JP2007014342A - リラキシンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】プロリラキシンはリーダーペプチド、B−鎖、非天然型のC−鎖、およびA−鎖を含んでなり、該リーダーペプチドはB−鎖に隣接する解裂部位を含み、該非天然型のC−鎖はB−鎖およびA−鎖に隣接する解裂部位を含む。該方法は、解裂剤を用いて、該解裂部位で該リーダーおよび非天然型のC−ペプチドを、プロリラキシンから除去し、リラキシンを回収することを含む。
【選択図】なし
Description
天然のリラキシンは、シグナルペプチド、B−鎖、結合用C−ペプチドおよびA−鎖の全体構造を有する一本鎖の23kDaプレプロリラキシンとして合成される。リラキシンの生合成の間、発生期の鎖が小胞体を横切って移動する時に、シグナルペプチドは除去されて19kDaのプロリラキシンを生ずる(Reddy等、上書)。プロリラキシンのリラキシンへの更なるプロセシングは、インシュリンと類似の方法でB−およびA−鎖の間のジサルファイド架橋の生成後に、B/C−鎖およびA−/C−鎖結合部に位置する特異的な対の塩基性アミノ酸残基におけるC−ペプチドのエンドプロテオリチック解裂によりインビボで起る[Marriott等、Mol. Endo, 6, No.9(1992)]。リラキシンのジサルファイド架橋は、A8およびA13間のA鎖内部の鎖内ジサルファイド架橋と共に、A9−B10およびA22−B2のシステイン間で起る(米国特許第4,656,249号、1987年4月7日発行)。
本発明は、リーダー配列、B−鎖、非天然C−ペプチド、およびA−鎖を有する、非天然プロリラキシン形の設計および構築に基づく。リーダー配列はプロリラキシンB−鎖に隣接する解裂部位を含み、非天然のC−ペプチドは、B−鎖/C−鎖結合およびA−鎖/C−鎖結合における解裂部位を含む。本発明は非天然のプロリラキシンからの、生物学的に活性なリラキシン製造の生成物回収方法の設計にも基づく。
(a)非天然プロリラキシンをコードする核酸を提供し(該プロリラキシンはリーダー配列、B−鎖、非天然のC−鎖、およびA−鎖を含んでなり、該リーダー配列はB−鎖配列に隣接する第1の解裂部位を含み、該非天然のC−鎖はB−鎖およびA−鎖にそれぞれ隣接する第2および第3の解裂部位を含んでなる);
(b)該非天然のプロリラキシンをコードする該核酸を含む原核細胞を培養し、
該培養は該原核生物細胞中で該核酸を発現して非天然のプロリラキシンを製造し;
(c)該培養方法により製造された該プロリラキシンを単離し、可溶化させ;
(d)該可溶化させたプロリラキシンを再生させ;
(e)該プロリラキシンから該リーダー配列および該非天然のC−ペプチドを切除し、切除は該解裂部位に特異的な解裂剤の使用により行い;そして
(f)リラキシンを回収する、
ことを含んでなる、非天然プロリラキシンの発酵からのリラキシンの製造方法を提供することにより成し遂げられる。その方法はA−鎖N末端のグルタミンを環化することを更に含み得る。
Arg C、トリプシンまたはLys Cの使用により、またはトリプシンおよび
Arg Cにより好ましくは行われる。図2A〜2Dを参照。
Endocrinology, 67, 102(1960)]。ラットの子宮平滑筋インビトロアッセイ[St. Louis, J. Can. J. Physiol. Pharmacol., 59, 507(1981)]、およびホルモン刺激後のcAMPレベルの測定[Braddon, S. A., Endocrinology, 102, 1292 (1978)およびJudson等、J. Endocrinology, 87, 153(1980)]等の承認されたリラキシン分析において生物学的に活性であることが知られた、様々な形のヒトおよび非ヒトの動物リラキシンをも同様に指す。
は、所望の変異体を製造するために2ラウンド以上の突然変異誘発を必要とする。
リラキシン組成物は良好な医学的プラクティスと一致した方法で製剤化し、投薬し、投与する。これに関して考慮する要素は、治療する個々の疾患、治療する個々の哺乳動物、各患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療関係者に知られた他の要素を含む。投与すべきリラキシンの「治療的に有効な量」はそのような考慮により支配され、疾患を予防し、改善し、治療するのに必要な最小量である。
天然には存在しないプロリラキシンモデルに対する発現ビヒクルの構築
プラスミドpRB250CTscは、プロリラキシン(第1図および第3図で示す通り、トリプシン並びにトリプシン/カルボキシペプチダーゼ酵素的開裂部位をA/C鎖ジャンクションおよびB/C鎖ジャンクションに有する、天然には存在しないリーダー配列および天然には存在しないC−ペプチドを含有するハドソン(Hudson)ら,[ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル(EMBO J.) 3,2333(1984)]で開示された配列から誘導されるリラキシンAおよびB鎖)を含む。大腸菌(E.Coli)においてプロリラキシン遺伝子を発現するのに必要とされる転写および翻訳配列は、pHCH207−1から誘導されるトリプトファン(Trp)プロモーターにより与えられる[デボーア(deBoer)ら、[プロモーターズ:ストラクチャー・アンド・ファンクション(Promoters:Structure and Function),ロドリゲツ(Rodriguez)およびチェンバーリン(Chamberlain)版,M.J.ペガー(Paeger)出版社,ニューヨーク 462(1982)]から]。ラムダt0転写ターミネーター[スカルティシーズ(Scholtisses)ら,NAR 15,3185(1987)]は、プロリラキシン終止コドンに隣接した位置にある。プラスミドpRB250CTscは、形質転換宿主にテトラサイクリン耐性を与える。プラスミドpRB250CTscは、pBR322ベクターを起源とする複製起点を有する[ストクリフ(Sutcliff),コールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム・オン・クオンティタティブ・バイオロジー(Cold Spring Harbor symposium on Quantitative Biology) 43,77(1978)]。
Bss HIIの小さなフラグメントが除去されたベクターpRB151であった。第2フラグメントは、LysおよびArgを加えたブタ成長ホルモンの9つのアミノ酸にメチオニンが加えられた配列を有する、合成二本鎖のRel 52であった。
を含む、合成二本鎖のRel 58であった。
末端を含むpRB192の、200塩基対のTaq IからEco RVのフラグメントであった。
配列をコードする、以下に記載するpAPlamBを起源とする75塩基対のXba I
−EaeIのフラグメントであった。第3フラグメントは、以下の配列を有する46塩基対の合成DNA二本鎖であった。
Bgl IIからNhe Iのフラグメントであった。
酵素的開裂部位を有する、天然には存在しないリーダー−C−ペプチドを含んでなる、プロリラキシン発現ベクターのpRELCIII、pRELCAspN、およびpRELCLysC[第2図を参照]は、pRB250CTscに関する上記の通り、合成C−ペプチドコード配列の適当な置換を伴って構築される。
トリプシンおよびCPBを用いて、天然には存在しないプロリラキシンからリラキシンを製造する方法
発酵およびリフラクタイルボディの最初の単離:
pRB250CTscでトランスフェクトしたW3110tonAを発酵に使用する。37℃で約8時間増殖したLB振盪フラスコを60Lのシード発酵で接種するのに使用する。OD550が45 +/− 5となるまで60Lの培養を37℃で増殖した(約8〜9時間)後、1000Lの製造発酵を接種するのに使用する。1000Lの培養を37℃で増殖し、インドール酢酸(IAA)を加えて8時間後、通常は接種してから12〜16時間後に収穫する。使用する培地は、LBフラスコ−ルリアブイヨン + テトラサイクリン5μg/mlである。
ブイヨンを熱−殺傷装置に通すことにより、細胞を収穫時間のうちに殺す。その混合物を2〜8℃まで冷却し、最終濃度が5mMとなるまでEDTAを加えて、pHを5.5に調節する。細胞を破壊(例えば、ガウリン(Gaulin)のホモジナイザー中で)して、リフラクタイルボディを遠心分離(例えば、アルファ・ラバル(Alfa Laval) AX213)により集める。ペレット化したリフラクタイルボディを凍結して、約−70℃で保存する。
リフラクタイルボディ1kgにつき14Lから20Lの抽出緩衝液(3.5M 塩酸グアニジン/50mM トリス/0.2% EDTA,pH 8.5)中に、凍結したリフラクタイルボディを溶解する。
イオン交換カラムから得られるプールを約5〜10mg/mlまで濃縮し、5Kのカットオフ(cutoff)膜(例えば、フィルトロン(Filtron) PES オメガ(Omega))上で、50mM トリス/5mM CaCl2,pH 8.5中へ濾過(diafiltered)する。
酸性とした溶液を約85℃に加熱し、その状態で約1時間保った後、約10℃まで冷却する。その結果得られる懸濁液を、0.5M 酢酸を等容量加えることにより希釈して、遠心分離する。そのペレットを0.5M 酢酸で洗浄して、再び遠心分離してもよい。その結果得られる上澄みを合わせて、濾過する。
0.5M 酢酸/50mM トリス/5mM CaCl2,pH 3.5中で平衡とした陽イオン交換カラム(例えば、S−セファロース高性能)上に、その透明な上澄みを負荷する。ローディングが完了した後、そのカラムを最初に平衡緩衝液で洗浄した後、50mM MES,pH 7.0および50mM MES/125mM NaCl,pH 7.0で洗浄する。50mM MES,pH7.0中、125mMから140mMまでのNaClのグラジエントを用いて、リラキシンを溶離する。
前述の記載では、本発明を行うのに利用することのできる具体的方法を詳述している。本願の特定化合物を特性決定し、製造して、使用するのに、初めに利用する具体的方法、またさらには利用する具体的モデルシステムに関する開示を詳述したことで、同じ知識に達するための、またこの知識を他の化合物およびシステムにまで拡張するための、他に代わる確実な方法をどのようにして考え出したらよいかということが、当業者には十分理解されるであろう。従って、本明細書中で前述のものをどんなに詳述して公にしても、本願の全体範囲を制限するものとして解釈すべきではない。むしろ、本発明の範囲は、付記する請求の範囲の法的構成によってのみ支配されるべきである。
Claims (32)
- 非天然型プロリラキシンからリラキシンを製造する方法であって、該プロリラキシンはリーダーペプチド、B−鎖、非天然型のC−鎖、およびA−鎖を含んでなり、該リーダーペプチドはB−鎖に隣接する解裂部位を含み、該非天然型のC−鎖はB−鎖およびA−鎖に隣接する解裂部位を含み、該方法は解裂剤を用いて該解裂部位で該リーダーおよび非天然型のC−ペプチドをプロリラキシンから除去し、リラキシンを回収することを含んでなる方法。
- リラキシンがH2ヒトリラキシンである請求項1に記載の方法。
- 解裂剤が1以上の酵素である請求項1に記載の方法。
- 酵素をエンドプロテイナーゼAspN、トリプシン、エンドプロテイナーゼLysC、エンドプロテイナーゼArgC、およびカルボキシペプチダーゼBよりなる群から選択される請求項3に記載の方法。
- 酵素がカルボキシペプチダーゼBと組み合わせたトリプシンまたはエンドプロテイナーゼArgCである請求項4に記載の方法。
- 酵素がカルボキシペプチダーゼBと組み合わせたLysCである請求項4に記載の方法。
- 酵素がLysCと組み合わせたAspNである請求項4に記載の方法。
- プロリラキシンをコードするDNAを宿主細胞にトランスフェクトする作動可能な発現ベクター内に提供し、そのトランスフェクトされた細胞を培養し、プロリラキシンを単離することによりプロリラキシンを組換え的に製造する請求項1に記載の方法。
- 単離がプロリラキシンの可溶化および再生を含む請求項8に記載の方法。
- プロリラキシンをグアニジン塩酸塩を含む溶液で可溶化する請求項9に記載の方法。
- プロリラキシンを希薄なタンパク質濃度の条件下に再生する請求項9に記載方法。
- プロリラキシンをレドックス緩衝液を用いて再生する請求項9に記載の方法。
- 宿主細胞がE.coliである請求項8に記載の方法。
- A−鎖N−末端グルタミンを環化することをさらに含んでなる請求項1に記載の方法。
- リラキシンA−鎖N−末端グルタミンを熱工程により環化する請求項14に記載の方法。
- 非天然のC−ペプチドがアミノ酸配列KRKPTGYGSRKKRを含む請求項1に記載の方法。
- 非天然のC−ペプチドがアミノ酸配列DKKRTGYGSRRRKを含む請求項1に記載の方法。
- 非天然のC−ペプチドがアミノ酸配列DKKRTGYGSRKKRを含む請求項1に記載の方法。
- 非天然のC−ペプチドがアミノ酸配列KRKPTGYGSRRRKを含む請求項1に記載の方法。
- リーダー配列がアミノ酸配列MKKNIAFLLKRを含む請求項1に記載の方法。
- リラキシンを、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/または限外濾過の使用を含んでなる方法により回収する請求項1に記載の方法。
- リラキシンを製剤緩衝液中で製剤化することを場合により含んでなる請求項1に記載の方法。
- リーダーペプチド、B−鎖、非天然のC−鎖、およびA−鎖を含んでなるプロリラキシンであって、該リーダー配列はB−鎖に隣接する解裂部位を含み、該非天然のC−鎖は、B−鎖およびA−鎖に隣接する解裂部位を含むプロリラキシン。
- 解裂部位が酵素的に解裂可能である請求項23に記載のプロリラキシン。
- 非天然のC−ペプチドがアミノ酸配列KRKPTGYGSRKKRを含む請求項23に記載のプロリラキシン。
- 非天然のC−ペプチドがアミノ酸配列DKKRTGYGSRRRKを含む請求項23に記載のプロリラキシン。
- 非天然C−ペプチドがアミノ酸配列DKKRTGYGSRKKRを含む請求項23に記載のプロリラキシン。
- 非天然Cペプチドがアミノ酸配列KRKPTGYGSRRRKを含む請求項23に記載のプロリラキシン。
- リーダー配列がアミノ酸配列MKKNIAFLLKRを含む請求項23に記載のプロリラキシン。
- 請求項23に記載のプロリラキシンをコードする単離されたDNA。
- 請求項30に記載のDNAを作動可能に含む発現ベクター。
- 請求項31に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
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