JPH0448431B2 - - Google Patents

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JPH0448431B2
JPH0448431B2 JP61220983A JP22098386A JPH0448431B2 JP H0448431 B2 JPH0448431 B2 JP H0448431B2 JP 61220983 A JP61220983 A JP 61220983A JP 22098386 A JP22098386 A JP 22098386A JP H0448431 B2 JPH0448431 B2 JP H0448431B2
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JP
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met
gly
ser
aminopeptidase
ala
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JP61220983A
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JPS62115281A (ja
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Bennbasato Earii
Chan Shin
Aran Booaa Kiisu
Chan Shennyun
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Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Original Assignee
Cetus Corp
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Publication date
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Publication of JPH0448431B2 publication Critical patent/JPH0448431B2/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換え技法を用いて、Ｎ−末端のメ
チオニンを欠失するタンパク質、特に外来性タン
パク質の細菌系における製造に関する。さらに詳
しくは、それは、インビトロで使用され又はこれ
らのシステムにおいて成熟タンパク質の完全なプ
ロセシングのために高いレベルのペプチダーゼを
含む卓越した細菌宿主を製造するために使用され
得る。Ｎ−末端のメチオニンに対して特異的なペ
プチダーゼに関する。
〔従来の技術〕
細菌宿主での外来性タンパク質の製造は、現在
十分に確立されている。比較的に標準の方法にお
いては、目的とするタンパク質をコードする遺伝
子配列が、宿主生来の又は宿主と適合する調節配
列の制御下に配置され、そして宿主細菌中に形質
転換される。一般的に、これを達成できる３つの
主な方法が存在する： (1) 目的とするタンパク質をコードするDNAが、
細菌の調節配列の制御下ですでに細菌の遺伝子
と読み枠を合わせて融合され、“融合タンパク
質”を得ることができ； (2) 目的とするコード配列が、分泌タンパク質を
もたらす作用可能なリーダー配列と読み枠を合
わせて触合され；又は (3) 目的とするコード配列が、“直接的な”発現
をもたらすATG開始コドンのすぐ下流に配置
され、“成熟”タンパク質を得ることができる。
この最後の場合においては、成熟タンパク質は
分泌されないが、しかししばしば封入体として
細胞内域に見出される。
ATG−先行のコード配列の直接的な発現によ
つて形成される成熟タンパク質が、ATGの翻訳
生成物であるＮ−末端のメチオニンを担持するこ
とは、言明されていないが、しかし当業者によつ
ては良く認識されている。特定の組換え体タンパ
ク質及びその生成の状況に依存して、このＮ−末
端のMet残基を除くことが多少、細胞内でプロセ
シングされるが、しかし、一般的にほんのいくら
かであり、そして普通、生成された組換え体タン
パク質の実質的な部分は、この所望としない外来
性残基を担持する。その存在は完全無害である。
この得られるタンパク質が治療上、使用される場
合、通常、受容体に対する自己由来のタンパク質
〔たとえば、ヒトに投与されるようなヒト成長ホ
ルモン（hGH）〕であろうものが、該受容体に対
してよく知られていないペプチド配列を含んでい
る。その結果は予想できる。免疫反応は、そのよ
く知られていない配列に対して生まれることがで
き、そして治療上重要なペプチドが、今、免疫原
になる。
外来性タンパク質の他に、成熟した生来のタン
パク質及び他の属又は種からの細菌性タンパク質
もまた、しばしば、不完全にプロセシングされ
る。この現象の例は、E.コリのアスパラギン酸ト
ランスカルバミラーゼ（Ｒ−鎖）、E.コリのトリ
プトフアンシンテターゼＡプロテイン及びE.コリ
のバクテリオフアージT4リゾチームを含む
（Fasman、G.O.、Ed.、CRC Handbook of
Biochemistry＆Molecular Biology、：303〜
313）。
他の人は、Ｎ−末端のメチオニンを分解するた
めに及びＮ−末端の“Met欠失性ペプチド又はタ
ンパク質を生成するために種々の方法で試みて来
た。Baxter（アメリカ特許第4350764号）は、交
互の切断部位を保護した後、前駆体タンパク質を
切断するためにプロテアーゼトリプシンによる処
置をインビトロで行なう。融合タンパク質もまた
合成され、ここで、目的とするコード配列が
ATGによつて先行され、従つてCNBrによつて
切断できる“内部”メチオニンをその融合体中に
提供する。これは、余分な製造段階を含むのみな
らず、またタンパク質又はペプチドがその残存す
る配列中のいずれのメチオニン残基で切断される
という一層重大な欠点を有する。ジエネンテツク
により1984年12月５日に出版されたEPO出願第
127305号は、得られるhGHの分泌をもたらすた
めにある細胞宿主中において明らかに作用する生
来のhGHリーダーペプチドを含むコード配列を
用いることによつてMet欠失性のhGHの生成を
開示する。Gilbert（アメリカ特許第4338397号）
は、多分、Ｎ−末端のMet欠失性のβ−グロビン
の分泌をもたらすためにペニシリナーゼのリーダ
ー配列を用いている。同じ譲受人に譲渡され、そ
してこの開示を引用によりこの明細書中に組み込
まれた、1986年３月25日に出願された、日本特許
出願第64995／86は、いくらかの（但しすべてで
はない）組換え体ペプチドの分泌をもたらすため
に、細菌のホスホリパーゼＡ（pho Ａ）について
のリーダー配列の使用を開示する。
前記の解決法は、その問題に対する普遍的な解
決を提供しない。Ｎ−末端のMet欠失性形で特定
の組換え体タンパク質を産生するための必要性に
直面している当業者は、産生されるべき特定のペ
プチドのために適切な方法を、可能性あるレパー
トリーから選択する必要がある。下記の発明の方
法は、もう１つのパターンの適応性を提供するた
めにこのレパートリーを広げる。
〔発明の開示〕
本発明は、細菌的に産生された組換え体タンパ
ク質又は他のタンパク質からＮ−末端のメチオニ
ン残基のプロセシングを保証するための便利な酵
素を提供する。また、別の段階を要しないでイン
ビボで目的とするプロセシングをもたらすため
に、組換え宿主生物の遺伝子操作を可能にする、
この酵素をコードするDNAが提供される。従つ
て、本発明のペプチダーゼ酵素の有効性が、治療
的に使用される場合、免疫原性を減じている組換
え体タンパク質の細胞宿主において産生を可能に
する。
１つの観点においては、本発明は、あるタンパ
ク質配列からＮ−末端のメチオニン残基を切断す
るペプチダーゼ、すなわち、メチオニンアミノペ
プチダーゼ又はＮ−末端エキソペプチダーゼに関
する。その酵素はこの明細書でMet−アミノペプ
チダーゼとして言及されるであろう。そのMet−
アミノペプチダーゼ酵素は、定義された特異性の
活性（下を参照のこと）を有し、そして第２図に
示されているアミノ酸配列のタンパク質に対して
生成された抗体と免疫沈澱するタンパク質を含
む。そのMet−アミノペプチダーゼ酵素はさら
に、この活性を有し、そしてそれは、推定される
アミノ酸配列をコードする、第２図に配列される
DNAに対して、特定の条件下でハイブリツド形
成するDNAによつてコードされているタンパク
質を含む。本発明はまた、第２図に示されている
アミノ酸配列のタンパク質と免疫反応性の抗体に
関し、そして脊椎動物中にこのタンパク質を注入
することによつて高められた抗体を含む。
他の観点においては、本発明は、Met−アミノ
ペプチダーゼをコードする組換え体DNA配列、
この配列を担持するプラスミド及びこれらのプラ
スミドにより形質転換された微生物宿主、並びに
本発明の物質を用いて、細胞宿主又はインビトロ
でＮ−末端のMet欠失性の組換え体タンパク質を
産生するための方法に関する。さらにもう１つの
観点においては、本発明は、一般的にペプチダー
ゼ−欠失（但し、Met−アミノペプチダーゼ欠失
ではない）の形質転換宿主（ここで該形質転換体
はそれ自体のゲノムの一部を導入している）をス
クリーニングすることを含んで成る、高いMet−
アミノペプチダーゼ活性を有する細菌株を得るた
めの方法に関する。
〔発明を実施するための態様〕
Ａ 定義 本明細書に使用される場合、“Met−アミノ
ペプチダーゼ”はペプチド配列からＮ−末端の
メチオニン残基を特異的に切断し、そして内部
のメチオニン残基又はメチオニンよりも他のＮ
−末端残基で切断しない酵素に関する。本発明
のMet−アミノペプチダーゼは、位置２を占め
る残基及び基質タンパク質又はペプチドの二次
又は三次構造に依存して、特定のペプチド配列
に対して特異的であるように思える。この事に
関する酵素の正確な特異性は、無数の基質をほ
とんど試験しないでは測定され得ない；しかし
ながら、大ざつぱなやり方が、Sherman、F.、
など、Bic.Essays（1985）３：27〜31によつて
示されている。Shermanなどは、Met−アミノ
ペプチダーゼの特異性についての彼らの考え
を、酵母からのイソ−１−チトクローム−Ｃの
突然変異体の観察形及び82の成熟の細胞内タン
パク質の公開された一次配列に置いた。彼ら
は、メチオニンは普通、1.29Å又はそれよりも
小さならせん状の半径を有する側鎖を含む残基
から切断されるが、しかし一般的に、1.43Åよ
りも大きならせん状の半径を有する残基からは
切断されないと推定する。原核及び真核系から
の他の公開されたタンパク質の配列を考慮して
得られた、突然変異的に変えられたイソ−１−
チトクローム−Ｃは、Ｎ−末端のメチオニンが
アラニン、システイン、グリシン、プロリン、
セリン、トレオニン又はバリンの残基を先行す
るがしかし、それがアラギニン、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン
酸、イソロイシン、ロイシン、リシン又はメチ
オニンの残基を先行しない場合、Ｎ−末端のメ
チオニンが切断されることを示し、そしてこの
事は観察と一致する。これらの結果は、一般的
に、下の例示に示されている結果と一致する。
しかしながら、第２アミノ酸についてのらせん
状の半径が1.29Åより大きく、そして第二及び
第三構造体又は他の条件が特に好ましい場合、
いくつかの例外が存在する。従つて、この特異
性の観点は、一般的なガイドラインとして意図
され、そして本発明を例示するために使用され
るアミノペプチターゼの特異性さえ正確に測定
されないことが心に留められるべきであり、す
なわち、すべての可能な第三構造体は必ずしも
試験されていない。従つて、“Met−アミノペ
プチダーゼ”の定義内に存在するためには、内
部のメチオニン残基の切断及びいずれかのペプ
チドからメチオニン以外のＮ−末端残基の切断
を伴わないでＮ−末端のメチオニンの特異的な
切断の必要条件を満たすのみの酵素が必要であ
る。
本発明の好ましいMet−アミノペプチダーゼ
は、第１図に示されているものに実質的に等し
いＮ−末端のアミノ酸配列及び第２図に例示さ
れているDNAによつてコードされているもの
に実質的に等しい全アミノ酸配列を有する。
“実質的に等しい”とは、たとえ小さな変化が
アミノ酸配列に存在したとしても、タンパク質
が第二及び第三構造体又はその次のアミノ酸残
基に関して、同じ根本的な特異性を基本的に有
する特定のペプチド配列又はタンパク質配列か
らＮ−末端のメチオニン残基を特異的に切断す
ることにおいて同じ活性を保持することを意味
する。少しも活性を変えない、配列中の１又は
複数のアミノ酸の変化、交換、付加又は欠失
は、この定義から特定のタンパク質を除外しな
い。
たとえば、保存性アミノ酸置換、たとえば位
置45，59，78，126又は245で１又は複数のシス
テインの代りにセリン又はアラニンの置換は、
Met−アミノペプチダーゼ活性を保持すること
ができるペプチドをもたらす。さらに、ロイシ
ン、イソロイシン及びバリン残基の互換性が存
在することができる。また、Ｎ−末端で始めの
７個のアミノ酸までを欠失することができ、そ
してアミノ酸228で始まるペプチドの下流領域
の部分は、活性のために必須でない。
もちろん、さらにMet−アミノペプチダーゼ
の中形性及び塩形、並びに付加の非タンパク質
成分、たとえばグリコシル化、脂質酸基又はア
セチル化を含む形が含まれる。
“ペプチダーゼ欠失”の菌株は、Met−アミ
ノペプチダーゼよりも他の少なくとも４個のペ
プチダーゼ（該ペプチダーゼは通常、野生型に
見出される）を欠いている菌株とみなす。
この明細書に使用される”Ｎ−末端のMet欠
失性”タンパク質は、Ｎ−末端のメチオンを欠
いているが、しかしその一次構造においてどこ
かよそにメチオニン残基を含むかも知れないタ
ンパク質と言及する。そのタンパク質のための
コード配列は、読み枠において、すぐ先行する
TAG開始コドンを有するであろう。“Ｎ−末端
のMet欠失性は、この状態をとりまく条件がく
り返して与えられる必要がないように、便利な
速記語として使用される。特に、”Ｎ−末端の
Met欠失性”は、タンパク質配列中に必ずしも
メチオニン残基が必要でなく、最初にＮ−末端
のメチオニンの可能性を持たないタンパク質、
たとえば融合タンパク質として又は分泌される
タンパク質として産生されるタンパク質を含む
ことも意図されないことを、本発明において意
味する。従つて、本明細書に使用されるような
“Ｎ−末端のMet欠失性タンパク質”は、DNA
配列によつてコードされているタンパク質とし
て見なされ、ここで該成熟タンパク質は、読み
枠のATG開始コドンによつてすぐ先行され、
そしてCNBr、トリプシン又は他の試薬によつ
て実質的に切断されるべき融合体の一部でな
い。組換え体タンパク質の場合、その構成体
は、明らかに記されていて；生来の又は天然に
組換られたDNA配列のための構成体は、容易
に定義され得ない。
“Met−先行のタンパク質”は、特定の成熟
タンパク質に通常、見出される第１アミノ酸を
すぐ先行するＮ−末端のメチオニン残基を含む
タンパク質である。
“細胞”、“細胞培養物”、”宿主細胞”及び同
様のものは、組換え体DNA操作のための主細
胞として見なされる。本文から明らかであるよ
うに、これらの細胞は、組換え技法に従つて、
新規DNA配列の形質転換のための候補者であ
ることができる。細胞によるDNA取り込みの
ために適切な技法は、インビトロでの形質転換
を含む。しかしながら、他の技法、たとえばト
ランスダクシヨン又は接合もまた使用され得
る。その定義はさらに、直接的に関連する細胞
の子孫を含む。そのような子孫は、それらの親
とDNA含有において、正確に同一でないが、
しかしたとえば突然の又は意図的な突然変異に
よる修飾が、それらの親によつて示される性質
に幾分か類似する方法で、導入されたDNAに
よつて与えられる性質を示すように細胞の能力
を破壊しない限り、そのような子孫は定義に含
まれることが理解される。
Ｂ 一般的な説明 本発明は、Met−アミノペプチダーゼの使用
によつて、細菌宿主中にＮ−末端のMet欠失性
の組換え体タンパク質の産生を達成する。最も
好ましい態様においては、そのMet−アミノペ
プチダーゼは、高レベルでその場で生成され、
そして細胞宿主中においてインビボで組換え体
又は他のタンパク質を処理する。しかしなが
ら、宿主細胞から目的とする組換え体又は他の
タンパク質を単離又は抽出し、そして細胞源か
ら独立して得られるMet−アミノペプチダーゼ
によりインビトロで該抽出物を処理することが
また可能である。
Met−アミノペプチダーゼそれ自体に関し
て、この酵素は生成され、そしてそれをコード
するDNAは、E.コリ株をスクリーニングする
ことで容易に回収され、そしてこれは、一般的
に、それら自体のゲノム中にコードされている
Met−アミノペプチダーゼの増強された産生に
ついて不完全なペプチダーゼである。この方法
において、Met−アミノペプチダーゼをコード
する、プラスミドに担持され、且つ増幅された
DNA源を得、そして次に、その酵素がそれら
の細胞から直接的に調製され、そして精製され
得る。さらに、このプラスミドDNA及び目的
とする組換え体タンパク質のための発現ベクタ
ーを含む組換え体宿主の同時−形質転換が、Ｎ
−末端のMet欠失性形の組換え体タンパク質の
産生を、その場でもたらす。
通常、野生型の細菌中に見出される多数のペ
プチダーゼを欠いている多数のE.コリ株が知ら
れている。たとえば、Miller、C.G.、など、J.
Bacteriol.（1978）135：603〜611は、ペプチダ
ーゼ欠失である多数の細菌株を開示する。これ
らの菌株の１つ、すなわちCM89（これは、ペ
プチダーゼＮ、ペプチダーゼＡ、ペプチダーゼ
Ｂ、ペプチダーゼＤ及びペプチダーゼＱを欠い
ている）が下の例示に使用された。しかしなが
ら、細菌株の他のペプチダーゼ欠失の突然変異
体も同じように使用され得た。
多分、これらの菌株のゲノムは、Met−アミ
ノペプチダーゼ活性をコードする配列をまだ含
み、そして従つて、そのゲノムDNAが、適切
な制限酵素により消化されそして担体ベクター
中にそのフラグメントをクローニングすること
によつてライブラリイを構成するために使用さ
れる。pUCシリーズ及びpBR322を含む、種々
のそのような担体ベクターが使用できる。次
に、所望により、プラスミドDNAは、プラス
ミドDNAの単離及びスクリーニングのために
ペプチダーゼ欠失の菌株中への形質転換の前
に、いずれか便利な野生型宿主を用いて増幅さ
れ得る。
次に、形質転換されたペプチダーゼ欠失の細
菌は、適切な基質を切断するためのそれらの能
力のために、粗抽出物を検定することによつ
て、目的とするMet−アミノペプチダーゼの産
生についてスクリーンされる。次に、高レベル
のMet−アミノペプチダーゼを示す菌株は、組
換え体タンパク質のための発現ベクターによる
同時−形質転換のために、この酵素源として、
又はプラスミドDNA源として便利に使用され
る。
さらに、この菌株からのプラスミドDNAを
使用し、適切なMet−アミノペプチダーゼをコ
ードする配列のために野生型細菌のゲノムをプ
ローブすることができる。適切な方法は、特に
下に記載されているハイブリツド形成条件の特
徴のものである。これらの特定条件は、使用さ
れる必要はないが、しかしそれらは相同する必
要条件を有する。もちろん、これらの回収され
た配列はまた、それら自信のプロモーターの制
御下で又は当業界に知られている他のプロモー
ター、たとえばtrpプロモーター又はペニシリ
ナーゼプロモーターを用いて、発現され得る。
本発明で産生されるMet−アミノペプチダー
ゼタンパク質を精製し、そしてその精製された
タンパク質及び適切な免疫方法を用いて抗体を
得ることができる。その精製は、細胞を破壊
し、そして溶菌を含む上清液から酵素を単離す
ることによつて行なわれる。この単離は、タン
パク質が吸着され、次に適切な緩衝液による溶
出を含む条件下で、陰イオン交換樹脂による処
置を含む。適切な陰イオン交換樹脂は、種々の
炭化水素支持体に接合されているDEAEを含
む。当業界で良く知られている、他の陰イオン
交換樹脂もまた使用され得る。
ウサギ、ラツト又は他の哺乳類中で精製され
たタンパク質に応じて生まれる抗体は、種々の
微生物からのMet−アミノペプチダーゼタンパ
ク質を同定することに有用である。
多数の組換え体タンパク質は、本発明の方法
を用いて、Ｎ−末端のメチオニンを含まない成
熟タンパク質として生成するための候補者であ
る。たとえば、リンフオカイン、たとえばIL
−２、IL−１；α−及びγ−インターフエロ
ン（β−インターフエロンは通常、その成熟形
中Ｎ−末端のメチオニンを含む）；腫瘍壊死因
子；及びリンパ系に関連する他のタンパク質が
産生される。また種々のホルモン、たとえば成
長ホルモン、インシユリン、ACTH、エンド
ルフイン及び他のペプチドホルモンが組換え体
により産生され得る。組換え体産生のための他
の候補者は、酵素、たとえば組織プラスミノー
ゲン活性化因子、ウロキナーゼ及び工業的用途
に有用な酵素、たとえばアルコールデヒドロゲ
ナーゼを含む。他のタンパク質は、毒素、たと
えばジフテリア及びリシン毒素及び種々の因
子、たとえば上皮成長因子及び形質転換成長因
子を含む。前記のものは、単に典型的なもので
あり、そしていつたんその遺伝子が得られた
後、大体、目的とするタンパク質が、すぐ上流
のATG開始コドンに読み枠を整合してそれに
結合し、そして必要な制御配列を提供すること
によつて成熟タンパク質として発現され得る。
本発明の方法は、これらのタンパク質のすべて
が、Ｎ−末端のメチオニンを含まないで便利に
産生されることを可能にする。
上に述べたように、Met−アミノペプチダー
ゼは、２つの一般的な方法で使用され得る。た
とえば、酵素は、プラスミド担持のDNAから
比較的多量に酵素を産生する特定の細胞から単
離され、そしてインビトロの反応混合物に添加
し、Ｎ−末端のメチオニンプロセシングをもた
らし、又はインビポプロセシングを可能にする
ために、Met−アミノペプチダーゼをコードす
るプラスミドを、組換え体細菌宿主中に目的と
するタンパク質のための発現ベクターと一緒に
同時形質転換することができる。
インビトロアプローチにおいては、精製され
たMet−アミノペプチダーゼを、プロセシング
されていないタンパク質、適切な塩及び緩衝液
を含む反応混合物に添加する。その反応混合物
を、約30℃の温度で一晩インキユベートし、そ
のプロセシングを可能にする。その酵素はコバ
ルトイオンを必要とする。典型的な反応混合物
は、約１mg／mlの基質タンパク質、PH＝７〜８
のリン酸緩衝液中、約80μｇ／mlの酵素及び約
0.2ｍＭのコバルトイオンを含むことができる。
もちろん、前記の典型的な混合物は単に例示的
であり、そしてその成分の濃度は、基質の性質
及び使用される時間及び温度の条件に依存して
連続的に変化することができる。完全なプロセ
シングは、切り離されるメチオリン残基の量を
測定し、プロセシングされた及びプロセシング
されていないタンパク質をSDS PAGE上その
移動度を比較し、又は混合物中に含まれる基質
材料を配列決定することによつて確かめられ得
る。
インビボアプローチにおいてはプラスミド
DNAを、Met−アミノペプチダーゼ源の菌株
から単離し、そしてそれを用いて、すでに含む
又はタンパク質のための発現系を含むために付
随的に又は続いて形質転換される細胞を形質転
換する。細菌性酵素のための細菌源に用いられ
る場合、プロセシングされていない基質を、微
生物によつて通常、生成されるタンパク質の補
体の一部として産生することができる。より一
般的には、その場で生成されるペプチダーゼを
用いて、組換え体により生成されたタンパク質
をプロセシングし、そしてその細胞は、形質転
換されるある点で、目的とするタンパク質のた
めの発現系を含むべきである。
Ｃ 標準的な技法 細菌の形質転換のための標準的な方法、マー
カーを用いての好結果をもたらす形質転換体の
選択、プラスミドベクターの製造及び遺伝子又
はcDNAバンクのスクリーニングが技術的に良
く理解されている。便宜上、下に示されている
例において特に有用な方法の選択がここに示さ
れる。ほとんどそのような方法、又は他の可能
な方法が、Maniatis、など、Molecular
Cloning−Ａ Laboratory Manual（1982）、
Cold Spring Harbor Pressに見出される。
C.1 宿主及び制御配列 Met−アミノペプチダーゼを担持するベク
ターによる同時形質転換のために適切な細胞
及びタンパク質のための発現系は細菌であ
る。最も頻繁に使用される宿主は、種々のE.
コリ株である。しかしながら、他の細菌株、
たとえばバチルス（たとえば枯草菌）、種々
のプソイドモナス又は他の細菌株もまた使用
され得る。そのような原核系においては、宿
主と適合できる種に由来する複製部位及び制
御配列を含むプラスミドベクターが使用され
る。たとえば、E.コリは、Bolivar、など、
Gene（1977）２：95によるE.コリ種に由来す
るプラスミド、すなわちpBR322の誘導体を
用いて典型的には形質転換される。pBR322
は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性
のための遺伝子を含み、そして従つて、目的
とするベクターを構成することにおいて、保
持され又は破壊され得る付加マーカーを提供
する。転写開始のためのプロモーター、場合
によつてはオペレーター及びリボゾーム結合
部位配列を含むようにこの明細書で定義され
ている、通常使用される原核生物の制御配列
は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及
びラクトース（lac）プロモーター系
〔Chang、など、Nature（1977）198：1056〕
及びトリプトフアン（trp）プロモーター系
〔Goeddel、などNucleic Acids Res.（1980）
８：4057〕並びにλ由来のPLプロモーター
のような通常用いられる。プロモーター及び
Ｎ−遺伝子のリボゾーム結合部位
〔Shimatake、など、Nature（1981）292：
128〕を含み、そしてこのカセツトは、1984
年２月８日出願された同時係属出願第578133
号に示されている。しかしながら、原核生物
と適合する、いずれか有効なプロモーター系
が使用され得る。
C.2 形質転換 Cohen、S.N.、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1972）69：2110によつて記載され
ているような塩化カルシウムを用いるカルシ
ウム処理方又はMariatis、など、（前記）に
記載しているRbCl2法を用いて、細胞を形質
転換する。
C.3 ベクター構成 目的とするコード配列及び制御配列を含む
適切なベクターの構成は、当業界において良
く理解されている標準の連結及び制限技法を
用いる。単離されたプラスミド、DNA配列
又は合成されたオリゴヌクレオチドを、目的
とする形に切断し、合わせ、そして再連結す
る。
部位特異的なDNA切断を、当業界におい
て一般的に理解されている条件及び商業的に
入手可能な制限酵素の製造業者によつて記さ
れている詳報下で適切な制限酵素（又は複数
の制限酵素）により処理することによつて行
なう。たとえばNew England Biolads、
Product Catalogを参照のこと。一般的に、
約1μｇのプラスミド又はDNA配列を、約
20μの緩衝溶液中１ユニツトの酵素によつ
て切断し；本明細書での例においては、典型
的には過剰の制限酵素を用いて、DNA基質
の完全な消化を確実にする。変動は寛大に見
られ得るが、約37℃で約１〜２時間のインキ
ユベーシヨン時間が用いられる。おのおのの
インキユベーシヨンの後、フエノール／クロ
ロホルムによる抽出によつてタンパク質を取
り除き、そしてその後エーテル抽出を行な
い、そしてエタノールによる沈澱、次に
Sephadex Ｇ−50スピンカラムを通すことに
よる水性面から核酸を回収する。所望によ
り、切断されたフラグメントのサイズ分離
を、標準技法を用いてポリアクリルアミドゲ
ル又はアガロースゲル電気泳動によつて行な
うことができる。一般的なサイズ分離の説明
は、Methods in Enzymology（1980）65：
499〜560に見出される。
制限することにより切断されたフラグメン
トを、50ｍＭのTris（PH＝7.6）、50ｍＭの
NaCl、６ｍＭのMgCl2、６ｍＭのDTT及び
５〜10μMのdNTP中において20〜25℃で約
15〜25分間のインキユベーシヨン時間を用い
て、４種のデオキシヌクレオチド トリホス
フエート（dNTP）の存在下でE.コリの
DNAポリマラーゼＩの大フラグメント
（Klenow）により処理することによつて平
滑末端にすることができる。たとえ４種の
dNTPが存在しても、Klenowフラグメント
は5′付着端でフイルインし、そして突出する
3′の単一鎖をチユバツクスする。所望によ
り、選択的な修復を、付着端の性質によつて
受ける範囲内でたつた１つ又は選択された
dNTPを供給することによつて行なうことが
できる。Klenowによる処理の後、その混合
物を、フエノール／クロロホルムにより抽出
し、そしてエタノールによる沈澱せしめた
後、Sephadex Ｇ−50スピンカラムを通す。
S1ヌクレアーゼによる適切な条件下での処
理は、単一鎖部分の加水分解をもたらす。
Matteucci、など、J.Am.Chem.Soc.
（1981）103：3185のトリエステル法又は商業
的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成
機を用いて、合成オリゴヌクレオチドを調製
する。アニ−リングの前又はラベリングのた
めの単一鎖のキナーゼ処理を、50ｍＭの
Tris（PH＝7.6）、10ｍＭのMgCl2、５ｍＭの
ジチオトレイトール、１〜２ｍＭのATP、
1.7pモルのγ32P−ATP（2.9ｍCi／ｍモル）、
0.1ｍＭのスペルミジン及び0.1ｍＭのEDTA
の存在下において0.1nモルの基質に対してお
よそ10ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて達成する。
次の標準条件及び温度：20ｍＭのTris−
Cl（PH＝7.5）、10ｍＭのMgCl2、10ｍＭの
DTT、33μｇ／mlのBSA、10ｍＭ〜50ｍＭ
のNaCl及び14℃で40μMのATP、0.01〜0.02
（Weiss）ユニツトのT4のDNAリガーゼ
（“付着端”の連結のための）又は14℃で１ｍ
ＭのATP、0.3〜0.6（Weiss）のユニツトの
T4のDNAリガーゼ（“平滑端”の連結のた
めの）のいずれか下で、連結を15〜30μの
体積で行なう。分子間の“付着端”連結は、
普通、合計のDNA濃度のml当り33〜100μｇ
（５〜100nMの合計最終濃度）で行なわれ
る。分子間の平滑端連結（普通10〜30倍のモ
ル過剰のリンカーを用いる）を、1μMの合
計最終濃度で行なう。
“ベクターフラグメント”を用いるベクタ
ー構成においては、5′のリン酸を取り除き、
そしてベクターの再連結を妨げるために、細
菌性アルカリホスフアターゼ（BAP）によ
りベクターフラグメントを通常、処理する。
BAPによる消化は、ベクターのμｇ当り約
１ユニツトのBAPを用いて60℃で約１時間、
Na+及びMg2+の存在下でおよそ150ｍＭの
Trip（PH＝８）中において行なわれる。核酸
フラグメントを回収するために、調製物をフ
エノール／クロロホルムにより抽出し、そし
てエタノールにより沈澱せしめ、そして
SephadexG−50スピンカラムに適用するこ
とによつて脱塩化する。他方、所望としない
フラグメントの追加の制限酵素による消化に
よつて二重消化されているベクターにおい
て、再連結を妨げることができる。
配列の修飾を必要とする。cDNA又はゲノ
ムDNAに由来するベクターの部分のために、
部位特異的プライマーにより指図された突然
変異誘発を、Zoller、M.J.、など、Nucleic
Acids Res.（1982）10：6487〜6500の方法に
従つて用いる。これは、突然変異誘発される
べき（但し、ミスマツチングを限定する）単
一鎖のフアージのDNAに相補的なプライマ
ー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ
る。手短に言えば、合成オリゴヌクレオチド
は、そのフアージに相補的な鎖の合成を指示
するプライマーとして用いられ、そしてその
得られる二重鎖DNAは、フアージ支持の宿
主細菌に形質転換される。形質転換された細
菌の培養物をカンテン上にプレートし、フア
ージを含む単一の細胞からプラーク形成を可
能にする。
理論上、新プラークの50％が、単一鎖とし
て突然変異形を有するフアージを含み；他の
50％が元の配列を有するであろう。得られる
プラークは、正確なマツチのハイブリツド形
成を可能にする温度で、キナーゼ処理された
合成プライマーによりハイブリツド形成され
るが、しかしここで、元の鎖とのミスマツチ
は、十分にハイブリツド形成を妨げる。次
に、そのプローブと共にハイブリツド形成す
るプラークを得、培養し、そしてそのDNA
を回収する。部位特異的な突然変異方法は下
の特定の例に詳しく説明される。
C.4 構成の確認 プラスミド構成のための正しい連結を、E.
コリGenetic Stock Center、CGSC＃6135か
ら得られたE.コリ株MM294又はその連結混
合物を有する他の適切な宿主をまず形質転換
することによつて確かめる。好結果をもたら
す形質転換体を、当業界に知られているよう
なアンピシリン、テトラサイクリン又は他の
抗生物質耐性により又はプラスミド抗生の態
様に依存して他のマーカーを用いることによ
つて選択する。次に、その形質転換体からの
プラスミドを、Clewell、D.B.、など、Proc.
Natl.Acad.Sic.（USA）（1969）62：1159の
方法、場合によつては続いて、クロラムフエ
ニコール増幅〔Clewell、D.B.、J.Bacteriol.
（1972）110：667〕に従つて調製する。その
単離されたDNAを制限処理によつて分析し、
そして／又はSanger、F.、など、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）（1977）74：5463、
さらにMessing、など、Nucleic Acids Res.
（1981）９：309又はMaxam、など、
Methods in Enzymology（1980）65：499の
ジデオキシ法によつて配列決定する。
C.5 本発明でクローニング及び発現に使用され
る宿主株は次の通りである： ローニング及び配列決定のためには、及び
ほとんどの細菌プロモーターの制御下で構成
体の発現のためには、E.コリ株MM294（前
記）を宿主として使用したTalmadge、K.、
など、Gene（1980）12：235；Meselson、
M.、など、Nature（1968）217：1110。PL
NRBSプロモーターの制御下での発現のために
は、E.コリ株K12MC1000λ溶原菌、
N7N53cI857SusP80、ATCC39531（この後、
時々MC1000−39531として言及する）を用
いる。挿入体の存在を確かめるために、その
挿入体の領域における主鎖ベクターの特徴を
相足する菌株を使用する。たとえば、pUC
シリーズのためには、挿入体の不在下でメー
ゲル支持倍地上で青色のコロニイー及び挿入
体の存在下で白色のコロニイーを生成するE.
コリ株DG99を用いる。
Ｄ 例 次の例は本発明を例示するものであつて、限
定するものではない。
D.1 プラスミドMet−アミノペプタダーゼをコ
ードするDNA源の製造 Silhavy、T.J.、など、Expriments with
Gere Fusions（1984）、Cold Spring Haibor
Laboratory、New York、137〜139の方法
によつて、E.コリ株CM89（前記）から染色
体DNAを抽出し、そして10ｍＭのTris及び
１ｍＭのEDTA（TE）緩衝液（PH＝8.0）中
に保存した。そのDNAを、0.1U／μｇ及び
0.2U／μｇで１時間37℃でSau3AIにより消
化した。反応を停止し、そしてエタノールに
よる沈澱せしめた後、一部消化されたDNA
をプールし、そしてBeckmann SW28ロー
ターを用いて26000rpmで24時間、15℃で10
〜40％のスクロースグラジエント上で画分し
た。４〜8kbのフラグメントを含む画分をプ
ールし、DE52カラム上で精製し、溶離剤か
らエタノールにより沈澱し、そしてTE緩衝
液中に保存した。
次に、染色体DNAの4μｇ部分を、BamHI
により消化された、BAP処理されたpUC18
ベクターフラグメント0.5μｇと共に連結し
た。その連結混合物を用いて、E.コリDG99
を形質転換し、そしてラクトース指示器プレ
ート上に置き、プラスミド中に挿入体の存在
を確めた。更に、形質転換体のおよそ94％が
およそ4kbのDNA挿入体を含んだ。
従つて、18μの連結混合物を用いて、
AmpRに対してE.コリMM294を形質転換し、
その遺伝子ライブラリイを得た。好結果をも
たらす形質転換体を得、そしてそれを用い
て、プラスミドDNA調製のためにアンピシ
リン含有の培養基700mlに接種した。
上のC.4.〔Clewll、D.B.、Proc.Nati.Acad.
Sci.（USA）（1969）〕に記載しているように
して、プラスミドDNAを細胞から得、そし
てそれを用いてE.コリCM89を形質転換し
た。AmpRに対して選択された、好結果の形
質転換体を、スクリーニングのためにマイク
ロタイタートレイ中に置き、そしておよよ
1000コロニイをスクリーンした。
2XのＬ−Broth（DIFCO）＋１％のNaCl、
10％のカサミノ酸及び10Xの酵母窒素塩基の
それぞれを５％ｖ／ｖで補足された最小培地
（たとえばアメリカ特許第4518584号を参照の
こと、そしてこの開示を引用によりこの明細
書中に組み入れる）200μ中に、単一のコ
ロニイーを取つた。37℃で１晩、増殖した
後、細胞を0.1MのTris−HCl（PH＝7.4）で２
度洗浄した。その細胞を、同じ緩衝液中１
mg／mlのリゾチーム溶液20μを添加するこ
とによつて細胞溶解し、次に凍結融解を３度
くり返した。次に、72μｇのMet−Gly−Met
−Met、36μｇのＬ−アミノ酸オキシダーゼ、
４〜5μｇのホースラデイシユ ペルオキシ
ダーゼ、及び18μｇのＯ−ジアニシジン ジ
ヒドロクロリドを含む、0.1Mリン酸カリウ
ム緩衝液（KPO4）（PH＝7.4）＋0.2ｍMCoCl2
の溶液180μを、おのおのウエルに添加
し；Met−アミペプチダーゼ含有の細胞溶解
物において、色の形成は明らかであつた。ス
クリーンされたおよそ1000のコロニイーのう
ち10のコロニイーが、Met−Gly−Met−
MetからMetを放す速度を上昇することを示
し、そしてさらに、同じ条件下でLeu−Gly
−GlyからLeuを放すことができないものに
ついてスクリーンした。１つの好結果をもた
らすコロニイーを、pSYC1174と名づけた。
E.コリのpSYC1174を、1985年８月27日、
American Type Culture Collectionに寄託
し、そして寄託番号53245を得た。
D.2 Met−アミノペプチダーゼをコードする配
列の回収 pSYC1174を有するE.コリ株（又18E7と名
づけられた）は、上に記載しているようにし
て一般的に行なわれた、Met−Gly−Met−
Met基質介在のイン ビトロ検定において、
およそ100倍の高い活性を与えた。
プラスミドDNAを、菌株18E7から単離
し、そしてMet−アミノペプチダーゼをコー
ドするプラスミドpSYC1174を単離した。
pSYC1174はBamHI部位で、pUC18ベクタ
ー中の3.2kbの挿入体を担持した。1.2kbのフ
ラグメントを、EcoRI／ClaIによる消化によ
つて該挿入体の5′末端から切り出し、そして
pUC18及びpUC19中に挿入し：pSYC1174
を、ClaIにより消化し、Klenowにより平滑
にし、そして次にEcoRIにより消化し、
1.2kbのEcoRI／平滑フラグメントを切り出
した。このフラグメントを、EcoRI／Sma
Ｉにより消化されたpUC18又はpUC19中に
挿入し、そしてこれは宿主プラスミド上で
lacプロモーターに対して反対の方向をもた
らす。CM89中にトランスフエクトされる場
合、得られるベクターpSYC1187及び
pSYC1188の両者は、pSYC1174によつて示
されるレベルに匹敵するアミノペプチダーゼ
生成のレベルを示した。これらの結果は、
Met−アミノペプチダーゼの遺伝子及びその
プロモーターの両者が1.2kbのフラグメント
内に位置していることを示す。
第２図は、ジデオキシ配列決定によつて決
定された1.2kbのフラグメントの完全なヌク
レオチド配列を示す。ATGから開始する読
み取り枠（open reading frame）は、位置
219〜1010であり、そして29333の計算分子量
を有する264個のアミノ酸の推定タンパク質
をコードする。推定される最初の64個のアミ
ノ酸は、下のD.3に記載されているような精
製タンパク質のアミノ酸配列決定法を用いて
得られるアミノ酸に対応する。この読み取り
枠に関連する２つの並んだプロモーターの位
置がまた示され、そしてP1及びP2としてラ
ベルされている。（左のカラムの数字はヌク
レオチドを示し、右のカラムの数字はアミノ
酸を示す。） 上の1.2kbのフラグメントを、サザン法に
よつてE.コリのゲノミDNAをプローブする
ために使用し、そしてそれぞれPstI、Eco
RI及びBssHによる消化によつて生成され
た3.6、5.2及び1.35kbのバンドに対してハイ
ブリツド形成し（但し、染色体の他の領域に
対してはハイブリツド形成しない）、従つて、
その遺伝子は、E.コリ中において単純複写と
して存在することを示す。その遺伝子の3′末
端での配列の測定はまた、Met−アミノペプ
チダーゼから下流に同時転写された遺伝子が
たぶん存在しないという結論を導びく。5′末
端での配列の測定は、並列のプロモーターの
存在を示す。
推定されるアミノ酸配列１〜264（又はその
補体）をコードする、第２図に示されるヌク
レオチド配列は、一般的に、追加のMet−ア
ミノペプチダーゼをコードする配列のために
細菌性ゲノムDNAをプローブするのに有用
である。従つて、この挿入体は、たとえばバ
シラス サブチリス、プソイドモナス又は酵
母からこの目的とするDNAを得るための便
利な道具である。ハイブリツド形成に関連す
る適切な方法は、６×SSC、0.01Mの
EDTA、５×Denhardts、0.5％のSDSを含
む緩衝液中において、65℃で反応を完結する
のに十分な時間反応せしめ、次に65℃で３×
SSCにより洗浄することである。すなわち、
これらの条件下で上のニツクトランスレーシ
ヨンされたプローブに対してハイブリツド形
成し、そして本明細書に定義されているよう
なMet−アミノペプチダーゼ活性を有するタ
ンパク質をコードするDNAが、本発明内に
含まれ、そして本発明内のMet−アミノペプ
チダーゼ タンパク質をコードする。
D.3 E.コリのpSYC1174からのMet−アミノペ
プチダーゼの特徴 Met−アミノペプチダーゼを、E.コリの
pSYC1174の粗抽出物から精製し、そしてそ
の精製されたタンパク質を、種々のペプチド
基質を用いてアミノ酸を放す能力について分
析した。
精製のためには、Brain Heat Infusionブ
イヨン中でのE.コリのpSYC1174の一晩の培
養物を、0.2ｍＭのCoCl2を含むKPO4緩衝液
（20ｍＭ、PH＝7.4）で２度洗浄し、そして音
波処理した。PMSF（0.1ｍＭ）を、その音波
処理物に添加した。その音波処理物を、遠心
分離し、そしてその上清液を、DEAE−セフ
アロース フアースト フローに通した。酵
素を、同じ緩衝液中、Naclグラジエント
（０〜0.25M）により溶離した。Met−アミ
ノペプチダーゼ活性を有する画分をプール
し、分子量30000のCentriconフイルターを用
いて濃縮し、そして同じ緩衝液＋１ｍＭのメ
チオニンを含むＳ−200セフアクリルカラム
を通した。活性画分をプールし、そして前の
ようにして濃縮した。
サブユニツトの分子量が、SDS PAGE
（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）に
よつておよそ32000であることが測定され
〔Laemmli、J.Mol.Biol.（1973）80：575〜
599〕そして酵素純度は95％であることが推
定された。従つて、そのタンパク質は、264
のアミノ酸のタンパク質についてこのおよそ
の予定サイズである。染色されたゲルのデン
シナメーターに基づく量の推定値は、Met−
アミノペプチダーゼが約15〜20％の細胞タン
パク質であることを示した。
Ｎ−末端の配列決定を、精製されたペプチ
ダーゼに対して行なつた。初めの65個のアミ
ノ酸についての結果は第１表に与えられてい
る。
変形されたＬ−アミノ酸オキシダーゼ−
HRP−ODAD検定を用いて、一般的には、
上に記載しているように及びTLC法によつ
て、精製されたMet−アミノペプチダーゼが
種々のペプチド基質からアミノ酸を放す能力
について分析された。初めにふれた検定のた
めには、タンパク質溶液（この場合、細胞溶
解物）10μを、４ｍＭのMet−Gly−Met−
Met、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液（PH＝
7.5及び0.2ｍＭのCoCl2を含む基質溶液90μ
中に添加した。その反応混合物を含むチユー
ブを、30℃で10分間インキユベートし、そし
て熱湯槽中に２分間、そのチユーブを置くこ
とによつて、その反応を停止せしめた。0.9
mlの発色混合物〔Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ
0.2mg、ホースラデイツシユ ペルオキシダ
ーゼ0.03mg及びＯ−ジアニヂン ジヒドロク
ロリド0.2mgを含む0.1MのTris−HCl（PH＝
7.4）〕を添加した後、そのチユーブを、30℃
で30〜60分間インキユベートし、そしてその
光学密度を440nｍで読取つた。
TLC法は、ｎ−ブタノール−酢酸−水
（120：50：30v／ｖ）溶媒混合物を含むシリ
カゲルプレートを使用した。ニンヒドリン試
薬によりそのプレートをスプレーした後、放
出されたアミノ酸を検出し、そして同定し
た。
メチオニンは、次のペプチドから放され
た： Met−Ala−Met； Met−Gly−Met−Met； Met−Gly−Met； Met−Als−Ser； Met−Gly−Gly； Met−Ala−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−
Thr−Lvs−Lys−Thr−Gln−Leu；及び Met−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−
Lys−Lys−Gln−Leu−Cys. アミノ酸は、次のペプチドからは放されな
かつた： Met−Phe−Gly； Met−Phe−Ala−Gly； Met−Leu−Phe； Met−Met−Met： Leu−Leu−Leu； Leu−Gly−Gly； Met−Ala； Leu−Gly； Leu−Ala−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−
Thr−Lys−Lys−Thr−Gln−Leu； Ｎ−ホルミル−Met−Met−Met； Met−Phe； Met−Ser； Val−Gly−Gly； Thr−Gly−Gly； Trp−Gly−Gly； Phe−Gly−Gly； Met−Glu−His−Phe−Arg−Try−
Gly； Met−Lys−Arg−Pro−Pro−Gly−Phe
−Ser−Pro−Phe−Arg； Gly−（Gly）3−Gly； Phe−Gly−Gly； Ser−Ser−Ser； Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys−
Lys−Gln−Leu−Cys； Ala−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−
Lys−Lys−Gln−Leu； Thr−Val−Leu； Arg−Gly−Gly； Ala−（Ala）2−Ala； Ala−Ala−Ala； Glu−Gly−Phe； Leu−Leu−Leu； Tyr−Gly−Gly； Ile−Gly−Gly； Met−Arg−Pheアセテート． そのペプチダーゼ活性は、１ｍＭの
EDTAによつて完全に抑制され、そして最
大の活性のためには、約１〜200ｍＭのリン
酸イオン及び0.02〜2.0ｍＭのCo+2を要する。
Co+2を、Mn+2、Cu+2、Zn+2又はMg+2イ
オンと取り替えることはできなかつた。リン
酸カリウム緩衝液の代りにTrisが用いられ
る場合、その活性はまた、激しく減少する
が、しかしこの活性は、ナトリウム又はカリ
ウム塩の添加によつてもとに戻され得る。
前記結果から、ペプチダーゼは、Ｎ−末端
のメチオニンのみを切断し、そして他の特異
的必要条件もまた有することが明らかであ
る。配列中の第２及び第３アミノ酸の性質
は、重要であるように思え、そしてペプチド
中に最小の３個のアミノ酸が必要とされるよ
うに思える。しかしながら、短鎖ペプチドに
基づく結果は、大きなタンパク質の折りたた
みが、残基２及び３に関しての特異性を変え
る二次及び三次構造を提供することができる
場合、続くアミノ酸のための必要条件の点か
ら完全に決定的であることができない。さら
に、その特異性は、条件に依存し、そして使
用される特定の条件下で加水分解を受けてい
ないペプチドは、もしその条件が変えられる
なら、まだ加水分解され得る。
第二残基が1.29Åよりも小さならせん半径
を有する側鎖を持つ場合、一般的にMet−ア
ミノペプチダーゼがＮ−末端のメチオニンを
切断し、そしてその側鎖のサイズが1.43Åよ
りも大きな場合、一般的に切断が起こらない
であろうと思われるが、下記に記載されてい
るリシンＡにおいて著しい例外が存在し、こ
こでIle、すなわち第二アミノ酸についての
らせん半径が1.56Åである。従つて、隣接す
るアミノ酸の影響及び基質の二次及び三次構
造がまた、その特異性に対して影響を及ぼす
ように思える。
さらに、上のようにしてpSYC1174から精
製されたMet−アミノペプチダーゼを、標準
の方法及びアジユバントを用いてウサギに注
入し、Met−アミノペプチダーゼと特異的に
反応する抗血清を得た。
D.4 Ｎ−末端のMet欠失性IL−２の製造 pSYC1143を担持するE.コリMM294、す
なわち、trpプロモーターの制御下で、成熟
タンパク質中においてＮ−末端配列：Ala−
Pro−Thr−Serを有する組換え体IL−２ム
テインのための発現ベクターを、E.コリ
pSYC1174から調製されたプラスミドDNA
（pSYC1174と名づけられた）と共に形質転
換した。目的とする両プラスミドの存在を示
す。好結果をもたらす形質転換体を、AmpR
及びTetRによつて選択した。
両プラスミドを含む細胞を、トリプトフア
ン50mg／、カサミノ酸５ｇ／、アンピシ
リン50mg／及びテトラサイクリン５mg／
を含む最小培地中で１晩37℃で増殖した。次
に、その培養物を洗浄し、IL−２合成を抑
制解除するためにトリプトフアンを含まない
同じ培地中に再懸濁し、そして37℃で４時間
インキユベートした。
このようにして産生されたIL−２は、細
胞内のＲ体中に含まれる。そのＲ体を、くり
返し音波処理することによつて精製し、８ｍ
ＭのEDTAにより洗浄し、そして最後に５
％SDS中に再懸濁した。そのIL−２を、
Vydac C4逆相カラム及び0.1％トリフルオロ
酢酸中アセトニトリルに対する水のグラジエ
ントを用いるHPLCによつてさらに精製し
た。その精製されたIL−２のためのＮ−末
端配列を決定し、そしてその配列は次の混合
物を示した： Met−Ala−Pro− ０〜５％ Ala−Pro− 25〜30％ Pro− 70〜75％ 上のようにして増殖され、そして誘導され
た対照培養物（但し、pSYC1143のみを含
む）は、生成されたIL−２を与え、ここで
その精製されたタンパク質は、70％のMet−
Ala−Pro及び30％のAla−Proの組成物を有
する。
〔pSYC1143は、trpプロモーター及びcry
位置の正のレトロレギユレーター配列の制御
下でIL−２配列を含む。それはpFC51.T
（0.95kbのEcoRIフラグメントとしてこの発
現系を含み）及びpACYC184（CmRマーカー
を担持するpUC18と適合する宿主ベクター
である）から製造される。その発現系は、
pFC51.TのEcoRI消化物として製造され、そ
してEcoRIにより消化されたpACYC184に連
結され、pSYC1143を得る。pFC513Tは、
1985年８月31日に出願された日本特許第
190976／85号に広く記載され、そしてこの開
示を引用によりこの明細書中に組み入れる。〕 D.5 Met−IL−２のインビトロプロセシング 精製されたMet−アミノペプチダーゼをま
た用いて、精製されたIL−２をインビトロ
でプロセシングした。その反応混合物は、
0.05％SDS中、上で調製された1.7mg／mlの
IL−２を含む原液50μ；0.2ｍＭのCoCl2を
含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH＝7.5）
40μ；及び８mg／mlのE.コリpSYC1174か
ら精製されたMet−アミノペプチダーゼの
１：10希釈溶液10μを含んだ。その反応混
合物を、30℃で１晩インキユベートし、そし
てプロセシングの度合は、SDS PAGE及び
Ｎ−末端の配列決定を用いて査定した。第３
図は、未反応のIL−２及び酵素の存在にお
けるIL−２に対して行なわれたSDS PAGE
の結果を示す。インキユベーシヨンの後、わ
ずかに低い分子量のタンパク質の存在が、元
のMet−先行のタンパク質によつて示される
バンドを補充する。酵素処理の前、その精製
されたIL−２のためのＮ−末端配列は、74
％のMet−Ala−Pro及び26％のAla−Proで
あり；酵素処理の後、それは94％Ala−Pro
及び６％のMet−Ala−Proであつた。
D.6 リシンＡの発現ベクターの構成 phoAプロモーター、リーダー配列及び該
リーダー配列のＣ−末端でNar部位を提供
するように変性されたコード配列、次にB.
スリンジエンシス（B.thuringientsis）の正
のレトロレギユレーターを含む、リシンＡ配
列のための宿主ベクター、すなわち
pSYC1089を次のようにして構成した。
pSYC997：Nar部位を含むように変性
されたPhoAプロモーター及びリーダー プラスミドpEG247、すなわちHind／
Xhoフラグメントとして2.6kbのphoA構造
遺伝子を含む25kbのプラスミドを、phoA遺
伝子の源として使用した。このプラスミドを
M.Casadabanから得、そしてGroisman、E.
A.、など、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）
1984）81：1840〜1843に示さている方法に類
似する方法により構成した。更に、前記の文
献に示されている方法を適用することによつ
て、phoA遺伝子を、いずれかの目的とする
主力ベクター中に便利にクローンすることが
できる。
pEG247からのHind／Xhoによる
2.6kbフラグメントを、精製し、そして
pUC18中にクローンした。この2.7kbプラス
ミドは、アンピシリン耐性マーカー及び目的
とする配列の便利な挿入を可能にするポリリ
ンカーを含む。pUC18をHind／Salによ
り消化し、そしてその線状ベクターを、単離
されたphoAフラグメントと連結した。その
連結混合物を用いて、E.コリJM103又は
JM105、に匹敵する株のE.コリDG99を
AmpRに対して形質転換し、そしてpUC18中
への挿入体についてスクリーンされた、好結
果をもたらす形質転換体における中間のプラ
スミドpSYC999の構成を確めた。
目的とするNar変性を含むpSYC997を、
特定部位の突然変異誘発によつてpSYC991
から製造した。Pvu／Pvuによる770個
の塩基対フラグメントを、pSYC991から得
た。それはphoAプローモーター及び成熱の
アルカリ性ホスフアターゼの上流のＮ−末端
配列の部分、及び従つて、完全なリーダー配
列もまた含む。このフラグメントを、
M13mp11のSma部位に連結し、そして単
鎖フアージを、突然変異誘発のための鋳型と
して調製した。この突然変異誘発において
は、次の合成の26−mer、 5′−TTCTGGTGTC
TTTGTCACAG−3′ （上に書いた線はNar部位を示す）は、プ
ライマー及びプローブとして使用された。次
に、突然異常誘発されたフアージ粒子を用い
て、Nar部位を含む、目的とするリーダー
配列のための源としてRF−DNAを調製し
た。
pSYC1015：CmRマーカーのパツクボーン
ベクター クロラムフエニコール耐性を提供する
pSYC1015、レプリコン及びphoA遺伝子に
おける適切な制限部位をまたpSYC991から
構成する。まずpSYC991を、Hind／
BamHにより消化し、そしてphoA遺伝子
を含むおよそ2.6kbのフラグメントを精製し、
そしてHind／BamHにより消化された
pACYC184からの、精製された3.65kbのベク
ターフラグメントと連結した。pACYC184
はATCCから入手可能であり、そしてクロラ
ムフエニコール遺伝子（CmR）、細菌性レプ
リコン及びテトラサイクリン耐性遺伝子にお
けるHind及びBamH部位を含む。その
連結混合物を用いてCmRに対するE.コリ
MM294を形質転換し、そしてpSYC1015の
構成を、制限分析及び配列決定によつて確め
た。
付加phoA−含有の中間体 ２つの付加中間体プラスミド、pSYC1052
及びpSYC1078が、B.スリンジエンシスの正
のレトロレギユレーターのための適切な宿主
ベクターを提供するために構成された。
変性されたリーダーpSYC997からのphoA
プロモーター及びNar部位を含む、精製さ
れた小さなHind／BasHフラグメント
を、Hind／BasHにおり消化された
pSAC1015（従つて、これは変性されていな
い欠失したphoA配列を有する）に結するこ
とによつてpSAC1052を構成した。この得ら
れるベクターpSYC1052を、CmRに対するE.
コリ形失転換体において確認した。
pSYC1078は、欠失されたphoAプロモー
ターの前にBamH部位を有するpSYC1052
の変性された形である。このBamH部位
を削除するために、pSYC1052を、部分的な
BamH消化にゆだね、４個のdNTPの存
在下でDNAポリマラーゼ（Klenow）を
用いてフイルインし、そして平滑末端条件下
で再連結した。phoA遺伝子のちようど3′で
唯一のBamH部位を含む、この目的とす
る得られたプラスミドを、好結果をもたらす
CmR形質転換体をスクリーニングした後、確
認した。
pHCW701：レトロレギユレーターの源 上流のコード配列の発現を促進するため
に、B.スリンジエンシスからの結晶タンパ
ク質をコードする遺伝子（Cry遺伝子）の
3′配列の能力は、1984年８月31日に出願され
たアメリカ同時系属出願第646584号に記載さ
れ、そして特許請求されていて、そしてこの
開示を引用によりこの明細書中に組み入れ
た。要約すれば、これらの配列は、約43％の
シトシン−グアニン残基含有物を有するステ
ム及びループ構造を形成することができる、
対応するRNA転写するDNA配列によつて特
徴づけられている。遺伝子の3′末端からの約
30〜300のヌクレオチドを連結する場合、正
のレトロレギユレーター効果がその遺伝子発
現上に示される。その正のレトロレギユレー
ターは、400bpのEcoR／BamH制限フ
ラグメントとして製造され、そしてそれは平
滑末端化され、そしてpLW1、すなわちイン
ターロイキン−２のための発現ベクター中に
連結された。
〔pLW1は、E.コリ中で効果的なレプリコ
ン、TetR遺伝子、E.コリのtrpプロモーター、
リポゾーム結合フラグメント及び706bpの
Hind／PatDNAフラグメント（ヒトIL
−２のための遺伝子を含む）を含む
pRBR322誘導体である。pLW1は、ブダペ
スト条約下でATCCに寄託され、そして寄託
番号第39405号を得る。〕 Klenow及び２個のdNTPによりcry遺伝
子の正のレトロレギユレーターを含む400bp
のEcoR／BamHフラグメントを平滑端
末化し、そしてT4リガーゼを用いてStuに
より消化されたプラスミドpLW1中にその平
滑端末化されたフラグメントを連結すること
によつてpHCW701を完成した。制限処理分
析によつて容易に区別でき、挿入体の２つの
可能な方向を得ることができる。pHCW701
と名付けられた目的とするプラスミドは、
IL−２遺伝子の3′末端の近くに、再構成され
たBamH部位を有する。このプラスミド
は、ブダペスト条約下でATCCに寄託され、
そして寄託番号39757号を得る。
pSYC1089の完結化 pSYC1089を完結化するために、
pHCW701をEcoRにより消化し、Klenow
及び４個のdNTPを用いてフイルインし、次
にBamHにより消化し、そして正のレト
ロレギユレーターを含む400bpのフラグメン
トを回収した。pSYC1078をAvaにより消
化し、Klenow及び４個のdNTPによりフイ
ルインし、そして次にBamHにより消化
した。その連結混合物を、E.コリMM294中
に形質転換し、そして目的とするプラスミド
pSYC1089、すなわちCmRを与える5.5kbの
プラスミドを確認した。pSYC1089は、
phoAプロモーターのための配列及びリーダ
ー（Nar部位を有する）配列並びにBamH
部位のすぐ上流に構造遺伝子、次にcry遺
伝子の正のレトロレギユレーター配列を含
む。
リシンＡ リシンＡのコード配列を、pRA123から、
より詳しくは、pRAT1の構成を通して、下
記のpRA123のM13サブクローンから得た。
pRA123は1984年８月17日にATCCに寄託さ
れ、そして寄託番号第39799号を得た。
pRA123からのpRAT1の構成は、1984年９
月20日に出願されたアメリカ特許第653515号
に広く記載され、そしてその開示を引用によ
りこの明細書に組み入れた。要約すれば、完
全なリシンＡのコード配列（第４図を参照の
こと）を含むpRA123を変性し、アミノ酸
265の後の正しい位置に終止コドン及び成熟
配列のすぐ先の位置に開始コドンを有する
Hind／BamHカセツトとしてこの配列
を提供する。pRA12、をBamHにより消
化し、およそ896bpのBamH／BamHフ
ラグメントを単離し、そしてM13ベクターに
おけるlacプロモーターに関してアンチ−セ
ンス方向においてM13mp18中にサブクロー
ンした。そのフアージの単離DNAを、プラ
イマーとして、次の配列： 5′−
CACAGTTTTAATTGCTTATAAGG−
3′、 （ここで、リシンＡ鎖のＣ−末端のser−gln
−phe配列の末端で正しく読み枠を合せて
TAA終止コドンを配置し）、次に、次の配
列： 5′−
CTTTCACATTAGAGAAGCTTATGAT
ＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣ−3′、 （ここで、リシンＡのＮ−末端のile−phe−
pro−lys配列のすぐ上流に目的とするHind
／ATG開始コドンの２回対称軸を配置し
ている）を用いて２段階のプライマー指図の
突然変異誘発にゆだねた。プローブとして適
切な上プライマーを用いておのおの当然変異
誘発の後、変性されたフアージを同定した。
次に、目的とする構成体を、Hind及び
BamHにより二重消化し、そして適切な
リジンＡをコードするフラグメントを単離し
た。Hind／BamHにより消化された
pTRP3とHind／BamHフラグメントと
の連結によりpRAT1を完結した。pTRP3
は、下流のHind部位と共にtrpプロモータ
ーを含む、pBR322基礎のベクターであり；
pTRPは1984年12月18日にATCCに寄託さ
れ、そして寄託番号第39946号を得た。
pRAT1から完全に由来したコード配列を
用いて、pRAP229を構成した。それは、(1)
順に、B.スリンギエンシス−正のレトロレ
ギユレーター配列、クロラムフエニコール耐
性マーカー、適合可能なレプリコン及び
phoAプロモーター及びリーダー配列を提供
する、Nar／BamHレプリコン含有の
pSYC1089のフラグメント；(2)適切に終結さ
れたリシンＡのＣ−末端部分をコードする
500bpフラグメントを提供する。Cla／
BamHにより消化されたpRAT1；及び(3)
pRAT1からのおよそ350bpのCla／Cla
フラグメントによつて提供されるようなＮ−
末端配列の３通りの連結によつて得られた。
リシンＡ配列はまた、pRAT1からのCla
（一部）／BamHにより切断されたフラグ
メントとして製造され得る（そして好ましく
は製造され得る）ことが明らかである。
その得られる融合体は、(1)イソロイシン残
基を先行するリシンＡ鎖の開始コドンを保持
し；(2)7bpづつ及び従つて、リーダー配列に
対する読み枠から分離され；(3)トリペプチド
のIle−Ser−LeuによつてphoAリーダを延長
し；そして(4)リシンＡの開始コドンを有する
フレームの外にあるが但し、すぐ近くの
TGAコドンでリーダー配列の終結を可能に
する。pRAP229は1985年３月８日にATCC
に寄託され、そして寄託番号第53408号を得
る。
D.7 E.コリにおけるリシンＡの製造及びプロセ
シング E.コリMM294を、pRAP229のみにより形
質転換し、又は、pRAP229及びpSYC1174に
より同時形質転換した。その形質転換培養物
を、Michaelis、など、J.Bact.（1983）154：
356〜365に記載されている条件に類似する条
件下で増殖せしめた。外因性リン酸塩濃度を
低め、そしてその培養物を16〜17時間維持す
ることによつて、その細胞を誘発する。
その細胞を収穫し、そして界面活性剤の不
在中で音波処理によつて調製された全細胞抽
出物を、天然のリシンＡに対するウサギ抗血
清を用いるウエスターン法を用いて発現につ
いて検定した。Ｎ−末端のメチル化を検定す
るために、そのリシンＡを精製し、そして定
量分析のためにエドマン分解にゆだねた。そ
の細胞を、pRAP229により形質転換する場
合、リシンＡの40％がＮ−末端のメチオニン
を含んだ、同時形質転換された細胞は、メチ
ル化された鎖の９％のみを有するリシンＡを
産生した。
D.8 Met−リシンＡのイン ビトロ プロ
セシング pRAP229により形質転換された細胞溶解
物から精製されたリシンＡ（600μｇ）を、0.2
ｍＭの塩化コバルト及び0.1ｍＭのリン酸カ
リウム緩衝液（PH＝7.5）（0.3mlの合計体積
を有する）中におちえ、E.コリpSYC1174か
ら精製されたMet−アミノペプチダーゼ24μ
ｇと共に混合した。その反応混合物を30℃で
１晩インキユベートし、そして熱湯槽中で加
熱することによつて停止した。その反応混合
物を脱塩化した後、Ｎ−末端配列をエドマン
分解によつて決定した。Met−アミノペプチ
ダーゼを含まない対照混合物は、Ｎ−末端の
メチオニンを有するリシンＡの40％を示し、
その同じ画面は、上に記載されているよう
に、細胞溶解物中に通常見出された。Met−
アミノペプチダーゼ酵素を含む反応混合物
は、タンパク質の８％のみがＮ−末端のメチ
オニンを含んでいるリシンＡを含み、そして
pRAP229／pSYC1174により形質転換された
細胞から得られる画分と実質的に同じであつ
た。
1985年８月27日、E.コリ株pSYC1174を、
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関す
るブタペスト条約及びそれに基づく規則（ブ
ダペスト条約）に基づいてAmerican Type
Calture Cellectonに寄託し、ATCC番号
53245を得た。これは寄託の日から30年間保
証される。微生物はブダペスト条約の元で、
そして適切なアメリカ特許の発行後には無制
限の入手可能性を保証する出願人とACCCの
間の契約に基づいて、寄託された菌株は
ATCCにより入手可能にされるであろう。特
許法に従つて、いずれかの政府の権威下で与
えられた権利に反してこの発明を実施する許
諾であると解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のMet−アミノペプチダーゼ
のタンパク質から決定されたＮ−末端のアミノ酸
配列を示す。第１図中の１〜４は次の意味を有す
る。 １：同量のPTU−Metが、その製造における
遊離メチオニンのために、サイクル１に観察され
た。２：サイクル36及び37の生成物は、サンプル
調製の間、偶然に混合された。サイクル38へのキ
ヤリーオーバー（Carryover）の定量分析は、ア
ミノ酸の順序がThr−SerよりかむしろSer−Thr
であることを提案する。３：サイクル43において
は確認され得なかつた。しかしながら、PTM−
デヒドロアラニンの実質量が観察された。この誘
導体は、セリン及びシステインの両者から形成さ
れる。４：配列決定機（sequencer）におけるフ
ランクシヨンコレクター問題を、誘導されるべき
複数のサンプルに引き起こした。 第２図は、第１図に例示されているMet−アミ
ノペプチダーゼをコードするpSYC1174の1.2kb
挿入体を示す。第３図は、本発明の酵素によりプ
ロセシングされる前及びプロセシングされた後の
精製された組換え体IL−２のSDSゲルを示し、
そしてこれは図面に代わる写真である。第４図
は、リシンＡについての遺伝子を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 組換えMet−アミノペプチダーゼであつて、
    30℃でコバルトイオンの存在下で、PH7.5でMet
    −ｙ−ｚ（ここでｙはAla、Pro、Ile又はGlyであ
    り、そしてｚはアミノ酸残基である）からＮ−末
    端のMet残基を加水分解することができ、そして
    分子量が、SDS−PAGEにより測定される場合、
    およそ32000であることを特徴とするMet−アミ
    ノペプチダーゼ。 ２ 前記アミノペプチダーゼが特異性を有し、そ
    れによつて、それが内部のメチオニン残基を分解
    しないで、Met−先行ペプチド又はタンパク質か
    らＮ−末端のメチオニン残基の切断をもたらし、
    そして他のＮ−末端残基で切断をもたらさず、そ
    してメチオニンが、 Met−Ala−Met； Met−Gly−Met−Met； Met−Gly−Met； Met−Ala−Ser； Met−Gly−Gly； Met−Ala−Pro−Thr−Ser−Ser−Thr−Lys
    −Lys−Thr−Gln−Leu；及び Met−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys
    −Lys−Gln−Leu−Cys から成る群から選択されたペプチドから開放さ
    れ；そしてアミノ酸が、 Met−Phe−Gly； Met−Phe−Ala−Gly； Met−Leu−Phe； Met−Met−Met； Leu−Leu−Leu； Leu−Gly−Gly； Met−Ala； Leu−Gly； Leu−Ala−Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr
    −Lys−Lys−Thr−Gln−Leu； Ｎ−formyl−Met−Met−Met； Met−Phe； Met−Ser； Val−Gly−Gly； Thr−Gly−Gly； Trp−Gly−Gly； Phe−Gly−Gly； Met−Glu−His−Phe−Arg−Tyr−Gly； Met−Lys−Arg−Pro−Pro−Gly−Phe−Ser
    −Pro−Phe−Arg； Gly−（Gly）3−Gly； Ser−Ser−Ser； Pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys−Lys
    −Gln−Leu−Cys； Ala−pro−Thr−Ser−Ser−Ser−Thr−Lys
    −Lys−Gln−Leu； Thr−Val−Leu； Arg−Gly−Gly； Ala−（Ala）2−Ala； Ala−Ala−Ala； Glu−Gly−Phe； Leu−Leu−Leu； Tyr−Gly−Gly； Ile−Gly−Gly；及び Met−Arg−Pheアセテート から成る群から選択されたペプチドから開放され
    ないことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    のMet−アミノペプチダーゼ。 ３ ハイブリダイゼーシヨン条件が、６×SSC、
    0.01MのEDTA、５×Denhardt及び0.5％のSDS
    を含む緩衝液中において、65℃で反応を完結する
    のに十分な時間、ハイブリダイズし、次に65℃で
    ３×SSCにより洗浄することに相当する場合、
    Met−アミノペプチダーゼが由来されるDNAが
    下記のDNA（又はその相補体）： 【表】 にハイブリダイズすることを特徴とする特許請求
    の範囲第１項記載のMet−アミノペプチダーゼ。 ４ Ｎ−末端配列Ala−Ile−Ser−Lys−Thr−
    Proを有することを特徴とする特許請求の範囲第
    １項記載のMet−アミノペプチダーゼ。 ５ 下記のアミノ酸配列： 【表】 【表】 を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載のMet−アミノペプチダーゼ。 ６ E.コリに由来することを特徴とする特許請求
    の範囲第１項記載のMet−アミノペプチダーゼ。 ７ 組換えMet−アミノペプチダーゼであり、30
    ℃でコバルトイオンの存在下で、PH7.5で、Met
    −ｙ−ｚ（ここでｙはAla、Pro、Ile又はGlyであ
    り、そしてｚはアミノ酸残基である）からＮ−末
    端のMet残基を加水分解することができ、そして
    分子量がSDS−PAGEにより測定される場合およ
    そ32000であることを特徴とするMet−アミノペ
    プチダーゼを得るための方法であつて： 第１細菌株からプラスミドに担持される遺伝子
    ライブラリイを調製し； 前記遺伝子ライブラリイを、ペプチダーゼ活性
    を欠失している第２細菌中に形質転換し；そして 形質転換細胞をMet−アミノペプチダーゼ活性
    についてスクリーニングすることを含んで成る方
    法。 ８ 前記第１細菌株がペプチダーゼ活性を欠失し
    ていることを特徴とする特許請求の範囲第７項記
    載の方法。 ９ 前記第１細菌株及び第２細菌株が同じである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方
    法。 １０ Ｎ−末端にメチオニンを含まないタンパク
    質を調製するための方法であつて、有効量のMet
    −アミノペプチダーゼ〔該アミノペプチダーゼ
    は、30℃でコバルトイオンの存在下で、PH7.5で
    Met−ｙ−ｚ（ここでｙはAla、Pro、Ile又はGly
    であり、そしてｚはアミノ酸残基である）からＮ
    −末端のMet残基を加水分解することができ、そ
    して分子量が、SDS−PAGEにより測定される場
    合、およそ32000であることを特徴とする組換え
    Met−アミノペプチダーゼである〕によりMetに
    先行されるタンパク質を処理することを含んで成
    る方法。 １１ 前記ペプチダーゼがE.コリに由来し、そし
    て前記Metに先行されるタンパク質がIL−２又は
    リシンＡであることを特徴とする特許請求の範囲
    第１０項記載の方法。 １２ 前記E.コリが金株pSYC1174であることを
    特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。
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