JP6003077B2 - 糖加水分解酵素の細胞外発現の増強剤及びその利用 - Google Patents
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Description
本明細書の開示は、糖加水分解酵素の細胞外発現の増強剤及びその利用に関する。
現在、バイオマス原料を資源化する様々な試みがなされている。例えば、CBP（Consolidated Bioprocessing：統合バイオプロセス／糖化発酵同時進行）がある。CBPは、バイオマス原料を糖化するとともに、その糖化物を酵母等で発酵させて有用物質を生産することを目的としている。
この場合、酵母で糖の分解活性の高い糖加水分解酵素を大量に細胞外に分泌したり細胞表層提示させたりすることが必要である。しかしながら、酵母において外来タンパク質を細胞外に分泌させたり細胞表層に提示させたりするには、困難性があるとされている。こうした背景から、例えば、Trichoderma harzianum（トリコデルマ ハージャナム）のエンドグルカナーゼIIのセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）とリンカーとを融合させると当該リパーゼの分泌が促進されることが記載されている（非特許文献１）。
J. K. Junら、Appl. Microbiol. Biotechnol(2004）64, 833-839
非特許文献１では、T. harzianumのエンドグルカナーゼのＣＢＤとリンカーとの双方に融合タンパク質の分泌促進の可能性があると言及し、これらの組み合わせがS. cerevisiaeにおける分泌促進に有用であるとしている。
しかしながら、非特許文献１にはこれ以上の記載はなく、さらなる分泌性の向上については全く記載も示唆もされていない。
そこで、本明細書の開示は、真核細胞での細胞外発現に適した糖加水分解酵素を得ることができる、糖加水分解酵素の細胞外発現の増強剤及びその利用を提供することを一つの目的とする。
本発明者らは、糖加水分解酵素について種々の修飾を試みていたところ、ある種のアミノ酸配列を付加することで、糖加水分解酵素の真核細胞の細胞外発現量が増強されるという知見を得た。また、こうしたアミノ酸配列を多重付加することでさらにその作用が高まるという知見を得た。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。
本明細書の開示によれば、糖加水分解酵素の真核細胞における細胞外発現の増強剤が提供される。この増強剤は、前記糖加水分解酵素に融合されるペプチドであり、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドである。
増強剤は、前記第１のアミノ酸配列を２以上有していてもよいし、前記第１のアミノ酸配列は、Trichoderma （トリコデルマ）属のエンドグルカナーゼにおけるセルロース結合ドメインと触媒ドメインとのリンカー配列であってもよい。さらに、前記糖加水分解酵素は、セルラーゼであってもよく、セルラーゼは、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼのいずれかであってもよい。さらに、前記真核細胞は、酵母であってもよい。
本明細書の開示によれば、糖加水分解酵素の真核細胞における細胞外発現の増強剤が提供される。この増強剤は、前記糖加水分解酵素に融合されるペプチドであり、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本明細書の開示によれば、融合タンパク質も提供される。この融合タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドと、糖加水分解酵素と、を備えている。
融合タンパク質において、前記糖加水分解酵素は、基質結合ドメインと触媒ドメインとを備えており、１又は２以上の前記第１のアミノ酸配列を前記基質結合ドメインと前記触媒ドメインとの間に備えることができる。
本明細書の開示によれば、ポリヌクレオチドも提供される。このポリヌクレオチドは、上記融合タンパク質をコードしている。
本明細書の開示によれば、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、前記融合タンパク質を細胞外発現可能である真核細胞が提供される。
本明細書の開示によれば、前記真核細胞を培養して、前記融合タンパク質を細胞外発現させる、糖加水分解酵素の生産方法が提供される。
本明細書の開示によれば、糖加水分解酵素に対して、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上付与することで、前記糖加水分解酵素の細胞外発現性を改変する方法が提供される。
本明細書の開示によれば、糖加水分解酵素に対して、同種又は異種の糖加水分解酵素が備えている基質結合ドメインと触媒ドメインとのリンカー配列から選択される１又は２以上のリンカー配列を１又は２以上有する被験アミノ酸配列を融合した被験融合タンパク質を細胞外発現可能な真核細胞を準備する工程と、当該準備した真核細胞による前記被験融合タンパク質の細胞外発現量を測定する工程と、を備える、糖加水分解酵素のスクリーニング方法が提供される。
本明細書の開示によれば、セルロースの分解産物の生産方法であって、セルラーゼと、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、前記融合タンパク質を細胞外発現可能な真核細胞の生産するセルラーゼとセルロースとを接触させる工程、を備える、生産方法が提供される。
本明細書の開示によれば、有用物質の生産方法であって、セルラーゼと配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、前記融合タンパク質を細胞外発現可能であって、前記有用物質の生産能を有する真核細胞を、セルロースの存在下に培養する工程、を備える、生産方法が提供される。
本明細書の開示は、糖加水分解酵素の真核細胞における細胞外発現の増強剤及びその利用に関する。本明細書に開示されるこの増強剤は、糖加水分解酵素に融合されて用いられるペプチドであり、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドである。
本増強剤を用いることで、糖加水分解酵素を真核細胞で生産させたときにその細胞外発現、すなわち、例えば、細胞表層提示又は細胞外分泌を増強することができる。このため、真核細胞を用いて糖加水分解酵素を細胞外で機能させたい場合において、あるいは、真核細胞を用いて、細胞外で糖加水分解酵素を回収したい場合において、有用である。さらに、こうした真核細胞の糖加水分解酵素を用いて細胞外において糖を分解し、その分解産物を真核細胞に代謝させて有用物質を生産する発酵に有用である。
従来、外来タンパク質の細胞外発現の増強には、宿主細胞の改変が行われることや、分泌発現システムや細胞表層提示システムの改変があったが、本明細書の開示によれば、糖加水分解酵素サイドで細胞外発現を増強するような改変を実現できた。
以下、本明細書に開示される増強剤及びその利用、すなわち、増強剤を用いた、融合タンパク質、真核細胞、糖加水分解酵素の生産方法、セルロース分解産物の生産方法、有用物質の生産方法等について詳細に説明する。
（増強剤）
本明細書に開示される増強剤は、糖加水分解酵素の真核細胞における細胞外発現の増強剤である。本明細書において細胞外発現とは、特に限定されないが、真核細胞の細胞表層に提示する形態や細胞外に分泌する形態が挙げられる。
本明細書に開示される増強剤は、糖加水分解酵素の真核細胞における細胞外発現の増強剤である。本明細書において細胞外発現とは、特に限定されないが、真核細胞の細胞表層に提示する形態や細胞外に分泌する形態が挙げられる。
（糖加水分解酵素）
本明細書において糖加水分解酵素は、多糖、オリゴ糖、三糖、二糖などを加水分解する酵素をいう。分解対象である糖としては、特に限定されない。典型的には、セルロース、キシラン、アラビノキシラン、キシログルカン、マンナン、グルコマンナン、グルクノキシランなどのヘミセルロース、キチン、キトサン、アガロース、ペクチン、アミロース、アミロペクチンなどの多糖が挙げられる。多糖としては、バイオマス資源を有効利用の観点からは、セルロース、ヘミセルロース、アガロース、ペクチン、キチンが挙げられる。糖加水分解酵素としては、こうした糖を加水分解する酵素が好ましい。典型的には、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどのセルラーゼ（セルロース分解用）、キシラナーゼ、ガラクタナーゼなどのヘミセルラーゼ（ヘミセルロース分解用）、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ（デンプン分解用）などが挙げられる。
本明細書において糖加水分解酵素は、多糖、オリゴ糖、三糖、二糖などを加水分解する酵素をいう。分解対象である糖としては、特に限定されない。典型的には、セルロース、キシラン、アラビノキシラン、キシログルカン、マンナン、グルコマンナン、グルクノキシランなどのヘミセルロース、キチン、キトサン、アガロース、ペクチン、アミロース、アミロペクチンなどの多糖が挙げられる。多糖としては、バイオマス資源を有効利用の観点からは、セルロース、ヘミセルロース、アガロース、ペクチン、キチンが挙げられる。糖加水分解酵素としては、こうした糖を加水分解する酵素が好ましい。典型的には、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどのセルラーゼ（セルロース分解用）、キシラナーゼ、ガラクタナーゼなどのヘミセルラーゼ（ヘミセルロース分解用）、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ（デンプン分解用）などが挙げられる。
セロビオヒドロラーゼとしては、例えば、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼI（ＧＨＦ７）、セロビオヒドロラーゼII（ＧＨＦ６）が挙げられる。また、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のセロビオヒドロラーゼも挙げられる。
エンドグルカナーゼとしては、たとえば、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼのなかでも、好ましくは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。より好ましくはTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼである。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼは、こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼも挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼが挙げられる。こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ７及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよい。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。
糖加水分解酵素は、天然の糖加水分解酵素のほか、適宜改変を加えたものであってもよい。糖加水分解酵素は、当業者であれば、目的に応じて酵素（タンパク質）のアミノ酸配列や当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を入手することができる他、変異体も取得できる。
（真核細胞）
本明細書において真核細胞とは、酵母、麹菌等の真核微生物が挙げられるが、特に限定されない。酵母としては、特に限定されないで、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。
本明細書において真核細胞とは、酵母、麹菌等の真核微生物が挙げられるが、特に限定されない。酵母としては、特に限定されないで、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。
また、麹菌としては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soya）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）等が挙げられる。
また、他の真核微生物としては、セルラーゼ生産微生物である、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）などのトリコデルマ属菌や、白色腐朽菌などを含む木材腐朽菌が挙げられる。セルラーゼ生産微生物を宿主とすることで、これらの微生物が生産うるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等と同時に本タンパク質を生産できる。
本増強剤は、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドである
第１のアミノ酸配列の構成要素である配列番号１で表されるアミノ酸配列は、トリコデルマ・ハージャナム(Trichoderma harsianum)のエンドグルカナーゼIIのセルロース結合ドメイン（CBD）と触媒ドメイン（CD）との間に配置されるリンカー配列である。
第１のアミノ酸配列は、また、配列番号１で表されるアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。以下の表に示すように、配列番号１で表されるアミノ酸配列を後述するBLAST検索を用いて公知の配列を検索すると、５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。本発明者らは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、６４％の同一性を有するTrichoderma reeseiのエンドグルカナーゼIIにおけるCBDとCDとの間のリンカー配列（配列番号４）及び同５５％の同一性を有するTrichoderma virideのエンドグルカナーゼIIにおけるCBDとCDとの間のリンカー配列（配列番号７）についても、その増強効果を確認している。
本明細書において、同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して５５％同一性の範囲内において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された態様が挙げられる。置換や付加されるアミノ酸としては、（セリン、トレオニンン）をはじめする、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）等の保存的置換が挙げられるほか、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）による置換あるいは付加が好ましい。
本明細書の開示を限定するものではないが、第１のアミノ酸配列は、以下の示す特徴の一つ以上を有しているといえる。
（１）セリン（Ｓ）とスレオニン（Ｔ）の比率が全アミノ酸配列において５５％以上である。
（２）アスパラギン（Ｎ）を含んでいない。
（３）Trichoderma属のエンドグルカナーゼに由来し、ＣＢＤとＣＤとのリンカー配列である。
（１）セリン（Ｓ）とスレオニン（Ｔ）の比率が全アミノ酸配列において５５％以上である。
（２）アスパラギン（Ｎ）を含んでいない。
（３）Trichoderma属のエンドグルカナーゼに由来し、ＣＢＤとＣＤとのリンカー配列である。
推論であって本明細書の開示を拘束するものではないが、こうした特徴から、第１のアミノ酸配列は、アスパラギン（Ｎ）を介したＮ型糖鎖修飾が回避又は抑制されるか、セリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）を介したＯ型糖鎖修飾のみが可能となっているものと考えられる。
本増強剤は、こうした第１のアミノ酸配列を１又は２以上を備えている。好ましくは、２以上を備えている。第１のアミノ酸配列を２以上繰り返して有する（タンデムリピート）ことで、一つ有する場合に比較して糖加水分解酵素の細胞外発現量を増大できる。第１のアミノ酸配列は、細胞外発現量を増大できる程度の複数個備えられている。第１のアミノ酸配列の好適な量は、対象とする糖加水分解酵素に第１のアミノ酸配列に１又は２以上を付与して、細胞外発現量を評価することで取得することができる。第１のアミノ酸配列は、例えば、３個以上６個以下であることがより好ましく、さらに好ましくは３個以上５個以下である。
第１のアミノ酸配列を２以上有する場合、２以上のアミノ酸配列は同一であっても異なっていてもよい。また、第１のアミノ酸配列を２以上有する場合、隣り合う第１のアミノ酸配列間には、アミド結合によるアミノ酸残基を備えていなくてもよいし、１又は２以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を備えていてもよい。例えば、遺伝子工学的に第１のアミノ酸配列を複数個連結させたペプチドを取得するには、第１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡに対してアミノ酸に翻訳可能な塩基配列であって制限酵素配列を含む塩基配列を連結部位をとして備えさせることが行われることもある。なお、第１のアミノ酸配列を複数個連結する場合において、当該連結部位には、アミノ酸配列を含まないことが好ましい。
第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドは、糖加水分解酵素に融合（連結）されて用いられるペプチドである。こうしたペプチドを糖加水分解酵素に対して連結することで、この糖加水分解酵素を公知の細胞外発現システム（後述）を用いて細胞外発現させるとき、その細胞外発現量を向上させることができる。
糖加水分解酵素（触媒ドメインのみで機能する場合には当該ドメインのみであってもよい。）に対するかかるペプチドの融合部位は、特に限定しないで、そのＮ末端であってもよいし、Ｃ末端であってもよい。糖加水分解酵素の活性等を考慮すると、Ｎ末端側であることが好ましい。また、糖加水分解酵素が、セルラーゼ等のように、ＣＢＤ等の基質結合ドメインと触媒ドメイン（ＣＤ）を備えるものであっても、同様であるが、好ましくは、基質結合ドメインと触媒ドメインとの間に第１のアミノ酸配列を１又は２以上備えることが好ましい。典型的には、触媒ドメインのＮ末端側であってかつ基質結合ドメインのＣ末端側である。そのＮ末端であることが好ましい。
こうした融合タンパク質は、糖加水分解酵素のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列をコードする塩基配列並びに第１のアミノ酸配列を知得できれば、当業者であれば、遺伝子工学ないしはタンパク質工学に基づき取得することができる。
本明細書に開示される増強剤は、また、第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。かかる増強剤は、真核細胞の形質転換に有用である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。形質転換のためのコンストラクトとしては、ＤＮＡの形態として用いるのが好ましい。ペプチドをコードするコドン用法は、使用する真核細胞の種類等に応じて適宜決定される。
ポリヌクレオチド形態の本増強剤は、ＤＮＡ断片などのポリヌクレオチド断片の形態のほか、各種ベクターに挿入された形態であってもよく、その形態は特に限定されない。ポリヌクレオチド形態の本増強剤は、主として適当な宿主細胞の形質転換を意図した発現ベクターとしての形態を採ることができる。形質転換の手法や宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの保持形態（染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態等）に応じて、上記コード領域以外の構成要素が適宜決定される。典型的には、真核細胞などの形質転換細胞において作動可能なプロモーターの制御下に、増強剤をコードする塩基配列が単独であるいは糖加水分解酵素をコードする塩基配列とともに連結され、さらにターミネーター等が連結されていることが好ましい。
（融合タンパク質）
本明細書に開示される融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドと糖加水分解酵素との融合タンパク質である。本融合タンパク質は、糖加水分解酵素としての活性を有するとともに、公知の細胞外発現システムにおける細胞外分泌性及び細胞表層提示性等が向上されている。
本明細書に開示される融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドと糖加水分解酵素との融合タンパク質である。本融合タンパク質は、糖加水分解酵素としての活性を有するとともに、公知の細胞外発現システムにおける細胞外分泌性及び細胞表層提示性等が向上されている。
本融合タンパク質における、糖加水分解酵素、第１のアミノ酸配列は、本増強剤の実施形態について説明した内容をそのまま適用できる。また、第１のアミノ酸配列と糖加水分解酵素との融合形態も、増強剤の実施形態において既に説明したとおりである。
本融合タンパク質は、当業者であれば、遺伝子工学的又は化学的な合成方法でも取得できる。好ましくは、後述するように、真核細胞における細胞外発現性を利用して、本融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するように真核細胞を形質転換して、真核細胞に本融合タンパク質を生産させる。
好ましい本融合タンパク質は、糖加水分解酵素が、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼであって、基質結合ドメインとしてのセルロース結合ドメインと触媒ドメインとを有するセルラーゼである。そして、第１のアミノ酸配列の１又は２以上が、基質結合ドメインと触媒ドメインとの間に配置されている。
（融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、本融合タンパク質をコードしている。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、形質転換を考慮するとＤＮＡであることが好ましい。融合タンパク質をコードするコドン用法は、使用する真核細胞の種類等に応じて適宜決定される。ポリヌクレオチド形態の本増強剤は、ＤＮＡ断片などのポリヌクレオチド断片の形態のほか、各種ベクターに挿入された形態であってもよく、その形態は特に限定されない。ベクターに挿入された形態においては、真核細胞などの形質転換細胞において作動可能なプロモーターの制御下に連結されていることが好ましく、さらにターミネーター等が連結されていることが好ましい。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、本融合タンパク質をコードしている。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、形質転換を考慮するとＤＮＡであることが好ましい。融合タンパク質をコードするコドン用法は、使用する真核細胞の種類等に応じて適宜決定される。ポリヌクレオチド形態の本増強剤は、ＤＮＡ断片などのポリヌクレオチド断片の形態のほか、各種ベクターに挿入された形態であってもよく、その形態は特に限定されない。ベクターに挿入された形態においては、真核細胞などの形質転換細胞において作動可能なプロモーターの制御下に連結されていることが好ましく、さらにターミネーター等が連結されていることが好ましい。
（本融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持する真核細胞）
本明細書に開示される真核細胞は、本融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、細胞外発現可能である真核細胞である。本真核細胞によれば、細胞外発現性に優れる糖加水分解酵素を生産し、細胞外発現することができる。本真核細胞は、本融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター等で宿主となる真核細胞を周知の方法で形質転換して取得できる。本融合タンパク質に実際に細胞外分泌性や細胞表層提示性を付与するには、公知の分泌シグナルや表層提示用のシステムを用いることができる。例えば、分泌シグナルや凝集性タンパク質又はその一部のアミノ酸配列が付与される。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeやC. albicansのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質としては、α−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。
本明細書に開示される真核細胞は、本融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、細胞外発現可能である真核細胞である。本真核細胞によれば、細胞外発現性に優れる糖加水分解酵素を生産し、細胞外発現することができる。本真核細胞は、本融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター等で宿主となる真核細胞を周知の方法で形質転換して取得できる。本融合タンパク質に実際に細胞外分泌性や細胞表層提示性を付与するには、公知の分泌シグナルや表層提示用のシステムを用いることができる。例えば、分泌シグナルや凝集性タンパク質又はその一部のアミノ酸配列が付与される。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeやC. albicansのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質としては、α−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。
本真核細胞は、２以上の糖加水分解酵素を本融合タンパク質の形態で細胞外発現可能であることが好ましい。多糖などの分解においては、多くの場合、２以上の糖加水分解酵素が協動して作用して効率的な分解が可能となるからである。多糖がセルロースの場合には、本真核細胞は、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼから選択される２種以上を融合タンパク質として細胞外発現可能であることが好ましい。多糖がデンプンの場合には、本真核細胞は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ及びグルコアミラーゼから選択される２種以上を融合タンパク質として細胞外発現可能であることが好ましい。
（糖加水分解酵素の生産方法）
本明細書に開示される糖加水分解酵素の生産方法は、本真核細胞を培養して、糖加水分解酵素を細胞表層に提示又は細胞外に分泌させる工程を備えることができる。本生産方法によれば、糖加水分解酵素を効率的に生産することができ、酵素製剤の使用量を低減又は回避することができる。こうした生産工程は、後述するセルロースの分解方法における分解工程や有用物質の生産方法における分解工程としても実施される。
本明細書に開示される糖加水分解酵素の生産方法は、本真核細胞を培養して、糖加水分解酵素を細胞表層に提示又は細胞外に分泌させる工程を備えることができる。本生産方法によれば、糖加水分解酵素を効率的に生産することができ、酵素製剤の使用量を低減又は回避することができる。こうした生産工程は、後述するセルロースの分解方法における分解工程や有用物質の生産方法における分解工程としても実施される。
（糖加水分解酵素の改変方法）
本明細書に開示される糖加水分解酵素の生産方法は、糖加水分解酵素に対して、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上付与することで、前記糖加水分解酵素の真核細胞における細胞外発現性を改変する方法である。
本明細書に開示される糖加水分解酵素の生産方法は、糖加水分解酵素に対して、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上付与することで、前記糖加水分解酵素の真核細胞における細胞外発現性を改変する方法である。
この方法は、公知の糖加水分解酵素の細胞外発現性を増強するための方法であり、細胞外発現性が増強されるように改変された糖加水分解酵素の生産方法（取得方法）でもある。従来、糖加水分解酵素の細胞外発現性を向上等するには、宿主側の遺伝子を改変したり、あるいは、分泌シグナル等の改変等したりすることが考えられるが、本方法によれば、酵素自体を改変することで、従来の細胞外発現システムを使用しつつ細胞外発現性を向上させることができる。
なお、改変にあたっては、例えば以下のように行うことができる。所望の糖加水分解酵素に対して、１又は２以上の第１のアミノ酸配列を、糖加水分解酵素のいずれかの位置に融合させたいくつかの融合タンパク質をそれぞれ発現可能な真核細胞を作製し、当該融合タンパク質の分泌発現量や培養上清の糖加水分解活性等を評価し、当該評価に基づいて、所望の糖加水分解酵素に対する第１のアミノ酸配列の連結個数や連結位置を決定することができる。
（糖加水分解酵素のスクリーニング方法）
本明細書に開示される糖加水分解酵素のスクリーニング方法は、糖加水分解酵素に対して、同種又は異種の糖加水分解酵素が備えている基質結合ドメインと触媒ドメインとのリンカー配列から選択される１又は２以上のリンカー配列を１又は２以上有する被験アミノ酸配列を融合した被験融合タンパク質を発現可能な真核細胞を準備する工程と、当該準備した真核細胞による前記被験融合タンパク質の細胞外発現量を測定する工程と、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、公知のリンカー配列から、所望の糖加水分解酵素に有用な更なる他のリンカー配列やその個数、さらにはその融合（連結）形態をスクリーニングできる。
本明細書に開示される糖加水分解酵素のスクリーニング方法は、糖加水分解酵素に対して、同種又は異種の糖加水分解酵素が備えている基質結合ドメインと触媒ドメインとのリンカー配列から選択される１又は２以上のリンカー配列を１又は２以上有する被験アミノ酸配列を融合した被験融合タンパク質を発現可能な真核細胞を準備する工程と、当該準備した真核細胞による前記被験融合タンパク質の細胞外発現量を測定する工程と、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、公知のリンカー配列から、所望の糖加水分解酵素に有用な更なる他のリンカー配列やその個数、さらにはその融合（連結）形態をスクリーニングできる。
スクリーニング対象となる被験融合タンパク質は以下のようにして設計する。まず、１又は２以上のリンカー配列が、糖加水分解酵素において知られているリンカー配列から選択することができる。選択されたリンカー配列を単数あるいは複数個連結して被験アミノ酸配列を設計し、糖加水分解酵素のアミノ酸配列のいずれかの位置に連結した被験融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する。
こうして設計したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持するベクターを構築し、当該ベクターで真核細胞を形質転換し、当該真核細胞の培養実験を行い、被験融合タンパク質の細胞外発現量を測定する。細胞外発現量は、細胞外に分泌発現されるように融合タンパク質が設計されている場合には、培養上清における融合タンパク質量を測定し、細胞表層に提示されるように設計されている場合には、培養細胞を用いた糖加水分解活性等を測定する。
細胞外発現量に基づいて、有効なリンカー配列とその個数や加水分解酵素に対するリンカー配列の連結位置を決定することができる。
（セルロース分解産物の生産方法）
セルロースの分解産物の生産方法は、セルラーゼと、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドとの融合タンパク質（セルラーゼ改変体）をコードするＤＮＡを保持し前記融合タンパク質を細胞外発現可能な真核細胞の生産するセルラーゼとセルロースとを接触させる工程、を備えることができる。本生産方法によれば、細胞外発現されるセルラーゼによってセルロースを分解することができる。
セルロースの分解産物の生産方法は、セルラーゼと、配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドとの融合タンパク質（セルラーゼ改変体）をコードするＤＮＡを保持し前記融合タンパク質を細胞外発現可能な真核細胞の生産するセルラーゼとセルロースとを接触させる工程、を備えることができる。本生産方法によれば、細胞外発現されるセルラーゼによってセルロースを分解することができる。
この接触工程においては、前記真核細胞がセルラーゼ改変体を分泌発現するように構築されているときには、培養上清とセルロース含有材料とを接触させてもよい。また、この場合、前記真核細胞をセルロース含有材料の存在下で培養することとしてもよい。この場合、真核細胞は、セルロースを加水分解しつつ増殖等することが可能である。さらに、前記真核細胞が、細胞表層にセルラーゼ改変体を提示可能に構築されている場合には、前記真核細胞細胞をセルロース含有材料の存在下に培養することができる。
なお、セルラーゼとしては、セロビオヒドロラーゼとエンドグルカナーゼとを用いることが好ましい。これらの相乗作用としてセルロースを効率的に分解できる。これらのセルラーゼは、いずれも細胞外発現されることが好ましく、２種を一つの真核細胞で同時発現させることが好ましいが、他の態様であってもよく、いずれか一方を、前記真核細胞外から供給してもよい。
接触工程における処理温度や時間等の条件は、用いるセルラーゼの種類及びセルロースの供給形態によって適宜設定することができる。
本明細書において、セルロースとは、バイオマスから他の成分から分離工程を経たセルロースとして供給されてもよいし、リグニン、ヘミセルロース及び／又はペクチンが共存する未処理あるいは部分的な前処理を施したバイオマスなどセルロースを含有する材料として供給されてもよい。セルロースを含む材料としては、稲ワラ、麦ワラ、バガス、枯れ草等の廃棄資源のほか、未利用資源であってもよく、セルロースを含んでいれば特に限定されない。また、本明細書において、セルロース分解産物としては、セルロースの低分子化物であればよく、グルコース、そのオリゴマー、セロビオース等が挙げられる。
（有用物質の生産方法）
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、セルラーゼと配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドとの融合タンパク質（セルラーゼ改変体）をコードするＤＮＡを保持し、前記融合タンパク質を細胞外発現可能であって、前記有用物質の生産能を有する真核細胞を、セルラーゼの存在下に培養する工程、を備えることができる。
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、セルラーゼと配列番号１で表されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である第１のアミノ酸配列を１又は２以上有するペプチドとの融合タンパク質（セルラーゼ改変体）をコードするＤＮＡを保持し、前記融合タンパク質を細胞外発現可能であって、前記有用物質の生産能を有する真核細胞を、セルラーゼの存在下に培養する工程、を備えることができる。
本生産方法によれば、前記真核細胞がセルラーゼ改変体を効果的に細胞外発現するため、セルラーゼを効率的に糖化でき、分解産物をそのまま前記真核細胞が代謝し、前記真核細胞を有する発酵能（有用物質の生産能）に基づき、有用物質を生産することができる。
本生産方法によれば、いわゆる糖化・発酵同時プロセス（ＣＢＰ）を効率的に行うことができる。なお、前記真核細胞は、セルロースの分解に必要なセロビオヒドロラーゼとエンドグルカナーゼとの双方を細胞外発現するように構築されていることが好ましいが、いずれか一方のみを発現している場合には、他方を外部から供給してもよい。
前記培養工程で用いる真核細胞は、既に説明した真核細胞を用いるが、酵母などのエタノール生産微生物や麹菌等の真核微生物を好ましく用いることができる。真核微生物は、人工的に取得された微生物であってもよい。例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して得られる本来の代謝物でない化合物を産生可能に遺伝子工学的に改変したものであってもよい。このような真核微生物を用いることで、例えば、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリンの生産、プラスチック・化成品原料を生産するなどのバイオリファイナリー技術に適用できる。有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましく、上記したように、バイオリファイナリー技術全般にわたる物質を対象とすることができる。
以上説明した本明細書に開示される実施形態は、いずれも、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて実施することができる。真核微生物などの宿主細胞の形質転換のためのベクター及びその構築方法は、当業者において周知であって、上記書籍等に開示されている。また、形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることも、同様に当業者において周知である。
本明細書または図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組合せによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組合せに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数目的を同時に達成し得るものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作は既出のMolecular Cloningに従い行った。
（リンカーを多重に連結したＤＮＡ断片（リンカー多重連結断片）の構築）
本実施例では、図１に示す方法で図４に示すリンカー多重連結断片を作製した。具体的には、Trichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのリンカー（配列番号１）をコードする１０２ｂｐからなる塩基配列（配列番号８）（ただし、酵母におけるコドン用法による。）を含むオリゴヌクレオチドとこのオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（５'末端はリン酸化修飾されている）を、両端が９ｂｐずれる形で合成した。なお、ずらした９ｂｐはライゲーション時において粘着末端となるように相補的な配列にデザインした。
本実施例では、図１に示す方法で図４に示すリンカー多重連結断片を作製した。具体的には、Trichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのリンカー（配列番号１）をコードする１０２ｂｐからなる塩基配列（配列番号８）（ただし、酵母におけるコドン用法による。）を含むオリゴヌクレオチドとこのオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（５'末端はリン酸化修飾されている）を、両端が９ｂｐずれる形で合成した。なお、ずらした９ｂｐはライゲーション時において粘着末端となるように相補的な配列にデザインした。
合成したオリゴヌクレオチドを９５℃で５分熱変性後、ゆっくり室温まで温度を低下させることでアニールさせ、２本鎖を形成させた。次に、作製した二本鎖オリゴヌクレオチドを、DNAライゲーションキットVer2.1を利用してライゲーションにより多重に連結し、アガロース電気泳動後、５００ｂｐ以上の長さの断片をゲルから切り出した。さらに、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（タカラバイオ）を用いてpUC１９へサブクローニングして、各種のマルチリンカーベクターを作製した。
マルチリンカーベクターを鋳型として２種類のプライマーペアでＰＣＲを行い、様々な長さのリンカー断片を作製後、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kitを用いて挿入することで、任意のCBD-CD間にリンカー多重連結断片を挿入したＤＮＡコンストラクトを構築した。
（多重連結リンカーを含むThCBD1-PcCD断片を保持したベクターの構築）
セロビオヒドロラーゼのモデル遺伝子として、Phanerochaete chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼII（PcCBH2）のCBDを、Trichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのCBDに置換したＤＮＡ断片（ThCBD1-PcCD）を用いた。S. cerevisiaeでの分泌発現ベクターには、pAUR112（タカラバイオ）のSmaＩサイトにTDH3プロモーター−Rhizopus orizaeのグルコアミラーゼのシグナル配列（MQLFNLPLKVSFFLVLSYFSLLVSＡＡ）−CYCターミネータを挿入したｐAUR112-GAPSSRG（図２）を用いた。ｐAUR112-GAPSSRGを、SphＩ、ClaＩで制限酵素処理し、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kitを用いて,Rhizopus oryzaeのグルコアミラーゼ由来のシグナル配列下流にThCBD1-PcCDが来るように、サブクローニングし、図３に示すpAUR112-GAPSSRG-ThCBD1-PcCDを作製した。このとき、挿入したＤＮＡ断片のＣ末端にテトラシステティンタグ（TC：Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys）を挿入することで、TC-FLASH Expression Anaysis Detection kits（Iinvitrogen）を用いて、培養上清の酵素量を測定できるように設計した。
セロビオヒドロラーゼのモデル遺伝子として、Phanerochaete chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼII（PcCBH2）のCBDを、Trichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのCBDに置換したＤＮＡ断片（ThCBD1-PcCD）を用いた。S. cerevisiaeでの分泌発現ベクターには、pAUR112（タカラバイオ）のSmaＩサイトにTDH3プロモーター−Rhizopus orizaeのグルコアミラーゼのシグナル配列（MQLFNLPLKVSFFLVLSYFSLLVSＡＡ）−CYCターミネータを挿入したｐAUR112-GAPSSRG（図２）を用いた。ｐAUR112-GAPSSRGを、SphＩ、ClaＩで制限酵素処理し、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kitを用いて,Rhizopus oryzaeのグルコアミラーゼ由来のシグナル配列下流にThCBD1-PcCDが来るように、サブクローニングし、図３に示すpAUR112-GAPSSRG-ThCBD1-PcCDを作製した。このとき、挿入したＤＮＡ断片のＣ末端にテトラシステティンタグ（TC：Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys）を挿入することで、TC-FLASH Expression Anaysis Detection kits（Iinvitrogen）を用いて、培養上清の酵素量を測定できるように設計した。
次に、実施例１の手法を用いて、pAUR112-GAPSSRG-ThCBD1-PcCDのCBD-CD間にTrichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのリンカーを多重連結し、多重連結リンカー断片を挿入したベクターを作製した。作製したベクターをFrozen-EZ Yeast Transforamation II Kit（Zymo Research）を用いてBJ5465株に形質転換した。
（多様なリンカー長を有するThCBD1-PcCDのS. cerevisiaeでの分泌発現と培養上清を用いたPSC（リン酸膨潤セルロース）の分解活性評価
培養は、９６穴ディープウェルプレートを用いて行った。生育した菌体コロニーを５００μｌのSD−URA液体培地（Yeast Nitorogen Base without amino acid without sulfate １．７ｇ、カザミノ酸１０g、-URAアミノ酸mix０．７７ｇ、グルコース１０g、脱イオン水１０００ｍｌ）に殖菌し、３０℃、２０時間培養した菌液を前培養液とした。１００μｌの前培養液を新たに５００μｌのSD-URA液体培地に殖菌し、３０℃、２０時間培養し本培養を行った。遠心分離により得られた培養上清を粗酵素液として用いてセルロース分解試験を行った。
培養は、９６穴ディープウェルプレートを用いて行った。生育した菌体コロニーを５００μｌのSD−URA液体培地（Yeast Nitorogen Base without amino acid without sulfate １．７ｇ、カザミノ酸１０g、-URAアミノ酸mix０．７７ｇ、グルコース１０g、脱イオン水１０００ｍｌ）に殖菌し、３０℃、２０時間培養した菌液を前培養液とした。１００μｌの前培養液を新たに５００μｌのSD-URA液体培地に殖菌し、３０℃、２０時間培養し本培養を行った。遠心分離により得られた培養上清を粗酵素液として用いてセルロース分解試験を行った。
基質には、０．５％PSCを用いた。基質２００μｌに対して、各DNA断片由来の培養上清を１５μｌ加え、４０℃で２４時間反応後に、遠心上清中の還元糖量をＴＺアッセイ法により測定した。全ての測定は３連で行った。結果を図５に示す。
図５に示すようにリンカー長に応じてPSC分解活性が向上していることがわかった。また、挿入リンカー数が５のときに最大活性を呈することがわかった。
（多様なリンカー長を有するThCBD1-PcCDのS. cerevisiaeでの分泌発現量評価）
実施例３で活性測定した培養上清に含まれるThCBD1-PcCDの量をTC-FLASH Expression Anaysis Detection kitsを用いて測定した。結果を図６に示す。SDS-PAGE後の画像からゾーンデシメトリーにより発現量を数値化し、リンカー挿入なしの場合を１としたときの相対比で示した。図６に示すように、リンカー数に応じて酵母での分泌発現量が向上しており、発現量のピークは挿入リンカー数が５のときであった。この結果は、実施例３で示したPSC分解活性と相関がみられた。
実施例３で活性測定した培養上清に含まれるThCBD1-PcCDの量をTC-FLASH Expression Anaysis Detection kitsを用いて測定した。結果を図６に示す。SDS-PAGE後の画像からゾーンデシメトリーにより発現量を数値化し、リンカー挿入なしの場合を１としたときの相対比で示した。図６に示すように、リンカー数に応じて酵母での分泌発現量が向上しており、発現量のピークは挿入リンカー数が５のときであった。この結果は、実施例３で示したPSC分解活性と相関がみられた。
（多重連結リンカーを含むThCBD1-TrEG2CD断片を保持したベクターの構築）
エンドグルカナーゼのモデル遺伝子として、Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼII（TrEG2）のCBDをTrichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのCBDに置換したDNA断片（ThCBD1-TrEGIICD）を用いた。実施例２と同様に、図７に示したベースとなるベクターを構築した後、実施例１と同様の手法を用いて、CBD-CDの間にTrichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのリンカー（配列番号１）をコードする塩基配列（配列番号８）を0、１、３、４及び５個挿入したDNA断片を構築した（図８）。構築したベクターをFrozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research）を用いてBJ5465株に形質転換した。
エンドグルカナーゼのモデル遺伝子として、Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼII（TrEG2）のCBDをTrichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのCBDに置換したDNA断片（ThCBD1-TrEGIICD）を用いた。実施例２と同様に、図７に示したベースとなるベクターを構築した後、実施例１と同様の手法を用いて、CBD-CDの間にTrichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIのリンカー（配列番号１）をコードする塩基配列（配列番号８）を0、１、３、４及び５個挿入したDNA断片を構築した（図８）。構築したベクターをFrozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research）を用いてBJ5465株に形質転換した。
（多様なリンカー長を有するThCBD1-TrEGIICDのS. cerevisiaeでの分泌発現と培養上清を用いたPSC（リン酸膨潤セルロース）の分解活性評価）
前培養及び本培養を実施例３と同様に行った。本培養の遠心分離により得られた培養上清を粗酵素液として用いて、実施例３と同様にしてセルロース分解試験を行った。結果を図９に示す。
前培養及び本培養を実施例３と同様に行った。本培養の遠心分離により得られた培養上清を粗酵素液として用いて、実施例３と同様にしてセルロース分解試験を行った。結果を図９に示す。
図９に示すように、PcCBH2のみならず、TrEG2であっても、リンカー長に応じて酵母でのPSC分解活性が向上していることがわかった。また、挿入リンカー数が４のとき最大活性を示すことがわかった。
（多様なリンカー長を有するThCBD1-TrEG2のS. cerevisiaeでの分泌発現量評価）
実施例４と同様の手法を用いて、分泌発現量を測定した。結果を図１０に示す。図１０に示すように、リンカー数に応じて酵母での分泌発現量が向上しており、発現量のピークは挿入リンカー数が５のときであった。
実施例４と同様の手法を用いて、分泌発現量を測定した。結果を図１０に示す。図１０に示すように、リンカー数に応じて酵母での分泌発現量が向上しており、発現量のピークは挿入リンカー数が５のときであった。
（野生型PcCBH2、TrEGIIのリンカー多重化の効果の評価）
本実施例では、野生型PcCBH2、TrEGIIにおいて、これら本来的に備えているリンカー（アミノ酸配列：配列番号１５、４、塩基配列：配列番号１６（ただし、酵母におけるコドン用法による。）、１１（ただし、酵母におけるコドン用法による。））をインバースPCR法により２個、３個に多重化して伸長したDNA断片を構築し、実施例２と同様にして、ベクターを構築し、同様にしてBJ5465株に形質転換した。さらに、実施例３、４と同様の手法を用いて培養上清のPSC分解活性と分泌発現量とを測定した。結果を図１１に示す。
本実施例では、野生型PcCBH2、TrEGIIにおいて、これら本来的に備えているリンカー（アミノ酸配列：配列番号１５、４、塩基配列：配列番号１６（ただし、酵母におけるコドン用法による。）、１１（ただし、酵母におけるコドン用法による。））をインバースPCR法により２個、３個に多重化して伸長したDNA断片を構築し、実施例２と同様にして、ベクターを構築し、同様にしてBJ5465株に形質転換した。さらに、実施例３、４と同様の手法を用いて培養上清のPSC分解活性と分泌発現量とを測定した。結果を図１１に示す。
図１１に示すように、PcCBH2のリンカーを多重化しても分解活性も分泌発現量も増加せず、むしろ減少する傾向があった。これに対して、TrEG2のリンカーでは、リンカー多重化に応じて発現量及びPSC分解活性も向上した。
（各種リンカーの配列比較）
ThEG2、TrEG2，PcCBH2のCBD-CD間にあるリンカーアミノ酸配列を比較した。結果を図１２に示す。図１２に示すように、ThEG2及びTrEG2の配列は非常に高い同一性を示したのに対し、てPcCBH2のリンカーは他の２種に対して低い同一性しか持っていなかった。また、BLAST検索により、ThEG2のリンカーとの相同性検索を行った結果を図１３に示す。図１３に示すように、Trichoderma属のエンドグルカナーゼのCBD−CD間のリンカー配列は、高い同一性を持ち、他のセルラーゼのCBD-CD間に多重化して挿入することで酵母における分泌発現量並びに活性を向上できることがわかった。
ThEG2、TrEG2，PcCBH2のCBD-CD間にあるリンカーアミノ酸配列を比較した。結果を図１２に示す。図１２に示すように、ThEG2及びTrEG2の配列は非常に高い同一性を示したのに対し、てPcCBH2のリンカーは他の２種に対して低い同一性しか持っていなかった。また、BLAST検索により、ThEG2のリンカーとの相同性検索を行った結果を図１３に示す。図１３に示すように、Trichoderma属のエンドグルカナーゼのCBD−CD間のリンカー配列は、高い同一性を持ち、他のセルラーゼのCBD-CD間に多重化して挿入することで酵母における分泌発現量並びに活性を向上できることがわかった。
（Trichoderma virideのエンドグルカナーゼIIリンカーによる発現量の向上）
実施例９において、Trichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIリンカーと相同性が５５％であったTrichoderma virideのエンドグルカナーゼIIのリンカーを、ThCBD1とPcCBH2のCDの間に挿入し、酵母における分泌発現量が向上するか否かを確認した。ThCBD1とPcCDとの間にLinkerを備えたＤＮＡ断片ThCBD1-TvLinker−PcCDを作製し、図１４に示すようにして、ｐAUR112-GAPSSRGへサブクローニングした。実施例２，３と同様に、酵母に形質転換した後、PSC分解活性を測定し、挿入前と比較した。結果を図１５に示す。
実施例９において、Trichoderma harzianumのエンドグルカナーゼIIリンカーと相同性が５５％であったTrichoderma virideのエンドグルカナーゼIIのリンカーを、ThCBD1とPcCBH2のCDの間に挿入し、酵母における分泌発現量が向上するか否かを確認した。ThCBD1とPcCDとの間にLinkerを備えたＤＮＡ断片ThCBD1-TvLinker−PcCDを作製し、図１４に示すようにして、ｐAUR112-GAPSSRGへサブクローニングした。実施例２，３と同様に、酵母に形質転換した後、PSC分解活性を測定し、挿入前と比較した。結果を図１５に示す。
図１５に示すように、TvLinkerを挿入したThCBD1−TvLinker−PcCDでは、挿入前のThCBD1−PcCDと比較して、１．２倍程度PSC分解活性が向上しており、TvLinkerでも分泌量が向上することが確認できた。
Claims (21)
- 糖加水分解酵素の真核細胞における細胞外発現の増強剤であって、
前記糖加水分解酵素に融合されるペプチドであり、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７で表されるアミノ酸配列、並びに、
トリコデルマ属のエンドグルカナーゼの触媒活性ドメインとセルロース結合ドメインとのリンカー配列又は前記リンカー配列に由来する配列であって配列番号１で表されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有し前記糖加水分解酵素の前記細胞外発現の増強活性を有するアミノ酸配列から選択される１又は２以上の第１のアミノ酸配列を２個以上をタンデムで有するペプチドである、増強剤。 - 前記リンカー配列に由来する配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の増強剤。
- 前記第１のアミノ酸配列は、Ｎ型糖鎖修飾配列を有していない、請求項１又は２に記載の増強剤。
- 前記第１のアミノ酸配列は、さらに、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）の比率がアミノ酸配列において５５％以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の増強剤。
- 前記ペプチドは、前記第１のアミノ酸配列を６個以下をタンデムで有する、請求項１〜４のいずれかに記載の増強剤。
- 前記ペプチドは、前記第１のアミノ酸配列を３個以上５個以下タンデムで有する、請求項１〜５のいずれかに記載の増強剤。
- 前記糖加水分解酵素は、セルラーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載の増強剤。
- 前記セルラーゼは、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼのいずれかである、請求項７に記載の増強剤。
- 前記真核細胞は、酵母である、請求項１〜８のいずれかに記載の増強剤。
- 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７で表されるアミノ酸配列並びにトリコデルマ属のエンドグルカナーゼの触媒活性ドメインとセルロース結合ドメインとのリンカー配列又は前記リンカー配列に由来する配列であって配列番号１で表されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有し前記糖加水分解酵素の前記細胞外発現の増強活性を有するアミノ酸配列、から選択される１又は２以上の第１のアミノ酸配列を２個以上をタンデムで有するペプチドと、糖加水分解酵素と、を備える融合タンパク質。
- 前記糖加水分解酵素は、セルラーゼである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
- 前記セルラーゼは、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼのいずれかである、請求項１０又は１１に記載の融合タンパク質。
- 前記糖加水分解酵素は、基質結合ドメインと触媒ドメインとを備えており、前記第１のアミノ酸配列を前記基質結合ドメインと前記触媒ドメインとの間に備える、請求項１０〜１２のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項１０〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１０〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、前記融合タンパク質を細胞外発現可能である真核細胞。
- 請求項１５に記載の真核細胞を培養して、前記融合タンパク質を細胞外発現させる、糖加水分解酵素の生産方法。
- 糖加水分解酵素に対して、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７で表されるアミノ酸配列並びにトリコデルマ属のエンドグルカナーゼの触媒活性ドメインとセルロース結合ドメインとのリンカー配列又は前記リンカー配列に由来する配列であって配列番号１で表されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有し前記糖加水分解酵素の前記細胞外発現の増強活性を有するアミノ酸配列、から選択される１又は２以上の第１のアミノ酸配列を２個以上をタンデムで有するペプチドを付与することで前記糖加水分解酵素の細胞外発現性を改変する方法。 - 糖加水分解酵素に対して、トリコデルマ属のエンドグルカナーゼのセルロース結合ドメインと触媒ドメインとのリンカー配列から選択される１又は２以上のリンカー配列を２個以上有する被験ペプチドを融合した被験融合タンパク質を細胞外発現可能な真核細胞を準備する工程と、当該準備した真核細胞による前記被験融合タンパク質の細胞外発現量を測定する工程と、を備える、糖加水分解酵素のスクリーニング方法。
- セルロースの分解産物の生産方法であって、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７で表されるアミノ酸配列並びにトリコデルマ属のエンドグルカナーゼの触媒活性ドメインとセルロース結合ドメインとのリンカー配列又は前記リンカー配列に由来する配列であって配列番号１で表されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有し前記糖加水分解酵素の前記細胞外発現の増強活性を有するアミノ酸配列、から選択される１又は２以上の第１のアミノ酸配列を２個以上をタンデムで有するペプチドとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持して前記融合タンパク質を細胞外発現可能な真核細胞の生産するセルラーゼと、セルロースと、を接触させる工程、
を備える、生産方法。 - 有用物質の生産方法であって、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７で表されるアミノ酸配列並びにトリコデルマ属のエンドグルカナーゼの触媒活性ドメインとセルロース結合ドメインとのリンカー配列又は前記リンカー配列に由来する配列であって配列番号１で表されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有し前記糖加水分解酵素の前記細胞外発現の増強活性を有するアミノ酸配列、から選択される１又は２以上の第１のアミノ酸配列を２個以上をタンデムで有するペプチドとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持して前記融合タンパク質を細胞外発現可能な真核細胞を、セルロースの存在下に培養する工程、
を備える、生産方法。 - 前記真核細胞は酵母である、請求項２０に記載の生産方法。
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