JPH06141865A - インシュリン前駆体の製造方法 - Google Patents

インシュリン前駆体の製造方法

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JPH06141865A
JPH06141865A JP5121694A JP12169493A JPH06141865A JP H06141865 A JPH06141865 A JP H06141865A JP 5121694 A JP5121694 A JP 5121694A JP 12169493 A JP12169493 A JP 12169493A JP H06141865 A JPH06141865 A JP H06141865A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 次の一般式（Ｉ）：Ｂ（１−２９）−（Ｘｎ
−Ｙ）ｍ−Ａ（１−２１）（Ｉ）〔式中Ｘｎはｎ個の天
然アミノ酸残基を有するペプチド鎖を表し、ＹはLys 又
はArg を表し、ｎは０〜３３の整数を表し、ｍは０又は
１を表し、Ｂ（１−２９）はPhe B1からLys B29 までの
ヒトインシュリンの短縮されたＢ−鎖を表し、Ａ（１−
２１）はヒトインシュリンのＡ鎖を表すが、ペプチド鎖
−Ｘｎ−Ｙ−は２個の隣接する塩基性アミノ酸残基を含
まないものとする〕を有するペプチド鎖を含むインシュ
リン前駆体の製造方法において、前記前駆体をコードす
るＤＮＡを含んで成る、酵母中で複製可能な発現ベクタ
ーを含む形質転換体酵母菌株を適当な栄養培地中で培養
し、次いでインシュリン前駆物質を回収することを特徴
とする方法。 【効果】 効率よくヒトインシュリンを工業的に製造す
るために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明の、インシュリン前駆体の
製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、インシュリンは、二つの鎖を酸化
法で結合させ、これにより還元された鎖の６個のシステ
インスルフヒドリル基（Ａ鎖において４個、Ｂ鎖におい
て２個）をジスルフィド結合に変えることによって合成
する（合成Ａ及びＢ鎖から）か、又は再合成されてきた
（天然Ａ鎖及びＢ鎖から）。この方法によって、ジスル
フィド結合は、大部分無作為に形成され、このことは、
それぞれシステイン基Ａ−６とＡ−１１，Ａ−７とＢ−
７，Ａ−２０とＢ−１９の間に正確に配置されたジスル
フィド架橋を有するインシュリンの収率は極めて低いこ
とを意味する。
【０００３】インシュリンの生物学的前駆物質としてプ
ロインシュリンが発見されたことにより、全体的に還元
された線状プロインシュリンのＡ−及びＢ−ポリペプチ
ド部分（それぞれインシュリンのＡ鎖及びＢ鎖に対応す
る部分）を酸化により結合させてジスルフィド結合の無
作為化を著しく少なくし、遊離のＡ鎖及びＢ鎖の組合せ
に比べて正確に折り畳まれたプロインシュリンが著しく
高い収率で得られることが判った〔シュタイナー（Ｄ．
Ｆ．Ｓｔｅｉｎｅｒ）ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，６０巻（１９６８），６２２頁〕。
【０００４】方法を調製用規模で可能にするには低すぎ
るプロインシュリン濃度でしか、高い収率は得られなか
ったとしても、プロインシュリンのＢ−Ｃ−Ａポリペプ
チド配列のＣ−部分（即ち、結合ペプチド）の機能、即
ち、６個のシステイン残基をプロインシュリンへの正確
な酸化に好ましい空間位置にもたらす作用は明らかに証
明された。形成されたプロインシュリンは、結合ペプチ
ドを酵素によって除去しうる〔ケムラー（Ｗ．Ｋｅｍｍ
ｌｅｒ）ら著：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６巻（１
９７１），６７８６頁〕点でインシュリンの生体外前駆
物質として作用する。
【０００５】その後、Ｃ−ペプチドより短い結合基を有
し、特殊な酵素又は化学的分解部位によって両方の末端
で作用を受けるプロインシュリン様化合物｛いわゆるミ
ニプロインシュリン〔ウォルマー（Ａ．Ｗｏｌｌｍｅ
ｒ）ら著、ホップ−サイラー（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅ
ｒ）のＺ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５５巻（１９
７４年）、１４７１〜１４７６頁及びディートリッヒ・
ブランデンブルク（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ Ｂｒａｎｄｅｎ
ｂｕｒｇ）ら著、ホップ−サイラーのＺ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．３５４巻（１９７３年）、１５２１〜１
５２４〕｝も、インシュリン前駆物質として作用する。
【０００６】生合成インシュリン、特にヒトのものと同
一のものを提供する努力は、合成インシュリンと同じ方
法にしたがっていた。インシュリンＡ鎖及びＢ鎖を、別
々の宿主生体中で表現させ、次いで、前記のように結合
させた〔チャンス（Ｒ．Ｅ．Ｃｈａｎｃｅ）ら：ダイア
ベーテス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）４巻
（１９８２）、１４７頁〕。
【０００７】微生物を形質転換させて、プリプロインシ
ュリン又はプロインシュリンをコードするベクターをク
ローニングし、プリプロインシュリン又はプロインシュ
リンをそのまま分泌させる〔ギルバート（Ｗ．Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ）らの欧州特許出願公告第６６９４号公報〕か、
又はハイブリッド遺伝子産生物として細胞内に蓄積させ
た〔ゲッデル（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ）らの欧州特許
出願公告第５５９４５号公報〕。ミニプロインシュリン
法も試みられた（ゲッデルの前掲文献）。
【０００８】Ａ鎖及びＢ鎖を別々の発酵工程で調製し、
次いで、それらの鎖を結合させることは、本来、実施不
可能である。二重発酵の不便は、プロインシュリン又は
ミニプロインシュリン調製法を選択することによって克
服することができる。しかしながら、生合成インシュリ
ン前駆物質としてプロインシュリンを使用することは、
若干の欠点を伴う。プロインシュリンは発酵液中に分泌
されようと、又は宿主生体内に、恐らくハイブリッド遺
伝子産生物として細胞内に蓄積されようと、実質的に無
作為化されたジスルフィド結合を含むらしい。
【０００９】このような“スクランブル”生成物を正確
に折り畳まれたプロインシュリンに再び折り畳むこと
は、直接に実施するか〔ガットナー（Ｈ．Ｇ．Ｇａｔｔ
ｎｅｒ）らのオランダ特許出願第４５２３／８３号明細
書〕又は一本鎖ヘキサ−Ｓ−スルホネートを経て実施す
る〔ヒル（Ｆ．Ｂ．Ｈｉｌｌ）：欧州特許出願公告第３
７２５５号公報〕。レフォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉ
ｎｇ）工程は、通常、ある程度の重合、及び従って、回
収の間煩雑な精製工程を使用する不便を伴う。
【００１０】更に、プロインシュリン型のインシュリン
前駆物質は、宿主細胞内又は発酵液中への分泌により酵
素分解を受けやすい。酵母においては、ヒトプロインシ
ュリンは特に２つの二塩基性配列（Arg 31-Arg 32 及び
Lys 64-Arg 65 ）のところで酵素分解に対して鋭敏であ
る。明らかに、これらの分解は、Ｓ−Ｓ架橋を形成する
前に起こって、Ｃ−ペプチド、Ａ鎖及びＢ鎖を形成す
る。
【００１１】
【発明の目的及びその要旨】本発明の目的は、Ａ部分と
Ｂ部分との間のジスルフィド架橋を大部分正しく配置さ
せ、従来公知の生合成インシュリン前駆物質より蛋白分
解による分解に対して著しく抵抗性の生合成インシュリ
ン前駆物質を産生させることによって、前記欠点を回避
することにある。
【００１２】Gly A1からAsn A21 までの完全なＡ鎖に続
くPhe B1からLys B29 までの短縮されたインシュリンＢ
鎖からなる１本鎖インシュリン前駆物質Ｂ（１−２９）
−Ａ（１−２１）は公知である〔ジャン・マーカッセン
（Ｊａｎ Ｍａｒｋｕｓｓｅｎ）、“プロテオリティッ
ク・デグラデイション・オブ・プロインシュリン・アン
ド・オブ・ザ・インターミディエイト・フォームス（Ｐ
ｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔ
ｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｏｒｍｓ）”：プロインシュリ
ン、インシュリン及びＣ−ペプチドに関するシンポジウ
ムの講演集、徳島、１９７８年７月１２〜１４日、編集
者：Ｓ．馬場ら〕。
【００１３】このインシュリン前駆物質Ｂ（１−２９）
−Ａ（１−２１）は、ポルシンインシュリンから半合成
法で製造される。まず、インシュリンＢ（１−２９）及
びＡ（１−２１）鎖を製造し、結合させて、線状ペプチ
ドＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）を形成させた。ヘキ
サチオール形のこの化合物を生体外で酸化して１本鎖デ
ス−（Ｂ３０）インシュリン分子を作った。
【００１４】
【本発明の構成および効果】本発明は、前記１本鎖イン
シュリン前駆物質及びＢ（１−２９）鎖のカルボキシル
末端とＡ（１−２１）鎖のアミノ末端と結合させる架橋
鎖を有する誘導体は、このようなインシュリン前駆物質
をコードするＤＮＡ−配列で形質転換した酵母菌株を培
養すると、高い収率でかつジスルフィド架橋が正しく配
置されて発現されるという意外な発見に基づくものであ
る。
【００１５】 本発明の第一の面によれば、一般式（Ｉ）： Ｂ（１−２９）−（Ｘｎ−Ｙ）ｍ−Ａ（１−２１）
（Ｉ）〔式中Ｘｎはｎ個の天然アミノ酸残基を有するペ
プチド鎖を表し、ＹはLys 又はArg を表し、ｎは０〜３
３の整数を表し、ｍは０又は１を表し、Ｂ（１−２９）
はPhe B1からLys B29 までのヒトインシュリンの短縮さ
れたＢ−鎖を表し、Ａ（１−２１）はヒトインシュリン
のＡ鎖を表すが、ペプチド鎖−Ｘｎ−Ｙ−は２個の隣接
する塩基性アミノ酸残基（即ち、Lys 及びArg ）を含ま
ないものとする〕を有するペプチド鎖を含むインシュリ
ン前駆物質をコードする配列を含んでなるＤＮＡ配列が
提供される。
【００１６】前記の一般式（Ｉ）の好ましいインシュリ
ン前駆物質は、Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）であ
る、即ち一般式（Ｉ）においてｍ＝０の化合物及びＢ
（１−２９）鎖とＡ（１−２１）鎖との間に相対的に短
い架橋鎖を有する化合物である。ｍ＝１の場合、ｎは好
ましくは１〜３３、更に好ましくは１〜１５、更に好ま
しくは１〜８若しくは１〜５、最も好ましくは１〜３若
しくは１〜２である。Ｘは好ましくはAla ，Ser 及びTh
r からなる群から選択され、個々のＸは同一又は異な
る。このような好ましい化合物の例はＢ（１−２９）−
Ser-Lys-Ａ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）
である。
【００１７】本発明の第二の面によれば、酵母中で一般
式（Ｉ）のインシュリン前駆物質をコードする配列を含
むＤＮＡ−配列を表現しうる複製可能の表現ベヒクルが
提供される。表現ベヒクルは、宿主微生物中で複製可能
又は宿主生物の染色体中に組み込み可能なプラスミドで
あってよい。使用するベヒクルは、所望のＤＮＡ−配列
の反復配列（それぞれ、選択的分解部位で分離される）
の表現についてコードすることができる。
【００１８】本発明の第三の面によれば、インシュリン
前駆物質を発現しうる発現ベヒクルを少なくとも１種含
む形質転換体酵母菌株を適当な栄養培地中で培養し、次
いでインシュリン前駆物質を単離する一般式（Ｉ）のイ
ンシュリン前駆物質の製造方法が提供される。
【００１９】本発明の第四の面によれば、新規ヒトイン
シュリン前駆物質が提供される。このような新規ヒトイ
ンシュリン前駆物質は、下記の一般式（II）： Ｂ（１−２９）−Ｘｎ−Ｙ−Ａ（１−２１）（II） 〔式中種々の記号は前記の定義を有する〕を有する。好
ましい新規インシュリン前駆物質はＢ（１−２９）−Se
r-Lys-Ａ（１−２１）及びＢ（１−２９）−Ala-Ala-Ly
s-Ａ（１−２１）である。
【００２０】本発明の第五の面によれば、酵母中で前記
インシュリン前駆物質をコードする配列を含んでなるＤ
ＮＡ−配列を表現可能な発現ベヒクルで形質転換された
酵母菌株が提供される。インシュリン前駆物質を生ずる
付加的蛋白質を用いてインシュリン前駆物質を発現させ
ることもできる。付加的蛋白質は、例えば内因性酵素に
よる生体内分解に対してインシュリン前駆物質を保護す
るか、又は所望の蛋白質をペリプラスム間隙中に移動さ
せ、最終的には細胞壁を通って培地中に移動させるのに
必要な情報を与える作用を有することができる。
【００２１】付加的蛋白質は、微生物自体によって又は
その後の酵素若しくは化学的分解によって付加的蛋白質
を後に脱離させることのできるＢ（１−２９）鎖のＮ−
末端に隣接する選択的分解部位を含む。従って、本発明
は、前記のインシュリン前駆物質をコードするＤＮＡ−
配列を含み、該配列は更にインシュリン前駆物質をコー
ドし、インシュリン前駆物質のＢ（１−２９）鎖のＮ−
末端に隣接する選択的分解部位を含む付加的アミノ酸−
配列をコードする配列より上方に位置する付加的ＤＮＡ
−配列を含んでなる。本発明の好ましい実施態様によれ
ば、付加的アミノ酸配列は、インシュリン前駆物質のＢ
（１−２９）鎖のＮ−末端に隣接する基本アミノ酸を少
なくとも１個含む。
【００２２】インシュリン前駆物質が酵母中に発現され
る場合、付加的アミノ酸配列はインシュリン前駆物質の
Ｂ（１−２９）鎖のＮ−末端に隣接する２個の基本性ア
ミノ酸（例えばLys-Lys ，Arg-Arg ，Lys-Arg 又はArg-
Lys ）を含むことができ、酵母は基本アミノ酸と前駆物
質との間でペプチド結合を分解することができる。所望
の蛋白質に隣接するGlu-Ala 又はAsp-Ala 分解部位は、
酵母によって産生されるジペプチダーゼ酵素によって酵
母自体による付加的アミノ酸配列を分離することを可能
にする。
【００２３】前駆物質のＢ（１−２９）鎖に結合したア
ミノ酸配列を有するインシュリン前駆物質が分泌される
が、このアミノ酸配列は不必要なアミノ酸配列をその後
に脱離するためＢ（１−２９）鎖に隣接する選択的分解
部位を含む。インシュリン前駆物質がメチオニンを含ま
ない場合には、所望の蛋白質に隣接するメチオニンのと
ころでの臭化シアン分解が行われるであろう。同様に、
所望の蛋白質に隣接するアルギニン−及びリジン−分解
部位はトリプシン様プロテアーゼで分解することができ
る。
【００２４】分泌の目的で、インシュリンの前駆物質を
コードするＤＮＡ−配列は、シグナルペプチドについて
コードする付加的ＤＮＡ−配列に融合することができ
る。シグナルペプチドは、細胞から発現された蛋白質産
生物を分泌する間に形質転換体微生物によって脱離さ
れ、所望の産生物を一層簡単に確実に単離する。分泌さ
れた産生物はインシュリン前駆物質であるか、又は前記
のように後に除去すべき付加的Ｎ−末端アミノ酸配列を
含むことができる。
【００２５】分泌は、発現ベヒクル中に酵母MFα１リー
ダー配列〔クルジャン（Ｋｕｒｊａｎ，Ｊ．）及びヘル
スコウィツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．）、セル（Ｃ
ｅｌｌ），３０巻（１９８２）９３３−９４３頁〕を含
むことによって行われ、本発明の更に好ましい実施態様
によれば、インシュリン前駆物質をコードする配列より
上方に配置された付加的アミノ酸配列は、酵母MFα１リ
ーダーをコードする配列又はその部分を含む。
【００２６】所望のＤＮＡ−配列の発現は、宿主生体中
に所望の蛋白質を発現するため所望の蛋白質産生物をコ
ードするＤＮＡ−配列に対して正しく配置されたプロモ
ータ配列の制御下にあるであろう。宿主生体に固有の遺
伝子からのプロモータを使用するのが好ましい。所望の
蛋白質に関するＤＮＡ−配列には、転写終了暗号配列、
好ましくは宿主生体に対して固有の遺伝子からの終了暗
号配列が続く。宿主生体として酵母を使用する場合、プ
ロモータ及び終了暗号配列は、それぞれトリオースホス
ファーゼイソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子のプロモータ及
び終了暗号であるのが好ましい。
【００２７】他のプロモータ、例えばホスホグリセレー
トキナーゼ（ＰＧＫ１）−及びMFα１−プロモータを利
用することもできる。本発明は、更に、前記の一般式
（Ｉ）のインシュリン前駆物質をコードするＤＮＡ−配
列を含む複製可能な発現ベヒクルで酵母菌株を形質転換
させ、形質転換された酵母菌株を適当な栄養培地中で培
養し、インシュリン前駆物質を培地から回収し、ヒトイ
ンシュリンに生体外で変えることによってヒトインシュ
リンを製造する方法を含む。
【００２８】本発明によるインシュリン前駆物質を、オ
ランダ特許出願第５７４／８０号明細書（その開示内容
を参考として本明細書に含める）に記載されているよう
に、トリプシン又はトリプシン誘導体の存在でＬ−スレ
オニンエステルでペプチド転移させ、次いで、公知方法
でヒトインシュリンのスレオニンエステルをヒトインシ
ュリンに変えることによって成人インシュリンに変える
ことができる。
【００２９】Ｂ（１−２９）鎖のＮ−末端に隣接する付
加的アミノ酸配列を有するインシュリン前駆物質を分泌
する場合には、このようなアミノ酸配列は、ペプチド転
移の前に生体外で除去するか又はＢ（１−２９）鎖のＮ
−末端に隣接する基本アミノ酸を少なくとも１個含むべ
きである。それというのは、トリプシンはペプチド転移
の間に基本アミノ酸とPhe のアミノ基との間のペプチド
結合を開裂するからである。
【００３０】添付図面は、本発明の好ましい実施態様を
示すものである。図面及び以下の説明の部分において、
Ｂ（１−２９）の代わりに表現Ｂ′を使用し、Ａ（１−
２１）の代わりにＡを使用する。従って、Ｂ′Ａは表現
Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）に等しい。
【００３１】
【詳細な説明】１．ヒトプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａについてコードす
る遺伝子の製造 ヒトの膵臓からの精製した全ＲＮＡ〔チルウィン（Ｃｈ
ｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．）、プルジビラ（Ｐｒｚｙｂｙ
ｌａ，Ａ．Ｅ．）、マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ，
Ｒ．Ｊ．）及びルッター（Ｒｕｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．）、
バイオケミストリィ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１８
巻（１９７９）５２９４〜５２９９頁〕をＡＭＶ逆転写
酵素及び第一の鎖プライマーとしてｄ（GCTTTATTCCATCT
CTC ）を用いて逆転写した〔ボェル（Ｂｏｅｌ，
Ｅ．）、ブースト（Ｖｕｕｓｔ，Ｊ．）、ノリス（Ｎｏ
ｒｒｉｓ，Ｆ．）、ノリス（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ．）ウィ
ンド（Ｗｉｎｄ，Ａ．）、レーフェルド（Ｒｅｈｆｅｌ
ｄ，Ｊ．Ｆ．）及びマーカー（Ｍａｒｃｋｅｒ，Ｋ．
Ａ．）著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８０，（１９８３）２８６６〜２８６９〕。
【００３２】ヒトプロインシュリンｃＤＮＡの調製用尿
素−ポリアクリルアミドゲル精製を行った後、第二の鎖
をこの鋳型上でＤＮＡポリメラーゼの大きい断片及び第
二の鎖プライマーとして d（CAGATCACTGTCC ）を用いて
合成した。Ｓ１核酸の消化後、ヒトプロインシュリンｄ
ｓ．ｃＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て精製し、末端転移酵素で末端を処理し、Ｅ．コリー
（ｃｏｌｉ）においてｐＢＲ３２７〔ソルベロン（Ｓｏ
ｒｂｅｒｏｎ）ら著、ジーン（Ｇｅｎｅ）９巻、（１９
８０），２８７〜３０５頁〕上のPst Ｉ部位でクローニ
ングした。
【００３３】ヒトプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａをコード
する遺伝子を含むプラスミドを保有する正しいクローン
を、制限エンドヌクレアーゼ分析によって組換え体から
同定し、ヌクレオチド配列分析によって確認した〔マク
サム（Ｍａｘａｍ，Ａ．）及びギルバート（Ｇｉｌｂｅ
ｒｔ，Ｗ．）著、メソッヅ・イン・エンツィモロジィ
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），６
５巻（１９８０），４９９〜５６０頁、サンガー（Ｓａ
ｎｇｅｒ，Ｆ．）、ニックレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ，
Ｓ．）及びクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．），
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４
巻、（１９７７）５４６３〜５４６７頁〕。
【００３４】２．ヒトインシュリンの前駆物質について
コードする遺伝子の製造 ヒトインシュリンのＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）を
コードする遺伝子を、環状１本鎖Ｍ−１３バクテリオフ
ァージベクター中に挿入されたＣ−ペプチドコード領域
におけるフレーム欠失の際に７５bpを有するヒトインシ
ュリン配列の部位特異性突然変異によって製造した。
【００３５】Ｍ１３鋳型に化学的に合成した１９−マー
欠失プライマーをアニールした変形方法を使用した
〔Ｋ．ノリスら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１
１巻（１９８３）５１０３〜５１１２頁〕。短い酵素伸
長反応の後、“ユニバーサル”１５−マーＭ１３ジデオ
キシ配列プライマーを添加し、次いで、酵素による伸長
及び結合を行った。２本鎖制限断片（BamHＩ−Hind II
I）を部分的に２本鎖の環状ＤＮＡから切断し、BamHＩ
及びHind IIIを用いてpBR ３２２中に結合させた。
【００３６】従って、Ｍ−１３バクテリオファージ中に
MFα１−Ｂ−Ｃ−Ａをコードするフラグメントを挿入
し、それぞれ化学的に合成した３０−マー及び２７−マ
ー欠失プライマー並びに前記の“ユニバーサル”１５−
マーＭ１３ジデオキシ配列プライマーでヒトプロインシ
ュリン配列を部位特異性突然変異を起こさせることによ
って、Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）及
びＢ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）を作った。
【００３７】２本鎖制限断片（XbalＩ−EcoRＩ）を部分
的に２本鎖の環状ＤＮＡから切断し、それぞれpUC １３
及びpT５に結合させた。Ｅ．コリー（Ｃｏｌｉ）の形質
転換及び再形質転換によってＢ（１−２９）−Ala-Ala-
Lys-Ａ（１−２１）をコードする遺伝子を含むプラスミ
ドpMT ５９８及びＢ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２
１）をコードする遺伝子を含むpMT ６３０を保有する被
形質転換体を同定した。
【００３８】前記と同様の方法で、Ｍ１３ｍｐ１１バク
テリオファージにMFα１−Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２
１）をコードする断片を挿入し、化学的に合成した４６
−マー欠失プライマー（５′-CACACCCAAGACTAAACAAGCTG
AAGACTTGCAAAGAGGCATTGTG-３′）（配列番号：１）及び
“ユニバーサル”プライマーでＢ（１−２９）−Ａ（１
−２１）配列の部位特異性突然変異を起こさせることに
よって、Ｂ（１−２９）−Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Le
u-Gln-Lys-Ａ（１−２１）を作った。
【００３９】また、同様の操作でＢ（１−２９）−Thr-
Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Le
u-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-
Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Ａ（１−２１）（配
列番号：２）をコードする遺伝子を製造した。
【００４０】３．プラスミドの構成 ヒトインシュリン（Ｂ′Ａ）のＢ（１−２９）−Ａ（１
−２１）をコードする遺伝子をpMT ３１９から制限断片
として単離し、ＴＰＩプロモーター（ＴＰＩｐ）〔アル
バー（Ｔ．Ａｌｂｅｒ）及びＧ．川崎著、サッカロミセ
ス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）のトリオースホスフェートイソメラー
ゼ遺伝子のヌクレオチド配列、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１巻（１９８２）４１９〜４３４
頁〕、MFα１リーダー配列〔カージャン（Ｊ．Ｋｕｒｊ
ａｎ）及びヘルスコウィツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）
著、酵母フェロモン遺伝子の構造：推定のα−ファクタ
ーは完成α−ファクターの４種の縦列コピーを含む。
【００４１】セル（Ｃｅｌｌ），３０巻（１９８２）９
３３〜９４３頁〕及びＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）（ＴＰＩT ）のＴＰＩからの転写終了配列
についてコードする断片と結合させた。これらの断片
は、Ｂ′Ａをコードする遺伝子について高い割合の転写
を確実にする配列を提供し、また、Ｂ′Ａを分泌路に極
在化させ、場合により増殖培地中に排出することのでき
る予備配列を提供する。Ｂ′Ａに関するこの発現単位
（ＴＰＩP −MFα１リーダー−Ｂ′Ａ−ＴＰＩT ）を次
に、酵母２μ複製起点及び選択可能のマーカーLeu ２を
含むプラスミドベクター上に置いてpMT ３４４、即ち
Ｂ′Ａについての酵母発現ベクターを作った。
【００４２】酵母中のα−ファクターの生体内突然変異
の間にMFα１リーダーペプチドの最後の（Ｃ−末端）の
６個のアミノ酸（Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala ）（配列番
号：３）をα−ファクター前駆物質から、Lys-Arg 配列
を認識するエンドペプチダーゼ及びGlu-Ala 基を除去す
るアミノジペプチダーゼの連続作用によって除去する
〔ジュリウス（Ｊｕｌｉｕｓ，Ｄ）ら著、セル（Ｃｅｌ
ｌ）３２巻（１９８３）８３９〜８５２頁〕。酵母アミ
ノジペプチダーゼの必要を排除するため、MFα１リーダ
ーのＣ−末端Glu-Ala-Glu-Ala についてコードする配列
を生体外突然変異により除去した。生ずる酵母発現プラ
スミドpMT ４７５は、ＴＰＩP −MFα１リーダー（マイ
ナスGlu-Ala-Glu-Ala ）−Ｂ′Ａ−ＴＰＩT についてコ
ードする挿入部を含む。
【００４３】好ましい構成においては、修飾された表現
単位は、単に増殖培地中のグルコースの存在によって選
択されうる安定な高コピー数酵母プラスミドＣＰＯＴ
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９６８５）に転移させた。Ｂ′Ａ
についての、生ずる酵母発現ベクターをpMT ４７９と番
号を付けた。MFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Al
a ）−Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）を
コードする断片をpMT ５９８から制限断片として単離
し、ＴＰＩプロモーター及びＴＰＩ終了暗号についてコ
ードする断片と結合させ、前記の高コピー数酵母プラス
ミドＣＰＯＴに転移させた。Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-
Lys-Ａ（１−２１）についての、生ずる発現ベクターを
pMT ６１０と番号を付けた。
【００４４】挿入ＴＰＩP −MFα１リーダー（マイナス
Glu-Ala-Glu-Ala ）−Ｂ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１
−２１）−ＴＰＩT を含むフラグメントをpMT ６３０か
ら制限断片として単離し、ＣＰＯＴに転移させた。Ｂ
（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）についての、生
ずる酵母発現ベクターをpMT ６３９と番号を付けた。挿
入ＴＰＩP −MFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Al
a ）−Ｂ（１−２９）−Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-
Gln-Lys-Ａ（１−２１）−ＴＰＩT を含む断片をＣＰＯ
Ｔの SphＩ−BamHＩ中に挿入されたpBR ３２２の SphＩ
−BamHＩ断片を含むＣＰＯＴ誘導体である高コピー数酵
母プラスミドＣＰＯＴ中に挿入した。Ｂ（１−２９）−
Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-Ａ（１−２１）
についての、生ずる酵母発現ベクターをｐ１１２６と番
号を付けた。
【００４５】４．形質転換 プラスミドpMT ３４４及びpMT ４７５を、ヒンネン（Ｈ
ｉｎｎｅｎ）らによって記載されたように〔Ａ．ヒンネ
ン、ヒックス（Ｊ．Ｂ．Ｈｉｃｋｓ）及びフィンク
（Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ．酵母の形質転換、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．７５（１９７８）１９２９頁〕ロ
イシンプロトトロフィについて選択することによって
Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）leu ２突然変
異体に形質転換した。
【００４６】プラスミドpMT ４７９，pMT ６１０，pMT
６３９及びｐ１１２６を、グルコースでの生育について
選択することによってＴＰＩ遺伝子中の欠失を有する
Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株に形
質転換した。このような菌株は、通常、唯一種の炭素源
としてグルコースでは増殖できず、ガラクトースラクテ
ート培地上で極めて緩徐に生育する。この欠失は、Ｓ．
セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）leu ２遺伝子で上
記遺伝子の大部分を欠失し、置換することによって得ら
れるトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子中の突
然変異による。
【００４７】生育不全であるため、ＴＰＩについてコー
ドする遺伝子を含むプラスミドについて強力な選択があ
る。pMT ４７９は、pMT ４７９についてコードする遺伝
子は、シゾー・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏ／ｐｏｍｂｅ）Ｔ
ＰＩ遺伝子を含む。
【００４８】５．酵母におけるヒトインシュリン前駆物
質の表現 インシュリン標準品の代わりに、問題のインシュリン前
駆物質標準品を使用する以外は、ヘディング（Ｈｅｄｉ
ｎｇ，Ｌ．）〔ダイアベートロジア（Ｄｉａｂｅｔｏｌ
ｏｇｉａ），８巻２６０〜２６６頁１９７２年〕によっ
て記載されたようにして、インシュリンについてラジオ
イムノアッセイによってヒトインシュリン型の発現産生
物を測定した。標準品の純度は、ＨＰＬＣで測定して約
９８％であり、標準品中のペプチドの現実の濃度は、ア
ミノ酸分析によって測定した。形質転換された酵母菌株
中の免疫反応性ヒトインシュリン前駆物質の発現濃度を
第１表にまとめる。
【００４９】
【表１】 発現産生物の単離及び特性を例７〜９及び１２〜１３に
示す。
【００５０】６．ヒトインシュリンのＢ３０エステルへ
のヒトインシュリン前駆物質の変換 ヒトインシュリンエステルへのヒトインシュリン前駆物
質の変換は、逆相でＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフ
ィー）によって定量的に行うことができる。４×３００
mmの“ミューボンダパック（μＢｏｎｄａｐａｋ）Ｃ１
８カラム”（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓ．）を使用し、０．
２Ｍの硫酸アンモニウム（硫酸で３．５のpH値に調節）
を含み、２６〜５０％のアセトニトリルを含む緩衝液を
用いて溶離を実施した。
【００５１】最適アセトニトリル濃度は、インシュリン
前駆物質からどのエステルを分離したいかに左右され
る。ヒトインシュリンメチルエステルの場合には、約２
６％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルで分離が達成される。
ＨＰＬＣカラムに適用する前に、１０容量のアセトンを
添加して、反応混合物中の蛋白質を沈澱させた。沈澱を
遠心分離によって単離し、真空乾燥し、１Ｍ酢酸に溶か
した。 実験の部
【００５２】
【実施例】例１ Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリンについて
コードする遺伝子の構成材料及び方法 “ユニバーサル”１５−マーＭ１３ジデオキシ配列プラ
イマー d（TCCCAGTCACGACGT ）（配列番号：４）、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ及び制限酵素は、ニュー・イングラン
ド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）から得た。ＤＮＡポリメラーゼＩ“クレナウ・
フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）”及
びＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｐ−Ｌバイオケミ
カルス（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。
【００５３】（γ−Ｐ）−ＡＴＰ（７５００Ｃｉ／ミリ
モル）は、ニュウ・イングランド・ニュウクリア（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）から得た。オリ
ゴヌクレオチド合成のための支持体は、バチェム（Ｂａ
ｃｈｅｍ）からのアミノメチル化され、１％架橋された
ポリスチレンビードに３′−Ｏ−スクシニル基を介して
結合された５′−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ2 −イソブ
チリルデオキシグアノシンであった。
【００５４】Ｍ１３ ｍｐ１０ ｉｎｓＨＸΔＰｓｔフ
ァージの構成 ｐ２８５から単離した２８４bpの大きいプロインシュリ
ンをコードするHind III−Xba Ｉ断片をHind III−Xba
Ｉで切断したＭ１３ ｍｐ１０ ＲＦにクローニングす
ることによってＭ１３ ｍｐ１０誘導ファージｍｐ１０
ｉｎｓＨＸを作った。Ｍ１３ ｍｐ１０ ＲＦは、ウ
ィスコンシン州ミルウォキーのＰ−Ｌバイオケミカルス
社（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）か
ら入手しうる（カタログＮｏ．１５４１）。
【００５５】完全Pst Ｉ消化、次いでＥ．コリー（Ｅ．
ｃｏｌｉ）JM１０３の結合及び形質転換によってmp10 i
nsHX，RFからM13 mp10 insHXΔPst を作った。生ずるフ
ァージは、Ｃ−ペプチドをコードする領域でフレーム欠
失に７５の塩基対を有するヒトプロインシュリンをコー
ドする配列を保有する。１本鎖ファージを記載されてい
るようにして製造した〔メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．）及びビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．），（１９８
２）、ジーン（Ｇｅｎｅ）１９巻２６９〜２７６頁〕。
【００５６】オリゴデオキシリボヌクレオチド合成 １９−マー欠失プライマーｄ（CACACCCAAGGGCATTGTG ）
（配列番号：５）を、１％架橋されたポリスチレン支持
体上でトリエステル法によって合成した〔Ｈ．伊藤、
Ｙ．池、Ｓ．生田及びＫ．板倉著（１９８２）Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，１７５５〜１７６
９〕。ポリマーを短いカラムに充填し、溶剤及び試薬を
ＨＰＬＣポンプ及びコントロールモジュールを用いて半
自動的に供給した。
【００５７】保護基を除去した後に、リクロソーブ（Ｌ
ｉＣｈｒｏｓｏｒｂ）ＲＰ１８カラム〔クロムパック
（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）｛フリッツ（Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．
−Ｊ．）ベラガジェ（Ｂｅｌａｇａｊｅ，Ｒ．）、ブラ
ウン（Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｌ．）、フリッツ（Ｆｒｉｔ
ｚ，Ｒ．Ｈ．）、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．
Ａ．）、リース（Ｌｅｅｓ，Ｒ．Ｇ．）及びコーラナ
（Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．）、（１９７８）、バイオ
ケミストリィ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１７巻１２
５７〜１２６７頁〕上でＨＰＬＣによってオリゴヌクレ
オチドを精製した。
【００５８】オリゴデオキシリボヌクレオチドの５′−
32Ｐ−標識 ５０mMのトリス−ＨＣｌ，pH９．５，１０mMのＭｇＣｌ
2 ，５mMのＤＴＴ，０．４％のグリセロール、１２０pm
ole のＡＴＰ，５０μＣｉの（γ−32Ｐ）−ＡＴＰ（１
０pmole ），１２０pmole のオリゴヌクレオチド及び３
０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む反応混合
物６０μｌ中で１９−マーを５′−末端で標識した。
【００５９】反応を３７℃で３０分実施し、１００℃で
３分加熱することによって終了した。標識したオリゴヌ
クレオチドをpH７．５の０．０５Ｍトリエチルアンモニ
ウム重炭酸塩中でセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ５０超微細品のカラム（１×８cm）上でクロマトグラ
フィーすることにより未反応の（γ−32Ｐ）−ＡＴＰか
ら分離した。
【００６０】コロニーのハイブリッド化のため、記載さ
れているような“コールド”ＡＴＰ〔ボエル（Ｂｏｅ
ｌ，Ｅ．）、ブースト（Ｖｕｕｓｔ，Ｊ．）、ノリス
（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｆ．）、ノリス（Ｎｏｒｒｉｓ，
Ｋ．）、ウィンド（Ｗｉｎｄ，Ａ．）、レーフェルド
（Ｒｅｈｆｅｌｄ，Ｊ．）及びマーカー（Ｍａｒｃｋｅ
ｒ，Ｋ．）（１９８３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，２８６６〜２８６９頁〕を添
加せずにオリゴヌクレオチドを標識した。
【００６１】オリゴデオキシリボヌクレオチドをプライ
マーとするＤＮＡの合成 １本鎖M13 mp10 insHXΔPst （０．４pmole ）を２０μ
ｌの５０mMのＮａＣｌ，２０mMのトリス−ＨＣｌ，pH
７．５，１０mMのＭｇＣｌ2 及び１mMのＤＤＴ中の１９
−マー５′−（32Ｐ）−標識オリゴデオキシリボヌクレ
オチドプライマー（１０pmole ）とともに５５℃で５分
間インキュベートし、１１℃で３０分アニールした。
【００６２】次に、それぞれ２．２mMのｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，２０mMのトリス−ＨＣｌ，
pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ2 ，５０mMのＮａＣｌ及び
１mMのＤＤＴからなるｄ−ＮＴＰ−混合物９μｌを添加
し、続いてＥ．コリー（ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ〔クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）〕７単位を添加した。混
合物を１１℃で３０分保持し、６５℃で１０分加熱し
た。ジデオキシ配列に関する１５−マーユニバーサルプ
ライマー（４pmole ）を添加し、混合物を更に１分６５
℃で加熱した。
【００６３】１１℃に冷却した後、２０mMのトリス−Ｈ
Ｃｌ，pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ 2 ，１０mMのＤＤ
Ｔ、それぞれ０．８mMのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，２．４mMのＡＴＰ及び１０3 単位のＴ４
リガーゼを含む溶液２６μｌを添加し、次いで９．５単
位のＥ．コリー（ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レナウ）を添加した。混合物の最終容量は６４μｌであ
った。１１℃で３時間インキュベートした後、２０μｌ
の４Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、容量をＴＥ−緩衝剤
（１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH８．０，１mMのＥＤＴ
Ａ）に調節した。
【００６４】混合物をフェノール／クロロホルムで２回
抽出した。BamHＩ及びHindIII で分解したpBR ３２２の
精製した大きい断片０．９μｇ（０．３pmole ）を担体
ＤＮＡとして添加した。水相のエーテル抽出後、ＤＮＡ
をエタノール沈澱によって単離した。
【００６５】エンドヌクレアーゼ消化 前記のようにして製造したＤＮＡをそれぞれ合計２２μ
ｌの緩衝液（５０mMのＮａＣｌ，１０mMのトリス−ＨＣ
ｌ，pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ2 ，１mMのＤＤＴ，４
mMのスペルミジン）中で制限エンドヌクレアーゼBamHＩ
及びHindIII のそれぞれ１６単位及び２０単位で消化し
た。混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、次い
でエーテルで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈澱によって
単離し、次いで１２μｌの水に溶かした。２μｌを７Ｍ
尿素６％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に使用
した。
【００６６】結合 ＤＮＡの１部（５μｌ）に、６６mMのトリス−ＨＣｌ，
pH７．４，１０mMのＭｇＣｌ2 ，１mMのＡＴＰ，１mMの
ＤＤＴ，４０μｇ／mlのゼラチンを含む合計４１μｌ中
の、BamHＩ及びHind IIIで切断されたpBR ３２２の精製
された大きいフラグメントの新しい部分（０．３８μ
ｇ）及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ４００単位を添加した。
結合を１６℃で１６時間実施した。
【００６７】形質転換 結合混合物を２０．５μｌを使用して、ＣａＣｌ2 で処
理したＥ．コリー（ｃｏｌｉ）ＭＣ １０００（ｒ- ，
ｍ+ ）を形質転換させた。細菌をＬＢ−平板寒天上に置
き、アンピシリンに対する耐性（１００μｇ／ml）につ
いて選択した。M13 mp10 insHXΔPst １pmole 当たり
２．６×１０3 個のコロニーが得られた。
【００６８】コロニーのハイブリッド形成 １２３個の形質転換コロニーを新しいアンピシリン平板
上に取り、３７℃で一夜増殖させた。コロニーをホワッ
トマン（ｗｈａｔｍａｎ）５４０濾紙に移し、定着させ
た〔ゲルゲン（Ｇｅｒｇｅｎ，Ｊ．Ｐ．）、ステルン
（Ｓｔｅｒｎ，Ｒ．Ｈ．）及びウェンシンク（Ｗｅｎｓ
ｉｎｋ，Ｐ．Ｃ．）著（１９７９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．７巻、２１１５〜２１３６頁〕。０．９
ＭのＮａＣｌ，０．０９Ｍのトリス−ＨＣｌ，pH７．
５，０．００６ＭのＥＤＴＡ，０．２％のフィコル（Ｆ
ｉｃｏｌｌ），０．２％のポリビニルピロリドン、０．
２％のウシ血清アルブミン、０．１％のＳＤＳ及び５０
μｇ／mlの鮭精液ＤＮＡを含む密封プラスチックバック
中で６５℃で２時間予備ハイブリッド形成を実施した。
【００６９】次に、８．５×１０6 cpm の32Ｐ−標識１
９−マーを添加し、４５℃で一夜ハイブリッド形成を実
施した。フィルターを０．９ＭのＮａＣｌ，０．０９Ｍ
のクエン酸ナトリウムで０℃で５分間、３回洗浄し、次
いで、オートラジオグラフィを実施し、４５℃で１分、
１回洗浄し、再びオートラジオグラフィを実施した。４
５℃で洗浄した後、突然変異したプラスミドを含む３個
のコロニーを認めることができた。
【００７０】突然変異したプラスミドのエンドヌクレア
ーゼ分析 突然変異株を含むと思われるコロニーからのプラスミド
を迅速方法〔イッシュ−ホロヴィツ（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏ
ｗｉｃｚ，Ｄ．）及びブルケ（Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｆ．）
著、（１９８１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９
巻、２９８９〜２９９８頁〕によって調製し、BamHＩ及
びHind IIIの混合物で消化し、次いで、２％アガロース
ゲル上での電気泳動によって分析した。１７９個の塩基
対の断片の存在から、３個のコロニーが突然変異プラス
ミドを含むことが確認された。
【００７１】再形質転換 “突然変異株”と同定されたコロニーは、後代のヘテロ
二重らせんであるプラスミドを含む。２つの突然変異株
コロニーからのプラスミドを用いてＣａＣｌ2で処理し
たＥ．コリー（ｃｏｌｉ）ＭＣ １０００（ｒ- ，
ｍ+ ）を再び形質転換させることにより純粋な変異体を
得ることができた。各平板から、５個のアンピシリン耐
性コロニーを単離し、プラスミドＤＮＡを調製し、前記
のようなエンドヌクレアーゼ分解によって分析した。５
個のうち３個及び５個のうち５個がそれぞれ純粋な変異
体であることが判った。更に使用するため、一つのプラ
スミドpMT ３１９を選択した。
【００７２】ＤＮＡ配列分析 ５μｇのpMT ３１９を標準条件下にBamHＩで分解し、フ
ェノールで抽出し、エタノールで沈澱させた。BamHＩ粘
着性末端の補充を、クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポ
リメラーゼＩ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ及びα−
32Ｐ−ｄＡＴＰを用いて実施した。
【００７３】フェノールで抽出し、エタノールで沈澱さ
せた後、ＤＮＡをEcoRＩで消化した。欠失を有するＰ−
標識断片を２％アガロースゲル上での電気泳動で精製
し、マクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ）法〔マクサム、Ａ．及びギルバート、Ｗ．，（１９
８０）、メソッヅ・イン・エンツィモロジィ（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５巻、４９９
〜５６０頁〕により配列を分析した。
【００７４】例２ ヒトインシュリン（Ｂ′Ａ）のＢ（１−２９）−Ａ（１
−２１）を発現する酵母プラスミドpMT ３４４の構成 Ｂ′Ａについてコードする遺伝子を含む、前記のように
して製造したプラスミドpMT ３１９を制限酵素Hind III
及びXba Ｉで切断し、２％アガロースゲルから０．１８
kb断片を単離した〔マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）、フリッチュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）及びサム
ブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、モレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ），１９
８２年）〕。
【００７５】同様に、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）ＴＰＩプロモーター（ＴＰＩP ）〔アルバ
ー（Ｔ．Ａｌｂｅｒ）及びＧ．川崎著、サッカロミセス
・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）のトリオースホスフェートイソメラーゼ
遺伝子のヌクレオチド配列、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｇｅｎｅｔ．１巻（１９８２）４１９〜４３４頁〕
及びMFα１リーダー配列〔クルジャン（Ｊ．Ｋｕｒｊａ
ｎ）及びヘルスコヴィツ（Ｉ．Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔ
ｚ）、酵母フェロモン遺伝子（MFα）の構造：推定のα
−ファクター前駆物質は成熟αファクターの４種の縦列
コピーを含む。セル（Ｃｅｌｌ）３０巻（１９８２）９
３３〜９４３頁〕を含む断片（６．５kb Xho Ｉ−Hind
III）を１９８３年１１月１日付け米国特許出願第５４
７，７４８号明細書に記載されているようにして製造し
たプラスミドｐ２８５から単離した。
【００７６】ｐ２８５は、挿入ＴＰＩP −MFα１リーダ
ー−Ｂ−Ｃ−Ａ−ＴＰＩT を含み、酵母菌株Ｚ３３（Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．２０６８１）として寄託された。ＴＰＩ
転写終了配列（ＴＰＩT ）〔アルバー（Ｔ．Ａｌｂｅ
ｒ）及びＧ．川崎著、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子のヌクレオ
チド配列、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔ．
１巻（１９８２）４１９〜４３４頁〕を含む断片（０．
７kb Xba Ｉ−BamHＩ）もｐ２８５から単離した。
【００７７】最後に、酵母ベクターＹＲｐ１３（ブロー
チ（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ．）著、２μｍ環状配列を使
用する高コピー酵母ベクターの構成。メソッヅ・エンツ
ィモロジィ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
１０１巻（１９８３）３０７〜３２５頁〕から５．４kb
Xba Ｉ−BamHＩ断片を単離した。
【００７８】前記の４種の断片を結合させ〔マニアティ
ス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）、フリッチュ（Ｅ．Ｆ．Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ）及びサムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ）著、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハー
バー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ），１９８２〕、アンピシリン耐性につい
て選択してＥ．コリー（ｃｏｌｉ）に形質転換させた
〔マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）、フリッチュ
（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）及びサムブルック（Ｊ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ）著、モレキュラー・クローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプ
リング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ），１９８２年〕。形質転換
体からプラスミドを単離し、これらのうちの一つ、pMT
３４４の構造を制限地図によって証明した。pMT ３４４
の構造及び主な特徴を第１図に示す。
【００７９】例３ 修飾MFα１リーダーの後にヒトインシュリン（Ｂ′Ａ）
のＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）を表現する酵母プラ
スミドpMT ４７５の構成 最後の４個のアミノ酸（Glu-Ala-Glu-Ala ）を欠くMFα
１リーダー〔クルジャン（Ｊ．Ｋｕｒｊａｎ）及びヘル
スコヴィツ（Ｉ．Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、酵母フェロ
モン遺伝子（MFα）の構造：推定のα−ファクター前駆
物質は成熟α−ファクターの４種の縦列コピーを含む。
【００８０】セル（Ｃｅｌｌ）３０巻（１９８２年）９
３３〜９４３頁〕の後にＢ′Ａを表現するプラスミドを
構成するため、Ａ配列及びＢ′配列の一部を含む０．１
４kbXba Ｉ−EcoRII断片をpMT ３１９から単離した。同
様にＢ′遺伝子の５′基部をｐＭ２１５から０．３６kb
EcoRＩ−EcoRII断片として単離した。
【００８１】プラスミドｐＭ２１５は、ｐ２８５からの
プロインシュリンＢ−Ｃ−Ａ遺伝子を含むEcoRＩ−Xba
Ｉ断片をpUC １３〔ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）らによっ
てpUC ８及びpUC ９について記載されたようにして製
造、ジーン（Ｇｅｎｅ）１９巻、２５９〜２６８頁（１
９８２年）〕にサブクローニングし、その後MFα１リー
ダーとプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａ遺伝子との接合点で
Glu −Ala −Glu −Alaについてコードする１２個の塩
基を生体外で環状で除去した。Ｂ′Ａ遺伝子を含むこれ
ら２片をEcoRＩ−Xba Ｉで消化したpUC １３ベクター
（第２図参照）に結合させてpMT ４７３を得た。
【００８２】０．５kb EcoRＩ−Xba Ｉ断片内に含まれ
る修飾遺伝子をpMT ４７３から単離し、次いで、pMT ３
４２からの二つの断片（４．３kb Xba Ｉ−EcoRＶ及び
３．３kb EcoRＶ−EcoRＩ）に結合させた。pMT ３４２
は、挿入されたＴＰＩP −MFα１リーダー−Ｂ−Ｃ−Ａ
−ＴＰＩT を有する酵母ベクターpMT ２１２である。精
製するプラスミド、pMT ４７５は挿入部：ＴＰＩP −MF
α１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala ）−Ｂ′Ａ−
ＴＰＩT を含む。プラスミドpMT ３４２，pMT４７３及
びpMT ４７５の構成を第２図に略示する。ベクターpMT
２１２の構成を第３図に示す。
【００８３】プラスミドpMLB１０３４は、ベルマン
（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ）ら著、アドバンスド・バクテ
リアル・ジェネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリン
グ・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）（１９８２年）４９〜５１頁に記載されており、pU
C １２はpUC １３について記載した（ビエイラらの前掲
文献）のと同様にして製造した。
【００８４】例４ 安定な酵母プラスミドpMT ４７９へのＢ（１−２９）−
Ａ（１−２１）（Ｂ′Ａ）遺伝子の挿入 pMT ４７５からの修飾Ｂ′Ａ遺伝子を２．１kb BamHＩ
−部分Sph １断片として単離し、プラスミドＣＰＯＴ
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９６８５）の約１１kb BamHＩ−
Sph １断片に結合させてプラスミドpMT ４７９を得た
（第４図）。
【００８５】プラスミドＣＰＯＴは、元のpBR ３２２Bg
１Ｉ−BamHＩ断片をpUC １３からの同様のBg１Ｉ−BamH
Ｉ断片で置換し、その後、BamHＩ−ＳａｌＩ断片として
Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）を挿
入〔１９８４年５月２５日出願の米国特許第６１４，７
３４号明細書〕することによって修飾してＣＰＯＴとし
たベクターＣ１／１に基づくものである。Ｃ１／１は、
pJDB２４８〔ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）ら著、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）２７５巻、１０４〜１０９頁（１９７
８年）〕から欧州特許出願第０１０３４０９Ａ号明細書
に記載されているようにして誘導されたものである。
【００８６】例５ 形質転換 Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株MT１１８
（ａ，Ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｔｒｐ１）をＹＰＤ培地
〔シェルマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら著、メソッヅ・イン
・イースト・ジェネティクス（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリィ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８１年〕
上で２．１のＯＤ600 になるまで増殖させた。１００ml
の培養液を遠心分離により採取し、水１０mlで洗浄し、
再遠心分離し、（１．２Ｍのソルビット、２５mMのＮａ
2ＥＤＴＡ，pH＝８．０，６．７mg／mlのジチオスレイ
トール）１０ml中に再懸濁した。
【００８７】懸濁液を３０℃で１５分インキュベート
し、遠心分離し、細胞を〔１．２Ｍのソルビット、１０
mMのＮａ2 ＥＤＴＡ，０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、
pH５．８，２mgのノボチーム（Ｎｏｖｏｚｙｍ、商標）
２３４酵素）１０ml中に再懸濁した。懸濁液を３０℃で
３０分インキュベートし、細胞を遠心分離によって集
め、１．２Ｍのソルビット１０ml及びＣＡＳ〔１．２Ｍ
のソルビット、１０mMのＣａＣｌ2 ，１０mMのトリス
（トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
pH７．５〕１０ml中で洗浄し、ＣＡＳ２ml中に再懸濁し
た。
【００８８】形質転換のため、ＣＡＳに再懸濁した細胞
０．１mlを約１μｇのプラスミドpMT ３４４と混合し、
室温で１５分放置した。１mlの（２０％ポリエチレング
リコール４０００，１０mMのＣａＣｌ2 ，１０mMのトリ
ス、pH７．５）を添加し、混合物を更に３０分室温で放
置した。混合物を遠心分離し、ペレットを０．１mlのＳ
ＯＳ（１．２Ｍのソルビット、３３％のｖ／ｖのＹＰ
Ｄ，６．７mMのＣａＣｌ 2 ，１４μｇ／mlのロイシン）
中に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。次
いで、懸濁液を遠心分離し、ペレットを０．５mlの１．
２Ｍのソルビット中に再懸濁した。
【００８９】５２℃の６mlのトップ寒天〔ロイシンを省
き、１．２Ｍのソルビット及び２．５％の寒天を含むシ
ェルマンらのＳＣ培地｛メソッヅ・イン・イースト・ジ
ェネティクス（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリィ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８１年｝〕を添加し、
懸濁液を同じ寒天固化ソルビット含有培地を含む平板の
上に注いだ。３０℃で３日後に形質転換体コロニーを採
取し、再び単離し、液体培養を開始するため使用する。
このような形質転換体の一つMT３５０（＝MT１１８／MT
３４４）を更に特性決定するため選択した。
【００９０】プラスミドpMT ４７９を前記と同じ操作に
よりＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株MT３
６２（α，Leu ２）に形質転換させ、形質転換体MT３７
１（＝MT３６２／MT４７５）を単離した。菌株Ｅ２−７
Ｂ Ｘ Ｅ１１−３Ｃ（ａ／α，Δｔｐｉ／Δｔｐｉ，
ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３；この株をMT５０１と言
う）へのpMT ４７９の形質転換を下記の点を変えて前記
のように実施した：
【００９１】１）形質転換前にMT５０１をＹＰＧａＬ
〔１％バクト（Ｂａｃｔｏ）酵母エキス、２％バクトペ
プトン、２％ガラクトース、１％乳酸塩〕上で０．６の
ＯＤ600まで増殖させた。２）ＳＯＳ溶液は、ＹＰＤの
代わりにＹＰＧａＬを含んでいた。形質転換体の一つMT
５１９（＝MT５０１／pMT ４７９）を更に特性決定する
ため選択した。
【００９２】出願人は、形質転換した微生物MT３５０，
MT３７１及びMT５１９を１９８４年５月１４日にＤ−３
４００ゲッティンゲン、グリーゼバッハシュトラーセ８
のドイツ微生物寄託（ＤＳＭ）に寄託し、それぞれ参照
番号ＤＳＭ２９５７，ＤＳＭ２９５８及びＤＳＭ２９５
９を与えられた。
【００９３】例６ 酵母におけるＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュ
リンの発現 菌株MT３５０（ＤＳＭ２９５７）及びMT３７１（ＤＳＭ
２９５８）をロイシンを省いた合成完全ＳＣ培地〔シェ
ルマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら著、メソッヅ・イン・イー
スト・ジェネティクス（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａ
ｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリィ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８１年〕中で
増殖させた。各菌株について、２ｌのバッフル付きフラ
スコ中の１ｌの培養液２つを７〜１０のＯＤ600nm に達
するまで３０℃で振盪した。これらを次に、遠心分離
し、上澄み液を更に分析するため取り除いた。
【００９４】菌株MT５１９（ＤＳＭ２９５９）を同様に
増殖させるが、ＹＰＤ培地〔シェルマン（Ｓｈｅｒｍａ
ｎ）ら著、メソッヅ・イン・イースト・ジェネティクス
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、１９８１年〕上で１５のＯＤ600nm に達
するまで増殖させ、遠心分離し、上澄み液を前記のよう
に分析のため分離した。
【００９５】例７ 酵母菌株MT３５０（ＤＳＭ２９５７）におけるＢ（１−
２９）−Ａ（１−２１）インシュリンの発現 酵母菌株MT３５０（ＤＳＭ２９５７）を前記の例６に記
載したように増殖させ、この菌株からの上澄み液１１０
０mlからの発現産生物を下記のようにして単離した。
【００９６】リクロプレプ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）
（商標）ＲＰ−１８〔メルク（Ｍｅｒｃｋ），ａｒｔ．
９３０３〕を５０mMのＮＨ4 ＨＣＯ3 ，６０％エタノー
ルで３回洗浄し、その後６×１cmのカラム中に充填し
た。カラムを５０mMのＮＨ4 ＨＣＯ3 ５０mlで平衡にし
た。酵母上澄み液１１００mlに９６％エタノール５５ml
を添加し、混合物をカラムに一夜適用した（流速７０ml
／ｈ）。
【００９７】カラムを０．５Ｍ ＮａＣｌ１０ml及びＨ
2 Ｏ１０mlで洗浄し、ペプチドを５０mMのＮＨ4 ＨＣＯ
3 ，６０％のＥｔＯＨで溶離した。溶離液（５ml）を真
空遠心分離により１．４mlに濃縮（エタノールを除去）
し、容量を２５mMのＨＥＰＥＳ緩衝液（pH＝７．４）で
１０mlに調節した。試料を抗インシュリン免疫吸収カラ
ム（ＡＩＳカラム）（２．５×４．５cm）に適用した。
このカラムは、適用前に５mlのＮａＦＡＭ−緩衝液〔ヘ
ディング（Ｈｅｄｉｎｇ，Ｌ．）、ダイアベートロジア
（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）８巻、２６０〜２６６
頁、１９７２年〕で４回、５mlの２５mM ＨＥＰＥＳ−
緩衝液で２回洗浄しておいた。
【００９８】適用後、カラムを室温で３０分放置し、そ
の後、２５mM ＨＥＰＥＳ−緩衝液４mlで１０回洗浄し
た。ペプチドを２０％のＨＡｃで溶離した。溶離液のpH
値をＮＨ4 ＯＨで７．０に調節し、プール液を真空回転
により５００μｌに濃縮した。前の工程からの試料を更
に、１０μウォータース・ミューボンダパック（Ｗａｔ
ｅｒｓ μＢｏｎｄａｐａｋ）Ｃ−１８カラム（３．９
×３００mm）上でＨＰＬＣ上で精製した。
【００９９】Ａ及びＢ緩衝液はそれぞれＨ2 Ｏ中の０．
１％ＴＦＡ及びＭｅＣＮ中の０．０７％ＴＦＡであっ
た。カラムを２５％のＢで平衡にし（流速：１．５ml／
分）、ペプチドを線勾配のＭｅＣＮ（１％／分）で溶離
し、２７６nmで検出した。各精製工程での収率を前記の
ラジオイムノアッセイによって測定し、第２表に精製を
まとめる。全収率は６８％であった。
【０１００】
【表２】
【０１０１】免疫反応性Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２
１）インシュリン材料を含む唯一つのピークがＨＰＬＣ
カラムから検出された。このピークからのペプチド材料
を単離し、アミノ酸配列分析に付した。配列分析は、ヘ
ウィック（Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．）らによってＪ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６巻、７９９０〜７９９７頁
（１９８１年）に記載されたようなガス相配列分析装置
〔アプライド・ビオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍ）４７０Ａ型〕を用いて実施した。配列分
析の結果から、発現産生物は３種のペプチドからなると
結論することができた：
【０１０２】 （Glu −Ala ）2 −Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリン ８９％ Glu −Ala ─Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリン ２％ Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリン ９％ ペプチドは、示した相対的量で存在した。
【０１０３】例８ 酵母菌株MT３７１（ＤＳＭ２９５８）におけるＢ（１−
２９）−Ａ（１−２１）インシュリンの発現 酵母菌株MT３７１（ＤＳＭ２９５８）を前記の例６に記
載したように増殖させ、この菌株からの上澄み液６６５
mlからの表現産生物を例７に記載したようにして単離し
た。全収率は、３９％に相当する５０nmolであった。ペ
プチド物質をＨＰＬＣカラムから単離し、例７に記載し
たように配列を分析した。配列分析の結果（Ｎ−末端か
ら１８個の基）から、ペプチドは均一なＢ（１−２９）
−Ａ（１−２１）インシュリンであると結論することが
できた。
【０１０４】これらの結果を例７で得られた結果と比較
することは、MFα１リーダーのＣ−末端からGlu-Ala-Gl
u-Ala 配列を除去することの当否を示す。例７から、酵
母ジペプチダーゼ酵素が、酵母細胞からインシュリン前
駆物質を分泌する前にＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）
インシュリンからGlu-Ala 及びGlu-Ala-Glu-Ala を脱離
するのにあまり効率的に作用しないことが判る。
【０１０５】例９ 酵母菌株MT５１９（ＤＳＭ２９５９）におけるＢ（１−
２９）−Ａ（１−２１）インシュリンの発現 酵母菌株MT５１９（ＤＳＭ２９５９）を前記の例６に記
載したように増殖させ、上澄み液７０mlからの表現産生
物を例７に記載したようにして単離した。全収率は、５
７％に相当する１１６nmolであった。ペプチド物質を例
７に記載したように配列分析した。
【０１０６】Ｎ−末端から確認された４２個の残基から
判断して、ペプチドは均一なＢ（１−２９）−Ａ（１−
２１）インシュリンであった。約５nmolのペプチドをベ
ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）１２１Ｍ型アミノ酸分析装
置で分析した。下記のアミノ酸組成が認められた：
【０１０７】
【表３】
【０１０８】例１０ Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）を発現す
る酵母プラスミドpMT ６１０の構成 pMT ３４２（例３参照）からの４．３kb EcoRＶ−Xba
Ｉ及び３．３kb EcoRＩ−EcoRＶ断片をpM２１５（例３
参照）からの０．６kb EcoRＩ−Xba Ｉ断片に結合させ
た。得られたプラスミドpMT ４６２は挿入MFα１リーダ
ー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala ）−Ｂ−Ｃ−Ａを保有す
る。
【０１０９】Ｂ−Ｃ−Ａをコードする断片をＢ（１−２
９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）をコードする断片に
変えるため、変形部位特異性突然変異操作〔Ｋ．ノリス
（Ｎｏｒｒｉｓ）らの前掲文献〕を使用した。pMT ４６
２をコードするMFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-
Ala ）−Ｂ−Ｃ−Ａからの０．６kb EcoRＩ−Xba Ｉ断
片をXba Ｉ−EcoRＩで切断したM13 mp10 RF ファージ中
に挿入した。
【０１１０】前記のEcoRＩ−Xba Ｉ挿入部を含む１本鎖
Ｍ１３ファージを３０−マー d（TTCACAATGCCCTTAGCGGC
CTTGGGTGTG）プライマー（ＫＦＮ１５）（配列番号：
６）及び “ユニバーサル”１５−マーＭ１３プライマ
ー d（TCCCAGTCACGACGT ）（例１参照）（配列番号：
７）とともにインキュベートし、９０℃で５分加熱し、
アニールするため、徐々に室温に冷却した。次に、ｄ−
ＮＴＰ−ミックス、クレナウポリメラーゼ及びＴ４リガ
ーゼを添加することによって部分的に２本鎖のＤＮＡを
作った。
【０１１１】フェノールで抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、再懸濁した後、ＤＮＡを制限酵素Apa Ｉ，Xba Ｉ及
びEcoRＩで切断した。更に、フェノールで抽出し、エタ
ノールで沈澱させ、再懸濁した後、ＤＮＡをEcoRＩ−Xb
a Ｉで切断したpUC １３に結合させた。結合混合物を
Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ｒ- ，ｍ+ ）菌株に形質
転換させ、プラスミドを多数の形質転換体から調製し
た。プラスミド調製物をEcoRＩ及びXba Ｉで切断し、
０．５及び０．６kbのところでバンドを示す調製物を
Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）に再形質転換させた。
【０１１２】再形質転換から０．５kb挿入部を有するpU
C １３だけを保有する形質転換体を選択した。このプラ
スミドpMT ５９８のEcoRＩ−Xba Ｉ挿入部の配列がMFα
１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala ）−Ｂ（１−２
９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）をコードすることを
マクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法で確認した。pMT ５９８からのXba Ｉ−EcoRＩ挿入部
は、pMT ５９８の０．５kb Xba Ｉ−EcoRＩ断片をｐＴ
５の５．５kb Xba Ｉ−EcoRＩ断片と結合させることに
よってＴＰＩプロモータ及びＴＰＩ停止剤を用いて得ら
れた。
【０１１３】挿入ＴＰＩP −MFα１リーダー−Ｂ−Ｃ−
Ａ−ＴＰＩT を保有するｐＴ５の構造を第８図に示す。
生ずるプラスミドpMT ６０１は挿入ＴＰＩP −MFα１リ
ーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala ）−Ｂ（１−２９）
−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）−ＴＰＩT をBamHＩ及び
部分的にSph Ｉで切断し、２．１kb断片をBamHＩ及びSp
h Ｉで切断したＣＰＯＴ中に挿入した。生ずるプラスミ
ドpMT ６１０を酵母の形質転換のため使用した。
【０１１４】例１１ Ｂ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）を発現する酵
母プラスミドpM T ６３９の構成 pMT ４６２（例１０参照）からのＢＣＡをコードする断
片を、例１０に記載した操作と同様にして２７−マー d
（TCCACAATGCCCTTAGACTTGGGTGTG ）プライマーＫＦＮ３
６（配列番号：８）と“ユニバーサル”１５−マーＭ１
３プライマーとの混合物での部位特異性突然変異によっ
てＢ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）に変えた。
【０１１５】クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼを
用いて補充し、Ｔ４リガーゼで結合した後、部分的に２
本鎖のＤＮＡをＡｐａＩ，EcoRＩ及びXba Ｉで消化し、
プラスミドｐＴ５からの５．５kb Xba Ｉ−EcoRＩ断片
と結合させる（例１０参照）。Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）に形質転換及び再形質転換した後、挿入MFα１リー
ダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala ）−Ｂ（１−２９）−
Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）を含むプラスミドpMT ６３
０を単離し、挿入部の配列を確認した。挿入ＴＰＩP −
MFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala ）−Ｂ（１
−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）−ＴＰＩT を含
むプラスミドpMT ６３９を得るため、例１０に記載した
ように更に操作した。pMT ６３９の構成を第９図に示
す。
【０１１６】例１２ 酵母菌株MT６２０におけるＢ（１−２９）−Ala-Ala-Ly
s-Ａ（１−２１）の発現 Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株MT５
０１（例５参照）を例５にpMT ４７９について記載した
ようにしてpMT ６１０で形質転換した。形質転換株コロ
ニーを３０℃で３日後に採取し、単離し、液体培養を開
始するため使用する。このような形質転換株MT６２０
（＝MT５０１／pMT ６１０）を更に特性決定するため選
択した。出願人はMT６２０を、１９８５年１月１６日に
ドイツ微生物寄託（ＤＳＭ）に寄託し、参照番号ＤＳＭ
３１９６を与えられた。
【０１１７】MT６２０をＹＰＤ培地上で増殖させた。２
Ｌのバッフル付きフラスコ中の２ｌの培養液を３０℃で
１５のＯＤ600 nmになるまで振盪した。遠心分離後、上
澄み液を更に分析のため除去した。ラジオイムノアッセ
イにより測定される表現レベルは１．２μmol ／Ｌであ
った。上澄み液８４０mlからの表現産生物を例７に記載
したようにして精製した（ＲＰ−１８カラム、抗インシ
ュリンセファロース及びＨＰＬＣ）。全収率は約１０％
に相当する１００nmolであった。
【０１１８】ペプチド物質をＨＰＬＣカラムから単離
し、例７に記載したようにして配列を決定した。３５エ
ドマン（Ｅｄｍａｎ）分解サイクル（ｄｅｇｒａｄａｔ
ｉｏｎｃｙｃｌｅ）を実施した（第４表）。配列決定の
結果から、Ｂ（１−２９）及びＡ（１−２１）鎖を分離
する３個のアミノ酸残基の鎖の位置を確認した（第４表
及び第５表参照）。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
【表５】
【０１２１】例１３ 酵母菌株MT６４３におけるＢ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ
（１−２１）の表現 Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株MT５０１
を例５にpMT ４７９について記載したようにしてpMT ６
３９で形質転換した。形質転換株MT６４３（＝MT５０１
／pMT ６３９）を更に特性決定するため選択した。出願
人はMT６４３を、１９８５年１月１６日にＤＳＭに寄託
し、参照番号ＤＳＭ ３１９７を与えられた。
【０１２２】MT６４３を例１２に記載したように増殖さ
せた。遠心分離後、上澄み液を更に分析のため除去し
た。ラジオイムノアッセイにより測定されるインシュリ
ン前駆物質の表現レベルは１．６μmol ／ｌであった。
MT６４３からの上澄み液からの表現産生物を例７に記載
したようにして単離した。ＨＰＬＣカラムから単離した
ペプチド物質を例７に記載したようにして配列分析に付
した。配列分析の結果から、Ｂ（１−２９）及びＡ（１
−２１）鎖を分離する２個のアミノ酸残基の鎖の位置を
確認した。
【０１２３】例１４ Thr （But ) −OBu t （Ｂ３０）ヒトインシュリンへの
Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）の変換 Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）２０mgを１０Ｍ酢酸
０．１mlに溶かした。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中
の１．５４Ｍ Thr （But ）−OBu t ０．２６mlを添加
した。混合物を１２℃に冷却した。０．０５Ｍ酢酸カル
シウム０．０３５mlに溶解したトリプシン２．８mgを添
加した。
【０１２４】１２℃で７２時間後、アセトン４mlを添加
して蛋白質を沈澱させ、遠心分離により単離し、真空中
で乾燥した。ここで、Thr （But ）−OBu （Ｂ３０）ヒ
トインシュリンへのＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）の
変換率は、ＨＰＬＣにより６４％であった。
【０１２５】例１５ Thr-OMe （Ｂ３０）ヒトインシュリンへのＢ（１−２
９）−Ａ（１−２１）の変換 Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）２０mgを１０Ｍ酢酸
０．１mlに溶かした。ジメチルスルホキシドとブタン−
１，４−ジオールとの１／１（ｖ／ｖ）混合物中の１．
５４Ｍ Thr-OMe ０．２６mlを添加した。水の０．０７
ml中のアクロモバクター・リチクス（Ａｃｈｒｏｍｏｂ
ａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ）からのリシルエンドペプ
チダーゼ（日本国大阪の和光純薬工業株式会社）１mgを
添加した。
【０１２６】２５℃で１２０時間後、アセトン４mlを添
加して蛋白質を沈澱させ、遠心分離により単離し、真空
中で乾燥した。Thr-OMe （Ｂ３０）ヒトインシュリンへ
のＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）の変換率は、ＨＰＬ
Ｃにより７５％であった。
【０１２７】例１６ Thr-OBu t （Ｂ３０）ヒトインシュリンへのＢ（１−２
９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）の変換 Ｂ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）２０mgを水中
の３４．３％酢酸（ｖ／ｖ）及び４２．２％Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド（ｖ／ｖ）の混合物０．１mlに溶か
した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のヒドロアセテ
ート塩として２Ｍ Thr-OBut ０．２mlを添加した。混
合物を１２℃に恒温保持した。０．０５Ｍ酢酸カルシウ
ム０．０５mlに溶解したトリプシン２mgを添加した。１
２℃で２４時間後、アセトン４mlを添加して蛋白質を沈
澱させ、遠心分離により単離し、真空中で乾燥した。Th
r-OBu t （Ｂ３０）ヒトインシュリンへのＢ（１−２
９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）の変換率は、ＨＰＬＣに
より８５％であった。
【０１２８】例１７ Thr-OBu t （Ｂ３０）ヒトインシュリンへのＢ（１−２
９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）の変換 Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）２０mgを
水中の３４．３％酢酸（ｖ／ｖ）及び４２．２％Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（ｖ／ｖ）の混合物０．１mlに
溶かした。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のヒドロア
セテート塩として２ＭのThr −OBu t ０．２mlを添加し
た。混合物を１２℃に恒温保持した。
【０１２９】０．０５Ｍ酢酸カルシウム０．０５ml中の
トリプシン２mgを添加した。１２℃で９６時間後、アセ
トン４mlを添加して蛋白質を沈澱させ、遠心分離により
単離し、真空中で乾燥した。Thr-OBu t （Ｂ３０）ヒト
インシュリンへのＢ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１
−２１）の変換率は、ＨＰＬＣにより８４％であった。
【０１３０】例１８ 種々のヒトインシュリンエステルからのヒトインシュリ
ンの製造 組成アセトン沈澱物中のヒトインシュリンエステルを、
メソッヅ・イン・ダイアベーテス・リサーチ（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）、１巻４０７〜４０８頁〔ラーナー（Ｊ．Ｌａｒｎ
ｅｒ）及びポール（Ｓ．Ｐｏｈｌ）編集、ジョーン・ウ
ィリィ・ソンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｓｏｎｓ）、
ニューヨーク、１９８４年発行〕に記載されているよう
にゲル濾過及びアニオン交換クロマトグラフィーによっ
て精製した。
【０１３１】この方法は、３種のヒトインシュリンエス
テルのいずれにも適用可能であった。ほぼ１００％の収
率でヒトインシュリンを生じる、種々のエステル基の分
解は、前掲文献の４０９頁に記載されているように、Th
r-OMe （Ｂ３０）ヒトインシュリンの加水分解並びにTh
r （But ）−OBu t （Ｂ３０）ヒトインシュリン及びTh
r-OBu t （Ｂ３０）ヒトインシュリンのトリフルオロ酢
酸によるアシドリシスによって実施した。
【０１３２】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CACACCCAAG ACTAAACAAG CTGAAGACTT GCAAAGAGGC ATTGTG 46
【０１３３】 配列番号：２ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 配列 Thr Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly 5 10 15 Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 20 25 30
【０１３４】 配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸
【０１３５】 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCCAGTCAC GACGT
【０１３６】 配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CACACCC AAG GGCATTGTG 19
【０１３７】 配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTCACAATGC CCTTAGCGGC CTTGGGTGTG
【０１３８】 配列番号：７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCCAGTCAC GACGT 15
【０１３９】 配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCACAATGC CCTTAGACTT GGGTGTG 27
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドpMT ３４４の製造工程図であ
る。
【図２】図２はプラスミドpMT ４７５の製造工程図であ
る。
【図３】図３はプラスミドpMT ２１２の製造工程図であ
る。
【図４】図４はプラスミドpMT ４７９の製造工程図であ
る。
【図５】図５はプラスミドpMT ３１９の製造工程図であ
る。
【図６】図６はプラスミドpMT ５９８の製造工程図であ
る。
【図７】図７はプラスミドpMT ６１０の製造工程図であ
る。
【図８】図８はプラスミドpT５の製造工程図である。
【図９】図９はプラスミドpMT ６３９の製造工程図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ニエルス フィール デンマーク国，ディーケー−2000 コペン ハーゲン エフ，フュグレバッケベュ ５ (72)発明者 グスタブ アンメラー アメリカ合衆国，ワシントン 98112，イ ースト シアトル，ボイヤー 2617 (72)発明者 モーゲンズ トリエル ハンセン デンマーク国，ディーケー−3650 オルス タイッケ，ビンケルベユ 21 (72)発明者 ラルス トヒム デンマーク国，ディーケー−2880 ゲント フテ，スキフテベイ 22 (72)発明者 キエルド ノルリス デンマーク国，ディーケー−3460 ビルケ ロード，エスケモセガルドサッレ 18 (72)発明者 ハンス オレ ボイグト デンマーク国，ディーケー−2800 リング ビ，フビデガルドスパルケン 36

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の一般式（Ｉ）： Ｂ（１−２９）−（Ｘｎ−Ｙ）ｍ−Ａ（１−２１）
    （Ｉ）〔式中Ｘｎはｎ個の天然アミノ酸残基を有するペ
    プチド鎖を表し、ＹはLys 又はArg を表し、ｎは０〜３
    ３の整数を表し、ｍは０又は１を表し、Ｂ（１−２９）
    はPhe B1からLys B29 までのヒトインシュリンの短縮さ
    れたＢ−鎖を表し、Ａ（１−２１）はヒトインシュリン
    のＡ鎖を表すが、ペプチド鎖−Ｘｎ−Ｙ−は２個の隣接
    する塩基性アミノ酸残基を含まないものとする〕を有す
    るペプチド鎖を含むインシュリン前駆体の製造方法にお
    いて、前記前駆体をコードするＤＮＡを含んで成る、酵
    母中で複製可能な発現ベクターを含む形質転換体酵母菌
    株を適当な栄養培地中で培養し、次いでインシュリン前
    駆物質を回収することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 酵母菌株ＤＳＭ２９５７又はインシュリ
    ン前駆物質を産生するその変異株若しくは突然変異株を
    適当な栄養培地中で培養し、次いでインシュリン前駆物
    質を回収する、請求項１に記載の式：Ｂ（１−２９）−
    Ａ（１−２１）のインシュリン前駆物質の製造方法。
  3. 【請求項３】 酵母菌株ＤＳＭ２９５８又はインシュリ
    ン前駆物質を産生するその変異株若しくは突然変異株を
    適当な栄養培地中で培養し、次いでインシュリン前駆物
    質を回収する、請求項１に記載の式：Ｂ（１−２９）−
    Ａ（１−２１）のインシュリン前駆物質の製造方法。
  4. 【請求項４】 酵母菌株ＤＳＭ２９５９又はインシュリ
    ン前駆物質を産生するその変異株若しくは突然変異株を
    適当な栄養培地中で培養し、次いでインシュリン前駆物
    質を回収する、請求項１に記載の式：Ｂ（１−２９）−
    Ａ（１−２１）のインシュリン前駆物質の製造方法。
  5. 【請求項５】 酵母菌株ＤＳＭ３１９６又はインシュリ
    ン前駆物質を産生するその変異株若しくは突然変異株を
    適当な栄養培地中で培養し、次いでインシュリン前駆物
    質を回収する、請求項１に記載の式：Ｂ（１−２９）−
    Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）のインシュリン前駆物質の
    製造方法。
  6. 【請求項６】 酵母菌株ＤＳＭ３１９７又はインシュリ
    ン前駆物質を産生するその変異株若しくは突然変異株を
    適当な栄養培地中で培養し、次いでインシュリン前駆物
    質を回収する、請求項１に記載の式：Ｂ（１−２９）−
    Ｓｅｒ−ＬｙｓＡ（１−２１）のインシュリン前駆物質
    の製造方法。
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