CN108977493A

CN108977493A - 采用木质纤维素制备虾青素的方法

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Publication number: CN108977493A
Application number: CN201810939518.XA
Authority: CN
Inventors: 崔球; 刘亚君; 宋晓金
Original assignee: Qingdao Zhongke Chao Sheng Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Zhongke Chao Sheng Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: CN108977493B

Abstract

针对现有技术中在红法夫酵母发酵生产虾青素以及木质纤维素酶解方面所存在的问题，本发明提供了通过木质纤维素类农林废弃物的高效糖化来生产虾青素的工艺，所述工艺包括预处理、糖化、红法夫酵母发酵和虾青素提取等步骤。本发明所述的工艺通过采用木质纤维素生物质为原料，一方面显著降低了糖化阶段的用酶成本和微生物发酵的生产成本，另一方面还解决了农林废弃物的综合利用问题。通过联合木质纤维素生物糖化与红法夫酵母高密度发酵阶段，使得糖化完成后的灰分可以进一步作为酵母发酵的固体基质，提高发酵密度。本发明所述的工艺中，虾青素占菌体干重比例可以达到2.6％，酵母菌体生物量可达65g/L。通过分子蒸馏等工艺，获得精制虾青素纯度大于90％。

Description

采用木质纤维素制备虾青素的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用木质纤维素原料生产虾青素的方法。

背景技术

虾青素(astaxanthin)，又名虾黄质、龙虾壳色素，化学名称：3，3′-二羟基-4，4′-二酮基β-胡萝卜素，色素Aj067-69CAS No:472-61-7，分子式C40H52O4，分子量为596.86。虾青素是一种类胡萝卜素，具有最强的抗氧化性，可以有效清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力，维持机体平衡和减少衰老细胞的堆积，从而保护皮肤健康，促进毛发生长，抗衰老、缓解运动疲劳、增强活力。此外，虾青素具有能提高免疫力，预防肿瘤、心血管疾病以及眼部疾病等功效，因此在食品、医药和化妆品等领域有广阔的应用前景。

虽然虾青素广泛存在于虾、蟹、鱼、藻体、酵母和鸟类的羽毛中，但相比较虾青素巨大的市场需求量，其产能过低，从而造成其衍生产品价格高昂。而化学合成的虾青素为3种结构虾青素的混合物(约左旋占25％、右旋占25％、内消旋50％)，极少抗氧化活性，美国FDA已经明文禁止化学合成的虾青素进入保健品市场。因此，目前国内外主要的天然虾青素生产方法均为通过微生物发酵法获得，微生物发酵法具有条件温和，易于大规模生产等优势，所用的微生物主要为雨声红球藻和红法夫酵母，其中红法夫酵母具有生长快速、易大规模培养的优势。

利用红法夫酵母发酵的方法来生产虾青素的现有技术包括：专利201711302561公开了一种利用诱变的红法夫酵母菌株与亲本菌株通过原生质体融合实现虾青素与甘露糖联产发酵的方法，其中原生质体的制备需要纤维素酶、溶菌酶和蜗牛酶，红法夫酵母的发酵采用高浓度的葡萄糖为碳源。专利CN201711208328提供一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，首先通过将虾下脚料研磨和酶解，获得酶解液，用于制备发酵基质；然后进行红发夫酵母发酵，并利用超临界二氧化碳萃取的方法获得虾青素粗提物。专利CN201711208300公开了一种高产天然虾青素的方法，与专利CN201711208328不同的是，采用海带下脚料作为原料进行酶解。专利CN201711208328和专利CN201711208300都在酶解液中添加了秸秆纤维素干物质，但是作为固体基质的作用进行红法夫酵母的发酵，而不是作为发酵的碳源。专利CN200910238464公开了一株产虾青素的海洋红酵母YS-185及其发酵生产虾青素的方法，其中酵母发酵采用的碳源为葡萄糖、果糖及麦芽糖。

综上可知，现有生产虾青素的以红法夫酵母发酵为代表的微生物发酵法中，主要以玉米淀粉来源的葡萄糖作为主要碳源，因此葡萄糖的供给和原料成本是影响微生物发酵产能和经济性的主要限制因素。因此，开发低成本新型碳源以及配套的生物制备技术具有必要性和广阔的应用前景。

木质纤维素是一类供应丰富且环境友好的可再生生物质，包括秸秆、废纸浆、稻壳、酒糟等农林废弃物。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成。其中，纤维素是由葡萄糖组成的。因此，木质纤维素生物质是潜在的廉价葡萄糖原料，发展以木质纤维素原料为底物的葡萄糖酸钠的生产方法，可以显著降低发酵生产成本，并同时解决农林废弃物的综合利用问题。

目前，木质纤维素的生物转化一般都是采用真菌来源的纤维素酶，存在效率和成本上的不足，基于真菌来源纤维素酶制剂的木质纤维素生物转化难以实现大规模应用。已知纤维小体是热纤梭菌等厌氧细菌生产的一种具有复杂结构和组分的多酶复合体，是自然界中已知的最高效的纤维素降解体系之一。尽管纤维小体及其生产菌株在木质纤维素糖化应用中具有巨大潜力，但仍需进一步改造，解除反馈抑制，提高酶解活力。

发明内容

针对现有技术中在红法夫酵母发酵生产虾青素以及木质纤维素酶解方面所存在的问题，本发明提供了通过木质纤维素类农林废弃物的高效糖化来生产虾青素的工艺，从而大大降低发酵的碳源成本。

本发明的技术方案：

采用木质纤维素制备虾青素的方法，包括以下步骤：

(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含量不高于25％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:2-1:25将步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的糖化培养基中，将纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34-65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液；所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。糖化过程中可通过流加氢氧化钠的方式使pH控制在5.8-6.2。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-180g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器，或者不经过过滤直接进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在18-24℃的温度条件、5.0-8.0的pH下发酵2-5天，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束；或者在发酵过程中连续流加步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，在18-24℃的温度条件、补氮且5.0-8.0的pH下发酵5-10天，获得发酵液。

所述的发酵培养基按照质量比例含有以下成分：玉米浆0.5％-6％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.5％，海水晶3％，维生素B1 0.02％，维生素B6 0.02％，维生素B12 0.005％，生物素0.005％。其余为水，pH 7.0。

(4)虾青素提取：将步骤(3)得到的发酵液离心处理，将类酵母菌菌体细胞与发酵后培养基进行固液分离；将得到的红法夫酵母菌菌体细胞酶解破壁之后，采用有机溶剂萃取法提取虾青素粗品，蒸馏得到精制虾青素。

所述方法还包括步骤(5)，具体为：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释或经过1-3倍稀释，用于配制步骤(2)的糖化培养基。

其中，步骤(2)所述的纤维素酶制剂，是通过非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分相互作用，将非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中得到的；所述非纤维小体蛋白为木聚糖酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、膨胀因子、蛋白酶、淀粉酶或果胶酶；所述纤维小体为由厌氧细菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体。所述的纤维小体中的组分为脚架蛋白、有催化功能的酶、组装模块。

所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分相互作用的方式为间接性连接或者直接性连接；所述间接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分通过共价相互作用进行连接，所述直接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接。

优选的是，所述非纤维小体蛋白具有序列表SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列；以及与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如SEQID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。其中：SEQ ID NO:15:Genbank序列号CRZ35393.1；SEQ ID NO:16:由基因组CP001393.1中1968724至1973904核酸序列编码；SEQ ID NO:17:Genbank序列号为KC763474.1；SEQ ID NO:18:由基因组CP001393.1中2531445至2532785核酸序列编码。

优选的是，所述厌氧细菌为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)，黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum)，嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)，解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)，解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)，溶纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens)，白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)，黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)。其中，所述热纤梭菌为表达外泌的β1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌。

其中，所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过共价相互作用进行连接，具体为：非纤维小体蛋白和纤维小体组分分别与具有共价相互作用的多肽片段连接，利用多肽片段间特异性共价相互作用实现纤维小体组分与非纤维小体蛋白的共价交联，利用纤维小体组分所带的组装模块，使非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中。所述与非纤维小体蛋白和纤维小体组分共价相互作用的多肽片段为SEQ ID NO:4中所示的碱基序列或SEQID NO:5中所示的氨基酸序列。具体实现步骤包括：

1)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与共价相互作用的多肽片段对中的一个片段(多肽片段I或II，即SEQ ID NO:4或5)的编码基因；

2)根据1)，通过基因克隆的方法，连接纤维小体组分蛋白与共价相互作用的多肽片段对中的另一个片段(多肽片段II或I，即SEQ ID NO:5或4)的编码基因。

3)根据1)，将非纤维小体蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达质粒；

4)根据2)，将纤维小体组分蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌同源重组质粒，并根据基因组序列设计同源臂。

5)将4)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选实现重组基因序列对基因组上原始纤维小体组分蛋白序列的替换，从而构建重组菌株，实现纤维小体组分蛋白与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。

6)将3)中获得的质粒转化到5)中获得的重组菌株中，实现非纤维小体蛋白与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。

最终获得的重组菌株中，基因组表达的纤维小体组分蛋白与质粒表达的非纤维小体蛋白通过所融合的多肽片段I及II间的特异性共价相互作用实现共价交联，并组装在纤维小体复合体中。

其中，所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接，具体为：非纤维小体蛋白与纤维小体的组装模块或具有组装模块的蛋白组分进行融合表达，通过组装模块间的特异性的非共价相互作用，实现将非纤维小体蛋白组装在纤维小体复合体中。所述融合表达为：非纤维小体蛋白的编码基因插入到编码纤维小体组分蛋白的序列的N端、C端或结构域序列中间的基因组上。

所述各自呼应的模块为粘连模块与对接模块。所述对接模块为SEQ ID NO:6、SEQID NO:9-13、SEQ ID NO:14中所示的碱基序列，粘连模块为SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。具体实现步骤包括：

1)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与I型对接模块(SEQ ID NO:6)的编码基因，或

2)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与II型粘连模块(SEQ ID NO:7)的编码基因

3)将1)或2)获得非纤维小体蛋白与组装模块的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达质粒

4)将3)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，实现非纤维小体蛋白与I型对接模块或II型粘连模块在产纤维小体细菌胞内的融合表达。

最终获得的重组菌株中，质粒表达的非纤维小体蛋白通过所融合的I型对接模块或II型粘连模块实现与纤维小体脚架蛋白进行特异性非共价相互作用，从而组装在纤维小体复合体中。

所述直接融合表达的具体实现步骤包括：

1)通过基因克隆的方法，将非纤维小体蛋白的编码基因连接到产纤维小体细菌同源重组质粒中，并根据基因组序列设计同源臂。

2)将1)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选实现非纤维小体蛋白的编码基因插入到基因组上纤维小体组分蛋白的序列的N端或C端或结构域序列中间，从而构建重组菌株，实现非纤维小体蛋白与纤维小体组分蛋白在产纤维小体细菌胞内的融合表达。

最终获得的重组菌株中，非纤维小体蛋白利用与其融合表达的纤维小体组分蛋白的组装模块结合到纤维小体复合体中。

优选的是，步骤(1)中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合；预处理后的木质纤维素底物为木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于12％。

优选的是，步骤(2)糖化步骤中的温度条件为55-60℃，水解体系中的固液重量体积比为1:3-1:10。

优选的是，步骤(3)中，当葡萄糖浓度为60-120g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器。所述补氮操作具体为：流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了以木质纤维素为原料发酵红法夫酵母生产虾青素的工艺，与现有采用玉米淀粉来源的葡萄糖作为碳源的发酵工艺相比，本发明所述的工艺通过采用木质纤维素生物质为原料，一方面显著降低了糖化阶段的用酶成本和微生物发酵的生产成本，另一方面还解决了农林废弃物的综合利用问题。

(2)本发明通过联合木质纤维素生物糖化与红法夫酵母高密度发酵阶段，使得糖化完成后的灰分可以进一步作为酵母发酵的固体基质，提高发酵密度；而且无需过滤，简化了操作工艺，进一步降低了生产成本。

(3)本发明所述的工艺中，木质纤维素糖化阶段培养基与发酵培养基可循环使用，可以显著节水和减少化学品使用，具有减少废水排放和降低成本的显著效果；这两点在产业上具有重要的意义，不但具有巨大的经济效益，而且环境友好，必然可以走的更加长远。

(4)本发明所述的工艺中，虾青素占菌体干重比例可以达到2.6％，酵母菌体生物量可达65g/L。通过分子蒸馏等工艺，获得精制虾青素纯度大于90％。与现有化学法生产技术相比，过程温和、简单，与现有发酵生产技术相比，虾青素生产水平更高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：通过间接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂

通过无缝克隆，将tdk表达盒(包含gapDH基因的启动子)以及pyrF表达盒(包含pyrF自身启动子)克隆到质粒pHK(Mohr,G.,Hong,W.,Zhang,J.,Cui,G.-Z.,Yang,Y.,Cui,Q.,et al.(2013)A targetron system for gene targeting in thermophiles and itsapplication in Clostridium thermocellum,PLoS One 8:e69032.)的抗生素基因cat的下游，并通过引物的设计，在tdk与pyrF表达盒之间增加NheI和XbaI酶切位点，在pyrF下游添加EagI和MluI酶切位点，用于同源臂片段的克隆，从而构建得到pHK-HR质粒。

选择热纤梭菌纤维小体中的纤维素酶Cel9K(外切纤维素酶，由基因组CP002416.1中2113813至2111293核酸序列编码)的酶催化结构域和对接模块之间作为靶向敲入位点。首先，将β-1,4-葡萄糖苷酶BglA(Genbank序列号为AFO70070.1)编码基因作为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，构建同源重组质粒pHK-HR-BglA。上游同源臂HR-up序列为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中2111347到2112870核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中2109848到2111354核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中2111347到2111659核酸序列。其次，将构建好的质粒转化到ΔpyrF中，并按照三步筛选获得底盘菌株。具体筛选方法为：

1)将同源重组质粒pHK-HR转化进入pyrF缺失的菌株中，利用含甲砜氯霉素的GS-2半固体培养基(KH₂PO₄ 1.5g/L,K₂HPO₄·3H₂O 3.8g/L,尿素2.1g/L,MgCl₂·6H₂O 1.0g/L,CaCl₂·2H₂O 150mg/L,FeSO₄·6H₂O 1.25mg/L,半胱氨酸盐酸1.0g/L,MOPS钠盐10g/L,酵母提取物6.0g/L,纤维二糖5.0g/L，二水柠檬酸三钠3.0g/L,刃天青0.1mg/L,pH 7.4)平板进行筛选，以获得质粒转化子。

2)获得的转化子在MJ液体培养基(KH₂PO₄ 1.5g/L,K₂HPO₄·3H₂O 3.8g/L,尿素2.1g/L,MgCl₂·6H₂O 1.0g/L,CaCl₂·2H₂O 150mg/L,FeSO₄·6H₂O 1.25mg/L,半胱氨酸盐酸1.0g/L,MOPS钠盐10g/L,纤维二糖5.0g/L，二水柠檬酸三钠3.0g/L,刃天青0.1mg/L,盐酸吡哆胺2mg/L,生物素0.2mg/L,对氨基苯甲酸0.4mg/L，维生素B12 0.2mg/L，pH 7.4)中转接三代后，涂布含10μg/mL 5-氟脱氧尿苷(FUDR)的MJ半固体培养基进行第一次同源重组筛选。在这一步骤中，由于Tdk可以将FUDR转化为对细胞有毒的F-dUMP，同时底盘细胞在MJ培养基中必须依靠质粒上的pyrF基因合成尿嘧啶核苷酸才能生存，因此，这一筛选策略保证了质粒上的同源重组模块与基因组发生同源重组的同时，重组后的质粒也发生丢失。根据长同源臂优先发生同源重组的原理，前后两个长同源臂首先与基因组发生同源重组，此时获得的重组子由出发菌株的尿嘧啶营养缺陷型回复成原养型。

3)经第一次同源重组后获得的重组子先在GS-2液体培养基中传代3次，并用相同的培养基对菌液进行梯度稀释后涂布含有500μg/mL 5-氟乳清酸(FOA)的GS-2半固体培养基进行筛选，获得目的无疤基因敲除/敲入菌株。在这一步骤中，PyrF的反向筛选作用会促使上游长同源臂和短同源臂发生第二次同源重组将pyrF表达框从基因组中去除。第二次同源重组后的突变株又从原养型突变成尿嘧啶营养缺陷型。从而实现基因组上目标位点基因的敲除、敲入或者替换。分别获得同源重组菌株ΔpyrF-I或ΔpyrF-II，分别表达Cel48S与多肽片段I或多肽片段II的融合蛋白。

选择热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶Cel48S(由基因组CP002416.1中3228088至3230229核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点，将多肽片段I(SEQ ID NO:4)或多肽片段II(SEQ ID NO:5)两个片段的编码序列作为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点分别克隆到同源重组质粒pHK-HR中，分别构建获得同源重组质粒pHK-HR-I或pHK-HR-II。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中3230200到3230700核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中3229699到3230199核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中3230200到3230500核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到上述构建的底盘菌株中，并按照上述三步筛选方法获得同源重组菌株ΔpyrF::BglA-I或ΔpyrF::BglA-II。

利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将多肽片段II或多肽片段I连接到木聚糖酶XynA(SEQ ID NO:1)的3’端。利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒pHK上。将含有XynA与多肽片段I的重组序列的表达质粒转化到ΔpyrF::BglA-II；将含有XynA与多肽片段II的重组序列的表达质粒转化到ΔpyrF::BglA-I，从而实现Cel48S和XynA能够通过多肽片段I和II间特异性共价相互作用进行结合。通过提取获得热纤梭菌重组菌株的纤维小体发现，表达的具有共价结合模块的XynA可以外泌到胞外，并与具有共价结合模块的Cel48S相互作用，组装到纤维小体复合体中。将上述重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例2：通过间接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂

与实施例1不同的是，将多肽片段II或多肽片段I连接到纤维小体内切酶CelZ(SEQID NO:15)的3’端。将构建的重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例3：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂

利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将纤维素外切酶Cel9-48(SEQ ID NO:16)与热纤梭菌的II型粘连模块CohIIct的序列(SEQ ID NO:7)或I型对接模块DocIct的序列(SEQ ID NO:6)直接连接起来，其中CohIIct或DocIct的序列连接至Cel9-48序列的3’端，获得Cel9-48-DocIct或Cel9-48-CohIIct序列。

以Cel9-48-DocIct或Cel9-48-CohIIct序列为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，以乳酸脱氢酶基因clo1313_1160为靶向替换序列，构建同源重组质粒pHK-HR-cel9-48。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中1380180到1380679核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中1380634到1381133核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中1380833到1381133核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到实施例1构建的底盘菌株中，并按照实施例1的三步筛选方法获得同源重组菌株1和2。通过提取重组菌株的纤维小体发现，Cel9-48与组装模块的融合蛋白可以外泌到胞外，并通过非共价交联的相互作用方式组装到纤维小体复合体中。将上述重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例4：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂

将膨胀因子Epn(SEQ ID NO:2)编码基因作为目标序列，选择热纤梭菌纤维小体的脚架蛋白SdbA(由基因组CP002416.1中1108113至1109912核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点构建同源重组质粒pHK-HR-epn。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中1107610到1108109核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中1109916到1110415核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中1107809到1108109核酸序列。

利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将木聚糖酶XynA(SEQ ID NO:1)与II型粘连模块CohII的序列(SEQ ID NO:7)直接连接起来，其中CohII的序列连接至XynA序列的3’端，从而获得XynA-CohII的序列。以XynA-CohII序列为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，以乳酸脱氢酶基因clo1313_1878为靶向替换序列，构建同源重组质粒pHK-HR-xynA。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中2194853到2195353核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中2196312到2196811核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中2195053到2195353核酸序列。

利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将果胶酶PelA(SEQ ID NO:18)编码基因与热纤梭菌的I型对接模块DocIct的序列(SEQ ID NO:6)直接连接起来，其中DocIct的序列连接至PelA序列的3’端，获得PelA-DocIct目标序列。再利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒pHK上，获得表达质粒pHK-PcelS-PelA-DocIct。由于pHK上带有来源于热纤梭菌的纤维素酶Cel48S的启动子及信号肽序列(SEQ IDNO:8)，表达的目标基因可以外泌到细胞胞外。

将同源重组质粒pHK-HR-xynA转化到实施例3构建的重组菌株1中，并按照实施例1所述筛选方法获得同源重组菌株3。再将同源重组质粒pHK-HR-epn转化到重组菌株3中，同样的按照实施例1所述筛选方法获得同源重组菌株重组菌株4。最后，将质粒pHK-PcelS-PelA-DocIct转化到重组菌株4中，从而获得同时表达具有II型粘连模块的XynA、具有I型对接模块的Cel9-48和PelA以及融合蛋白Epn-SdbA的热纤梭菌重组菌株5。

通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的木聚糖酶XynA、纤维素外切酶Cel9-48、果胶酶PelA都通过直接性连接的方式结合在热纤梭菌纤维小体上、膨胀因子Epn通过与脚架蛋白SdbA的融合表达也可以外泌并组装到纤维小体复合体中。将重组菌株5在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例5：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂

将实施例4构建的重组菌株5，在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例6：通过直接性连接的方法，构建基于黄色溶纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂

利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将纤维素外切酶Cel48S与黄色溶纤梭菌的I型对接模块序列DocIccl(SEQ ID NO:9)连接起来，其中DocIccl的序列连接至Cel48S序列的3’端，从而获得Cel48S-DocIccl序列。再利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒pHK上。构建好的质粒转化到黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum DSM 19732)中获得表达的具有DocIccl的Cel48S重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIccl的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到黄色溶纤梭菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例7：通过直接性连接的方法，构建基于白色瘤胃球菌纤维小体的纤维素酶制剂

与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与白色瘤胃球菌的I型对接模块序列DocIra(SEQ ID NO:10)连接起来，从而获得Cel48S-DocIra序列。构建好的质粒转化到白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus SY3)中获得表达的具有DocIra的Cel48S的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIra的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到白色瘤胃球菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例8：通过直接性连接的方法，构建基于黄化瘤胃球菌纤维小体的纤维素酶制剂

与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与黄化瘤胃球菌的I型对接模块序列DocIrf(SEQ ID NO:11)连接起来，从而获得Cel48S-DocIrf序列。构建好的质粒转化到黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)中获得表达的具有DocIrf的Cel48S的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIrf的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到黄化瘤胃球菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例9：通过直接性连接的方法，构建基于溶纤维假拟杆菌纤维小体的纤维素酶制剂

与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与溶纤维假拟杆菌的I型对接模块序列DocIpc(SEQ ID NO:13)连接起来，从而获得Cel48S-DocIpc序列。构建好的质粒转化到溶纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens DSM 2933)中获得表达的具有DocIpc的Cel48S的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIpc的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到溶纤维假拟杆菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例10：通过直接性连接的方法，构建基于嗜纤维梭菌纤维小体的纤维素酶制剂

将蛋白酶ProL(SEQ ID NO:3)编码基因作为目标序列，选择嗜纤维梭菌纤维小体的纤维素酶Clocel_2823(由基因组CP002160.1中3464080至3466140核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点。利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，构建同源重组质粒pHK-HR-ProL。同源臂HR-up、HR-down和HR-short分别为Clostridiumcellulovorans 743B基因组中(NCBI数据库中序列号为CP002160.1)中3466141到3466640、3465641到3466140以及3466141到3466441核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到pyrF缺失的743B突变株中，并按照实施例1的方法筛选获得蛋白酶ProL与纤维素酶Clocel_2823融合表达的同源重组菌。通过提取重组菌株的纤维小体发现，该融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例11：通过直接性连接的方法，构建基于解纤维梭菌纤维小体的纤维素酶制剂

与实施例10不同的是，将淀粉酶AmyA(SEQ ID NO:17)编码基因作为目标序列，选择解纤维梭菌纤维小体的纤维素酶Ccel_0729(由基因组CP001348.1中843122至845197核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点。同源臂HR-up、HR-down和HR-short分别为Clostridium cellulolyticum H10基因组中(NCBI数据库中序列号为NC_011898)中842441到842941、842942到843441以及842641到842941核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到pyrF缺失的H10突变株中，筛选获得淀粉酶AmyA与纤维素酶Ccel_0729融合表达的同源重组菌。通过提取重组菌株的纤维小体发现，该融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例12：通过直接性连接的方法，构建基于解纤维醋弧菌纤维小体的纤维素酶制剂

与实施例10不同的是，将果胶酶PelA(SEQ ID NO:18)编码基因与解纤维醋弧菌的I型对接模块序列DocIac(SEQ ID NO:14)连接起来，从而获得PelA-DocIac序列。构建好的质粒转化到解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)中。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的PelA可以外泌到胞外，并通过具有的DocIac组装到解纤维醋弧菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。

实施例13：采用木质纤维素制备虾青素

(1)预处理：对玉米秸秆按照文献(中国造纸，2015,34,1-6)中采用的磺化法进行预处理，得到木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于10％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:6，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的6L培养基中，然后将实施例1制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在55℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。糖化过程中可通过流加氢氧化钠的方式使pH控制在5.8-6.2。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到70-80g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在20℃的温度条件、8.0的pH条件下发酵5天，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。

所述的发酵培养基按照质量百分比由以下组分组成：玉米浆0.6％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.8％，硫酸镁0.5％，海水晶3％，维生素B1 0.02％，维生素B6 0.02％，维生素B120.005％，生物素0.005％，其余为水，pH 7.0。

(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释，直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。

实施例14：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对小麦秸秆按照专利CN201610133959中采用的水热与磺化法联合预处理法进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于8％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:3.5，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的350L培养基中，然后将实施例2制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到140-150g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在22℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵7天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释3倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。

实施例15：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对灌木枝条按照文献(Bin Li,et al.Recent progress on thepretreatment and fractionation of lignocelluloses for Biorefinery atQIBEBT.Journal of Bioresources and Bioproducts,2017,2(1),4-9)中的碱法预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于7.5％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:8，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的800L培养基中，然后将实施例3制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到90-110g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在18℃的温度条件、7.0的pH条件下发酵8天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释1倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。

实施例16：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对木片按照文献(Biotechnology for Biofuels，2014，7:116)中的碱法与水热相结合的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于10％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:10，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的1000L培养基中，然后将实施例4制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到60-70g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在24℃的温度条件、5.0的pH条件下发酵4天，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。

实施例17：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对稻草按照文献(纤维素科学与技术，2002，3，47-52)中的汽爆预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含量不高于14.5％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的5L培养基中，然后将实施例5制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在58℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到50-60g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在19℃的温度条件、8.0的pH条件下发酵7天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

实施例18：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对废纸按照文献(Bioresource Technology，2004，91，93-100)中的水热预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于7％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:2，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例6制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在37℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到160-180g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在20℃的温度条件、5.0的pH条件下发酵9天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

实施例19：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对麦秆按照实施例13预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:15，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的3L培养基中，然后将实施例7制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在37℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到30-50g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在23℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵5天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。

实施例20：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(2)糖化：按照固液重量体积比1:10，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例8制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到40-60g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在24℃的温度条件、7.0的pH条件下发酵6天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同

(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释1倍然后用于配制步骤(2)的糖化培养基。

实施例21：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对麦秆按照实施例14预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于8％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:4.5，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的4.5L培养基中，然后将实施例9制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到110-130g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在21℃的温度条件、8.0的pH条件下发酵10天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍然后用于配制步骤(2)的糖化培养基。

实施例22：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对玉米芯按照文献(生物加工过程，2010，3，66-72)中的稀酸水解预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于9％，半纤维素含量不高于13％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将0.4kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例10制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在42℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到60-80g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在20℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵7天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

实施例23：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对废纸按照实施例17的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于7％，半纤维素含量不高于9％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:25，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的5L培养基中，然后将实施例11制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在40℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-35g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在18℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵2天，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

实施例24：采用木质纤维素制备虾青素

与实施例13不同的是，

(1)预处理：对玉米芯按照实施例17的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于5％，半纤维素含量不高于25％的木质纤维素底物；

(2)糖化：按照固液重量体积比1:3，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的0.6L培养基中，然后将实施例12制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在40℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到100-120g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在22℃的温度条件、5.5的pH条件下发酵5天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮。

(4)虾青素提取：与实施例13相同。

(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍，然后直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。

表1.实施例13-24采用木质纤维素制备虾青素的结果列表

由表1可知，实施例13-24中采用木质纤维素制备虾青素的方法，纤维素糖化率为80.90-90.80％，虾青素占菌体干重的比例为0.96-2.65％，酵母菌体生物量为10.28-65.08g/L，虾青素产量为0.10-1.45g/L，虾青素纯度90.3-95.1％，培养基再利用后的纤维素糖化率为81.10-90.6％。这说明，本发明所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，不但具有原料来源广泛且廉价的优势，而且通过木质纤维素生物糖化与红法夫酵母高密度发酵相结合，实现了高的虾青素的产量和得率。

此外，与第一轮的纤维素糖化率相比，培养基再利用后的纤维素糖化率相差无几，说明本发明所述的工艺中，木质纤维素糖化阶段培养基与发酵培养基可循环使用，可以显著节水和减少化学品使用，具有减少废水排放和降低成本的显著效果。本发明所述的工艺中，虾青素占菌体干重比例可以达到2.6％，酵母菌体生物量可达65g/L。通过分子蒸馏等工艺，获得精制虾青素纯度大于90％。与现有化学法生产技术相比，过程温和、简单，与现有发酵生产技术相比，虾青素生产水平更高。

序列表

<110> 青岛中科潮生生物技术有限公司

<120> 采用木质纤维素制备虾青素的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 212

<212> PRT

<213> 热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor sp. )

<400> 1

Ala Ile Thr Leu Thr Ser Asn Ala Ser Gly Thr Tyr Asp Gly Tyr Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Ser Gly Asn Thr Thr Met Thr Val Asp Thr

20 25 30

Gly Gly Arg Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Asn Asn Ala Leu Phe

35 40 45

Arg Thr Gly Lys Lys Phe Asn Thr Ala Trp Asn Gln Leu Gly Thr Val

50 55 60

Lys Ile Thr Tyr Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu

65 70 75 80

Cys Ile Tyr Gly Trp Ser Lys Asn Pro Leu Val Glu Phe Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Thr

100 105 110

Val Thr Ile Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Val

115 120 125

Asn Gln Pro Ser Ile Glu Gly Thr Thr Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser

130 135 140

Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Asp His

145 150 155 160

Phe Lys Ala Trp Ala Ala Lys Gly Leu Asn Leu Gly Thr Ile Asp Gln

165 170 175

Ile Thr Leu Cys Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Ile

180 185 190

Thr Gln Asn Thr Phe Ser Ile Thr Ser Asp Ser Ser Gly Ser Thr Thr

195 200 205

Pro Thr Thr Thr

210

<210> 2

<211> 327

<212> PRT

<213> 黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum)

<400> 2

Met Asn Phe Lys Lys Ile Arg Leu Phe Thr Ala Ile Leu Ile Ile Ala

1 5 10 15

Ala Gln Val Leu Ser Tyr Asn Phe Ile Ser Ser Ala Gln Leu Gln Val

20 25 30

Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Asn Val Asp Ser Ile Asp Phe Ala Leu

35 40 45

Met Lys Ser Phe Ile Leu Lys Ile Ile Asn Thr Leu Pro Ala Glu Asp

50 55 60

Ser Leu Leu Ala Gly Asp Leu Asp Gly Asp Gly Ser Ile Asn Ser Ile

65 70 75 80

Asp Cys Ala Leu Met Lys Gln Tyr Leu Leu Gly Met Ile Lys Val Phe

85 90 95

Pro Lys Thr Gln Ser Pro Ala Pro Thr Pro Thr Asn Thr Pro Leu Pro

100 105 110

Glu Tyr Ser Glu Pro Tyr Pro Gly Trp Asp Lys Ile Arg Ser Gly Tyr

115 120 125

Ala Thr Tyr Thr Gly Ser Gly Tyr Val Gly Gly Ile Ala Leu Leu Asp

130 135 140

Pro Ile Pro Glu Asp Met Glu Ile Val Ala Val Asn Lys Pro Asp Phe

145 150 155 160

Asn Cys Tyr Gly Val Gln Ala Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Leu Glu Val

165 170 175

Thr Gly Pro Lys Gly Thr Thr Val Val Tyr Val Thr Asp Cys Tyr Thr

180 185 190

Glu Ala Pro Glu Gly Ala Leu Asp Leu Cys Gly Ile Ser Cys Asp Lys

195 200 205

Ile Gly Asp Thr Asn Val Pro Gly Gly Lys Ile Asp Val Thr Trp Arg

210 215 220

Ile Ile Pro Ala Pro Ile Thr Gly Asn Phe Ile Tyr Arg Ile Leu Pro

225 230 235 240

Ala Ser Ser Lys Trp Trp Phe Ala Ile Gln Val Arg Asn His Lys Tyr

245 250 255

Pro Val Met Lys Met Glu Tyr Phe Lys Asp Gly Glu Trp Val Asp Ile

260 265 270

Pro Lys Asp Arg Cys Asn Tyr Phe Val Ile Asn Asn Leu Asp Thr Ser

275 280 285

Asn Leu Lys Ile Arg Ile Thr Asp Ile Arg Gly Lys Val Val Thr Asp

290 295 300

Ile Ile Asp Pro Ile Pro Asp Asn Leu Met Asn Gly Cys Phe Ile Gln

305 310 315 320

Gly Asn Val Gln Phe Pro Asp

325

<210> 3

<211> 440

<212> PRT

<213> 溶蛋白杆菌(Coprothermobacter proteolyticus)

<400> 3

Met Lys Lys Ile Leu Leu Thr Leu Val Ile Ala Val Leu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ala Gly Val Lys Ser Ala Glu Leu Leu Phe Val Ser Asn Ser

20 25 30

Thr Thr Thr Asn Gln Glu Asp Pro Glu Asn Glu Ile Ile Val Gly Tyr

35 40 45

Lys Glu Asn Thr Asp Val Ala Val Leu Ser Lys Gln Val Glu Lys Thr

50 55 60

Thr Gly Ala Lys Leu Ser Arg Lys Gly Leu Lys Asn Phe Ala Val Phe

65 70 75 80

Lys Leu Pro Gln Gly Lys Ala Ala Asp Val Val Met Asn Gln Leu Lys

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Asn Asp Pro Asn Val Glu Tyr Val Glu Pro Asn Tyr Ile Ala His Ala

100 105 110

Phe Asp Val Pro Asn Asp Thr Phe Phe Asn Pro Tyr Gln Trp Asn Phe

115 120 125

Tyr Asp Tyr Gly Met Thr Ser Asn Gly Tyr Val Ser Asn Tyr Gly Ile

130 135 140

Gln Ala Val Ser Ala Trp Asn Ile Thr Lys Gly Ala Gly Val Lys Val

145 150 155 160

Ala Ile Ile Asp Thr Gly Val Ala Tyr Glu Asn Tyr Gly Ala Tyr Thr

165 170 175

Lys Ala Pro Asp Leu Ala Asn Thr Leu Phe Asp Thr Ala Asn Ala Tyr

180 185 190

Asp Phe Val Asn Asn Asp Thr His Ala Asn Asp Asp Asn Ser His Gly

195 200 205

Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Gln Ser Thr Asn Asn Gly Met Gly

210 215 220

Ala Ala Gly Ile Ala Tyr Gln Ala Thr Ile Leu Pro Ile Lys Val Leu

225 230 235 240

Asp Ser Glu Gly Ser Gly Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Asn Gly Ile Ile

245 250 255

Trp Ala Ala Asp Lys Gly Ala Arg Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

260 265 270

Ser Ser Gly Ser Thr Thr Leu Gln Asn Ala Ile Gln Tyr Ala Tyr Asn

275 280 285

Lys Gly Val Val Ile Val Cys Ala Ser Gly Asn Asp Arg Arg Ser Thr

290 295 300

Val Ser Tyr Pro Ala Ala Tyr Thr Gln Cys Ile Ala Val Gly Ser Thr

305 310 315 320

Arg Phe Asp Gly Thr Arg Ala Arg Tyr Ser Asn Tyr Gly Ser Ala Leu

325 330 335

Asp Ile Val Ala Pro Gly Gly Asp Thr Ser Val Asp Gln Asn His Asp

340 345 350

Gly Tyr Gly Asp Gly Ile Leu Gln Gln Thr Phe Ala Glu Gly Ser Pro

355 360 365

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370 375 380

His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Val Leu Ser Ala His Pro Thr Tyr

385 390 395 400

Thr Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Leu Gln Ser Thr Ala Lys Asp Leu

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Gly Thr Ala Gly Trp Asp Lys Tyr Tyr Gly Tyr Gly Leu Val Asn Ala

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Tyr Ala Ala Val Asn Trp Thr Pro

435 440

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)

<400> 4

Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 97

<212> PRT

<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)

<400> 5

Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser

1 5 10 15

Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu

20 25 30

Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser

35 40 45

Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly

50 55 60

Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala

65 70 75 80

Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn

85 90 95

Gly

<210> 6

<211> 55

<212> PRT

<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)

<400> 6

Tyr Gly Asp Val Asn Asp Asp Gly Lys Val Asn Ser Thr Asp Ala Val

1 5 10 15

Ala Leu Lys Arg Tyr Val Leu Arg Ser Gly Ile Ser Ile Asn Thr Asp

20 25 30

Asn Ala Asp Leu Asn Glu Asp Gly Arg Val Asn Ser Thr Asp Leu Gly

35 40 45

Ile Leu Lys Arg Tyr Ile Leu

50 55

<210> 7

<211> 160

<212> PRT

<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)

<400> 7

Ser Ser Ile Glu Leu Lys Phe Asp Arg Asn Lys Gly Glu Val Gly Asp

1 5 10 15

Ile Leu Ile Gly Thr Val Arg Ile Asn Asn Ile Lys Asn Phe Ala Gly

20 25 30

Phe Gln Val Asn Ile Val Tyr Asp Pro Lys Val Leu Met Ala Val Asp

35 40 45

Pro Glu Thr Gly Lys Glu Phe Thr Ser Ser Thr Phe Pro Pro Gly Arg

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ala Gly Tyr Lys Glu Thr Gly Val Thr Glu Glu Ser Gly Ile Ile Ala

100 105 110

Lys Ile Gly Phe Lys Ile Leu Gln Lys Lys Ser Thr Ala Val Lys Phe

115 120 125

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130 135 140

Asp Trp Asp Gly Glu Val Ile Thr Gly Tyr Glu Val Ile Gln Pro Asp

145 150 155 160

<210> 8

<211> 891

<212> DNA

<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)

<400> 8

tagtactatt aaagtcagac ttggttaaat ataaatttta tgacttgcat acaaacttga 60

tgtgtattat aataaaaata caaaacaaaa tagcaataat ttactcagtt atttttgaaa 120

tgggggtagt attaatatcg tataatgggg ttgcatatct gctgtctttc gaaaaaagca 180

caagaacttc aaatgtttcc atagtgaaat ttaaaaattg gagatttctt tgttgccccc 240

tcaaaaagta tatttttttc gaagatatat atatggaatt tattgattaa tttaagttat 300

taattttggc cttttagggt cgttgaaaac tgaatatgtt aagttgtttt gcgtgattca 360

gctgcatttg acgtaagact tcgccggtct gtttaaattc ccataataag atgtatttat 420

tgtagtaata atctggcatc tacaaatttc agtatttgca atagtctctg ttcaaaaaag 480

caattgtctt ttaaaccttt cagtattgtc ttcgtggcag tttcttttgt tatacgtcgt 540

tccgacaaaa aaatgtaaat ttatgtcaaa tgcgcggctg atttgataaa aaagtttgtt 600

aacacaaatt tattatgtta acacaagtat tttttgggtc cagcttagtt ttatgatgaa 660

aataatgcgt aaaatttatc cgcaaaaagg gggaatgaat ttattgcggg taggttgcat 720

tatttcatca tataacttaa aaagaataaa aaagtatatt tgaaagggga agatggagag 780

atggtaaaaa gcagaaagat ttctattctg ttggcagttg caatgctggt atccataatg 840

atacccacaa ctgcattcgc aggtcctaca aaggcaccta caaaagatgg g 891

<210> 9

<211> 59

<212> PRT

<213> 黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum)

<400> 9

Tyr Gly Asp Leu Asn Gly Asp Lys Leu Val Asn Ser Ile Asp Phe Ala

1 5 10 15

Leu Leu Lys Ile Tyr Leu Leu Gly Tyr Ser Lys Glu Phe Pro Tyr Glu

20 25 30

Tyr Gly Ile Lys Ser Ala Asp Leu Asn Arg Asn Gly Glu Val Asp Ser

35 40 45

Ile Asp Phe Ala Ile Leu Arg Ser Phe Leu Leu

50 55

<210> 10

<211> 57

<212> PRT

<213> 白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)

<400> 10

Arg Gly Asp Val Asn Gly Asp Gly Val Val Asn Val Thr Asp Val Ala

1 5 10 15

Lys Ile Ala Ala His Val Lys Gly Lys Lys Ile Leu Thr Gly Asp Ser

20 25 30

Leu Lys Asn Ala Asp Val Asn Phe Asp Gly Ser Val Asn Ile Thr Asp

35 40 45

Ile Thr Arg Ile Ala Ala Phe Val Lys

50 55

<210> 11

<211> 56

<212> PRT

<213> 黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)

<400> 11

Tyr Gly Asp Ala Asn Cys Asp Gly Asn Val Ser Ile Ala Asp Ala Thr

1 5 10 15

Ala Ile Leu Gln His Leu Gly Asn Arg Asp Lys Tyr Gly Leu Arg Ala

20 25 30

Gln Gly Met Leu Asn Ala Asp Val Asp Gly Gln Ser Gly Val Thr Ala

35 40 45

Asn Asp Ala Leu Val Leu Gln Lys

50 55

<210> 12

<211> 54

<212> PRT

<213> 解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)

<400> 12

Tyr Gly Asp Tyr Asn Asn Asp Gly Ser Ile Asp Ala Leu Asp Phe Ser

1 5 10 15

Ser Phe Lys Met Tyr Leu Met Asn Pro Val Arg Thr Tyr Thr Glu Val

20 25 30

Leu Asp Leu Asn Ser Asp Asn Thr Val Asp Ala Ile Asp Phe Ala Ile

35 40 45

Met Lys Gln Tyr Leu Leu

50

<210> 13

<211> 57

<212> PRT

<213> 溶纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens)

<400> 13

Tyr Gly Asp Val Thr Gly Asp Gln Leu Val Thr Asp Ala Asp Lys Thr

1 5 10 15

Lys Val Ser Asn Tyr Ile Leu Gly Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Ala Ala Ala Asp Val Asn Gly Asp Gln Val Val Asn Ser Gly Asp

35 40 45

Leu Thr Leu Ile Asn Arg His Ile Leu

50 55

<210> 14

<211> 58

<212> PRT

<213> 解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)

<400> 14

Lys Gly Asp Val Asp Leu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Phe Gly

1 5 10 15

Lys Met Arg Leu Cys Leu Leu Gly Lys Ser Pro Ala Phe Thr Gly Gln

20 25 30

Ala Leu Asp Asn Ala Asp Leu Asn Asp Asp Gly Ala Phe Asn Ser Ile

35 40 45

Asp Phe Gly Tyr Met Arg Lys Lys Leu Leu

50 55

Claims

1.采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(2)糖化：按照固液重量体积比1:2-1:25将步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的糖化培养基中，将纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34-65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液；

(3)红法夫酵母发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-180g/L后，使糖液进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的红法夫酵母种子液，在18-24℃的温度条件、5.0-8.0的pH下发酵2-5天，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束；或者在发酵过程中连续流加步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，在18-24℃的温度条件、补氮且5.0-8.0的pH下发酵5-10天，获得发酵液；

2.根据权利要求1所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：还包括步骤(5)，具体为：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释或经过1-3倍稀释，用于配制步骤(2)的糖化培养基；步骤(3)中所述的糖液进入生物反应器之前经过过滤或者不经过过滤。

3.根据权利要求2所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：所述纤维素酶制剂通过非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分相互作用，将非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中得到；所述非纤维小体蛋白为木聚糖酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、膨胀因子、蛋白酶、淀粉酶或果胶酶；所述纤维小体为由厌氧细菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体。

4.根据权利要求3所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：所述厌氧细菌为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌；所述热纤梭菌为表达外泌的β1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌。

5.根据权利要求3或4所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：所述非纤维小体蛋白具有序列表SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列；以及与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分相互作用的方式为间接性连接或者直接性连接；所述间接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分通过共价相互作用进行连接，所述直接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接。

7.根据权利要求6所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过共价相互作用进行连接为：非纤维小体蛋白和纤维小体组分分别与具有共价相互作用的多肽片段连接，利用多肽片段间特异性共价相互作用实现纤维小体组分与非纤维小体蛋白的共价交联，利用纤维小体组分所带的组装模块，使非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中；

所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体的组装模块或具有组装模块的蛋白组分进行融合表达，通过组装模块间的特异性的非共价相互作用，实现将非纤维小体蛋白组装在纤维小体复合体中；所述融合表达为：非纤维小体蛋白的编码基因插入到编码纤维小体组分蛋白的序列的N端、C端或结构域序列中间的基因组上。

8.根据权利要求7所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：步骤(2)所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5；步骤(3)所述的发酵培养基按照质量百分比由以下组分组成：玉米浆0.6％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.8％，硫酸镁0.5％，海水晶3％，维生素B1 0.02％，维生素B6 0.02％，维生素B12 0.005％，生物素0.005％，其余为水，pH 7.0。

9.根据权利要求7所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合；预处理后的木质纤维素底物为木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于12％；步骤(2)糖化步骤中的温度条件为55-60℃，体系中的固液重量体积比为1:3-1:10。

10.根据权利要求7所述的采用木质纤维素制备虾青素的方法，其特征在于：步骤(3)中，当葡萄糖浓度为60-120g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；所述补氮操作具体为：流加8％(w/v)的硫酸铵溶液进行补氮；步骤(4)中所述的有机溶剂萃取法具体为：采用乙醇和正己烷的混合液进行有机溶剂萃取。