NO309200B1 - Genledersekvens som induserer en post-translasjonell modifikasjon av polypeptider i bakterier og polypeptidsekvens - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører ekspresjon av proteiner som trenger post-translasjonell modifikasjon av deres aminosyre-sekvens før en moden form oppnås. Slike proteiner inneholder aminosyrer forskjellig fra de 20 vanlige aminosyrene kodet for av konvensjonelle nukleinsyrer. En lederpeptidsekvens blir spesifikt identifisert som kan indusere post-translasjonell modifikasjon av spesifikke aminosyrer når disse blir uttrykt i sammenheng med forløperpolypeptidet. Frem-gangsmåter for dannelse av forbedrede sammensetninger ved anvendelse av denne ledersekvensen er også beskrevet.

Polypeptider, inkludert de som har naturlig antibiotiske aktiviteter, er blitt identifisert og omfatter aminosyrer som er forskjellig fra de 20 vanlige syrene spesifisert av den genetiske koden, som ekspresjonsprodukter av bakterier og andre organismer. Strukturen til to av de mere viktige, nisin og subtil in, er angitt i fig. 1 i foreliggende søknad.

Tilstedeværelse av disse polypeptidene og andre av de uvanlige aminosyrene lantionin, e-metyllantionin, D-alanin, dehydroalanin og dehydrobutyrin, foreslår klart at noe annet enn vanlig proteinbiosyntese ledet av den genetiske koden, er involvert ved ekspresjon av de modne formene til disse naturlig forekommende polypeptidene. Til tross for dette har forskning demonstrert at tilsynekomst av disse polypeptidene kan bli blokkert av proteinbiosynteseinhibitorer. Hurst et al., Canadian Journal of Microbiology, 17, 1379-1384 (1971). Det er også kjent at forløperpeptider av de modne formene kan bli detektert med antistoffer mot det modne peptidet. Nishio etal., Biochemistry Biophysics Research Community, 116, 751-751 (1983). Disse observasjonene sammen med andre observa-sjoner vedrørende nisin, subtilin og beslektede proteiner foreslår en mekanisme som omfatter primær biosyntese av en forløper via en ribosomal mekansime, etterfulgt av post-translasjonelle modifikasjoner.

Aktiviteten til disse proteinene og potensielle mutantvaria-sjoner derav, er av tilstrekkelig kommersiell interesse til at de danner vesentlig aktivitet innen området utvidede mikroorganismer inneholdende fremmede DNA-fragmenter og som koder for proteinets produksjon. US-patent 4.716.115, utstedt til Gonzalez et al., er rettet mot en slik avledet mikroor-ganisme. Umuligheten av å oppnå en genetisk sekvens som koder direkte for det modne proteinet og mangel på informasjon vedrørende egenskapen til den posttranslasjonelle modifika-sjonen - nødvendig for å oppnå det modne proteinet - har vanskeliggjort kloning av mikroorganismer inneholdende det spesifikke genet som koder for disse proteinene, og kanskje viktigere, har medført vansker i forsøk på å danne tilfeldige varianter og setespesifikt muterte proteiner, som sannsynligvis kan føre til høyere grader av aktivitet og andre forsterkende egenskaper.

En hensikt innenfor det biotekniske området er å oppnå en omfattende forståelse av mekanismen hvorved modne former av disse uvanlige aminosyreinneholdende polypeptider blir fremstilt, og å utvikle en ekspresjonsbærer for inkorporering av et gen som spesifikt vil kode for produksjon av disse peptidene og som er egnet for transformasjon av vanlig tilgjengelige bakterier.

Det er i foreliggende oppfinnelse identifisert genleder-sekvenser som når koblet med genet kodende for forløperen for et polypeptid, induserer eller deltar i post-translasjonell modifikasjon av forløperen for å oppnå den modne formen. Strukturen til hele genet, inkludert sannsynlige ribosomal-bindingsseter, bekrefter den post-translasjonelle modifika-sjonsmodellen for fremstilling av disse peptidene.

Genet for ekspresjon av forløperen og det modne proteinet til subtilin fremgår av fig. 2. Ledersekvensen, som kan bli anvendt for å fremme post-translasjonell modifikasjon av andre proteiner som inneholder uvanlige aminosyrer så som nisin o.l., er spesifkt angitt i fig. 3. En separat ledersekvens som utviser betraktelig homologi med den til subtilin er også identifisert, og hele gensekvensen er angitt i fig. 3. Figur 1 viser konformasjonsstrukturen til de små antibiotiske proteinene nisin og subtilin som bestemt av Gross et al., Protein Cross-linking, s. 131-153 (1977). Figur 2 viser genetisk baseparsekvens for hele det spaltede fragmentet inneholdende genet som koder for subtilinforløperpeptidet, inkludert lederfragmentet ansvarlig for indusering av post-translasjonell modifikasjon. Et antatt ribosomalt bindingssete er merket R.B.S., lederfragmentet er utstyrt med stjerne, og de aminosyrene til forløperen som gjennomgår modifikasjon er angitt med uthevet skrift. Figur 3 viser en illustrasjon som angir sekvensen for genet kodende for nisin og forløperpolypeptidet som denne tilsvarer, inneholdende samme typer markeringer og som har samme betydninger som figur 2.

Beste fremgangsmåte for utføring av oppfinnelsen

For å oppnå genet for polypeptidforløperen for proteinene av interesse, og derfor for ekspresjon av den modne formen av proteinet, er det nødvendig å utvikle en genprobe, basert på den antatte aminosyreforløpersekvensen til proteinet som det gjelder. For å lette diskusjonen vil beskrivelsen heri først omhandle genet of forløperen for subtilin, til tross for at samme metodologi er blitt anvendt for å bestemme hele genet for forløperen til nisin som diskutert nedenfor og er anvendbar for ytterligere gener som koder for proteinet inneholdende lignende uvanlige aminosyrer i den modne formen.

Subtilin

Organisme og dyrkingsbetingelser. Bacillus subtilis ATCC 6633, en subti 1inproduserende stamme, ble tilveiebragt fra the American Type Culture Collection, Rockville, MD. Den ble dyrket i høysukrose medium A til Nishio et al (1983), opprinnelig beskrevet av Feeney et al., (1948). Det inneholder (pr. 1) 100 g sukrose, 11,7 g sitronsyre, 4 g Na2S04, 4,2 g (NH4)2HP04, 5 g gjærekstrakt (Difco), 100 ml av en salt-blanding (7,62 g KC1, 4,18 g MgCl2-6H20, 0,543 g MnCl2-4H20), 0,49 g FeCl3-6H20 og 0,208 g ZnCl2 i 1000 ml H20), og tilstrekkelig NH4OH for å bringe pH til 6,8-6,9 pr. liter. Stamoppløsninger ble opprettholdt på LB-skåler (10 g trypton, 5 gjærekstrakt, 10 g NaCl (pr. 1) inneholdende 1,5$ agar.

Klonisolas. jon og hybrldiseringsprosedyrer. En subtilingen-probe ble konstruert basert på den antatte aminosyrefor-løpersekvensen til subtilin. Det modne subtilinmolekylet inneholdere bare 32 aminosyrer, og inneholder ikke regioner med lav kodondegenerasjon. I steden for å preparere en probeblanding som inneholder alle mulige sekvenser kodende for et kort område av aminosyrer i subtilinforløperen, ble derfor en enkelt lang probe syntetisert ifølge strategien til Lathe, Journal of Molecular Biology, 183, s. 1-12 (1985). Flertydige posisjoner innenfor kodonene ble valgt ved begrunnede gjetninger ifølge en kodonfrekvensanvendelses-tabell konstruert fra det kjente B. subtilis genet som koder for alfa-amylase Yang et al, Nucleic Acids Research, 11, s. 237-249 (1983). På grunn av at man ikke kan forutsi sekvens-homologien mellom proben og målgensekvensen, må hybridisering og vaskebetingelser bli optimalisert empirisk. 96-mer "guessmer" ble ende-merket ved anvendelse av polynukleotid-kinase, renset på disulfidkryssbindende BAC-geler som beskrevet av Hansen et al (1982), og hybridisert til EcoRl spaltninger av totalt ATCC 6633 genomiske DNA ved 7°C temperaturintervaller i området 37-60°C, ved anvendelse av et 6x standard saltvannsitrat (SSC) saltstyrke. Separate strimler ble deretter vasket ved anvendelse av temperatur-økninger på 4"C i 2x SSC. Hybridiseringen og vaskebeting-elsene som ga den beste kombinasjon av signalstyrke og spesifisitet, ble valgt for påfølgende screening av et delvis Mbol bibliotek av ATCC 6633 DNA, konstruert i lambda Jl. Hybridiseringer der probe og mål var meget homologe, ble utført i samme hybridiseringsbuffer som ovenfor, men hybridiseringstemperaturen var 70°C, vaskingene ble utført i 0,lx SSC ved 52° C. DNA sekvensanalyse ble utført ved anvendelse av modifisert T7 polymerase "Sequenase"-system fra United States Biochemical Corp.

RNA isolas. jon og Sl- kartlegging. Total RNA ble isolert ved anvendelse av metoden til Ulmanen et al (1985). Sl-kartlegging ble utført ved fremgangsmåten til Davis et al (1986), der et syntetisk oligonukleotid ble anvendt for å prime syntesen av den andre tråden ved anvendelse av enkelt-trådet M13 DNA, som inneholder det klondede genet som templat. Markør ble inkorporert som 32P fra [alfa-32P-dATP]. Etter en kort merkingstid ble et overskudd umerket dATP tilsatt, og syntese av den andre tråden ble i sin helhet fortsatt. Et hensiktsmessig restriksjonsenzym ble anvendt for å kutte det dobbelt-trådede produktet, og den merkede tråden, ble tilveiebragt ved elektroforese på en denaturerende agarose-gel, etterfulgt av autoradiografi for å lokalisere fragmentet, utspalting fra gelen og elektroeluering av DNA. Etter elektroeluering ble DNA ekstrahert med 1:1 kloroform:fenol og presipitert med etanol. Det merkede fragmentet ble hybridisert til total mRNA ved flere forskjellige tempera-turer, og uhybridisert enkelt-trådet nukleinsyre ble degradert ved anvendelse av nuklease-Sl. Produktet ble elektroforert på en denaturerende sekvenseringsgel sammen med et sett av dideoksysekvenseringsreaksjoner som ble dannet ved anvendelse av det samme syntetiske oligonukleotidet som primer. Beliggenheten til det beskyttede, merkede DNA-fragmentet med hensyn på sekvenseringskolonner identifiserte enden av mRNA.

RNA og proteinanal<y>se. Northern analyse hie utført ved elektroblotting av akrylamidgeler av RNA preparater på Zeta-probe nylonmembran (Bio-Rad). Proteiner ble analysert ved elektroforese på polyakrylamidgelsystemet til Swank og Munkres (1971), og sølvfarvet ved anvendelse av Bio-Rad-reagenser. Subtilinaktiviteten ble målt som for nisin, beskrevet av Morris et al (1984).

Ved anvendelse av materialene og metodene ovenfor, ble fragmenter som inneholdt sekvensen hybridiserende med "quessmer" klonet inn i M13 og sekvensert. Sekvensen ble undersøkt for homologi med subtilisgenproben, og også computer-translatert i alle leserammene. Disse ble undersøkt for den antatte subtilinforløpersekvensen. En perfekt parring ble funnet som inneholder den nøyaktige sekvensen på 32 residier. Sekvensen er angitt i fig. 3.

Som angitt omfatter denne sekvensen en del kodende for et forløperpolypeptid som inneholder seriner, treoniner og cysteiner som gjennomgår modifikasjon etter translasjon, for å oppnå det modne proteinet som har de vanlige angitte aminosyrene. (-10) regionen tilsvarer nær opptil en consensus prokaryotisk promoter (TATAAT) som observert i andre bakterier, Siebenlist et al., Cell, 20, s. 269-281 (1980). Det antatte ribosombindingssetet ble merket som RBS og omfatter en 12 baseparsekvens som er typisk for de som er observert i B. subtilis, som rapportert av Band et al., DNA, 3, s. 17-21 (1984 ). Det er å bemerke at den er beliggende slik at translasjonsinitiering vil begynne ved det like nedstrøms Metkodonet, som initierer ledersekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er å bemerke at subtilin-forløperpeptidleder-regionen, som spiller en rolle ved transport av subtilin ut av cellen, er uvanlig sammenlignet med sekvensene til andre prokaryotisk eksporterte proteiner.

NISIN .

Fremgangsmåten ovenfor er blitt utført på nytt for anti-biotisk nisin, og den resulterende gensekvensen kodende for forløperen, er angitt i fig. 3.

Bakterielle stammer, kloningsvektorer og dyrkningsbetingel-ser. Nisin-produserende Streptococcus lactis ATCC 11454 ble tilveiebragt fra the American Type Culture Collection (Rockville, MD). Stammene ble lagret ved -20"C i ATCC medium 17 (100 g skummet melkepulver, 100 g tomat-juice, 5 g gjærekstrakt til pH 7,0) inneholdende 25$ glyserol. Stammer ble opprettholdt på 1,2$ LB agarskåler (10 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-gjærekstrakt, 10 g NaCl pr. liter). M17 kulturme-dium (8), bestående av 5 g Bacto-pepton (Difco), 5 g Bacto-soytone (Difco), 2,5 g gjærekstrakt (Difco), 5 g kjøtt-ekstrakt (Difco), 0,5 g askorbinsyre, 5 g laktose (eller glukose) 19 g beta-dinatriumglyserofosfat (Eastman) og 0,12 vannfri MgS04 pr. liter, ble anvendt for å dyrke S. lactis for nisinproduksjon, konstruksjon av genetisk bibliotek og isolasjon av RNA. Organismen ble dyrket ved 32°C uten lufting ved anvendelse av et 2% inoculum i et hensiktsmessig volum av M17 medium.

Bacillus cereus T-sporer anvendt i analysen for nisinproduksjon, ble preparert og lagret som tidligere beskrevet. Antibiotiske aktivitetanalyser ble utført ved anvendelse av fraksjoner av S. lactis cultursupernatant.

DNA isolerlngsprosedyre. S. lactis ATCC 11454 ble inkubert i 500 ml M17 medium i 30 timer ved 32° C uten lufting. Cellene ble samlet ved sentrifugering og vasket i 25 ml PBS (8 g NaCl, 1,4 g Na2HP04, 1,2 ml 1 N HC1 pr. liter). Cellene ble resuspendert i 15 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) og deretter spaltet med 33 mikrogram pr. ml mutanolysin (Sigma) i 15 minutter ved 37°C med forsiktig røring (12). Deretter ble 5 ml STEP oppløsning (13) (0,5# SDS, 50 mM Tris-HCl i 0,4 M EDTA og 1 mg pr. ml proteinase K) tilsatt og inkubasjonen utført ved 37°C i 30 min. med leilighetsvis blanding. Blandingen ble ekstrahert med 1 volum CHC13, 1 volum 50:50 fenol:CHCl3 og til slutt med 1 volum CHC13. En tiendedel volum 3 M Na acetat og 2 volum etanol ble tilsatt; DNA'et ble spolet og resuspendert i 20 ml 50 mM Tris-HCl og 4 mM EDTA inneholdende 50 mikrogram pr. ml bukspyttkjertel RNase (Sigma). Oppløsningen ble dialysert mot en buffer bestående av 50 mM Tris-HCl og 4 mM EDTA i 16 timer ved 4°C med et bufferskift. DNA ble etanolpresipiert to ganger i nærvær av 2,5 M ammoniumacetat og til slutt løst opp i 2 ml 10 mM Tris-Hcl, pH 7,6.

Probekonstruks. jon. radiomerking og hvbr idiseringsprosedvrer . Flere forskjellige prober ble anvendt for å lete etter nisin-genet i S. lactis ATCC 11454 DNA. Hybridiserings-betingelser ble optimalisert som tidligere beskrevet (2). To oligomeriske prober ble preparert ved kjemisk syntese ved anvendelse av en Biosearch Model 8700 DNA syntesemaskin. En var en 20-mer blandet probe konstruert mot en region med lav kodondegenerasjon innenfor den antatte nisinforløpersekven-sen. Den andre var en enkelt sekvens 103-mer oligonukleotid-probe konstruert ved anvendelse av strategien til Lathe. En naturlig DNA-probe ble også anvendt, som var et 1,1 kg restriksjonsfragment inneholdende subtilingenet som tidligere er blitt klonet fra Bacillus subtilis ATCC 6633 (2).

Bibliotek- konstruks. ion og isolasjon av nisingenet.

Et totalt genomisk biblitotek av S. lactis ATCC 11454 DNA i lambda Jl ble konstruert og sekvensert som beskrevet ovenfor. Positive kloner ble kartlagt ved restriksonsanalyse og subklonet inn i pUC9 og pTZ19U plasmidvektorer for ytterligere analyser, og inn i M13mpl8 og M13mpl8 for sekvensering. Sekvensbestemming ble utført ved dideoksytermineringsmetoden ved anvendelse av modifisert T7 polymerase og protokollen i et Sequenase-kit tilveiebragt fra United States Biochemical Company.

RNA isolasjon og Northern blot analyse. Total RNA isolasjon ble utført ifølge fremgangsmåten til Ulmanen et al. RNA fraksjonering ble utført på en denaturerende akrylamidgel, elektroblottet på Zeta-probe (Biorad) nylonmembran og hybridisert som beskrevet ovenfor.

Proteinanalyse. Proteinene ble analysert ved elektroforese på polyakrylamidgelsystemet til Swank og Munkres, og sølvfarvet ved anvendelse av bioradreagenser. Nisinaktivitet ble bestemt ved metoden til Morris et al.

Dlskusj on.

Metoden hvorved subtilon, nisin og andre proteiner inneholdende uvanlig aminosyrer ikke kodet av den genetiske koden er etablert. Spesifikke ledersekvenser kodet for innenfor genene for subtilin og nisin vist i figurene 2 og 3 nødvendig for post-translasjonell modifikasjon av spesifikke aminosyrer, inkludert forløper-residiene Ser, Thr og Cys, som blir omdannet til uvanlig amonosyrer referert til ovenfor, gjennomgår reaksjoner som omfatter dehydrering og potensielle elektrofile addisjonsreaksjoner som involverer stereoinver-sjon for å danne tioeter-kryssbindinger og D-aminosyrer. Gener kodende for forløperpolypeptid inkludert lederen, kan bli skutt inn ved hjelp av konvensjonelle teknologier inn i en hvilken som helst ekspresjonsbærer, som for eksempel for nisin, inkluderer Streptococcus lactis som en naturlig produsent, og ekspresjonsbakteriene angitt for eksempel i US-patent 4.716.115. Lignende ekspresjonsbærere kan bli identifisert for andre proteiner.

Før oppfinnelsen beskrevet heri, ble gensekvensen for epidermin, et annet lantionininneholdende polypeptidanti-biotika, publisert av Schnell et al, Nature, 333, s. 276-278

(1988). Til tross for at aminoresidiene for ledersekvensene til de tre antibiotikaene reflekterer tilstrekkelig homologi som angir en fellesevolusjonær opprinnelse, er det klart på det nåværende tidspunkt at det er betraktelige forskjeller i aminosyresekvensene til hver, og deres tilsvarende gensekven-ser. Som angitt i tabell 1 er den hydropatiske indeksen til de tre lederaminosyresekvensene overraskende like. Ved siden av de strukturelle regionene er en region med høy hydrofilisitet, etterfulgt av en region mere fjernt fra den strukturelle regionen, som i gjennomsnitt er nøytral, men alternerer mellom en hydrofil og en hydrofob residie. Det er, når plassert på samme grafisk fremstilling, en overraskende korrelasjon med hensyn på disse residiene. Denne korrela-sjonen fortsetter ned til det faktum at hver leder-region reflekterer et avbrudd i de hydrofile residiene med et hydrofobt residie ved nøyaktig samme beliggenhet i hvert tilfelle. Oppfinnelsen omfatter dermed ikke bare oppdagelsen av at modifikasjon blir oppnådd ved koding av en leder-region som leder eller hjelper med å oppnå modifikasjon i den strukturelle regionen, men omfatter oppdagelsen av at leder-regionen generelt kan bli karakterisert og ha en del som er proksimal til den strukturelle regionen som er hydrofil av natur, komplementert med en mere distal del der hydrofile og hydrofobe residier alternerer for å tilveiebringe en helt nøytral verdi. Empirisk omfatter de tre eksemplene heri alle tilstedeværelse av en enkelt hydrofobisk residie i den hydrofile delen ved siden av den strukturelle regionen. Ved inngivelsesdatoen for foreliggende oppfinnelse er det ukjent om tilstedeværelse av et slikt residie er essensiell for oppnåelse av de nødvendige post-translasjonelle modifikasjonene. Med teknikkens stand kan rutinemessig eksperimentering bestemme nødvendigheten av en slik tilstedeværelse sammen med forskjellige alternativer, som kan forbedre modifika-sjonseffektiviteter.

Tilgjengelig teknologi muliggjør også fremstilling av et gen kodende for et modent protein, fra genet for bare den strukturelle regionen som i mange tilfeller kan bli bestemt på en relativt enkel måte, dvs. omtagelse basert på aminosyresekvensen etterfulgt av hybridisering og sekvensanalyse. Virkningen av ledersekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse på spesifikke aminosyrer tilveiebringer også en ny fremgangsmåte for oppnåelse av setespesifikk mutagenese uten DNA modifikasjon. Det har dermed for eksempel blitt rapportert at delesjon eller erstatning av forskjellige residier så som cystein, kan forbedre biologisk aktivitet. Se for eksempel US-patent 4.518.584.

Nye mutanter av naturlig forekommende peptider utviser sannsynligvis høyere aktiviteter eller bedre spesifisiteter for visse biologiske funksjoner. Disse kan bli dannet ved innskudd av den genetiske koden for ledersekvensen ifølge denne oppfinnelsen foran genet kodende for ekspresjon av et naturlig forekommende polypeptid, som deretter vil gjennomgå post-translasjonell modifikasjon ledet av ledersekvensen, som eliminerer eller modifiserer aktuelle residier.

Det er også selvfølgelig å bemerke at der hvor det er ønskelig å forsikre vesentlig ekspresjon av forløperen og ikke selve peptidet, kan dette nå bli oppnådd ved spesifikk avspaltning av lederfragmentet fra genet kodende for peptidforløperen. I fravær av ledersekvens ifølge foreliggende oppfinnelse, er det forløperen som vil bli uttrykt, uten beskjed om å gjennomgå post-translasjonell modifikasjon.

Et annet trekk ifølge oppfinnelsen er evnen til å konstruere "målsøkte proteiner", eller proteiner som, i kraft av tilstedeværelse av de uvanlige aminosyrene dehydroalanin og dehydrobutyrin, kan bli kovalentelig koblet til et "mål"

("target"). Ved anvendelse av strukturelle varianter som dermed vil gjenkjenne og selektere for spesifikke mål, kan lederfragmentet bli anvendt for å indusere "bindingsseter" for å utvikle en kovalent binding "antistoff", for å nøy-tralisere spesifikke toksiner, for å selektere ut spesifikt materiale osv. Alle disse modifikasjonene hører inn under området til fagfolk og den ekspanderende bioteknologien, og representerer dermed øyeblikkelige anvendelser av oppdagelsen av ledersekvensen beskrevet heri.

Anvendelser av foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til modifikasjon av eksisterende proteiner. Ved hjelp av tilstedeværende evner til å syntetisere DNA-sekvenser, kan spesifikke polypeptider bli kodet av kunstige kloner og målsøkt for spesifikke anvendelser. Som et eksempel kan, på grunn av den kryssbindende evnen til de uvanlige aminosyrer, et adhesiv bli preparert spesifikt for et gitt substrat, for eksempel karbonfibre, som på grunn av evnen til de uvanlige aminosyrene dannet ved modifikasjon for dannelsen av kovalente bindinger, kan bli fast bundet til substratet. Tilgjengeligheten av aminosyrene muliggjør innføring som et adhesiv en hvilken som helst ønsket mengde hydrofobisitet, hydrofilisitet osv. for å løse problemer som oppstår i for tiden anvendte adhesiver så som epoksier.

Spesifikke anvendelser vil selvfølgelig danne mutasjoner av ledesekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse og andre spesifikke varianter. Dersom disse variantene beholder den essensielle biologiske funksjonen for indusering eller assistering i post-translasjonell modifikasjon, vil de være innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Det er å bemerke at en publikasjon vedrørende identifikasjon av ledersekvensen ved søkeren i sammenheng med Sharmila Banerjee vil fremkomme i Journal of Biological Chemistry, Vol. 263, antatt publikasjonsdato 5. juli, 1988.

Den nøyaktige mekansimen hvorved post-translasjonell modifikasjon blir indusert, er uklar. Uten å være bundet av noen teori, er det å bemerke at subtilinforløperen utviser residier i ledersekvensen som opprinnelig alternerer mellom høy hydrofil og høy hydrofob natur, blir meget hydrofil nære ved den strukturelle regionen, som i kontrast er sterk hydrofob. Dette bør være i kontrast til vanlig lederregioner for eksporterte proteiner fra prokaryoter som generelt har en meget hydrofob region og inneholder basiske residier, ikke sure residier ifølge oppfinnelsen. Dette foreslår at de post-translasjonelle modifikasjonene oppstår i et oppdelt sted hvor den uvanlige ledersekvensen er behjelpelig med målsøking eller leding av forløperen dertil Det er ventet at andre proteiner vil delta i modifikasjonsmekanismene. Enzymer nødvendig for å tilveiebringe essensielle kjemiske reaksjoner beliggende ved, eller nære ved, cellemembranen.

Foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet i detalj med hensyn på spesifikke proteiner, materialer og metoder. Unntatt hvor det er nødvendig for operabilitet, er ingen begrensninger til disse spesifikke materialene antatt, slik begrensning skal heller ikke bli betraktet utover begrens-ningene av kravene heri. Anvendelse av ledersekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med omtrent en hvilken som helst prokaryot ekspresjonsbærer, spesifikt bakterier, er overveiet.

Claims (5)

1. Genlederfragment, karakterisert ved at det koder for en peptidledersekvens som induserer post-translasjonell modifikasjon av aminosyrer valgt fra gruppen bestående av Cys, Ser og Thr, idet nevnte fragment har sekvensen ATG TCA AAG TTC GAT GAT TTC GAT TTG GAT GTT GTG AAA GTC TCT AAA CAA GAC TCA AAA ATC ACT CCG CAA.

2 . Genetisk sekvens, karakterisert ved at den koder for en polypeptidforløper av subtilin i bakterier, med sekvensen ATG TCA AAG TTC GAT GAT TTC GAT TTG GAT GTT GTG AAA GTC TCT AAA CAA GAC TCA AAA ATC ACT CCG CAA TGG AAA AGT GAA TCA CTT TGT ACA CCA GGA TGT GTA ACT GGT GCA TTG CAA ACT TGC TTC CTT CAA ACA CTA ACT TGT AAC TGC AAA ATC TCT AAA.

3. Genlederfragment, karakterisert ved at det koder for en peptidledersekvens som induserer post-translasjonell modifikasjon av aminosyrer valgt fra gruppen bestående av Cys, Ser og Thr, i det nevnte fragment har sekvensen ATG AGT ACA AAA GAT TTT AAC TTG GAT TTG GTA TCT GTT TCG AAG AAA GAT TCA GGT GCA TCA CCA CGC.

4 . Polypeptidsekvens som når den er festet som en leder til en proteinforløper som gjennomgår post-translasjonell modifi-sering assisterer i indusering av nevnte modifikasjon, karakterisert ved at den omfatter et polypeptid som har aminosyresekvensen Met Ser Thr Lys Asp Phe Asn Leu Asp Leu Val Ser Val Ser Lys Lys Asp Ser Gly Ala Ser Pro Arg.

5. Genetisk sekvens som koder for et forløper-polypeptid til nisin i bakterier, karakterisert ved at den har sekvensen ATG AGT ACA AAA GAT TTT AAC TTG GAT TTG GTA TCT GTT TCG AAG AAA GAT TCA GGT GCA TCA CCA CGC ATT ACA AGT ATT TCG CTA TGT ACA CCC GGT TGT AAA ACA GGA GCT CTG ATG GGT TGT AAC ATG AAA ACA GCA ACT TGT CAT TGT AGT ATT CAC GTA AGC AAA.