NO174351B

NO174351B - Fremgangsmaate for fremstilling av human insulinforloeper samt DNA-sekvens og vektor til anvendelse av fremgangsmaaten

Info

Publication number: NO174351B
Application number: NO852132A
Authority: NO
Inventors: Jan Markussen; Niels Fiil; Mogens Trier Hansen; Lars Thim; Kjeld Norris; Hans Ole Voigt; Gustav Ammerer
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1984-05-30
Filing date: 1985-05-29
Publication date: 1994-01-10
Also published as: DK58285D0; EP0427296A1; AU4309285A; IE66387B1; NO174351C; JPH0630613B2; JPS611389A; FI852135L; IE851331L; EP0427296B1; AU590197B2; DK323687D0; GR851304B; ES8609483A1; EP0163529A1; NZ212243A; DK157933B; ES8702488A1; EP0163529B1; NO852132L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en DNA-sekvens for bruk

i en gjærvektor, nevnte vektor, en fremgangsmåte ved fremstil-

ling av en insulinforløper med formelen

hvor Xn er en peptidkjede med n naturlig forekommende aminosyrerester, Y er Lys eller Arg, n er et helt tall fra 0 til 33, m er 0 eller 1, B(l-29) er en forkortet B-kjede av human-

insulin fra Phe<B1> til Lys <B29> og A(l-21) er A-kjeden av human-

insulin, med det forbehold at peptidkjeden -X^-Y- ikke innehol-

der to nabostående basiske aminosyrerester; og en fremgangs-

måte ved fremstilling av human insulin.

Tidligere er insulin syntetisert (fra syntetiske A- og B-

kjeder) eller resyntetisert (fra naturlige A- og B-kjeder) ved å kombinere de to kjeder i en oksydasjonsprosess, hvorved de 6 cystein-sulfhydrylgrupper i de reduserte kjeder (4 i A-

kjeden, 2 i B-kjeden) overføres i disulfidgrupper. Ved denne metoden dannes disulfidbindinger i stor grad tilfeldig, hvil-

ket betyr at insulinutbyttet med disulfidbroer riktig plassert mellom cysteinrester A-6 og A-ll, A-7 og B-7, og A-20 og B-19

resp. er meget lavt.

Etter oppdagelsen av proinsulin som et biologisk for-

stadium for insulin, observerte man at A- og B-polypeptid-

restene av det rettkjedede totalt reduserte proinsulin (disse rester svarer til A- og B-kjedene i insulin henholdsvis),

kunne kombineres oksydativt med meget mindre tilfeldighet i disulfidbindinger og gi et betydelig høyere utbytte av riktig foldet proinsulin sammenlignet med kombinasjonen av fri A- og B-kjeder (D.F. Steiner et al.: Proe. Nat. Acad. Sei. 60

(1968), 622). Selv om høye utbytter ble oppnådd bare ved for

lave proinsulinkonsentrasjoner til å gjøre fremgangsmåten brukbar i preparativ skala, ble funksjonen av C- (dvs. for-

bindende peptid) resten til B-C-A-polypeptidsekvensen til proinsulin, nemlig den å bringe de 6 cysteinrester i rommelig gunstige posisjoner for korrekt oksydasjon til proinsulin,

tydelig påvist.

Det dannede proinsulin kan virke som et in vitro forløper for insulin ved at det forbindende peptid kan fjernes enzymatisk (W. Kemmler et al.: J.Biol. Chem. 246 (1971), 6786).

Senere er det vist at proinsulin-lignende forbindelser med kortere bindingsrester enn C-peptidet og ved begge ender flankert av spesifikke enzymatiske eller kjemiske spaltningsseter (de såkalte miniproinsuliner (A. Wollmer et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 355 (1974), 1471-1476 og Dietrich Brandenburg et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem 354

(1973), 1521-1524)) også kan tjene som insulinforløpere.

Bestrebelser på å frembringe biosyntetiske insuliner, spesielt det som er identisk med menneskenes, har fulgt de samme strategiske baner som for syntetisk insulin. Insulin A-og B-kjedene har vært uttrykt i separate verts-organismer, isolert fra disse og så kombinert som beskrevet ovenfor (R.E. Chance et al.; Diabetes Care 4 (1982), 147). Mikro-organismer er blitt transformert med kloningsvektorer som koder for pre-proinsulin eller proinsulin hvilke kan utskilles som sådanne (W. Gilbert et al.: European Patent Publ. nr. 6694) eller akkumuleres intracellulært som hybdirgenprodukter (D.V. Goeddel et al.; European Patent Publ. nr. 55945). Minipro-insulinveien er også forsøkt (D.V. Goeddel, ovenfor).

Frembringelse av A- og B- kjedene i adskilte fermen-teringsprosesser etterfulgt av kombinasjon av kjedene er nød-vendigvis upraktisk. Den tungvinte doble fermentering kan unngås ved å velge proinsulin eller miniproinsulin-strategien. Imidlertid kan bruken av et proinsulin som biosyntetisk insu-linf orsløper medføre visse ulemper. Proinsulinet, enten det utskilles i fermenteringsvæsken som sådan eller akkumuleres intracellulært i vertsorganismen, eventuelt som et hybridgen-produkt, vil sannsynligvis inneholde betydelig tilfeldige disulfidbindinger. Nyfoldingen av slike "sammenristede" produkter i riktig foldet proinsulin kan enten utføres direkte

(H.G. Gattner et al.: Danish Patent Application nr. 4523/83)

eller via det enkeltkjedede heksa-S-sulfonat (F.B. Hill: European Patent Publ. nr. 37255). Nyfoldingsprosessen medfø-

rer normalt en viss polymeriseringsgrad og følgelig bryet med bruk av arbeidskrevende rensetrinn under isoleringen.

I tillegg er insulinforløpere for proinsulintypen utsatt for enzymatisk nedbrytning, enten inne i vertcellene eller etter utskillelse derav i fermenteringsmediet. I gjær er det vist at human-proinsulin er spesielt sensitivt overfor enzymatiske spaltninger på de to dibasiske sekvenser (Arg31-Arg32 og Lys64-Arg65). Åpenbart finner disse spaltningere sted før dannelsen av S-S-broene og fører til dannelsen av C-peptid, A-kjede og B-kjede.

Målet for foreliggende oppfinnelse er å unngå disse ulemper ved å tilveiebringe biosyntetiske insulinforløpere som dannes i stor grad med riktig plasserte disulfidbroer mellom A- og B-restene, og videre er betydelig mer bestandige overfor proteolytisk nedbrytning enn tidligere kjente biosyntetiske insulinforløpere.

En enkelt-kjedet insulinforløper bestående av en forkortet insulin B-kjede fra PheB1 til Lys<B29> som fortsetter i en fullstendig A-kjede fra Gly<*1> til Asn<*21>, B(l-29)-A(l-21) , er kjent (Jan Markussen, "Proteolytic degradation of proinsulin and of the intermediate forms",: Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide, Tokushima, 12-14, juli, 1978, utg..: S. Baba et al.). Denne insulinforløper B(l-29)-A(l-21) fremstilles ved en semisyntetisk fremgangsmåte fra svine-insulin. Først fremstilles insulin B(l-29) og A(l-21)-kjedene og kobles under dannelse av et lineært peptid B(l-29)-A(l-21). Denne forbindelse i heksatiolformen ble oksydert in vitro til det enkjedede des-(B30)-insulin-molekylet.

Foreliggende oppfinnelse bygger på den overraskende opp-dagelse at den ovenfor nevnte enkjedede insulinforløper B(l-29)-A(1-21) og derivater derav med en brodannende kjede som forbinder karboksylenden til B(1-29)-kjeden med aminoenden av A(1-21)-kjeden uttrykkes i høye utbytter og mer riktig plasserte disulfidbroer når gjærstammer som er transformerte med DNA-sekvenser kodende for slike insulinforløpere dyrkes.

Ifølge et første aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en DNA-sekvens som koder fo insulinforløpere med formelen

hvor Xn er en peptidkjede med n naturlig forekommende aminosyre-rester, Y er Lys eller Arg, n er et helt tall fra 0 til 33, m er 0 eller 1, B(l-29) er en forkortet B-kjede av human-insulin fra Phe<B1> til Lys <529> og A (1-21) er A-kjeden av human-insulin, idet peptidkj eden -X„-Y- dog ikke kan inneholde to nabostående basiske aminosyrerester.

Foretrukne insulinforløpere med ovennevnte formel I er B(l-29)-A(l-21), dvs. m = 0 i formel I, og forbindelser med en relativt kort brokjede mellom B(l-29)- og A(1-21)-kjeden.

Når m = 1, er n fortrinnsvis 1-3 3, gjerne 1-15, 1-8 eller 1-5 og helst 1-3 eller 1-2. X kan fortrinnsvis velges fra gruppen bestående av Ala, Ser og Thr, idet de enkelte X'er er like eller forskjellige. Eksempler på slike foretrukne forbindelser er B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21)) og B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) .

Ifølge et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes en replikerbar ekspresjonsvektor med evne til ekspresjon av en DNA-sekvens omfattende en sekvens som koder for insulinforløpere med formel I i gjær.

Ekspresjonsvektoren kan være et plasmid med evne til replikasjon i vertsmikroorganismer eller istand til integre-ring i vertsorganismekromosomet. Den anvendte vektor kan kode for ekspresjon av gjentatte sekvenser av den ønskede DNA-sekvens som alle er adskilt med selektive spaltningsseter.

Ifølge et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av insulin-forløpere med formel I i gjær, hvor en transformert gjærstamme inneholder minst én ekspresjonsvektor med evne til å uttrykke at insulinforløperne dyrkes i et velegnet næringsmedium, hvoretter insulinforløperne isoleres på i og for seg kjent måte.

Ifølge en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, koder DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen for nye insulinforløpere med formlene B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) og B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21).

Insulinforløperne kan utrustes med et ytterligere protein som står forut for insulinforløperen. Tilleggsproteinet kan ha en beskyttelsesfunksjon for insulinforløperen mot f.eks. in vivo-nedbrytning med endogene enzymer, eller gi nødvendig informasjon til det transporterende ønskede protein til det periplasmiske rom og til slutt gjennom celleveggen ut i mediet.

Tilleggsproteinet inneholder et selektivt spaltningssete nær N-enden til B(1-29)-kjeden til insulinforløperne som muliggjør etterfølgende avspaltning av tilleggsproteinet enten av mikroorganismen selv eller ved senere enzymatisk eller kjemisk spaltning.

Følgelig innbefatter foreliggende oppfinnelse en DNA-sekvens som koder for ovennevnte insulinforløpere og omfatter videre en ytterligere DNA-sekvens plassert oppstrøms for sekvensen som koder for insulinforløperne og koder for en ytterligere aminosyresekvens inneholdende et selektivt spaltningssete nær N-enden til B(1-29)-kjeden av insulinforløperne.

Fortrinnsvis omfatter tilleggs-aminosyresekvensen minst én basisk aminosyre nær N-enden av B(1-29)-kjeden til insulin-forløperen.

Når insulinforløperen uttrykkes i gjær, kan tilleggs-aminosyresekvensen inneholde to basiske aminosyrer (f.eks. Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg eller Arg-Lys) nær N-enden av B(1-29)-kjeden av insulinforløperen, idet gjær kan spalte peptidbindingen mellom de basiske aminosyrer og forløperen. Også et Glu-Ala eller Asp-Ala spaltningssete nær det ønskede protein muliggjør adskillelse av tilleggs-aminosyresekvensen med gjær selv ved hjelp av et dipeptidase-enzym fremstilt av gjæren.

Insulinforløperne kan utskilles med en aminosyresekvens bundet til B(1-29)-kjeden til forløperne, forutsatt at denne aminosyresekvens inneholder et selektivt spaltningssete nær B(1-29)-kjeden for senere avspaltning av den overflødige aminosyresekvens. Hvis insulinforløperne ikke inneholder metionin, vil bromcyan-spaltning ved metioninet nær det ønskede protein virke. Likeledes muliggjør arginin- og lysin-spaltningsseter nær det ønskede protein spaltning med trypsin-lignende proteaser.

For utskillelse kan DNA-sekvensen som koder for insulin-forløperne sammenkobles med en tilleggs-DNA-sekvens som koder for et signalpeptid. Signalpeptidet avspaltes av transformant-mikroorganismen under utskillelsen av det uttrykte proteinprodukt fra cellene, hvilket gir en enklere isolering av det ønskede produkt. Det utskilte produkt kan være insulinforløperen eller kan inneholde en ytterligere N-terminal aminosyresekvens som må fjernes senere som forklart ovenfor.

Sekresjon kan oppnås ved å ta inn i ekspresjonsvektoren gjærens MFal-ledersekvens (Kurjan J, og Herskowitz I., Cell 30, (1982), 933-943) og ifølge en ytterligere foretrukket ut-førelsesform av foreliggende oppfinnelse, omfatter tilleggs-aminosyresekvensen som befinner seg oppstrøms for sekvensen som koder for insulinforløperne gjærens MFal-leder som koder for sekvensen eller en del derav.

Ekspresjonen av den ønskede DNA-sekvens vil være under kontroll av en promotor-sekvens korrekt plassert i forhold til DNA-sekvensen som koder for det ønskede protein i verts-orga-nismen. Fortrinnsvis kan en promotor opprinnelig hjemme-hørende i vertsorganismen brukes. DNA-sekvensen for det ønskede protein vil etterfølges av en transkripsjons-avslut-ningssekvens fra et gen hjemmehørende i vertsorganismen. Hvis gjæren brukes som vertsorganisme, er promotor- og avslutnings-sekvenser fortrinnsvis promotor og avslutning for triosefosfat-isomerase (TPI)-genet, resp.

Andre promotorer kan også anvendes såsom fosfoglycerat-kinase (PGK1)- og MFal-promotoren.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av human-insulin, hvori en gjærstamme som inneholder en DNA-sekvens som koder for en insulinforløper med formelen

hvor Xn er en peptidkjede med n naturlig forekommende aminosyre-rester, Y er Lys eller Arg, n er et helt tall fra 0 til 33, m er 0 eller 1, B(l-29) er en forkortet B-kjede av human-insulin fra Phe<B1> til Lys B2<9> og A (1-21) er A-kjeden av human-insulin, idet peptidkj eden -Xn-Y- dog ikke kan inneholde to nabostående basiske aminosyrerester, dyrkes i et egnet næringsmedium, hvorpå den uttrykte insulinforløper utvinnes fra kulturvæsken og omdannes til humaninsulin på i og for seg kjent måte.

Insulinforløperne kan overføres i ferdig human-insulin ved transpeptidering med en L-threoninester i nærvær av trypsin eller et trypsin-derivat som beskrevet i dansk patent-søknad 574/80 etterfulgt av transformering av threoninesteren av human-insulin til human-insulin ved kjente fremgangsmåter.

Hvis insulinforløperne utskilles med en ytterligere amino-syresekvens nær N-enden av B(l-29)-kjeden, bør en slik amino-syresekvens enten fjernes in vitro før transpeptidering, eller bør inneholde minst én basisk aminosyre nær N-enden til B(1-29)-kjeden, da trypsin vil spalte peptidbindingen mellom den basiske aminosyre og aminogruppen til Phe<B1> under trans-peptideringen.

De medfølgende tegninger illustrerer en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

Fig. 1 illustrerer fremstillingen av plasmid pMT344,

fig. 2 illustrerer fremstillingen av plasmid pMT475,

fig. 3 illustrerer fremstillingen av plasmid pMT212,

fig. 4 illustrerer fremstillingen av plasmid pMT479,

fig. 5 illustrerer fremstillingen av plasmid pMT319,

fig. 6 illustrerer fremstillingen av plasmid pMT59 8,

fig. 7 illustrerer fremstillingen av plasmid pMT610,

fig. 8 illustrerer fremstillingen av plasmid pT5, og fig. 9 illustrerer fremstillingen av plasmid pMT639.

På tegningene og del av den følgende beskrivelse brukes uttrykket B' istedenfor B(l-29) og A istedenfor A(l-21). Følgelig er uttrykket B'A likeverdig med uttrykket B(l-29)-A(l-21) .

1. Fremstilling av et gen som koder for human- proinsulin B- C- A

Totalt renset RNA (Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., McDonald, R.J. & Rutter, W.J., Biochemistry 18, (1979) 5294-5299) fra menneskebukspyttkjertler ble reverst transkribert (Boel, E., Vuust, J., Norris, F., Norris, K., Wind, A., Rehfeld, J.F. & Marcker, K.A., Proe.Nati.Acad.Sei. USA 80,

(1983), 2866-2869) med AMV revers transkriptase og d(GCTTTATTCCATCTCTC) som første kjede-primer. Etter preparativ urea-polyakrylamidgelrensning av human-proinsulin cDNA, ble den annen kjede syntetisert på denne mal med DNA-polymerase stort fragment og d(CAGATCACTGTCC) som andre kjede-primer. Etter Sl-nukleasebehandling ble human-proinsulinet d.v.s. cDNA renset med polyakrylamidgel-elektroforese, hengt på med terminal transferase og klonet i Pstl-punktet på pBR327 (Sorberon et al., Gene 9, (1980), 287-305) i E. coli. Et riktig klon som inneholdt et plasmid inneholdende et gen som koder for human-proinsulin B-C-A ble identifisert fra rekombi-nantene ved restriksjonsendonuklease-analyse og bekreftet ved nukleotid sekvensbestemmelse (Maxam, A., & Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65 (1980), 499-560. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R., Proe.Nati.Acad.Sei. USA 74, (1977), 5463-5467) .

2. Fremstilling av gener som koder for forstadier for human-insulin

Genet som koder for B(1-29)-A(1-21) av human-insulin ble fremstilt ved sete -spesifikk mutagenese av human-proinsulinsekvensen med en 75bp i rammedelesjon i C-peptid-kodeområdet innsatt i en sirkulær enkeltkjedet M-13 bakteriofag vektor.

En modifisert metode (K. Norris et al., Nucl.Acids.Res. 11

(1983) 5103-5112) ble brukt, hvori en kjemisk syntetisert 19-mer-delesjonprimer ble festet til M13-malen. Etter en kort enzymatisk ekstensjonsreaksjon ble en "universal" 15-mer M13 dideoksysekvensprimer tilsatt etterfulgt av enzymatisk eksten-sjon og ligering. Et dobbeltkjedet restriksjonsfragment (BamHl-Hind III) ble skåret ut av det delvis dobbeltkjedede sirkulære DNA og ligert i pBR322 skåret ved BamH. log Hind III.

Den oppnådde ligeringsblanding ble brukt til å trans-formere E.coli og transformanter inneholdende et plasmid pMT319 inneholdende genet som koder for B(1-29)-A(l-21) i human-insulin ble identifisert.

Gener som koder for B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) og B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21) ble følgelig fremstilt ved innsetning av et fragment som koder for MFal-B-C-A i en M-l3-bakteriofagen og gtste^-spesifikk mutagenese av human-proinsulinsekvensen med kjemisk syntetiserte 30-mer og 27-mer delesjonsprimere, resp., og den ovenfor nevnte "universal" 15-mer M13 dideoksysekvensprimer. Et dobbeltkjedet restriksjonsfragment (Xbal-EcoRl) ble skåret ut av det delvis dobbeltkjedede sirkulære DNA og ligert i henholdsvis pUC13 og pT5. Ved transformering og retransformering av E. coli identifisertes transformanter inneholdende et plasmid pMT598 inneholdende genet som koder for B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) og pMT6 30 inneholdende genet som koder for B (1-29)-Ser-Lys-A(1-21).

Et gen som koder for B (1-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(1-21) ble fremstilt på lignende måte som beskrevet ovenfor ved innsetning av et fragment som koder for MFal-B(1-29)-A(1-21) i en M13 mpll bakteriofag og punktspesifikk mutagenese av B(1-29)-A(1-21)-sekvensen med en kjemisk syntetisert 46-mer delesjonsprimer (5<1->CACACCCAAGACTAAAGAAGCTAAGACTT-GCAAAGAGGCATTGTG-3') og "universal" primeren. Ved en lignende fremgangsmåte ble også et gen som koder for B(1-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-A(1-21) konstruert.

3. Plasmidkonstruksjoner

Genet som koder for B(1-29)-A(1-21) i human-insulin

(B'A) ble isolert som et restriksjonsfragment fra pMT319 og kombinert med fragmenter som koder for TPI-promoteren (TPIp) (T. Alber og G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae. J.Moi. Applied Genet. 1 (1982) 419-434) , MFal-ledersekvensen (J. Kurjan og I. Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative a-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature a-Factor. Cell 30 (1982) 933-943) og transskrip-sjons-avslutningssekvensen fra TPI i S. cerevisiae (TPIT). Disse fragmenter gir sekvenser som sikrer en høy transskrip-sjonsgrad for det B'A-kodende gen og gir også en for-sekvens som kan bevirke lokaliseringen av B'A i sekresjonsbanen og dets eventuelle utskillelse i vekstmediet. Denne ekspresjonsenhet for B'A (TPIp-MFal-leder - B'A - TPIp) ble så plassert på en plasmidvektor inneholdende gjær 2y opprinnelse av replikasjon og en selekterbar markør LEU 2 som gir pMT344, en gjær-ekspresjonsvektor for B'A.

Under in vivo modning av a-faktor i gjær fjernes de siste (C-terminalene) seks aminosyrer fra MFal-lederpeptidet (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) fra a-faktor-forstadiet ved sekvensiell innvirkning av en endopeptidase som gjenkjenner Lys-Arg-sekvensen og en aminodipeptidase som fjerner Glu-Ala-restene (Julius, D. et al., Cell 32 (1983) 839-852). For å unngå behovet for gjæraminodipeptidase, ble sekvensen som koder for C-enden Glu-Ala-Glu-Ala av MFal-lederen fjernet ved in vitro mutagenese. Det resulterende gjærekspresjonsplasmid, pMT475, inneholder innsatsen som koder for TPIp-MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala) - B<1>A - TPIT.

I en foretrukket konstruksjon ble den modifiserte ekspresjonsenhet overført i et stabilt gjærplasmid CPOT,

(ATCC nr. 396 85) med høyt kopinummer, hvilket kan selekteres bare ved nærvær av cellulose i vekstmediet. Den resulterende gjær-ekspresjonsvektor for B'A ble gitt nummeret pMT479.

Fragmentet som koder for MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) ble isolert som et restriksjonsfragment fra pMT598 og kombinert med fragmenter som koder for TPI-promoteren og TPI-terminatoren og overført til ovennevnte gjærplasmid CPOT med høyt kopinummer. Den resulterende gjær-ekspresjonsvektor for B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) ble gitt nummeret pMT610.

Fragmentet inneholdende innsatt TPIp-MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21)-TPIT ble isolert som

et restriksjonsfragment fra pMT630 og overført til CPOT.

Den resulterende gjærekspresjonsvektor for B(1-29)-Ser-Lys-A(l-21) ble gitt nummeret pMT6 39.

Fragmentet inneholdende innsatsen TPIp-MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21)-TPIT ble innsatt i gjærplasmid DPOT med høyt kopinummer som er et CPOT-derivat inneholdende et Sphl-BamHI-fragment av pBR3 22 innsatt i et SpHI-BamHI-fragment av CPOT.

Den resulterende gjærekspresjonsvektor for B(1-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21) ble gitt nummeret pll26.

4. Transformasjon

Plasmider pMT344 og pMT475 ble transformert i S.

cerevisiae Leu 2 mutanter ved seleksjon for leucin prototrofi som beskrevet av Hinnen et al./ (A.Hinnen, J.B. Hicks og G.R. Fink. Transformation of Yeast. Proe.Nat.Aca.Sei. 75 (1978) 1929).

Plasmider pMT47 9, pMT610, pMT639 og pll26 ble transformert i S. cerevisiae-stammer med delesjoner i TPI-genet ved å selektere for vekst på glukose. Slike stammer er normalt ikke i stand til å vokse på glukose som eneste karbonkilde og vokser meget langsomt på galaktose-laktat-medium. Denne defekt skyldes en mutasjon i triosefosfat-isomerase-genet oppnådd ved delesjon og erstatning av en hoveddel av dette gen med S. cerevisiae Leu 2 genet. På grunn av vekst-manglene er det en sterk seleksjon for et plasmid som inneholder et gen kodende for TPI. pMT479 inneholder Schizo. pombe TPI-genet. 5. Ekspresjon av human- insulinforstadier i gjær Ekspresjonsprodukter av human-insulintypen ble målt ved radiologisk-immunologisk bestemmelse av insulin som beskrevet av L. Heding (Diabetologia 8, 260-66, 1972) med den eneste unntagelse at den aktuelle insulinforstadiumsstandard ble brukt istedenfor en insulinstandard. Standardenes renhet var ca. 9 8% målt med HPLC og den faktiske konsentrasjon av peptid i standarden ble målt ved aminosyreanalyse. Ekspresjonsnivåene for immunoreaktive human-insulinforstadier i de transformerte gjærstammer er sammensatt i tabell 1.

Tabell 1

Ekspresjonsnivåer for immunoreaktive human-insulinforstadier i gjær.

Isoleringen og karakteriseringen av ekspresjonsprodukter er beskrevet i eksemplene 7 - 9 og 12 - 13.

6. Overføring av human- insulinforstadium i B30- estere av human- insulin

Overføringen av human-insulinforstadiene i human-insulinestere kan følges kvantitativt ved HPLC (høytrykks-væskekroma-tografi) på revers fase. En 4 x 30 0 mm "yBondapak C18-kolonne" ble brukt, og elueringen utført med en puffer omfattende 0,2M ammoniumsulfat (justert til en pH-verdi på 3,5 med svovelsyre) og inneholdende 26-50% acetonitril.

Den optimale acetonitrilkonsentrasjon avhenger av hvilken ester man ønsker å skille fra insulinforstadiet. I tilfelle av human-insulinmetylester oppnås separasjon i ca. 26% acetonitril.

Før bruk av HPLC-kolonnen utfelles proteinene i reaksjons-blandingen ved tilsetning av 10 volumdeler aceton. Det utfelte materiale ble isolert ved sentrifugering, tørket i vakuum og oppløst i IM eddiksyre.

Eksempel 1

Konstruksjon av et gen som koder for B( 1- 29)- A( 1- 21) insulin Materialer og fremgangsmåter

"Universal" 15-mer M13 dideoksy-sekvenserende primer d(TCCCAGTCACGACGT), T4 DNA ligase og restriksjonsenzymer,

DNA polymerase I "Klenow-fragment" og T4 polynukleotidkinase, ("Y-<32>P)-ATP (75oo ci/mmol) . Bæreren for oligonukleotidsyntese var 5' -0-dietoksytrityl-N2-isobutyryldeoksyguanosin bundet gjennom en 3'-O-suksinylgruppe til aminometylert 1% kryss-bundne polystyrenkuler.

Konstruksjon av M13 mplO insHXAPst- fag:

M13 mplO avledet fag mplO insHX ble konstruert ved å

klone det 284 bp store proinsulin som koder for Hind III-XbaI-fragment isolert fra p285 i Hind III-XbaI skåret M13 mplO RF.

M13 mplO insHXAPst ble konstruert fra mplO insHX,RF ved fullstendig Pstl-nedbrytning etterfulgt av ligering og transformasjon av E. coli JM103. Den resulterende fag rommer de human-proinsulin-kodende sekvenser med en 75 bp i rammedelesjon i det C-peptid-kodende område. Enkeltkjedet fag ble fremstilt som beskrevet (Messing, J. og Vieira, J. (1982)

Gene 19, 269-276).

Oligodeoksyribonukleotid syntese

19-mer delesjonsprimeren d(CACACCCAAGGGCATTGTG) ble syntetisert ved triestermetoden på en 1% tverrbundet polystyren-bærer (Ito, H., Ike, Y., Ikuta, S., og Itakura, K. (1982) Nucl.Acids.Res. 10, 1755-1769). Polymeren ble pakket i en kort kolonne og løsningsmidler og reagenser ble avgitt halv-automatisk ved hjelp av en HPLC-pumpe og en kontroll-modulus. Oligonukleotidet ble renset etter fjerning av beskyttelsesgrupper med HPLC på en LiChrosorb RPl8-kolonne (Chrompack (Fritz, H.-J., Belagaje, R., Brown, E.L. Fritz, R.H., Jones, R.A., Lees, R.G. og Khorana, H.G. (1978) Biochemistry 17, 1257-1267).

32

5'- P<-> merking av oligodeoksyribonukleotid

19-meren ble merket på 5'-enden i en 60 yl reaksjons-blanding inneholdende 50 mM tris-HCl med pH 9,5, 10 mM MgCl2,

5 mM DTT, 0,4% glycerol, 120 pmol ATP, 50 yCi (y-<32>P)-ATP

(10 pmol), 120 pmol oligonukleotid og 30 enheter T4 poly-nukleotid-kinase. Reaksjonen ble utført ved 37°C i 30 min.

og avsluttet ved oppvarmning ved 100°C i 3 minutter. Det merkede oligonukleotid ble skilt fra ikke-omsatt { y- 32P)-ATP ved kromatografi på en kolonne (1x8 cm) av Sephadex G50 superfin i 0,0 5 M trietylammoniumbikarbonat med pH 7,5.

For kolonihybridisering ble oligonukleotidet merket uten tilsetning av "kald" ATP som beskrevet av (Boel, E., Vuust, J., Norris, F., Norris, K., Wind, A., Rehfeld, J. og Marcker, K.

(1983) Proe.Nati.Acad.Sei. USA 80, 2866-2869).

Oligodeoksyribonukleotid- primet DNA- syntese

Enkeltkjedet M13 mplO insHXAPst (0,4 pmol) ble inkubert med 19-meren 5'-( 32P)-merket oligodeoksyribonukleotidprimer (10 pmol) i 20 yl 50 mM NaCl, 20 mM tris-HCl med pH 7,5,

10 mM MgCl2 og 1 mM DDT i 5 minutter ved 55°C og tilknyttet i

30 minutter ved 11°C. Så ble 9 yl d-NTP-blanding bestående av 2,2 mil av hver dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DDT tilsatt etterfulgt av 7 enheter E.coli DNA polymerase I (Klenow). Blandingen ble holdt i 30 minutter ved 11°C og oppvarmet 10 minutter ved 65°C.

15-mer universal-primeren for dideoksysekvensering (4 pmol)

ble tilsatt og blandingen oppvarmet ved 65°C ytterligere 1 min-utt. Etter avkjøling til 11°C ble 26 yl løsning inneholdende 20 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl-, 10 mM DTT, 0,8 mM hver av dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2,4 mM ATP og 10 enheter T4-ligase tilsatt etterfulgt av 9,5 enheter E. coli DNA polymerase I (Klenow). Blandingens sluttvolum var 6 4 yl. Etter inkubering i 3 timer ved 11°C ble 20 yl 4M natriumacetat tilsatt, og volumet justert til 200 yl med TE-puffer (10 mM tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA).

Blandingen ble ekstrahert to ganger med fenol/kloroform. 0,9 yg (0,3 pmol) av det rensede store fragment av pBR322 spaltet med BamHI og Hind III ble £ilsatt som bærer DNA. Etter eterekstraksjon av den vandige fase, ble DNAet isolert ved etanolutfelling.

Endonukleasespalting

DNAet fremstilt som beskrevet ovenfor, ble spaltet henholdsvis med 16 og 20 enheter av restriksjons-endonukleasene BamHI og Hind III i et totalvolum på 22 ul puffer (50 mil NaCl, 10 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DDT, 4 mM spermidin). Blandingen ble ekstrahert med fenol/kloroform etterfulgt av eter, og DNAet ble isolert ved etanolutfelling og deretter oppløst i 12 yl H20. 2 yl ble brukt til elektroforese på en 7M urea 6% polyakrylamidgel.

Ligering

Til en del av DNAet (5 yl) ble tilsatt en ny porsjon av det rensede store fragment av pBR3 22 skåret med BamHI og Hind III (0,38 yg) og 400 enheter T4 DNA-ligase, i et totalvolum på 41 yl inneholdende 66 mM tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DDT, 40 yg/ml gelatin. Ligering ble utført ved

16°C i 16 timer.

Transformasjon

20,5 yl av ligeringsblandingen ble brukt til å trans-formere CaCl2~behandlede' E. coli MC 1000 (r , m+) . Bakteriene ble plattert på LB-agar-plater og selektert for resistens overfor ampicillin (100 yg/ml). 2,6 x 10 3 kolonier pr. pmol M13 mplO insHXAPst ble oppnådd.

Kolonihybridisering

123 transformerte kolonier ble tatt opp på ferske ampi-cillinplater og dyrket natten over ved 37°C. Kolonier ble overført til Whatman 540 filterpapir og fiksert (Gergen, J.P., Stem, R.H. og Wensink, P.C. (1979), Nucl.Acids Res. 7, 2115-2136). En forhybridisering ble utført i en lukket plastpose med 6 ml 0,9 M NaCl, 0,09 M tris-HCl, pH 7,5, 0,006 M EDTA, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% kalveserum-albumin, 0,1% SDS og 50 yg/ml laksesperm DNA i 2 timer ved 65°C.

6 32

Så ble 8,5 x 10 cpm P-merket 19-mer tilsatt og hybridisering ble utført ved 45°C natten over. Filteret ble vasket med 0,9M NaCl, 0,0 9 M natriumcitrat tre ganger ved 0°C i 5 min., og deretter autoradiografert og vasket én gang ved 45°C i 1 min. og autoradiografert igjen. Etter vask ved 45°C, var det mulig å identifisere 3 kolonier som inneholdt mutert plasmid.

Endonukleaseanalyse av muterte plasmider

Plasmider fra antatte mutantkolonier ble fremstilt ved

en hurtigmetode (Ish-Horowicz, D.og Burke, J.F. (1981), Nucl.Acids Res. 9, 2989-2998), spaltet med en blanding av

BamHI og Hind III og så analysert ved elektroforese på en 2% agarosegel. Nærværet av et 179 bp fragment bekreftet at de 3 kolonier inneholdt mutant plasmid.

Retrans formasjon

Koloniene som ble identifiserte som "mutant" inneholder plasmider som er avkommet av en heteroduplex. Ren mutant kunne oppnås ved retransformasjon av CaCl9-behandlede E.coli MC1000 (r , m ) med plasmid fra 2 av mutantkoloniene. Fra hver plate ble 5 ampicillin-resistente kloner isolert, plasmid DNA fremstilt og analysert ved endonukleasespalting som nevnt ovenfor. 3 av 5 og henholdsvis 5 av 5 ble vist å være ren mutant. Ett plasmid pMT319 ble utvalgt for videre bruk.

DNA- s ek ven s an aly s e

5 yg pMT319 ble spaltet med BamHI under standard-betingelser, .fenol-ekstrahert og etanolutfelt. Oppfylling av de BamHI-overhengende ender ble foretatt med Klenow DNA-polymerase I, dCTP, dGTP, dTTP og a-<32>P-dATP.

Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling ble DNAet spaltet med EcoRI. Det <32->P-merkede fragment ved delesjonen ble renset ved elektroforese på en 2% agarosegel og sekvensert ved Maxam-Gilbert-metoden (Maxam, A. og Gilbert, W. (1980) Methods in Enzymology 65, 499-560).

Eksempel 2

Konstruksjon av et gjærplasmid pMT344 for ekspresjon av B( 1-29)- A( l- 21) av human- insulin ( B' A).

Plasmid pMT319 inneholdende genet som koder for B'A og

er konstruert som forklart ovenfor ble kappet med restriksjonsenzymer Hind III og Xbal og et 0,18 kb fragment ble isolert

(T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press 1982) fra en 2% agarosegel. På lignende måte et fragment (6,5 kb Xhol - Hind III) inneholdende S. cerevisiae TPI promotor (TPIp) (T. alber og G. Kawasaki.

Nukleotidsekvensen til triosefosfat-isomerasegenet fra Saccharomyces cerevisiae, J.Moi. Applied Genet. 1 (1982) 419-434) og MFal-ledersekvensen (J. Kurjan og I. Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative a-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature a-Factor.

Cell 30 (1982) 933-943) ble isolert fra plasmid p285

konstruert som beskrevet i US-patentsøknad 547.748 av 1. nov.

19 83. P2 85 inneholder innsatsen TPIp-MFal-leder -B-C-A- TPIT og deponert i gjærstamme Z33 (ATCC nr. 20681). Et fragment

(0,7 kb Xbal - BamHI) inneholdende TPI-transkripsjonen av slutningssekvenser (TPIT) (T. Alber og G. Kawasaki, Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae J.Moi. Applied Genet. 1 (1982) 419-434) ble også isolert fra p285. Til slutt ble et 5,4 kb Xhol - BamHI-fragment isolert fra gjærvektoren YEpl3 (J.R. Broach. Construction of High Cony Yeast Vectors Using 2ytm Circle Sequences. Methods Enzymology 101 (1983) 307-325). De ovennevnte fire fragmenter ble ligert (T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press 1982) og transformert i E. coli (T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press 19 82) under seleksjon for ampicillin-resistens. Plasmider ble isolert fra transformantene og strukturen til én av disse, pMT344, bekreftet ved restriksjonskartlegging. Konstruksjonen og hovedtrekkene til pMT344 er vist i fig. 1.

Eksempel 3

Konstruksjon av et gjærplasmid pMT475 for ekspresjon av B( l-29)- A( l- 21) fra human- insulin ( B' A) etter en modifisert MFal- leder

For å konstruere et plasmid for ekspresjon av B'A etter en MFal-leder (J. Kurjan og I Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromon-j Gene (MFa) : A Putative a-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature a-Factor. Cell 30 (1982) 933-943) som manglet sine siste fire aminosyrer (Glu-Ala-Glu-Ala),

ble 0,14 kb Xbal - EcoRII-fragmentet inneholdende A og en del av B<1->sekvensene isolert fra pMT319. Likeledes ble 5'-delen av B'-genet isolert som et 0,36 kb EcoRI - EcoRII-fragment fra pM215. Plasmid pM215 ble konstruert ved å subklone EcoRI - Xbal-fragmentet inneholdende proinsulin B-C-A-genet fra p285

i pUC13 (konstruert som beskrevet for pUC8 og pUC9 av Vieira et al., Gene 19: 259-268 (1982) og deretter in vitro sløyfe-danningsfjerning av de 12 baser som koder for Glu-Ala-Glu-Ala ved skjøten mellom MFal-leder og proinsulin B-C-A-gen. Disse to stykker som dekker B'A-genet ble ligert til EcoRI - Xbal-spaltet pUC13 vektor (se fig. 2) og gav pMT473. Det modifiserte genet i et 0,5 kb EcoRI - Xbal-fragment ble isolert fra pMT473 og så ligert til to fragmenter (4,3 kb Xbal - EcoRV og 3,3 kb EcoRV - EcoRI) fra pMT342. pMT342 er gjærvektoren pMT212 med en innsatt TPIp-MFal-leder - B-C-A-TPIT. Det resulterende plasmid, pMT47 5, inneholder innsatsen: TPIp - MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala) - B'A - TPIT. Konstruksjonen av plasmidene pMT342, pMT473 og pMT475 er vist i fig. 2. Konstruksjonen av vektoren pMT212 er vist i fig. 3. Plasmid pMLBl034

er beskrevet av M.L. Berman et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor (19 82), 49-51 og pUCl2 ble konstruert som beskrevet for pUC13 (Vieira et al., ibid.).

Eksempel 4

Innsetning av B( 1- 29)- A( 1- 21) ( B' A)- genet i et stabilt gjærplasmid pMT479

Det modifiserte B'A-gen fra pMT475 ble isolert som et

2,1 kb BamHI - delvis Sphl-fragment og ligert til et omtrentlig 11 kb BamHI - Sphl-fragment av plasmid CPOT (ATCC nr. 396 85)

og ga plasmid pMT479 (fig. 4). Plasmid CPOT er basert på vektoren Cl/l som er modifisert ved å substituere det opp-rinnelige pBR3 22 Bgll - BamHI-fragment med det lignende Bgll - BamHI-fragment fra pUC13 og deretter innsetning av S.pombe TPI-genet (POT) (US-patentsøknad nr. 614.734 av 25. mai 1984) som et BamHI - Sall-fragment for å gi CPOT. Cl/l stammer fra pJDB 248, Beggs et al., Nature 275, 104-109 (1978) som beskrevet i europeisk patentsøknad 0103409A.

Eksempel 5

Transformasjon

S. cerevisiae stamme MT118 (a, leu 2, ura 3, trp 1) ble dyrket på YPD-medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) til en OD6Q0 på 2,1.

100 ml av kulturen ble høstet ved sentrifugering, vasket med

10 ml vann, resentrifugert og resuspendert i 10 ml (1,2 M sorbitol, 25 mfl Na^EDTA pH= 8,0, 6,7 mg/ml ditiotreitol) . Sus<p>ensjonen ble inkubert ved 30°C i 15 minutter, sentrifugert

og cellene resuspendert i 10 ml (1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 m natriumcitrat pH = 5,8, 2mg "Novozym" 234 enzym). Suspensjonen ble inkubert ved 30°C i 30 minutter, cellene

samlet opp ved sentrifugering, vasket i 10 ml 1,2 M sorbitol og 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM tris (tris = tris(hydroksymetyl)-aminometan) pH = 7,5) og resuspendert i 2 ml CAS. For transformasjon ble 0,1 ml CAS-resuspenderte celler blandet med ca. 1 yg plasmid pMT344 og fikk stå ved romtemperatur i 15 minutter. 1 ml (20% polyetylenglykol 4000,

10 mM CaCl2, 10 mM tris pH = 7,5) ble tilsatt og blandingen fikk stå ytterligere 30 minutter ved romtemperatur. Blandingen ble sentrifugert og klumpen resuspendert i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaCl2, 14 yg/ml leucin) og inkubert ved 30°C i 2 timer. Suspensjonen ble så sentrifugert og klumpen resuspendert i 0,5 ml 1,2 M sorbitol. 6 ml topp-

agar (SC-mediet fra Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1981) uten leucin og inneholdende

1,2 M sorbitol pluss 2,5% agar) ved 52°C ble tilsatt og suspensjonen hellet på toppen av plater inneholdende det samme agar-stivnede, sorbitolholdige medium. Transformantkolonier ble tatt opp etter 3 dager ved 30°C, reisolert og brukt til å

starte væskekulturer. Én slik transformant MT350 (=MT 118/pMT344) ble valgt til ytterligere karakterisering.

Plasmid pMT475 ble transformert i S. cerevisiae stamme

MT 362 (a,leu2) ved samme fremgangsmåte som ovenfor, og trans-formanten MT371 (=MT362/pMT475) ble isolert.

Transformasjon av pMT479 i stamme E2-7B X E11-3C (a/a,Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3; denne stamme vil refereres til som MT501) ble utført som ovenfor med de følgende modi-fikasjoner: 1) før transformasjon ble stamme MT501 dyrket på YPGal (1% Bacto gjærekstrakt, 2% Bacto pepton, 2% galaktose,

1% laktat) til en ODg00 på 0,6. 2) SOS-løsningen inneholdt YPGal istedenfor YPD. En transformant MT519 (=MT501/pMT479)

ble utvalgt for videre karakterisering.

De transformerte mikroorganismer MT 350, MT371 og MT 519 ble deponert av søkeren hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Gøttingen,

15. mai 1984 og tiljent henvisningstallene DSM 2957, DSM 2958

og DSM 2 9 59 , resp.

Eksempel 6

Ekspresjon av B ( 1- 29)- A( 1- 21) insulin i gjær

Stammene MT350 (DSM 2957) og MT371 (DSM 2958) ble dyrket

i syntetisk fullstendig medium SC (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981) uten

leucin. For hver stamme ble to 1 liters kulturer i 2 liters kolber med tverrplater rystet ved 30°C inntil de nådde ODgQ0n<m>

på 7 til 10. De ble så sentrifugert og supernatanten fjernet for videre analyse.

Stamme MT519 (DSM 2959) ble dyrket på lignende måte, men

på YPD-medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) og til en ODgoOnm p^ 15' sentrifugert og supernatanten skilt fra for analyse som ovenfor.

Eksempel 7

Ekspresjon av B( 1- 29)- A ( 1- 21) insulin i gjærstamme MT350

( DSM 2 9 57)

Gjærstamme MT350 (DSM 2957) ble dyrket som forut beskrevet

i eks. 6 og ekspresjonsprodukter fra 1100 ml supernatant fra denne stamme ble isolert som følger:

10 g LiChroprep^ RP-18 ble vasket

tre ganger med 50 mM NH4HC03, 60% EtOH og deretter pakket i en

6 x 1 cm kolonne. Kolonnen ble likevektsinnstilt med 50 ml

50 mM NH4HC03. 55 ml 96% EtOH ble satt til 1100 ml av gjær-supernatanten, og blandingen ble satt på kolonnen natten over (strøm: 70 ml/time).

Kolonnen ble vasket med 10 ml 0,5 M NaCl og 10 ml H20,

og peptidene ble eluert med 50 mM NH4HC03, 60% EtOH. Eluatet (5 ml) ble konsentrert ved vakuum-sentrifugering til 1,4 ml (for å fjerne etanolen), og volumet ble justert til 10 ml med 25 mM HEPES-puffer pH = 7,4. Prøven ble satt på en anti-insulin-immunoabsorpsjonskolonne (AIS-kolonne) (2,5 x 4,5 cm)

som var vasket 4 ganger med 5 ml NaFAM-puffer (Heding, L., Diabetologia 8, 260-66, 1972) og to ganger med 5 ml 25 mM HEPES-puffer før påsettingen. Etter påsettingen fikk kolonnen stå i 30 minutter ved romtemperatur og ble deretter vasket 10 ganger

med 4 ml 2 5 mM HEPES-puffer. Peptidene ble eluert med 20% HAc. pH-verdien til eluatet ble justert til 7,0 med NH^OH, og samlingen ble konsentrert til 500 yl ved vakuumrotasjon.

Prøven fra det foregående trinn ble videre renset på HPLC på en 10y Waters yBondopak C-18-kolonne (3,9 x 300 mm).

A og B pufferne var 0,1% TFA i H20 og 0,07% TFA i MeCN, resp. Kolonnen ble ekvilibrert med 25% B (strøm: 1,5 ml/min.) og peptidene ble eluert med en lineær gradient av MeCN (1%/min.) og påvist ved 276 nm. Utbytte i hvert rensetrinn ble målt radioimmunologisk som tidligere beskrevet, og tabell 2 sammen-fatter rensingen. Det totale utbytte var 68%.

Bare én topp inneholdende immunoreaktivt B(1-29)-A(1-21) insulinmateriale ble påvist fra HPLC-kolonnen. Peptidmateriale fra denne topp ble isolert og underkastet aminosyresekvens-analyse. Sekvensanalysen ble utført med en Gas Phase-sekvenser som beskrevet av Hewick, R.M. et al., (J.Biol.Chem. 256, 7990-7997, 1981). Fra sekvensresultåtene kunne det konkluderes at ekspresjonsproduktene bestod av 3 peptider:

bestod av 3 peptider:

Peptidene forelå i de angitte relative mengder.

Eksempel 8

Ekspresjon av B( 1- 29)- A( 1- 21) insulin i gjærstamme MT371

( DSM 2958)

Gjærstamme MT371 (DSM 2958) ble dyrket som forut beskrevet i eks. 6 og ekspresjonsprodukter fra 665 ml supernatant fra denne stamme ble isolert som beskrevet i eks. 7. Totalutbyttet var 50 nmol, tilsvarende 39%. Peptidmaterialet ble isolert fra HPLC-kolonnen og sekvensert som beskrevet i eks. 7. Fra sekvensresultatene (18 rester fra N-terminalen) kunne man slutte at peptidet var homogent B(1-29)-A(l-21)-insulin. Sammen-ligning av disse resultater med resultatene fra eks. 7 viser at Glu-Ala-Glu-Ala-sekvensen bør fjernes fra MFal-lederen Man ser fra eks. 7 at gjær-dipeptidaseenzymet ikke fungerer særlig effektivt ved avspaltning av Glu-Ala og Glu-Ala-Glu-Ala fra B(1-29)-A(l-21)-insulinet før sekresjon av insulinforstadiet fra gjærcellene.

Eksempel 9

Ekspresjon av B( 1- 29)- A( 1- 21) insulin i gjærstamme MT519

( DSM 2959)

Gjærstamme MT519 (DSM 2959) ble dyrket som forut beskrevet i eks. 6 og ekspresjonsprodukter fra 70 ml supernatant ble isolert som beskrevet i eks. 7. Totalutbyttet var 116 nmol, tilsvarende 57%. Peptidet ble sekvensert som beskrevet i eks. 7. Bedømt fra de 42 rester identifisert fra den N-terminale ende var peptidet homogent B(1-29)-A(l-21)-insulin. Ca. 5 nmol peptid ble hydrolysert i 100 ul 6N HC1 i 24 timer ved 110°C. Hydrolysatet ble analysert på en Beckman Model 121M aminosyre-analysator. Den følgende aminosyresammensetning ble funnet:

Eksempel 10

Konstruksjon av et gjærplasmid pMT610 for ekspresjon av B( 1- 29)- Ala- Ala- Lys- A( 1- 21)

Et 4,3 kb EcoHV-Xbal og et kb EcoRI-EcoRV-fragment fra PMT342 (se eks. 3) ble ligert til et 0,6 kb EcoRI-Xbal-fragment fra pM215 (se eks. 3). Det erholdte plasmid pMT462 rommer innsatsen MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A). For overføring av det B-C-A-kodende fragment i et B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A (1-21) -kodende fragment ble det brukt den modifiserte punktspesifikke mutagenesemetode (K. Norris et al., ibid).

Et 0,6 kb EcoRI-Xbal-fragment fra pMT462 som koder for MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A) ble innsatt i M13 mplO RF-fag kappet med Xbal-EcoRI. Enkeltkjedet M13-fag inneholdende ovennevnte EcoRI-Xbal innsats ble inkubert med en 30-mer d(TTCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGGGTGTG)-primer (KFN15) og den "universelle" 15-mer Ml3 primer d(TCCCAGTCACGACGT) (se eks. 1), oppvarmet til 90°C i 5 minutter og langsomt avkjølt til romtemperatur for å muliggjøre feste. Det delvis dobbeltkjedede DNA ble fremstilt ved tilsetning av en d-NTP-blanding, Klenow Polymerase og T4-ligase. Etter fenol-ekstraksjon, etanol-presipitering og resuspensjon, ble DNAet kappet med restriksjonsenzymer Apal, Xbal og EcoRI. Etter ytterligere fenol-ekstraks jon, etanolutfelling og resuspensjon, ble DNA ligert til EcoRI-Xbal kappet pUC13. Ligeringsblandingen ble transformert i en E. coli (r m+)-stamme og plasmider fremstilt fra flere transformanter. Plasmidpreparater ble kappet med EcoRI og Xbal og de fremstillinger som viser bånd ved både 0,5 og 0,6 kb ble retransformert i E. coli. Fra retransformasjonen ble en transformant som bare rommet pUC13 med en 0,5 kb innsats utvalgt. Sekvensen av EcoRl-Xbal-innsatsen til dette plasmid, pMT59 8, ble så bekreftet ved Maxam-Gilbert-metoden å kode for MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21). Xbal-EcoRI-innsatsen fra pMT59 8 ble frembragt med TPI promoter og TPI terminator ved ligering av et 0,5 kb Xbal-EcoRI-fragment fra pMT59 8 med et 5,5 kb Xbal-EcoRI-fragment fra pT5. Konstruksjonen av pT5 som rommer innsatsen TPIo-MFal-leder-B-C-A-TPIT er illustrert i fig. 8. Det resulterende plasmid pMT 601

som inneholder innsatsen TPI P-MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala) -B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21) -TPI ble kappet med BamlU ojg delvis med Sphl og 2,1 kb fragmentet ble satt inn i CPOT kuttet med BamHI og Sphl. Det resulterende plasmid pMT610 ble brukt for transformasjon av gjær.

Eksempel 11

Konstruksjon av et gjærplasmid pMT639 for ekspresjon av B( 1- 29)- Ser- Lys- A( l- 21)

BCA-kodende fragment fra pMT462 (se eks. 10) ble overført i B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) analogt med fremgangsmåten som er beskrevet i eks. 10 med punktspesifikk mutagenese med en blanding av en 27-mer d(TCCACAATGCCCTTAGACTTGGGTGTG)primer KFN36 og den "universelle" 15-mer M13 primer. Etter innfylling med Klenow polymerase og ligering med T4-ligase ble det delvis dobbeltkjedede DNA spaltet med Apal, EcoRI og Xbal og ligert med 5,5 kb Xbal - EcoRI-fragmentet fra plasmid pT5 (se eks. 10). Etter transformering og retransformering i E.coli, isolerte man et plasmid pMT630 inneholdende innsatsen MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala) -B(1-29)-Ser-Lys-A(l-21), og innsatsens sekvens ble bekreftet. Den videre metode for fremstilling av plasmid pMT6 39 som inneholdt innsatsen TPI^-MFal (minus Glu-Ala-Glu-Ala) -B(1-29)-Ser-Lys-A(l-21)-TPI var som beskrevet i eks. 10. Konstruksjonen av pMT639 er illustrert i fig. 9.

Eksempel 12

Ekspresjon av B( 1- 29)- Ala- Ala- Lys- A( 1- 21) i gjærstamme MT 620

S. cerevisiae stamme MT501 (se eks. 5) ble transformert med pMT 610 som beskrevet for pMT479 i eks. 5. Transformantkolonier ble plukket ut etter 3 dager ved 30°C, reisolert og brukt til å starte væskekulturer. En slik transformant MT 620 = (MT501/pMT610) ble valgt for videre karakterisering. MT620 ble deponert av søkeren hos Deutsche Sammlung von Miroorganismen (DSM), 16. januar 1985 og tilkjent henvisnings-tallet DSM 3196.

MT 620 ble dyrket på YPD-medium. En 2 liters kultur i

2 liters kolbe ble rystet ved 30°C til en O<D>600nm på 15 *

Etter sentrifugering ble supernatanten fjernet for ytterligere analyse. Ekspresjonsnivået som var bestemt ved radioimmunologisk måling var 1,2 ymol/liter. Ekspresjonsprodukter fra 840 ml supernatant ble renset som beskrevet i eks. 7.

(RP-18-kolonne, anti-insulin Sepharose og HPLC). Totalutbyttet var 100 nm tilsvarende ca. 10%. Peptidmateriale ble isolert fra HPLC-kolonnen og sekvensert som beskrevet i eks. 7.

35 Edman nedbrytningsrunder ble utført (tabell 4). Fra sekvensresultatene ble stillingen til de 3 aminosyrerest-kjeder (Ala-Ala-Lys) som skiller B(l-29) og A(1-21)-kjedene bekreftet (se tabell 4) .

Det gjennomsnittlige repititive utbytte var 95,6%.

Eksempel 13

Ekspresjon av B( 1- 29)- Ser- Lys- A( 1- 21) i gjærstamme MT643

S. cerevisiae stamme MT501 ble transformert med pMT639 som beskrevet for pMT479 i eks. 5.

Én transformant MT643 = (MT501/pMT639) ble utvalgt for ytterligere karakterisering. MT643 ble deponert av søkeren hos DSM 16. januar 1985 og tilkjent henvisningsnummeret DSM 3197.

MT6 4 3 ble dyrket som beskrevet i eks. 12. Etter sentrifugering ble supernatanten fjernet for ytterligere analyse.

Ekspresjonsnivået for insulinforstadiet bestemt ved radioimmunologisk måling var 1,6 ymol/1. Ekspresjonsprodukter fra supernatanten fra MT643 ble isolert som beskrevet i eks. 7. Det isolerte peptidmateriale fra HPLC-kolonnen ble underkastet sekvensanalyse som beskrevet i eks. 7. Fra sekvensresultatene (ikke vist) ble stillingen til de to aminosyrerester (Ser-Lys) som skiller B(l-29) og A(1-21)-kjedene bekreftet.

Eksempel 14

Overføring av B ( 1- 29) - A ( 1- 21) til Thr ( Bufc)- OBu11 ( B30) human-insulin 20 mg B (1-29)-A (1-21) ble oppløst i 0,1 ml 10M eddiksyre. 0,26 ml 1,54 M Thr(But)- OBu1 i N/N-dimetylacetamid ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt til 12°C. 2,8 mg trypsin oppløst i 0,035 ml 0,05 M kalsiumacetat ble tilsatt. Etter 72 timer ved 12°C, ble proteiner utfelt ved tilsetning av 4 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørket i vakuum. Overføringen av B (1-29)-A(1-21) til Thr(Bu<t>)-Obu<t>(B30) human-insulin var 64% ved HPLC.

Eksempel 15

Overføring av B( 1- 29)- A( 1- 21) til Thr- OMe( B30) human- insulin

20 mg B(1-29)-A(1-21) ble oppløst i 0,1 ml 10 M eddiksyre. 0,26 ml 1,54 II Thr-OMe i en blanding av dimetylsulfoksyd og butan-1,4-diol 1/1 (v/v) bie tilsatt. 1 mg lysyl-endopeptidase fra Achromobacter lyticus (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) i 0,07 ml vann ble tilsatt. Etter 120 timer

ved 2 5°C ble proteinene utfelt ved tilsetning av 4 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørket i vakuum. Overføringen av B(1-29)-A(1-21) til Thr-OMe(B30) human-insulin var 75%

ved HPLC.

Eksempel 16

Overføring av B ( 1- 29)- Ser- Lys- A( 1- 21) til Thr- QBut( B30) human-insulin

20 mg B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) ble oppløst i 0,1 ml av

en blanding av 34,3% eddiksyre (v/v) og 42,2% N,N-dimetyl-formamid (v/v) i vann. 0,2 ml 2 M Thr-OBu<t> som hydroacetatsalt

i N,N-dimetylformamid ble tilsatt. Blandingen ble termoståtert ved 12°C. 2 mg trypsin i 0,05 ml 0,05 M kalsiumacetat ble tilsatt. Etter 24 timer ved 12°C ble proteinene utfelt ved tilsetning av 4 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørket i vakuum. Overføringen av B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) til Thr-OBu<t>(B30) human-insulin var 85% ved HPLC.

Eksempel 17

Overføring av B ( 1- 29)- Ala- Ala- Lys- A( 1- 21) til Thr- OBu* 1 ( B30) human- insulin

20 mg B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) ble oppløst i 0,1 ml

av en blanding av 34,3% eddiksyre (v/v) og 42,2% N,N-dimetyl-formamid (v/v) i vann. 0,2 ml 2 M Thr-OBu<t> som hydroacetatsalt i N'N-dimetylformamid ble tilsatt. Blandingen ble termo-statert ved 12°C. 2 mg trypsin i 0,05 ml 0,05 M kalsiumacetat ble tilsatt. Etter 96 timer ved 12°C ble proteinene utfelt ved tilsetning av 4 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørket i vakuum.Overføringen av B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)

til Thr-OBu11 (B3/) human-insulin var 84% ved HPLC.

Eksempel 18

Fremstilling av human- insulin fra forskjellige human- insulinestere

Human-insulinesterene i de rå acetonutfellinger ble renset ved gelfiltrering og anionebytter-kromatografi som beskrevet i Methods in Diabetes Research vol. 1, s. 407-408 (Utg. J.Larner & S. Pohl (John Wiley Sons, New York, 1984)). Fremgangsmåten var anvendelig på alle de 3 human-insulinestere. Spaltningene av de forskjellige estergruppene som ga human-insulin i nesten 100% utbytter, ble utført ved hydrolyse av Thr-OMe(B30) human-insulin og acidolyse med trifluoreddiksyre av Thr ( Bu~) -OBu1" (B30) human-insulin og av Thr-OBu<t>(B30) human-insulin som beskrevet samme sted side 409.

Claims

1. DNA-sekvens for bruk i en gjærvektor, karakterisert ved at den består av en nukleotidkombinasjon, som koder for en insulinforløper med formelen hvor Xn er en peptidkjede med n naturlig forekommende aminosyre-rester, Y er Lys eller Arg, n er et helt tall fra 0 til 33, m er 0 eller 1, B(l-29) er en forkortet B-kjede av human-insulin fra Phe<B1> til Lys <B29> og A (1-21) er A-kjeden av humaninsulin, idet peptidkjeden - X^- Y- dog ikke kan inneholde to nabostående basiske aminosyrerester.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den består av en nukleotidkombinasjon som koder for en insulinforløper med formelen

3. Vektor som er replikerbar i gjær, karakterisert ved at den inneholder og kan uttrykke i gjær, en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av en insulinforløper med formelen hvor Xn er en peptidkjede med n naturlig forekommende aminosyrerester, Y er Lys eller Arg, n er et helt tall fra 0 til 33, m er 0 eller 1, B(l-29) er en forkortet B-kjede av human-insulin fra Phe<B1> til Lys B2<9> og A(1-21) er A-kjeden av human- insulin, med det forbehold at peptidkjeden -Xj,-Y- ikke inneholder to nabostående basiske aminosyrerester, karakterisert ved at en gjærstamme som inneholder en DNA-sekvens som koder for insulinforløperen dyrkes i et egnet næringsmedium, hvoretter insulinforløperen utvinnes på i og for seg kjent måte.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4 ved fremstilling av en insulinforløper med formelen B(l-29)-A(l-21), karakterisert ved at det som gjærstamme anvendes DSM 2959.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 ved fremstilling av en insulinforløper med formelen B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), karakterisert ved at det som gjærstamme anvendes DSM 3196.

7. Fremgangsmåte ved fremstilling av human insulin, karakterisert ved at en gjærstamme som inneholder en DNA-sekvens som koder for en insulinforløper med formelen hvor Xn er en peptidkjede med n naturlig forekommende aminosyre-rester, Y er Lys eller Arg, n er et helt tall fra 0 til 33, m er 0 eller 1, B(l-29) er en forkortet B-kjede av human-insulin fra Phe<B1> til Lys <B29> og A(1-21) er A-kjeden av human-insulin, idet peptidkjeden -X„-Y- dog ikke kan inneholde to nabostående basiske aminosyrerester, dyrkes i et egnet næringsmedium, hvorpå den uttrykte insulinforløper utvinnes fra kulturvæsken og omdannes til humaninsulin på i og for seg kjent måte.