PL203546B1 - Analog prekursora insuliny, sposób wytwarzania analogu prekursora insuliny i sposób wytwarzania analogu insuliny - Google Patents

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest analog prekursora insuliny, sposób wytwarzania analogu prekur- sora insuliny i sposób wytwarzania analogu insuliny. Dro zd ze wytwarzaj a wiele bia lek, spe lniaj acych kilka funkcji poza komórk a. Bia lka takie zwane s a bia lkami wydzielanymi. Te bia lka wydzielane ulegaj a najpierw ekspresji wewn atrz komórki w postaci prekursorowej, czyli pierwotnej, zawieraj acej sekwen- cje prepeptydow a, zapewniaj ac a skuteczne ukierunkowanie (translokacj e) ulegaj acego ekspresji pro- duktu przez b lon e siateczki endoplazmatycznej (ER). Prepeptyd, zwany zwykle peptydem sygna lo- wym, jest zazwyczaj wycinany z po zadanego produktu w czasie translokacji. Po wej sciu na szlak wy- dzielniczy bia lko jest transportowane do aparatu Golgiego. Z aparatu Golgiego bia lko mo ze wej sc na jeden z kilku ró znych szlaków, prowadz acych do takich kompartmentów, jak wodniczki komórki lub b lona komórkowa, lub te z wychodzi c z komórki i ulega c wydzieleniu do srodowiska zewn etrznego (Pfeffer i wsp. (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:829-852). Insulina jest hormonem polipeptydowym wydzielanym przez komórki ß trzustki, sk ladaj acym si e z dwóch lancuchów polipeptydowych - A i B - po laczonych dwoma mostkami dwusiarczkowymi mi e- dzy lancuchowymi. Ponadto lancuch A zawiera jeden wewn atrz la ncuchowy mostek dwusiarczkowy. Hormon ten jest syntetyzowany jako jednola ncuchowy prekursor - proinsulina (preproinsulina), utworzony z prepeptydu o d lugo sci 24 aminokwasów i proinsuliny, zawieraj acej 86 aminokwasów w konfiguracji: prepeptyd-B-ArgArg-C-LysArg-A, przy czym C stanowi peptyd lacz acy o d lugo sci 31 aminokwasów. Arg-Arg i Lys-Arg s a miejscami ci ecia, w których peptyd lacz acy jest odcinany od la n- cuchów A i B. Do wytwarzania insuliny ludzkiej w drobnoustrojach stosuje si e trzy podstawowe metody. W dwóch wykorzystuje si e Escherichia coli, z ekspresj a du zego bia lka fuzyjnego w cytoplazmie (Frank i wsp. (1981), w: Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (red. Rich i Gross), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Stany Zjednoczone, str. 729-739), lub z zastosowaniem peptydu sygna lowego, celem umo zliwienia wydzielania do przestrzeni oko loplazmatycznej (Chan i wsp. (1981) PNAS 78:5401-5404). W trzeciej metodzie wykorzystuje si e Saccharomyces cerevisiae do wydzielania prekursora insuliny do po zywki (Thim i wsp. (1986), PNAS 83:6766-6770). Ze stanu techniki znana jest pewna, ograniczona, liczba prekursorów insuliny, ulegaj acych ekspresji w E. coli lub Saccharomyces cerevisiae, zob. patent Stanów Zjednoczonych 5,962,267, zg loszenia: WO 95/16708, EP 0055945, EP 0163529, EP 0347845 i EP 0741188. W celu oznaczania stabilno sci bia lka i wzgl ednej stabilno sci cz asteczek stosuje si e dichroizm ko lowy (circular dichroism - CD). CD obserwowany poni zej 240 nM spowodowany jest chromoforem amidu peptydowego i mo zna go wykorzystywa c do szacunkowej oceny drugorz edowej struktury bia lka (Johnson (1988) Ann. Rev. Biophys. Chem. 17:145-166). Widmo insuliny cechuje si e minimum na 220 i 209 nm, zmian a z warto sci ujemnych na dodatnie w okolicy 203 nm i maksimum na 195 nm. Przy denaturacji ujemne CD w zakresie 240-218 nm stopniowo zmniejsza si e, zgodnie z utrat a uporz adko- wanej struktury drugorz edowej, towarzysz ac a zanikaniu pofa ldowania bia lka. Tak wi ec, stabilno sc pofa ldowania insuliny mo zna ocenia c ilo sciowo, mierz ac utrat e struktury drugorz edowej w zale zno sci od ilo sci dodawanego srodka denaturuj acego, na przyk lad chlorowodorku guanidyny (GuHCl) (zob. na przyk lad Pace (1975) CRC Crit. Rev. Biochem. 3:1-43). Przedmiotem wynalazku jest analog prekursora insuliny o wzorze: B(1-27)-X2-X3-X1-Y-A(1-21) w którym B(1-27) jest la ncuchem peptydowym z lo zonym z aminokwasów nr 1-27 lancucha B ludzkiej in- suliny i aminokwasów A(1-21) lancucha A ludzkiej insuliny, X1 jest sekwencj a peptydow a 1-5 reszt aminokwasowych, z których jedna jest aromatyczn a reszt a aminokwasow a po lo zon a N-terminalnie bezpo srednio do Y, X2 stanowi jedn a z Pro, Asp, Lys lub Ile w pozycji 28 la ncucha B, X3 stanowi jedn a z Pro, Lys, Ala, Arg lub Pro-Thr w pozycji 29 lancucha B, a Y stanowi Lys lub Arg. Korzystnie w analogu prekursora insuliny wed lug wynalazku X1 stanowi 1-3 reszt aminokwaso- wych, lub stanowi 1-2 reszt aminokwasowych, z których jedna jest reszt a Trp lub Phe. W innym korzystnym wykonaniu, w analogu prekursora insuliny, sekwencj e X1-Y wybiera si e z gru- py obejmuj acej nast epuj ace sekwencje: (a) Met-Trp-Lys; (b) Ala-Trp-Lys; (c) Val-Trp-Lys; (d) Ile-Trp-Lys;PL 203 546 B1 3 (e) Leu-Trp-Lys (f) Glu-Glu-Phe-Lys (SEQ ID nr 15); (g) Glu-Phe-Lys; (h) Glu-Trp-Lys; (i) Ser-Trp-Lys; (j) Thr-Trp-Lys; (k) Arg-Trp-Lys; (l) Glu-Met-Trp-Lys (SEQ ID nr 1); (m) Gln-Met-Trp-Lys (SEQ ID nr 2) i (n) Asp-Trp-Lys. W innym, równie z korzystnym rozwi azaniu, analog prekursora insuliny charakteryzuje si e tym, ze aromatyczne reszty aminokwasowe wybiera si e spo sród Trp lub Tyr. W kolejnym korzystnym rozwi azaniu, analog prekursora insuliny, charakteryzuje si e tym, ze X2 oznacza Asp, X3 oznacza Lys i X1 oznacza 1-3 reszt aminokwasowych w których jedna oznacza Trp lub Phe. Przedmiotem wynalazku jest tak ze sekwencja polinukleotydowa koduj aca analog prekursora in- suliny wed lug wynalazku jak scharakteryzowano powy zej. Przedmiotem wynalazku jest równie z wektor ekspresji zawieraj acy sekwencj e polinukleotydow a, która koduje analog prekursora insuliny zdefiniowanego powy zej. Przedmiotem wynalazku jest tak ze komórka gospodarz transformowana wektorem ekspre- sji, zawieraj acym sekwencj e polinukleotydow a koduj ac a analog prekursora insuliny zdefiniowany powy zej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania analogu prekursora insuliny zdefi- niowanego powy zej, polegaj acy na tym, ze prowadzi si e (i) hodowl e komórki gospodarza, która zawie- ra sekwencj e polinukleotydow a koduj ac a analog prekursora insuliny o wzorze: B(1-27)-X2-X3-X1-Y-A(1-21) w którym B(1-27) jest la ncuchem peptydowym z lo zonym z aminokwasów nr 1-27 lancucha B ludzkiej in- suliny i aminokwasów A(1-21) lancucha A ludzkiej insuliny, X1 jest sekwencj a peptydow a 1-5 reszt aminokwasowych, z których jedna jest aromatyczn a reszt a aminokwasow a po lo zon a N-terminalnie bezpo srednio do Y, X2 stanowi jedn a z Pro, Asp, Lys lub Ile w pozycji 28 la ncucha B, X3 stanowi jedn a z Pro, Lys, Ala, Arg lub Pro-Thr w pozycji 29 lancucha B, a Y stanowi Lys lub Arg, w warunkach hodowli korzystnych dla ekspresji tego prekursora i wykonu- je si e (ii) izolowanie analogu prekursora, który uleg l ekspresji. W sposobie wed lug wynalazku komórk a gospodarzem korzystnie mo ze by c dro zd zowa komór- ka gospodarza. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania analogu insuliny, polegaj acy na tym, ze prowadzi si e (i) hodowl e komórki gospodarza, która zawiera sekwencj e polinukleotydow a ko- duj ac a analog prekursora insuliny o wzorze: B(1-27)-X2-X3-X1-Y-A(1-21) w którym B(1-27) jest la ncuchem peptydowym z lo zonym z aminokwasów nr 1-27 lancucha B ludzkiej in- suliny i aminokwasów A(1-21) lancucha A ludzkiej insuliny, X1 jest sekwencj a peptydow a 1-5 reszt aminokwasowych, z których jedna jest aromatyczn a reszt a aminokwasow a po lo zon a N-terminalnie bezpo srednio do Y, X2 stanowi jedn a z Pro, Asp, Lys lub Ile w pozycji 28 la ncucha B, X3 stanowi jedn a z Pro, Lys, Ala, Arg lub Pro-Thr w pozycji 29 lancucha B, a Y stanowi Lys lub Arg, w warunkach hodowli korzystnych dla ekspresji tego prekursora i doko- nuje si e (ii) izolowania tego analogu prekursora z medium hodowlanego, i nast epnie (iii) przekszta lca sie ten analog prekursora w analog insuliny na drodze chemicznej lub enzymatycznej konwersji in vitro. W korzystnej odmianie tego sposobu wed lug wynalazku komórk a gospodarzem mo ze by c dro zd zowa komórka gospodarz. W prekursorach insuliny lub analogach prekursorów insuliny zawieraj acych peptyd lacz acy (peptydy C), stwierdzono, ze nadaje on cz asteczkom prekursora insuliny i cz asteczkom analogu pre- kursora insuliny zdolno sc zwi ekszenia wydzielania i/lub zwi ekszenia stabilno sci przy ekspresji w prze- kszta lconym drobnoustroju, zw laszcza w dro zd zach. Mo zna je nast epnie przekszta lca c do insuliny lub analogu insuliny w jednym lub wi ecej korzystnych, znanych ze stanu techniki etapów konwersji.PL 203 546 B1 4 Peptydy lacz ace wed lug niniejszego wynalazku zawieraj a co najmniej jedn a aromatyczn a resz- t e aminokwasow a Phe, Trp lub Tyr i b ed a na ogó l krótsze, ni z naturalny ludzki peptyd C, który (je sli liczy c le zace na jego ko ncach dwuzasadowe miejsca ci ecia) utworzony jest z 35 aminokwasów. Podobnie jak w cz asteczce naturalnej insuliny ludzkiej, peptyd lacz acy b edzie zawiera l miejsce ciecia na swych ko ncach C i N, umo zliwiaj ac odcinanie in vitro peptydu lacz acego od la ncuchów A i B. Takie miejsca ci ecia mog a stanowi c dowolne korzystne miejsca ci ecia znane ze stanu techniki, na przyk lad Met, który mo zna rozcina c bromkiem cyjanku, lub pojedyncza zasadowa reszta aminokwa- sowa lub para reszt aminokwasowych (Lys lub Arg), które mo zna rozcina c trypsyn a lub proteazami trypsynopodobnymi: proteaz a Acromobactor lyticus lub proteaz a karboksypeptydazow a. Miejscem ciecia, umo zliwiaj acym odcinanie peptydu lacz acego od la ncucha A jest, korzystnie, pojedyncza za- sadowa reszta aminokwasowa Lys lub Arg, korzystnie, Lys. Zamiast tego, odci ecia peptydu lacz acego od la ncucha B mo zna dokona c poprzez przeci ecie, na poziomie naturalnej reszty aminokwasowej Lys B29 lancucha B, uzyskuj ac prekursor des-B30in- sulinowy lub analog prekursora des-B30insulinowego. Nast epnie mo zna dolaczy c po zadan a reszt e aminokwasow a B30 znanymi ze stanu techniki metodami enzymatycznymi in vitro. W jednym z wykona n, peptyd lacz acy nie b edzie zawiera l dwóch przyleg lych zasadowych reszt aminokwasowych (Lys, Arg). W tym wykonaniu, odcinania od lancucha A mo zna dokonywa c na poje- dynczej reszcie Lys lub Arg, znajduj acej si e na ko ncu N lancucha A i na naturalnej reszcie Lys w po- zycji B29 la ncucha B. Peptyd lacz acy mo ze zawiera c wiecej ni z jedn a aromatyczn a reszt e aminokwasow a, korzystnie jednak nie wi ecej ni z 5. Aromatyczne reszty aminokwasowe mog a by c takie same lub ró zne. Peptyd lacz acy, korzystnie, nie b edzie zawiera l wi ecej, ni z 3 aromatyczne reszty aminokwasowe, i najkorzyst- niej, b edzie zawiera l jedynie pojedyncz a reszt e aminokwasow a. W jednym wykonaniu niniejszego wynalazku jedna z aromatycznych reszt aminokwasowych peptydu lacz acego jest po lozona bezpo srednio w kierunku ko nca N za miejscem ci ecia przylegaj acym do lancucha A. Prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny cechuj a si e du za stabilno sci a pofa ldo- wania w roztworze. Prekursory wed lug niniejszego wynalazku b ed a cechowa c si e zwi ekszon a stabilno sci a C mid w porównaniu z insulin a lub analogami insuliny, niezawieraj acymi aromatycznej reszty aminokwasowej w peptydzie lacz acym. Stabilno sc C mid jest zatem wi eksza od oko lo 5,5 M GuHCl, typowo, wi eksza od oko lo 6,0 M GuHCl, jeszcze bardziej typowo, wi eksza od oko lo 6,5 M GuHCl. Niektóre prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny, zawieraj a peptyd lacz acy, zawieraj acy co najmniej jedn a aromatyczn a reszt e aminokwasow a (peptyd C), który mo zna od- szczepi c (odci ac) od la ncuchów A i B, oraz miejsce ci ecia, umo zliwiaj ace ci ecie wi azania pepty- dowego mi edzy la ncuchem A a peptydem lacz acym, przy czym jedna aromatyczna reszta amino- kwasowa znajduje si e bezpo srednio N-ko ncowo w stosunku do tego miejsca ci ecia. Inne prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny, zawieraj a peptyd lacz acy (peptyd C), który mo zna odci ac od lancuchów A i B, utworzony z maksymalnie 9 reszt aminokwasowych, z których co najmniej jedna jest aromatyczn a reszt a aminokwasow a. Badane by ly tak ze prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny, zawieraj ace peptyd la- cz acy (peptyd C), który mo zna odciac od lancuchów A i B, przy czym peptyd lacz acy zawiera jedn a aromatyczn a reszt e aminokwasow a, po lo zon a w odleg lo sci poni zej 5 Å od co najmniej jednej z reszt w pozycjach B11, B12 lub B26 lancucha B. Istniej a tak ze prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny, zawieraj ace peptyd lacz acy (peptyd C), zawieraj acy co najmniej jedn a aromatyczn a reszt e aminokwasow a, który mo zna odci ac od lancuchów A i B, przy czym te prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny cechuj a si e zwi ek- szon a stabilno scia C mid w stosunku do prekursorów insuliny lub analogów prekursorów insuliny, nie- zawieraj acych aromatycznej reszty aminokwasowej w peptydzie lacz acym. Zwi ekszenie aktywno sci potwierdza si e rozmaitymi metodami znanymi specjalistom, jak to opi- sano poni zej. W jednym z wykona n zwi ekszenie stabilno sci mierzy si e poprzez oznaczenie CD steze- nia chlorowodorku guanidyny (GuHCl), koniecznego dla osi agni ecia po lowy maksymalnej utraty pofa l- dowania cz asteczki prekursora insuliny (C mid ). Krótki opis rysunków Fig. 1 przedstawia wektor ekspresyjny S. cerevisiae pAK721, wykazuj acy ekspresj e lidera LA19 - bia lka fuzyjnego EEAEAEAEPK (SEQ ID nr 3)-IP(AlaAlaLys).PL 203 546 B1 5 Fig. 2 przedstawia sekwencj e DNA i wydedukowan a na jej podstawie sekwencj e aminokwaso- w a kodowanego bia lka fuzyjnego (lidera czynnika a EEAEAEAPK (SEQ ID nr 4) - cz esci Asp B28 IP pAK1150 (SEQ ID nr 5 i 6), stosowanego jako matryca PCR. Fig. 3 przedstawia sekwencj e DNA koduj ac a lider czynnika a-ASP B28 IP (GluTrpLys) z synte- tycznym mini-peptydem C GluTrpLys, wytworzonym na drodze losowej optymalizacji (SEQ ID nr 7 i 8). Mini-peptyd C (EWK) wyró zniono podkre sleniem. Fig. 4 przedstawia stabilno sc pofa ldowania analogu insuliny Asp B2 8IP (MetTrpLys) wzgl edem Asp B28 IP. Fig. 5 przedstawia struktury roztworu Asp B28 IP (MetTrpLys) jako linie rdzenia ca losci zbiegaj a- cych si e struktur. Fig. 6 przedstawia wst egowe zobrazowanie Asp B28 IP (MetTrpLys). Rysunek wykonano z u zy- ciem MOLSCRIPT (Kraulis (1991) J. Appl. Crystalog. 24:946-959). Oznaczenia reszt aminokwaso- wych maj a nast epuj ace pochodzenie: B1-B29 ( la ncuch B) s a oznaczone numerami 1-29, reszty C1-C3 (peptyd lacz acy) numerami 30-32, a reszty A1-A21 ( la ncuch A) - numerami 33-53. Fig. 7 jest ID protonowego widma MR dla Asp B28 IP (MetTrpLys), zarejestrowanego w tempera- turze 27°C przy st ezeniu 1,0 mM w 10%/90% D 2 O/H 2 O z 10 mM buforu fosforanowego przy pH 8,0. Fig. 8 przedstawia DNA i wydedukowan a z niego sekwencj e aminokwasow a kasety ekspresji, wykazuj acej ekspresj e bia lka fuzyjnego YAP3-TA39-EEGEPK (SEQ ID nr 17)-Asp B28 IP z syntetycz- nym mini-peptydem C GluTrpLys (SEQ ID nr 9 i 10), a Fig. 9 przedstawia DNA i wydedukowan a z niego sekwencj e aminokwasow a kasety ekspresji, wykazuj acej ekspresj e bia lka fuzyjnego YAP3-TA57-EEGEPK (SEQ ID nr 17)-Asp B28 IP z syntetycz- nym mini-peptydem C GluTrpLys (SEQ ID nr 11 i 12). Szczegó lowy opis wynalazku Skróty i nazewnictwo Okre slenie „peptyd lacz acy" lub „peptyd C" oznacza lacz ac a cz astk e „C" sekwencji polipepty- dowej B-C-A jedno la ncuchowej cz asteczki preproinsulinopodobnej. Bardziej szczegó lowo, w natural- nym lancuchu insuliny peptyd C laczy pozycj e 30 la ncucha B z pozycj a 1 la ncucha A. „Mini-peptyd C", czyli „peptyd lacz acy" taki, jak opisano w niniejszym opisie, laczy B29 lub B30 z A1, i ró zni si e se- kwencj a i d lugo scia od naturalnego peptydu C. „IP" oznacza jedno la ncuchowy prekursor insuliny, w którym la ncuch desB30 laczy si e z la ncu- chem A insuliny poprzez peptyd lacz acy. Jedno lancuchowy prekursor insuliny b edzie zawiera c prawi- d lowo usytuowane mostki dwusiarczkowe (trzy) takie, jak w insulinie ludzkiej. Okre slenie „desB30" lub ,,B(1-29)" oznacza lancuch B insuliny naturalnej, pozbawiony reszty aminokwasowej B30, ,,A(1-21)" oznacza la ncuch A insuliny naturalnej, ,,B(1-27)" oznacza la ncuch B insuliny naturalnej pozbawiony reszt aminokwasowych B28, B29 i B30; „Asp B28 IP" oznacza jedno la n- cuchowy prekursor insuliny z kwasem asparaginowym w pozycji 28 la ncucha B, bez peptydu C (B29 jest po laczony z A1). Mini-peptyd C i jego sekwencja aminokwasowa jest wskazana w trzyliterowym kodzie aminokwasowym w cudzys lowie po IP; tak wi ec „Asp B28 IP (MetTrpLys" oznacza jedno la ncu- chowy prekursor insuliny z kwasem asparaginowym w pozycji 28 lancucha B i mini-peptyd C z se- kwencj a Met-Trp-Lys lacz ac a B29 z A1. Okre slenie „prekursor insuliny" oznacza jedno lancuchowy polipeptyd, który poprzez jeden lub wi ecej kolejnych procesów chemicznych i/lub enzymatycznych mo zna przekszta lcic w insulin e ludzk a. Okre slenie „analog prekursora insuliny" oznacza cz asteczk e prekursora insuliny z jedn a lub kil- koma mutacjami, substytucjami, delecjami i/lub addycjami lancuchów A i/lub B aminokwasów w sto- sunku do cz asteczki insuliny ludzkiej. Analogi insuliny s a korzystnie takimi analogami, w których jedn a lub wi ecej naturalnie wyst epuj acych reszt aminokwasowych, korzystnie, jedn a, dwie lub trzy, podsta- wiono inn a kodowaln a reszt a aminokwasow a. W jednym z wykona n, przedmiotem niniejszego wyna- lazku s a cz asteczki analogu o pozycji 28 lancucha B zmienionej w stosunku do cz asteczki naturalnej insuliny ludzkiej. W tym wykonaniu pozycja 28 jest zmieniona z naturalnej reszty Pro do jednej z reszt Asp, Lys lub Ile. W korzystnym wykonaniu naturalna reszta Pro w pozycji B28 jest zmieniona na reszt e Asp. W innym wykonaniu Lys w pozycji B29 jest zmieniona na Pro; równie z Asn w pozycji A21 mo ze by c zmieniona na Ala, Gln, Alu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr lub Val, zw laszcza na Gly, Ala, Ser lub Thr, korzystne na Gly. Ponadto, Asn w pozycji B3 mo ze by c zmieniona na Lys. Innym przyk ladami analogów prekursorów insuliny s a: insulina ludzka des(B30), analogi insuliny, w których Phe B1 poddano delecji, analogi insuliny, w których lancuch A i/lub lancuch B maj a wyd luzeniePL 203 546 B1 6 N-ko ncowe i analogi insuliny, w których lancuch A i/lub lancuch B maj a wyd lu zenie C-ko ncowe. Tak wi ec do pozycji B1 mo zna doda c jedn a lub dwie reszty Arg. Okre slenie „bezpo srednio w stron e ko nca N" ilustruje sytuacj e, w której reszta aminokwa- sowa lub sekwencja peptydowa jest bezpo srednio po laczona na swym ko ncu od strony ko nca C z ko ncem N-ko ncowym innej reszty aminokwasowej lub sekwencji aminokwasowej poprzez wi a- zanie peptydowe. W kontek scie niniejszego opisu, okre slenie „funkcjonalny analog insuliny" i podobne okre slenia maja oznacza c polipeptyd o dzia laniu biologicznym podobnym, jak natywne bia lko insuliny ludzkiej. Poprzez odleg losc „mniejsz a od 5 Å mi edzy dwiema resztami aminokwasowymi rozumie si e najkrótsz a odleg lo sc mi edzyatomow a wynosz ac a mniej ni z 5 Å, mi edzy dowolnym atomem pierwsze- go aminokwasu a dowolnym atomem drugiego aminokwasu. Odleg losci mi edzy atomami mierzy si e na podstawie trójwymiarowej struktury cz asteczki, oznaczanej technik a MR (Wüthrich, K., 1986, NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley, New York) lub krystalografii rentgenowskiej (Drenth, J., 1994, Pinciples of Protein X-ray crystallography, Springer Verlag Berlin). Odleg losc mi edzy dwoma amino- kwasami mierzy si e jako najkrótsz a odleg lo sc mi edzyatomow a mi edzy dowolnym atomem pierwszego aminokwasu a dowolnym atomem drugiego aminokwasu, je sli nie zaznaczono inaczej. Przedmiotem niniejszego wynalazku s a nowe analogi insuliny istotnie zwi ekszaj ace wytwarza- nie produktu w dro zd zowej komórce gospodarzu. Okre slenia „istotne zwi ekszenie wytwarzania", „zwi ekszenie wydajno sci fermentacji" i podobne maj a oznacza c zwi ekszenie wydzielanej ilo sci cz a- steczki prekursora insuliny lub cz asteczki analogu prekursora insuliny obecnych w nadsaczu hodowli w porównaniu z wydajno scia prekursora insuliny lub analogu prekursora insuliny bez aromatycznej reszty aminokwasowej w mini-peptydzie C. „Zwi ekszona" wydajnosc fermentacji jest to liczba bez- wzgl edna wi eksza od kontroli; korzystnie, zwi ekszenie jest o 50% lub wi ecej wi eksze od poziomu kon- troli (Asp B28 IP); jeszcze korzystniej, zwi ekszenie jest o 100% lub wi ecej wi eksze od poziomu kontroli. Okre slenie „zwi ekszenie stabilno sci" oznacza na przyk lad zwi ekszenie warto sci C mid w roztwo- rze w porównaniu z warto scia uzyskiwan a dla analogu prekursora insuliny (na przyk lad Asp B28 IP) bez aromatycznej reszty aminokwasowej w mini-peptydzie C. Okre slenie „C mid " oznacza st ezenie GuHCl niezb edne do rozfa ldowania po lowy populacji bia lka w te scie mierz acym dichroizm ko lowy w dalekim nadfiolecie cz asteczki insuliny w funkcji rosn acego st ezenia srodka denaturuj acego. „POT" oznacza gen izomerazy fosforanu triozy Schizosaccharomyces pombe, a „TPI1" oznacza gen izomerazy fosforanu triozy S. Cerevisiae. „Lider" oznacza sekwencj e aminokwasow a utworzon a z prepeptydu (peptyd sygna lowy) i pro- peptydu. „Peptyd sygna lowy" oznacza prepeptyd obecny jako sekwencja N-ko ncowa na prekursorowej postaci bia lka. Funkcj a peptydu sygna lowego jest umo zliwienie bia lku heterologicznemu u latwienia translokacji do siateczki endoplazmatycznej. Peptyd sygna lowy w zwyk lych warunkach ulega w tym procesie odszczepieniu. Peptyd sygna lowy mo ze by c hetero- lub homologiczny wzgl edem dro zd zy produkuj acych to bia lko. Znanych jest kilka peptydów sygna lowych, które mo zna stosowa c z sekwen- cja DNA wed lug niniejszego wynalazku, w tym peptyd sygnalowy proteazy asparaginowej dro zdzy 3 (YAP3) i wszelkie jego funkcjonalne analogi (Egel-Mitani i wsp. (1990), Yeast 6:127-137 i patent Stanów Zjednoczonych 5,726,038) i sygna l czynnika a genu MF a1 (Thorner (1981) w: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, pod red. Strathern i wsp., str. 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, i patent Stanów Zjednoczonych nr 4, 870,00. Okre slenie „propeptyd" oznacza sekwencj e polipeptydow a, której funkcj a jest umo zliwienie poli- peptydowi, który uleg l ekspresji, ukierunkowania z siateczki endoplazmatycznej do aparatu Golgiego i dalej do p echerzyka wydzielniczego celem wydzielenia do po zywki hodowlanej (to znaczy wyj scia polipeptydu przez scian e komórkow a lub co najmniej przez b lon e komórkow a do przestrzeni oko lopla- zmatycznej komórki dro zd zy). Propeptyd mo ze by c drozd zowym propeptydem czynnika a, zob. paten- ty Stanów Zjednoczonych 4,546,082 i 4,870,008. Zamiast tego propeptyd mo ze by c propeptydem syntetycznym, to znaczy propeptydem nie wyst epuj acym w warunkach naturalnych. Korzystnymi pro- peptydami syntetycznymi s a propeptydy opisane w patentach Stanów Zjednoczonych 5,395,922; 5,795,746; 5,162,498 i w zgloszeniu WO 98/32867. Propeptyd bedzie, korzystnie, zawiera l miejsce obróbki endopeptydazy na zako nczeniu C-ko ncowym, takie jak sekwencja Lys-Arg lub jej dowolny analog funkcjonalny. Sekwencj e polinukleotydow a wed lug niniejszego wynalazku mo zna wytwarza c syntetycznie znanymi, standardowymi sposobami, na przyk lad metod a fosfoamidytow a opisan a przez BeaucagePL 203 546 B1 7 i wsp. (1981), Tetrahedron Letters 22:1859-1869, lub metod a opisan a przez Matthes i wsp. (1984), EMBO Journal 3:801-805. W metodzie fosfoamidytowej syntetyzuje si e oligonukleotydy, na przyk lad w automatycznym urz adzeniu do syntezy DNA, oczyszcza si e je, podwaja i poddaje ligacji celem wy- tworzenia syntetycznej struktury DNA. Obecnie preferowanym sposobem wytwarzania struktury DA jest polimerazowa reakcja lancuchowa (PCR). Sekwencja polinukleotydowa wed lug niniejszego wynalazku mo ze równie z by c mieszanego po- chodzenia genomowo-cDNA-syntetycznego. Na przyk lad, genomow a lub cDNA sekwencj e koduj ac a peptyd liderowy mo zna laczy c z genomow a lub cDNA sekwencj a koduj ac a la ncuchy A i B, nast epnie modyfikowa c sekwencj e DNA w tym miejscu poprzez wprowadzanie syntetycznych oligonukleotydów koduj acych pozadan a sekwencj e aminokwasow a do rekombinacji homologicznej dobrze znanymi sposobami, lub, korzystnie, wytwarza c po zadan a sekwencj e metod a PCR z zastosowaniem odpo- wiednich oligonukleotydów. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest równie z wektor zdolny do replikacji w wybranych drobnoustrojach lub komórce-gospodarzu, zawieraj acy sekwencj e polinukleotydow a, koduj ac a prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny wed lug niniejszego wynalazku. Wektor re- kombinacyjny mo ze by c autonomicznie replikuj acym si e wektorem, to znaczy wektorem istniej a- cym jako jednostka pozachromosomalna, którego replikacja nie zale zy od replikacji chromoso- malnej, na przyk lad plazmidem, elementem pozachromosomalnym, minichromosomem lub sztucznym chromosomem. Wektor mo ze zawiera c dowolne srodki do zapewnienia samoreplikacji. Zamiast tego mo zna wykorzystywa c wektor, który, po wprowadzeniu do komórki gospodarza, ulega integracji do genomu i replikacji wraz z chromosomem lub chromosomami, do których zo- sta l zintegrowany. Ponadto mo zna stosowa c pojedynczy wektor lub plazmid, lub dwa lub wi ecej wektorów lub plazmidów, które razem zawieraj a ca lo sc DNA, które ma by c wprowadzone do ge- nomu komórki gospodarza, lub transpozon. Wektor mo ze by c plazmidem liniowym lub zamkni e- tym plazmidem kolistym i b edzie korzystnie zawiera c element lub elementy umo zliwiaj ace stabiln a integracj e wektora do genomu komórki gospodarza lub autonomiczn a replikacj e wektora w ko- mórce niezale znie od genomu. W korzystnym wykonaniu rekombinacyjny wektor ekspresyjny jest zdolny do replikowania si e w dro zd zach. Przyk lady sekwencji, umo zliwiaj acych wektorowi replikacj e w dro zd zach, stanowi a geny REP 1-3 i pocz atek replikacji genów replikacji plazmidu dro zd zowego 2 µm. Wektory wed lug niniejszego wynalazku korzystnie zawieraj a jeden lub wi ecej wybieralnych markerów, umo zliwiaj acych latw a selekcj e przekszta lconych komórek. Wybieralny marker stanowi gen, którego produkt zapewnia oporno sc na biocydy lub wirusy, oporno sc na metale ci ezkie, prootrofi e na auksotrofy i tym podobne. Przyk ladami bakteryjnych markerów wybieralnych s a geny dal Bacillus subtilis lub Bacillus licheniformis, lub markery nadaj ace oporno sc na antybiotyki, takie jak ampicylina, kanamycyna, chloramfenikol lub tetracyklina. Do wybieralnych markerów do zastosowania w zawiera- jacych w lókna grzybowych komórkach gospodarzach nale za amdS (acetamidaza), argB (karbamoilo- transferaza ornitynowa), pyrG (dekarboksylaza orotydyno-5'-fosforanu) i trpC (syntetaza antranilanu). Korzystnymi markerami dro zd zowych komórek gospodarzy s a ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 i URA3. Korzystnym wybieralnym markerem dla dro zd zy jest gen TPI Schizosaccharomyces pompe (Russell (1985) Gene 40 : 125-130). W wektorze sekwencja polinukleotydowa jest po laczona w sposób umo zliwiaj acy dzia lanie z odpowiedni a sekwencj a promotorow a. Promotorem mo ze by c dowolna sekwencja kwasu nukleino- wego, wykazuj aca aktywno sc transkrypcyjn a w wybranej komórce gospodarzu, w laczaj ac w to promo- tory b ed ace mutantami, sekwencjami okrojonymi lub hybrydowymi, i mo zna j a wytwarza c z genów koduj acych polipeptydy zewn atrz- lub wewn atrzkomórkowe, homologiczne lub heterologiczne w od- niesieniu do komórki gospodarza. Przyk ladami korzystnych promotorów do ukierunkowywania transkrypcji w bakteryjnej ko- mórce gospodarzu s a promotory wytwarzane z operonu lac E. coli, genu agarozy Streptomyces coelicolor (dagA), genu lewanosacharozy Bacillus subtilis (sacB), genu alfa-amylazy Bacillus li- cheniformis (amyL), genu amylazy maltogenowej Bacillus stearothermophilus (amyM), genu alfa- amylazy Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) i genu penicylinazy Bacillus licheniformis (penP). Przyk ladami korzystnych promotorów do ukierunkowywania transkrypcji we w lóknistych grzybo- wych komórkach gospodarzach s a promotory uzyskane z genów z amylazy TAKA Aspergillus oryzae, proteinazy asparaginianowej Rhizomucor miehei, oboj etnej alfa-amylazy Aspergillus nigerPL 203 546 B1 8 i stabilnej w srodowisku kwa snym alfa-amylazy Aspergillus niger. W gospodarzu dro zd zowym korzystnymi promotorami s a promotory Ma1, TPI, ADH lub PGK Saccharomyces cerevisiae. Struktura polinukleotydowa wed lug niniejszego wynalazku b edzie równie z, typowo, po laczona w sposób umo zliwiaj acy dzia lanie z odpowiednim terminatorem. W przypadku dro zd zy odpowiednim terminatorem jest terminator TPI (Alber i wsp. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434). Sposoby stosowane do ligacji sekwencji polinukleotydowej wed lug niniejszego wynalazku, od- powiednio, promotora i terminatora, i wprowadzania ich do odpowiednich wektorów dro zd zowych, zawieraj acych informacje niezb edne do replikacji dro zd zy, s a znane specjalistom. Nale zy rozumie c, ze wektor mo zna wytwarza c przez wytworzenie struktury DNA zawieraj acej pe lna sekwencj e DNA, kodu- jac a prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny wed lug niniejszego wynalazku i nast epnie wprowadzenie tego fragmentu do odpowiedniego wektora ekspresji lub przez kolejne wprowadzanie fragmentów DNA, zawieraj acych informacj e genetyczn a dla poszczególnych fragmentów (takich jak peptyd sygna lowy, propeptyd, mini peptyd C, lancuchy A i B) i nast epnie ligacj e. Do komórki gospodarza wprowadza si e wektor zawieraj acy takie sekwencje polinukleoty- dowe, tak ze wektor utrzymuje si e jako integralny sk ladnik chromosomu lub jako samoreplikuj acy si e wektor pozachromosomowy, jak to opisano uprzednio. Okre slenie „komórka gospodarz" obej- muje ka zde potomstwo komórki macierzystej, które nie jest identyczne z komórk a macierzyst a ze wzgl edu na mutacje powstaj ace w czasie replikacji. Dobór komórki gospodarza b edzie w znacz- nym stopniu zale za l od genu koduj acego polipeptyd i od jego zród la. Komórka gospodarz mo ze by c drobnoustrojem jednokomórkowym, na przyk lad Procaryota, lub drobnoustrojem wielokomór- kowym, na przyk lad Eucaryota. Korzystnymi komórkami jednokomórkowymi s a komórki bakteryj- ne, takie jak bakterie Gram-dodatnie, w tym, jednak bez ograniczenia, komórki Bacillus, Strepto- myces lub bakterie Gram-ujemne, takie jak E. coli i Pseudomonas sp. Komórki eukariotyczne mo- g a by c komórkami ssaków, owadów, ro slin lub grzybów. W korzystnym wykonaniu komórk a go- spodarzem jest komórka dro zd zy. Dro zd zami stosowanymi w sposobie wed lug niniejszego wyna- lazku mog a by c dowolne odpowiednie dro zd ze, które w czasie hodowli wytwarzaj a w du zych ilo- sciach prekursor insuliny i analogi insuliny wed lug niniejszego wynalazku. Przyk ladami korzyst- nych dro zd zy s a szczepy dobrane z gatunków dro zd zy Saccharomyces cerevisiae, Saccharomy- ces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Han- senula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Can- dida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. i Geotrichum fermentans. Transformacji komórek dro zd zy mo zna dokonywa c na przyk lad poprzez tworzenie protoplastu i nast epnie transformacj e w sposób znany sam przez si e. Po zywk a stosowan a do hodowli komórek mo ze by c dowolna konwencjonalna po zywka nadaj aca si e do hodowli dro zd zy. Wydzielany prekursor insuliny lub analogi prekursorów insuliny wed lug niniejszego wynalazku, z których znaczna czes c b e- dzie obecna w po zywce w postaci prawid lowo obrobionej, mo zna odzyskiwa c z po zywki konwencjo- nalnymi sposobami, obejmuj acymi oddzielanie komórek dro zd zy od po zywki poprzez odwirowanie, filtracj e lub wychwytywanie prekursora insuliny lub analogu prekursora insuliny przez macierz jono- wymienn a lub macierz wch laniania odwrotnej fazy, str acanie bia lkowych sk ladników nads aczu lub filtratu za pomoc a soli, na przyk lad siarczanu amonowego, i nast epnie oczyszczanie rozmaitymi me- todami chromatograficznymi, na przyk lad poprzez chromatografi e jonowymienn a, chromatografi e po- winowactwa lub tym podobne. Analog prekursora insuliny lub prekursor insuliny wed lug niniejszego wynalazku mo ze ulega c ekspresji z wyd luzeniem z N-ko ncowymi resztami aminokwasowymi, jak to opisano w patencie Sta- nów Zjednoczonych nr 5,395,922 i w patencie europejskim nr 765,395A; oba te patenty w lacza si e swoi scie przez przywo lanie. Stwierdzono, ze wyd lu zenie jest stabilnie przymocowane do prekursora insuliny lub analogu prekursora insuliny wed lug niniejszego wynalazku w czasie fermentacji, zabez- pieczaj ac zako nczenie N-ko ncowe prekursora insuliny lub analogu prekursora insuliny przed aktywno- sci a proteolityczn a proteaz dro zd zowych, takich jak DPAP. Obecno sc wyd luzenia N-ko ncowego pre- kursora insuliny lub analogu prekursora insuliny mo ze równie z s lu zy c jako zabezpieczenie N-ko ncowej grupy aminowej w czasie chemicznej obróbki bia lka, to znaczy mo ze s lu zy c jako substytut BOC (grupy t-butylo-oksakarbonylowej) lub podobnej grupy zabezpieczaj acej. Wyd luzenie N-ko ncowe mo zna usuwa c z odzyskanego prekursora insuliny lub analogu prekursora insuliny za pomoc a enzy- mu proteolitycznego, swoistego dla aminokwasu zasadowego (na przyk lad Lys), tak aby ko ncowe wyd lu zenie zosta lo odszczepione od reszty Lys. Przyk ladami takich enzymów proteolitycznych s a trypsyna i proteaza Achromobacter lyticus.PL 203 546 B1 9 Po wydzieleniu do srodowiska hodowli i odzyskaniu, prekursor insuliny lub analog prekursora insuliny wed lug niniejszego wynalazku zostanie poddany rozmaitym procedurom in vitro w celu usu- ni ecia ewentualnej sekwencji wyd lu zenia N-ko ncowego i mini-peptydu C, wskutek czego powstanie insulina lub po zadany analog insuliny. Do takich metod nale za: przekszta lcenie enzymatyczne za pomoc a trypsyny lub proteazy Achromobacter lyticus w obecno sci estru L-treoniny i nast epnie prze- kszta lcenie estru treoninowego insuliny lub analogu insuliny do insuliny lub analogu insuliny poprzez hydroliz e zasadow a lub kwa sn a hydroliz e, któr a opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4,343,898 i 4,916,212 oraz w Zg loszeniu Badawczym z wrze snia 1994/487; opisy te w lacza si e do niniejszego opisu przez przywo lanie. Jak to opisano poni zej, wytworzono prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny z syn- tetycznymi peptydami C, zawieraj ace co najmniej jeden aminokwas aromatyczny (przyk lad 1). Metod a PCR wytworzono plazmidy ekspresyjne Saccharomyces cerevisiae, zawieraj ace se- kwencj e polinukleotydow a, koduj ac a prekursory insuliny lub analogi prekursorów insuliny wed lug ni- niejszego wynalazku i zastosowano je do przekszta lcenia komórki gospodarza S. cerevisiae. Ilosc produktu, który uleg l ekspresji, na przyk lad analogu insuliny, mierzono jako odsetek odpowiedniego poziomu kontrolnego, na przyk lad ilo sci Asp B28 IP, pozbawionego mini-peptydu C (Tabela 1), który uleg l ekspresji, i Asp B28 IP(AlaAlaLys) z mini-peptydem C, bez aromatycznej reszty aminokwasowej (Tabela 2). Nowe C-peptydy wed lug niniejszego wynalazku pozwoli ly uzyska c zwi ekszenie wydajno sci do 7 razy. Niniejszy wynalazek opisano bardziej szczegó lowo w poni zszych przyk ladach, które nie maj a na celu jakiegokolwiek ograniczenia jego zakresu, okre slonego w zastrze zeniach. Do laczone rysunki nale zy uwa za c za integraln a czes c opisu wynalazku. Wszystkie cytowane pozycje pi smiennictwa w la- cza si e do niniejszego opisu przez przywo lanie. P r z y k l a d y Procedury ogólne Wszystkie plazmidy ekspresyjne s a typu C-POT, podobne do opisanych w EP 171,142, cechu- jace si e tym, ze zawieraj a gen izomerazy fosforanu triozy Schizosaccharomyces pombe (POT) w celu dobrania plazmidu i stabilizacji w S. cerevisiae. Plazmidy zawieraj a tak ze promotor i terminator izome- razy fosforanu triozy S. cerevisiae. Sekwencje te s a podobne do odpowiadaj acych im sekwencji w plazmidzie pKFN1003 (opisanym w zg loszeniu WO 90/100075), podobnie jak wszystkie sekwencje oprócz sekwencji fragmentu EcoRI-XbaI, koduj acego bia lko fuzyjne lidera i produkt prekursora insuli- ny. Dla uzyskania ekspresji ró znych bia lek fuzyjnych, fragment EcoRI-XbaI pKFN1003 zast epuje si e poprostu fragmentem EcoRI-XbaI, koduj acym po zadan a fuzj e lidera z prekursorem insuliny. Takie fragmenty EcoRI-XbaI mo zna wytwarza c z zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów i PCR standardowymi sposobami. Transformanty dro zd zy wytwarzano poprzez przekszta lcenie szczepu gospodarza - szczepu S. cerevisiae MT663 (MATalMAT a pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi : :LEU2/tpi : :LEU2 Cir + ). Szczep dro zd zy MT663 zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen w po- wi azaniu ze zg loszeniem WO 92/11378; otrzyma l on numer depozytu DSM 6278. MT663 hodowano na YPGaL (1% wyci agu dro zd zy Bacto, 2% peptonu Bacto, 2% galaktozy, 1% mleczanu) to g esto sci optycznej 0,6 przy d lugo sci fali 600 nm. 100 ml hodowli zebrano przez od- wirowanie, przep lukano 10 ml wody, ponownie odwirowano i ponownie zawieszono w 10 ml roztworu, zawieraj acego 1,2 M sorbitu, 25 mM Na 2 EDTA o pH=8,0 i 6,7 mg/ml ditiotreitolu. Zawiesin e inku- bowano w temperaturze 30°C przez 15 minut, odwirowano i komórki ponownie zawieszono w 10 ml roztworu zawieraj acego 1,2 M sorbitu, 10 mM Na 2 EDTA, 0,1 M cytrynianu sodowego o pH=5,8 i 2 mg Novozym ® 234. Zawiesin e inkubowano w temperaturze 30°C przez 30 minut, komórki zebrano przez odwirowanie, przep lukano w 10 ml 1,2 M sorbitu i 10 ml CAS (1,2 M sorbitu, 10 mM CaCl 2 , 10 mM Tris HCl (Tris = Tris(hydroksymetylo)aminometan) o pH=7,5) i ponownie zawieszono w 2 ml CAS. W celu przekszta lcenia 1 ml komórek zawieszonych w CAS zmieszano z oko lo 0,1 mg plazmidu DNA i pozo- stawiono w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodano 1 ml mieszaniny zawierajacej 20% gliko- lu polietylenowego 4000, 10 mM CaCl 2 , 10 mM Tris HCl, o pH=7,5) i mieszanin e pozostawiono na kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszanin e odwirowano i grudk e ponownie zawieszono w 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitu, 33% obj . YPD, 6,7 mM CaCl 2 ) i inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Zawiesin e nast epnie odwirowano i grudk e ponownie zawieszono w 0,5 ml 1,2 M sorbitu. Nast epnie dodano 6 ml wierzchniego agaru (po zywka S.C. Shermana i wsp. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory), zawieraj acego 1,2 M sorbitu z 2,5% agaru) w temperaturzePL 203 546 B1 10 52°C i zawiesin e wylano na górn a czes c p lytek, zawieraj ac a t e sam a utwardzan a agarem, zawieraj a- c a sorbit po zywk e. Szczep S. cerevisiae MT663, przekszta lcony plazmidami ekspresyjnymi, hodowano w YPD przez 72 godziny w temperaturze 30°C. Ilo sciowej oceny wydajno sci prekursora insuliny w nads a- czach z hodowli dokonano poprzez analiz e metod a HPLC z odwróconymi fazami z zastosowaniem insuliny ludzkiej jako normy zewn etrznej (Snel i Damgaard (1988) Proinsulin heterogenity in pigs. Horm. Metabol. Res. 20:476-488). P r z y k l a d 1 Wytwarzanie syntetycznych peptydów z aminokwasem aromatycznym (jednym lub wi ecej) Technik a PCR w warunkach standardowych (Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press) i technik a polimerazy E.H.F. (Boehringer Mannheim GmbH, Sand- hoefer Strasse 116, Mannheim, Niemcy) wytworzono geny syntetyczne, koduj ace bia lka fuzyjne, utwo- rzone z Asp B28 IP po laczonego z sekwencj a liderow a, sk ladaj ac a si e z prepeptydu (peptyd sygna lowy) i propeptydu. Wytworzone fragmenty DNA izolowano i poddano trawieniu endonukleazami i oczysz- czano zestawem Gene Clean (Bio101 Inc., La Jolla, Kalifornia, Stany Zjednoczone). Do ligacji DNA zastosowano metody standardowe i dokonano transformacji komórek E. coli metod a CaCl 2 (Sambrook i wsp. (1989), jak wy zej). Z poddanych transformacji komórek E. coli oczyszczono plazmidy, stosuj ac kolumny QIAGEN (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Ustalano sekwencj e nukleotydow a, stosuj ac system sekwencjonowania ALF Pharmacia Biotech DNA z oczyszczonym dwuniciowym DNA plazmidowym jako matryc a. Primery oligonukleotydowe do DNA wytworzono technik a DNA ( Lrhus, Dania). Dokonano ekspresji wydzielniczej Asp B28 IP w S. cerevisiae, wykorzystuj ac szczep MT663 S. cerevisiae i oparty na 2 µm dro zd zowy wektor ekspresyjny CPOT (zob. Fig. 1), jak to opisali Thim L. i wsp. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6766-6770. Wektor ekspresyjny dro zd zy zawiera gen izomerazy fosforanu triozy Schizosaccharomyces pombe (POT) do doboru plazmidów i stabilizacji w S. cerevisiae. Ponadto stosuje si e promotor i terminator genu izomerazy fosforanu triozy S. cerevi- siae (TPI1) do inicjacji i terminacji transkrypcji genu rekombinacyjnego, koduj acego bia lko fuzyjne lider-Asp B28 . Wydzielanie Asp B28 u latwia l lider czynnika a, mo zna jednak stosowa c rozmaite znane dro zd zowe sekwencje liderowe. Jak to ukazano na Fig. 1, wytworzono plazmid ekspresyjny S. cerevisiae pAK721, wykazuj acy ekspresj e bia lka fuzyjnego lider LA19-EEAEAEAEPK (SEQ ID nr 3)-IP w oparciu o plazmid wahad lo- wy POT S. cerevisiae E. coli (patent Stanów Zjednoczonych 5,871,957). Na Fig. 1, L-IP wskazuje kaset e ekspresji bia lka fuzyjnego, koduj ac a bia lko fuzyjne lider-IP; PROMOTOR TPI jest promotorem TPT1 S. cerevisiae, TERMINATOR TPI jest terminatorem TPJ1 S. cerevisiae; TPI-POMBE wskazuje gen POT S. pombe, stosowany do doboru S. cerevisiae; POCZ ATEK wskazuje na pocz atek replikacji w S. cerevisiae, pochodz acy z plazmidu 2 µm; AMP-R wskazuje gen ß-laktamazy, nadaj acy oporno sc na ampicylin e, u latwiaj acy dobór w E. coli, a POCZ ATEK-PBR322 wskazuje pocz atek replikacji w E. coli. Wytworzono DNA, koduj ace bia lka fuzyjne sekwencji liderowych i Asp B28 z ro znymi mini- peptydami C, technik a PCR z zastosowaniem odpowiednich oligonukleotydów jako primerów, jak to opisano poni zej. Zastosowano standardowe metody celem subklonowania fragmentów DNA, koduj acych bia lka fuzyjne lider-AspB28 do wektora ekspresyjnego CPOT w nast epuj acej konfigu- racji: lider-Lys-Arg-przerywnik (ang. spacer)-Asp B28 IP, przy czym Lys-Arg jest potencjalnym miej- scem obróbki proteazy dwuzasadowej, a przerywnik jest wyd lu zeniem N-ko ncowym. W celu optymalizacji obróbki bia lka fuzyjnego przez endoproteaz e Kex2 S. cerevisiae dokonano insercji DNA koduj acego peptyd przerywnikowy (wyd lu zenie N-ko ncowe), na przyk lad EEAEAEAPK (SEQ ID nr 4) mi edzy DNA koduj ace lider a Asp B28 IP (Kjeldsen i wsp. (1996) Gene 170, 107-112). Jed- nak ze obecno sc peptydu przerywnikowego nie jest konieczna. Dojrza le Asp B28 IP wydziela lo si e jako jedno la ncuchowy prekursor insuliny z wyd lu zeniem N-ko ncowym z mini-peptydem C, lacz ac Lys B29 i Gly A1 . Po oczyszczeniu Asp B28 IP i proteolitycznym usuni eciu wyd lu zenia N-ko ncowego i mini-peptydu C mo zna doda c aminokwas Thr B30 do Lys B29 przez transpeptydacj e enzymatyczn a, celem wytworzenia insuliny ludzkiej Asp B28 (Markussen i wsp. (1987) w „Peptides 1986" (pod red. Theodoropoulos, D.), str. 189-194, Walter de Gruyter & Co., Berlin). Dokonano rozwini ecia syntetycznych mini-peptydów C poprzez losowy dobór jednego lub wi e- cej kodonów, koduj acych aminokwasy w mini-peptydzie C. Wszystkie syntetyczne mini-peptydy C posiadaj a miejsce obróbki enzymatycznej (Lys) na ko ncu C, umo zliwiaj ace enzymatyczne usuwanie syntetycznego mini-peptydu C (patent Stanów Zjednoczonych nr 4,916,212, który w lacza si e do ni-PL 203 546 B1 11 niejszego opisu przez przywo lanie). Doboru losowego dokonano z zastosowaniem uszlachetnionych oligonukleotydów, wprowadzaj acych wariacje kodonu lub kodonów w jednej lub kilku pozycjach synte- tycznych mini-peptydów C. Typowo uszlachetniano jeden z dwóch primerów (oligonukleotydów) sto- sowanych do PCR. Przyk ladem pary oligonukleotydowej, stosowanej do wytwarzania PCR lidera- -Asp B28 IP z losowo dobranymi syntetycznymi mini-peptydami C, stosowanej do wytworzenia synte- tycznych mini-peptydów C o ogólnym wzorze: Xaa-Trp-Lys (XWK) s a nast epuj ace primery: Primer A: 5'-TAAATCTATAACTACAAAAAACACATA-3' (SEQ ID nr 13) i Primer B: 3'-CCAAAGAAGATGTGACTGTTCNNMACCTTCCCATAGCAACTTGTTACAAC- ATGAAGATAGACAAGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATCAGATCTTTGA-TTC-5' (SEQ ID nr 14), przy czym N stanowi A, C, G lub T, a M stanowi C lub A. Polimerazowa reakcja la ncuchowa PCR typowo wykonywano w sposób opisany poni zej: 5 µl primera A (20 pmol), 5 µl primera B (20 pmol), 10 µl bufora PCR 10X, 8 µl mieszaniny dNTP, 0,75 µl enzymu E.H.F., 1 µl plazmidu pAK1150 jako matryca (oko lo 0,2 µg DNA) i 70,25 µl wody destylowanej. Typowo przeprowadzano 10-15 cykli, przy czym jeden z cykli, typowo, w temperaturze 94°C przez 45 minut; 55°C przez 1 minut e; 72°C przez 1,5 minuty. Mieszanin e PCR nak ladano nast epnie na 2% zel agarozowy i wykonywano elektroforez e standardowymi sposobami. Powsta ly fragment DNA wycinano z zelu agarozowego i izolowano zestawem Gene Clean. Fig. 2 ukazuje sekwencj e DNA pAK1150, stosowanego jako matryca PCR i aminokwasy, które wesz ly w sk lad kodowanego bia lka fuzyjnego (czynnik a-lider-(EEAEAEAPK) (SEQ ID nr 4)-Asp B28 IP pAK1150 (SEQ ID nr 5 i 6). Plazmid pAK1150 jest podobny do pAK721, ukazanego na Fig. 1. Koniec C czynnika a-lidera zmieniono tak, aby wprowadzi c endonukleazowe miejsce restrykcyjne Ncol, zmie- niaj ace sekwencj e aminokwasów z SerLeuAsp na SerMetAla. Ponadto kodowane Asp B28 IP nie zawie- ra mini-peptydu C: Lys B29 jest bezpo srednio polaczony z Gly A1 . Oczyszczony fragment PCR DNA rozpuszczono w wodzie i buforze endonukleaz restrykcyjnych i trawiono odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi (na przyk lad Bgl II i Xbal), standardowymi sposobami. Fragmenty DNA BgIII-XbaI poddano elektroforezie na zelu agarozowym i oczyszczono z zastosowaniem zestawu Gene Clean. Plazmid ekspresji pAK1150 lub podobny plazmid typu CPOT (zob. Fig. 1) trawiono endonuklea- zami restrykcyjnymi Bgl II i Xbal, i izolowano fragment wektorowy nukleotydu o d lugo sci 10765 par zasad z zastosowaniem zestawu Gene Clean. Dwa strawione izolowane fragmenty DNA (fragment wektorowy i fragment PCR) poddano wza- jemnej ligacji, stosuj ac ligaz e DNA T4 i standardowe warunki. Mieszanin e ligacyjn a transformowano nast epnie do kompetentnego szczepu E. coli (R-, M+) i nast epnie dokonywano selekcji z wykorzysta- niem oporno sci na ampicylin e. Z powsta lych E. coli izolowano plazmidy, stosuj ac kolumny QIAGEN. Plazmidy zastosowano nast epnie do transformacji odpowiedniego szczepu gospodarza S. ce- revisiae, na przyk lad MT662 (MATa/MATa pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi: :LEU2/tpi : :LEU2 Cir + ). Po- szczególne transformowane klony S. cerevisiae hodowano w po zywce p lynnej, i oznaczano ilo sc Asp B28 IP wydzielanego do nads aczu hodowli metod a RP-HPLC. Nast epnie oznaczono sekwencj e DNA, koduj ac a syntetyczny mini-peptyd C plazmidów ekspresyjnych z klonów S. cerevisiae, wydziela- jacych w zwi ekszonej ilo sci Asp B28 IP. Nast epnie zidentyfikowane sekwencje syntetycznego mini- peptydu C mo zna by lo podda c kolejnemu cyklowi optymalizacji doboru losowego. Przyk lad sekwencji DNA koduj acej bia lko fuzyjne lider-Asp B28 IP (GluTrpLys) z mini-peptydem C (GluTrpLys), powsta le w wyniku procesu optymalizacji doboru losowego, przedstawiono na Fig. 3 (SEQ ID nr 7 i 8). W Tabeli 1 i 2 przedstawiono analogi prekursorów insuliny wytworzone powy zszym sposobem i wydajno sc produkcji, wyra zon a jako odsetek warto sci dla sposobu kontrolnego. Fermentacj e prowa- dzono w temperaturze 30°C przez 72 godziny w 5 ml YPD. Ilosc wytworzonego prekursora insuliny oznaczono RP-HPLC nads aczu hodowli i wyra zono w stosunku do ilo sci szczepu kontrolnego, wyka- zuj acego ekspresj e bia lka fuzyjnego lider-AspB28-IP, w którym reszta B29 jest po laczona z reszt a A1 wi azaniem peptydowym, lub bia lka fuzyjnego lider-Asp B28 -IP, w którym reszta B29 jest po laczona z reszt a A1 mini-peptydem C. W tabelach „ a*" oznacza lider czynnika a, w którym koniec C do Lys-Arg zmodyfikowano z „SLD (SerLeuAsp)" do „SMA (SerMetAla)", a „ex4" jest wyd luzeniem N-ko ncowym z sekwencj a aminokwasow a EEAEAEAPK (SEQ ID nr 4). YAP3 jest sekwencj a sygna low a TA39 jestPL 203 546 B1 12 syntetyczn a prosekwencj a QPIDDTESNTTSVNLMADDTESRFATNTTLAGGLDVVNLISMAKR (SEQ ID nr 16). Sekwencja EEGEPK (SEQ ID nr 17) jest wyd lu zeniem N-ko ncowym la ncucha B analogu insuli- ny. TA57 jest syntetyczn a prosekwencj a QPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLIS- MAKR (SEQ ID nr 18). T a b e l a 1 Lider- wyd lu zenie N-ko ncowe Prekursor Mini-peptyd C Wydajno sc* SEQ ID nr: a*-ex4 Asp B28 IP (kontrola) brak 100 a*-ex4 Asp B28 IP MetTrpLys 378 a*-ex4 Asp B28 IP AlaTrpLys 270 a*-ex4 Asp B28 IP ValTrpLys 284 a*-ex4 Asp B28 IP IleTrpLys 330 a*-ex4 Asp B28 IP LeuTrpLys 336 a*-ex4 Asp B28 IP LysTrpLys 288 a*-ex4 Asp B28 IP GluGluPheLys 272 SEQ ID nr: 15 a*-ex4 Asp B28 IP GluPheLys 379 a*-ex4 Asp B28 IP GluTrpLys 374 a*-ex4 Asp B28 IP SerTrpLys 226 a*-ex4 Asp B28 IP ThrTrpLys 270 a*-ex4 Asp B28 IP ArgTrpLys 227 a*-ex4 Asp B28 IP GluMetTrpLys 212 SEQ ID nr: 1 a*-ex4 Asp B28 IP GlnMetTrpLys 239 SEQ ID nr: 2 T a b e l a 2 Lider- wyd lu zenie N-ko ncowe Prekursor Mini-peptyd C Wyda no sc* SEQ ID nr: a*-ex4 Asp B28 IP (kontrola) AlaAlaLys 100 a*-ex4 Asp B28 IP GluTrpLys 626 a*-ex4 Asp B28 IP GluTyrLys 466 a*-ex4 Asp B28 IP GluPheLys 444 a*-ex4 Asp B28 IP AspTrpLys 460 AP3-TA57- EEGEPK Asp B28 IP GluTrpLys 767 (SEQ ID nr: 17) YAP3-TA39- EEGEPK Asp B28 IP MetTrpLys 687 (SEQ ID nr: 17) P r z y k l a d 2 Oznaczanie struktury Asp B28 IP (MetTrpLys) w roztworze wodnym przez spektroskopi e MR Spektroskopia NMR Wytworzono próbki do NMR poprzez rozpuszczenie liofilizowanego proszku bia lkowego w 10/90 D 2 O/H 2 O w 10 mM buforu fosforanowego i dostosowanie do zadanego pH poprzez doda- nie ma lej obj eto sci 1 M DCI lub NaOD. Wszystkie odczyty z pH-metru przeprowadzano bez po- prawki na efekty izotopowe. Wytwarzano próbki Asp B28 IP (MetTrpLys) do MR w st ezeniu od 25 µM do 1 mM w pH 8,0. Dwuwymiarowe widma 1 H- 1 H MR próbek 1 mM, QF-COSY (Piantini i wsp. (1982) J. Am. Chem. Soc. 104:6800-6801, Rance i wsp. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 117:479-485), TOCSY (Braunschweiler i wsp. (1983) J. Magn. Reson. 53:521-528, Bax i wsp. (1985) J. Magn. Reson. 65:355-360) i NOESY (Jeener i wsp. (1979) J. Chem. Phys.PL 203 546 B1 13 71:4546-4553) rejestrowano przy cz esto sci 600 MHz, na spektrometrze MR Varian Unity Inova, wyposa zonym w sond e potrójnego rezonansu 1 H/ 13 C/ 15 N z samoos laniaj ac a si e trójosiow a spiral a gradientow a z zastosowaniem standardowych sekwencji impulsowych z biblioteki u zytkownika Varian. Temperatur e ustawiono na 27°C. Dla ka zdej fazy uzyskano czu le, dwuwymiarowe przyro- sty widma MR 512 t 1 , z punktami danych rzeczywistych 2048 lub 4096 wed lug metody TPPI- -States (Marion i wsp. (1989) J. Magn. Reson. 85:393-399). Zastosowano szeroko sci widmowe 6983 Hz w obu wymiarach, umieszczaj ac no snik dok ladnie na cz esto sci rezonans wody, os labio- ny poprzez zastosowanie saturacji mi edzy skanami dla 1,5 sekundy lub wybiórczego wzbudzania poprzez sekwencj e impulsow a wzbudzania gradientowego (WATERGATE, Piotto i wsp. (1992) J. Biomol. NMR 2:661-665). Zarejestrowano widma QGFCOSY, stosuj ac wersj e ze zwi ekszonym gradientem z wykorzystaniem gradientów k ata magicznego (Mattiello i wsp. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:3253-3261). Dla widm TOCSY zastosowano czasy mieszania od 30 do 80 ms, a dla NOESY czasy mieszania od 50 do 200 ms. Przeprowadzono obróbk e dwuwymiarowych widm NMR z zastosowaniem pakietu oprogra- mowania Xwinnmr (wersja 2.5, oprogramowanie z Bruker Analytische Messtechnik GmbH, D- 76275 Ettlingen, Niemcy). Ka zdy wymiar poddawano obróbce z przesuni et a apodyzacj a typu „sine-bell" i wyzerowaniem dokonywanym jeden raz w ka zdym wymiarze. W razie potrzeby doko- nywano poprawek w odniesieniu do warto sci wyj sciowych z zastosowaniem standardowych pro- cedur Xwinnmr. Przyporz adkowania widmowego, ca lkowania piku poprzecznego, przyporz adkowania swo- istego sekwencji, przypisania stereospecyficznego i innych operacji pomocniczych dokonano z zastosowaniem programu PRONTO (PRONTO Software Development and Distribution, Kopen- haga, Dania) (Kj cr i wsp. (1991), NATO ASI Series (pod red. Hoch, J.C., Redfield C. & Poulsen, F.M.) Plenum, Nowy Jork, Stany Zjednoczone). Mierzono przesuni ecia chemiczne w ppm, a rezo- nans wody ustawiano na 4,75 ppm. Obliczenia struktury Granice odleg losci do pó zniejszych oblicze n struktury uzyskano z sca lkowanych pików po- przecznych z widma NOESY, klasyfikowanych jako ma le, srednie lub du ze, odpowiadaj ace górnej granicy, wynosz acej odpowiednio 5,5, 3,3 i 2,7 L. Dla granic obejmuj acych grupy metylowe do górnej granicy dodawano dodatkowe 0,5 L (Wagner i wsp. (1985) J. Mol. Biol. 196:611-639). Dokonano obli- cze n struktury, stosuj ac metod e hybrydow a, lacz ac a geometri e odleg lo sci (Crippen i wsp. (1988) Dis- tance Geometry and Molecular Conformation, Research Studies Press, Taunton, Somerset, Anglia; Kuszewski i wsp. (1992) J. Biomol. NMR 2:33-56) i symulowan a denaturacj e, zgodnie z za lo zeniami Nilges i wsp. (1988) FEBS Lett. 229:317-324 z zastosowaniem X-PLOR 3,0 (Brünger (1992) X-PLOR version 3.1: A System for X-ray Crystallography and NMR, Yale University Press, New Haven, Stany Zjednoczone) wed lug przyk ladów podanych w podr eczniku X-PLOR (dgsubembed.inp, dgsa.inp, refi- ne.inp). Numery reszt pochodz a od standardowej numeracji reszt insuliny; reszty w lancuchu B s a numerowane B1-B29, reszty w peptydzie C (na przyk lad MetTrpLys) - C1-C3, a reszty w lancuchu A-A1-A21. Przyporz adkowanie widmowe widma MR, dla wi ekszo sci rezonansów, by lo zgodne ze standar- dowym sposobem przyporz adkowania sekwencyjnego, opisanym przez Wüthrich (1986 NMR of Prote- ins and Nucleic Acids, Wiley, Nowy Jork, Stany Zjednoczone). Standardowy sposób przyporz adkowy- wania zawodzi, gdy proton z grupy amidowej danej reszty aminokwasowej wymienia si e zbyt szybko z protonami wody. W pH 8,0 dochodzi do tego w przypadku kilku reszt aminokwasowych, jednak po- równanie z wcze sniejszym przyporz adkowaniem widmowym NMR zmutowanej insuliny i identyfikacja s asiednich (w przestrzeni) reszt aminokwasowych przez NOE umo zliwia niemal ca lkowite przyporz ad- kowanie widmowe. Analiza widm NOESY wykaza la, ze kilka reszt aminokwasowych posiada lo sie c NOE do otaczaj acych reszt, podobn a do oznaczonej uprzednio dla innych cz asteczek insuliny, na przyk lad mutanta insuliny ludzkiej HisB 16 (Ludvigsen i wsp. (1994) Biochemistry 33:7998-8006) i takie same zwi azki wykazano dla reszt B1-B10, B13-B14, B17-B24 i A4-A21. Ponadto przyj eto ogranicze- nia k ata dwu sciennego dla wy zej wymienionych reszt z reszt stosowanych poprzednio (Ludvigsen i wsp. 91994), jak wy zej). Kilka aminokwasów, zw laszcza B27-B29, C1-C3, A1-A3, ma wzorce pików poprzecznych, zgodne z wzorcami lancuchów peptydowych mniej uporz adkowanych, ni z zazwyczaj dobrze zdefinio- wane elementy struktury drugorz edowej. Tak wi ec dodatkowe NOE przekszta lcono w granice bez klasyfikowania, poza ustaleniem górnej granicy na 5,5 L, lub 6,0 L (przy zawarto sci grupy metylowej).PL 203 546 B1 14 W sumie obliczono 20 zbie znych struktur (Fig. 5) i odpowiednie ich parametry wymieniono w tabeli 3. Ka zde z tych NOE, identyczne z granic a odleg lo sci, liczy si e tylko raz, mimo, ze mog lo wyst api c kilka razy w widmie NOESY. Ocena jako sci wykresu Ramachandran jest standardowym parametrem jako- sci dla oceny jako sci geometrii lokalnej. Ogólnie, opisane parametry jako sci s a porównywalne z rozdzielczo sci a 2,5 L rentgenowskich struktur bia lek (Laskowski i wsp. (1996) J. Biolmol. NMR 8:477-486). T a b e l a 3 Ocena jako sci struktury Asp B28 IP (MetTrpLys) Liczba NOE W sumie 742 Wewn etrznych 319 Krótkiego zakresu (w obr ebie 5 reszt, lecz nie wewn atrz NOE) 270 D lugiego zakresu (w odleg lo sci wi ekszej od 5 reszt) 153 Odst epstwo od NOEs 0,4 Å ( srednia dla 20 struktur) 0 RMS odst epstw od NOE 0,013 (±0,002) Å RMS ograniczenia k ata dihedralnego 0,30 (±0,08) ° Odst epstwa od idealnej geometrii Niew la sciwe 0,28 (±0,02) ° K aty 0,38 (±0,02)° Wi azania 0,0031 (±0,0002) Å Wykres Ramachandrana (Laskowski 1996) Regiony korzystne 77,2% Dodatkowe dozwolone regiony 19,8% Maksymalnie dozwolone regiony 2,6% Regiony niedozwolone 0,4% Opis obliczonej struktury Przyk ladow a struktur e, najbardziej przypominaj ac a sredni a zespo lu, przedstawiono na Fig. 6. Asp B28 IP(MetTrpLys) jest strukturalnie podobna do struktury insuliny natywnej dla regionów zawieraj a- cych reszty B1-B10, B14-B23, A4-A21. Ró znice s a najbardziej zaznaczone dla regionów po lo zonych w s asiedztwie peptydu lacz acego w pozycjach B26-B29, C1-C3, A1-A3 i mniej zaznaczone dla reszt B11-B13. Struktura Asp B28 IP (MetTrpLys) jest uderzaj aco odmienna od struktury podobnej do struktury insuliny natywnej (Ludvigsen (1994), jak wy zej). La ncuchy boczne metioniny i tryptofanu w Asp B28 IP (MetTrpLys) otwieraj a struktur e rdzeniow a insuliny tradycyjnej poprzez przesuni ecie na jedn a stron e lancuchów bocznych, zw laszcza Tyr B26 i Phe B25 i pozostawienie w stanie niezmienionym s asiedniej hydrofobowej cz esci, utworzonej przez lancuchy boczne Leu B11 , Val B12 , Ile A2 i Tyr A19 . Ta „kiesze n", utworzona przez przesuni ecie Phe B25 , Tyr B26 i la ncucha peptydowego, utworzonego przez reszty B25- B29, nadaje si e jak wida c do przyj ecia lancuchów bocznych Met C1 i Trp C2 z peptydu C. Kilka NOE z tych dwóch lancuchów bocznych do strukturalnie s asiaduj acych z nimi reszt potwierdza to zupe lnie nowe uporz adkowanie lancuchów bocznych, nie obserwowane uprzednio w strukturze zadnej insuliny. Met C1 umieszcza si e w „kieszeni", utworzonej z reszt Leu B15 , Phe B24 , Tyr B26 , Trp C1 Ile A2 i Tyr A19 , z któ- rych wszystkie maj a NOE do Met C2 . Trp C2 ma nawet lepiej rozwini et a sie c NOE, lecz ze wzgl edu na szybk a wymian e protonu amidu indolowego mo zna przyporz adkowa c tylko cztery rezonanse nale zace do uk ladu pier scienia aromatycznego dla Trp C2 . Mimo to w widmie NOESY Asp B2 8IP (MetTrpLys) obserwowano 21 NOE mi edzy resztami - mi edzy Trp C2 a resztami s asiednimi, rozdzielonymi przez Leu B11 , Val B12 , Leu B15 , Tyr B26 , Met C1 i Ile A2 . Obecno sc tryptofanowego lancucha bocznego w „kieszeni" ma równie z du zy wp lyw na przesu- ni ecia chemiczne, obserwowane w widmach Asp B28 IP(MetTrpLys). W warunkach stosowanych dla MR na widma Asp B28 IP(MetTrpLys) wp lywa pewnego stopnia wzajemna asocjacja (Fig. 7), lecz wymiana mi edzy monomerem a dimerem jest w skali czasowej MR obserwowana jedynie jako srednia mi edzyPL 203 546 B1 15 dwoma stanami. W obrazie MR stopie n wzajemnej asocjacji nie zmienia si e w st ezeniu od 25 µM do 0,2 mM. W Tabeli 4 przedstawiono przesuni ecia chemiczne Asp B28 IP (MetTrpLys) w temperaturze 27°C, uzyskane przy cz esto sci 600 MHz, pH 8 w 10%/90% D 2 O/H 2 O z 10 mM buforu fosforanowego. Odniesienie dla przesuni ecia chemicznego uzyskuje si e, ustawiaj ac resztkowy sygna l wody na 4,75 ppm. „N/A" oznacza brak przyporz adkowania. Przyporz adkowanie Asp B28 IP (MetTrpLys): (1-29=B21-B29; 30-32=C1-C3 i 33-53=A1-A21); w Tabeli 5 przedstawiono wspó lrz edne atomowe Asp B28 IP (MetTrpLys) w formacie PDB. T a b e l a 4: Przyporz adkowanie widmowe NMR dla Asp B28 IP(MetTrpLys) Uk lad spinowy HN HA Inne Phe-1 4,52 HB#a : 2,976; HB#b: 3,040, HD6#: 7,104, HE#: 7,214, HZ: 7,177 Val-2 N/A N/A HB: N/A, HG#a: N/A, HG#b: N/A Asn-3 N/A HB#a: N/A, HB#b: N/A, HD2 #a: N/A, HD2#b: N/A Glu-4 N/A HB#a: N/A, HB#b: N/A His-5 4,30 HB#a:3,311, HB#b: 2,992, HD2: 6,850, HE1 : 7,605 Leu-6 4,47 HB#a 1,635, HB#b: 0,807, HG: 1,506, HD#a: 0,753, HD#b: 0,675 Cys-7 8,30 4,83 HB#a 2,901, HB#b: 3,173 Gly-8 N/A, N/A Ser-9 N/A HB#: N/A His-10 N/A 4,41 HB#a: 3,110, HB#b: 3,351, HD2: 7,112, HE1: 7,729 Leu-11 N/A 3,93 HB#a: N/A, HB#b: 1,143, HG: 1,257, HD#a: 0,375, HD#b: 0,559 Val-12 7,25 3,37 HB: 2,000, HG#a: 0,849, HG#b: N/A Glu-13 N/A N/A HB#a: N/A, HG#a: N/A, HG#b: N/A Ala-14 7,71 3,98 HB#: 1,307 Leu-15 7,83 3,74 HB#a: 0,671, HB#b: 1,254, HG 1,157, HD#a: N/A, HD#b: 0,295 Tyr-16 8,15 4,31 HB#a: 3,115, HD#: 7,204, HE#: 6,734 Leu-17 7,99 4,05 HB#a: 2,004, HB#b: 1,849, HG 1,732, HD#a: 0,900, HD#b: 0,879 Val-18 8,49 3,71 HB: 1,996, HG#a: 0,994, HG#b 0, 834 Cys-19 8,57 4,81 HH#a: 2,820, HH#b: 3,250 Gly-20 7,75 3,96, N/A Arq-22 N/A N/A HB#a: N/A, HB#b: N/A, HG#a: N/A, HG#b: N/A, HD#a: N/A, HD#b: N/A Gly-23 7,12 4,06, 3,76 Phe-24 7,56 4,99 HB#a: 2,971, HB#b: 3,206, HD#: 6,746, HE#: 6,877, HZ: N/A Phe-25 N/A 4,78 HB#a: 3,051, HB#b: N/A, HD#: 7,172, HE#: 7,249 Tyr-26 N/A 4,63 HB#a: 2,770, HB#b: N/A, HD#: 6,694, HE#: 6,291 Thr-27 N/A N/A HB: N/A, HG#: N/A Asp-28 N/A N/A HB#a: N/A, HB#b: N/A Lys-29 Met-30 7,84 4,18 HB#: 2,627, HG#: 2,904, HE#: 2,110 Trp-31 4,19 HB#a: 3,182, HE#: 7,037, HH2: 6,763, HZ2: 7,147, HZ3: 6,437 Lys-32 Gly-33 N/A, N/APL 203 546 B1 16PL 203 546 B1 17 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 18 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 19 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 20 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 21 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 22 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 23 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 24 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 25 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 26 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 27 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 28 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 29 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 30 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 31 cd. tabeli 5PL 203 546 B1 32 P r z y k l a d 3 Wzgl edna stabilno sc pofa ldowania analogów Asp B28 IP W celu oceny stabilno sci pofa ldowania dla analogów prekursorów insuliny, wytworzono próbki do denaturacji, lacz ac w ró znym stosunku analog prekursora insuliny i roztwór podstawowy GuHCl z 10 mM Tris/ClO 4 - , pH 8,0. Roztwory podstawowe bia lek by ly to typowo roztwory 0,06 mM w 10 mM Tris/ClO 4 , pH 8,0. Roztwory podstawowe GuHCl by ly to typowo roztwory 8,25 M w 10 mM Tris/ClO 4 - , pH 8,0. Rejestrowano widma CD spektropolarymetrem Jasco J-715 kalibrowanym kwa- sem (+)-10-kamforosulfonowym. Wszystkie widma rejestrowano w temperaturze 20°C. Próbki denaturacyjne skanowano w zakresie od 250 do 218 nm. Typowa d lugo sc laty komórkowej i st e- zenie bia lka wynosi ly, odpowiednio, 0,5 cm i 3 µM. Wszystkie widma wyg ladzono przed odj eciem miejsc pustych dla odpowiednich rozpuszczalników. Dichroizm ko lowy wyra zono jako ?e, w od- niesieniu do st ezenia molowego wi azania peptydowego. W celu prezentacji ka zd a krzyw a znor- malizowano do skali 0-1, dziel ac obserwowan a zmian e w ka zdym punkcie przez zmian e ca lkowit a obserwowan a w do swiadczeniu. Analiza danych Krzywe denaturacji GuHCl analizowano przyjmuj ac, ze przej scie ze stanu pofa ldowanego w niepofa ldowany jest dwustanowe, jak to opisywali Santoro i Bolen (1988), Biochemistry 27:8063-8068 i Kaarsholm i wsp. (1993), Biochemistry 32; 10773-10778; obie te publikacje w la- cza si e do niniejszego opisu przez przywo lanie ze wzgl edu na opis metod obliczania stabilno sci przez denaturacj e GuHCl. W wyniku analizy uzyskano kilka parametrów, w tym st ezenie GuHCl w srodkowym punkcie krzywej denaturacji, warto sc C mid , odzwierciedlaj ac a st ezenie srodka dena- turuj acego, niezb edn a do zniesienia pofa ldowania po lowy populacji bia lek. Zwi ekszenie stabilno- sci pofa ldowania przejawia si e zatem zwi ekszeniem warto sci C mid . Dla ka zdego st ezenia srodka denaturuj acego mo zna uzyska c sta le równowagi, stosuj ac K= ( ?e N - ?e)/( ?e- ?e U ), przy czym ?e jest obserwowan a warto sci a CD, a ?e N i ?e U oznaczaj a warto sc CD, odpowiednio, dla postaci natyw- nej i niesfa ldowanej, w danym st ezeniu GuHCl (Pace, 1975). Warto sci dla ?e N i ?e U w st ezeniu GuHCl w regionie przej sciowym uzyskuje si e przez liniow a ekstrapolacj e warto sci wyj sciowych sprzed i po przej sciu do regionu przej scia, na przyk lad ?e N = ?e° N + m N [GuHCl], a ?e U = ?e° U + m U [GuHCl], przy czym ?e° N i ?e° U s a miejscami odci ecia, a m N i m U s a nachyleniem, odpowiednio, warto sci wyj sciowych sprzed i po przej sciu. Woln a energi e rozfa ldowywania w danym st ezeniu srodka denaturuj acego w strefie przej scia podano jako ?G=-RTInK. Zak ladaj ac liniow a zale zno sc ?G od st ezenia srodka denaturuj acego: ?G= ?G H2O -m[GuHCl], przy czym ?G H2O jest warto sci a ?G w nieobecno sci srodka denaturuj acego, a m jest miar a zale zno sci ?G od st ezenia srodka denatu- ruj acego. Tak wi ec warto sci ?G obliczone z K w strefie przej scia mo zna z powrotem ekstrapolo- wa c do 0 M srodka denaturuj acego dla uzyskania ?G H2O . Zwi azek mi edzy ?e a [GuHCl] dla krzy- wej ca lkowitego rozfa ldowania przedstawiono w równaniu 1 (Santoro i Bolen, 1988): [ ] ( ) [ ] ( ) [ ] ( ) ( ) [] () () (1) /RT GuHCl m ?G exp 1 /RT GuHCl m ?G exp GuHCl m ?e GuHCl m ?e ?e H2O H2O U U N N - - + - - + + + = o o w którym ?e oznacza reakcj e a [GuHCl] oznacza zmienn a niezale zn a; równanie (1) podlega nieliniowej analizie metod a najmniejszych kwadratów z zastosowaniem procedury NLIN PC SAS (SAS Inc. Cery, North Carolina, Stany Zjednoczone). Nast epnie sze sc parametrów opisuje krzyw a denaturacji: ?e° N , ?e° U , m N , m U , m i ?G H2O . Ponadto st ezenie GuHCl w srodkowym punkcie krzy- wej denaturacji - C mid - podano jako ?G H2O /m. Oceny wzgl ednej stabilno sci pofa ldowania cz asteczki pochodnej Asp B28 IP z peptydem C MetTrpLys (Asp B28 IP (MetTrpLys)) dokonano wzgl edem Asp B28 IP. Wyniki wykazuj a, ze cz asteczka Asp B28 IP (MetTrpLys) by la znacznie bardziej stabilna, ni z Asp B28 IP (Fig. 5), czego dowodzi zmiana C mid . C mid dla Asp B28 IP wynosi oko lo 5,5 M GuHCl, natomiast Asp B28 IP (MetTrpLys) jest zwi ekszo- na do co najmniej oko lo 6,5 M GuHCl, co stanowi wzrost o oko lo 18%. P r z y k l a d 4 Wytworzono prekursor analogu insuliny Asp B28 IP (EWK), hoduj ac szczep dro zd zy MT663, transformowany plazmidem ekspresyjnym, wykazuj acym ekspresj e bia lka fuzyjnego YAP3-TA39- EEGEPK (SEQ ID nr 17)-Asp B28 IP (EWK) lub bia lka fuzyjnego AP3-TA57-EEGEPK (SEQ ID nr 17)-Asp B28 IP (EWK).PL 203 546 B1 33 Dokonano klonowania cDNA koduj acego sekwencje liderowe YAP3-TA3 9 i YAP3-TA57 i cDNA koduj acego Asp B28 IP (EWK) i klonowano wyd lu zenie N-ko ncowe do wektora ekspresyjne- go typu C-POT, stosuj ac standardowe sposoby (Sambrook J, Fritsch EF i Maniatis T, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). DNA i kodowane przeze n sekwencje ami- nokwasowe ukazano na Fig. 8 i 9. W Tabeli 6 ukazano wydajno sc. Fermentacj e prowadzono w temperaturze 30°C przez 72 godziny w 5 ml YPD. Wydajno sc IP oznaczono w RP-HPLC nads aczu hodowli i wyra zono j a w stosunku do wydajno sci IP szczepu kontrolnego. W Tabeli 6 „ a*" oznacza lider czynnika a, w którym koniec C do LysArg zmodyfikowano z „SLD(SerLeuAsp)" do „SMA(SerMetAla)", a „ex4" jest wyd lu zeniem N-ko ncowym o sekwencji aminokwasowej EEAEAEAPK (SEQ ID nr 4). YAP3 jest to sekwencja sygna lowa YAP3. TA39 jest syntetyczn a prosekwencj a QPIDDTESNTTSVNLMADDTESRFATNTTLAGGLDVVNLISMAKR (SEQ ID nr 16). Sekwencja EEGEPK (SEQ ID nr 17) jest wyd lu zeniem N-ko ncowym la ncucha B analogu insuliny. TA57 jest syntetyczn a prosekwencj a QPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQ- TNSGGLDVVGLIS- MAKR (SEQ ID nr 18). T a b e l a 6 Lider Prekursor Wyd lu zenie N-ko ncowe Peptyd C Wydajno sc* a*-ex4 Asp B28 IP GluGluAlaGluAlaGluAlaProLys (SEQ ID nr:4) Brak 100 YAP3-TA39 Asp B28 IP GluGluGlyGluProLys (SEQ ID nr:1) GluTrpLys 531% YAP3-TA57 Asp B28 IP GluGluGlyGluProLys (SEQ ID nr:17) GluTrpLys 500%PL 203 546 B1 34 WYKAZ SEKWENCJIPL 203 546 B1 35PL 203 546 B1 36PL 203 546 B1 37PL 203 546 B1 38PL 203 546 B1 39PL 203 546 B1 40PL 203 546 B1 41PL 203 546 B1 42PL 203 546 B1 43PL 203 546 B1 44 PL PL PL PL PL PL

Claims (13)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Analog prekursora insuliny o wzorze: B(1-27)-X 2 -X 3 -X 1 -Y-A(1-21) w którym B(1-27) jest la ncuchem peptydowym z lo zonym z aminokwasów nr 1-27 lancucha B ludzkiej in- suliny i aminokwasów A(1-21) lancucha A ludzkiej insuliny, X 1 jest sekwencj a peptydow a 1-5 reszt aminokwasowych, z których jedna jest aromatyczn a reszt a aminokwasow a po lo zon a N-terminalnie bezpo srednio do Y, X 2 stanowi jedn a z Pro, Asp, Lys lub Ile w pozycji 28 la ncucha B, X 3 stanowi jedn a z Pro, Lys, Ala, Arg lub Pro-Thr w pozycji 29 lancucha B, a Y stanowi Lys lub Arg.

2. Analog prekursora insuliny wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze X 1 stanowi 1-3 reszt ami- nokwasowych.

3. Analog prekursora insuliny wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze X 1 stanowi 1-2 reszt ami- nokwasowych, z których jedna jest reszt a Trp lub Phe.

4. Analog prekursora insuliny wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencj e X 1 -Y wybiera sie z grupy obejmuj acej nast epuj ace sekwencje: (a) Met-Trp-Lys; (b) Ala-Trp-Lys; (c) Val-Trp-Lys; (d) Ile-Trp-Lys (e) Leu-Trp-Lys (f) Glu-Glu-Phe-Lys (SEQ ID nr 15); (g) Glu-Phe-Lys; (h) Glu-Trp-Lys; (i) Ser-Trp-Lys; (j) Thr-Trp-Lys; (k) Arg-Trp-Lys; (l) Glu-Met-Trp-Lys (SEQ ID nr 1); (m) Gln-Met-Trp- -Lys (SEQ ID nr 2) i (n) Asp-Trp-Lys.

5. Analog prekursora insuliny wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze aromatyczne reszty ami- nokwasowe wybiera si e spo sród Trp lub Tyr.

6. Analog prekursora insuliny, wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze X 2 oznacza Asp, X 3 ozna- cza Lys i X 1 oznacza 1-3 reszt aminokwasowych w których jedna oznacza Trp lub Phe.

7. Sekwencja polinukleotydowa koduj aca analog prekursora insuliny jak zdefiniowano w zastrz. 1.

8. Wektor ekspresji zawieraj acy sekwencj e polinukleotydow a jak zdefiniowano w zastrz. 7.

9. Komórka gospodarz transformowana wektorem jak zdefiniowano w zastrz. 8.

10. Sposób wytwarzania analogu prekursora insuliny zdefiniowanego w zastrz. 1, znamienny tym, ze obejmuje (i) hodowl e komórki gospodarza, która zawiera sekwencj e polinukleotydow a, kodu- jac a analog prekursora insuliny, jak zdefiniowano w zastrz. 1 w warunkach hodowli korzystnych dla ekspresji tego prekursora i (ii) izolowanie analogu prekursora, który uleg l ekspresji.

11. Sposób wed lug zastrz. 10, znamienny tym, ze komórk a gospodarzem jest dro zd zowa ko- mórka gospodarz.

12. Sposób wytwarzania analogu insuliny, znamienny tym, ze obejmuje (i) hodowl e komórki gospodarza, która zawiera sekwencj e polinukleotydow a koduj ac a analog prekursora insuliny jak zde- finiowano w zastrz. 1 w warunkach hodowli korzystnych dla ekspresji tego prekursora i (ii) izolowanie tego analogu prekursora z medium hodowlanego, i (iii) przekszta lcanie tego analogu prekursora w analog insuliny przez chemiczn a lub enzymatyczn a konwersj e in vitro.

13. Sposób wed lug zastrz. 12, znamienny tym, ze komórk a gospodarzem jest dro zd zowa ko- mórka gospodarz.PL 203 546 B1 45 RysunkiPL 203 546 B1 46PL 203 546 B1 47PL 203 546 B1 48PL 203 546 B1 49PL 203 546 B1 50PL 203 546 B1 51PL 203 546 B1 52PL 203 546 B1 53PL 203 546 B1 54 Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 z l. PL PL PL PL PL PL