DE69433357T2 - Rekombinantes Mersacidin und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

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    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Strukturgensequenz des Peptidantibiotikums Mersacidin. Die Sequenzierung zeigte, das Prämersacidin aus einer unüblich langen 48 Aminosäure-Leader-Sequenz und einem 20 Aminosäure-Propeptidteil besteht, welcher während der Biosynthese zum reifen Lantibiotikum modifziert wird.
  • Mersacidin gehört zu einer Gruppe von bakteriziden Peptiden, welche als Lantibiotika bezeichnet wurde, zur Kennzeichnung, daß diese Peptide die seltenen Aminosäuren Lanthionin und/oder 3-Methyllanthionin enthalten. Zusätzliche modifizierte Aminosäuren, wie Dehydroalanin und Dehydrobutyrin treten regelmäßig auf, wogegen S-Aminovinylcystein und Lysinoalanin nur in einigen Lantibiotika gefunden werden (G. Jung (1991), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 1051–1068). Lantibiotika werden von Grampositiven Bakterien produziert und aus ribosomal synthetisierten Präpeptiden hergeleitet. Die lantibiotischen Strukturgene finden sich entweder auf dem bakteriellen Chromosom (z. B. Subtilin und Synamycin) oder mit bewegbaren Elementen wie Transposonen (z. B. Nisin) oder großen Plasmiden (z. B. Epidermin und Pep5) assoziiert. Die Präpeptide bestehen aus einer N-terminalen Leader-Sequenz, welche nach dem Export aus der Zelle des Herstellers abgespalten wird, und dem C-terminalen Propeptid, welches posttranslational zum reifen Lantibiotikum modifiziert wird (G. Jung (1991), oben). In einem ersten Modifizierungsschritt werden Serin- und Threoninreste dehydratisiert, um Dehydroalanin (Dha) beziehungsweise Dehydrobutyrin (Dhb) zu erhalten (H.-P. Weil et al. (1990), Eur. J. Biochem. 194: 217–223). Darauffolgend reagieren die SH-Gruppen der Cysteinreste mit den Doppelbindungen von Dha- oder Dhb-Resten, um die Lanthionine bzw. Methyllanthionine auszubilden.
  • Mersacidin wurde aus dem Kulturüberstand von Bacillus spec. HIL Y-85,54728 isoliert und wurde zum Gegenstand des Interesses aufgrund seiner signifikanten in vivo-Effizienz gegenüber Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA) (S. Chatterjee et al. (1992), J. Antibiotics 45: 839–845). Es ist das kleinste bislang isolierte Lantibiotikum (1825 Da), synthetisiert aus einem Propeptid von 20 Aminosäuren und es enthält 3 Methyllanthioninreste, ein Dehydroalanin und ein S-Aminovinyl-2-methylcystein (1A) (S- Chatterjee (1992), J. Antibiotics 45: 832–838). Mersacidin trägt keine Nettoladung und besitzt insgesamt hydrophobe Eigenschaften. Jüngere Ergebnisse weisen darauf hin, daß Mersacidin die Peptidoglycanbiosynthese behindert. Dies erfolgt am wahrscheinlichsten auf der Ebene der Transglycosylierung über einen Mechanismus, welcher sich von denjenigen der Antibiotika unterscheidet, die gegenwärtig gegen MRSA verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf Prämersacidin mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz von Aminosäure Nr. 1 bis 68 und Promersacidin mit der Aminosäuresequenz, wie sie in 2 gezeigt ist, von Aminosäure Nr. 49 bis 68.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind DNAs, welche für Prämersacidin codieren, insbesondere DNAs mit der Nucleotidsequenz, wie sie in 2 von Nr. 22 bis 225 gezeigt ist, welche für Prämersacidin codiert, ein Vektor, welcher die genannte DNA enthält, und eine Wirtszelle, welche den genannten Vektor enthält.
  • Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung von Prämersacidin, Promersacidin oder reifem Mersacidin durch gentechnologische Verfahren, die allgemein einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, d. h. eine geeignete Wirtszelle, welche die genannten für Prämersacidin codierenden DNAs enthält, wird unter geeigneten Bedingungen kultiviert, gefolgt von der Isolation von Prämersacidin, welches von der genannten Wirtszelle, vorzugsweise einem Gram-positiven Bakterium, wie Bacillus, Streptomyces oder Streptococcus exprimiert wird.
  • Schließlich können das Prämersacidinpeptid oder die Gene erfindungsgemäß zur Herstellung von reifem Mersacidin verwendet werden, wie es beispielsweise in WO 90/00558 beschrieben ist.
  • Beispielsweise ist reifes Mersacidin als Peptidantibiotikum für die Konservierung von Nahrungsmitteln, insbesondere gegen Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus, oder als Antibiotikum zur Behandlung von Infektionen mit Staphylococcus aureus bei Tieren oder Menschen nützlich. Die Erfindung kann ferner verwendet werden, um in der Aminosäuresequenz modifizierte Mersacidinderivate mit einem erweiteren antibiotischen Spektrum oder einer unterschiedlichen Effizienz zu erhalten. Darüber hinaus eröffnet die Erfindung Wege, um Mersacidin oder dessen Derivate durch Genmanipulation zu überexprimieren.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: A) Struktur des Lantibiotikums Mersacidin. B) Mutmaßliche Präpeptidsequenz und Sequenz des 51 Basen-Guessmers, welches für die Identifizierung des Strukturgens verwendet wurde.
  • 2: Nukleotidsequenz des Strukturgens mrsA des Lantibiotikums Mersacidin und abgeleitete Aminosäuresequenz des Präpeptids. Die Ribosomenbindungsstelle vor dem ATG-Start-Codon ist eingerahmt und die Verarbeitungsstelle ist durch einen Pfeil markiert. Der mutmaßliche rho-unabhänige Terminator ist unterstrichen.
  • 3: Vergleich der Leadersequenzen mehrerer Lantibiotika. Die konservierten Sequenzen sind in Fettdruck markiert.
  • Beispiel
  • 1. Klonierung des Strukturgens von Mersacidin
  • Die mutmaßliche Mersacidinpropeptidsequenz (1B) wurde aus der Struktur von Mersacidin abgeleitet und basiert auf der allgemeinen Information über die lantibiotische Biosynthese. Die dargestellte Sonde wurde als ein 51-Basen-Guessmer synthetisiert, basierend auf der bevorzugten Codon-Verwendung von Bacillus auf einem PCR-Mate® (Applied Biosystems, Weiterstadt, FRG) und mit Digoxigenin (Boehringer Mannheim, Mannheim, BRD) (1B) markiert. Die Aminobutyrylreste (Abus-Hälfte von Methyllanthionin) stammen aus Threoninen, wogegen die Alaninreste (Alas-Hälfte von Methyllanthionin) als Cystein im Propeptid codiert sind. Das S-Aminovinyl-2-methylcystein, welches die terminale Ringstruktur ausbildet, wird wahrscheinlich aus einem Methyllantionin gebildet, welches oxidativ decarboxyliert wird, wie es für Epidermin gezeigt wurde, das ein C-terminales S-Aminovinylcystein enthält (T. Kupke et al. (1992), J. Bacteriol. 174: 5354–5361).
  • Da keine Plasmide im Produzentenstrang festgestellt werden konnten, wurde chromosomale DNA hergestellt, wie von Marmur beschrieben (J. Marmur (1961), J. Mol. Biol. 3: 208–218) beschrieben, mit der Ausnahme, daß nur eine Chloroformextraktion und Fällung durchgeführt wurde und daß die DNA darauffolgend in einem Äquilibrierungspuffer gelöst und auf einer Qiagen-tip® 100 Säule (Diagen, Hilden, BRD) gereinigt wurde. Bei 51°C hybridisierte eine einzige 2 kb Bande einer chromosomalen Restriktionsverdauung mit Hind III mit der Sonde in einem Southern-Blot (E. M. Southern (1975), J. Mol. Biol. 98: 503–517).
  • Die Fragmente, welche in der Größe von 1,9 bis 2,3 kb reichen, wurden aus dem Gel ausgeschnitten, mit einem BIOTRAP® (Schleicher und Schüll, Dassel, BRD) eluiert und in pUC18 (C. Yanisch-Perron et al. (1985), Gene 33: 103–109) in E. coli subkloniert. Die Plasmide mehrerer rekombinanter Kolonien wurden durch das Birnboim und Doly-Verfahren (H. C. Birnbom und J. Doly (1979), Nucl. Acids Res. 7: 1513–1523) hergestellt, mit Hind III verdaut und mit dem Guessmer bepropt. Einer der Klone, welcher ein positives Signal ergab, wurde durch Restriktionsverdauungen mit verschiedenen Enzymen und darauffolgende Southern-Blots weiter analysiert. Abschließend wurde ein 1,3 kb EcoR I-Hind III-Fragment in pEMBL18 und pEMBL19 (L. Dente et al. (1983), Nucleic Acids. Res. 11: 1645–1655) in E. coli subkloniert. Darüber hinaus wurde ein 0,6 kb EcoR V-Fragment in den Vektor pCU1 (J. Augustin et al. (1992), Eur. J. Biochem. 204: 1149–1154) kloniert nach einer Site-directed-Mutagenese der EcoR I-Stelle in eine EcoR V-Stelle unter Verwendung des Transformer-Site-directed Mutagenese-Kits (Clontech, Palo Alto, USA).
  • 2. Nukleotidsequenz des Mersacidinstrukturgens, mrsA
  • Das 0,6 kb Fragment wurde auf einem automatischen DNA-Sequnzer A.L.F. (Pharmacia, Brüssel, Belgien) unter Verwendung der Didesoxykettenterminierungsmethode (F. Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467) aus doppelsträngiger DNA sequenziert; zum Primen wurden der Universal und Reversal-Primer des AutoRead®-Sequenzierungskits (Pharmacia, Brüssel, Belgien) und zwei synthetische Oligonukleotide 5'-TCTCTTCCATTTTTTTG)3' und 5'-(AAATCAAATTAACAAATAC)3' angewandt. Die Nukleotidsequenz des Mersacidin-Strukturgens, mrsA, ist in 2 gezeigt. Es wurde eine potentielle Ribosomenbindungsstelle (AGG GGG) acht Basenpaare stromaufwärts des ATG-Start-Codons des offenen Leserasters gefunden. Der C-terminale Teil der Sequenz stimmt mit der veröffentlichten Mersacidin- Primerstruktur (S. Chatterjee et al. (1992), J. Antibiotics 45: 832–838) und seiner vorgeschlagenen Propeptidsequenz überein. Der N-terminale Teil besteht aus einer 48 Aminosäure-Leader-Sequenz (Pfeil in 2). Das Promersacidin besteht aus 20 Aminosäuren. Die volle Länge des Präpeptids ist somit 68 Aminosäuren mit einer berechneten Molekularmasse von 7228 Da. Acht Basen stromabwärts des TAA (Ochre)-Stop-Codons wurde eine Haarnadelstruktur mit einem freien Energiewert von –86,7 kJ Mol–1 und einer Stammgröße von 14 Basenpaaren gefunden, welche als ein rho-unabhängiger Terminator während der Transkription dienen könnte, da ihr eine TTTATT-Sequenz folgt (2).
  • 3. Charakterisierung des Mersacidinpräpeptids
  • Lantibiotika wurden in zwei Gruppen eingeteilt (G. Jung (1991), oben). Typ A-Lantibiotika sind verlängerte amphiphile Peptide, welche vorübergehende Poren in den Membranen empfindlicher Bakterien ausbilden (H.-G. Sahl (1991), Pore formation in bacterial membranes by cationic lantibiotics, S. 347–358. In G. Jung und H.-G. Sahl (Hrsg.), Nisin and novel lantibiotics, Escom, Leiden). Typ B-Lantibiotika sind globulare Peptide, welche durch Streptomyces produziert werden, sie besitzen Molekülmassen kleiner als 2100 Da und sind hochhomolog was ihre Aminosäuresequenz und Ringstruktur betrifft, was eine Kopf-zu-Schwanz-Kondensation umfaßt (G. Jung (1991), oben). Bislang konnte Mersacidin nicht in eine der Gruppen klassifiziert werden (G. Bierbaum und H.-G. Sahl (1993), Zbl. Bakt. 278: 1–22). In dieser Hinsicht ist der Vergleich der Präpeptidsequenz von Mersacidin mit jener von Typ A- und Typ B-Lantibiotika von besonderem Interesse.
  • Es sind zwei übliche Charakteristika von lantibiotischen Leader-Sequenzen in Mersacidin konserviert: i) Es gibt kein Cystein in der Leader-Sequenz (G. Jun (1991), oben), ii) es wird eine α-Helixneigung für den C-terminalen Teil der Leader- Sequenz vorhergesagt. Derartige Strukturelemente sind auch für die Leader-Peptide von Typ A-Lantibiotika durch zirkulare Dichroismus-Messungen in Trifluorethanol/Wasser-Gemischen vorhergesagt und gezeigt worden (A. G. Beck-Sickinger und G. Jung. Synthesis and conformational analysis of lantibiotic leader-, pro- and prepeptides, S. 218–230. In G. Jung und H.-G. Sahl (Hrsg.), Nisin and novel lantibiotics, Escom, Leiden 1991). In jeder anderen Hinsicht unterscheidet sich die Mersacidin-Leader-Sequenz von den bislang beschriebenen Typ A-Lantibiotika-Leader-Sequenzen: Wie in 3 gezeigt, ähnelt sie in der Länge und in der Ladungsverteilung (48 Aminosäuren/12 Ladungen) eher der unüblich langen 59 Aminosäure-Leader-Sequenz (11 Ladungen) vom Typ B-Lantibiotikum Cynnamycin (C. Kaletta et al. (1989), Pep5, a new lantibiotic: strucutral gene isolation and prepeptide sequence. Arch. Microbiol. 152: 16–19). Im Gegensatz dazu enthält eine typische, eine hohe Ladung aufweisende Typ A-Lantibiotikum-Leader-Sequenz, z. B. das Pep5-Leader-Peptid, 10 geladene Reste in insgesamt nur 26 Aminosäuren (C. Kaletta et al. (1989), oben). Konservierte Sequenzen von Typ A-Lantibiotika (z. B. das F D/N L D/E-Motif) werden im Mersacidin-Leader-Peptid nicht gefunden. Die Proteasespaltungstelle der Mersacidin-Leader-Sequenz (–4M-–3E-–2A-–1A-+1C) unterscheidet sich von der konservierten Stelle der Typ A-Lantibiotika (3). Hier finden wir entweder die Nisin-Typ-Spaltungsstelle (–1, positiv geladene Aminosäure; –2, Prolin; –3, negativ geladen oder polar und –4 hydrophob) oder die hydrophobes Glycin enthaltenden Spaltungsstellen von Lacticin 481 (J.-C. Piard et al. (1993), J. Biol. Chem., 268, 16361–16368) oder Streptococcin A-FF22 (W. L. Hynes et al. (1993), Appl. Env. Micorbiol. 59: 1969–1971). Die (–3A-–2F-–1A)-Spaltungsstelle von Cinnamycin (C. Kaletta et al. (1989), oben) stimmt mit der (–3A-–2X-–1A)-Regel für Proteine überein, welche über den Sec-Pfad ausgeschieden werden. Schließlich zeigt das Mersacidin-Präpeptid keine Homologien zu den konservierten Sequenzen von Typ A-Lantibiotika-Leader- Sequenzen. Es besteht Ähnlichkeit zum Präpeptid von Cinnamycin in der Länge und in der Ladungsverteilung, aber keine offensichtliche Sequenzhomologie am Aminosäureniveau. Mersacidin ist kleiner als Typ A-Lantibiotika, es ist nicht positiv geladen und es depolarisiert keine Membranen, sondern es inhibiert eher die Peptidoglycanbiosynthese. Dies weist, zusätzlich zu den Eigenschaften des Leader-Peptids, darauf hin, daß Mersacidin mehr mit den Typ B-Lantibiotika als mit den Typ A-Lantiobiotika verwandt ist. Vor kurzem wurde das Sequenz- und Überbrückungsmuster eines weiteren Lantibiotikums, Actagardin, welches ebenfalls die Zellwandbiosynthese inhibiert (S. Somma et al., Antimicrob. Agents Chemother. 11: 396–401, 1977) aufgeklärt. Ein Vergleich mit Mersacidin zeigt, daß ein Ring nahezu vollständig in beiden Lanitbiotika konserviert ist. Im Hinblick auf die starke Homologie der bislang charakterisierten Typ B-Lantibiotika Duramycin A, B, C, Ancovenin und Cinnamycin könnten diese Peptide auch als Strukturvarianten betrachtet werden, wie es für Epidermin und Gallidermin oder Nisin A und Nisin Z beobachtet wird. Wir schlagen daher vor, daß Mersacidin und Actagardin mit den Typ B-Lantibiotika klassifiziert werden sollten und daß die Bezeichung Typ B-Lantibiotikum nicht ausschließlich für Strukturvarianten von Duramycin reserviert sein sollte, sondern auch schmale, globulare Lantibiotika umfaßt, welche eine niedrige Ladung tragen und Enzymaktivität zeigen.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00090001
  • Figure 00100001
  • Figure 00110001

Claims (8)

  1. Prämersacidin mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ-ID NR: 4 von Aminosäure Nr. 1 bis 68 gezeigt ist.
  2. DNA, welche für Prämersacidin nach Anspruch 1 codiert.
  3. DNA, welche für Prämersacidin codiert, mit der Nucleinsäuresequenz, wie sie in SEQ-ID Nr: 3 von Nucleinsäure Nr. 22 bis 225 gezeigt ist.
  4. DNA, welche für Promersacidin codiert, mit der Nucleinsäuresequenz, wie sie in SEQ-ID Nr: 3 von Nucleinsäure Nr. 166 bis 225 gezeigt ist.
  5. Vektor mit einer DNA nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4.
  6. Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach Anspruch 5.
  7. Verfahren zur Herstellung von Prämersacidin, Promersacidin oder reifem Mersacidin, enthaltend die Schritte: a) Kultivieren einer geeigneten Wirtszelle, welche eine DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 2 bis 4 enthält, unter geeigneten Bedingungen; und b) Isolieren von Prämersacidin, Promersacidin oder reifem Mersacidin.
  8. Verwendung von Premersacidin mit der SEQ-ID Nr: 4 von Aminosäure Nr. 1 bis 68 zur Herstellung von reifem Mersacidin.
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