KR100394289B1

KR100394289B1 - 재조합 머사시딘 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100394289B1
Application number: KR1019950029599A
Authority: KR
Inventors: 클라우스-페터콜러; 한스게오르그샬; 가브릴레비르바움
Original assignee: 훽스트 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1995-09-12
Publication date: 2003-10-22
Also published as: KR960010863A; CZ231895A3; CN1131192A; NZ272960A; SI9500270B; EP0700998B1; DE69433357D1; AU3055495A; ATE255165T1; EP0700998A1; DK0700998T3; PT700998E; HUT73800A; FI954220A; CZ285741B6; HU9502643D0; CA2157975C; IL115242A0; JPH0898695A; ES2207636T3

Abstract

본 발명은 특히 펩타이드 항생물질 머사시딘의 구조적 유전자 서열에 관한 것이다. 이의 서열분석은 프레머사시딘이 특수한 48개 아미노산의 길이의 리더 서열과 생합성 과정중 성숙한 란티바이오틱으로 변형되는 20개 아미노산의 프로펩타이드 부분으로 이루어져 있음을 나타낸다.

Description

재조합 머사시딘 및 이의 제조방법{Recombinant Mersacidin and a method for production}

본 발명은 특히 펩타이드 항생물질 머사시딘(mersacidin)의 구조 유전자 서열에 관한 것이다. 서열 분석으로, 프레머사시딘(premersacidin)이 일반적으로 48개 아미노산의 길이의 리더 서열과 생합성 과정 동안 성숙한 란티바이오틱(lantibiotic)으로 변형되는 20개 아미노산 프로펩타이드 부분으로 이루어져 있음이 밝혀졌다.

머사시딘은 세균 펩타이드가 희귀한 아미노산인 란티오닌 및/또는 3-메틸란티오닌을 함유한다는 것을 나타내기 위해 란티바이오틱이라 명명된, 세균 펩타이드 그룹에 속한다. 추가의 변형된 아미노산(예; 데하이드로알라닌 및 데하이드로부티린)은 일정하게 발생하지만, S-아미노비닐시스테인 및 라이시노알라닌은 단지 일부 란티바이오틱에서만 발견된다[참조; G. Jung(1991), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1051-1068]. 란티바이오틱은 그람 양성균에 의해 생산되며 리보소옴에서 합성된 프레펩타이드로부터 기원한다. 이 란티바이오틱 구조 유전자는 세균 염색체(예; 서브틸린 및 신나마이신)에서 발견되거나, 트랜스포손(transposon; 예; 다이신)과 같은 이동성 성분 또는 거대 플라스미드(예: 에피더민 및 Pep5)와 결합되어 있다. 프레펩타이드는 생산 세포로부터 방출된 후 분해되는 N-말단 리더 서열 및 C-말단 서열 프로펩타이드로 이루어져 있으며, 이 C-말단 리더 서열은 해독후 성숙한 란티바이오틱으로 변형된다[참조: G. Jung(1991), 상기 참조]. 변형의 제1 단계에서는, 세린 및 트레오닌 잔기가 탈수되어 각각 데하이드로알라닌(Dha) 또는 데하이드로부티린(Dub)으로 된다[참조: H.-P. Weil et al.(1990), Eur. J. Biochem. 194:217-223]. 이어서, 시스테인 잔기의 SH-그룹은 Dha 또는 Dhb 잔기의 이중 결합과 반응하여 각각 란티오닌 또는 메틸란티오닌을 형성한다. 머사시딘은 바실러스 종 HIL Y-85, 54728의 배양 상층액으로부터 분리되며 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)에 대한 이의 현저한 생체내 효능으로 인하여 관심이 집중되고 있다[참조: S. Chatterjee et al (1992). J. Antibioties 45:839-845]. 이것은 (1825Da) 정도로 분리된 가장 작은 란티바이오틱이며, 20개 아미노산의 프로펩타이드로부터 합성되고 3개의 메틸란티오닌 잔기, 1개의 데하이드로알라닌 및 1개의 S-아미노비닐-2-메틸시스테인을 포함한다(제1A도)[참조; S. Chatterjee(1992). J. Antibiotics 45: 832-838]. 머사시딘은 순 전하(net charge)를 지니지 않으며 전체적으로 소수성을 지닌다. 최근의 연구 결과에서는 머사시딘이 펩티도글리칸 생합성을 방해함을 제시하고 있다. 이 작용은 MRSA에 대해 현재 사용되는 항생물질과는 상이한 메카니즘을 통해 대부분 트랜스글리코실화(transglycosylation) 수준에서 일어난다.

따라서, 본 발명은 아미노산 제1번으로부터 제68번까지의 제2도에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 지니는 프레머사시딘 및 아미노산 제49번으로부터 제68번까의 제2도에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 지니는 프로머사시딘(promersacidin)에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양태는 프레머사시딘 또는 프로머사시딘을 암호화하는 DNA, 특히 프레머사시딘을 암호화하는 제22번으로부터 제225번에 이르는 제2도에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 프로머사시딘을 암호화하는 제166번 내지 제225번에 이르는 제2도에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 지닌 DNA, 이 DNA를 함유하는 백터 및 이 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

또다른 양태는 당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지된 유전공학 방법,즉 프레머사시딘 또는 프로머사시딘을 암호화하는 상기 DNA를 함유하는 적합한 숙주 세포를 적합한 조건하에 배양한 후, 상기 숙주 세포, 바람직하게는 그람-양성세균[예; 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 스트렙토코커스(Streptococcus)]에 의해 발현된 프레머사시딘, 프로머사시닌 또는 성숙한 머사시딘을 분리함으로써 프레머사시딘, 프로머사시딘 또는 성숙한 머사시딘을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최종적으로, 본 발명에 따른 프레머사시딘 또는 프로머사시딘 펩타이드 또는 이의 유전자는 예를 들어 WO 제90/00558호에 기술된 바와 같은 성숙한 머사시딘의 생산에 사용될 수 있다.

예로서 성숙한 머사시딘은 특히 메티실린-내성 스타필로코키스 아우레우스에 대한 식료품 보존용의 펩타이드 항생물질로서 또는 동물 또는 사람에 있어 스타필로코커스 아우레우스에 의한 감염증의 치료용 항생물질로서 유용하다. 본 발명은 또한 표출된 항생물질 스펙트럼 또는 상이한 효능을 지닌 아미노산 서열에 있어 변형된 머사시딘 유도체를 수득하는데 사용될 수 있다. 더우기, 본 발명은 유전 공학에 의해 머사시딘 또는 이의 유도체를 과발현시키는 방법을 제공한다.

실시예

1. 머사시딘의 구조 유전자의 클로닝

추정의 머사시딘 프로펩타이드 서열(제1B도)은 머사시딘의 구조로부터 추론되었으며 란티바이오틱 생합성에 대한 일반적인 정보를 기초로 하였다. 기술된 프로브는 PCR-메이트(PCR-Mate^?; Applied Biosystems, Weiterstadt, FRG 제조원) 상에서 바실러스의 바람직한 코돈 사용빈도를 기초로 하여 51개-염기 게스머로서 합성되었으며 디곡시게닌(Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG 제조원)으로 표지되었다(제1B도). 아미노부티릴 잔기(Abu_S-메틸란티오닌의 1/2)는 트레오닌으로부터 기원하는 반면 알라닌 잔기(Ala_s-메틸란티오닌의 1/2)는 프로펩타이드내 시스테인으로서 암호화된다. 말단 환 구조를 형성하는 S-아미노비닐-2-메틸시스테인은 C-말단S-아미노비닐시스테인을 함유하는 에피더민(epidermin)에 대해 나타낸 바와 같이 산화적으로 탈카복실화된 메틸란티오닌으로부터 적절하게 형성된다[참조; T. Kupke et al.(1992), J. Bacteriol. 174:5354-5361]. 플라스미드는 생산 균주내에서 검출되지 않을 수 있으므로, 염색체성 DNA는 마르무르(Marmur)가 기술한 바와 같이 제조하였으며[참조: J. Marmur(1961), J. Mol. Biol. 3:208:218), 단 단지 클로로 포름 추출 및 침전을 1회 수행하고, 이어서 DNA를 평형 완충액중에 용해시켜 퀴아겐-팁 100 컬럼(Quiagen-tip^?) 100 column, Diagen, Hilden, FRG 제조원)상에서 정제한다는 점만이 상이하다. Hind III의 염색체성 제한 분해물 중 51℃에서 2kb 단일 밴드가 서던 블롯[참조; E.M. Southern(1975), J. Mol. Biol. 98:503-517]에서 프로브와 하이브리드화되었다. 크기가 1.9 내지 2.3kb 범위인 단편을 겔로부터 절단하여 BIOTRAP^?(Schleicher and Schull, Dassel, FRG 제조원)로 용출시키고 이. 콜라이내 pUC18[참조: C. Yanisch-Perron et al. (1985), Gene 33 :103-109]내에 서브클로닝시켰다. 몇몇 재조합 콜로니의 플라스미드를 번보임 및 돌리 방법[참조; H.C. Birnboim and J. Doly(1979), Nucl. Acids Res. 7:1513-1523]으로 제조하고, Hind III로 분해하여 게스머로 탐침했다. 양성 시그날을 나타내는 클론중 1개를 다양한 효소로 제한분해한 후 서던 블롯하여 추가로 분석했다. 최종적으로, 1.3kb EcoRI-HindIII 단편을 이. 콜라이내 pEMBL 18 및 pEMBL 19[참조; L. Dente et al.(1983), Nucleic Acids. Res. 11:1645-1655]내에 서브클로닝시켰다. 또한, 형질전환체 부위 지시된 돌연변이유발 키트(transformer site directed mutagenesis kit; Clontech, Palo Alto, USA 제조원)를 사용하여 EcoR I 부위를 EcoR V 부위로 부위 지시된 돌연변이 유발시킨 후, 0.6kb EcoR V 단편을 벡터 pCU1[참조; J. Augustin et al. (1992), Eur. J. Biochem. 204:1149-1154]내에 클로닝시켰다.

2. 머사시딘 구조 유전자 mrsA의 뉴클레오타이드 서열

0.6kb 단편을 이본쇄 DNA로부터 디데옥시 쇄 종결법[참조; F. Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467]을 사용하며 A.L.F 자동 DNA 서열분석기(A.L.F. automatic DNA sequencer; Pharmacia, Brussels, Belgium 제조원)상에서 서열분석하였으며; 이때 프라이밍 공정을 위해 Auto Read^?서열분석 키트(Pharmacia, Brussels, Belgium 제조원)의 일반적인 역 프라이머 및 2개의 합성 올리고뉴클레오타이드, 즉 5'-TCTCTTCCATTTTTTTG)3' 및 5'-(AAATCAAATTAACAAATAC)3'를 사용하였다. 머사시딘 구조 유전자 mrsA의 뉴오타이드 서열은 제2도에 나타낸다. 잠재적인 리보소옴 결합 부위(AGGGGG)가 개방 판독 프레임의 ATG 개시 코돈 상부의 8개 염기쌍에서 발견되었다. 이 서열의 C-말단 부위는 공개된 머사시딘 1차 구조[참조; S. Chatterjee et al. (1992), J. Antibiotics 45: 832-838] 및 이의 제안된 프로펩타이드 서열과 일치한다. N-말단 부위는 48개 아미노산의 리더 서열(제2도의 화살표 표시부)로 이루어진다. 프로-머사시딘은 20개의 아미노산으로 이루어져 있다. 따라서, 프레펩타이드의 전체 길이는 7228Da의 계산된 분자량을 갖는 68개 아미노산이다. 자유 에너지 값이 -86.7kJmol^-1이고 스템(stem) 크기가 14 염기쌍인 헤어핀 구조(hairpin structure)의 TAA(ochre) 정지 코돈 하부의 8개의 염기가 발견되었다. 이 염기는, TTTATT 서열이 이어지므로, 전사 과정중 rho-독립적인 터미네이터로서 작용할 수 있을 것이다(제2도).

3. 머사시딘 프레펩타이드의 특성화

란티바이오틱은 2개의 그룹으로 소분리된다[참조; G. Jung(1991), 상기 참조]. A형-란티바이오틱은 민감성 세균의 막내에 일시적인 세공을 형성하는 연장된 양친매성 펩타이드이다[참조; H.-G. Sahl(1991), Pore formation in bacterial membranes by cationic lantibiotics, p. 347-358, in G. Jung and H.-G. Sahl (ed.), Nisin and novel lantibiotics, Escom, Leiden]. B형-란티바이오틱은 스트렙토마이세스에 의해 생산되는 구형 펩타이드이며, 이의 분자량은 2100Da 미만이고, 그들의 아미노산 서열이 매우 상동적이며, 헤드 투 테일 축합(head to tail condensation)을 포함하는 환 구조를 갖는다(G-Jung(1991), 상기 참조). 지금까지 머사시딘은 어떠한 그룹으로도 분류될 수 없었다[참조; G. Bierbaum and H.-G.Sahl(1993), Zbl. Bakt. 278:1-22]. 이와 관련하여, 머사시딘의 프레펩타이드 서열과 A형- 및 B형- 란티바이오틱의 프레펩타이드 서열의 비교가 특히 주목된다. 란티바이오틱 리더 서열의 2가지 공통적인 특성이 머사시딘중에 보존되었다: 즉, i) 리더 서열 내에 시스테인이 없고[참조: G. Jung(1991), 상기 참조], ii) 리더 서열의 C-말단 부위에 대해 α-나선형 경향이 예견된다는 것이다. 이와 같은 구조적 요소는 또한 트리플루오로에탄올/물의 혼합물중에서의 환형 이색 측정(circular dichroism measurement)에 의해서 A형-란티바이오틱의 리더 펩타이드에 대해 예측 되고 입증된 바 있다[참조; A. G. Beck-Sickinger and G. Jung. Synthesis and conformational analysis of lantibiotic leader-, pro- and prepeptides, p. 218-230. In G. Jung and H.-G Sahl (ed.), Nisin and novel lantibiotics. Escom. Leiden 1991]. 모든 다른 측면에서 머사시딘 리더 서열은 이제까지 기술된 A형-란티바이오틱 리더 서열과 상이하다. 제3도에 나타낸 바와 같이, 머사시딘 리더 서열은 길이 및 하전 분포(48개 아미노산/12개 하전)에 있어 오히려 B형-란티바이오틱 신나마이신의 독특하게 긴 59개 아미노산 길이의 리더(11개의 하전)와 유사하다[참조; C. Kaletta et al. (1989), Pep5, a new lantibiotic: structural gene isolation and prepeptide sequence. Arch. Microbiol. 152; 16-19]. 대조적으로, 통상적으로 고 하전된 A형-란티바이오틱 리더 서열, 예를 들어, Pep5 리더 펩타이드는 단지 26개의 아미노산중 총 10개의 하전된 잔기를 포함한다[참조; C. Kaletta et. al. (1989), 상기참조]. A형-란티바이오틱의 보존된 서열(예; F D/N L D/E 모티브)은 미사시딘 리더 펩타이드내에서 발견되지 않는다. 머사시딘 리더 서열의 프로테아제 절단 부위(^-4M-^-3E-^-2A-^1-A-⁺¹C)는 A형-란티바이오틱의 보존된 부위와는 상이하다(제3도). 본 발명자들은 나이신형 절단 부위(-1, 양전하 아미노산; -2, 프롤린; -3, 음전하 또는 극성; 및 -4 소수성) 또는 락티신 481[참조: J. -C. Piard et al. (1993), J. Biol. Chem., 268, 16361-16368] 또는 스트렙토코신 A-FF22[참조; W. L. Hynes et al. (1993), Appl. Env. Microbiol. 59:1969-1971]의 절단 부위를 함유하는 소수성 글라이신을 발견하였다. 신나마이신의 절단 부위 (^-3A-^-2F-^-1A) [참조; C. Kaletta et al. (1989), 상기 참조]는 2차 경로를 통해 분비되는 단백질에 대한(^-3A-^-2X-^-1A) 규칙을 따른다. 결론적으로, 머사시딘 프레펩타이드는 A형-란티바이오틱 리더 서열의 보존된 서열과의 상동성을 나타내지 않는다. 길이 및 하전 분포 면에서 신나마이신의 프레펩타이드와의 유사성이 있으나, 아미노산 수준에서 명백한 서열 상동성은 나타내지 않는다. 머사시딘은 A형-란티바이오틱 보다 작으며, 양으로 하전되어 있지 않고, 막을 탈극화(depolarization)시키지 않으며, 오히려 펩티도글리칸 생합성을 억제한다. 이것은, 리더 펩타이드의 특성외에, 머사시딘이 A형-란티바이오틱 보다는 B형-란티바이오틱과 더욱 관련된다는 것을 나타낸다. 최근, 또한 세포벽 생합성을 억제하는 또다른 란티바이오틱인 악타가르딘(참조; S. Somma et al., Antimicrob. Agents Chemother. 11:396-401, 1977)의 서열 및 브릿지 패턴이 밝혀졌다. 머사시딘과의 비교는 하나의 환이 두 란티바이오틱 모두에서 거의 완전히 보존되어 있음을 보여준다. 지금까지 특성화된 B-형 란티바이오틱 듀라마이신 A, B, C, 안코베닌 및 신나마이신의 강한 상동성에 비추어, 이들 펩타이드는 또한 에피더민(epidermin) 및 갈리더민(gallidermin) 또는 나이신 A 및 나이신 Z에서 관측되는 바와 같은 구조적 변이체로서 간주될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 머사시딘 및 악타가르딘이 B형-란티바이오틱으로 분류되어야 하며 B형-란티바이오틱이란 명칭은 듀라마이신의 구조적 변이체에 대해서 배타적으로 유보되는 것이 아니라 낮은 하전을 수반하며 효소 활성을 억제하는 작은 구형의 란티바이오틱을 포함해야 하는 것임을 제안한다.

제 1A)도는 란티바이오틱 머사시딘(lantibiotic mersacidin)의 구조를 도시한 것이다. 제 1B)도는 추정의 프레펩타이드 서열(prepeptide sequence) 및 구조 유전자를 동정하는데 사용된 51개 염기 게스머(base guessmer)의 서열을 도시한 것이다.

제2도는 란티바이오틱 머사시딘의 구조 유전자 mrsA의 뉴클레오타이드 서열 및 프레펩타이드의 추론된 아미노산 서열을 도시한 것이다. ATG 개시 코돈 앞 부위의 리보소옴 결합 부위는 박스형으로 표시되어 있고 프로세싱 부위는 화살표로 표시되어 있다. 추정적인 rho-독립적인 터미네이터는 밑줄로 표시되어 있다.

제3도는 몇몇 란티바이오틱의 리더 서열을 비교한 것이다. 보존된 서열은 굵은 활자로 표시되어 있다.

Claims

제2도에 나타낸 바와 같은 제1번 내지 제68번의 아미노산 서열을 갖는 프레머사시딘(premersacidin).
제1항에 따른 프레머사시딘을 암호화하는 DNA.
제2도에 나타낸 바와 같은 제22번 내지 제225번의 핵산 서열을 갖는 프레머사시딘을 암호화하는 DNA.
제3항 또는 제4항에 따른 DNA를 함유하는 벡터.
제7항에 따른 벡터를 함유하는 세균 세포.
(a) 제3항 또는 제4항에 따른 DNA 서열을 함유하는 세균 세포를 적합한 조건하에서 배양하는 단계; 및 (b) 프레머사시딘, 프로머사시딘 또는 성숙한 머사시딘을 분리하는 단계를 포함하는, 프레머사시딘, 프로머사시딘 또는 성숙한 머사시딘의 제조 방법.
제1항에 있어서, 성숙한 머사시딘의 제조에 사용하기 위한 프레머사시딘.