FI120100B - Yhdistelmä-mersasidiini ja sen valmistusmenetelmä - Google Patents

Description

Yhdistelraä-mersasidiini ja sen valmistusmenetelmä Tämä keksintö liittyy erityisesti mersasidiini-peptidiantibiootin rakennegeenin sekvenssiin. Sekvensoin-5 nilla on saatu selville, että premersasidiini koostuu epätavallisen pitkästä 48 aminohapon johtosekvenssistä ja 20 aminohapon propeptidiosasta, joka biosynteesin aikana muokkautuu kypsäksi lantibiootiksi.

Mersasidiini kuuluu bakterisidisten peptidien ryh-10 mään, jolle on annettu nimitys lantibiootit, millä halutaan painottaa sitä, että nämä peptidit sisältävät harvinaisia aminohappoja lantioniinia ja/tai 3-metyylilantio-niinia. Näissä peptideissä esiintyy säännönmukaisesti myös muita muunnettuja aminohappoja, kuten dehydroalaniinia ja 15 dehydrobutyriinia, kun taas S-aminovinyylikysteiiniä ja lysinoalaniinia esiintyy vain muutamissa lantibiooteissa [Jung, G., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30 (1991) 1051 -1068]. Lantibiootit ovat grampositiivisten bakteerien tuottamia ja ne ovat muodostuneet ribosomeissa syntetoitu-20 neista prepeptideistä. Lantibioottien rakennegeenejä on löydetty joko bakteerien kromosomista (esimerkiksi subtiilini ja kinnamysiini) tai liittyneenä siirtymiskykyisiin elementteihin, kuten transposoneihin (esimerkiksi nisiini) tai suuriin plasmideihin (esimerkiksi epidermiini ja 25 Pep5). Prepeptidit koostuvat N-terminaalisesta johtosekvenssistä, joka pilkkoutuu pois, kun prepeptidiä tuottava solu on kuljettanut prepeptidin ulos solusta, sekä C-ter-minaalisesta propeptidistä, joka muokkautuu translaation jälkeen kypsäksi lantibiootiksi [Jung, G., (1991), edel- 30 lä]. Muokkautumisen ensimmäisessä vaiheessa seriiniryhmä dehydroituu dehydroalaniiniksi (Dha) ja treoniiniryhmä dehydrobutyriiniksi (Dhb) [Weil, H.-P., et ai., Eur. J. Biochem. 194 (1990) 217 - 223]. Kysteiiniryhmien SH-ryhmät reagoivat sitten Dha:n tai Dhb:n kaksoissidosten kanssa, 2 mistä muodostuu Dha:n yhteydessä lantioniineja tai Dhb:n yhteydessä metyylilantioniineja.

Mersasidiini eristettiin Bacillus-lajin HIL Y-85,54728:n viljelmän supernatantista ja se herätti huo-5 miota, koska se on erittäin tehokas metisilliiniresistent-tiä Staphylococcus aureusta (MRSA) vastaan in vivo -olosuhteissa [Chatterjee, S., et ai., J. Antibiotics 45 (1992) 839 - 845]. Mersasidiini on pienikokoisin (1 825 Da) tähän mennessä eristetty lantibiootti, joka syntetoituu 20 amino-10 hapon propeptidistä ja sisältää 3 metyylilantioniiniryhmää, yhden dehydroalaniiniryhmän ja yhden S-aminovinyyli-2-metyylikysteiiniryhmän (kuvio IA) [Chatterjee, S., et ai., J. Antibiotics 45 (1992) 832 - 838]. Mersasidiinissa ei ole lainkaan nettovarausta ja se on ominaisuuksiltaan kokonaan 15 hydrofobinen. Viimeaikaiset koetulokset ovat osoittaneet, että mersasidiini estää peptidoglykaanien biosynteesiä. Tämä tapahtuu todennäköisimmin transglykosylaatiotasolla mekanismilla, joka poikkeaa nykyisin käytössä olevien MRSA:ta vastaan suunnattujen antibioottien mekanismeista.

20 Näistä syistä tämä keksintö liittyy premersasidii- niin, jonka aminohapposekvenssi on kuviossa 2 esitetyn sekvenssin mukainen ja joka sisältää aminohapot nro 1-68.

Tämän keksinnön toisena sovellutusmuotona ovat pre-mersasidiinia tai promersasidiinia koodaavat DNA-mole-25 kyylit, erityisesti DNA-molekyylit, joiden nukleotidise-kvenssi on kuviossa 2 esitetyn sekvenssin mukainen ja jotka sisältävät premersasidiinia koodaavat nukleotidit nro 22 - 225 tai promersasidiinia koodaavat nukleotidit nro 166 - 225; mainittua DNA:ta sisältävä vektori ja mainittua 30 vektoria sisältävä isäntäsolu.

3

Toisena sovellutusmuotona on premersasidiinin, pro-mersasidiini tai kypsän mersasidiinin valmistusmenetelmä, jossa käytetään tämän alan ammattikokemuksen perusteella tunnettuja geeniteknisiä menetelmiä, toisin sanottuna pre-5 mersasidiinia tai promersasidiinia koodaavia mainittuja DNA-molekyylejä sisältävää sopivaa isäntäsolua viljellään sopivissa olosuhteissa, minkä jälkeen eristetään mainitun isäntäsolun, edullisesti grampositiivisen bakteerin, kuten Bacillus-, Streptomyces- tai Streptococcus-bakteerin, il-10 mentämä premersasidiini, promersasidiini tai kypsä mersa-sidiini.

Lopuksi on mainittava, että tämän keksinnön mukaista premersasidiini- tai promersasidiinipeptidiä tai niiden geenejä voidaan käyttää kypsän mersasidiinin valmistukses-15 sa esimerkiksi julkaisussa WO-90/00 558 kuvatulla tavalla.

Kypsä mersasidiini on käyttökelpoista esimerkiksi peptidiantibioottina elintarvikkeiden säilönnässä erityisesti metisilliiniresistenttiä Staphylococcus aureusta vastaan tai antibioottina ihmisten tai eläinten Staphylo-20 coccus aureus -infektioiden hoitoon. Keksintöä voidaan lisäksi käyttää sellaisten entistä laajakirjoisempien tai tehokkuudeltaan poikkeavien mersasidiinijohdannaisten aikaansaamiseksi, joiden aminohapposekvenssiä on muokattu. Lisäksi tämä keksintö avaa uusia tapoja mersasidiinin tai 25 sen johdannaisten ilmentämiseksi geenitekniikalla normaalitasoa voimakkaammin.

Piirrosten kuvaus

Kuvio 1: A) Mersasidiini-lantibiootin rakenne. B) Oletettu prepeptidisekvenssi ja parhaan arvauksen mu-30 kainen 51 emäksen pituinen sekvenssi (guessmer), jota käytettiin rakennegeenin tunnistukseen.

Kuvio 2: Mersasidiini-lantibiootinmrsA-rakennegee-nin nukleotidisekvenssi ja prepeptidin päätelty aminohapposekvenssi. ATG-aloituskodonin edellä oleva ribosomia 35 sitova kohta on ympäröity suorakaiteella ja muokkautumis- 4 kohta on merkitty nuolella. Oletettu rho:sta riippumaton terminaattorisekvenssi on alleviivattu.

Kuvio 3: Useiden lantibioottien johtosekvenssien vertailu. Säilyneet sekvenssit on merkitty lihavoinnilla.

5 Esimerkki 1. Mersasidiinin rakennegeenin kloonaus Mersasidiinin oletettu propeptidisekvenssi (kuvio IB) pääteltiin mersasidiinin rakenteen perusteella ja se perustuu yleisiin tietoihin lantibioottien biosynteesistä. 10 Kuvattu koetin syntetoitiin PCR-MateR-laitteella (Applied Biosystems, Weiterstadt, Saksa) parhaan arvauksen mukaisena 51 emäksen sekvenssinä, joka perustuu Bacilluksen kodo-nipreferenssiin, ja se varustettiin digoksigeniinileimalla (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Saksa) (kuvio IB). Amino-15 butyryyliryhmät (metyylilantioniinin Abus-puoli) ovat peräisin treoniiniryhmistä kun taas alaniiniryhmät (metyylilantioniinin Alas-puoli) on propeptidissä koodattu kysteii-niryhminä. Terminaalisen rengasrakenteen muodostava S-ami-novinyyli-2-metyylikysteiini muodostuu luultavasti oksida-20 tiivisesti dekarboksyloituneesta metyylilantioniinista, kuten C-terminaalisen S-aminovinyylikysteiinin sisältävän epidermiinin osalta on osoitettu [Kupke, T., et ai., J. Bacteriol. 174 (1992) 5354 - 5361].

Koska tuottajakannasta ei pystytty havaitsemaan 25 plasmideja, niin kromosomaalinen DNA valmistettiin Marmu-rin [Marmur, J., J. Mol. Biol. 3 (1961) 208 - 218] kuvaamalla menetelmällä sillä poikkeuksella, että tehtiin vain yksi uuttaminen ja saostus kloroformilla ja että sen jälkeen DNA liuotettiin tasapainotuspuskuriliuokseen ja puh-30 distettiin QiagentipR 100 -kolonnissa (Diagen, Hilden,

Saksa). Seoksesta, joka oli saatu kromosomin pilkkomisesta Hind III -restriktioentsyymillä, hybridisoitui Southern-blottauksessa [Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98 (1975) 503 - 517] 51 °C:ssa koettimeen vain yksi 2 ke:n suurui-35 nen vyöhyke. 1,9 - 2,3 ke:n suuruiset fragmentit leikat- 5

tiin irti geelistä, eluoitiin BiotrapR-eluointiaineella (Schleicher ja Schull, Dassel, Saksa) ja jatkokloonattiin vektoriin pUC18 [Yanish-Perron, C. , et ai., Gene 33 (1985) 103 - 109] E. colissa. Useista yhdistelmä-pesäkkeistä pe-5 räisin olevat plasmidit valmistettiin Birnboimin ja Dolyn menetelmällä [Birnboim, H.C. ja Doly, J., Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513 - 1523], pilkottiin Hind III :11a ja käsiteltiin koettimella, jonka sekvenssi oli parhaan arvauksen mukainen. Yhtä positiivisen signaalin antanutta kloo-10 nia tutkittiin tarkemmin pilkkomalla sitä ensin monilla erilaisilla restriktioentsyymeillä ja tekemällä sitten Southern-blottaukset. Lopuksi 1,3 ke:n suuruinen EcoR I -Hind III -fragmentti jatkokloonattiin vektoreihin pEMBL 18 ja pEMBL 19 [Dente, L., et ai., Nucleic Acids Res. 11 15 (1983) 1645 - 1655] E. colissa. Lisäksi 0,6 ke:n EcoR V

-fragmentti kloonattiin pCUl-vektoriin [Augustin, J. , et ai., Eur. J. Biochem. 204 (1992) 1149 - 1154] sen jälkeen, kun EcoR I -kohta oli muokattu kohdemutageneesillä EcoR V -kohdaksi käyttäen transformaatiokohdemutageneesipakkausta 20 (Clontech, Palo Aito, USA).

2. Mersasidiinin mrsA-rakennegeenin nukleotidisek- venssi Tämä 0,6 ke:n fragmentti sekvensoitiin kaksinauhai-sesta DNA:sta automaattisella A.L.F.-DNA-sekvensointilait-25 teella (Pharmacia, Bryssel, Belgia) käyttäen ketjun di-deoksiterminaatiomenetelmää [Sanger, F., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467]; alukkeina käytettiin AutoreadR-sekvensointipakkauksen (Pharmacia, Bryssel, Belgia) yleisaluketta ja käänteisaluketta (rever-30 sal primer) sekä kahta synteettistä oligonuklotidia 5'-(TCTCTTCCATTTTTTTG)3' ja 5'-(AAATCAAATTAACAAATAC)3'. Mersasidiinin mrsA-rakennegeenin nukleotidisekvenssi on esitetty kuviossa 2. Mahdollinen ribosomia sitova kohta (AGG GGG) löydettiin kahdeksan emäsparin päästä avoimen 35 lukukehyksen ATG-aloituskodonista vastasuuntaan. Sekvens- 6 sin C-terminaalinen osa sopii yhteen mersasidiinin julkaistun primaarirakenteen kanssa [Chatterjee, S., et ai., J. Antibiotics 45 (1992) 832 - 838] sekä sen ehdotetun propeptidisekvenssin kanssa. N-terminaalinen osa koostuu 5 48 aminohapon johtosekvenssistä (nuoli kuviossa 2). Pro- mersasidiini koostuu 20 aminohaposta. Prepetidin kokonaispituus on siis 68 aminohappoa ja sen laskennallinen suhteellinen moolimassa on 7 228 Da. Kahdeksan emäksen päästä TAA (okra)-lopetuskodonista myötäsuuntaan löydettiin sil-10 mukkarakenne, jonka vapaan energian arvoksi saatiin -86,7 kJ mol"1 ja kannan kooksi saatiin 14 emäsparia ja joka voisi toimia rho:sta riippumattomana terminaatiosekvenssinä transkription aikana sitä seuraavan TTTATT-sekvenssin johdosta (kuvio 2).

15 3. Mersasidiinipeptidin karakterisointi

Lantibiootit on jaettu kahteen alaryhmään [Jung, G., (1991), edellä)]. A-tyypin lantibiootit ovat pitkän omaisia amfifiilisiä peptideitä, jotka muodostavat väliaikaisia reikiä niille herkkien bakteerien membraaneihin 20 [Sahl, H.-G., Pore formation in bacterial membranes by cationic lantibiotics, teoksessa Jung, G. ja Sahl, H.-G. (toim.), Nisin and novel lantibiotics (1991) 347 - 358, Escom, Leiden). B-tyypin lantibiootit ovat Streptomyces-bakteerin tuottamia globulaarisia peptidejä, joiden suh-25 teellinen moolimassa on alle 2 100 Da ja jotka ovat erittäin homologisia aminohapposekvenssin ja sellaisen rengas-rakenteen suhteen, joka sisältää alkupään kondensoitumisen loppupäähän [Jung, G., (1991), edellä]. Tähän mennessä mersasidiinia ei pystytty luokittelemaan kumpaankaan ryh-30 mään kuuluvaksi [Bierbaum, G. ja Sahl, H.G., Zbl. Bakt.

278 (1993) 1 - 22]. Tässä mielessä on erityisen mielenkiintoista verrata mersasidiinin prepeptidisekvenssiä A-ja B-tyypin lantibioottien prepeptidisekvensseihin.

Mersasidiinissa on säilynyt kaksi lantibioottien 35 johtosekvensseille yhteistä ominaispiirrettä: i) johtosek- 7 venssissä ei ole kysteiiniä [Jung, G., (1991), edellä], ii) johtosekvenssin C-terminaalisessa osassa otaksutaan olevan taipumusta a--kierteen muodostumiseen. A-tyypin lan-tibioottien johtopeptidien kyseessä ollessa on tällaisten 5 rakenne-elementtien olemassaolo ennustettu ja osoitettu määrittämällä Sirkulaarinen dikroismi trifluorietanolin ja veden seoksissa (Beck-Sickinger, A.G. ja Jung, G., Synthesis and conformational analysis of lantibiotic leader-, pro- and prepeptides, teoksessa Jung, G. ja Sahl, H.-G. 10 (toim.), Nisin and novel lantibiotics (1991) 218 - 230,

Escom, Leiden). Mersasidiinin johtosekvenssi on kaikissa muissa suhteissa tähän mennessä kuvatuista A-tyypin lanti-bioottien johtosekvensseistä poikkeva: kuvion 3 mukaisesti se muistuttaa pituudeltaan ja varausjakaumaltaan (48 ami-15 nohappoa ja 12 varausta) pikemminkin B-tyypin lantibioo-tin, kinnamysiinin, epätavallisen pitkää 59 aminohapon johtosekvenssiä (11 varausta) [Kaletta, C. et ai., Pep5, a new lantibiotic: structural gene isolation and prepetide sequence, Arch. Microbiol. 152 (1989) 16 - 19]. Sitä vas-20 toin tyypillisessä voimakkaasti varautuneessa A-tyypin lantibiootin johtosekvenssissä, esimerkiksi Pep5-johtosek-venssissä, on yhteensä vain 26 aminohappoa 10 varauksellista ryhmää kohti [Kaletta, C. (1989), edellä). A-tyypin lantibioottien säilyneitä sekvenssejä (esimerkiksi F D/N 25 L D/E -sekvenssimotiivi) ei esiinny mersasidiinin johto-peptidissä. Mersasidiinin johtosekvenssin proteaasilla pilkkoutuva kohta ("4M - "3E - '2A - _1A - +1C) poikkeaa A-tyypin lantibioottien säilyneestä kohdasta (kuvio 3). Tässä on havaittu joko nisiinityyppinen pilkkoutumiskohta 30 (-1, positiivisesti varautunut aminohappo; -2, proliini; -3, negatiivisesti varautunut tai polaarinen ja -4, hydrofobinen) tai hydrofobinen glysiini, joka sisältää lakti-siini 481 :n, Piard, J.-C., et ai., J. Biol. Chem 268 (1993) 16361 - 16368, tai streptokokkiini A-FF22:n [Hynes, 35 W.L., et ai., Appi. Env. Microbiol. 59 (1993) 1969 - 1971] 8 pilkkoutumiskohtia. Kinnamysiinin (_3A - ”2F - _1A) -pilkkou-tumiskohta [Kaletta, C., et al., (1989), edellä] on yhdenmukainen Sec-reaktiotien kautta erittyvien proteiinien ("3A - ~2X - _1Α) -säännön suhteen. Johtopäätöksenä voidaan 5 sanoa, että mersasidiinin prepeptidissä ei esiinny A-tyy-pin lantibioottien johtosekvenssien säilyneiden sekvenssien suhteen homologisia kohtia. Mersasidiinin prepeptidin pituus ja varausjakauma muistuttavat kinnamysiinin prepeptidin vastaavia ominaisuuksia, mutta aminohappotasolla ei 10 ole havaittavissa ilmiselvää sekvenssihomologiaa. Mersasi-diini on A-tyypin lantibiootteja pienempi, sillä ei ole positiivista varausta eikä se depolarisoi membraaneja vaan ennemminkin inhiboi peptidoglykaanien biosynteesiä. Tämä sekä johtopeptidin ominaisuudet osoittavat, että mersasi-15 diini muistuttaa enemmän B-tyypin lantibiootteja kuin A-tyypin lantibiootteja. Viime aikoina on saatu selville toisen, niin ikään soluseinän biosynteesiä inhiboivan lan-tibiootin, aktagardiinin, sekvenssi ja yhdyssiltojen muodostuminen [Somma, S., et ai., Antimicrob. Agents Che-20 mother. 11 (1977) 396 - 401]. Vertailu mersasidiiniin osoittaa, että yksi rengas on lähes täysin säilynyt kummassakin lantibiootissa. Tähän mennessä karakterisoitujen B-tyypin lantibioottien, duramysiini-A:n, -B:n, -C:n, an-koveniinin ja kinnamysiinin välisen suuren homologian huo-25 mioon ottaen myös näitä peptidejä voidaan pitää rakenteellisina variantteina, kuten on havaittu epidermiinin ja gallidermiinin tai nisiini A:n ja nisiini Z:n yhteydessä. Edellä mainituista syistä tässä keksinnössä tehdään ehdotus, jonka mukaan mersasidiini ja aktagardiini olisi luo-30 kiteltava B-tyypin lantibiooteiksi ja ettei B-tyypin lan-tibiooteilla tarkoitettaisi ainoastaan duramysiinin rakenteellisia variantteja vaan että niihin kuuluisivat myös pienet globulaariset pienivarauksiset lantibiootit, jotka inhiboivat entsyymiaktiivisuutta.

9

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANTS

(A) NAMES Hoechst Aktiengesellschaft (B) STREETS - (C) CITY: Frankfurt am Main (D) STATE: - (E) COUNTRY: Germany (F) POSTAL CODE (ZIP): 65926 (G) TELEPHONE: 069-305-6031 (H) TELEFAX: 069-35 7175 (I) TELEX: 41234700 hod (ii) TITLE OF INVENTION: Recombinant Mersacidin and a method for production (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 4 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: YES

(iii) ANTI-SENSE: YES

(vi) FEATURE: (A) NAME/KEY: exon (B) LOCATION: 1..17 (ix) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: TCTCTTCCAT TTTTTTG 17 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: YES

(iii) ANTI-SENSE: YES

(vi) FEATURE: (A) NAME/KEY: exon (B) LOCATION: 1..19 10 (ix) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: ÄAATCAAATT AACAAATAC 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 288 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: YES

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) SCIENTIFIC NAME: Mersacidin (B) STRAIN: Bacillus (C) INDIVIDUAL ISOLATE: HIL Y-85,54728 (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: RBS

(B) LOCATION: 1..21 (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 22..225 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Terminator (B) LOCATION: 208..288 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: CTTAATAAGG GGGTGAATAC A ATG AGT CAA GAA GCT ATC ATT CGT TCA TGG 51

Met Ser Gin Glu Ala lie lie Arg Ser Trp 15 10 AAA GAT CCT TTT TCC CGT GAA AAT TCT ACA CAA AAT CCA GCT GGT AAC 99

Lys Asp Pro Phe Ser Arg Glu Asn Ser Thr Gin Asn Pro Ala Gly Asn 15 20 25 CCA TTC AGT GAG CTG AAA GAA GCA CAA ATG GAT AAG TTA GTA GGT GCG 147

Pro Phe Ser Glu Leu Lys Glu Ala Gin Met Asp Lys Leu Val Gly Ala 30 35 40 GGA GAC ATG GAA GCA GCA TGT ACT TTT ACA TTG CCT GGT GGC GGC GGT 195

Gly Asp Met Glu Ala Ala Cys Thr Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gly Gly 45 50 55 GTT TGT ACT CTA ACT TCT GAA TGT ATT TGT TAATTTGATT TATATAGGCT 245

Val Cys Thr Leu Thr Ser Glu Cys lie Cys 60 65 GTTTCCCTTC AGAAGGAACA GCCTATATTT TATTATATAA ACT 288 1 INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 68 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear 11 (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

Met Ser Gin Glu Ala lie lie Arg Ser Trp Lys Asp Pro Phe Ser Arg 15 10 15

Glu Asn Ser Thr Gin Asn Pro Ala Gly Asn Pro Phe Ser Glu Leu Lys 20 25 30

Glu Ala Gin Met Asp Lys Leu Val Gly Ala Gly Asp Met Glu Ala Ala 35 40 45

Cys Thr Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gly Gly Val Cys Thr Leu Thr Ser 50 55 60

Glu Cys lie Cys 65

Claims (8)

1. Premersasidiini, tunnettu siitä, että sen aminohapposekvenssi on aminohaposta nro 1 aminohappoon nro 5 68 kuviossa 2 esitetyn sekvenssin mukainen.

2. DNA, tunnettu siitä, että se koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaista premersasidiinia.

3. DNA, tunnettu siitä, että se koodaa premersasidiinia, jonka nukleiinihapposekvenssi on nukleiinihap- 10 ponumerosta 22 nukleiinihapponumeroon 225 kuviossa 2 esitetyn sekvenssin mukainen.

4. DNA, tunnettu siitä, että se koodaa pro-mersasidiinia, jonka nukleiinihapposekvenssi on nukleiini-happonumerosta 166 nukleiinihapponumeroon 225 kuviossa 2 esi- 15 tetyn sekvenssin mukainen.

5. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNArta, joka on jonkin patenttivaatimuksista 2, 3 tai 4 mukainen DNA.

6. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se si- 20 sältää patenttivaatimuksen 5 mukaisen vektorin.

7. Premersasidiinin, promersasidiinin tai kypsän mer- sasidiinin valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, jotka ovat: (a) viljellään patenttivaatimusten 2-4 mukaisen

25 DNA-sekvenssin sisältävää sopivaa isäntäsolua sopivissa olo suhteissa; ja (b) eristetään premersasidiini, promersasidiini tai kypsä mersasidiini.

8. Patenttivaatimuksen 1 premersasidiinin käyttö 30 kypsän mersasidiinin valmistamiseen.