CN105296574A - 重组人表皮生长因子原液制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组人表皮生长因子原液制备方法，该培养基由以下重量比例成分制成：甘油5.0-7.0％、酵母碱基(YNB)3.0-3.5％、微量金属离子1.8-2.2％、诱导剂1.2-1.8％、生物素0.5-1.0％、促进剂0.5-1.0％、水余量；所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；用磷酸盐缓冲液调pH为5.5-6.5。本发明使用的植物原料成分经过了蒸汽爆破、蒸馏、高剪切均质机处理，得到纳米乳状的植物油性成分，和培养基中其他配方的相容性好。本发明通过在培养基中添加植物原料成分作为促进剂，和现有技术相比，发酵液的产量会提高30-38％。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组人表皮生长因子原液制备方法。
背景技术
表皮生长因子(hEGF)是人体重要的多肽，它具有多种生物学功能，例如可与表皮细胞上特异的受体结合，将信息传递入细胞，改变细胞内的酸碱度和游离钙度，从而促进糖酵解和蛋白质合成以及增加某些专一性基因转录，促进DNA复制和细胞分裂。表皮生长因子是由Cohen等人在上世纪60年代从小鼠颌下腺发现的一种生长调节蛋白，由53个氨基酸组成，研究证实它具有广泛的刺激细胞增殖的作用。1975年，Starkey、Cohen等人从人尿中提取了人表皮生长因子(humanEpidermalGrowthFactor，hEGF)，与鼠表皮生长因子具有高度一致的结构，并具有一致的生物学活性。表皮生长因子广泛存在于人体各种组织中，可刺激多种细胞增殖，主要是上皮细胞和内皮细胞的增殖，这是通过结合细胞膜上的表皮生长因子受体(EGFR)而起作用的。EGF通过与细胞受体的膜外部分结合，激活其酪氨酸激酶活性，诱导蛋白磷酸化，启动DNA合成，激活RNA、蛋白质合成，促进细胞增生、移行。因此，hEGF可促进表皮细胞、神经细胞和器官组织上皮细胞生长；可促进新生胎儿齿、骨与各器官的生长；可促进肝细胞再生；可促进胃肠道黏膜细胞生长和保护胃肠道黏膜受损。
表皮生长因子广泛存在于人体内各种组织，含量极微，对于维持人体各种组织器官(如角结膜、皮肤、各种黏膜、腺体等)的正常生理功能具有重要作用。随着年龄的增长，体内表皮生长因子水平逐渐下降，表现为相关组织器官的衰老和退化，特别是上皮组织的衰老，因此，及时向人体补充表皮生长因子，可维护人体正常功能并延缓衰老，这是表皮生长因子在美容保健行业的应用基础。另外，在肌体受损等的情况下，内源性表皮生长因子不能满足组织修复的大量需要，及时向受损部位补充表皮生长因子，可促进受损肌体组织的修复，在临床上应用非常广泛，如用于创伤、炎症、手术、化学烧伤及干眼症等各种原因引起的角膜上皮缺损修复，烧伤、创伤、外科手术、炎症、溃疡等各种皮肤和黏膜缺损的修复。
重组人表皮生长因子(rhEGF)是通过基因工程技术将大肠杆菌或酵母分泌表达而来的，其制品纯度可达98％。重组人表皮生长因子属于分子量超过500道的大分子多肽类药物。目前，对表皮生长因子和重组表皮生长因子已有研究，例如中国专利97115284.5，公开了表皮生长因子工程菌及使用该菌制备表皮生长因子的方法，研究人员通过表皮生长因子可以得到重组人表皮生长因子(或者称为重组人表皮生长因子原液)。科技在不断进步，对于表皮生长因子和重组表皮生长因子的研究也在不断的进行当中。
发明内容
本发明的目的是提供重组人表皮生长因子原液制备方法，包括以下步骤：
1)培养基的准备：由以下重量比例成分制成：
所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；
用磷酸盐缓冲液调pH为5.5-6.5；
所述促进剂采用以下方法制备：
①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；
②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；
③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；
④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；
2)发酵、表达：应用2L摇瓶及20L原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，以1O％培养基接种后，添加诱导剂，30℃培养，控制pH7.0，氧饱和度10-50％，搅拌150-170rpm，罐压0.01378-0.03445MPa，流加甘油至每L湿菌达100-300g后流加甲醇保持其浓度为1％以进行EGF的诱导表达；
3)分离：表达结束，离心分离，收集上清既得重组克隆菌株离心液；
4)纯化：将步骤3)得到的重组克隆菌株离心液，加入硫酸铵使浓度成0.5M，上样于用5倍柱体积量的20mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5M硫酸胺溶液平衡过的疏水柱，以20mM磷酸缓冲液pH7.0,0.5M硫酸胺将进样峰洗至基线，以20mM磷酸缓冲液洗脱出EGF峰，该样品峰以20mMTris-HClpH7.6缓冲液稀释10倍后上样于Q-sepharoseHighPerformance柱，以A液(20mMTris-HClpH7.6)至B液(20mMTris-HC1pH7.6，0.5MNaCl)梯度洗脱方法收集EGF峰，最后用分子筛Superdex30柱纯化重组hEGF蛋白，纯度可达98％以上。
进一步优选的，步骤1)所述培养基的准备按照以下步骤：
培养基由以下重量比例成分制成：
所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；
用磷酸盐缓冲液调pH为6.0；
所述促进剂采用以下方法制备：
①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；
②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；
③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；
④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到。
本发明所述用水符合制药行业标准。
本发明所述积雪草、金银花的使用量，优选粉碎后的体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/4-1/3。
本发明所述用水符合制药行业标准，所述遗传工程菌株参照现有技术，优选遗传工程菌株GS115-3EGF。
步骤2)所述诱导剂为甲醇，用量1.2-1.8％(w/w)。
步骤4)所述疏水柱优选Phenylsepharose6FastFlow(highsub)柱。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明使用的植物原料成分经过了蒸汽爆破、蒸馏、高剪切均质机处理，得到纳米乳状的植物油性成分，和培养基中其他配方的相容性好。
2、现有技术中常用的工程菌的诱导方式有温控或者是化学物质，比如甲醇、IPTG等等。本发明通过在培养基中添加植物原料成分作为促进剂，和现有技术相比，表达产量会提高30-38％。
具体实施方式
下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：
重组人表皮生长因子原液制备方法，包括以下步骤：
1)培养基的准备：由以下重量比例成分制成：
所述微量金属离子为三氯化铁；
用磷酸盐缓冲液调pH为5.5；
所述促进剂采用以下方法制备：
①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；
②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/3，爆破压力3.0Mpa，保压时间维持在200s；
③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；
④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30m/s，时间3min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；
2)发酵、表达：应用2L摇瓶及20L原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，以1O％培养基接种后，添加诱导剂1.2％，30℃培养，控制pH7.0，氧饱和度50％，搅拌150rpm，罐压0.01378MPa，流加甘油至每L湿菌达100g后流加甲醇保持其浓度为1％以进行EGF的诱导表达；
3)分离：表达结束，离心分离，既得重组克隆菌株离心液；
4)纯化：将步骤3)得到的重组克隆菌株离心液，加入硫酸铵使浓度成0.5M，上样于用5倍柱体积量的20mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5M硫酸胺溶液平衡过的疏水柱(Phenylsepharose6FastFlow(highsub)柱)，以20mM磷酸缓冲液pH7.0,0.5M硫酸胺将进样峰洗至基线，以20mM磷酸缓冲液洗脱出EGF峰，该样品峰以20mMTris-HClpH7.6缓冲液稀释10倍后上样于Q-sepharoseHighPerformance柱，以A液(20mMTris-HClpH7.6)至B液(20mMTris-HC1pH7.6，0.5MNaCl)梯度洗脱方法收集EGF峰，最后用分子筛Superdex30柱纯化重组hEGF蛋白，纯度达98.5％。
实施例2：
重组人表皮生长因子原液制备方法，包括以下步骤：
1)培养基的准备：由以下重量比例成分制成：
所述微量金属离子为氯化钙；
用磷酸盐缓冲液调pH为6.5；
所述促进剂采用以下方法制备：
①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；
②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/4，爆破压力3.5Mpa，保压时间维持在180s；
③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；
④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度35m/s，时间4min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；
2)发酵、表达：应用2L摇瓶及20L原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，以1O％培养基接种后，添加诱导剂1.5％，30℃培养，控制pH7.0，氧饱和度10％，搅拌170rpm，罐压0.03445MPa，流加甘油至每L湿菌达200g后流加甲醇保持其浓度为1％以进行EGF的诱导表达；
3)分离：表达结束，离心分离，既得重组克隆菌株离心液；
4)纯化：将步骤3)得到的重组克隆菌株离心液，加入硫酸铵使浓度成0.5M，上样于用5倍柱体积量的20mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5M硫酸胺溶液平衡过的疏水柱(Phenylsepharose6FastFlow(highsub)柱)，以20mM磷酸缓冲液pH7.0,0.5M硫酸胺将进样峰洗至基线，以20mM磷酸缓冲液洗脱出EGF峰，该样品峰以20mMTris-HClpH7.6缓冲液稀释10倍后上样于Q-sepharoseHighPerformance柱，以A液(20mMTris-HClpH7.6)至B液(20mMTris-HC1pH7.6，0.5MNaCl)梯度洗脱方法收集EGF峰，最后用分子筛Superdex30柱纯化重组hEGF蛋白，纯度达99.1％。
实施例3：
重组人表皮生长因子原液制备方法，包括以下步骤：
1)培养基的准备：由以下重量比例成分制成：
所述微量金属离子为硫酸铜；
用磷酸盐缓冲液调pH为6.0；
所述促进剂采用以下方法制备：
①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；
②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/3，爆破压力3.0Mpa，保压时间维持在150s；
③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；
④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度40m/s，时间5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；
2)发酵、表达：应用2L摇瓶及20L原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，以1O％培养基接种后，添加诱导剂1.8％，30℃培养，控制pH7.0，氧饱和度30％，搅拌160rpm，罐压0.02067MPa，流加甘油至每L湿菌达300g后流加甲醇保持其浓度为1％以进行EGF的诱导表达；
3)分离：表达结束，离心分离，既得重组克隆菌株离心液；
4)纯化：将步骤3)得到的重组克隆菌株离心液，加入硫酸铵使浓度成0.5M，上样于用5倍柱体积量的20mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5M硫酸胺溶液平衡过的疏水柱(Phenylsepharose6FastFlow(highsub)柱)，以20mM磷酸缓冲液pH7.0,0.5M硫酸胺将进样峰洗至基线，以20mM磷酸缓冲液洗脱出EGF峰，该样品峰以20mMTris-HClpH7.6缓冲液稀释10倍后上样于Q-sepharoseHighPerformance柱，以A液(20mMTris-HClpH7.6)至B液(20mMTris-HC1pH7.6，0.5MNaCl)梯度洗脱方法收集EGF峰，最后用分子筛Superdex30柱纯化重组hEGF蛋白，纯度达98.8％。
Claims (4)
1.重组人表皮生长因子原液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养基的准备：由以下重量比例成分制成：
所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；
用磷酸盐缓冲液调pH为5.5-6.5；
所述促进剂采用以下方法制备：
①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；
②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；
③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；
④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；
2)发酵、表达：应用2L摇瓶及20L原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，以1O％培养基接种后，添加诱导剂，30℃培养，控制pH7.0，氧饱和度10-50％，搅拌150-170rpm，罐压0.01378-0.03445MPa，流加甘油至每L湿菌达100-300g后流加甲醇保持其浓度为1％以进行EGF的诱导表达；
3)分离：表达结束，离心分离，既得重组克隆菌株离心液；
4)纯化：将步骤3)得到的重组克隆菌株离心液，加入硫酸铵使浓度成0.5M，上样于用5倍柱体积量的20mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5M硫酸胺溶液平衡过的疏水柱，以20mM磷酸缓冲液pH7.0,0.5M硫酸胺将进样峰洗至基线，以20mM磷酸缓冲液洗脱出EGF峰，该样品峰以20mMTris-HClpH7.6缓冲液稀释10倍后上样于Q-sepharoseHighPerformance柱，以A液(20mMTris-HClpH7.6)至B液(20mMTris-HC1pH7.6，0.5MNaCl)梯度洗脱方法收集EGF峰，最后用分子筛Superdex30柱纯化重组hEGF蛋白，纯度可达98％以上。
2.根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子原液制备方法，其特征在于，步骤1)所述培养基由以下重量比例成分制成：
所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；
用磷酸盐缓冲液调pH为6.0；
所述促进剂采用以下方法制备：
①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；
②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；
③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；
④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到。
3.根据权利要求1或2所述的重组人表皮生长因子原液制备方法，其特征在于：所述积雪草、金银花的使用量，粉碎后的体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/4-1/3。
4.根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子原液制备方法，其特征在于：步骤2)所述诱导剂为甲醇，用量1.2-1.8％。
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