DE10055789A1 - DNA-Sequenz und Microcin aus Escherichia coli StammDSM 6601 - Google Patents
DNA-Sequenz und Microcin aus Escherichia coli StammDSM 6601Info
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz mit der in Abbildung dargestellten Nucleotidfolge und das dadurch codierte Peptid, Derivate des Peptids sowie die Verwendung der DNA-Sequenz, des Peptids sowie der Peptidderivate.
Description
Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz und ein neues hierdurch
codiertes Microcin aus Escherichia coli Stamm DSM 6601.
Escherichia coli ist ein gramnegatives Bakterium, das in der menschlichen
und tierischen Darmflora, aber auch extraintestinal vorkommt. E. coli tritt in
zahlreichen Varianten auf, die sich hinsichtlich der Kapsel-, Oberflächen-
und Flagellenantigene unterscheiden und in zahlreiche serologische
Typen unterteilt werden können. Die Einordnung nach den Serotypen läßt
allerdings keine Aussage über die unterschiedliche Virulenz der Keime zu.
Vertreter ein- und desselben Serotyps können sowohl im menschlichen
als auch im tierischen Körper ein unterschiedliches Pathogenitätspotential
besitzen, das im Extremfall von avirulent bis hochgradig pathogen reichen
kann. Der E. coli Stamm DSM 6601 gehört zu der Serogruppe O6:K5 und
wird als nicht human und nicht tierpathogen bewertet.
Als Bakteriocine bezeichnet man spezifische Proteine, die von bestimmten
Bakterien produziert werden und mit abtötender Wirkung gegen andere
Stämme derselben oder einer nahe verwandten Bakterienart gerichtet
sind. Es sind bereits über zwanzig Colicine aus E. coli bekannt, die jeweils
hohe antibakterielle Spezifität aufweisen. Zu den Bakteriocinen zählen
auch die sogenannten Microcine, die u. a. auch von bestimmten E. coli-
Stämmen produziert werden. Bakteriocine werden, abgesehen von ihrer
antibiotischen Wirkung, für die Taxonomie von Bakterienstämmen
eingesetzt.
Es war bekannt, daß E. coli Stamm DSM 6601 antibiotische Aktivität
aufweist, die dem Vorhandensein eines Microcins zugeschrieben wurde,
das im folgenden als Microcin M (McmC) bezeichnet wird. Versuche, das
Peptid durch Anreicherung aus Flüssigkulturen oder durch Extraktion von
Kulturen auf Agarplatten oder aus dem Agar anzureichern, brachten keine
verwertbaren Ergebnisse. Es wurde daher versucht, das Microcin mit Hilfe
genetischer Methoden zu identifizieren. Mit dem oben genannten Stamm
von E. coli wurde eine Mu-Mutagenese durchgeführt. Der Phage Mu kann
sich nach Infektion einer Bakterienzelle wie ein Transposon verhalten und
an einem beliebigen Ort in der DNA integrieren und dadurch eine Mutation
hervorrufen. Im vorliegenden Fall wurde der Phage Mud 1 nach der
Vorschrift von Casadaban (Casadaban und Cohen, 1979, Proc. Natl. Acad
Sci. 76, 4530-4533) verwendet. Durch die Mutagenese wurde eine
Mutante isoliert, die kein Microcin mehr produzierte. Aus der
chromosomalen DNA dieser Mutante wurde das für die Microcinsynthese
kodierende DNA-Fragment isoliert und nach Insertion in den Vektor
pUC18 und PCR-Amplifikation kloniert und sequenziert.
Überraschenderweise wurde anhand der Sequenzanalyse festgestellt,
daß die mcm-Region aus E. coli DSM 6601 einen dem Colicin V ähnlichen
Hemmstoff kodiert, der im folgenden Microcin M (McmC) genannt wird.
Die Abb. 1 zeigt die entsprechende Sequenz der mcm-Region.
Die Abb. 1a zeigt in der Übersicht die in diesem Bereich aufgrund
der DNA-Sequenz vorhergesagten Gene. Die Genprodukte McmA und
McmB zeigen hohe Sequenzähnlichkeit zu den Exportproteinen für Colicin
und Microcin 24. Es folgt das Gen mcmI, dessen Produkt nur geringe
Ähnlichkeit zu den Immunitätsproteinen der beiden obigen Microcine zeigt.
Direkt im Anschluß wird das Microcin M (McmC) kodiert. Das darauf
folgende Gen mcmP wird in entgegengesetzter Richtung abgelesen und
wirkt aufgrund seiner Homologien zum cvpA-Gen (Colicin V Produktion)
bei der Expression von McmC mit. Stromauf vom mcmA-Gen liegt das
Gen mcmD, dessen Produkt Ähnlichkeit mit den fettsäureübertragenden
Proteinen (Transacylasen) aufweist, die auch in die posttranslationale
Modifikation der E. coli-Hämolysine involviert sind.
Zur Erläuterung wird darauf hingewiesen, daß das Protein CvaB zur
Familie der MDR-Proteine (Multi-Drug-Resistance) gehört, die ATP-
abhängig den Export oder Import von kleinen Substanzen, aber auch den
Export von Proteinen katalysieren. Es handelt sich um Proteine mit 6 oder
8 hydrophoben Helices in der Membran und einer Domäne mit einer ATP-
spaltenden Aktivität, womit der Transportvorgang energetisiert wird. Die
ATP-spaltende Aktivität kann auch als separates Protein vorliegen. CvaB
und zehn weitere verwandte Proteine besitzen im Gegensatz zu anderen
MDR-Proteinen eine N-terminale Domäne mit Cysteinproteinase-Aktivität
im Cytoplasma. Diese Proteinase spaltet beim Export eine kleine
Leaderpeptidsequenz vom N-terminalen Ende des Colicins V ab und zwar
nach der Gly-Gly Erkennungssequenz (siehe Pfeil bei dem
Homologieversuch in Abb. 1a). Eine solche Gly-Gly Sequenz findet
sich auch in der abgeleiteten Sequenz für das unreife McmC, einem
Peptid aus 92 Aminosäuren. Für das reife McmG-Peptid ist somit eine
Kettenlänge von 77 Aminosäuren vorgegben.
Das Protein CvaA wird über eine alpha-Helix in der Cytoplasmamembran
verankert und dient als Verbindungsprotein (Connector) zur äußeren
Membran. In der äußeren Membran bindet CvaA an das TolC Protein.
Soweit bekannt, bilden die Proteine CvaB, CvaA und TolG einen
Proteinkomplex, der den Export von Colicin V über die
Cytoplasmamembran und die äußere Membran in einem Schritt
katalysiert. Sehr ähnliche Exportapparate hat man z. B. für das E. coli-
Hämolysin oder für Proteinasen aus Erwinia-Arten gefunden. Aufgrund der
hohen Ähnlichkeit zu CvaA und CvaB dürften das McmA und McmB
dieselben Funktionen beim Export und bei der Reifung von McmC erfüllen.
In den nachfolgenden Tabellen ist die prozentuale Identität der Microcine,
der Exportproteine und der Immunitätsproteine sowie die prozentuale
Identität im Vergleich zu anderen verwandten Proteinen
zusammengestellt:
Aufgrund der DNA-Analyse ergibt sich für die neue Substanz ein Peptid
mit 77 Aminosäuren, das aufgrund seiner Größe den Microcinen
zugerechnet wird. Dieses reife Microcin (MemC) zeigt aber nur geringe
Sequenzhomologie zu bekannten Polypeptiden wie z. B. Colicin V.
Zur Synthese und zur näheren Untersuchung des Peptids wurden
überlappende Oligopeptide mit jeweils fünfzehn Aminosäuren
synthetisiert, also 1 bis 15, 5 bis 20, 10 bis 25 usw., und zwar durch
Oligopeptidsynthese unter Anwendung der Fmoc-Strategie auf einem
Polystyrol-1% Divinylbenzolharz mit 2-Chlortriphenylmethylchlorid als
Linker.
Die Gesamtsynthese des Microcin-Peptids kann in an sich bekannter
Weise durch Segmentkondensation auf dem Harz unter Verwendung von
drei bis vier Peptid-Segmenten und Einsatz des ABI-Peptidsynthesizers
erfolgen, wobei vorzugsweise so vorgegangen wird, daß mit dem an das
Harz gebundenen Segment I., bestehend aus den Aminosäuren 77 bis 54,
die gereinigten Segmente II. (Aminosäuren 53 bis 24) und III.
(Aminosäuren 23 bis 1) gekoppelt werden.
Die Herstellung von Lipopeptidmischungen zur Gewinnung von Antiseren
erfolgt in an sich bekannter Weise, wobei Pam3Cys-Lys-Ser-Peptide zur
Immunisierung verwendet werden können.
Zur Beschichtung von Streptavidinplatten für ELISA-Teste werden in an
sich bekannter Weise Biotinyl-Aca-Aca-Peptide verwendet, wobei diese
Beschichtungen sowohl mit den entsprechenden Einzelpeptiden als auch
mit einer Mischung von Peptiden durchgeführt werden können.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Beispiele näher erläutert:
Nach dem Verfahren von Casadaban et al. wurde eine Mutante, die kein
Microcin mehr produzierte, im Plattentest mit dem Indikatorstamm H1941
identifiziert. Chromosomale DNA dieser Mutante wurde isoliert und mit
dem Restriktionsenzym HincII verdaut, danach mit dem mittels Smal
geschnittenen Vektor pUC18 ligiert und mit den Primern MuD1 (spezifisch
für ein Mu-DNA-Ende) und UNI (spezifisch für den ligierten pUC18 Vektor)
in einer PCR amplifiziert. Das DNA-Fragment wurde nach bekannten
Verfahren (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis; Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) kloniert und
sequenziert. Es stellte sich heraus, daß dieses DNA-Fragment hohe
Sequenzähnlichkeit zu dem Colicin-V-Exportprotein B aufwies. Klonierung
und Sequenzanalyse des gesamten Bereiches zeigten, daß diese Region
einen dem Colicin V ähnlichen Hemmstoff kodiert.
Die Aminosäuresequenz des Microcin McmC läßt sich aus der DNA der
Region, die dieses Peptid kodiert, ableiten und ergibt sich aus der
beigefügten Abb. 3.
Zur Synthese des Peptids werden in an sich bekannter Weise (G. Jung,
Ed.; Combinatorial Peptide and Non-Peptide Libraries, Wiley VCH,
Weinheim, 1996) Oligopeptide mit fünfzehn Aminosäuren synthetisiert, die
überlappend die Aminosäuren 1 bis 15, 5 bis 20, 10 bis 25, 15 bis 30 usw.
aufweisen. Die Synthese erfolgt unter Verwendung von Fmoc-
Schutzgruppen auf einem Polystyrol-1%-Divinylbenzolharz nach dem
Merryfield-Verfahren mit 2-Chlortriphenylmethylchlorid als Linker.
Nach hinreichend langer Synthesedauer werden in den jeweiligen
Ansätzen die Peptide vom Harz gelöst und unter Verwendung von HPLC
und ES-MS-Spektroskopie untersucht. Die Sekundärstruktur kann zum
Teil durch Untersuchung des Circulardichroismus festgestellt werden.
Die Gesamtsynthese des Peptids aus siebenundsiebzig Aminosäuren
erfolgt unter Verwendung eines ABI-Peptidsynthesizers unter
Kondensation von Peptidsegmenten auf dem Harz, wobei vorzugsweise
mit dem harzgebundenen Peptidsegment I. (Aminosäuren 77 bis 54)
angefangen wird und dann die gereinigten Segmente II. (Aminosäuren 53
bis 24) und III. (Aminosäuren 23 bis 1) gekoppelt werden.
Die freien Peptide können über HPLC gereinigt werden, wobei die
Reinheit für die Derivatisierung etwa 90% betragen sollte.
Für die Derivatisierung zur Herstellung von Lipopeptiden wird nach
publizierten Verfahren vorgegangen (K.-H. Wiesmüller, G. Jung, G. Hess;
Vaccine 7: 29-33, 1989; G. Jung, K.-H. Wiesmüller, G. Becker, H.-J.
Bühring, WG Bessler; Angewandte Chemie [Internat. Ed.] 24: 872-873,
1985). Die Herstellung von für ELISA-Teste geeigneten biotinylierten
Peptiden erfolgt ebenfalls nach bereits publizierten Verfahren (G. Jung,
Ed.; Combinatorial Peptide and Non-Peptide Libraries, Wiley VCH,
Weinheim, 1996).
Claims (13)
1. DNA-Sequenz mit der in Abb. 1 dargestellten Nucleotidfolge.
2. Verwendung der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 in der
mikrobiologischen Analytik und/oder Diagnostik.
3. Verwendung der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 in der Biotechnik
als Expressionsvektor oder als Bestandteil von Multi-Copy-
Plasmiden zur Herstellung des antimikrobiellen Wirkstoffes.
4. Peptid mit der in Abb. 2 dargestellten Aminosäuresequenz.
5. Verwendung des Peptids nach Anspruch 4 zur Herstellung von
Antipeptid-Antikörpern.
6. Verwendung des Peptides nach Anspruch 4 als antimikrobieller
Wirkstoff zu mikrobiologischen oder medizinischen Zwecken.
7. Oligopeptide mit den in Abb. 3 dargestellten
Aminosäuresequenzen.
8. Verwendung der Oligopeptide nach Anspruch 7 zur Herstellung von
Antipeptid-Antikörpern.
9. Verwendung der Oligopeptide nach Anspruch 7 als antimikrobielle
Wirkstoffe zu mikrobiologischen oder medizinischen Zwecken.
10. Lipopeptide nach Anspruch 4 oder 7, gekennzeichnet durch
Kopplung zu Pam3Cys-Lys-Ser-Peptiden.
11. Peptide nach Anspruch 4 oder 7, gekennzeichnet durch Kopplung zu
Biotinyl-Aca-Aca-Peptiden.
12. Verwendung der Lipopeptide nach Anspruch 10 zur Herstellung von
Antiseren.
13. Verwendung der Peptide nach Anspruch 11 zur Herstellung von
ELISA-Tests.
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