BRPI0417686B1

BRPI0417686B1 - processos para a produção de uma infusão tendo filtrabilidade realçada e/ou rendimento melhorado do extrato depois da filtração

Info

Publication number: BRPI0417686B1
Authority: BR
Inventors: Viksoe-Nielsen Anders; Thea Joergensen Christel; Lehmann Hylling Christensen Lars; Monica Festersen Rikke
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2019-12-10
Also published as: CN102220191A; DK1706477T3; US9279165B2; EP1706477A1; CN102220192A; MXPA06006748A; CN1918277A; US8679791B2; CN102220191B; RU2376347C2; WO2005059084A1; US20090269818A1; EP2258829A3; PL1706477T3; CN102220193A; CN102220192B; US20070148741A1; BRPI0417686A; US20140170712A1; RU2006126098A

Abstract

"processos para a produção de uma infusão tendo filtrabilidade realçada e/ou rendimento melhorado do extrato depois da filtração, e para reduzir a viscosidade de uma solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido, composição, e, uso de uma composição". a presente invenção diz respeito a uma etapa de brassagem e filtração em um processo de fabricação de bebida fermentada e a uma composição útil na brassagem e etapa de filtração de um processo de brassagem. a infusão é preparada na presença de atividades da enzima compreendendo uma xilanase de uma família gh 10.

Description

“PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE UMA INFUSÃO TENDO FILTRABILIDADE REALÇADA E/OU RENDIMENTO MELHORADO DO EXTRATO DEPOIS DA FILTRAÇÃO.” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito, inter alia, a uma etapa de brassagem e filtração em um processo para a produção de uma bebida alcoólica, tal como cerveja ou uísque, e a uma composição útil na etapa de brassagem e filtração em um tal processo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O uso de enzimas no fabrico de bebida fermentada é comum. A aplicação de enzimas à etapa de brassagem para melhorar a filtrabilidade da infusão e aumentar o rendimento do extrato está descrita na WO 97/42302. Entretanto, existe uma necessidade quanto a melhora da etapa de brassagem e filtração e quanto às composições enzimáticas melhoradas para o uso na etapa de brassagem e filtração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção fornece um processo para a produção de uma infusão tendo filtrabilidade realçada e/ou rendimento melhorado do extrato depois da filtração, que compreende; preparar uma infusão na presença de atividades enzimáticas e filtrar a infusão para se obter um mosto, em que as atividades enzimáticas compreendem; uma xilanase da família da glicosídeo hidrolase 10 presente em uma quantidade de pelo menos 15% p/p da xilanase total e proteína da enzima de endoglicanase.

Em um outro aspecto a invenção fornece um processo para reduzir a viscosidade de uma solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido, o dito processo compreendendo: testar pelo menos uma enzima xilanolítica quanto a sua atividade hidrolítica com respeito à arabinoxilano do trigo insolúvel, selecionando uma enzima xilanolítica que cliva próximo aos resíduos ramificados deixando deste modo oligossacarídeos de xilose substituídos no terminal, e adicionando a enzima xilanolítica selecionada à solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido.

Ainda em um outro aspecto a invenção fornece um processo para reduzir a viscosidade de uma solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido, o dito processo compreendendo: testar pelo menos uma enzima endoglicanolítica quanto a sua atividade hidrolítica com respeito à beta-glicano da cevada, selecionando uma enzima endoglicanolítica que sob as condições: 10 microgramas/ml de enzima purificada e 5 mg/ml de beta-glicano da cevada em 50 mM de acetato de sódio, 0,01% de Triton X-100, no pH 5,5 e 50° C, dentro de 1 hora degrada mais do que 70% do beta-glicano da cevada a DP 6 ou DP<6, e adicionando a enzima endoglicanolítica selecionada à solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido. Já em um outro aspecto a invenção fornece uma composição que compreende; uma GH10 xilanase presente em uma quantidade de pelo menos 15% p/p da proteína de enzima total; e/ou, uma GH12, GH7 e/ou GH5 endoglicanase presente em uma quantidade de pelo menos 40% p/p da proteína de enzima total.

Outros aspectos incluem o uso da composição do aspecto de procedimento em um processo que compreende a redução da viscosidade de uma solução aquosa compreendendo um hidrolisado de amido, incluindo processos tais em que a solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido é uma infusão para fabricar cerveja, ou em que a solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido é intencionada para o uso em uma composição alimentícia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições Por toda esta divulgação, vários dos termos que são no geral entendidos por aqueles de habilidade comum nas técnicas são usados. Vários termos são usados com significados específicos, entretanto, e são intencionados como definido pelos seguintes.

Como aqui usado o termo “grão moído” é entendido como o material contendo amido ou açúcar que é a base para a produção de cerveja, por exemplo, o malte de cevada e o adjunto. O termo “malte” é entendido como qualquer grão de cereal maltado, em particular cevada. O termo “adjunto” é entendido como a parte do grão moído que não é malte de cevada. O adjunto pode ser qualquer material rico em carboidrato. O termo “infusão” é entendido como uma lama de amido aquoso, por exemplo, que compreende malte de cevada moído, cevada moída, e/ou outro adjunto ou uma combinação destes, macerados em água para fabricar o mosto. O termo “mosto” é entendido como o líquido não fermentado escoado a seguir da extração do grão moído durante a brassagem. O termo “grãos gastos” é entendido como os sólidos drenados que permanecem quando o grão moído foi extraído e o mosto separado da infusão. O termo “cerveja” é aqui entendido como mosto fermentado, por exemplo uma bebida alcoólica fermentada a partir do malte de cevada, opcionalmente adjunto e lúpulo. O termo “recuperação de extrato” no mosto é definido como a soma de substâncias solúveis extraídas do grão moído (malte e adjuntos) expressadas em porcentagem com base na matéria seca. O termo “uma enzima termoestável” é entendido como uma enzima que sob o regime de temperatura e o período de incubação aplicado nos processos da presente invenção nas quantidades adicionadas é capaz de degradação suficiente do substrato em questão. O termo “xilanase Tipo A” é entendido como uma xilanase que cliva polímeros de arabinoxilano próximo aos resíduos ramificados deixando oligossacarídeos de xilose substituídos no terminal. As xilanases Tipo A podem ser identificadas usando o método descrito na seção métodos da presente divulgação O termo “homologia” quando usado relativo a polipeptídeo ou seqüências de DNA e aludido nesta divulgação é entendido como o grau de homologia entre duas seqüências indicando uma derivação da primeira seqüência do segundo. A homologia pode ser adequadamente determinada por meio de programas de computador conhecidos na técnica tais como GAP fornecido no pacote de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, Agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Os seguintes ajustes para a comparação de seqüência de polipeptídeo são usados: penalidade de criação GAP de 3,0 e penalidade de extensão GAP de 0,1. O termo “DP” é o grau de polimerização, aqui usado para o número médio de unidades de glicose nos polímeros em um hidrolisado de polissacarídeo. A numeração de Famílias de Glicosídeo Hidrolase (GH) e Módulos de Ligação de Carboidrato (CBM) aplicados nesta divulgação segue o conceito de Coutinho, P. M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - Carbohydrate-Active Enzymes server at URL: http://aftnb.cnrs- mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html ou altemativamente Coutinho, P. M. & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: a integrated database approach. In “Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation”., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita e T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tóquio, pp. 15-23, e em Boume, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11: 593-600. Este sistema de classificação agrupa glicosídeo hidrolases com base nas similaridades na estrutura primária. Os membros de uma família além disso mostram o mesmo mecanismo catalítico e têm similaridades na estrutura tridimensional global, embora uma família possa conter membros com variação substancial na especificidade de substrato. O nome de Humicola insolens endoglicanases segue o sistema de Karlsson, J. 2000. Fungai Cellulases, Study of hydrolytic properties of endoglucanases from Trichoderma reesei and Humicola insolens. Lund University.

Os processos de fabrico de bebida fermentada são bem conhecidos na técnica, e no geral envolvem as etapas de maltagem, brassagem e fermentação. No processo de fabricação de bebida fermentada tradicional a maltagem serve para o propósito de converter amido insolúvel em amido solúvel, reduzir proteínas complexas, geração de cor e compostos de sabor, gerar nutrientes para o desenvolvimento de levedura, e o desenvolvimento de enzimas. As três etapas principais do processo de maltagem são maceração, germinação, e estufagem. A maceração inclui misturar os grãos de cevada com água para elevar o nível de umidade e ativar os processos metabólicos do grão dormente. Na etapa seguinte, a cevada úmida é germinada mantendo-a em uma temperatura e nível de umidade adequadas até que a modificação adequada, isto é, tais como a degradação de amido e ativação de enzimas, tenha sido obtidas. A etapa final é secar o malte verde na estufa. O regime de temperatura na estufa determina a cor do malte de cevada e a quantidade de enzimas que sobrevivem para o uso no processo de brassagem. A estufagem em temperatura baixa é mais apropriada para os maltes quando é essencial preservar a atividade enzimática. Os maltes estufados em temperaturas altas têm muito pouca ou nenhuma atividade enzimática mas são muito altos em coloração tal como açúcares caramelizados assim como em compostos aromatizantes. A brassagem é o processo de converter o amido do malte de cevada moído e adjuntos sólido em açúcares fermentáveis e não fermentáveis para produzir o mosto da composição desejada. A brassagem tradicional envolve misturar malte de cevada moído e adjuntos com água a uma temperatura e volume ajustados para continuar as mudanças bioquímicas iniciadas durante o processo de maltagem. O processo de brassagem é conduzido em um período de tempo em várias temperaturas de modo a ativar as enzimas do malte endógenas responsáveis pela degradação de proteínas e carboidratos. De longe a mudança mais importante realizada na brassagem é a conversão de moléculas de amido em açúcares fermentáveis. As enzimas principais responsáveis pela conversão de amido em um processo de brassagem tradicional são alfa- e beta-amilases. A alfa-amilase muito rapidamente reduz amido insolúvel e solúvel pela divisão das moléculas de amido em muitas cadeias mais curtas que podem ser atacadas pela beta-amilase. O dissacarídeo produzido é a maltose.

Tradicionalmente a cerveja lager tem freqüentemente sido fermentada usando um método aludido como “infusão por etapa”. Este procedimento de brassagem envolve uma série de repousos em várias temperaturas, cada uma favorecendo uma das atividades de enzima endógena necessárias. Atualmente o sistema de infusão de infusão dupla é o sistema mais amplamente usado para a produção industrial de cerveja, especialmente a cerveja do tipo lager. Este sistema prepara duas infusões separadas. Ele utiliza um cozedor de cereal para ferver adjuntos e uma tonel de infusão para maltes muito enzimaticamente ativos, bem modificado.

Quando do fabrico de bebida fermentada a partir de grãos moídos baixos em enzimas tais como grãos moídos de adjunto alto, a brassagem pode ser realizada na presença de composições de enzima adicionada que compreendem as enzimas necessárias para a hidrólise do amido do grão moído. Estas enzimas podem compreender alfa-amilases, pululanases, beta-amilases e glicoamilases.

Depois da brassagem, é necessário separar o extrato líquido (o mosto) dos sólidos (grãos gastos isto é, o grão insolúvel e o material de casca que forma parte do grão moído). A separação do mosto é importante porque os sólidos contêm quantidades grandes de polissacarídeos que não amido, proteína, amido escassamente modificado, material graxo, silicatos, e polifenóis (taninos). Os polissacarídeos que não de amido importantes presentes nos grãos de cereal são beta-glucano e arabinoxilano. A parede celular endospermática da cevada compreende 75% de beta-glucano, 20% de arabinoxilano, e 5% de proteína remanescente com pequena quantidade de celulose, glicomanana e ácidos fenólicos. As cadeias longas dos arabinoxilanos da cevada, e em um grau menor beta-glucano, que não foram modificados devido à hidrólise enzimática pode causar a formação de géis quando solubilizados em água, estes géis aumentarão fortemente a viscosidade do mosto e reduzirão a filtrabilidade. Do mesmo modo é muito importante para a qualidade do mosto que o beta-glucano seja reduzido a oligômeros menores, como beta-glicanos não modificados se não mais tarde darão origem a problemas de estabilidade de turvação na cerveja final. Portanto, as composições enzimáticas que compreendem endoglicanases e xilanases, tais como Ultraflo® ou Viscozyme®, são freqüentemente usado na etapa de brassagem para melhorar a separação do mosto. Os objetivos da separação de mosto, inter alia, incluem o seguinte: • para se obter boa recuperação de extrato, • para se obter boa filtrabilidade, e • para produzir mosto claro. 4 A recuperação e a filtrabilidade da extração são importantes para a economia no processo de fabricação de bebida fermentada, enquanto que a limpidez do mosto é uma obrigação de modo a produzir uma cerveja que não desenvolva turbidez. A recuperação da extração, filtrabilidade e limpidez do mosto são enormemente afetados pelo padrão do grão moído, por exemplo o malte de cevada e os tipos de adjunto, assim como o procedimento de brassagem aplicado. A seguir da separação do mosto dos grãos gastos o mosto pode ser fermentado com levedura de cervejeiro para produzir uma cerveja.

Informação adicional sobre os processos de fabrico de bebida fermentada convencionais pode ser encontrada em “Technology Brewing and Malting” por Wolfgang Kunze do Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 2a Edição revisada 1999, ISBN 3-921690-39-0.

Formas de realização da invenção A invenção fornece um processo para a produção de uma infusão tendo filtrabilidade realçada e/ou rendimento melhorado do extrato depois da filtração, que compreende; preparar uma infusão na presença de atividades enzimáticas e filtrar a infusão para se obter um mosto, em que as atividades enzimáticas compreendem; uma xilanase da família GH 10 presente em uma quantidade de pelo menos 15%, 20%, preferivelmente 25%, tal como pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou ainda 100% p/p da xilanase total e proteína da enzima de endoglicanase.

Em uma forma de realização preferida a xilanase é uma xilanase tipo A, e em uma forma de realização particular a xilanase é uma xilanase tipo A tendo uma relação Ii,3terminai/11,3interna de pelo menos 0,25, tal como pelo menos 0,30, pelo menos 0,40, pelo menos 0,50, ou ainda pelo menos 0,60.

Preferivelmente a xilanase tem um CBM, preferivelmente um CBM da família 1.

Em uma outra forma de realização preferida a xilanase é uma xilanase que no ensaio de ligação de xilanase aqui descrito tem uma relação de ligação de fibra solúvel/insolúvel de cevada de pelo menos 0,50, preferivelmente pelo menos 0,60, mais preferivelmente pelo menos 0,70, tal como 0,80, 0,90, 1,00, 1,10 ou ainda pelo menos 1,20.

Em uma outra forma de realização preferida a xilanase é derivada de um fungo filamentoso tal como de uma cepa de um Aspergillus sp., preferivelmente de Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9), de uma cepa de um Myceliophotora sp., preferivelmente de um Myceliophotora thermophilia (SEQ ID NO: 13), de uma cepa de um Humicola sp., preferivelmente de Humicola insolens (SEQ ID NO: 12). Já em uma outra forma de realização preferida a xilanase é derivada de uma cepa de um Trichoderma sp., preferivelmente de T. reesei tal como a xilanase mostrada na SEQ ID NO: 17. Em uma forma de realização mais preferida a xilanase é derivada de um tem pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, 70%, 80% ou ainda 90% de homologia com qualquer uma das seqüências anteriormente mencionadas.

Em uma outra forma de realização preferida a xilanase é derivada de uma bactéria tal como de uma cepa de um Bacillus, preferivelmente de Bacillus halodurans.

Em uma outra forma de realização preferida a endoglicanase é uma endoglicanase derivada de Humicola sp., tal como a endoglicanase da Humicola insolens (SEQ ID NO:3), ou a endoglicanase de H. insolens (SEQ ID NO:4), de Thermoascus sp., tal como a endoglicanase derivada de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO:6), ou de Aspergillus sp., tal como a endoglicanase derivada de Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO: 16).

Em uma forma de realização preferida a xilanase tem pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, 70%, 80% ou ainda 90% de homologia com qualquer uma das seqüências anteriormente mencionadas. 7 Em uma outra forma de realização preferida pelo menos uma enzima adicional está presente, enzima esta que é arabinofuranosidase. A invenção também fornece um processo para reduzir a viscosidade de uma solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido, o dito processo compreendendo: testar pelo menos uma enzima xilanolítica quanto a sua atividade hidrolítica com respeito à arabinoxilana do trigo insolúvel, selecionando uma enzima xilanolítica que clive junto aos resíduos ramificados deixando deste modo oligossacarídeos de xilose substituídos no terminal, e adicionando a enzima xilanolítica selecionada à solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido. A invenção ainda fornece um processo para reduzir a viscosidade de uma solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido, o dito processo compreendendo: testar pelo menos uma enzima endoglicanolítica quanto a sua atividade hidrolítica com respeito ao beta-glicano da cevada, selecionando uma enzima endoglicanolítica que sob as condições: 10 microgramas/ml de enzima purificada e 5 mg/ml de beta-glicano da cevada em 50 mM de acetato de sódio, 0,01% de Triton X-100, no pEl 5,5 e 50° C, dentro de 1 hora degrada mais do que 70% do beta-glicano da cevada ao DP 6 ou DP<6, e adicionando a enzima endoglicanolítica selecionada à solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido.

Em formas de realização preferidas dos dois processos a solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido é uma infusão para fabricar cerveja. A invenção também fornece uma composição que compreende; uma GH10 xilanase presente em uma quantidade de pelo menos 15% p/p da proteína de enzima total; e/ou, uma GH12, GE17 e/ou GH5 endoglicanase presente em uma quantidade de pelo menos 40% p/p da proteína de enzima total.

Em uma forma de realização preferida a xilanase da composição é uma xilanase tipo A, e preferivelmente uma xilanase tipo A tendo uma relação Ii,3terminai/Ii,3intema de pelo menos 0,25, tal como pelo menos 0,30, pelo menos 0,40, pelo menos 0,50, ou ainda pelo menos 0,60.

Em uma forma de realização preferida a xilanase da composição é derivada de um fungo filamentoso tal como de uma cepa de um Aspergillus sp., preferivelmente de Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9), de uma cepa de um Myceliophotora sp., preferivelmente de um Myceliophotora thermophilia (SEQ ID NO: 13), de uma cepa de um Humicola sp., preferivelmente de Humicola insolens (SEQ ID NO: 12). Em uma forma de realização preferida a xilanase da composição tem pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, 70%, 80% ou ainda 90% de homologia a qualquer uma das seqüências anteriormente mencionadas.

Em uma forma de realização preferida a xilanase da composição é derivada de uma bactéria tal como de uma cepa de um Bacillus, preferivelmente de Bacillus halodurans.

Em uma forma de realização preferida a endoglicanase da composição é uma endoglicanase derivada de Humicola sp., tal como a endoglicanase de Humicola insolens (SEQ ID NO:3), a endoglicanase de H. insolens (SEQ ID NO:4) ou de Thermoascus sp., tal como a endoglicanase derivada de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO:6), ou de Aspergillus sp., tal como a endoglicanase derivada de Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO: 16), ou de Trichoderma sp. preferivelmente de T. reesei e/ou T. viride, tal como a família 5 da endoglicanase mostrada na SEQ ID NO: 18, a família 7 de beta-glicanase mostrada na SEQ ID NO: 19 ou a família 12 da beta-glicanase mostrada na SEQ ID NO:20 Em uma forma de realização preferida a endoglicanase da composição tem pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, 70%, 80% ou ainda 90% de homologia a qualquer uma das seqüências anteriormente mencionadas. >

Em uma forma de realização preferida a xilanase GH família 10 da composição está presente em uma quantidade de pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 25%, tal como pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou ainda pelo menos 50% p/p da xilanase total e proteína da enzima de endoglicanase.

Em uma forma de realização preferida a endoglicanase da Família GH 12, 7 e/ou 5 da endoglicanase da composição está presente em uma quantidade de pelo menos 25%, preferivelmente 30%, tal como pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou ainda pelo menos 50%, tal como pelo menos 55%, ou ainda pelo menos 60% p/p da xilanase total e proteína da enzima de endoglicanase. A composição de acordo com o aspecto procedente pode ser usada em um processo que compreende reduzir a viscosidade de uma solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido. A composição pode ser ainda usada em um processo que compreende a filtração de uma solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido. Em uma forma de realização preferida a solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido é uma infusão para fabricar cerveja, e em uma outra forma de realização preferida a solução aquosa que compreende um hidrolisado de amido é uma composição alimentícia. O processo da invenção pode ser aplicado na brassagem de qualquer grão moído. De acordo com a invenção o grão moído pode compreender qualquer material vegetal contendo amido e/ou açúcar derivável de qualquer planta e parte de planta, incluindo tubérculos, raízes, caules, folhas e sementes. Preferivelmente o grão moído compreende grão, tal como grão de cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz, sorgo, painço e sorgo, e mais preferivelmente, pelo menos 10%, ou mais preferivelmente pelo menos 15%, ainda mais preferivelmente pelo menos 25%, ou o mais preferivelmente pelo menos 35%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% ou ainda 100% (p/p) do grão moído do mosto é derivado de grão. O mais preferivelmente o grão moído compreende grão maltado, tal como malte de cevada. Preferivelmente, pelo menos 10%, ou mais preferivelmente pelo menos 15%, ainda mais preferivelmente pelo menos 25%, ou o mais preferivelmente pelo menos 35%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% ou ainda 100% (p/p) do grão moído do mosto é derivado de grão maltado.

Para brassagem de grãos moídos de malte baixo as enzimas de brassagem podem ser exogenamente fornecidas. As enzimas a maioria das vezes usadas como enzimas que degradam amido incluem pululanases, alfa-amilases e amiloglicosidases. O uso de enzimas que degradam amido na brassagem é bem conhecido pela pessoa habilitada.

Adjunto que compreende carboidratos facilmente fermentáveis tais como açúcares ou xaropes pode ser adicionado à infusão de malte antes, durante ou depois do processo de brassagem da invenção mas é preferivelmente adicionado depois do processo de brassagem. Uma parte do adjunto pode ser tratada com uma protease e/ou uma endoglicanase, e/ou tratada por calor antes de ser adicionada à infusão da invenção.

Durante o processo de brassagem, o amido extraído do grão moído é gradualmente hidrolisado em açúcares fermentáveis e dextrinas menores. Preferivelmente a infusão é negativa em amido no teste de iodo, antes da separação do mosto. A aplicação das atividades de xilanase e endoglicanase apropriadas no processo da presente invenção resulta na redução eficiente do nível de beta-glicano e arabino-xilano facilitando a separação do mosto, garantindo assim tempo de ciclo reduzido, recuperação de extrato alta e mosto claro. O mosto produzido pelo processo do primeiro aspecto da invenção pode ser fermentado para produzir uma cerveja. A fermentação do mosto pode incluir arfar o mosto com uma lama de levedura que compreende levedura fresca, isto é, levedura não anteriormente usada pela invenção ou a levedura pode ser levedura reciclada. A levedura aplicada pode ser qualquer levedura adequada para o fabrico de bebida fermentada de cerveja, especialmente leveduras selecionadas de Saccharomyces spp. tais como S. cerevisiae e S. uvarum, incluindo as variantes natural ou artificialmente produzidas destes organismos. Os métodos para a fermentação de mosto para a produção de cerveja são bem conhecidos pela pessoa habilitada nas técnicas. O processo da invenção pode incluir adicionar hidrogel de sílica ao mosto fermentado para aumentar a estabilidade coloidal da cerveja. Os processos podem ainda incluir adicionar terra diatomácea ao mosto fermentado e filtrar para tomar a cerveja brilhante. A cerveja produzida pela fermentação do mosto da invenção pode ser qualquer tipo de cerveja, por exemplo ale, ale forte, stout, porter, lager, pilsner, bitter, cerveja export, malt liquor, happoushu, lambic, barley wine, cerveja de alto teor alcoólico, cerveja de baixo teor alcoólico, cerveja de baixa caloria ou cerveja leve. A cerveja produzida pelo processo da invenção pode ser destilada para recuperar etanol, por exemplo para a produção de uísque. São considerados qualquer tipo de uísque (chamado de “whiskey” nos US e Irlanda) incluem bourbon, uísque canadense, uísque irlandês, de centeio, e uísque escocês.

Xilanase Para os presentes propósitos uma xilanase é uma enzima classificada como EC 3.2.1.8. O nome oficial é endo-l,4-beta-xilanase. O nome sistemático é 1,4-beta-D-xilan xilanoidrolase. Outros nomes podem ser usados, tais como endo-(l-4)-beta-xilanase; (l-4)-beta-xilan 4-xilanoidrolase; endo-l,4-xilanase; xilanase; beta-l,4-xilanase; endo-l,4-xilanase; endo-beta- 1,4-xilanase; endo-l,4-beta-D-xilanase; 1,4-beta-xilan xilanoidrolase; beta- xilanase; beta-l,4-xilan xilanoidrolase; endo-l,4-beta-xilanase; beta-D-xilanase. A reação catalisada é a endoidrólise de ligações de 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos.

Embora a xilanase a ser usada para a presente invenção possa ser de qualquer origem incluindo a origem mamífera, vegetal ou animal é presentemente preferido que a xilanase seja de origem microbiana. Em particular a xilanase pode ser uma derivável de um fungo filamentoso ou uma levedura.

As xilanases fora descobertas em várias espécies fungicas, em particular espécies de Aspergillus, tais como A. niger, A. awamori, A. aculeatus e A. oryzae, Trichoderma, tais como T. reesei ou T. harzianum, Penicíllium, tais como P. camenbertii, Fusarium, tais como F. oxysporum, Humicola, tais como H. insolens, e Thermomyces lanuginosa, tais como T. lanuginosa. As xilanases também foram descobertas em espécies bacterianas, por exemplo dentro do gênero Bacillus, tais como B. pumilus.

Preferivelmente, de acordo com o processo da invenção a xilanase é derivada de um fungo filamentoso tal como de Aspergillus sp., Bacillus sp., Humicola sp., Myceliophotora sp., Poitrasia sp. Rhizomucor sp. ou Trichoderma. A especificidade de substrato foi mostrada ser um parâmetro chave para o desempenho de xilanases no processo da invenção. Uma xilanase com desempenho ótimo no processo da invenção parece ser uma enzima que se liga muito fortemente à arabino-xilano solúvel e muito fracamente à arabino-xilano insolúvel. Preferivelmente a xilanase a ser usada na presente invenção é uma xilanase que no ensaio de ligação na descrição dos métodos desta divulgação tem uma relação de ligação de fibra solúvel/insolúvel de cevada de pelo menos 0,50, preferivelmente pelo menos 0,60, mais preferivelmente pelo menos 0,70, tal como 0,80, 0,90, 1,00, 1,10 ou ainda pelo menos 1,20.

L Várias xilanases identificadas tendo estas características são membros da família 10 de glicosídeo hidrolase. Preferivelmente a xilanase a ser usada na presente invenção é uma xilanase da Família 10 de Glicosídeo Hidrolase (GH10), e o mais preferivelmente a xilanase é uma xilanase GH10 que também é uma xilanase tipo A isto é, uma xilanase que cliva polímeros insolúveis de arabinoxilana do trigo próximo aos resíduos ramificados deixando oligossacarídeos de xilose substituídos no terminal (favor ver os exemplos para uma definição de tipo A e B). Visto que as enzimas GH10 são capazes de ir mais próximo das unidades de xilose ramificadas, elas formam oligossacarídeos menores dos que as xilanases GH11.

Preferivelmente a xilanase a ser usada na presente invenção tem uma CBM funcional, tal como uma CBM da família 1.

Preferivelmente, de acordo com o processo da invenção a xilanase é selecionada da lista que consiste da xilanase de mostrada como, a xilanase de Aspergillus aculeatus mostrada como SEQ ID NO:8 (AA XYL I), a xilanase de Aspergillus aculeatus mostrada como SEQ ID NO:9 (AA XYL II), a xilanase de Bacillus halodurans mostrada como SWISS PROT P07528 (BH XYL A), a xilanase de Humicola insolens mostrada como SEQ ID NO: 12 (HI XYL III), a xilanase de Myceliophotora thermophila mostrada como SEQ ID NO: 13 (MT XYL I), e a xilanase de Trichoderma reesei, tal como a xilanase mostrada como SEQ ID NO: 17. Também preferidas são quaisquer seqüências tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou ainda pelo menos 90% de homologia com qualquer uma das seqüências de xilanase anteriormente mencionadas.

Endoglicanase Para os presentes propósitos uma endoglicanase é uma enzima classificada como EC 3.2.1.4. Embora a endoglicanase a ser usada para a presente invenção possa ser de qualquer origem incluindo origem mamífera, vegetal ou animal é presentemente preferido que a endoglicanase seja de (. origem microbiana. Em particular a endoglicanase pode ser uma derivável de um fungo filamentoso ou uma levedura.

Preferivelmente a endoglicanase é uma glicanase da Família 12 de Glicosídeo Hidrolase (GH12), Família 7 de Glicosídeo Hidrolase (GH7) ou uma Família 5 de Glicosídeo Hidrolase (GH5). Mais preferivelmente a endoglicanase é um polipeptídeo tendo um beta-jelly-roll ou um b8/a8-barrell na superestrutura.

Embora a endoglicanase a ser usada para a presente invenção possa ser de qualquer origem incluindo origem mamífera, vegetal ou animal é presentemente preferido que a endoglicanase seja de origem microbiana. Em particular a endoglicanase pode ser uma derivável de um fungo filamentoso ou uma levedura.

Mais preferivelmente, de acordo com o processo da invenção a endoglicanase é derivada de um fungo filamentoso tal como de Aspergillus sp. ou Humicola sp.

Preferivelmente, de acordo com o processo da invenção a endoglicanase é selecionada da lista consistindo da endoglicanase de Aspergillus aculeatus mostrada na SEQ ID NO:1 (AA EG I), a endoglicanase de Aspergillus aculeatus mostrada na SEQ ID NO:2 (AA EG II), a endoglicanase de Aspergillus aculeatus mostrada na SEQ ID NO: 16 (AA EG

III), a endoglicanase de Humicola insolens mostrada na SEQ ID NO:3 (HI EG I), a endoglicanase de Humicola insolens mostrada na SEQ ID NO:4 (HI EG

III) , a endoglicanase de Humicola insolens mostrada na SEQ ID NO:5 (HI EG IV) , a endoglicanase de Trichoderma sp. mostrada na SEQ ID NO: 18, a endoglicanase de Trichoderma sp. mostrada na SEQ ID NO: 19 ou a endoglicanase de Trichoderma sp. mostrada na SEQ ID NO:20. Também preferidas são quaisquer seqüências tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou ainda pelo menos 90% de homologia a qualquer uma das seqüências anteriormente mencionadas.

Outras glicanases GH12 incluem endoglicanases obtidas de Aspergillus sp. tais como de Aspergillus kawcichii (SWISSPROT Q12679), ou Aspergillus niger (SWISSPROT 074705), Aspergillus oryzae (SWISSPROT 013454), de Erwinia sp., tal como de Erwinia carotovora (SWISSPROT PI 6630), e de Thermotoga sp., tal como de Thermotoga marítima (SWISSPROT Q60032 ou Q9S5X8). Também preferidas são quaisquer seqüências tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou ainda pelo menos 90% homologia a quaisquer das seqüências de glicanases GH12 anteriormente mencionadas.

Outras glicanases GH7 incluem endoglicanases obtidas de Agaricus sp., tais como de Agaricus bisporus (SWISSPROT Q92400), de Aspergillus sp., tais como de Aspergillus niger (SWISSPROT Q9UVS8), de Fusarium sp., tais como de Fusarium oxysporum (SWISSPROT P46238), de Neurospora sp., tais como de Neurospora crassa (SWISSPROT P38676), e de Trichoderma sp., tais como de Trichoderma longibrachiatum (SWISSPROT Q12714). Também preferidas são quaisquer seqüências tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou ainda pelo menos 90% de homologia com qualquer uma das seqüências de GH7 glicanases anteriormente mencionadas.

Outras glicanases GH5 incluem endoglicanases obtidas de Acidothermus sp., tais como de Acidothermus cellulolyticus (SWISSPROT P54583), de Aspergillus sp., tais como de Aspergillus niger (SWISSPROT 074706), e de Bacillus sp., tais como de Bacillus polimyxa (SWISSPROT P23548). Também preferidas são quaisquer seqüências tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou ainda pelo menos 90% de homologia com qualquer uma das seqüências de glicanases GH5 anteriormente mencionadas.

Arabinofuranosidase A arabinofuranosidase EC 3.2.1.55, nome comum alfa-N- arabinofuranosidase hidrolisa resíduos de alfa-L-arabinofuranosídeo não redutores de terminal em alfa-L-arabinosídeos. A enzima atua nos alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanas contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanas e arabinogalactanas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Atividade de Xilanase A atividade xinalolítica pode ser expressada em unidades FXU, determinada no pH 6,0 com remazol-xilano (4-O-metil-D-glicurono-D-xilano tingido com Remazol Azul Brilhante R, Fluka) como substrato.

Uma amostra de xilanase é incubada com o substrato de remazol-xilano. O fundo do substrato tingido não degradado é precipitado pelo etanol. A cor azul remanescente no sobrenadante (como determinado espectrofotometricamente a 585 nm) é proporcional à atividade de xilanase, e as unidades de xilanase são depois determinadas relativamente a um padrão de enzima nas condições de reação padrão, isto é, a 50,0° C, pH 6,0, e 30 minutos de tempo de reação.

Um panfleto AF 293.6/1 que descreve este método analítico em mais detalhes está disponível sob requisição à Novozymes A/S, Dinamarca, panfleto este que é aqui incluído por referência.

Atividade de Glicanase A atividade celulítica pode ser medida em unidades de endoglicanase fungicas (FBG), determinada em um substrato de beta-glicano a 0,5% a 30° C, pH 5,0 e tempo de reação de 30 min. a endoglicanase füngica reage com a beta-glicano liberando glicose ou reduzindo o carboidrato que é determinado como açúcar reduzido de acordo com o método de Somogyi-Nel-son. 1 unidade de endoglicanase fungica (FBG) é a quantidade de enzima que de acordo com as condições padrão esboçadas acima, libera glicose ou reduz carboidrato com uma capacidade de redução equivalente a 1 micromol de glicose por minuto.

Enzimas Ultraflo® L, uma composição de enzima multicomponente derivada de Humicola insolens que compreende uma mistura de endoglicanases, xilanases, pentosanases e arabanases. Ultraflo® L é padronizada a 45 FBG/g, e tem uma gravidade de aproximadamente 1,2 g/ml. Ultraflo® é disponível da Novozymes A/S.

Viscozyme® L, uma composição de enzima multicomponente derivada de Aspergillus aculeatus que compreende uma mistura de endoglicanases, arabanases e xilanases. Viscozyme® L é padronizada a 100 FBG/g, e tem uma gravidade de aproximadamente 1,2 g/ml. Viscozyme é disponível da Novozymes A/S.

Alcalase®, Subtilisina uma composição de protease derivada de Bacillus licheniformis. Alcalase® está disponível da Novozymes A/S.

Termamil SC ®, uma alfa-amilase de Bacillus disponível da Novozymes A/S.

As seguintes endoglicanases e xilanases monocomponentes foram aplicadas: Endoglicanases; AA EG I Aspergillus aculeatus SEQ ID NO: 1 AA EG II Aspergillus aculeatus Cell2b SEQEDNO:2 AA EG III Aspergillus aculeatus Cell2a SEQ ID NO: 16 HI EG I Humicola insolens Cell2a, GH12 SEQIDNO:3. HI EG III Humicola insolens Cell2a, GH12 SEQ ID NO:4. HI EG IV Humicola insolens Cel5a, GH12 SEQIDNO:5 HI EG V Humicola insolens Cel45a, GH45 SEQIDNO:8 TA EG BG025 Thermoascus aurantiacus SEQ ID NO:6 Xilanases AAXILI Aspergillus aculeatus GH10, TipoA SEQBDNO:8 AA XILII Aspergillus aculeatus GH10, TipoA SEQEDNO:9 AA XILIII Aspergillus aculeatus GHll,TipoB SEQEDNOTO

BH XIL UM Bacillus halodurans GH 10, TipoA SWISS PROT P07528. HIXILI Humicola insolens GHll,TipoB SEQIDNO:11 HI XIL III Humicola insolens GH10, TipoA SEQ ID NO: 12 MT XIL I Myceliophotora thermophila GH10, Tipo A SEQ ID NO: 13 MT XIL III Myceliophotora thermophila GH11, Tipo B SEQ ID NO: 14 TLXIL Thermomyces lanuginosus GHll,TipoB SEQIDNO:15 Métodos Preparação de Infusão A menos que de outro modo estabelecido a brassagem foi realizada como segue. Exceto-quando mencionado (por exemplo com respeito à dosagem de enzima) a infusão foi preparada de acordo com EBC: 4.5.1 usando malte moído de acordo com EBC: 1.1. Os testes de brassagem foram realizados em vasos tampados de 500 ml incubados em banho de água com agitação e cada um contendo uma infusão com 50 g de grão moído e ajustado a um peso total de 300 ± 0,2 g com água pré aquecida até a temperatura de incubação inicial + 1° C. O mosto produzido foi ap. 12% de Plato.

Perfil de temperatura de brassagem A menos que de outro modo estabelecido a brassagem foi realizada usando uma temperatura de incubação inicial a 52° C por 30 minutos, seguido por uma etapa crescente a 63° C permanecendo aí por 20 min. O perfil é continuado com uma etapa crescente a 72° C por 30 min, e brassagem a 78° C por 5 min. Todos os gradientes de temperatura escalonados são obtidos por um aumento de 1 ° C/min. A infusão é esfriada a 20° C durante 15 min, que resulta em um período de incubação total de 2 horas e 11 min. Métodos adicionais Os métodos para a análise de produtos brutos, mosto, cerveja etc. podem ser encontrados em Analytica-EBC, Analysis Committee of EBC, the European Brewing Convention (1998), Verlag Hans Carl Geranke-Fachverlag. Para a presente invenção os métodos aplicados para a determinação dos seguintes parâmetros foram como indicado abaixo.

Plato: refratômetro.

Beta-glicano: EBC: 8.13.2 (teor de beta-glicano de peso molecular alto de mosto: Método Fluorimétrico).

Turbidez: EBC: 4.7.1 Filtrabilidade: Determinação do volume de filtrado (ml): De acordo com EBC: 4.5.1 (Extrato de Malte: infusão Congress) subseção 8.2. Filtrabilidade: O volume de filtração é lido depois de 1 hora de filtração através de papel de filtro estriado, 320 mm de diâmetro. Schleicher and Schüll N° 597 Vi, Machery, Nagel and Co. em funis, 200 mm de diâmetro, adaptado em frascos de 500 ml.

Recuperação de extrato: EBC: 4.5.1 (Extrato de Malte: Infusão Congress, Extrato em seco). O termo recuperação de extrato no mosto é definido como a soma de substâncias solúveis (glicose, sacarose, maltose, maltotriose, dextrinas, proteína, gomas, inorgânicos, outras substâncias) extraídas do grão moído (malte e adjuntos) expressada em porcentagem com base na matéria seca. A parte insolúvel remanescente é definida como grãos gastos. onde; E\ = o teor de extrato da amostra, em% (m/m) E\ = o teor de extrato de do grão moído seco, em% (m/m) P = o teor de extrato no mosto, em% de Plato M = o teor de umidade do mosto, em% m/m 800 = a quantidade de água destilada adicionada no mosto para 100 g de grão moído Viscosidade: Microviscosímetro Automatizado (AMVn) é fundamentado no princípio de bola rolante. A amostra a ser medida é introduzida em um capilar de vidro em que uma bola de aço rola. As propriedades viscosas do fluido de teste pode ser determinado medindo-se o tempo de rolagem da bola de aço. O tempo de rolagem t0 de uma bola em uma distância de medição definida em um capilar é medido. A viscosidade dinâmica η da amostra é calculada a partir da constante de calibração Kj(a) do sistema de medição, o tempo de rolagem to e a diferença de densidade Δρ entre a bola e a amostra. A seguinte equação é usada: η = Kx (α). t0. (/?k - ps), onde η = viscosidade dinâmica da amostra, [mPa.s] K (a) = Constante de calibração para o sistema de medição [mPa.scm3/g] tO = Tempo de rolagem para 100 mm [s] pk = densidade da bola [7,85 g/cm3] ps = densidade da amostra medida [g/cm3] A viscosidade é apresentada com base no extrato (Plato°) como tal, ou convertido a 8,6° Plato com base em um procedimento de brassagem Congress.

Exemplo 1. Caracterização de xilanases usando ensaio de ligação Produção de frações de fibra A fração de fibra solúvel de cevada foi produzida como segue: 1. 50 kg de cevada foi moída e formada em pasta fluida em 450 kg de água a 50° C sob agitação. 2. A extração foi realizada por 30 minutos sob agitação. 3. Usando uma centrífuga decantadora pré aquecida a 50° C, e uma centrífuga ejetora de sólidos uma fração isenta de partícula clarificada foi preparada. 4. A fração clarificada foi ultra filtrada a 50° C em uma membrana tubular com um valor de corte de 20000 Daltons. O processo de ultra filtração foi continuado até que a viscosidade aumentasse e o fluxo fosse significantemente reduzido no sistema. 5. A fração concentrada foi coletada e liofilizada. A fração de fibra insolúvel de cevada foi produzida como segue: 1. 50 kg de cevada foram moídos e formados em pasta fluida em 450 kg de água a 50° C. 0,25 kg de Termamil SC foi adicionada e a solução foi aquecida a 85° C sob agitação. A reação foi realizada por 30 minutos. Uma amostra foi tirada para a análise de amido pelo teste de iodo. 2. A amostra foi centrifugada por 5 min a 3000 x g (em frascos de centrífuga de 10 ml). O °Plato foi medido usando-se um refratômetro no sobrenadante. A conversão de amido foi seguida pela reação de cor de iodo; se azul amido persistiu. 3. A reação foi continuada até que o °Plato tenha estabilizado. O produto de reação estava pronto para centrifugação. 4. A centrifugação foi realizada usando um decantador. A separação foi realizada a 75° C, e um sobrenadante claro e isento de partícula foi obtido. Esta fração foi descartada. Apenas a fração sólida foi usada no processo seguinte. 5. A fração sólida coletada foi formada em pasta fluida em 500 kg de água quente. A temperatura desta pasta fluida foi ajustada a 50° C. 6. O pH foi ajustado a 7,5 usando NaOEl. Uma reação de hidrólise foi realizada usando 125 g de Alcalase 2,4 L. Durante a hidrólise o pH foi mantido no pH = 7,5 (pH-stoí) e o tempo de reação foi de 120 minutos. Depois disso, a reação foi deixada agitada sem pH-sto/ em T = 50° C durante a noite. 7. O pH foi depois ajustado a 6,5 usando HC1. 8. A mistura de reação foi centrifugada usando o decantador. 9. A fração sólida foi coletada e lavada com 500 L de água a 50° C por 30 minutos. A etapa de centrifugação e a etapa de lavagem foi repetida. 10. Esta fração sólida lavada foi liofilizada.

Análise da fração de fibra A composição de açúcar das frações de fibra foi analisada i como segue: 1 g de fibra foi adicionado a 50 ml de HC1 1 M e incubada a 100° C por 2 horas com agitação. Depois deste tratamento a mistura de reação foi imediatamente esfriada em gelo e 11 ml de NaOH 4 M foram adicionados para neutralizar a mistura. O conteúdo de arabinose, galactose, glicose e xilose foi quantificado usando um sistema Dionex BioLC equipado com uma coluna CarBoPac PA-1 como descrito em Sorensen et al. (2003) Biotech.

Bioeng. vol. 81, N2 6, p. 726-731. Os resultados são mostrados na tabela 1.

Tabela 1. Conteúdo (g/kg) dos açúcares individuais nas frações de fibra de cevada___________________________________________ ____________________Arabinose Galactose Glicose_____Xilose Fibras solúveis 34,9 14,8 486,6 38,1 Fibras insolúveis 102,3 10,4________42,3________207,2 Ensaio de ligação de xilanases O ensaio de ligação de xilanases foi realizado como segue: a fibra (10 mg) foi lavada em um tubo de Eppendorf misturando-se por turbilhonamento com 500 microL de tampão de acetato (50 mM, pH 5,5, 0,1% de Triton X-100) antes de ser centrifugada por 2 min a 13000 g. A lavagem e centrifugação foi realizada duas vezes. A solução contendo a enzima* (500 microL, em tampão de acetato pH 5,5) foi depois adicionada ao substrato e a mistura foi cuidadosamente misturada por turbilhonamento e mantida em um banho de gelo por 10 min. O tubo de Eppendorf contendo a mistura de reação foi depois centrifugado a 14000 g por 3 min onde depois as atividades inicial e residual foram determinadas usando-se como substrato 0,2% de AZCL-Arabinoxilan do trigo (Megazyme) em 0,2 M de tampão de Na-fosfato pH 6,0 + 0,01% de Triton-x-100. Um frasco com substrato de 900 microL foi pré aquecido a 37° C em um termomisturador. 100 microL de amostra de enzima foram adicionados seguido pela incubação por 15 min a 37° C e agitação máxima. O frasco foi colocado em gelo por 2 min antes de ser centrifugado por 1 min a 20.000 g. A partir do sobrenadante 2 x 200 microL foram transferidos a uma placa microtituladora e o ponto final na OD 590 nm foi medido e comparado em relação a um controle. O controle foi 100 microL de amostra de enzima incubados com 900 microL de tampão de Na-fosfato 0,2 M pH 6,0 + 0,01% de Triton-x-100 ao invés do substrato e subseqüentemente toda a atividade é recuperada no sobrenadante e este valor ajustado a 1. Os resultados são mostrados na tabela 2.

As duas xilanases tendo a relação de fibra de cevada solúvel/insolúvel mais alta, Xilanase II e I de A. aculeatus, foram também as duas xilanases tendo o melhor desempenho nos testes de brassagem.

Exemplo 2. Caracterização da especificidade da xilanase A Ressonância Magnética Nuclear de Alto Campo (*H RMN) foi aplicado para identificar diferenças na especificidade da xilanase com respeito à arabinoxilana do trigo insolúvel (AX) (insolúvel, Megazyme).

Na 'Η RMN, arabinoxilano ou oligossacarídeos deste (AXO) mostram sinais (mudanças químicas) em tomo de 5,0 a 5,5 ppm que surgem dos prótons anoméricos H-l das unidades de α-L-arabinofiiranosídeo. As diferenças individuais entre estes que dependem dos seus ambientes locais podem ser usadas para avaliar a especificidade das xilanases com respeito a este polímero altamente ramificado.

J A condição padrão foi de 10 mg/ml de AX em 50 mM de tampão de acetato, pH 5,5 foi incubados com 0,1 XU/ml por 120 min a 30° C. A xilanase foi depois inativada (95° C, 20 min) e a solução concentrada em um evaporador rotativo. A amostra foi depois evaporada duas vezes a partir de D2O (1 ml) e finalmente recolocada em suspensão em D2O (~0,8 ml) antes de ser analisada. Os espectros de !H RMN foram registrados em um Varian Mercury 400 MHz a 30° C. Os dados foram coletados em 100 escaneamentos e o sinal HDO foi usado como um sinal de referência (4,67 ppm). A degradação de AX com uma xilanase muda os espectros de !H RMN de acordo com a especificidade da enzima. Assim, a mudança química de arabinofuranosídeo H-l muda se a arabinose no oligossacarídeo resultante estiver localizado em uma xilose terminal quando comparada a uma xilose “interna”. Este será o resultado se a xilanase for capaz de colocar uma unidade de xilose substituída no seu subsítio +1. Usando as condições aplicadas foi descoberto que todas as xilanases GH10 testadas foram capazes de fazer isto, ao passo que nenhuma das xilanases GH11 tendo a característica foram encontradas. Tipo A refere-se a uma xilanase que cliva a seguir aos resíduos ramificados (deixando os oligossacarídeos de xilose substituídos no terminal) ao passo que Tipo B refere-se a uma xilanase que cliva apenas entre as unidades de xilose não substituídas internas. As xilanases Tipo A também são capazes de clivar entre unidades de xilose não substituídas. Os exemplos de xilanase Tipo A e Tipo B identificadas pelos inventores são mostrados na tabela 3. Para a invenção uma xilanase tipo A é preferida.

Tabela 3. Exemplos de xilanases Tipo A e Tipo B_____________ Tipo A_________________________Tipo B_______________________ Aspergillus aculeatus Xyl I Biobake (Quest) Aspergillus aculeatus Xyl II Humicola insolens Xyl I Bacillus halodurans Xyl A Myceliophotora thermophila Humicola insolens Xyl III Xyl III

Myceliophotora thermophila Thermomyces lanuginosus Xyl I Xyl I

Mesmo dentro das xilanases Tipo A a preferência para a clivagem a seguir dos resíduos ramificados ou entre xilose não substituída varia como mostrado na tabela 4, onde a relação Ii,3terminai/Ii,3mtema diz respeito à relação entre os integrais respectivos dos dois tipos de prótons. Assim, a clivagem Tipo A resulta em um aumento de Ii,3termmai ao passo que o tipo B não. As mudanças químicas para os dois tipos de prótons são: arabinofuranosídeos ligados em 1,3 H-l na xilose terminal: 5,26 ppm e arabinofuranosídeo ligados em 1,3 H-l na xilose intema: 5,32 ppm. Para a invenção uma xilanase tipo A tendo uma relação Ii,3terminai/Ii,3intema de pelo menos 0,25, tal como pelo menos 0,30, pelo menos 0,40, pelo menos 0,50, ou ainda pelo menos 0,60, é preferida.

Exemplo 3. Caracterização de especificidade de endoglicanase A especificidade de endoglicanases foi estudada analisando-se produtos de degradação na incubação com beta-glicano da cevada. Os tubos Eppendorf com 0,1 e 10 microgramas/ml de enzima purificada e 5 mg/ml de beta-glicano da cevada (Megazyme, viscosidade baixa) em 50 mM de acetato de sódio, 0,01% de Triton X-100 no pH 5,5 foram incubados em um termomisturador de Eppendorf a 50° C com agitação.

As enzimas testadas foram endoglicanase EG I de Humicola insolens, endoglicanase EG III de Humicola insolens, endoglicanase Humicola insolens EG IV, Aspergillus aculeatus EG II (XG5, Cell2B), e Aspergillus aculeatus EG III (XG53, Cell2A).

As amostras foram retiradas entre 1 e 21,5 horas e inativadas por aquecimento por 30 min a 95° C. Metade do volume de cada amostra foi degradada com lichenase (0,085 micrograma/ml, Megazyme, de Bacillus subtilis) em 50 mM de MES, 1 mM de CaCfr, pH 6,5 por 2 horas a 50° C, depois que a lichenase foi inativada por calor a 95° C por 30 min. As amostras com e sem tratamento com lichenase foram diluídas apropriadamente com água Milli Q e analisadas em um sistema Dionex DX-500 HPAEC-PAD (coluna CarboPac PA-100; tampão A: 150 mM de NaOH; tampão B: 150 mM de NaOH + 0,6 M de acetato de sódio; Taxa de fluxo: 1 ml/min. Condições de elução: 0 a 3 min: 95% de A + 5% de B; 3 a 19 min: gradiente linear: 95% de A + 5% de B a 50% de A e 50% de B; 19 a 21 min: gradiente linear: 50% de A + 50% de B a 100% de B; 21 a 23 min: 100% de B). Como referência no sistema Dionex uma mistura de celooligossacarídeos foi usada (DPI a DP6, 100 microM de cada um). Os picos em cromatogramas foram identificados usando as referências de celooligo e composição conhecida de beta-glicano da cevada depois do tratamento com lichenase (por exemplo Izydorczyk, M. S., Macri, L. J., & MacGregor, A. W., 1997, Carbohydrate Polymers, 35, 249-258). A quantificação de picos em cromatogramas foi feita usando fatores de resposta obtidos para as referências de celooligo e assumindo que o fator de resposta foi idêntico para os oligossacarídeos de mesmo DP com ligações beta-1,3. para oligossacarídeos maiores do que o fator de resposta DP6 de DP6 foi usado. A partir da análise de produtos de degradação com EG I de Humicola insolens (Tabelas 5 e 6), foi descoberto que a enzima é capaz de degradar tanto as ligações beta-1,3 quanto as beta-1,4. Inicialmente, celobiose, celotriose e em algum grau laminaribiose são os produtos principais que aumentam depois do tratamento com lichenase. isto indica que as ligações beta-1,3 são aceitas entre unidades de glicose em subsítios -4/-3, -5/-4 e +1/+2. Os produtos principais com dosagem de enzima mais alta (10 microgramas/ml) e tempo de incubação mais longo (21,5 horas) foram descobertos ser glicose e celobiose.

Com EG III de Humicola insolens (Tabelas 7 e 8) os produtos principais depois de 21,5 horas e 10 microgramas/ml de enzima foram tetraoses (principalmente Glu(beta-l,4)Glu(beta-l,3)Glu(beta-l,4) Glu e Glu(beta-l,4)Glu(beta-l,4)Glu(beta-l,3)Glu mas não Glu(beta-l,3)Glu(beta- l,4)Glu(beta-l,4)Glu), pentaoses (de modo provável principalmente Glu(beta- 1.3) Glu(beta-l,4)Glu(beta-l,4)Glu(beta-l,3) Glu e Glu(beta-l,4)Glu(beta- 1.4) Glu(beta-l,3)Glu(beta-l,4)Glu) e oligômeros maiores. A composição de produtos de degradação depois do tratamento com lichenase mostra que a enzima exclusivamente degrada as ligações beta-1,4 em beta-glicano. Além disso, as ligações beta-1,4 que são hidrolisadas são principalmente aquelas não hidrolisadas pelas lichenases (sem ligação beta-1,3 adjacente com respeito à extremidade não redutora). Que a quantidade de Glu(beta- 1.4) Glu(beta-l,3)Glu (“Lic3”) depois do tratamento com lichenase não diminui significantemente mesmo depois de 21,5 horas com 10 microgramas/ml indica que a enzima apenas tem atividade limitada em trechos com apenas duas ligações beta-1,4 entre as ligações beta-1,3. O aparecimento de quantidades significantes de glicose e laminaribiose mas não celobiose ou celotriose depois do tratamento com lichenase indica que as ligações beta-1,3 são aceitas entre as unidades de glicose em subsítios -3/-2 e + 1/+2 mas não entre -4/-3 ou -5/-4. A enzima EG IV de Humicola insolens principalmente degrada a beta-glicano em oligômeros maiores (Tabelas 9 e 10), mas depois de 21,5 horas com 10 microgramas/ml de enzima quantidades substanciais de celobiose e oligômeros de DP4 (provável e principalmente Glu(beta- 1.4) Glu(beta-1,3 )Glu(beta-1,4)Glu e Glu(beta-1,3 )Glu(beta-1,4)Glu(beta- 1.4) Glu) são formados. A enzima degrada cerca de quantidades iguais de ligações beta-1,4 e beta-1,3 em beta-glicano e as ligações beta-1,4 clivadas parecem ser aquelas sem uma ligação beta-1,3 adjacente com respeito à extremidade não redutora (diferente das lichenases). O tratamento com lichenase dá celotriose aumentada já depois da hidrólise limitada com EG IV, ao passo que a celobiose e glicose apenas aparecem depois de hidrólise mais extensiva com EG IV. Isto indica que as ligações beta-1,3 são melhor aceitas entre a glicose em subsítios -5/-4 do que entre -4/-3 e especialmente -3/-2. A aparência de laminaribiose depois do tratamento com lichenase mostra que as ligações beta-1,3 também são aceitas entre a glicose em subsítios +1/+2.

Com Aspergillus aculeatus EGII (XG5, Cell2B), a glicose é observada ser o produto de peso molecular baixo principal (Tabelas 11 e 12). O tratamento com lichenase de amostras com pouca degradação de beta-glicano pela EG II dá aumento de celobiose, celotriose e laminaribiose mas não de glicose. Isto indica que as ligações beta-1,3 são aceitas entre as unidades de glicose nos subsítios -5/-4, -4/-3 e +1/+2 mas provavelmente não -3/-2. Assim, a glicose liberada pela EG II é provavelmente liberada pela exo-ação em produtos de degradação. A enzima é capaz de hidrolisar tanto a ligação beta-1,4 quanto beta-1,3 embora as ligações beta-1,4 pareçam ser preferidas. Depois de 20 horas com a concentração de enzima mais alta, o beta-glicano é observado ser quase totalmente degradado a glicose. O Aspergillus aculeatus EG III (XG53, Cell2A) rapidamente degrada o beta-glicano dando os oligômeros de DP4 (principalmente Glu(beta-1,3)Glu(beta-1,4)Glu(beta-1,4)Glu e Glu(beta-1,3)Glu(beta- 1.4) Glu(beta-l,4)Glu) e DP5 (principalmente Glu(beta-1,4)Glu(beta- 1.4) Glu(beta-l,3)Glu(beta-l,4)Glu mas também alguma Glu(beta- 1.4) Glu(beta-1,3)Glu(beta-1,4)Glu(beta-1,4)Glu e Glu(beta-1,4)Glu(beta- 1.4) Glu(beta-l,4)Glu(beta-l,3)Glu) (Tabelas 13 e 14). Depois de 20 horas com a concentração de enzima mais alta quantidades significantes de celobiose, glicose e celotriose também são formadas. O tratamento com lichenase de amostras dá aumento de glicose, celotriose e laminaribiose e especialmente celobiose. Isto indica que as ligações beta-1,3 podem ser preferidas entre as unidades de glicose nos subsítios -4/-3 mas também são aceitas entre -5/-4, -3/-2 e +1/+2. A enzima é capaz de degradar tanto as ligações beta-1,4 quanto as beta-1,3.

Exemplo 4. Desempenhos de Brassagem e Filtração Um tratamento padrão convencional de Ultraflo® 2,7 mg EP/kg de matéria seca (dm) grão moído (índice 1,000) foi comparado a um tratamento experimental com Ultraflo® 1,4 mg EP/kg dm de grão moído suplementado com várias endoglicanases. Uma dosagem de 0,2 g de Ultraflo® /kg DM de grão moído eqüivale a 2,7 mg de proteína de enzima /kg dm de grão moído.

Ultraflo® 1,4 mg EP/kg dm suplementado com H. insolens EG I, Cel 7b (GE1 7) 8 mg EP/kg dm de beta-glicano reduzido comparado com o tratamento padrão (índice 1,000). O H. insolens, endoglicanase III, (Cel 12a, GE112) e Ultraflo® 1,4 mg EP/kg dm reduziram o beta-glicano, a O.D e a viscosidade enquanto também melhoram a filtrabilidade comparada com o tratamento padrão.

Ultraflo® 1,4 mg EP/kg dm suplementado com a endoglicanase BG025 de T. aurantiacus (GH 5) reduziu o nível de beta-glicano significantemente comparado com o tratamento padrão.

Um tratamento padrão convencional de Ultraflo® 0,2 g/kg DM de grão moído (índice 1,000) foi comparado a um tratamento experimental com Ultraflo® 0,1 g/kg DM de grão moído suplementado com várias xilanases.

Nenhuma das duas xilanases GH 11, tipo B dos fungos Bh e Cc tiveram qualquer efeito positivo sobre o beta-glicano, OD, recuperação de extrato, viscosidade ou filtrabilidade. A xilanase I de Aspergillus aculeatus e a xilanase II de Aspergillus aculeatus reduziram a viscosidade assim como melhoraram a filtrabilidade comparadas com o tratamento padrão.

Um tratamento padrão convencional de Ultraflo® 0,2 g/kg dm de grão moído (índice 1,000) foi comparado com um tratamento experimental com Viscozyme 0,1 g ou 0 g/kg dm de grão moído suplementado com xilanase II de Aspergillus aculeatus e várias endoglicanases.

Uma combinação de Xilanase II de Aspergillus aculeatus e endoglicanase EG III de Aspergillus aculeatus teve um efeito significante no beta-glicano, viscosidade e filtrabilidade.

Uma composição que compreende Viscozyme® 3,6 mg EP/kg dm, Aspergillus aculeatus EG III 2 mg EP/kg dm, e Xilanase II de Aspergillus aculeatus 4 mg EP/kg dm teve um efeito significantemente mais positivo 1 sobre beta-glicano, OD, recuperação de extrato, e viscosidade do que teve uma dosagem de 7,5 vezes a dosagem padrão convencional de Viscozyme® (dosagem padrão = 3,6 mg EP/kg dm) (Tabela 22).

Exemplo 5. Quantificação de faixas de proteína em géis de SDS-PAGE. A composição de enzima foi diluída 250 vezes em água desionizada e carregada em um gel de SDS-PAGE de 4 a 20% de Tris-glicina (Nu Page, Invitrogen) e a eletroforese foi conduzida como descrita pelo fabricante.

Depois da eletroforese o gel foi tingido com GelCode Blue (Pierce) o/n e subseqüentemente descolorido em água até que o fundo tomou-se claro. O gel resultante foi depois escaneado usando um densitômetro e analisado pelo software ImageMaster® v. 1 0 da Amersham Biosciences seguindo o protocolo do fabricante. Os resultados são expressados como% de densidade de faixa da densidade total em uma dada linha. A quantidade total de proteína nas amostras de enzima foi medida usando o kit Micro BCA da Pierce usando o protocolo fornecido com o kit.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para a produção de uma infusão tendo filtrabilidade realçada e/ou rendimento melhorado do extrato depois da filtração, caracterizado pelo fato de que compreende: preparar uma infusão na presença de atividades enzimáticas e filtrar a infusão para se obter um mosto, em que as atividades enzimáticas compreendem: a) uma xilanase pertencente à família GH10 como definido na SEQ ID NO: 9, presente em uma quantidade de pelo menos 15% p/p da proteína de enzima total de xilanase e endoglicanase, e b) uma endoglicanase derivada de Thermoascus aurantiacus como definido na SEQ ID NO: 7, presente em uma quantidade de pelo menos 40% p/p da proteína de enzima total de xilanase e endoglicanase.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a xilanase da família GH10 está presente em uma quantidade de pelo menos 20%, preferencialmente 25%, tal como pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, ou ainda pelo menos 70% p/p da proteína de enzima total de xilanase e endoglicanase.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a endoglicanase pertencente à família GH GH12, GH7 e/ou GH5 está presente em uma quantidade de pelo menos 45%, preferencialmente 50%, tal como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou ainda pelo menos 80% p/p da proteína de enzima total de xilanase e endoglicanase.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma enzima adicional está presente, enzima esta que é selecionada da lista que compreende; arabinofuranosidase, ácido ferúlico esterase e xilan acetil esterase.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende um hidrolisado de amido é uma infusão para fabricar cerveja ou uma composição alimentícia.