシェ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａの形質転
換を行い、それぞれ形質転換体サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ。
換を行い、それぞれ形質転換体サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ ／ ｐ
Ｐ Ｆ Ｌ７２５Ｔ 、サツカロミセスセレビシェ（
Ｓ、 ｃｅｒｓｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３Ａ／ｐＴ
ＦＬ ７１０Ｔおよびサツカロミセスセレビシェ（Ｓ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ ／
ｐ Ｇ ＦＥ２１３を得た。
Ｐ Ｆ Ｌ７２５Ｔ 、サツカロミセスセレビシェ（
Ｓ、 ｃｅｒｓｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３Ａ／ｐＴ
ＦＬ ７１０Ｔおよびサツカロミセスセレビシェ（Ｓ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ ／
ｐ Ｇ ＦＥ２１３を得た。
参考例３で得たヒトリゾチーム分泌プラスミドｐＴＦＬ
７１０Ｔを用いてリチウム法でサツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ Ｘ −５
０Ｄの形質転換体サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ Ｘ −５０Ｄ ／ ｐ
Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔを得た。
７１０Ｔを用いてリチウム法でサツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ Ｘ −５
０Ｄの形質転換体サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ Ｘ −５０Ｄ ／ ｐ
Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔを得た。
実施例２
形 転 組換え の のラボラトリーコ
ースマニュアルフォーメソソズインイーストジェネティ
クス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕ
ａｌ ｆｏｒ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） （コールドスプリングハーバ−
ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 １９８６）に記載されて
いる方法に従ってエチジウムブロマイドを用いて、実施
例１で得られた形質転換体＜ｍ換え体）サツカロミセス
セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ３３−
７８ ／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５．サツカロミセスセレ
ビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ８７−１
１Ａ／ ｐＧ Ｆ Ｌ７３５．サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ
／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ ７３５．サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ ７４−３Ａ
／ ｐ Ｐ Ｆ Ｌ７２５Ｔ、サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ ７４−３
Ａ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ７１０Ｔ。
ースマニュアルフォーメソソズインイーストジェネティ
クス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕ
ａｌ ｆｏｒ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） （コールドスプリングハーバ−
ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 １９８６）に記載されて
いる方法に従ってエチジウムブロマイドを用いて、実施
例１で得られた形質転換体＜ｍ換え体）サツカロミセス
セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ３３−
７８ ／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５．サツカロミセスセレ
ビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ８７−１
１Ａ／ ｐＧ Ｆ Ｌ７３５．サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ
／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ ７３５．サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ ７４−３Ａ
／ ｐ Ｐ Ｆ Ｌ７２５Ｔ、サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ ７４−３
Ａ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ７１０Ｔ。
サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） ＮＡ Ｘ−５０Ｄ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔ
、およびサツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ） ＮＡ ７４−３Ａ／ｐＧＦＥ２１３から
、それぞれの呼吸欠損株サツカロミセスセレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ ３３−７Ｂ（ρ−）
／ｐＧＦＬ ７３５．サツカロミセスセレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ） ＮＡ８７−１１Ａ （ρ
−）／ｐＧＦＬ７３５．サツカロミセスセレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＮＡ ７４−３Ａ （
１）−） ／ ＰＧＦ［、７３５，サツカロミセスセレ
ビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ ７４−
３Ａ （ρ） ／ｐＰＦＬ ７２５Ｔ。
ｅ） ＮＡ Ｘ−５０Ｄ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔ
、およびサツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ） ＮＡ ７４−３Ａ／ｐＧＦＥ２１３から
、それぞれの呼吸欠損株サツカロミセスセレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ ３３−７Ｂ（ρ−）
／ｐＧＦＬ ７３５．サツカロミセスセレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ） ＮＡ８７−１１Ａ （ρ
−）／ｐＧＦＬ７３５．サツカロミセスセレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＮＡ ７４−３Ａ （
１）−） ／ ＰＧＦ［、７３５，サツカロミセスセレ
ビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ ７４−
３Ａ （ρ） ／ｐＰＦＬ ７２５Ｔ。
サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＴＦＬ ７１０Ｔ、サ
ツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） ＮＡＸ−５０Ｄ（ρ−）／ＰＴＦＬ７１０、および
サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ （ｐ −）／ｐＧＦＥ２１
３を得た。
） ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＴＦＬ ７１０Ｔ、サ
ツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） ＮＡＸ−５０Ｄ（ρ−）／ＰＴＦＬ７１０、および
サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ （ｐ −）／ｐＧＦＥ２１
３を得た。
実施例３
呼吸 損株の形 転換体（組換え の調製実施例２で
示した方法で、サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａからその呼吸
欠損株（ρ″）を分離し、これを参考例３で得られたヒ
トリゾチーム分泌プラスミドｐＴＦＬ７１０Ｔを用いて
リチウム法で形質転換することによって、形質転換体サ
ツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） ＮＡ７４−３ Ａ（ρ）／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ７１０
Ｔを得た。
示した方法で、サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａからその呼吸
欠損株（ρ″）を分離し、これを参考例３で得られたヒ
トリゾチーム分泌プラスミドｐＴＦＬ７１０Ｔを用いて
リチウム法で形質転換することによって、形質転換体サ
ツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） ＮＡ７４−３ Ａ（ρ）／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ７１０
Ｔを得た。
実施例４
実施例１および２で得られた組換え体サツカロミセスセ
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ３３−７
８／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５．サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ。
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ３３−７
８／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５．サツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ） Ｎ Ａ８７−１１Ａ ／ ｐ
Ｇ Ｆ Ｌ ７３５．サツカロミセスセレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ ７４−３Ａ／
ＰＧＦＬ７３５およびこれらの呼吸欠損株サツカロミセ
スセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ３３
−７Ｂ（ρ−） ／ｐＧＦＬ ７３５．サツカロミセス
セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ８７
−１１Ａ（ρ−）／ｐＧＦＬ７３５．サツカロミセスセ
レビシェ（Ｓ。
Ｇ Ｆ Ｌ ７３５．サツカロミセスセレビシェ（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ ７４−３Ａ／
ＰＧＦＬ７３５およびこれらの呼吸欠損株サツカロミセ
スセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｋ３３
−７Ｂ（ρ−） ／ｐＧＦＬ ７３５．サツカロミセス
セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ８７
−１１Ａ（ρ−）／ｐＧＦＬ７３５．サツカロミセスセ
レビシェ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ （ρ−）
／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５をシヨ糖８．９％、グルコ
ース１．１％、ＫＨ，ＰＯ４０，０４４％を含む改変バ
ルクホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）培地ｃ束江等（
丁ｏｈ−Ｅ、Ａ、 ａｔ ａｌ、）、 ｒジャーナルオ
ブバクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） Ｊ
ｒ １１３＋７２７ （１９７３））に接種し、３０℃
で３日間振どう培養した。この培養液１ ｍ Ｑを４ｍ
Ｑの同じ培地を含む試験管に移し、３０℃で１日間振ど
う培養した。
／ ｐ Ｇ Ｆ Ｌ７３５をシヨ糖８．９％、グルコ
ース１．１％、ＫＨ，ＰＯ４０，０４４％を含む改変バ
ルクホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）培地ｃ束江等（
丁ｏｈ−Ｅ、Ａ、 ａｔ ａｌ、）、 ｒジャーナルオ
ブバクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） Ｊ
ｒ １１３＋７２７ （１９７３））に接種し、３０℃
で３日間振どう培養した。この培養液１ ｍ Ｑを４ｍ
Ｑの同じ培地を含む試験管に移し、３０℃で１日間振ど
う培養した。
次にその培養液２ ｍ Ｑを１８ｍＱの同じ培地を含む
２００ｍＱ容三角フラスコに移し、３０℃で７２時間振
どう培養した。得られた培養液を遠心分離し、その上清
のヒトリゾチーム活性を吉相（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ）ら
〔「バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコ
ミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
２００ｍＱ容三角フラスコに移し、３０℃で７２時間振
どう培養した。得られた培養液を遠心分離し、その上清
のヒトリゾチーム活性を吉相（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ）ら
〔「バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコ
ミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）Ｊ、１４５，７１２ （１９
８７））によって記載されている方法で測定し、それぞ
れのヒトリゾチーム生産量を求めた。その結果を第２表
に示す６第２表 培養時間 生育 （時間） （Ｋｌｅｔｔ） 〃４７０ 〃４４０ 〃５２０ 〃５００ 〃５０５ 〃３８０ 組換え体 Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ Ｋ３３−７８／ｐＧＦＬ７
３５に３３−７Ｂ（ρ−）／ｐＧＦ１．７３５ＩＩ
ＮＡ８７−１１Ａ／ｐＧＦＬ７３５ＮＡ８７−１１Ａ
（ρ−）／ｐＧＦ１．７３５ＮＡ７４−３Ａ／ｐＧＦＬ
７３５ ＩＩ ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＧＦ１．７３５
〃ＮＡ７４−３Ａ／ｐＰＦＬ７２５Ｔ ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＰＦＬ７２５ＴＮＡ７４−
３Ａ／ｐＴＦＬ７１０Ｔ ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ＰＴＦＬ７１０丁＃ Ｎ
ＡＸ−５００／ｐＴＦＬ７１０ＴＩＩ ＮＡＸ−５
００（ρ−）／ＰＴＦＩ、７１０Ｔ第２表から明らかな
様に、ＧＬＤプロモーターを有するヒトリゾチーム分泌
プラスミドｐＧＦＬ７３５を用いた場合には、いずれの
酵母菌株でも呼吸欠損株（ρ−）のヒトリゾチーム生産
量は親（ρ＋）のそれよりも２〜６倍高かった。
８７））によって記載されている方法で測定し、それぞ
れのヒトリゾチーム生産量を求めた。その結果を第２表
に示す６第２表 培養時間 生育 （時間） （Ｋｌｅｔｔ） 〃４７０ 〃４４０ 〃５２０ 〃５００ 〃５０５ 〃３８０ 組換え体 Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ Ｋ３３−７８／ｐＧＦＬ７
３５に３３−７Ｂ（ρ−）／ｐＧＦ１．７３５ＩＩ
ＮＡ８７−１１Ａ／ｐＧＦＬ７３５ＮＡ８７−１１Ａ
（ρ−）／ｐＧＦ１．７３５ＮＡ７４−３Ａ／ｐＧＦＬ
７３５ ＩＩ ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＧＦ１．７３５
〃ＮＡ７４−３Ａ／ｐＰＦＬ７２５Ｔ ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＰＦＬ７２５ＴＮＡ７４−
３Ａ／ｐＴＦＬ７１０Ｔ ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ＰＴＦＬ７１０丁＃ Ｎ
ＡＸ−５００／ｐＴＦＬ７１０ＴＩＩ ＮＡＸ−５
００（ρ−）／ＰＴＦＩ、７１０Ｔ第２表から明らかな
様に、ＧＬＤプロモーターを有するヒトリゾチーム分泌
プラスミドｐＧＦＬ７３５を用いた場合には、いずれの
酵母菌株でも呼吸欠損株（ρ−）のヒトリゾチーム生産
量は親（ρ＋）のそれよりも２〜６倍高かった。
実施例５
実施例１および２で得られた組換え体サツカロミセスセ
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−
３Ａ／ ｐ Ｐ Ｆ Ｌ７２５Ｔおよびその呼吸欠損株
サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ ｐ Ｐ Ｆ Ｌ７２
５Ｔを高リン酸培地〔東江等（Ｔｏｈ−Ｅ、Ａ、ａｔ
ａｔ、）、 ｒジャーナルオブバクテリオロジ−（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） Ｊ、 １１３，７２７ （１
９７３））に接種し、３０℃で３日間振どう培養した。
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−
３Ａ／ ｐ Ｐ Ｆ Ｌ７２５Ｔおよびその呼吸欠損株
サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ ｐ Ｐ Ｆ Ｌ７２
５Ｔを高リン酸培地〔東江等（Ｔｏｈ−Ｅ、Ａ、ａｔ
ａｔ、）、 ｒジャーナルオブバクテリオロジ−（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） Ｊ、 １１３，７２７ （１
９７３））に接種し、３０℃で３日間振どう培養した。
この培養液１ｍ１２を４ｍ＋２の同じ培地を含む試験管
に移し、３０℃で１日間振どう培養した６次にその培養
液２ｍＱを１８ｍ Ｑの低リン酸培地〔シヨ糖８．９％
、グルコース１．１％、Ｋ Ｈ，Ｐ Ｏ４０，００３％
を含む改変バルクホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）培
地（前出）〕を含む２００ｍＱ容三角フラスコに移し、
３０℃で１２０時間振どう培養した。
に移し、３０℃で１日間振どう培養した６次にその培養
液２ｍＱを１８ｍ Ｑの低リン酸培地〔シヨ糖８．９％
、グルコース１．１％、Ｋ Ｈ，Ｐ Ｏ４０，００３％
を含む改変バルクホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）培
地（前出）〕を含む２００ｍＱ容三角フラスコに移し、
３０℃で１２０時間振どう培養した。
得られた培養液の上清のヒトリゾチーム活性を測定し、
それぞれのヒトリゾチーム生産量を求めた。
それぞれのヒトリゾチーム生産量を求めた。
その結果、ＰＨ０５プロモーターを有するヒトリゾチー
ム分泌プラスミドｐＰＦＬ７２５Ｔを用いた場合も、呼
吸欠損株（ρ−）はその親株（ρ＋）よりも約２倍高い
ヒトリゾチーム生産量を示すことが明らかになった（第
２表）。
ム分泌プラスミドｐＰＦＬ７２５Ｔを用いた場合も、呼
吸欠損株（ρ−）はその親株（ρ＋）よりも約２倍高い
ヒトリゾチーム生産量を示すことが明らかになった（第
２表）。
実施例６
プラスミドｐＴＦＬ７１０Ｔを用いたヒトリゾチームの
分泌生産 実施例１および２で得られた組換え体サツカロミセスセ
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−
３Ａ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔおよびその呼吸欠損
株サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ） ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ Ｐ Ｔ Ｆ Ｌ７
１０Ｔをシヨ糖８．９％、グルコース１．１％、Ｋ Ｈ
，Ｐ Ｏ４０，０４４％を含む改変バルクホルダー（Ｂ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）培地（前出）に接種し、３０℃で
３日間振どう培養した。この培養液１ｍＱを４ｍＱの同
じ培地を含む試験管に移し、３０℃で１日間振どう培養
した０次いでその培養液２ｍＱを１８ｍ Ｑのガラクト
ース培地〔ショＭ８．９％。
分泌生産 実施例１および２で得られた組換え体サツカロミセスセ
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−
３Ａ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔおよびその呼吸欠損
株サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ） ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ Ｐ Ｔ Ｆ Ｌ７
１０Ｔをシヨ糖８．９％、グルコース１．１％、Ｋ Ｈ
，Ｐ Ｏ４０，０４４％を含む改変バルクホルダー（Ｂ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）培地（前出）に接種し、３０℃で
３日間振どう培養した。この培養液１ｍＱを４ｍＱの同
じ培地を含む試験管に移し、３０℃で１日間振どう培養
した０次いでその培養液２ｍＱを１８ｍ Ｑのガラクト
ース培地〔ショＭ８．９％。
ガラクトース５％、グルコース０．２５％、ＫＨ２ＰＯ
４０，０４４％を含む改変バルクホルダー（Ｂｕｒｋｈ
ｏｌｄｅｒ）培地（前出）〕を含む２００ｍＱ容三角フ
ラスコに移し、３０℃で１４４時間振どう培養した。
４０，０４４％を含む改変バルクホルダー（Ｂｕｒｋｈ
ｏｌｄｅｒ）培地（前出）〕を含む２００ｍＱ容三角フ
ラスコに移し、３０℃で１４４時間振どう培養した。
得られた培養液の上清のヒトリゾチーム活性を測定し、
それぞれのヒトリゾチーム生産量を求めた。
それぞれのヒトリゾチーム生産量を求めた。
その結果、Ｇａ１ｌＯプロモーターを有するヒトリゾチ
ーム分泌プラスミドｐＴＦＬ７１０Ｔを用いた場合も、
呼吸欠損株（ρジはその親株（ρ１）よりも約９倍高い
ヒトリゾチーム生産量を示すことが明らかになった（第
２表）。
ーム分泌プラスミドｐＴＦＬ７１０Ｔを用いた場合も、
呼吸欠損株（ρジはその親株（ρ１）よりも約９倍高い
ヒトリゾチーム生産量を示すことが明らかになった（第
２表）。
また実施例１で得られた組換え体サツカロミセスセレビ
シェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３
Ａ／ｐＴＦＬ７１０Ｔおよび実施例３で得られた呼吸欠
損株の組換え体サツカロミセスセレビシェ（Ｓ。
シェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３
Ａ／ｐＴＦＬ７１０Ｔおよび実施例３で得られた呼吸欠
損株の組換え体サツカロミセスセレビシェ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ（ρ−）／
ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔを同様の方法で培養したと
ころ、上記の結果と同様に、サツカロミセスセレビシェ
（Ｓ、 ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ（
、ｏ−）／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ７１０Ｔのヒトリゾチーム
生産量はサツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ
７１０Ｔのそれよりも高かった。
ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔを同様の方法で培養したと
ころ、上記の結果と同様に、サツカロミセスセレビシェ
（Ｓ、 ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ（
、ｏ−）／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ７１０Ｔのヒトリゾチーム
生産量はサツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ
７１０Ｔのそれよりも高かった。
実施例１および２で得られた形質転換体サツカロミセス
セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒａｖｉｓｉａａ） Ｎ Ａ
Ｘ −５０Ｄ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔ、およびそ
の呼吸欠損株サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡＸ−５０Ｄ （ρ−）／ ｐ
Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔを同様の方法で９６時間培養した
ところ、後者は前者よりも約６倍多いヒトリゾチームを
生産した（第２表）。
セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒａｖｉｓｉａａ） Ｎ Ａ
Ｘ −５０Ｄ／ ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔ、およびそ
の呼吸欠損株サツカロミセスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡＸ−５０Ｄ （ρ−）／ ｐ
Ｔ Ｆ Ｌ ７１０Ｔを同様の方法で９６時間培養した
ところ、後者は前者よりも約６倍多いヒトリゾチームを
生産した（第２表）。
実施例７
プラスミド ＧＦＥ２１３を いたヒトＥＧＦの泌生産
実施例１および２で得られた組換え体サツカロミセスセ
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−
３Ａ／ｐＧＦＥ２１３およびその呼吸欠損株サツカロミ
セスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ
７４−３Ａ（ρ−）／ｐＧＦＥ２１３を実施例４と同じ
方法で培養した。得られた培養液を遠心分離し、その上
清のヒトＥＧＦをラジオイムノアッセイのキット（アマ
ジャム社）を用いて定量した。その結果を第３表に示す 第３表 生育 ヒトＥＧＦ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ ＮＡ７４−３Ａ／ｐＧ’Ｅ
２１３ ５２５ＮＡ７４−３Ａ （ρつ／ｐＧＦ
Ｅ２１３ ４７５０．５６ ０．８５ 以上のように遺伝子としてヒトＥＧＦのものを用いた場
合でも、呼吸欠損株（ρ−）のヒトＥＧＦ生産量は親株
（ρ＋）のそれよりも高かった。
レビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−
３Ａ／ｐＧＦＥ２１３およびその呼吸欠損株サツカロミ
セスセレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ
７４−３Ａ（ρ−）／ｐＧＦＥ２１３を実施例４と同じ
方法で培養した。得られた培養液を遠心分離し、その上
清のヒトＥＧＦをラジオイムノアッセイのキット（アマ
ジャム社）を用いて定量した。その結果を第３表に示す 第３表 生育 ヒトＥＧＦ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａａ ＮＡ７４−３Ａ／ｐＧ’Ｅ
２１３ ５２５ＮＡ７４−３Ａ （ρつ／ｐＧＦ
Ｅ２１３ ４７５０．５６ ０．８５ 以上のように遺伝子としてヒトＥＧＦのものを用いた場
合でも、呼吸欠損株（ρ−）のヒトＥＧＦ生産量は親株
（ρ＋）のそれよりも高かった。
参考例５
参考例３で示したＧａ１ｌＯプロモーターを含む０．７
ｋｂ ＢｇｌＩ［−ＥｃｏＲＩ断片にＥｃｏＲＩ−Ｘｈ
ｏＴアダプターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連絡したのち、
Ｓ ａ ｕ ３ Ａ ｌおよびＸｈｏｌで処理し。
ｋｂ ＢｇｌＩ［−ＥｃｏＲＩ断片にＥｃｏＲＩ−Ｘｈ
ｏＴアダプターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連絡したのち、
Ｓ ａ ｕ ３ Ａ ｌおよびＸｈｏｌで処理し。
アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｇａ１ｌＯプロモ−タ
ーを含む０．５１ｋｂ ５ａｕ３Ａ１−Ｘｈｏｌ断片
を単離した。
ーを含む０．５１ｋｂ ５ａｕ３Ａ１−Ｘｈｏｌ断片
を単離した。
一方、参考例３で得られたプラスミドｐＧ Ｆ Ｌ７３
５ＴのＧＬＤプロモーターを含む１．１ｋｂＢａｍＨＩ
−Ｘｈｏｌ断片を除去し２代わりに上記のＧａ１ｌＯプ
ロモータを含む０．５１ ｋ ｂ Ｓ ａ ｕ ３Ａ
ｌ−Ｘｈｏｌ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連絡させ、エ
シェリキア・コリ（Ｅ ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈｌの形質転
換株からプラスミドを単離し、これをｐＴＦＬ ７７１
Ｔと命名した。
５ＴのＧＬＤプロモーターを含む１．１ｋｂＢａｍＨＩ
−Ｘｈｏｌ断片を除去し２代わりに上記のＧａ１ｌＯプ
ロモータを含む０．５１ ｋ ｂ Ｓ ａ ｕ ３Ａ
ｌ−Ｘｈｏｌ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連絡させ、エ
シェリキア・コリ（Ｅ ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈｌの形質転
換株からプラスミドを単離し、これをｐＴＦＬ ７７１
Ｔと命名した。
参考例６
参考例３で得られたプラスミドｐＴＦＬ７１０よりＧａ
１ｌＯプロモーターを含む０．７ｋｂ ＢａｍＨＩ
−Ｘｈ ｏ Ｉ断片を除去し１代わりに参考例５で得ら
れた０、５１ｋｂ ５ａｕ３Ａ１−Ｘｈｏｌ断片を挿
入し、ヒトリゾチーム分泌プラスミドｐＴＦＬ ７８０
Ｔを得た。
１ｌＯプロモーターを含む０．７ｋｂ ＢａｍＨＩ
−Ｘｈ ｏ Ｉ断片を除去し１代わりに参考例５で得ら
れた０、５１ｋｂ ５ａｕ３Ａ１−Ｘｈｏｌ断片を挿
入し、ヒトリゾチーム分泌プラスミドｐＴＦＬ ７８０
Ｔを得た。
実施例８
形質転換体の調製
参考例５および６で得られたヒトリゾチーム分泌プラス
ミドｐＴＦＬ７７１ＴおよびｐＴＦＬ７８０Ｔを用いて
、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃａｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ、およびその呼吸欠損株
サツカロミセス・セルビシｘ （Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）（実施例３）をリチ
ウム法で形質転換させ、それぞれ形質転換体サツカロミ
セス・セルビシｘ （Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＮＡ７４ ３Ａ／ｐＴＦＬ７７１Ｔ、サッカロミセス・
セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−
３ Ａ（、ｏ −） ／ｐＴ Ｆ Ｌ ７７１Ｔ。
ミドｐＴＦＬ７７１ＴおよびｐＴＦＬ７８０Ｔを用いて
、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃａｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ） Ｎ Ａ７４−３ Ａ、およびその呼吸欠損株
サツカロミセス・セルビシｘ （Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）（実施例３）をリチ
ウム法で形質転換させ、それぞれ形質転換体サツカロミ
セス・セルビシｘ （Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＮＡ７４ ３Ａ／ｐＴＦＬ７７１Ｔ、サッカロミセス・
セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−
３ Ａ（、ｏ −） ／ｐＴ Ｆ Ｌ ７７１Ｔ。
サツカロミセス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ／ Ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７８０
Ｔ、およびサツカロミセス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ（ρ−）／ ｐ
Ｔ Ｆ Ｌ ７８０Ｔを得た。
ａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ／ Ｐ Ｔ Ｆ Ｌ ７８０
Ｔ、およびサツカロミセス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ） ＮＡ７４−３ Ａ（ρ−）／ ｐ
Ｔ Ｆ Ｌ ７８０Ｔを得た。
実施例９
実施例８で得られた形質転換体を実施例６と同様の方法
で培養し、それぞれのヒトリゾチーム生産量を求めたと
ころ、ｐＴＦＬ７７１ＴおよびｐＴＦＬ７８０Ｔのいず
れの場合も、実施例６と同様に呼吸欠損株の形質転換体
は親株の形質転換体よりも多くのヒトリゾチームを生産
した。
で培養し、それぞれのヒトリゾチーム生産量を求めたと
ころ、ｐＴＦＬ７７１ＴおよびｐＴＦＬ７８０Ｔのいず
れの場合も、実施例６と同様に呼吸欠損株の形質転換体
は親株の形質転換体よりも多くのヒトリゾチームを生産
した。
実施例１０
プラスミドｐＧＥＬ１２５（前出）のＧＬＤプロモータ
ーとシグナルペプチドをコードする部分を含むＤＮＡ断
片を、プラスミドｐ６９Ａ（セル（Ｃｅ１１）、３０，
９３３ （１９８２）］由来のα−ファクター遺伝子の
プロモーターおよびプレ・プロ領域をコードする部分を
含むＤＮＡ断片に置き換えたヒトリゾチーム分泌プラス
ミドｐＡＡＬ４１０を構築した。
ーとシグナルペプチドをコードする部分を含むＤＮＡ断
片を、プラスミドｐ６９Ａ（セル（Ｃｅ１１）、３０，
９３３ （１９８２）］由来のα−ファクター遺伝子の
プロモーターおよびプレ・プロ領域をコードする部分を
含むＤＮＡ断片に置き換えたヒトリゾチーム分泌プラス
ミドｐＡＡＬ４１０を構築した。
一方、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ ） ＮＡ７４−３ Ａ （前出）とサツカロ
ミセス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ
Ｋ−１３Ｄ （α１ｅｕ２ｈｉｓ３ ｔｒｐ＋）（モレ
キュラーセルラーアンドバイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ
１１． Ｂｉｏｌ、）、４，７７１ （１９８４））と
の交雑によってサッカロミセス・セレビシェ（Ｓ。
ｓｉａｅ ） ＮＡ７４−３ Ａ （前出）とサツカロ
ミセス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ
Ｋ−１３Ｄ （α１ｅｕ２ｈｉｓ３ ｔｒｐ＋）（モレ
キュラーセルラーアンドバイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ
１１． Ｂｉｏｌ、）、４，７７１ （１９８４））と
の交雑によってサッカロミセス・セレビシェ（Ｓ。
ｃｅｒａｖｉｓｉａｅ ） Ｔ Ａ３９ （ａ １ｅ
ｕ２ ｈｉｓ ｃａｎｌ） を作製し、さらに実施
例２に記載した方法でその呼吸欠損株サッカロミセス・
セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＴＡ３９
（ρ−）を得た。
ｕ２ ｈｉｓ ｃａｎｌ） を作製し、さらに実施
例２に記載した方法でその呼吸欠損株サッカロミセス・
セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＴＡ３９
（ρ−）を得た。
上記のサッカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ ） ＴＡ３９、およびその呼吸欠損株サツカ
ロミセス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） ＴＡ３９ （ｐ−）を上記のヒトリゾチーム分泌プ
ラスミドｐＡＡＬ４１０を用いてリチウム法で形質転換
させることによって、それぞれ形質転換体サツカロミセ
ス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） Ｔ
Ａ３９／ ｐ Ａ Ａ Ｌ４１０およびサッカロミセ
ス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒａｖｉｓｉａｅ ） ＴＡ
３９ （１）−＞ ／ Ｐ ＡＡＬ４１０を得た。
ｓｉａｅ ） ＴＡ３９、およびその呼吸欠損株サツカ
ロミセス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） ＴＡ３９ （ｐ−）を上記のヒトリゾチーム分泌プ
ラスミドｐＡＡＬ４１０を用いてリチウム法で形質転換
させることによって、それぞれ形質転換体サツカロミセ
ス・セルビシｘ （Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） Ｔ
Ａ３９／ ｐ Ａ Ａ Ｌ４１０およびサッカロミセ
ス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒａｖｉｓｉａｅ ） ＴＡ
３９ （１）−＞ ／ Ｐ ＡＡＬ４１０を得た。
形質転換体サッカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ） Ｔ Ａ３９／ ｐ Ａ Ａ Ｌ４１
０、およびサツカロミセス・セルビシｘ （Ｓ、 ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＴＡ３９（ρ−）／ｐＡＡＬ４
１０を実施例４と同様の方法で培養し、得られた培養液
の上清のヒトリゾチーム活性を３１１１定することによ
ってヒトリゾチーム生産量を求めた。 サッカロミセス
・セレビシェ（Ｓ。
ｖｉｓｉａｅ ） Ｔ Ａ３９／ ｐ Ａ Ａ Ｌ４１
０、およびサツカロミセス・セルビシｘ （Ｓ、 ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ） ＴＡ３９（ρ−）／ｐＡＡＬ４
１０を実施例４と同様の方法で培養し、得られた培養液
の上清のヒトリゾチーム活性を３１１１定することによ
ってヒトリゾチーム生産量を求めた。 サッカロミセス
・セレビシェ（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｔ Ａ３９／ ｐ Ａ Ａ
Ｌ４１０、およびサッカロミセス・セレビシェ（Ｓ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＴＡ３９ρ−／ｐＡＡＬ４１
０はそれぞれ０．５■／し、および２．６■／Ｌのヒト
リゾチームを生産し、呼吸欠損株（後者）の生産量は親
株（前者）の生産量よりも５倍多かった。
Ｌ４１０、およびサッカロミセス・セレビシェ（Ｓ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＴＡ３９ρ−／ｐＡＡＬ４１
０はそれぞれ０．５■／し、および２．６■／Ｌのヒト
リゾチームを生産し、呼吸欠損株（後者）の生産量は親
株（前者）の生産量よりも５倍多かった。
実施例および参考例に記載された次に示す微生物は発酵
研究所（大阪）（ＩＦ○）、および通産省工業技術院微
生物工業研究所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に基いて寄
託されている。
研究所（大阪）（ＩＦ○）、および通産省工業技術院微
生物工業研究所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に基いて寄
託されている。
１、 ＮＡ７４−３Ａ
２、 ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）
３、 ＮＡ７４−３Ａ／ｐＴＦｔ、７１０Ｔ４、 ＮＡ
７４−３Ａ（ρつ／ｐＴＦＬ７１０Ｔ５、に３３−７Ｂ
（ρ−） ６、 ＮＡ８７−１１Ａ（ρ−） ７、 ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＰａ７２５Ｔａ、
ＮＡ７４−３Ａ（ρつ／ド圧２１３９、 ＮＡＸ−５０
０（１）−）／ＰＴＦＬ７１０ＴＢＰ−１９４７（Ｐ−
９６９１） ＢＰ−１９４８（Ｐ−９６９２） ＢＰ−２０９０（Ｐ−９６９３） ＢＰ−２０９１（Ｐ−９６９４） ＢＰ−２０９２ ＢＰ−２０９３ ＢＰ−２０９４ ＢＰ−２０９５ ＢＰ−２０９６ １０、ＡＨ２２Ｒ−／ｐＧＦＬ７３５ １
０２２７ ＢＰ−１３４６１１、ＡＨ２２Ｒ７／ｐ
ＧＥＬ１２５ １０２１１ ＢＰ−１
３４５１２、ＡＨ２２Ｒ−／ｐＧＬｌ） Ｐ３１−Ｒｃ
Ｔ １０２０６ ＢＰ−１０５９
７４−３Ａ（ρつ／ｐＴＦＬ７１０Ｔ５、に３３−７Ｂ
（ρ−） ６、 ＮＡ８７−１１Ａ（ρ−） ７、 ＮＡ７４−３Ａ（ρ−）／ｐＰａ７２５Ｔａ、
ＮＡ７４−３Ａ（ρつ／ド圧２１３９、 ＮＡＸ−５０
０（１）−）／ＰＴＦＬ７１０ＴＢＰ−１９４７（Ｐ−
９６９１） ＢＰ−１９４８（Ｐ−９６９２） ＢＰ−２０９０（Ｐ−９６９３） ＢＰ−２０９１（Ｐ−９６９４） ＢＰ−２０９２ ＢＰ−２０９３ ＢＰ−２０９４ ＢＰ−２０９５ ＢＰ−２０９６ １０、ＡＨ２２Ｒ−／ｐＧＦＬ７３５ １
０２２７ ＢＰ−１３４６１１、ＡＨ２２Ｒ７／ｐ
ＧＥＬ１２５ １０２１１ ＢＰ−１
３４５１２、ＡＨ２２Ｒ−／ｐＧＬｌ） Ｐ３１−Ｒｃ
Ｔ １０２０６ ＢＰ−１０５９
第１図はオリゴヌクレオチドの集成、連結によるヒト・
リゾチーム合成遺伝子の合成法を示す図である。 第２図はヒト・リゾチーム遺伝子のＴａｑ−１−ＸｈＯ
■断片のＤＮＡ配列を示す図である。 第３図は改良型卵白リゾチームシグナルペプチドのＤＮ
Ａ配列を示す図である。 第４図、第５図及び第６図は本発明で用いるヒト・リゾ
チーム分泌発現プラスミドの構築図であり、第７図は本
発明で用いるヒトＥＧＦ分泌発現プラスミドの構築図で
ある。 第８図は本発明で用いるマルチリンカ−のＤＮＡ配列を
示す図である。
リゾチーム合成遺伝子の合成法を示す図である。 第２図はヒト・リゾチーム遺伝子のＴａｑ−１−ＸｈＯ
■断片のＤＮＡ配列を示す図である。 第３図は改良型卵白リゾチームシグナルペプチドのＤＮ
Ａ配列を示す図である。 第４図、第５図及び第６図は本発明で用いるヒト・リゾ
チーム分泌発現プラスミドの構築図であり、第７図は本
発明で用いるヒトＥＧＦ分泌発現プラスミドの構築図で
ある。 第８図は本発明で用いるマルチリンカ−のＤＮＡ配列を
示す図である。
Claims (6)
- （１）酵母にとって異種の蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ
で形質転換させ、かつ呼吸能が欠損した酵母〔ただし、
サッカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ＾−株を除く〕
。 - （２）遺伝子がヒトリゾチーム遺伝子またはヒトＥＧＦ
遺伝子である特許請求の範囲第１項記載の酵母。 - （３）遺伝子の発現に用いるプロモーターが、グリセラ
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）遺伝
子、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）またはウ
リジン−二リン酸ガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝
子（Ｇａｌ１０）のプロモーターである特許請求の範囲
第１項記載の酵母。 - （４）酵母がサッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＡ７４−
３Ａ（ρ＾−）、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｋ３３−
７Ｂ（ρ＾−）、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＡ８７
−１１Ａ（ρ＾−）またはサッカロミセスセレビシェ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＮＡＸ−５０Ｄ（ρ＾−）である特許請求の範囲第１項
記載の酵母。 - （５）酵母にとって異種の蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ
で形質転換させ、かつ呼吸能が欠損した酵母〔ただし、
サッカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ＾−株を除く〕
を培養し、培養物中に蛋白質を生成蓄積させることを特
徴とする酵母にとって異種の蛋白質の製造法。 - （６）蛋白質がヒトリゾチームまたはヒトＥＧＦである
特許請求の範囲第５項記載の蛋白質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63283716A JP2766651B2 (ja) | 1987-11-13 | 1988-11-11 | 遺伝子の発現を高める方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-285175 | 1987-11-13 | ||
| JP28517587 | 1987-11-13 | ||
| JP63283716A JP2766651B2 (ja) | 1987-11-13 | 1988-11-11 | 遺伝子の発現を高める方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02418A true JPH02418A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2766651B2 JP2766651B2 (ja) | 1998-06-18 |
Family
ID=26555164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63283716A Expired - Fee Related JP2766651B2 (ja) | 1987-11-13 | 1988-11-11 | 遺伝子の発現を高める方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2766651B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004022742A1 (ja) | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Epoch Medical International Inc. | 生理活性物質のスクリーニング方法 |
| JP2006527991A (ja) * | 2003-07-23 | 2006-12-14 | サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク | Ｒｎａを作製するための工業的方法および該方法を行うためのシステム |
-
1988
- 1988-11-11 JP JP63283716A patent/JP2766651B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004022742A1 (ja) | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Epoch Medical International Inc. | 生理活性物質のスクリーニング方法 |
| JP2006527991A (ja) * | 2003-07-23 | 2006-12-14 | サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク | Ｒｎａを作製するための工業的方法および該方法を行うためのシステム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2766651B2 (ja) | 1998-06-18 |
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|---|---|---|---|
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