CN111893148A - 用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶 - Google Patents

用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶 Download PDF

Info

Publication number
CN111893148A
CN111893148A CN202010887173.5A CN202010887173A CN111893148A CN 111893148 A CN111893148 A CN 111893148A CN 202010887173 A CN202010887173 A CN 202010887173A CN 111893148 A CN111893148 A CN 111893148A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
xylanase
feed
nucleotide sequence
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010887173.5A
Other languages
English (en)
Inventor
S·L·阿伦特
B·S·劳尔森
E·G·基亚里
L·F·R·米兰
张正宏
R·刘
于哲永
F·K·库伊
J·H·范图伊尔
B·C·库普斯
M·B·彼泽森
S·达尔斯高
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DuPont Nutrition Biosciences ApS
Original Assignee
DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DuPont Nutrition Biosciences ApS filed Critical DuPont Nutrition Biosciences ApS
Publication of CN111893148A publication Critical patent/CN111893148A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A23K10/37—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms from waste material
    • A23K10/38—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms from waste material from distillers' or brewers' waste
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
    • C12C5/004—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/02—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/06—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of starch or raw materials containing starch
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Abstract

本发明涉及用于溶解含阿拉伯木聚糖的物质(尤其是含不溶性阿拉伯木聚糖的物质)的方法，所述方法包括将含木聚糖的物质与木聚糖酶混合。本发明还涉及新木聚糖酶，其包含(或为)SEQ ID No.3、SEQ ID No.2或SEQ ID No.1的多肽序列，或其变体、同源物、片段或衍生物。本发明还涉及与饲料、麦芽制造和酿造、含谷物的物质的加工例如在生物乙醇或生物化学品(例如生物基异戊二烯)生产中、小麦面筋‑淀粉分离工艺等相关的方法。

Description

用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶
本申请是申请日为2013年8月2日的、发明名称为“用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶”的中国专利申请201380051740.1(PCT/EP2013/066255)的分案申请。
发明领域
本发明涉及具有不常见性质的木聚糖酶的应用，所述应用包括饲料、酿造或麦芽制造、处理含有阿拉伯木聚糖的原材料如基于谷物(grain)的物质，例如用于生产生物燃料或其他发酵产物，包括生物化学品(例如生物基异戊二烯)，和/或用于小麦面筋-淀粉分离工业中；和使用这些木聚糖酶的方法，以及包含所述木聚糖酶的组合物(如饲料添加剂组合物)。本发明还涉及具有不常见性质的新木聚糖酶，所述不常见性质使得其可以用于这样的应用，包括饲料、酿造或麦芽制造、处理含有阿拉伯木聚糖的原材料如基于谷物的物质，例如用于生产生物燃料或其他发酵产物，包括生物化学品(例如生物基异戊二烯)，和/或用于小麦面筋-淀粉分离工业中。
发明背景
许多年以来，内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)(在本文中称为木聚糖酶)已经用于改性来源于植物细胞壁材料的复杂糖。本领域所熟知的是，不同木聚糖酶(来源于不同的微生物或植物)的功能十分不同。木聚糖酶是对一类将线性多糖β-1,4-木聚糖降解为木寡糖或木糖从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要成分之一)的酶的命名。
基于结构和遗传信息，已经将木聚糖酶分类至不同的糖苷水解酶(GH)家族(Henrissat,(1991)Biochem.J.280,309-316)。
最初所有已知并表征的木聚糖酶属于GH10或GH11家族。之后，进一步的工作鉴定了属于GH5,GH7、GH8和GH43家族的许多其他类型的木聚糖酶(Collins等(2005)FEMSMicrobiol Rev.,29(1),3-23)。
迄今为止，GH11家族不同于所有其他GH，其是唯一一个仅由木聚糖特异性木聚糖酶组成的家族。可以将GH11木聚糖酶的结构描述成β-Jelly卷结构或全β-链夹层折叠结构(Himmel等1997Appl.Biochem.Biotechnol.63-65,315-325)。GH11酶具有大约20kDa的催化结构域。
GH10木聚糖酶具有分子量在32-39kDa范围内的催化结构域。GH10木聚糖酶的催化结构域的结构由八倍β/α桶组成(Harris等1996-Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401)。
可以获得大量GH10家族酶的三维结构，第一个解析的是变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)木聚糖酶A(Derewenda等J Biol Chem 1994Aug 19；269(33)20811-4)、纤维单胞菌(C.fimi)endo-glycanase Cex(White等Biochemistry 1994Oct 25；33(42)12546-52)和日本纤维弧菌(Cellvibrio japonicus)Xyn10A(先前的萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)木聚糖酶亚种A)(Harris等Structure 994Nov 15；2(11)1107-16.)。作为Clan GHA的成员，它们具有典型的(α/β)8TIM桶折叠，其具有位于β-链4(酸/碱)和7(亲核基团)的C末端上的两个关键活性位点谷氨酸(Henrissat等Proc NatlAcad Sci U S A 1995Jul 18；92(15)7090-4)。
已经在充分表征的纯底物上完成了表征木聚糖酶功能的广泛研究(Kormelink等,1992Characterisation and mode of action of xylanases and some accessoryenzymes.Ph.D.Thesis,Agricultural University Wageningen,Holland(第175页,English and Dutch summaries))。这些研究显示，不同的木聚糖酶在阿拉伯木聚糖(AX)的木糖主链的取代方面具有不同的特殊要求。一些木聚糖酶需要三个未取代的木糖残基，以水解木糖主链；其他仅需要一个或两个。认为特异性上的这些差异的原因是由于催化结构域内的三维结构，其继而依赖于木聚糖酶的一级结构，即氨基酸序列。然而，当木聚糖酶作用于复杂环境，如植物物质，例如饲料中时，将氨基酸序列中的这些差异翻译成木聚糖酶功能的差异迄今为止还没有被文献报道。
传统上，将植物物质，例如小麦中的木聚糖酶底物分为两部分：水不可提取的AX(WU-AX)和水可提取的AX(WE-AX)。对于为什么存在两个不同的AX部分已经有了很多解释。较早的文献(D'Appolonia和MacArthur-(1976,Cereal Chem.53.711-718)和Montgomery和Smith(1955,J.Am.Chem.Soc.77.3325-332)描述了WE-AX与WU-AX之间在取代程度上非常高的差异。最高的取代程度发现于WE-AX。这用于解释为什么一些AX是可以提取的。高的取代程度使得聚合物可溶，相对地较低的取代程度会引起聚合物之间的氢键合以及由此沉淀。
据认为，不同木聚糖酶的功能差异是由于木聚糖酶特异性的差异，由此其对WU-AX或WE-AX底物的偏好性的差异。
已经从近100种不同生物，包括植物、真菌和细菌中报道了木聚糖酶。这些木聚糖酶被分类到40个以上糖基水解酶家族的几个中。糖基水解酶，包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和其他糖酶，基于诸如氨基酸序列、其三维结构及其催化位点的几何学等性质来分类(Gilkes,等,1991,Microbiol.Reviews 55:303-315)。
附图简述
图1显示了本发明的木聚糖酶(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.1)。这是前蛋白原。序列划线(小写)部分反映了可以在酶成熟之前被剪切的N末端信号肽。黑体和斜体显示的氨基酸也可以在酶完全成熟之前通过翻译后修饰而被剪切。
图2显示了本发明的木聚糖酶(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.2)。这是蛋白原。黑体和斜体显示的氨基酸也可以在酶完全成熟之前通过翻译后修饰而被剪切。
图3显示了本发明的木聚糖酶(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.3)。这是酶的活性形式。这在本文中可以称为酶的成熟形式。
图4显示了编码本发明的木聚糖酶(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.4)。粗体小写核苷酸显示了内含子序列。信号序列以粗体显示(大写)。
图5显示了编码本发明的木聚糖酶(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.5)。信号序列以粗体显示(大写)。
图6显示了编码本发明的木聚糖酶(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.6)。
图7显示了用于通过自动化间苯三酚法测定戊聚糖的自动化分析仪的示意图：(a)混有HCl的醋酸；(b)气泡生成器(air bubbling)；(c)乙醇中的间苯三酚；(d)样品；(e)样品加速器；(f)流动室出口；(g)蠕动泵；(h)玻璃线圈；(i)恒温器(96℃)；(j)多波长分光光度计(410、510、550和620nm)；(k)废料；(l)计算机(Rouau&Surget,1994CarbohydratePolymers,24,123-32)。
图8显示了戊聚糖(C-5糖)从小麦麸的释放(戊聚糖的溶解)，作为木聚糖酶剂量的函数。所使用的木聚糖酶是与参照木聚糖酶(即
Figure BDA0002655917430000031
XT)进行比较的本发明木聚糖酶(FveXyn4)。
图9显示了戊聚糖自cDDGS的溶解，作为木聚糖酶剂量的函数。所使用的木聚糖酶是与参照木聚糖酶(即
Figure BDA0002655917430000032
XT)进行比较的本发明的木聚糖酶(FveXyn4)。
图10显示了pZZH254的质粒图谱。
图11显示了FveXyn4的pH活性谱。
图12显示了FveXyn4的温度谱。
图13显示了在体外动物模型(其中pH维持在6.0)中通过FveXyn4对高粘度小麦的粘度减小。
图14显示了对于本发明木聚糖酶FveXyn4和参照酶XylathinTM，起始于pH5.2，全小麦粉中的RVA粘度谱。
图15显示了本发明的木聚糖酶(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.9)。这是前蛋白原。序列划线(小写)部分反映了可以在酶成熟之前被剪切的N末端信号肽。黑体和斜体显示的氨基酸也可以在酶完全成熟之前通过翻译后修饰而被剪切。
图16显示了本发明的木聚糖酶(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.10)。这是蛋白原。黑体和斜体显示的氨基酸也可以在酶完全成熟之前通过翻译后修饰而被剪切。该序列可以是蛋白质的活性形式并且可以是蛋白质的一种活性形式。这在本文中可以称为酶的成熟形式。
图17显示了本发明的木聚糖酶(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.11)。这是酶的另一种活性形式。在一些实施方案中，这在本文中可以称为酶的成熟形式。
图18显示了对于本发明木聚糖酶FoxXyn2和参照酶XylathinTM，在pH5.2开始时，全小麦粉中的RVA粘度谱。
图19显示了编码本发明的木聚糖酶(FoxXyn2)的核苷酸序列(SEQ ID No.12)。黑体的小写核苷酸显示内含子序列。以黑体显示信号序列(大写)。
图20显示了编码本发明的木聚糖酶(FoxXyn2)的核苷酸序列(SEQ ID No.13)。以黑体显示信号序列(大写)。
图21显示了编码本发明的木聚糖酶(FoxXyn2)的核苷酸序列(SEQ ID No.14)。
图22显示了pZZH135的质粒图谱。
图23显示了FoxXyn2的pH谱。
图24显示了FoxXyn2的温度谱。
图25显示了本发明的木聚糖酶(来自镰孢菌属(Fusarium)-FusariumComparative Sequencing Project,Broad Institute of Harvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/))的多肽序列(SEQ ID No.15)。在一些实施方案中，这在本文中可以称为酶的成熟形式。
图26显示了FveXyn4(SEQ ID No.3)、FoxXyn2(SEQ ID No.11)和本文示为SEQ IDNo.15的木聚糖酶的成熟蛋白质的比对。
图27显示了木聚糖酶和蛋白酶单独和组合处理对戊聚糖和蛋白质自不溶性玉米DDGS的溶解的影响。根据单因素方差分析(on-way ANOVA)和Holm-Sidak比较，字母a-d具有显著差异，整体显著水平在P＝0.05。误差线指示了S.D。
图28显示了木聚糖酶和蛋白酶单独和组合处理对戊聚糖和蛋白质自不溶性小麦DDGS的溶解的影响。根据单因素ANOVA和Holm-Sidak比较，字母a-d具有显著差异，整体显著水平在P＝0.05。误差线指示了S.D。
图29显示了戊聚糖自cDDGS的溶解，作为木聚糖剂量的函数。所用的木聚糖酶是本发明的木聚糖酶(FveXyn4和FoxXyn2)。
图30显示了编码来自镰孢菌属的用于本发明的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ IDNo.16)——获自Fusarium Comparative Sequencing Project,Broad Institute ofHarvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。黑体的小写核苷酸显示内含子序列。以黑体显示信号序列(大写)。划线标出与SEQ ID No.4比较的变化。
图31显示了编码来自镰孢菌属的用于本发明的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ IDNo.17)——获自Fusarium Comparative Sequencing Project,Broad Institute ofHarvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。以黑体显示信号序列(大写)。划线标出与SEQ ID No.5比较的变化。
图32显示了编码来自镰孢菌属的用于本发明的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ IDNo.18)——获自Fusarium Comparative Sequencing Project,Broad Institute ofHarvard and MIT(http://www.broadinstitute.org)。划线标出与SEQ ID No.6比较的变化。
发明概述
本发明开创性发现了从轮枝样镰刀菌(Fusarium verticilloides)分离的新木聚糖酶，所述酶具有令人吃惊并且出乎预料的性质。尤其是，该酶在分解(溶解)不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)方面出乎预料的好。惊人的，已发现该酶可以自大范围底物有效分解(溶解)AXinsol，底物包括玉米、小麦、DDGS等，尤其是玉米和基于玉米的底物，特别是小麦(包括基于小麦的)产品和玉米(包括基于玉米的产品)产品。其与已知的酶明显不同，已知的酶经常在溶解玉米或基于玉米的底物中的AXinsol方面表现较差，或在基于小麦和基于玉米两者的底物中无效。
此外，本发明的酶不但特别善于分解(溶解)AXinsol，而且善于有效分解(或降解)溶解的聚合物。通过能够有效(快速)分解(降解)溶解的聚合物(从溶解AXinsol获得)，获得粘度的(快速)减小或使溶解的聚合物(从溶解AXinsol获得)不能促进粘度增加。后一种效果在一些要求保护的应用中至关重要。
不期望被理论所限制，本发明的酶主要释放聚合物，其不能促进粘度，因为所述释放的聚合物是短的。
本发明人第一次分离并测序了这种新的木聚糖酶。
典型地，常规的木聚糖酶可以分解AXinsol，但常常导致混合物粘度的增加。这种增加的粘度在许多应用中是不利的。
不期望被理论所限制，虽然一些常规的木聚糖酶分解AXinsol，但其导致高分子量可溶性降解产物的增加，这导致混合物的粘度增加。
进一步地或备选地，再次不期望被理论所限制，常规的木聚糖酶可以分解AXinsol，但由于它们降解溶解的高分子量产物不够快，混合物的粘度并不理想。相反地，与常规酶相比，使用本发明的方法和用途，木聚糖酶分解AXinsol而不增加粘度和/或快速减小粘度。不期望被理论所限制，据信通过本发明的酶不形成高分子量产物。
已发现，本发明的且如本文所述的酶不仅分解(溶解)大范围底物中的不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)，还有效地保证粘度不升高和/或降低粘度，所述底物包括玉米、小麦、DDGS等，特别是玉米和基于玉米的底物，特别是小麦(包括基于小麦的)产品和玉米(包括基于玉米的)产品。不期望被理论所限制，据信通过本发明的酶不形成高分子量产物。
因此，本发明涉及能溶解戊聚糖，特别是溶解含有木聚糖的原料，例如阿拉伯木聚糖，尤其是不溶性阿拉伯木聚糖的酶。特别的，该酶特别善于溶解广谱底物中的戊聚糖，特别是含有木聚糖的原料，如阿拉伯木聚糖，特别是不溶性阿拉伯木聚糖，所述底物包括基于玉米的底物。
本发明还涉及能够降解AXsol或AXinsol的分解产物的酶，以保证反应混合物中粘度不增加和/或减小。
商品化用于饲料中溶解戊聚糖的许多木聚糖酶是GH11酶。本领域的技术人员一直认为与GH11木聚糖酶相比，GH10木聚糖酶在溶解戊聚糖上并不强，特别是AXinsol。令人吃惊地，已经发现，本文公开的新木聚糖酶(其为GH10木聚糖酶)特别善于降解广谱底物中的AXinsol，包括基于玉米的底物。令人吃惊地，本发明人已经发现，本发明的GH10木聚糖酶比商品化的GH11木聚糖酶在其溶解戊聚糖的能力上表现优异。
本发明酶有效地降解玉米和玉米基底物中的AXinsol的事实是显著有利的，因为玉米与其他谷类，例如小麦和黑麦相比具有多得多的不溶性形式的AX。因而，只有可以分解AXinsol的木聚糖酶可以对以玉米基饲粮(diet)，例如玉米-大豆饲料喂养的动物显示明显益处。
GH10木聚糖酶如此善于在谷类，特别是玉米或基于玉米的底物中降解AXinsol是完全出乎预料的。
本发明的酶能够有效(并快速地)降解聚合物和寡聚物，所述聚合物和寡聚物从降解AXinsol产生或其存在于基于谷物的物质中。这导致本文教导的GH10木聚糖酶出乎预料的优势，即它们特别善于在许多应用中保持低粘度或减小粘度，例如在饲料中；在酿造或麦芽制造中；在基于谷物的葡萄糖生产中，例如用于进一步加工成生物燃料和/或生物化学品(例如，生物基异戊二烯)中；或在小麦面筋-淀粉分离工业中用于生产淀粉等等。
特别已经发现与GH11酶相比，本文测试的GH10酶的降解产物平均更短。这意味着所述降解产物不促成或引起粘度的增加。
基于这些发现，根据本发明的木聚糖酶可用于降解含有木聚糖的原料，尤其是阿拉伯木聚糖，特别是AXinsol。此外或备选地，根据本发明的木聚糖酶可被用于降解产生于AXinsol降解的、或(天然地)存在于基于谷物的物质中的可溶性聚合物(如寡聚物)。令人吃惊的是，已经发现根据本发明的木聚糖酶可被用于降解含有木聚糖的原料，尤其是阿拉伯木聚糖，特别是AXinsol，并且可用于降解产生于AXinsol的降解的可溶性聚合物(如寡聚物)。
此类酶可以用于许多工业中，包括饲料、酿造或麦芽制造、处理含有阿拉伯木聚糖的原材料如基于谷物的物质、小麦面筋-淀粉分离工业、生产淀粉来源的糖浆、生产生物燃料等。
仅通过分离和测试FveXyn 4(SEQ ID No.3)，已经发现了这些令人吃惊且出乎预料的技术效果。之后，可以鉴定其他类似作用酶(例如SEQ ID No.11和/或SEQ ID No.15)。
发明内容
第一个方面，本发明提供包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3所示多肽序列的木聚糖酶、或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少98.5％(例如至少98.8或99或99.1或99.5％)同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或由本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列、或与SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6具有至少97.7％(例如，至少98％、98.5％或99％)同一性的核苷酸序列编码的木聚糖。
在其他方面，本发明提供分离或重组核酸分子，其包含(或为)选自以下的多核苷酸序列：
a.多核苷酸序列，其编码选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列、或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少98.5％(例如至少98.8或99或99.1或99.5％)同一性的变体、同源物、片段或衍生物；或
b.本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的多核苷酸序列；或与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6具有至少97.7％(例如，至少98％、98.5％或99％)同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个方面提供了包含选自以下的多核苷酸序列的载体(例如，质粒)：
a.多核苷酸序列，其编码选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列、或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少98.4％(例如至少98.5％或98.8或99或99.1或99.5％)同一性的变体、同源物、片段或衍生物；或
b.本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的多核苷酸序列；或与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6具有至少97.7％(例如，至少98％、98.5％或99％)同一性的核苷酸序列。
本发明的其他方面提供了包含本发明载体或核酸的宿主细胞，所述核酸包含(或为)本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列；或与SEQ ID No.4、SEQID No.5或SEQ ID No.6具有至少97.7％(例如，至少98％、98.5％或99％)同一性的核苷酸序列。
本发明还涉及用于降解含阿拉伯木聚糖的物质的方法，其包括混合含阿拉伯木聚糖的物质与木聚糖酶，所述木聚糖酶是GH10真菌木聚糖酶，和降解不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)以及降解从AXinsol降解产生的聚合物、寡聚物或其组合，其中所述木聚糖酶降解从AXinsol降解直接或基本上直接产生的聚合物、寡聚物或其组合。
本发明还涉及降解含不溶性阿拉伯木聚糖的物质的方法，其包括混合所述物质与木聚糖酶，其中所述木聚糖包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列、或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
本发明还涉及用于生产葡萄糖或淀粉(例如来自小麦的淀粉或来自淀粉的葡萄糖)的方法，其包括混合含木聚糖的物质(优选含阿拉伯木聚糖的物质，如含不溶性阿拉伯木聚糖的物质)与木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列。
在一个实施方案中，含木聚糖的物质还包含淀粉。
本发明提供木聚糖酶用于降解含木聚糖的物质(优选含阿拉伯木聚糖的物质，如含不溶性的阿拉伯木聚糖的物质)的用途，任选地不增加反应混合物的粘度或还降低其粘度，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了用于改善受试者的表现或用于改善饲料中原料的消化性(例如营养物消化性)或用于改善受试者的饲料效率或用于减小肠内含物的粘度的方法，所述方法包括向受试者施用木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述方法包括向受试者施用轮枝样镰刀菌可获得(或获得)的木聚糖酶。
本发明的又一方面是：木聚糖酶的用途，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶的用途，用于改善受试者表现或用于改善饲料中原料消化性(例如营养物消化性)或用于改善受试者的饲料效率或用于减小肠内含物的粘度的用途。
在另一个方面，本发明提供包含(或基本上为或为)木聚糖酶的饲料添加剂组合物，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
在再一方面，本发明提供包含木聚糖酶和使用说明书的试剂盒，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
在又一方面，本发明提供包含饲料添加剂组合物的饲料，所述饲料添加剂组合物包含(或基本上为或为)木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
本发明提供包含饲料添加剂组合物和至少一种矿物质和/或至少一种维生素的预混合物，所述饲料添加剂组合物包含(或基本上为或为)木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ IDNo.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
在另一个方面，本发明提供制备饲料的方法，其包括混合饲料成分与饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物包含(或基本上为或为)木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ IDNo.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
根据本发明的另一个方面，提供用于降解基于谷物的物质(包括全谷物或部分谷物或发芽谷物，例如发芽大麦)和减小反应介质(例如，谷物糖化醪)的粘度的方法，所述方法包括混合所述基于谷物的物质与木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
本发明的又一方面是木聚糖酶用于降解基于谷物的物质(包括全谷物或部分谷物或发芽谷物，例如发芽大麦)同时减小反应介质(例如，谷物糖化醪)的粘度的用途，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
根据本发明的另一个方面，提供用于生产生物燃料(例如生物乙醇)或生物化学品(例如生物基异戊二烯)的方法，所述方法包括混合基于谷物的物质与木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
本发明的又一方面是木聚糖酶用于生产生物燃料(例如生物乙醇)或生物化学品(例如生物基异戊二烯)的用途，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
根据本发明的另一个方面，提供用于将谷类面粉(例如小麦面粉)分离成淀粉和面筋级分的方法，所述方法包括混合谷类面粉(例如小麦面粉)、水与木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
本发明的又一方面提供木聚糖酶用于将谷类面粉(例如小麦面粉)分离成淀粉和面筋级分同时减小反应介质(例如谷物糖化醪)的粘度的用途，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ IDNo.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得(或获得的)木聚糖酶。
在再一方面，本发明提供木聚糖酶在生产发酵饮料，如啤酒中的用途，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
在又一方面，本发明提供生产发酵饮料(如啤酒)的方法，所述方法包括使糖化醪(mash)和/或麦芽汁(wort)与木聚糖酶接触的步骤，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
本发明的再一方面提供生产发酵饮料(例如啤酒)的方法，其包括步骤：(a)制备糖化醪，(b)过滤所述糖化醪以获得麦芽汁，和(c)发酵所述麦芽汁以获得发酵饮料，如啤酒，其中向(i)步骤(a)的糖化醪和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁和/或(iii)步骤(c)的麦芽汁中加入木聚糖酶，其中所述木聚糖酶包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ IDNo.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
本发明还提供通过本发明的方法生产的发酵饮料，如啤酒。
为了避免疑问，SEQ ID No.3是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的成熟形式。
同样，SEQ ID No.11是SEQ ID No.9或SEQ ID No.10的成熟形式。
本发明优选实施方案的详细公开
除非另有定义，本发明中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。Singleton等,DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,第20版,John Wiley和Sons,New York(1994)和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)向本领域技术人员提供本发明中使用的许多术语的通用词典。
本发明并不限于本文公开的示例性方法和物质，任何与本发明描述的方法和物质相似或等同的方法和物质均可用于本发明具体实施方案的实施或检测。数值范围包括定义该范围的端点值。除非另有说明，任何核酸序列都以5'到3'的方向书写；氨基酸序列由左向右分别按照氨基到羧基的方向书写。
在此提供的标题不构成对本发明不同的方面或实施方案的限制，本发明的各个方面或实施方案可以参照说明书全文而获得。相应的，紧接下文所定义的术语通过参考说明书全文具有更加完整的定义。
本文使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来提及氨基酸。
如本发明所用，术语“蛋白质”，包括蛋白质、多肽和肽。
如本发明所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”意思相同。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”意思相同。
术语“蛋白质”和“多肽”在本发明中可以互换使用。在本发明的说明书和权利要求书中，氨基酸残基可以使用传统的单字母和三字母编码。氨基酸的三字母编码与IUPACIUB生物化学命名联合委员会(JCBN)的定义相同。也可以理解的是，由于遗传密码的简并性，一种多肽可以由一种以上核苷酸序列编码。
其他术语的定义将见于说明书整体。在更详细的描述示例性具体实施方案之前，需要理解的是，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为它们可能，当然，发生变化。也可以理解的是，本发明使用术语的目的只是描述特定的实施方案，并不意味着对其进行限制，因为本发明的保护范围只被后附的权利要求所限定。
当提供数值范围时，应当理解，除非上下文另有明确指示，也具体地公开了数值范围的上下限之间间隔下限单位的十分之一的每个居间值。本发明也包括在一个所述范围中的任何所述数值或居间值与该所述范围中的任何其他所述值或居间值之间形成的每个更小的范围。这些更小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在范围外，本发明也包括上下限的二者、二者之一或无一包括在更小范围内的每个范围，在该所述范围内可以有任何具体排除的界限。在所述范围包括一个或两个端点时，本发明也包括排除所包括的这些端点之一或二者的范围。
必须要注意的是，如本发明说明书以及后附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”涵盖复数形式，除非上下文另有清晰的指示。因此，例如，当言及“一种酶”时其包括该类候选试剂的复数，当言及“该饲料”时其包括一种或更多饲料以及本领域技术人员所熟知的其等同物，等等。
提供了本发明讨论的出版物，只是由于它们公开在本申请的申请日之前。本文的任何内容都不能被理解为承认这样的出版物构成本文所附的权利要求的现有技术。
在动物饲料中常规用作能源、在生物燃料生产中用作供料、在酿造或麦芽制造中用作成分，或在小麦面筋-淀粉分离工艺中用作供料的原材料价格持续增涨，已经导致例如在这些工业的初始底物中使用低成本纤维材料，特别是在动物饲料中使用低成本纤维副产物。
纤维的加入可导致若干不利影响。例如在动物饲料中，加入纤维可导致抗营养作用。动物肠内存在的未降解聚合物导致产生高粘性内含物，结果阻碍扩散并降低了营养吸收。同样，聚合物具有高持水性，妨碍了有效的水分重吸收，并且该水分保持增加了消化道内容物的体积，其导致肠转运时间减少(Englyst&Kingman(1993)，Human Nutrition andDietetics,第9版(Garrow J.S.,James W.P.T.,编辑)第53页)。
在饲料中，半纤维素和纤维素(包括不溶性的阿拉伯木聚糖)也形成物理屏障，包裹(或截留)像淀粉和蛋白质一样的营养物并由此阻止了动物对这些营养物的吸收。
半纤维素和纤维素(包括不溶性的阿拉伯木聚糖(AXinsol))本身也是潜在的能量来源，因为它们由C5和C6糖组成。C6单糖可被动物用作能量来源，而寡C5糖可被动物消化道中存在的微生物群转化为短链脂肪酸(van den Broek等,2008Molecular Nutrition&FoodResearch,52,146-63)，所述短链脂肪酸可以被动物消化道摄取并消化。
因物理屏障降解而从饲料物质释放营养物和水依赖于木聚糖酶降解不溶性纤维组分(例如，不溶性的阿拉伯木聚糖(AXinsol))的能力。
在一个方面，本发明涉及新的木聚糖酶。
在一个实施方案中，本发明提供这样的木聚糖酶，其包含(或为)本文SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3具有至少98.4％(例如至少98.5或98.8或99或99.1或99.5％)同一性的其变体、同源物、片段或衍生物。
本发明还涉及这样的木聚糖酶，其由本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ IDNo.6的核苷酸序列，或可以在高严格条件下与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6具有至少97.7％(例如，至少98％、98.5％或99％)同一性的核苷酸序列编码。
在一个方面，本发明的木聚糖酶可从真菌轮枝样镰刀菌获得(或从其获得)。
在另一个方面，本发明提供从轮枝样镰刀菌可获得的(或获得的)木聚糖酶用于饲料或饲料添加剂组合物。
在一个实施方案中，本发明的木聚糖酶在本文中可以称为FveXyn4或Hifi168。
本发明进一步提供这样的核酸，其包含(或为)本文示为SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列；或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6具有至少97.7％(例如，至少98％、98.5％或99％)同一性的核苷酸序列。
本文教导的多肽序列和核酸序列优选是分离的。
本发明的木聚糖酶优选为GH10木聚糖酶。换言之，所述木聚糖酶可以具有32-39kDa范围的分子量和/或木聚糖酶的催化结构域由八倍β/α桶结构组成(如Harris等1996-Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401中教导)。
在一个方面，本发明提供包含木聚糖酶的组合物，所述木聚糖酶包含(或为)本文示为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列或与SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3具有至少98.5％(例如至少98.8或99或99.1或99.5％)同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或所述木聚糖酶由本文示为SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQID No.6的核苷酸序列、或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6具有至少97.7％(例如，至少98％、98.5％或99％)同一性的核苷酸序列编码。
在一个方面，用于本发明的方法和用途中的木聚糖酶包含(或为)本文示为SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.9或SEQID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(适宜地至少85％或至少90％或至少99％同一性)的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQID No.18具有至少75％同一性(适宜地至少85％、或至少90％、或至少98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列。
在一个方面，用于本发明的方法和用途中的木聚糖酶包含(或为)本文SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少85％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少85％同一性的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
在一个方面，用于本发明的方法和用途中的木聚糖酶包含(或为)本文SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少90％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少90％同一性的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
在一个方面，用于本发明的方法和用途中的木聚糖酶包含(或为)本文SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.15具有至少99％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少98％同一性的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明的木聚糖酶在本文中可以称为FveXyn4(该术语指活性蛋白质，例如成熟蛋白质)。
在一个实施方案中，本发明的木聚糖酶在本文中可以称为FoxXyn2(该术语指活性蛋白质，例如成熟蛋白质)。
在一个实施方案中，木聚糖酶优选是真菌木聚糖酶。
在一个实施方案中，木聚糖酶优选是GH10木聚糖酶。
在一个实施方案中，木聚糖酶优选是真菌GH10木聚糖酶。
在一个实施方案中，木聚糖酶优选是内切木聚糖酶，例如内切1,4-β-d-木聚糖酶。用于内切1,4-β-d-木聚糖酶的分类是E.C.3.2.1.8。
优选地，本发明的木聚糖酶具有约6的最适pH。
优选地，本发明的木聚糖酶在pH 4.6-7，优选5.1-7之间保持70％以上的最大活性。
不希望受理论所限制，pH对酶功效和效率也具有重要的影响。对于饲料应用，特别地本发明木聚糖酶的pH谱有利于在中性条件下小肠中的活性。
优选地，本发明的木聚糖酶具有约60℃的最适温度。
优选地，本发明的木聚糖酶在45℃-64℃之间保持70％以上的最大活性。
在一个实施方案中，本发明的木聚糖酶能够降解(或降解)含木聚糖的物质，特别是阿拉伯木聚糖，特别是不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)。
在另一实施方案中，本发明的木聚糖酶能够降解(或降解)可溶性聚合物(例如，寡聚物)，其中所述可溶性聚合物由AXinsol的降解而产生或(天然)存在于基于谷物的物质中。
在其他实施方案中，本发明的木聚糖酶能够降解(或降解)含木聚糖的物质，特别是阿拉伯木聚糖，特别是AXinsol，和通过降解AXinsol产生的可溶性聚合物(例如寡聚物)。
在一个实施方案中，本发明的木聚糖酶不受小麦木聚糖酶抑制剂，例如蛋白质性抑制剂，例如小麦中的TAXI样蛋白质性抑制剂的影响。现有真菌木聚糖酶可以被小麦蛋白质性抑制剂抑制高达70-95％。优选地，本发明的木聚糖酶在小麦应用中至多仅被抑制20-30％。
TAXI是谷类中存在的小麦(Triticum aestivum)木聚糖酶抑制剂。
本发明使用的术语“基本上为”/"基本上由......组成"(consistingessentially of)是指，如果要求保护的组合物的特征并不受实质性的影响，则可以存在未指明的成分。
术语“为”/"由......组成"(consisting of)是指，特定成分的比例总共必须是100％。
本发明使用的术语“包含”在某些实施方案中可以被修改为指“基本上为”或“为”(两者均较“包含”具有更为限制的含义)。
在一个实施方案中，含有不溶性阿拉伯木聚糖的物质不是小麦秆。
用途
本发明的木聚糖酶可以适宜地用于以下应用中的任何一种：
a)动物饲料中的添加剂；和/或
b)动物的饲料补充剂；和/或
c)分解基于谷物的物质(例如，这可以是全谷物或部分谷物)。分解产物(例如葡萄糖)可以用作原料用于任何发酵工艺，如生物燃料(例如生物乙醇)的生产、或其他产品如生物化学品(例如生物基异戊二烯)的生产。因而，在一个实施方案中，本发明涉及生物燃料(例如生物乙醇)的生产、和在生物燃料工业中增强对基于谷物的物质的利用；和/或
c)谷类(例如小麦)面筋-淀粉分离工业。所得产物可以是淀粉(例如，纯化的淀粉)和/或面筋和/或纤维和/或水溶物(如可溶性戊聚糖)。在一个实施方案中，本发明涉及淀粉和/或面筋的生产；和/或
d)改善酿造和麦芽制造，例如通过分解基于谷物的物质(例如发芽大麦)。
在一个实施方案中，本发明的木聚糖酶用于饲料中。优选地，饲料包含玉米或是基于玉米的饲料。
在一个实施方案中，本发明的木聚糖酶用于酿造或麦芽制造。
在再一实施方案中，本发明的木聚糖酶用于小麦面筋-淀粉分离。
在又一实施方案中，本发明的木聚糖酶用于分解基于谷物的物质并且可以是生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺的一部分。
为了避免疑问，SEQ ID No.3是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的成熟形式。
同样，SEQ ID No.11是SEQ ID No.9或SEQ ID No.10的成熟形式。
优点
本文教导的新木聚糖酶与已知木聚糖酶相比具有许多优点。
本文教导的和本发明的木聚糖酶在溶解戊聚糖方面出乎预料的好。
本文教导的和本发明的木聚糖酶在溶解AXinsol方面出乎预料的好。
令人吃惊的是，已经发现，本发明的木聚糖酶特别善于降解广谱底物中的含木聚糖的物质，如阿拉伯木聚糖，例如AXinsol，所述底物如玉米、小麦、DDGS等，特别是玉米和基于玉米的底物，特别是小麦(包括基于小麦的)产品和玉米(包括基于玉米的)产品。与参照木聚糖酶(全部都已经商业化生产和销售)相比，本文教导的新的木聚糖酶能从更多的基于植物的物质(尤其是基于玉米的底物)高效得多地降解和释放戊聚糖(与销售的木聚糖酶相比)。这是完全预料不到的。本发明酶区别于已知的酶，已知的酶在溶解玉米或基于玉米的底物中的Axinsol时经常表现不佳或在溶解基于小麦和基于玉米两者的底物时没有效率。
此外，本发明的酶不但特别善于分解(溶解)Axinsol，而且善于高效地分解(或降解)溶解的聚合物。通过能够有效(快速)分解(降解)溶解的聚合物(从溶解AXinsol获得)，获得粘度的减小。后一种效果在一些要求保护的应用中至关重要。
通常，常规的木聚糖酶可以分解AXinsol，但将导致聚合物生产产物的增加，其将导致混合物粘度的增加。这种增加的粘度在许多应用中是不利的。
已发现，本发明的且如本文所述的酶不仅分解(溶解)来源于大范围底物的不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)，并且有效分解由此溶解的聚合物，从而保证粘度不升高和/或降低粘度，其中所述底物包括玉米、小麦、DDGS等，特别是玉米和基于玉米的底物，特别是小麦(包括基于小麦的)产品和玉米(包括基于玉米的产品)。
本发明的且如本文所述的木聚糖酶能够降解AXsol或AXinsol的分解产物，以保证反应混合物中粘度不增加和/或减小。
商品化用于饲料中溶解戊聚糖的许多木聚糖酶是GH11酶。本领域的技术人员一直认为与GH11木聚糖酶相比，GH10木聚糖酶在溶解戊聚糖，特别是AXinsol上并不强。令人吃惊地已经发现，本文公开的新木聚糖酶(其为GH10木聚糖酶)特别善于溶解广泛底物谱中的AXinsol，包括基于玉米的底物。令人吃惊地，本发明人已经发现本发明的(和本文教导的)GH10木聚糖酶比商品化的GH11木聚糖酶在其溶解戊聚糖的能力上表现优异。
本发明酶有效地溶解玉米和基于玉米的底物中的AXinsol的事实是显著有利的，因为玉米与其他谷类，例如小麦和黑麦相比拥有多得多的不溶性形式的AX。因而，只有可以分解AXinsol的木聚糖酶可以对以例如玉米-大豆饲粮喂养的动物显示明显益处。
GH10木聚糖酶如此善于在谷类，特别是玉米或基于玉米的底物中溶解AXinsol，是完全出乎预料的。
本发明的酶能够有效(并快速地)降解聚合物和/或寡聚物，其中所述聚合物和/或寡聚物从溶解AXinsol产生或存在于基于谷物的物质中。这导致本文教导的GH10木聚糖酶出乎预料的优势，即它们特别善于在许多应用中保持低粘度或减小粘度，例如在饲料中；在酿造和/或麦芽制造中；在基于谷物的葡萄糖生产中，例如用于进一步加工成生物燃料和/或生物化学品(例如，生物基异戊二烯)；或在小麦面筋-淀粉分离工业中用于生产例如淀粉。
特别地已经发现与GH11酶相比，本文测试的GH10酶的降解产物平均更短。这增强了粘度降低效应。
此外，本发明的GH10木聚糖酶的再一优势(不像许多GH11木聚糖酶)不受小麦木聚糖酶抑制剂，例如在小麦中出现的TAXI样蛋白质性抑制剂的影响。
本发明的一个优势是其提高小麦面筋-淀粉分离。
本发明的酶对增强受试者的表现或改善饲料中原材料的消化性和/或改善受试者的饲料效率特别有效。
含木聚糖的物质
本发明的木聚糖酶(或包含本发明的木聚糖酶的组合物)可以用于降解任何含木聚糖的物质。
在一个实施方案中，含木聚糖的物质是包含阿拉伯木聚糖的任何植物材料。
在一个实施方案中，含木聚糖的物质是包含不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)的任何植物材料。
在一个实施方案中，含木聚糖的物质是饲料或饲料组分。
在一个实施方案中，含木聚糖的物质是基于谷物的物质(包括全谷物或部分谷物或发芽谷物，例如发芽大麦)。当所述方法涉及生物燃料生产(例如生物乙醇生产)时，含木聚糖的物质优选是基于谷物的物质。
在一个实施方案中，含木聚糖的物质可以是大麦芽或糖化醪，或发芽大麦或其组合。
在又一实施方案中，含木聚糖的物质可以是谷类面粉(例如，小麦、燕麦、黑麦或大麦面粉)。当所述方法涉及面筋-淀粉分离方法时，含木聚糖的物质优选是谷类面粉(例如小麦、燕麦、黑麦或大麦面粉)。
分解或降解
本发明的或本文公开的酶(或包含该酶的组合物)可用于分解(降解)AXinsol或Axsol或Axinsol的降解产物。
术语“分解”或“降解”是水解的同义词。
溶解/降解
本发明涉及降解含木聚糖的物质(优选含有阿拉伯木聚糖的物质，优选含有不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)的物质)以生产可溶性戊聚糖(其可以是聚合物、寡聚物或单体)的方法。
该方法在本文中可被描述为戊聚糖溶解或阿拉伯木聚糖溶解或AXinsol溶解或AXinsol降解。
在一个实施方案中，本发明涉及降解(或分解)不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)的方法。这也可以称为不溶性阿拉伯木聚糖的溶解和/或戊聚糖的溶解。
在本发明再一实施方案中，所述方法涉及降解(例如分解)从不溶性阿拉伯木聚糖降解得到的聚合物。
阿拉伯木聚糖(AX)
本文所用的术语“阿拉伯木聚糖”(AX)是指由具有L-阿拉伯呋喃糖(五元环形式的L-阿拉伯糖)的木聚糖骨架(1,4-连接的木糖单元)组成的多糖，其中L-阿拉伯呋喃糖通过1α→2和/或1α→3键随机附着到整个链上的木糖单元。阿拉伯木聚糖是存在于植物初生和次生细胞壁两者中的半纤维素。阿拉伯木聚糖可在谷物如小麦、玉米(maize,corn)、黑麦和大麦的麸皮中找到。
已发现，阿拉伯木聚糖(AX)与植物细胞壁关系密切，其在植物细胞壁中充当连接植物细胞壁和组织的各种结构单元的粘胶，赋予其结构强度和刚性。
本文所用的术语“戊聚糖”是在完全水解后产生戊糖的一组糖中的任何一种。
由于木糖和阿拉伯糖(阿拉伯木聚糖的成分)都是戊糖，阿拉伯木聚糖一般被归类为戊聚糖。
AX是包括小麦和玉米在内的若干最重要饲料原材料中主要的非淀粉多糖(NSP)级分。
其在植物材料中的丰度、定位和分子结构使得AX对饲料消化性具有严重的负面影响，有效地降低了含有其的原材料的营养价值。这使得AX成为重要的抗营养因子，降低了动物生产效率。
此外，当例如在如酿造、麦芽制造、生物燃料制造等工艺中试图分解植物材料时，AX可以具有严重的负面影响，有效降低植物原材料中可用的底物的量。
AX还可以保持大量水分(可以称为其持水性)——这可以造成可溶性阿拉伯木聚糖以导致(高)粘度——这在许多应用中是不利的。
本文所用的术语“半纤维素”是指植物细胞壁中非纤维素的多糖组分。本文所用的术语“半纤维素”可以指植物细胞壁中可被稀碱溶液提取的多糖。半纤维素包含木本植物组织中几乎三分之一的糖。半纤维素的化学结构由多种戊糖、己糖以及其相应的糖醛酸构成的长链组成。半纤维素可发现于水果、植物茎和谷物外壳。木聚糖是戊聚糖的实例，其由D-木糖单元通过1β→4键连接组成。
水不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)
水不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)也称为无法水提的阿拉伯木聚糖(WU-AX)，其构成相当比例的植物材料干物质。
在小麦中，AXinsol可以占到干物质的6.3％。在小麦麸和小麦DDGS中，AXinsol可占到干物质的约20.8％或13.4％(w/w)。
在黑麦中，AXinsoI可占到干物质的5.5％。
在玉米中，AXinsol可占到干物质的3.5-6％(例如5.1％)。在玉米DDGS中，AXinsol可占到干物质的10-20％(例如12.6％)。
AXinsol在饲料中造成营养物截留。大量的易消化的营养物如淀粉和蛋白质保持包裹在细胞壁物质丛中或连接在AX的侧链上。这些被截留的营养物将无法在小肠中被消化和随后被吸收。
水溶性阿拉伯木聚糖(AXsol)
水溶性阿拉伯木聚糖(AXsol)，也称为可水提的阿拉伯木聚糖(WE-AX)，可以在生物燃料生产和/或麦芽制造和/或酿造和/或饲料中引起问题，这是因为由于AXsol的水结合能力，它们可以引起增加的粘度。
在饲料中，AXsol可具有抗营养作用，特别是在单胃动物中，这是由于AXsol非凡的水结合能力引起肠内含物粘度显著增加。粘度增加能影响饲料消化和营养物利用，这是因为其可阻止饲料和消化酶以及胆盐的恰当混合，和/或减缓营养物可利用性和吸收，和/或刺激后肠的发酵。
在小麦中，AXsol可占到干物质的1.8％。在小麦麸和小麦DDGS中，AXsol可占到干物质的约1.1或4.9％(w/w)。
在黑麦中，AXsol可占到干物质的3.4％。
在大麦中，AXsol可占到干物质的0.4-0.8％。
在玉米中，AXsol可占到干物质的0.1-0.4％(例如0.1％)。在玉米DDGS中，AXsol可占到干物质的0.3-2.5％(例如0.4％)。
然而，除了植物材料中存在的AXsol量以外，当木聚糖酶溶解植物材料中的AXinsol时，还可以释放戊聚糖和/或寡聚物，促进植物材料中AXsol的含量。
本文公开的木聚糖酶的一个重要优势是其具有溶解AXinsol而不增加粘度的能力。目前认为没有高分子量产物形成。
AXsol的分解可降低粘度。
AXsol的分解可释放营养物。
粘度
本发明可以用于在任何AXsol的水结合能力会引起粘度不想要的增加的方法中保证粘度不增加和/或减小粘度。
本发明涉及通过分解(降解)AXsol或通过分解(降解)由溶解AXinsol产生的聚合物和/或寡聚物来保证粘度不增加和/或减小粘度。
不希望受理论的限制，通过能够有效地(快速地)分解(降解)由溶解AXinsol获得的溶解的聚合物(例如寡聚物)，可以避免粘度不想要的增加和/或可以获得粘度的减小。如本文所述的术语“有效地”是指，酶能够比AXinsol降解(或溶解)的速度更快地降解由AXinsol溶解形成的聚合物(例如寡聚物)。
减小粘度在本文教导的许多应用中具有优势。
Bedford&Classen(1993Poultry Sci.,72,137-143)最先描述了尝试模拟鸡小肠中环境的体外试验。所述试验由两步温育组成，首先在低pH下将饲料与胃蛋白酶温育，随后在中性pH下与胰酶温育。一般公认，最后温育后上清液的粘度与肉鸡(broiler)体内产生的粘度相关。
对饲料应用而言如本文教导的不增加粘度和/或粘度减小是指，加入木聚糖酶将导致通过实施例7中所述方法测量的未改变的或较低的粘度。未改变是指，测量的值(三次重复的平均)落入没有木聚糖酶加入的小麦样品的测量值的两个标准差内。
可以使用以下装置测量粘度：Rapid ViscoAnalyzer(RVA)(例如在生物乙醇加工中)和Haake VT550粘度计(Thermofisher)(例如在小麦-面筋淀粉加工中)。两个装置均可以监测燃料乙醇工艺和小麦淀粉分离工艺的粘度谱，其实验条件分别在实施例8和9中教导。
在本发明中，可以通过比较包含本发明(或本文教导的)的木聚糖酶的一个样品与没有本发明(或本文教导的)的木聚糖酶的另一可比样品，计算粘度的减小。
比较本发明木聚糖酶与市售参照木聚糖酶的粘度减小谱可以证明酶的性能。目标是与市售参照相比提高酶性能。在下文实施例中提供了用于各应用的参照酶。
用于饲料应用的参照酶是
Figure BDA0002655917430000261
X。
用于生物乙醇加工的参照酶是XylathinTM。
用于小麦-面筋淀粉分离的参照酶是Shearzyme PlusTM。
在本发明的一个实施方案中，本文教导的木聚糖酶是粘度减小剂。
一般地，小麦(或其他谷类)首先被干磨以分离麸皮和胚芽与胚乳，胚乳被磨成面粉。然后通过小麦淀粉分离工艺将该胚乳面粉进一步分级成具有多种商业价值的若干产物流。主要目标是产生精制等级的A-淀粉，其由大的15-40μm的豆状颗粒组成。第二流B-淀粉由较不纯化的球形小(1-10μm)淀粉颗粒组成。(C.C.Maningat,P.A.Seib,S.D.Bassi,K.S.Woo,G.D.Lasater,书"Starch"(2009)441-451的第10章,Wheat starch:production,properties,modification and uses)。分离的小麦淀粉形成了用于改性淀粉生产的起始材料，其在食品和非食品应用中有用。活性面筋是小麦分离过程中具有附加值的第三种产物。通过形成粘弹网络(其为面包制作所需)的能力，决定了分离的小麦面筋的活性(vitality)。活性面筋包裹在烘焙过程中生面团制备中形成的二氧化碳，并因此增加面包体积。(Anne van der Borght,Hans Goesaert,Wim S.Veraverbeke,Jan A.Delcour,Journal of Cereal Science 41(2005)221-237,Fractionation of wheat and wheatflour into starch and gluten:overview of the main processes and the factorsinvolved.)。因而其经常用于丰富用于面包制备的面粉，以获得改良的面包产品。面筋的其他市场包括在素食、肉、鱼或家禽产品中，包括在宠物食品工业中；在谷类早餐中；或在酱油中作为添加剂。由于其热塑性和良好的成膜性质，面筋还用于非食品市场作为粘着剂(L.Day,M.A.Augustin,I.L Batey,C.W.Wrigley,Trends in Food Science&Technology17(2006)82-90,Wheat-gluten uses and industry needs.)。
本文教导的木聚糖酶可以用于在将谷类面粉(例如，小麦、燕麦、黑麦或大麦面粉)分离成淀粉和面筋级分的过程中减小粘度(或不增加粘度)并通过降解妨碍面筋聚集的寡糖来改善分离。
酿造和麦芽制造中麦芽汁粘度、大麦糖化醪和大麦麦芽的粘度可以在酿造和/或麦芽制造过程中引起显著不利。本发明涉及减小麦芽汁、大麦糖化醪、大麦麦芽或其组合的粘度(或不增加粘度)。
饲料或饲料物质
本发明的酶或饲料添加剂组合物可用作饲料或用于制备饲料。
术语“饲料”(feed)在本发明中与“饲料物质”(feedstuff)具有相同含义。
优选地，本发明含有阿拉伯木聚糖的物质是饲料、或饲料的组分、或饲料成分。
饲料可以是溶液、固体或半固体的形式-这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
当用作或用于制备饲料如功能性饲料时，本发明的酶或组合物可与一种或多种下述物质联合使用：营养上可接受的载体，营养上可接受的稀释剂，营养上可接受的赋形剂，营养上可接受的助剂，营养活性成分。
在优选的实施方案中，本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成饲料物质。
本发明所用术语“饲料成分”是指饲料的全部或部分。饲料的部分可以指饲料的一种组分或饲料的一种以上的组分，例如2种、3种或4种。在一个实施方案中，术语“饲料成分”涵盖了预混料或预混合组分。
优选地，饲料可以是草料或其预混料，配合饲料或其预混料。在一个实施方案中，根据本发明的饲料添加剂组合物可以与配合饲料、配合饲料成分混合，或将其加入配合饲料的预混料，将其加入草料、草料成分或草料的预混料。
本发明使用的术语“草料”是指任何提供给动物(而不是动物必须要自己寻找)的食物。草料涵盖了已经切割好的植物。
术语“草料”包括青贮饲料、压制并制粒的饲料、油和混合日粮(mixed ration)，也包括发芽的谷物和豆类。
草料可以从一种或多种植物获得，所述植物选自：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(Lucerne)、大麦、百脉根(birdsfoot trefoil)、芸苔、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜(canola)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、芜菁、苜蓿、瑞士三叶草、红三叶苜蓿、地下三叶苜蓿、白三叶苜蓿、羊茅草、雀麦、粟、燕麦、高梁、大豆、树(制作树枝-干草所用的修剪过的树枝)、小麦和豆类。
术语“配合饲料”是指商业化的饲料，其形式为粉状、颗粒状、坚果状、饼状或碎屑状。配合饲料可以由不同的原料和添加剂混合得到。这些混合物根据目标动物的特定需求而配制。
配合饲料可以是提供每日所需所有营养的全饲料、提供部分日粮(蛋白质、能量)的浓缩物，或仅提供附加的微量营养物例如矿物质和维生素的补充剂。
配合饲料中使用的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、卡诺拉(canola)粉、菜籽粉、羽扁豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。
适宜地，如本发明所描述的预混料可以是由下列微量成分组成的组合物，例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物，和其他必需成分。预混料通常是适合掺入商业日粮的组合物。
本发明的任何饲料都包含一种或多种选自以下的饲料原料：a)谷类，例如小谷物(如小麦、大麦、黑麦、燕麦、黑小麦及其组合)和/或大谷物，如玉米或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米面筋粉、湿饼(特别是基于玉米的湿饼)、干酒糟(DDG)(特别是基于玉米的干酒糟(cDDG))、带可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是基于玉米的带可溶物的干酒糟(cDDGS))、小麦麸、带麸粗麦粉(wheat middlings)、次麦粉(wheat shorts)、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质，如大豆、向日葵、花生、羽扁豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉骨粉、土豆蛋白质、乳清、椰仁干、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
在一个实施方案中，饲料包含或由玉米、DDGS(如cDDGS)、小麦、小麦麸或其组合组成。
在一个实施方案中，饲料成分可以是玉米、DDGS(如cDDGS)、小麦、小麦麸皮或其组合。
在一个实施方案中，饲料包含或由玉米、DDGS(如cDDGS)或其组合组成。
在一个实施方案中，饲料成分可以是玉米、DDGS(如cDDGS)或其组合。
本发明的饲料可以含有至少30％、至少40％、至少50％或至少60％重量的玉米和大豆粉、或玉米和全脂大豆、或小麦粉或向日葵粉。
本发明的饲料可以含有约5-约40％玉米DDGS。对于家禽，饲料平均含有约7-约15％玉米DDGS。对于猪(pig/swine)，饲料平均含有5-40％玉米DDGS。
本发明的饲料可以含有玉米作为单一谷物，在所述情况中所述饲料可以包含约35％-约80％的玉米。
在包含混合谷物，例如包含玉米或小麦的饲料中，所述饲料可以包含至少10％的玉米。
此外或另外可选的，本发明的饲料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，以提供高纤维饲料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦，来自谷类的副产物，如玉米面筋粉、玉米面筋饲料、湿饼、干酒糟(DDG)、带可溶物的干酒糟(DDGS)、小麦麸、带麸粗麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质源也可以被视为高纤维：获自诸如向日葵、羽扁豆、蚕豆和棉花等来源的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明的饲料包含至少一种高纤维材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，所述高纤维饲料材料选自例如带可溶物的干酒糟(DDGS)——特别是cDDGS、湿饼、干酒糟(DDG)——特别是cDDG，小麦麸和小麦。
在一个实施方案中，本发明的饲料包含至少一种高纤维材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，所述高纤维饲料材料选自例如带可溶物的干酒糟(DDGS)——特别是cDDGS、小麦麸和小麦。
在本发明中，饲料可以是以下的一种或多种：配合饲料和预混料，包括颗粒、坚果或(牛)饼；作物或作物残茬：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰仁干、麦秆、谷壳、甜菜废料；鱼粉；肉骨粉；糖蜜；油渣饼和压缩饼；低聚糖；保存的饲草作物：青贮料；海草；种子和谷物，其是整体的或是通过压榨、研磨等制备的；发芽谷物和豆类；酵母提取物。
在某些实施方案中，本发明的术语“饲料”涵盖宠物食品。宠物食品是为旨在用于宠物食用的植物或动物材料，例如狗粮或猫粮。宠物食品，例如狗粮和猫粮，可以是干燥形式，例如粗粒狗粮，或湿罐装形式。猫粮可含有氨基酸牛磺酸。
在某些实施方案中，本发明的术语“饲料”涵盖鱼食。鱼食通常包含保证饲养鱼类的良好健康所必需的大量营养物质、微量元素和维生素。鱼食的形式可以是薄片、颗粒或片。颗粒化的形式，其中一些沉降快，经常被用作较大的鱼或水底饲养的品种。一些鱼食也包含添加剂，例如β-胡萝卜素或性激素，以人工增强观赏鱼的颜色。
在某些实施方案中，本发明的术语“饲料”涵盖鸟食。鸟食包括用于野鸟喂食器以及用于饲养宠物鸟的鸟食。典型的鸟食由各种种子组成，但也可以包括板油(牛脂或羊脂)。
本发明所用的术语“接触”是指将本发明的酶(或含该酶的组合物)间接或直接应用于产品(例如饲料)。可使用的应用方法的例子包括，但不限于，将产品在包含饲料添加剂组合物的物质中处理，通过混合饲料添加剂组合物和产品而直接应用，将饲料添加剂组合物喷撒到产品表面或将产品浸渍到饲料添加剂组合物中。
在一个实施方案中，本发明饲料添加剂组合物优选与产品(例如饲料)混合。备选的，饲料添加剂组合物可以包含在饲料的乳液或原料成分中。
对于某些应用，重要的是，使组合物可以存在或达到待影响和/或处理的产品表面。这允许组合物可以赋予下述一种或多种有利的特征：性能益处。
可以施用本发明的酶(或含该酶的组合物)，以便将控制量的所述酶散布于产品(例如饲料或饲料的原料成分)中、覆盖和/或浸渍产品。
优选的，本发明的酶(或含酶的组合物)对于高达约70℃；高达约85℃；或高达约95℃的热处理是热稳定的。热处理的进行时间可长达约1分钟、长达约5分钟、长达约10分钟、长达约30分钟、长达约60分钟。术语“热稳定”是指，加热到规定温度前在添加剂中存在或具有活性的酶在冷却到室温之后至少约75％仍存在或具有活性。优选的，加热到规定温度前在添加剂中存在和具有活性的酶在冷却到室温之后至少约80％仍存在和具有活性。
在特别优选的实施方案中，本发明的酶(或含酶的组合物)经过均质化制成粉末。
在备选的优选实施方案中，如WO2007/044968(称为TPT颗粒)或WO1997/016076或WO1992/012645中所描述的，本发明的酶(或含该酶的组合物)被配制成颗粒，这些文献在此作为参考引入本发明。
在另一个优选的实施方案中，当饲料添加剂组合物配制成颗粒时，该颗粒包括包裹蛋白质核心的水合屏障盐。这种盐包衣的好处是改进热耐受性、改进贮存稳定性和提供对抗对酶具有不利作用的其他饲料添加剂的防护作用。
优选的，用于盐包衣的盐具有20℃大于0.25的水活性或大于60％的恒定湿度。
优选的，盐包衣含有Na2SO4。
制备本发明的酶(或含酶的组合物)的方法也可以包括将粉末造粒的进一步步骤。粉末可与其他本领域已知的成分混合。粉末或含有粉末的混合物可通过冲模挤压，将形成的条带切割成不同长度的适宜颗粒。
可选的，造粒步骤可在形成丸粒之前包括蒸汽处理或调理阶段。含有粉末的混合物可置于调理器中，例如，具有蒸汽注射的混合器。在调理器中混合物被加热到特定温度，例如从60-100℃，典型的温度可以是70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留的时间可以是几秒钟到几分钟甚至几小时的不同长短。例如，5秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
可以理解的是，本发明的酶(或含酶的组合物)适于向任何合适的饲料物质中添加。
本领域技术人员可以理解的是，不同动物需要不同的饲料，甚至相同动物也会需要不同饲料，这取决于饲养该动物的目的。
任选的，饲料也可以含有额外的矿物质，如例如，钙和/或额外的维生素。
优选的，饲料是玉米大豆粉混合物。
在一个实施方案中，优选的饲料不是宠物食品。
另一方面提供了生产饲料的方法。饲料典型地在饲料粉碎机中生产，其中原材料首先研磨成合适的粒度，随后与适当的添加剂混合。随后饲料被制作成糊状或颗粒；后者典型地涉及方法：将温度升高到目标水平并随后让饲料通过模具而制成具有特定粒度的颗粒。让颗粒冷却。随后可加入液体添加剂，例如脂肪和酶。饲料生产也可以涉及包括造粒之前的挤出或膨胀的额外步骤——尤其是通过可以包括至少使用蒸汽的适宜技术。
饲料可以是单胃动物的饲料，例如家禽(如肉鸡、下蛋母鸡、肉鸡种禽、火鸡、鸭、鹅、水禽)，和猪(所有种龄)，反刍动物，例如牛(如乳牛或公牛(包括小牛))、马、羊、宠物(如狗、猫)或鱼(如无胃性鱼、有胃性鱼、淡水鱼(例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤))、海洋鱼类(例如黑鲈)和甲壳类动物(例如虾、贻贝和扇贝))。饲料优选是禽类饲料。
基于玉米的饲料
在一个优选的实施方案中，饲料可以是基于玉米的饲料。本文所用术语“基于玉米的饲料”是指包含或由玉米(corn,maize)或玉米副产物组成的饲料。
优选地，基于玉米的饲料包含玉米或玉米副产物作为主要成分。例如，基于玉米的饲料可包含至少35％的玉米或玉米副产物，如至少40％的玉米或玉米副产物，如至少50％的玉米或玉米副产物，如至少60％的玉米或玉米副产物，如至少70％的玉米或玉米副产物，如至少80％的玉米或玉米副产物，如至少90％的玉米或玉米副产物，如100％的玉米或玉米副产物。
在一些实施方案中，基于玉米的饲料可包含玉米或玉米副产物作为次要成分；在该情况下，饲料中可以补充加入玉米或玉米副产物。仅举例来说，饲料可包含例如小麦并补充玉米或玉米副产物。
当玉米或玉米副产物是饲料的次要成分时，玉米或玉米副产物是饲料的至少5％、优选至少10％、优选至少20％、优选至少30％。
为避免任何疑问，本发明所用术语“玉米”(corn)与玉米(maize)、例如玉蜀黍(Zeamays)是同义词。
在一个实施方案中，玉米副产物可以是玉米带可溶物的干酒糟(cDDGS)或玉米湿饼或玉米干酒糟(DDG)或玉米面筋粉或玉米面筋饲料或其组合。
在一个实施方案中，本发明的含有阿拉伯木聚糖的物质优选包含玉米副产物，例如玉米带可溶物的干酒糟(cDDGS)或玉米湿饼或玉米干酒糟(DDG)或玉米面筋粉或玉米面筋饲料或其组合。
基于小麦的饲料
在优选的实施方案中，饲料可以是基于小麦的饲料。如本文所用的术语“基于小麦的饲料”是指包含或由小麦或小麦副产物组成的饲料。
优选地，基于小麦的饲料包含小麦或小麦副产物作为主要成分。例如，基于小麦的饲料可包含至少40％的小麦或小麦副产物，如至少60％的小麦或小麦副产物，如至少80％的小麦或玉米副产物，如至少90％的小麦或小麦副产物，例如100％的小麦或小麦副产物。
在一些实施方案中，基于小麦的饲料可包含小麦或小麦副产物作为次要成分；在该情况下，饲料中可以补充加入小麦或小麦副产物。仅举例来说，饲料可包含例如小麦并补充小麦或小麦副产物。
当小麦或小麦副产物是饲料的次要成分时，小麦或小麦副产物是饲料的至少5％、优选至少10％、优选至少20％、优选至少30％。
在一个实施方案中，小麦副产物可以是例如小麦麸、带麸粗麦粉、小麦纤维。
麸皮是谷物的硬外层并由结合的糊粉和果皮组成。与胚一起，其是完整谷物的一个组成部分，并且经常在精制谷物的生产中作为研磨副产物而产生。当从谷物中去除麸皮时，谷物丢失了其部分营养价值。麸皮可以存在于任何谷类籽粒中并可以从任何谷类籽粒中研出，谷类籽粒包括稻、玉米、小麦、燕麦、大麦和黑小麦。麸皮特别富含膳食纤维和必需氨基酸并含有相当量的淀粉、蛋白质、维生素和膳食矿物质。
带麸粗麦粉是小麦麸皮的粗粒及细粒和次麦粉的细粒、小麦胚芽、小麦粉和来自“研磨末段”的废物。
带麸粗麦粉是人食物和动物饲料的廉价副产物中间物。在一个实施方案中，本发明含有阿拉伯木聚糖的物质优选包含小麦麸和/或带麸粗麦粉。
湿饼、干酒糟(DDG)和带可溶物的干酒糟(DDGS)
湿饼、干酒糟和带可溶物的干酒糟是采用谷物蒸馏工业的方法通过蒸馏从谷物或谷物混合物的酵母发酵物中除去乙醇后获得的产品。
蒸馏获得的釜馏物(例如含有水，谷物剩余物，酵母细胞等)被分离为“固体”部分和液体部分。
固体部分称为“湿饼”，可就此用作动物饲料。
液体部分(部分地)蒸发成浆(可溶物)。
当湿饼被干燥后，其成为干酒糟(DDG)。
当湿饼与浆(可溶物)一起干燥，其成为带可溶物的干酒糟(DDGS)。
湿饼可被用于乳品生产和肉牛饲养场。
干燥的DDGS可用于家畜，例如乳牛、肉牛和猪饲料以及禽类饲料。
玉米DDGS对奶牛来说是非常好的蛋白源。
玉米面筋粉
在一个方面，玉米副产物可以是玉米面筋粉(CGM)。
CGM是玉米研磨工业的粉状副产物。CGM在例如动物饲料中具有用途。其可被用作例如宠物食品、家畜饲料和禽类饲料等饲料的廉价蛋白来源。其是氨基酸半胱氨酸的尤其好的来源，但必须用提供赖氨酸的其他蛋白质来平衡。
饲料添加剂组合物
本发明的饲料添加剂组合物和/或含有其的饲料可以以任何适当的形式使用。
本发明的饲料添加剂组合物可以固体或液体制剂或其替代物的形式使用。固体制剂的实例包括粉末、糊、大丸、胶囊、丸粒、片、撒粉剂(dust)以及颗粒，其可以是可湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括，但不限于，水溶液、有机溶液或水-有机溶液、悬浮液和乳液。
在一些应用中，本发明的饲料添加剂组合物可与饲料混合或在饮用水中施用。
本发明的一个方面涉及制备饲料添加剂组合物的方法，其包括将本文教导的木聚糖酶与饲料可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合，并(任选地)包装。
预混料
饲料和/或饲料添加剂组合物可与至少一种矿物质和/或至少一种维生素组合。由此得到的组合物在本文中可以称为预混料。
麦芽制造和酿造
本发明的酶(或含该酶的组合物)可用于麦芽制造和酿造。
大麦谷物含有1.7-4.1％(w/w)可水提的和3.6-6.4％(w/w)总的β-葡聚糖(Anderson,M.A.,Cook,J.A.,&Stone,B.A.,Journal of the Institute of Brewing,1978,84,233-239；Henry,J.,Journal of the Science of Food and Agriculture,1985,36,1243)。
小麦谷物含有0.1-0.8％(w/w)可水提的和0.6-1.4％(w/w)总的β-葡聚糖(Anderson,.A.等(1978)上文)。
有效水解阿拉伯木聚糖(AXsol)和β-葡聚糖是重要的，因为这些化合物可以与诸如麦芽汁粘度(Ducroo,P.&Frelon,P.G.,Proceedings of the European BreweryConvention Congress,Zurich,1989,445；
Figure BDA0002655917430000331
R.J.&Voragen,A.G.J.,Journal of theInstitute of Brewing,1993,99,243)、可滤性和轻微混浊的发生(Coote,N.&Kirsop,B.H.1976.,Journal of the Institute of Brewing,1976,82,34；Izawa,M.,Kano,Y.&Kanimura,M.1991.Proceedings Aviemore Conference on Malting,brewing andDistillling,1990,427)等生产问题有关。
本发明提供了麦芽制造和酿造过程中水解阿拉伯木聚糖(例如AXinsol和AXsol)的方法，其中将小麦谷物、大麦谷物或其组合、或小麦和/或大麦谷物的部分与本发明的酶混合。
本发明的一个方面可以涉及食品组合物，其是饮料，包括但不限于，发酵饮料，如啤酒和果酒(wine)，其含有木聚糖酶，其中所述木聚糖包含(或为)本文SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列、或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物，或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列，或可以在高度严格条件下与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18杂交的核苷酸序列，或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列。
本发明的另一个方面可以涉及食品组合物，其是饮料，包括但不限于发酵饮料，如啤酒和果酒，其包含木聚糖酶，所述木聚糖酶包含或(为)本文SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列、或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少98.5％(例如至少98.8或99或99.1或99.5％)同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列为本文SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列、或与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6具有至少97.7％(例如，至少98％、98.5％或99％)同一性的核苷酸序列。
在本发明的上下文中，术语“发酵饮料”旨在涵盖任何通过包括发酵工艺，例如微生物发酵，例如细菌和/或酵母发酵，的方法生产的饮料。
在本发明的一个方面，发酵饮料是啤酒。术语“啤酒”旨在包括通过发酵/酿造含淀粉植物材料而产生的任何发酵麦芽汁。经常，啤酒生产自麦芽或辅料(adjunct)，或麦芽和辅料例如含淀粉的植物材料的任何组合。如本发明所用，术语“麦芽”应理解为任何发芽的谷类籽粒，例如发芽的大麦或小麦。
本发明所用的术语“辅料”是指任何不是麦芽如大麦或小麦麦芽的、含有淀粉和/或糖的植物材料。作为辅料的实例，可以提及的材料是例如普通玉米糁、精制玉米糁、研磨的啤酒酵母、大米、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去皮大麦、小麦、小麦淀粉、焙炒的谷类、谷类薄片、黑麦、燕麦、玉米(corn/maize)、马铃薯、木薯(tapioca)、甜木薯(cassava)和糖浆，例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖糖浆、大麦和/或小麦糖浆以及可以用作淀粉来源的其他物质。
如本文所用，术语“糖化醪”是指任何含淀粉和/或糖的植物材料例如碎麦芽的水浆体，所述植物材料例如包含压碎的大麦麦芽、压碎的大麦和/或其他辅料或其组合，随后与水混合，待分离成麦芽汁和废糟。
如本发明所用，术语“麦芽汁”是指在制糖化醪过程中提取碎麦芽后的未发酵的液体流出物。
本发明另一方面涉及制备诸如啤酒的发酵饮料的方法，其包括将本发明的木聚糖酶与麦芽或辅料混合。
啤酒的例子包括：全麦芽啤酒(full malted beer)、在依照“纯酒令”(reinheitsgebot)酿造的啤酒、爱尔啤酒、IPA、窖藏啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(Happoshu)(二次啤酒)、三次啤酒、干啤酒、淡啤酒、低度啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、烈性啤酒、烈性黑啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等等，以及替代性谷类和麦芽饮料，例如果味麦芽饮料，如柑橘味，如柠檬、橙、酸橙或浆果味麦芽饮料，酒味麦芽饮料，如伏特加、朗姆酒或龙舌兰酒味麦芽酒，或咖啡味麦芽饮料，例如咖啡因味麦芽酒等等。
分解基于谷物的物质例如用于生物燃料生产
本发明的或本文公开的酶(或含该酶的组合物)可以用于在从例如基于谷物的物质在谷物加工过程中分解(降解)AXinsol和AXsol。基于谷物的物质可以是全谷物(例如全小麦、大麦、黑麦、黑小麦或玉米籽粒或其混合物)或全谷物的部分，或其混合物。
在一个实施方案中，本发明的或本文公开的酶(或含该酶的组合物)可以用于分解(降解)基于谷物的物质或全谷物中的AXinsol和AXsol。
为了避免疑问，全谷物可以是机械破坏的。
基于谷物的物质可以分解或降解成葡萄糖。葡萄糖随后可以用作原料用于任何发酵过程，例如生物燃料(例如生物乙醇)生产和/或生物化学品(例如生物基异戊二烯)生产。
基于谷物的物质可以是用于生物燃料(例如生物乙醇)生产过程的原料。
如今，大多数燃料乙醇从玉米籽粒生产，所述玉米籽粒被研磨、以淀粉酶处理以水解淀粉为糖、发酵和蒸馏。尽管在降低乙醇生产成本中已经取得了重大进步，但是仍然存在重大挑战。仍然需要改进的技术来降低用于乙醇生产的生物燃料原料的成本。例如，在基于谷物的乙醇生产中，阿拉伯木聚糖的降解可以增加淀粉的可及性。
本发明提供木聚糖酶用于分解半纤维素，例如阿拉伯木聚糖，特别是AXinsol和AXsol。
仅举例来说，在欧洲的燃料醇工业中、小谷物像小麦、大麦和黑麦是常见的原材料，在美国，最主要使用玉米。小麦、大麦和黑麦含有仅次于淀粉的高水平的非淀粉多糖聚合物(NSP)，像纤维素、β-葡聚糖和半纤维素。
对于每一种原料，不同NSP所占的比例不同。下表显示了与一些其他原料相比，小麦、大麦和黑麦中的NSP的不同量。
表1：不同原料中存在的非淀粉多糖(g kg-1干物质)
Figure BDA0002655917430000361
1非纤维素多糖：戊聚糖、(阿拉伯)木聚糖和其他半纤维素
由于NSP的大水结合能力，NSP可以造成谷物糖化醪的高粘度。高粘度对乙醇生产具有负面影响，因为其将限制可以用于制糖化醪的固体浓度并且其将降低方法的能效。此外，在整个所述方法中存在的残留半纤维素可以在热交换器和蒸馏设备中促成污染(fouling)。当糖化醪冷却至发酵温度(32℃)时，可以看到高粘度的最大影响。这解释了为什么需要在方法中无论如何在冷却步骤之前的任何时候减小粘度。
在本发明的一个实施方案中，用于降解基于谷物的物质的方法包括在生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺中尽可能早地，例如优选在工艺开始阶段混合基于谷物的物质的过程中，混合本文公开的木聚糖酶。在工艺的早期阶段加入本文公开的木聚糖酶的一个优势是酶降解初始粘度。
在本发明的一个实施方案中，用于降解基于谷物的物质的方法包括在糖化、发酵或其组合之前或其过程中混合本文公开的木聚糖酶。
在本发明的一个实施方案中，用于降解基于谷物的物质的方法包括在液化(例如混合后的高温步骤)过程中混合本文公开的木聚糖酶。
因而，在一个实施方案中，本发明涉及在降解基于谷物的物质时，例如在生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺中，减小粘度。
在降解基于谷物的物质时，例如在生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺中，使用本文教导的木聚糖酶减小粘度的益处是多重的：
·较高的干物质糖化醪可以用于工艺中
·可获得最终糖浆的较高固体含量
·更好的热传递，更低的能量需求
·减少的蒸发器污染，导致降低的清洁成本
·增加的最终乙醇产量
·DDGS(副产物)的提高质量
·(蒸馏后)釜馏物分离过程中固体和液体部分之间更好地分离。
较低的粘度增加分离效率。
本发明的其他显著优势是：生物燃料生产中使用本文所述的木聚糖酶还可以从该工艺导致改善的(副)产物，如湿饼、干酒糟(DDG)或带可溶物的干酒糟(DDGS)。因而，本发明的一个优势是，由于湿饼、DDG和DDGS是生物燃料(例如生物乙醇)生产的(副)产物，本发明的使用可以导致这些(副)产物的质量提高。例如，(副)产物中的阿拉伯木聚糖可以已经在生物燃料生产过程中被溶解了。
谷物(例如小麦)面筋-淀粉分离
本发明的或本文公开的酶(或含该酶的组合物)可以用于在小麦淀粉和面筋分离过程中分解(降解)AXinsol和AXsol。
在将小麦麸皮和胚与胚乳初始分离之后，可以将小麦胚乳大规模地工业分级分离为淀粉和面筋级分，以获得高品质的A-淀粉和副产物B-淀粉和活性面筋(vital gluten)。
本发明中谷类面粉(例如小麦面粉)降解的产物是淀粉(高品质的A-淀粉)。
此外，还产生副产物B-淀粉和活性面筋。每一种单独产物然后可以进一步加工，以为市场需求而补充或改良食物产品特征。
文献中描述了工业使用的若干小麦分离工艺。这些工业方法主要区别在于：呈递给分级分离装置(离心机、水力旋流器或滤网)的面粉-水混合物的形式、或初始反应条件如温度和剪切力的应用(Abdulvahit Sayaslan,Lebensm.-Wiss.U-Technol 37(2004)499-515,Wetmilling of wheat flour:industrial processes and small-sacale testmethods)。
在用于将谷类面粉(例如小麦面粉)分离成淀粉和面筋级分的方法中，所述方法包括混合谷类面粉(例如小麦面粉)、水和木聚糖酶。谷类面粉、水和木聚糖酶可以同时或连续混合。在一些实施方案中，谷类面粉(例如小麦面粉)和水可以在与木聚糖酶混合之前混合。
一般而言，在～20-45℃的温度，谷类面粉(例如小麦面粉)混合成生面团或面糊，在35-63％干固体之间变化。然后通过以下进一步加工所述混合物：
1)让混合物静止一些时间(～30分钟)，随后使用滤网、离心机或水力旋流器从混合物中洗出淀粉，以从面筋中分离淀粉乳状物，或
2)向混合物应用剪切力，任选地进一步稀释混合物，然后通过水力旋流器或2-或3-相倾析式离心机,分离小麦面粉。
如本文所用的术语“干固体”是指干重基础上浆液的总固体(溶解的和未溶解的，以％计)。
在本发明的一个实施方案中，所要求保护的方法或用途可以包括在约20-约45℃的温度之间混合小麦面粉以形成35-63％干固体的生面团或面糊并从面筋分离淀粉的步骤。
本发明的方法可以进一步包括：
1)让混合物静止约30分钟，随后使用滤网、离心机或水力旋流器从混合物中洗出淀粉，以从面筋中分离淀粉乳状物，或
2)向混合物应用剪切力，任选地进一步稀释混合物，然后通过水力旋流器或2-或3-相倾析式离心机,将面筋与淀粉分离。
本发明提供：在用于小麦淀粉分离的上述多种工艺中，适宜地在面粉和水的初始混合步骤过程中，加入本文教导的木聚糖酶来改善淀粉和面筋的分离。由于粘度减小和干扰面筋颗粒的AXsol和/或AXinsol的水解，通过在初始混合步骤过程中加入木聚糖酶，可以改善分离。通过降解这些多糖和寡糖，可以增强面筋聚集，提高面筋产量(S.A.Frederix,CM.Courtin,J.A.Delcour,J.Cereal Sci.40(2004)41-49,Substrate selectivity andinhibitor sensitivity affect xylanase functionality in wheat flour gluten-starch separation)。
本发明的一个优势是其导致较高的A-淀粉产量和/或更好质量的面筋(例如更好质量的活性面筋)。
本发明的一个优势是其改善小麦面筋-淀粉分离。
评价面筋质量的一种方式是通过监测面筋聚集。当通过搓揉面团或混合面糊而施加一定量的摩擦力时，面筋颗粒趋向于团聚成较大的颗粒，其形成聚合物网络，称为“活性面筋”。“活性面筋”可以加入到食物产品中以改善烘焙产品的性质，如生面团强度、贮存期限和面包体积(L Day,M.A.Augustin,I.L.Batey和C.W.Wrigley；Wheat-gluten uses andindustry needs；Trends in Food Science&Technology 17(2006)82-90)。
在烘焙业中，通过ICC标准测定试验No.155(AACC 38-12)，使用Glutomatic，测定小麦面粉中面筋的质量和数量。在该设备中，从与小量2％NaCl溶液(4.2-4.8ml)混合的小麦面粉(10.0gr)形成生面团。20秒混合步骤后，连续揉捏生面团，同时利用2％NaCl溶液在室温(～22℃)下洗涤5分钟，以～70ml/分钟的流速泵过混合杯。在该洗涤步骤中，收集含有淀粉的洗涤水，面筋颗粒在Glutomatic筛夹持器内形成面筋球。
通过评价面筋聚集来测定面筋的质量。这通过在含有小型筛的专门离心机中离心面筋球来完成。称量通过筛的面筋颗粒(小的面筋)并称重面筋的总量。通过(总的湿面筋-小的湿面筋)/总的湿面筋来计算面筋指数。面筋团聚改善得越多，小的面筋级分将越小，面筋指数值将越高。高的面筋指数，其理论最大值为100％，指示高品质的面筋球。
定量面筋的量的另一个值是干面筋产率(％)。通过总的干面筋的克数除以用于实验中的干面粉的总量来计算该值。回收的干面筋越多，分离得越好。该工业测定试验目前在适应性调整，以模拟用于工业的生面团分离过程。
剂量
优选地，木聚糖酶以约500XU/kg到约16,000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)的范围，更优选地约750XU/kg饲料到约8000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，优选地约1500XU/kg饲料到约3000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，优选地约2000XU/kg饲料到约2500XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，甚至更优选地约1000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)到约4000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，存在于在含木聚糖的物质(例如饲料)中。
在一个实施方案中，木聚糖酶以大于约500XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是大于约600XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是大于约700XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是大于约800XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是大于约900XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是大于约1000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是大于约2000XU/kg，合适的是大于约2500XU/kg，合适的是大于约3000XU/kg含木聚糖的物质(如饲料)，存在于含木聚糖的物质(例如饲料)中。
在一个实施方案中，木聚糖酶以约2000XU/kg到约2500XU/kg的浓度存在于含木聚糖的物质(例如饲料)中。
在一个实施方案中，木聚糖酶以小于约16,000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是小于约8000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是小于约7000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是小于约6000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是小于约5000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，合适的是小于约4000XU/kg含木聚糖的物质(例如饲料)，存在于含木聚糖的物质(例如饲料)中。
优选地，木聚糖酶可以在饲料添加剂组合物中以约100XU/g到约320,000XU/g组合物，更优选地约300XU/g组合物到约160,000XU/g组合物，甚至更优选地约500XU/g组合物到约50,000XU/g组合物，甚至更优选地约500XU/g组合物到约40,000XU/g组合物而存在。
在一个实施方案中，木聚糖酶在饲料添加剂组合物中以大于约100XU/g组合物，合适地大于约200XU/g组合物，合适地大于约300XU/g组合物，合适地大于约400XU/g组合物，合适地大于约500XU/g组合物而存在。
在一个实施方案中，木聚糖酶在饲料添加剂组合物中的存在量是：小于约320,000XU/g组合物，合适地小于约160,000XU/g组合物，合适地小于约50,000XU/g组合物，合适地小于约40,000XU/g组合物，合适地小于约30000XU/g组合物。
木聚糖酶的活性可表示为木聚糖酶单位(XU)，其用AZCL-阿拉伯木聚糖(天青精-交联的小麦阿拉伯木聚糖，Xylazyme片，Megazyme)作为底物在pH 5.0测定。通过内切-(1-4)-β-D-木聚糖酶(木聚糖酶)的水解产生水溶性染色片段，其释放速率(590nm下吸收的增加)可以与酶活性直接相关。木聚糖酶单位(XU)相对于酶标准(Danisco木聚糖酶，可从Danisco Animal Nutrition获得)进行测定，测定在40℃、5分钟反应时间、McIlvaine缓冲液以及pH5.0的标准反应条件下进行。
标准酶的木聚糖酶活性通过pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦-斯佩特小麦-木聚糖(oat-spelt-xylan)底物中释放还原性糖末端基团的量来确定。还原性糖末端基团与3,5-二硝基水杨酸反应并且形成的反应产物可通过540nm吸收的增加来测量。酶活性通过与木糖标准曲线(还原糖当量)进行对比而量化。一个木聚糖酶单位(XU)是在pH 5.3和50℃下每分钟释放0.5μmol还原糖当量的标准酶的酶量。
合适地，在一个实施方案中，酶使用上述E.C.分类号进行分类，该E.C.分类号命名当在本发明教导的用于确定1XU的测定试验中测试时具有该活性的酶。
优选地，在小麦淀粉分离工艺的混合步骤中，木聚糖酶以约0.01kg/MT DS生面团或面糊到约0.60kg/MT DS的范围，更优选地约0.05kg/MT DS到约0.45kg/MT DS生面团或面糊，并甚至更优选地约0.10kg/MT DS到约0.25kg/MT DS生面团或面糊，存在于生面团或面糊中。
在一些实施方案中(特别是小麦淀粉分离实施方案中)，木聚糖酶可以是约0.019g蛋白质/MT DS小麦淀粉(其等同于0.019mg/kg DS)到约119g蛋白质/MT DS小麦淀粉(其等同于119mg/kg DS–其中DS表示干固体含量，MT表示公吨)的剂量施用。
在一些实施方案中(特别是小麦淀粉分离实施方案中)，木聚糖酶可以是约1.19g蛋白质/MT DS小麦淀粉(其等同于约1.19mg/kg DS)的剂量施用——其中DS表示干固体含量，MT表示公吨。
在一些实施方案中(特别是小麦淀粉分离实施方案中)，木聚糖酶可以是约9到约120000单位/kg小麦面粉，合适地约500-2400单位/kg小麦面粉，合适地约900-1200单位/kg小麦面粉的剂量(其中1个单位定义为在实施例3的桦木(birch wood)测定条件下每分钟产生1微摩尔的木糖还原糖当量所需的酶的量)。
在一些实施方案中(特别是在降解基于谷物的物质时)，木聚糖酶可以是约0.29g/蛋白质/MT DS小麦(其等同于0.29mg/kg DS)到约0290g/蛋白质/MT DS小麦(其等同于290mg/kg DS)范围的剂量。
在一些实施方案中(特别是降解基于谷物的物质)，木聚糖酶可以是约2.9g/蛋白质/MT DS小麦(其等同于0.29mg/kg DS)的剂量。
在一些实施方案中(特别是降解基于谷物的物质)，木聚糖酶可以是约22到约285000单位/kg，适宜地约1100到约5700单位/kg，适宜地2200到约2850单位/kg范围的剂量(其中1个单位定义为在实施例3的桦木测定条件下产生1微摩尔的木糖还原糖当量/分钟所需的酶的量)。
根据本发明的酶和/或含该酶的组合物可被设计成一次性剂量或可被设计成用于每日使用(如饲喂)的方式。
待在本发明中使用的酶和/或含该酶的组合物的最适用量将取决于待处理的产品和/或将产品与组合物接触的方法和/或其期望的用途。
组合物中酶的用量应当是足以产生效果的量，。
组合物中酶的用量应当是足量的，以产生效果，并在例如改进含有所述组合物的动物饲养饲料产品的性能方面保持足够有效。有效性的时间长度应当至少延续到产品(例如饲料添加剂组合物或含有其的饲料)使用时。
配制
在一个实施方案中，酶可以配制成液体、干粉或颗粒。
干粉或颗粒可通过本领域技术人员已知的方法制备，例如，在顶喷式流化床涂布机中、在底喷流化床(buttom spray Wurster)中或通过转鼓造粒(例如高剪切力造粒)、挤出、锅包衣法或在微成分混合器中。
对于某些实施方案来说，酶可以是被包被的，例如，胶囊化的。
在一个实施方案中，包衣防止酶受热而被视为阻热剂。
在一个实施方案中，饲料添加剂组合物被配制成干粉或颗粒，如WO2007/044968(称为TPT颗粒)或WO1997/016076或WO1992/012645(每篇均作为参考文献引入本文)所描述的。
在一个实施方案中，饲料添加剂组合物可被配制成用于饲料组合物的颗粒，其包括：核心；活性剂；和至少一层包衣，颗粒的活性剂在下述的一种或多种条件后保持至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料造粒工艺，b)蒸汽加热饲料预处理工艺，c)贮存，d)在未成粒的混合物中作为成分贮存，和e)作为饲料基础混合物或饲料预混料中的成分贮存，所述饲料基础混合物或饲料预混合物包含至少一种选自以下的化合物：微量矿物质、有机酸、还原性糖、维生素、氯化胆碱、和产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混料的化合物。
对于颗粒来说，至少一层包衣可包括至少占颗粒的55％w/w的水分水合物质；和/或至少一层包衣可包括两层包衣。两层包衣可以是水分水合包衣和水分屏障包衣。在某些实施方案中，水分水合包衣可占颗粒的25％到60％w/w，水分屏障包衣可占颗粒的2％到15％w/w。水分水合包衣可以选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，而水分屏障包衣可以选自聚合物、胶、乳清和淀粉。
可以用饲料造粒工艺生产颗粒，饲料预处理工艺可以在70℃到95℃之间进行多达若干分钟，例如在85℃到95℃间。
在一个实施方案中，饲料添加剂组合物可被配制成动物饲料颗粒，其包括：核心；活性剂，颗粒的活性剂在贮存后以及在该颗粒作为成分时在蒸汽加热造粒工艺后保持至少80％活性；水分屏障包衣；至少占颗粒25％w/w的水分水合包衣，该颗粒的水活性在蒸汽加热造粒工艺之前低于0.5。
该颗粒可具有选自聚合物和胶的水分屏障包衣，且水分水合物质可以是无机盐。水分水合包衣可占颗粒的25％到45％w/w之间，水分屏障包衣可占颗粒的2％到10％w/w之间。
可以用蒸汽加热造粒工艺生产颗粒，其可以在85℃到95℃之间进行多达若干分钟。
在某些实施方案中，酶可使用稀释剂，例如淀粉粉末、石灰石等等稀释。
在一个实施方案中，酶或含该酶的组合物是适合于消费的液体制剂，优选的液体消费形式包括一种或多种的下述物质：缓冲液、盐、山梨醇和/或甘油。
在另一个实施方案中，酶或含该酶的组合物可以通过应用下述方法配制，例如将酶喷雾在诸如粉碎小麦的载体基质上。
在一个实施方案中，根据本发明的酶或含该酶的组合物可配制成预混料。仅作为举例，预混料可含有一种或多种饲料成分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
在一个实施方案中，本发明使用的酶与至少一种生理上可接受的载体进行配制，载体选自下列的至少一种：麦芽糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦成分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯钾酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及上述物质的混合物。
包装
在一个实施方案中，根据本发明的酶和/或包含其的组合物(例如，饲料添加剂组合物)和/或预混料和/或饲料和/或饲料原料是包装的。
在一个优选的实施方案中，饲料添加剂组合物和/或预混料和/或饲料或饲料物质用袋子，例如纸袋包装。
在一个备选的实施方案中，饲料添加剂组合物和/或预混料和/或饲料或饲料物质被密封进容器。可以使用任何适当的容器。
形式
酶或含该酶的组合物(如饲料添加剂组合物)和其他成分和/或含有其的饲料可以任何适当的形式使用。
本发明的酶或包含其的组合物(例如，饲料添加剂组合物)可以以固体或液体制剂或其替代物的形式使用。固体制剂的例子包括粉剂、糊剂、大丸、胶囊剂、小丸、片剂、丸剂、胶囊剂、珠剂、溶液剂或悬浮剂、粉剂和粒剂，其可以是可湿的、喷雾干燥的或冻干的。液体制剂的例子包括，但不限于，水溶液、有机或含水有机溶液、悬浮液和乳液。
含该酶的组合物可含有调味剂或着色剂，用于立即的、延迟的、改变的、持续的、脉冲的或控制释放的应用。
举例来说，如果本发明的组合物用作固体，例如颗粒化形式，其也可含有一种或多种的下述物质：赋形剂如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂如淀粉(优选玉米、土豆或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐；造粒粘结剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。
制备所述形式使用的营养上可接受的载体的实例包括：例如，水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘酯和双甘酯、petroethral脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
所述形式优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子量聚乙二醇。
对于水性悬液和/或酏剂来说，本发明的组合物可以组合：各种甜味剂或调味剂、色素或着色剂、乳化剂和/或悬浮剂、稀释剂如水、丙二醇和甘油，及其组合。
受试者
本发明使用的术语“受试者”是指动物，根据本发明的饲料添加剂组合物或包含所述根据本发明的饲料添加剂组合物的饲料将要施用于或已经施用于该动物。
本发明使用的术语“受试者”是指动物。
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物、禽类、鱼类或甲壳类动物，包括例如家畜或饲养动物(如宠物)。
在一个实施方案中，“受试者”是家畜。
如本发明所用的术语“家畜”是指任何耕畜动物。优选的，家畜是一种或多种反刍动物如牛(例如奶牛或公牛(包括小牛))，单胃动物例如禽类(包括肉鸡、小鸡和火鸡)，猪(包括小猪)，鸟，水生动物如鱼、无胃性鱼、有胃性鱼、淡水鱼(如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤))、海洋鱼类(例如黑鲈)和甲壳类动物(例如虾、贻贝和扇贝)，马(包括竞赛马)，羊(包括羔羊)。
在另一个实施方案中，“受试者”是驯化动物或宠物或喂养在动物园环境中的动物。
本发明所用术语“驯化动物或宠物或喂养在动物园环境中的动物”是指任何相关的动物，包括犬类(如狗)、猫科动物(如猫)、啮齿动物(如豚鼠、大鼠、小鼠)、禽类、鱼类(包括淡水鱼类和海洋鱼类)和马。
表现
如本发明所用，“动物表现”可通过以下方面来确定：饲料效率和/或动物的增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中营养物的消化性(如氨基酸消化性)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能量和/或通过氮驻留和/或通过动物避免坏死性肠炎消极影响的能力和/或受试者的免疫反应。
优选的，“动物表现”可通过饲料效率和/或动物的增重和/或通过饲料转化率来确定。
“改进的动物表现”是指，通过在饲料中使用本发明的饲料添加剂组合物，与不含有所述饲料添加剂组合物的饲料相比，在受试者中出现饲料效率增加，和/或动物的增重增加，和/或饲料转化率降低，和/或饲料中营养物或能量的消化性改进，和/或氮驻留的改进，和/或免疫应答的改进。
优选的，“改进的动物表现”是指饲料效率提高和/或体重增长增加和/或饲料转化率降低。
如本发明所用，术语“饲料效率”是指当动物在一段时间之内自由采食或定量饲料喂养时，按单位饲料计体重增加的量。
“饲料效率增加”是指，在饲料中使用根据本发明的饲料添加剂组合物使得与未用本发明的饲料添加剂饲养的动物相比，每单位饲料摄取量的体重增长增加。
饲料转化率(FCR)
如本发明所用，术语“饲料转化率”是指为使动物增加规定量的体重而饲喂给所述动物的饲料量。
改进的饲料转化率是指更低的饲料转化率。
“更低的饲料转化率”或“改进的饲料转化率”是指，在饲料中使用饲料添加剂组合物时，与饲料不含所述饲料添加剂组合物时相比，为使动物增加规定量的体重而需要饲喂给动物的饲料量降低。
营养消化率
如本发明所用的“营养消化率”是指，从胃肠道或胃肠道的特定部分如小肠消失的营养部分。营养消化率可以以施用给受试者的和从受试者粪便排出的营养物之间的差别来测量，或以施用给受试者的和保留在胃肠道特定部分例如回肠的消化物中的营养物之间的差别来测量。
如本发明所用的“营养消化率”可以通过一段时间内营养摄取和由总排泄物收集物排出的营养之间的差别来测量；或通过使用惰性标记物来测量，其中所述惰性标记物不被动物吸收并允许研究者可以计算在整个胃肠道或胃肠道的一部分消失的营养物的量。这样的惰性标记物可以是二氧化钛、氧化铬或不溶于酸的灰分。消化率可被表示为饲料中营养物的百分比，或饲料里每个质量单位的营养中可消化营养物的质量单位。
本发明所用的营养消化率包括淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
如本发明所用的“能量消化率”是指，消耗的饲料的总能量减去粪便中的总能量，或消耗的饲料的总能量减去保留在动物胃肠道特定部分例如回肠的剩余消化物的总能量。本发明所用的“可代谢能量”是指明显可代谢能量，并且是指消耗的饲料的总能量减去粪便、尿和消化物的气态产物中含有的总能量。能量消化率和可代谢能量可以以摄入的总能量和粪便中排出的或存在于胃肠道特定部分的消化物中的总能量的差别来测量，使用与测量营养消化率相同的方法，其中针对氮排泄进行适当修正以计算饲料的可代谢能量。
与其他成分的组合
本发明的酶(或如本文所教导的木聚糖酶)可与其他成分组合使用。
在一个实施方案中，本发明的酶(或如本文所教导的木聚糖酶)可以与益生素或直接饲喂性微生物(DFM)如直接饲喂性细菌，组合使用。
本发明的组合包括本发明的酶(或如本文所教导的木聚糖酶或含该酶的组合物，例如饲料添加剂组合物)和其它成分，该其它成分适合于人或动物消费并且能为消费者提供医学或生理益处。
在一个实施方案中，“其它成分”可以是一种或多种其他的酶(如其他的饲料酶或酿造或麦芽制造酶，或谷物加工酶或小麦面筋-淀粉分离酶)。
本发明中使用的合适的其他酶可以是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(celliobiohydrolases)(E.C.3.2.1.91)，β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)，纤维素酶(E.C.3.2.1.74)，苔聚糖酶(E.C.3.1.1.73)，脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，脂酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)，磷脂酶(E.C.3.1.1.4，E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)，植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8))，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其他木聚糖酶(E.C.3.2.1.8，E.C.3.2.1.32，E.C.3.2.1.37，E.C.3.1.1.72，E.C.3.1.1.73)，葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或bacillolysin(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或甘露聚糖酶(如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施方案(特别是用于饲料应用)中，其他成分可以是一种或多种选自下组的酶：淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)，β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)和/或蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或bacillolysin(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在一个实施方案(特别是用于饲料应用)中，其他成分可以是淀粉酶(如α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62))的组合。
在一个实施方案(特别是用于饲料应用)中，其他成分可以是β-葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。
在一个实施方案(特别是用于饲料应用)中，其他成分可以是甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施方案(特别是用于饲料应用)中，其他成分可以是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)或磷酯酶(E.C.3.1.1.4，E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)，适宜地脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。
在一个实施方案(特别是用于饲料应用)中，其他成分可以是蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或bacillolysin(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在一个实施方案中，其它成分可以是稳定剂，或乳化剂，或粘合剂，或载体，或赋形剂，或稀释剂，或崩解剂。
本发明所用的术语“稳定剂”被定义为保持产品(如饲料产品)不随时间而变的成分或成分的组合。
本发明所用的术语“乳化剂”是指防止乳液分离的成分(如饲料成分)。乳液是两种不互溶的物质，一种物质以小滴形式存在，包含在另一种物质之中。乳液可由水包油组成，其中小滴或分散相是油，连续相是水；或由油包水组成，其中水成为分散相而连续相是油。泡沫是液包气，悬浮液是液包固，其也可以通过使用乳化剂而稳定。
本发明所用术语“粘合剂”是指一种成分(如饲料成分)，其通过物理或化学反应将产品粘合在一起。例如在“凝胶化”过程中，水分被吸收，提供了粘合的效果。但是，粘合剂能吸收其他液体，例如油，将其保留在产品中。在本发明的上下文中，粘合剂被典型地用在固体或低湿度产品中，例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包和其他。造粒粘合剂的例子包括以下的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶。
“载体”是指适用于施用酶的物质，包括任何本领域已知的那些物质，例如，任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂，等等，其是无毒的并且不以有害方式与组合物中的任何成分发生相互作用。
本发明提供制备组合物(例如饲料添加剂组合物)的方法，包括：将本发明的酶与至少一种生理上可接受的载体混合，载体选自下列中的至少一个：麦芽糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦成分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及上述物质的混合物。
“赋形剂”的例子包括以下的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、奶糖和高分子量聚乙二醇。
“崩解剂”的例子包括以下的一种或多种：淀粉(优选玉米、土豆或木薯淀粉)、乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐。
“稀释剂”的例子包括以下的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和甘油及其组合。
其他的成分可与本发明的木聚糖酶同时使用(如，当它们是混合在一起时，或甚至当它们由不同的路径递送时)或顺序(如，它们通过不同的路径递送)使用。
优选的，当本发明的饲料添加剂组合物与其他成分混合时，DFM保持活的。
优选的，在一个实施方案中，根据本发明的饲料添加剂组合物不包含铬或有机铬。
优选的，在一个实施方案中，根据本发明的饲料添加剂组合物不包含葡聚糖酶。
优选的，在一个实施方案中，根据本发明的饲料添加剂组合物不包含山梨酸。
分离的
在一个方面，优选地，根据本发明的氨基酸序列、或核酸、或酶是分离形式的。术语“分离的”是指，序列或酶或核酸至少基本上不含至少一种与其在自然条件下天然相关的自然存在的其它成分。本发明的序列、酶或核酸可以以基本上不含一种或多种与该物质原本相关联的杂质的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一种或多种潜在污染性多肽和/或核酸分子。
纯化的
一个方面，优选的，根据本发明的序列、酶或核酸是纯化的形式。术语“纯化的”是指所述成分以高水平存在。期望的是，该成分是组合物中存在的主要成分。优选的，其存在的水平至少是约90％或至少大约95％，或至少大约98％，所述水平是在干重上/基于干重、相对于所考虑的总组合物而确定的。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文定义的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。
本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。所述核苷酸序列可以是基因组的或合成的或重组的来源，其可以是双链的或单链的(代表正义链或反义链)。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选地编码本发明蛋白的cDNA序列。
在优选的实施方案中，本发明范围本身所涉及和涵盖的核苷酸序列不包括，处于其天然环境中且与其天然相连的序列(同样处于其天然环境中)连接的根据本发明的天然核苷酸序列。为了便于提及，我们将此优选实施方案称为“非天然核苷酸序列”。就此方面，术语“天然核苷酸序列”是指处于其天然环境中并与其天然相连的完整启动子(该启动子同处于其天然环境中)有效连接的完整核苷酸序列。然而，包含在本发明的范围内的氨基酸序列可以是在核苷酸序列于其天然生物体内表达后被分离和/或纯化的。然而，优选地，包含在本发明范围内的氨基酸序列可以由核苷酸序列在其天然生物体内表达，但其中所述核苷酸序列不处于在该生物体内与其天然相连的启动子的控制下。
典型地，包含在本发明范围内的核苷酸序列使用重组DNA技术(即重组DNA)制备。然而，在本发明的备选的实施方案中，可利用本领域公知的化学方法(参见Caruthers MH等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser225-232)合成全部或部分核苷酸序列。
核苷酸序列的制备
编码具有本文定义的特定性质的蛋白质或适于修饰的蛋白质的核苷酸序列，可以从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化。本领域熟知用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的多种方法。举例来说，一旦鉴定和/或分离和/或纯化到合适的序列，则可通过PCR扩增技术来制备更多序列。
进一步举例来说，可以使用来自产生该酶的生物体的染色体DNA或信使RNA，构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果已知酶的氨基酸序列，则可以合成带标记的寡核苷酸探针，并用于从由所述生物体制备的基因组文库鉴定编码酶的克隆。备选地，可使用含有与另一个已知酶基因同源的序列的带标记寡核苷酸探针来鉴定编码酶的克隆。在后一种情况中，使用较低严谨度的杂交和洗涤条件。
可选择地，可以通过以下鉴定编码酶的克隆：将基因组DNA片段插入表达载体(例如质粒)，用所产生的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌涂布到含有酶底物(即麦芽糖)的琼脂平板上，从而鉴定表达酶的克隆。
又或者，可通过成熟的标准方法合成制备编码酶的核苷酸序列，如Beucage S.L.等人，(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869所述的亚磷酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等人，(1984)EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在亚磷酰胺法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接并克隆到合适的载体中。
核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源，或混合的基因组和cDNA来源，按照标准技术连接合成的、基因组的或cDNA来源的(如果合适)片段来制备。每个连接的片段对应于完整核苷酸序列的不同部分。也可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)来制备DNA序列，例如US 4,683,202或Saiki R K等，Science(1988)239，pp487-491中所述的。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有本文定义的特定特性的酶的氨基酸序列。
本文中所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
可以由合适的来源制备/分离氨基酸序列，或者可以合成制备，或是可以使用重组DNA技术来制备。
优选地，本发明范围本身所涉及和涵盖的氨基酸序列不是天然的酶。在这点上，术语“天然酶”指在其天然环境中且由其天然核苷酸序列表达的完整的酶。
序列同一性或序列同源性
本发明也涵盖使用与具有本发明定义特性的多肽的氨基酸序列或编码该多肽的任何核苷酸序列具有一定程度序列同一性或序列同源性的序列(下文称为“同源序列”)。在本文中，术语“同源物”表示与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在本文中，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保留酶的功能活性和/或增强酶活性的多肽。
在本发明的上下文中，在一些实施方案中，同源序列意在包括可以与主题序列具有至少97.7％同一性，优选至少98或99％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列。
在一些实施方案中，同源序列意在包括可以与主题序列具有至少85％同一性，优选至少90或95％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列。
典型地，同源物可以例如包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可认为是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的上下文中，优选以序列同一性表示同源性。
在一个实施方案中，同源序列意在包括与主题序列相比具有一个或几个添加、缺失和/或取代的氨基酸序列或核苷酸序列。
在本文中，“主题序列”是指根据本发明的核苷酸序列或多肽/氨基酸序列。
优选的，关于多肽序列的％序列同一性是使用SEQ ID No.3作为序列比对中的主题序列来确定的。在一个实施方案中，多肽主题序列选自：SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15。在一个优选的实施方案中，多肽主题序列选自成熟序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15。
优选的，关于核苷酸序列的％序列同一性是使用SEQ ID No.6作为序列比对中的主题序列来确定的。在一个实施方案中，主题核苷酸序列选自：SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQ ID No.18。在一个优选的实施方案中，主题序列是序列SEQ ID No.6。
“亲本核酸”或“亲本氨基酸”是指编码(encoding或coding for)亲本多肽的核酸序列或氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及具有本文所示氨基酸序列的蛋白质，或衍生自该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白质的活性的蛋白质，所述衍生为：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸，例如10个或大于10个氨基酸。
适当的，氨基酸序列的同一性程度跨至少20个连续的氨基酸来确定，优选至少30个连续的氨基酸，更优选至少40个连续的氨基酸，更优选至少50个连续的氨基酸，更优选至少60个连续的氨基酸，更优选至少100个连续的氨基酸，更优选至少200个连续的氨基酸。
在一个实施方案中，本发明涉及编码具有如本发明所示氨基酸序列的蛋白质的核酸序列(或基因)、或编码衍生自该(亲本)蛋白质的蛋白质的核酸序列(或基因)，该衍生蛋白质通过在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸，例如10个或大于10个氨基酸而获得并具有亲本蛋白质的活性。
在本发明的上下文中，在一个实施方案中，同源序列或外源序列意在包括这样的核苷酸序列，其与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)可具有至少97.7％同一性，优选至少98或99％同一性。
在另一个实施方案中，同源序列意在包括这样的核苷酸序列，其与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)可具有至少85％同一性，优选至少90或95％同一性。
典型地，同源物将包含与主题序列编码相同的活性位点等的相同序列。尽管同源性也可就相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)而考虑，但是在本发明的上下文中，优选以序列同一性表示同源性。
可以通过目测，或者更常见地借助易于获得的序列比较程序，进行同源性比较。这些商业性计算机程序能计算两种或多种序列之间的％同源性或％同一性。
可以对连续序列计算％同源性或％同一性，即将一个序列与其它序列进行比对，并将一个序列中的每一个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接进行比较，每次一个残基。这称为“无空位”比对。通常只对较短数目的残基进行这种无空位比对。
尽管这是一种非常简单且可靠的方法，然而它未能考虑，例如，在原来相同的一对序列中，一处插入或删除将引起后面的氨基酸残基无法进行对齐，由此可能导致在进行整体对比时％同源性或％同一性大大降低。因此，大多数序列比较方法设计成在考虑到可能的插入和删除的条件下生成最佳对比，而不过度处罚整体同源性得分。这是通过在序列比对中插入“空位”以设法使局部同源性最大化而实现的。
可是，这些更加复杂的方法给比对中发生的每个空位赋予“空位罚分”，这样对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位的序列比对(反映了两种比较序列之间的较高相关性)将获得比具有许多空位的序列比对更高的得分。通常使用“仿射空位成本(affine gap costs)”，其对空位的存在处以较高惩罚，而对空位中的每一个后续残基处以较低罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然产生具有较少空位的优化比对。大多数比对程序容许修改空位罚分。可是，在使用这种软件进行序列比较时，优选使用缺省值。
因此，最大％同源性或％同一性的计算首先需要生成考虑空位罚分的最佳比对。适合进行这种比对的计算机程序是Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999Short Protocols inMolecular Biology,4th Ed–第18章)，BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)和FASTA(Altschul等，1990J.Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA能进行离线和在线搜索(参见Ausubel等，1999,7-58至7-60页)，例如在GenomeQuest搜索工具中(www.genomequest.com)。
尽管最终的％同源性或％同一性可以根据同一性进行量度，然而比对过程自身通常不是基于“全是或全非”成对比较。相反，通常使用按比例缩放的相似性评分矩阵，其根据化学相似性或进化距离给每对比较赋予得分。常用的此类矩阵的实例是BLOSUM62矩阵，即BLAST程序套件的缺省矩阵。Vector NTI程序通常使用公开的缺省值或定制的符号比较表，如果提供的话(其他细节见用户手册)。对于有些应用，优选使用Vector NTI软件包的缺省值。
可选地，可以使用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对——基于与CLUSTAL(Higgins DG和Sharp PM,1988,Gene 73(1):237-244)类似的算法，计算百分比同源性。
一旦软件生成了最佳比对，即可计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。
如果在确定序列同一性时使用空位罚分，则优选使用下列参数进行成对比对。
Figure BDA0002655917430000501
Figure BDA0002655917430000511
在一个实施方案中，可根据上述定义的空位罚分和空位延伸设定来使用CLUSTAL。
适宜地，核苷酸序列或蛋白质序列的同一性程度跨至少20个连续的核苷酸/氨基酸确定，优选至少30个连续的核苷酸/氨基酸，更优选至少40个连续的核苷酸/氨基酸，更优选至少50个连续的核苷酸/氨基酸，更优选至少60个连续的核苷酸/氨基酸，更优选至少100个连续的核苷酸/氨基酸。
适宜地，核苷酸序列的同一性程度跨至少100个连续的核苷酸确定，优选至少200个连续的核苷酸，更优选至少300个连续的核苷酸，更优选至少400个连续的核苷酸，更优选至少500个连续的核苷酸，更优选至少600个连续的核苷酸，更优选至少700个连续的核苷酸，更优选至少800个连续的核苷酸。
适宜地，核苷酸序列的同一性程度可在本文教导的全长序列上确定。
适宜地，核苷酸序列的同一性程度可在本文教导的作为成熟序列的全长序列，例如SEQ ID No.6或SEQ ID No.14或SEQ ID No.18上确定。适宜地，核苷酸序列的同一性程度可在本文教导的全长序列如SEQ ID No.6上确定。
适宜地，蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度可在至少100个连续的氨基酸，优选至少200个连续的氨基酸，优选至少300个连续的氨基酸上确定。
适宜地，氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文教导的全长序列上确定。
适宜地，氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文教导的作为成熟序列的全长序列上来确定，例如SEQ ID No.3、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15。适宜地，氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文教导的如SEQ ID No.3的全长序列上确定。
在本上下文中，术语“查询序列”是指同源序列或外源序列，将其与主题序列进行比对，以观察其是否落入本发明的范围之中。相应的，这样的查询序列可以例如是现有技术序列或第三方序列。
在一个优选的实施方案中，序列通过全局比对程序进行比对，序列同一性通过程序识别的精确匹配数除以主题序列的长度而进行计算。
在一个实施方案中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度由下列方法确定：1)使用缺省打分矩阵和缺省空位罚分，用任何合适的比对程序对两个序列进行比对，2)鉴定精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序在两个比对序列中的给定比对位点识别出相同的氨基酸或核苷酸的位置，和3)将精确匹配的数量除以主题序列的长度。
在进一步优选的实施方案中，全局比对程序选自CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)，序列同一性通过程序识别的精确匹配数除以主题序列的长度而进行计算。
序列也可以具有产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选为在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代：
Figure BDA0002655917430000521
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现有氨基酸残基与替代残基的交换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或者备选地涉及包括非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
也可以使用非天然氨基酸进行替换，非天然氨基酸包括：α*和α-双取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯丙氨酸*、p-Br-苯丙氨酸*、p-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫杂脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。符号*用于上述的讨论的目的(涉及同源或非同源取代)，以揭示衍生物的疏水本质，而#用于揭示衍生物的亲水本质，#*代表两亲特性。
变体氨基酸序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的合适间隔子基团，除了诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基的氨基酸间隔子外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免疑问，“类肽形式”用来指其中的α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的变体氨基酸残基。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等,PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。
在一个实施方案中，本发明使用的木聚糖酶可以包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、或SEQ ID No.15的多肽序列。
适宜地，可以存在至少两个保守取代，诸如至少3个或至少4个或至少5个。
适宜地，可以存在少于15个保守取代，诸如少于12个、少于10个、或少于8个或少于5个。
本发明所使用的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解，可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。为了增强本发明核苷酸序列的体内活性或寿命，可以进行所述修饰。
本发明还涵盖与本文所示序列互补的核苷酸序列、或其任何衍生物、片段或衍生物的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物体中的相似编码序列等。
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它同源物，且所述同源物和其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严格条件下使用包含所附序列表中任何一条序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。可以通过例如，比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严格性可低于使用针对已知序列的单一序列引物来克隆序列时所用的那些条件。
备选地，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码子序列改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。为了引入限制性酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能，可能需要其它序列改变。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)来制备引物，如PCR引物，用于选择性扩增反应的引物，探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显示性标记物标记的探针，或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段的长度可以是至少15个，优选为至少20个，如至少25个、30个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语“多核苷酸”之内。
可以重组地、合成地或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸和探针)。它们也可以通过标准技术进行克隆。
通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。可以设计引物使其包含合适的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。
氨基酸编号
在本发明中，对本发明使用的木聚糖酶的氨基酸残基位置进行了具体的编号。通过将样品木聚糖酶的氨基酸序列与本发明的木聚糖酶(特别是SEQ ID No.3)进行比对，可以给所述样品木聚糖酶的氨基酸残基位置分配一个数字，该数字与本发明SEQ ID NO:3所示的氨基酸残基位置或氨基酸序列编号相对应。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交或与其互补的序列杂交的序列。
本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。
本发明还涵盖能与本发明公开的序列互补的序列杂交的核苷酸序列或其任何片段或衍生物的用途。
术语“变体”还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
优选的，术语“变体”涵盖能够与本发明的核苷酸序列在严格条件下(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠pH 7.0})杂交的序列互补的序列。
更优选的，术语“变体”涵盖能够与本发明的核苷酸序列在高严格条件下(如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠pH 7.0})杂交的序列互补的序列。
本发明也涉及能与本发明的核苷酸序列(包括本发明的那些互补序列)杂交的核苷酸序列的用途。
本发明也涉及能够与本发明的核苷酸序列(包括本发明的那些互补序列)杂交的序列互补的核苷酸序列的用途。
优选地，杂交在本文教导的整个序列上进行分析。
酶的表达
可以将用于本发明的核苷酸序列引入至重组的可复制载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或由相容宿主细胞复制并以蛋白质/酶的形式表达所述核苷酸序列。
可以使用控制序列如调控序列来控制表达。
根据所使用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列而生成的蛋白质可以是分泌的，或者可以是包含在细胞内的。编码序列可以设计成具有信号序列，其指导序列所编码物质穿过特定原核或真核细胞膜的分泌。
表达载体
术语“表达载体”指能够在体内或在体外进行表达的构建体。
优选地，将表达载体引入至合适宿主生物体的基因组中。术语“引入”优选包括稳定的引入基因组中。
本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列有效连接调控序列，该调控序列能够通过合适的宿主生物提供核苷酸序列的表达。
可以按照下文所述的方法将用于本发明用途的载体转化到合适的宿主细胞中，以提供本发明多肽的表达。
载体例如质粒、粘粒或噬菌体载体的选择常常取决于待导入的宿主细胞。
用于本发明用途的载体可以含有一种或多种选择性标记基因，例如赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。备选地，可以通过共转化来进行选择(如WO 91/17243中所述)。
可以在体外使用载体，例如用于生成RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因此，在进一步的实施方案中，本发明提供了制备本发明的核苷酸序列的方法，其中通过将本发明的核苷酸序列导入可复制载体，将载体导入相容宿主细胞，并在促使载体复制的条件下培养宿主细胞。
载体可以进一步包含使得载体能够在所述宿主细胞中进行复制的核苷酸序列。这些序列的实例有质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
调控序列
在某些应用中，用于本发明用途的核苷酸序列有效连接调控序列，所述调控序列能够通过例如所选择的宿主细胞提供核苷酸序列的表达。举例来说，本发明覆盖包含有效地连接至此种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即所述载体是表达载体。
术语“有效地连接”指位置毗邻，其中所述组件的相互关系容许它们以其预期方式发挥功能。与编码序列“有效地连接”的调控序列的连接方式使得能够在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子和其它表达调控信号。
术语“启动子”采用本领域的常用含义，例如RNA聚合酶结合位点。
还可以通过选择异源调控区，例如启动子、分泌前导序列和终止子区，来实现编码本发明酶的核苷酸序列的增强表达。
优选地，本发明的核苷酸序列有效连接至少一个启动子。
其他启动子也可以用于指导本发明多肽的表达。
适合指导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的实例在本领域是熟知的。
启动子可额外包括一些特征，以保证或增加在合适宿主中的表达。例如，所述特征可是保守区域，例如Pribnow盒或TATA盒。
构建体
术语“构建体”(其与诸如“结合物”、“盒”和“杂交体”等的术语同义)包含直接或间接与启动子相连的用于本发明的核苷酸序列。
间接相连的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供合适的间隔区，例如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子。术语“融合的”在本发明中也是如此，包括直接或间接相连。在有些情况中，所述术语不包括编码蛋白质的核苷酸序列与通常相连的野生型基因启动子都处于其天然环境中时的天然组合。
构建体甚至可以包含或表达容许选择遗传构建体的标记。
对于有些应用，优选本发明的构建体至少包含有效地与启动子连接的本发明核苷酸序列。
宿主细胞
术语“宿主细胞”在涉及本发明时包括包含上文所述的核苷酸序列或表达载体且用于重组生产具有本文定义的特定特性的蛋白质的任何细胞。
在一个实施方案中，生物体是表达宿主。
因此，本发明的进一步的实施方案提供了用表达本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。将要选择与所述载体相容的细胞，而且其可以例如是原核(例如细菌)、真菌或酵母细胞。
合适的细菌宿主生物的实例有革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。
在一个实施方案中，本发明教导的木聚糖酶在表达宿主里氏木霉(Trichodermareesei)中表达。
在某些实施方案中，本发明教导的木聚糖酶的表达宿主可以是一种或多种下列真菌表达宿主：镰刀菌属(Fusarium spp.)(例如尖镰孢菌(Fusarium oxysporum))；曲霉属(Aspergillus spp.)(例如黑曲霉(Aspergillus niger))，米曲霉(A.oryzae)，构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori)或木霉属(Trichoderma spp.)(如里氏木霉)。
在某些实施方案中，表达宿主可以是一种或多种下列细菌表达宿主：链霉菌属(Streptomyces spp.)或芽孢杆菌属(Bacillus spp.)(如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))。
如果需要赋予本发明的重组表达产物最适的生物学活性，则使用合适的宿主细胞-例如酵母或真菌宿主细胞-可提供翻译后修饰(如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)。
生物
涉及本发明的术语“生物”包括能够包含编码本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子能允许在本发明的核苷酸序列存在于生物中时表达所述核苷酸序列的任何生物。
在一个实施方案中，生物是表达宿主。
合适的生物可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
涉及本发明的术语“转基因生物”包括包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子能够容许本发明的核苷酸序列在生物内表达的任何生物。优选地，将核苷酸序列引入到所述生物的基因组中。
术语“转基因生物”不涵盖处于其天然环境中的天然核苷酸编码序列(此时天然核苷酸编码序列处于同样处于其天然环境中的其天然启动子的控制之下)。
因此，本发明的转基因生物包括包含编码本发明的多肽的核苷酸序列、本发明的构建体、本发明的载体、本发明的质粒、本发明的细胞、本发明的组织或其产物中的任何一种或其组合的生物。
例如，转基因生物还可以包含处于异源启动子控制之下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/生物的转化
如上所述，宿主生物可以是原核或真核生物。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌，链霉菌属和芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌。
关于原核宿主转化的教导在本领域有很好的记载，例如见Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,1989,Cold Spring HarborLaboratory Press)。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前进行合适的修饰，诸如清除内含子。
可以使用本领域知道的多种方法转化丝状真菌细胞，例如包括以已知方式形成原生质体，转化原生质体，随后再生细胞壁的方法。EP 0 238 023中描述了使用曲霉菌属(Aspergillus)作为宿主微生物的用途。
原核生物、真菌和酵母的转化通常为本领域技术人员所熟知。
宿主生物可以是真菌-如霉菌。这样的适当宿主的实例包括属于木霉属(Trichoderma)(如里氏木霉)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、支顶孢属(Acremonium)、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、脉孢属(Neurospora)等的任何成员。
在一个实施方式中，宿主生物可以是真菌。在一个优选的实施方式中，宿主生物属于木霉属，如里氏木霉。
培养和生产
可以在有益于生产所编码的多肽且易于从细胞和/或培养基中回收多肽的条件下，培养经过本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞。
用于培养细胞的培养基可以是适于培养所讨论宿主细胞且获得多肽表达的任何常规培养基。
由重组细胞生产的蛋白质可以展示在细胞表面上。
可利用公知的方法从宿主细胞分泌蛋白并方便地从培养基中回收。
分泌
通常希望表达宿主将蛋白质分泌到培养基中，由此可以更加容易地回收蛋白质。根据本发明，可以根据期望的表达宿主来选择分泌前导序列。杂合信号序列也可用于本发明。
大规模应用
在本发明的一个优选实施方式中，氨基酸序列被用于大规模的应用。
优选的氨基酸序列的生产量是从1g每升到约2g每升宿主生物培养后总细胞培养物体积。
优选的氨基酸序列的生产量是从100mg每升到约900mg每升宿主生物培养后总细胞培养物体积。
优选的氨基酸序列的生产量是从250mg每升到约500mg每升宿主生物培养后总细胞培养物体积。
一般重组DNA方法学技术
除非另有说明，本发明使用在本领域技术人员能力范围之内的常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术。这些技术在文献中均有解释。参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，1-3册，冷泉港实验室出版社；Ausubel,F.M.等人(1995和周期性增补；Current Protocols in Molecular Biology,第9、13和16章,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:EssentialTechniques,John Wiley&Sons；M.J.Gait(编辑),1984,Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach,Irl出版社；和D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods ofEnzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology,学术出版社。这些一般性教科书每篇均作为参考引入本发明。
本发明也涉及在下列编号的段落中定义的下列方面：
1.一种用于降解含阿拉伯木聚糖的物质的方法，所述方法包括将含阿拉伯木聚糖的物质与木聚糖酶混合，其中所述木聚糖酶是GH10真菌木聚糖酶，降解不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)，以及降解从AXinsol降解产生的聚合物、寡聚物或它们的组合，并且其中对于从AXinsol降解产生的聚合物、寡聚物或它们的组合，所述木聚糖酶在其产生后立即或基本上立即将其降解。
2.一种用于在含木聚糖的物质中降解含阿拉伯木聚糖的物质的方法，所述方法包括将所述含木聚糖的物质与木聚糖酶混合，其中所述木聚糖酶包含如文中所示的SEQ IDNo.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQ ID No.9或SEQID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18在高严紧条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得的(或获得的)木聚糖酶。
3.木聚糖酶的用途，所述木聚糖酶包含如文中所示的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由文中所示的SEQID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQ ID No.6、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQ ID No.6、SEQID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码；或所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得的(或者获得的)木聚糖酶，用于溶解含木聚糖的物质中的阿拉伯木聚糖。
4.根据段2或段3中任一项所述的方法或用途，其中所述阿拉伯木聚糖是不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)。
5.根据段1-4任一项所述的方法或用途，其中含木聚糖的物质选自以下的一种或多种：饲料或饲料物质、饲料成分、基于谷物的物质、糖化醪、麦芽汁、麦芽、发芽的大麦、辅料、大麦糖化醪和谷类面粉。
6.根据前述段落中任一项所述的方法或用途，其中所述阿拉伯木聚糖在反应介质中溶解而不增加粘度。
7.根据前述段落任一项所述的方法或用途，其中所述的方法或用途是小麦面筋-淀粉分离工艺(或者是其一部分)。
8.根据段1-6中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途是生物燃料(如生物乙醇)或生物化学品(例如，生物基异戊二烯)的生产工艺(或者是其一部分)。
9.根据段1-6中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途是麦芽制造或酿造工艺(或者是其一部分)。
10.根据段1-6中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途用于改进受试者的表现或用于改进饲料中原料的消化率(如营养消化率)或用于改进受试者中的饲料效率或用于降低受试者肠道内容物的粘度。
11.根据前述段落中任一项所述的方法或用途，其中所述木聚糖酶包含如文中所示的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQ IDNo.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少85％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少85％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6或SEQ ID No.5或SEQ ID No.4或SEQ IDNo.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码。
12.根据前述段落中任一项所述的方法或用途，其中所述木聚糖酶包含如文中所示的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQ IDNo.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少95％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少95％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6或SEQ ID No.5或SEQ ID No.4或SEQ IDNo.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码。
13.根据前述段落中任一项所述的方法或用途，其中所述木聚糖酶包含如文中所示的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQ IDNo.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少99％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少97％(例如至少97.7％或至少98％)同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.4或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码。
14.根据段5所述的方法或用途，其中饲料或饲料物质包含或由玉米、DDGS(如cDDGS)、小麦、麦麸或它们的组合组成。
15.根据段14所述的方法或用途，其中饲料或饲料物质是基于玉米的饲料。
16.根据前述段落任一项所述的方法或用途，其中所述木聚糖酶与选自下组中的一种或多种酶联合使用：蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或bacillolysin(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)；和/或蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)或bacillolysin(EC 3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.x)或角蛋白酶(EC 3.4.xx))。
17.根据前述段落中任一项所述的方法或用途，其中所述木聚糖酶与淀粉酶(例如，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1))和蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62))联合使用。
18.根据段1-15任一项所述的方法或用途，其中所述酶与β葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)联合使用。
19.根据前述段落中任一项所述的方法或用途，其中所述木聚糖酶与糖化醪和/或麦芽汁接触。
20.根据前述段落中任一项所述的方法或用途，其中所述方法包括以下步骤：a)制备糖化醪，b)过滤糖化醪以获得麦芽汁，和c)发酵麦芽汁以获得发酵饮料，其中向i)步骤a)的糖化醪和/或ii)步骤b)的麦芽汁和/或iii)步骤c)的麦芽汁中加入所述的木聚糖酶。
21.根据前述段落中任一项所述的方法或用途，其中所述木聚糖酶包含(或为)如文中所示的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2或SEQ ID No.1的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQID No.2或SEQ ID No.1具有至少99％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4的核苷酸序列编码的多肽；或由与SEQ IDNo.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4具有至少97％(例如至少97.7％或至少97.8％)的同一性的核苷酸序列编码的多肽。
22.通过根据前述段落中任一项的方法生产的发酵饮料，例如啤酒。
23.一种具有木聚糖酶活性的多肽，其包含(或为)如文中所示的SEQ ID No.3、SEQID No.2或SEQ ID No.1的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1具有至少99％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.4的核苷酸序列编码的多肽；或由与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ IDNo.4具有至少97％(例如至少97.7％或至少98％)的同一性的核苷酸序列编码的多肽。
24.根据段23所述的多肽，其中木聚糖酶是内切-1.4-β-d-木聚糖酶。
25.根据段23或段24所述的多肽，其中酶具有50-70℃，优选约60℃的最适温度。
26.根据段23至段25任一项所述的多肽，其中酶具有4.6至7，优选约6的最适pH。
27.根据段23-26任一项所述的多肽，其中酶被配制成包被的或胶囊化的。
28.一种分离的或重组的核酸分子，其包含(或为)选自下组的多核苷酸序列:
a.编码选自下组的多肽序列的多核苷酸序列:SEQ ID No.3、SEQ ID No.2或SEQID No.1；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1具有至少99％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或
b.如文中SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4具有至少97％(例如至少97.7％或至少98％)的同一性的核苷酸序列。
29.一种载体(例如，质粒)，其包含选自下组的多核苷酸序列:
a.编码选自下组的多肽序列的多核苷酸序列:SEQ ID No.3、SEQ ID No.2或SEQID No.1；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1具有至少99％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；
b.如文中SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4具有至少97％(例如至少97.7％或至少98％)的同一性的核苷酸序列。
30.一种宿主细胞，其包含段28的核酸或段29的载体。
31.一种降解含木聚糖的物质(优选不溶性的含阿拉伯木聚糖的物质)的方法，所述方法包括将物质与根据段23-27任一项的多肽混合。
32.一种饲料添加剂组合物，其包含(或基本上为或为)木聚糖酶，所述木聚糖酶包含文中所示的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6或SEQ ID No.5或SEQID No.4或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码；或者所述木聚糖酶是从轮枝样镰刀菌可获得的(或者获得的)木聚糖酶，或根据段23至27任一项所述的多肽。
33.根据段32的饲料添加剂组合物，其进一步包含一种或多种选自下组中的酶：淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、和/或蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)或bacillolysin(EC3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.x)或角蛋白酶(EC 3.4.x.x))。
34.根据段32或段33所述的饲料添加剂组合物，其进一步包含淀粉酶(例如α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)。
35.根据段32所述的饲料添加剂组合物，其进一步包含β葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。
36.一种预混料，所述预混料包含木聚糖酶、或根据段23至27任一项的多肽、或根据段32至35任一项的饲料添加剂组合物，以及至少一种矿物质和/或至少一种维生素，其中所述木聚糖酶包含文中所示的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列；或所述木聚糖由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.4或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码；或所述木聚糖是从轮枝样镰刀菌可获得的(或者获得的)木聚糖酶。
37.根据段1-21任一项所述的方法或用途，其包括向受试者施用根据段23-27任一项所述的多肽或根据段32至35任一项所述的饲料添加剂组合物或根据段36所述的预混料或从轮枝样镰刀菌可获得的(或者获得的)木聚糖酶。
38.一种试剂盒，其包含根据段23-27任一项所述的多肽或根据段32-35任一项所述的饲料添加剂组合物或根据段36所述的预混料、和用于施用的说明书。
39.一种饲料，其包含根据段32-35任一项所述的饲料添加剂组合物或包含(或基本上为或为)木聚糖酶的饲料添加剂组合物，其中所述木聚糖酶包含文中所示的SEQ IDNo.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQ ID No.9或SEQID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6或SEQ ID No.5或SEQ ID No.4或SEQ ID No.12或SEQ IDNo.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码；或者所述木聚糖是根据段23-27任一项所述的多肽，或从轮枝样镰刀菌可获得的(或者获得的)木聚糖酶。
40.一种制备饲料的方法，其包括将饲料成分与木聚糖酶混合，所述木聚糖酶包含文中所示的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1或SEQID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.15具有至少75％同一性的其变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的多肽序列；或所述木聚糖酶由文中所示的SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的核苷酸序列编码；或由能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17或SEQ ID No.18具有至少75％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6或SEQ ID No.5或SEQID No.4或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18不同的核苷酸序列编码；
或者包括将饲料成分与根据段23-27任一项所述的多肽，或从轮枝样镰刀菌可获得的(或者获得的)木聚糖酶、或根据段32-35任一项的饲料添加剂组合物混合。
41.参考附图和实施例在本文中一般性地描述的多肽、核酸、载体、宿主细胞、方法、用途和试剂盒。
现在参考以下附图和实施例，仅仅是以举例的方式描述本发明。
实施例1
克隆轮枝样镰刀菌木聚糖酶(FveXyn4)
使用自轮枝样镰刀菌分离的基因组DNA扩增木聚糖酶基因。克隆的基因序列称为FveXyn4基因，描述为SEQ ID No.4。FveXyn4基因编码的蛋白质描述为SEQ ID No.1。根据PFAM检索(http://pfam.sanger.ac.uk/)，FveXyn4基因的蛋白质产物属于糖基水解酶家族10(GH10)。依据SignalP-NN(Emanuelsson等,Nature Protocols,2:953-971,2007)的预测，FveXyn4蛋白在N末端具有15个氨基酸的信号肽。这表明FveXyri4是分泌型糖基水解酶。
实施例2
FveXyn4蛋白的表达
使用如下引物：引物1 5'-caccATGAAGCTGTCTTCTTTCCTCTA-3'(SEQ ID No.7)和引物2 5'-TTTTT AGCGGAGAGCGTTGACA ACAGC-3'(SEQ ID No.8)，由轮枝样镰刀菌的基因组DNA扩增FveXyn4基因。将PCR产物克隆入pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen K2400)，产生FveXyn4 pEntry质粒。使用
Figure BDA0002655917430000661
LR
Figure BDA0002655917430000662
II酶试剂盒(Invitrogen 1 1791)，通过在FveXyn4 pEntry质粒和pTrex3gM表达载体(描述于US 2011/0136197A1)之间的Gateway克隆反应，获得表达质粒pZZH254。图10提供了质粒pZZH254的图谱。通过DNA测序确定了FveXyn4基因的序列(SEQ ID No.4)。使用生物轰击法(Te'o VS等,J Microbiol Methods,51:393-9,2002)将质粒pZZH254转化入四元缺失(quad deleted)的里氏木霉菌株(描述于WO 05/001036)。
序列确证之后，使用PEG原生质体法(Penttila等人,Gene,61:155-164,1987)，用表达质粒pTTT-Ate CA1转化四元缺失的里氏木霉菌株的原生质体(描述于WO 05/001036)。为制备原生质体，在木霉属基本培养基MM(20g/L葡萄糖、15g/L KH2PO4,pH 4.5、5g/L(NH4)2SO4、0.6g/L MgSO4x7H2O、0.6g/L CaCl2x2H2O、1ml的1000X里氏木霉微量元素溶液(175g/L无水柠檬酸、200g/LFeSO4x7H2O、16g/LZnSO4x7H2O、3.2g/LCuSO4、1.4g/LMnSO4xH2O和0.8g/L硼酸))中，于24℃培养孢子大约10小时。100rpm离心回收萌发的孢子，并用30mg/mLVinoflow FCE(Novozymes,AGSwitzerland)溶液处理，时间从7小时到过夜，温度30℃，以溶解真菌细胞壁。用含有0.6M山梨醇的0.1M Tris盐酸缓冲液(pH7)洗涤原生质体，并用含有1.2M山梨醇和10mM氯化钙的10mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)重悬。为进行PEG转化，将约1μg的DNA和1-5x107的原生质体在总体积200μl中用2ml的25％PEG溶液处理，用2倍体积的1.2M山梨醇/10mMTris,pH7.5/10mMCaCl2溶液稀释。
在含有乙酰胺作为唯一氮源的培养基(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水氯化钙0.6g/L；硫酸亚铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化亚钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)中筛选转化体。转化的菌落(约50-100个)在约1周之内出现。在乙酰胺平板上生长之后，收集孢子并在乙酰胺平板上重新选择。5天后，使用10％的甘油收集孢子，将1x 108个孢子接种到250ml的摇瓶中，该摇瓶装有用于蛋白表达的30ml葡萄糖/槐糖确定成分培养基。通过SDS-PAGE确定蛋白质的表达。孢子悬液随后在7L发酵罐中、在含有60％葡萄糖-槐糖补料的确定成分培养基中生长。葡萄糖/槐糖确定成分培养基(每升)含有：(NH4)2SO4 5g、PIPPS缓冲液33g、酪蛋白氨基酸9g、KH2PO4 4.5g、CaCl2(无水)1g、MgSO4.7H2O 1g、用50％NaOH调整pH到5.5，用Milli-Q水调整达到966.5mL。灭菌后，加入下列物质：26mL 60％葡萄糖/槐糖，和400X里氏木霉微量金属2.5mL。
使用两个层析柱，从7L发酵罐培养物的浓缩发酵上清液中纯化FveXyn4蛋白质。在含有1M硫酸铵的20mM磷酸钠缓冲液pH6.0中缓冲的浓缩发酵液，上样到疏水相互作用层析柱(Sepharose Butyl FF,XK 26/10)。使用线性梯度的平衡/洗脱缓冲液，从柱子上洗脱蛋白质到pH 6.0的20mM磷酸钠缓冲液。将含有FveXyn4蛋白的级分上样到凝胶过滤柱(HiLoadSuperdex 75pg 26/60)上，使用的流动相是含有0.15M NaCl的pH7.0的20mM磷酸钠。使用3KAmico Ultra-15设备对纯化的蛋白质进行浓缩，浓缩的蛋白级分用于进一步的研究。
来自表达质粒pZZH254的FveXyn4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。信号序列以粗体(大写字母)表示，推测的内含子以粗体和小写字体表示。
表达自质粒pZZH254的FveXyn4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。通过SignalP-NN软件预测的信号序列以下划线显示。这是前原蛋白。
预测的FveXyn4蛋白成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。这是酶的活性形式。SEQ ID No.2显示了蛋白原，即，在翻译后修饰之前的蛋白质。翻译后修饰可以随宿主而不同，因此本发明还涵盖SEQ ID No.2的成熟的、活性形式。
实施例3
FveXyn4的木聚糖酶活性
FveXyn4属于糖基水解酶家族10(GH10，CAZy编号)。FveXyn4的β1-4木聚糖酶活性通过使用来自桦木的1％木聚糖(Sigma 95588)或来自小麦面粉的1％阿拉伯木聚糖(Megazyme P-WAXYM)作为底物进行测定。该测试在50℃在50mM柠檬酸钠pH 5.3、0.005％吐温-80缓冲液中进行10分钟。
释放的还原性糖通过与3,5-二硝基水杨酸反应并在540nm测定吸光度而量化。酶活性根据木糖标准曲线而量化。在该检测中，1个木聚糖酶单位(U)被定义为在本测试条件下每分钟产生1微摩尔木糖还原性糖当量所需要的酶量。
实施例4
FveXyn4的pH谱
使用桦木木聚糖(Sigma 95588)作为底物测定FveXyn4的pH谱。该测试在pH值调整为2-9的柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液中进行。将溶于水的桦木木聚糖(2％溶液)与等体积的50mM柠檬酸/磷酸缓冲液在96-孔板中混合，在加入酶前，使底物在50℃平衡。10分钟后，通过将60微升反应混合物转入含有100微升DNS溶液的96孔PCR板来终止酶反应。在Bio-RadDNA Engine中、95℃加热PCR板5分钟。随后将板冷却到室温并从每一个孔取100微升转入新的96孔板中。还原糖从底物的释放通过用分光光度计测定540nm下的光密度而得到。将每个pH的酶活性记录为相对活性，其中将最适pH的活性设置为100％。FveXyn4的pH谱如图11所示。发现FveXyn4的最适pH是约6，发现其在pH4.6到7之间保有最大活性的70％以上。
实施例5
FveXyn4的温度谱
通过在50mM pH5.3的柠檬酸钠缓冲液中在40℃到75℃之间的不同温度下测定木聚糖酶活性10分钟，确定纯化的FveXyn4的最适温度。活性记录为相对活性，其中将最适温度的活性设定为100％。FveXyn4的温度谱如图12所示。发现了FveXyn4的最适温度是60℃，其在45℃到64℃之间保持了最大活性的70％以上。
实施例6
戊聚糖的溶解(不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)的分解或溶解)
对新的木聚糖酶(FveXyn4)进行克隆、表达、纯化和表征，并针对参照木聚糖酶产品(
Figure BDA0002655917430000681
XT)进行了测试。
使用从4种底物，即，小麦、麦麸、玉米和玉米DDGS，中溶解出不溶性阿拉伯木聚糖的能力作为关键筛选标准。
新的木聚糖酶表现出从相关的饲料原材料(小麦、麦麸、玉米、玉米DDGS)中溶解出戊聚糖的强大性能。令人惊讶的是，新的木聚糖酶对大部分底物的效果远优于参照产品(例如，可商购的木聚糖酶产品)。
特别是，对于基于玉米的材料，该酶令人惊讶地远远优于参照产品。
新的木聚糖酶还表现出多种对工业应用有利的特性，包括超过预期的高戊聚糖溶解度，特别是对于包含玉米的饲料。
6.1材料与方法
酶样品
在本研究中使用的木聚糖酶是：
于里氏木霉中表达的来自轮枝样镰刀菌的新GH10木聚糖酶(命名为FveXyn4)——该木聚糖酶以纯化的形式使用，该酶在本文中可以被称为FveXyn4；和下列可商购的参照木聚糖酶：
Figure BDA0002655917430000682
XT。该参照酶从商品化的干燥配制的样品中提取。来自
Figure BDA0002655917430000683
XT商品化干燥配制样品的木聚糖酶成分用pH 5.0的McIlvain缓冲液在33％(w/w)的浆液中提取。使用离心(3000RCF，进行10min)澄清提取物并使用PALL Acrodisc PF针筒过滤器(0.8/0.2μm Supor滤膜)过滤提取物，随后在70℃下加热20min。通过离心(38 724RCF进行15min)除去沉淀后，该缓冲液通过用20mM柠檬酸钠、20mM NaCl,pH 3.4平衡的Sephadex G25柱(PD10，来自Pharmacia)，以进行置换。使用Source 15S树脂对木聚糖酶成分进行纯化，随后用线性递增盐梯度(NaCl溶于20mM柠檬酸钠缓冲液，pH 3.4)进行洗脱。
Econase
Figure BDA0002655917430000684
是由里氏木霉菌株RF5427(CBS 114044)产生的内切-1,4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.8)，可从ABVista得到。
通过测量280nm下的吸光度来确定蛋白质浓度。消光系数根据氨基酸序列来估算。对于Econase XT来说，其1mg/ml在280nm的吸光度被计算为2.84AU。
饲料原料
这些实验中使用的饲料是原料。饲料是玉米、玉米DDGS、小麦或麦麸。
戊聚糖的溶解(AXinsol的溶解)
用于溶解戊聚糖的方法是：将100mg饲料原料转入2ml Eppendorf离心管中，记录精确重量。加入750μL孵育缓冲液(200mM HEPES、100mM NaCl、2mM CaCl,pH 6.0)和900μl氯霉素溶液(40μg/ml在孵育缓冲液中)。加入选定的酶使总体积为1.8mL。
每个样品测定两次，并与空白对照(在无外来加入的酶时孵育)平行。样品在40℃下于Eppendorf恒温混匀器中震荡孵育。孵育2或18小时后，使用96孔滤板(Pall公司,AcroPrep 96滤板，1.0μm玻璃，NTRL，1mL孔)对上清液进行过滤。过滤后，将样品保存在4℃，直到对C5糖、阿拉伯糖和木糖的总量进行分析时。
C5糖(戊聚糖)的定量
进入溶液的戊糖总量通过使用Rouau和Surget的方法(1994,A rapid semi-automated method of the determination of total and water-extractable pentosanin wheat flours.Carbohydrate Polymers,24,123-32)、用一种连续流注射装置，进行测量(图7)。用酸处理上清液以使多糖水解成单糖。将间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)加入，以与单戊糖和单己糖反应，其形成有色的复合物。
通过测量550nm吸光度与510nm吸光度的差别，使用标准曲线算出了溶液中戊糖的量。与戊糖-间苯三酚复合物不同，己糖-间苯三酚复合物的吸光度在这些波长下是恒定的。将葡萄糖加入间苯三酚溶液以产生恒定的葡萄糖信号，并进一步确认没有来自己糖的干扰。
6.2结果和讨论
使用小麦的纤维性副产物(即麦麸)和玉米的纤维性副产物(即cDDGS)，在剂量反应设置中监测了戊聚糖溶解。
图8(麦麸)和图9(玉米DDGS)显示了参照酶
Figure BDA0002655917430000691
XT和新木聚糖酶(FveXyn4)的结果
图8显示了来自麦麸的戊聚糖(C-5糖)释放(戊聚糖溶解)，作为木聚糖酶剂量的函数。使用的木聚糖酶是本发明的木聚糖酶(FveXyn4)，其与参照木聚糖酶，即
Figure BDA0002655917430000692
XT进行比较。
图9显示了来自cDDGS的戊聚糖溶解，作为木聚糖酶剂量的函数。使用的木聚糖酶是本发明的木聚糖酶(FveXyn4)，其与参照木聚糖酶，即
Figure BDA0002655917430000693
XT进行比较。
Figure BDA0002655917430000694
XT在小麦上表现良好，但在玉米上未表现出作用或表现出有限的作用。
这说明，与例如FveXyn4相比明显的底物特异性差异，出乎预料的是，在基于小麦和玉米的底物中FveXyn4都很好的降解了Axinsol(例如，溶解戊聚糖)。典型地，木聚糖酶在基于玉米的产品上性能较差。令人惊讶的是，本发明的酶能够溶解基于小麦的底物和基于玉米的底物两者中的不可溶阿拉伯木聚糖(Axinsol)。
值得注意的是，测试的可商购木聚糖酶(
Figure BDA0002655917430000695
XT)没有对玉米表现出显著的溶解。实际上，几乎不存在在溶解玉米的Axinsol(或溶解玉米)上表现出显著能力的可商购木聚糖酶。这是本发明的酶的显著不同之处。
实施例7
在体外动物模型测定试验中粘度的降低
使用经过修改的Bedford和Classen描述的方法(1993Poultry Sci.,72,137-143)，确定在小麦上的粘度降低。将3.6ml胃蛋白酶溶液(2000U/mL，在0.1N HCl中)与2.4g小麦混合，之后加入所示量的木聚糖酶(FveXyn4)，40℃温育45min。然后，将1.2ml胰酶溶液(在1M MES中，8mg/mL，pH 6.8)混入浆中，获得6.0的最终pH。，将样品在40℃温育60min，其中在30和60min后混合。然后，将样品放置在冰上5min，终止反应，在3320RCF离心10min，通过0.45μm过滤器过滤，获得澄清的上清液。然后，使用配备有CPE-40锥和平板的Brookfield数字粘度计(型号DV-I+，Brookfield Engineering Laboratories,Stoughton,MA02172,USA)，测量样品粘度。每个数据点都是三次重复的平均值。
结果显示在图13中。可见，甚至在上述条件下(所述条件旨在模拟动物小肠内的环境)，FveXyn4降低了粘度。
实施例8
基于谷物的材料中粘度的降低(例如，用于生物燃料生产)
在欧洲的燃料乙醇工业中，小粒谷物如小麦、大麦和黑麦是常见的原材料，相反，美国主要使用玉米。这些小粒谷物含有仅次于淀粉的高水平的非淀粉多糖聚合物(NSP)，如纤维素、β-葡聚糖和半纤维素。
对于每种饲料，不同NSP呈现的比例是不同的。
由于NSP具有较大的水结合能力，NSP造成谷物糖化醪具有高粘度。高粘度对乙醇生产具有不利的影响，这是因为它会限制可用于制糖化醪的固体浓度，降低蛋白酶的能量效率。此外，在整个过程中存在的残余半纤维素可能引起热交换器和蒸馏装置的污染。高粘度的最大影响出现在将糖化醪冷却至发酵温度(32℃)时。这解释了为什么需要在工艺中无论如何于冷却步骤前降低粘度。
8.1材料与方法
使用Perten Instruments的Rapid Visco分析仪(RVA 4500)测量小麦糖化醪的粘度谱。RVA 4500是一款具有温度梯度变化(ramp)和可变剪切力的蒸煮搅拌型粘度计，可用于确定谷物、块茎、面粉、和挤出的和蒸煮的食品和饲料中的淀粉的质量和加工特征。还可用于蛋白质食品、成分如改性淀粉和水凝胶、以及麦芽制造和酿造。
根据下列操作方案，制备小麦糖化醪(50克30％DS，34.86％“原样(as is)”浆液)：
——称量17.42克的小麦
——在50ml烧杯中，称量32.58克自来水，加入114μl 4N H2SO4
——将小麦加入水中，以悬挂搅拌器最大速度搅拌5分钟(约500RPM)
——将25.0克的该浆液(pH5.2)转移到RVA杯中，加入50倍稀释的酶，开始RVA运行
——将所有的浆液分入2个15ml Greiner离心管，3500rpm(2547xg)离心10分钟
——确定分层(读取离心管上的体积刻度)
术语“干固体含量(DS)”指在干重的基础上计，浆液中的总固体(溶解的和未溶解的)。一开始，“初始DS”指在零时浆液中的干固体。随着水解反应的进行，溶解的DS部分可以被称为“糖浆DS”和“上清液DS”。
在每个实验中(25克浆液)，按25μg蛋白质(每8.71g“原样”小麦)的剂量添加木聚糖酶FveXyn4和FoxXyn2，对应于2.9μg蛋白质/g“原样”小麦。XYLATHINTM的剂量为4μg蛋白质/g“原样”小麦。
Figure BDA0002655917430000712
CL的剂量为2.0AAU/g DS(2.3AAU/g“原样”)。
在RVA中模拟标准的小麦液化。在60℃实施预处理20分钟，再在85℃进行液化步骤30分钟。在预处理和液化后，将浆液冷却至32℃，确定发酵条件下的粘度。下表包含各个步骤后的粘度，图14和18中显示了全部RVA谱。
在一个实验中，比较FveXyn4(轮枝样镰刀菌)与Verenium的XylathinTM(参照酶)的性能。XylathinTM中的酶是来自未培养(metagenomic)的细菌的糖基水解酶家族11(US专利7504120)。
表8.1
Figure BDA0002655917430000711
Brix值是水性液体中或在谷物加工情况下糖浆中的溶解物(例如糖)的浓度的量度。其用于定量糖的溶解/降解过程。值越高，溶解的糖越多。需要参照值用于比较。Brix值用度表示，使用折射仪测量。
上述数据与图14一起显示了，对于粘度，FveXyn4的性能比XYLATHINTM优秀。
在另一个实验中，比较FoxXyn2(尖镰孢菌,Fusarium oxysporum)与Verenium的XylathinTM(参照酶)的性能。XylathinTM中的酶是来自未培养(metagenomic)的细菌的糖基水解酶家族11(US专利7504120)。
表8.2
Figure BDA0002655917430000721
上述数据与图18一起显示了，对于粘度，FoxXyn2的性能比XYLATHINTM优秀。
实施例9
小麦面筋-淀粉分离
将小麦面粉分离成淀粉和面筋级分在产业上大规模用于获得高质量A淀粉和副产物B淀粉和活性面筋。
通过添加木聚糖酶改善分离
9.1材料和方法
下列测定试验模拟在40℃面糊加工(batter process)中的小麦淀粉分离。在该测定中，将工业小麦面粉(Cargill)加入到预热的自来水(50℃)中，在厨房用搅拌机(Braun)中混合1分钟，生成35％DS浆液。浆液的pH保持“原样”在约6.1。将100克该浆液转移到在40℃下校准的Haake VT550粘度计中。在温育1分钟后，向浆液中加入酶溶液。同时，监控添加酶前后的粘度谱共计15分钟。温育后，采集温育过的浆液的一式3次重复样品和t0浆液的一个样品，进行离心测试。每个离心测试样品都具有22.5g总重量，含有15.8-15.9g浆液样品添加到6.6-6.7g一次性离心管(15ml)中。在Hermle Z400离心机中将所有样品3500rpm离心15分钟。从离心的样品的糖浆，确定Brix值。
实施例9A
在一个实验中，比较本发明的木聚糖酶FveXyn4与商业化酶Shearzyme PlusTM(Novozymes)在小麦面筋-淀粉分离工艺中的性能。按0.20kg/MT DS的剂量使用商业化酶Shearzyme PlusTM。按1.19g蛋白质/MT DS的剂量测试木聚糖酶FveXyn4。
通过向预热至50℃的去离子化水中添加Cargill小麦面粉，制备35％干固体面糊(pH'原样'在约6.1)，同时在Braun搅拌器中以18900r.p.m连续混合1分钟。从该面糊中，转移100g至Haake VT550粘度计中，预热至40℃并以γ＝50 1/s搅拌。测量粘度1分钟，之后加入酶，监控粘度共计15分钟，参见表1的结果。下划线的值是较低的粘度值，换言之，是比参照酶Shearzyme PlusTM的性能更好的性能。很明显，木聚糖酶FveXyn4的性能显著优于参照酶Shearzyme PlusTM。
之后，将3个面糊样品在温育后立即放入15ml一次性离心管中，每个的总重量为22.5g。在Hermle Z400离心机中以3500r.p.m.离心15分钟，测量各层，并求三次重复的平均值。针对空白和所有测试的木聚糖酶，表2显示了各层的百分比，空白是在相同的条件下在Haake VT550粘度计中温育的不加酶的面糊。上清液层的下划线值(％)是明显大于参照酶Shearzyme PlusTM的值。
表9.1：在40℃下温育15分钟的过程中，随时间木聚糖酶对小麦面粉粘度的影响
Figure BDA0002655917430000731
表9.2：在40℃下温育15分钟后，木聚糖酶对小麦淀粉分离的影响
Figure BDA0002655917430000732
实施例9B
在第二个实验中，比较木聚糖酶FoxXyn2与商业化酶Shearzyme PlusTM在小麦淀粉分离工艺中的性能。按0.20kg/MT DS的剂量使用商业化酶Shearzyme PlusTM。按1.19g蛋白质/MT DS的剂量测试木聚糖酶FoxXyn2。
通过向预热至50℃的去离子化水中添加Cargill小麦面粉，制备35％干固体面糊(pH'原样'在约6.1)，同时在Braun搅拌器中以18900r.p.m连续混合1分钟。从该面糊中，转移100g至Haake VT550粘度计中，预热至40℃并以γ＝50 1/s搅拌。测量粘度1分钟，之后加入酶，监控粘度共计15分钟，参见表1的结果。下划线的值是较低的粘度值，换言之，是比参照酶Shearzyme PlusTM的性能更好的性能。很明显，木聚糖酶FveXyn2的性能显著优于参照酶Shearzyme PlusTM。
之后，将3个面糊样品在温育后立即放入15ml一次性离心管中，每个的总重量为22.5g。在Hermle Z400离心机中以3500r.p.m.离心15分钟，测量各层，并求三次重复的平均值。针对空白和所有测试的木聚糖酶，表2显示了各层的百分比，空白是在相同的条件下在Haake VT550粘度计中温育的不加酶的面糊。上清液层的下划线值(％)是明显大于参照酶Shearzyme PlusTM的值。
表9.3：在40℃下温育15分钟的过程中，随时间木聚糖酶对小麦面粉粘度的影响
Figure BDA0002655917430000741
表9.4：在40℃下温育15分钟后，木聚糖酶对小麦淀粉分离的影响
Figure BDA0002655917430000742
实施例10
克隆尖镰孢菌木聚糖酶FoxXyn2
自尖镰孢菌分离的FoxXyn2基因的核苷酸序列如SEQ ID Nos.12、13和14所示。预测的内含子在SEQ ID No.12(图19)中以斜体小写字母显示。
FoxXyn2前体蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示(图15)。预测的信号序列显示为斜体小写字母。
预测的FoxXyn2的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID Nos.10和11所示(图15和17所示)。SEQ ID No.10显示了可在蛋白质完全成熟前切割下来的多肽部分。活性形式的蛋白质可以含有或不含该部分，因此，活性蛋白质可具有SEQ ID No.10或SEQ ID No.11。
基因FoxXyn2的蛋白质产物属于糖基水解酶家族10。这表明FoxXyn2是分泌型糖基水解酶。
实施例11
FoxXyn2蛋白的表达
使用如下引物：引物1 5'-ccgcggccgcaccATGAAGCTGTCTTCCTTC CTCTACACC-3'(SEQ ID No.19)和引物2 5'-ccgg cgcg cccttaTTAG C GG AG AG CGTTG AC AACAG-3'(SEQ ID No.20)，由尖镰孢菌的基因组DNA扩增FoxXyn2基因。用Not I和Asc I酶消化后，将PCR产物克隆入用同样的限制性内切酶消化的pTrex3gM表达载体(描述于US2011/0136197A1)，产生的质粒命名为pZZH135。图22提供了质粒pZZH135的图谱。通过DNA测序确定了FoxXyn2基因的序列。
使用生物轰击法(Te'o VS等,J Microbiol Methods,51:393-9,2002)将质粒pZZH135转化入四元缺失(quad deleted)的里氏木霉菌株(描述于WO 05/001036，通过引用整合到本文中)。使用从过滤后的培养物上清液分离的蛋白质实施SDS-PAGE分析，并测定木聚糖酶活性以验证酶表达。
来自表达质粒pZZH135的FoxXyn2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示(图19)。信号序列以粗体表示，预测的内含子以粗体小写字体表示。
表达自质粒pZZH135的FoxXyn2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示(图15)。信号序列以斜体显示。
FoxXyn2蛋白成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示(图16)。
使用亲和层析树脂Blue Sepharose 6FF从培养上清液中纯化FoxXyn2蛋白，使用样品进行后续实施例中描述的生物化学表征。
实施例12
FoxXyn2的木聚糖酶活性
FoxXyn2属于糖基水解酶家族10(GH10，CAZy编号)。FoxXyn2的β1-4木聚糖酶活性通过使用来自桦木的1％木聚糖(Sigma 95588)或来自小麦面粉的1％阿拉伯木聚糖(Megazyme P-WAXYM)作为底物进行测定。该测试在50℃在50mM柠檬酸钠pH 5.3、0.005％吐温-80缓冲液中进行10分钟。
释放的还原性糖通过与3,5-二硝基水杨酸反应并在540nm测定吸光度而量化。酶活性根据木糖标准曲线而量化。在该检测中，1个木聚糖酶单位(U)被定义为在本测试条件下每分钟产生1微摩尔木糖还原性糖当量所需要的酶量。
实施例13
FoxXyn2的pH谱
使用桦木木聚糖(Sigma 95588)作为底物测定FoxXyn2的pH谱。该测试在pH值调整为2-9的柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液中进行。将溶于水的桦木木聚糖(2％溶液)与等体积的50mM柠檬酸/磷酸缓冲液在96-孔板中混合，在加入酶前，使底物在50℃平衡。10分钟后，通过将60微升反应混合物转入含有100微升DNS溶液的96孔PCR板来终止酶反应。在Bio-RadDNA Engine中、95℃加热PCR板5分钟。随后将板冷却到室温并从每一个孔取100微升转入新的96孔板中。还原糖从底物的释放通过用分光光度计测定540nm下的光密度而得到。将每个pH的酶活性记录为相对活性，其中将最适pH的活性设置为100％。FoxXyn2的pH谱如图23所示。发现FoxXyn2的最适pH是约6，发现其在pH4.5到6.5之间保有最大活性的50％以上。
实施例14
FoxXyn2的温度谱
通过在50mM pH5.3的柠檬钠盐缓冲液在45℃到94℃之间的不同温度下测定木聚糖酶活性10分钟，获得纯化的FoxXyn2的最适温度。活性记录为相对活性，其中将最适温度的活性设定为100％。FoxXyn2的温度谱如图24所示。发现了FoxXyn2的最适温度是60℃，其在40℃到65℃之间保持了最大活性的50％以上。
实施例15
FveXyn4用于动物饲料——猪
15.1材料与方法
进行2个实验以评价FveXyn4在基于玉米/玉米DDGS的食物(实验1)和基于小麦/麦麸的食物(实验2)中的效果。猪的使用得到了动物关爱和利用委员会的批准，并使用相关的国家福利指南。每个实验使用总计48只猪([♀约克夏猪(Yorkshire)x长白猪(Landrace)]x♂杜洛克猪(Duroc))，2只一组圈养，每个猪栏均含1只小母猪(gilt)和1只阉猪。每个猪栏都在控温室内(22±2℃)，配备了光滑的透明塑料边和塑料覆盖的金属扩展板。
表15.1：基础饲粮
Figure BDA0002655917430000761
Figure BDA0002655917430000771
1维生素和微量矿物质预混物提供(每千克饲粮)：维生素A，11,000IU；维生素D3，2,756IU；维生素E，55IU；维生素B12，55pg；核黄素，16,000mg；泛酸，44.1mg；烟酸，82.7mg；Zn，150mg；Fe，175mg；Mn，60mg；Cu，17.5mg；I，2mg；和Se，0.3mg。
配制相应的基础饲粮，以符合猪的NRC营养建议(NRC，1998；表15.1)。在每个实验中，生产一批基础饲粮并分成四部分，随后每一部分均与表15.2中定义的添加剂混合。在实验1中，向猪提供42天实验饲粮，而在实验2中，向猪提供21天实验饲粮。在整个实验过程中，动物可随时自由获得饲料和饮水。每个实验的每种处理都重复四次；实验开始时基于猪体重随机安排用于处理的栏位置。每周记录体重和饲料摄入，用于计算饲料转化率。使用SAS的GLM方法，对生长性能数据(BW、ADFI、ADG和FCR)应用混合线性模型。
表15.2处理鉴定
Figure BDA0002655917430000772
1植酸酶来自Danisco Animal Nutrition
2 Econase
Figure BDA0002655917430000773
来自 AB Vista(在本文中有时被称为AB Vista)
15.2结果与讨论
相比对照，FveXyn4在玉米(表15.3)和小麦(表15.4)基饲粮中改善动物体重增重。此外，对于生长表现，FveXyn4具有比可商购饲料木聚糖酶明显更好的效果，特别是在基于玉米的饲粮中。这证实了FveXyn4对于减少谷物成分中的不溶性和可溶性纤维级分对猪表现的负面影响方面的有效性，并显示出对包含在谷粒的纤维组分中的能量的更好利用。
表15.3：实验1：新木聚糖酶对用基于玉米-玉米DDGS的饲粮饲养的生长猪的生长性能的影响
Figure BDA0002655917430000781
表15.4：实验2：新木聚糖酶对用基于小麦-麦麸的饲粮饲养的生长猪的生长性能的影响
Figure BDA0002655917430000782
实施例16
FveXyn4用于动物饲料——猪
16.1材料与方法
进行实验以评价FveXyn4在基于小麦/麦麸的饲粮中的效力。动物的使用和实验流程得到了动物关爱和利用委员会的批准，并使用相关的国家福利指南。生长中的小母猪
Figure BDA0002655917430000783
Figure BDA0002655917430000784
获得自Research Unit，在运到后，将猪称重，并按体重随机分栏，每个处理8栏。每个猪栏均配备喂食器、乳头型饮水器、塑料覆盖的扩展金属地面，并在栏之间安放有允许相邻栏中的猪进行视觉接触的隔离墙。在实验过程中，室温保持在22±2℃。
表16.1：基础饲粮的组成
Figure BDA0002655917430000785
Figure BDA0002655917430000791
1提供(每千克全部饲粮)：维生素A，8255IU；维生素D3，1000IU；维生素E，20IU；维生素K，1.5mg；核黄素，7.5mg；烟酸，30mg；维生素B12，25μg；吡哆醇，4.5mg；生物素，200μg；叶酸，1mg；硫胺素，4mg；胆碱，781mg；铜，10mg；碘，0.6mg；铁，130mg；锰，40mg；硒，0.3mg；锌，130mg。
配制基础饲粮，以符合猪的NRC营养建议(NRC，1998；表16.1)。生产一批基础饲粮并分成四部分，随后每一部分均与表16.2中定义的添加剂混合。4种处理的位置分布是完全随机的设计，以给出每种处理8栏。用实验饲粮喂养猪42天，其间饲料和饮水总是随时可以自由获得的。每周记录体重和饲料摄入，用于计算饲料转化率。使用SAS的GLM方法，对生长性能数据(BW、ADFI、ADG和FCR)应用混合线性模型。
表16.2处理鉴定
Figure BDA0002655917430000792
1植酸酶来自Danisco Animal Nutrition
2 Econase
Figure BDA0002655917430000793
来自AB Vista
16.2结果与讨论
相比AB Vista的商业化木聚糖酶，FveXyn4导致了更好的体重增重，具体地高9.9％的平均每日增重(在42天内)。猪接受FveXyn4时表现出更好的FCR和更重的终体重。
表16.3：新木聚糖酶对用基于小麦的饲粮饲养的生长猪的生长性能的影响
Figure BDA0002655917430000801
实施例17
FveXyn4用于动物饲料——猪
17.1材料与方法
进行该实验以评价FveXyn4在喂食基于小麦/麦麸的饲粮的生长猪中对回肠营养物和能量消化率的影响。实验流程得到了动物关爱和利用委员会的批准，并使用相关的国家福利指南。为了实验的目的，在六只生长的阉猪(初始体重30kg)的回肠末端配备T-插管。猪是与Fertilium 25雌性猪(Genetiporc,Alexandria,MN,美国)交配的G-Performer公猪的后代，其在环境控制室中在独立的猪栏(1.2×1.5m)内圈养。每个猪栏均配备喂食器、乳头型饮水器、和全部铺设水泥板地面。
表17.1：基础饲粮的组成
Figure BDA0002655917430000802
Figure BDA0002655917430000811
1每千克全饲粮提供以下量的维生素和微量矿物质：维生素A，作为视黄基醋酸酯，11,128IU；维生素D3，作为胆钙化醇，2,204IU；维生素E，作为醋酸DL-α生育酚，66IU；维生素K，作为甲萘醌烟酰胺亚硫酸氢盐，1.42mg；硫胺素，作为单硝酸硫胺素，0.24mg；核黄素，6.58mg；吡哆醇，作为吡哆醇盐酸盐，0.24mg；维生素B12，0.03mg；D-泛酸，作为D-泛酸钙，23.5mg；烟酸，作为尼克酰胺和尼克酸，44mg；叶酸，1.58mg；生物素，0.44mg；Cu，10mg，作为硫酸铜；Fe，125mg，作为硫酸铁；I，1.26mg，作为碘酸钾；Mn，60mg，作为硫酸锰；Se，0.3mg，作为亚硒酸钠；和Zn，100mg，作为氧化锌。
表17.2处理鉴定
Figure BDA0002655917430000812
1植酸酶来自Danisco Animal Nutrition
2 Econase
Figure BDA0002655917430000813
来自AB Vista
配制基础饲粮，以符合NRC对猪的营养建议(NRC，1998；表17.1)。生产一批基础饲粮并分成四部分，随后每一部分均与表17.2中鉴定的添加剂混合。实验的设计和实施根据4×4拉丁方设计进行，其中增加两列以得到每种饲粮6个重复。所有猪均以其维持能量所需3倍水平进行饲养(106千卡ME每kg0.75；NRC，1998)，并在08:00和17:00提供。动物可通过碗型饮水器自由饮水。记录每个周期开始和结束时的猪体重，并记录每日供应的饲料量。每个实验周期持续7天。每个周期的前5天被认为是饲粮的适应期。在第6和7天使用标准操作程序收集回肠消化物8小时。简言之，将塑料袋连接到插管桶，并收集流入塑料袋的消化物。每当塑料袋装满消化物时，或至少30分钟一次，撤掉塑料袋，并将其立即于–20℃冷冻。在一个实验周期完成时，动物被禁食过夜，次日早晨提供新的实验饲粮。
在实验结束，将回肠样品解冻，并在动物和饲粮中混合，收集子样品进行化学分析。对基础饲粮的样品也进行收集和分析。在化学分析之前，将消化物样品冻干并精细研磨。对所有样品都根据标准流程(AOAC,2005)进行干物质、钛、总能量、粗蛋白、脂肪和中性洗涤剂纤维的分析。能量和营养物的表观回肠消化率的值按先前描述的方法计算(Stein等人,2007Livestock Science,2007vol.109,第1卷，第3部分，p282-285和J ANIM SCI 2007年1月，vol.85no.1 172-180)。使用SAS的MIXED程序对数据进行分析。
17.2结果与讨论
结果说明，用FveXyn4饲养的猪具有比对照和商业木聚糖酶饲养的猪明显更高(P<0.05)的粗蛋白和脂肪表观回肠消化率(表17.3)。结果提示FveXyn4通过降解纤维而有效地释放出饲喂给生长猪的纤维饲料中的能量。实际上，与用对照和商业木聚糖酶饲养的猪相比，用FveXyn4饲养的猪表现出增加6至11百分比单位的纤维消化率(表17.3)。随后，与用对照和商业木聚糖酶饲养的猪相比，用FveXyn4喂养的猪能分别额外提取106和219kcal的能量(表17.3)。
表17.3新木聚糖酶对用基于小麦的饲粮饲养的生长猪的表观回肠营养和纤维能量消化率(％)以及能量利用率(kcal/kg)的影响
Figure BDA0002655917430000821
实施例18
FveXyn4用于动物饲料——猪
18.1材料与方法
研究了FveXyn4对用基于玉米-玉米DDGS和小麦/麦麸的饲粮饲养的生长猪的回肠和全部肠道营养物以及能量消化率的影响。猪的使用通过了动物关爱和利用委员会的批准，并且使用相关的国家福利指南。为进行实验的目的，在一共24只阉猪(
Figure BDA0002655917430000822
Figure BDA0002655917430000823
初始体重为30kg)的回肠末端配备了T-插管。猪在新陈代谢板条箱中单独圈养，室内铺有光滑的透明塑料边和塑料覆盖的扩展金属板地面，并控制温度在22±2℃。
表18.1使用的基础饲粮
项目 基于玉米 基于小麦
玉米 41.44
美国玉米DDGS 40.00
硬质小麦 56.57
麦麸 5.06
带麸粗小麦粉 19.94
大豆粉 15.00 13.50
牛脂 0.99
盐酸L-赖氨酸 0.75 0.73
DL-甲硫氨酸 0.10 0.17
L-苏氨酸 0.25 0.30
L-色氨酸 0.06 0.01
消化率标记物(C盐) 0.30 0.30
盐 0.30 0.47
石灰石 1.30 1.38
磷酸氢钙 0.00 0.08
维生素/微量矿物质预混物<sup>1</sup> 0.50 0.50
计算的配给
粗蛋白，％ 21.44 19.11
净能量，MJ/kg 8.88 8.88
SID赖氨酸g/NE MJ 1.31 1.31
SID赖氨酸，％ 1.16 1.16
SID甲硫氨酸，％ 0.35 0.35
中性洗涤剂纤维，％ 20.63 17.93
钙，％ 0.67 0.68
可利用磷，％ 0.22 0.22
1维生素和微量矿物质预混物提供(每千克饲粮)：维生素A，11,000IU；维生素D3，2,756IU；维生素E，55IU；维生素B12，55μg；核黄素，16,000mg；泛酸，44.1mg；烟酸，82.7mg；Zn，150mg；Fe，175mg；Mn，60mg；Cu，17.5mg；I,2mg和Se，0.3mg。
配制相应的基础饲粮，以符合NRC对猪的营养建议(NRC,1998表18.1)。在每个实验中，生产一批基础饲粮并分成四部分，随后每一部分均与表18.2中的添加剂混合。
表18.2处理鉴定
Figure BDA0002655917430000841
1植酸酶来自Danisco Animal Nutrition
2 Econase
Figure BDA0002655917430000842
来自AB Vista
该实验的设计和实施根据两期交叉设计进行，其中所有的玉米饲粮在一期进行，所有小麦饲粮在第二期进行。在一个周期之中，4组处理完全随机设计分配给猪，每个处理具有6个重复。在第二个周期开始前，猪用常见商业饲粮饲养一周。给猪饲喂相应饲粮，分两个相等的部分在08:30和16:30喂食。每日的饲料限额根据猪在周期开始的BW确定，并计算出提供预计维持需要量的2.6倍。每个实验周期持续14天：第7天适应，第8和9天进行攫取排泄物收集(grab fecal collection)，第10和11天进行回肠消化物的收集，以检测N、DM、能量和粗脂肪的表观回肠和总肠道消化率的系数。允许猪从每个猪栏中的乳头式饮水器中全天候自由饮水。消化物流的测定和血液样品收集在第12到14天进行。使用SAS的GLM程序进行数据分析。统计学显著性为P<0.05处被接受。
18.2结果与讨论
初步结果表明用FveXyn4饲养的猪具有显著改善的能量消化率。
实施例19
FveXyn4用于动物饲料(禽类)
19.1材料与方法
进行实验以评估FveXyn4对用基于玉米/玉米DDGS的饲粮和基于小麦/麦麸的饲粮喂养的肉鸡的生长表现的效用。实验步骤通过了动物伦理委员会的批准，并且遵守了相关的国家福利指南。使用了两阶段的饲养程序(开始阶段和终止阶段)(表19.1)。开始阶段和终止阶段的饲粮分别在第0到21天和22到42天提供。
表19.1基础饲粮的组成1
Figure BDA0002655917430000843
Figure BDA0002655917430000851
1顶部添加Danisco Animal Nutrition的商业化植酸酶以提供500FTU/kg最终饲料。
2每千克饲粮提供：抗氧化剂、100mg；生物素、0.2mg；泛酸钙、12.8mg；胆钙化醇、60μg；氰钴胺素、0.017mg；叶酸、5.2mg；甲萘醌、4mg；烟酸、35mg；吡哆醇、10mg；反式-视黄醇、3.33mg；核黄素、12mg；硫胺素、3.0mg；醋酸dl-α-生育酚、60mg；氯化胆碱、638mg；Co、0.3mg；Cu、3.0mg；Fe、25mg；I、1mg；Mn、125mg；Mo、0.5mg；Se、200μg；Zn、60mg。
除AME以外，对两种基础饲粮(其中一种基于小麦/麦麸和大豆粉，另一种基于玉米/玉米DDGS和大豆粉)进行配制以符合或超出对于肉鸡而言的建议营养需求(表19.1)。由每一种基础饲粮开发了四种实验饲粮，包括对照、FveXyn4、商业化木聚糖酶1和商业化木聚糖酶2，如表19.2所鉴定。
表19.2处理鉴定
Figure BDA0002655917430000861
1植酸酶来自Danisco Animal Nutrition
2 Econase
Figure BDA0002655917430000862
来自AB Vista
从商业化的孵化器，获得数日龄的雄性肉鸡(Ross 308)仔鸡。仔鸡单独称重并分配到72个育雏笼中(8只一笼)，8种喂食处理分别随机配给8个笼子。在第12天，将鸡群转入生长笼中。育雏笼和生长笼中分配给每只鸡的空间分别是530和640cm2。育雏笼和生长笼均置于控制环境条件的房间中。温度在第一周保持在31℃，随后到第三周末前逐渐降低到22℃。鸡群接受20小时荧光照射，允许自由进食和饮水。在42天的实验周期内，每间隔一周记录一次体重和饲料摄取量。每天记录死亡率。任何死亡的鸡均要称重，该体重值用于修正FCR。饲料转化率通过存活鸡加上死亡鸡的体重增加除总饲料摄取量而计算得到。数据以双因子的因子排列(two-way factorial arrangement)的处理方式使用SAS(2004)的通用线性模型程序进行分析。
19.2结果与讨论
与对照和商业化木聚糖酶2相比，FveXyn4同时改进了基于玉米和基于小麦的饲粮的收益和FCR(表19.3)。这证明了FveXyn4具有减轻谷类成分中可能限制禽类表现的不溶性和可溶性纤维部分的负面影响的效力。
表19.3新木聚糖酶对用基于玉米-玉米DDGS和小麦/麦麸的饲粮喂养的肉鸡仔鸡的生长表现的影响
Figure BDA0002655917430000863
Figure BDA0002655917430000871
在一列中，具有不同字母的平均值是显著不同的(P<0.05)。
实施例20
FveXyn4用于动物饲料(禽类)
20.1材料与方法
进行试验以评估FveXyn4对用基于玉米/玉米DDGS的饲粮喂养的肉鸡仔鸡的能量和营养利用/保留的效用。动物关爱和利用委员会批准了所有的禽类处理和收集程序。将256只雄性肉鸡仔鸡(Ross 708,Aviagen,Huntsville,AL)笼养在置于环境可控室内的电加热的层架式鸡笼中(model SB 4T,Alternative Design Manufacturing,Siloam Springs,AR)，进行为期21天的试验。第1至8天、第8至15天、第15至21天的笼内温度分别为35、32和27℃。
配制基于玉米的基础饲粮(表20.1)，以符合肉鸡仔鸡的营养需求。由每一种基础饲粮开发了四种实验饲粮，包括对照、FveXyn4、商业化木聚糖酶，如表20.2所鉴定。
表20.1基础饲粮的组成
Figure BDA0002655917430000872
Figure BDA0002655917430000881
A.38％Ca
B.16％Ca，21％P。
C.每千克饲粮提供：维生素A，5484IU；维生素D3，2643ICU；维生素E，11IU；甲萘醌烟酰胺亚硫酸氢盐、4.38mg；核黄素，5.49mg；d-泛酸、11mg；烟酸、44.1mg；氯化胆碱、771mg；维生素B12、13.2ug；生物素、55.2ug；单硝酸硫胺素、2.2mg；叶酸、990ug；吡哆醇盐酸盐、3.3mg；I,1.11mg；Mn、66.06mg；Cu、4.44mg；Fe、44.1mg；Zn、44.1mg；Se、300ug。每克预混物还含有：维生素A、1828IU；维生素D3、881ICU；维生素E，3.67IU；甲萘醌烟酰胺亚硫酸氢盐、1.46mg；核黄素、1.83mg；d-泛酸、3.67mg；烟酸、14.69mg；氯化胆碱、257mg；维生素B12、4.4ug；生物素、18.4ug；单硝酸硫胺素、735ug；叶酸、330ug；吡哆醇盐酸盐、1.1mg；I、370ug；Mn、22.02mg；Cu、1.48mg；Fe、14.69mg；Zn、14.69mg；Se、100ug。
D.按每20g精细研磨的SBM中添加5g TiO2来制备。
E.按每9.8g精细研磨的SBM中添加0.2g植酸酶来制备。
表20.2：处理鉴定
Figure BDA0002655917430000882
1植酸酶来自Danisco Animal Nutrition
2 Econase
Figure BDA0002655917430000883
来自AB Vista
达到研究设备后，将小鸡称重，分成4个区组，并随机分配到每个区组的4个饮食组中，其中每个区组随机完全区组设计中每个笼子中8只鸟。小鸡从第一天随机喂养实验饮食(麦芽浆)并还允许随意获得干净的饮用水。在孵化后第19/20和21天每天两次收集排泄物。在收集过程中，将蜡纸置于笼子下的托盘中并收集蜡纸上的排泄物。集合3天内每个笼子里收集的排泄物样品，保存在冰箱中，干燥并使用研磨器(Retsch ZM 100,GmbH&Co.K.C.,Haan,Germany)磨碎以通过0.5-mm筛。使用标准程序(AOAC,2005)分析排泄物和饮食样品的总能量、干物质、脂肪和中性去污剂纤维用于计算表观存留和AME。随后使数据进行SAS的GLM程序。
20.2结果和讨论
喂养FveXyn4的鸟与对照喂养的鸟相比存留更多的脂肪和纤维，并随后提取更多的能量(～57kcal/kg)(表6)。此外，FveXyn4喂养的鸟与商品化的木聚糖酶相比具有显著更高的纤维存留。
表20.3：新的木聚糖酶在喂养基于玉米-玉米DDGS饮食的肉鸡中对营养物和纤维存留(％)和能量(kcal/kg)利用的影响
Figure BDA0002655917430000891
在列内，具有不同字母的表示是显著不同的，(P<0.05)。
实施例21
动物饲料(家禽)中的FveXyn4
21.1材料和方法
进行实验以评价FveXyn4对喂养基于玉米-玉米DDGS饮食的肉鸡中的能量和营养物利用/存留的效力。
该实验由Animal Experimentation Committee批准并符合相关法规所需的方案。当鸟14天龄时将它们分配到饮食处理中。在天龄时，鸟一起孵蛋并接受商品化的玉米-大豆粉预实验饮食。在环境受控的房间里进行实验。
表21.1：基础饮食的组成
Figure BDA0002655917430000892
Figure BDA0002655917430000901
提供预混合物(单位kg-1饮食)；Vit A 16,000iu；Vit D3 3,000iu；Vit E 75iu；VitΒ1,3mg；Vit B2 10mg；Vit B6 3mg；Vit B12 15μg；Vit K3 5mg；烟酸60mg；泛酸14.5mg；叶酸1.5mg；生物素275μg；氯化胆碱250mg；铁20mg；铜10mg；锰100mg；钴1mg；锌82mg；碘1mg；硒0.2mg；钼0.5mg。
表21.2处理标识
Figure BDA0002655917430000902
1来自Danisco Animal Nutrition的植酸酶
2来自AB Vista的Econase
Figure BDA0002655917430000903
配制基于玉米的基础饮食(表21.1)以满足肉鸡的营养需要。从基础饮食中开发四种实验饮食以构成如表21.2中鉴定的对照、FveXyn4和商品化木聚糖酶。192只14天龄的鸟在翅膀上进行标记并分配到4个处理中，其中每个处理具有8个重复笼子并且每个重复笼子具有6只鸟。实验设计是随机完全区组，区组随机分配到房间内空间中。从第14天到第21天喂养鸟实验饮食。向鸟随意提供自来水。在第19天到第21天收集排泄的总排泄物。这使得使用总收集物计算表观总消化道存留。在化学分析之前，在强力热气烘箱长中干燥排泄物。化学分析饮食和排泄物。在强力阀烘箱中，在100℃下干燥24小时来测定干物质(DM)。使用佐克斯莱特提取器系统(AOAC 920.39)测定粗脂肪。使用Leco系统(Sweeney,1998)通过燃烧法测定氮含量。使用Short等(1996)的方法测定钛。在绝热测热计中测定总能量。随后使数据进行SAS的GLM程序。
21.2结果和讨论
与对照相比，在基于玉米-玉米DDGS的饮食中，FveXyn4增加干物质、粗蛋白和脂肪的存留(P<0.05)(表21.3)。此外，FveXyn4相对于市售饲料木聚糖酶具有更高的干物质、蛋白质和脂肪存留。这证明了FveXyn4在减轻玉米谷物和玉米副产品中的不溶性和可溶性纤维部分的不利作用中的效力。的确，在对照饮食中添加FveXyn4导致116kcal/kg的明显能量升高。
表21.3：新的木聚糖酶在喂养基于玉米-玉米DDGS的饮食的肉鸡中对表观营养物和纤维存留(％)和能量利用(kcal/kg)的影响
Figure BDA0002655917430000911
在列内，具有不同字母的表示是显著不同的，(P<0.05)。
实施例22
动物饲料(家禽)中的FveXyn4
22.1材料和方法
进行实验以评价FveXyn4对喂养基于玉米/玉米DDGS饮食和小麦/小麦麦麸的饮食的肉鸡的生长表现的剂量应答效力。实验程序由Institutional Animal EthicsCommittee批准并遵循国家的相关福利指导。使用两相喂养程序(起动机和终止机)(表22.1)。分别从第0天到第21天和第22天到42天提供起动机和终止机饮食。
表22.1：基础饮食的组成1
Figure BDA0002655917430000912
Figure BDA0002655917430000921
1植酸酶B最高补充至提供500FTU/kg的最终饲料
2每千克饮食供应：抗氧化剂,100mg；生物素,0.2mg；泛酸钙,12.8mg；维生素D3,60pg；维生素B12,0.017mg；叶酸,5.2mg；维生素K3,4mg；烟酸,35mg；维生素B6,10mg；反式-视黄醇，3.33mg；核黄素,12mg；硫胺素,3.0mg；d1-α-醋酸维生素E,60mg；氯化胆碱,638mg；Co,0.3mg；Cu,3.0mg；Fe,25mg；I,1mg；Mn,125mg；Mo,0.5mg；Se,200pg；Zn,60mg。
配制两种基础饮食(一种基于小麦/小麦麦麸和大豆粉，另一种基于玉米-玉米DDGS和大豆粉)以满足或超出肉鸡对营养物，除了AME的推荐需要(表22.1)。从每种基础饮食开发三种实验饮食以构成如表22.2中鉴定的3次剂量的FveXyn4和商品化的木聚糖酶。
表22.2处理标识
Figure BDA0002655917430000931
1AB Vista
从商品化的孵卵所获得日龄的雄性肉鸡(Ross 308)。各自称重小鸡并分配到60个孵卵器笼子中(每个笼子8只小鸡)并且10个饮食处理随机分配到各自6个笼子中。在第12天，将鸟转移到生长笼子中。孵卵器和生长笼子中每只鸟的空间分配分别是530和640cm2。在环境受控的房间中放置孵卵器和生长笼子。在第一周温度维持在31℃，然后到第三周结束时逐渐降低至22℃。鸟接受20小时的荧光照射并允许自由摄入饮食和水。在42天实验期间每周一次间隔记录体重和食物摄取。每天记录死亡率。称重死亡的任何鸟并且该重量用于调整FCR。通过总饲料摄取除以活鸟加死亡鸟的体重增加计算饲料转化率。使用SAS的General Linear Models程序(2004)分析数据作为处理的双向阶乘排列。
22.2结果和讨论
与对照和商品化木聚糖酶相比，FveXyn4在基于玉米和小麦的饮食中以剂量依赖性方式提高了饲料转化效率(表22.3)。这些观察提示木聚糖酶以更高包含率衍生的更大价值。这证明了FveXyn4在减轻谷类成分中的不溶性和可溶性纤维部分的副作用中的效力，所述成分可以显示家禽利用饮食营养物支持生长表现的能力。
表22.3：新木聚糖酶对基于玉米-玉米DDGS和小麦/小麦麦麸的饮食喂养的肉鸡的生长表现的剂量应答影响
Figure BDA0002655917430000932
Figure BDA0002655917430000941
在列内，具有不同字母的表示是显著不同的，(P<0.05)。
实施例23
FveXyn4与蛋白酶的组合
研究FveXyn4与蛋白酶组合对来自制备的不溶性DDGS的戊聚糖和蛋白质的溶解性的影响
23.1材料和方法
酶样品
用于本研究的木聚糖酶是来自Fusarium verticilloides表达于里氏木霉中的新的GH10木聚糖酶(命名为FveXyn4)，其中以纯化形式使用所述木聚糖酶，该酶在本文中可以称为FveXyn4。
用于本研究的蛋白酶是Multifect P-3000产品(可从Danisco Animal Nutrition获得)。仅在装载之前进行蛋白酶的制备。在冷却的MQ-水中稀释适量的贮存液并保持在冰上的同时进行混合。一个蛋白酶单位(U)定义为1.0μg酚化合物(表示为酪蛋白等同物)每分钟从酪蛋白底物的释放。
底物制备
对于制备不溶性DDGS底物，根据Bach Knudsen(Bach Knudsen,K.E.,Carbohydrate and lignin contents of plant materials used in animalfeeding.Animal Feed Science and Technology1997,67,319-338.)进行可溶性非淀粉多糖(S-NSP)的去除；研磨的DDGS(<212μm)和醋酸/CaCI2-缓冲液(0,1M/20mM,pH 5.0)与热稳定的α淀粉酶(E-BLAAM 53.7U/mg,Megazyme International)一起加入并在频繁混合的情况下在100℃下温育1小时。通过在60℃下与淀粉葡萄糖苷酶(E-AMGDF 36U/mg,MegazymeInternational)温育2小时完成淀粉的完全降解。去除淀粉后，通过磷酸盐缓冲液(0.2M,pH7.0)提取S-NSP并置于100℃，1小时，随后离心。然后利用磷酸盐缓冲液、乙醇(85％v/v)，并最终利用丙酮彻底洗涤沉淀，离心并在洗涤之间丢弃上清液。将样品置于室温下直至完全干燥。
程序
在制备的不溶性DDGS的戊聚糖和蛋白质的溶解性上研究FveXyn4单独或与蛋白酶组合。称重87.5mg制备的不溶性DDGS底物到1.5ml eppendorf管中并与柠檬酸盐缓冲液(25mM,pH 6)、木聚糖酶(对于玉米和小麦DDGS分别为217mg/kg底物和206mg/kg底物)和蛋白酶(8.6x105U/kg底物)混合到1.0ml的最终反应体积。在39℃下，通过使用EppendorfThermoMixer温育箱(Eppendorf)1300rpm进行温育4小时。温育后，过滤样品并分析可溶性戊聚糖和蛋白质含量，如下所述。一式两份进行反应。
蛋白质定量
使用来自Pierce的BCA(bicinchoninic acid)Protein Assay Kit定量可溶性蛋白质。在微量滴定板(25μΙ/孔)中制备样品并与200μΙ预先混合的测定试剂在37℃下1100rpm温育30分钟。在562nm针对0-2000μg/ml Bovine Serum Albumin(BSA)标准分光光度计测量吸光值，如手册中所述。校正添加的酶量的值。
C5糖(戊聚糖)的定量
使用Rouau和Surget(1994,A rapid semi-automated method of thedetermination of total and water-extractable pentosan in wheatflours.Carbohydrate Polymers,24,123-32)的方法，利用连续流注射装置(图7)测定进入到溶液中的戊聚糖的总量。利用酸处理上清液，以水解多糖成为单糖。加入间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)用于与单戊糖和单己糖反应，其形成有颜色的络合物。
通过测量550nm处的吸光值与510nm处的相比的差异，使用标准曲线计算溶液中戊糖的量。不像戊糖-间苯三酚络合物，己糖-间苯三酚络合物的吸光值在这些波长下是恒定的。向间苯三酚溶液中加入葡萄糖以产生恒定葡萄糖信号并进一步保证没有来自己糖的干扰。
统计学分析
单因素ANOVA应用于实验数据上用于比较戊聚糖和蛋白质的溶解性上的处理，其中通过Holm-Sidak方法，使用SigmaPlot 12.0(SyStat Software Inc.)进行配对比较。整体显著水平在P＝0.05。
23.2结果和讨论
通过不溶性玉米和小麦DDGS与木聚糖酶以及蛋白酶单独和组合的温育测定戊聚糖和蛋白质溶解。
在图27(不溶性玉米DDGS)和图28(不溶性小麦DDGS)中显示了结果。
图27显示了木聚糖酶和蛋白酶处理单独和组合对来自不溶性玉米DDGS的戊聚糖和蛋白质溶解的作用。根据单因素ANOVA和Holm-Sidak比较，字母a-d具有显著差异，整体显著水平在P＝0.05。误差线指示了S.D。
图28显示了木聚糖酶和蛋白酶处理单独和组合对来自不溶性小麦DDGS的戊聚糖和蛋白质溶解的作用。根据单因素ANOVA和Holm-Sidak比较，字母a-d具有显著差异，整体显著水平在P＝0.05。误差线指示了S.D。
当与仅木聚糖酶处理的作用相比时，木聚糖酶和蛋白酶的组合进一步增加来自玉米和小麦DDGS的蛋白的溶解。更有趣的是，添加蛋白酶还显著增加了戊聚糖从玉米和小麦DDGS两者中的溶解，表明其中添加蛋白酶通过经蛋白降解打开饲料基质结构从而增加木聚糖酶对底物的接近程度。此外，木聚糖酶自身以及与蛋白酶组合还分别相比于对照和单独蛋白酶增加蛋白的溶解。这进一步支持木聚糖酶和蛋白酶之间的协同作用的理论。
实施例24
FveXyn4和FoxXyn2在戊聚糖溶解(不溶性阿拉伯糖基木聚糖(AXinsol)的分解或溶解)中的比较
使用从玉米DDGS中溶解不溶性阿拉伯糖基木聚糖的能力作为关键选择标准之一并且在该实验中将从玉米DDGS中溶解阿拉伯糖基木聚糖的能力与本发明的两种木聚糖酶(FveXyn4和FoxXyn2)进行比较。
两种木聚糖酶显示出对从玉米DDGS中戊聚糖溶解强且相等的性能，表明这些同源木聚糖酶对从纤维副产品中将阿拉伯糖基木聚糖溶解的相等性能。
24.1材料和方法
酶样品
本研究中所用的木聚糖酶为：
来自Fusarium verticilloides表达于里氏木霉中的GH10木聚糖酶(命名为FveXyn4)，其中该木聚糖酶以纯化的形式使用——该酶可以在本文中称为FveXyn4，和来自Fusarium oxysporum表达于里氏木霉中的GH10木聚糖酶(命名为FoxXyn2)，其中该木聚糖酶以纯化的形式使用——该酶可以在本文中称为FoxXyn2。
饲料原材料
该实验中所用的饲料为玉米DDGS。
戊聚糖溶解(AXinsol溶解)
用于戊聚糖溶解的方法为：将100mg饲料原材料转移至2ml Eppendorf离心管中并记录准确重量。加入750μL温育缓冲液(200mM HEPES,100mM NaCl,2mM CaCl,pH 6.0)和900μl氯霉素溶液(40μg/ml于温育溶液中)。加入所选的酶使得总体积为1.8ml。
两次重复测定每一样品，并与空白(无外源加入的酶的温育)平行测定。将该样品在Eppendorf热混合仪中在40℃下摇动温育。温育2或18小时后，将上清液使用96孔滤器板(Pall Corporation,AcroPrep 96Filter Plate,1.0μm Glass,NTRL,1mL孔)进行过滤。过滤后，将样品储存在4℃直至分析C5糖、阿拉伯糖和木糖的总量。
C5糖(戊聚糖)的定量
加入溶液中的戊糖总量使用Rouau和Surget(1994,A rapid semi-automatedmethod of the determination of total and water-extractable pentosan in wheatflours.Carbohydrate Polymers,24,123-32)的方法用连续流动注射仪器进行测量(图7)。将上清液用酸处理以水解多糖为单糖。加入间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)来与单戊糖和单己糖反应，其形成带有颜色的络合物。通过测量在550nm处的吸光度相比于510nm处的差异，溶液中的戊糖的量使用标准曲线来计算。与戊糖-间苯三酚络合物不同，己糖-间苯三酚复合物的吸光度在这些波长下是恒定的。将葡萄糖加入到间苯三酚溶液中以产生恒定的葡萄糖信号并进一步保证没有来自己糖的干扰。
24.2结果和讨论
使用玉米的纤维副产品(即cDDGS)在剂量应答设定中监测戊聚糖溶解。
比较本发明的两种木聚糖酶(FveXyn4和FoxXyn2)的结果显示于图29(在玉米DDGS)中。
图29显示来自cDDGS的戊聚糖的溶解为木聚糖酶剂量的函数。所用的木聚糖酶为本发明的木聚糖酶(FveXyn4和FoxXyn2)。
两种木聚糖酶均在玉米中表现优秀且在分解基于玉米的底物中的AXinsol(例如，溶解戊聚糖)中同样良好，其明确地表明这两种同源木聚糖酶在来自纤维副产品的阿拉伯糖基木聚糖的溶解中表现相同。
上述说明书中提到的所有出版物都作为参考引入本发明。本发明描述的方法和系统的各种改变和变化形式对于本领域技术人员是显而易见的，并不背离本发明的范围和精神。虽然本发明通过特定的优选实施方式进行了描述，应当理解的是，要求保护的发明不应当过度的限制到这样的特定实施方式。实际上，为实现本发明而描述的模式所做的对生物化学和生物技术或相关领域技术人员而言是显而易见的多种改变包括在下述权利要求的范围之内。
序列表
<110> 杜邦营养生物科学有限公司(DuPont Nutrition Biosciences ApS)
<120> 用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶
<130> P045404PCT1
<150> PCT/CN2012/079650
<151> 2012-08-03
<150> CN 201310311358.1
<151> 2013-07-23
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 328
<212> PRT
<213> 轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)
<400> 1
Met Lys Leu Ser Ser Phe Leu Tyr Thr Ala Ser Leu Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
Pro Thr Ala Ile Glu Pro Arg Gln Ala Ala Asp Ser Ile Asn Lys Leu
20 25 30
Ile Lys Asn Lys Gly Lys Leu Tyr Tyr Gly Thr Ile Thr Asp Pro Asn
35 40 45
Leu Leu Gly Val Ala Lys Asp Thr Ala Ile Ile Lys Ala Asp Phe Gly
50 55 60
Ala Val Thr Pro Glu Asn Ser Gly Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser
65 70 75 80
Gln Gly Lys Phe Asn Phe Gly Ser Phe Asp Gln Val Val Asn Phe Ala
85 90 95
Gln Gln Asn Gly Leu Lys Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Ser
100 105 110
Gln Leu Pro Gln Trp Val Lys Asn Ile Asn Asp Lys Ala Thr Leu Thr
115 120 125
Lys Val Ile Glu Asn His Val Thr Gln Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly
130 135 140
Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ile Phe Glu Trp Asp Gly
145 150 155 160
Thr Leu Arg Lys Asp Ser His Phe Asn Asn Val Phe Gly Asn Asp Asp
165 170 175
Tyr Val Gly Ile Ala Phe Arg Ala Ala Arg Lys Ala Asp Pro Asn Ala
180 185 190
Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala Ser Lys
195 200 205
Val Thr Lys Gly Met Val Pro Ser Val Lys Lys Trp Leu Ser Gln Gly
210 215 220
Val Pro Val Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Asp Pro Gly Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gln Ile Gln Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Asn Ser Gly Val
245 250 255
Lys Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Thr Ala Pro Ala Asn
260 265 270
Asp Tyr Ala Thr Val Thr Lys Ala Cys Leu Asn Val Pro Lys Cys Ile
275 280 285
Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ser Asp Lys Asn Ser Trp Arg Lys Glu
290 295 300
His Asp Ser Leu Leu Phe Asp Ala Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Ala Tyr
305 310 315 320
Thr Ala Val Val Asn Ala Leu Arg
325
<210> 2
<211> 313
<212> PRT
<213> 轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)
<400> 2
Ile Pro Thr Ala Ile Glu Pro Arg Gln Ala Ala Asp Ser Ile Asn Lys
1 5 10 15
Leu Ile Lys Asn Lys Gly Lys Leu Tyr Tyr Gly Thr Ile Thr Asp Pro
20 25 30
Asn Leu Leu Gly Val Ala Lys Asp Thr Ala Ile Ile Lys Ala Asp Phe
35 40 45
Gly Ala Val Thr Pro Glu Asn Ser Gly Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro
50 55 60
Ser Gln Gly Lys Phe Asn Phe Gly Ser Phe Asp Gln Val Val Asn Phe
65 70 75 80
Ala Gln Gln Asn Gly Leu Lys Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp His
85 90 95
Ser Gln Leu Pro Gln Trp Val Lys Asn Ile Asn Asp Lys Ala Thr Leu
100 105 110
Thr Lys Val Ile Glu Asn His Val Thr Gln Val Val Gly Arg Tyr Lys
115 120 125
Gly Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ile Phe Glu Trp Asp
130 135 140
Gly Thr Leu Arg Lys Asp Ser His Phe Asn Asn Val Phe Gly Asn Asp
145 150 155 160
Asp Tyr Val Gly Ile Ala Phe Arg Ala Ala Arg Lys Ala Asp Pro Asn
165 170 175
Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala Ser
180 185 190
Lys Val Thr Lys Gly Met Val Pro Ser Val Lys Lys Trp Leu Ser Gln
195 200 205
Gly Val Pro Val Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Asp Pro Gly
210 215 220
Ala Ala Gly Gln Ile Gln Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Asn Ser Gly
225 230 235 240
Val Lys Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Thr Ala Pro Ala
245 250 255
Asn Asp Tyr Ala Thr Val Thr Lys Ala Cys Leu Asn Val Pro Lys Cys
260 265 270
Ile Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ser Asp Lys Asn Ser Trp Arg Lys
275 280 285
Glu His Asp Ser Leu Leu Phe Asp Ala Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Ala
290 295 300
Tyr Thr Ala Val Val Asn Ala Leu Arg
305 310
<210> 3
<211> 305
<212> PRT
<213> 轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)
<400> 3
Gln Ala Ala Asp Ser Ile Asn Lys Leu Ile Lys Asn Lys Gly Lys Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Thr Ile Thr Asp Pro Asn Leu Leu Gly Val Ala Lys Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Ile Lys Ala Asp Phe Gly Ala Val Thr Pro Glu Asn Ser
35 40 45
Gly Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Gly Lys Phe Asn Phe Gly
50 55 60
Ser Phe Asp Gln Val Val Asn Phe Ala Gln Gln Asn Gly Leu Lys Val
65 70 75 80
Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Gln Trp Val Lys
85 90 95
Asn Ile Asn Asp Lys Ala Thr Leu Thr Lys Val Ile Glu Asn His Val
100 105 110
Thr Gln Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val
115 120 125
Val Asn Glu Ile Phe Glu Trp Asp Gly Thr Leu Arg Lys Asp Ser His
130 135 140
Phe Asn Asn Val Phe Gly Asn Asp Asp Tyr Val Gly Ile Ala Phe Arg
145 150 155 160
Ala Ala Arg Lys Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr
165 170 175
Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala Ser Lys Val Thr Lys Gly Met Val Pro
180 185 190
Ser Val Lys Lys Trp Leu Ser Gln Gly Val Pro Val Asp Gly Ile Gly
195 200 205
Ser Gln Thr His Leu Asp Pro Gly Ala Ala Gly Gln Ile Gln Gly Ala
210 215 220
Leu Thr Ala Leu Ala Asn Ser Gly Val Lys Glu Val Ala Ile Thr Glu
225 230 235 240
Leu Asp Ile Arg Thr Ala Pro Ala Asn Asp Tyr Ala Thr Val Thr Lys
245 250 255
Ala Cys Leu Asn Val Pro Lys Cys Ile Gly Ile Thr Val Trp Gly Val
260 265 270
Ser Asp Lys Asn Ser Trp Arg Lys Glu His Asp Ser Leu Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Ala Tyr Thr Ala Val Val Asn Ala Leu
290 295 300
Arg
305
<210> 4
<211> 1039
<212> DNA
<213> 轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)
<400> 4
atgaagctgt cttctttcct ctacaccgcc tcgctggtcg cggccattcc caccgccatc 60
gagccccgcc aggctgccga cagcatcaac aagctgatca agaacaaggg caagctctac 120
tacggaacca tcaccgaccc caacctgctc ggcgtcgcaa aggacaccgc catcatcaag 180
gccgactttg gcgccgttac ccccgagaac tcgggcaagt gggacgccac cgagcccagc 240
cagggcaagt tcaacttcgg tagcttcgac caggttgtca actttgccca gcagaatggc 300
ctcaaggtcc gaggtcacac tctggtctgg cactctcagc tccctcagtg ggttaagaac 360
atcaacgaca aggctactct gaccaaggtc attgagaacc acgtcaccca agtcgttgga 420
cgctacaagg gcaagatcta cgcctgggta tgttttattc ccccagactt cttcgaaatg 480
actttgctaa catgttcagg acgtcgtcaa cgagatcttc gagtgggacg gtaccctccg 540
aaaggactct cacttcaaca acgtcttcgg caacgacgac tacgttggca ttgccttccg 600
cgccgcccgc aaggctgacc ccaacgccaa gctgtacatc aacgactaca gcctcgactc 660
cggcagcgcc tccaaggtca ccaagggtat ggttccctcc gtcaagaagt ggctcagcca 720
gggcgttccc gtcgacggca ttggctctca gactcacctt gaccccggtg ccgctggcca 780
aatccagggt gctctcactg ccctcgccaa ttctggtgtc aaggaggttg ccatcaccga 840
gctcgacatc cgcactgccc ccgccaacga ctacgctacc gtcaccaagg cctgcctcaa 900
cgtccccaag tgcattggta tcaccgtctg gggtgtctct gacaagaact cttggcgcaa 960
ggagcacgac agtcttctgt tcgatgctaa ctacaacccc aagcctgctt acactgctgt 1020
tgtcaacgct ctccgctaa 1039
<210> 5
<211> 987
<212> DNA
<213> 轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)
<400> 5
atgaagctgt cttctttcct ctacaccgcc tcgctggtcg cggccattcc caccgccatc 60
gagccccgcc aggctgccga cagcatcaac aagctgatca agaacaaggg caagctctac 120
tacggaacca tcaccgaccc caacctgctc ggcgtcgcaa aggacaccgc catcatcaag 180
gccgactttg gcgccgttac ccccgagaac tcgggcaagt gggacgccac cgagcccagc 240
cagggcaagt tcaacttcgg tagcttcgac caggttgtca actttgccca gcagaatggc 300
ctcaaggtcc gaggtcacac tctggtctgg cactctcagc tccctcagtg ggttaagaac 360
atcaacgaca aggctactct gaccaaggtc attgagaacc acgtcaccca agtcgttgga 420
cgctacaagg gcaagatcta cgcctgggac gtcgtcaacg agatcttcga gtgggacggt 480
accctccgaa aggactctca cttcaacaac gtcttcggca acgacgacta cgttggcatt 540
gccttccgcg ccgcccgcaa ggctgacccc aacgccaagc tgtacatcaa cgactacagc 600
ctcgactccg gcagcgcctc caaggtcacc aagggtatgg ttccctccgt caagaagtgg 660
ctcagccagg gcgttcccgt cgacggcatt ggctctcaga ctcaccttga ccccggtgcc 720
gctggccaaa tccagggtgc tctcactgcc ctcgccaatt ctggtgtcaa ggaggttgcc 780
atcaccgagc tcgacatccg cactgccccc gccaacgact acgctaccgt caccaaggcc 840
tgcctcaacg tccccaagtg cattggtatc accgtctggg gtgtctctga caagaactct 900
tggcgcaagg agcacgacag tcttctgttc gatgctaact acaaccccaa gcctgcttac 960
actgctgttg tcaacgctct ccgctaa 987
<210> 6
<211> 942
<212> DNA
<213> 轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)
<400> 6
attcccaccg ccatcgagcc ccgccaggct gccgacagca tcaacaagct gatcaagaac 60
aagggcaagc tctactacgg aaccatcacc gaccccaacc tgctcggcgt cgcaaaggac 120
accgccatca tcaaggccga ctttggcgcc gttacccccg agaactcggg caagtgggac 180
gccaccgagc ccagccaggg caagttcaac ttcggtagct tcgaccaggt tgtcaacttt 240
gcccagcaga atggcctcaa ggtccgaggt cacactctgg tctggcactc tcagctccct 300
cagtgggtta agaacatcaa cgacaaggct actctgacca aggtcattga gaaccacgtc 360
acccaagtcg ttggacgcta caagggcaag atctacgcct gggacgtcgt caacgagatc 420
ttcgagtggg acggtaccct ccgaaaggac tctcacttca acaacgtctt cggcaacgac 480
gactacgttg gcattgcctt ccgcgccgcc cgcaaggctg accccaacgc caagctgtac 540
atcaacgact acagcctcga ctccggcagc gcctccaagg tcaccaaggg tatggttccc 600
tccgtcaaga agtggctcag ccagggcgtt cccgtcgacg gcattggctc tcagactcac 660
cttgaccccg gtgccgctgg ccaaatccag ggtgctctca ctgccctcgc caattctggt 720
gtcaaggagg ttgccatcac cgagctcgac atccgcactg cccccgccaa cgactacgct 780
accgtcacca aggcctgcct caacgtcccc aagtgcattg gtatcaccgt ctggggtgtc 840
tctgacaaga actcttggcg caaggagcac gacagtcttc tgttcgatgc taactacaac 900
cccaagcctg cttacactgc tgttgtcaac gctctccgct aa 942
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物1
<400> 7
caccatgaag ctgtcttctt tcctcta 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2
<400> 8
tttttagcgg agagcgttga caacagc 27
<210> 9
<211> 328
<212> PRT
<213> 尖镰孢(Fusarium oxysporum)
<400> 9
Met Lys Leu Ser Ser Phe Leu Tyr Thr Ala Ser Leu Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
Pro Thr Ala Ile Glu Pro Arg Gln Ala Ser Asp Ser Ile Asn Lys Leu
20 25 30
Ile Lys Asn Lys Gly Lys Leu Tyr Tyr Gly Thr Ile Thr Asp Pro Asn
35 40 45
Leu Leu Gly Val Ala Lys Asp Thr Ala Ile Ile Lys Ala Asp Phe Gly
50 55 60
Ala Val Thr Pro Glu Asn Ser Gly Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser
65 70 75 80
Gln Gly Lys Phe Asn Phe Gly Ser Phe Asp Gln Val Val Asn Phe Ala
85 90 95
Gln Gln Asn Gly Leu Lys Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Ser
100 105 110
Gln Leu Pro Gln Trp Val Lys Asn Ile Asn Asp Lys Ala Thr Leu Thr
115 120 125
Lys Val Ile Glu Asn His Val Thr Asn Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly
130 135 140
Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ile Phe Asp Trp Asp Gly
145 150 155 160
Thr Leu Arg Lys Asp Ser His Phe Asn Asn Val Phe Gly Asn Asp Asp
165 170 175
Tyr Val Gly Ile Ala Phe Arg Ala Ala Arg Lys Ala Asp Pro Asn Ala
180 185 190
Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala Ser Lys
195 200 205
Val Thr Lys Gly Met Val Pro Ser Val Lys Lys Trp Leu Ser Gln Gly
210 215 220
Val Pro Val Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Asp Pro Gly Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gln Ile Gln Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Asn Ser Gly Val
245 250 255
Lys Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Thr Ala Pro Ala Asn
260 265 270
Asp Tyr Ala Thr Val Thr Lys Ala Cys Leu Asn Val Pro Lys Cys Ile
275 280 285
Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ser Asp Lys Asn Ser Trp Arg Lys Glu
290 295 300
His Asp Ser Leu Leu Phe Asp Ala Asn Tyr Asn Pro Lys Ala Ala Tyr
305 310 315 320
Thr Ala Val Val Asn Ala Leu Arg
325
<210> 10
<211> 313
<212> PRT
<213> 尖镰孢(Fusarium oxysporum)
<400> 10
Ile Pro Thr Ala Ile Glu Pro Arg Gln Ala Ser Asp Ser Ile Asn Lys
1 5 10 15
Leu Ile Lys Asn Lys Gly Lys Leu Tyr Tyr Gly Thr Ile Thr Asp Pro
20 25 30
Asn Leu Leu Gly Val Ala Lys Asp Thr Ala Ile Ile Lys Ala Asp Phe
35 40 45
Gly Ala Val Thr Pro Glu Asn Ser Gly Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro
50 55 60
Ser Gln Gly Lys Phe Asn Phe Gly Ser Phe Asp Gln Val Val Asn Phe
65 70 75 80
Ala Gln Gln Asn Gly Leu Lys Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp His
85 90 95
Ser Gln Leu Pro Gln Trp Val Lys Asn Ile Asn Asp Lys Ala Thr Leu
100 105 110
Thr Lys Val Ile Glu Asn His Val Thr Asn Val Val Gly Arg Tyr Lys
115 120 125
Gly Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ile Phe Asp Trp Asp
130 135 140
Gly Thr Leu Arg Lys Asp Ser His Phe Asn Asn Val Phe Gly Asn Asp
145 150 155 160
Asp Tyr Val Gly Ile Ala Phe Arg Ala Ala Arg Lys Ala Asp Pro Asn
165 170 175
Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala Ser
180 185 190
Lys Val Thr Lys Gly Met Val Pro Ser Val Lys Lys Trp Leu Ser Gln
195 200 205
Gly Val Pro Val Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Asp Pro Gly
210 215 220
Ala Ala Gly Gln Ile Gln Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Asn Ser Gly
225 230 235 240
Val Lys Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Thr Ala Pro Ala
245 250 255
Asn Asp Tyr Ala Thr Val Thr Lys Ala Cys Leu Asn Val Pro Lys Cys
260 265 270
Ile Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ser Asp Lys Asn Ser Trp Arg Lys
275 280 285
Glu His Asp Ser Leu Leu Phe Asp Ala Asn Tyr Asn Pro Lys Ala Ala
290 295 300
Tyr Thr Ala Val Val Asn Ala Leu Arg
305 310
<210> 11
<211> 305
<212> PRT
<213> 尖镰孢(Fusarium oxysporum)
<400> 11
Gln Ala Ser Asp Ser Ile Asn Lys Leu Ile Lys Asn Lys Gly Lys Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Thr Ile Thr Asp Pro Asn Leu Leu Gly Val Ala Lys Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Ile Lys Ala Asp Phe Gly Ala Val Thr Pro Glu Asn Ser
35 40 45
Gly Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Gly Lys Phe Asn Phe Gly
50 55 60
Ser Phe Asp Gln Val Val Asn Phe Ala Gln Gln Asn Gly Leu Lys Val
65 70 75 80
Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Gln Trp Val Lys
85 90 95
Asn Ile Asn Asp Lys Ala Thr Leu Thr Lys Val Ile Glu Asn His Val
100 105 110
Thr Asn Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val
115 120 125
Val Asn Glu Ile Phe Asp Trp Asp Gly Thr Leu Arg Lys Asp Ser His
130 135 140
Phe Asn Asn Val Phe Gly Asn Asp Asp Tyr Val Gly Ile Ala Phe Arg
145 150 155 160
Ala Ala Arg Lys Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr
165 170 175
Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala Ser Lys Val Thr Lys Gly Met Val Pro
180 185 190
Ser Val Lys Lys Trp Leu Ser Gln Gly Val Pro Val Asp Gly Ile Gly
195 200 205
Ser Gln Thr His Leu Asp Pro Gly Ala Ala Gly Gln Ile Gln Gly Ala
210 215 220
Leu Thr Ala Leu Ala Asn Ser Gly Val Lys Glu Val Ala Ile Thr Glu
225 230 235 240
Leu Asp Ile Arg Thr Ala Pro Ala Asn Asp Tyr Ala Thr Val Thr Lys
245 250 255
Ala Cys Leu Asn Val Pro Lys Cys Ile Gly Ile Thr Val Trp Gly Val
260 265 270
Ser Asp Lys Asn Ser Trp Arg Lys Glu His Asp Ser Leu Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Asn Tyr Asn Pro Lys Ala Ala Tyr Thr Ala Val Val Asn Ala Leu
290 295 300
Arg
305
<210> 12
<211> 1039
<212> DNA
<213> 尖镰孢(Fusarium oxysporum)
<400> 12
atgaagctgt cttccttcct ctacaccgcc tcgctggtcg cggccattcc caccgccatc 60
gagccccgcc aggcctccga cagcatcaac aagctgatca agaacaaggg caagctctac 120
tacggaacca tcaccgaccc caacctgctc ggcgtcgcaa aggacactgc catcatcaag 180
gctgactttg gcgccgtcac acccgagaac tcgggtaagt gggatgccac cgagcccagc 240
cagggcaagt tcaacttcgg cagcttcgac caggtcgtca actttgctca gcagaatggc 300
ctcaaggtcc gaggtcacac tctagtctgg cactcccagc tccctcagtg ggttaagaac 360
atcaacgaca aggctacttt gaccaaggtc atcgagaacc acgtcaccaa cgtcgttgga 420
cgctacaagg gcaagatcta cgcctgggta tgttttcttc actcgaactt cttataaatg 480
gctttactaa catgttcagg acgtcgttaa cgagatcttc gactgggatg gtaccctccg 540
aaaggactct cacttcaaca acgtcttcgg caacgacgac tacgttggca ttgccttccg 600
cgctgcccgc aaggctgacc ccaacgccaa gctgtacatc aacgactaca gcctcgactc 660
cggcagcgcc tccaaggtca ccaagggcat ggttccctct gtcaagaagt ggctcagcca 720
gggcgtcccc gtcgacggta ttggttctca gactcacctt gaccccggtg ccgctggcca 780
aatccagggt gctctcactg ccctcgccaa ctctggtgtg aaggaggttg ccatcaccga 840
gctcgacatc cgcactgccc ccgccaacga ctacgctacc gttaccaagg cctgcctcaa 900
cgtccccaag tgcattggta tcaccgtctg gggcgtatct gacaagaact cttggcgcaa 960
ggagcacgac agccttctgt tcgatgctaa ctacaacccc aaggctgctt acactgctgt 1020
tgtcaacgct ctccgctaa 1039
<210> 13
<211> 987
<212> DNA
<213> 尖镰孢(Fusarium oxysporum)
<400> 13
atgaagctgt cttccttcct ctacaccgcc tcgctggtcg cggccattcc caccgccatc 60
gagccccgcc aggcctccga cagcatcaac aagctgatca agaacaaggg caagctctac 120
tacggaacca tcaccgaccc caacctgctc ggcgtcgcaa aggacactgc catcatcaag 180
gctgactttg gcgccgtcac acccgagaac tcgggtaagt gggatgccac cgagcccagc 240
cagggcaagt tcaacttcgg cagcttcgac caggtcgtca actttgctca gcagaatggc 300
ctcaaggtcc gaggtcacac tctagtctgg cactcccagc tccctcagtg ggttaagaac 360
atcaacgaca aggctacttt gaccaaggtc atcgagaacc acgtcaccaa cgtcgttgga 420
cgctacaagg gcaagatcta cgcctgggac gtcgttaacg agatcttcga ctgggatggt 480
accctccgaa aggactctca cttcaacaac gtcttcggca acgacgacta cgttggcatt 540
gccttccgcg ctgcccgcaa ggctgacccc aacgccaagc tgtacatcaa cgactacagc 600
ctcgactccg gcagcgcctc caaggtcacc aagggcatgg ttccctctgt caagaagtgg 660
ctcagccagg gcgtccccgt cgacggtatt ggttctcaga ctcaccttga ccccggtgcc 720
gctggccaaa tccagggtgc tctcactgcc ctcgccaact ctggtgtgaa ggaggttgcc 780
atcaccgagc tcgacatccg cactgccccc gccaacgact acgctaccgt taccaaggcc 840
tgcctcaacg tccccaagtg cattggtatc accgtctggg gcgtatctga caagaactct 900
tggcgcaagg agcacgacag ccttctgttc gatgctaact acaaccccaa ggctgcttac 960
actgctgttg tcaacgctct ccgctaa 987
<210> 14
<211> 942
<212> DNA
<213> 尖镰孢(Fusarium oxysporum)
<400> 14
attcccaccg ccatcgagcc ccgccaggcc tccgacagca tcaacaagct gatcaagaac 60
aagggcaagc tctactacgg aaccatcacc gaccccaacc tgctcggcgt cgcaaaggac 120
actgccatca tcaaggctga ctttggcgcc gtcacacccg agaactcggg taagtgggat 180
gccaccgagc ccagccaggg caagttcaac ttcggcagct tcgaccaggt cgtcaacttt 240
gctcagcaga atggcctcaa ggtccgaggt cacactctag tctggcactc ccagctccct 300
cagtgggtta agaacatcaa cgacaaggct actttgacca aggtcatcga gaaccacgtc 360
accaacgtcg ttggacgcta caagggcaag atctacgcct gggacgtcgt taacgagatc 420
ttcgactggg atggtaccct ccgaaaggac tctcacttca acaacgtctt cggcaacgac 480
gactacgttg gcattgcctt ccgcgctgcc cgcaaggctg accccaacgc caagctgtac 540
atcaacgact acagcctcga ctccggcagc gcctccaagg tcaccaaggg catggttccc 600
tctgtcaaga agtggctcag ccagggcgtc cccgtcgacg gtattggttc tcagactcac 660
cttgaccccg gtgccgctgg ccaaatccag ggtgctctca ctgccctcgc caactctggt 720
gtgaaggagg ttgccatcac cgagctcgac atccgcactg cccccgccaa cgactacgct 780
accgttacca aggcctgcct caacgtcccc aagtgcattg gtatcaccgt ctggggcgta 840
tctgacaaga actcttggcg caaggagcac gacagccttc tgttcgatgc taactacaac 900
cccaaggctg cttacactgc tgttgtcaac gctctccgct aa 942
<210> 15
<211> 305
<212> PRT
<213> 镰孢菌属物种(Fusarium sp).
<400> 15
Gln Ala Ala Asp Ser Ile Asn Lys Leu Ile Lys Asn Lys Gly Lys Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Thr Ile Thr Asp Pro Asn Leu Leu Gly Val Ala Lys Asp
20 25 30
Thr Ala Val Ile Lys Ala Asp Phe Gly Ala Val Thr Pro Glu Asn Ser
35 40 45
Gly Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Gly Asn Phe Asn Phe Gly
50 55 60
Ser Phe Asp Gln Val Val Asn Phe Ala Gln Gln Asn Gly Leu Lys Val
65 70 75 80
Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Gln Trp Val Lys
85 90 95
Asn Ile Asn Asp Lys Ala Thr Leu Thr Lys Val Ile Glu Asn His Val
100 105 110
Thr Gln Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val
115 120 125
Val Asn Glu Ile Phe Asp Trp Asp Gly Thr Leu Arg Lys Asp Ser His
130 135 140
Phe Asn Asn Val Phe Gly Asn Asp Asp Tyr Val Gly Ile Ala Phe Arg
145 150 155 160
Ala Ala Arg Lys Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr
165 170 175
Ser Leu Asp Ser Ala Ser Ala Ser Lys Val Thr Lys Gly Met Val Pro
180 185 190
Ser Val Lys Lys Trp Leu Ser Gln Gly Val Pro Val Asp Gly Ile Gly
195 200 205
Ser Gln Ser His Leu Asp Pro Gly Ala Ala Gly Gln Val Gln Gly Ala
210 215 220
Leu Thr Ala Leu Ala Asn Ser Gly Val Lys Glu Val Ala Ile Thr Glu
225 230 235 240
Leu Asp Ile Arg Thr Ala Pro Ala Asn Asp Tyr Ala Thr Val Thr Lys
245 250 255
Ala Cys Leu Asn Val Pro Lys Cys Ile Gly Ile Thr Val Trp Gly Val
260 265 270
Ser Asp Lys Asn Ser Trp Arg Lys Glu His Asp Ser Leu Leu Phe Asp
275 280 285
Ser Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Ala Tyr Thr Ala Val Val Asn Ala Leu
290 295 300
Arg
305
<210> 16
<211> 1039
<212> DNA
<213> 镰孢菌属物种(Fusarium sp).
<400> 16
atgaagctgt cttctttcct ctacaccgcc tcgctggtcg cggccattcc caccgccatc 60
gagccccgcc aggccgccga cagcatcaac aagctgatca agaacaaggg caagctctac 120
tacggaacca tcaccgaccc caacctgctc ggcgtcgcaa aggacaccgc cgtcatcaag 180
gccgactttg gcgccgtcac ccccgagaac tcgggcaagt gggacgccac cgagcccagc 240
cagggcaact tcaacttcgg tagcttcgac caggtcgtca actttgctca gcagaatggc 300
ctcaaggtcc gaggtcacac tctggtctgg cactctcagc tccctcagtg ggttaagaac 360
atcaacgaca aggctactct gaccaaggtc attgagaacc acgtcaccca agtcgttgga 420
cgctacaagg gcaagatcta cgcctgggta tgttttcttg cctcgacctt ctcaaagatg 480
aatttgctaa catgttcagg acgttgtcaa cgagatcttc gactgggacg gtaccctccg 540
aaaggattct cacttcaaca acgtcttcgg caacgatgac tacgttggca ttgccttccg 600
cgccgcccgc aaggctgacc ccaacgccaa gctgtacatc aacgactaca gcctcgactc 660
cgccagcgcc tccaaggtca ccaagggcat ggtcccctcc gtcaagaagt ggctcagcca 720
gggcgttccc gtcgacggca ttggctccca gtctcacctt gaccccggtg ccgctggcca 780
agtccagggt gctctcactg ccctcgccaa ctctggtgtc aaggaggttg ccatcaccga 840
gctcgacatc cgcactgccc ccgccaacga ctacgccacc gtcaccaagg cctgcctaaa 900
cgtccccaag tgcattggta tcaccgtctg gggtgtctct gacaagaact cttggcgcaa 960
ggagcacgac agccttctgt tcgactccaa ctacaacccc aagcctgctt acactgctgt 1020
tgtcaacgct ctccgctaa 1039
<210> 17
<211> 987
<212> DNA
<213> 镰孢菌属物种(Fusarium sp).
<400> 17
atgaagctgt cttctttcct ctacaccgcc tcgctggtcg cggccattcc caccgccatc 60
gagccccgcc aggccgccga cagcatcaac aagctgatca agaacaaggg caagctctac 120
tacggaacca tcaccgaccc caacctgctc ggcgtcgcaa aggacaccgc cgtcatcaag 180
gccgactttg gcgccgtcac ccccgagaac tcgggcaagt gggacgccac cgagcccagc 240
cagggcaact tcaacttcgg tagcttcgac caggtcgtca actttgctca gcagaatggc 300
ctcaaggtcc gaggtcacac tctggtctgg cactctcagc tccctcagtg ggttaagaac 360
atcaacgaca aggctactct gaccaaggtc attgagaacc acgtcaccca agtcgttgga 420
cgctacaagg gcaagatcta cgcctgggac gttgtcaacg agatcttcga ctgggacggt 480
accctccgaa aggattctca cttcaacaac gtcttcggca acgatgacta cgttggcatt 540
gccttccgcg ccgcccgcaa ggctgacccc aacgccaagc tgtacatcaa cgactacagc 600
ctcgactccg ccagcgcctc caaggtcacc aagggcatgg tcccctccgt caagaagtgg 660
ctcagccagg gcgttcccgt cgacggcatt ggctcccagt ctcaccttga ccccggtgcc 720
gctggccaag tccagggtgc tctcactgcc ctcgccaact ctggtgtcaa ggaggttgcc 780
atcaccgagc tcgacatccg cactgccccc gccaacgact acgccaccgt caccaaggcc 840
tgcctaaacg tccccaagtg cattggtatc accgtctggg gtgtctctga caagaactct 900
tggcgcaagg agcacgacag ccttctgttc gactccaact acaaccccaa gcctgcttac 960
actgctgttg tcaacgctct ccgctaa 987
<210> 18
<211> 942
<212> DNA
<213> 镰孢菌属物种(Fusarium sp).
<400> 18
attcccaccg ccatcgagcc ccgccaggcc gccgacagca tcaacaagct gatcaagaac 60
aagggcaagc tctactacgg aaccatcacc gaccccaacc tgctcggcgt cgcaaaggac 120
accgccgtca tcaaggccga ctttggcgcc gtcacccccg agaactcggg caagtgggac 180
gccaccgagc ccagccaggg caacttcaac ttcggtagct tcgaccaggt cgtcaacttt 240
gctcagcaga atggcctcaa ggtccgaggt cacactctgg tctggcactc tcagctccct 300
cagtgggtta agaacatcaa cgacaaggct actctgacca aggtcattga gaaccacgtc 360
acccaagtcg ttggacgcta caagggcaag atctacgcct gggacgttgt caacgagatc 420
ttcgactggg acggtaccct ccgaaaggat tctcacttca acaacgtctt cggcaacgat 480
gactacgttg gcattgcctt ccgcgccgcc cgcaaggctg accccaacgc caagctgtac 540
atcaacgact acagcctcga ctccgccagc gcctccaagg tcaccaaggg catggtcccc 600
tccgtcaaga agtggctcag ccagggcgtt cccgtcgacg gcattggctc ccagtctcac 660
cttgaccccg gtgccgctgg ccaagtccag ggtgctctca ctgccctcgc caactctggt 720
gtcaaggagg ttgccatcac cgagctcgac atccgcactg cccccgccaa cgactacgcc 780
accgtcacca aggcctgcct aaacgtcccc aagtgcattg gtatcaccgt ctggggtgtc 840
tctgacaaga actcttggcg caaggagcac gacagccttc tgttcgactc caactacaac 900
cccaagcctg cttacactgc tgttgtcaac gctctccgct aa 942
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物1
<400> 19
ccgcggccgc accatgaagc tgtcttcctt cctctacacc 40
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2
<400> 20
ccggcgcgcc cttattagcg gagagcgttg acaacag 37

Claims (10)

1.一种用于在基于谷物的葡萄糖生产中减小粘度的方法，包括使基于谷物的物质与木聚糖酶接触，其中所述木聚糖酶包含SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、或SEQ ID No.1所示的多肽序列；或与SEQ ID No.3或SEQ ID No.2或SEQ ID No.1具有至少75％同一性的其变体或同源物；或包含具有至少一个且少于15个氨基酸保守取代的SEQ ID No.3、SEQ ID No.2或SEQ ID No.1的多肽序列；或所述木聚糖酶由SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码；或由能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4在高严紧条件下杂交的核苷酸序列编码；或由与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5或SEQ ID No.4具有至少75％同一性的核苷酸序列编码；或由由于遗传密码子简并性而与SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、或SEQ ID No.4不同的核苷酸序列编码。
2.权利要求1的方法，其中基于谷物的物质是全谷物或部分谷物或发芽谷物。
3.权利要求1或2的方法，其中全谷物是全小麦、大麦、黑麦、黑小麦或玉米籽粒或其混合物。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中，基于谷物的物质中的阿拉伯木聚糖被溶解而不增加反应介质中的粘度。
5.权利要求1-4任一项的方法，还包括：使基于谷物的物质接触选自以下的一种或多种酶：蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或bacillolysin(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)；和/或蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)或bacillolysin(EC3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.x)或角蛋白酶(EC 3.4.x.x))。
6.权利要求1-5任一项的方法，其是小麦面筋-淀粉分离工艺的一部分。
7.权利要求1-6任一项的方法，还包括发酵葡萄糖。
8.权利要求7的方法，其中葡萄糖发酵为生物燃料或生物化学品。
9.权利要求8的方法，其中生物燃料是生物乙醇。
10.通过权利要求1-9任一项的方法产生的生物燃料。
CN202010887173.5A 2012-08-03 2013-08-02 用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶 Pending CN111893148A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2012/079650 2012-08-03
CN2012079650 2012-08-03
CN201310311358 2013-07-23
CN2013103113581 2013-07-23
CN201380051740.1A CN104755616B (zh) 2012-08-03 2013-08-02 用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380051740.1A Division CN104755616B (zh) 2012-08-03 2013-08-02 用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111893148A true CN111893148A (zh) 2020-11-06

Family

ID=48914312

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380051740.1A Active CN104755616B (zh) 2012-08-03 2013-08-02 用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶
CN202010887173.5A Pending CN111893148A (zh) 2012-08-03 2013-08-02 用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380051740.1A Active CN104755616B (zh) 2012-08-03 2013-08-02 用于溶解含有阿拉伯木聚糖的物质的木聚糖酶

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20150210993A1 (zh)
EP (1) EP2880157B1 (zh)
KR (1) KR20150038586A (zh)
CN (2) CN104755616B (zh)
AR (1) AR091983A1 (zh)
AU (1) AU2013298503A1 (zh)
BR (1) BR112015002484A2 (zh)
CA (1) CA2880774A1 (zh)
DK (1) DK2880157T3 (zh)
ES (1) ES2734145T3 (zh)
MX (2) MX365416B (zh)
PL (1) PL2880157T3 (zh)
WO (1) WO2014020142A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE041860T2 (hu) * 2014-01-31 2019-06-28 Danisco Us Inc Eljárások melléktermékek javítására fermentációs folyamatokból, amelyek xilanázt használnak
GB201418739D0 (en) 2014-10-22 2014-12-03 Univ Strathclyde Bioprocess for corproduction of products
JP2019162036A (ja) 2016-08-05 2019-09-26 味の素株式会社 ヘミセルラーゼ
CN111511771A (zh) * 2017-12-22 2020-08-07 诺维信公司 小麦研磨方法和gh8木聚糖酶
EP3818154A1 (en) * 2018-07-06 2021-05-12 DuPont Nutrition Biosciences ApS Xylanase-containing feed additives for cereal-based animal feed

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1918277A (zh) * 2003-12-19 2007-02-21 诺维信公司 糖化工艺
WO2007095398A2 (en) * 2006-02-14 2007-08-23 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9416841D0 (en) * 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
AU2002356880A1 (en) * 2001-10-31 2003-05-12 Phytex, Llc Phytase-containing animal food and method
BRPI0908879B1 (pt) * 2008-02-29 2019-07-09 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Método de degradação de planta, coquetel de degradação de plantas, material de planta homogeneizado e coquetel de enzimas
BR112015001767A2 (pt) * 2012-08-03 2017-08-08 Dupont Nutrition Biosci Aps enzimas
ES2929858T3 (es) * 2012-08-03 2022-12-02 Dupont Nutrition Biosci Aps Composición de aditivo para piensos

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1918277A (zh) * 2003-12-19 2007-02-21 诺维信公司 糖化工艺
WO2007095398A2 (en) * 2006-02-14 2007-08-23 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOLY RAVALASON,ET AL.: "Fusarium verticillioides secretome as a source of auxiliary enzymes to enhance saccharification of wheat straw" *

Also Published As

Publication number Publication date
AR091983A1 (es) 2015-03-11
US20150210993A1 (en) 2015-07-30
MX2019006356A (es) 2019-09-05
EP2880157A1 (en) 2015-06-10
MX2015001544A (es) 2015-09-21
EP2880157B1 (en) 2019-03-06
US20180094253A1 (en) 2018-04-05
US20200318092A1 (en) 2020-10-08
BR112015002484A2 (pt) 2017-11-07
WO2014020142A1 (en) 2014-02-06
MX365416B (es) 2019-06-03
PL2880157T3 (pl) 2019-08-30
ES2734145T3 (es) 2019-12-04
KR20150038586A (ko) 2015-04-08
CA2880774A1 (en) 2014-02-06
CN104755616B (zh) 2020-11-06
AU2013298503A1 (en) 2015-02-26
DK2880157T3 (da) 2019-06-11
CN104755616A (zh) 2015-07-01
US10612014B2 (en) 2020-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020203266B2 (en) Protein
US20190090525A1 (en) Xylanases for solubilizing arabinoxylan-containing material
US20200318092A1 (en) Xylanases for solubilising arabinoxylan-containing material
CN106103707B (zh) 使用木聚糖酶改善发酵过程副产物的方法
US20150351433A1 (en) Method
US20230093634A1 (en) Xylanases for solubilising arabinoxylan-containing material

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20201106